CN117431217A - 表达靶向cd5的嵌合抗原受体(car)的细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本文提供了可以特异性结合CD5蛋白的嵌合抗原受体(CAR)，其包含CD5结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，还提供了包含所述嵌合抗原受体的经工程化的免疫效应细胞(诸如T细胞)。本文还提供了所述CAR及工程化的免疫效应细胞在用于治疗与CD5的表达相关的疾病或病症中的应用。

Description

表达靶向CD5的嵌合抗原受体(CAR)的细胞及其应用
技术领域
本文涉及生物医药领域，具体涉及表达靶向CD5的嵌合抗原受体的细胞(如T细胞)及其应用。
背景技术
近年来，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)技术取得了突破性进展，尤其在针对B细胞恶性肿瘤的靶点取得了巨大的成功，以anti-CD19 CAR-T为代表，迄今为止，已有Kymriah，Yescarta及Tecartus三款产品先后经美国FDA批准上市。临床试验已证实，特异性靶向CD19分子的CAR-T细胞能有效治疗B细胞性恶性肿瘤，包括复发/难治性的B-ALL、CLL和B细胞淋巴瘤1-11。文献报道，CD19 CAR-T对复发/难治性ALL的治疗有效率可高达90％，对CLL和部分B细胞淋巴瘤的有效率大于50％。尽管CAR-T疗法在B细胞恶性肿瘤治疗领域取得了巨大的成功，但其在T细胞恶性肿瘤的研究及应用十分有限。
T细胞恶性肿瘤包括急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)及T细胞淋巴瘤(TCL)。T-ALL是T淋巴细胞异常增生造成的血液疾病，具有侵袭性并且进展迅速。T细胞淋巴瘤是T细胞的一种恶性肿瘤，可在淋巴组织(如淋巴结和脾脏)中或在淋巴组织之外(如胃肠道，肝脏，鼻腔，皮肤等)发展，约占非霍奇金淋巴瘤10％～15％，在我国比例更高。CD5在淋巴细胞前体，成熟T细胞和一部分成熟B细胞(Bl细胞)上组成性表达12,13。CD5在约85％的T-ALL和约75％的外周T细胞淋巴瘤中高表达。此外，CD5在套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)和毛细胞白血病细胞(HCL)中也常有表达。目前T细胞恶性肿瘤放化疗后复发率高、预后差，是临床较难治愈的血液系统恶性肿瘤，急需开发针对该疾病的细胞治疗药物。在正常细胞中，CD5的表达仅限于成熟的T细胞和B细胞的部分亚型，CD5抗原的生物学特性允许CD5 CAR T细胞在体外和体内产生针对T-ALL和T淋巴瘤细胞的有效抗肿瘤活性。所以，CD5可以作为T细胞肿瘤的安全且可靠的靶点。
Mamonkin M等研究者开发了一个二代CD5 CAR，采用鼠源单克隆抗体H65的scFv，临床实验研究结果表明该CD5 CAR-T细胞在既往多线治疗的r/r CD5+T-ALL和T细胞非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)患者中是安全的，而且能产生临床疗效，并且不会导致完全的T细胞消除14,15。更重要的是，通过CD5 CAR-T细胞清除恶性T细胞或许能使既往不适合移植的患者接受HSCT(造血干细胞移植)。但根据现有临床随访数据得知该鼠源scFv CAR-T在输注后可出现CD5+恶性疾病的复发，CAR-T在患者体内存续时间有限可能与抗鼠抗体的产生有关，而全人源scFv可能可以解决CD5 CAR-T在患者体内存续时间短的问题。开发全人源的CD5抗体，对于研发下一代体内存续时间更长、长期疗效更好的CAR-T产品，有非常重要的意义。
发明内容
在一方面，本文提供了免疫效应细胞，其包括：
1)嵌合抗原受体(CAR)和/或其编码核酸序列；以及
2)自杀基因和/或自杀基因编码的蛋白产物，
其中所述自杀基因为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因。
在一些实施方案中，所述HSV-TK为HSV-TK mut2；优选地，所述HSV-TK mut2包括SEQ ID NO：71所示序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述CAR包括CD5结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，所述CD5结合结构域包含一个或更多个特异性结合CD5的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列选自以下组合的任一个：
(1)SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：39所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：40所示序列的HCDR3；
(2)SEQ ID NO：41所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：42所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：43所示序列的HCDR3；
(3)SEQ ID NO：64所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：65所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：66所示序列的HCDR3；以及
(4)SEQ ID NO：67所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：68所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：69所示序列的HCDR3。
在一些实施方案中，所述CD5结合结构域包括至少两个特异性结合CD5的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3分别独立地选自以下组合的任一个：
(1)SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：39所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：40所示序列的HCDR3；
(2)SEQ ID NO：41所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：42所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：43所示序列的HCDR3；
(3)SEQ ID NO：64所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：65所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：66所示序列的HCDR3；以及
(4)SEQ ID NO：67所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：68所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：69所示序列的HCDR3。
在一些实施方案中，所述CD5结合结构域包括特异性结合CD5的第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段，所述第一抗体或其抗原结合片段和所述第二抗体或其抗原结合片段包括的HCDR1、HCDR2、HCDR3分别独立地选自以下组合的任一个：
(1)所述第一抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1、SEQ IDNO：39所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：40所示序列的HCDR3；所述第二抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：41所示序列的HCDR1、SEQ ID NO：42所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：43所示序列的HCDR3；
(2)所述第一抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1、SEQ IDNO：39所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：40所示序列的HCDR3；所述第二抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：64所示序列的HCDR1、SEQ ID NO：65所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：66所示序列的HCDR3；以及
(3)所述第一抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1、SEQ IDNO：39所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：40所示序列的HCDR3；所述第二抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：67所示序列的HCDR1、SEQ ID NO：68所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：69所示序列的HCDR3。
在一些实施方案中，所述至少两个特异性结合CD5的抗体或其抗原结合片段之间串联连接。
在一些实施方案中，所述抗体为单域抗体，优选全人源单域抗体。
在一些实施方案中，所述CD5结合结构域包括至少两个单域抗体，所述单域抗体之间通过linker片段连接；优选地，所述linker片段包括SEQ ID NO：25所示序列。
在一些实施方案中，所述CD5结合结构域包括SEQ ID NO：33、35、37、47、57、59、61或63所示序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域包括来自选自下述蛋白的多肽：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3e，CD45，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154；优选地，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO：6所示序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述共刺激结构域包括选自下述蛋白的多肽：CD28、4-1BB、OX-40和ICOS；优选地，所述共刺激结构域包括SEQ ID NO：8所示序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包含来自CD3ζ的信号传导结构域；优选地，所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：10所示序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述CAR还包含铰链区，所述铰链区连接所述CD5结合结构域和所述跨膜结构域；优选地，所述铰链区包含SEQ ID NO：4所示序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述CAR包括CD8α信号肽；优选地，所述信号肽包含SEQ IDNO：2所示序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述CAR的编码核酸序列和所述自杀基因位于同一核酸分子中。
在一些实施方案中，所述CAR的编码核酸序列和所述自杀基因位于被引入所述免疫效应细胞的同一表达载体中。
在一些实施方案中，所述表达载体为慢病毒表达载体，如pLVx载体或pCDH载体。
在一些实施方案中，所述CAR的编码核酸序列和所述自杀基因之间包括剪切肽编码序列。
在一些实施方案中，所述自杀基因位于所述CAR的编码核酸序列的5’方向或3’方向。
在一些实施方案中，所述剪切肽包括来自T2A肽的氨基酸序列；优选地，所述剪切肽包括SEQ ID NO：12所示序列或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述免疫效应细胞不表达CD5。
在一些实施方案中，所述免疫效应细胞不表达TRAC基因和/或TRBC基因。
在一些实施方案中，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞。
另一方面，本文提供了分离的核酸分子，其包括上述CAR的编码核酸序列和自杀基因。
在一些实施方案中，所述编码核酸序列包括SEQ ID NO：32、34、36、46、56、58、60或62所示序列。
在一些实施方案中，所述剪切肽包括来自T2A肽的氨基酸序列；优选地，所述剪切肽包括SEQ ID NO：12所示序列或其功能性变体。
另一方面，本文提供了表达载体，其包括上述核酸分子。
在一些实施方案中，所述载体选自质粒、逆转录病毒载体和慢病毒载体，如pLVx载体或pCDH载体。
另一方面，本文提供了制备免疫效应细胞的方法，其包括：
1)敲除所述免疫效应细胞的(1)CD5基因和/或(2)TRAC基因和/或TRBC基因；以及
2)向免疫效应细胞中引入权利要求22-24任一项所述的核酸分子或权利要求25或26所述的表达载体。
在一些实施方案中，采用CRISPR/Cas9技术进行所述CD5基因的敲除；优选地，所用的sgRNA的靶序列包括SEQ ID NO：70所示序列。
另一方面，本文提供了药物组合物，其包括：
1)权利要求1-21中任一项所述的免疫效应细胞、权利要求22-24任一项所述的核酸分子或权利要求25或26所述的表达载体；以及
2)药学上可接受的佐剂。
另一方面，本文提供了上述免疫效应细胞、核酸分子或表达载体在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗与CD5的表达相关的疾病或病症。
另一方面，本文提供了治疗与CD5的表达相关的疾病或病症的方法，其包括以治疗有效量的上述免疫效应细胞、核酸分子、表达载体或药物组合物向有需要的受试者给药。
在一些实施方案中，还包括以更昔洛韦GCV向有需要的受试者给药以杀灭所述免疫效应细胞。
在一些实施方案中，所述与CD5的表达相关的疾病或病症为癌症或恶性肿瘤。
在一些实施方案中，所述与CD5的表达相关的疾病或病症为T淋巴母细胞淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。
附图说明
图1显示了本实验中抗CD5 VHs竞争结合FACS的原理示意图(图1A)及用流式细胞术检测CD5 KO CD5 CAR-T细胞的CD5抗原表位结合鉴定结果(图1B)。
图2显示了本实验中采用的CAR结构(图2A)及转染后CAR-T细胞的CD5和EGFRt表达检测(图2B)。
图3显示了T-ALL和T-淋巴瘤细胞系中CD5的表面表达情况。
图4显示了不同靶细胞与CAR-T细胞共孵育后的CD107a脱粒作用结果。
图5显示了CAR-T细胞对多种靶细胞的杀伤结果。
图6显示了CAR-T/T细胞的基础凋亡水平结果。
图7显示了CD5阳性靶细胞反复刺激CD5 CAR-T细胞后CAR-T细胞的增殖情况。
图8显示了CAR-T/T细胞及PBS对小鼠T细胞肿瘤模型治疗结果。
图9显示了实施例4中CT125A细胞与CD5抗原的结合研究结果。
图10显示了实施例5中CT125A在阳性靶细胞刺激下的脱颗粒活性结果(**,p<0.01；*,p<0.05)。
图11显示了实施例6中CT125A对不同种类的阳性靶细胞的杀伤结果。
图12显示了实施例7中CT125A细胞因子释放研究结果。
图13显示了西妥昔介导自然杀伤细胞体外对CT125A细胞清除研究结果。
图14显示了实施例9中各组动物实验期间的生存率曲线。
图15显示了实施例9中各组动物体重变化趋势。
图16显示了实施例9中各组动物平均肿瘤荧光信号强变化趋势。
图17显示了实施例9中各组动物外周血IL-2变化趋势。
图18显示了实施例9中各组动物外周血IL-4变化趋势。
图19显示了实施例9中各组动物外周血IL-6变化趋势。
图20显示了实施例9中各组动物外周血IL-10变化趋势。
图21显示了实施例9中各组动物外周血TNF-α变化趋势。
图22显示了实施例9中各组动物外周血IFN-γ变化趋势。
图23显示了实施例10中各组动物各时间点体重变化图(g)。
图24显示了实施例10各组各时间点动物肿瘤生长曲线。
图25显示了实施例13中RD125 61-42-rFc单域抗体兔Fc融合蛋白与CD5阳性细胞的结合研究结果。
图26显示了不同分子结构的CD5 HSV-TK CAR-T制备及活率和细胞量变化情况。(A)CD5 HSV-TK的四种不同CAR分子载体结构示意图。四种载体结构中CAR分子的核心元件均相同，只是HSV-TK开关的位置以及载体骨架分子的不同；2946和2947为同一慢病毒骨架，携带氨苄霉素抗性，而2948和2949为同一慢病毒骨架，携带卡那霉素抗性。(B).CAR-T细胞的制备简要流程。(C).2946和2947CAR-T细胞在制备过程中活率和细胞量变化统计图，D2为转毒前，D3为换液前。(D).2948和2949CAR-T细胞在制备过程中活率和细胞量变化统计图，D2为转毒前，D3为换液前。
图27显示了不同分子结构的CD5 HSV-TK CAR-T制备过程中的CAR阳性细胞比例。(A)2946和2947CAR-T制备过程中的CAR阳性细胞比例随着培养天数(转毒后)的变化。(B)2948和2949CAR-T制备过程中的CAR阳性细胞比例随着培养天数(转毒后)的变化。(C)CAR-T制备时的CD5敲除效率。
图28显示了CAR阳性细胞分选结果。(A)2946和2947CAR-T的CAR阳性细胞分选的结果，input指分选前细胞，pos指分选后结合在柱子上的细胞，neg指未被结合在柱子上而流下的细胞。(B)CAR阳性细胞分选4天后CAR的纯度检测以及CAR阳性细胞分选时结合上的抗原残留情况检测。
图29显示了CD5 CAR-T的体外杀瘤功能检测结果。(A)CD5 KO T细胞杀瘤能力；(B)CD5 CAR-T细胞杀瘤能力；(C)利用pLVx载体构建制备出的携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5CAR-T细胞的杀瘤功能检测。
图30显示了CD5 CAR-T的体外杀瘤功能检测结果。(A)CD5 KO T细胞杀瘤能力；(B)CD5 CAR-T细胞杀瘤能力；(C)利用pCDH载体构建制备出的携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5CAR-T细胞的杀瘤功能检测。
图31显示了GCV药物对HSV-TK阳性细胞的抑制结果。(A)CD5 CAR-T细胞在不同浓度的GCV处理下，细胞总量变化情况。(B)pLVx载体构建的CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞在不同浓度的GCV处理下，细胞总量变化情况。(C)CD5 CAR-T细胞在不同浓度的GCV处理下，CAR阳性细胞数量变化情况。6D.pLVx载体构建的CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞在不同浓度的GCV处理下，CAR阳性细胞数量变化情况。
图32显示了GCV药物对HSV-TK阳性细胞的抑制结果。(A)CD5 CAR-T细胞在1ug/mlGCV存在或撤除情况下，细胞总量变化情况。(B)pLVx载体构建的CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞1ug/ml GCV存在或撤除情况下，细胞总量变化情况。(C)CD5 CAR-T细胞在1ug/ml GCV存在或撤除情况下，CAR阳性细胞数量变化情况。(D)pLVx载体构建的CD5CAR-T(HSV-TK)细胞1ug/ml GCV存在或撤除情况下，CAR阳性细胞数量变化情况。
图33显示了CD5 CAR-T的动物实验体内杀瘤功能检测结果：CAR-T组G3、G4、G5组与对照组的小鼠血液luciferase读值。
图34显示了通过流式细胞术检测的GCV对小鼠体内CD5 CAR-T的清除情况。CAR-T组G3组有明显的CAR-T细胞群，即CD3+CAR+细胞群。GCV处理7天的CAR-T组，即G4组与GCV处理14天的CAR-T组，即G5组几乎检测不到CAR-T细胞，即CD3+CAR+细胞群。
图35显示了实时定量PCR检测的GCV对小鼠体内CD5 CAR-T的清除情况。在Day14/21两个时间点，即GCV给药7/14天后，外周血，脾脏和肺中，G3组的CAR-T拷贝数目(VCN)显著高于GCV给药处理组。
图36显示了GCV停止药物处理后小鼠的肿瘤复发情况。G4组在Day14时停止GCV处理，G5组在Day21时停止GCV处理，即在GCV停止给药14天后，部分小鼠的外周血中luciferase读值较高，显示携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5 CAR-T细胞被GCV清除后，肿瘤细胞再次生长起来。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。本文所述的CAR可特异性结合CD5，利用所述CAR制得的CAR-T细胞可以稳定表达所述CAR，利用所述CAR制得的CAR-T细胞有较高的CAR阳性率。此外，所述CAR可促进细胞因子的释放，并可用于治疗与CD5的表达相关的疾病或病症。
除非明确指明相反，否则本申请的实施将采用本领域技术内的常规化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学的方法。这些方法的描述可以参见，例如，Sambrook等人，MolecμLar Cloning:A LaboratoryManual(第3版，2001)；Sambrook等人，MolecμLar Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)；Maniatis等人，MolecμLar Cloning:A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人，Current Protocols in MolecμLar Biology(John Wiley和Sons，2008年7月更新)；ShortProtocols in MolecμLar Biology:A Compendium of Methods from Current Protocolsin MolecμLar Biology，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience；Glover，DNACloning:A Practical Approach，vol.I&II(IRL Press，Oxford，1985)；Anand，Techniquesfor the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press，New York，1992)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins，Eds.，1984)；Perbal，A PracticalGuide to MolecμLar Cloning(1984)；Harlow和Lane，Antibodies，(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1998)Current Protocols in ImmunologyQ.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.MargμLies，E.M.Shevach和W.Strober，eds.，1991)；Annual Review of Immunology；以及期刊专著如Advances in Immunology。
除非另有定义，否则本申请中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本申请的目的，下文定义了以下术语。
在本文中，术语“嵌合抗原受体”(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是包括抗体的可变区和T细胞信号分子的融合蛋白。它使T细胞可以通过非MHC限制性的方式识别特异性抗原，发挥杀伤作用。CAR是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部件，其可以包括肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异抗原(TSA)结合区、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号结构域，在肿瘤相关抗原结合区和跨膜结构域之间还可以进一步包含铰链区。在本文中，所述CAR可以是一种能够将免疫效应细胞的细胞毒性重定向至T细胞的基因工程嵌合蛋白，其将基于抗体的抗原(例如CD5)特异性与T细胞受体活化胞内结构域组合在一起。经遗传修饰表达CAR的T细胞可以特异地识别和消除表达靶抗原的恶性细胞。关于CAR和CAR T细胞的描述，可以参见例如Sadelain M,Brentjens R,Rivi`ere I.The basicprinciples of chimericantigen receptor design.Cancer Discov.2013；3(4):388-398；Turtle CJ,Hudecek M,Jensen MC,Riddell SR.Engineered T cells for anti-cancer therapy.Curr OpinImmunol.2012；24(5):633-639；Dotti G,Gottschalk S,Savoldo B,Brenner MK.Designand development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing Tcells.Immunol Rev.2014；257(1):107-126；以及WO2013154760、WO2016014789。
在本文中，术语“CD5”是I型跨膜糖基化蛋白，在T细胞受体信号传导的负调控中起着重要作用，并促进正常和恶性淋巴细胞的存活。CD5是恶性T细胞肿瘤的特征性表面标志物之一，80％的T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)和外周T细胞淋巴瘤都表达CD5。在本文中，所述CD5可以为人CD5，其GenBank登录号为NM_014207.4。CD5蛋白也可包括CD5的片段，诸如胞外结构域及其片段。由于为了防止靶向CD5的CAR-T细胞对自身进行攻击，可在制备CAR-T细胞之前将T细胞进行CD5基因敲除。
“TRAC基因”和“TRBC基因”在本文中分别指T细胞受体α链恒定区的编码基因和T细胞受体β链恒定区的的编码基因。该α链和β链构成T细胞受体(TCR)，其识别抗原和介导免疫应答的作用。“TRAC基因”和/或“TRBC基因”的敲除导致细胞不能表达TCR分子。敲除“TRAC基因”和/或“TRBC基因”使得T细胞不能表达有功能的TCR，可避免移植物抗宿主病。
在本文中，术语“CD5结合结构域”通常是指CD5 CAR的胞外结构域，该结构域可以与抗原特异性结合。例如，所述CD5胞外结合结构域可包含能特异性结合人体细胞上表达的CD5多肽的抗CD5抗体或其抗原结合片段。在本文中使用的术语“结合结构域”、“胞外结构域”、“胞外结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”和“胞外抗原特异性结合结构域”可互换使用。CD5结合结构域可以为天然来源、合成来源、半合成来源或重组来源。
在本文中，术语“抗体”通常是指能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包括通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链组成的经典免疫球蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单域抗体(例如，sdAb)，单链抗体(例如，scFv)。本文中，抗体的“抗原结合片段”指抗体的可结合对应抗原的片段，例如，Fab、Fab’和(Fab’)2片段等。本领域技术人员已知如何获得这些抗原结合片段。例如，经典抗体分子可经木瓜蛋白酶消化而得到Fab片段，经胃蛋白酶消化得到F(ab’)2，通过以还原剂处理断开F(ab’)2铰链区之间的二硫键而形成Fab’片段。术语“抗体”还包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。VH区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链的可变区含有与抗原相互作用的结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。
“单链抗体(single chain fragment variable,scFv)”，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接成一条肽链而构成。通过正确折叠，来自重链和轻链的可变区通过非共价键相互作用形成Fv段，因而scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性。
“单域抗体(single domain antibody，sdAb)”，或者也称为“VHH抗体”，指具有抗原结合能力，包括重链可变区而无轻链的抗体分子。从结构上看，单域抗体也可以认为是抗体分子的一种抗原结合片段。其首先在骆驼科动物中被发现，随后，研究人员通过抗体库(例如噬菌体展示文库)筛选发现了更多的具有抗原结合能力的单域抗体。单域抗体相对于普通抗体分子(例如，经典四聚体抗体分子)或其抗原结合片段具有一些优势，例如包括但不限于：分子量更小，使用于人体时易于到达普通抗体分子难以到达的组织或部位，或者，能够接触到蛋白或多肽中普通抗体分子难以接触到的抗原表位；更加稳定，能够耐受例如温度和pH的变化以及变性剂和蛋白酶的作用。
提及抗体或其抗原结合片段时，“靶向”或“特异性结合”指，相对于环境中同时存在的其他分子，一种分子(例如抗体或其抗原结合片段)对另一种分子(如肿瘤细胞表面抗原)具有更高的结合亲和力。“靶向”或“特异性结合”并不排除该分子可以对一种以上的分子具有结合亲和力，例如双特异性抗体可以对两种不同抗原具有高亲和力。
在本文中，术语“跨膜结构域”(Transmembrane Domain)通常是指CAR中穿过细胞膜的结构域，其与细胞内信号转导结构域相连接，起着传递信号的作用。本发明中，跨膜结构域可以是CD8α跨膜结构域。
在本文中，术语“共刺激结构域”通常是指可以提供免疫共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。所述共刺激结构域可包括CD28的共刺激结构域，还可包括TNF受体家族的共刺激结构域，例如OX40和4-1BB的共刺激结构域。
在本文中，术语“铰链区”通常是指抗原结合区和免疫细胞Fc受体(FcR)结合区之间的连接区。本发明中，铰链区可以是CD8α铰链区。
在本文中，术语“胞内信号传导结构域”通常是指CAR位于细胞内信号传导的组分，其包含信号传导结构域和特异性结合所述受体组分的结构域，例如：其可选自CD3ζ胞内域，CD28胞内域、CD28胞内域、4-1BB胞内域和OX40胞内域。
在本文中，术语“CD8α信号肽”(Signal peptide)通常是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(长度5-30个氨基酸)肽链。
在本文中，术语“标记检测信号”通常是指已知功能或序列的能够起到特异性标记作用，发出可以被检测到的信号的基因、蛋白质或其他分子。所述标记检测信号可以为荧光蛋白，如：GFP、RFP和YFP等。所述标记检测信号可以为EGFRt。术语“EGFRt”或“tEGFR”在本发明中可以互换使用，是指编码截短的人表皮生长因子受体多肽的基因，其缺乏远端膜EGF结合域和细胞质信号传导尾，但保留了由抗EGFR抗体识别的细胞外表位。EGFRt可用作具有遗传修饰细胞功能的非免疫原性选择工具以及追踪标记。在本文中，其可作为CAR-T细胞的标记分子，还可以用于在必要时清除体内的CAR-T细胞。可利用EGFR抗体(例如，西妥昔单抗)介导的ADCC途径(cetuximab mediated ADCC pathway)清除体内的CAR-T细胞(参见US8802374B2)，即在临床转化时作为安全开关使用。
本文中，术语“CSF2RA信号肽”，即集落刺激因子2受体α亚基(colony stimμLatingfactor 2receptor subunit alpha)信号肽，是可引导新合成的蛋白质在CAR-T细胞表面表达的肽链。
在本文中，“EGFR抗体”是指能引发抗体依赖型细胞媒介毒性作用(antibodydependent cell-mediated cytotoxicity)，使免疫细胞攻击具有截短型表皮生长因子受体(EGFRt)的CAR-T细胞，协助清除CAR-T细胞的抗体。所述EGFR抗体可在患者输注CAR-T后发生严重不良反应或其他需要清除CAR-T细胞的情况时使用，其可以协助清除CAR-T细胞，减轻CAR-T治疗相关症状。所述EGFR抗体包括但不限于西妥昔单抗、帕尼单抗、耐昔妥珠单抗和尼妥珠单抗。
另一种在受试者体内清除CAR-T细胞(或NK细胞)的方法是采用自杀基因。术语“自杀基因”指该基因在宿主细胞中表达后，可导致表达该基因的宿主细胞的死亡(包括凋亡，失去活性等)。该自杀基因的表达可以是可诱导地、或者该自杀基因发挥自杀作用依赖于另外提供的小分子药物。在一个实施方案中，所采用的自杀基因为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因，通过提供HSV-TK的底物更昔洛韦(GCV)使得HSV-TK可作为控制CAR-T细胞数量的开关。在一个实施方案中，所采用的自杀基因为诱导型Caspase-9(iC9)，通过提供小分子药物AP1903使其二聚化并导致细胞凋亡。tEGFR或这些自杀基因的使用使得临床医生在观察到受试者中出现的明显副作用或在癌症已被清除时终止治疗。对于分子开关目的的“tEGFR”和“自杀基因”，其编码序列可以独立于CAR编码序列被引入免疫效应细胞(如T细胞)中。优选地，它们可以与CAR编码序列位于相同表达载体上被引入免疫效应细胞(如T细胞)中，以方便操作。
“自剪切肽”在本文中指可经核糖体跳跃而非蛋白酶水解来实现剪切蛋白的功能的短肽，可包括T2A、F2A和P2A等。
术语蛋白质或多肽序列的“功能性变体”在本文中指，通过1个或更多个，例如1-30，或1-20或1-10个，例如1或2或3或4或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而与亲本相比具有氨基酸改变的序列。功能性变体基本上保持改变之前的蛋白质或多肽序列的生物学特性。在一方面，本文涵盖在文中所述的任何蛋白质或多肽序列的变体。在某些实施方式中，蛋白质或多肽序列的功能性变体保持改变前亲本的至少60％、70％、80％、90％或100％的生物学活性。本文所述的功能性变体可以是信号肽、抗体、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域胞内信号传导域、剪切肽、CSF2RA信号肽、EGFRt或HSV-TK的功能性变体。当提及抗体的功能性变体时，还包括抗体可变区(如VH或VL)、抗体恒定区(如CH或CL)、重链CDR区(HCDR1、HCDR2或HCDR3)、轻链CDR区(LCDR1、LCDR2或LCDR3)等的功能性变体。氨基酸的取代、缺失和/或插入可以发生在重链CDR区或轻链CDR区，或者重链FR区或轻链FR区，或者重链恒定区或轻链恒定区，其中变体基本上保持改变之前的抗体分子的生物学特性。对于抗体而言，其生物学活性例如包括抗原结合能力。在某些实施方式中，抗体的功能性变体包含的氨基酸改变不会导致抗体变体丧失对抗原的结合，但任选地可以赋予诸如提高的抗原亲和力和不同的效应子功能等性质。可以理解的，抗体的重链可变区或轻链可变区、或各CDR区可以单独改变或组合改变。在某些实施方案中，在一个或多个或全部三个重链CDR中的氨基酸改变不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。在某些实施方式中，所述氨基酸改变可以为氨基酸取代，例如可以为保守取代。在某些实施方式中，功能性变体与亲本具有至少80％、85％、90％或95％或99％或更高的氨基酸一致性。类似地，核酸分子的“功能性变体”在本文中指，能与亲本核酸分子编码相同氨基酸序列的核酸分子。
在本文中，“序列一致性”通常是指在比较窗中以逐个核苷酸或逐个氨基酸为基础的序列相同的程度。可以通过以下方式计算“序列一致性百分比”：将两条最佳比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同一性百分比。为了确定序列同一性百分数而进行的最佳比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。
在本文中，术语“分离的”通常是指所描述的对象与它的天然环境中的组分处于分离状态。在某些实施方式中，分离的抗体可包括将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定。关于评价抗体纯度的方法的综述可参见Flatman，S.等，J.Chrom.B 848(2007)79-87。类似地，“分离的核酸分子”指经过提取或纯化的核酸分子，也包括人工合成的核酸分子。
在本文中，术语“核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。在本文中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，具体操作可参见Sambrook等人，MolecμLar Cloning,A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in MolecμLar Biology,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York N.Y.,1993。
在本文中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，用以将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够将其中的部分序列转录并翻译成多肽的多核苷酸，即表达载体。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。在本申请中，所述载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。本文所述载体可选自质粒、逆转录病毒载体和慢病毒载体。本文所述质粒、逆转录病毒载体和慢病毒载体可包含CAR编码序列。
在本文中，术语“质粒”通常是指细菌、酵母菌等生物中染色体或拟核以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其能够在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒在遗传工程研究中被用作基因的载体。
在本文中，术语“逆转录病毒载体”通常是指RNA病毒的一种，其遗传信息存储在核糖核酸上，此类病毒多具有反转录酶。反转录病毒至少含有三种基因：gag，包含组成病毒中心和结构的蛋白质的基因；pol，包含反转录酶的基因和env，包含组成病毒外壳的基因。通过逆转录病毒转染，逆转录病毒载体可将自身基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，例如，可将CAR分子整合进宿主细胞中。
在本文中，术语“慢病毒载体”通常是指属于逆转录病毒的一种二倍体RNA病毒载体。慢病毒载体是以慢病毒的基因组为基础，将其中多个和病毒活性相关的序列结构去除，使其具有生物学的安全性，然后再在这个基因组骨架中引入实验所需要的目标基因的序列和表达结构制备成的载体。与其他逆转录病毒相比，慢病毒载体有着更广泛的宿主，对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力，对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因的转导效率(参见陈琛和万海粟，“慢病毒载体及其研究进展，Chinese Journal of Lung Cancer 17.12(2014):870–876.PMC)。通过慢病毒载体转染，逆转录病毒载体可将自身基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，例如，可将CAR分子整合进宿主细胞中。
在本文中，术语“转座子”通常是指含有转座酶基因的离散DNA片段，侧翼是含有转座酶结合位点的末端反向重复序列(TIR)。转座酶可与TIR结合并使转座子转移到新的位点。本文所述转座子是由一个携带CAR(转座子)的质粒和另一个携带转座酶的质粒组成的双组分系统。所述转座子可以通过电转导等方式导入靶细胞。例如，首先，两种组分被电穿孔到外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)中，表达的转座酶作用于CAR两侧的末端反向重复序列(terminal inverted repeat，TIR)，切割CAR(转座子)并随后整合到靶细胞(例如T细胞)基因组中的TA二核苷酸序列上。转座和稳定的基因组整合完成后，靶细胞表面就能表达出CAR蛋白(参见Cheng Zhang,Jun Liu,Jiang F Zhong,etal.Engineering CAR-T cells.Biomarker Research.2017，5:22)。
“敲除”或“基因敲除”在本文中指改变细胞中某基因的核苷酸序列，无论该改变是核苷酸插入、缺失还是替换，只要被敲除的该基因在细胞中不能产生有功能的基因产物(如RNA或蛋白)即可。理想地，基因敲除使得细胞或细胞群完全不形成该基因的基因产物或者有功能的基因产物。可理解地，导致基因产物的量明显减少，或者基因产物的活性明显减低，也可认为是实现了“基因敲除”。在一些情况下，可能需要对细胞中的两个或更多个基因进行基因敲除。在一些实施方案中，可以按次序进行基因敲除，即在敲除一个基因后，接着进行下一个基因的敲除。在另一些实施方案中，可以同时对两个或更多个基因进行敲除。例如，在采用CRISPR技术敲除细胞中的多个基因时，可以同时向该细胞引入Cas9和分别靶向各个基因的多种sgRNA。
在本文中，术语“基因编辑”通常是指对基因组进行定点修饰的技术，可包括基于锌指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator like effector nucleases，TALENs)、规律性重复短回文序列簇(clustered regμLarly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein(Cas9)，CRISPR/Cas9)等的技术。其可以对基因组进行高效靶向修饰，通过在基因组的特定位置添加、去除或改变遗传物质来进行修饰。本文所述基因编辑可包括通过基因编辑的技术(例如CRISPR-Cas9)，将CAR分子导入受体细胞的基因组中。
“CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)基因编辑技术”是一种由RNA指导的通过Cas核酸酶对靶基因进行DNA编辑的技术。该技术所使用的CRISPR基因编辑系统包括Cas核酸酶和引导RNA(single-guide RNA,sgRNA)，视情况可还包括作为修复模板的ssDNA。sgRNA的一部分序列可以与Cas核酸酶结合，另外部分序列(crRNA)可以与靶基因的部分序列互补，借助sgRNA的识别作用使得Cas核酸酶可以在靶基因特定位点形成单链或双链切口。细胞通常会通过两种方式对断裂链进行DNA修复，这两种方式分别是同源重组修复机制(homology-directed repair,HDR)和非同源末端连接修复机制(non-homologous end joining,NHEJ)。在将CRISPR技术例如用来对细胞的基因进行基因敲除操作时，通常只需要考虑破坏该基因的正常编码功能，例如引起移码突变或基因片段缺失，从而不能产生有正常功能的产物(如蛋白)。通常，可以在向细胞中引入Cas核酸酶(例如Cas9)和sgRNA后，再筛选出不表达待敲除基因的产物的细胞。“CRISPR基因编辑系统”在本文中指Cas核酸酶和sgRNA的组合，用于在引入细胞后对sgRNA靶向基因进行编辑。
提及sgRNA时，术语“靶序列”指目标基因或待敲除基因中与sgRNA的部分序列(crRNA，约20个碱基)互补的核苷酸片段。借助于sgRNA中与靶序列互补的这部分序列，让Cas9等蛋白可以在相对确定的位置在目标基因中引入核苷酸序列改变，达到基因敲除的效果。相应地，在本文中，“靶向某指定序列的sgRNA”指该sgRNA的靶序列为该指定序列。
在本文中，术语“免疫效应细胞”通常是指在免疫应答中参与清除异物抗原和行使效应功能的免疫细胞。例如浆细胞、细胞毒性T细胞、NK细胞、APSC多能细胞、肥大细胞等。
在本文中，术语“癌症”通常是指或描述哺乳动物的生理状况，其典型特征在于细胞增殖或存活失调。在本文中，被称为癌症的过度增殖性疾病包括但不限于实体瘤，例如发生在乳腺、呼吸道、脑、生殖器官、消化道、尿道、眼、肝脏、皮肤、头颈、甲状腺、甲状旁腺的癌症，以及它们的远端转移。这类疾病还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。乳腺癌的实例包括但不限于浸润性导管癌、浸润性小叶癌、乳腺导管原位癌和乳腺小叶原位癌。呼吸道癌症的实例包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌，以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。脑癌的实例包括但不限于脑干和下丘脑角质瘤、小脑和大脑星状细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤，以及神经外胚层和松果体肿瘤。男性生殖器肿瘤包括但不限于前列腺和睾丸癌。女性生殖器肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌，以及子宫瘤。消化道肿瘤包括但不限于肛门、结肠、结肠直肠、食管、胆囊、胃、胰腺、直肠、小肠和唾液腺癌。尿道肿瘤包括但不限于膀胱、阴茎、肾、肾盂、输尿管和尿道癌。眼癌包括但不限于眼球内黑素瘤和视网膜母细胞瘤。肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌(有或没有纤维板层变异的肝细胞瘤)、胆管癌(肝内胆管癌)和混合型肝细胞胆管细胞癌。皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌、卡波西(Kaposi’s)肉瘤、恶性黑素瘤、Merkel细胞皮肤癌和非黑素瘤型皮肤癌。头颈癌包括但不限于喉/下咽/鼻咽/口咽癌，和嘴唇和口腔癌。淋巴癌包括但不限于AIDS相关的淋巴癌、非霍奇金淋巴癌、皮肤T细胞淋巴癌、霍奇金氏病，以及中枢神经系统淋巴癌。肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。白血病包括但不限于急性髓样白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病和毛细胞白血病。
“治疗”指对受试者进行处理以获得有益的或所期望的临床结果。本文所用的“治疗”涵盖各种处理手段，包括以任何可能的药物向受试者给药、手术、辐射等。出于本发明的目的，有益或所期望的临床结果包括但不限于以下的任一种或多种：减轻一种或更多种症状、减弱疾病程度、预防或延迟疾病扩散(例如转移，例如转移至肺或淋巴结)、预防或延迟疾病复发、延迟或减缓疾病进展、改善疾病病况、抑制疾病或疾病进展、阻滞其发展和缓解(无论部分抑或完全缓解)。本文所提供的方法涵盖这些治疗方面中的任一种或多种。按照以上内容，“治疗”不需要完全去除病症或疾病的所有症状或完全缓解。
术语“治疗有效量”指足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的活性化合物的量。本发明融合蛋白的“治疗有效量”可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。例如，典型的日剂量范围可以为每kg体重0.01mg至100mg或更多活性成分。
提及药物组合物，所使用的术语“药学上可接受的载体”指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质，这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。依照给药途径，可以施用本领域众所周知的各种不同的载体，包括，但不限于糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽糖、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸缓冲液、乳化剂、等渗盐水、和/或无热原水等。本文所提供的药物组合物可以制成粉末、注射剂等临床可接受的剂型。可以使用任何适当的途径向受试者施用本发明的药物组合物，例如可通过口服、静脉内输注、肌肉内注射、皮下注射、腹膜下、直肠、舌下，或经吸入、透皮等途径给药。
“药物试剂盒”指包括至少两种活性成分的药物组合。不同于药物组合物，药物试剂盒中至少一种活性成分与其他活性成分分开保存。
“受试者”指动物，例如哺乳动物，包括(但不限于)人类、啮齿动物、猿猴、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊、山羊、哺乳类实验动物、哺乳类农畜、哺乳类运动动物和哺乳类宠物。受试者可为雄性或雌性且可为任何适龄受试者，包括婴儿、幼年、青年、成年和老年受试者。在一些实例中，受试者指需要治疗疾病或病症的个体。在一些实例中，接受治疗的受试者可为患者，其患有与该治疗有关联的病症，或有风险患上该病症。在另一些实例中，受试者为健康个体或者为患有非所关注疾病的个体。在特定实例中，受试者为人类，诸如人类患者。该术语通常可与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
在本文中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
本发明使用全人源的、仅包含重链可变区的单克隆抗体。首先，全人源单域抗体分子量小，使CAR的结构更为简化，比人源化的鼠源抗体具有更低的免疫原性，在抗体药物或CAR-T应用上有更好的潜力。其次，更小的尺寸使得全人源单域抗体更有可能接触到更狭小或部分隐藏的抗原表位，比尺寸较大的scFv具有空间优势。此外，更小的尺寸可增加其基因治疗载体的病毒滴度，并使得其更易于在T细胞表面表达。并且，在双特异CAR的应用中，与两个scFv的搭配设计相比，采用能够识别两种抗原的两个单域抗体sdAb搭配能简化双特异CAR的结构，改善其表达效率和结构稳定性。在获得了特异性结合细胞表面CD5抗原及CD5重组蛋白的抗体克隆后，我们将其构建至带human Fc段的IgG表达载体上，通过CHOS细胞进行蛋白表达，并进行流式竞争实验，并获得结合CD5抗原不同表位的全人源单域克隆。单域串联CAR与单个单域克隆相比可能具有增强CAR-T药效的功能，并可能降低抗原突变治疗无效和复发的风险。全人源单域克隆，串联的结合CD5抗原不同表位的全人源单域克隆及对照克隆H65构建至二代CAR结构上，然后进行慢病毒包装，并转染T细胞，在CAR-T细胞水平，从靶细胞激活和杀伤，靶细胞刺激增殖等角度验证了串联全人源单域CD5抗体克隆FHVH3VH1功能强于对照克隆H65。
此外，文献报道在大多数构建的肿瘤动物模型中，重新出现的肿瘤细胞保留了CD5表达，这表明肿瘤复发并非源于抗原的丧失，未能根除所有异种移植物是由于CD5 CAR-T细胞在小鼠中的存续性差。我们用CRISPR/Cas9技术将T细胞表面的CD5抗原敲除，最大限度的减少CD5 CAR-T的自激活及自杀现象，保证其在临床验证中的持续性和有效性。此外，分子开关的使用增强了CAR-T细胞的临床安全性。
在开发流程上，通过噬菌体水平的抗体筛选/特异性鉴定，快速高效筛选到特异抗体克隆，后面直接衔接CAR-T功能测试，优选出最佳的候选抗体，优化了以CAR-T开发为目的的抗体筛选流程，在保证研究质量的同时，提高了研发效率。
嵌合抗原受体
在本文中，所述CAR可以包含特异性结合CD5的胞外结构域、跨膜结构域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号传导结构域。在本文中，所述CAR的胞外结构域可以包含本发明的单域抗体(VHH)、两个或更多个串联的单域抗体(2×VHH)。例如，所述单域抗体可以通过铰链区，例如CD8α铰链，与跨膜结构域连接。在本文中，所述CAR可以用于转导免疫效应细胞(例如T细胞)并在细胞表面表达。由此本文也可提供表达所述嵌合抗原受体的T细胞，以及该T细胞和/或所述CAR用于制备治疗CD5相关疾病的药物中的用途。
在本文中，所述嵌合抗原受体(CAR)可包含CD5结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。在本文中，所述CD5结合结构域可包含特异性结合CD5的抗体或其片段，所述抗体可包含重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述HCDR1-3的氨基酸序列如SEQ ID NO：38-43、64-69所示。在本文中，所述抗体可包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：33、35、37、47、57、59、61或63所示。
在本文中，所述抗体可为单域抗体。在某些实施方案中，所述抗体可包含SEQ IDNO：33、35、37、47、57、59、61或63所示的氨基酸序列或其功能性变体。例如，所述单域抗体可包括FHVH1 sdAb，其序列如SEQ ID NO：33所示；所述单域抗体可包括FHVH3 sdAb，其序列如SEQ ID NO：35所示；所述单域抗体可包括FHVH3VH1 sdAb，其序列如SEQ ID NO：37所示；所述单域抗体可包括FHVH1VH3 sdAb，其序列如SEQ ID NO：47所示；所述单域抗体可包括FHVH2 sdAb，其序列如SEQ ID NO：57所示；所述单域抗体可包括FHVH4 sdAb，其序列如SEQID NO：59所示；所述单域抗体可包括FHVH2VH1 sdAb，其序列如SEQ ID NO：61所示；所述单域抗体可包括FHVH4VH1 sdAb，其序列如SEQ ID NO：63所示。
例如，本文所述单域抗体可以为FHVH1 sdAb，其序列如SEQ ID NO：33所示，单域抗体FHVH1的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示；所述单域抗体可包括FHVH3 sdAb，其序列如SEQ ID NO：35所示，单域抗体FHVH3的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示；所述单域抗体可包括FHVH1VH3 sdAb，其序列如SEQ ID NO：37所示，单域抗体FHVH1VH3的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ IDNO：42和SEQ ID NO：43所示。所述单域抗体可包括FHVH3VH1 sdAb，其序列如SEQ ID NO：37所示，单域抗体FHVH3VH1的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示。
本文所述单域抗体可以为FHVH2 sdAb，其序列如SEQ ID NO：57所示，单域抗体FHVH2的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66所示；所述单域抗体可包括FHVH4 sdAb，其序列如SEQ ID NO：59所示，单域抗体FHVH4的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示；所述单域抗体可包括FHVH2VH1 sdAb，其序列如SEQ ID NO：61所示，单域抗体FHVH2VH1的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示。所述单域抗体可包括FHVH4VH1 sdAb，其序列如SEQ ID NO：63所示，单域抗体FHVH4VH1的HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示。
本文所述CAR可包括跨膜结构域，所述跨膜结构域可包含来自选自下述蛋白的多肽：T细胞受体的α，β或ζ链、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在本文中，所述跨膜结构域可包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或其功能性变体。例如，本文所述CAR的跨膜结构域可包括CD8α，其序列如SEQ ID NO：6所示。
在本文中，所述共刺激结构域可包含来自选自下述蛋白的多肽：CD28、4-1BB、OX40和ICOS。在本文中，所述共刺激结构域可包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或其功能性变体。
本文所述CAR可包括胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域可包含来自CD3ζ的信号传导结构域。在本文中，所述胞内信号传导结构域可包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或其功能性变体。
本文所述CAR可包括铰链区，所述铰链区可连接所述抗体和所述跨膜结构域。在本文中，所述铰链区可包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其功能性变体。
本文所述CAR可包括信号肽，所述信号肽例如可以位于特异性结合CD5的胞外结构域的N端。所述信号肽可包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其功能性变体。例如，所述信号肽可为CD8α信号肽，其序列如SEQ ID NO：2所示。
在本文中，所述CAR还可连接剪切肽。在本文中，所述剪切肽可包含来自T2A肽的氨基酸序列。在本文中，所述剪切肽可包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或其功能性变体。例如，所述剪切肽可为T2A，其序列如SEQ ID NO：12所示。
在本文中，所述CAR还可连接EGFRt片段，所述EGFRt片段可用于信号检测，或作为CAR-T细胞的分子开关使用。
在本文中，所述CAR可包含SEQ ID NO：27、29、31、45、49、51、53或55所示的氨基酸序列或其功能性变体。例如，所述CAR可选自FHVH1 CAR，其序列如SEQ ID NO：27所示。又例如，所述CAR可选自FHVH3 CAR，其序列如SEQ ID NO：29所示；所述CAR可选自FHVH3VH1 CAR，其序列如SEQ ID NO：31所示。所述CAR可选自FHVH1VH3 CAR，其序列如SEQ ID NO：45所示。所述CAR可选自FHVH2 CAR，其序列如SEQ ID NO：49所示；所述CAR可选自FHVH4 CAR，其序列如SEQ ID NO：51所示；所述CAR可选自FHVH2VH1 CAR，其序列如SEQ ID NO：53所示；所述CAR可选自FHVH4VH1 CAR，其序列如SEQ ID NO：55所示。
在某些实施方式中，本文所述CAR可自N端依次包括CD5结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。其中，所述CAR可包括CD5结合结构域，所述CD5结合结构域序列如SEQ ID NO：33、35所示。其中，所述CD5结合结构域可包括HCDR1-3，其序列依次如SEQ ID NO：38-40所示；并且，CD5结合结构域可包括另一组HCDR1-3，其序列依次如SEQID NO：41-43所示。所述CAR可包括FHVH3VH1 CAR或与其具有相同的两组HCDR1-3的本文所述的CAR。所述CD5结合结构域包括串联的重链可变区，其序列如SEQ ID NO：37或47所示，其中，所述重链可变区可包括HCDR1-3，其序列依次如SEQ ID NO：38-40所示，并且，CD5结合结构域可包括另一组HCDR1-3，其序列依次如SEQ ID NO：41-43所示。
在某些实施方式中，本文所述CAR可自N端依次包括CD5结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域。其中，所述CAR可包括CD5结合结构域，所述CD5结合结构域序列如SEQ ID NO：57、59所示。其中，所述CD5结合结构域可包括HCDR1-3，其序列依次如SEQ ID NO：64-66所示；并且，CD5结合结构域可包括另一组HCDR1-3，其序列依次如SEQID NO：67-69所示。所述CD5结合结构域包括串联的重链可变区，其序列如SEQ ID NO：61或63所示，其中，所述重链可变区可包括HCDR1-3，其序列依次如SEQ ID NO：64-66、38-40所示，并且，CD5结合结构域可包括另一组HCDR1-3，其序列依次如SEQ ID NO：67-69、38-40所示。
所述重链可变区之间还可包括连接肽，其序列如SEQ ID NO：25所示。例如，所述CAR可包括FHVH3VH1 CAR、FHVH1VH3 CAR、FHVH2VH1 CAR、FHVH4VH1 CAR或与其具有相同的连接肽的本文所述的CAR。所述跨膜结构域的可包含来自CD8α的跨膜结构域，其序列可以如SEQ ID NO：6所示。例如，所述CAR可包括FHVH3VH1 CAR、FHVH1VH3 CAR、FHVH2VH1 CAR、FHVH4VH1 CAR或与其具有相同的跨膜结构域的本文所述的CAR。所述共刺激结构域可包含来自4-1BB的共刺激结构，其序列可以如SEQ ID NO：8所示。例如，所述CAR可包括FHVH3VH1CAR、FHVH1VH3 CAR、FHVH2VH1 CAR、FHVH4VH1 CAR或与其具有相同的共刺激结构域的本文所述的CAR。所述胞内信号传导结构域可包含来自CD3ζ的信号传导结构域，其序列如SEQ IDNO：10所示。例如，所述CAR可包括FHVH3VH1CAR、FHVH1VH3 CAR、FHVH2VH1 CAR、FHVH4VH1CAR或与其具有相同的胞内信号转导结构域的本文所述CAR。所述CAR还可包含铰链区，所述铰链区可位于所述CD5结合结构域的C端且位于所述跨膜结构域的N端，其序列例如可以如SEQ ID NO：4所示。例如，所述CAR可包括FHVH3VH1 CAR、FHVH1VH3 CAR、FHVH2VH1 CAR、FHVH4VH1 CAR或与其具有相同的铰链区的本文所述CAR。所述CAR还可连接信号肽，其可位于所述CAR的N端，其序列可以如SEQ ID NO：2所示。
所述CAR还可连接剪切肽，例如：T2A。所述剪切肽可以位于所述胞内信号转导域的C端，其序列可以如SEQ ID NO：12所示。所述CAR还可以连接CSF2RA信号肽，其可以位于EGFRt之前，其序列例如可以如SEQ ID NO：14所示。所述CAR还可连接标记检测信号，其可位于所述CAR(或者，所述剪切肽)的C端。所述标记检测信号可选自以下组：GFP、RFP、YFP或EGFRt，EGFRt的序列例如可以如SEQ ID NO：16所示。
例如，本文所述的CAR可以为FHVH3VH1 CAR，其VHH(FHVH1)HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示；VHH(FHVH1)的氨基酸序列如SEQID NO：33所示；VHH(FHVH3)HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示；VHH(FHVH3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示VHH(FHVH3)与VHH(FHVH1)之间的连接肽的序列如SEQ ID NO：25所示；其铰链区如SEQ ID NO：4所示；其跨膜结构域如SEQ ID NO：6所示；其共刺激结构域为4-1BB共刺激结构域，如SEQ ID NO：8所示；其CD3ζ胞内信号传导结构域如SEQ ID NO：10所示；所述FHVH3VH1 CAR还包含如SEQ ID NO：12所示的剪切肽，如SEQ ID NO：14所示的CSF2RA信号肽，以及如SEQ ID NO：16所示的EGFRt；如SEQ ID NO：2所示的CD8α信号肽。
CD8α例如，本文所述的CAR可以为FHVH1 CAR，其VHH(FHVH1)HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示；VHH(FHVH1)的氨基酸序列如SEQID NO：33所示；其铰链区如SEQ ID NO：4所示；其跨膜结构域如SEQ ID NO：6所示；其共刺激结构域为4-1BB共刺激结构域，如SEQ ID NO：8所示；其CD3ζ胞内信号传导结构域如SEQ IDNO：10所示；所述FHVH1 CAR还包含如SEQ ID NO：12所示的剪切肽，如SEQ ID NO：14所示的CSF2RA信号肽，以及如SEQ ID NO：16所示的EGFRt；如SEQ ID NO：2所示的CD8α信号肽。
例如，本文所述的CAR可以为FHVH3 CAR，其VHH(FHVH3)HCDR1-3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43所示；VHH(FHVH3)的氨基酸序列如SEQ IDNO：35所示；其铰链区如SEQ ID NO：4所示；其跨膜结构域如SEQ ID NO：6所示；其共刺激结构域为4-1BB共刺激结构域，如SEQ ID NO：8所示；其CD3ζ胞内信号传导结构域如SEQ IDNO：10所示；所述FHVH1 CAR还包含如SEQ ID NO：12所示的剪切肽，如SEQ ID NO：14所示的CSF2RA信号肽，以及如SEQ ID NO：16所示的EGFRt；如SEQ ID NO：2所示的CD8α信号肽。
本文提供的CAR可以通过剪切肽与分子开关(如tEGFR或HSV-TK)连接，或认为CAR也包括分子开关部分。本领域技术人员可理解的是，由于剪切肽的作用，表达该CAR的细胞中通常并不存在该CAR与分子开关的融合蛋白，以上描述仅是处于简洁目的。但是，对于核酸分子来说，CAR的编码序列可以与剪切肽以及分子开关的编码序列组合在一个表达盒中，由同一个启动子进行转录。
核酸、载体、细胞、制备方法和组合物
另一方面，本文提供了一种分离的核酸分子，其可编码本文所述的CAR。本文所述编码CAR的分离的核酸分子，其可包含选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17-24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、或62所示的核酸序列或其功能性变体。本文所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
另一方面，本文提供了一种载体，其可包含所述的核酸分子。在本文中，所述载体可选自质粒、逆转录病毒载体和慢病毒载体中的一种或多种。本文所述慢病毒载体可包含CAR。例如，本文所述慢病毒载体可包含选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17-24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、或62所示的核酸序列或其功能性变体。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。本文所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体，包括载体sdAb质粒和/或CAR质粒。
另一方面，本文提供给了一种免疫效应细胞，其可包含本文所述的CAR，所述的核酸分子，或所述的载体。在本文中，所述免疫效应细胞可为哺乳动物细胞。在本文中，免疫效应细胞可选自T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞。
另一方面，本文提供了一种制备免疫效应细胞的方法，其包括敲除所述免疫效应细胞的CD5基因，并向免疫效应细胞中引入本文所述的CAR表达载体。本文还提供了一种制备免疫效应细胞的方法，其包括敲除所述免疫效应细胞的TRAC和/或TRBC基因，并向免疫效应细胞中引入本文所述的CAR表达载体。本文还提供了一种制备免疫效应细胞的方法，其包括敲除所述免疫效应细胞的CD5基因以及TRAC和/或TRBC基因，并向免疫效应细胞中引入本文所述的CAR表达载体。
例如，可将本文所述的CAR表达载体引入所述免疫效应细胞中，例如T淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞。在某些实施方式中，每种或每个细胞可包含一个或一种本文所述的表达载体。在某些实施方式中，每种或每个细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本文所述的表达载体。在本文中，可通过本领域已知的方法将所述表达载体引入免疫效应细胞中。例如，可以通过逆转录病毒载体进行转染免疫效应细胞，将带有CAR分子的病毒基因组能整合到宿主基因组，保证目的基因长期、稳定地表达。又例如，利用转座子，通过携带CAR(转座子)的质粒和携带转座酶的质粒导入到靶细胞中。又例如，可以通过基因编辑的方式(例如CRISPR/Cas9)将CAR分子添加进基因组中。在本文中，可通过本领域已知的方法将本文所述的带有CAR分子的载体引入所述细胞中，例如电穿孔、脂质体法转染(lipofectamine 3000，Invitrogen)等。
另一方面，本文提供了一种药物组合物，其可包含所述的免疫效应细胞和药学上可接受的佐剂。所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂等。在本文中，所述药物组合物可被配制用于口服给药，静脉内给药(例如，静脉注射，I.V.)，肌肉内给药(例如，肌肉注射，I.M.)，在肿瘤部位的原位给药，吸入，直肠给药，阴道给药，经皮给药或通过皮下储存库给药。
制药用途
另一方面，本文提供了所述的CAR、所述的核酸分子、所述的载体或所述的免疫效应细胞用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗与CD5的表达相关的疾病或病症。在本文中，所述与CD5的表达相关的疾病或病症可为癌症或恶性肿瘤。在某些实施方式中，所述癌症或恶性肿瘤可选自恶性T细胞肿瘤或恶性B细胞肿瘤。其中，所述恶性T细胞肿瘤可选自T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、T细胞淋巴瘤(TCL)(例如外周T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、T细胞非霍奇金淋巴瘤(T-NHL))；所述恶性B细胞肿瘤可选自慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)(例如毛细胞白血病细胞(HCL))、套细胞淋巴瘤(B-MCL)、弥漫大B淋巴瘤(DLBCL)。
另一方面，本文提供了所述的CAR、所述的核酸分子、所述的载体或所述的免疫效应细胞，其治疗与CD5的表达相关的疾病或病症。
另一方面，本文提供了一种治疗与CD5的表达相关的疾病或病症的方法，包括向患者施用所述的CAR，所述的核酸分子，所述的载体，或所述的免疫效应细胞。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本文的嵌合抗原受体、载体、细胞、组合物的工作方式，而不用于限制本文发明的范围。
研究概述
我们使用全人源噬菌体进行抗体筛选，直接获得全人源的单克隆抗体。与传统杂交瘤技术相比，省却了困难的鼠源抗体人源化步骤，而且全人源抗体比人源化的鼠源抗体具有更低的免疫原性，在CAR-T开发上有更好的潜力。在获得了特异性结合细胞表面CD5抗原及CD5重组蛋白的抗体克隆后，我们进行了深入研究，将这些克隆及对照克隆H65构建至二代CAR结构上，然后进行慢病毒包装，并转染T细胞，在CAR-T细胞水平，从靶细胞激活和杀伤、靶细胞刺激增殖等角度筛选出了功能强于对照克隆H65的全人源CD5抗体克隆及候选CAR-T分子。
此外，文献报道在大多数构建的肿瘤动物模型中，重新出现的肿瘤细胞保留了CD5表达，这表明肿瘤复发并非源于抗原的丧失，未能根除所有异种移植物是由于CD5 CAR-T细胞在小鼠中的存续性差14。实验结果表明，CD5敲除的CAR-T细胞能正常扩增，并保持对CD5阳性靶细胞的杀伤功能，同时最大限度的减少CD5 CAR-T的自激活及自杀现象，保证其在临床验证中的持续性和有效性。另外，我们还在体内外验证了分子开关(tEGFR或HSV-TK)的有效性。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本文的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本文的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
实施例
实施例1.CAR-T细胞抗原结合检测及表位竞争实验
实验目的和原理：
如图1A所示，为检测所获得的全人源单域克隆中是否存在结合CD5抗原不同表位的克隆，待测克隆被构建至带human Fc tag的IgG载体上并在CHOS细胞中表达。若待测克隆IgG抗体与表达待测CAR的CD5 KO T细胞结合CD5抗原不同表位，则待测克隆IgG抗体和表达待测CAR的CD5 KO T细胞可同时结合在同一CD5抗原上，再结合APC-human Fc抗体，在流式检测中表现为APC阳性，否则，表现为APC阴性。
细胞抗原结合检测简要实验步骤：
1)取克隆H65,FHVH1,FHVH3转染的CD5 KO CAR-T和MOCK T各1×10^6，600g，室温，离心5分钟。PBS洗涤两次后与0.2μg生物素化的CD5抗原混合，4℃避光孵育30分钟。
2)用PBS洗涤两次，加入0.2μL/test APC-streptavidin及5μL PE-EGFR抗体后，PBS洗涤两次，用100μL PBS重悬，通过流式细胞仪检测。
表位竞争实验简要实验步骤：
1)取克隆H65,FHVH1,FHVH3的CD5 KO CAR-T和MOCK T各1×10^6，600g，室温，离心5min。PBS洗涤两次后备用；
2)将带有human Fc标签的H65抗体、FHVH3抗体或FHVH1抗体各0.5μg与0.2μg CD5抗原预先混合，再分别加入表达待测CAR的CD5 KO T细胞中，4℃避光孵育30min。
3)PBS洗涤两次。
4)每孔加入2μL APC-human Fc以及5μL的PE-EGFR抗体，4℃避光孵育30min。PBS洗涤后，用100μL PBS重悬，通过流式细胞仪检测。
主要材料和试剂：
APC anti-human IgG,Fcγfragment specific,Jackson ImmunoResearch,Cat.109-136-170；
PE anti-human EGFR Antibody,Clone AY13,BioLegend,Cat.No.352904；
实验结果：
如图1A原理图所示，将带有hFc的FHVH3-IgG抗体与CD5抗原结合后，能与克隆FHVH1的CD5 KO CAR-T结合，进而结合APC-human Fc抗体。H65,FHVH1,FHVH3的CD5 KO CAR-T都可有效结合CD5抗原，而MOCK T不结合CD5抗原(图1B上部分)。H65-hFc和FHVH3-hFc抗体不影响FHVH1 CAR-T细胞与CD5抗原的结合，说明FHVH1与H65和FHVH3结合不同的CD5抗原表位，而FHVH3与H65识别重叠的CD5抗原表位(图1B下部分)。在证明了FHVH1和FHVH3结合不同的CD5抗原表位后，我们推测FHVH1和FHVH3串联使用可以提高疗效，降低抗原突变引起的肿瘤逃逸风险。因此，将FHVH1和FHVH3按照不同顺序串联可作为抗CD5双表位抗体和抗CD5双表位CAR的两个候选克隆。
实施例2.CD5 KO CAR-T细胞的制备与检测
实验目的和原理：
本申请采用慢病毒转染的方式使敲除后的T细胞表达CAR，CAR-T制备流程参见专利(Zhou J,Liu J,Hu G,et al.Chimeric antigen receptor(car)binding to bcma,anduses thereof:U.S.Patent Application 16/650,580[P].2020-8-6.)。慢病毒载体是以慢病毒的基因组为基础，将其中多个和病毒活性相关的序列结构去除，使其具有生物学的安全性，然后再在这个基因组骨架中引入实验所需要的目标基因的序列和表达结构制备成的载体。与其他逆转录病毒相比，慢病毒载体有着更广泛的宿主，对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力，对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因的转导效率(参见陈琛和万海粟，“慢病毒载体及其研究进展，Chinese Journalof Lung Cancer 17.12(2014):870–876.PMC)。通过慢病毒载体转染，可将CAR分子整合进宿主细胞中。
T细胞进行CD5敲除并转染单个单域克隆CAR慢病毒，串联全人源单域克隆CAR慢病毒(如图2A所示结构)，以及鼠源对照H65 CAR慢病毒，5～7天后检测CD5、EGFRt表达和CD5抗原表达情况(图2B)。CAR结构中包含CD8α信号肽，sdAb，CD8α铰链区，CD8α跨膜区，4-1BB共刺激分子和CD3ζ并用T2A连接一个截短的EFGR分子(EGFRt)，EGFRt可在临床转化时作为安全开关使用，且由于EGFRt与CAR分子共表达，所以可以作为CAR分子在T细胞表面分布的间接检测指标且不影响CAR的结构及功能。
本文中提到的示例性CAR分子及其抗原识别部分的序列如下表1所示。
表1.示例性CAR分子及其抗原识别部分
实验目的和原理：
成熟的T细胞表面均表达CD5抗原，而Mamonkin M等研究者开发的未进行CD5敲除的CD5 CAR-T被报道存在一定程度的自杀情况14，在患者体内存续时间有限，极大地限制了患者疾病缓解时间和该CAR-T产品的应用。为了解决这一问题，本申请采用CRISPR/Cas9技术将T细胞表面的CD5抗原敲除，最大限度地减少CD5 CAR-T的自激活及自杀现象，保证其持续性和有效性。
CD5 KO T细胞制备过程简要实验步骤如下：
1)准备sgRNA/Cas9 RNP混合物：根据细胞量计算所需sgRNA和Cas9蛋白用量(1×10^6T细胞需要使用30μg Cas9蛋白及20μg sgRNA)，将sgRNA和Cas9蛋白轻柔混合后置于室温共孵育15分钟。
2)将孵育后的sgRNA/Cas9 RNP混合物与T细胞轻柔混合后置于室温共孵育10分钟。
3)使用电转仪推荐的电压和电击时间进行T细胞的CD5抗原敲除。
4)将CD5 KO T细胞置于新鲜复温的T细胞培养基，放回37℃5％二氧化碳培养箱，24h后进行慢病毒转染，待细胞状态恢复后于第5天至第7天检测敲除效率和CAR转染效率。CAR-T/T细胞CD5抗原表达检测及EGFRt表达检测简要实验步骤如下：
1)取1×106CAR-T/T细胞每孔，加入PBS洗一遍，300g离心5分钟，弃上清。
2)用100μL PBS重悬细胞沉淀，分别加入5μL APC-CD5抗体及5μL PE-EGFR抗体，4℃避光孵育15分钟。
3)用PBS洗两遍，300g离心5分钟。
4)用200μL PBS重悬，流式上机检测。
主要材料和试剂：
化学合成EasyEdit sgRNA，南京金斯瑞生物科技有限公司；
sgRNA:gctgtagaactccaccacgc(SEQ ID NO：70)；
TrueCutTM Cas9 Protein v2,thermo,Cat.No.A36498；
APC Mouse Anti-Human CD5 antibody,Clone UCHT2,BD Pharmingen,Cat.No.555355；
PE anti-human EGFR Antibody,Clone AY13,BioLegend,Cat.No.352904；
胎牛血清(FBS),Gibco，Cat.No.10099141。
实验结果：
本申请研究的CAR-T针对CD5靶点，若CAR-T细胞功能良好，转染慢病毒后CAR-T细胞可杀伤仍然表达CD5抗原的CAR-T/T细胞。本次实验中CAR-T细胞均可将未敲除CD5的细胞清除干净。为了减少后续实验中CD5 CAR-T细胞的自杀情况，通过CRISPR/Cas9技术进行CD5的敲除。
如图2B所示，横坐标为EGFRt的表达(即间接代表的CAR表达)，纵坐标为CD5的表达。与MOCK T(没有转染的T细胞)相比，进行CD5敲除后的T细胞CD5阳性表达率仅为16.1％，说明通过CRISPR/Cas9技术进行CD5的敲除，效率可达80％以上，有助于减少后续实验中CD5CAR-T细胞的自杀情况。其中，未被敲除干净的、仍表达CD5抗原的T细胞在培养过程中逐渐被CD5KO CAR-T细胞清除干净，所以CD5KO CAR-T细胞中的CD5抗原基本检测不到，证明CD5KO CAR-T细胞对CD5+细胞的清除功能良好。
实施例3.CAR-T细胞的体内外功能验证
CAR-T细胞的体外功能验证
实验目的和原理：
由于结合CD5抗原的全人源单域克隆及串联克隆构建至CAR结构后未必具有良好的激活功能，其在CAR-T细胞上的功能需要进一步确认并筛选出活性最好的CAR分子。为此，我们制备了这些CAR分子克隆的慢病毒载体，并转导T细胞制备成CAR-T细胞。然后，通过CD107a脱粒实验(CD107a degranulation assay)和体外细胞杀伤实验(in vitrocytotoxicity assay)进行CAR-T细胞的体外生物学效力评估。通过这些CAR-T水平的功能验证，最终筛选有效性和安全性都理想的CAR分子进行下游CAR-T产品开发。
CD107a脱粒实验
CD107a是细胞内微囊泡的标志物，当负载有颗粒酶的微囊泡与细胞膜融合后，细胞膜上的CD107a会增加，当用莫能酶素(monesin，购自BioLegend)阻断其回收时，可以定量反映微囊泡释放的强度。当CAR-T受到靶细胞上靶抗原刺激后，会造成颗粒酶释放，并可通过流式检测CD107a的增加来判断T细胞的激活情况。
CD107a脱粒简要实验步骤：
1)验证靶细胞的CD5表达情况：取1×106靶细胞JURKAT,CCRF-CEM,CCRF-CD5 KO,MOLT-4,SUP-T1,K562,RAJI每孔，加入PBS洗一遍，300g离心5分钟，弃上清。用100μL PBS重悬细胞沉淀，分别加入5μL APC-CD5抗体抗体，4℃避光孵育15分钟。用PBS洗两遍，300g离心5分钟。100μL PBS重悬后，用流式细胞仪检测。
2)将待测的CAR-T细胞和靶细胞分别在室温下以300g离心5min，弃上清后，用1640培养基+10％FBS重悬为4x106个细胞/mL；
3)在96孔板中，分别加入100μL待测的CAR-T细胞和100μL靶细胞，并混匀；
4)在每孔细胞中加入5μL PE/Cy7 mouse anti-human CD107a抗体和0.2μlmonensin，然后放入细胞培养箱中(37℃,5％CO2)孵育4h；
5)孵育完成后，在4℃下600g离心5min后弃上清，用200μL PBS洗细胞2次；
6)用100μLPBS重悬细胞，并分别加入5μL APC anti-human EGFR和5μLBV421anti-human CD8α抗体，混匀后在冰上避光孵育20min；
7)孵育完成后，用200μL PBS洗细胞3次；用100μL PBS重悬后，用流式细胞仪检测。主要样品和试剂：
靶细胞JURKAT,CCRF-CEM,CCRF-CD5 KO,MOLT-4,SUP-T1,K562,RAJI；
APC Mouse Anti-Human CD5 antibody,Clone UCHT2,BD Pharmingen,Cat.No.555355；
胎牛血清,Gibco,Cat.No.10099141；
Monensin,BioLegend,Cat.No.420701；
PE/Cy7 mouse anti-human CD107a,BD Pharmingen,Cat.No.561348；
BV421 anti-human CD8α,Biolegend,Cat.No.301036；
APC anti-human EGFR,BioLegend,Cat.No.352906。
实验结果：
如图3所示，通过检测靶细胞CCRF-CEM,JURKAT,MOLT-4,SUP-T1,CCRF-CD5 KO,K562,RAJI APC Anti-Human CD5的平均荧光强度判断各靶细胞的CD5抗原表达强度，JURKAT,CCRF-CEM为CD5抗原高表达细胞系，MOLT-4,SUP-T1为CD5抗原中等表达细胞系，CCRF-CD5 KO,K562,RAJI为阴性细胞系。CCRF-CD5 KO是由CCRF-CEM细胞系经CRISPR/Cas9技术敲除CD5(方法同T细胞的CD5敲除)之后，取敲除后的细胞进行极限稀释后铺单克隆板待单克隆细胞扩增至可检测的数量时，取2*10^5CCRF-CD5 KO单克隆细胞进行流式鉴定确认其CD5表达为阴性，随后该单克隆可应用于实验。
通过慢病毒转导的方式获得CAR-T细胞，将该CAR-T细胞在体外培养9天后进行CD107a脱粒实验。待检测的CAR-T细胞和靶细胞、莫能酶素和CD107a抗体共同孵育4h，CAR-T细胞与靶细胞的细胞密度均为4×105个细胞/mL。然后用CD8抗体、EGFR抗体标记样品后，进行流式检测。在Flowjo软件中分析，散点图中选取活细胞门(P1)，去除细胞碎片；在P1门中的细胞，经过分析选取单个分散细胞门(P2)；然后，在P2门中进一步选取CD8阳性的细胞(P3)；最后，在P3门中，分析EGFR抗体染色呈阳性的细胞(即CAR阳性细胞)中CD107a阳性的比例。
分析结果如图4所示，结果表明除FHVH1VH3外，所有的CAR-T细胞都能特异性地被CD5阳性靶细胞激活而不被CD5阴性的靶细胞激活，具有较好的特异性。FHVH1,FHVH3,FHVH3VH1的CAR-T细胞具有比对照CAR-T细胞(H65 CAR-T细胞)强的CD107a脱粒功能，而FHVH1VH3 CAR-T细胞本身存在非特异激活。
体外细胞杀伤实验
实验目的和原理：体外细胞杀伤实验采用CCRF-CEM、JURKAT、MOLT4和SUP-T1作为CD5阳性靶细胞，CCRF-CD5 KO、K562和RAJI细胞作为CD5阴性靶细胞，进行CD5 CAR-T细胞的抗原特异性杀伤能力评价。其中，以上细胞分别通过慢病毒转导方式，获得稳定表达萤火虫荧光素酶的靶细胞，因此样品中荧光素酶的活性可以反映靶细胞的数量。将CAR-T细胞和靶细胞共孵育培养。当靶细胞被CAR-T细胞杀伤时，荧光素酶会被释放并且很快失活(萤火虫荧光素酶半衰期约0.5h)。如果靶细胞没有被CAR-T细胞杀伤或者抑制，随着靶细胞的扩增和荧光素酶的持续表达，将会产生更多的荧光素酶。因此，可以通过荧光素酶的活性来检测CAR-T对靶细胞的杀伤情况。
体外细胞杀伤简要实验步骤：
1)将上述细胞分别在室温下以300g离心5min，弃上清后，用1640+10％FBS培养基重悬为2x105个细胞/mL；在96孔板的每孔中分别加入100μL靶细胞；
2)根据待测CAR-T样品的CAR阳性率和效靶比，分别在96孔板的每孔中加入对应的CAR-T细胞，并和靶细胞混匀；然后放入37℃5％CO2培养箱中孵育培养24h；
3)使用荧光素酶检测试剂盒分别检测每孔样品中的荧光素酶活性。
主要样品和试剂：
靶细胞CCRF-CEM、JURKAT、MOLT4、SUP-T1、CCRF-CD5 KO、K562和RAJI；
Steady-Glo Luciferase Assay System,Promega,Cat.No.E2520。
实验结果：
将CAR-T细胞样品和固定数量的靶细胞(2x104个)按照不同效靶比(E:T)混合后，共同孵育24h，然后检测样品中的荧光素酶活性(RLU)。由于荧光素酶活性可以反映靶细胞在样品中的数量，通过样品中荧光素酶活性的变化，可以得到CAR-T细胞对靶细胞的杀伤/抑制能力。荧光素酶活性读数(RLU)越低，靶细胞被杀伤的越多。
如图5所示，图中纵坐标为杀伤靶细胞的比例，横坐标为效应细胞与靶细胞的比例(Effector：target cells ratio,E:T)。所有CAR-T细胞样品，对阳性靶细胞的杀伤均强于对照H65CAR-T细胞，且与阴性靶细胞共同孵育时都无明显杀伤。因此，FHVH1,FHVH3,FHVH1VH3,FHVH3VH1的CAR-T样品都可以特异性地杀伤CD5阳性靶细胞，并且对CD5阴性靶细胞没有非特异性杀伤，在较低效靶比时，尤其是与中等表达CD5的靶细胞MOLT-4及SUP-T1共孵育时，FHVH1VH3及FHVH3VH1对靶细胞的杀伤能力强于FHVH1及FHVH3。
CAR-T/T细胞凋亡检测
1)取培养至第10～12天的CAR-T细胞和CD5 KO T以及MOCK T细胞各1*10^6，600g，室温，离心5min，PBS洗涤两次。
2)每孔加入100μL binding buffer重悬，加入10μL annexin V(FITC)以及5μL PI(PE)，室温孵育15min后加入200μL binding buffer，流式上机。
主要样品和试剂：
H65、FHVH1、FHVH3、FHVH1VH3、FHVH3VH1 CAR-T细胞,CD5 KO T,MOCK T细胞；
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI，Biolegend,Cat.No.640914。
实验结果：
如图6所示，H65、FHVH1、FHVH3、FHVH1VH3、FHVH3VH1 CAR-T细胞,CD5 KO T,及MOCKT细胞的凋亡水平无统计学差异(3次独立重复实验)，表明CD5敲除后CD5 CAR-T细胞培养10～12天后并未出现明显自激活及“自杀”导致的细胞凋亡，表明其可能不会因为自激活及“自杀”而出现功能丧失，可在患者体内稳定存在并发挥杀伤肿瘤的作用。
反复刺激增殖实验
实验目的和原理：
采用丝裂霉素(Mitomycin C)处理过的靶细胞(CCRF-CEM)与不同组别CD5 KOCAR-T细胞混合进行多次刺激后将CAR-T细胞和靶细胞共孵育培养，从而确定不同CAR-T在被靶细胞持续多次刺激后的增殖能力。
反复刺激实验简要实验步骤：
1)取CCRF-CEM细胞7×106细胞，300g，室温，离心5min；
2)完全培养基调整密度至0.2×106细胞/mL，加入5μL Mitomycin C母液(1μg/μL)混匀后37℃，5％CO2培养24h后待用。
3)取Mitomycin C处理24h后的CCRF-CEM-Mitomycin C细胞，300g，离心换液，用PBS洗涤6次，CTS培养基重悬CCRF-CEM-Mitomycin C细胞，并计数且调整密度至6×106细胞/mL，待用。
4)分别取3×105CD5KO CAR-T细胞，转入24孔板中。每孔加入CCRF-CEM-Mitomycin细胞50μL，使效靶比E:T＝1：1。用CTS完全培养基补液至培养终体积至500μL，混匀，37℃，5％CO2培养72h并计数，再次用Mitomycin处理靶细胞(CCRF-CEM)，重复上述1-4中反复刺激的步骤并绘制扩增曲线。
主要样品和试剂：
FHVH1,FHVH3,FHVH3VH1,H65 CAR-T细胞，CCRF-CEM细胞系；
Mitomycin C,STEMCELL Technologies,Cat.No.73274；
CTSTM OpTmizerTM T Cell Expansion SFM,Gibco,Cat.No.A1048501；
胎牛血清(FBS),Gibco，Cat.No.10099141。
实验结果：
如图7所示，4组CAR-T细胞样品反复刺激后，增殖能力：FHVH3VH1 CAR-T>FHVH3CAR-T>H65 CAR-T>FHVH1 CAR-T，靶细胞刺激5次后，FHVH3VH1,FHVH3及H65的CAR-T细胞依然能够有效扩增。CAR-T细胞被靶细胞刺激后的增殖能力与患者长期预后密切相关，因此，FHVH3VH1 CAR-T及FHVH3 CAR-T可被认为具有在体内长期增殖并清除肿瘤细胞的潜能。
CAR-T细胞的小鼠肿瘤模型体内功能验证
实验目的和原理：
由于结合CD5抗原的全人源单域克隆及串联克隆构建至CAR结构后在体外功能验证中证明其具有良好的激活和杀伤肿瘤细胞的功能，且全人源单域串联克隆FHVH3VH1对CD5+靶细胞杀伤能力及靶细胞刺激后扩增能力相对于单个单域克隆得到了增强。为此，我们进行CAR-T细胞的体内生物学效力评估。用人急性T细胞白血病细胞系CCRF-CEM-ffLuc建立肿瘤模型，在小鼠体内进行CAR-T的功能验证，证明CAR-T的有效性和安全性。
简要实验步骤：
1)6周龄的雌性NCG小鼠在第0天通过尾静脉注射1×106个CCRF-CEM-ffLuc细胞进行肿瘤接种。
2)在第4天和第7天分别通过尾静脉注射注入2×106和1×106CD5KO CAR+T、CD5KOT细胞或PBS(n＝5)。
3)每周使用生物发光成像评估肿瘤负荷，并监测小鼠生存曲线。
主要样品和试剂：
FHVH1、FHVH3、FHVH3VH1及H65 CAR-T细胞，及人急性T细胞白血病细胞系CCRF-CEM-ffLuc细胞系；
NCG重度免疫缺陷鼠，江苏集萃药康生物科技有限公司。
实验结果：
如图8所示，4组CAR-T细胞样品中FHVH1，FHVH3及FHVH3VH1 CAR-T可在荷瘤小鼠体内清除肿瘤细胞，而相同剂量的H65 CAR-T在小鼠体内仅有微弱的抑制肿瘤作用，FHVH1CAR-T细胞、FHVH3 CAR-T细胞和FHVH3VH1 CAR-T细胞在体内的抗肿瘤效果优于H65 CAR-T细胞，而FHVH3VH1 CAR-T细胞抗肿瘤作用强于FHVH1及FHVH3 CAR-T细胞。如图8B所示，截止至第23天，H65,FHVH1，FHVH3及FHVH3VH1 CAR-T细胞都可有效延长荷瘤小鼠生存时间，相对于CD5KO T细胞或PBS治疗组有统计学差异(P<0.0001,n＝5)。
为了进一步研究FHVH3VH1 CAR-T(以下简称CT125A)细胞的功能，进行了以下研究。
实施例4CT125A细胞与靶抗原CD5结合研究
研究目的：考察CT125A细胞与靶抗原CD5的结合能力。
研究方法：CT125A细胞(2×105cells/孔)与不同浓度的荧光染料标记的人源CD5蛋白孵育后，采用FCM(Flow cytometry，流式细胞术)方法检测，通过分析荧光标记的CAR+阳性细胞百分比和CD5蛋白的浓度之间的关系，由Graphpad Prism软件进行拟合计算亲和力EC50常数。本实验由上海驯鹿生物技术有限公司完成，共进行三次独立重复实验。
研究结果：在3批验证批中，CT125A与人CD5抗原表观亲和力EC50为2.07±1.03nM，结果见表2和图9。
表2 CT125A与人CD5抗原亲和力检测结果汇总表
研究结论：CT125A细胞与人CD5抗原具有稳定、良好、特异性的结合能力。
实施例5CT125A体外脱颗粒活性研究
研究目的：评价CT125A在阳性靶细胞特异刺激下的脱颗粒活性。
研究方案：利用流式细胞术检测3批CAR-T细胞膜表面CD107a分子的转运。CAR-T细胞其胞浆内含有高浓度以囊泡形式存在的细胞毒性颗粒。当CAR-T细胞与靶细胞共孵育时，毒性颗粒将到达浆膜面与细胞膜融合，引起颗粒内容物释放，最终导致靶细胞死亡。随着脱颗粒的发生，CD107a分子被转运到细胞膜表面，可与CD107a抗体结合，采用FCM方法定量分析CD107a表达，评价CT125A的脱颗粒功能。本实验由上海驯鹿生物技术有限公司完成，共进行三次独立重复实验
研究结果：CT125A与4株CD5阳性靶细胞孵育后，脱颗粒反应显著增加，CD107a的阳性率分别为33.22％±3.18％(CCRF-CEM-Luc)，35.43±7.33nM(SUP-T1-Luc)；29.71±10.01nM(JVM-2-Luc-CD5)；36.38±8.56nM(MEC-1-CD5-Luc)；而不加靶细胞组的情况下，CD107a的阳性率仅为3.07％±3.34％。数据详见表3和图10。
表3 CT125A在不同种类的阳性靶细胞刺激下的脱颗粒活性
研究结论：CT125A细胞与所测定的4株阳性靶细胞共孵育后，相较于CT125A细胞自身，CD107a的阳性率均显著增加。这一结果表明CT125A细胞具有稳定、特异、良好的脱颗粒活性。
实施例6 CT125A体外杀伤研究
研究目的：评价CT125注射液对阳性靶细胞体外杀伤能力。
研究方法：CAR-T细胞和靶细胞按照不同效靶比(从10:1到0.5:1，2倍稀释)进行共孵育培养。当靶细胞被CAR-T细胞杀伤时，荧光素酶会被释放并且很快失活。如果靶细胞没有被CAR-T细胞杀伤或者抑制，随着靶细胞的扩增和荧光素酶的持续表达，将会产生更多的荧光素酶。因此，可以通过荧光素酶的活性来检测CAR-T对靶细胞的杀伤情况。
研究结果：与MOCK-T组相比，CT125A在所测定的高中低三个效靶比中，前两个效靶比对所测定的4株阳性靶细胞具有显著的杀伤效果，具有量效关系：对于CCRF-CEM-Luc细胞，效靶比为2:1和1:1时的杀伤率分别为96.91％和95.58％；对于SUP-T1-Luc细胞，效靶比为2:1和1:1时的杀伤率分别为91.04％和56.94％；对于JVM-2-Luc-CD5细胞，效靶比为10:1和5:1时的杀伤率分别为98.51％和96.40％；对于MEC-1-CD5-Luc细胞，效靶比为2:1和1:1时的杀伤率分别为98.25％和97.71％。具体数据详见表4和图11。
表4 CT125A对不同种类的阳性靶细胞的杀伤
研究结论：CT125A细胞在体外对所测定的4株阳性靶细胞具有稳定、特异、良好的杀伤活性。
实施例7 CT125A注射液γ干扰素表达研究
研究目的：研究CT125A注射液与靶细胞共孵育后所分泌的Interferon-γ(IFN-γ)表达水平，以了解此注射液杀伤肿瘤细胞情况。
研究方法：采用CBA(Cytometric Bead Array，流式微球芯片技术)方法检测不同种类的CD5阳性靶细胞与CT125注射液共孵育后的上清中的IFN-γ表达量的分泌水平。
研究结果：与只有CAR-T细胞组相比：在阳性靶细胞CCRF-CEM-Luc和SUP-T1-Luc的刺激下，IFN-γ的释放量略有增加；在阳性靶细胞JVM-2-Luc-CD5和MEC-1-CD5-Luc的刺激下，IFN-γ的释放量明显增加；而在阴性靶细胞CCRF-CEM-CD5 KO的刺激下，IFN-γ的释放量无明显改变。具体实验结果见图12。
研究结论：CT125A在所测定的4株阳性靶细胞刺激下，IFN-γ的释放量的平均值有增加趋势，但是无统计学显著差异。所测定的1株阴性靶细胞刺激下，IFN-γ的释放量无明显改变。
实施例8西妥昔介导自然杀伤细胞体外对CT125A细胞清除研究
研究目的：考察CT125A细胞表面分子开关EGFRt在西妥昔(Centuximab)的作用下是否能介导自然杀伤细胞对CT125A细胞的清除。
研究方法：主要考察不同浓度的西妥昔在NK作用下的CAR+细胞的存活比率。
研究结果：三个供试体来源的NK的杀伤数据显示，西妥昔可以有效杀伤CT125A。在所测试的3个效靶比时均有效类似，杀伤效果与抗体呈现剂量依赖关系，EC50在0.01–0.03nM之间，最大杀伤率30％-70％。具体实验结果见图13。
研究结论：西妥昔在体外能介导NK细胞对于CT125A的杀伤和清除，证明EGFRt-CART的分子开关机制有效。与报道的西妥昔作用机制：抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)，抗体依赖细胞吞噬(ADCP)，以及抗体依赖的补体介导细胞毒作用(CDC)相符合。部分供试体显示CT125A在西妥昔高浓度时出现自杀伤现象，可能与CT125A制剂中存在少量CAR-NK，CAR-NKT有关(部分NKT会有少量CD16表达)。
实施例9 CT125A在荷SUP-T1-Luci移植瘤免疫缺陷小鼠中药效研究
研究目的：本实验以供试品CT125A注射液静脉注射给予移植人T淋巴母细胞瘤细胞(SUP-T1-Luci)的NOG小鼠(NOD-Cg.PrkdcSCID IL-2rgtm1sug/JicCrl小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，以评价其对肿瘤细胞增殖的抑制效果。
研究方法：65只雌性NOG小鼠无菌条件下尾静脉接种人T淋巴母细胞瘤细胞(SUP-T1-Luci)悬液0.2mL(细胞密度5.33×106cells/mL细胞活率100.00％)，接种后第4天挑选肿瘤信号合适、体重相近的50只动物，随机分为5组：细胞保护液组(10只)、Mock-T组(10只，9.87×106T cells/只)、供试品低剂量组(10只，0.3×106CAR-T cells/只)、供试品中剂量组(10只，1.0×106CAR-T cells/只)和供试品高剂量组(10只，3.0×106CAR-T cells/只)。所有动物均为尾静脉单次注射给药，以给药当日为D1，给药后第2天计为D2，以此类推。
首次给药后进行每天2次的一般临床观察，分组前、D3、D7、D11、D14、D18、D21和D23各称重1次，分组前、D7、D14、D21和D23，所有动物以小动物活体成像仪拍摄化学发光信号。D2、D3、D5、D7和D23各检测1次淋巴细胞亚群(CD45+、CD45+CD3+和CD45+CD3+CD5+)和外周血细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ)。
研究结果：1)一般临床观察和生存率
实验期间，细胞保护液组于D17开始出现死亡，死亡前临床表现包括弓背和/或后肢无力，D23时余3只存活。Mock-T组于D13开始出现死亡，死亡前临床表现包括弓背、后肢无力、歪头和精神不振，D23时余3只存活。供试品低、中和高剂量组分别于D21、D15和D18时开始出现死亡，D23时分别余8、9和8只存活。其余动物观察至D23时进行安乐死处理。具体结果见图14。
2)体重
给药后，供试品各组均呈现平稳上升的趋势。细胞保护液组和Mock-T组动物体重呈先上升后下降的变化趋势。与细胞保护液组相比，实验期间，Mock-T组动物体重无显著差异，供试品低、中和高剂量组从D18时开始显著高于细胞保护液组(P≤0.05)。结果见图15。
3)肿瘤细胞增殖(肿瘤细胞生物发光强度)：
给药后，细胞保护液组和Mock-T组肿瘤信号强度持续上升。供试品低、中和高剂量组肿瘤信号强度持续下降。与细胞保护液组相比，实验期间，Mock-T组肿瘤信号强度无显著差异。供试品各组从D7开始肿瘤信号强度显著降低(P≤0.05)，且肿瘤信号强度的减弱随着供试品给药剂量的升高而降低，存在明显的剂量依赖关系。结果见图16。
4)流式细胞检测
实验期间，供试品低剂量组外周血CD45+淋巴细胞比率基本呈稳定趋势，D23时为0.4±0.3％。细胞保护液组、Mock-T组、供试品中和高剂量组D2～D7期间略微波动，至D23时上升。供试品各组外周血CD45+淋巴细胞比率在实验期间呈明显的剂量依赖性升高。
实验期间，细胞保护液组外周血CD45+CD3+淋巴细胞比率呈波动式下降。Mock-T组呈稳定趋势。供试品低、中和高剂量组均呈先下降后上升趋势。
实验期间，细胞保护液组外周血CD45+CD3+CD5+淋巴细胞比率总体呈上升趋势。Mock-T组呈波动上升趋势。供试品低、中和高剂量组均呈先上升后下降趋势。
5)细胞因子检测
细胞保护液组外周血IL-2含量基本呈稳定趋势，至D23时略微升至0.36±0.09pg/mL。Mock-T组外周血IL-2含量变化基本稳定。供试品低、中和高剂量组总体均呈下降趋势。结果见图17。
实验期间，细胞保护液组外周血IL-4含量由D2时0.00±0.00pg/mL升至D23时58.55±9.42pg/mL。其余组别外周血IL-4含量基本无变化，稳定在0.00±0.00pg/mL基线附近。所有组别动物外周血IL-6含量基本稳定在0.00±0.00pg/mL基线附近。结果见图18-19。
实验期间，细胞保护液组和Mock-T组外周血IL-10含量略有波动，基本稳定在基线附近。供试品高剂量组由D2时0.35±6.29pg/mL至D28时略微升至6.29±3.38pg/mL。其余组别外周血IL-10含量基本稳定在基线附近，无明显变化趋势。结果见图20。
实验期间，细胞保护液组外周血TNF-α含量D23时略微升至0.29±0.26pg/mL。Mock-T组先上升后降低。供试品低、中和高剂量组升高至D5而后降低，D7时均降至0.00±0.00pg/mL，至D23时又略微升高，呈波动变化。供试品各组外周血TNF-α含量在D2～D5和D23时有明显的剂量依赖性的升高，提示供试品各组外周血TNF-α含量的变化可能存在剂量依赖性。结果见图21。
实验期间，细胞保护液组外周血IFN-γ含量基本稳定在0.00±0.00pg/mL。Mock-T组呈持续升高的趋势。供试品低剂量组D5时上升，而后下降至D23。供试品中和高剂量组上升至D5而后下降至D7，而后上升至D23。供试品各组各时间点外周血IFN-γ含量呈明显的剂量依赖性的升高，提示供试品各组外周血IFN-γ含量的变化可能存在剂量依赖性。结果见图22。
结论：本实验成功建立人T淋巴母细胞瘤细胞(SUP-T1-Luci)的NOG小鼠静脉移植瘤模型。在本实验条件下，供试品CT125A注射液以0.3×106、1.0×106和3.0×106CAR-Tcells/只的剂量，单次静脉注射给药对人T淋巴母细胞瘤SUP-T1-Luci细胞NOG小鼠静脉移植瘤的生长均有抑制和清除作用，且肿瘤抑制和清除效果随着供试品给药剂量的升高而增强，存在明显的剂量依赖关系。
实施例10 CT125A对人套细胞淋巴瘤JVM-2-Luc-CD5细胞株NPG小鼠系统性移植瘤 模型的药效实验
研究目的：研究靶向CD5的CAR-T细胞注射液CT125A对CD5阳性的人套细胞淋巴瘤JVM-2-Luc-CD5细胞NPG小鼠系统性移植瘤的抗肿瘤药效作用。
研究方法：
1)细胞培养
用于本实验的人套细胞淋巴瘤JVM-2-Luc-CD5细胞悬液为发明人自制，是利用市售的JVM-2细胞过表达Luc，构建JVM-2-Luc细胞系，随后将CD5表达在JVM-2-Luc的细胞系上，得到JVM-2-Luc-CD5细胞。收集细胞并计数，用PBS重悬细胞，接种于50只NPG小鼠尾静脉。每只小鼠接种3×106JVM-2-Luc-CD5细胞，将其重悬于PBS，通过尾静脉注射接种于小鼠，接种体积为200μL。
2)动物分组和给药方案
接种后的第4天，小鼠将根据体重和肿瘤大小(荧光强度)使用E-workbook进行随机分组，每组10只，共3组。分组情况和给药方案如表5所示。分组当天进行CAR-T细胞的注射，分组和给药当天定义为Day 0。
表5.分组和给药方案
注：1.N表示每组动物只数；2.给药体积:给药体积按照200μL/只进行调整。3.CT125A细胞如前所述，CS10为市售细胞冻存液，用作空白对照。
3)药物配制方法
药物配制方法：将4管CT125A从低温保存场所中取出后迅速置37℃水浴，轻柔晃动至细胞刚刚全部解冻后于生物安全柜中无菌取出细胞。将CT125A细胞转移至合适的无菌容器中，上下颠倒混匀后取适量细胞计数细胞密度和活力。CT125A活细胞密度为2.58×107/mL(活率为85.52％)，以CAR+(41.59％)活细胞计为1.07×107/mL，共4mL，则加入CS10稀释至所需密度定容至4.28mL。采用同样的方法调整Mock T细胞密度同CT125A总T细胞密度一致。配好的细胞悬液置于湿(碎)冰上传入动物房用于动物给药，于复苏后2h内完成给药。
4)评价方法
笼边观察：每天观察每只小鼠的外观及行为，自分组开始连续观察至实验结束。所有非正常的外观形态和行为活动都记录在澎立生物实验室临床观察表内。
活体成像：分组前(Day0)，分组后的Day 5，Day 10，Day 15及Day 18，共计4次。小鼠成像前，以3-4％异氟烷维持麻醉。
动物体重：分组后每周测量并记录小鼠体重二次至实验结束。
动物生临床观察：实验期间每天观察1次，观察内容包括但不限于动物精神状态、饮食情况等。所有非正常的外观形态和行为活动都记录在澎立生物实验室临床观察表内并及时反馈给委托方。观察给药后是否有过敏反应，是否产生腹水等，如果有异常或死亡现象需要记录并报告。
样品收集：分组后的Day 7天，每只小鼠收集约100μL的全血置于-80℃保存；Day18实验终点，每只小鼠收集约300μL的全血置于-80℃保存。
5)安乐死
在实验过程中，若出现以下任何一项或多项情况时，应对动物实施安乐死：
1)健康状况:严重的消瘦和身体评分(评分依据SOP PL-ONC023)小于2。
2)动物功能受损：结节干扰正常的动物功能(例如进食，饮水或走动)。
3)其他疾病症状。
显示上述症状的动物将被记录为“异常”。
Day18体内实验结束，所有小鼠用CO2窒息，然后脱颈椎处死。体内实验结束前，已死亡的动物将不进行样品收集。
6)统计分析
结果将以平均值±S.E.M的方式呈现。各组小鼠的体重和肿瘤荧光强度用统计学软件GraphPad Prism8 for Windows(序列号：GPS-1766552-EDSH-0204F)进行作图和统计分析。将肿瘤荧光强度进行Log转换(如有零值数据则取1再进行Log转换)后，利用Two-wayANOVA(mixed model)和Turkey检验比较各组之间的荧光信号值是否有显著差异，P<0.05认为有显著差异。
研究结果：
1)动物体重及状态
实验期间，CS10对照组及CT125A给药组中部分动物出现了15％以上的体重下降和动物死亡，其中CS10组中10只小鼠有2只小鼠死亡，CT125A给药组中有1只小鼠死亡；Day 18时，CS10对照组平均体重下降率为8.96％，CT125A给药组平均体重下降率为8.64％，表明该模型本身会引起动物体重中度下降，而CT125A对动物体重未有影响，未产生明显毒性。各组各时间点动物体重的变化见图23，各组各时间点体重统计数据见表6。
表6.各组各时间点体重统计表(g)
2)肿瘤生长情况
人套细胞淋巴瘤JVM-2-Luc-CD5细胞株接种4天后，进行分组给药。给药当天视为Day0。实验过程中分别在Day5、Day10、Day15及Day18进行荧光成像，对各组动物体内肿瘤生长情况进行统计分析，各时间点各组动物肿瘤生长情况及数据统计见图24和表7。
实验期间，溶媒CS10组(G1)小鼠的肿瘤荧光强度出现了先降后升的现象；在Day0分组时其肿瘤荧光强度为8.77×107±0.88×107p/s；在Day5时其肿瘤荧光强度降为1.19*×107±0.17×*107p/s；之后肿瘤荧光强度保持上升趋势；至Day18时，对照组动物荧光强度为6.65×107±2.57×107p/s；结果表明本研究在NPG小鼠中成功建立了人套细胞淋巴瘤JVM-2-Luc-CD5细胞系统性移植瘤模型。
G2组动物于Day0天单次给予剂量为4.81×106T cells/mouse的Mock T细胞后定期检测肿瘤荧光强度。，数据显示Mock T组(G2)动物的肿瘤荧光强度变化趋势与对照组类似，至Day18时其肿瘤荧光强度为1.36×108±2.44×107p/s；各时间点的肿瘤荧光强度与同期溶媒对照组CS10相比差异不显著。
G3组动物于Day0天单次给予剂量为2×106CAR+cells/mouse的CT125A细胞后定期检测肿瘤荧光强度。数据显示CT125A给药组(G3)动物给药后各时间点的肿瘤荧光强度与分组当天相比显著下降，其Day0时的肿瘤荧光强度为8.77×107±9.08×106p/s，至Day18时其肿瘤荧光强度为1.15×107±1.15×107p/s。CT125A给药组动物各时间点的肿瘤荧光强度与同期CS10对照组或Mock T组相比显著降低(P<0.01，见表7)。并且在实验结束时，CT125A给药组存活的9只小鼠中有8只小鼠的肿瘤荧光强度为零，而CS10对照组和Mock T组存活动物中均未有小鼠的肿瘤荧光强度为零。
表7.各组各时间点肿瘤生长情况(×107，Bioluminescence intensity，p/s)
结论
综上所述，在本实验条件下，CT125A注射液以2×106CAR-T cells/mouse的剂量单次静脉注射给药对人套细胞淋巴瘤JVM-2-Luc-CD5细胞NPG小鼠系统性移植瘤的生长有较强的抑制和清除作用，且动物耐受性良好。
实施例11人膜蛋白阵列研究
研究目的：考察CT125A串联单域抗体兔FC融合蛋白RD125 61-42rFc(通过将上述FHVH3VH1与rFc融合构成)与人膜蛋白非特异性交叉反应。
研究方法：采用美国Integral Molecular公司的由6000个左右不同的人膜蛋白克隆组成的膜蛋白阵列平台(Membrane Proteome Array，MPA)，检测CT125A单链抗体兔FC融合蛋白RD125 61-42rFc与表达人膜蛋白克隆的细胞结合，筛选出阳性结合细胞，并对结果进行二次确认。
研究结果：筛选试验中，在5μg/mL浓度下，RD125 61-42rFc与表达人CD5克隆的细胞有强信号，与少数人膜蛋白细胞有弱结合。在二次浓度梯度确认试验中，确认RD125 61-42rFc与人CD5膜表达细胞有剂量依赖性的强结合，与CAMK1G钙调蛋白激酶膜表达细胞存在较弱结合；在不同浓度下其与人CD5膜表达细胞结合的荧光值比与CAMK1G膜表达细胞结合的荧光值高40-100倍左右。
研究结论：人膜蛋白阵列检测结果显示CT125A单链抗体兔FC融合蛋白RD125 61-42rFc仅与CAMK1G钙调蛋白激酶存在较弱非特异性结合，表明CT125A单域抗体具有较好的特异性。
实施例12.抗CD5 sdAbs亲和力的测定
实验目的和原理：
CD5 sdAbs与抗原间的亲和力大小可能对CAR-T在患者体内发挥杀伤作用及存续时间有着重要影响，为了确定这一重要性质，我们采用了ForteBio公司的Octet分子相互作用技术对其进行了测定。Octet系统所运用的生物膜干涉技术，是一种免标记技术，实时提供高通量的生物分子相互作用信息。该仪器发射白光到传感器表面并收集反射光，不同频率的反射光谱受到生物传感器的光膜层厚度的影响，一些频率的反射光形成了相长干涉(蓝色)，而另一些受到了相消干涉(红色)。这些干涉被光谱仪所检测到，并形成一幅干涉光谱，并以干涉光谱的相位位移强度(nm)显示。因此，结合到传感器表面的分子一旦有数量上的增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移，而这种位移直接反应出传感器表面生物膜的厚度，从中可以获取生物分子相互作用的高质量的数据，从而进行生物分子间相互作用动力学参数测定(Kon,Kdis和KD)，为研发过程提供重要的信息。
简要实验步骤：
1)用上样缓冲液(1×PBS，pH 7.4，0.01％BSA和0.02％Tween 20)将抗CD5 IgG(将CD5的VHH序列与human IgG4 Fc融合构成)稀释至20μg/mL，并在生物传感器上上样，约0.8nM。
2)在60s平衡阶段后，在多种抗原浓度(100至1.563nM)下监测CD5抗原(Acro,CD5-H52H5)的结合动力学。在每个浓度下分别进行至160s结合和300s解离。
3)用10mM Glycine-HCl,pH1.5洗涤3次使芯片再生。
4)通过使用1：1结合位点模型(Biacore X-100评估软件)分析结合常数。
实验结果：
亲和力系指单个分子与其配体结合的强度，通常通过平衡解离常数(KD)进行测定和报告，平衡解离常数可用于评估两分子间相互作用的强度并对此进行排序。抗体与其抗原的结合是一个可逆的过程，结合反应的速率与反应物的浓度成正比。KD值越小，抗体对其靶标的亲和力越大。如表8所示，H65、FHVH1、FHVH3、FHVH3VH1、FHVH4和FHVH2均可与CD5抗原结合，且FHVH3VH1亲和力稍高于H65、FHVH1、FHVH3、FHVH4和FHVH2。
表8抗CD5 IgG亲和力测定
Analyte KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
H65 2.25E-09 3.61E+05 8.13E-04
FHVH1 2.90E-09 4.80E+04 1.39E-04
FHVH3 3.96E-09 7.28E+04 2.88E-04
FHVH3VH1 1.67E-09 1.13E+05 1.89E-04
FHVH4 2.74E-08 1.25E+04 3.09E-04
FHVH2 8.32E-09 2.55E+04 2.12E-04
实施例13.串联单域抗体与CD5+靶细胞的结合研究
研究目的：考察CD5单域抗体与CD5+靶细胞的结合能力。
研究方法：不同浓度的CD5串联单域抗体兔Fc融合蛋白61-42-rFc(通过将FHVH3VH1与rFc融合构成)分别与CD5+靶细胞孵育后，细胞用PBS洗两遍后加入荧光染料标记的兔Fc抗体标记阳性细胞，采用FCM(Flow cytometry，流式细胞术)方法检测，通过分析荧光标记的阳性CD5+靶细胞百分比和不同浓度的CD5串联单域抗体之间的关系，由Graphpad Prism软件进行拟合计算EC50常数。本实验共进行三次独立重复实验。
研究结果：CD5串联单域抗体兔FC融合蛋白61-42rFc与4株CD5阳性细胞之间均有很高的亲和力，Kd分别为：2.99±0.35nM(CCRF-CEM-Luc)；4.02±0.92nM(SUP-T1-Luc)；0.64±0.07nM(JVM-2-Luc-CD5)；1.14±0.16nM(MEC-1-CD5-Luc)。具体结果见表9和图25。
表9 61-42-rFc单域抗体与各CD5阳性细胞之间的亲和力汇总如表
研究结论：CD5串联单域抗体兔Fc融合蛋白61-42-rFc与所测定的4株CD5阳性细胞之间具有稳定、良好、特异性的结合能力，EC50数值均在1～5nM。
实施例14：靶向CD5的携带HSV-TK自杀基因的自体CAR-T细胞
方法与材料
1.CD4+T和CD8+T细胞的分选和激活
复苏冻存的健康供体(具体信息保密)PBMC共1.0×108个细胞每管，快速融化后重悬于8ml预热的Rinsing buffer中，取少量细胞悬液进行细胞计数。将PBMC悬液以300g离心(↑8↓8)10分钟。离心结束后，弃上清，分别加入20ul/107的anti-CD4和anti-CD8磁珠，混匀后放入4℃冰箱孵育20分钟，期间每10分钟轻弹管壁数次避免细胞沉淀。孵育结束后，加入Rinsing buffer润洗1遍后离心(400g 10min↑8↓8)，再用500μl Rinsing buffer重悬细胞。同时将LS分选柱放置在美天旎磁力分选架上，用2ml Rinsing buffer润洗润洗1遍后，加入500μl的细胞悬液，待细胞悬液滴尽后反复2次加入2ml Rinsing buffer于LS柱上。用5mLRinsing buffer将目的细胞从LS柱上冲出并收集，做适当稀释后对目的细胞进行计数，取约1×105个细胞以流式细胞术确定分选的T细胞的纯度。随后将细胞悬液300g离心10分钟，用新鲜T细胞培养基将细胞密度调整至1×106/ml,以10ul/106个细胞的浓度加入T细胞激活剂TransAct激活，按每孔4mL，种入到12孔板中，放入37℃，CO2培养箱中进行培养。
2.T细胞激活48小时后电转
细胞收集于离心管中离心(300g 15min升8降8)；结束后，弃上清，用适量的复方电解质将细胞重悬到一起，取细胞计数；根据细胞计数结果配制相应量的RNP(Cas9蛋白和sgRNA的复合物)，37°孵育10分钟以上；同时将细胞再次离心，结束后用相应量的电转buffer重悬细胞，加入孵育好的RNP，轻轻混匀后加入Lonza电转仪配套的电转杯中，选择电转激活T细胞的程序EH-115，电转，然后立即加入少量的经温热后的T细胞培养基，放入培养箱中恢复15分钟以上，再将细胞悬液从电转杯中转出至合适的培养瓶中，加入T细胞培养基使培养密度为2M/ml。
3.CAR的慢病毒转导
细胞电转5小时后，进行CAR的慢病毒转导。对细胞悬液进行活率检测和细胞计数，根据细胞计数结果加入相应量的慢病毒，MOI为3，再加入1％的DMSO助转剂，轻轻混匀后，37℃培养箱中继续培养。24小时后换液去除病毒，换新鲜的培养基继续培养T培养细胞，密度为1M/ml。
4.FACS(流式细胞术)检测
取约2×10^5个细胞悬液于1.5ml离心管中，300g离心5分钟，用PBS+2％胎牛血清缓冲液洗1遍，完全弃去上清，用100μl缓冲液重悬细胞后加入相应抗体1μl，混匀后4℃避光孵育30分钟，加入100ul缓冲液洗一遍后，用100ul含DAPI或者7AAD的缓冲液重悬后上机检测。
5.CAR阳性细胞分选
细胞计数后，收集细胞室温离心(300g 15min，升8降8)，结束后弃上清，用RinsingBuffer重悬细胞(80ul/10^7cells)，加入CD5-PE抗原蛋白(3ul/10^6cells),四度避光孵育50min；孵育完毕后，加10ml的Rinsing Buffer重悬细胞，室温离心，结束后弃上清，用Rinsing Buffer重悬细胞(80ul/10^7cells)，anti-PE-beads(1.5ul/10^6cells)，四度避光孵育30min；孵育完毕后，加10ml的Rinsing Buffer重悬细胞，室温离心，同时用3ml的buffer润洗LS柱子；离心结束后弃上清，用Rinsing Buffer(1*10^8/ml)重悬细胞，过柱子3遍(1ml/柱子)，然后用3ml的buffer洗柱子3遍，最后用5ml的Rinsing Buffer将柱子上的阳性细胞吹打出，计数，取少量细胞用于FACS检测CAR阳性分选的纯度，将阳性细胞离心后用适量的T细胞完全培养基培养于培养瓶中。
主要试剂
主要耗材
14.1 CD5 HSV-TK CAR-T细胞的制备
针对HSV-TK开关的CD5 CAR-T，发明人首先设计了四种结构分子(图26A)：其中CAR分子的核心元件(胞外信号肽-binder-跨膜结构-胞内共刺激分子)均相同且来自于本发明人所属公司的tEGFR开关的CD5 CAR-T，发明人将HSV-TK开关放在CAR分子的前面和后面以及使用了两种不同的慢病毒骨架。
接下来，发明人对这四种结构分子的CAR-T进行了制备，通过比较其活率、扩增速度、CAR的转效、杀瘤功能等来评估哪一种结构的CAR-T最好。CAR-T的制备过程如图26B所示：一般地，Day0时用anti-CD4和anti-CD8的microbeads从冻存复苏或新鲜的PBMC中分选出CD4和CD8阳性的T细胞，然后用TransAct激活剂激活48h，day2进行电转敲除CD5蛋白，电转后4小时进行CAR的慢病毒转导，day3换液去除病毒，day5通过FACS检测CAR阳性细胞的比例，day6通过CD5-PE蛋白和Anti-PE的磁珠将CAR阳性的细胞分选出来继续培养，day8和day10对分选后的细胞进行CD5-PE蛋白残留情况检测以及CAR阳性细胞纯度检测，待CD5-PE蛋白无残留以及细胞数量足够时即可进行冻存。
四种CAR-T细胞在制备过程中的活率和总细胞的扩增速度如图26C和26D所示：细胞的活率均能在转毒后快速恢复，一般在day5时即能达到90％左右，四种CAR-T之间无明显差异；总细胞的扩增速度在day7时，2948和2949的速度稍高于2946和2947，2948和2949之间无差异，而2946和2947之间，2946在day7之后的扩增速度快于2947。
对于四种CAR-T的CAR转效以及CAR阳性细胞比例随着培养天数的变化结果如图27所示，从转毒后3天来看，在相同的MOI下，2948和2949的CAR转效比2946和2947高约一倍，四种CAR-T的CAR阳性细胞比例均会随着培养天数的增加而升高，CD5的敲除效率均在96％以上。
综上所述，在四种CAR-T结构分子中，2948或许是最优的选择。
发明人用2946和2947CAR-T细胞进行了CAR阳性细胞分选的测试，结果如图28所示。分选后阳性细胞里基本全是CAR阳性的，但阴性细胞里还有非常多的CAR阳性细胞未被分选出来，从比例上来看CAR阳性细胞的分选效率非常低；从分选后阳性细胞和阴性细胞里的CAR阳性细胞的MFI(平均荧光强度)来看，用抗原来分选CAR阳性细胞只能分选出CAR表达量非常高的细胞，推测可能是由于抗原蛋白和CAR分子的结合力比较弱导致的(3A)。
分选后4天，对分选出的CAR阳性细胞不染色直接进行流式检测，发现已基本没有抗原蛋白阳性的细胞，而重新用抗原蛋白对细胞进行染色后检测，发现基本上所有细胞均能被抗原蛋白结合，这说明之前分选时结合上的抗原蛋白已基本上降解，而且分选后的细胞在培养4天后CAR阳性细胞的纯度不变，此实验说明在进行CAR阳性细胞分选后4天细胞可以进行冻存制剂。
14.2携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5 CAR-T细胞的杀瘤功能检测
利用pLVx载体构建的抗人CD5CAR-T(HSV-TK)细胞体外杀伤肿瘤细胞实验
利用pLVx载体构建制备出的抗人CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞，其杀瘤功能可以在体外进行初步鉴定。一般地，将CD5 CAR-T(HSV-TK)和肿瘤靶细胞(稳定表达luciferase蛋白)以不同的效靶比混合后共培养24小时，通过检测共培养后细胞中的luciferase蛋白表达量来反应肿瘤细胞的存活情况，进而判断CD5 CAR-T(HSV-TK)的杀瘤功能。
图29是利用pLVx载体构建制备的CD5 CAR-T(HSV-TK)的杀瘤情况。图29A是敲除CD5的T细胞对靶细胞CCRF及阴性对照细胞CD5 KO CCRF细胞的杀伤情况，敲除CD5的T细胞对CCRF及CD5 KO CCRF在效靶比2-0.125时均无杀伤。图29B是CD5 CAR-T细胞对靶细胞CCRF及阴性对照细胞CD5 KO CCRF细胞的杀伤情况，CD5 CAR-T细胞对CCRF细胞有明显的杀伤作用。在效靶比为2-0.25时，杀伤效率接近100％；CD5 CAR-T细胞对CD5 KO CCRF在效靶比2-0.125时均无杀伤。图29C是利用pLVx载体构建制备的CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞对靶细胞CCRF及阴性对照细胞CD5 KO CCRF细胞的杀伤情况，CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞对CCRF细胞有明显的杀伤作用。在效靶比为2-0.5时，杀伤效率接近100％；而对CD5KO CCRF在效靶比2-0.125时均无杀伤。
利用pCDH载体构建的抗人CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞体外杀伤肿瘤细胞实验
利用pCDH载体构建制备出的抗人CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞，其杀瘤功能可以在体外进行初步鉴定。一般地，将CD5 CAR-T(HSV-TK)和肿瘤靶细胞(稳定表达luciferase蛋白)以不同的效靶比混合后共培养24小时，通过检测共培养后细胞中的luciferase蛋白表达量来反应肿瘤细胞的存活情况，进而判断CD5 CAR-T(HSV-TK)的杀瘤功能。
图30是利用pCDH载体构建制备的CD5 CAR-T(HSV-TK)的杀瘤情况。图30A是敲除CD5的T细胞对靶细胞CCRF及阴性对照细胞CD5 KO CCRF细胞的杀伤情况，敲除CD5的T细胞对CCRF及CD5 KO CCRF在效靶比2-0.125时均无杀伤。图30B是CD5 CAR-T细胞对靶细胞CCRF及阴性对照细胞CD5 KO CCRF细胞的杀伤情况，CD5 CAR-T细胞对CCRF细胞有明显的杀伤作用。在效靶比为2-0.25时，杀伤效率接近100％；CD5 CAR-T细胞对CD5 KO CCRF在效靶比2-0.125时均无杀伤。图30C是利用pCDH载体构建制备的CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞对靶细胞CCRF及阴性对照细胞CD5 KO CCRF细胞的杀伤情况，CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞对CCRF细胞有明显的杀伤作用。在效靶比为2-0.5时，杀伤效率接近100％；而对CD5 KO CCRF在效靶比2-0.125时均无杀伤。
14.3 HSV-TK联合更昔洛韦(GCV)药物对CAR-T的抑制
HSV-TK能高效地和GCV结合并对其进行一磷酸化，随后细胞内的激酶对其进行二磷酸化和三磷酸化，三磷酸化的GCV结构与细胞内的核苷极其类似，因此会竞争性地与DNA聚合酶结合或打破细胞内四种核苷的比例而抑制DNA的合成，从而导致细胞死亡。
发明人用不同浓度的GCV药物同时分别处理CD5 CAR-T(HSV-TK)(pLVx)细胞与CD5CAR-T细胞，每3天通过细胞计数、CAR阳性率流式检测得到细胞总数及CAR阳性细胞的变化数据。结果如图31所示，对于不含有HSV-TK结构的CD5 CAR-T细胞，培养体系中GCV浓度0.3ug/ml、1ug/ml、3ug/ml对细胞的扩增并无影响(图31A)，对细胞的CAR阳性细胞数也无影响(图31C)；GCV不影响CD5 CAR-T细胞生长。
对于CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞，培养体系中GCV浓度0.3ug/ml、1ug/ml、3ug/ml均能有效抑制CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞的扩增(图31B)，细胞的CAR阳性细胞数被GCV明显抑制(图31D)；GCV在较低浓度(0.3ug/ml)即可抑制CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞的生长。
为了明确携带HSV-TK结构的CD5 CAR-T细胞在GCV撤除后细胞数量是否会回升，发明人在CD5 CAR-T(HSV-TK)(pLVx)细胞与CD5 CAR-T细胞培养体系的前5天加入1ug/ml的GCV药物，第6天开始撤除GCV，直到第13天再次加入1ug/ml的GCV。间隔3-4天通过细胞计数、CAR阳性率流式检测得到细胞总数及CAR阳性细胞的变化数据。结果如图32所示，对于不含有HSV-TK结构的CD5 CAR-T细胞，培养体系中1ug/ml GCV存在与否对细胞的扩增并无影响(图32A)，对细胞的CAR阳性细胞数也无影响(图32C)；GCV不影响CD5 CAR-T细胞生长。与之前的实验结论一致。
对于CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞，培养体系中1ug/ml的GCV能有效抑制CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞的扩增(图32B)，细胞的CAR阳性细胞数被GCV明显抑制(图32D)；当第6天撤除GCV后，在第9天可见到CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞数与CAR阳性细胞数均有所增加。而在第13天培养体系中再次加入1ug/ml的GCV时，CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞数与CAR阳性细胞数再次下降。本次实验再次证实了携带HSV-TK的CD5 CAR-T可被GCV有效抑制，而当GCV药物撤除之后，未被清除的CD5 CAR-T(HSV-TK)细胞可逐步恢复，这部分细胞当再次遇见GCV时仍会被抑制。
14.4：小鼠体内携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5 CAR-T细胞的杀瘤功能，以及体内GCV对携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5 CAR-T细胞的杀伤药效确认
为了确认本实施例14.2和14.3部分的结论在体内环境下是否适用，即确认体内环境下携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5 CAR-T细胞的杀瘤功能，以及确认体内环境下GCV对携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5 CAR-T细胞的杀伤药效，发明人进行了本部分的动物实验。
经尾静脉对NPG小鼠注射1*106个SUP_T1-luciferase肿瘤细胞，4天后注射CAR-T细胞，并定期对试验小鼠采血检测SUP_T1-luciferase的水平，记录存活情况以及体重变化，从而得知CAR-T对肿瘤细胞的清除情况。同时，还在另外两个CAR-T实验组上进行GCV给药处理，给药1～2周后，检测小鼠不同组织内的CAR-T水平以监测GCV的杀伤效果，同时也对小鼠采血检测SUP_T1-luciferase的水平，以监测清除CAR-T后的肿瘤复发。
动物分组设置如下：
简要实验步骤：
1)Day 0向每只试验小鼠接种1*106个SUP_T1-luciferase肿瘤细胞；
2)4天后，即Day4向CAR-T实验组的每只小鼠体内注射3*106CAR-T细胞，实验组每组12只小鼠，另外设置CD5 KO T对照组和PBS对照组，对照组每组6只试验小鼠；
3)接种肿瘤细胞7天后，即Day7，开始对两个GCV实验组进行GCV给药，给药前留取外周血；
4)接种肿瘤细胞14天后，即Day14，第一个GCV实验组停止GCV给药，各小鼠留取外周血；
5)接种肿瘤细胞21天后，即Day21，第二个GCV实验组停止GCV给药，各小鼠留取外周血，同时每组杀死3只小鼠并留取组织；
6)接种肿瘤细胞后的21-50天期间，即Day21-Day50期间，每周留取剩余小鼠的外周血及组织；Day25时，取小鼠的脾脏样本，用流式细胞术检测脾脏中的CAR-T细胞；
7)Day25后的每次取血，在取血当天也同时检测新鲜血液中的luciferase读值，从而检测肿瘤细胞水平。待所有小鼠组织样品收齐后，提取基因组并检测CAR-T细胞载体拷贝数(VCN)。
实验结果：
1)如图33所示，在注射CAR-T细胞21天后，即Day25时，取对照组和CAR-T实验组小鼠的新鲜血液样本并测量luciferase读值，三个CAR-T组的luciferase读值均明显低于对照组，说明各CAR-T细胞组中的肿瘤细胞水平都很低，在体内环境下携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5 CAR-T细胞的杀瘤功能正常。
2)如图34所示，在GCV给药处理结束后，Day25时取对照组和CAR-T实验组小鼠的新鲜脾脏样本并分离细胞用于流式细胞术检测。实验显示，未经GCV处理的CAR-T组，即G3组可以检测到CAR-T细胞群，即CD3+CAR+细胞群。而GCV处理7天的CAR-T组，即G4组，以及GCV处理14天的CAR-T组，即G5组几乎检测不到CAR-T细胞，说明GCV给药处理可以明显清除携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5 CAR-T细胞。
3)如图35所示，在GCV给药处理结束后，除了流式细胞术检测之外，发明人还用实时定量PCR的计数检测了小鼠不同组织样本中的CAR-T载体拷贝数目，即VCN。外周血样本的检测实验显示，对CAR-T细胞组的小鼠GCV给药处理7天后，即Day14时，未经GCV处理的CAR-T组，即G3组的VCN显著高于GCV给药处理组，即G4和G5组，说明GCV给药处理可以较彻底地清除外周血中携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5 CAR-T细胞。脾脏和肺组织样本的检测实验显示，对CAR-T细胞组的小鼠GCV给药处理14天后，即Day21时，未经GCV处理的CAR-T组，即G3组的VCN显著高于GCV给药处理组，即G4和G5组，说明GCV给药处理可以较彻底地清除脾脏和肺中携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5 CAR-T细胞。
4)CAR-T组用GCV给药处理7/14天后停止给药，携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5CAR-T细胞已被GCV清除干净，小鼠体内的残留肿瘤细胞存在复发情况。如图36所示，在GCV停止给药14天后，部分小鼠存在肿瘤复发情况，说明GCV加药处理可以清除携带HSV-TK自杀基因的抗人CD5 CAR-T细胞，失去CAR-T细胞的抑制后，肿瘤细胞复发。
相应地，本文至少提供了如下技术方案：
方案1：免疫效应细胞，其包括：
1)嵌合抗原受体(CAR)和/或其编码核酸序列；以及
2)自杀基因和/或自杀基因编码的蛋白产物，
其中所述CAR包括CD5结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，所述CD5结合结构域包含一个或更多个特异性结合CD5的抗体或其抗原结合片段，
其中所述自杀基因为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因。
方案2：如方案1所述的免疫效应细胞，其中所述HSV-TK为HSV-TK mut2；优选地，所述HSV-TK mut2包括SEQ ID NO：71所示序列或其功能性变体。
方案3：如方案1或2所述的免疫效应细胞，其中：
所述抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列选自以下组合的任一个：
(1)SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：39所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：40所示序列的HCDR3；
(2)SEQ ID NO：41所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：42所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：43所示序列的HCDR3；
(3)SEQ ID NO：64所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：65所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：66所示序列的HCDR3；以及
(4)SEQ ID NO：67所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：68所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：69所示序列的HCDR3。
方案4：如方案1-3中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CD5结合结构域包括至少两个特异性结合CD5的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3分别独立地选自以下组合的任一个：
(1)SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：39所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：40所示序列的HCDR3；
(2)SEQ ID NO：41所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：42所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：43所示序列的HCDR3；
(3)SEQ ID NO：64所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：65所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：66所示序列的HCDR3；以及
(4)SEQ ID NO：67所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：68所示序列的HCDR2，和SEQ IDNO：69所示序列的HCDR3。
方案5：如方案1-4中任一所述的免疫效应细胞，其中所述CD5结合结构域包括特异性结合CD5的第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段，所述第一抗体或其抗原结合片段和所述第二抗体或其抗原结合片段包括的HCDR1、HCDR2、HCDR3分别独立地选自以下组合的任一个：
(1)所述第一抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1、SEQ IDNO：39所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：40所示序列的HCDR3；所述第二抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：41所示序列的HCDR1、SEQ ID NO：42所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：43所示序列的HCDR3；
(2)所述第一抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1、SEQ IDNO：39所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：40所示序列的HCDR3；所述第二抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：64所示序列的HCDR1、SEQ ID NO：65所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：66所示序列的HCDR3；以及
(3)所述第一抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1、SEQ IDNO：39所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：40所示序列的HCDR3；所述第二抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：67所示序列的HCDR1、SEQ ID NO：68所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：69所示序列的HCDR3所述至少两个特异性结合CD5的抗体或其抗原结合片段之间串联连接。
方案6：如方案1-5中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述抗体为单域抗体。
方案7：如方案1-6任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CD5结合结构域包括至少两个单域抗体，所述单域抗体之间通过linker片段连接；优选地，所述linker片段包括SEQID NO：25所示序列。
方案8：如方案1-7任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CD5结合结构域包括SEQID NO：33、35、37、47、57、59、61或63所示序列或其功能性变体。
方案9：如方案1-8中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述跨膜结构域包括来自选自下述蛋白的多肽：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3e，CD45，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154；优选地，所述跨膜结构域包含SEQID NO：6所示序列或其功能性变体。
方案10：如方案1-9中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述共刺激结构域包括选自下述蛋白的多肽：CD28、4-1BB、OX-40和ICOS；优选地，所述共刺激结构域包括SEQ ID NO：8所示序列或其功能性变体。
方案11：如方案1-10中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述胞内信号传导结构域包含来自CD3ζ的信号传导结构域；优选地，所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：10所示序列或其功能性变体。
方案12：如方案1-11中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CAR还包含铰链区，所述铰链区连接所述CD5结合结构域和所述跨膜结构域；优选地，所述铰链区包含SEQ IDNO：4所示序列或其功能性变体。
方案13：如方案1-12中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CAR包括CD8α信号肽；优选地，所述信号肽包含SEQ ID NO：2所示序列或其功能性变体。
方案14：如方案1-13中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CAR的编码核酸序列和所述自杀基因位于同一核酸分子中。
方案15：如方案1-14中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CAR的编码核酸序列和所述自杀基因位于被引入所述免疫效应细胞的同一表达载体中。
方案16：如方案1-15中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述表达载体为慢病毒表达载体，如pLVx载体或pCDH载体。
方案17：如方案1-16中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CAR的编码核酸序列和所述自杀基因之间包括剪切肽编码序列。
方案18：如方案1-17中任一项所述的免疫效应细胞，所述自杀基因位于所述CAR的编码核酸序列的5’方向或3’方向。
方案19：如方案1-18中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述剪切肽包括来自T2A肽的氨基酸序列；优选地，所述剪切肽包括SEQ ID NO：12所示序列或其功能性变体。
方案20：如方案1-19中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞不表达CD5。
方案21：如方案1-20中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞不表达TRAC基因和/或TRBC基因。
方案22：如方案1-21中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞。
方案23：分离的核酸分子，其包括方案1-22中任一项所述的CAR的编码核酸序列和自杀基因。
方案24：如方案23所述的核酸分子，其中所述编码核酸序列包括SEQ ID NO：32、34、36、46、56、58、60或62所示序列。
方案25：如方案23或24所述的核酸分子，其中所述剪切肽包括来自T2A肽的氨基酸序列；优选地，所述剪切肽包括SEQ ID NO：12所示序列或其功能性变体。
方案26：表达载体，其包括方案23-25中任一项所述的核酸分子。
方案27：如方案26所述的表达载体，其中所述载体选自质粒、逆转录病毒载体和慢病毒载体，如pLVx载体或pCDH载体。
方案28：制备免疫效应细胞的方法，其包括：
1)敲除所述免疫效应细胞的(1)CD5基因和/或(2)TRAC基因和/或TRBC基因；以及
2)向免疫效应细胞中引入方案22-24任一项所述的核酸分子或方案25或26所述的表达载体。
方案29：如方案28所述的方法，其中采用CRISPR/Cas9技术进行所述CD5基因的敲除；优选地，所用的sgRNA的靶序列包括SEQ ID NO：70所示序列。
方案30：药物组合物，其包括：
1)方案1-22中任一项所述的免疫效应细胞、方案23-25任一项所述的核酸分子或方案26或27所述的表达载体；以及
2)药学上可接受的佐剂。
方案31：方案1-22中任一项所述的免疫效应细胞、方案23-25任一项所述的核酸分子或方案26或27所述的表达载体在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗与CD5的表达相关的疾病或病症。
方案32：治疗与CD5的表达相关的疾病或病症的方法，其包括以治疗有效量的方案1-22中任一项所述的免疫效应细胞、方案23-25任一项所述的核酸分子、方案26或27所述的表达载体、或方案30所述的药物组合物向有需要的受试者给药。
方案33：如方案32所述的方法，其还包括以更昔洛韦GCV向有需要的受试者给药以杀灭所述免疫效应细胞。
方案34：如方案31所述的用途或方案32或33所述的方法，其中所述与CD5的表达相关的疾病或病症为癌症或恶性肿瘤。
方案35：如方案31所述的用途或方案32或33所述的方法，其中所述与CD5的表达相关的疾病或病症为T淋巴母细胞淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。
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本文实施例中以及其他部分提及的氨基酸和核苷酸序列的具体序列如下：
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的CD8α信号肽核酸序列，63bp(SEQ ID NO:1)：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCC
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的CD8α信号肽蛋白序列，21aa(SEQ ID NO:2)：
MALPVTALLLPLALLLHAARP
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的CD8α铰链区核酸序列：165bp(SEQ ID NO:3)
TTCGTGCCCGTGTTCCTGCCCGCCAAACCTACTACTACCCCTGCACCTAGGCCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGAC
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的CD8α铰链区蛋白序列，55aa(SEQ ID NO:4)
FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的CD8α跨膜区核酸序列，84bp(SEQ ID NO:5)：
ATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACCGGAAC
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的CD8α跨膜区蛋白序列，28aa(SEQ ID NO:6)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的4-1BB共刺激结构域核酸序列，126bp，(SEQ ID NO:7)：
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的4-1BB共刺激结构域蛋白序列，42aa(SEQ ID NO:8)：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的CD3z胞内信号结构域核酸序列，336bp(SEQ ID NO:9)：
AGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGCGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的CD3z胞内信号结构域蛋白序列，112aa(SEQ ID NO:10)：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的剪切肽T2A核酸序列，54bp(SEQ ID NO:11)：
GAGGGAAGGGGCAGCTTATTAACATGTGGCGATGTGGAAGAGAACCCCGGTCCC；
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的剪切肽T2A蛋白序列，18aa，(SEQ ID NO:12)：
EGRGSLLTCGDVEENPGP；
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的CSF2RAsignal核酸序列，66bp,(SEQ ID NO:13)：
ATGCTGCTGCTCGTGACCTCTTTACTGTTATGTGAGCTGCCCCACCCCGCTTTTTTACTGATCCCT
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的CSF2RA signal蛋白序列，22aa，(SEQ ID NO:14)：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的tEGFR核酸序列：1005bp(SEQ ID NO:15)
CGTAAGGTGTGTAACGGAATCGGCATTGGCGAGTTCAAGGACTCTTTAAGCATCAACGCCACAAACATCAAGCACTTCAAGAATTGTACCTCCATCAGCGGCGATTTACACATTCTCCCCGTGGCTTTTCGTGGCGATTCCTTCACCCACACCCCCCCTCTGGACCCCCAAGAGCTGGACATTTTAAAAACCGTGAAGGAGATCACCGGCTTTCTGCTGATCCAAGCTTGGCCCGAGAATCGTACCGACCTCCACGCCTTCGAGAATTTAGAGATTATTCGTGGAAGGACCAAGCAGCACGGCCAGTTCTCTTTAGCCGTCGTGTCTTTAAACATTACCAGCCTCGGTTTAAGGTCTTTAAAGGAGATTAGCGACGGCGACGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTCTGCTACGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTCGGAACCAGCGGCCAAAAGACCAAGATCATCAGCAATCGTGGAGAGAACTCTTGTAAGGCCACTGGTCAAGTTTGCCACGCCCTCTGTAGCCCCGAAGGATGTTGGGGCCCCGAGCCTAGGGACTGTGTTAGCTGCAGAAACGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTGTGGACAAATGCAATTTACTGGAAGGAGAGCCTAGGGAGTTCGTGGAGAACAGCGAATGTATCCAGTGCCACCCCGAGTGTTTACCTCAAGCCATGAACATCACTTGTACCGGAAGGGGCCCCGATAACTGCATCCAATGCGCCCACTACATCGACGGACCCCACTGCGTGAAAACTTGTCCCGCCGGAGTGATGGGAGAGAATAACACTTTAGTGTGGAAGTACGCCGACGCTGGCCACGTCTGCCATCTGTGCCACCCCAACTGTACCTACGGCTGCACTGGTCCCGGTTTAGAGGGATGTCCTACCAACGGCCCCAAGATCCCCTCCATCGCCACCGGAATGGTGGGCGCTCTGTTATTACTGCTGGTGGTGGCTCTGGGCATCGGTTTATTCATG
FHVH1，FHVH2,FHVH3和FHVH4的tEGFR蛋白序列，335aa(SEQ ID NO:16):
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTK
IISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
FHVH3VH1,FWVH2VH1和FWVH4VH1CD8α信号肽核酸序列，63bp(SEQ ID NO:17)
ATGGCCCTACCTGTGACAGCCCTACTGTTACCCCTGGCCCTCCTTCTGCATGCTGCTAGACCT
FHVH3VH1,FWVH2VH1和FWVH4VH1CD8α铰链区核酸序列：249bp(SEQ ID NO:18)
TTTGTGCCTGTATTTCTGCCTGCCAAGCCCACCACAACACCTGCCCCTAGACCACCCACCCCTGCCCCCACCATTGCTTCTCAGCCCCTTAGCTTAAGACCTGAAGCCTGTAGACCTGCTGCTGGGGGGGCTGTGCACACAAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAAC
FHVH3VH1,FWVH2VH1和FWVH4VH14-1BB胞内共刺激结构域核酸序列，126bp，(SEQID NO:19)
AAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACCCAAGAGGAGGATGGCTGCAGCTGCAGATTCCCTGAGGAGGAGGAGGGGGGCTGTGAGCTG
FHVH3VH1,FWVH2VH1和FWVH4VH1CD3z胞内信号结构域核酸序列，336bp(SEQ IDNO:20)
AGAGTGAAGTTCAGCAGATCTGCTGATGCCCCTGCCTATCAGCAAGGGCAGAATCAGCTGTACAATGAGCTGAATCTGGGCAGAAGAGAGGAGTATGATGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCTGAGATGGGGGGCAAGCCTAGAAGAAAGAACCCCCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCTGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAGGGGGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCATGATGGCCTGTACCAAGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTATGATGCCCTACACATGCAAGCTCTGCCTCCTAGA
FHVH3VH1,FWVH2VH1和FWVH4VH1剪切肽T2A核酸序列，54bp(SEQ ID NO:21)：
GAAGGAAGGGGCAGCCTACTGACCTGTGGGGATGTGGAGGAGAACCCTGGCCCC
FHVH3VH1,FWVH2VH1和FWVH4VH1CSF2RA signal核酸序列，66bp,(SEQ ID NO:22)：
ATGTTGCTATTAGTAACCAGCCTGCTGCTGTGTGAGCTGCCCCACCCTGCCTTCCTGTTAATCCCA
FHVH3VH1,FWVH2VH1和FWVH4VH1tEGFR核酸序列：1005bp(SEQ ID NO:23)
CGAAAGGTATGTAATGGCATTGGCATTGGGGAGTTTAAGGACAGCCTGAGCATCAATGCCACCAACATCAAGCACTTCAAGAACTGCACAAGCATCAGTGGGGACTTGCACATCCTGCCTGTGGCCTTCAGAGGGGACAGCTTCACCCACACCCCCCCCCTGGACCCCCAAGAGCTGGACATCCTGAAGACAGTGAAGGAGATCACTGGCTTCTTGCTGATCCAAGCCTGGCCTGAGAACAGAACAGACCTGCATGCCTTTGAGAACCTGGAGATCATCAGAGGCAGAACCAAGCAGCATGGGCAGTTCAGCCTGGCTGTGGTGAGCCTGAACATCACAAGCCTGGGCCTGAGAAGCTTAAAGGAGATCTCTGATGGGGATGTGATCATCTCTGGCAACAAGAACCTGTGCTATGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGGCAGAAGACCAAGATCATCAGCAACAGAGGGGAGAACTCCTGTAAGGCCACTGGCCAAGTGTGTCATGCCCTATGCAGCCCTGAGGGGTGCTGGGGCCCTGAGCCTAGAGACTGTGTGAGCTGCAGAAATGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTGTGGACAAGTGCAACCTGCTGGAGGGGGAGCCTAGAGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGTATTCAGTGTCATCCTGAGTGCCTGCCCCAAGCCATGAACATCACCTGCACTGGCAGAGGCCCTGACAACTGCATTCAGTGTGCCCACTACATTGATGGCCCCCACTGTGTGAAGACCTGCCCTGCTGGGGTGATGGGGGAGAACAACACCCTGGTGTGGAAGTATGCTGATGCTGGCCATGTGTGTCACCTGTGCCATCCCAACTGCACCTATGGCTGCACTGGCCCTGGCCTGGAGGGCTGCCCCACCAATGGTCCCAAGATTCCTAGCATTGCCACTGGCATGGTGGGGGCCCTGCTCCTACTTCTGGTGGTTGCCCTGGGCATTGGCCTGTTCATG
FHVH3VH1,FWVH2VH1和FWVH4VH1连接Linker核酸序列，45bp(SEQ ID NO:24)
GGGGGGGGGGGCTCTGGGGGGGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGCTCT
FHVH3VH1,FWVH2VH1和FWVH4VH1连接Linker蛋白序列，15aa(SEQ ID NO:25)
GGGGSGGGGSGGGGS
FHVH1:CAR核酸序列，2271bp(SEQ ID NO:26)：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCGAAGTTCAGCTGCTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTAGCCATAGCGCCATGGGTTGGGTTCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGCATCTATGCCCGCGGCGGCTATACCTATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAACAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTGCGCGCGGTTACCATCTGGAATACATGGTTTCTCAGGATGTTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCATTCGTGCCCGTGTTCCTGCCCGCCAAACCTACTACTACCCCTGCACCTAGGCCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACCGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGCGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGAGGATCCGGAGAGGGAAGGGGCAGCTTATTAACATGTGGCGATGTGGAAGAGAACCCCGGTCCCATGCTGCTGCTCGTGACCTCTTTACTGTTATGTGAGCTGCCCCACCCCGCTTTTTTACTGATCCCTCGTAAGGTGTGTAACGGAATCGGCATTGGCGAGTTCAAGGACTCTTTAAGCATCAACGCCACAAACATCAAGCACTTCAAGAATTGTACCTCCATCAGCGGCGATTTACACATTCTCCCCGTGGCTTTTCGTGGCGATTCCTTCACCCACACCCCCCCTCTGGACCCCCAAGAGCTGGACATTTTAAAAACCGTGAAGGAGATCACCGGCTTTCTGCTGATCCAAGCTTGGCCCGAGAATCGTACCGACCTCCACGCCTTCGAGAATTTAGAGATTATTCGTGGAAGGACCAAGCAGCACGGCCAGTTCTCTTTAGCCGTCGTGTCTTTAAACATTACCAGCCTCGGTTTAAGGTCTTTAAAGGAGATTAGCGACGGCGACGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTCTGCTACGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTCGGAACCAGCGGCCAAAAGACCAAGATCATCAGCAATCGTGGAGAGAACTCTTGTAAGGCCACTGGTCAAGTTTGCCACGCCCTCTGTAGCCCCGAAGGATGTTGGGGCCCCGAGCCTAGGGACTGTGTTAGCTGCAGAAACGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTGTGGACAAATGCAATTTACTGGAAGGAGAGCCTAGGGAGTTCGTGGAGAACAGCGAATGTATCCAGTGCCACCCCGAGTGTTTACCTCAAGCCATGAACATCACTTGTACCGGAAGGGGCCCCGATAACTGCATCCAATGCGCCCACTACATCGACGGACCCCACTGCGTGAAAACTTGTCCCGCCGGAGTGATGGGAGAGAATAACACTTTAGTGTGGAAGTACGCCGACGCTGGCCACGTCTGCCATCTGTGCCACCCCAACTGTACCTACGGCTGCACTGGTCCCGGTTTAGAGGGATGTCCTACCAACGGCCCCAAGATCCCCTCCATCGCCACCGGAATGGTGGGCGCTCTGTTATTACTGCTGGTGGTGGCTCTGGGCATCGGTTTATTCATG
FHVH1:CAR蛋白序列,757aa(SEQ ID NO:27)：
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHSAMGWVRQAPGKGLEWVSSIYARGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYHLEYMVSQDVWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
FHVH3 CAR核酸序列，2262bp(SEQ ID NO:28)：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCCTACAATGGTGACACAAAATATGCACAGAGGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAACCTAAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGCTACGAATCTATGTCTGGTCAGGATATCTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCATTCGTGCCCGTGTTCCTGCCCGCCAAACCTACTACTACCCCTGCACCTAGGCCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACCGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGCGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGAGGATCCGGAGAGGGAAGGGGCAGCTTATTAACATGTGGCGATGTGGAAGAGAACCCCGGTCCCATGCTGCTGCTCGTGACCTCTTTACTGTTATGTGAGCTGCCCCACCCCGCTTTTTTACTGATCCCTCGTAAGGTGTGTAACGGAATCGGCATTGGCGAGTTCAAGGACTCTTTAAGCATCAACGCCACAAACATCAAGCACTTCAAGAATTGTACCTCCATCAGCGGCGATTTACACATTCTCCCCGTGGCTTTTCGTGGCGATTCCTTCACCCACACCCCCCCTCTGGACCCCCAAGAGCTGGACATTTTAAAAACCGTGAAGGAGATCACCGGCTTTCTGCTGATCCAAGCTTGGCCCGAGAATCGTACCGACCTCCACGCCTTCGAGAATTTAGAGATTATTCGTGGAAGGACCAAGCAGCACGGCCAGTTCTCTTTAGCCGTCGTGTCTTTAAACATTACCAGCCTCGGTTTAAGGTCTTTAAAGGAGATTAGCGACGGCGACGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTCTGCTACGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTCGGAACCAGCGGCCAAAAGACCAAGATCATCAGCAATCGTGGAGAGAACTCTTGTAAGGCCACTGGTCAAGTTTGCCACGCCCTCTGTAGCCCCGAAGGATGTTGGGGCCCCGAGCCTAGGGACTGTGTTAGCTGCAGAAACGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTGTGGACAAATGCAATTTACTGGAAGGAGAGCCTAGGGAGTTCGTGGAGAACAGCGAATGTATCCAGTGCCACCCCGAGTGTTTACCTCAAGCCATGAACATCACTTGTACCGGAAGGGGCCCCGATAACTGCATCCAATGCGCCCACTACATCGACGGACCCCACTGCGTGAAAACTTGTCCCGCCGGAGTGATGGGAGAGAATAACACTTTAGTGTGGAAGTACGCCGACGCTGGCCACGTCTGCCATCTGTGCCACCCCAACTGTACCTACGGCTGCACTGGTCCCGGTTTAGAGGGATGTCCTACCAACGGCCCCAAGATCCCCTCCATCGCCACCGGAATGGTGGGCGCTCTGTTATTACTGCTGGTGGTGGCTCTGGGCATCGGTTTATTCATG
FHVH3 CAR蛋白序列，754 aa(SEQ ID NO:29)：
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGDTKYAQRLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRNLRSDDTAVYYCARYESMSGQDIWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
FHVH3VH1 CAR核酸序列，2262bp(SEQ ID NO:30)：
ATGGCCCTACCTGTGACAGCCCTACTGTTACCCCTGGCCCTCCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCCTACAATGGTGACACAAAATATGCACAGAGGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAACCTAAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGCTACGAATCTATGTCTGGTCAGGATATCTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCAGGGGGGGGGGGCTCTGGGGGGGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGCTCTGAAGTTCAGCTGCTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTAGCCATAGCGCCATGGGTTGGGTTCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGCATCTATGCCCGCGGCGGCTATACCTATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAACAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTGCGCGCGGTTACCATCTGGAATACATGGTTTCTCAGGATGTTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCATTTGTGCCTGTATTTCTGCCTGCCAAGCCCACCACAACACCTGCCCCTAGACCACCCACCCCTGCCCCCACCATTGCTTCTCAGCCCCTTAGCTTAAGACCTGAAGCCTGTAGACCTGCTGCTGGGGGGGCTGTGCACACAAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACCCAAGAGGAGGATGGCTGCAGCTGCAGATTCCCTGAGGAGGAGGAGGGGGGCTGTGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCTGCTGATGCCCCTGCCTATCAGCAAGGGCAGAATCAGCTGTACAATGAGCTGAATCTGGGCAGAAGAGAGGAGTATGATGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCTGAGATGGGGGGCAAGCCTAGAAGAAAGAACCCCCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCTGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAGGGGGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCATGATGGCCTGTACCAAGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTATGATGCCCTACACATGCAAGCTCTGCCTCCTAGAGGCTCTGGGGAAGGAAGGGGCAGCCTACTGACCTGTGGGGATGTGGAGGAGAACCCTGGCCCCATGTTGCTATTAGTAACCAGCCTGCTGCTGTGTGAGCTGCCCCACCCTGCCTTCCTGTTAATCCCACGAAAGGTATGTAATGGCATTGGCATTGGGGAGTTTAAGGACAGCCTGAGCATCAATGCCACCAACATCAAGCACTTCAAGAACTGCACAAGCATCAGTGGGGACTTGCACATCCTGCCTGTGGCCTTCAGAGGGGACAGCTTCACCCACACCCCCCCCCTGGACCCCCAAGAGCTGGACATCCTGAAGACAGTGAAGGAGATCACTGGCTTCTTGCTGATCCAAGCCTGGCCTGAGAACAGAACAGACCTGCATGCCTTTGAGAACCTGGAGATCATCAGAGGCAGAACCAAGCAGCATGGGCAGTTCAGCCTGGCTGTGGTGAGCCTGAACATCACAAGCCTGGGCCTGAGAAGCTTAAAGGAGATCTCTGATGGGGATGTGATCATCTCTGGCAACAAGAACCTGTGCTATGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGGCAGAAGACCAAGATCATCAGCAACAGAGGGGAGAACTCCTGTAAGGCCACTGGCCAAGTGTGTCATGCCCTATGCAGCCCTGAGGGGTGCTGGGGCCCTGAGCCTAGAGACTGTGTGAGCTGCAGAAATGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTGTGGACAAGTGCAACCTGCTGGAGGGGGAGCCTAGAGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGTATTCAGTGTCATCCTGAGTGCCTGCCCCAAGCCATGAACATCACCTGCACTGGCAGAGGCCCTGACAACTGCATTCAGTGTGCCCACTACATTGATGGCCCCCACTGTGTGAAGACCTGCCCTGCTGGGGTGATGGGGGAGAACAACACCCTGGTGTGGAAGTATGCTGATGCTGGCCATGTGTGTCACCTGTGCCATCCCAACTGCACCTATGGCTGCACTGGCCCTGGCCTGGAGGGCTGCCCCACCAATGGTCCCAAGATTCCTAGCATTGCCACTGGCATGGTGGGGGCCCTGCTCCTACTTCTGGTGGTTGCCCTGGGCATTGGCCTGTTCATG
FHVH3VH1,CAR蛋白序列，890 aa(SEQ ID NO:31)：
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGDTKYAQRLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRNLRSDDTAVYYCARYESMSGQDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGS
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHSAMGWVRQAPGKGLEWVSSIYARGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYHLEYMVSQDVWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
FHVH1:sdAb核酸序列,363bp(SEQ ID NO:32)
GAAGTTCAGCTGCTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTAGCCATAGCGCCATGGGTTGGGTTCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGCATCTATGCCCGCGGCGGCTATACCTATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAACAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTGCGCGCGGTTACCATCTGGAATACATGGTTTCTCAGGATGTTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCA
FHVH1:sdAb蛋白序列,121 aa(SEQ ID NO:33)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHSAMGWVRQAPGKGLEWVSSIYARGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYHLEYMVSQDVWGQGTLVTVSS
FHVH3:sdAb核酸序列,354bp(SEQ ID NO:34)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCCTACAATGGTGACACAAAATATGCACAGAGGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAACCTAAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGCTACGAATCTATGTCTGGTCAGGATATCTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCA
FHVH3:sdAb蛋白序列,118 aa(SEQ ID NO:35)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGDTKYAQRLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRNLRSDDTAVYYCARYESMSGQDIWGQGTLVTVSS
FHVH3VH1 sdAb核酸序列，762 bp(SEQ ID NO:36)：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCCTACAATGGTGACACAAAATATGCACAGAGGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAACCTAAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGCTACGAATCTATGTCTGGTCAGGATATCTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCAGGGGGGGGGGGCTCTGGGGGGGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGCTCTGAAGTTCAGCTGCTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTAGCCATAGCGCCATGGGTTGGGTTCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGCATCTATGCCCGCGGCGGCTATACCTATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAACAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTGCGCGCGGTTACCATCTGGAATACATGGTTTCTCAGGATGTTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCA
FHVH3VH1 sdAb蛋白序列，254 aa(SEQ ID NO:37)：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGDTKYAQRLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRNLRSDDTAVYYCARYESMSGQDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHSAMGWVRQAPGKGLEWVSSIYARGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYHLEYMVSQDVWGQGTLVTVSS
FHVH1:的CDR区序列
HCDR1的氨基酸序列为GFTFSHSA(SEQ ID NO：38)；
HCDR2的氨基酸序列为IYARGGYT(SEQ ID NO：39)；
HCDR3的氨基酸序列为ARGYHLEYMVSQDV(SEQ ID NO：40)；
FHVH3:的CDR区序列
HCDR1的氨基酸序列为GGTFSNYA(SEQ ID NO：41)；
HCDR2的氨基酸序列为ISAYNGDT(SEQ ID NO：42)；
HCDR3的氨基酸序列为ARYESMSGQDI(SEQ ID NO：43)；
FHVH1VH3 CAR核酸序列(SEQ ID NO：44)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCGAAGTTCAGCTGCTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTAGCCATAGCGCCATGGGTTGGGTTCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGCATCTATGCCCGCGGCGGCTATACCTATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAACAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTGCGCGCGGTTACCATCTGGAATACATGGTTTCTCAGGATGTTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCAGGGGGGGGGGGCTCTGGGGGGGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGCTCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCCTACAATGGTGACACAAAATATGCACAGAGGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAACCTAAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGCTACGAATCTATGTCTGGTCAGGATATCTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCATTCGTGCCCGTGTTCCTGCCCGCCAAACCTACTACTACCCCTGCACCTAGGCCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACCGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGCGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGAGGATCCGGAGAGGGAAGGGGCAGCTTATTAACATGTGGCGATGTGGAAGAGAACCCCGGTCCCATGCTGCTGCTCGTGACCTCTTTACTGTTATGTGAGCTGCCCCACCCCGCTTTTTTACTGATCCCTCGTAAGGTGTGTAACGGAATCGGCATTGGCGAGTTCAAGGACTCTTTAAGCATCAACGCCACAAACATCAAGCACTTCAAGAATTGTACCTCCATCAGCGGCGATTTACACATTCTCCCCGTGGCTTTTCGTGGCGATTCCTTCACCCACACCCCCCCTCTGGACCCCCAAGAGCTGGACATTTTAAAAACCGTGAAGGAGATCACCGGCTTTCTGCTGATCCAAGCTTGGCCCGAGAATCGTACCGACCTCCACGCCTTCGAGAATTTAGAGATTATTCGTGGAAGGACCAAGCAGCACGGCCAGTTCTCTTTAGCCGTCGTGTCTTTAAACATTACCAGCCTCGGTTTAAGGTCTTTAAAGGAGATTAGCGACGGCGACGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTCTGCTACGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTCGGAACCAGCGGCCAAAAGACCAAGATCATCAGCAATCGTGGAGAGAACTCTTGTAAGGCCACTGGTCAAGTTTGCCACGCCCTCTGTAGCCCCGAAGGATGTTGGGGCCCCGAGCCTAGGGACTGTGTTAGCTGCAGAAACGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTGTGGACAAATGCAATTTACTGGAAGGAGAGCCTAGGGAGTTCGTGGAGAACAGCGAATGTATCCAGTGCCACCCCGAGTGTTTACCTCAAGCCATGAACATCACTTGTACCGGAAGGGGCCCCGATAACTGCATCCAATGCGCCCACTACATCGACGGACCCCACTGCGTGAAAACTTGTCCCGCCGGAGTGATGGGAGAGAATAACACTTTAGTGTGGAAGTACGCCGACGCTGGCCACGTCTGCCATCTGTGCCACCCCAACTGTACCTACGGCTGCACTGGTCCCGGTTTAGAGGGATGTCCTACCAACGGCCCCAAGATCCCCTCCATCGCCACCGGAATGGTGGGCGCTCTGTTATTACTGCTGGTGGTGGCTCTGGGCATCGGTTTATTCATG
FHVH1VH3 CAR氨基酸序列(SEQ ID NO：45)
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FHVH1VH3 sdAb核酸序列(SEQ ID NO：46)
GAAGTTCAGCTGCTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTAGCCATAGCGCCATGGGTTGGGTTCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGCATCTATGCCCGCGGCGGCTATACCTATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAACAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTGCGCGCGGTTACCATCTGGAATACATGGTTTCTCAGGATGTTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCAGGGGGGGGGGGCTCTGGGGGGGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGCTCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAACTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCCTACAATGGTGACACAAAATATGCACAGAGGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAACCTAAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGCTACGAATCTATGTCTGGTCAGGATATCTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCA
FHVH1VH3 sdAb氨基酸序列(SEQ ID NO：47)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHSAMGWVRQAPGKGLEWVSSIYARGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYHLEYMVSQDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGDTKYAQRLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRNLRSDDTAVYYCARYESMSGQDIWGQGTLVTVSS
FHVH2 CAR核酸序列(SEQ ID NO：48)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGTCGCCCAGAGAGAAGGGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCATTCGTGCCCGTGTTCCTGCCCGCCAAACCTACTACTACCCCTGCACCTAGGCCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACCGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGCGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGAGGATCCGGAGAGGGAAGGGGCAGCTTATTAACATGTGGCGATGTGGAAGAGAACCCCGGTCCCATGCTGCTGCTCGTGACCTCTTTACTGTTATGTGAGCTGCCCCACCCCGCTTTTTTACTGATCCCTCGTAAGGTGTGTAACGGAATCGGCATTGGCGAGTTCAAGGACTCTTTAAGCATCAACGCCACAAACATCAAGCACTTCAAGAATTGTACCTCCATCAGCGGCGATTTACACATTCTCCCCGTGGCTTTTCGTGGCGATTCCTTCACCCACACCCCCCCTCTGGACCCCCAAGAGCTGGACATTTTAAAAACCGTGAAGGAGATCACCGGCTTTCTGCTGATCCAAGCTTGGCCCGAGAATCGTACCGACCTCCACGCCTTCGAGAATTTAGAGATTATTCGTGGAAGGACCAAGCAGCACGGCCAGTTCTCTTTAGCCGTCGTGTCTTTAAACATTACCAGCCTCGGTTTAAGGTCTTTAAAGGAGATTAGCGACGGCGACGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTCTGCTACGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTCGGAACCAGCGGCCAAAAGACCAAGATCATCAGCAATCGTGGAGAGAACTCTTGTAAGGCCACTGGTCAAGTTTGCCACGCCCTCTGTAGCCCCGAAGGATGTTGGGGCCCCGAGCCTAGGGACTGTGTTAGCTGCAGAAACGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTGTGGACAAATGCAATTTACTGGAAGGAGAGCCTAGGGAGTTCGTGGAGAACAGCGAATGTATCCAGTGCCACCCCGAGTGTTTACCTCAAGCCATGAACATCACTTGTACCGGAAGGGGCCCCGATAACTGCATCCAATGCGCCCACTACATCGACGGACCCCACTGCGTGAAAACTTGTCCCGCCGGAGTGATGGGAGAGAATAACACTTTAGTGTGGAAGTACGCCGACGCTGGCCACGTCTGCCATCTGTGCCACCCCAACTGTACCTACGGCTGCACTGGTCCCGGTTTAGAGGGATGTCCTACCAACGGCCCCAAGATCCCCTCCATCGCCACCGGAATGGTGGGCGCTCTGTTATTACTGCTGGTGGTGGCTCTGGGCATCGGTTTATTCATG
FHVH2 CAR蛋白序列(SEQ ID NO：49)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVAQREGDVWGKGTTVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
FHVH4 CAR核酸序列(SEQ ID NO：50)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGCCAGACCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAGGATCTCCTGTAAGGCTTCTGGATACAGTTTTAGCAACCATTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGAAGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGAGCGTCTATCCTGGTGACTCCGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCACGTCACTGTCTCAGCCGACAAGTCCATGAATACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGACCTCGGACACCGCCATGTATTATTGTGCGAGAGGTGGGACTATTGACGGTGACTACGGGGGGAGGCAAGACTTCTGGGGCCAGGGAACCATGGTCACCGTCTCTTCATTCGTGCCCGTGTTCCTGCCCGCCAAACCTACTACTACCCCTGCACCTAGGCCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACCGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGCGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGAGGATCCGGAGAGGGAAGGGGCAGCTTATTAACATGTGGCGATGTGGAAGAGAACCCCGGTCCCATGCTGCTGCTCGTGACCTCTTTACTGTTATGTGAGCTGCCCCACCCCGCTTTTTTACTGATCCCTCGTAAGGTGTGTAACGGAATCGGCATTGGCGAGTTCAAGGACTCTTTAAGCATCAACGCCACAAACATCAAGCACTTCAAGAATTGTACCTCCATCAGCGGCGATTTACACATTCTCCCCGTGGCTTTTCGTGGCGATTCCTTCACCCACACCCCCCCTCTGGACCCCCAAGAGCTGGACATTTTAAAAACCGTGAAGGAGATCACCGGCTTTCTGCTGATCCAAGCTTGGCCCGAGAATCGTACCGACCTCCACGCCTTCGAGAATTTAGAGATTATTCGTGGAAGGACCAAGCAGCACGGCCAGTTCTCTTTAGCCGTCGTGTCTTTAAACATTACCAGCCTCGGTTTAAGGTCTTTAAAGGAGATTAGCGACGGCGACGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTCTGCTACGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTCGGAACCAGCGGCCAAAAGACCAAGATCATCAGCAATCGTGGAGAGAACTCTTGTAAGGCCACTGGTCAAGTTTGCCACGCCCTCTGTAGCCCCGAAGGATGTTGGGGCCCCGAGCCTAGGGACTGTGTTAGCTGCAGAAACGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTGTGGACAAATGCAATTTACTGGAAGGAGAGCCTAGGGAGTTCGTGGAGAACAGCGAATGTATCCAGTGCCACCCCGAGTGTTTACCTCAAGCCATGAACATCACTTGTACCGGAAGGGGCCCCGATAACTGCATCCAATGCGCCCACTACATCGACGGACCCCACTGCGTGAAAACTTGTCCCGCCGGAGTGATGGGAGAGAATAACACTTTAGTGTGGAAGTACGCCGACGCTGGCCACGTCTGCCATCTGTGCCACCCCAACTGTACCTACGGCTGCACTGGTCCCGGTTTAGAGGGATGTCCTACCAACGGCCCCAAGATCCCCTCCATCGCCACCGGAATGGTGGGCGCTCTGTTATTACTGCTGGTGGTGGCTCTGGGCATCGGTTTATTCATG
FHVH4 CAR蛋白序列(SEQ ID NO：51)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKASGYSFSNHWIGWVRQKPGKGLEWMGSVYPGDSDTRYSPSFQGHVTVSADKSMNTAYLQWSSLKTSDTAMYYCARGGTIDGDYGGRQDFWGQGTMVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
FHVH2VH1 CAR核酸序列(SEQ ID NO：52)
ATGGCCCTACCTGTGACAGCCCTACTGTTACCCCTGGCCCTCCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGTCGCCCAGAGAGAAGGGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGGGGGGGGGGCTCTGGGGGGGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGCTCTGAAGTTCAGCTGCTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTAGCCATAGCGCCATGGGTTGGGTTCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGCATCTATGCCCGCGGCGGCTATACCTATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAACAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTGCGCGCGGTTACCATCTGGAATACATGGTTTCTCAGGATGTTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCATTTGTGCCTGTATTTCTGCCTGCCAAGCCCACCACAACACCTGCCCCTAGACCACCCACCCCTGCCCCCACCATTGCTTCTCAGCCCCTTAGCTTAAGACCTGAAGCCTGTAGACCTGCTGCTGGGGGGGCTGTGCACACAAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACCCAAGAGGAGGATGGCTGCAGCTGCAGATTCCCTGAGGAGGAGGAGGGGGGCTGTGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCTGCTGATGCCCCTGCCTATCAGCAAGGGCAGAATCAGCTGTACAATGAGCTGAATCTGGGCAGAAGAGAGGAGTATGATGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCTGAGATGGGGGGCAAGCCTAGAAGAAAGAACCCCCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCTGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAGGGGGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCATGATGGCCTGTACCAAGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTATGATGCCCTACACATGCAAGCTCTGCCTCCTAGAGGCTCTGGGGAAGGAAGGGGCAGCCTACTGACCTGTGGGGATGTGGAGGAGAACCCTGGCCCCATGTTGCTATTAGTAACCAGCCTGCTGCTGTGTGAGCTGCCCCACCCTGCCTTCCTGTTAATCCCACGAAAGGTATGTAATGGCATTGGCATTGGGGAGTTTAAGGACAGCCTGAGCATCAATGCCACCAACATCAAGCACTTCAAGAACTGCACAAGCATCAGTGGGGACTTGCACATCCTGCCTGTGGCCTTCAGAGGGGACAGCTTCACCCACACCCCCCCCCTGGACCCCCAAGAGCTGGACATCCTGAAGACAGTGAAGGAGATCACTGGCTTCTTGCTGATCCAAGCCTGGCCTGAGAACAGAACAGACCTGCATGCCTTTGAGAACCTGGAGATCATCAGAGGCAGAACCAAGCAGCATGGGCAGTTCAGCCTGGCTGTGGTGAGCCTGAACATCACAAGCCTGGGCCTGAGAAGCTTAAAGGAGATCTCTGATGGGGATGTGATCATCTCTGGCAACAAGAACCTGTGCTATGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGGCAGAAGACCAAGATCATCAGCAACAGAGGGGAGAACTCCTGTAAGGCCACTGGCCAAGTGTGTCATGCCCTATGCAGCCCTGAGGGGTGCTGGGGCCCTGAGCCTAGAGACTGTGTGAGCTGCAGAAATGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTGTGGACAAGTGCAACCTGCTGGAGGGGGAGCCTAGAGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGTATTCAGTGTCATCCTGAGTGCCTGCCCCAAGCCATGAACATCACCTGCACTGGCAGAGGCCCTGACAACTGCATTCAGTGTGCCCACTACATTGATGGCCCCCACTGTGTGAAGACCTGCCCTGCTGGGGTGATGGGGGAGAACAACACCCTGGTGTGGAAGTATGCTGATGCTGGCCATGTGTGTCACCTGTGCCATCCCAACTGCACCTATGGCTGCACTGGCCCTGGCCTGGAGGGCTGCCCCACCAATGGTCCCAAGATTCCTAGCATTGCCACTGGCATGGTGGGGGCCCTGCTCCTACTTCTGGTGGTTGCCCTGGGCATTGGCCTGTTCATG
FHVH2VH1 CAR蛋白序列(SEQ ID NO：53)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVAQREGDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHSAMGWVRQAPGKGLEWVSSIYARGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYHLEYMVSQDVWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
FHVH4VH1 CAR核酸序列(SEQ ID NO：54)
ATGGCCCTACCTGTGACAGCCCTACTGTTACCCCTGGCCCTCCTTCTGCATGCTGCTAGACCTCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAGGATCTCCTGTAAGGCTTCTGGATACAGTTTTAGCAACCATTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGAAGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGAGCGTCTATCCTGGTGACTCCGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCACGTCACTGTCTCAGCCGACAAGTCCATGAATACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGACCTCGGACACCGCCATGTATTATTGTGCGAGAGGTGGGACTATTGACGGTGACTACGGGGGGAGGCAAGACTTCTGGGGCCAGGGAACCATGGTCACCGTCTCTTCAGGGGGGGGGGGCTCTGGGGGGGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGCTCTGAAGTTCAGCTGCTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTAGCCATAGCGCCATGGGTTGGGTTCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGCATCTATGCCCGCGGCGGCTATACCTATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAACAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTGCGCGCGGTTACCATCTGGAATACATGGTTTCTCAGGATGTTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCATTTGTGCCTGTATTTCTGCCTGCCAAGCCCACCACAACACCTGCCCCTAGACCACCCACCCCTGCCCCCACCATTGCTTCTCAGCCCCTTAGCTTAAGACCTGAAGCCTGTAGACCTGCTGCTGGGGGGGCTGTGCACACAAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAACAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACCCAAGAGGAGGATGGCTGCAGCTGCAGATTCCCTGAGGAGGAGGAGGGGGGCTGTGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGATCTGCTGATGCCCCTGCCTATCAGCAAGGGCAGAATCAGCTGTACAATGAGCTGAATCTGGGCAGAAGAGAGGAGTATGATGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCTGAGATGGGGGGCAAGCCTAGAAGAAAGAACCCCCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCTGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAGGGGGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCATGATGGCCTGTACCAAGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTATGATGCCCTACACATGCAAGCTCTGCCTCCTAGAGGCTCTGGGGAAGGAAGGGGCAGCCTACTGACCTGTGGGGATGTGGAGGAGAACCCTGGCCCCATGTTGCTATTAGTAACCAGCCTGCTGCTGTGTGAGCTGCCCCACCCTGCCTTCCTGTTAATCCCACGAAAGGTATGTAATGGCATTGGCATTGGGGAGTTTAAGGACAGCCTGAGCATCAATGCCACCAACATCAAGCACTTCAAGAACTGCACAAGCATCAGTGGGGACTTGCACATCCTGCCTGTGGCCTTCAGAGGGGACAGCTTCACCCACACCCCCCCCCTGGACCCCCAAGAGCTGGACATCCTGAAGACAGTGAAGGAGATCACTGGCTTCTTGCTGATCCAAGCCTGGCCTGAGAACAGAACAGACCTGCATGCCTTTGAGAACCTGGAGATCATCAGAGGCAGAACCAAGCAGCATGGGCAGTTCAGCCTGGCTGTGGTGAGCCTGAACATCACAAGCCTGGGCCTGAGAAGCTTAAAGGAGATCTCTGATGGGGATGTGATCATCTCTGGCAACAAGAACCTGTGCTATGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGGCAGAAGACCAAGATCATCAGCAACAGAGGGGAGAACTCCTGTAAGGCCACTGGCCAAGTGTGTCATGCCCTATGCAGCCCTGAGGGGTGCTGGGGCCCTGAGCCTAGAGACTGTGTGAGCTGCAGAAATGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTGTGGACAAGTGCAACCTGCTGGAGGGGGAGCCTAGAGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGTATTCAGTGTCATCCTGAGTGCCTGCCCCAAGCCATGAACATCACCTGCACTGGCAGAGGCCCTGACAACTGCATTCAGTGTGCCCACTACATTGATGGCCCCCACTGTGTGAAGACCTGCCCTGCTGGGGTGATGGGGGAGAACAACACCCTGGTGTGGAAGTATGCTGATGCTGGCCATGTGTGTCACCTGTGCCATCCCAACTGCACCTATGGCTGCACTGGCCCTGGCCTGGAGGGCTGCCCCACCAATGGTCCCAAGATTCCTAGCATTGCCACTGGCATGGTGGGGGCCCTGCTCCTACTTCTGGTGGTTGCCCTGGGCATTGGCCTGTTCATG
FHVH4VH1 CAR蛋白序列(SEQ ID NO：55)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKASGYSFSNHWIGWVRQKPGKGLEWMGSVYPGDSDTRYSPSFQGHVTVSADKSMNTAYLQWSSLKTSDTAMYYCARGGTIDGDYGGRQDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHSAMGWVRQAPGKGLEWVSSIYARGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYHLEYMVSQDVWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
FHVH2 sdAb核酸序列(SEQ ID NO：56)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGTCGCCCAGAGAGAAGGGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
FHVH2 sdAb蛋白序列(SEQ ID NO：57)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVAQREGDVWGKGTTVTVSS
FHVH4 sdAb核酸序列(SEQ ID NO：58)
CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAGGATCTCCTGTAAGGCTTCTGGATACAGTTTTAGCAACCATTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGAAGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGAGCGTCTATCCTGGTGACTCCGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCACGTCACTGTCTCAGCCGACAAGTCCATGAATACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGACCTCGGACACCGCCATGTATTATTGTGCGAGAGGTGGGACTATTGACGGTGACTACGGGGGGAGGCAAGACTTCTGGGGCCAGGGAACCATGGTCACCGTCTCTTCA
FHVH4 sdAb蛋白序列(SEQ ID NO：59)
QVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKASGYSFSNHWIGWVRQKPGKGLEWMGSVYPGDSDTRYSPSFQGHVTVSADKSMNTAYLQWSSLKTSDTAMYYCARGGTIDGDYGGRQDFWGQGTMVTVSS
FHVH2VH1 sdAb核酸序列(SEQ ID NO：60)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGTCGCCCAGAGAGAAGGGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGGGGGGGGGGCTCTGGGGGGGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGCTCTGAAGTTCAGCTGCTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTAGCCATAGCGCCATGGGTTGGGTTCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGCATCTATGCCCGCGGCGGCTATACCTATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAACAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTGCGCGCGGTTACCATCTGGAATACATGGTTTCTCAGGATGTTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCA
FHVH2VH1 sdAb蛋白序列(SEQ ID NO：61)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVAQREGDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHSAMGWVRQAPGKGLEWVSSIYARGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYHLEYMVSQDVWGQGTLVTVSS
FHVH4VH1 sdAb核酸序列(SEQ ID NO：62)
CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAGGATCTCCTGTAAGGCTTCTGGATACAGTTTTAGCAACCATTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGAAGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGAGCGTCTATCCTGGTGACTCCGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCACGTCACTGTCTCAGCCGACAAGTCCATGAATACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGACCTCGGACACCGCCATGTATTATTGTGCGAGAGGTGGGACTATTGACGGTGACTACGGGGGGAGGCAAGACTTCTGGGGCCAGGGAACCATGGTCACCGTCTCTTCAGGGGGGGGGGGCTCTGGGGGGGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGCTCTGAAGTTCAGCTGCTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTAGCCATAGCGCCATGGGTTGGGTTCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGCATCTATGCCCGCGGCGGCTATACCTATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAACAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTGCGCGCGGTTACCATCTGGAATACATGGTTTCTCAGGATGTTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCA
FHVH4VH1 sdAb蛋白序列(SEQ ID NO：63)
QVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKASGYSFSNHWIGWVRQKPGKGLEWMGSVYPGDSDTRYSPSFQGHVTVSADKSMNTAYLQWSSLKTSDTAMYYCARGGTIDGDYGGRQDFWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHSAMGWVRQAPGKGLEWVSSIYARGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYHLEYMVSQDVWGQGTLVTVSS
FHVH2 HCDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO：64)
GFTFSSYE
FHVH2 HCDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO：65)
ISSSGSTI
FHVH2 HCDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO：66)
ARVAQREGDV
FHVH4 HCDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)
GYSFSNHW
FHVH4 HCDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO：68)
VYPGDSDT
FHVH4 HCDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO：69)
ARGGTIDGDYGGRQDF
CD5 KO sgRNA:GCTGTAGAACTCCACCACGC(SEQ ID NO：70)
HSV1-TK-MUT2氨基酸序列：
MASYPCHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRLEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWQVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHVGGEAGSSHAPPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWWEDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEAN(SEQ ID NO：71)

Claims (10)

1.免疫效应细胞，其包括：
1)嵌合抗原受体(CAR)和/或其编码核酸序列；以及
2)自杀基因和/或自杀基因编码的蛋白产物，
其中所述CAR包括CD5结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号传导结构域，所述CD5结合结构域包含一个或更多个特异性结合CD5的抗体或其抗原结合片段，
其中所述自杀基因为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因。
2.如权利要求1所述的免疫效应细胞，其中所述HSV-TK为HSV-TK mut2；优选地，所述HSV-TK mut2包括SEQ ID NO：71所示序列或其功能性变体。
3.如权利要求1所述的免疫效应细胞，其中：
所述抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列选自以下组合的任一个：
(1)SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：39所示序列的HCDR2，和SEQ ID NO：40所示序列的HCDR3；
(2)SEQ ID NO：41所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：42所示序列的HCDR2，和SEQ ID NO：43所示序列的HCDR3；
(3)SEQ ID NO：64所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：65所示序列的HCDR2，和SEQ ID NO：66所示序列的HCDR3；以及
(4)SEQ ID NO：67所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：68所示序列的HCDR2，和SEQ ID NO：69所示序列的HCDR3。
优选地，所述CD5结合结构域包括至少两个特异性结合CD5的抗体或其片段，所述抗体或其片段包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3分别独立地选自以下组合的任一个：
(1)SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：39所示序列的HCDR2，和SEQ ID NO：40所示序列的HCDR3；
(2)SEQ ID NO：41所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：42所示序列的HCDR2，和SEQ ID NO：43所示序列的HCDR3；
(3)SEQ ID NO：64所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：65所示序列的HCDR2，和SEQ ID NO：66所示序列的HCDR3；以及
(4)SEQ ID NO：67所示序列的HCDR1，SEQ ID NO：68所示序列的HCDR2，和SEQ ID NO：69所示序列的HCDR3；
优选地，所述CD5结合结构域包括特异性结合CD5的第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段，所述第一抗体或其抗原结合片段和所述第二抗体或其抗原结合片段包括的HCDR1、HCDR2、HCDR3分别独立地选自以下组合的任一个：
(1)所述第一抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1、SEQ ID NO：39所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：40所示序列的HCDR3；所述第二抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：41所示序列的HCDR1、SEQ ID NO：42所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：43所示序列的HCDR3；
(2)所述第一抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1、SEQ ID NO：39所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：40所示序列的HCDR3；所述第二抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：64所示序列的HCDR1、SEQ ID NO：65所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：66所示序列的HCDR3；以及
(3)所述第一抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：38所示序列的HCDR1、SEQ ID NO：39所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：40所示序列的HCDR3；所述第二抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：67所示序列的HCDR1、SEQ ID NO：68所示序列的HCDR2和SEQ ID NO：69所示序列的HCDR3；
优选地，所述至少两个特异性结合CD5的抗体或其抗原结合片段之间串联连接。
优选地，所述抗体为单域抗体；
优选地，所述CD5结合结构域包括至少两个单域抗体，所述单域抗体之间通过linker片段连接；更优选地，所述linker片段包括SEQ ID NO：25所示序列；
优选地，所述CD5结合结构域包括SEQ ID NO：33、35、37、47、57、59、61或63所示序列或其功能性变体；
优选地，所述跨膜结构域包括来自选自下述蛋白的多肽：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3e，CD45，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154；更优选地，所述跨膜结构域包含SEQ ID NO：6所示序列或其功能性变体；
优选地，所述共刺激结构域包括选自下述蛋白的多肽：CD28、4-1BB、OX-40和ICOS；更优选地，所述共刺激结构域包括SEQ ID NO：8所示序列或其功能性变体；
优选地，所述胞内信号传导结构域包含来自CD3ζ的信号传导结构域；更优选地，所述胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：10所示序列或其功能性变体。
优选地，所述CAR还包含铰链区，所述铰链区连接所述CD5结合结构域和所述跨膜结构域；更优选地，所述铰链区包含SEQ ID NO：4所示序列或其功能性变体。
优选地，所述CAR包括CD8α信号肽；更优选地，所述信号肽包含SEQ ID NO：2所示序列或其功能性变体；
优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞。
4.如权利要求1-3中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CAR的编码核酸序列和所述自杀基因位于同一核酸分子中；优选地，所述CAR的编码核酸序列和所述自杀基因位于被引入所述免疫效应细胞的同一表达载体中。
5.如权利要求1-4中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述表达载体为慢病毒表达载体，如pLVx载体或pCDH载体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述CAR的编码核酸序列和所述自杀基因之间包括剪切肽编码序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞不表达：
1)CD5；和/或
2)TRAC基因和/或TRBC基因。
8.分离的核酸分子或表达载体，其包括权利要求1-7中任一项所述的CAR的编码核酸序列和自杀基因。
9.制备免疫效应细胞的方法，其包括：
1)敲除所述免疫效应细胞的(1)CD5基因和/或(2)TRAC基因和/或TRBC基因；以及
2)向免疫效应细胞中引入权利要求8所述的核酸分子。
10.治疗与CD5的表达相关的疾病或病症的方法，其包括以治疗有效量的权利要求1-7中任一项所述的免疫效应细胞或权利要求8任一项所述的核酸分子向有需要的受试者给药。
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