CN109266667B - 靶向cd5的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种编码靶向CD5的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其编码的所述胞外区包含CD5结合结构域，所述CD5结合结构域为如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。通过流式细胞术、脱颗粒分析实验、ELISA检测NK细胞分泌的细胞因子，证明该CD5 CAR NK细胞对表达CD5的血液肿瘤细胞有很强的杀伤作用，而对不表达CD5的细胞杀伤作用很弱，有效防止了脱靶效应。本发明嵌合抗原受体CD5 scFv‑CD8α‑4‑1BB‑CD3ζ可用于CD5阳性的淋巴细胞血液肿瘤的治疗。

Description

靶向CD5的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及靶向CD5的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
近年来，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)免疫疗法已成为强有力的一种新的过继免疫治疗技术，其对许多实体肿瘤、血液系统肿瘤，尤其是B细胞淋巴瘤治疗效果明显。CAR治疗利用改良的患者的T细胞可以突破MHC限制性直接识别肿瘤抗原，靶向清除恶性肿瘤。CAR-T细胞在血液肿瘤中已经被广泛应用，特别是CD19作为靶抗原的CAR-T细胞免疫治疗已获得突破性进展。然而，CAR-T细胞和恶性T细胞之间靶抗原的共同表达所导致的自我靶向杀伤问题限制了CAR-T在T细胞血液肿瘤中的应用。
NK细胞是一种细胞毒性淋巴细胞，为固有免疫系统的重要组成部分。NK细胞因其特殊的识别靶细胞的机制、短暂的生理周期、广泛的肿瘤杀伤能力等优势，被视为同样具有潜力通过CAR修饰增强其抗肿瘤能力的效应细胞。重要的是，NK细胞缺乏与T细胞共享的抗原，有效避免了自我靶向的问题。此外，在许多针对实体瘤和血液恶性肿瘤的临床试验中被验证有效的同时，也被证实几乎没有移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GvHD)的风险。
CAR-NK的细胞来源除了原代细胞外，还有许多成熟的细胞系，包括NK-92、NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS和NKL等，其中NK-92应用最为广泛。NK-92来源于一名患有非霍奇金淋巴瘤的女性外周血，于1992年建立，是一株IL-2依赖的永生细胞系。NK-92具有强大的细胞毒性，其在体外扩增得到的细胞群体一致性更好，且NK细胞系并不涉及分选纯化步骤。相较于原代NK细胞，NK-92最大的优势在于其表面的抑制性受体表达很低，抑制性受体信号的缺失使得其对多种肿瘤的杀伤能力要优于原代NK细胞。此外，NK-92在实体瘤治疗中也有一定的潜力。CAR-T在实体瘤中效果不佳的重要原因是，肿瘤细胞高表达PD-L1与T细胞表面的PD-1结合进而抑制了其杀伤活性，NK-92表面抑制性受体的缺失使之能够避免类似抑制信号的干扰。
CD5是正常T细胞表面的一种分化抗原，而NK细胞(NK-92细胞系)表面并不表达。此外，CD5是大多数淋巴细胞肿瘤，包括T细胞-急性淋巴细胞白血病(T-ALL),慢性淋巴细胞白血病(CLL),T细胞淋巴瘤及部分B细胞淋巴瘤的特征性的表面标志，且其并不表达于正常的造血干细胞及其他类型的非造血细胞，因此作为淋巴细胞肿瘤抗原的特异性高，可成为淋巴细胞恶性肿瘤中的理想治疗靶点。
目前市场上的靶向CD5的嵌合抗原受体对表达CD5的淋巴瘤细胞和淋巴细胞白血病细胞的杀伤效果不佳，无法更好地满足临床治疗要求，因此急需寻找一种新的靶向CD5的嵌合抗原受体来解决上述问题。
发明内容
本发明的一个方面，是针对现有技术中靶向CD5的嵌合抗原受体对表达CD5的淋巴瘤细胞和淋巴细胞白血病细胞的杀伤效果不佳，无法更好地满足临床治疗要求，提供了一种CD5特异性的嵌合抗原受体，该CAR特异性结合到靶抗原上，并发挥针对表达CD5的淋巴瘤细胞和淋巴细胞白血病细胞的细胞毒效应。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
编码靶向CD5的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其编码的所述胞外区包含CD5结合结构域，所述CD5结合结构域为如SEQID NO.3所示的氨基酸序列。
在本发明中，CD5阳性的肿瘤细胞与CD5 scFv结合后可以激活CAR-NK细胞，产生细胞毒效应；而CD5阴性细胞则几乎不能激活CAR-NK细胞产生应答。因此，以CD5 scFv为抗原识别区制备的CAR-NK细胞在识别并杀伤CD5阳性肿瘤细胞的同时，对CD5阴性的细胞不产生脱靶效应。
在本发明中，可以对所述CD5 scFv的氨基酸序列以合适的方式进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力和/或解离性质，而这些突变后的氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。
在本发明中，所述核酸分子可编码信号肽。信号肽可引导抗原识别区及铰链区转移到胞外。任意合适的信号肽或信号肽的组合均可实现本发明的目的。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述胞外区还包含构建在所述的嵌合抗原受体氨基末端的信号肽或与所述信号肽具有90-99％同一性的氨基酸序列，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列或GM-CSF。
更优选地，所述信号肽为如SEQ ID NO.4所示的信号肽。
在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述CD5结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接。任意合适的铰链区序列均可实现本发明的目的。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述铰链区为CD8α中的铰链区序列。
在本发明中，所述核酸分子还编码跨膜结构域。任意合适的跨膜结构域均能实现本发明的目的。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。
在本发明中，所述核酸分子编码的所述胞内信号转导区还包含共刺激因子。
作为优选，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。
更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述共刺激因子为CD28或4-1BB或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。
同时，本发明核酸分子还编码任意合适的胞内信号结构域。可以为CD3ζ胞内信号结构与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。
作为优选，本发明核酸分子所编码的嵌合抗原受体是以CD5 scFv抗原识别区、CD8α铰链区和跨膜区、以及4-1BB和CD3ζ胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其序列如SEQ ID NO.2所示。
另外，在上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区之间合适的位置可插入任意肽链作为间隔区，所述肽链可以为寡肽或多肽。
对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区等结构域的碱基序列，通过化学合成或PCR扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知文献或NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。
在本发明的一个实施方式中，发明人采用PCR扩增的方法获得CD5结合结构域CD5scFv抗原识别区的碱基序列。具体为，提取小鼠抗人CD5单克隆抗体杂交瘤细胞株的总RNA，逆转录合成cDNA第一链，使用“小鼠抗体scFv基因扩增试剂盒”PCR扩增合成鼠抗人CD5scFv。
上述小鼠抗人CD5单克隆抗体杂交瘤细胞株(HI211)是由中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)研制的。
本发明的另一个方面，是提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由上述核酸分子编码。
上述嵌合抗原受体的胞外区包含CD5结合结构域，所述CD5结合结构域为鼠抗人CD5抗体重链和轻链构成的scFv的氨基酸序列。
作为优选，本发明嵌合抗原受体是以CD5 scFv抗原识别区、CD8α铰链区和跨膜区、以及4-1BB和CD3ζ胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包含上述核酸分子。
在本发明中，上述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体，还可以为利用转座子的载体。所述载体中可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。另外，上述载体也可包含编码自杀基因的序列，可根据治疗过程，通过给予激活自杀基因的物质，从而控制体内CAR-NK细胞的数目。
作为上述病毒载体，可以为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。在本发明的一个实施方式中，使用的是慢病毒表达载体。
本发明的另一个方面，是提供了一种细胞，所述细胞包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体或上述载体。
作为优选，上述细胞为T细胞或NK细胞，更优选为NK细胞；
更优选地，上述NK细胞为选自原代NK细胞、NK-92、NK92.26.5、NK92.MI、NK-92Ci、NK-92Fc、NK3.3、NKL、NKG、NK-YT、NK-YS、NK-YTS、HANK-1、KHYG-1、CD56dim NK细胞、CD56brightNK细胞或HATAK细胞。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，上述细胞为ATCC来源的NK-92细胞系。所述的细胞也可以为其他类型的NK细胞系，包括NK-92MI、NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS和NKL等。也可以为未成系的NK细胞，如人体血液、骨髓等体液，及脾脏、胸腺、淋巴等组织，或者原发肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌症组织，经分离、纯化后得到的NK细胞，以及诱导多能干细胞、胚胎干细胞来源的NK细胞等。同时，所述NK细胞可以为CD56dim NK细胞，CD56bright NK细胞。所述NK细胞可以以合适的方式替换为T细胞，例如，敲除CD5分子的T细胞，其也视为包含在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述核酸分子在制备抗CD5阳性的淋巴细胞血液肿瘤药物中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述嵌合抗原受体在制备抗CD5阳性的淋巴细胞血液肿瘤药物中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述载体在制备抗CD5阳性的淋巴细胞血液肿瘤药物中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述细胞在制备抗CD5阳性的淋巴细胞血液肿瘤药物中的应用。
作为优选，上述应用为在制备难治/复发的抗CD5阳性细胞的血液肿瘤药物中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体、上述载体或上述细胞，以及药学上接受的载体。
本发明药物组合物除包含上述成分以外，还可包含任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。
同样，本发明药物组合物也可以和其他合适的抗肿瘤药物联合应用。例如，长春新碱、柔红霉素、门冬酰胺酶、环磷酰胺、泼尼松等。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述核酸分子在治疗CD5阳性表达的淋巴细胞血液肿瘤中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述嵌合抗原受体在治疗CD5阳性表达的淋巴细胞血液肿瘤中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述载体在治疗CD5阳性表达的淋巴细胞血液肿瘤中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述细胞在治疗CD5阳性表达的淋巴细胞血液肿瘤中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述药物组合物在治疗CD5阳性表达的淋巴细胞血液肿瘤中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明从小鼠抗人CD5单克隆抗体杂交瘤细胞株(HI211)中提取RNA，逆转成cDNA，使用“小鼠抗体scFv基因扩增试剂盒”经PCR技术扩增得到CD5 scFv并克隆到含有信号肽和CD8α-4-1BB-CD3ζ的慢病毒表达载体中，包装成携带CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ编码基因的慢病毒载体。利用慢病毒感染NK-92细胞，使NK-92细胞表达该嵌合抗原受体。通过流式细胞术、脱颗粒分析实验、以及ELISA检测NK-92细胞分泌的细胞因子，证明该嵌合抗原受体修饰的NK-92细胞对表达CD5的淋巴瘤细胞和淋巴细胞白血病细胞有很强的杀伤作用，对不表达CD5的细胞几乎没有杀伤作用，有效防止了脱靶效应。本发明嵌合抗原受体CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ可用于CD5阳性表达的淋巴细胞血液肿瘤的治疗。
附图说明
图1为本发明实施例中鼠抗人CD5单克隆抗体重链(VH)和轻链(VL)的PCR扩增电泳图；A图中1为2kb核酸分子量标准泳道，2为VH泳道，B图中1为2kb核酸分子量标准泳道，2为VL泳道；
图2为本发明实施例中慢病毒表达载体CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，泳道1为15kb核酸分子量标记泳道；泳道2为用核酸内切酶XbaⅠ和NotⅠ双酶切慢病毒表达质粒CD5scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ所得到的编码CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ的DNA片段(1474bp)和载体片段(7228bp)；泳道3为BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切慢病毒表达质粒CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ所得到的编码CD5 scFv DNA片段(723bp)和载体片段(7979bp)；
图3为本发明实施例中慢病毒表达载体示意图，其中，逆时针序列是正向基因片段，顺时针序列为反向基因片段；
图4为利用流式细胞术检测本发明实施例中构建的CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰NK-92细胞中CAR分子的表达结果图，其中，GFP为载体携带的标志蛋白的表达，F(ab')2为兔抗鼠IgG标记CD5 scFv在NK-92细胞表面的表达；
图5为利用流式细胞术检测本发明实施例中人急性单核细胞白血病细胞系MV4-11，人急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat、MOLT-4，人套细胞淋巴瘤细胞系Mino，细胞中CD5靶抗原分子的表达强度结果图，其中，A为CD5靶抗原分子表达阳性率；B为CD5靶抗原分子的表达强度(specific fluorescence intensity,SFI)；
图6为利用流式细胞术检测本发明实施例中NK-92细胞与靶细胞共培养后残留的肿瘤细胞存活率结果图。其中，CAR-NK-92为CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰NK-92细胞的实验组；VEC-NK-92为转染空载体的NK-92细胞的对照组；其中，A为CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰NK-92细胞的实验组及转染空载体的NK-92细胞的对照组分别与CD5表达阴性(CD5-)的MV4-11细胞系、CD5表达阳性(CD5+)的Mino、Jurkat、MOLT-4细胞系按效靶比(E:T)1:8、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1共培养6小时后残留的CD5+肿瘤细胞存活率结果图；B为CD5scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰NK-92细胞与MV4-11、Mino、Jurkat及MOLT-4细胞系按效靶比4:1共培养6小时后残留的肿瘤细胞存活率流式示意图；
图7为本发明实施例中CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰NK-92细胞对MV4-11、Mino、Jurkat和MOLT-4和(效靶比1:3)杀伤作用的脱颗粒检测结果图，其中，CAR-NK-92为CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰NK-92细胞的实验组，VEC-NK-92为转染空载体的NK-92细胞的对照组；
图8为本发明实施例中CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰NK细胞与MV4-11、Mino、Jurkat和MOLT-4细胞系按效靶比1:1共培养12小时后，NK-92细胞释放的细胞因子IFN-γ水平结果图，其中，CAR-NK-92为CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰NK-92细胞的实验组，VEC-NK-92为转染空载体的NK-92细胞的对照组；
图9为利用流式细胞术检测淋巴细胞白血病患者或淋巴瘤患者骨髓单个核细胞(BMMCs)CD5靶抗原分子的表达结果图，其中P1～P3表示患者编号；
图10为本发明实施例中CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰NK-92细胞与淋巴细胞白血病患者或淋巴瘤患者的BMMCs按效靶比1:4共培养12小时后流式检测残留的CD5+肿瘤细胞存活率结果图，其中，CAR-NK-92为CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰NK-92细胞的实验组，VEC-NK-92为转染空载体的NK-92细胞的对照组；
图11为本发明实施例中CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰NK-92细胞对淋巴细胞白血病患者或淋巴瘤患者的BMMCs杀伤作用的脱颗粒检测结果图，其中，CAR-NK-92为CD5scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ修饰NK-92细胞的实验组，VEC-NK-92为转染空载体的NK-92细胞的对照组。
序列说明
SEQ ID NO.1为本发明靶向CD5的嵌合抗原受体的氨基酸序列；
SEQ ID NO.2为本发明靶向CD5的嵌合抗原受体的核酸序列；
SEQ ID NO.3为本发明靶向CD5的嵌合抗原受体中抗原识别区的氨基酸序列；
SEQ ID NO.4为本发明靶向CD5的嵌合抗原受体中信号肽的氨基酸序列；
SEQ ID NO.5为本发明靶向CD5的嵌合抗原受体中CD8α-4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明公开了一种靶向CD5的嵌合抗原受体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：嵌合抗原受体中抗原识别区CD5 scFv的克隆
1.提取鼠抗人CD5单克隆抗体杂交瘤细胞株(HI211)的总RNA：在5×106的细胞团块中加入RNAiso Plus(Takara)1ml，吹打混匀。加入200μl三氯甲烷，上下颠倒、振荡混匀。室温静置5分钟后，于4℃，12000rpm，离心15分钟。吸取上清至1.5ml EP管，加入同体积异丙醇，轻轻上下颠倒混匀。4℃，12000rpm，离心15分钟。4℃预冷75％乙醇沉淀RNA，50μl DEPC水溶解总RNA。
2.逆转录合成cDNA第一链：配制PCR反应体系(20μl)如下：Oligo d(T)15Primers:2μl；M-MLV(200u/μl)：1μl；dNTP(each 2.5mM)：1μl；DTT(0.1M)：2μl；Firststrand buffer(5×)：4μl；CD5-RNA:2μg；DEPC水:补足至20μl。反应条件：37℃，60分钟，70℃10分钟。
3.使用“小鼠抗体scFv基因扩增试剂盒”(Public Protein/Plasmid Library)PCR扩增鼠抗人CD5单克隆抗体轻链(VL)和重链(VH)的基因片段：
扩增VL链：配制PCR反应体系(50μl)如下：MVLmix：45μl；DNA polymerase：0.3μl；cDNA：400ng；ddH2O：补足至50μl。反应条件：94℃预变性3分钟；重复如下循环30次：94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒；最后，72℃延伸10分钟；
扩增VH链：配制PCR反应体系(50μl)如下：MVH mix：45μl；DNA polymerase：0.3μl；cDNA：400ng；ddH2O：补足至50μl。反应条件：94℃预变性3分钟；重复如下循环30次：94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒；最后，72℃延伸10分钟；
琼脂糖凝胶电泳分离并回收VL、VH片段。结果如图1所示。
4.将VL、VH连接至pMD19-simple T载体并测序，根据测序结果确定CD5单克隆抗体VL、VH的核酸序列。
5.SOE-PCR方法构建VH-linker-VL方向CD5 scFv片段：
P1：5'CGGGATCCCAGGTGAAGCTGCAGCAGTC 3'
P2：5'GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT 3'
P3：5'GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGACATTGAGCTCACCCAGTCT 3'
P4：5'CGGAATTCTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCT 3'
配制第一轮PCR反应体系，获得BamH Ⅰ-VH-linker片段(50μl)：2×Pfu PCRMaster Mix(TianGen公司)：25μl；10μM P1+P2：2μl；pMD19-VH质粒：100ng；ddH2O：补足至50μl。反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环32次：94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒；最后，72℃延伸10分钟；
配制第一轮PCR反应体系，获得linker-VL-EcoR Ⅰ片段(50μl)：2×Pfu PCRMaster Mix(TianGen公司)：25μl；10μM P3+P4：2μl；pMD19-VL质粒：100ng；ddH2O：补足至50μl。反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环32次：94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒；最后，72℃延伸10分钟；
琼脂糖凝胶电泳分离并回收BamH Ⅰ-VH-linker、linker-VL-EcoR Ⅰ片段；
配制第二轮PCR反应体系，获得CD5 scFv(VH-linker-VL方向)片段(50μl)：2×PfuPCR Master Mix(TianGen公司)：25μl；10μM P1+P4：2μl；BamH Ⅰ-VH-linker片段：100ng；linker-VL-EcoR Ⅰ片段：100ng；ddH2O：补足至50μl。反应条件：94℃预变性5分钟；重复如下循环32次：94℃30秒，68℃90秒；最后，72℃延伸10分钟。
实施例2：嵌合抗原受体载体的构建
1.采用BamH I、EcoR I核酸内切酶酶切含有CD8α-4-1BB-CD3ζ片段的质粒，获得CD8α-4-1BB-CD3ζ片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。所述含有CD8α-4-1BB-CD3ζ片段的质粒可通过现有技术中任意合适的方法制得。
2.将实施例1中得到的CD5 scFv片段与目的载体进行连接，将构建的CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζCAR目的载体分别用BamH I、EcoR I及Xba I、Not I进行双酶切鉴定。结果如图2所示，酶切结果表明阳性克隆含有目的条带且测序鉴定正确。载体示意图如图3所示。
实施例3：嵌合抗原受体CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒修饰NK-92细胞的制备
1.采用EndoFree Plasmid Maxi质粒抽提试剂盒(QIAGEN公司)提取CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ表达质粒和包装质粒psPAX2、pMD.2G。三种质粒以4：3：1比例用PEI转染试剂(polyscience公司)进行转染(具体方法见PEI转染试剂说明书)。转染后12小时更换新鲜培养液，之后48小时收取病毒上清，于4℃，3000rpm，离心20分钟，经0.45μm滤器过滤后，采用50000g，4℃，2.5小时超速离心后浓缩10倍，-80℃保存。
2.NK-92细胞的培养：使用加入12.5％胎牛血清(Gibco公司),12.5％马血清(Gibco公司)，0.2mM肌醇，0.1mM 2-巯基乙醇，0.02mM叶酸及200U/ml人IL-2的MEM-α(Gibco公司)培养基，在5％CO2，37℃孵箱中培养。
3.慢病毒感染NK-92细胞及感染后NK-92细胞的培养：从-80℃中取出病毒上清，室温下融化，按每6×105NK-92细胞加入150μl病毒上清，加入Polybrene至终浓度为8μg/ml。32℃，1800rpm，离心1.5小时，转入5％CO2，37℃孵箱中培养，8小时后更换新鲜的完全培养基。
4.流式细胞术检测CAR修饰NK-92细胞的阳性率：收集细胞，标记兔抗鼠IgG F(ab')2抗体，流式细胞术分析NK-92细胞F(ab')2和GFP的表达。利用流式分选仪，分选出GFP表达阳性的VEC-NK-92细胞和F(ab')2、GFP表达阳性CAR-NK-92细胞，结果如图4所示，对照组VEC-NK-92细胞及实验组CAR-NK-92细胞在病毒感染后第5天阳性率分别为45.5％，19.8％；流式分选后阳性率分别为94.7％，85.2％。
实验例1：嵌合抗原受体CD5 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒修饰NK-92细胞对白血病细胞的杀伤作用
1.血液肿瘤细胞系中CD5的表达水平：
MV4-11、Mino、Jurkat和MOLT-4细胞系均购自美国ATCC。分别培养后，各吸取5×105细胞悬液，PBS洗2次后，标记APC抗人CD5单抗(Biolegend公司)，另标记一管APC-isotype(同型对照)为对照组，4℃孵育30分钟。运用流式细胞术检测各种细胞系CD5的表达水平，结果如图5所示。其中MV4-11、Mino、Jurkat和MOLT-4细胞系表达CD5及对应的同型对照的直方图如图5的A所示，其特异荧光强度(specific fluorescence intensity,SFI)分别为1.02、12.79、16.33和94.07，结果如图5的B所示。结果表明，本实验例中所使用的各种细胞系除MV4-11以外，均表达CD5。
2.CAR修饰的NK-92细胞与MV4-11、Mino、Jurkat和MOLT-4细胞系共培养后流式检测残留的肿瘤细胞：
将CAR5修饰的NK-92细胞(CAR-NK-92)与上述细胞按5×105细胞/孔的总细胞量接种于24孔培养板，并将效靶比(E：T)分别调整至1:8、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1，并将转染不含CAR的空载体NK-92细胞(VEC-NK-92)设为对照组，置于孵箱中共同培养。将共培养后的细胞用APC抗人CD5单抗(Biolegend公司)标记MV4-11、Mino、Jurkat和MOLT-4细胞系，用PE/Cy7抗人CD56单抗(Biolegend公司)标记NK-92细胞，流式细胞术检测残留细胞。结果如图6中的A所示，CAR-NK-92与表达CD5的MOLT-4细胞系共培养6小时后，各效靶比组CD5+肿瘤细胞残留分别为91.85％、68.5％、30.15％、23.2％、18.79％和12％，对照组存留MOLT4分别为97.85％、87.5％、81.94％、77.6％、73.94％和67.5％。与此相似，CAR-NK-92与其他两种表达CD5的细胞系Mino和Jurkat细胞系共培养6小时后，各效靶比组CD5+肿瘤细胞残留相较对照组也有明显降低。而CAR-NK-92与CD5表达阴性的MV4-11共培养6小时后，各效靶比组的肿瘤细胞无明显降低(分别为98.43％、97.25％、94.03％、87.2％、88.48％、80％)，与对照组(100.67％、101.63％、100.9％、100.6％、96.97％、94.5％)无显著差别。同样的，如图6中的B流式图所示，CAR-NK-92与CD5表达阳性的Mino、Jurkat和MOLT-4细胞按效靶比4:1共培养6小时后，残留CD5阳性的靶细胞分别为4.0％、0.5％和12.0％。CAR-NK-92细胞与CD5表达阴性的MV4-11细胞按效靶比4:1共培养6小时后，靶细胞仍残留80.0％。由上述结果可以看出，CAR-NK-92对表达CD5的肿瘤细胞具有明显的杀伤作用，同时，对不表达CD5的靶细胞作用微弱。
3.脱颗粒实验分析CAR修饰的NK-92细胞的激活：
将CAR-NK-92及VEC-NK-92细胞分别与MV4-11、Mino、Jurkat和MOLT-4细胞按照效靶比1:3进行共培养，并在共培养体系中加入anti-CD107a抗体和monensin；4h后应用流式细胞仪检测GFP+细胞表面CD107a的表达水平。结果如图7所示，结果表明，CAR-NK-92与MV4-11、Mino、Jurkat和MOLT-4共培养体系中，细胞激活百分率分别为4.17％、13.33％、16％、17.03％，VEC-NK-92与MV4-11、Mino、Jurkat和MOLT-4细胞共培养体系中，细胞激活百分率分别为3.87％、5.0％、4.8％、1.93％。CAR-NK-92与VEC-NK-92的激活有显著差异(P<0.001)；且CAR-NK-92与MV4-11细胞共培养的激活水平显著低于与CD5表达阳性的细胞共培养的激活水平。
4.ELISA检测淋巴瘤细胞系与CAR-NK-92细胞共培养上清中细胞因子IFN-γ的水平：
分别将MV4-11、Mino、Jurkat和MOLT-4细胞系按照2.5×105细胞/孔接种24孔板。按每孔2.5×105细胞分别加入CAR-NK-92、VEC-NK-92细胞，补充培养液至1ml于孵箱中共培养12小时后。采用人IFN-γELISA检测试剂盒(R&D公司)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)。结果如图8所示，结果表明，表达CD5的淋巴瘤细胞系Mino及急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat、MOLT-4与CAR-NK-92共培养上清中IFN-γ的水平均较VEC-NK-92组有显著性升高(P<0.001)，但在不表达CD5的MV4-11细胞的共培养上清中的IFN-γ水平很低。结果表明，CAR-NK-92在表达CD5的肿瘤细胞刺激下，能够显著分泌IFN-γ。
5.淋巴细胞白血病及淋巴瘤患者的骨髓单个核细胞(BMMCs)中CD5的表达水平：
病人标本均来自中国医学科学院血液病医院，并征得患者的知情同意。采用Ficoll梯度离心分离出BMMCs后，各吸取5×105细胞悬液，PBS洗2次后，标记APC抗人CD5单抗(Biolegend公司)或APC-isotype(对照组)，4℃孵育30分钟。运用流式细胞术检测各患者BMMCs表达CD5的比例和强度，如图9所示，其中P1～P3代表1～3号患者。
6.CAR修饰的NK-92细胞与患者的BMMCs共培养后流式检测残留的肿瘤细胞：
将细胞按4×105细胞/孔接种24孔培养板，分别加入1×105(E:T＝1:4)的CAR修饰的NK-92细胞，转染不含CAR的空载体NK-92细胞(VEC-NK-92)设为对照组，于孵箱中共培养。将共培养后0h及12h的细胞用APC抗人CD5单抗(Biolegend公司)标记患者的白血病细胞，用PE/Cy7抗人CD56单抗(Biolegend公司)标记NK-92细胞，流式细胞术检测残留细胞。结果如图10中的A和图10中的B所示，结果显示，CAR-NK-92与表达CD5的1-3号患者BMMCs共培养12小时后，CAR-NK-92组分别存留CD5+细胞为17.3％、15.92％、31.9％，对照组存留为82.1％、119.01％、100.0％。由上述结果可以说明，CAR-NK-92对表达CD5的血液肿瘤原代BMMCs具有杀伤作用，同时，对不表达CD5的靶细胞没有表现出脱靶效应。
7.CAR修饰的NK-92细胞与患者的BMMCs共培养后脱颗粒实验分析CAR修饰的NK-92细胞的激活：
将CAR-NK-92及VEC-NK-92细胞分别与1～3号患者的BMMCs按照效靶比1:4进行共培养，并在共培养体系中加入anti-CD107a抗体和monensin；4h后应用流式细胞仪检测CD56+细胞表面CD107a的表达水平。结果如图11所示，结果显示，CAR-NK-92与1～3号患者共培养体系中，细胞激活百分率分别为12.6％、37.8％、4.9％；VEC-NK-92与表达与1～3号患者共培养体系中，细胞激活百分率分别为6.7％、3.1％、2.3％。由上述结果可以说明，CAR-NK-92与VEC-NK-92的激活有显著差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）
<120> 靶向CD5的嵌合抗原受体及其应用
<130> 2018
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 487
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro
20 25 30
Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu
65 70 75 80
Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu
85 90 95
Thr Ser Ala Arg Ser Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Asp
100 105 110
Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Lys Ile Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Phe Ser Val
165 170 175
Thr Cys Lys Ala Ser His Asp Val Ser Val Asp Val Ala Trp Tyr Gln
180 185 190
Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser His
195 200 205
Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr
210 215 220
Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val
225 230 235 240
Tyr Phe Cys His Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly
245 250 255
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Phe Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
260 265 270
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
290 295 300
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
305 310 315 320
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
325 330 335
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
340 345 350
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
355 360 365
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
370 375 380
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
385 390 395 400
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
405 410 415
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
420 425 430
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
435 440 445
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
450 455 460
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
465 470 475 480
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 2
<211> 1461
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgggatccc aggtgaagct gcagcagtct ggacctgaac tgaagaagcc tggagagaca 120
gtcaagatct cctgcaaggc ttctggctat accttcacaa actatggaat gaactgggtg 180
aagcaggctc caggaaaggg tttaaagtgg atgggctgga taaacaccga cactggagag 240
ccaacatatg ctgaagagtt caagggacgg tttgccttct ccttggaaac ctctgccagg 300
tctgcctatc tgcagatcaa caacctcaaa aatgacgaca cggcttcata tttctgtgca 360
agacgttacg actggtactt cgatgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420
ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctccgacat tgagctcacc 480
cagtctccaa aaatcatgtc cacatcagta ggagacaggt tcagcgtcac ctgcaaggcc 540
agtcacgatg tgagtgttga tgtagcctgg tatcaacaga aaccaggaca ttctcctaaa 600
ctactgattt actcggcatc ccaccggtac actggagtcc ctgatcgctt cactggcagt 660
ggatctggga cggatttcac tttcaccatc agcagtgtgc aggctgaaga cctggcagtt 720
tacttctgtc accaatatta tactactcct tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa 780
atcaaagaat tcaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840
tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900
acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 960
ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 1020
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1080
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1140
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1200
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1260
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1320
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1380
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1440
atgcaggccc tgccccctcg c 1461
<210> 3
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 3
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Arg Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Asp Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Ile Met Ser
130 135 140
Thr Ser Val Gly Asp Arg Phe Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser His Asp
145 150 155 160
Val Ser Val Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro
165 170 175
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser His Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
180 185 190
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser
195 200 205
Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Tyr Tyr
210 215 220
Thr Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> Human
<400> 4
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 5
<211> 223
<212> PRT
<213> Human
<400> 5
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
65 70 75 80
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
85 90 95
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
100 105 110
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
115 120 125
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
130 135 140
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
145 150 155 160
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
165 170 175
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
180 185 190
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
195 200 205
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
210 215 220

Claims (18)

1.编码靶向CD5的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其特征在于，其编码的所述胞外区包含CD5结合结构域，所述CD5结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述胞外区还包含构建在所述的嵌合抗原受体氨基末端的信号肽，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列或GM-CSF。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述信号肽为如SEQ ID NO.4所示的信号肽。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述CD5结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接；所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α或β链、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4-1BB或CD154。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述铰链区为CD8α中的铰链区序列。
6.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述胞内信号转导区还包含共刺激因子。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、整联蛋白、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为CD28或4-1BB。
9.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2所示。
10.靶向CD5的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由权利要求1～9中任意一项所述的核酸分子编码。
11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
12.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求1～9中任意一项所述的核酸分子。
13.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求1～9中任意一项所述的核酸分子、如权利要求10或11所述的嵌合抗原受体或如权利要求12所述的载体；
所述细胞为T细胞或NK细胞。
14.根据权利要求13所述的细胞，其特征在于，所述细胞为NK细胞。
15.根据权利要求14所述的细胞，其特征在于，所述NK细胞为选自原代NK细胞、NK-92、NK92.26.5、NK92.MI、NK-92Ci、NK-92Fc、NK3.3、NKL、NKG、NK-YT、NK-YS、NK-YTS、HANK-1、KHYG-1、CD56dim NK细胞、CD56brightNK细胞或HATAK细胞。
16.如权利要求1～9中任意一项所述的核酸分子、如权利要求10或11所述的嵌合抗原受体、如权利要求12所述的载体或如权利要求13所述的细胞在制备抗CD5阳性细胞的血液肿瘤药物中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述应用为制备难治或复发的抗CD5阳性细胞的血液肿瘤药物中的应用。
18.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1～9中任意一项所述的核酸分子、如权利要求10或11所述的嵌合抗原受体、如权利要求12所述的载体或如权利要求13所述的细胞，以及药学上接受的载体。
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