CN108277205B

CN108277205B - 表达cxcr4的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞及制备方法和用途

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Publication number: CN108277205B
Application number: CN201711464799.XA
Authority: CN
Inventors: 王永生; 魏于全; 郭福春; 王玮
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2022-12-20
Anticipated expiration: 2037-12-28
Also published as: CN108277205A; WO2018121679A1

Abstract

本发明涉及细胞治疗领域，特别是一种表达趋化因子受体CXCR4的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞，本发明具体涉及通过基因工程手段，将非特异性的淋巴细胞改造为能够识别肿瘤表面相关抗原并表达趋化因子受体CXCR4，从而在特定部位富集并对特定细胞进行靶向杀伤的特异性淋巴细胞的制备方法及其在恶性肿瘤治疗中的用途。

Description

表达CXCR4的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞及制备方法和用途

技术领域

本发明涉及细胞领域，具体涉及通过基因工程手段，将非特异性的淋巴细胞定向改造为能够识别肿瘤表面相关抗原并表达趋化因子受体CXCR4，从而在特定部位富集并对细胞进行杀伤的特异性淋巴细胞的制备方法及其在恶性肿瘤治疗中的用途。

背景技术

免疫治疗被认为是最具前景的肿瘤治疗方法。其中，免疫检查点抑制剂(如CTLA-4、PD-1等)在多种肿瘤临床试验中显示出了明显优于现有疗法的效果，被批准用于非小细胞肺癌、膀胱癌等恶性肿瘤的治疗。不同于CTLA-4和PD-1抗体等通过重新激活机体免疫反应发挥抗肿瘤作用，嵌合抗原受体修饰的免疫细胞疗法不依赖于机体免疫状态，通过基因工程技术，将嵌合抗原受体表达于免疫细胞表面，识别肿瘤抗原，激活免疫效应细胞从而产生直接抗肿瘤作用。目前，以CD19为靶点的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞在治疗急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤临床试验中显示出良好的效果，有效率最高达90％，显示出这种疗法巨大的治疗潜力。目前，超出300项与嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞治疗相关的临床试验正在进行。

尽管嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中有着诱人的前景，但仍然存在几个问题：1.肿瘤特异性抗原缺乏。目前发现的肿瘤特异性表面抗原很少，且多数肿瘤缺乏特异性抗原，大部分为肿瘤高表达但正常组织也表达的肿瘤相关抗原，从而限制了其作为嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞治疗靶点。如在靶向HER2的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞临床研究中，由于人体正常肺组织同样表达HER2，引起了非特异性细胞毒性杀伤反应，导致患者死亡。2.嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞在肿瘤部位的富集。目前关于嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞治疗进展均发生在血液系统肿瘤中，实体瘤尚无报道，其中一个重要原因是体外扩增后的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞不能大量、有效进入实体瘤内，导致抗肿瘤作用不明显。3.肿瘤微环境对嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞的抑制作用。相对于血液系统肿瘤，实体瘤内存在复杂的肿瘤免疫微环境，使嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞无法发挥功能，而且最新的文献提示，坏死的肿瘤细胞还可以通过释放K⁺使淋巴细胞衰竭。因此，仍需要加强本领域的研究，以期进一步提高嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞的疗效。

淋巴细胞向肿瘤聚集迁移是一个依赖趋化因子的复杂过程，涉及循环淋巴细胞与内皮细胞间的相互作用。研究显示，CXCL12/SDF-1α是重要的T细胞和髓源单核细胞的趋化调节因子，通过与其受体CXCR4结合，驱使细胞沿着浓度梯度达到相关部位。放射治疗后，照射部位CXCL12/SDF-1α表达升高，募集髓源单核细胞向照射部位迁移。在一些高表达CXCL12的胶质细胞肿瘤中也发现了这个现象。研究证实，HIV感染可导致T细胞CXCR4表达下调，而且随时间延长，下降更明显。我们发现，T细胞经慢病毒介导的基因修饰后，趋化因子受体CXCR4表达明显下降，趋化活性受限。

基于以上现象，我们设想通过在嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞表达CXCR4，可以使其在CXCL12/SDF-1α高表达的脑胶质瘤或多发性骨髓瘤中聚集，增强抗肿瘤作用，也可以通过放疗等手段使肿瘤部位CXCL12/SDF-1α表达升高，诱导嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞产生归巢效应，从而产生更好的抗肿瘤作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为恶性肿瘤的治疗提供一种新的有效手段。

本发明解决技术问题的技术方案是提供了一种嵌合抗原受体，包括胞外抗原结合区，跨膜区和胞内信号区。

其中，上述嵌合抗原受体中，所述的胞外抗原结合区是与肿瘤抗原结合的单克隆抗体单链可变区，受体或配体。

进一步的，所述的肿瘤抗原包括但不限于：(EGFR)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、间皮素(mesothelin)、白介素13受体α2(IL-13Rα2)、表皮生长因子受体2(ERBB2)、表皮生长因子受体3(ERBB3)、表皮生长因子受体4(ERBB4)、血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、神经节苷脂抗原G_D2(GD2)、叶酸受体1(FOLR1)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、黑色素前体蛋白(gp100)、粘蛋白1(MUC1)、粘蛋白16(MUC16)、碳酸酐酶9(CA9)、L1细胞黏附分子(CD171)、肿瘤抗原125(CA125)、肿瘤抗原15-3(CA15-3)、肿瘤抗原19-9(CA19-9)、NY-ESO-1、MART-1、MAGE4、B细胞成熟抗原(BCMA)、白细胞分化抗原19(CD19)、白细胞分化抗原20(CD20)、白细胞分化抗原22(CD22)、白细胞分化抗原30(CD30)、白细胞分化抗原33(CD33)、癌胚抗原(CEA)、白细胞分化抗原38(CD38)、白细胞分化抗原133(CD133)、白细胞分化抗原138(CD138)、白细胞分化抗原123(CD123)、EPH受体A2(EPHA2)、EPH受体A3(EPHA3)。

其中，上述嵌合抗原受体中，所述的跨膜区为白细胞分化抗原8(CD8)跨膜区或白细胞分化抗原28(CD28)跨膜区。

其中，上述嵌合抗原受体中，所述的胞内信号区为白细胞分化抗原28(CD28)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF9/CD134/OX40)、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9/CD137/4-1BB)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、诱导性T细胞共刺激分子(ICOS)、CD40、CD27或DAP10(DNAX激活蛋白10)中一种或多种的胞内结构域。

其中，上述嵌合抗原受体中，所述的单克隆抗体单链可变区为scFv单链抗体可变区。

其中，上述嵌合抗原受体中，所述的scFv单链抗体可变区的氨基酸序列为SEQ IDNo.1所示。

SEQ ID No.1 scFv单链抗体可变区的氨基酸序列

MVLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIVLTQSPASLAMSLGERATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTISRVQAEDAAIYSCLQSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGSELKKPGESVKISCKASGYTFTDYSINWVKQAPGQGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFSLDTSASTAYLQISSLKAEDTAVYFCALDYSYAMDYWGQGTLVTVSS。

其中，上述嵌合抗原受体中，所述的scFv单链抗体可变区的编码核苷酸序列为SEQIDNo.2所示。

SEQ ID No.2 scFv单链抗体可变区的编码核苷酸序列

ATGGTGCTGCTGGTGACCTCCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCCCACCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCAGCCTGGCCATGTCCCTGGGCGAAAGGGCCACCATCTCCTGCAGGGCCAGCGAGAGCGTGAGCGTTATTGGAGCCCACTTAATTCACTGGTATCAACAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGTTAATTTATCTGGCCTCCAACCTGGAGACAGGCGTGCCTGCCAGATTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATCTCCAGGGTGCAGGCCGAAGACGCCGCCATCTACAGCTGCCTGCAGAGCCGTATTTTCCCTAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATTAAGGGCTCCACAAGCGGCAGCGGAAAGCCCGGTTCTGGCGAGGGAAGCACAAAGGGACAAATTCAGCTCGTGCAGTCCGGCTCCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGAGTCCGTGAAAATTAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATTAATTGGGTGAAGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGAAGTGGATGGGCTGGATTAACACCGAAACCAGGGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTTAGGGGCAGGTTCGTGTTCAGCCTGGACACCTCCGCCAGCACCGCCTACCTCCAAATTAGCTCCCTGAAGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTCTGCGCCCTGGACTACAGCTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTGGTCACCGTGAGCTCC。

更具体的，上述嵌合抗原受体为通过氮端到碳端顺次联接信号肽、scFv单链抗体、CD8α跨膜区、CD28胞内段、4-1BB胞内段、CD3δ链得到的。

所述的信号肽的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示。

MVLLVTSLLLCELPHPAFLLIP。SEQ ID No.3

所述信号肽的编码核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。

ATGGTGCTGCTGGTGACCTCCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCCCACCCTGCCTTCCTGCTGATTCCC。SEQ ID No.4

其中，所述的CD8跨膜区氨基酸序列为SEQ ID No.5所示。

AAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN。SEQ ID No.5

所述的CD8跨膜区的编码核苷酸序列为SEQ ID No.6所示。

GCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAAC。SEQ ID No.6

所述CD28胞内域的氨基酸序列为SEQ ID No.7所示。

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS；SEQ ID No.7。

所述CD28胞内域的编码核苷酸序列为SEQ ID No.8所示。

AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC。SEQ ID No.8。

所述4-1BB胞内域的氨基酸序列为SEQ ID No.9所示。

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；SEQ ID No.9。

所述4-1BB胞内域的编码核苷酸序列为SEQ ID No.10所示。

AGGTTCAGCGTCGTGAAGAGAGGAAGGAAGAAGCTCCTGTATATCTTCAAGCAGCCTTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGCTCCTGTAGGTTTCCCGAAGAGGAGGAGGGAGGATGCGAGCTG。SEQID No.10。

所述CD3δ域的氨基酸序列为SEQ ID No.11所示。

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。SEQ ID No.11。

所述CD3δ域的编码核苷酸序列为SEQ ID No.12所示。

SEQ ID No.12 CD3δ域的编码核苷酸序列

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC。

进一步的，上述嵌合抗原受体中，所述的嵌合抗原受体为(1)具有SEQ ID No.13所示的氨基酸序列的蛋白；

或：(2)在SEQ ID No.13所示的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与SEQ ID No.13所示的蛋白的功能相同或相似的蛋白。

SEQ ID No.13嵌合抗原受体的氨基酸序列

MVLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIVLTQSPASLAMSLGERATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTISRVQAEDAAIYSCLQSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGSELKKPGESVKISCKASGYTFTDYSINWVKQAPGQGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFSLDTSASTAYLQISSLKAEDTAVYFCALDYSYAMDYWGQGTLVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

进一步的，上述嵌合抗原受体中，所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列为(1)：如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列或其简并序列；

或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.14的核苷酸序列编码功能相同或相似的蛋白。

SEQ ID NO:14编码嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列

ATGGTGCTGCTGGTGACCTCCCTGCTGCTGTGCGAACTGCCCCACCCTGCCTTCCTGCTGATTCCCGACATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCAGCCTGGCCATGTCCCTGGGCGAAAGGGCCACCATCTCCTGCAGGGCCAGCGAGAGCGTGAGCGTTATTGGAGCCCACTTAATTCACTGGTATCAACAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGTTAATTTATCTGGCCTCCAACCTGGAGACAGGCGTGCCTGCCAGATTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATCTCCAGGGTGCAGGCCGAAGACGCCGCCATCTACAGCTGCCTGCAGAGCCGTATTTTCCCTAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATTAAGGGCTCCACAAGCGGCAGCGGAAAGCCCGGTTCTGGCGAGGGAAGCACAAAGGGACAAATTCAGCTCGTGCAGTCCGGCTCCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGAGTCCGTGAAAATTAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATTAATTGGGTGAAGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGAAGTGGATGGGCTGGATTAACACCGAAACCAGGGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTTAGGGGCAGGTTCGTGTTCAGCCTGGACACCTCCGCCAGCACCGCCTACCTCCAAATTAGCTCCCTGAAGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTTCTGCGCCCTGGACTACAGCTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGCACACTGGTCACCGTGAGCTCCGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA。

特别的，上述嵌合抗原受体中，所述的配体为APRIL配体。

进一步的，上述嵌合抗原受体中，所述APRIL氨基酸序列为SEQ ID NO.15所示。

SVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDP。SEQ ID NO.15。

所述APRIL的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.16所示。

AGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGATAGCGACGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCCGCCCTGAGGAGAGGAAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGAGTGAGAATCCAGGACGCCGGCGTGTACCTGCTGTACAGCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACTATGGGTCAGGTGGTGAGCAGAGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCAGGTGCATCAGAAGCATGCCCTCCCACCCCGACAGGGCCTACAACAGCTGCTACTCCGCCGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTTATTATCCCCAGAGCCAGGGCCAAGCTGAACCTGTCTCCTCATGGTACCTTCCTGGGCTTTGTGAAGCTGAGCGGCGGCGGCTCCGACCC。SEQ ID NO.16。

进一步的，上述嵌合抗原受体为通过氮端到碳端顺次联接信号肽、APRIL、CD8α跨膜区、CD28胞内段、4-1BB胞内段、CD3δ链得到的。

特别的，上述嵌合抗原受体中，所述的嵌合抗原受体为(1)具有SEQ ID No.17所示的氨基酸序列的蛋白；

或：(2)在SEQ ID No.17所示的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与SEQ ID No.17所示的蛋白的功能相同或相似的蛋白。

SEQ ID No.17嵌合抗原受体的氨基酸序列

METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

进一步的，上述嵌合抗原受体中，所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列为(1)：如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列或其简并序列；

或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO.18的核苷酸序列编码功能相同或相似的蛋白。

SEQ ID NO:18编码嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列

ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTCTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCTGGAAGCACCGGAAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGATAGCGACGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCCGCCCTGAGGAGAGGAAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGAGTGAGAATCCAGGACGCCGGCGTGTACCTGCTGTACAGCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACTATGGGTCAGGTGGTGAGCAGAGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCAGGTGCATCAGAAGCATGCCCTCCCACCCCGACAGGGCCTACAACAGCTGCTACTCCGCCGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTTATTATCCCCAGAGCCAGGGCCAAGCTGAACCTGTCTCCTCATGGTACCTTCCTGGGCTTTGTGAAGCTGAGCGGCGGCGGCTCCGACCCCGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA。SEQ ID NO.18。

本发明还提供了一种上述嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞，共表达趋化因子CXCR4。

进一步的，所述的CXCR4受体为(1)具有SEQ ID No.19所示的氨基酸序列的蛋白；

或：(2)在SEQ ID No.19所示的蛋白的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的与SEQ ID No.19所示的蛋白的功能相同或相似的蛋白。

SEQ ID No.19 CXCR4的氨基酸序列

EGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS。

进一步的，上述嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞中，所述CXCR4的编码基因核苷酸序列为(1)：如SEQ ID No：20所示的核苷酸序列或其简并序列；

或(2)：在(1)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO：20的核苷酸序列编码功能相同或相似的蛋白。

SEQ ID No：20编码CXCR4基因的核苷酸序列GGACCCGAGGGCATTTCCATCTACACCTCCGACAACTATACCGAGGAGATGGGCAGCGGCGACTACGATTCCATGAAGGAGCCCTGTTTCAGGGAGGAGAACGCCAACTTCAACAAAATTTTTCTCCCCACCATCTACAGCATCATCTTCCTGACAGGCATCGTGGGAAACGGCCTGGTGATCCTGGTGATGGGCTACCAGAAGAAGCTGAGGAGCATGACCGACAAGTACAGGCTCCACCTGAGCGTGGCCGACCTGCTGTTTGTCATTACACTGCCCTTCTGGGCCGTGGACGCCGTGGCCAACTGGTATTTCGGCAACTTTCTCTGCAAGGCCGTCCATGTGATCTACACCGTGAACCTCTACAGCAGCGTGCTGATTCTGGCCTTCATCAGCCTGGATAGGTACCTGGCCATCGTCCACGCCACCAACTCCCAGAGGCCTAGAAAGCTGCTGGCCGAGAAGGTGGTGTATGTGGGCGTCTGGATTCCTGCCCTGCTCCTGACCATCCCTGACTTCATCTTCGCCAACGTGAGCGAAGCCGATGACAGGTACATCTGCGACAGGTTCTACCCTAACGATCTGTGGGTGGTGGTGTTCCAGTTCCAGCACATCATGGTGGGCCTCATCCTGCCCGGCATTGTCATCCTGTCCTGCTACTGCATCATCATCTCCAAGCTCAGCCACAGCAAGGGCCATCAAAAGAGGAAGGCCCTGAAGACCACAGTGATCCTGATCCTGGCCTTCTTTGCCTGCTGGCTGCCTTACTACATCGGCATCAGCATCGACAGCTTCATCCTCCTGGAGATCATCAAGCAGGGCTGCGAGTTTGAGAACACAGTCCACAAGTGGATCTCCATTACCGAAGCCCTCGCCTTCTTCCACTGCTGCCTCAACCCTATCCTGTACGCTTTCCTCGGCGCCAAGTTCAAGACCTCCGCTCAGCATGCTCTCACCAGCGTGTCCAGAGGCAGCAGCCTGAAGATCCTGAGCAAGGGCAAGAGAGGCGGCCACAGCAGCGTGAGCACAGAGTCCGAGAGCTCCAGCTTCCACTCCAGCTGA。

其中，所述的CXCR4通过P2A与嵌合抗原受体共表达，所述的P2A的氨基酸序列为SEQ ID No.21所示。

SEQ ID No.21 P2A的氨基酸序列

GSGATNFSLLKQ AGDVEENPGP。

进一步的，所述的P2A的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.22所示。

SEQ ID No.22 P2A的编码核苷酸序列

GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACC。

进一步的，所述的P2A可以有T2A替代，所述的T2A的氨基酸序列为SEQ ID No.23所示。

SEQ ID No.23 T2A的氨基酸序列

RRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP。

进一步的，所述T2A的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.24所示。

SEQ ID No.24 T2A的编码核苷酸序列

GGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCT。

在本发明中，P2A和T2A均可用于基因的共表达，其优势是剪切效率比较高。

其中，所述的嵌合抗原受体包括：胞外抗原结合区，跨膜区和胞内信号区，其中胞外抗原结合区是结合肿瘤表面特异性抗原或相关抗原的配体，跨膜区为CD8跨膜区或CD28跨膜区，胞内信号区为CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS、CD40、CD27或DAP10中的一种或几种的胞内结构域。

其中，所述的肿瘤表面特异性抗原或相关抗原包括但不限于：EGFR、EpCAM、mesothelin、IL-13Rα2、ERBB2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、GD2、FR、PSMA、gp100、MUC1、MUC16、CA9、CD171、CD125、CD15-3、CD19-9、NY-ESO-1、MART-1、MAGE4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CEA、CD38、CD138、CD123、EphA2。

其中，上述嵌合抗原受体中，所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列为(1)：如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列或其简并序列；

或者，上述嵌合抗原受体中，所述的嵌合抗原受体为(1)具有SEQ ID No.17所示的氨基酸序列的蛋白；

其中，上述嵌合抗原受体中，所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列为(1)：如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列或其简并序列；

其中，上述的嵌合抗原受体和CXCR4，由一个载体共同表达。

本发明还提供了一种表达载体。

所述的表达载体为同时表达SEQ ID NO：13所述的嵌合抗原受体和SEQ ID NO：19所述的CXCR4的表达载体。或

所述的表达载体为同时表达SEQ ID NO：17所述的嵌合抗原受体和SEQ ID NO：19所述的CXCR4的表达载体。

进一步的，所述的表达载体为病毒载体。更进一步的，所述的表达载体为慢病毒载体。

本发明还提供了一种病毒。该病毒包含上述的表达载体。

本发明还提供了含有上述的表达载体或病毒的宿主细胞。

进一步的，上述宿主细胞为淋巴细胞。更进一步的，所述淋巴细胞为T细胞或单核细胞，所述的T细胞为αβT细胞、NKT细胞或γδT细胞。

本发明还提供了一种上述嵌合抗原受体，嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞在单独或与放疗联合用于治疗恶性肿瘤的用途。主要用于制备治疗恶性肿瘤的药物或与放射治疗联合抑制肿瘤。所述的恶性肿瘤为肺癌。肝癌。淋巴瘤。结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、多发性骨髓瘤或前列腺癌。

更具体的，本发明包括三个方面，分述如下：

本发明的第一个方面涉及一种共表达CXCR4的嵌合抗原受体。其中嵌合抗原受体由能够结合肿瘤特异性或相关抗原的配体、跨膜区和胞内信号区组成，通过P2A序列或T2A序列与CXCR4表达基因相连。共同表达在同一个载体上。(例如如图1所示的结构)。

本发明的第二个方面涉及获得一种表达CXCR4的嵌合型抗原受体修饰的淋巴细胞。利用本发明第一个方面提供的共表达CXCR4和嵌合型抗原受体的载体，转染人外周淋巴细胞，从而获得表达CXCR4的嵌合型抗原受体修饰的淋巴细胞。一般通过慢病毒包装体系，产生高滴度的慢病毒，转染人外周淋巴细胞，

本发明的第三个方面涉及本发明第一方面任一所述的共表达CXCR4的嵌合抗原受体或第二方面所述的淋巴细胞单独或与放疗联合用于治疗恶性肿瘤的用途。

在本发明中，类似于“在SEQ ID NO：14中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”表述的基因序列一般是指编码具有SEQ ID NO：14所编码的蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ IDNO：14同源性低至约89％的简并序列也能编码出SEQ ID NO：14所述的序列。另外,“在SEQID NO：14中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO：14核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO：14中的核苷酸序列的同源性至少80％，较佳地至少89％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语“在SEQ ID NO：14中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”还包括能编码具有与SEQ ID NO：14所编码蛋白功能相同的蛋白的SEQ ID NO：14中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1～90个，较佳地1～60个，更佳地1～20个，最佳地1～10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，“在所述的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸衍生所得的氨基酸序列”的表述包括但并不限于若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括所述蛋白的活性片段和活性衍生物。

“在所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸衍生所得的氨基酸序列”的表述还包括但并不限于有至多10个(即一个或几个)，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽，即保守性变异多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1氨基酸替换表

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的有益效果为：

本发明通过构建共表达嵌合抗原受体和趋化因子受体CXCR4的病毒表达载体，生产慢病毒，转导淋巴细胞，得到一种共表达CXCR4的嵌合抗原受体T淋巴细胞，能够逆转病毒修饰导致的T细胞CXCR4表达下降，增强嵌合抗原受体T细胞的趋化活性，促进该淋巴细胞向SDF-1(CXCL12)高浓度区域聚集，趋化性从3％提高至9％，有利于增强嵌合抗原受体T淋巴细胞的抗肿瘤效应。当其与放射治疗联合使用时，还能诱导嵌合抗原受体T淋巴细胞产生归巢效应，从而产生更好的抗肿瘤作用。

附图说明

图1所示为共表达CXCR4的嵌合抗原受体示意图；A表示胞外抗原结合区为scFv的嵌合抗原受体，B表示胞外抗原结合区为APRIL的嵌合抗原受体，C表示胞外抗原结合区为受体的嵌合抗原受体；其中，SP为GM-CFSR信号肽，scFv表示抗原结合区，APRIL表示配体结合区。CD8α hinge表示CD8α跨膜区，CD28和4-1BB表示共刺激信号域，CD3δ表示T细胞激活域，P2A为连接片段，CXCR4为趋化因子受体；

图2所示为慢病毒感染后T细胞CXCR4表达；

图3所示为慢病毒感染后T细胞的趋化活性；

图4所示为共表达CXCR4后CAR-T细胞CXCR4表达；

图5所示为共表达CXCR4后CAR-T细胞趋化活性；A表示RPMI-8226细胞培养上清诱导的CAR-T趋化活性，B表示SDF-1(即CXCL12)诱导的CAR-T趋化活性；

图6所示为CAR-T和CAR/CXCR4-T细胞CAR表达；

图7所示为CAR-T和CAR/CXCR4-T细胞杀伤活性。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明进行详细说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook J,RussellD.W.,2001,Molecular Cloning:A laboratory manual(3^rd ed),Spring HarborLaboratory Press中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1获得CAR、CAR/CXCR4全长基因，完成重组质粒载体的构建

一、全长scFv-CAR和scFv-CAR/CXCR4基因的获得

采用全基因合成的方法得到scFv-CAR，scFv-CAR-P2A-CXCR4基因片段。

同时，设计如下引物扩增scFv-CAR片段：

5’引物：5’AGGTTTAAACTACGGATGGTGCTGCTGGTGACCTCCC3’SEQ ID NO：25

3’引物：5’ATGACTAGTCCCGGGTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGC3’SEQ ID NO：26

反应条件如下：

PCR反应：94℃变性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸1分钟。反应25个循环。然后72℃再延伸10分钟。

设计如下引物扩增scFv-CAR/CXCR4片段：

5’引物：5’AGGTTTAAACTACGGATGGTGCTGCTGGTGACCTCCC3’SEQ ID NO：27

3’引物：5’ATGACTAGTCCCGGGTCAGCTGGAGTGGAAGCTGGAG 3’SEQ ID NO：28

反应条件如下：

PCR反应：94℃变性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸2分钟。反应25个循环。然后72℃再延伸10分钟。

二、全长APRIL-CAR和APRIL-CAR/CXCR4基因的获得

采用全基因合成的方法得到APRIL-CAR，APRIL-CAR-P2A-CXCR4基因片段。

同时，设计如下引物扩增APRIL-CAR片段：

5’引物：5’aggtttaaactacggATGGAGACCGACACCCTGCTGC3’SEQ ID NO：29

3’引物：5’atgactagtcccgggTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGC3’SEQ ID NO：30

反应条件如下：

设计如下引物扩增APRIL-CAR/CXCR4片段：

5’引物：5’aggtttaaactacggATGGAGACCGACACCCTGCTGC3’SEQ ID NO：31

3’引物：5’atgactagtcccgggTCAGCTGGAGTGGAAGCTGGAG 3’SEQ ID NO：32

反应条件如下：

三、含全长CAR和CAR/CXCR4基因的慢病毒重组质粒的构建

如上所述，在全基因合成片段中的没有酶切位点，我们采用同源重组的方法将片段直接插入真核表达载体pWPXLd(购自美国addgene公司)的多克隆位点EcoR I/BamH I中，重组后酶切位点将会消失。其构建过程如下：

1.重组慢病毒质粒pWPXLd-CAR的构建

通过限制性内切酶EcoR1和BamH1将慢病毒载体pWPXLd线性化，利用天根EasyGeno快速重组克隆试剂盒(天根生化科技有限公司、VI201)将全长CAR基因扩增片段插入pWPXLd的EcoR I/BamH I位点，重组产物pWPXLd-CAR转化大肠杆菌Stbl3，随机挑选30个克隆进行测序鉴定。测序结果与设计的CAR全长序列一致。

2.重组慢病毒质粒pWPXLd-CAR/CXCR4的构建

通过限制性内切酶EcoR1和BamH1将慢病毒载体pWPXLd线性化，利用天根EasyGeno快速重组克隆试剂盒(天根生化科技有限公司、VI201)将全长CAR/CXCR4基因扩增片段插入pWPXLd的EcoR I/BamH I位点，重组产物pWPXLd-CAR/CXCR4转化大肠杆菌Stbl3，随机挑选30个克隆进行测序鉴定。测序结果与设计的CAR/CXCR4全长序列一致。

构建的慢病毒重组载体结构示意图如图1所示，图1A、图1B和图1C分别表示嵌合抗原受体的胞外抗原结合区为scFv、配体和受体结合区时的重组载体结构。

实施例2慢病毒包装及CAR-T细胞的生产

1、慢病毒包装

293T细胞采用DMEM+10％胎牛血清(FBS)培养，待生长至70-90％密度时用于病毒包装，步骤如下：转染前2h更换新鲜预热的DMEM培养基(含10％FBS)，在15ml离心管中配制转染体系：实验条件如表2和3所示。

表2质粒体系

表3转染体系:

混匀后，将转染液均匀滴加至平皿中，37℃，5％CO₂培养箱中继续培养。12h后更换为DMEM+2％FBS培养基。分别于48h和72h收集病毒上清，0.45μm滤膜过滤病毒液，4℃，160000g，超速离心90min，PBS重悬，分装保存于-80°。

2、T细胞感染

采用Ficoll-Hypaque(sigma)分离人外周血单核细胞(PBMC)，步骤如下：将等体积的外周血缓慢加入Ficoll-Hypaque中，1000g，18°离心30分钟，吸取中间层白膜，红细胞裂解液作用2分钟，300g离心5分钟，1640培养基洗两次，计数，加入CD3/CD28Dynabeads(lifetechnologies 11131D)(cells:beads＝1：3)共培养。24h后，慢病毒感染激活的PBMC，步骤如下：离心细胞，用含病毒上清的培养基(感染复数MOI＝1：10)重悬细胞，1×10⁶/ml细胞，加入凝聚胺(polybrene)，终浓度为8mg/ml，混匀，32°条件下1000g离心90分钟，然后37℃5％CO₂培养箱中继续培养。

实施例3 T细胞CXCR4表达检测

将实施例1构建的慢病毒感染或未感染的T细胞和外周血单核细胞，24h后换液，用X-VIVO 15(04-418Q，LONZA公司)完全培养基+10％人AB血清(H4522，sigma公司)继续培养5天，同时加入重组人白介素2(IL-2)细胞因子100U/ml(C013，novaprotein公司)。然后收集细胞，PBS洗两次，APC标记的抗人CXCR4抗体(货号306510，biolegend公司)染色，流式细胞术检测细胞膜CXCR4表达，结果显示：感染了含CAR全长基因的慢病毒后，外周血单核细胞CXCR4表达明显下降，其荧光强度(对数值)由238下降至174(图4)，T细胞感染慢病毒后CXCR4表达下降更明显，其荧光强度(对数值)由239降至108，降低超过一半(如图2所示)。

实施例4慢病毒感染的T细胞趋化活性检测

在实施例3中感染的外周血单核细胞和T细胞观察到CXCR4表达下降后，为评估其影响，进一步对其介导的趋化活性进行检测。具体操作步骤如下：

淋巴细胞趋化活性检测通过细胞迁移试验评估。采用5μm孔径的(货号3421；Costar，Cambridge，MA)transwell检测，transwell中聚碳酸酯膜在含20μg/ml BSA的PBS中4℃浸泡过夜，使用前置于24孔板中晾干。

试验前，感染(CAR-T组)或未感染(对照组)慢病毒细胞T细胞和外周血单核细胞在RPMI1640完全培养基(含有1％BSA，10mM HEPES缓冲液，pH6.9)中血清饥饿4小时。

试验时，在24孔板中加入500ul含100ng/mlSDF-1的无血清RPMI1640完全培养基；晾干的transwell放入孔内，然后将200ul Far red标记的血清饥饿细胞(5×10⁵)加入transwell上室。在37℃，5％CO₂条件下孵育4h，收集下室的迁细胞，离心沉淀，并重悬于300ul预冷的FACS缓冲液(含10％小牛血清和0.2％叠氮钠)，每个样品中加入1×10⁵数量的9微米的乳胶珠(BCR167，sigma公司)和25微升浓度为50ug/ml的Propidium Iodide/碘化丙啶工作液(ST511，碧云天生物技术有限公司)，流式细胞仪检测样品。

因各组中乳胶珠数量相同，以其作为参照。统计PI染色阴性细胞，可以计算出迁移的Farred标记的T细胞数量＝

迁移率(％)＝

分析发现：感染慢病毒后，在SDF-1趋化作用下，外周单核细胞的迁移率由16.7％下降至9.2％，T细胞迁移率由19.3％降至4.1％(图3)，结果表明随着CXCR4表达的降低，T细胞和外周单核细胞的趋化活性也明显下降。

实施例5表达CXCR4增强嵌合抗原受体修饰T细胞趋化活性

为逆转T细胞的趋化活性，我们在T细胞中过表达CXCR4以增强慢病毒感染的CAR-T细胞趋化活性。

首先，在CAR-T细胞中共表达CXCR4。含全长CAR(CAR-T组)或CAR/CXCR4(CAR/CXCR4-T组)的慢病毒感染T细胞，48h后收集细胞，PBS洗两次，APC标记的抗人CXCR4抗体(货号306510，biolegend公司)染色，流式细胞术检测细胞膜CXCR4表达，结果显示：与CAR-T组相比，CAR/CXCR4组T细胞CXCR4表达明显升高，平均荧光强度(对数值)由108升高至229(如图4所示)。

其次，趋化活性检测，试验方法同实施例4：采用5μm孔径的(货号3421；Costar，Cambridge，MA)transwell检测，transwell中聚碳酸酯膜在含20μg/ml BSA的PBS中4℃浸泡过夜，使用前置于24孔板中晾干。

试验前，表达(CAR/CXCR4-T组)或不表达(CAR-T组)CXCR4的T细胞在RPMI1640完全培养基(含有1％BSA，10mM HEPES缓冲液，pH6.9)中血清饥饿4小时。

试验时，在24孔板中加入500ul含100ng/mlSDF-1的无血清RPMI1640完全培养基或RPMI-8226细胞培养上清；晾干的transwell放入孔内，然后将200ul Far red标记的血清饥饿细胞(5×10⁵)加入transwell上室。在37℃，5％CO₂条件下孵育4h，收集下室的迁细胞，离心沉淀，并重悬于300ul预冷的FACS缓冲液(含10％小牛血清和0.2％叠氮钠)，每个样品中加入1×10⁵数量的9微米的乳胶珠(BCR167，sigma公司)和25微升浓度为50ug/ml的Propidium Iodide/碘化丙啶工作液(ST511，碧云天生物技术有限公司)，流式细胞仪检测样品。

因各组中乳胶珠数量相同，以其作为参照。统计PI染色阴性细胞，可以计算出迁移的Far red标记的T细胞数量＝

迁移率(％)＝

结果显示：RPMI-8226细胞(高表达并分泌SDF-1)培养上清可促进CAR/CXCR4-T细胞迁移，从不足2.9％增加到4.15％(图5A)；在趋化因子SDF-1(CXCL12)浓度为100ng/ml时，可明显增加共表达CXCR4的CAR-T细胞趋化效率，由CAR-T组的3％左右升高到9％，提升了三倍(图5B)；充分说明共表达CXCR4可以增强CAR-T细胞向SDF-1高浓度部位迁移的趋化活性。

实施例6 CAR表达和活性检测

含全长CAR或CAR/CXCR4的慢病毒感染T细胞，培养5天后，收集细胞，采用FITC标记的重组人BCMA蛋白(novaprotein公司)染色，检测T细胞CAR表达。结果显示，相对于对照组(小于5％)，CAR组和CAR/CXCR4组中CAR表达明显升高(达40％)，荧光峰值发生偏移(图6)。

不同浓度的上述T细胞、CAR-T细胞或CAR/CXCR4-T细胞(即效应细胞)分别与CSFE标记的人骨髓瘤细胞系RPMI-8226细胞(靶细胞，BCMA高表达)共培养，24h后，每组中加入数量为1×10⁵的Far red标记K562细胞，PBS洗2次，流式细胞仪FITC和APC通道检测荧光细胞比例。因各组中Far red标记的K562细胞数量相同，因此，以K562细胞为参照，可以计算出FITC标记的靶细胞(RPMI-8226)数量

杀伤效率(百分比％)＝

其中阴性组未加T细胞)。

结果显示：在效应细胞数量/靶细胞数量(E/T)＝1:1时，对照组细胞对RPMI-8226细胞的杀伤效率为23.7％，而CAR-T细胞和CAR/CXCR4-T细胞分别达45.3％和51％；在效应细胞数量/靶细胞数量(E/T)＝5:1时，对照组细胞对RPMI-8226细胞的杀伤效率约为44.7％，而CAR-T细胞和CAR/CXCR4-T细胞分别达75.1％和82.3％(图7)，结果表明，嵌合抗原受体(CAR)可以增强T细胞对RPMI-8226的杀伤活性，而共表达CXCR4可以增强CAR-T细胞的杀伤活性。

综上所述，由上述试验可知，本发明通过构建共表达嵌合抗原受体和CXCR4慢病毒表达载体，并导入T细胞中，能够消除T细胞表达CAR-T时存在的趋化性降低的缺陷，提供一种杀伤活性和趋化活性都提高的淋巴细胞，有利于增强嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞的抗肿瘤效应。

序列表

<110> 四川大学

<120> 表达CXCR4的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞及制备方法和用途

<130> A171561K

<141> 2017-12-28

<150> 201611253681.8

<151> 2016-12-30

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 268

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Val Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser

20 25 30

Leu Ala Met Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Glu Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu

65 70 75 80

Glu Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr

100 105 110

Ser Cys Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser

130 135 140

Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser

145 150 155 160

Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

165 170 175

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro

180 185 190

Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu

195 200 205

Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp

210 215 220

Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu

225 230 235 240

Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp

245 250 255

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

260 265

<210> 2

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtgctgc tggtgacctc cctgctgctg tgcgaactgc cccaccctgc cttcctgctg 60

attcccgaca tcgtgctgac ccagagccct gccagcctgg ccatgtccct gggcgaaagg 120

gccaccatct cctgcagggc cagcgagagc gtgagcgtta ttggagccca cttaattcac 180

tggtatcaac agaagcccgg ccagcccccc aagctgttaa tttatctggc ctccaacctg 240

gagacaggcg tgcctgccag atttagcggc agcggcagcg gcaccgattt taccctgacc 300

atctccaggg tgcaggccga agacgccgcc atctacagct gcctgcagag ccgtattttc 360

cctaggacct tcggccaggg caccaagctg gaaattaagg gctccacaag cggcagcgga 420

aagcccggtt ctggcgaggg aagcacaaag ggacaaattc agctcgtgca gtccggctcc 480

gagctgaaga agcccggcga gtccgtgaaa attagctgca aggcctccgg ctacaccttc 540

accgactaca gcattaattg ggtgaagcag gctcctggcc agggcctgaa gtggatgggc 600

tggattaaca ccgaaaccag ggagcccgcc tacgcctacg actttagggg caggttcgtg 660

ttcagcctgg acacctccgc cagcaccgcc tacctccaaa ttagctccct gaaggccgag 720

gacaccgccg tgtacttctg cgccctggac tacagctacg ccatggacta ctggggacag 780

ggcacactgg tcaccgtgag ctcc 804

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Val Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggtgctgc tggtgacctc cctgctgctg tgcgaactgc cccaccctgc cttcctgctg 60

attccc 66

<210> 5

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr

1 5 10 15

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

20 25 30

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

35 40 45

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

50 55 60

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Cys Asn His Arg Asn

85

<210> 6

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 60

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 120

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 180

atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 240

tactgcaacc acaggaac 258

<210> 7

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 8

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 9

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 10

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggttcagcg tcgtgaagag aggaaggaag aagctcctgt atatcttcaa gcagcctttc 60

atgaggcccg tgcagaccac ccaggaagag gacggctgct cctgtaggtt tcccgaagag 120

gaggagggag gatgcgagct g 141

<210> 11

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 12

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 13

<211> 554

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Met Val Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser

20 25 30

Leu Ala Met Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Glu Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu

65 70 75 80

Glu Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr

100 105 110

Ser Cys Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser

130 135 140

Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser

145 150 155 160

Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

165 170 175

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro

180 185 190

Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu

195 200 205

Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp

210 215 220

Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu

225 230 235 240

Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp

245 250 255

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Phe

260 265 270

Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

275 280 285

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

290 295 300

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

305 310 315 320

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

325 330 335

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His

340 345 350

Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn

355 360 365

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

370 375 380

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val

385 390 395 400

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

405 410 415

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

420 425 430

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

435 440 445

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

450 455 460

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

465 470 475 480

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

485 490 495

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

500 505 510

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

515 520 525

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

530 535 540

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

545 550

<210> 14

<211> 1665

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggtgctgc tggtgacctc cctgctgctg tgcgaactgc cccaccctgc cttcctgctg 60

attcccgaca tcgtgctgac ccagagccct gccagcctgg ccatgtccct gggcgaaagg 120

gccaccatct cctgcagggc cagcgagagc gtgagcgtta ttggagccca cttaattcac 180

tggtatcaac agaagcccgg ccagcccccc aagctgttaa tttatctggc ctccaacctg 240

gagacaggcg tgcctgccag atttagcggc agcggcagcg gcaccgattt taccctgacc 300

atctccaggg tgcaggccga agacgccgcc atctacagct gcctgcagag ccgtattttc 360

cctaggacct tcggccaggg caccaagctg gaaattaagg gctccacaag cggcagcgga 420

aagcccggtt ctggcgaggg aagcacaaag ggacaaattc agctcgtgca gtccggctcc 480

gagctgaaga agcccggcga gtccgtgaaa attagctgca aggcctccgg ctacaccttc 540

accgactaca gcattaattg ggtgaagcag gctcctggcc agggcctgaa gtggatgggc 600

tggattaaca ccgaaaccag ggagcccgcc tacgcctacg actttagggg caggttcgtg 660

ttcagcctgg acacctccgc cagcaccgcc tacctccaaa ttagctccct gaaggccgag 720

gacaccgccg tgtacttctg cgccctggac tacagctacg ccatggacta ctggggacag 780

ggcacactgg tcaccgtgag ctccgcggcc gcattcgtgc cggtcttcct gccagcgaag 840

cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 900

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 960

ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 1020

ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaccacagga acaggagtaa gaggagcagg 1080

ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat 1140

taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctcccgttt ctctgttgtt 1200

aaacggggca gaaagaagct cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1260

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1320

gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1380

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1440

cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1500

tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1560

gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1620

gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gctaa 1665

<210> 15

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp Ser

1 5 10 15

Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg Gly

20 25 30

Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr

35 40 45

Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met Gly

50 55 60

Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe Arg

65 70 75 80

Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser Cys

85 90 95

Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser Val

100 105 110

Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly Thr

115 120 125

Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Ser Gly Gly Gly Ser Asp Pro

130 135 140

<210> 16

<211> 425

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agcgtgctgc acctggtgcc catcaacgcc accagcaagg acgatagcga cgtgaccgag 60

gtgatgtggc agcccgccct gaggagagga agaggcctgc aggcccaggg ctacggagtg 120

agaatccagg acgccggcgt gtacctgctg tacagccagg tgctgttcca ggacgtgacc 180

ttcactatgg gtcaggtggt gagcagagag ggccagggca gacaggagac cctgttcagg 240

tgcatcagaa gcatgccctc ccaccccgac agggcctaca acagctgcta ctccgccggc 300

gtgtttcacc tgcaccaggg cgacatcctg agcgttatta tccccagagc cagggccaag 360

ctgaacctgt ctcctcatgg taccttcctg ggctttgtga agctgagcgg cggcggctcc 420

gaccc 425

<210> 17

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser

20 25 30

Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg

35 40 45

Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp

50 55 60

Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr

65 70 75 80

Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu

85 90 95

Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala

100 105 110

Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp

115 120 125

Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser

130 135 140

Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Ser Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr

165 170 175

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

180 185 190

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly

195 200 205

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp

210 215 220

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

225 230 235 240

Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu

245 250 255

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

260 265 270

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

275 280 285

Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

290 295 300

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

305 310 315 320

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

325 330 335

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

340 345 350

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

355 360 365

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

370 375 380

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

385 390 395 400

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

405 410 415

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

420 425 430

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

435 440 445

<210> 18

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atggagaccg acaccctgct gctctgggtg ctgctgctgt gggtgcctgg aagcaccgga 60

agcgtgctgc acctggtgcc catcaacgcc accagcaagg acgatagcga cgtgaccgag 120

gtgatgtggc agcccgccct gaggagagga agaggcctgc aggcccaggg ctacggagtg 180

agaatccagg acgccggcgt gtacctgctg tacagccagg tgctgttcca ggacgtgacc 240

ttcactatgg gtcaggtggt gagcagagag ggccagggca gacaggagac cctgttcagg 300

tgcatcagaa gcatgccctc ccaccccgac agggcctaca acagctgcta ctccgccggc 360

gtgtttcacc tgcaccaggg cgacatcctg agcgttatta tccccagagc cagggccaag 420

ctgaacctgt ctcctcatgg taccttcctg ggctttgtga agctgagcgg cggcggctcc 480

gaccccgcgg ccgcattcgt gccggtcttc ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg 540

ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 600

gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 660

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 720

accctttact gcaaccacag gaacaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 780

atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 840

ccacgcgact tcgcagccta tcgctcccgt ttctctgttg ttaaacgggg cagaaagaag 900

ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 960

ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1020

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1080

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1140

atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1200

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1260

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1320

cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1347

<210> 19

<211> 351

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met Gly

1 5 10 15

Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu Asn

20 25 30

Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile Phe

35 40 45

Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly Tyr

50 55 60

Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu Ser

65 70 75 80

Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Asp

85 90 95

Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val His

100 105 110

Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala Phe

115 120 125

Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser Gln

130 135 140

Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val Trp

145 150 155 160

Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn Val

165 170 175

Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr Pro Asn Asp

180 185 190

Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu Ile

195 200 205

Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser Lys

210 215 220

Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr Thr

225 230 235 240

Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr Ile

245 250 255

Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln Gly

260 265 270

Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu Ala

275 280 285

Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe Leu

290 295 300

Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val Ser

305 310 315 320

Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly His

325 330 335

Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser

340 345 350

<210> 20

<211> 1062

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggacccgagg gcatttccat ctacacctcc gacaactata ccgaggagat gggcagcggc 60

gactacgatt ccatgaagga gccctgtttc agggaggaga acgccaactt caacaaaatt 120

tttctcccca ccatctacag catcatcttc ctgacaggca tcgtgggaaa cggcctggtg 180

atcctggtga tgggctacca gaagaagctg aggagcatga ccgacaagta caggctccac 240

ctgagcgtgg ccgacctgct gtttgtcatt acactgccct tctgggccgt ggacgccgtg 300

gccaactggt atttcggcaa ctttctctgc aaggccgtcc atgtgatcta caccgtgaac 360

ctctacagca gcgtgctgat tctggccttc atcagcctgg ataggtacct ggccatcgtc 420

cacgccacca actcccagag gcctagaaag ctgctggccg agaaggtggt gtatgtgggc 480

gtctggattc ctgccctgct cctgaccatc cctgacttca tcttcgccaa cgtgagcgaa 540

gccgatgaca ggtacatctg cgacaggttc taccctaacg atctgtgggt ggtggtgttc 600

cagttccagc acatcatggt gggcctcatc ctgcccggca ttgtcatcct gtcctgctac 660

tgcatcatca tctccaagct cagccacagc aagggccatc aaaagaggaa ggccctgaag 720

accacagtga tcctgatcct ggccttcttt gcctgctggc tgccttacta catcggcatc 780

agcatcgaca gcttcatcct cctggagatc atcaagcagg gctgcgagtt tgagaacaca 840

gtccacaagt ggatctccat taccgaagcc ctcgccttct tccactgctg cctcaaccct 900

atcctgtacg ctttcctcgg cgccaagttc aagacctccg ctcagcatgc tctcaccagc 960

gtgtccagag gcagcagcct gaagatcctg agcaagggca agagaggcgg ccacagcagc 1020

gtgagcacag agtccgagag ctccagcttc cactccagct ga 1062

<210> 21

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 22

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacc 65

<210> 23

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Arg Arg Lys Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr

1 5 10 15

Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 24

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60

cct 63

<210> 25

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aggtttaaac tacggatggt gctgctggtg acctccc 37

<210> 26

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atgactagtc ccgggttagc gagggggcag ggcctgc 37

<210> 27

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aggtttaaac tacggatggt gctgctggtg acctccc 37

<210> 28

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atgactagtc ccgggtcagc tggagtggaa gctggag 37

<210> 29

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aggtttaaac tacggatgga gaccgacacc ctgctgc 37

<210> 30

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

atgactagtc ccgggttagc gagggggcag ggcctgc 37

<210> 31

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aggtttaaac tacggatgga gaccgacacc ctgctgc 37

<210> 32

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

atgactagtc ccgggtcagc tggagtggaa gctggag 37

Claims

1.一种嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞，共表达趋化因子受体CXCR4；所述淋巴细胞为T淋巴细胞；所述的嵌合抗原受体包括：胞外抗原结合区，跨膜区和胞内信号区；其是从氮端到碳端顺次联接信号肽、肿瘤抗原结合的单克隆抗体可变区、CD8α跨膜区、CD28胞内段、4-1BB胞内段、CD3ζ链得到的；

所述的胞外抗原结合区是与肿瘤抗原结合的单克隆抗体可变区；所述的肿瘤抗原为B细胞成熟抗原BCMA；所述的肿瘤抗原结合的单克隆抗体可变区为scFv单链抗体，所述的scFv单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；

所述的CXCR4通过P2A与嵌合抗原受体连接共表达；所述的CXCR4为SEQ ID No.19所示的氨基酸序列的蛋白。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞，其特征在于：所述的CXCR4的编码核苷酸序列为SEQ ID No.20所示。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞，其特征在于：所述的P2A的氨基酸序列为SEQ ID No.21所示。

4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞，其特征在于：所述的P2A的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.22所示。

5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞，其特征在于：所述的scFv单链抗体的编码核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞，其特征在于：所述的嵌合抗原受体为氨基酸序列为SEQ ID No.13所示的蛋白；

7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞，其特征在于：所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.14所示。

8.表达载体在制备共表达趋化因子受体CXCR4的、靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞中的用途，其特征在于：所述表达载体能表达嵌合抗原受体和趋化因子受体CXCR4；

所述靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体包括胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号区；其是从氮端到碳端顺次联接信号肽、肿瘤抗原结合的单克隆抗体可变区、CD8α跨膜区、CD28胞内段、4-1BB胞内段、CD3ζ链得到的；

所述的胞外抗原结合区是与肿瘤抗原结合的单克隆抗体可变区；所述的肿瘤抗原为B细胞成熟抗原BCMA；所述的单克隆抗体单链可变区为scFv单链抗体，所述的scFv单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的CXCR4的编码核苷酸序列为SEQ IDNo.20所示的核苷酸序列。

10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的P2A的氨基酸序列为SEQ ID No.21所示。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述的P2A的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.22所示。

12.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的scFv单链抗体的编码核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

13.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的嵌合抗原受体为SEQ ID No.13所示的氨基酸序列的蛋白；

14.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述嵌合抗原受体的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.14所示。

15.权利要求1-7任一项所述的嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞在制备治疗多发性骨髓瘤的药物中的用途。