ES2878449T3 - Receptores antigénicos quiméricos de BCMA - Google Patents

Receptores antigénicos quiméricos de BCMA Download PDF

Info

Publication number
ES2878449T3
ES2878449T3 ES15824299T ES15824299T ES2878449T3 ES 2878449 T3 ES2878449 T3 ES 2878449T3 ES 15824299 T ES15824299 T ES 15824299T ES 15824299 T ES15824299 T ES 15824299T ES 2878449 T3 ES2878449 T3 ES 2878449T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
cell
car
bcma
vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15824299T
Other languages
English (en)
Inventor
Richard Morgan
Kevin Friedman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
2Seventy Bio Inc
Original Assignee
2Seventy Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 2Seventy Bio Inc filed Critical 2Seventy Bio Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2878449T3 publication Critical patent/ES2878449T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Un receptor antigénico quimérico (CAR) que comprende: un anticuerpo anti-BCMA (antígeno de maduración de células B) humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a uno o más epítopos de un polipéptido de BCMA humano; un dominio transmembrana de CTLA-4 o un dominio transmembrana de PD-1 que reduce la liberación de citocinas independiente de antígeno del CAR; uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelulares; y un dominio de señalización primaria.

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores antigénicos quiméricos de BCMA
Antecedentes
Campo Técnico
La presente invención se refiere a composiciones y métodos mejorados para tratar afecciones relacionadas con las células B. Más particularmente, la invención se refiere a receptores antigénicos quiméricos (CAR) mejorados que comprenden anticuerpos anti-BCMA humanizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, células efectoras inmunitarias genéticamente modificadas para expresar estos CAR, y el uso de estas composiciones para tratar eficazmente afecciones relacionadas con las células B.
Descripción de la técnica relacionada
Varias enfermedades importantes implican a los linfocitos B, es decir, las células B. La fisiología anormal de las células B también puede conducir al desarrollo de enfermedades autoinmunitarias, lo que incluye el lupus eritematoso sistémico (SLE). La transformación maligna de las células B conduce a cánceres, lo que incluye linfomas, por ejemplo, mieloma múltiple y linfoma no Hodgkin.
La gran mayoría de los pacientes que tienen neoplasias malignas de las células B, lo que incluye el linfoma no Hodgkin (NHL) y el mieloma múltiple (MM), contribuyen significativamente a la mortalidad por cáncer. La respuesta de las neoplasias malignas de las células B a diversas formas de tratamiento es mixta. Los métodos tradicionales de tratamiento de las neoplasias malignas de las células B, lo que incluye la quimioterapia y la radioterapia, tienen una utilidad limitada debido a los efectos secundarios tóxicos. La inmunoterapia con anticuerpos terapéuticos anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22, anti-CD23, anti-CD52, anti-CD80 y anti-HLA-DR ha proporcionado un éxito limitado, debido en parte a perfiles farmacocinéticos deficientes, rápida eliminación de los anticuerpos por las proteasas séricas y la filtración en el glomérulo y penetración en el sitio del tumor y niveles de expresión limitados del antígeno objetivo en las células cancerosas. Los intentos de usar células genéticamente modificadas que expresan receptores antigénicos quiméricos (CAR) también han tenido un éxito limitado debido a la deficiente expansión in vivo de las células T con CAR, la rápida desaparición de las células después de la infusión y una actividad clínica decepcionante.
Carpenter, R.O. y otros, Clin Cancer Res, vol. 19, núm. 8, 2048-2060 (2013), Garfall, y otros, Discov Med, vol. 17, núm. 91, 37-46 (2014), documentos WO 2010/104949 A2, WO 2015/158671 A1, WO 2016/94304 A2, WO 2015/164745 A2, WO 2015/164745 y WO 2014/099671 A1 describen todos polinucleótidos que codifican CAR anti-BCMA.
Breve resumen
La invención se define en las reivindicaciones.
La invención proporciona generalmente vectores mejorados para generar terapias de células T y métodos para usar las mismas. Más particularmente, la invención proporciona moléculas de CAR anti-BCMA humanizadas y su uso en el tratamiento, prevención o mejora de afecciones relacionadas con las células B.
Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, los inventores han descubierto que ciertos CAR anti-BCMA humanizados inducen la liberación de citocinas independientes de antígeno ("tónicas"), una característica que haría que los CAR anti-BCMA humanizados no fueran adecuados para su uso en terapias de células T. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que la liberación de citocinas tónica por ciertas células T con CAR anti-BCMA humanizadas puede hacerse dependiente del antígeno mediante la alteración de una o más características de al menos el dominio transmembrana de los CAR anti-BCMA humanizados.
En diversas modalidades, se proporciona un receptor antigénico quimérico (CAR) que comprende: un dominio extracelular que comprende un anticuerpo anti-BCMA (antígeno de maduración de células B) humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a uno o más epítopos de un polipéptido de BCMA humano; un dominio transmembrana de CTLA-4 o un dominio transmembrana de PD-1 que reduce la liberación de citocinas independiente del antígeno del CAR, uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares y un dominio de señalización primario.
En modalidades particulares, el anticuerpo anti-BCMA humanizado o el fragmento de unión a antígeno que se une al polipéptido de BCMA humano se selecciona del grupo que consiste en: una Ig de camello, Ig NAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, anticuerpo Fv de cadena sencilla ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpo, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, proteína Fv estabilizada con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de un solo dominio (sdAb, Nanocuerpo).
En modalidades adicionales, el anticuerpo anti-BCMA humanizado o el fragmento de unión a antígeno que se une al polipéptido de BCMA humano es un scFv.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-BCMA humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una o más CDR como se expone en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3.
En modalidades particulares, el anticuerpo anti-BCMA humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una o más CDR como se expone en cualquiera de las SEQ ID NOs: 4-6.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-BCMA humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de la cadena ligera variable como se expone en cualquiera de las SEQ ID NOs: 7-9. En modalidades particulares, la secuencia de la cadena ligera variable comprende las secuencias de CDR expuestas en las SeQ ID NOs: 1-3.
En otras modalidades, el anticuerpo anti-BCMA humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una secuencia de la cadena pesada variable como se expone en cualquiera de las SEQ ID NOs: 10-14. En modalidades adicionales, la secuencia de la cadena pesada variable comprende las secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NOs: 4-6.
En modalidades adicionales de la descripción, el dominio transmembrana es de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD3e, CD3Z, c D4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 y PD1.
En algunas modalidades de la descripción, el dominio transmembrana es de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: CD8a; CD4, CD45, PD1 y CD152.
En algunas modalidades, el dominio transmembrana es de PD1.
En algunas modalidades de la descripción, el dominio transmembrana es de CD152.
En ciertas modalidades de la descripción, el dominio transmembrana es de CD8a.
En modalidades particulares, el uno o más dominios de señalización coestimuladores son de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70.
En modalidades particulares, el uno o más dominios de señalización coestimuladores se seleccionan de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CD28, CD134 y CD137.
En modalidades adicionales, el uno o más dominios de señalización coestimuladores se seleccionan de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CD28, CD134 y CD137.
En modalidades adicionales, el uno o más dominios de señalización coestimuladores es de CD28.
En modalidades particulares, el uno o más dominios de señalización coestimuladores es de CD134.
En otras modalidades, el uno o más dominios de señalización coestimuladores es de CD137.
En ciertas modalidades, un CAR comprende un polipéptido de la región bisagra.
En modalidades adicionales, la región bisagra es de un polipéptido seleccionado de PD1 o CTLA-4.
En modalidades adicionales, el polipéptido de la región bisagra comprende una región bisagra de PD1
En modalidades adicionales de la descripción, el polipéptido de la región bisagra comprende una región bisagra de CD 152.
En modalidades adicionales de la descripción, el polipéptido de la región bisagra comprende una región bisagra de CD8a.
En modalidades adicionales, el CAR comprende un polipéptido de la región bisagra y un dominio transmembrana de En modalidades adicionales de la descripción, el CAR comprende un polipéptido de la región bisagra y un dominio transmembrana de CD 152.
En modalidades adicionales de la descripción, el CAR comprende un polipéptido de la región bisagra y un dominio transmembrana de CD8a.
En algunas modalidades de la descripción, un CAR comprende una región espaciadora.
En modalidades adicionales de la descripción, el polipéptido de la región espaciadora comprende las regiones CH2 y CH3 de IgG1 o IgG4.
En modalidades particulares, un CAR comprende un péptido señal.
En modalidades adicionales, el péptido señal comprende un polipéptido señal de la cadena pesada de IgG1, un polipéptido señal de CD8a o un polipéptido señal del receptor alfa de GM-CSF humano.
En una modalidad, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en las SEQ ID NO: 71 o SEQ ID NO: 73.
En otra modalidad de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 15.
En una modalidad particular de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 16.
En una cierta modalidad de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 17.
En una modalidad adicional de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 18.
En una modalidad adicional de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 19.
En una modalidad particular de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 20.
En una modalidad de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 21.
En otra modalidad de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 22.
En aún otra modalidad de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 23.
En aún otra modalidad más de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 24.
En una modalidad particular de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 25.
En una cierta modalidad de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 26.
En una modalidad adicional de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 27.
En una modalidad adicional de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 28.
En otra modalidad de la descripción, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 29.
En otra modalidad, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 71.
En otra modalidad, un CAR comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 73. En diversas modalidades, se proporciona un polinucleótido que codifica un CAR contemplado en la presente descripción.
En diversas modalidades particulares, se proporciona un polinucleótido que codifica un CAR, en donde la secuencia de polinucleótidos se expone en la SEQ iD NO: 70 o SEQ ID NO: 72.
En diversas ciertas modalidades, se proporciona un vector que comprende un polinucleótido que codifica un CAR contemplado en la presente descripción o como se expone en la SEQ ID NO: 70 o SEQ ID NO: 72.
En ciertas modalidades, el vector es un vector de expresión.
En modalidades adicionales, el vector es un vector episomal.
En modalidades particulares, el vector es un vector viral.
En modalidades adicionales, el vector es un vector retroviral.
En otras modalidades, el vector es un vector lentiviral.
En modalidades adicionales, el vector lentiviral se selecciona del grupo que consiste esencialmente en: virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1); virus de inmunodeficiencia humana 2 (VIH-2), virus visna-maedi (VMV); virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV); virus de la anemia infecciosa equina (VAIE); virus de inmunodeficiencia felina (VIF); virus de inmunodeficiencia bovina (BIV); y virus de inmunodeficiencia de los simios (VIS).
En modalidades particulares, un vector comprende una LTR retroviral izquierda (5'), una señal de empaquetamiento Psi (V), un tramo de polipurina central/fragmento de ADN (cPPT/FLAP), un elemento de exportación retroviral; un promotor unido operativamente al polinucleótido que codifica un CAR contemplado en la presente descripción; y una LTR retroviral derecha (3').
En otras modalidades, un CAR comprende una secuencia de poliadenilación heteróloga.
En algunas modalidades, un CAR comprende un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis B (HPRE) o un elemento regulador postranscripcional de la marmota (WPRE).
En ciertas modalidades, el promotor de la LTR 5' se reemplaza con un promotor heterólogo.
En modalidades adicionales, el promotor heterólogo es un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) o un promotor del virus de los simios 40 (SV40).
En modalidades particulares, la LTR 5' o LTR 3' es una LTR lentiviral.
En modalidades particulares, la LTR 3' comprende una o más modificaciones.
En algunas modalidades, la LTR 3' comprende una o más deleciones.
En ciertas modalidades, la LTR 3' es una LTR autoinactivable (SIN).
En algunas modalidades, la secuencia de poliadenilación es una secuencia señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina o de poliadenilación de p-globina de conejo.
En modalidades adicionales, un polinucleótido que codifica un CAR contemplado en la presente descripción comprende una secuencia de Kozak optimizada.
En modalidades adicionales, el promotor unido operativamente al polinucleótido que codifica un CAR contemplado en la presente descripción se selecciona del grupo que consiste en: un promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1-a), un promotor de fosfoglicerato quinasa 1 (PGK), un promotor de ubiquitina-C (UBQ-C), un potenciador de citomegalovirus/promotor de beta-actina de pollo (CAG), potenciador de polioma/promotor de timidina quinasa del herpes simple (MC1), un promotor de beta actina (p-ACT), un promotor del virus de los simios 40 (SV40) y un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor con sitio de unión a cebador dl587rev sustituido (MND).
En diversas modalidades, se proporciona una célula efectora inmunitaria que comprende un vector contemplado en la presente descripción.
En modalidades adicionales, la célula efectora inmunitaria se selecciona del grupo que consiste en: un linfocito T y una célula asesina natural (NK).
En diversas modalidades, se proporciona una composición que comprende una célula efectora inmunitaria contemplada en la presente descripción y un excipiente fisiológicamente aceptable.
En diversas modalidades, se proporciona un método para generar una célula efectora inmunitaria que comprende un CAR contemplado en la presente descripción, que comprende introducir en una célula efectora inmunitaria un vector que comprende un polinucleótido que codifica el CAR.
En modalidades adicionales, el método comprende además estimular la célula efectora inmunitaria e inducir la proliferación de la célula al poner en contacto la célula con anticuerpos que se unen a CD3 y anticuerpos que se unen a CD28; lo que genera de esta manera una población de células efectoras inmunitarias.
En modalidades particulares, la célula efectora inmunitaria se estimula e induce a proliferar antes de introducir el vector.
En ciertas modalidades, las células efectoras inmunitarias comprenden linfocitos T.
En modalidades particulares, las células efectoras inmunitarias comprenden células NK.
En diversas modalidades, puede usarse una composición que comprende células T con CAR anti-BCMA contempladas en la presente descripción y un excipiente farmacéuticamente aceptable en un método para tratar una afección relacionada con las células B en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición.
En otras modalidades, la afección relacionada con las células B es mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, proliferaciones de células B de potencial maligno incierto, granulomatosis linfomatoide, trastorno linfoproliferativo postrasplante, un trastorno inmunorregulador, artritis reumatoide, miastenia grave, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome antifosfolípidos, enfermedad de Chagas, enfermedad de Grave, granulomatosis de Wegener, poliarteritis nodosa, síndrome de Sjogren, pénfigo vulgar, esclerodermia, esclerosis múltiple, síndrome antifosfolípido, vasculitis asociada a ANCA, enfermedad de Goodpasture, enfermedad de Kawasaki, anemia hemolítica autoinmunitaria y glomerulonefritis rápidamente progresiva, enfermedad de la cadena pesada, amiloidosis primaria o asociada a inmunocitos o gammapatía monoclonal de importancia indeterminada.
En modalidades adicionales, la afección relacionada con las células B es una neoplasia maligna de las células B. En ciertas modalidades, la neoplasia maligna de las células B es mieloma múltiple (MM) o linfoma no Hodgkin (NHL). En ciertas modalidades, el MM se selecciona del grupo que consiste en: mieloma múltiple manifiesto, mieloma múltiple latente, leucemia de células plasmáticas, mieloma no secretor, mieloma IgD, mieloma osteoesclerótico, plasmocitoma óseo solitario y plasmocitoma extramedular.
En algunas modalidades, el NHL se selecciona del grupo que consiste en: linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño (CLL/SLL), linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores B y linfoma de células del manto.
En modalidades particulares, la afección relacionada con las células B es una neoplasia maligna de células plasmáticas.
En modalidades adicionales, la afección relacionada con las células B es una enfermedad autoinmunitaria.
En modalidades adicionales, la enfermedad autoinmunitaria es el lupus eritematoso sistémico. En ciertas modalidades, la afección relacionada con las células B es la artritis reumatoide.
En modalidades particulares, la afección relacionada con las células B es púrpura trombocitopénica idiopática, miastenia grave o anemia hemolítica autoinmunitaria.
Breve descripción de varias vistas de los dibujos
La Figura 1 muestra un esquema de constructos de CAR anti-antígeno de maduración de células B (anti-BCMA) humanizados.
La Figura 2 muestra la cantidad de IFNy liberado de células T con CAR anti-BCMA después de que las células se cultivaran conjuntamente durante 24 horas con células K562 que expresan BCMA.
La Figura 3 muestra la actividad citolítica de células T con CAR anti-BCMA cultivadas conjuntamente durante cuatro horas con células K564 que expresan BCMA.
La Figura 4 muestra la expresión de CAR anti-BCMA en células T transducidas con secuencias de CAR de ratón (anti-BCMA-02) o humanizadas (anti-BCMAanti-BCMA-10, anti-anti-BCMA-11, anti-anti-BCMA-31).
La Figura 5 muestra la cantidad de IFNy liberado de las células T con CAR anti-BCMA después de que las células se cultivaran conjuntamente durante 24 horas con células BCMA K562 que expresan cantidades bajas o altas de BCMA, líneas celulares de mieloma múltiple (RPMI-8226, NCI-H929) o líneas celulares negativas para BCMA (K562, HDLM-2).
La Figura 6 muestra la actividad citolítica de células T que expresan CAR anti-BCMA cultivadas conjuntamente con células K564-BCMA durante cuatro horas.
La Figura 7 muestra la liberación de citocinas independiente del antígeno por células T que expresan el constructo de CAR anti-BCMA-10 humanizado cultivadas en medio que contiene suero humano pero que carece de BCMA.
La Figura 8 muestra la liberación de citocinas independiente del antígeno por células T que expresan el constructo CAR anti-BCMA-10 humanizado cultivadas en medio que contiene suero humano pero que carece de BCMA.
La Figura 9 muestra un esquema de los constructos de CAR anti-BCMA-02, anti-BCMA-10, anti-BCMA-10.2 y anti-BCMA-10.5.
La Figura 10 muestra la cantidad de IFNy liberado de células T con CAR anti-BCMA-10, anti-BCMA-10.2 o anti-BCMA-10.5 después de que las células se cultivaran conjuntamente durante 24 horas con células K562 que expresan BCMA.
La Figura 11 muestra una comparación de la cantidad de liberación de IFNy tónica de células T que expresan el CAR anti-BCMA-02 de ratón, o que expresan el CAR anti-BCMA-10, anti-BCMA-10.2 o anti-BCMA-10.5 humanizado después de 24 horas en cultivo.
Breve descripción de los identificadores de secuencia
Las SEQ ID NOs: 1-3 exponen secuencias de aminoácidos de secuencias de CDR de la cadena ligera ilustrativas para los CAR anti-BCMA contemplados en la presente descripción.
Las SEQ ID NOs: 4-6 exponen secuencias de aminoácidos de secuencias de CDR de la cadena pesada ilustrativas para los CAR anti-BCMA contemplados en la presente descripción.
Las SEQ ID NO: 7-9 exponen secuencias de aminoácidos de secuencias de cadenas ligeras ilustrativas para los CAR anti-BCMA contemplados en la presente descripción.
Las SEQ ID NOs: 10-14 exponen secuencias de aminoácidos de secuencias de la cadena pesada ilustrativas para los CAR anti-BCMA contemplados en la presente descripción.
Las SEQ ID NOs: 15-29, 71 y 73 exponen secuencias de aminoácidos de los CAR anti-BCMA ilustrativos contemplados en la presente descripción.
Las SEQ ID NOs: 30-44, 70 y 72 exponen secuencias de polinucleótidos que codifican CAR anti-BCMA ilustrativos contemplados en la presente descripción.
La SEQ ID NO: 45 expone la secuencia de aminoácidos de BCMA humano.
Las SEQ ID NOs: 46-56 exponen la secuencia de aminoácidos de diversos enlazadores.
Las SEQ ID NOs: 57-69 exponen la secuencia de aminoácidos de los sitios de escisión de proteasa y los sitios de escisión de polipéptido autoescindible.
Descripción detallada
A. Visión general
La invención se refiere generalmente a composiciones y métodos mejorados para tratar afecciones relacionadas con las células B. Como se usa en la presente, el término "afecciones relacionadas con las células B" se refiere a afecciones que implican una actividad inadecuada de las células B y neoplasias malignas de las células B.
En modalidades particulares, la invención se refiere a una terapia celular adoptiva mejorada de afecciones relacionadas con células B mediante el uso de células efectoras inmunitarias genéticamente modificadas. Los enfoques genéticos ofrecen un medio potencial para potenciar el reconocimiento inmunitario y la eliminación de las células cancerosas. Una estrategia prometedora es modificar genéticamente células efectoras inmunitarias para expresar receptores antigénicos quiméricos (CAR) que redirigen la citotoxicidad hacia las células cancerosas. Sin embargo, las inmunoterapias de células adoptivas existentes para tratar los trastornos de las células B presentan un riesgo grave de comprometer la inmunidad humoral porque las células se dirigen a los antígenos expresados en todas o la mayoría de las células B. En consecuencia, dichas terapias no son clínicamente convenientes y, por lo tanto, permanece la necesidad en la técnica de terapias más eficientes para las afecciones relacionadas con las células B que respeten la inmunidad humoral.
Las composiciones y los métodos de terapia celular adoptiva mejorados descritos en la presente descripción, proporcionan células efectoras inmunitarias genéticamente modificadas que pueden expandirse fácilmente, exhiben persistencia a largo plazo in vivo y reducen el deterioro de la inmunidad humoral al dirigirse a la expresión por las células B del antígeno de maduración de células B (BCMA, también conocido como CD269 o superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 17; TNFRSF17).
BCMA es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (ver, por ejemplo, Thompson y otros, J. Exp. Medicine, 192(1): 129-135, 2000 y Mackay y otros, Annu. Rev. Immunol, 21: 231-264, 2003. BCMA se une al factor de activación de células B (BAFF) y un ligando inductor de la proliferación (APRIL) (ver, por ejemplo, Mackay y otros, 2003 y Kalled y otros, Immunological Reviews, 204: 43-54, 2005). Entre las células no malignas, se ha informado que el BCMA se expresa principalmente en células plasmáticas y subconjuntos de células B maduras (ver, por ejemplo, Laabi y otros, Em BO J., 77(1): 3897-3904, 1992; Laabi y otros, Nucleic Acids Res., 22(7): 1147­ 1154, 1994; Kalled y otros, 2005; O'Connor y otros, J. Exp. Medicine, 199(1): 91-97, 2004; y Ng y otros, J. Immunol., 73(2): 807-817, 2004. Los ratones deficientes en BCMA están sanos y tienen un número normal de células B, pero la supervivencia de las células plasmáticas de larga vida está alterada (ver, por ejemplo, O'Connor y otros, 2004; Xu y otros, Mol. Cell. Biol, 21(12): 4067-4074, 2001; y Schiemann y otros, Science, 293(5537): 2 111-21 14, 2001). El ARN de BCMA se ha detectado universalmente en células de mieloma múltiple y en otros linfomas, y varios investigadores han detectado la proteína BCMA en la superficie de las células plasmáticas de pacientes con mieloma múltiple (ver, por ejemplo, Novak y otros, Blood, 103(2): 689-694, 2004; Neri y otros, Clinical Cancer Research, 73(19): 5903-5909, 2007; Bellucci y otros, Blood, 105(10): 3945-3950, 2005; y Moreaux y otros, Blood, 703(8): 3148-3157, 2004.
En diversas modalidades, los CAR que comprenden secuencias de anticuerpos anti-BCMA humanizados son altamente eficaces en comparación con los CAR anti-BCMA que comprenden secuencias de anticuerpos de ratón; experimentan una robusta expansión in vivo; y reconocen las células B humanas que expresan BCMA y muestran actividad citotóxica contra las células B que expresan BCMA. Los presentes inventores han descubierto inesperadamente que la modificación sustancial de porciones de las secuencias de anticuerpos anti-BCMA humano de ratón, lo que incluye dominios de reconocimiento de antígenos estructurales y menores, no alteró sustancialmente la función de las células T con CAR anti-BCMA humanizadas, y que las propiedades de liberación de citocinas de las células T con CAR anti-BCMA humanizadas pueden aumentarse o disminuirse en comparación con una célula T que expresa un CAR anti-BCMA humanizado de referencia al alterar al menos el dominio transmembrana del CAR anti-BCMA humanizado.
En modalidades particulares, un CAR anti-BCMA humanizado conduce a una liberación de citocinas tónica o independiente de antígeno sorprendentemente alta. En modalidades particulares, el dominio transmembrana de un CAR anti-BCMA humanizado que genera la liberación de citocinas independiente del antígeno se altera de manera que las propiedades de señalización (por ejemplo, liberación de citocinas) de las células T con CAR anti-BCMA humanizadas alteradas se vuelven sustancialmente dependientes del antígeno en comparación con una célula T que expresa el CAR anti-BCMA humanizado inalterado.
En ciertas modalidades, el dominio transmembrana de un CAR anti-BCMA humanizado que genera la liberación de citocinas independiente del antígeno se altera de manera que las células T con CAR anti-BCMA humanizadas alteradas se vuelven sustancialmente dependientes del antígeno o liberan sustancialmente menos citocinas en ausencia de antígeno en comparación con una célula T que expresa el CAR anti-BCMA humanizado inalterado. En una modalidad, se proporciona un CAR que comprende un anticuerpo anti-BCMA humanizado o un fragmento de unión a antígeno, un dominio transmembrana y uno o más dominios de señalización intracelular.
En una modalidad, se proporciona una célula efectora inmunitaria genéticamente modificada para expresar un CAR contemplado en la presente descripción. Las células T que expresan un CAR se denominan en la presente descripción células T con CAR o células T modificadas con CAR.
En diversas modalidades, las células efectoras inmunitarias genéticamente modificadas contempladas en la presente descripción se administran a un paciente con una afección relacionada con las células B, por ejemplo, una enfermedad autoinmunitaria asociada con las células B o una neoplasia maligna de las células B.
La práctica de la invención empleará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, química orgánica, biología molecular, microbiología, técnicas de ADN recombinante, genética, inmunología y biología celular que están dentro de la experticia de la técnica, muchos de los cuales se describen más abajo con fines ilustrativos. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ra Edición, 2001); Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da Edición, 1989); Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, actualizado en julio de 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, Nueva York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames y S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow y Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach y W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; así como también monografías en revistas tales como Advances in Immunology. B. Definiciones
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente descripción tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, en la presente descripción se describen modalidades preferidas de composiciones, métodos y materiales. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.
Los artículos "un", "una" y "el/la" se usan en la presente descripción para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno, o a uno o más) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o uno o más elementos.
El uso de la alternativa (por ejemplo, "o") debe entenderse que significa una, ambas o cualquier combinación de las alternativas.
El término "y/o" debe entenderse que significa una o ambas alternativas.
Como se usa en la presente, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía tanto como 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. En una modalidad, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud ± 15 %, ± 10 %, ± 9 %, ± 8 %, ± 7 %, ± 6 %, ± 5 %, ± 4 %, ± 3 %, ± 2 % o ± 1 % sobre una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud.
A lo largo de esta descripción, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, se entenderá que las palabras "comprende", "comprenden" y "que comprende" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. Por "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a, lo que sigue a la frase "que consiste en". Por lo tanto, la frase "que consiste en" indica que los elementos enumerados son indispensables u obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos. Por "que consiste esencialmente en" se entiende que incluye todos los elementos mencionados después de la frase, y limitado a otros elementos que no interfieren o no contribuyen a la actividad o acción especificada en la descripción de los elementos enumerados. Por lo tanto, la frase "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son obligatorios u obligatorios, pero que no están presentes otros elementos que afecten materialmente la actividad o acción de los elementos enumerados.
La referencia en esta descripción a "una modalidad", "una modalidad particular", "una modalidad relacionada", "una cierta modalidad", "una modalidad adicional" u "otra modalidad" o combinaciones de las mismas significa que una característica, estructura o rasgo en particular descrita en relación con la modalidad se incluye en al menos una modalidad de la presente invención. Por lo tanto, las apariciones de las frases anteriores en diversos lugares a lo largo de esta descripción no se refieren todas necesariamente a la misma modalidad. Además, las características, estructuras o rasgos particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más modalidades. También se entiende que la mención positiva de una característica en una modalidad sirve como base para excluir la característica en una modalidad particular.
C. Receptores antigénicos quiméricos
En diversas modalidades, se proporcionan receptores modificados genéticamente que redirigen la citotoxicidad de las células efectoras inmunitarias hacia las células B. Estos receptores modificados genéticamente se denominan en la presente descripción receptores antigénicos quiméricos (CAR). Los CAR son moléculas que combinan la especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, BCMA) con un dominio intracelular que activa el receptor de células T para generar una proteína quimérica que exhibe una actividad inmunitaria celular antitumoral anti-BCMA específica. Como se usa en la presente descripción, el término "quimérico" describe estar compuesto de partes de diferentes proteínas o ADN de diferentes orígenes.
Los CAR contemplados en la presente descripción comprenden un dominio extracelular (también denominado dominio de unión o dominio de unión específico de antígeno) que se une a BCMA, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular. La activación del dominio de unión a antígeno anti-BCMA del CAR con BCMA en la superficie de una célula objetivo da como resultado el agrupamiento del CAR y suministra un estímulo de activación a la célula que contiene el CAR. La característica principal de los CAR es su capacidad para redirigir la especificidad de las células efectoras inmunitarias, lo que desencadena la proliferación, la producción de citocinas, la fagocitosis o la producción de moléculas que pueden mediar la muerte celular de la célula que expresa el antígeno objetivo de manera independiente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), al explotar las capacidades de direccionamiento específico a células de los anticuerpos monoclonales, ligandos solubles o correceptores específicos de células.
En diversas modalidades, un CAR comprende un dominio de unión extracelular que comprende un dominio de unión específico de BCMA humanizado; un dominio transmembrana; uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares; y un dominio de señalización primario.
En modalidades particulares, un CAR comprende un dominio de unión extracelular que comprende un anticuerpo anti-BCMA humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo; uno o más dominios de bisagra o dominios espaciadores; un dominio transmembrana que incluye; uno o más dominios de señalización coestimuladores intracelulares; y un dominio de señalización primario.
1. Dominio de unión
En modalidades particulares, los CAR contemplados en la presente descripción comprenden un dominio de unión extracelular que comprende un anticuerpo anti-BCMA humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de BCMA humano expresado en una célula B. Como se usa en la presente descripción, los términos "dominio de unión", "dominio extracelular", "dominio de unión extracelular", "dominio de unión específico de antígeno" y "dominio de unión extracelular específico de antígeno" se usan indistintamente y proporcionan un CAR con la capacidad para unirse específicamente al antígeno objetivo de interés, por ejemplo, bCMa . El dominio de unión puede derivarse ya sea de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante.
Los términos "afinidad de unión específica" o "se une específicamente" o "unido específicamente" o "unión específica" o "dirigido específicamente" como se usa en la presente descripción, describen la unión de un anticuerpo anti-BCMA o un fragmento de unión a antígeno del mismo (o un CAR que comprende el mismo) a BCMA con una mayor afinidad de unión que la unión de fondo. Un dominio de unión (o un CAR que comprende un dominio de unión o una proteína de fusión que contiene un dominio de unión) "se une específicamente" a un BCMA si se une o se asocia con BCMA con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación en equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) de, por ejemplo, mayor o igual que aproximadamente 105 M-1. En ciertas modalidades, un dominio de unión (o una proteína de fusión del mismo) se une a un objetivo con una Ka mayor o igual que aproximadamente 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1 o 1013 M-1. Lo unión de "alta afinidad" (o proteínas de fusión de cadena sencilla de los mismos) se refieren a aquellos dominios de unión con una Ka de al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 1013 M-1 o mayor.
Alternativamente, la afinidad puede ser definida como una constante de disociación en equilibrio (Kd) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, 10-5 M a 10-13 M, o menos). Las afinidades de los polipéptidos del dominio de unión y las proteínas CAR de acuerdo con la presente descripción pueden determinarse fácilmente mediante el uso de técnicas convencionales, por ejemplo, mediante ELISA competitivo (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), o mediante asociación de unión, o ensayos de desplazamiento mediante el uso de ligandos marcados, o mediante el uso de un dispositivo de resonancia de plasmones de superficie tal como el Biacore T100, que está disponible de Biacore, Inc., Piscataway, NJ, o tecnología de biosensores ópticos tales como el sistema EPlC o EnSpire que están disponibles de Corning y Perkin Elmer, respectivamente (ver también, por ejemplo, Scatchard y otros, (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660; y las patentes de Estados Unidos núms. 5,283,173;
5,468,614, o el equivalente).
En una modalidad, la afinidad de la unión específica es aproximadamente 2 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 5 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 10 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 20 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 50 veces mayor que la unión de fondo, aproximadamente 100 veces mayor que la unión de fondo, o aproximadamente 1000 veces mayor que la unión de fondo o más.
En modalidades particulares, el dominio de unión extracelular de un CAR comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este. Un "anticuerpo" se refiere a un agente de unión que es un polipéptido que comprende al menos una región variable de inmunoglobulina de la cadena ligera o la cadena pesada que reconoce y se une específicamente a un epítopo de un antígeno, tal como un péptido, lípido, polisacárido o ácido nucleico que contiene un determinante antigénico, tal como los reconocidos por una célula inmunitaria.
Un "antígeno (Ag)" se refiere a un compuesto, composición o sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de células T en un animal, lo que incluye las composiciones (tal como una que incluye una proteína específica del cáncer) que se inyectan o absorben en un animal. Un antígeno reacciona con los productos de la inmunidad humoral o celular específica, lo que incluye los inducidos por antígenos heterólogos, tales
como los antígenos descritos. En modalidades particulares, el antígeno objetivo es un epítopo de un polipéptido de BCMA.
Un "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a la región de un antígeno al que se une un agente de unión. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se retienen típicamente tras la exposición a solventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario se pierden típicamente en el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye típicamente al menos 3, y más usualmente, al menos 5, aproximadamente 9 o aproximadamente 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.
Los anticuerpos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tales como Ig de camello, Ig NAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, proteínas Fv de cadena sencilla ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, proteínas Fv estabilizadas con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de dominio único (sdAb, Nanocuerpo) y porciones de anticuerpos de longitud completa responsables de la unión a antígeno. El término también incluye formas genéticamente modificadas, tales como anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados), anticuerpos heteroconjugados (tales como anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de unión a antígeno de estos. Ver además, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3ra Ed., W. H. Freeman & Co., Nueva York, 1997.
Como comprenderá el experto en la técnica y como se describe en otra parte de la presente descripción, un anticuerpo completo comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada consiste en una región variable y una primera, segunda y tercera región constante, mientras que cada cadena ligera consiste en una región variable y una región constante. Las cadenas pesadas de los mamíferos se clasifican como a, 6, £, y y M. Las cadenas ligeras de los mamíferos se clasifican como A o k. Las inmunoglobulinas que comprenden las cadenas pesadas a, 6, £, y y M se clasifican como inmunoglobulina (Ig)A, IgD, IgE, IgG e IgM. El anticuerpo completo tiene forma de "Y". El tallo de la Y consiste en las segunda y tercera regiones constantes (y para IgE e IgM, la cuarta región constante) de dos cadenas pesadas unidas entre sí y se forman enlaces disulfuro (intercadena) en la bisagra. Las cadenas pesadas y, a y 6 tienen una región constante compuesta por tres dominios Ig en tándem (en una línea) y una región bisagra para mayor flexibilidad; las cadenas pesadas m y £ tienen una región constante compuesta por cuatro dominios de inmunoglobulina. La segunda y tercera regiones constantes se denominan "dominio CH2" y "dominio CH3", respectivamente. Cada brazo de la Y incluye la región variable y la primera región constante de una única cadena pesada unida a las regiones variable y constante de una única cadena ligera. Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada son responsables de la unión a antígeno.
Las regiones variables de la cadena ligera y pesada contienen una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables, también llamadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". Las CDR pueden definirse o identificarse mediante métodos convencionales, tales como por la secuencia de acuerdo con Kabat y otros, (Wu, TT y Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970); Borden, P. y Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987); (ver, Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, o por la estructura de acuerdo con Chothia y otros, (Chothia, C. y Lesk, A.M., J Mol. Biol., 196(4): 901-917 (1987), Chothia, C. y otros, Nature, 342: 877 - 883 (1989)).
Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie, tales como los seres humanos. La región marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR en el espacio tridimensional. Las CDR son las principales responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan típicamente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente a partir del extremo N terminal, y también se identifican típicamente por la cadena en la que se ubica la CDR particular. Por lo tanto, las CDR ubicadas en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3, mientras que las CDR ubicadas en el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo se denominan CDRL1, CDRL2, y CDRL3. Los anticuerpos con diferentes especificidades (es decir, diferentes sitios de combinación para diferentes antígenos) tienen diferentes CDR. Aunque son las CDR las que varían de un anticuerpo a otro, solo un número limitado de posiciones de aminoácidos dentro de las CDR están directamente implicadas en la unión a antígeno. Estas posiciones dentro de las CDR se denominan residuos determinantes de la especificidad (SDR). Los ejemplos ilustrativos de CDR de la cadena ligera que son adecuadas para construir CAR anti-BCMA humanizados contemplados en la presente descripción incluyen las secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NOs: 1-3. Los ejemplos ilustrativos de CDR de la cadena pesada que son adecuadas para construir CAR anti-BCMA humanizados contemplados en la presente descripción incluyen las secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NOs: 4-6.
Las referencias a "Vh" o "VH" se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye la de un anticuerpo, Fv, scFv, dsFv, Fab u otro fragmento de anticuerpo como se describe en la presente descripción. Las referencias a "Vl" o "VL" se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, que incluye la de un anticuerpo, Fv, scFv, dsFv, Fab u otro fragmento de anticuerpo como se describe en la presente descripción.
Un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo producido por un solo clon de linfocitos B o por una célula en la que se han transfectado los genes de la cadena ligera y pesada de un solo anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales se producen mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante la producción de células híbridas formadoras de anticuerpos a partir de una fusión de células de mieloma con células inmunitarias del bazo. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos monoclonales humanizados.
Un "anticuerpo quimérico" tiene residuos del marco de una especie, como la humana, y CDR (que generalmente confieren unión a antígeno) de otra especie, como un ratón. En modalidades preferidas particulares, un CAR contemplado en la presente descripción comprende un dominio de unión específica a un antígeno que es un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
En modalidades preferidas, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado (tal como un anticuerpo monoclonal humanizado) o un fragmento del mismo que se une específicamente a un polipéptido de BCMA humano. Un anticuerpo "humanizado" es una inmunoglobulina que incluye una región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, de ratón, rata o sintética). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante", y la inmunoglobulina que proporciona el marco se denomina "aceptora". En una modalidad, todas las CDR son de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. Las regiones constantes no necesitan estar presentes, pero si lo están, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente 85-90 %, tal como aproximadamente 95 % o más idénticas. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de las secuencias de inmunoglobulinas humanas naturales. Los anticuerpos monoclonales humanizados u otros pueden tener sustituciones conservadoras de aminoácidos adicionales que no tienen sustancialmente ningún efecto sobre la unión a antígeno u otras funciones de la inmunoglobulina. Los anticuerpos humanizados pueden construirse por medio de ingeniería genética (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,585,089).
En modalidades particulares, un anticuerpo anti-BCMA humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, incluye una Ig de camello (un anticuerpo de camélido (VHH)), Ig NAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, anticuerpo Fv de cadena sencilla ("scFV), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpo, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, proteína Fv estabilizada con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de dominio único (sdAb, Nanocuerpo).
"Ig de camello" o "VHH de camélido", como se usa en la presente descripción, se refiere a la unidad de unión a antígeno más pequeña conocida de un anticuerpo de cadena pesada (Koch-Nolte, y otros, FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)). Un "anticuerpo de cadena pesada" o un "anticuerpo de camélido" se refiere a un anticuerpo que contiene dos dominios VH y no contiene cadenas ligeras (Riechmann L. y otros, J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999); los documentos WO94/04678; WO94/25591; patente de Estados Unidos núm. 6,005,079).
"IgNAR", de "nuevo receptor de antígeno de inmunoglobulina", se refiere a una clase de anticuerpos del repertorio inmunitario de tiburones que consiste en homodímeros de un dominio variable del nuevo receptor de antígeno (VNAR) y cinco dominios constantes del nuevo receptor de antígeno (CNAR). Los IgNAR representan algunos de los andamios proteicos basados en inmunoglobulinas más pequeños conocidos y son muy estables y poseen características de unión eficientes. La estabilidad inherente puede atribuirse tanto a (i) el andamio de Ig subyacente, que presenta un número considerable de residuos expuestos a la superficie cargados e hidrófilos en comparación con los dominios VH y VL de anticuerpos convencionales que se encuentran en los anticuerpos murinos; y (ii) las características estructurales estabilizantes en los bucles de la región determinante de la complementariedad (CDR) lo que incluyen puentes disulfuro entre bucles y patrones de enlaces de hidrógeno intrabucles.
La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y todavía es capaz de reticular el antígeno.
"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio completo de unión a antígeno. En una modalidad, una especie de Fv de doble cadena consiste en un dímero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. En una especie de Fv de cadena sencilla (scFv), un dominio variable de la cadena pesada y uno de la cadena ligera pueden unirse covalentemente mediante un enlazador peptídico flexible de manera que las cadenas ligera y pesada puedan asociarse en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie de Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables (HVR) de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis HVR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab contiene los dominios variables de la cadena pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CHI) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo terminal carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente descripción para el Fab' en el que el(los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson y otros, Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger y otros, PNAS USA 90: 6444­ 6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson y otros, Nat. Med. 9: 129-134 (2003).
"Anticuerpo de dominio único" o "sdAb" o "nanocuerpo" se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en la región variable de una cadena pesada de anticuerpo (dominio VH) o la región variable de una cadena ligera de anticuerpo (dominio VL) (Holt, L., y otros, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490).
Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica única y en cualquier orientación (por ejemplo, VL-VH o VH-VL). Generalmente, el polipéptido scFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de scFv, ver, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, eds. Rosenburg y Moore, (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), págs. 269-315.
En modalidades preferidas, un CAR contemplado en la presente descripción comprende un dominio de unión específico de antígeno que es un scFv y puede ser un scFv murino, humano o humanizado. Los anticuerpos de cadena sencilla pueden clonarse a partir de los genes de la región V de un hibridoma específico para un objetivo deseado. La producción de dichos hibridomas se ha convertido en una rutina. Se ha descrito una técnica que puede usarse para clonar la cadena pesada de la región variable (Vh) y la cadena ligera de la región variable (Vl), por ejemplo, en Orlandi y otros, PNAS, 1989; 86: 3833-3837.
En modalidades particulares, el dominio de unión específico de antígeno es un scFv humanizado que se une a un polipéptido de BCMA humano. Los ejemplos ilustrativos de cadenas pesadas variables que son adecuadas para construir los CAR anti-BCMA contemplados en la presente descripción incluyen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 10-14. Los ejemplos ilustrativos de cadenas ligeras variables que son adecuadas para construir los CAR anti-BCMA contemplados en la presente descripción incluyen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 7-9.
Un dominio de unión específico anti-BCMA humanizado ilustrativo es una región variable de inmunoglobulina específica para BCMA que comprende al menos una región marco humana. Una "región marco humana" se refiere a una región marco de tipo silvestre (es decir, de origen natural) de una región variable de inmunoglobulina humana, una región marco alterada de una región variable de inmunoglobulina humana con menos de aproximadamente 50 % (por ejemplo, preferentemente, menos de aproximadamente 45 %, 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % o 1%) de los aminoácidos en la región eliminados o sustituidos (por ejemplo, con uno o más residuos de aminoácidos de una región marco de inmunoglobulina no humana en las posiciones correspondientes) o una región marco alterada de una región variable de inmunoglobulina no humana con menos de aproximadamente 50 % (por ejemplo, menos de 45 %, 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 %) de los aminoácidos en la región eliminados o sustituidos (por ejemplo, en posiciones de residuos expuestos y/o con uno o más residuos de aminoácidos de una región marco de inmunoglobulina humana en posiciones correspondientes) de modo que, en un aspecto, se reduce la inmunogenicidad.
En ciertas modalidades, una región marco humana es una región marco de tipo silvestre de una región variable de inmunoglobulina humana. En ciertas otras modalidades, una región marco humana es una región marco alterada de una región variable de inmunoglobulina humana con deleciones o sustituciones de aminoácidos en una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más posiciones. En otras modalidades, una región marco humana es una región marco alterada de una región variable de inmunoglobulina no humana con deleciones o sustituciones de aminoácidos en una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más posiciones.
En modalidades particulares, un dominio de unión específico de BCMA comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho regiones marco humanas (FR) seleccionadas de FR1 de la cadena ligera humana, FR1 de la cadena pesada humana, FR2 de la cadena ligera humana, FR2 de la cadena pesada humana, FR3 de la cadena ligera humana, FR3 de la cadena pesada humana, FR4 de la cadena ligera humana y FR4 de la cadena pesada humana.
Las FR humanas que pueden estar presentes en dominios de unión específicos de BCMA también incluyen variantes de las FR ilustrativas proporcionadas en la presente descripción en las que uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos de las FR ilustrativas se han sustituido o eliminado.
En ciertas modalidades, un dominio de unión específico anti-BCMA humanizado comprende (a) una región variable de la cadena ligera humanizada que comprende una FR1 de la cadena ligera humana, una FR2 de la cadena ligera humana, una FR3 de la cadena ligera humana y una FR4 de la cadena ligera humana, y (b) una región variable de la cadena pesada humanizada que comprende una FR1 de la cadena pesada humana, una FR2 de la cadena pesada humana, una FR3 de la cadena pesada humana y una FR4 de la cadena pesada humana.
Los dominios de unión específicos de BCMA proporcionados en la presente descripción también comprenden una, dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR. Dichas CDR pueden ser CDR no humanas o CDR no humanas alteradas seleccionadas de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de la cadena ligera y CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de la cadena pesada. En ciertas modalidades, un dominio de unión específico de BCMA comprende (a) una región variable de la cadena ligera que comprende una CDRL1 de la cadena ligera, una CDRL2 de la cadena ligera y una CDRL3 de la cadena ligera, y (b) una región variable de la cadena pesada que comprende una CDRH1 de la cadena pesada, una CDRH2 de la cadena pesada y una CDRH3 de la cadena pesada.
2. Enlazadores
En ciertas modalidades, los CAR contemplados en la presente descripción pueden comprender residuos enlazadores entre los diversos dominios, por ejemplo, añadidos para el espaciado y la conformación apropiados de la molécula. En modalidades particulares, el enlazador es una secuencia de enlace de la región variable. Una "secuencia de unión de la región variable" es una secuencia de aminoácidos que conecta los dominios de Vh y Vl y proporciona una función espaciadora compatible con la interacción de los dos subdominios de unión para que el polipéptido resultante conserve una afinidad de unión específica con la misma molécula objetivo que un anticuerpo que comprende las mismas regiones variables de la cadena ligera y pesada. Los CAR contemplados en la presente descripción pueden comprender uno, dos, tres, cuatro o cinco o más enlazadores. En modalidades particulares, la longitud de un enlazador es aproximadamente 1 a aproximadamente 25 aminoácidos, aproximadamente 5 a aproximadamente 20 aminoácidos, o aproximadamente 10 a aproximadamente 20 aminoácidos, o cualquier longitud intermedia de aminoácidos. En algunas modalidades, el enlazador es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más aminoácidos de longitud.
Los ejemplos ilustrativos de enlazadores incluyen polímeros de glicina (G)n; polímeros de glicina-serina (G-i-sS-î n, donde n es un número entero de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco; polímeros de glicina-alanina; polímeros de alanina-serina; y otros enlazadores flexibles conocidos en la técnica. Los polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como un enlace neutro entre dominios de proteínas de fusión tales como los CAR descritos en la presente descripción. La glicina accede significativamente más espacio phi-psi que incluso la alanina, y es mucho menos restringida que los residuos con cadenas laterales más largas (ver Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). El experto en la técnica reconocerá que el diseño de un CAR en modalidades particulares puede incluir enlazadores que son total o parcialmente flexibles, de manera que el enlazador puede incluir un enlazador flexible, así como también una o más porciones que confieren una estructura menos flexible para proporcionar una estructura deseada del CAR.
Otros enlazadores ilustrativos incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos: GGG; DGGGS (SEQ ID NO: 46); TGEKP (SEQ ID NO: 47) (ver, por ejemplo, Liu y otros, PNAS 5525-5530 (1997)); GGRR (SEQ ID NO: 48) (Pomerantz y otros, 1995, más arriba); (GGGGS)n en donde = 1, 2, 3, 4 o 5 (SEQ ID nO: 49) (Kim y otros, PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO: 50) (Chaudhary y otros, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 51) (Bird y otros, 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS (SEQ ID NO: 52); LRQRDGERP (SEQ ID NO: 53); LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO: 54); LRQKd(GGGS)2 ERP (SEQ ID NO: 55). Alternativamente, los enlazadores flexibles pueden diseñarse racionalmente mediante el uso de un programa informático capaz de modelar tanto los sitios de unión al ADN como los péptidos mismos (Desjarlais y Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994) o métodos de presentación en fagos. En una modalidad, el enlazador comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 56) (Cooper y otros, Blood, 101(4): 1637-1644 (2003)).
3. Dominio espaciador
En modalidades particulares, el dominio de unión del CAR está seguido por uno o más "dominios espaciadores", que se refiere a la región que aleja el dominio de unión a antígeno de la superficie de la célula efectora para permitir el contacto apropiado célula/célula, la unión a antígeno y la activación (Patel y otros, Gene Therapy, 1999; 6: 412-419). El dominio bisagra puede derivarse de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. En ciertas modalidades, un dominio espaciador es una porción de una inmunoglobulina, lo que incluye una o más regiones constantes de la cadena pesada, por ejemplo, CH2 y CH3. El dominio espaciador puede incluir la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de inmunoglobulina natural o una región bisagra de inmunoglobulina alterada.
En una modalidad, el dominio espaciador comprende los dominios CH2 y CH3 de IgG1 o IgG4.
4. Dominio bisagra
El dominio de unión del CAR generalmente está seguido por uno o más "dominios bisagra", que desempeñan un papel en el posicionamiento del dominio de unión a antígeno lejos de la superficie de la célula efectora para permitir el contacto apropiado célula/célula, la unión a antígeno y la activación. Un CAR generalmente comprende uno o más dominios bisagra entre el dominio de unión y el dominio transmembrana (TM). El dominio bisagra puede derivarse de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. El dominio bisagra puede incluir la secuencia de aminoácidos de una región bisagra de inmunoglobulina natural o una región bisagra de inmunoglobulina alterada. Una "región bisagra alterada" se refiere a (a) una región bisagra de origen natural con hasta 30 % de cambios de aminoácidos (por ejemplo, hasta 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de sustituciones o deleciones de aminoácidos), (b) una porción de una región de bisagra de origen natural que tiene al menos 10 aminoácidos (por ejemplo, al menos 12, 13, 14 o 15 aminoácidos) de longitud con hasta 30 % de cambios de aminoácidos (por ejemplo, hasta 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de sustituciones o deleciones de aminoácidos), o (c) una porción de una región bisagra de origen natural que comprende la región bisagra principal (que puede ser de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos de longitud). En ciertas modalidades, uno o más residuos de cisteína en una región bisagra de inmunoglobulina de origen natural pueden estar sustituidos por uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, uno o más residuos de serina). Una región bisagra de inmunoglobulina alterada puede tener alternativa o adicionalmente un residuo de prolina de una región bisagra de inmunoglobulina de tipo silvestre sustituido por otro residuo de aminoácido (por ejemplo, un residuo de serina).
Los dominios bisagra ilustrativos adecuados para su uso en los CAR descritos en la presente descripción incluyen la región bisagra derivada de las regiones extracelulares de proteínas de membrana de tipo 1 tales como CD8a, CD4, CD28, PD1, CD152 y CD7, que pueden ser regiones bisagra de tipo silvestre de estas moléculas o pueden estar alteradas. En otra modalidad, el dominio bisagra comprende una región bisagra de PD1, CD152 o CD8a.
5. Dominio transmembrana (TM)
El "dominio transmembrana" es la porción del CAR que fusiona la porción de unión extracelular y el dominio de señalización intracelular y ancla el CAR a la membrana plasmática de la célula efectora inmunitaria. El dominio TM puede derivarse de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. El dominio TM puede derivarse (es decir, comprender al menos la(s) región(es) transmembrana) de la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD3£, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 y PD1. En una modalidad particular, el dominio TM es sintético y comprende predominantemente residuos hidrófobos tales como leucina y valina.
En una modalidad, los CAR contemplados en la presente descripción comprenden un dominio TM derivado de PD1, CD152 o CD8a. En otra modalidad, un CAR contemplado en la presente descripción comprende un dominio TM derivado de PD1, CD152 o CD8a y un enlazador oligo o polipeptídico corto, preferentemente, entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud que une el dominio TM y el dominio de señalización intracelular del CAR. Un enlazador de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado.
6. Dominio de señalización intracelular
En modalidades particulares, los CAR contemplados en la presente descripción comprenden un dominio de señalización intracelular. Un "dominio de señalización intracelular" se refiere a la parte de un CAR que participa en la transducción del mensaje de la unión eficaz del CAR anti-BCMA a un polipéptido de BCMA humano en el interior de la célula efectora inmunitaria para provocar la función de la célula efectora, por ejemplo, activación, producción de citocinas, proliferación y actividad citotóxica, lo que incluye la liberación de factores citotóxicos contra la célula objetivo unida al CAR, u otras respuestas celulares provocadas con la unión del antígeno al dominio extracelular del CAR.
El término "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula efectora inmunitaria. La función efectora de la célula T, por ejemplo, puede ser una actividad citolítica o ayuda o actividad que incluye la secreción de una citocina. Por lo tanto, el término "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de la función efectora y que dirige a la célula a realizar una función especializada. Aunque usualmente puede emplearse todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario usar todo el dominio. En la medida en que se usa una porción truncada de un dominio de señalización intracelular, dicha porción truncada puede usarse en lugar del dominio completo siempre que transduzca la señal de la función efectora. El término dominio de señalización intracelular está destinado a incluir cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de la función efectora.
Se conoce que las señales generadas a través del TCR solo son insuficientes para la activación completa de la célula T y que también se requiere una señal secundaria o coestimuladora. Por lo tanto, puede decirse que la activación de las células T está mediada por dos clases distintas de dominios de señalización intracelular: dominios de señalización primaria que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (por ejemplo, un complejo TCR/CD3) y dominios de señalización coestimuladora que actúan en una manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora. En modalidades preferidas, un CAR contemplado en la presente descripción comprende un dominio de señalización intracelular que comprende uno o más "dominios de señalización coestimuladora" y un "dominio de señalización primaria."
Los dominios de señalización primaria regulan la activación primaria del complejo TCR, ya sea de forma estimuladora o inhibitoria. Los dominios de señalización primaria que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina del inmunorreceptor o ITAM.
Los ejemplos ilustrativos de ITAM que contienen dominios de señalización primaria que son de uso particular en la invención incluyen los derivados de TCRZ, FcRy, FcRp, CD3y, CD38, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, cD79b y CD66d. En modalidades preferidas particulares, un CAR comprende un dominio de señalización primaria de CD3Z y uno o más dominios de señalización coestimuladora. Los dominios de señalización primaria intracelular y de señalización coestimuladora pueden estar unidos en cualquier orden en tándem al extremo terminal carboxilo del dominio transmembrana.
Los CAR contemplados en la presente descripción comprenden uno o más dominios de señalización coestimuladora para mejorar la eficacia y la expansión de las células T que expresan los receptores CAR. Como se usa en la presente descripción, el término "dominio de señalización coestimuladora" o "dominio de coestimulación" se refiere a un dominio de señalización intracelular de una molécula coestimuladora. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígenos o receptores de Fc que proporcionan una segunda señal necesaria para la activación y función eficiente de los linfocitos T tras la unión a antígeno. Ejemplos ilustrativos de dichas moléculas coestimuladoras incluyen CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70. En una modalidad, un CAR comprende uno o más dominios de señalización coestimuladora seleccionados del grupo que consiste en CD28, CD137 y CD134, y un dominio de señalización primaria CD3Z
En otra modalidad, un CAR comprende dominios de señalización coestimuladora CD28 y CD137 y un dominio de señalización primaria CD3Z.
En otra modalidad más, un CAR comprende dominios de señalización coestimuladora CD28 y CD134 y un dominio de señalización primaria CD3Z.
En una modalidad, un CAR comprende dominios de señalización coestimuladora CD137 y CD134 y un dominio de señalización primaria CD3Z.
En una modalidad, un CAR comprende un dominio de señalización coestimuladora CD137 y un dominio de señalización primaria CD3Z.
En una modalidad, un CAR comprende un dominio de señalización coestimuladora CD134 y un dominio de señalización primaria CD3Z.
En una modalidad, un CAR comprende un dominio de señalización coestimuladora CD28 y un dominio de señalización primaria CD3Z.
En modalidades particulares, los CAR contemplados en la presente descripción comprenden un anticuerpo anti-BCMA humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de BCMA expresado en células B.
En una modalidad, un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio transmembrana derivado de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD3e, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, Cd 152, CD 154 y PD1; y uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelulares de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70; y un dominio de señalización primaria TCRZ, FcRy, FcRp, CD3y, c D35, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.
En una modalidad, un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra seleccionado del grupo que consiste en: bisagra/CH2/CH3 de IgG1, bisagra/CH2/CH3 de IgG4, una bisagra de PD1, una bisagra de CD152 y una bisagra de CD8a; un dominio transmembrana derivado de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD3e, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 y PD1; y uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelulares de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70; y un dominio de señalización primaria TCRZ, FcRy, FcRp, CD3y, CD38, CD3e, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.
En una modalidad, un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio de bisagra seleccionado del grupo que consiste en: bisagra/CH2/CH3 de IgG1, bisagra/CH2/CH3 de IgG4, una bisagra de PD1, una bisagra de CD152 y una bisagra de CD8a; un dominio transmembrana derivado de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD3e, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 y PD1; un enlazador oligo o polipéptido corto, preferentemente, entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud que une el dominio TM al dominio de señalización intracelular del CAR; y uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelulares de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, La T, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAp7o; y un dominio de señalización primaria Tc Rz, FcRy, FcRp, CD3y, CD38, CD3£, CD3Z, CD22, CD79a, CD79b y CD66d.
En una modalidad particular, un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra que comprende un polipéptido bisagra/CH2/CH3 de IgG1 y un polipéptido CD8a; un dominio transmembrana CD8a que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimuladora intracelular CD137; y un dominio de señalización primaria CD3Z.
En una modalidad particular, un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra que comprende un polipéptido CD8a; un dominio transmembrana CD8a que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular CD134; y un dominio de señalización primaria CD3Z.
En una modalidad particular, un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra que comprende un polipéptido CD8a; un dominio transmembrana CD8a que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular CD28; y un dominio de señalización primaria CD3Z
En una modalidad particular, un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra que comprende un polipéptido de bisagra de PD1; un dominio transmembrana de PD1 o CD152 que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular CD137; y un dominio de señalización primaria CD3Z.
En una modalidad particular, un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra que comprende un polipéptido de bisagra de PD1; un dominio transmembrana de PD1 o CD152 que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular CD134; y un dominio de señalización primaria CD3Z.
En una modalidad particular, un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra que comprende un polipéptido de bisagra de PD1; un dominio transmembrana de PD1 o CD152 que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimuladora intracelular CD28; y un dominio de señalización primaria CD3Z.
En una modalidad particular, un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra que comprende un polipéptido de bisagra CD152; un dominio transmembrana de PD1 o CD152 que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimuladora intracelular CD137; y un dominio de señalización primaria CD3Z.
En una modalidad particular, un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra que comprende un polipéptido de bisagra CD152; un dominio transmembrana de PD1 o CD152 que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimulador intracelular CD134; y un dominio de señalización primaria CD3Z.
En una modalidad particular, un CAR comprende un scFv anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio bisagra que comprende un polipéptido de bisagra CD152; un dominio transmembrana de PD1 o CD152 que comprende un enlazador polipeptídico de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 aminoácidos; un dominio de señalización coestimuladora intracelular CD28; y un dominio de señalización primaria CD3Z.
Además, el diseño de los CAR contemplados en la presente descripción permite una expansión mejorada, persistencia a largo plazo y propiedades citotóxicas en las células T que expresan los CAR en comparación con las células T no modificadas o las células T modificadas para expresar otros CAR.
D. Polipéptidos
La presente invención contempla, en parte, los polipéptidos de CAR y fragmentos de los mismos, las células y las composiciones que los comprenden, y los vectores que expresan los polipéptidos. En modalidades preferidas, se proporciona un polipéptido que comprende uno o más CAR como se expone en cualquiera de las SEQ ID NOs: 15­ 29, 71 y 73.
"Polipéptido", "fragmento de polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente, a menos que se especifique lo contrario, y de acuerdo con el significado convencional, es decir, como una secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos no están limitados a una longitud específica, por ejemplo, pueden comprender una secuencia de proteína de longitud completa o un fragmento de una proteína de longitud completa, y pueden incluir modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como también otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como de origen no natural. En diversas modalidades, los polipéptidos de CAR contemplados en la presente descripción comprenden una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína, que dirige la transferencia de la proteína de manera cotraduccional o postraduccional. Los ejemplos ilustrativos de secuencias señal adecuadas útiles en los CAR descritos en la presente descripción incluyen el polipéptido señal de la cadena pesada de IgG1, un polipéptido señal de CD8a o un polipéptido señal del receptor alfa de GM-CSF humano. Los polipéptidos pueden prepararse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas recombinantes y/o sintéticas bien conocidas. Los polipéptidos contemplados en la presente descripción abarcan específicamente los CAR de la presente descripción, o secuencias que tienen deleciones, adiciones y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de un CAR como se describe en la presente descripción.
Un "péptido aislado" o un "polipéptido aislado" y similares, como se usa en la presente descripción, se refieren al aislamiento y/o purificación in vitro de un péptido o molécula de polipéptido a partir de un entorno celular, y de la asociación con otros componentes de la célula, es decir, no está asociado significativamente con sustancias in vivo. De manera similar, una "célula aislada" se refiere a una célula que se ha obtenido de un tejido u órgano in vivo y está sustancialmente libre de matriz extracelular.
Los polipéptidos incluyen "variantes de polipéptidos". Las variantes de polipéptidos pueden diferir de un polipéptido natural en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Dichas variantes pueden ser de origen natural o pueden generarse sintéticamente, por ejemplo, mediante la modificación de una o más de las secuencias de polipéptidos anteriores. Por ejemplo, en modalidades particulares, puede ser conveniente mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de los CAR mediante la introducción de una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones en un dominio de unión, bisagra, dominio TM, dominio de señalización coestimuladora o dominio de señalización primaria de un polipéptido de CAR. Preferentemente, los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 65 %, 70 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de aminoácidos con estos.
Los polipéptidos incluyen "fragmentos de polipéptidos". Los fragmentos de polipéptidos se refieren a un polipéptido, que puede ser monomérico o multimérico, que tiene una deleción amino terminal, una deleción carboxilo terminal y/o una deleción o sustitución interna de un polipéptido de origen natural o producido recombinantemente. En ciertas modalidades, un fragmento de polipéptido puede comprender una cadena de aminoácidos de al menos 5 a aproximadamente 500 aminoácidos de longitud. Se apreciará que en ciertas modalidades, los fragmentos son de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 aminoácidos de longitud. Los fragmentos de polipéptidos particularmente útiles incluyen dominios funcionales, lo que incluye dominios de unión a antígeno o fragmentos de anticuerpos. En el caso de un anticuerpo anti-BCMA humanizado, los fragmentos útiles incluyen: una región CDR, una región CDR3 de la cadena pesada o ligera; una región variable de una cadena pesada o ligera; una porción de una cadena de anticuerpo o región variable que incluye dos CDR; y similares.
El polipéptido también puede fusionarse en marco o conjugarse con un enlazador u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para potenciar la unión del polipéptido a un soporte sólido.
Como se señaló anteriormente, los polipéptidos de la invención pueden alterarse de diversas maneras, lo que incluye sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones se conocen generalmente en la técnica. Por ejemplo, las variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido de referencia pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de la secuencia de nucleótidos se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel y otros, (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), la patente de Estados Unidos núm. 4,873,192, Watson, J. D. y otros, (Molecular Biology of the Gene, cuarta edición, Benjamin/Cummings, Menlo Park, California, 1987) y las referencias citadas allí. Puede encontrarse orientación sobre las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés en el modelo de Dayhoff y otros, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).
En ciertas modalidades, una variante contendrá sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido no cambien sustancialmente. Pueden realizarse modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención y todavía obtener una molécula funcional que codifique un polipéptido variante o derivado con características convenientes. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear una variante de polipéptido equivalente, o incluso mejorada, de la invención, un experto en la técnica, por ejemplo, puede cambiar uno o más de los codones de la secuencia de ADN codificante, por ejemplo, de acuerdo con la Tabla 1.
TABLA 1-Codones de aminoácidos
Figure imgf000019_0001
Puede encontrarse orientación para determinar qué residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o eliminarse sin abolir la actividad biológica mediante el uso de programas informáticos bien conocidos en la técnica, tales como el software DNASTAR™. Preferentemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteínas descritas en la presente descripción son cambios de aminoácidos conservadores, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados similarmente o no cargados. Un cambio de aminoácido conservador implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos de origen natural se dividen generalmente en cuatro familias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), apolares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En un péptido o proteína, los expertos en esta técnica conocen sustituciones conservadoras adecuadas de aminoácidos y, generalmente, pueden realizarse sin alterar la actividad biológica de una molécula resultante. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de un solo aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (ver, por ejemplo, Watson y otros, Molecular Biology of the Gene, 4a edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224). Las sustituciones conservadoras ilustrativas se describen en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos núm. 61/241,647.
Al realizar tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se comprende generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de sus características de hidrofobicidad y carga (Kyte y Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (­ 0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Se conoce en la técnica que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y todavía dan como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, todavía obtienen una proteína funcionalmente biológica equivalente. Al realizar tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ± 2, se prefieren particularmente aquellos dentro de ± 1, y se prefieren aún más particularmente aquellos dentro de ± 0,5. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse de forma eficaz sobre la base de la hidrofilicidad.
Como se detalla en la Patente de Estados Unidos núm. 4,554,101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y todavía obtener una proteína biológicamente equivalente, y en particular, una proteína inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2, se prefieren particularmente aquellos dentro de ± 1, y se prefieren aún más particularmente aquellos dentro de ± 0,5.
Como se indicó anteriormente, las sustituciones de aminoácidos pueden basarse en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares.
Las variantes de polipéptidos incluyen además formas glucosiladas, conjugados agregativos con otras moléculas y conjugados covalentes con restos químicos no relacionados (por ejemplo, moléculas pegiladas). Las variantes covalentes pueden prepararse mediante la unión de grupos funcionales a grupos que se encuentran en la cadena de aminoácidos o en el residuo N o C-terminal, como se conoce en la técnica. Las variantes incluyen además variantes alélicas, variantes de especies y muteínas. Los truncamientos o deleciones de regiones que no afectan la actividad funcional de las proteínas también son variantes.
En una modalidad, cuando se desea la expresión de dos o más polipéptidos, las secuencias de polinucleótidos que los codifican pueden separarse mediante una secuencia IRES como se analiza en otra parte de la presente descripción. En otra modalidad, dos o más polipéptidos pueden expresarse como una proteína de fusión que comprende una o más secuencias de polipéptidos autoescindibles.
Los polipéptidos de la presente invención incluyen polipéptidos de fusión. En modalidades preferidas, se proporcionan polipéptidos de fusión y polinucleótidos que codifican polipéptidos de fusión, por ejemplo, CAR. Los polipéptidos de fusión y las proteínas de fusión se refieren a un polipéptido que tiene al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez o más segmentos de polipéptidos. Los polipéptidos de fusión están típicamente unidos del extremo C-terminal al extremo N-terminal, aunque también pueden estar unidos del extremo C-terminal al extremo C-terminal, del extremo N-terminal al extremo N-terminal o del extremo N-terminal al extremo C-terminal. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden o en un orden específico. Los polipéptidos de fusión o las proteínas de fusión también pueden incluir variantes modificadas de forma conservadora, variantes polimórficas, alelos, mutantes, subsecuencias y homólogos entre especies, siempre que se mantenga la actividad transcripcional deseada del polipéptido de fusión. Los polipéptidos de fusión pueden producirse por métodos químicos sintéticos o por enlace químico entre los dos restos o generalmente pueden prepararse mediante el uso de otras técnicas estándar. Las secuencias de ADN ligadas que comprenden el polipéptido de fusión están operativamente unidas a elementos de control transcripcionales o traduccionales adecuados como se analiza en otra parte de la presente descripción.
En una modalidad, una pareja de fusión comprende una secuencia que ayuda a expresar la proteína (un potenciador de la expresión) con rendimientos más altos que la proteína recombinante nativa. Pueden seleccionarse otras parejas de fusión para aumentar la solubilidad de la proteína o para permitir que la proteína se dirija a los compartimentos intracelulares deseados o para facilitar el transporte de la proteína de fusión a través de la membrana celular.
Los polipéptidos de fusión pueden comprender además una señal de escisión de polipéptidos entre cada uno de los dominios de polipéptidos descritos en la presente descripción. Además, el sitio del polipéptido puede ponerse en cualquier secuencia peptídica enlazadora. Las señales de escisión de polipéptidos ilustrativas incluyen sitios de reconocimiento de escisión de polipéptidos tales como sitios de escisión de proteasas, sitios de escisión de nucleasas (por ejemplo, sitios de reconocimiento de enzimas de restricción raras, sitios de reconocimiento de ribozimas de autoescisión) y oligopéptidos virales autoescindibles (ver deFelipe y Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26). Los sitios de escisión de proteasas adecuados y los péptidos de autoescisión son conocidos por el experto (ver, por ejemplo, en Ryan y otros, 1997. J. Gener. Virol 78, 699-722; Scymczak y otros, (2004) Nature Biotech. 5, 589-594). Los sitios de escisión de proteasa ilustrativos incluyen los sitios de escisión de proteasas NIa de potyvirus (por ejemplo, proteasa del virus del grabado del tabaco), proteasas HC de potivirus, proteasas PI de potivirus (P35), proteasas NIa de byovirus, proteasas codificadas por ARN-2 de byovirus, proteasas L de aftovirus, proteasas 2A de enterovirus, proteasas 2A de rinovirus, proteasas 3C de picornavirus, proteasas 24K de comovirus, proteasas 24K de nepovirus, proteasa similar a 3C del RTSV (virus esférico del tungro del arroz), proteasa similar a 3C del PYVF (virus de la mancha amarilla de la chirivía), heparina, trombina, factor Xa y enteroquinasa. Debido a su alta rigurosidad de escisión, se prefieren los sitios de escisión de proteasas del TEV (virus del grabado del tabaco) en una modalidad, por ejemplo, EXXYXQ(G/S) (SEQ ID NO: 57), por ejemplo, ENLYFQG (SEQ ID NO: 58) y ENLYFQS (SEQ ID NO: 59), en donde X representa cualquier aminoácido (la escisión por TEV se produce entre Q y G o Q y S).
En una modalidad particular, los péptidos autoescindibles incluyen aquellas secuencias de polipéptidos obtenidas a partir de péptidos 2A de potyvirus y cardiovirus, FMDV (virus de la fiebre aftosa), virus de la rinitis equina A, virus de Thosea asigna y teschovirus porcino.
En ciertas modalidades, el sitio del polipéptido autoescindible comprende un sitio, secuencia o dominio 2A o similar a 2A (Donnelly y otros, 2001. J. Gen. Virol. 82: 1027-1041).
TABLA 2: Los sitios 2A ilustrativos incluyen las siguientes secuencias:
Figure imgf000021_0001
En modalidades preferidas, un polipéptido contemplado en la presente descripción comprende un polipéptido de CAR.
E. Polinucleótidos
En modalidades preferidas, se proporciona un polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos de CAR, por ejemplo, SEQ ID NOs: 30-44, 70 y 72. Como se usa en la presente descripción, los términos "polinucleótido" o "ácido nucleico" se refieren a ARN mensajero (ARNm), ARN, ARN genómico (ARNg), ARN de cadena positiva (ARN(+)), ARN de cadena negativa (Ar N(-)), ADN genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc) o ADN recombinante. Los polinucleótidos incluyen polinucleótidos monocatenarios y bicatenarios. Preferentemente, los polinucleótidos de la invención incluyen polinucleótidos o variantes que tienen al menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a cualquiera de las secuencias de referencia descritas en la presente descripción (ver, por ejemplo, el Listado de secuencias), típicamente donde la variante mantiene al menos una actividad biológica de la secuencia de referencia. En diversas modalidades ilustrativas, la presente invención contempla, en parte, polinucleótidos que comprenden vectores de expresión, vectores virales y plásmidos de transferencia, y composiciones, y células que los comprenden.
En modalidades particulares, los polinucleótidos proporcionados por esta invención codifican al menos aproximadamente 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 o más residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido de la invención, así como también todas las longitudes intermedias. Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias", en este contexto, significa cualquier longitud entre los valores citados, tal como 6, 7, 8, 9, etc., 101, 102, 103, etc.; 151, 152, 153, etc.; 201, 202, 203, etc.
Como se usa en la presente descripción, los términos "variante polinucleotídica" y "variante" y similares se refieren a polinucleótidos que muestran una identidad de secuencia sustancial con una secuencia polinucleotídica de referencia o polinucleótidos que hibridan con una secuencia de referencia en condiciones rigurosas que se definen más adelante. Estos términos incluyen polinucleótidos en los que se han añadido o eliminado uno o más nucleótidos, o se han reemplazado con diferentes nucleótidos en comparación con un polinucleótido de referencia. A este respecto, se entiende bien en la técnica que pueden realizarse ciertas alteraciones que incluyen mutaciones, adiciones, deleciones y sustituciones a un polinucleótido de referencia de manera que el polinucleótido alterado retiene la función o actividad biológica del polinucleótido de referencia.
Las frases "identidad de secuencia" o, por ejemplo, que comprende una "secuencia 50 % idéntica a", como se usa en la presente descripción, se refieren al grado en que las secuencias son idénticas sobre la base nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido a lo largo de una ventana de comparación. Por lo tanto, puede calcularse un "porcentaje de identidad de secuencia" mediante la comparación de dos secuencias alineadas óptimamente en la ventana de comparación, al determinar el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) se produce en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicar el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Se incluyen nucleótidos y polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a cualquiera de las secuencias de referencia descritas en la presente descripción, típicamente donde la variante de polipéptido mantiene al menos una actividad biológica del polipéptido de referencia.
Los términos utilizados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" tiene una longitud de al menos 12 pero con frecuencia 15 a 18 y a menudo, al menos 25 unidades monoméricas, incluidos nucleótidos y residuos de aminoácidos. Debido a que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, solo una porción de la secuencia completa de polinucleótidos) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente mediante la comparación de las secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, generalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más generalmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el que se compara una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después que las dos secuencias están alineadas de manera óptima. La ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) de aproximadamente el 20 % o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de las secuencias para alinear una ventana de comparación puede llevarse a cabo mediante implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTa en Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, EE. UU.) o por inspección y el mejor alineamiento (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología en la ventana de comparación) es generado por cualquiera de los diversos métodos seleccionados. También puede hacerse referencia a la familia de programas BLAST como se describe por ejemplo por Altschul y otros, 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. Puede encontrarse una discusión detallada del análisis de secuencia en la Unidad 19.3 de Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Capítulo 15.
Como se usa en la presente descripción, “polinucleótido aislado” se refiere a un polinucleótido que se ha purificado a partir de las secuencias que lo flanquean en un estado de origen natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha eliminado de las secuencias que normalmente están adyacentes al fragmento. Un "polinucleótido aislado" también se refiere a un ADN complementario (ADNc), un ADN recombinante u otro polinucleótido que no existe en la naturaleza y que se ha elaborado por la mano del hombre.
Los términos que describen la orientación de los polinucleótidos incluyen: 5' (normalmente el extremo del polinucleótido que tiene un grupo fosfato libre) y 3' (normalmente el extremo del polinucleótido que tiene un grupo hidroxilo (OH) libre). Las secuencias de polinucleótidos pueden anotarse en la orientación 5' a 3' o en la orientación 3' a 5'. Para el ADN y el ARNm, la cadena 5' a 3' se denomina cadena "sentido", "positiva" o "codificante" porque su secuencia es idéntica a la secuencia del premensajero (ARNprem) [excepto para uracilo (U) en el ARN, en lugar de timina (T) en el ADN]. Para el ADN y el ARNm, la cadena complementaria 3' a 5' que es la cadena transcrita por la ARN polimerasa se designa como cadena "molde", "antisentido", "negativa" o "no codificante". Como se usa en la presente descripción, el término "orientación inversa" se refiere a una secuencia 5' a 3' escrita en la orientación 3' a 5' o una secuencia 3' a 5' escrita en la orientación 5' a 3'.
Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a los polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la cadena complementaria de la secuencia de ADN 5' A G T C A T G 3' es 3' T C A G T A C 5'. La última secuencia a menudo se escribe como complemento inverso con el extremo 5' a la izquierda y el extremo 3' a la derecha, 5' C A T G A C T 3'. Se dice que una secuencia que es igual a su complemento inverso es una secuencia palindrómica. La complementariedad puede ser "parcial", en la que solo algunas de las bases de los ácidos nucleicos se emparejan de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases. O puede haber complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos.
Además, los expertos en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido, o fragmento de variante del mismo, como se describe en la presente descripción. Algunos de estos polinucleótidos tienen una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, la presente invención contempla específicamente polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones, por ejemplo, polinucleótidos que están optimizados para la selección de codones en humanos y/o primates. Además, también pueden usarse los alelos de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en la presente descripción. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos.
El término "casete de ácido nucleico", como se usa en la presente descripción, se refiere a secuencias genéticas dentro de un vector que puede expresar un ARN, y posteriormente una proteína. El casete de ácido nucleico contiene el gen de interés, por ejemplo, un CAR. El casete de ácido nucleico está orientado posicionalmente y secuencialmente dentro del vector de manera que el ácido nucleico en el casete pueda transcribirse en ARN y, cuando sea necesario, traducirse en una proteína o polipéptido, experimentar las modificaciones postraduccionales apropiadas requeridas para la actividad en la célula transformada, y se trasladará al compartimento apropiado para la actividad biológica mediante el direccionamiento a compartimentos intracelulares apropiados o la secreción hacia compartimentos extracelulares. Preferentemente, el casete tiene sus extremos 3' y 5' adaptados para una fácil inserción en un vector, por ejemplo, tiene sitios de endonucleasa de restricción en cada extremo. En una modalidad preferida de la invención, el casete de ácido nucleico contiene la secuencia de un receptor antigénico quimérico usado para tratar una neoplasia maligna de las células B. El casete puede extraerse e insertarse en un plásmido o vector viral como una sola unidad.
En modalidades particulares, los polinucleótidos incluyen al menos un polinucleótido de interés. Como se usa en la presente descripción, el término "polinucleótido de interés" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido (es decir, un polipéptido de interés), insertado en un vector de expresión que se desea expresar. Un vector puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 polinucleótidos de interés. En ciertas modalidades, el polinucleótido de interés codifica un polipéptido que proporciona un efecto terapéutico en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno. Los polinucleótidos de interés y los polipéptidos codificados a partir de ellos incluyen polinucleótidos que codifican polipéptidos de tipo silvestre, así como también variantes funcionales y fragmentos de los mismos. En modalidades particulares, una variante funcional tiene al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % de identidad con respecto a un polinucleótido de referencia o secuencia de polipéptido de tipo silvestre correspondiente. En ciertas modalidades, una variante o fragmento funcional tiene al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 % o al menos 90 % de una actividad biológica de un polipéptido de tipo silvestre correspondiente.
En una modalidad, el polinucleótido de interés no codifica un polipéptido pero sirve como molde para transcribir ARNmi, ARNip o ARNhc, ribozima u otro ARN inhibidor. En diversas otras modalidades, un polinucleótido comprende un polinucleótido de interés que codifica un CAR y uno o más polinucleótidos de interés adicionales, lo que incluye una secuencia inhibidora de ácido nucleico que incluye: un ARNip, un ARNmi, un ARNhc y una ribozima.
Como se usa en la presente descripción, los términos "ARNip" o "ARN de interferencia corto" se refieren a una secuencia polinucleotídica corta que media en un proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia, inhibición de la traducción, inhibición de la transcripción o ARNi epigenético en animales (Zamore y otros, 2000, Cell, 101, 25-33; Fire y otros, 1998, Nature, 391, 806; Hamilton y otros, 1999, Science, 286, 950-951; Lin y otros, 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13, 139-141; y Strauss, 1999, Science, 286, 886). En ciertas modalidades, un ARNip comprende una primera hebra y una segunda hebra que tienen el mismo número de nucleósidos; sin embargo, la primera y la segunda hebras están desplazadas de manera que los dos nucleósidos terminales de la primera y la segunda hebras no se emparejan con un residuo en la hebra complementaria. En ciertos casos, los dos nucleósidos que no están emparejados son residuos de timidina. El ARNip debe incluir una región de suficiente homología con el gen objetivo, y tener una longitud suficiente en términos de nucleótidos, de modo que el ARNip, o un fragmento del mismo, pueda mediar la regulación negativa del gen objetivo. Por lo tanto, un ARNip incluye una región que es al menos parcialmente complementaria al ARN objetivo. No es necesario que exista una complementariedad perfecta entre el ARNip y el objetivo, pero la correspondencia debe ser suficiente para permitir que el ARNip, o un producto de escisión del mismo, dirija el silenciamiento específico de la secuencia, tal como por escisión del ARNi del ARN objetivo. La complementariedad, o el grado de homología con la hebra objetivo, es más crítica en la hebra antisentido. Aunque a menudo se desea una complementariedad perfecta, particularmente en la hebra antisentido, algunas modalidades incluyen uno o más, pero preferentemente 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o menos emparejamientos erróneos con respecto al ARN objetivo. Los emparejamientos erróneos se toleran más en las regiones terminales y, si están presentes, se encuentran preferentemente en una región o regiones terminales, por ejemplo, dentro de 6, 5, 4 o 3 nucleótidos del extremo 5' y/o 3'. La hebra sentido sólo necesita ser suficientemente complementaria con la hebra antisentido para mantener el carácter global de doble hebra de la molécula.
Además, un ARNip puede modificarse o incluir análogos de nucleósidos. Las regiones monocatenarias de un ARNip pueden modificarse o incluir análogos de nucleósidos, por ejemplo, la región o regiones no apareadas de una estructura en horquilla, por ejemplo, una región que une dos regiones complementarias, puede tener modificaciones o análogos de nucleósidos. También es útil la modificación para estabilizar uno o más extremos 3' o 5' de un ARNip, por ejemplo, contra exonucleasas, o para favorecer que el agente ARNip antisentido entre en RISC. Las modificaciones pueden incluir enlazadores amino C3 (o C6, C7, C12), enlazadores tiol, enlazadores carboxilo, espaciadores no nucleotídicos (C3, C6, C9, C12, abásico, trietilenglicol, hexaetilenglicol), reactivos especiales de biotina o fluoresceína que vienen como fosforamiditas y que tienen otro grupo hidroxilo protegido por DMT, lo que permite múltiples acoplamientos durante la síntesis de ARN. Cada hebra de un ARNip puede tener una longitud igual o menor que 30, 25, 24, 23, 22, 21 o 20 nucleótidos. La hebra tiene, preferentemente, al menos 19 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada hebra puede tener entre 21 y 25 nucleótidos de longitud. Los ARNip preferidos tienen una región dúplex de 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 o 25 pares de nucleótidos, y uno o más salientes de 2-3 nucleótidos, preferentemente, uno o dos salientes 3', de 2-3 nucleótidos.
Como se usa en la presente descripción, los términos "ARNmi" o "microARN" se refieren a pequeños ARN no codificantes de 20-22 nucleótidos, típicamente escindidos a partir de estructuras precursoras de ARN replegado de ~70 nucleótidos conocidas como pre-ARNmi. Los ARNmi regulan negativamente sus objetivos en una de dos formas en dependencia del grado de complementariedad entre el ARNmi y el objetivo. En primer lugar, los ARNmi que se unen con una complementariedad perfecta o casi perfecta a las secuencias de ARNm que codifican proteínas inducen la vía de interferencia mediada por ARN (ARNi). Los ARNmi que ejercen sus efectos reguladores al unirse a sitios complementarios imperfectos dentro de las regiones no traducidas (UTR) 3' de sus objetivos de ARNm, reprimen la expresión del gen objetivo postranscripcionalmente, aparentemente a nivel de traducción, a través de un complejo RISC que es similar a, o posiblemente idéntico al que se usa para la vía del ARNi. De acuerdo con el control de la traducción, los ARNmi que usan este mecanismo reducen los niveles de proteína de sus genes objetivo, pero los niveles de ARNm de estos genes solo se ven afectados mínimamente. Los ARNmi abarcan tanto ARNmi de origen natural como ARNmi diseñados artificialmente que pueden dirigirse específicamente a cualquier secuencia de ARNm. Por ejemplo, en una modalidad, el experto en la técnica puede diseñar constructos de ARN de horquilla corta expresados como transcritos primarios de ARNmi humano (por ejemplo, miR-30 o miR-21). Este diseño añade un sitio de procesamiento de Drosha al constructo de horquilla y se ha demostrado que aumenta en gran medida la eficiencia de la inactivación (Pusch y otros, 2004). El tallo en horquilla consiste en 22 nt de ARNds (por ejemplo, el antisentido tiene una complementariedad perfecta con el objetivo deseado) y un bucle de 15-19 nt de un miR humano. La adición del bucle miR y las secuencias flanqueantes de miR30 en uno o ambos lados de la horquilla da como resultado un aumento de más de 10 veces en el procesamiento de Drosha y Dicer de las horquillas expresadas en comparación con los diseños convencionales de ARNhc sin microARN. Un mayor procesamiento de Drosha y Dicer se traduce en una mayor producción de ARNip/ARNmi y una mayor potencia para las horquillas expresadas.
Como se usa en la presente descripción, los términos "ARNhc" o "ARN de horquilla corta" se refieren a una estructura de doble hebra que está formada por una única hebra de ARN autocomplementaria. Se prefieren para la inhibición los constructos de ARNhc que contienen una secuencia de nucleótidos idéntica a una porción, de secuencia codificante o no codificante, del gen objetivo. También se ha encontrado que las secuencias de ARN con inserciones, deleciones y mutaciones puntuales con respecto a la secuencia objetivo son eficaces para la inhibición. Se prefiere una identidad de secuencia superior al 90 %, o incluso una identidad de secuencia del 100 %, entre el ARN inhibidor y la porción del gen objetivo. En ciertas modalidades preferidas, la longitud de la porción de formación de dúplex de un ARNhc es de al menos 20, 21 o 22 nucleótidos de longitud, por ejemplo, correspondiente en tamaño a los productos de ARN producidos por escisión dependiente de Dicer. En ciertas modalidades, el constructo de ARNhc tiene una longitud de al menos 25, 50, 100, 200, 300 o 400 bases. En ciertas modalidades, el constructo de ARNhc tiene una longitud de 400-800 bases. Los constructos de ARNhc son altamente tolerantes a la variación en la secuencia del bucle y el tamaño del bucle.\
Como se usa en la presente descripción, el término "ribozima" se refiere a una molécula de ARN catalíticamente activa capaz de escisión específica de sitio del ARNm objetivo. Se han descrito varios subtipos, por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo y de horquilla. La actividad catalítica y la estabilidad de las ribozimas pueden mejorarse al sustituir desoxirribonucleótidos por ribonucleótidos en bases no catalíticas. Aunque pueden usarse ribozimas que escinden el ARNm en secuencias de reconocimiento específicas de sitio para destruir ARNm particulares, se prefiere el uso de ribozimas de cabeza de martillo. Las ribozimas de cabeza de martillo escinden los ARNm en ubicaciones dictadas por regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarios con el ARNm objetivo. El único requisito es que el ARNm objetivo tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construcción y producción de ribozimas de cabeza de martillo se conoce bien en la técnica.
Un método preferido de administración de un polinucleótido de interés que comprende un ARNip, un ARNmi, un ARNhc o una ribozima comprende una o más secuencias reguladoras, tales como, por ejemplo, una pol III constitutiva fuerte, por ejemplo, el promotor U6 de ARNpn humano, el promotor U6 de ARNpn de ratón, el promotor HI de ARN humano y de ratón y el promotor val de ARNt humano, o un promotor de pol II constitutivo fuerte, como se describe en otra parte de la presente descripción.
Los polinucleótidos de la presente invención, independientemente de la longitud de la secuencia codificante en sí misma, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores y/o potenciadores, regiones no traducidas (UTR), secuencias señal, secuencias de Kozak, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiples, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), sitios de reconocimiento de recombinasas (por ejemplo, sitios LoxP, FRT y Att), codones de terminación, señales de terminación transcripcional y polinucleótidos que codifican polipéptidos autoescindibles, etiquetas de epítopos, como se describe en otra parte de la presente descripción o como se conoce en la técnica, de manera que su longitud total puede variar considerablemente. Por lo tanto, se contempla que se pueda emplear un fragmento de polinucleótido de casi cualquier longitud, de manera que la longitud total preferentemente está limitada por la facilidad de preparación y uso en el protocolo previsto de ADN recombinante.
Los polinucleótidos pueden prepararse, manipularse y/o expresarse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas conocidas y disponibles en la técnica. Para expresar un polipéptido deseado, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido puede insertarse en el vector apropiado. Ejemplos de vectores son plásmidos, secuencias de replicación autónoma y elementos transponibles. Los vectores ilustrativos adicionales incluyen, plásmidos, fagémidos, cósmidos, cromosomas artificiales tales como el cromosoma artificial de levadura (YAC), el cromosoma artificial bacteriano (BAC) o el cromosoma artificial derivado de PI (PAC), bacteriófagos tales como el fago lambda o el fago M13 y virus animales. Los ejemplos de categorías de virus animales útiles como vectores incluyen, retrovirus (incluidos los lentivirus), adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple), poxvirus, baculovirus, papilomavirus y papovavirus (por ejemplo, SV40). Ejemplos de vectores de expresión son los vectores pClneo (Promega) para la expresión en células de mamíferos; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ y pLenti6.2/V5-GW/lacZ (Invitrogen) para la transferencia y expresión génica mediada por lentivirus en células de mamíferos. En modalidades particulares, las secuencias codificantes de las proteínas quiméricas descritas en la presente descripción pueden ligarse en dichos vectores de expresión para la expresión de la proteína quimérica en células de mamífero.
En modalidades particulares, el vector es un vector episomal o un vector que se mantiene extracromosómicamente. Como se usa en la presente descripción, el término "episomal" se refiere a un vector que es capaz de replicarse sin integración en el a Dn cromosómico del huésped y sin pérdida gradual de una célula huésped en división, lo que también significa que dicho vector se replica extracromosómicamente o episómicamente. El vector se modifica genéticamente para albergar la secuencia que codifica el origen de la replicación del ADN u "ori" de un virus del herpes linfotrófico o un virus del herpes gamma, un adenovirus, SV40, un virus del papiloma bovino, o una levadura, específicamente un origen de replicación de un virus del herpes linfotrófico o un herpesvirus gamma correspondiente al oriP del EBV. En un aspecto particular, el virus del herpes linfotrófico puede ser el virus de Epstein Barr (EBV), el virus del herpes del sarcoma de Kaposi (KSHV), el virus del herpes saimiri (HS) o el virus de la enfermedad de Marek (MDV). El virus de Epstein Barr (EBV) y el virus del herpes del sarcoma de Kaposi (KSHV) también son ejemplos de un herpesvirus gamma. Típicamente, la célula huésped comprende la proteína transactivadora de replicación viral que activa la replicación.
Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión son aquellas regiones no traducidas del vector: origen de replicación, casetes de selección, promotores, potenciadores, señales de iniciación de traducción (secuencia de Shine Dalgarno o secuencia de Kozak) intrones, una secuencia de poliadenilación, regiones no traducidas 5' y 3', que interactúan con las proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción y la traducción. Dichos elementos pueden variar en su resistencia y especificidad. En dependencia del sistema de vectores y del huésped utilizado, puede usarse cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluidos promotores ubicuos y promotores inducibles.
En modalidades particulares, un vector para su uso en la práctica de la invención lo que incluye, pero no se limita a vectores de expresión y vectores virales, incluirá secuencias de control exógenas, endógenas o heterólogas tales como promotores y/o potenciadores. Una secuencia de control "endógena" es aquella que está naturalmente ligada a un gen dado en el genoma. Una secuencia de control "exógena" es aquella que se coloca en yuxtaposición a un gen mediante manipulación genética (es decir, técnicas de biología molecular) de modo que la transcripción de ese gen es dirigida por el potenciador/promotor vinculado. Una secuencia de control "heteróloga" es una secuencia exógena que es de una especie diferente a la célula que se manipula genéticamente.
El término "promotor", como se usa en la presente descripción, se refiere a un sitio de reconocimiento de un polinucleótido (ADN o ARN) al que se une una ARN polimerasa. Una ARN polimerasa inicia y transcribe polinucleótidos unidos operativamente al promotor. En modalidades particulares, los promotores operativos en células de mamífero comprenden una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases aguas arriba del sitio donde se inicia la transcripción y/u otra secuencia encontrada 70 a 80 bases aguas arriba del inicio de la transcripción, una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido.
El término "potenciador" se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar una transcripción potenciada y en algunos casos puede funcionar independientemente de su orientación con respecto a otra secuencia de control. Un potenciador puede funcionar de forma cooperativa o aditiva con promotores y/u otros elementos potenciadores. El término "promotor/potenciador" se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias que pueden proporcionar funciones tanto de promotor como de potenciador.
El término "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. En una modalidad, el término se refiere a una unión funcional entre una secuencia de control de la expresión del ácido nucleico (tal como un promotor y/o potenciador) y una segunda secuencia de polinucleótido, por ejemplo, un polinucleótido de interés, en donde la secuencia de control de la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
Como se usa en la presente descripción, el término "secuencia de control de expresión constitutiva" se refiere a un promotor, potenciador o promotor/potenciador que permite constantemente y continuamente la transcripción de una secuencia unida operativamente. Una secuencia de control de expresión constitutiva puede ser un promotor, potenciador o promotor/potenciador "ubicuos" que permite la expresión en una amplia variedad de tipos de células y tejidos o un promotor, potenciador o promotor/potenciador "específico de célula", "específico de un tipo de célula", "específico de un linaje celular" o "específico de tejido" que permite la expresión en una variedad restringida de tipos de células y tejidos, respectivamente.
Las secuencias de control de la expresión ubicuas ilustrativas adecuadas para su uso en modalidades particulares de la invención incluyen, pero no se limitan a, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un virus de los simios 40 (SV40) (por ejemplo, temprano o tardío), un promotor LTR del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), un LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), un promotor (timidina quinasa) del virus del herpes simple (HSV), promotores H5, P7.5 y P11 del virus vaccinia, un promotor del factor de alargamiento 1 -alfa (EF1a), respuesta de crecimiento temprano 1 (EGR1), ferritina H (FerH), ferritina L (FerL), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), factor de iniciación de la traducción eucariota 4A1 (EIF4A1), proteína 5 de choque térmico de 70 kDa (HSPA5), proteína beta de choque térmico de 90 kDa, miembro 1 (HSP90B 1), proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP70), p-kinesina (p-KIN), el locus ROSA 26 humano (Irions y otros, Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), un promotor de Ubiquitina C (UBC), un promotor de fosfoglicerato quinasa-1 (PGK), un potenciador de citomegalovirus/promotor de p-actina de pollo (cAg ), un promotor de p-actina y un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor sustituido con sitio de unión a cebador de dl587rev (MND) (Challita y otros, J Virol. 69(2):748-55 (1995)).
En una modalidad, un vector de la invención comprende un promotor de MND.
En una modalidad, un vector de la invención comprende un promotor de EFla que comprende el primer intrón del gen EF1a humano.
En una modalidad, un vector de la invención comprende un promotor de EFla que carece del primer intrón del gen EF1a humano.
En una modalidad particular, puede ser conveniente expresar un polinucleótido que comprenda un CAR a partir de un promotor específico de células T.
Como se usa en la presente descripción, "expresión condicional" puede referirse a cualquier tipo de expresión condicional que incluye, pero no se limita a, expresión inducible; expresión reprimible; expresión en células o tejidos que tienen un estado fisiológico, biológico o patológico particulares, etc. Esta definición no pretende excluir la expresión específica de tejido o del tipo de célula. Ciertas modalidades de la invención proporcionan la expresión condicional de un polinucleótido de interés, por ejemplo, la expresión se controla al someter a una célula, tejido, organismo, etc., a un tratamiento o condición que provoque que el polinucleótido se exprese o que provoque un aumento o disminución en la expresión del polinucleótido codificado por el polinucleótido de interés.
Los ejemplos ilustrativos de promotores/sistemas inducibles incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles con esteroides tales como promotores para genes que codifican receptores de glucocorticoides o estrógenos (inducibles por tratamiento con la hormona correspondiente), promotor de metalotionina (inducible por tratamiento con diversos metales pesados), promotor de MX-1 (inducible por interferón), el sistema regulable de mifepristona "GeneSwitch" (Sirin y otros, 2003, Gene, 323:67), el interruptor génico inducible por cumato (documento WO 2002/088346), sistemas reguladores dependientes de tetraciclina, etc.
La expresión condicional también puede lograrse mediante el uso de una recombinasa de ADN específica de sitio. De acuerdo con ciertas modalidades de la invención, el vector comprende al menos un (típicamente dos) sitio(s) para la recombinación mediada por una recombinasa específica de sitio. Como se usa en la presente descripción, los términos "recombinasa" o "recombinasa específica de sitio" incluyen proteínas, enzimas, cofactores o proteínas asociadas de escisión o integradoras que están implicadas en reacciones de recombinación que implican uno o más sitios de recombinación (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, siete, diez, doce, quince, veinte, treinta, cincuenta, etc.), que pueden ser proteínas de tipo silvestre (ver Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)), o mutantes, derivados (por ejemplo, proteínas de fusión que contienen las secuencias de proteínas de recombinación o fragmentos de las mismas), fragmentos y variantes de los mismos. Los ejemplos ilustrativos de recombinasas adecuadas para su uso en modalidades particulares de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, OC31, Cin, Tn3 resolvasa, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1, y ParA.
Los vectores pueden comprender uno o más sitios de recombinación para cualquiera de una amplia variedad de recombinasas específicas de sitio. Debe entenderse que el sitio objetivo para una recombinasa específica de sitio es además de cualquier sitio(s) requerido(s) para la integración de un vector, por ejemplo, un vector retroviral o un vector lentiviral. Como se usa en la presente descripción, los términos "secuencia de recombinación", "sitio de recombinación" o "sitio de recombinación específica de sitio" se refieren a una secuencia de ácido nucleico particular a la que una recombinasa reconoce y se une.
Por ejemplo, un sitio de recombinación para la recombinasa Cre es loxP, que es una secuencia de 34 pares de bases que comprende dos repeticiones invertidas de 13 pares de bases (que sirven como sitios de unión de recombinasa) que flanquean una secuencia de núcleo de 8 pares de bases (ver Figura 1 de Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)). Otros sitios loxP ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: lox511 (Hoess y otros, 1996; Bethke y Sauer, 1997), lox5171 (Lee y Saito, 1998), lox2272 (Lee y Saito, 1998), m2 (Langer y otros, 2002), lox71 (Albert y otros, 1995) y lox66 (Albert y otros, 1995).
Los sitios de reconocimiento adecuados para la recombinasa FLP incluyen, pero no se limitan a: FRT (McLeod, y otros, 1996), F1, F2, F3 (Schlake y Bode, 1994), F4, F5 (Schlake y Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff y otros, 1988), FRT(RE) (Senecoff y otros, 1988).
Otros ejemplos de secuencias de reconocimiento son las secuencias attB, attP, attL y attR, que son reconocidas por la enzima recombinasa A Integrasa, por ejemplo, phi-c31. El 0C31 SSR media la recombinación sólo entre los sitios heterotípicos attB (34 pb de longitud) y attP (39 pb de longitud) (Groth y otros, 2000). attB y attP, llamados así por los sitios de unión de la integrasa del fago en los genomas bacterianos y de fago, respectivamente, contienen repeticiones invertidas imperfectas que probablemente estén unidas por homodímeros 0C31 (Groth y otros, 2000). Los sitios del producto, attL y attR, son eficazmente inertes para la recombinación adicional mediada por 0C31 (Belteki y otros, 2003), lo que hace que la reacción sea irreversible. Para catalizar las inserciones, se ha encontrado que el ADN que lleva attB se inserta en un sitio attP genómico más fácilmente que un sitio attP en un sitio attB genómico (Thyagarajan y otros, 2001; Belteki y otros, 2003). Por lo tanto, las estrategias típicas posicionan mediante recombinación homóloga un "sitio de acoplamiento" que porta attP en un locus definido, que después se asocia con una secuencia entrante que porta attB para la inserción.
Como se usa en la presente descripción, un "sitio interno de entrada al ribosoma" o "IRES" se refiere a un elemento que promueve la entrada de ribosoma interno directo al codón de iniciación, tal como ATG, de un cistrón (una región que codifica una proteína), lo que conduce de esta manera a la traducción independiente de cap del gen. Ver, por ejemplo, Jackson y otros, 1990. Trends Biochem Sci 15(12): 477-83) y Jackson y Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000. En modalidades particulares, los vectores contemplados por la invención incluyen uno o más polinucleótidos de interés que codifican uno o más polipéptidos. En modalidades particulares, para lograr una traducción eficiente de cada uno de la pluralidad de polipéptidos, las secuencias de polinucleótidos pueden separarse mediante una o más secuencias de IRES o secuencias de polinucleótidos que codifican polipéptidos autoescindibles.
Como se usa en la presente descripción, el término "secuencia de Kozak" se refiere a una secuencia de nucleótidos corta que facilita en gran medida la unión inicial de ARNm a la subunidad pequeña del ribosoma y aumenta la traducción. La secuencia consenso de Kozak es (GCC)RCCATGG, donde R es una purina (A o G) (Kozak, 1986. Cell. 44(2): 283-92, y Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20): 8125-48). En modalidades particulares, los vectores contemplados por la invención, comprenden polinucleótidos que tienen una secuencia consenso de Kozak y que codifican un polipéptido deseado, por ejemplo, un CAR.
En algunas modalidades de la invención, un polinucleótido o una célula que alberga el polinucleótido utiliza un gen suicida, lo que incluye un gen suicida inducible para reducir el riesgo de toxicidad directa y/o proliferación incontrolada. En aspectos específicos, el gen suicida no es inmunogénico para el huésped que alberga el polinucleótido o la célula. Un cierto ejemplo de un gen suicida que puede usarse es caspasa-9 o caspasa-8 o citosina desaminasa. La caspasa-9 puede activarse mediante el uso de un inductor químico específico de dimerización (CID).
En ciertas modalidades, los vectores comprenden segmentos de genes que provocan que las células efectoras inmunitarias de la invención, por ejemplo, las células T, sean susceptibles a la selección negativa in vivo. Por "selección negativa" se entiende que la célula infundida puede eliminarse como resultado de un cambio en la condición in vivo del individuo. El fenotipo seleccionable negativo puede ser el resultado de la inserción de un gen que confiere sensibilidad a un agente administrado, por ejemplo, un compuesto. Los genes seleccionables negativos se conocen en la técnica e incluyen, entre otros, los siguientes: el gen de timidina quinasa de tipo I del virus del Herpes simple (HSV-I TK) (Wigler y otros, Cell 11: 223, 1977) que confiere sensibilidad al ganciclovir; el gen de la hipoxantina fosfribosiltransferasa celular (HPRT), el gen de la adenina fosforribosiltransferasa celular (APRT) y la citosina desaminasa bacteriana, (Mullen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 33 (1992)).
En algunas modalidades, las células efectoras inmunitarias genéticamente modificadas, tales como las células T, comprenden un polinucleótido que comprende además un marcador positivo que permite la selección de células del fenotipo seleccionable negativo in vitro. El marcador seleccionable positivo puede ser un gen que, al introducirse en la célula huésped, expresa un fenotipo dominante que permite la selección positiva de células portadoras del gen. Los genes de este tipo se conocen en la técnica e incluyen, entre otros, el gen de la higromicina-B fosfotransferasa (hph) que confiere resistencia a la higromicina B, el gen de la aminoglicósido fosfotransferasa (neo o aph) de Tn5 que codifica la resistencia al antibiótico G418, el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR), el gen de la adenosina desaminasa (ADA) y el gen de la resistencia a múltiples fármacos (MDR).
Preferentemente, el marcador seleccionable positivo y el elemento seleccionable negativo están enlazados de manera que la pérdida del elemento seleccionable negativo también necesariamente va acompañada por la pérdida del marcador seleccionable positivo. Aún con mayor preferencia, los marcadores seleccionables positivos y negativos se fusionan de modo que la pérdida de uno conduce obligatoriamente a la pérdida del otro. Un ejemplo de un polinucleótido fusionado que produce como un producto de expresión un polipéptido que confiere las características de selección tanto positivas como negativas deseadas descritas anteriormente es un gen de fusión de higromicina fosfotransferasa timidina quinasa (HyTK). La expresión de este gen produce un polipéptido que confiere resistencia a higromicina B para la selección positiva in vitro y sensibilidad a ganciclovir para la selección negativa in vivo. Ver Lupton S. D. y otros, Mol. and Cell. Biology 11: 3374-3378, 1991. Además, en modalidades preferidas, los polinucleótidos de la invención que codifican los receptores quiméricos están en vectores retrovirales que contienen el gen fusionado, particularmente aquellos que confieren resistencia a higromicina B para la selección positiva in vitro, y sensibilidad a ganciclovir para la selección negativa in vivo, por ejemplo el vector retrovira1HyTK descrito en Lupton, S. D. y otros, (1991), supra. Ver también las publicaciones de PCT US91/08442 y PCT/US94/05601, por S. D. Lupton, que describen el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de marcadores seleccionables positivos dominantes con marcadores seleccionables negativos.
Los marcadores seleccionables positivos preferidos se derivan de genes seleccionados del grupo que consiste en hph, nco y gpt, y los marcadores seleccionables negativos preferidos se derivan de genes seleccionados del grupo que consiste en citosina desaminasa, HSV-I TK, VZV t K, HPRT, APRT y gpt. Los marcadores especialmente preferidos son genes de fusión seleccionables bifuncionales en los que el marcador seleccionable positivo se deriva de hph o neo, y el marcador seleccionable negativo se deriva de citosina desaminasa o un gen TK o marcador seleccionable. Genes de suicidio inducible
F. Vectores virales
En modalidades particulares, una célula (por ejemplo, una célula efectora inmunitaria) se transduce con un vector retroviral, por ejemplo, un vector lentiviral, que codifica un CAR. Por ejemplo, una célula efectora inmunitaria se transduce con un vector que codifica un CAR que comprende un anticuerpo anti-BCMA humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un polipéptido de BCMA, con un dominio de señalización intracelular CD3Z, CD28, 4-1BB, Ox40, o cualquier combinación de los mismos. Por lo tanto, estas células transducidas pueden provocar una respuesta citotóxica mediada por CAR.
Los retrovirus son una herramienta común para el suministro de genes (Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). En modalidades particulares, se usa un retrovirus para administrar un polinucleótido que codifica un receptor antigénico quimérico (CAR) a una célula. Como se usa en la presente descripción, el término "retrovirus" se refiere a un virus de ARN que transcribe inversamente su ARN genómico en una copia lineal de ADN de doble cadena y posteriormente integra covalentemente su ADN genómico en un genoma del huésped. Una vez que el virus se integra en el genoma del huésped, se denomina "provirus". El provirus sirve como un molde para la ARN polimerasa II y dirige la expresión de moléculas de ARN que codifican las proteínas estructurales y las enzimas necesarias para producir nuevas partículas virales.
Los retrovirus ilustrativos adecuados para su uso en modalidades particulares incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV), virus del sarcoma murino de Moloney (MoMSV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV), virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), virus de la leucemia felina (FLV), espumavirus, virus de la leucemia murina de Friend, virus de células madre murinas (MSCV) y virus del sarcoma de Rous (RSV) y lentivirus.
Como se usa en la presente descripción, el término "lentivirus" se refiere a un grupo (o género) de retrovirus complejos. Los lentivirus ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: VIH (virus de inmunodeficiencia humana; que incluye VIH tipo 1 y VIH tipo 2); virus visna-maedi (VMV); virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV); virus de la anemia infecciosa equina (EIAV); virus de inmunodeficiencia felina (FIV); virus de inmunodeficiencia bovina (BIV); y virus de inmunodeficiencia en simios (SIV). En una modalidad, se prefieren cadenas principales de vectores basados en VIH (es decir, elementos de secuencia del VIH que actúan en cis). En modalidades particulares, se usa un lentivirus para administrar un polinucleótido que comprende un CAR a una célula.
Pueden usarse vectores retrovirales y más particularmente vectores lentivirales en la práctica de modalidades particulares de la presente invención. En consecuencia, el término "retrovirus" o "vector retroviral", como se usa en la presente descripción, pretende incluir "lentivirus" y "vectores lentivirales", respectivamente.
El término "vector' se usa en la presente descripción para referirse a una molécula de ácido nucleico que puede transferir o transportar otra molécula de ácido nucleico. El ácido nucleico transferido está generalmente unido a, por ejemplo, insertado en, la molécula del vector de ácido nucleico. Un vector puede incluir secuencias que dirigen la replicación autónoma en una célula, o puede incluir secuencias suficientes para permitir la integración en el ADN de la célula huésped. Los vectores útiles incluyen, por ejemplo, plásmidos (por ejemplo, plásmidos de ADN o plásmidos de ARN), transposones, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos y vectores virales. Los vectores virales útiles incluyen, por ejemplo, retrovirus y lentivirus deficientes para la replicación.
Como será evidente para un experto en la técnica, el término "vector viral" se usa ampliamente para referirse a una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido de transferencia) que incluye elementos de ácido nucleico derivados de virus que típicamente facilitan la transferencia de la molécula de ácido nucleico o integración en el genoma de una célula o en una partícula viral que media la transferencia de ácido nucleico. Las partículas virales típicamente incluirán diversos componentes virales y, a veces, también componentes de la célula huésped además del (de los) ácido(s) nucleico(s).
El término vector viral puede referirse a un virus o partícula viral que puede transferir un ácido nucleico a una célula o al propio ácido nucleico transferido. Los vectores virales y los plásmidos de transferencia contienen elementos genéticos estructurales y/o funcionales que se derivan principalmente de un virus. El término "vector retroviral" se refiere a un vector viral o plásmido que contiene elementos genéticos estructurales y funcionales, o porciones de los mismos, que se derivan principalmente de un retrovirus. El término "vector lentiviral" se refiere a un vector viral o plásmido que contiene elementos genéticos estructurales y funcionales, o porciones de los mismos, que incluyen LTR que se derivan principalmente de un lentivirus. El término "vector híbrido" se refiere a un vector, LTR u otro ácido nucleico que contiene tanto secuencias retrovirales, por ejemplo, lentivirales, como secuencias virales no lentivirales. En una modalidad, un vector híbrido se refiere a un vector o plásmido de transferencia que comprende secuencias retrovirales, por ejemplo, lentivirales, para la transcripción inversa, replicación, integración y/o empaquetamiento.
En modalidades particulares, los términos "vector lentiviral", "vector de expresión lentiviral" pueden usarse para referirse a plásmidos de transferencia lentivirales y/o partículas lentivirales infecciosas. Cuando se hace referencia en la presente descripción a elementos tales como sitios de clonación, promotores, elementos reguladores, ácidos nucleicos heterólogos, etc., debe entenderse que las secuencias de estos elementos están presentes en forma de ARN en las partículas lentivirales de la invención y están presentes en forma de ADN en los plásmidos de ADN de la invención.
En cada extremo del provirus hay estructuras llamadas "repeticiones terminales largas" o "LTR". El término "repetición terminal larga (LTR)" se refiere a dominios de pares de bases ubicados en los extremos de los ADN retrovirales que, en su contexto de secuencia natural, son repeticiones directas y contienen regiones U3, R y U5. Las LTR generalmente proporcionan funciones fundamentales para la expresión de genes retrovirales (por ejemplo, promoción, iniciación y poliadenilación de transcritos génicos) y para la replicación viral. La LTR contiene numerosas señales reguladoras que incluyen elementos de control de la transcripción, señales de poliadenilación y secuencias necesarias para la replicación e integración del genoma viral. La LTR viral se divide en tres regiones denominadas U3, R y U5. La región U3 contiene los elementos potenciadores y promotores. La región U5 es la secuencia entre el sitio de unión del cebador y la región R y contiene la secuencia de poliadenilación. La región R (repetición) está flanqueada por las regiones U3 y U5. La LTR se compone de regiones U3, R y U5 y aparece tanto en los extremos 5' como 3' del genoma viral. Adyacente a la LTR 5' hay secuencias necesarias para la transcripción inversa del genoma (el sitio de unión del cebador de ARNt) y para el empaquetamiento eficiente del ARN viral en partículas (el sitio Psi).
Como se usa en la presente descripción, el término "señal de empaquetamiento" o "secuencia de empaquetamiento" se refiere a secuencias ubicadas dentro del genoma retroviral que se requieren para la inserción del ARN viral en la cápside o partícula viral, ver, por ejemplo, Clever y otros, 1995. J. of Virology, vol. 69, núm. 4; págs. 2101-2109. Varios vectores retrovirales usan la señal de empaquetamiento mínima (también conocida como la secuencia psi [V]) necesaria para la encapsidación del genoma viral. Por lo tanto, como se usa en la presente descripción, los términos "secuencia de empaquetamiento", "señal de empaquetamiento", "psi" y el símbolo " V se usan en referencia a la secuencia no codificante requerida para la encapsidación de cadenas de ARN retroviral durante la formación de la partícula viral.
En diversas modalidades, los vectores comprenden LTR 5' y/o LTR 3' modificadas. Cualquiera o ambas de las LTR pueden comprender una o más modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, una o más deleciones, inserciones o sustituciones. Las modificaciones de la LTR 3' a menudo se realizan para mejorar la seguridad de los sistemas lentivirales o retrovirales al hacer que los virus sean deficientes para la replicación. Como se usa en la presente descripción, el término "defectuoso en la replicación" se refiere a un virus que no puede llevar a cabo una replicación completa y eficaz de modo que no se produzcan viriones infecciosos (por ejemplo, progenie lentiviral deficientes para la replicación). El término "competente en la replicación" se refiere a un virus de tipo silvestre o un virus mutante que puede replicarse, de modo que la replicación viral del virus puede producir viriones infecciosos (por ejemplo, progenie lentiviral competente para la replicación).
Los vectores "autoinactivadores" (SIN) se refieren a vectores deficientes para la replicación, por ejemplo, vectores retrovirales o lentivirales, en los que la región promotora potenciadora de LTR (3') derecha, conocida como región U3, se ha modificado (por ejemplo, mediante deleción o sustitución) para evitar la transcripción viral más allá de la primera ronda de replicación viral. Esto se debe a que la región U3 de LTR (3') derecha se usa como un molde para la región U3 de LTR (5') izquierda durante la replicación viral y, por lo tanto, la transcripción viral no puede llevarse a cabo sin el promotor potenciador de U3. En una modalidad adicional de la invención, la LTR 3' se modifica de modo que la región U5 se reemplaza, por ejemplo, con una secuencia de poli(A) ideal. Debe señalarse que las modificaciones a las LTR, tales como modificaciones a la LTR 3', la LTR 5', o tanto a la LTR 3' como 5', también se incluyen en la invención.
Se proporciona una mejora de seguridad adicional al reemplazar la región U3 de la LTR 5' con un promotor heterólogo para impulsar la transcripción del genoma viral durante la producción de partículas virales. Los ejemplos de promotores heterólogos que pueden usarse incluyen, por ejemplo, promotores del virus de los simios 40 (SV40) (por ejemplo, temprano o tardío), de citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, temprano inmediato), del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), del virus del sarcoma de Rous (RSV) y del virus del herpes simple (HSV) (timidina quinasa). Los promotores típicos pueden conducir a altos niveles de transcripción de una manera independiente de Tat. Este reemplazo reduce la posibilidad de recombinación para generar virus competentes en replicación porque no hay una secuencia U3 completa en el sistema de producción de virus. En ciertas modalidades, el promotor heterólogo tiene ventajas adicionales para controlar la manera en que se transcribe el genoma viral. Por ejemplo, el promotor heterólogo puede ser inducible, de modo que la transcripción de todo o parte del genoma viral ocurrirá solo cuando los factores de inducción estén presentes. Los factores de inducción incluyen, pero no se limitan a, uno o más compuestos químicos o las condiciones fisiológicas como la temperatura o el pH, en las que se cultivan las células huésped.
En algunas modalidades, los vectores virales comprenden un elemento TAR. El término "TAR" se refiere al elemento genético de "respuesta de transactivación" ubicado en la región R de las LTR lentivirales (por ejemplo, VIH). Este elemento interactúa con el elemento genético transactivador lentiviral (tat) para potenciar la replicación viral. Sin embargo, este elemento no se requiere en modalidades en donde la región U3 de la LTR 5' se reemplaza por un promotor heterólogo.
La "región R" se refiere a la región dentro de las LTR retrovirales que comienzan al inicio del grupo de protección (es decir, el inicio de la transcripción) y terminan inmediatamente antes del inicio del segmento de poli A. La región R también se define como flanqueada por las regiones U3 y U5. La región R desempeña un papel durante la transcripción inversa al permitir la transferencia del ADN naciente de un extremo del genoma al otro.
Como se usa en la presente descripción, el término "elemento FLAP" se refiere a un ácido nucleico cuya secuencia incluye el segmento central de polipurinas y las secuencias de terminación central (cPPT y CTS) de un retrovirus, por ejemplo, VIH-1 o VIH-2. Los elementos FLAP adecuados se describen en la patente de Estados Unidos núm.
6,682,907 y en Zennou y otros, 2000, Cell, 101:173. Durante la transcripción inversa del VIH-1, la iniciación central del ADN de cadena positiva en el segmento central de polipurinas (cPPT) y la terminación central en la secuencia de terminación central (CTS) conducen a la formación de una estructura de ADN de tres hebras: el pliegue de ADN central del VIH-1. Sin desear estar atados por ninguna teoría, el pliegue de ADN puede actuar como un determinante cis-activo de la importación nuclear del genoma lentiviral y/o puede aumentar el título del virus. En modalidades particulares, las cadenas principales de vectores retrovirales o lentivirales comprenden uno o más elementos FLAP aguas arriba o aguas abajo de los genes heterólogos de interés en los vectores. Por ejemplo, en modalidades particulares, un plásmido de transferencia incluye un elemento FLAP. En una modalidad, un vector de la invención comprende un elemento FLAP aislado de VIH-1.
En una modalidad, los vectores de transferencia retrovirales o lentivirales comprenden uno o más elementos de exportación. El término "elemento de exportación" se refiere a un elemento regulador post-transcripcional, que actúa en cis, que regula el transporte de un transcrito de ARN desde el núcleo al citoplasma de una célula. Los ejemplos de elementos de exportación de ARN incluyen, pero no se limitan al elemento de respuesta rev (RRE) del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (ver, por ejemplo, Cullen y otros, 1991. J. Virol. 65: 1053; y Cullen y otros, 1991. Cell 58: 423), y el elemento regulador posttranscripcional del virus de la hepatitis B (HPRE). En general, el elemento de exportación de ARN se coloca dentro de la UTR 3' de un gen, y puede insertarse como una o múltiples copias.
En modalidades particulares, la expresión de secuencias heterólogas en vectores virales se incrementa mediante la incorporación de elementos reguladores postranscripcionales, sitios de poliadenilación eficientes y, opcionalmente, señales de terminación de la transcripción en los vectores. Una variedad de elementos reguladores postranscripcionales puede aumentar la expresión de un ácido nucleico heterólogo a la proteína, por ejemplo, elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE; Zufferey y otros, 1999, J. Virol., 73: 2886); el elemento regulador postranscripcional presente en el virus de la hepatitis B (HPRE) (Huang y otros, Mol. Cell. Biol., 5: 3864); y similares (Liu y otros, 1995, Genes Dev., 9: 1766). En modalidades particulares, los vectores de la invención comprenden un elemento regulador postranscripcional tal como un WPRE o HPRE En modalidades particulares, los vectores de la invención carecen o no comprenden un elemento regulador postranscripcional tal como un WPRE o HPRE porque en algunos casos estos elementos aumentan el riesgo de transformación celular y/o no aumentan sustancial o significativamente la cantidad de transcrito de ARNm o aumentan la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, en algunas modalidades, los vectores de la invención carecen o no comprenden un WPRE o HPRE como una medida de seguridad adicional.
Los elementos que dirigen la terminación eficiente y la poliadenilación de los transcritos del ácido nucleico heterólogo aumentan la expresión génica heteróloga. Las señales de terminación de la transcripción se encuentran generalmente aguas abajo de la señal de poliadenilación. En modalidades particulares, los vectores comprenden una secuencia de poliadenilación 3' de un polinucleótido que codifica un polipéptido a expresar. El término "sitio de poliA" o "secuencia de poliA" como se usa en la presente descripción denota una secuencia de ADN que dirige tanto la terminación como la poliadenilación del transcrito de ARN naciente por la ARN polimerasa II. Las secuencias de poliadenilación pueden promover la estabilidad del ARNm mediante la adición de una cola de poliA al extremo 3' de la secuencia de codificación y, por lo tanto, contribuir a una mayor eficiencia traduccional. La poliadenilación eficiente del transcrito recombinante es conveniente ya que los transcritos que carecen de una cola de poliA son inestables y se degradan rápidamente. Los ejemplos ilustrativos de señales de poliA que pueden usarse en un vector de la invención, incluyen una secuencia de poliA ideal (por ejemplo, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), una secuencia de poliA de la hormona de crecimiento bovina (BGHpA), una secuencia de poliA de p-globina de conejo (rpgpA), u otra secuencia de poliA heteróloga o endógena adecuada conocida en la técnica.
En ciertas modalidades, un vector retroviral o lentiviral comprende además uno o más elementos aislantes. Los elementos aislantes pueden contribuir a proteger las secuencias expresadas por lentivirus, por ejemplo, polipéptidos terapéuticos, de los efectos del sitio de integración, que pueden estar mediados por elementos que actúan en cis presentes en el ADN genómico y conducir a la expresión desregulada de secuencias transferidas (es decir, efecto de posición; ver, por ejemplo, Burgess-Beusse y otros, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99: 16433; y Zhan y otros, 2001, Hum. Genet., 109: 471). En algunas modalidades, los vectores de transferencia comprenden uno o más elementos aislantes, la LTR 3' y tras la integración del provirus en el genoma del huésped, el provirus comprende el uno o más aislantes tanto en la LTR 5' como en la LTR 3', en virtud de la duplicación de la LTR 3'. Los aislantes adecuados para su uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, el aislante de p-globina de pollo (ver Chung y otros, 1993. Cell 74: 505; Chung y otros, 1997. PNAS 94: 575; y Bell y otros, 1999. Cell 98: 387). Los ejemplos de elementos aislantes incluyen, pero no se limitan a, un aislante de un locus de p-globina, tal como HS4 de pollo.
De acuerdo con ciertas modalidades específicas de la invención, la mayoría o todas las secuencias de la cadena principal del vector viral derivan de un lentivirus, por ejemplo, VIH-1. Sin embargo, debe entenderse que pueden usarse o combinarse muchas fuentes diferentes de secuencias retrovirales y/o lentivirales y pueden acomodarse numerosas sustituciones y alteraciones en algunas de las secuencias lentivirales sin afectar la capacidad de un vector de transferencia para realizar las funciones descritas en la presente descripción. Además, se conocen en la técnica una variedad de vectores lentivirales, ver Naldini y otros, (1996a, 1996b y 1998); Zufferey y otros, (1997); Dull y otros, 1998, las patentes de Estados Unidos núms. 6,013,516; y 5,994,136, muchos de los cuales pueden adaptarse para producir un vector viral o un plásmido de transferencia de la presente invención.
En diversas modalidades, los vectores de la invención comprenden un promotor unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido CAR. Los vectores pueden tener una o más LTR, en donde cualquiera de las LTR comprende una o más modificaciones, tales como una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos. Los vectores pueden comprender además uno de más elementos accesorios para aumentar la eficiencia de la transducción (por ejemplo, un cPPT/FLAP), empaquetamiento viral (por ejemplo, una señal de empaquetamiento Psi (V), RRE) y/u otros elementos que aumentan la expresión del gen terapéutico (por ejemplo, secuencias de poli (A)), y opcionalmente pueden comprender un WPRE o HPRE.
En una modalidad particular, el vector de transferencia de la invención comprende una LTR retroviral izquierda (5'); un tramo de polipurina central/fragmento de ADN (cPPT/FLAP); un elemento de exportación retroviral; un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; y una LTR retroviral derecha (3'); y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En una modalidad particular, el vector de transferencia de la invención comprende una LTR retroviral izquierda (5'); un elemento de exportación retroviral; un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; una LTR retroviral derecha (3'); y una secuencia poli (A); y opcionalmente un WPRE o HPRe . En otra modalidad particular, la invención proporciona un vector lentiviral que comprende: una LTR izquierda (5'); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; una LTR (3') derecha; y una secuencia de poliadenilación; y opcionalmente un WPRe o HPRE.
En una cierta modalidad, la invención proporciona un vector lentiviral que comprende: una LTR de VIH-1 (5') izquierda; una señal de empaquetamiento Psi (y ); un cPPT/FLAP; un r RE; un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; una LTR de VIH-1 (3') derecha autoinactivante (SIN); y una secuencia de poliadenilación de p-globina de conejo; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En otra modalidad, la invención proporciona un vector que comprende: al menos una LTR; un tramo de polipurina central/fragmento de ADN (cPPT/FLAP); un elemento de exportación retroviral; y un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En una modalidad particular, la presente invención proporciona un vector que comprende al menos una LTR; un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; y una secuencia de poliadenilación; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
En una cierta modalidad, la presente invención proporciona al menos una LTR de VIH-1 SIN; una señal de empaquetamiento Psi (^); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor activo en una célula T, unido operativamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido CAR contemplado en la presente descripción; y una secuencia de poliadenilación de p-globina de conejo; y opcionalmente un WPRE o HPRE.
Una "célula huésped" incluye células electroporadas, transfectadas, infectadas o transducidas in vivo, ex vivo o in vitro con un vector recombinante o un polinucleótido de la invención. Las células huésped pueden incluir células de empaquetamiento, células productoras y células infectadas con vectores virales. En modalidades particulares, las células huésped infectadas con un vector viral de la invención se administran a un sujeto que necesita de la terapia. En ciertas modalidades, el término "célula objetivo" se usa indistintamente con célula huésped y se refiere a células transfectadas, infectadas o transducidas de un tipo de célula deseado. En modalidades preferidas, la célula objetivo es una célula T.
La producción de partículas virales a gran escala es a menudo necesaria para lograr un título viral razonable. Las partículas virales se producen al transfectar un vector de transferencia en una línea celular de empaquetamiento que comprende genes virales estructurales y/o accesorios, por ejemplo, genes gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx o nef u otros genes retrovirales.
Como se usa en la presente descripción, el término "vector de empaquetamiento" se refiere a un vector de expresión o vector viral que carece de una señal de empaquetamiento y comprende un polinucleótido que codifica uno, dos, tres, cuatro o más genes virales estructurales y/o accesorios. Típicamente, los vectores de empaquetamiento se incluyen en una célula de empaquetamiento, y se introducen en la célula mediante transfección, transducción o infección. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos de transfección, transducción o infección. Un vector de transferencia retroviral/lentiviral de la presente invención puede introducirse en una línea celular de empaquetamiento, mediante transfección, transducción o infección, para generar una célula o línea celular productora. Los vectores de empaquetamiento de la presente invención pueden introducirse en células o líneas celulares humanas mediante métodos estándar que incluyen, por ejemplo, transfección con fosfato de calcio, lipofección o electroporación. En algunas modalidades, los vectores de empaquetamiento se introducen en las células junto con un marcador de selección dominante, tal como neomicina, higromicina, puromicina, blastocidina, zeocina, timidina quinasa, DHFR, Gln sintetasa o ADA, seguido de la selección en presencia del fármaco apropiado y el aislamiento de clones. Un gen marcador de selección puede unirse físicamente a genes codificados por el vector de empaquetamiento, por ejemplo, por IRES o péptidos virales autoescindibles.
Las proteínas de la envoltura viral (env) determinan la variedad de células huésped que finalmente pueden ser infectadas y transformadas por los retrovirus recombinantes generados a partir de las líneas celulares. En el caso de los lentivirus, como VIH-1, VIH-2, SIV, FIV y EIV, las proteínas env incluyen gp41 y gp120. Preferentemente, las proteínas env virales expresadas por las células de empaquetamiento de la invención están codificadas en un vector separado de los genes gag y pol virales, como se ha descrito anteriormente.
Los ejemplos ilustrativos de genes env derivados de retrovirus que pueden emplearse en la invención incluyen, pero no se limitan a: envolturas de MLV, envoltura 10A1, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, Ébola, Sendai, FPV (virus de la peste aviar), y envolturas del virus de la influenza. De manera similar, pueden utilizarse genes que codifican las envolturas de virus de ARN (por ejemplo, familias de virus de ARN de Picornaviridae, Calciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae) así como también de virus de ADN (familias de Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxyiridae e Iridoviridae). Los ejemplos representativos incluyen FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, Rabia, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 y EIAV.
En otras modalidades, las proteínas de la envoltura para el pseudotipado de un virus de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los siguientes virus: influenza A tal como H1N1, HlN2, H3N2 y H5N1 (gripe aviar), influenza B, virus de la influenza C, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D, virus de la hepatitis E, rotavirus, cualquier virus del grupo del virus Norwalk, adenovirus entéricos, parvovirus, virus de la fiebre del dengue, viruela del mono, mononegavirales, lisavirus tales como el virus de la rabia, virus del murciélago de Lagos, virus de Mokola, virus de Duvenhage, virus de murciélago europeo 1 y 2 y virus de murciélago australiano, ephemerovirus, vesiculovirus, virus de la estomatitis vesicular (VSV), herpesvirus tales como el virus del herpes simple tipos 1 y 2, varicela zoster, citomegalovirus, virus de Epstein-Bar (EBV), herpesvirus humano (HHV), herpesvirus humano tipo 6 y 8, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma, gammaherpesvirus murino, arenavirus tales como el virus de la fiebre hemorrágica argentina, virus de la fiebre hemorrágica boliviana, virus de la fiebre hemorrágica asociada a Sabia, virus de la fiebre hemorrágica venezolana, virus de la fiebre de Lassa, virus de Machupo, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), bunyaviridiae tales como el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, Hantavirus, virus que provoca fiebre hemorrágica con síndrome renal, virus de la fiebre del Valle del Rift, filoviridae (filovirus), lo que incluye la fiebre hemorrágica del Ébola y la fiebre hemorrágica de Marburgo, flaviviridae, lo que incluye el virus de la enfermedad del bosque de Kaysanur, el virus de la fiebre hemorrágica de Omsk, el virus que provoca la encefalitis transmitida por garrapatas y paramixoviridae, tales como el virus Hendra y el virus Nipah, la viruela mayor y la viruela menor (viruela), alfavirus tal como el virus de la encefalitis equina venezolana, el virus de la encefalitis equina del este, el virus de la encefalitis equina del oeste, el coronavirus asociado al SARS (SARS-CoV), el virus del Nilo occidental, cualquier virus que provoque encefalitis.
En una modalidad, la invención proporciona células de empaquetamiento que producen retrovirus recombinantes, por ejemplo, lentivirus, pseudotipados con la glicoproteína VSV-G.
Los términos "pseudotipo" o "pseudotipado", como se usan en la presente descripción, se refieren a un virus cuyas proteínas de la envoltura viral se han sustituido con las de otro virus que posee características preferibles. Por ejemplo, el VIH puede seudotiparse con proteínas de la envoltura, proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), lo que permite que el VIH infecte una variedad más amplia de células porque las proteínas de la envoltura del VIH (codificadas por el gen env) normalmente dirigen el virus a las células presentadoras CD4+. En una modalidad preferida de la invención, las proteínas de la envoltura lentivirales se pseudotipan con VSV-G. En una modalidad, la invención proporciona células de empaquetamiento que producen retrovirus recombinantes, por ejemplo, lentivirus, pseudotipados con la glicoproteína de la envoltura VSV-G.
Como se usa en la presente descripción, el término "líneas celulares de empaquetamiento" se usa en referencia a líneas celulares que no contienen una señal de empaquetamiento, pero que expresan de manera estable o transitoria proteínas estructurales virales y enzimas de replicación (por ejemplo, gag, pol y env) que son necesarias para el correcto empaquetamiento de partículas virales. Puede emplearse cualquier línea celular adecuada para preparar las células de empaquetamiento de la invención. En general, las células son células de mamífero. En una modalidad particular, las células usadas para producir la línea celular de empaquetamiento son células humanas. Las líneas celulares adecuadas que pueden usarse incluyen, por ejemplo, células CHO, células BHK, células MDCK, células C3H 10T1/2, células FLY, células Psi-2, células bOs C 23, células PA317, células WEHI, células COS, células BSC 1, células BSC 40, células BMT 10, células VERO, células W138, células MRC5, células A549, células HT1080, células 293, células 293T, células B-50, células 3T3, células NIH3T3, células HepG2, células Saos-2, Células Huh7, células HeLa, células W163, células 211 y células 211A. En una modalidad preferida, las células de empaquetamiento son células 293, células 293T o células A549. En otra modalidad preferida, las células son células A549.
Como se usa en la presente descripción, el término "línea celular productora" se refiere a una línea celular que es capaz de producir partículas retrovirales recombinantes, que comprende una línea celular de empaquetamiento y un constructo de vector de transferencia que comprende una señal de empaquetamiento. La producción de partículas virales infecciosas y soluciones madre virales puede llevarse a cabo mediante el uso de técnicas convencionales. Los métodos para preparar soluciones madre virales se conocen en la técnica y se ilustran, por ejemplo, en Y. Soneoka y otros, (1995) Nucl. Acids Res. 23: 628-633, y N. R. Landau y otros, (1992) J. Virol. 66: 5110-5113. Las partículas virales infecciosas pueden recolectarse de las células de empaquetamiento mediante el uso de técnicas convencionales. Por ejemplo, las partículas infecciosas pueden recolectarse mediante lisis celular, o la recolección del sobrenadante del cultivo celular, como se conoce en la técnica. Opcionalmente, las partículas virales recolectadas pueden purificarse si se desea. Las técnicas de purificación adecuadas son bien conocidas por los expertos en la técnica.
El suministro de uno o más genes u otra secuencia de polinucleótidos mediante el uso de un vector retroviral o lentiviral mediante infección viral en lugar de mediante transfección se denomina "transducción". En una modalidad, los vectores retrovirales se transducen a una célula a través de la infección y la integración de provirus. En ciertas modalidades, una célula objetivo, por ejemplo, una célula T, es "transducida" si comprende un gen u otra secuencia de polinucleótidos suministrados a la célula por infección mediante el uso de un vector viral o retroviral. En modalidades particulares, una célula transducida comprende uno o más genes u otras secuencias de polinucleótidos suministradas por un vector retroviral o lentiviral en su genoma celular.
En modalidades particulares, las células huésped transducidas con un vector viral de la invención que expresa uno o más polipéptidos, se administran a un sujeto para tratar y/o prevenir una neoplasia maligna de las células B. Pueden encontrarse otros métodos relacionados con el uso de vectores virales en la terapia génica, que pueden utilizarse de acuerdo con ciertas modalidades, por ejemplo, en Kay, M. A. (1997) Chest 111 (Sup. 6):138S-142S; Ferry, N. y Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9: 1975-81; Shiratory, Y. y otros, (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. y otros, (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. y Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. y Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. y Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; y Lee, H. C. y otros, (2000) Nature 408: 483-8.
G. Células genéticamente modificadas
La presente invención contempla, en modalidades particulares, células genéticamente modificadas para expresar los CAR contemplados en la presente descripción, para su uso en el tratamiento de afecciones relacionadas con las células B. Como se usa en la presente descripción, el término "diseñado genéticamente" o "modificado genéticamente" se refiere a la adición de material genético adicional en forma de ADN o ARN en el material genético total en una célula. Los términos "células genéticamente modificadas", "células modificadas" y "células redirigidas" se usan indistintamente. Como se usa en la presente descripción, el término "terapia génica" se refiere a la introducción de material genético extra en forma de ADN o ARN en el material genético total en una célula que restaura, corrige o modifica la expresión de un gen, o con el propósito de expresar un polipéptido terapéutico, por ejemplo, un CAR
En modalidades particulares, los CAR contemplados en la presente descripción se introducen y expresan en células efectoras inmunitarias para redirigir su especificidad a un antígeno objetivo de interés, por ejemplo, un polipéptido de BCMA. Una "célula efectora inmunitaria" es cualquier célula del sistema inmunitario que tiene una o más funciones efectoras (por ejemplo, actividad citotóxica para matar células, secreción de citocinas, inducción de ADCC y/o CDC). Las células efectoras inmunitarias de la invención pueden ser autólogas/autogénicas ("propias") o no autólogas ("no propias", por ejemplo, alogénicas, singénicas o xenogénicas).
"Autólogas", como se usa en la presente descripción, se refiere a células del mismo sujeto.
"Alogénicas", como se usa en la presente descripción, se refiere a células de la misma especie que difieren genéticamente de la célula en comparación.
"Singénicas", como se usa en la presente descripción, se refiere a células de un sujeto diferente que son genéticamente idénticas a la célula en comparación.
"Xenogénicas", como se usa en la presente descripción, se refiere a células de una especie diferente a la célula en comparación. En modalidades preferidas, las células de la invención son alogénicas.
Las células efectoras inmunitarias ilustrativas usadas con los CAR contemplados en la presente descripción incluyen los linfocitos T. Los términos "células T" o "linfocitos T" se reconocen en la técnica y están destinados a incluir timocitos, linfocitos T inmaduros, linfocitos T maduros, linfocitos T en reposo o linfocitos T activados. Una célula T puede ser una célula T auxiliar (Th), por ejemplo, una célula T auxiliar 1 (Th1) o una célula T auxiliar 2 (Th2). La célula T puede ser una célula T auxiliar (HTL; célula T CD4+) célula T CD4+, una célula T citotóxica (CTL; célula T CD8+), célula T CD4+CD8+, célula T CD4'CD8‘ o cualquier otro subconjunto de células T. Otras poblaciones ilustrativas de células T adecuadas para su uso en modalidades particulares incluyen las células T vírgenes y células T de memoria.
Como entenderá un experto, también pueden usarse otras células como células efectoras inmunitarias con los CAR como se describe en la presente descripción. En particular, las células efectoras inmunitarias incluyen además células NK, células NKT, neutrófilos y macrófagos. Las células efectoras inmunitarias incluyen además progenitoras de células efectoras en donde dichas células progenitoras pueden inducirse para diferenciarse en células efectoras inmunitarias in vivo o in vitro. Por lo tanto, en modalidades particulares, la célula efectora inmunitaria incluye progenitoras de células efectoras inmunitarias tales como células madre hematopoyéticas (HSC) contenidas dentro de la población CD34+ de células derivadas de sangre de cordón umbilical, la médula ósea o de sangre periférica movilizada que tras la administración en un sujeto se diferencian en células efectoras inmunitarias maduras, o que pueden inducirse in vitro a que se diferencien en células efectoras inmunitarias maduras.
Como se usa en la presente descripción, las células efectoras inmunitarias diseñadas genéticamente para contener CAR específico de BCMA pueden denominarse "células efectoras inmunitarias redirigidas específicas de BCMA." El término "célula CD34+", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula que expresa la proteína CD34 en su superficie celular. "CD34", como se usa en la presente descripción, se refiere a una glicoproteína de la superficie celular (por ejemplo, proteína de sialomucina) que a menudo actúa como un factor de adhesión célulacélula y está implicada en la entrada de células T en los ganglios linfáticos. La población de células CD34+ contiene células madre hematopoyéticas (HSC), que tras la administración a un paciente se diferencian y contribuyen a todos los linajes hematopoyéticos, lo que incluye células T, células NK, células NKT, neutrófilos y células del linaje de monocitos/macrófagos.
La presente invención proporciona métodos para preparar las células efectoras inmunitarias que expresan el CAR contemplado en la presente descripción. En una modalidad, el método comprende transfectar o transducir células efectoras inmunitarias aisladas de un individuo de manera que las células efectoras inmunitarias expresen uno o más CAR como se describe en la presente descripción. En ciertas modalidades, las células efectoras inmunitarias se aíslan de un individuo y se modifican genéticamente sin manipulación adicional in vitro. Después dichas células pueden volver a administrarse directamente al individuo. En modalidades adicionales, las células efectoras inmunitarias primero se activan y estimulan para que proliferen in vitro antes de modificarse genéticamente para expresar un CAR. A este respecto, las células efectoras inmunitarias pueden cultivarse antes y/o después de modificarse genéticamente (es decir, transducidas o transfectadas para expresar un CAR contemplado en la presente descripción).
En modalidades particulares, antes de la manipulación in vitro o la modificación genética de las células efectoras inmunitarias descritas en la presente descripción, la fuente de células se obtiene de un sujeto. En modalidades particulares, las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR comprenden las células T. Las células T pueden obtenerse a partir de varias fuentes que incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre de cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En ciertas modalidades, las células T pueden obtenerse a partir de una unidad de sangre recolectada de un sujeto mediante el uso de cualquier número de técnicas conocidas por el experto, tales como sedimentación, por ejemplo, separación con FICOLL™. En una modalidad, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen mediante aféresis. El producto de aféresis típicamente contiene linfocitos, lo que incluye células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En una modalidad, las células recolectadas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para el procesamiento posterior. Las células pueden lavarse con PBS o con otra solución adecuada que carezca de calcio, de magnesio y de la mayoría, o de todos los demás, cationes divalentes. Como apreciarán los expertos en la técnica, una etapa de lavado puede realizarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como mediante el uso de una centrífuga de flujo continuo semiautomatizada. Por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991, el Baxter CytoMate o similares. Después del lavado, las células pueden resuspenderse en una variedad de tampones biocompatibles u otra solución salina con o sin tampón. En ciertas modalidades, los componentes no deseados de la muestra de aféresis pueden eliminarse en el medio de cultivo resuspendido directamente de la célula.
En ciertas modalidades, las células T se aíslan a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante lisis de los glóbulos rojos y al depletar los monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de un gradiente de PERCOLL™. Puede aislarse adicionalmente una subpoblación específica de células T, que expresa uno o más de los siguientes marcadores: CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA y CD45RO, mediante técnicas de selección positiva o negativa. En una modalidad, una subpoblación específica de células T, que expresan CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA y CD45RO se aísla adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, el enriquecimiento de una población de células T mediante selección negativa puede lograrse con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas negativamente. Un método para su uso en la presente descripción es la clasificación y/o selección celular mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que usa un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales normalmente incluye anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. La citometría de flujo y la clasificación celular también pueden usarse para aislar poblaciones celulares de interés para su uso en la presente invención.
Las PBMC pueden modificarse genéticamente directamente para expresar CAR mediante el uso de métodos contemplados en la presente descripción. En ciertas modalidades, después del aislamiento de las PBMC, los linfocitos T se aíslan adicionalmente y en ciertas modalidades, tanto los linfocitos T citotóxicos como los auxiliares pueden clasificarse en subpoblaciones de células T vírgenes, de memoria y efectoras antes o después de la modificación y/o expansión genética.
Las células CD8+ pueden obtenerse mediante el uso de métodos estándar. En algunas modalidades, las células CD8+ se clasifican además en células vírgenes, de memoria central y efectoras mediante la identificación de antígenos de la superficie celular que están asociados con cada uno de esos tipos de células CD8+.
En ciertas modalidades, los linfocitos T CD8+ vírgenes se caracterizan por la expresión de marcadores fenotípicos de células T vírgenes lo que incluye CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD 127 y CD45RA.
En modalidades particulares, las células T de memoria están presentes tanto en los subconjuntos CD62L+ como CD62L- de los linfocitos de sangre periférica CD8+. Las PBMC se clasifican en fracciones CD62L-CD8+ y CD62L+CD8+ después de la tinción con anticuerpos anti-CD8 y anti-CD62L. En algunas modalidades, la expresión de marcadores fenotípicos de células T de memoria central incluyen CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 y CD127 y son negativas para granzima B. En algunas modalidades, las células T de memoria central son Células T CD45RO+, CD62L+, CD8+.
En algunas modalidades, las células T efectoras son negativas para CD62L, CCR7, CD28 y CD127, y positivas para granzima B y perforina.
En ciertas modalidades, las células T CD4+ se clasifican además en subpoblaciones. Por ejemplo, las células auxiliares T CD4+ pueden clasificarse en células vírgenes, de memoria central y efectoras mediante la identificación de poblaciones de células que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ pueden obtenerse mediante métodos estándar. En algunas modalidades, los linfocitos T CD4+ vírgenes son células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ CD4+. En algunas modalidades, las células de memoria central CD4+ son positivas para CD62L y positivas para CD45RO. En algunas modalidades, las células efectoras CD4+ son negativas para CD62L y CD45RO.
Las células efectoras inmunitarias, tales como las células T, pueden modificarse genéticamente después del aislamiento mediante el uso de métodos conocidos, o las células efectoras inmunitarias pueden activarse y expandirse (o diferenciarse en el caso de progenitores) in vitro antes de modificarse genéticamente. En una modalidad particular, las células efectoras inmunitarias, tales como las células T, se modifican genéticamente con los receptores antigénicos quiméricos contemplados en la presente descripción (por ejemplo, se transducen con un vector viral que comprende un ácido nucleico que codifica un CAR) y después se activan y expanden in vitro. En diversas modalidades, las células T pueden activarse y expandirse antes o después de la modificación genética para expresar un CAR, mediante el uso de métodos como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos núms. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7, 144,575; 7,067,318; 7, 172,869; 7,232,566; 7, 175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; y en la Publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20060121005.
En general, las células T se expanden por contacto con una superficie que tiene unido un agente que estimula una señal asociada al complejo CD3 TCR y un ligando que estimula una molécula coestimuladora en la superficie de las células T. Las poblaciones de células T pueden estimularse por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de proteína quinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. También se contempla la coestimulación de moléculas accesorias en la superficie de las células T.
En modalidades particulares, las PBMC o las células T aisladas se ponen en contacto con un agente estimulador y un agente coestimulador, tales como anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, generalmente unidos a una perla u otra superficie, en un medio de cultivo con citocinas apropiadas, tales como IL-2, IL-7 y/o IL-15. Para estimular la proliferación de células T CD4+ o células T CD8+, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Los ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diacione, Besancon, Francia) pueden usarse como otros métodos comúnmente conocidos en la técnica (Berg y otros, Transplant Proc. 30(8): 3975-3977, 1998; Haanen y otros, J. Exp. Med. 190(9): 1319-1328, 1999; Garland y otros, J. Immunol Meth. 227(1-2): 53-63, 1999). Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a la misma perla sirven como una célula presentadora de antígeno "sustituta" (APC). En otras modalidades, las células T pueden activarse y estimularse para que proliferen con células alimentadoras y anticuerpos y citocinas apropiados mediante el uso de métodos tales como los descritos en los documentos US6040177; US5827642; y WO2012129514.
En otras modalidades, las APC artificiales (aAPC) pueden obtenerse mediante modificación por ingeniería genética de las células K562, U937, 721.221, T2 y C1R para dirigir la expresión y secreción estables de una variedad de moléculas coestimuladoras y citocinas. En una modalidad particular, las aAPC K32 o U32 se usan para dirigir la expresión de una o más moléculas estimuladoras basadas en anticuerpos en la superficie celular de las AAPC. La expresión de diversas combinaciones de genes en la aAPC permite la determinación precisa de los requisitos de activación de las células T humanas, de manera que las aAPC pueden adaptarse para la propagación óptima de subconjuntos de células T con requisitos de crecimiento específicos y funciones distintas. Las aAPC apoyan el crecimiento ex vivo y la expansión a largo plazo de células T CD8 humanas funcionales sin requerir la adición de citocinas exógenas, en contraste con el uso de APC naturales. Las poblaciones de células T pueden expandirse mediante aAPC que expresan una variedad de moléculas coestimuladoras que incluyen, pero no se limitan a, CD137L (4-1BBL), CD134L (OX40L) y/o CD80 o CD86. Finalmente, las aAPC proporcionan una plataforma eficiente para expandir las células T genéticamente modificadas y para mantener la expresión de CD28 en las células T CD8. Las aAPC se proporcionan en los documentos WO 03/057171 y US2003/0147869.
En una modalidad, las células CD34+ se transducen con un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la invención. En ciertas modalidades, las células CD34+ transducidas se diferencian en células efectoras inmunitarias maduras in vivo después de la administración a un sujeto, generalmente el sujeto del que se aislaron originalmente las células. En otra modalidad, las células CD34+ pueden estimularse in vitro antes de la exposición o después de modificarse genéticamente con un CAR como se describe en la presente descripción, con una o más de las siguientes citocinas: ligando Flt-3 (FLT3), factor de células madre (SCF), factor de crecimiento y diferenciación de megacariocitos (TPO), IL-3 e IL-6 de acuerdo con los métodos descritos anteriormente (Asheuer y otros, 2004; Imren, y otros, 2004).
La invención proporciona una población de células efectoras inmunitarias modificadas para el tratamiento del cáncer, donde las células efectoras inmunitarias modificadas comprenden un CAR como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, se prepara una población de células efectoras inmunitarias modificadas a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de un paciente diagnosticado con una neoplasia maligna de las células B descrita en la presente descripción (donantes autólogos). Las PBMC forman una población heterogénea de linfocitos T que pueden ser CD4+, CD8+ o CD4+ y CD8+.
Las PBMC también pueden incluir otros linfocitos citotóxicos tales como células NK o células NKT. Un vector de expresión que porta la secuencia codificante de un CAR contemplado en la presente descripción puede introducirse en una población de células T, células NK o células NKT de donantes humanos. Las células T transducidas exitosamente que portan el vector de expresión pueden clasificarse mediante citometría de flujo para aislar células T CD3 positivas y después propagarse para aumentar el número de células T que expresan la proteína CAR además de la activación celular mediante el uso de anticuerpos anti-CD3 y/o anticuerpos anti-CD28 e IL-2 o cualesquiera otros métodos conocidos en la técnica como se describe en otra parte de la presente descripción. Se usan procedimientos estándar para la criopreservación de células T que expresan la proteína CAR para el almacenamiento y/o preparación para su uso en un sujeto humano. En una modalidad, la transducción, cultivo y/o expansión in vitro de células T se realizan en ausencia de productos derivados de animales no humanos tales como suero de ternero fetal y suero bovino fetal. Dado que una población heterogénea de PBMC está genéticamente modificada, las células transducidas resultantes son una población heterogénea de células modificadas que comprenden un CAR que se dirige al BCMA como se contempla en la presente descripción.
En una modalidad adicional, puede usarse una mezcla de, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco o más vectores de expresión diferentes para modificar genéticamente una población donante de células efectoras inmunitarias, en donde cada vector codifica una proteína receptora de antígeno quimérico diferente como se contempla en la presente descripción. Las células efectoras inmunitarias modificadas resultantes forman una población mixta de células modificadas, con una proporción de células modificadas que expresan más de una proteína CAR diferente.
En una modalidad, la invención proporciona un método para almacenar células efectoras inmunitarias que expresan proteína CAR murina, humana o humanizada genéticamente modificada que se dirigen a una proteína del BCMA, que comprende criopreservar las células efectoras inmunitarias de manera que las células permanezcan viables tras la descongelación. Una fracción de las células efectoras inmunitarias que expresan las proteínas CAR puede criopreservarse mediante métodos conocidos en la técnica para proporcionar una fuente permanente de dichas células para el tratamiento futuro de pacientes afectados por la afección relacionada con las células B. Cuando sea necesario, las células efectoras inmunitarias transformadas criopreservadas pueden descongelarse, cultivarse y expandirse para obtener más de dichas células.
Como se usa en la presente descripción, "criopreservación" se refiere a la conservación de las células mediante el enfriamiento a temperaturas bajo cero, tales como (típicamente) 77 K o -196 °C. (el punto de ebullición del nitrógeno líquido). Los agentes crioprotectores se usan a menudo a temperaturas bajo cero para impedir que las células que se conservan se dañen debido al congelamiento a bajas temperaturas o al calentamiento a temperatura ambiente. Los agentes criopreservantes y las tasas de enfriamiento óptimas pueden proteger contra el daño celular. Los agentes crioprotectores que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, dimetilsulfóxido (DMSO) (Lovelock y Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirrolidina (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576) y polietilenglicol (Sloviter y Ravdin, Nature, 1962; 196: 48). La tasa de enfriamiento preferida es de 1 °C a 3 °C/minuto. Después de al menos dos horas, las células T han alcanzado una temperatura de -80 °C y pueden colocarse directamente en nitrógeno líquido (-196 °C) para el almacenamiento permanente, como en un recipiente de almacenamiento criogénico a largo plazo.
H. Composiciones y formulaciones
Las composiciones contempladas en la presente descripción pueden comprender uno o más polipéptidos, polinucleótidos, vectores que los comprenden, células efectoras inmunitarias genéticamente modificadas, etc. como se contempla en la presente descripción. Las composiciones incluyen, pero no se limitan a, composiciones farmacéuticas. Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición formulada en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para la administración a una célula o un animal, ya sea sola o en combinación con una o más de otras modalidades de terapia. También se entenderá que, si se desea, las composiciones de la invención también pueden administrarse en combinación con otros agentes, tales como, por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, moléculas pequeñas, quimioterapéuticos, profármacos, fármacos, anticuerpos, u otros diversos agentes farmacéuticamente activos. Prácticamente no hay límite para otros componentes que también pueden incluirse en las composiciones, siempre que los agentes adicionales no afecten negativamente la capacidad de la composición para administrar la terapia prevista.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente descripción para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y de animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, proporcional con una relación beneficio/riesgo razonable.
Como se usa en la presente descripción, "portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier adyuvante, portador, excipiente, deslizante, agente edulcorante, diluyente, conservante, tinte/colorante, potenciador del sabor, tensioactivo, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, estabilizador, agente isotónico, solvente, tensioactivo o emulsionante que se ha aprobado por la Food and Drug Administration de los Estados Unidos como aceptable para su uso en seres humanos o en animales domésticos. Los portadores farmacéuticamente aceptables ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto; malta; gelatina; talco; manteca de cacao, ceras, grasas animales y vegetales, parafinas, siliconas, bentonitas, ácido silícico, óxido de zinc; aceites, tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tal como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones tampón de fosfato; y cualquier otra sustancia compatible empleada en formulaciones farmacéuticas.
En modalidades particulares, las composiciones de la presente invención comprenden una cantidad de células efectoras inmunitarias que expresan CAR contempladas en la presente descripción. Como se usa en la presente descripción, el término "cantidad" se refiere a "una eficaz cantidad" o "una cantidad eficaz" de una célula terapéutica genéticamente modificada, por ejemplo, una célula T, para lograr un resultado profiláctico o terapéutico beneficioso o deseado, lo que incluye resultados clínicos.
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una célula terapéutica genéticamente modificada que es eficaz para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente pero no necesariamente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz es menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una célula terapéutica genéticamente modificada puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de las células madre y progenitoras para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que cualquiera de los efectos tóxicos o perjudiciales del virus o de las células terapéuticas se compensan por los efectos terapéuticamente beneficiosos. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" incluye una cantidad que es eficaz para "tratar" a un sujeto (por ejemplo, un paciente). Cuando se indica una cantidad terapéutica, la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención a administrar puede determinarse por un médico en consideración a las diferencias individuales en edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y el estado del paciente (sujeto). En general, puede afirmarse que una composición farmacéutica que comprende las células T descritas en la presente descripción puede administrarse a una dosis de 102 a 1010 células/kg de peso corporal, preferentemente, 105 a 106 células/kg de peso corporal, lo que incluye todos los valores enteros dentro de esos intervalos. El número de células dependerá del uso final para el que está destinada la composición, al igual que el tipo de células incluidas en el mismo. Para los usos proporcionados en la presente descripción, las células están generalmente en un volumen de un litro o menos, puede ser de 500 ml o menos, incluso de 250 ml o 100 ml o menos. Por lo tanto, la densidad de las células deseadas es típicamente mayor que 106 células/ml y generalmente es mayor que 107 células/ml, generalmente 108 células/ml o mayor. El número clínicamente relevante de células inmunitarias puede distribuirse en múltiples infusiones que acumulativamente igualan o exceden 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 o 1012 células. En algunos aspectos de la presente invención, particularmente dado que todas las células infundidas serán redirigidas a un antígeno objetivo particular, pueden administrarse números menores de células, en el intervalo de 106/kilogramo (106-1011 por paciente). Las composiciones de células que expresan CAR pueden administrarse múltiples veces en dosis dentro de estos intervalos. Las células pueden ser alogénicas, singénicas, xenogénicas o autólogas para el paciente sometido a terapia. Si se desea, el tratamiento también puede incluir la administración de mitógenos (por ejemplo, PHA) o linfocinas, citocinas y/o quimiocinas (por ejemplo, IFN-y, IL-2, IL-12, TNF-alfa, IL-18 y TNF-beta, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, Mlp1a, etc.) como se describe en la presente descripción para potenciar la inducción de la respuesta inmunitaria.
Generalmente, las composiciones que comprenden las células activadas y expandidas como se describe en la presente descripción pueden utilizarse en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en individuos inmunocomprometidos. En particular, las composiciones que comprenden las células T modificadas con CAR contempladas en la presente descripción se usan en el tratamiento de las neoplasias malignas de las células B. Las células T modificadas con CAR de la presente invención pueden administrarse solas o como una composición farmacéutica en combinación con portadores, diluyentes, excipientes y/o con otros componentes tales como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares. En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas contempladas en la presente descripción comprenden una cantidad de células T genéticamente modificadas, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención que comprenden una población de células efectoras inmunitarias que expresan CAR, tales como las células T, pueden comprender tampones tales como solución salina tamponada neutra, solución salina tamponada con fosfato y similares; carbohidratos tales como glucosa, manosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tales como EDTA o glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente invención se formulan preferentemente para la administración parenteral, por ejemplo, administración intravascular (intravenosa o intraarterial), intraperitoneal o intramuscular.
Las composiciones farmacéuticas líquidas, ya sea soluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente, solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites no volátiles tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como solvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede envasarse en ampollas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples de vidrio o plástico. Una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril.
En una modalidad particular, las composiciones contempladas en la presente descripción comprenden una cantidad eficaz de células efectoras inmunitarias que expresan CAR, solas o en combinación con uno o más agentes terapéuticos. Por lo tanto, las composiciones de células efectoras inmunitarias que expresan CAR pueden administrarse solas o en combinación con otros tratamientos conocidos contra el cáncer, tales como radioterapia, quimioterapia, trasplante, inmunoterapia, terapia hormonal, terapia fotodinámica, etc. Las composiciones también pueden administrarse en combinación con antibióticos. Dichos agentes terapéuticos pueden aceptarse en la técnica como un tratamiento estándar para un estado patológico particular como se describe en la presente descripción, tal como un cáncer particular. Los agentes terapéuticos ilustrativos contemplados incluyen citocinas, factores de crecimiento, esteroides, AINE, DMARD, antiinflamatorios, quimioterapéuticos, radioterapéuticos, anticuerpos terapéuticos u otros agentes activos y auxiliares.
En ciertas modalidades, las composiciones que comprenden células efectoras inmunitarias que expresan CAR descritas en la presente descripción pueden administrarse junto con cualquier número de agentes quimioterapéuticos. Los ejemplos ilustrativos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, que incluyen altretamina, trietilenomelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; abastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de elliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2, 2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); derivados del ácido retinoico tales como Targretin™ (bexaroteno), Panretin™ (alitretinoína); ONTAK™ (denileukin diftitox); esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las hormonas sobre los cánceres tales como los antiestrógenos, que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Puede usarse una variedad de otros agentes terapéuticos junto con las composiciones descritas en la presente descripción. En una modalidad, la composición que comprende células efectoras inmunitarias que expresan CAR se administra con un agente antiinflamatorio. Los agentes o fármacos antiinflamatorios incluyen, pero no se limitan a, esteroides y glucocorticoides (que incluyen betametasona, budesonida, dexametasona, acetato de hidrocortisona, hidrocortisona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona), fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) que incluyen aspirina, ibuprofeno, naproxeno, metotrexato, sulfasalazina, leflunomida, medicamentos anti-TNF, ciclofosfamida y micofenolato.
Otros AINE ilustrativos se eligen del grupo que consiste en ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inhibidores de Cox-2 tales como VIOXX® (rofecoxib) y CELEBREX® (celecoxib) y sialilatos. Los analgésicos ilustrativos se eligen del grupo que consiste en paracetamol, oxicodona, tramadol de hidrocloruro de proporxifeno. Los glucocorticoides ilustrativos se eligen del grupo que consiste en cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona o prednisona. Los modificadores de la respuesta biológica ilustrativos incluyen moléculas dirigidas contra marcadores de la superficie celular (por ejemplo, CD4, CD5, etc.), inhibidores de citocinas, tales como los antagonistas del TNF (por ejemplo, Etanercept (En BREL®), adalimumab (HUMIRA®) e infliximab (REMICADE®), inhibidores de quimiocinas e inhibidores de moléculas de adhesión. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen anticuerpos monoclonales, así como también formas recombinantes de moléculas. Los DMARD ilustrativos incluyen azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, oro (oral (auranofín) e intramuscular) y minociclina.
Los ejemplos ilustrativos de anticuerpos terapéuticos adecuados para la combinación con las células T modificadas con CAR contempladas en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, bavituximab, bevacizumab (avastin), bivatuzumab, blinatumomab, conatumumab, daratumumab, duligotumab, dacetuzumab, dalotuzumab, elotuzumab (HuLuc63), gemtuzumab, ibritumomab, indatuximab, inotuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, milatuzumab, moxetumomab, ocaratuzumab, ofatumumab, rituximab, siltuximab, teprotumumab y ublituximab.
En ciertas modalidades, las composiciones descritas en la presente descripción se administran junto con una citocina. Por "citocina", como se usa en la presente descripción, se entiende un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen las hormonas de crecimiento tales como la hormona de crecimiento humana, la hormona de crecimiento humana N-metionil y la hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteicas tales como hormona estimulante de folículos (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nervioso tal como NGF-beta; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a la insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF) tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos y macrófagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, iL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y el ligando de kit (KL). Como se usa en la presente descripción, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
I. Métodos terapéuticos
Las células efectoras inmunitarias genéticamente modificadas contempladas en la presente descripción proporcionan métodos mejorados de inmunoterapia adoptiva para su uso en el tratamiento de afecciones relacionadas con células B que incluyen, pero no se limitan a afecciones inmunorreguladoras y neoplasias malignas hematológicas.
En modalidades particulares, la especificidad de una célula efectora inmunitaria primaria se redirige a las células B al modificar genéticamente la célula efectora inmunitaria primaria con un CAR contemplado en la presente descripción. En diversas modalidades, se usa un vector viral para modificar genéticamente una célula efectora inmunitaria con un polinucleótido particular que codifica un CAR que comprende un dominio de unión a antígeno anti-BCMA humanizado que se une a un polipéptido de BCMA; un dominio de bisagra; un dominio transmembrana (TM), un enlazador oligo o polipéptido corto, que une el dominio TM al dominio de señalización intracelular del CAR; y uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelulares; y un dominio de señalización primaria.
En una modalidad, la presente invención incluye un tipo de terapia celular en la que las células T se modifican genéticamente para expresar un CAR que se dirige a las células B que expresan BCMA, y la célula T con CAR se infunde a un receptor que lo necesita. La célula infundida puede matar las células B que provocan la enfermedad en el receptor. A diferencia de las terapias con anticuerpos, las células T con CAR pueden replicarse in vivo, lo que da como resultado una persistencia a largo plazo que puede conducir a una terapia contra el cáncer sostenida.
En una modalidad, las células T con CAR de la invención pueden experimentar una robusta expansión de células T in vivo y pueden persistir durante un período de tiempo prolongado. En otra modalidad, las células T con CAR de la invención evolucionan a células T de memoria específica que pueden reactivarse para inhibir cualquier formación o crecimiento tumoral adicional.
En modalidades particulares, las composiciones que comprenden células efectoras inmunitarias que comprenden los CAR contemplados en la presente descripción se usan en el tratamiento de afecciones asociadas con la actividad anormal de las células B.
Los ejemplos ilustrativos de afecciones que pueden tratarse, prevenirse o mejorarse mediante el uso de las células efectoras inmunitarias que comprenden los CAR contemplados en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a: lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, miastenia gravis, anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome antifosfolípido, enfermedad de Chagas, enfermedad de Grave, granulomatosis de Wegener, poliarteritis nodosa, síndrome de Sjogren, pénfigo vulgar, esclerodermia, esclerosis múltiple, síndrome antifosfolípido, vasculitis asociada a ANCA, enfermedad de Goodpasture, enfermedad de Kawasaki y glomerulonefritis rápidamente progresiva.
Las células efectoras inmunitarias modificadas también pueden tener aplicación en trastornos de células plasmáticas tales como la enfermedad de la cadena pesada, amiloidosis primaria o asociada a inmunocitos y gammapatía monoclonal de significado indeterminado (MGUS).
Como se usa en la presente descripción, "neoplasia maligna de las células B" se refiere a un tipo de cáncer que se forma en las células B (un tipo de célula del sistema inmunológico) como se describió más arriba.
En modalidades particulares, las composiciones que comprenden células T modificadas con CAR contempladas en la presente descripción se usan en el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas, que incluyen, pero no se limitan a, neoplasias malignas de las células B tales como, por ejemplo, mieloma múltiple (MM) y linfoma no Hodgkin (NHL).
El mieloma múltiple es una neoplasia maligna de las células B de la morfología de células plasmáticas maduras caracterizada por la transformación neoplásica de un solo clon de este tipo de células. Estas células plasmáticas proliferan en la BM y pueden invadir el hueso adyacente y, a veces, la sangre. Las formas variantes de mieloma múltiple incluyen mieloma múltiple manifiesto, mieloma múltiple latente, leucemia de células plasmáticas, mieloma no secretor, mieloma IgD, mieloma osteoesclerótico, plasmacitoma óseo solitario y plasmacitoma extramedular (ver, por ejemplo, Braunwald, y otros, (eds), Harrison's Principles of Internal Medicine, 15a edición (McGraw-Hill 2001)).
El linfoma no Hodgkin abarca un gran grupo de cánceres de linfocitos (glóbulos blancos). Los linfomas no Hodgkin pueden producirse a cualquier edad y a menudo están marcados por ganglios linfáticos que son más grandes de lo normal, fiebre y pérdida de peso. Existen muchos tipos diferentes de linfoma no Hodgkin. Por ejemplo, el linfoma no Hodgkin puede dividirse en tipos agresivos (de crecimiento rápido) e indolentes (de crecimiento lento). Aunque los linfomas no Hodgkin pueden derivarse de células B y células T, como se usa en la presente descripción, el término "linfoma no Hodgkin" y "linfoma no Hodgkin de células B" se usan indistintamente. Los linfomas no Hodgkin de células B (LNH) incluyen el linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño (CLL/SLL), linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores B y linfoma de células del manto. Los linfomas que se producen después del trasplante de médula ósea o de células madre son usualmente linfomas no Hodgkin de células B.
La leucemia linfocítica crónica (CLL) es un cáncer indolente (de crecimiento lento) que provoca un aumento lento en los glóbulos blancos inmaduros denominados linfocitos B, o células B. Las células cancerosas se diseminan a través de la sangre y la médula ósea, y también pueden afectar los ganglios linfáticos u otros órganos como el hígado y el bazo. La CLL eventualmente provoca que la médula ósea falle. A veces, en etapas posteriores de la enfermedad, la enfermedad se denomina linfoma linfocítico pequeño.
En modalidades particulares, se proporcionan métodos que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de células efectoras inmunitarias que expresan CAR contempladas en la presente descripción o una composición que comprende las mismas, a un paciente que lo necesite, solas o en combinación con uno o más agentes terapéuticos. En ciertas modalidades, las células de la invención se usan en el tratamiento de pacientes con riesgo de desarrollar una afección asociada con la actividad anormal de las células B o una neoplasia maligna de las células B. Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento o la prevención de una afección asociada con la actividad anormal de las células B o una neoplasia maligna de las células B que comprenden administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de las células modificadas con CAR contempladas en la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, los términos "individuo" y "sujeto" a menudo se usan indistintamente y se refieren a cualquier animal que presente un síntoma de una enfermedad, trastorno o afección que pueda tratarse con los vectores de terapia génica, productos terapéuticos basados en células y métodos descritos en otra parte de la presente descripción. En modalidades preferidas, un sujeto incluye cualquier animal que presente síntomas de una enfermedad, trastorno o afección del sistema hematopoyético, por ejemplo, una neoplasia maligna de las células B, que pueda tratarse con vectores de terapia génica, productos terapéuticos basados en células y métodos descritos en otra parte de la presente descripción. Los sujetos adecuados (por ejemplo, pacientes) incluyen animales de laboratorio (tales como ratones, ratas, conejos o conejillos de Indias), animales de granja y animales domésticos o mascotas (tales como gatos o perros). Se incluyen primates no humanos y, preferentemente, pacientes humanos. Los sujetos típicos incluyen pacientes humanos que tienen una neoplasia maligna de las células B, que se han diagnosticado con una neoplasia maligna de las células B o están en riesgo o que tienen una neoplasia maligna de las células B.
Como se usa en la presente descripción, el término "paciente" se refiere a un sujeto que se ha diagnosticado con una enfermedad, trastorno o afección particular que puede tratarse con los vectores de terapia génica, los productos terapéuticos basados en células y los métodos descritos en otra parte de la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción "tratamiento" o "tratar", incluye cualquier efecto beneficioso o conveniente sobre los síntomas o la patología de una enfermedad o afección patológica, y puede incluir incluso reducciones mínimas en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que se trata. El tratamiento puede implicar opcionalmente ya sea la reducción o la mejora de los síntomas de la enfermedad o afección, o el retraso de la progresión de la enfermedad o afección. El "tratamiento" no indica necesariamente la erradicación o cura completa de la enfermedad o afección, o los síntomas asociados a las mismas.
Como se usa en la presente descripción, "prevenir' y palabras similares tales como "prevenido", "que previene", etc., indican un enfoque para prevenir, inhibir o reducir la probabilidad de aparición o recurrencia de una enfermedad o afección. También se refiere a retrasar el inicio o la recurrencia de una enfermedad o afección o retrasar la aparición o recurrencia de los síntomas de una enfermedad o afección. Como se usa en la presente descripción, "prevención" y palabras similares incluyen además reducir la intensidad, el efecto, los síntomas y/o la carga de una enfermedad o afección antes del inicio o la recurrencia de la enfermedad o afección.
Por "potenciar' o "promover', o "aumentar" o "expandir' se refiere en general a la capacidad de una composición contemplada en la presente descripción, por ejemplo, una célula genéticamente modificada o vector que codifica un CAR para producir, provocar o inducir una mayor respuesta fisiológica (es decir, efectos aguas abajo) en comparación con la respuesta provocada ya sea por un vehículo o una molécula/composición de control. Una respuesta fisiológica medible puede incluir un aumento en la expansión, activación y persistencia de células T y/o un aumento en la capacidad de matar células cancerosas, entre otros evidentes a partir de la comprensión en la técnica y la descripción en la presente descripción. Una cantidad "aumentada" o "potenciada" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir un aumento que es 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluidos todos los números enteros y decimales entre y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7. 1,8, etc.) la respuesta producida por el vehículo o una composición de control.
Por "disminuir' o "aminorar" o "atenuar' o "reducir' o "mitigar" se refiere generalmente a la capacidad de la composición contemplada en la presente descripción para producir, inducir o provocar una respuesta fisiológica menor (es decir, efectos aguas abajo) en comparación a la respuesta provocada ya sea por un vehículo o una molécula/composición de control. Una cantidad "disminuida" o "reducida" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir una disminución que es 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluidos todos los números enteros y decimales entre y por encima de 1, por ejemplo, 1,5, 1,6, 1,7. 1,8, etc.) la respuesta (respuesta de referencia) producida por el vehículo, una composición de control o la respuesta en un linaje celular particular.
Por "mantener" o "preservar" o "mantenimiento" o "sin cambio" o "sin cambio sustancial" o "sin disminución sustancial" se refiere generalmente a la capacidad de una composición contemplada en la presente descripción para producir, inducir o provocar una respuesta fisiológica menor (es decir, efectos aguas abajo) en una célula, en comparación con la respuesta provocada ya sea por un vehículo, una molécula/composición de control o la respuesta en un linaje celular particular. Una respuesta comparable es aquella que no es diferente significativamente o diferente cuantitativamente de la respuesta de referencia.
En una modalidad, una composición que comprende las células efectoras inmunitarias genéticamente modificadas, contempladas en la presente descripción, puede usarse en un método para tratar una afección relacionada con células B en un sujeto que lo necesita que comprende administrar una cantidad eficaz, por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición. La cantidad y la frecuencia de administración estarán determinadas por factores tales como la afección del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del paciente, aunque los ensayos clínicos pueden determinar las dosis apropiadas.
En ciertas modalidades, puede ser conveniente administrar células efectoras inmunitarias activadas a un sujeto y después volver a extraerle sangre (o realizarle una aféresis), células efectoras inmunitarias activadas a partir de ellas de acuerdo con la presente invención y reinfundir al paciente con estas células efectoras inmunitarias activadas y expandidas. Este proceso puede llevarse a cabo varias veces cada pocas semanas. En ciertas modalidades, las células efectoras inmunitarias pueden activarse a partir de extracciones de sangre de 10 cc a 400 cc. En ciertas modalidades, las células efectoras inmunitarias se activan a partir de extracciones de sangre de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 100 cc, 150 cc, 200 cc, 250 cc, 300 cc, 350 cc o 400 cc o más. Sin estar limitados por la teoría, el uso de este protocolo de extracción múltiple/reinfusión múltiple de sangre puede servir para seleccionar ciertas poblaciones de células efectoras inmunitarias.
La administración de las composiciones contempladas en la presente descripción puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, lo que incluye por inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implante o trasplante. En una modalidad preferida, las composiciones se administran por vía parenteral. Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" tal como se usan en la presente descripción se refieren a los modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, generalmente mediante inyección, e incluyen inyección e infusión intravascular, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intratumoral, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intraesternal. En una modalidad, las composiciones contempladas en la presente descripción se administran a un sujeto mediante inyección directa en un tumor, ganglio linfático o sitio de infección.
En una modalidad, a un sujeto que lo necesita se le administra una cantidad eficaz de una composición para aumentar la respuesta inmunitaria celular a una afección relacionada con células B cáncer en el sujeto. La respuesta inmunitaria puede incluir respuestas inmunitarias celulares mediadas por células T citotóxicas capaces de matar células infectadas, células T reguladoras y respuestas de células T auxiliares. También pueden inducirse respuestas inmunitarias humorales, mediadas principalmente por células T auxiliares capaces de activar las células B, lo que conduce a la producción de anticuerpos. Puede usarse una variedad de técnicas para analizar el tipo de respuestas inmunitarias inducidas por las composiciones de la presente invención, que están bien descritas en la técnica; por ejemplo, Current Protocols in Immunology, editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, Nueva York.
En el caso de la muerte mediada por células T, la unión CAR-ligando inicia la señalización de CAR a la célula T, lo que resulta en la activación de una variedad de vías de señalización de las células T que inducen a la célula T a producir o liberar proteínas capaces de inducir apoptosis de las células objetivo mediante diversos mecanismos. Estos mecanismos mediados por células T incluyen (pero no se limitan a) la transferencia de gránulos citotóxicos intracelulares de la célula T a la célula objetivo, la secreción de células T de citocinas proinflamatorias que pueden inducir la muerte de las células objetivo directamente (o indirectamente a través del reclutamiento de otras células efectoras asesinas), y una regulación positiva de los ligandos de receptores de muerte (por ejemplo, FasL) en la superficie de las células T que inducen la apoptosis de las células objetivo después de la unión a su receptor de muerte correspondiente (por ejemplo, Fas) en la célula objetivo.
En una modalidad, la invención proporciona una población de células efectoras inmunitarias modificadas para su uso en un método de tratamiento de un sujeto diagnosticado con una afección relacionada con células B, que comprende retirar las células efectoras inmunitarias de un sujeto diagnosticado con una afección relacionada con las células B que expresa un BCMA, modificar genéticamente dichas células efectoras inmunitarias con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un CAR como se contempla en la presente descripción, lo que produce de esta manera la población de células efectoras inmunitarias modificadas y administrar la población de células efectoras inmunitarias modificadas al mismo sujeto. En una modalidad preferida, las células efectoras inmunitarias comprenden células T.
En ciertas modalidades, la presente descripción también proporciona métodos para estimular una respuesta inmunomoduladora mediada por células efectoras inmunitarias a una población de células objetivo en un sujeto, que comprende las etapas de administrar al sujeto una población de células efectoras inmunitarias que expresan un constructo de ácido nucleico que codifica una molécula CAR.
Los métodos para administrar las composiciones celulares descritas en la presente descripción incluyen cualquier método que sea eficaz para dar como resultado la reintroducción de células efectoras inmunitarias genéticamente modificadas ex vivo que expresen directamente un CAR de la invención en el sujeto o la reintroducción de los progenitores genéticamente modificados de las células efectoras inmunitarias que al introducirse en un sujeto se diferencian en células efectoras inmunitarias maduras que expresan el CAR. Un método comprende transducir células T de sangre periférica ex vivo con un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la invención y devolver las células transducidas al sujeto.
Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad para su comprensión, será evidente para un experto en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención que pueden hacerse ciertos cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del alcance de la reivindicaciones adjuntas. Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente a modo de ilustración y no a modo de limitación. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían modificarse o cambiarse para producir resultados esencialmente similares.
Ejemplos
Ejemplo 1
Construcción de CAR anti-BCMA
Los CAR que contienen anticuerpos scFv anti-BCMA humanizados se diseñaron para contener un promotor de MND unido operativamente a un scFv anti-BCMA, un dominio bisagra y transmembrana de CD8a y dominios coestimuladores de CD137 seguidos por el dominio de señalización intracelular de la cadena de CD3Z. Figura 1. Los CAR anti-BCMA comprenden una secuencia de péptido señal (SP) de CD8a para la expresión superficial en células efectoras inmunitarias. Las secuencias de polinucleótidos de los CAR anti-BCMA se exponen en las SEQ ID NO: 30 a 44, 70 y 72; las secuencias de polipéptidos de los CAR anti-BCMA se exponen en las SEQ ID NO: 15 a 29, 71 y 73; y los mapas vectoriales se muestran en la Figura 1. Las Tablas 3 a 5 muestran la identidad, la referencia del Genbank, el nombre de la fuente y la citación de los diversos segmentos de nucleótidos de diversos vectores lentivirales de CAR anti-BCMA ilustrativos.
Tabla 3.
Figure imgf000044_0001
continuación
Figure imgf000045_0001
Tabla 4.
Figure imgf000045_0002
continuación
Figure imgf000046_0001
Tabla 5.
Figure imgf000047_0001
continuación
Figure imgf000048_0001
Ejemplo 2
Tamiz de alto rendimiento de CAR anti-BCMA humanizado
Se desarrolló un ensayo de microcultivo para tamizar rápidamente los CAR anti-BCMA. El ensayo de microcultivo puede comparar 15-20 células T modificadas con CAR (células T con CAR). Se cultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en placas de 24 pocillos en medio que contenía IL-2 (CellGenix) y anticuerpos específicos para CD3 y CD28 (Miltenyi Biotec) para iniciar el crecimiento de células T. Las células T expandidas eran >99 % de células T CD3 positivas después de 7 días de cultivo.
Las células T expandidas de PBMC se modificaron por lentivirus para expresar los CAR anti-BCMA. Se añadieron sobrenadantes lentivirales transitorios al cultivo de PBMC en una relación de 1:1 (volumen:volumen) un día después del inicio del cultivo. Los cultivos se dividieron según fue necesario con medio fresco que contenía IL-2 después de volverse ópticamente confluentes mediante el uso de un microscopio de luz invertida. Después de doce días de cultivo, las células T con CAR se cosecharon y se evaluaron para determinar la expresión y función de CAR.
La expresión de los CAR en la superficie de las células T se ensayó por citometría de flujo mediante el uso de un anticuerpo reactivo a la porción del fragmento variable de cadena única de los CAR (Ig de cabra anti-ratón (GAM), Life Technologies). La expresión promedio de cada uno de los 15 CAR en tres donantes normales separados se muestra en la Tabla 6. La expresión de CAR fue comparable, y varió del 47 % al 63 % de células T positivas para CAR. Eficiencia de la transducción (representada como VCN en la Tabla 6) entre los diversos constructos de CAR probados. La VCN se ensayó por PCR mediante el uso de cebadores que amplifican el virus integrado.
Tabla 6.
Figure imgf000049_0001
Ejemplo 3
Reactividad específica de antígeno de células T con CAR
Se examinó la reactividad específica de antígeno después de cultivar conjuntamente con líneas celulares positivas para BCMA. Se cultivaron conjuntamente células T con CAR anti-BCMA con células K562 (K562-BCMA) diseñadas por ingeniería genética con BCMA durante 24 horas. La reactividad de las células T con CAR anti-BCMA a K562-BCMA se ensayó mediante la liberación de IFN-gamma (IFNy) en el sobrenadante por ELISA. Todas las células T con CAR anti-BCMA humanizadas ensayadas liberaron cantidades similares de IFNy y las cantidades fueron comparables a las del CAR anti-BCMA de ratón parental. Figura 2. Por el contrario, no se detectó IFNy en cultivos que contenían células T con CAR no transducidas o específicas de CD19, lo que confirma que se requería la especificidad de BCMA de las células T con CAR para la reactividad con células K562-BCMA.
En otro conjunto de experimentos, se examinó la actividad citolítica tumoral de las células T que expresan uno de los cinco CAR anti-BCMA humanizados. Las células T con CAR anti-BCMA se cultivaron conjuntamente con células K562-BCMA durante cuatro horas. Las cinco células T con CAR anti-BCMA humanizadas exhibieron una actividad citolítica similar a K562-BCMA en tres relaciones de células T:tumor. Figura 3. Sorprendentemente, todas las células T con CAR anti-BCMA humanizadas ensayadas mostraron mayor actividad citolítica que la célula T CAR anti-BCMA de ratón parental.
Ejemplo 4
Fenotipo y función de las células t con CAR anti-BCMA humanizadas
El fenotipo y la función de tres constructos anti-BCMA humanizados (anti-BCMA-10, anti-BCMA-11, anti-BCMA-31) se evaluaron en un sistema de cultivo directamente escalable a grandes procesos de fabricación clínicos. Brevemente, se cultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en matraces estáticos en medios que contenían IL-2 (CellGenix) y anticuerpos específicos para CD3 y CD28 (Miltenyi Biotec). Se añadieron 2x1o8 unidades de transducción de lentivirus que codifica CAR anti-BCMA un día después del inicio del cultivo. Las células T con CAR anti-BCMA se mantuvieron en fase logarítmica mediante la adición de medio fresco que contenía IL-2 durante un total de diez días de cultivo. Las células T transducidas con CAR anti-BCMA de ratón (BCMA-02), los tres CAR anti-BCMA humanizados o un CAR anti-CD19 que carece de capacidad de señalización (CAR19A) se expandieron a partir de tres donantes normales (800290, 800309, 801269). Las células T con CAR se evaluaron para determinar la expresión de CAR y antígeno y la reactividad de las células tumorales al final del cultivo.
La expresión de los CAR anti-BCMA en la superficie de las células T se ensayó por citometría de flujo mediante el uso de un anticuerpo reactivo a la porción del fragmento variable de cadena sencilla del CAR (Ig de cabra anti-ratón (GAM), Life Technologies). Figura 4. Se observó una expresión de CAR comparable tanto para las secuencias de ratón (msBCMA-02) como las humanizadas (anti-BCMA-10, anti-BCMA-11, anti-BCMA-31). No se observaron diferencias significativas en la expresión de CAR anti-BCMA de ratón o humanizado entre los tres donantes (Tabla 7).
Tabla 7.
Figure imgf000050_0001
No hubo diferencia significativa en la eficiencia de la transducción entre las células T con CAR anti-BCMA. El número de copias del vector (VCN), ensayado por PCR mediante el uso de cebadores que amplifican el virus integrado, fue comparable en todas las células T con CAR anti-BCMA (Tabla 8).
Tabla 8.
Figure imgf000050_0002
Se evaluó la reactividad de las células T con CAR anti-BCMA frente a líneas celulares y tumores positivos para BCMA. Se observó una liberación de IFNy comparable después del cultivo conjunto de células T con CAR anti-BCMA con células K562-BCMA (que expresan cantidades bajas o altas de BCMA) o líneas celulares de mieloma múltiple (RPMI-8226, NCI-H929) pero no con BCMA negativas líneas celulares (HDLM-2, K562). Figura 5.
Se examinó la actividad citolítica de las células T que expresan CAR anti-BCMA. Se cultivaron conjuntamente células T con CAR anti-BCMA con células K562-BCMA durante cuatro horas. Todas las células T con CAR anti-BCMA ensayadas provocaron una citotoxicidad de células K562-BCMA comparable. Figura 6.
Ejemplo 5
Liberación de citocina tónica en células T con CAR anti-BCMA humanizadas
En modalidades particulares, las moléculas de CAR anti-BCMA pueden liberar citocinas en ausencia de estimulación. Esta liberación de citocinas independiente del antígeno ("tónica") puede observarse después del cultivo in vitro en condiciones que carecen de la presencia de su antígeno.
Se observó la liberación de citocinas tónica de las células T diseñadas por ingeniería genética para expresar un CAR anti-BCMA-10 humanizado. El anti-BCMA10 humanizado se derivó de anti-BCMA-02 de ratón para reducir la inmunogenicidad potencial provocada por reacciones inmunitarias a secuencias de ratón. En total, existe menos del 20 % de diferencia de secuencia entre las moléculas de CAR anti-BCMA-02 y anti-BCMA-10. A pesar de estos cambios, no se observaron diferencias en la expresión de CAR o la reactividad a los antígenos de BCMA entre el anti-BCMA-02 de ratón y el anti-BCMA-10 humanizado (Figura 5 y Tabla 7). Sin embargo, en ausencia de BCMA, las células T con CAR anti-BCMA-10 humanizadas liberaron significativamente más citocinas inflamatorias. Figura 7.
Se cultivaron células T con CAR anti-BCMA-02 de ratón o anti-BCMA-10 humanizadas durante la noche en medio que contenía suero humano pero que carecía de BCMA. Se determinaron los niveles de 12 citocinas liberadas en el sobrenadante mediante el uso de un enfoque de perlas de multiplexado (ensayo Luminex). 5x104 células T con CAR anti-BCMA-10 humanizadas liberaron hasta 5 ng/ml de citocinas inflamatorias lo que incluye MIP1a, MIP1p, IFNy, GMCSF, IL-8 y TNFa. La misma cantidad de células T con CAR anti-BCMA-02 de ratón liberó menos de 200 pg/ml. Ninguna modificación de CAR afectó la liberación de citocinas antiinflamatorias, lo que incluye IL-10 e IL-4.
La liberación de citocinas tónicas planteó preocupaciones sobre la toxicidad conocida provocada por la liberación excesiva de citocinas en pacientes tratados con células T con CAR anti-CD 19. La alta liberación de citocinas tónicas independientes de antígeno observada a partir de células T con CAR anti-BCMA-10 humanizadas podría provocar niveles tóxicos de citocinas en pacientes incluso en ausencia del antígeno BCMA. Los cambios de secuencia realizados en anti-BCMA-02 de ratón para generar anti-BCMA-10 humanizado podrían introducir reactividad naciente a proteínas en suero humano que no se observa en células T anti-BCMA-02 de ratón. La reactividad a las proteínas del suero humano podría explicar la liberación de citocinas "tónica" observada en anti-BCMA-10 humanizado.
Se dejaron en reposo células T con CAR anti-BCMA-02 de ratón y anti-BCMA-10 humanizadas durante 48 horas en medio que contenía suero de ternero fetal en lugar de suero humano. Las células T con CAR se cambiaron a medios que contenían suero humano y la cantidad de IFNy liberada se comparó con cultivos mantenidos en suero de ternero fetal. Los medios de cultivo no afectaron la liberación de IFN-y de ninguna de las células T con CAR. No se detectó IFNy al final del cultivo de células T con CAR anti-BCMA-02 de ratón mientras que los cultivos de anti-BCMA10 humanizados contenían aproximadamente 4 ng/ml de IFNy independientemente del medio de cultivo (Figura 8). La falta de reactividad en las células T con CAR anti-BCMA-02 de ratón no se debió a la disfunción de las células T: ambas células T con CAR anti-BCMA reaccionaron con el BCMA inmovilizado en placa (datos no mostrados).
Ejemplo 6
Ajuste de la liberación de citocinas en células T con CAR anti-BCMA humanizadas
Los CAR que contienen secuencias de ratón tienen el potencial de provocar respuestas inmunitarias indeseables. La evidencia anecdótica en los ensayos clínicos con CAR ha sugerido que estas respuestas inmunitarias pueden limitar la eficacia de las células T con CAR en algunos pacientes. La humanización de secuencias de ratón es una estrategia para reducir las respuestas inmunitarias a las secuencias de ratón. Sin embargo, el CAR anti-BCMA-10 humanizado introdujo la liberación inflamatoria tónica. El dominio de reconocimiento de antígenos de las células T con CAR anti-BCMA-10 se une a la superficie de las células T mediante el uso de un dominio transmembrana CD8a. Se examinó la identidad del dominio transmembrana y su impacto en la dimerización de las moléculas de CAR y la activación posterior en ausencia de antígeno.
Se construyeron moléculas de CAR anti-BCMA-10 para reemplazar el dominio transmembrana CD8a con un dominio transmembrana de CTLA-4 (anti-BCMA-10.2) o un PD-1 (anti-BCMA-10.5) (Figura 9). La expresión de anti-BCMA-10.2 y anti-BCMA-10.5 se comparó con anti-BCMA-10 mediante tinción de proteína Bc MA humana recombinante conjugada con IgG1 Fc-PE y ensayada mediante el uso de citometría de flujo. La Tabla 9 muestra los resultados de dos células T de donantes normales representativas en las que se observó una robusta expresión superficial de las tres moléculas de CAR.
Tabla 9
Figure imgf000051_0001
Se evaluó la reactividad de las células T con CAR anti-BCMA con las líneas celulares K562 positivas para BCMA. Se observó una liberación de IFNy comparable después del cultivo conjunto de anti-BCMA-10, anti-BCMA-10.2 o anti-BCMA-10.5 con células K562-BCMA (Figura 10). Estos datos muestran que cambiar el dominio transmembrana a secuencias de CTLA-4 o PD-1 no afectó la reactividad de la célula T CAR anti-BCMA-10.
La liberación de citocinas tónica se evaluó al medir el IFNy en los sobrenadantes de cultivos durante la noche con anti-BCMA-02 de ratón, o anti-BCMA-10, anti-BCMA-10.2 o anti-BCMA-10.5 humanizados. Los cultivos anti-BCMA-02 contenían bajas cantidades de IFNy como se observó anteriormente. Los sobrenadantes de cultivos anti-BCMA-10 contenían mayores cantidades de IFNy. Los cultivos anti-BCMA-10.2 y anti-BCMA-10.5 contenían niveles de IFNy comparables a los de anti-BCMA-02 y niveles más bajos que los de las células T con CAR anti-BCMA-10 (Figura 11). Estos datos sugieren que cambiar el dominio transmembrana puede reducir la liberación de citocinas tónica sin afectar la reactividad antigénica de las células T con CAR.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor antigénico quimérico (CAR) que comprende: un anticuerpo anti-BCMA (antígeno de maduración de células B) humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a uno o más epítopos de un polipéptido de BCMA humano; un dominio transmembrana de CTLA-4 o un dominio transmembrana de PD-1 que reduce la liberación de citocinas independiente de antígeno del CAR; uno o más dominios de señalización coestimuladora intracelulares; y un dominio de señalización primaria.
2. El CAR de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-BCMA humanizado o el fragmento de unión a antígeno que se une al polipéptido de BCMA humano;
a) se selecciona del grupo que consiste en: una Ig de camello, Ig NAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, anticuerpo Fv monocatenario ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpo, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, proteína Fv estabilizada con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de dominio único (sdAb, Nanocuerpo), preferentemente, un scFv; y/o
b) comprende una o más CDR como se expone en cualquiera de las SEQ ID NOs: 4-6; y/o
c) comprende una o más CDR como se expone en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3; y/o
d) comprende una secuencia de la cadena ligera variable como se expone en cualquiera de las SEQ ID NOs: 7-9, en donde opcionalmente la secuencia de la cadena ligera variable comprende las secuencias de CDR que se exponen en las SeQ ID NOs: 1-3; y/o
e) comprende una secuencia de la cadena pesada variable como se expone en cualquiera de las SEQ ID NOs: 10-14, en donde opcionalmente la secuencia de la cadena pesada variable comprende las secuencias de CDR que se exponen en las SEQ ID NOs: 4-6.
3. El CAR de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el uno o más dominios de señalización coestimuladora son de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA-4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C, SLP76, TRIM y ZAP70, preferentemente, en donde el uno o más dominios de señalización coestimuladora son de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en: CD28, CD134 y CD137.
4. El CAR de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además un polipéptido de la región bisagra, preferentemente, en donde el polipéptido de la región bisagra comprende una región bisagra de PD1 o CTLA-4.
5. El CAR de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además un péptido señal, preferentemente, en donde el péptido señal comprende un polipéptido señal de la cadena pesada de IgG1, un polipéptido señal de CD8a o un polipéptido señal del receptor alfa de GM-CSF humano.
6. El CAR de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 71 o SEQ ID NO: 73.
7. Un polinucleótido que codifica un CAR de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un polinucleótido que codifica un CAR, en donde la secuencia de polinucleótidos se expone en SEQ ID NO: 70 o SEQ ID NO: 72.
8. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 7, en donde opcionalmente el vector es un vector de expresión, un vector episomal, un vector viral, un vector retroviral, un vector lentiviral, preferentemente, en donde el vector lentiviral se selecciona del grupo que consiste esencialmente en: virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1); virus de inmunodeficiencia humana 2 (VIH-2), virus visna-maedi (VMV); virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV); virus de la anemia infecciosa equina (EIAV); virus de inmunodeficiencia felina (FIV); virus de inmunodeficiencia bovina (BIV); y virus de inmunodeficiencia de los simios (SIV).
9. El vector de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el vector es un vector viral, un vector retroviral o un vector lentiviral que comprende una LTR retroviral izquierda (5'), una señal de empaquetamiento Psi (V), un segmento central de polipurina/pliegue de ADN (cPPT/FLAP), un elemento de exportación retroviral; un promotor unido operativamente al polinucleótido de la reivindicación 7; y una LTR retroviral derecha (3'); opcionalmente, en donde:
a) el vector comprende además una secuencia de poliadenilación heteróloga; y/o
b) el vector comprende además un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis B (HPRE) o un elemento regulador postranscripcional de la marmota (WPRE); y/o
c) el promotor de la LTR 5' se reemplaza con un promotor heterólogo; y/o
d) el promotor heterólogo es un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) o un promotor del virus de los simios 40 (SV40); y/o
e) la LTR 5' o la LTR 3' es una LTR de lentivirus; y/o
f) la LTR 3' comprende una o más modificaciones, comprende una o más deleciones y/o es una LTR autoinactivable (SIN); y/o
g) la secuencia de poliadenilación es una secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina o señal de poliadenilación de p-globina de conejo; y/o
h) el polinucleótido de la reivindicación 7 comprende una secuencia de Kozak optimizada; y/o
i) el promotor unido operativamente al polinucleótido de la reivindicación 7 se selecciona del grupo que consiste en: un promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1-a), un promotor de fosfoglicerato quinasa-1 (PGK), un promotor de ubiquitina-C (UBQ-C), un potenciador de citomegalovirus/promotor de beta-actina de pollo (CAG), potenciador de polioma/promotor de timidina quinasa del herpes simple (MC1), un promotor de beta actina (p-ACT), un promotor del virus de los simios 40 (SV40) y un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo, región de control negativo eliminada, promotor del sitio de unión al cebador dl587rev sustituido (MND).
10. Una célula efectora inmunitaria que comprende el vector de la reivindicación 8 o 9, en donde, preferentemente, la célula efectora inmunitaria se selecciona del grupo que consiste en: un linfocito T y una célula asesina natural (NK).
11. Una composición que comprende la célula efectora inmunitaria de la reivindicación 10 y un excipiente fisiológicamente aceptable.
12. La composición de la reivindicación 11 para su uso en un método de tratamiento de una afección relacionada con las células B en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición.
13. La composición para el uso de la reivindicación 12, en donde la afección relacionada con las células B es: a) mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, proliferaciones de células B de potencial maligno incierto, granulomatosis linfomatoide, trastorno linfoproliferativo postrasplante, trastorno inmunorregulador, artritis reumatoide, miastenia grave, púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome antifosfolípidos, enfermedad de Chagas, enfermedad de Grave, granulomatosis de Wegener, poliarteritis nodosa, síndrome de Sjogren, pénfigo vulgar, esclerodermia, esclerosis múltiple, síndrome antifosfolípido, vasculitis asociada a ANCA, enfermedad de Goodpasture, enfermedad de Kawasaki, anemia hemolítica autoinmunitaria y glomerulonefritis rápidamente progresiva, enfermedad de la cadena pesada, amiloidosis primaria o asociada a inmunocitos, o gammapatía monoclonal de significado indeterminado;
b) una neoplasia maligna de las células B, preferentemente, en donde la neoplasia maligna de las células B es mieloma múltiple (MM) o linfoma no Hodgkin (NHL), opcionalmente en donde, el MM se selecciona del grupo que consiste en: mieloma múltiple manifiesto, mieloma múltiple latente, leucemia de células plasmáticas, mieloma no secretor, mieloma IgD, mieloma osteoesclerótico, plasmocitoma óseo solitario y plasmocitoma extramedular, o en donde el NHL se selecciona del grupo que consiste en: linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica/linfoma linfocítico pequeño (CLL/SLL), linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, linfoma inmunoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores B y linfoma de células del manto;
c) una neoplasia maligna de células plasmáticas; o
d) una enfermedad autoinmunitaria, preferentemente, en donde la enfermedad autoinmunitaria es lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, púrpura trombocitopénica idiopática, miastenia grave o anemia hemolítica autoinmunitaria.
ES15824299T 2014-07-24 2015-07-23 Receptores antigénicos quiméricos de BCMA Active ES2878449T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462028664P 2014-07-24 2014-07-24
US201462044103P 2014-08-29 2014-08-29
US201562152575P 2015-04-24 2015-04-24
PCT/US2015/041722 WO2016014789A2 (en) 2014-07-24 2015-07-23 Bcma chimeric antigen receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2878449T3 true ES2878449T3 (es) 2021-11-18

Family

ID=55163965

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15824299T Active ES2878449T3 (es) 2014-07-24 2015-07-23 Receptores antigénicos quiméricos de BCMA

Country Status (14)

Country Link
US (2) US20170226216A1 (es)
EP (1) EP3172231B1 (es)
JP (1) JP6706244B2 (es)
KR (1) KR102523934B1 (es)
CN (1) CN106795217B (es)
AU (1) AU2015292590B2 (es)
CA (1) CA2956002C (es)
ES (1) ES2878449T3 (es)
IL (1) IL250202B (es)
MX (1) MX2017001079A (es)
RU (1) RU2747457C2 (es)
SG (2) SG10201900455YA (es)
WO (1) WO2016014789A2 (es)
ZA (1) ZA201700730B (es)

Families Citing this family (201)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112016024481A2 (pt) * 2014-04-25 2017-10-10 Bluebird Bio Inc receptores quiméricos de antígenos com promotor mnd
US11041021B2 (en) 2014-05-23 2021-06-22 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Car based immunotherapy
SI3151672T1 (sl) 2014-06-06 2021-03-31 Bluebird Bio, Inc. Izboljšani T-celični sestavki
PT3226897T (pt) 2014-12-05 2021-04-13 Eureka Therapeutics Inc Anticorpos tendo como alvo o antigénio de maturação das células b e métodos de utilização
PL3227432T3 (pl) 2014-12-05 2024-03-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeryczne receptory antygenowe ukierunkowane na antygen dojrzewania komórek b i ich zastosowania
BR112017012502B1 (pt) 2014-12-12 2020-09-15 Bluebird Bio, Inc. Polinucleotídeo, polipeptídeo de car codificado pelo dito polinucleotídeo, vetor compreendendo o dito polinucleotídeo, composição compreendendo o dito vetor e método para geração de uma célula imune efetora compreendendo um car
US10647778B2 (en) * 2015-02-09 2020-05-12 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Bi-specific chimeric antigen receptor and uses thereof
US11248058B2 (en) 2015-02-19 2022-02-15 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric antigen receptors and uses thereof
IL297223A (en) 2015-04-13 2022-12-01 Pfizer Chimeric antigen receptors antigen-directed maturation of b cells
HUE051661T2 (hu) 2015-05-18 2021-03-29 Tcr2 Therapeutics Inc Készítmények és gyógyászati felhasználások a TCR újraprogramozására fúziós fehérjék felhasználásával
CN106397592A (zh) * 2015-07-31 2017-02-15 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对程序性死亡配体(pd-l1)的单域抗体及其衍生蛋白
CN105384825B (zh) * 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
US11479755B2 (en) 2015-12-07 2022-10-25 2Seventy Bio, Inc. T cell compositions
EP3397756B1 (en) 2015-12-30 2023-03-08 Novartis AG Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
EP3408297A2 (en) 2016-01-29 2018-12-05 Med Manor Organics, (P) Ltd A chimeric antigen receptor specific to b-cell maturation antigen, a recombinant expression vector and a method thereof
US20200281973A1 (en) 2016-03-04 2020-09-10 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
JP7250519B2 (ja) * 2016-03-23 2023-04-03 ヘルムホルツ ツェントゥルム ミュンヘン ドイチェス フォルシュングスツェントゥルム フューア ゲズントハイト ウント ウムヴェルト （ゲーエムベーハー） Ｐｄ－１及び４－１ｂｂの融合タンパク質
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
MA43603A1 (fr) 2016-04-01 2019-03-29 Amgen Inc Récepteurs chimériques et leurs procédés d'utilisation
IL303785A (en) 2016-04-01 2023-08-01 Kite Pharma Inc Chimeric antigen and T cell receptors and methods of use
NZ746700A (en) 2016-04-01 2023-04-28 Kite Pharma Inc Bcma binding molecules and methods of use thereof
US20190161530A1 (en) * 2016-04-07 2019-05-30 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptor t cell compositions
CA3020993A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 Bluebird Bio, Inc. Salvage chimeric antigen receptor systems
SI3443096T1 (sl) 2016-04-15 2023-07-31 Novartis Ag Sestavki in postopki za selektivno izražanje himerni antigenskih receptorjev
US11634498B2 (en) 2016-04-29 2023-04-25 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2017211900A1 (en) 2016-06-07 2017-12-14 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Chimeric antigen receptor and car-t cells that bind bcma
US20190161542A1 (en) 2016-08-01 2019-05-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
JP7109789B2 (ja) 2016-08-02 2022-08-01 ティーシーアール２ セラピューティクス インク． 融合タンパク質を使用したｔｃｒの再プログラム化のための組成物及び方法
EP3500696A4 (en) 2016-08-16 2020-04-08 Bluebird Bio, Inc. IL-10 RECEPTOR ALPHA HOMING ENDONUCLEASE VARIANTS, COMPOSITIONS AND METHODS FOR USE
US20190263928A1 (en) * 2016-09-30 2019-08-29 Baylor College Of Medicine Adaptive chimeric antigen receptor t-cell design
ES2875959T3 (es) 2016-10-07 2021-11-11 Tcr2 Therapeutics Inc Composiciones y métodos para reprogramación de receptores de linfocitos T mediante el uso de proteínas de fusión
WO2018098365A2 (en) 2016-11-22 2018-05-31 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
EP4035659A1 (en) 2016-11-29 2022-08-03 PureTech LYT, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
US20190350978A1 (en) * 2016-12-05 2019-11-21 Juno Therapeutics, Inc. Production of engineered cells for adoptive cell therapy
CN108276493B (zh) * 2016-12-30 2023-11-14 南京传奇生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
CN108277205B (zh) * 2016-12-30 2022-12-20 四川大学 表达cxcr4的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞及制备方法和用途
ES2912408T3 (es) 2017-01-26 2022-05-25 Novartis Ag Composiciones de CD28 y métodos para terapia con receptores quiméricos para antígenos
WO2018144535A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
AU2018222749B2 (en) * 2017-02-17 2024-04-18 Fred Hutchinson Cancer Center Combination therapies for treatment of BCMA-related cancers and autoimmune disorders
AU2018243664B2 (en) * 2017-03-31 2024-02-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of treating T cell exhaustion by inhibiting or modulating T cell receptor signaling
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
WO2018204427A1 (en) 2017-05-01 2018-11-08 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a cell therapy and an immunomodulatory compound
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
MX2019013514A (es) 2017-05-12 2020-01-20 Crispr Therapeutics Ag Materiales y metodos para modificar celulas por ingenieria genetica y usos de los mismos en inmunooncologia.
EP3638218A4 (en) 2017-06-14 2021-06-09 The Broad Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHOD OF TARGETING COMPLEMENTING COMPONENT 3 FOR INHIBITION OF TUMOR GROWTH
JP7303126B2 (ja) 2017-06-20 2023-07-04 テネオバイオ， インコーポレイテッド 抗ｂｃｍａ重鎖のみ抗体
WO2019000223A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ENABLERS OF IMMUNE EFFECTOR CELLS OF CHIMERIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
PE20200614A1 (es) 2017-07-14 2020-03-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Molecula de polipeptido con especificidad dual mejorada
EP3694878A1 (en) 2017-09-14 2020-08-19 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
CA3075717A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
BR112020005077A2 (pt) 2017-09-14 2020-09-15 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited tratamento de combinação para câncer
WO2019067677A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Cell Design Labs, Inc. METHODS OF MANUFACTURING RECEPTORS OF ANTI-CD307E ANTI-BACTERIAL CHIMERIC ANTIGENS AND USES THEREFOR
WO2019079569A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Novartis Ag COMPOSITIONS AND METHODS FOR SELECTIVE DEGRADATION OF A PROTEIN
MX2020004572A (es) 2017-11-01 2020-10-07 Juno Therapeutics Inc Receptores de antigenos quimericos especificos para el antigeno de maduracion de celulas b y polinucleotidos que codifican los mismos.
US11851679B2 (en) 2017-11-01 2023-12-26 Juno Therapeutics, Inc. Method of assessing activity of recombinant antigen receptors
CN109748968B (zh) * 2017-11-03 2020-12-01 西安宇繁生物科技有限责任公司 Bcma特异性嵌合抗原受体t细胞及其应用
BR112020008812A2 (pt) 2017-11-06 2020-10-27 Juno Therapeutics Inc combinação de terapia celular e um inibidor de gama secretase
WO2019094983A1 (en) 2017-11-13 2019-05-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for treating cancer by targeting the clec2d-klrb1 pathway
WO2019099639A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 Navartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, cd19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
MX2020005651A (es) 2017-11-30 2020-10-28 Novartis Ag Receptor de antigeno quimerico dirigido a bcma y usos del mismo.
CN108085340B (zh) * 2017-12-07 2020-07-07 北京市肿瘤防治研究所 一种同时表达靶向cd19和cd20的car与pd1-cd28嵌合受体的慢病毒载体
SG11202005750TA (en) * 2017-12-20 2020-07-29 Poseida Therapeutics Inc Vcar compositions and methods for use
CN109971715A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 深圳华大生命科学研究院 一种扩增特异性car-t细胞的培养方法
US20200368268A1 (en) 2018-01-08 2020-11-26 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
AU2019215031A1 (en) 2018-01-31 2020-08-20 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
EP3674327A4 (en) 2018-02-01 2021-05-05 Nanjing Iaso Biotherapeutics Co., Ltd. CHEMICAL ANTIGENIC RECEPTOR (CAR) BINDING TO BCMA AND ITS APPLICATIONS
CN116082518A (zh) 2018-02-01 2023-05-09 南京驯鹿生物技术股份有限公司 一种结合bcma的嵌合抗原受体（car）及其应用
US11807663B2 (en) 2018-02-01 2023-11-07 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Fully humanized anti-B cell maturation antigen (BCMA) single-chain antibody and use thereof
SG11202007543TA (en) * 2018-02-09 2020-09-29 Immatics Us Inc Methods for manufacturing t cells
TW201934575A (zh) 2018-02-11 2019-09-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 一種分離的嵌合抗原受體以及包含其的修飾ｔ細胞及用途
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
EP3549597A1 (en) * 2018-04-06 2019-10-09 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Synthetic signalling constructs and its use
CN110372796B (zh) * 2018-04-12 2023-05-02 上海赛比曼生物科技有限公司 靶向bcma的嵌合抗原受体及其制法和应用
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
US20210047405A1 (en) 2018-04-27 2021-02-18 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788369A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
EP3790629A1 (en) 2018-05-11 2021-03-17 CRISPR Therapeutics AG Methods and compositions for treating cancer
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
CA3098420A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Novartis Ag Binding molecules against bcma and uses thereof
US20210371932A1 (en) 2018-06-01 2021-12-02 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients
WO2019237035A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
JP7438988B2 (ja) 2018-06-13 2024-02-27 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａキメラ抗原受容体及びその使用
KR20210020900A (ko) * 2018-06-14 2021-02-24 블루버드 바이오, 인코포레이티드. 항-bcma car 항체, 접합체 및 사용 방법
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
CN112689516A (zh) * 2018-07-11 2021-04-20 细胞基因公司 抗bcma嵌合抗原受体的用途
WO2020018825A1 (en) * 2018-07-19 2020-01-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric antigen receptors with bcma specificity and uses thereof
CN109134665B (zh) * 2018-08-24 2021-06-11 上海先博生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及应用
BR112021003410A2 (pt) * 2018-08-24 2021-05-18 Shenzhen Pregene Biopharma Co. Ltd. anticorpos de domínio único anti-bcma, grupo de genes dos ditos anticorpos, polipeptídeo, vetor de expressão, célula hospedeira, receptor de antígeno quimérico, célula t modificada pelo mesmo, composição farmacêutica e usos dos ditos anticorpos
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
JP2021534783A (ja) 2018-08-31 2021-12-16 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
MX2021003636A (es) * 2018-09-27 2021-07-21 Autolus Ltd Receptor antigenico quimerico.
WO2020072700A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hla single allele lines
WO2020081730A2 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating microenvironment
US20210386788A1 (en) 2018-10-24 2021-12-16 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
US20220170097A1 (en) 2018-10-29 2022-06-02 The Broad Institute, Inc. Car t cell transcriptional atlas
CN112955748A (zh) 2018-10-31 2021-06-11 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 治疗癌症的方法
PE20211058A1 (es) 2018-11-01 2021-06-07 Juno Therapeutics Inc Receptores de antigenos quimericos especificos para el miembro d del grupo 5 de la clase c del receptor acoplado a proteina g (gprc5d)
CN113573719A (zh) 2018-11-08 2021-10-29 朱诺治疗学股份有限公司 治疗和t细胞调节的方法和组合
WO2020131586A2 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
CA3123511A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
CN109651511B (zh) * 2018-12-26 2020-06-09 广州百暨基因科技有限公司 一种靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
CN109485733B (zh) * 2018-12-28 2020-04-24 广州百暨基因科技有限公司 一种全人源的抗bcma嵌合抗原受体及其应用
US11739156B2 (en) 2019-01-06 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology Methods and compositions for overcoming immunosuppression
CN111454358A (zh) * 2019-01-18 2020-07-28 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
JP2022523763A (ja) * 2019-02-13 2022-04-26 コイミューン インコーポレイテッド キメラ抗原受容体を発現する細胞とモノクローナル抗体との組み合わせを用いたがん免疫療法
WO2020165833A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
CA3123519A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
KR20210134339A (ko) 2019-02-25 2021-11-09 노파르티스 아게 바이러스 전달을 위한 메조다공성 실리카 입자 조성물
US20220154282A1 (en) 2019-03-12 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Detection means, compositions and methods for modulating synovial sarcoma cells
AU2020241428A1 (en) 2019-03-15 2021-08-12 Cartesian Therapeutics, Inc. Anti-BCMA chimeric antigen receptors
EP3938387A1 (en) * 2019-03-15 2022-01-19 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Chimeric adaptor and kinase signaling proteins and their use in immunotherapy
EP3942023A1 (en) 2019-03-18 2022-01-26 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating metabolic regulators of t cell pathogenicity
EP3942025A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novartis AG Car-t cell therapies with enhanced efficacy
JP2022529618A (ja) 2019-04-04 2022-06-23 上海医薬集団股▲フン▼有限公司 腫瘍抗原認識受容体を有する免疫細胞とその応用
US20220168389A1 (en) 2019-04-12 2022-06-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
JP2022531185A (ja) 2019-04-30 2022-07-06 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト 遺伝子改変ｔ細胞を標的化するｃｄ１９を使用するｂ細胞悪性病変の同種細胞療法
EP3733707A1 (en) 2019-04-30 2020-11-04 Celyad S.A. Car t-cells targeting bcma and uses thereof
GB201906283D0 (en) * 2019-05-03 2019-06-19 Moredun Res Institute Vector
CN111944054B (zh) * 2019-05-15 2022-04-05 重庆精准生物技术有限公司 抗bcma的car及其表达载体和应用
CN110078826B (zh) * 2019-05-15 2021-10-01 重庆精准生物技术有限公司 抗bcma的人源化单链抗体及应用
WO2020236967A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Random crispr-cas deletion mutant
BR112022002236A2 (pt) 2019-08-06 2022-05-03 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Composições, composições farmacêuticas e uso das mesmas para tratar câncer, bem como formulações que compreendem as mesmas
WO2021030627A1 (en) 2019-08-13 2021-02-18 The General Hospital Corporation Methods for predicting outcomes of checkpoint inhibition and treatment thereof
WO2021041922A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
WO2021046451A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
US20220331363A1 (en) * 2019-09-20 2022-10-20 Shanghai GenBase Biotechnology Co., Ltd. Bcma-targeted antibody and chimeric antigen receptor
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
US11793787B2 (en) 2019-10-07 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for enhancing anti-tumor immunity by targeting steroidogenesis
CN112646031B (zh) * 2019-10-10 2021-12-07 天境生物科技(上海)有限公司 抗4-1bb纳米抗体及其用途
CN110642953B (zh) * 2019-10-12 2021-09-17 华夏源（上海）细胞基因工程股份有限公司 一种靶向bcma的t细胞受体融合蛋白和应用
US11844800B2 (en) 2019-10-30 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia
CN115925976A (zh) * 2019-11-21 2023-04-07 博生吉医药科技(苏州)有限公司 Cd7-car-t细胞及其制备和应用
WO2021108661A2 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Novartis Ag Chimeric antigen receptors and uses thereof
JP2023505719A (ja) * 2019-12-16 2023-02-10 ナンジン レジェンド バイオテック シーオー．， エルティーディー． Ｂｃｍａを標的とする単一ドメイン抗体及びキメラ抗原受容体、ならびにその使用方法
CN115175937A (zh) 2019-12-20 2022-10-11 诺华股份有限公司 用于治疗骨髓纤维化和骨髓增生异常综合征的抗TIM-3抗体MBG453和抗TGF-β抗体NIS793与或不与地西他滨或抗PD-1抗体斯巴达珠单抗的组合
US20230114854A1 (en) * 2020-02-14 2023-04-13 Cellgentek Co., Ltd. Chimeric antigen receptor targeting b-cell maturation antigen and use thereof
TW202146441A (zh) 2020-02-27 2021-12-16 瑞士商諾華公司 製備表現嵌合抗原受體的細胞之方法
WO2021173995A2 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
BR112022020333A2 (pt) 2020-04-10 2022-11-22 Juno Therapeutics Inc Métodos e usos relacionados à terapia celular projetada com um receptor de antígeno quimérico que alveja o antígeno de maturação de células b
CN116157125A (zh) 2020-04-28 2023-05-23 朱诺治疗学股份有限公司 针对bcma的t细胞疗法与免疫调节化合物的组合
JP2023529211A (ja) 2020-06-11 2023-07-07 ノバルティス アーゲー Ｚｂｔｂ３２阻害剤及びその使用
TW202214844A (zh) 2020-06-17 2022-04-16 美商健生生物科技公司 用於製造多能幹細胞之材料及方法
JP2023531676A (ja) 2020-06-23 2023-07-25 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピぺリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与レジメン
WO2022029573A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Novartis Ag Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
CA3188978A1 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Sandeep Tharian Koshy Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
WO2022060806A1 (en) 2020-09-16 2022-03-24 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for expression of anti-bcma chimeric antigen receptors with small molecule-regulated il15 in t cells
CN112143707A (zh) * 2020-09-29 2020-12-29 广东先康达生物科技有限公司 一种治疗自身免疫细胞的免疫细胞及其应用
US20230399412A1 (en) 2020-10-12 2023-12-14 Nanjing IASO Biotechnology Co., Ltd. Antibody and chimeric antigen receptor (car) binding to cd70, and application thereof
EP4238990A1 (en) 2020-11-01 2023-09-06 Nanjing Iaso Biotechnology Co., Ltd. Fully human antibody targeting cd5, and fully human chimeric antigen receptor (car) and application thereof
WO2022116952A1 (zh) 2020-12-01 2022-06-09 苏州克睿基因生物科技有限公司 靶向cd70的抗原结合蛋白及其应用
US20240010745A1 (en) * 2020-12-14 2024-01-11 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Methods and compositions for depleting natural killer cells and uses thereof in cellular therapies
EP4263600A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
CN113024671B (zh) 2020-12-31 2022-05-24 北京艺妙神州医药科技有限公司 一种抗bcma的抗体及其应用
EP4279508A1 (en) 2021-01-12 2023-11-22 Nanjing Iaso Biotechnology Co., Ltd. Cd5-targeting fully humanized antibody
CN116917333A (zh) * 2021-01-20 2023-10-20 江苏恒瑞医药股份有限公司 特异性结合bcma和cd3的抗原结合分子及其医药用途
KR20230165771A (ko) 2021-03-03 2023-12-05 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 T 세포 요법 및 dgk 억제제의 조합
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
WO2022221726A2 (en) 2021-04-16 2022-10-20 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapies with bcma-directed t cell therapy
IL307598A (en) 2021-04-16 2023-12-01 Juno Therapeutics Inc T-cell therapy in patients who have had a previous stem cell transplant
WO2022228429A1 (zh) * 2021-04-27 2022-11-03 原启生物科技(上海)有限责任公司 靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
CN118056008A (zh) 2021-04-27 2024-05-17 诺华股份有限公司 病毒载体生产系统
IL308257A (en) 2021-05-05 2024-01-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigen binding proteins that uniquely bind PRAME
CN117916256A (zh) 2021-05-06 2024-04-19 朱诺治疗学有限公司 用于刺激和转导t细胞的方法
CN117396513A (zh) 2021-05-28 2024-01-12 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 治疗癌症的联合疗法
WO2022269473A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for hinge regions in functional exogenous receptors
AU2022310862A1 (en) 2021-07-14 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Engineered t cell receptors fused to binding domains from antibodies
CA3227515A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Biopharmaceutical compositions and stable isotope labeling peptide mapping method
AU2022325955A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions
CA3227108A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Xiaomeng HU Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy
AU2022325231A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions
AU2022326565A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy
AU2022330406A1 (en) 2021-08-20 2024-03-07 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor–expressing cells
CN118056012A (zh) 2021-08-24 2024-05-17 赛斯尔擎生物技术（上海）有限公司 一种修饰细胞的方法
WO2023025207A1 (zh) 2021-08-24 2023-03-02 赛斯尔擎生物技术（上海）有限公司 T细胞产品及其用途
WO2023044633A1 (zh) * 2021-09-22 2023-03-30 南京驯鹿医疗技术有限公司 Bcma car-t在制备用于治疗自身免疫病的药物中的应用
CA3233953A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Matthew Bruce Combination therapies for treating cancer
US20230134748A1 (en) 2021-11-03 2023-05-04 Janssen Biotech, Inc. Corticosteriod Reduction in Treatment with Anti-CD38 Antibody
WO2023081735A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen for use in treating myeloma
WO2023109257A1 (zh) * 2021-12-16 2023-06-22 浙江瑞加美生物科技有限公司 人源化的bcma抗体和bcma-car-t/bcma-car-dnt细胞
WO2023144702A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy for cancer
WO2023147515A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Juno Therapeutics, Inc. Methods of manufacturing cellular compositions
WO2023158836A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered cd47 proteins and uses thereof
WO2023196996A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 2Seventy Bio, Inc. Multipartite receptor and signaling complexes
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2023213969A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
WO2023220655A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Celgene Corporation Methods to overcome drug resistance by re-sensitizing cancer cells to treatment with a prior therapy via treatment with a t cell therapy
WO2023220641A2 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Juno Therapeutics, Inc. Methods and uses related to t cell therapy and production of same
WO2023230581A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
WO2023230548A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Method for predicting response to a t cell therapy
WO2024018426A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Janssen Biotech, Inc. Enhanced transfer of genetic instructions to effector immune cells
WO2024031091A2 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for gprc5d and bcma
WO2024054944A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a t cell therapy and continuous or intermittent dgk inhibitor dosing
WO2024077256A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 The General Hospital Corporation Methods and compositions for high-throughput discovery ofpeptide-mhc targeting binding proteins
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations
WO2024097905A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 Celgene Corporation Methods of treatment with t cell therapy and immunomodulatory agent maintenance therapy
WO2024097315A2 (en) 2022-11-02 2024-05-10 Sana Biotechnology, Inc. Cell therapy products and methods for producing same
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
PT1498427E (pt) 1992-08-21 2010-03-22 Univ Bruxelles Imunoglobulinas desprovidas de cadeias leves
US6838254B1 (en) 1993-04-29 2005-01-04 Conopco, Inc. Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of camelidae
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
FR2777909B1 (fr) 1998-04-24 2002-08-02 Pasteur Institut Utilisation de sequences d'adn de structure triplex pour le tranfert de sequences de nucleotides dans des cellules, vecteurs recombinants contenant ces sequences triplex
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
AU2001243288B2 (en) 2000-02-24 2005-11-24 Life Technologies Corporation Simultaneous stimulation and concentration of cells
CA2446110C (en) 2001-05-01 2013-06-25 National Research Council Of Canada A system for inducible expression in eukaryotic cells
US7670781B2 (en) 2002-01-03 2010-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an agent that provides a primary activation signal and another agent that provides a co-stimulatory signal
EP2332990A1 (en) * 2004-03-19 2011-06-15 Imclone LLC Human anti-epidermal growth factor receptor antibody
NZ594985A (en) 2009-03-10 2013-07-26 Biogen Idec Inc Anti-bcma (b-cell maturation antigen, cd269, tnfrsf17) antibodies
NZ743310A (en) 2011-03-23 2022-11-25 Fred Hutchinson Cancer Center Method and compositions for cellular immunotherapy
KR102229945B1 (ko) * 2012-04-11 2021-03-18 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 B-세포 성숙 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체
AU2013204922B2 (en) * 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
US20150329640A1 (en) 2012-12-20 2015-11-19 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptors and immune cells targeting b cell malignancies
CN104781789B (zh) 2012-12-20 2018-06-05 三菱电机株式会社 车载装置
US9108442B2 (en) 2013-08-20 2015-08-18 Ricoh Company, Ltd. Image forming apparatus
EP3131927B8 (en) 2014-04-14 2020-12-23 Cellectis Bcma (cd269) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
BR112016024481A2 (pt) * 2014-04-25 2017-10-10 Bluebird Bio Inc receptores quiméricos de antígenos com promotor mnd
MX370018B (es) * 2014-04-25 2019-11-28 Bluebird Bio Inc Metodos mejorados para la elaboracion de terapias celulares adoptivas.
BR112017012502B1 (pt) * 2014-12-12 2020-09-15 Bluebird Bio, Inc. Polinucleotídeo, polipeptídeo de car codificado pelo dito polinucleotídeo, vetor compreendendo o dito polinucleotídeo, composição compreendendo o dito vetor e método para geração de uma célula imune efetora compreendendo um car

Also Published As

Publication number Publication date
KR102523934B1 (ko) 2023-04-20
SG10201900455YA (en) 2019-02-27
JP2017522882A (ja) 2017-08-17
US20200079864A1 (en) 2020-03-12
KR20170036021A (ko) 2017-03-31
EP3172231A4 (en) 2018-01-10
IL250202B (en) 2020-09-30
EP3172231A2 (en) 2017-05-31
WO2016014789A3 (en) 2016-03-17
AU2015292590B2 (en) 2020-01-16
EP3172231B1 (en) 2021-05-05
WO2016014789A2 (en) 2016-01-28
SG11201700492SA (en) 2017-02-27
RU2017106025A3 (es) 2019-02-15
CA2956002A1 (en) 2016-01-28
CN106795217A (zh) 2017-05-31
IL250202A0 (en) 2017-03-30
AU2015292590A1 (en) 2017-02-16
US20170226216A1 (en) 2017-08-10
MX2017001079A (es) 2017-09-12
RU2747457C2 (ru) 2021-05-05
BR112017001498A2 (pt) 2018-02-20
JP6706244B2 (ja) 2020-06-03
CN106795217B (zh) 2021-08-06
ZA201700730B (en) 2021-06-30
RU2017106025A (ru) 2018-08-30
CA2956002C (en) 2023-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2878449T3 (es) Receptores antigénicos quiméricos de BCMA
JP7375098B2 (ja) Ｂｃｍａキメラ抗原受容体
ES2781073T3 (es) Receptores de antígenos quiméricos del promotor MND
ES2911015T3 (es) Receptores quiméricos de antígeno anti-sialil Tn
WO2015164739A1 (en) Kappa/lambda chimeric antigen receptors
BR112021000249A2 (pt) Usos de receptores de antígeno quimérico anti-bcma
BR112017001498B1 (pt) Receptor de antígeno quimérico (car) anti-bcma, polinucleotídeo que codifica o dito car, vetor, composição e uso da mesma para tratar uma condição relacionada à célula b
EA045264B1 (ru) Способ лечения гемобластоза с помощью иммунных эффекторных клеток, содержащих химерные антигенные рецепторы к bcma