CN112961248B - 共表达IL-7和CCR2b的嵌合抗原受体融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种共表达IL‑7和CCR2b的嵌合抗原受体融合蛋白及其应用。所述融合蛋白包括依次串联的嵌合抗原受体、2A肽、IL‑7、2A肽和CCR2b。本发明构建了同时表达IL‑7和CCR2b的CAR‑T细胞，其能更有效的增强CAR‑T迁移至实体肿瘤并能在肿瘤区域高效增殖。

Description

共表达IL-7和CCR2b的嵌合抗原受体融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种共表达IL-7和CCR2b的嵌合抗原受体融合蛋白及其应用。

背景技术

最近，肿瘤的生物疗法成为继手术治疗和放化疗之后的新型治疗方法。生物疗法是一种运用生物学方法对机体的“抗癌机构”进行调节，使其平衡、稳定的治疗方法。生物疗法包括了细胞疗法、基因疗法、抗体疗法和细胞因子疗法。

其中，CAR-T疗法具有很好的前景。CAR-T细胞即嵌合抗原受体T细胞(Chimericantigen receptor T-Cell，CAR-T)，嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原结合区(通常来源于抗体抗原结合区域的scFv段)、一个胞外铰链区、一个跨膜区和一个胞内信号区。一旦T细胞表达这种受体，单个融合分子便与抗原进行特异性结合并激活T细胞，因此经嵌合抗原受体修饰的T细胞具有抗体的特异性和效应T细胞的细胞毒作用。CAR一旦与肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合，可通过由CD3或高亲和性受体FceRI的胞内区使T细胞活化，表现为CAR依赖的细胞杀伤、增殖及细胞因子释放。同时CAR-T细胞的扩增倍数可超过1000倍，临床实验中发现输入CAR-T细胞六个月后患者体内仍能检测到高水平表达的CAR。总而言之，CAR-T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高。

CAR-T细胞在癌症免疫治疗中表现出显着的疗效，特别是在治疗血癌方面。然而，CAR-T在实体瘤部位的存活及向实体瘤部位的有效迁移是目前CAR-T治疗实体肿瘤亟需解决的两大难题。

发明内容

本发明的第一方面包含嵌合抗原受体的融合蛋白，其包括依次串联的嵌合抗原受体、2A肽、IL-7、2A肽和CCR2b。

本发明的第二方面涉及分离的核酸，其表达得到权利要求1～8任一项所述的融合蛋白。

本发明的第三方面涉及含有如上所述核酸的载体。

本发明的第四方面涉及T细胞，其含有如上所述的核酸或如上所述的载体。

本发明的第五方面涉及组合物，其包含在药学上可接受的载体以及如上所述的T细胞。

本发明的第六方面涉及如上所述的T细胞或如上所述的组合物在制备用于预防和/或治疗实体瘤的药物中的应用。

本发明的有益效果为：

传统的CAR-T细胞由于在体内生存时间不够长，而且受到肿瘤微环境中各种免疫抑制因子的影响，对肿瘤的浸润能力较差，在肿瘤微环境中的增殖能力也很弱。本发明构建了同时表达IL-7和CCR2b的CAR-T细胞(7×2b CAR-T细胞)，其能更有效的增强CAR-T迁移至实体肿瘤并能在肿瘤区域高效增殖。

与常规CAR-T细胞相比，IL-7的分泌和CCR2b的表达不影响T细胞表面CAR表达以及CAR-T杀伤肿瘤细胞的特异性和有效性。然而在无外源性添加IL-7的培养过程中，7×2bCAR-T细胞展现出了更为出色的增殖能力，这将有利于其在体内的生存，提高其临床活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中经典CAR与同时表达IL-7和CCR2b(7×2b)的CAR结构示意图的比较；

图2A为本发明一个实施例中经典的靶向GD2的CAR结构；

图2B为本发明一个实施例中同时表达IL-7和CCR2b(7×2b)的CAR结构；

图3为本发明一个实施例中流式检测CAR-T的表达及ELISA检测IL-7的分泌情况；

图4为本发明一个实施例中流式检测GD2抗原在黑色素瘤和神经母细胞瘤中表达；

图5为本发明一个实施例中ELISA检测CAR-T细胞与肿瘤细胞共孵育后分泌的IFN-γ水平；

图6为本发明一个实施例中荧光素酶法检测CAR-T的杀伤效率；

图7为本发明一个实施例中ELISA检测肿瘤细胞分泌CCL2的水平；

图8为本发明一个实施例中CAR T细胞的促增殖及促迁移作用；(A)评估CAR-T细胞的扩增效率；(B)CAR-T细胞上清液刺激T细胞扩增的效果；(C)Tscm亚群的分析；(D)评估肿瘤细胞上清趋化CAR-T细胞的能力；

图9为本发明一个实施例中ELISA检测IMR-32-CCL2细胞(稳转CLL2基因)分泌CLL2水平；

图10为本发明一个实施例中小鼠活体成像图和生物发光成像结果分析数据结果；

图11为本发明一个实施例中CAR-T治疗后小鼠分泌细胞因子水平；

图12为本发明一个实施例中免疫组化检测小鼠脾脏和肿瘤块中人CD3的表达情况。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及包含嵌合抗原受体的融合蛋白，包括依次串联的嵌合抗原受体、2A肽、IL-7、2A肽和CCR2b。

人白细胞介素7(interleukin-7，IL7)是一种多效细胞因子，具有广泛的免疫效应，可影响B细胞和T细胞的生长、存活及分化，在抗肿瘤方面也有直接或间接的作用。

趋化因子受体2(chemokine receptor type 2,CCR2)为单核细胞化学引诱蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)的受体。CCR2及其配体MCP-1已被证实在炎症疾病病理学方面起着重要作用，例如在肺移植时对分枝杆菌结核的抵抗中，在脂多糖引起的死亡和延迟型过敏性皮炎等方面有着非常重要的作用。

为了提高CAR-T细胞对实体肿瘤的治疗效果，本发明构建并制备了共表达IL-7和CCR2b的CAR-T细胞(7×2b CAR-T)，其生存能力、趋化能力和亚型分布均优于常规CAR-T细胞，因此有望在体内取得更好的抗肿瘤效果，并为之后的临床试验提供临床前研究基础。

在一些实施方式中，所述IL-7的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在一些实施方式中，所述IL-7还具有信号肽，所述信号肽的氨基酸序列可选如SEQID NO:9所示。

在一些实施方式中，所述CCR2b的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在一些实施方式中，所述2A肽为T2A，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含A)sc-Fv区，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区。

在一些实施方式中，所述铰链区选自CD8α的hinge区；优选其氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示。

在一些实施方式中，所述跨膜域选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和NKG2C中的一种；

在一些实施方式中，所述跨膜域为CD8α跨膜区，其氨基酸序列可选为SEQ ID NO：6所示。

在一些实施方式中，所述胞内信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、PKCθ、FcεRIγ、ZAP70、和CD3ζ中的任一种，或其任意组合；

在一些实施方式中，所述胞内信号传导区为4-1BB以及CD3ζ；

在一些实施方式中，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；

在一些实施方式中，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体的N端还具有信号肽，进一步可选为CD8α信号肽；进一步其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

在一些实施方式中，所述sc-Fv区用于靶向实体瘤的表面标志物；

sc-Fv区可以是嵌合、人源化或人抗体片段，其能够识别肿瘤的抗原结合结构域。在一些实施方式中，所述识别肿瘤的抗原结合结构域识别以下抗原组成的组中的任一种：α-甲胎蛋白(AFP)、α-辅肌动蛋白-4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、碳酸酐酶IX、CASP-8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、纤维母细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和它的亚单位、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导性因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、胰腺癌粘蛋白、PD1受体、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆逊-弗雷登里希抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标志物、bc1-2、bc1-6、Kras、致癌基因标志物和致癌基因产物。

在一些实施方式中，优选靶向GD2，进一步优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还涉及分离的核酸，其表达得到如上所述的融合蛋白。核酸可为DNA或RNA。

本发明还涉及含有如上所述核酸的载体。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述载体选自逆转录病毒载体、腺病毒、腺病毒相关病毒或CRISPR/CAS质粒；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述逆转录病毒载体为慢病毒载体；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述CRISPR/CAS质粒选自CRISPR/CAS-1、CRISPR/CAS-5、CRISPR/CAS-7、CRISPR/CAS-9、CRISPR/CAS-2、CRISPR/CAS-3、CRISPR/CAS-10中的任一种。

本发明还涉及T细胞，其含有如上所述的核酸或如上所述的载体。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述T细胞为辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、MAIT细胞、γδT细胞中的任意一种。

本发明还涉及组合物，其包含在药学上可接受的载体以及如上所述的T细胞。

本发明还涉及如上所述的T细胞或如上所述的组合物在制备用于预防和/或治疗实体瘤的药物中的应用。

在本发明中，“实体瘤”包括：骨、骨连接、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、静脉、毛细血管、淋巴结、淋巴管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、阑尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴部、阴囊、睾丸、输精管、阴茎、眼、耳、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、脊髓、脑脊液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺以及腮腺中任一处病变生成的肿瘤。特别地，优选预期的肿瘤可被靶向，例如胆管癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓源性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和尿路膀胱癌。

在一些实施方式中，所述实体瘤为高CCL2肿瘤。

在一些实施方式中，所述实体瘤为神经母细胞瘤和黑色素瘤。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1嵌合抗原受体的设计

本实施例采用抗GD2抗体14G2a的单链抗体(scFv)作为抗原结合结构域，结合CD8α信号肽、CD8α铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域，构建靶向GD2的CAR，结构示意图如图1所示；本实施例还构建了同时表达IL-7和CCR2b的CAR(7×2b)，结构示意图如图1所示。

其中14G2a-CAR的氨基酸序列为SEQ ID NO：11所示；核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示。

14G2a-CAR-7×2b的氨基酸序列为SEQ ID NO：13所示；核苷酸序列为SEQ ID NO：14所示。

实施例2：构建嵌合抗原受体表达载体

(1)根据CAR基因的蛋白理论序列，优化CAR基因，使其能够在人细胞中高效表达，通过密码子优化及全基因合成方法制备CAR基因，在广州艾基生物技术有限公司进行全基因合成；

(2)用EcoRI和BamHI双酶切全基因合成的CAR基因和空载体pLVX-EF1-MCS，于37℃水浴中酶切30min后，使用1.5％的琼脂糖凝胶进行DNA电泳，然后使用天根的琼脂糖凝胶试剂盒纯化回收处理；

(3)pLVX-EF1-MCS载体与CAR基因片段的连接：

连接体系如表1所示：

表1

组件	添加量(μl)
		pLVX-EF1-MCS载体	2(50ng)
CAR基因	10(150ng)
		T4 DNA连接缓冲液	2
T4 DNA连接酶(NEB)	1
		dd H<sub>2</sub>O	5
总共	20

于22℃连接1h，连接产物直接转化Stbl3大肠杆菌感受态细胞，取200μl转化产物涂布氨苄抗性的LB平板，LB平板于37℃的培养箱中倒置培养过夜。次日早晨随机挑选3个单克隆进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送样测序。

其中，经典嵌合抗原受体慢病毒表达载体pLVX-14G2a-CAR的载体图谱见图2A；同时表达IL-7和CCR2b(7×2b)的嵌合抗原受体慢病毒表达载体pLVX-14G2a-CAR-7×2b的载体图谱见图2B。

实施例3：慢病毒包装

分别对实施例中的慢病毒表达载体进行慢病毒包装，采用四质粒系统，具体步骤如下：

(1)四质粒系统分别表达慢病毒载体包装所需的gag/pol、Rev、VSV-G及本发明构建的CAR表达载体：将四质粒进行瞬时转染293T细胞，DNA含量为2μg/mL；

(2)将上述质粒与PEI转染试剂混合，加入至一定体积的无血清的DMEM中，混匀后放置15分钟，将上述混合液加入至铺有293T细胞的细胞的T75培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱培养6h；

(3)6h后更换新鲜培养基，继续进行培养，并且加入10mM的丁酸钠溶液，72小时后收集慢病毒的培养上清进行纯化检测。

实施例4：CAR-T细胞的制备及鉴定

利用外周血淋巴细胞分离液Ficoll提取健康人外周血中单个核细胞(Peripheralblood mononuclear cell，PBMC)，按照T细胞与磁珠数量之比为1︰1加入α-CD3/α-CD28抗体包被的磁珠分离人T细胞，并置于含10％血清和100μg/mL IL-2的GT-T551 H3 Culturemedium(Takara)中培养。24h后，计数活化的人CD3+T细胞，于每个孔加入0.1×10⁶个T细胞和感染复数(Multiplicity of infection，MOI)＝10的病毒浓缩液，然后置于细胞培养箱中，4h后换液。每隔2-3d补充培养基。制备的CAR-T细胞分别命名为常规CAR-T细胞和7×2bCAR-T细胞，将未经病毒感染的人T细胞(Mock T)作为阴性对照。

取转导5d后的T细胞，用流式洗涤液(由50mL PBS加1mL胎牛血清配制而成)洗涤细胞，离心；细胞沉淀加入100μL FITC标记的protein L或anti-CCR2b(工作浓度均为3μg/mL)重悬细胞，4℃孵育60min，然后用流式洗涤液洗涤3次，用流式细胞仪检测T细胞表面CAR及CCR2b的表达情况，上清液用于检测IL-7的分泌水平。根据细胞因子ELISA检测试剂盒(Human IL-7ELISA KIT)要求，采用双抗体夹心法检测CAR-T细胞分泌的人IL-7细胞因子水平，底物显色后，使用酶标仪在450nm读取OD值，根据标准曲线计算各样品中相应的细胞因子浓度。

为进一步验证7×2b CAR-T细胞能否表达CCR2b及有效分泌IL-7，我们用FITC-protein L(1:100)检测CAR表达，APC anti-human CD192(CCR2)Antibody(biolegend；1:20)检测CCR2b的表达。结果显示，protein L检测的CAR的表达为T mock为3.62％，经典的14G2a-CAR-T为67.75％，同时表达IL-7和CCR2b的7×2bCAR-T为71.53％。7×2b CAR-T除了表达CAR外，还表达CCR2b分子(图3A)。使用不添加IL-7的H3培养基对T细胞进行培养，取第5天T细胞培养上清，用ELISA法检测上清中IL-7的浓度。结果表明，7×2b CAR-T能分泌大量的IL-7，未转导慢病毒的对照T细胞(T mock)和只转导经典CAR结构的CAR-T都没有检测到IL-7的分泌(图3B)。

实施例5：CAR-T细胞体外抗肿瘤活性测定

先前有报道GD2抗原在黑色素瘤和神经母细胞瘤中表达。我们用Anti-Ganglioside GD2 antibody[14.G2a](ab68456)检测了细胞系中GD2的表达情况。如Fig 2A所示，黑色素瘤细胞系中，除SK-MEL3细胞株外其余细胞株均高表达GD2抗原；而在神经母细胞瘤细胞系中，除BE2-M17及IMR-32细胞株外，其余细胞株均低表达GD2。见图4。

分别将未经转导的对照T细胞、经典CAR-T细胞及7×2b CAR-T细胞与不同GD2表达的肿瘤细胞共培养，CAR-T：肿瘤靶细胞＝效靶比10：1，在96孔板中共孵育12h后，用ELISA试剂盒方法检测上清液中IFN-γ的水平。常规CAR-T细胞组及7×2b CAR-T细胞组与GD2表达阳性的肿瘤细胞共孵育后均能分泌大量IFN-γ，而与GD2阴性细胞共孵育后几乎不分泌IFN-γ(见图5)，说明7×2b CAR-T细胞组与常规CAR-T细胞组能够被表达GD2的肿瘤细胞特异性激活,分泌炎症性细胞因子IFN-γ,并对GD2阳性的肿瘤细胞产生免疫毒性效应。另外，7×2b CAR-T细胞组与GD2表达阳性的肿瘤细胞共孵育后分泌的IFN-γ量高于常规CAR-T细胞组，但差异无统计学意义。

进一步荧光素酶法检测不同效靶比下CAR-T对三种肿瘤细胞的杀伤率(％)。SK-N-AS细胞、IMR-32细胞及A375细胞分别预先转导荧光素酶基因，构建稳定表达荧光素酶的细胞系。各组T细胞按不同E/T比例与三种肿瘤靶细胞共孵育4h。结果显示，7×2b CAR-T细胞组与常规CAR-T细胞组杀伤效果无明显区别，CAR-T细胞均杀伤GD2抗原阳性的IMR-32细胞及A375细胞，不杀伤GD2阴性的SK-N-AS细胞，表现出良好的特异性(图6)。

实施例6：IL-7和CCR2b的表达增强了CAR-T细胞的存活和迁移能力

CC族趋化因子2(CCL2)由多种肿瘤细胞分泌，是最早被发现且被广泛研究的趋化因子家族成员，对单核细胞、记忆T细胞等具有较强的趋化作用，因此我们在CAR结构中加入CCL2的受体CCR2b，以期改进CAR-T细胞的趋化性。ELISA检测各肿瘤细胞分泌CCL2的水平，结果见图7。

结果显示，293T、SK-MEL-3、SK-N-MC、IMR-32细胞几乎不分泌CCL2；C32、Malme-3M及SH-SY-5Y细胞分泌少量CCL2，而A375、SK-NS-AS、SK-N-SH、BE2M17细胞能分泌大量CCL2，其中SK-NS-AS分泌量最大。

细胞因子IL-7能有效促进T细胞的增殖能力，为进一步验证7×2b CAR-T功能，我们首先检查了CAR-T细胞增殖能力。如图8中A所示，从第2天开始，抗原激活后的7×2b CAR-T细胞增殖能力明显高于常规CAR-T细胞。当常规CAR-T细胞额外加入10ng/mL IL-7培养后，扩增能力有所提高，说明IL7可增强CAR-T细胞扩增。而7×2b CAR-T细胞中加入IL7培养后，细胞增殖情况无变化，说明7×2b CAR-T细胞自身分泌的IL7已足够满足扩增所需。

我们进一步分析CAR-T细胞上清液刺激T细胞扩增的效果，收集常规CAR-T或7×2bCAR-T细胞的培养上清，跟新鲜培养基(TAKARA GT-T551 H3无血清培养基+2％自体血清+300U/mL IL2)以1:1比例混合后，加入PBMC来源的T细胞(1×10⁶)中，每2-3天补充上述混合培养液，连续培养7天后，流式细胞仪检测T细胞CD3，CD4，CD8亚群的扩增比例。结果提示，常规CAR-T组及7×2b CAR-T组上清液均能使T细胞扩增，且7×2b CAR-T组扩增的CD3，CD4，CD8 T细胞数量均高于常规CAR-T组，且CD8T细胞扩增更多(图8中B)。

由于T细胞亚型对于CAR-T免疫治疗效果具有重要作用，因此我们独立制备培养8次上述三组T细胞，并通过流式细胞术比较T细胞的亚型分布。结果显示，在7×2b CAR-T组中，CD8+T细胞中T记忆干细胞(Tscm)(CAR+CD62L+CD45RA+CCR7+)的比例明显高于Mock T及常规CAR-T细胞组，差异有统计学意义(P<0.001)，说明7×2b CAR-T细胞持久性良好(图8中C)。

我们进一步评估肿瘤细胞上清CCL2趋化CAR-T细胞的能力，选取CCL2分泌量最大的SK-N-AS细胞作为研究对象，293T细胞作为阴性对照，细胞浓度为5×10⁶个/孔，于无血清培养基培养48h后，收集上清液，加入transwell下室中，其中一个组在无血清培养基中加入10ng/mL CCL2作为阳性对照；在上室中加入3×10⁴个Mock T、常规CAR-T、7×2b CAR-T细胞，分别培养24h后，用流式细胞仪计数迁移到下室的T细胞数量。结果显示，239T细胞上清液可促使少量的T细胞迁移到下室，但各种T细胞的迁移数量无明显差异。而加入SK-N-AS细胞培养上清的孔中，其迁移到下室的7×2b CAR-T细胞数量明显高于Mock T细胞及常规CAR-T细胞，差异有统计学意义(P<0.01)。在Transwell下室中加入10ng/mL CCL2后也能引起细胞的大量迁移(图8中D)。提示7×2b CAR-T细胞中的CCR2b受体可被SK-N-AS细胞分泌的CCL2所诱导，促使7×2b CAR-T细胞向含有CCL2的上清液趋化。

实施例7：7×2b CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性

我们进一步进行7×2b CAR-T细胞在体内抑制肿瘤的研究。我们选取几乎不分泌CCL2的IMR-32细胞作为研究细胞。构建稳转细胞系IMR-32-CCL2，使其表达CCL2基因及Luciferase标记。如图9所示，ELISA法检测得IMR-32-CCL2细胞培养上清液中含有高浓度的CCL2，提示所构建的稳转细胞系能分泌CCL2，说明构建成功。

裸鼠皮下注射稳转细胞系IMR-32-CCL2(5×10⁶cells/只)成瘤，10天后，分成Mock-T组、CAR-T组及7×2b CAR-T组，每组5只裸鼠，分别尾静脉回输Mock T、常规CAR-T及7×2b CAR-T细胞(5×10⁶cells/只)，并于第0天、7天、14天进行裸鼠活体成像。生物发光成像结果(图10中A)提示，与Mock T组及常规CAR-T组相比，7×2b CAR-T细胞能有效抑制肿瘤的生长，在第14天能使小鼠体内的肿瘤消退，相应的荧光强度定量分析如图10中的B所示。

此外，本研究抽取各组裸鼠尾静脉血，用流式BCA法检测人多种细胞因子含量。如图11所示，回输7×2b CAR-T细胞后，在第14天，IFN-γ、IL2和Gzms-B表达均升高，提示7×2b CAR-T细胞具有肿瘤杀伤作用。IL-7只在7×2b CAR-T组小鼠静脉血中存在，提示IL-7由7×2b CAR-T细胞所分泌。各组小鼠静脉血中均可测的CCL2，其水平在各小鼠见无明显差异，提示CCL-2是由接种的IMR-32-CCL2细胞所分泌。

人CD3的表达能反映回输的T细胞在小鼠脾脏的存在数量和浸润肿瘤的情况。在第7天时，我们取裸鼠脾脏和肿瘤块进行免疫组化检测，结果显示，7×2b CAR-T细胞在脾脏存在最多(图12)，说明其扩增能力较强，且7×2b CAR-T细胞比Mock T细胞及CAR-T细胞更有利于迁移至肿瘤部位。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州百暨基因科技有限公司

<120> 共表达IL-7和CCR2b的嵌合抗原受体融合蛋白及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 241

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

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485

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<213> artificial sequence

<400> 14

atggcactgc cagtcaccgc actgctgctg ccactcgcac tgctcctgca tgccgctaga 60

ccagacgtgg tgatgaccca gactcctctg agcctcccag tgtctctggg agatcaggct 120

tccataagtt gcagatccag ccagtcactc gtccacagga atggtaacac ctacctccac 180

tggtacctgc aaaagcctgg tcagtctcca aagctcctga ttcacaaggt ttccaataga 240

ttcagtggcg tgccagaccg gttttccggc tcagggagtg gcaccgactt cacactcaag 300

atcagtcggg tggaggccga ggatctcggc gtctactttt gctctcagtc cacacacgtt 360

ccacctctca cctttggagc tggtacaaag ctggagctga aaggaggagg cggctctggc 420

ggaggtggct ccggtggtgg cgggagcgag gttcagctgc tccagagcgg acctgagctc 480

gagaagccct ctgctagcgt gatgatctct tgtaaggctt ccggcagtag ctttaccggg 540

tacaacatga attgggttag gcagaacata gggaaatctc tggaatggat cggagctatc 600

gatccctatt acggtggcac tagttacaac caaaagttca agggacgcgc tactctcaca 660

gtcgataaga gctccagtac tgcatacatg cacctcaagt ctctcacatc cgaagatagc 720

gccgtgtact attgcgtcag cgggatggag tattgggggc agggaacctc cgttaccgtt 780

tcttctacaa ctactccagc tccaagacct ccaactcctg caccaaccat cgcttctcag 840

cctctgtctc tgagacccga ggcttgcagg ccagccgcag gaggagcagt tcatactcgc 900

ggcctcgatt tcgcatgtga tatctacatc tgggctccac tggcaggcac ctgtggagtt 960

ctgctgctga gcctggtgat cactctgtat tgtaagagag gtagaaagaa gctgctgtac 1020

atctttaagc agccctttat gcgccctgtt cagacaacac aggaggaaga tgggtgctca 1080

tgcaggttcc cagaggagga agagggaggg tgcgagctga gggtcaagtt ttctcggagc 1140

gctgacgcac ctgcctatca gcagggtcag aatcagctgt acaacgagct caatctcggc 1200

agacgcgagg agtacgacgt gctcgataaa cggcgcggtc gggaccctga aatgggaggt 1260

aagcctcgca ggaagaaccc acaggagggt ctgtacaacg aactgcagaa agacaagatg 1320

gctgaggcct acagcgagat tggcatgaag ggcgagagga ggagaggaaa aggccatgac 1380

ggcctgtatc agggtctgtc tactgcaact aaggatacct atgatgccct gcacatgcag 1440

gctctcccac ccagatccgg atccggacct ggcgctacta acttttctct cctgaagcaa 1500

gctggtgatg tcgaggaaaa ccctggacca atgtttcacg tctcctttcg gtatatcttt 1560

ggactgcctc cactcattct ggtcctgctg ccagtggcct cttcagattg tgacattgag 1620

ggtaaggatg gtaaacagta cgagtctgtc ctgatggtta gcattgacca gctcctcgac 1680

tctatgaaag agattggttc taattgcctg aataacgagt tcaacttctt caagaggcat 1740

atctgcgacg ccaataagga aggtatgttt ctcttcagag ctgctagaaa gctgcgccag 1800

ttcctgaaga tgaactccac aggcgatttt gacctccacc tgctcaaagt ctcagaggga 1860

actactattc tgctgaattg tactggccag gtgaagggca gaaagccagc agcactgggt 1920

gaggctcagc ccactaagtc actggaagag aacaagagcc tgaaagaaca aaagaaactc 1980

aacgacctgt gctttctcaa aagactgctc caggagatca aaacctgctg gaataagatt 2040

ctgatgggca ctaaggagca cggttcagca tctagaggag agggtagagg aagtctgctc 2100

acctgtggag atgttgaaga aaaccccggg cctatgctgt ccacaagtag gagccgcttc 2160

atcagaaata caaacgaatc tggagaagag gttaccacat tctttgacta cgattatggc 2220

gctccatgcc acaagtttga tgtcaaacag ataggtgctc aactcctgcc acctctgtat 2280

agcctcgttt tcatcttcgg cttcgtggga aatatgctcg tggtgctgat tctgattaac 2340

tgtaagaaac tgaaatgcct gaccgacatc tacctcctca acctcgccat tagcgacctg 2400

ctgtttctga ttaccctccc tctgtgggca catagtgctg caaatgaatg ggtgttcggt 2460

aacgctatgt gcaaactctt tacagggctc tatcacattg ggtactttgg cggtatcttc 2520

ttcatcatcc tgctcaccat agaccggtat ctggctatcg ttcatgccgt gttcgccctg 2580

aaggctagga cagtgacctt tggagttgtg acaagtgtta tcacttggct ggtcgcagtg 2640

ttcgccagtg tgccagggat catctttacc aaatgccaga aggaagattc agtgtacgtc 2700

tgcggaccat acttccctag aggttggaat aatttccaca ccataatgcg caacatcctg 2760

ggactcgtgc tgccactgct gatcatggtg atttgttact caggcatcct gaaaaccctg 2820

ctccgctgcc ggaacgagaa gaaacggcat agggcagtga gggttatatt cacaatcatg 2880

atcgtgtact ttctgttctg gacaccttac aacattgtga tactcctgaa cactttccaa 2940

gagttcttcg gtctgtctaa ctgtgaaagc accagccaac tcgaccaagc aacccaggtt 3000

actgagacac tgggcatgac acactgttgc atcaatccta tcatatacgc atttgttggc 3060

gagaaatttc ggagatacct ctcagtgttc ttcagaaaac acataactaa gaggttctgt 3120

aaacagtgcc ctgtcttcta tcgcgagaca gtggatggag tgacaagcac caatactcct 3180

tctaccggag aacaggaggt gtccgcagga ctgtaa 3216

Claims (12)

1.包含嵌合抗原受体的融合蛋白，其特征在于，包括依次串联的嵌合抗原受体、2A肽、IL-7、2A肽和CCR2b；所述IL-7的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述CCR2b的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示；所述嵌合抗原受体包含A）sc-Fv区，B）铰链区，C）跨膜域和D）胞内信号传导区；所述sc-Fv区用于靶向实体瘤的表面标志物，所述实体瘤为高表达CCL2肿瘤；所述铰链区选自CD8α的hinge区，所述跨膜域选自CD8α跨膜区，所述胞内信号传导区为4-1BB以及CD3ζ。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述2A肽为T2A，氨基酸序列如SEQ IDNO: 4所示。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ IDNO: 5所示。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述跨膜域的氨基酸序列为SEQ IDNO：6所示。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ IDNO：7所示；所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

6.根据权利要求3~5任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述sc-Fv区用于靶向GD2。

7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述sc-Fv区的氨基酸序列如SEQ IDNO: 1所示。

8.分离的核酸，其特征在于，表达得到权利要求1~7任一项所述的融合蛋白。

9.含有权利要求8所述核酸的载体。

10.T细胞，其含有权利要求8所述的核酸或权利要求9所述的载体。

11.组合物，其包含在药学上可接受的载体以及权利要求10所述的T细胞。

12.权利要求10所述的T细胞或权利要求11所述的组合物在制备用于预防和/或治疗实体瘤的药物中的应用。

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