CN106414502A - April变体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供变体增殖诱导配体(APRIL)，其具有比野生型APRIL高的对BCMA的结合亲和力；和/或与野生型APRIL相比改变的结合动力学，和/或比野生型APRIL高的BCMA：TACI(跨膜活化子和钙调节物和亲环素配体相互作用分子)结合比率，且在一个或多个以下位置包含突变：A125,V174,T175,M200,P201,S202,H203,D205和R206。

Description

APRIL变体
发明领域
本发明涉及变体增殖诱导配体(proliferation-inducing ligand)(APRIL)，其结合B细胞成熟抗原(BCMA)。包含此类变体APRIL的治疗剂在浆细胞疾病例如多发性骨髓瘤的治疗中有用。
发明背景
多发性骨髓瘤
多发性骨髓瘤(骨髓瘤)是浆细胞的骨髓恶性肿瘤。异常浆细胞的集合在骨髓中积累，在那里它们干扰正常血细胞的产生。骨髓瘤是美国第二普遍的血液恶性肿瘤(在非霍奇金淋巴瘤之后)，并构成血液恶性肿瘤的13％和所有癌症的1％。该疾病在遭受痛苦以及医疗费用方面是繁重的，因为其引起病理性骨折，对感染的易感性，以及死亡之前的肾和骨髓衰竭。
不像许多淋巴瘤，骨髓瘤目前是不能治愈的。用于淋巴瘤的标准化疗试剂对于骨髓瘤很大程度上无效。另外，由于浆细胞中CD20表达缺失，利妥昔单抗(Rituximab)无法用于针对该疾病。新的试剂例如硼替佐米(Bortezamib)和来那度胺(Lenolidomide)是部分有效的，但无法引起持久的缓解。
因此，对于用于骨髓瘤治疗的替代试剂存在需要，其具有增加的效率和改进的长期效果。
BCMA
BCMA，也称为TNFRSF17，是浆细胞特异性表面抗原，其仅在B谱系造血细胞或树突状细胞上表达。它是TNF受体家族的成员。BCMA不表达于未免疫的B细胞上，但在B细胞分化为浆母细胞(plasmablasts)期间上调，并在记忆B细胞，浆母细胞和骨髓浆细胞上明亮表达。BCMA还表达在大多数的初级骨髓瘤细胞上。除了在树突状细胞上检测的低水平mRNA外，BCMA表达似乎在其它组织上缺失，提示作为靶标用于多发性骨髓瘤的新疗法的潜力。
BCMA在相互连接的配体和受体的网络中发挥功能，其图示于图1中。两种其它的TNF受体与BCMA-跨膜活化子和钙调节物和亲环素配体相互作用分子(TACI，也称为TNFRSF13B)共享配体APRIL和BAFF，其存在于活化的T细胞和所有B细胞上；以及BAFF-R(TNFRSF13C)，其主要表达在B淋巴细胞上。多发性骨髓瘤细胞在一些病例中表达TACI而在大多数病例中表达BCMA，但从不表达BAFF-R。
天然配体APRIL作为BCMA靶向治疗或作为其部分潜在有用。然而，与TACI的交叉反应是潜在的问题，因为TACI存在于活化的T细胞和B细胞上，因此使用针对骨髓瘤细胞上的BCMA的治疗也可能导致非癌性B和T亚群的病理性耗竭。
APRIL在诊断应用以鉴定浆细胞，特别是在例如多发性骨髓瘤的状况中恶性浆细胞的存在中潜在有用。然而，再一次，APRIL也结合TACI的能力也意味着基于APRIL的诊断也鉴定一般性活化的T细胞和所有B细胞，意味着结果是不明确的。
因此，对于开发与这些缺点不相关的抗BCMA治疗和诊断存在需要。
附图简述
图1-APRIL和BAFF的配体特异性和功能分配
B细胞活化因子(BAFF，TNFSF13B)与BAFF受体(BAFF-R，TNFRSF13C)，B细胞膜抗原(BCMA，TNFRSF17)以及跨膜活化子和钙调节物和亲环素配体相互作用分子(TACI，TNFRSF13B)相互作用，而A增殖诱导配体(APRIL,TNFSF13)与BCMA，TACI和蛋白聚糖相互作用。BAFF-R活化影响外周B细胞存活，而BCMA可以影响浆细胞存活。APRIL与蛋白聚糖相互作用涉及含酸性硫酸化的二醇-萨米诺聚糖(glycol-saminoglycan)侧链的APRIL氨基末端。
图2-骨髓瘤上BCMA的表达数据
通过CD138+磁珠选择，从来自39个多发性骨髓瘤患者的骨髓样品分离了骨髓瘤细胞。使用缀合了PE的抗BCMA单克隆抗体J6MO(GSK)染色这些细胞。使用PE Quantibrite珠(Becton Dickenson)根据制造商的说明定量了抗原拷贝数。与标绘的范围，四分位数和中位数值一起呈现抗原拷贝数的盒须图(box and whiskers plot)。我们发现范围为348.7-4268.4个BCMA拷贝每细胞，其均值为1181和中位数为1084.9。
图3-嵌合抗原受体的标准设计
示出了嵌合抗原受体的典型形式。这些是I型跨膜蛋白。胞外域识别抗原。这是由抗体衍生的单链可变片段(scFv)组成，其附接于间隔域。这转而连接至跨膜域，其作用于将该分子锚定在膜中。最后，这连接至胞内域，其作用于传输细胞内信号至细胞。这由一个或多个信号转导域组成。
图4-生成的不同的基于APRIL的CAR的设计
如图3中所示的CAR设计经修饰使得scFv替代为修饰形式的APRIL以作为抗原结合域作用：APRIL经截短使得蛋白聚糖结合的氨基末端缺失。然后，将信号肽附接到截短的APRIL的氨基末端以将该蛋白引导到细胞表面。使用这一基于APRIL的结合域生成了三种CAR：A.在第一种CAR中，人CD8茎部域用作间隔域。B.在第二种CAR中，来自IgG1的铰链区用作间隔域。C.在第三种CAR中，人IgG1的铰链区，CH2和CH3域，其使用Hombach等人描述的pva/a突变修饰(2010Gene Ther.17:1206-1213)以降低Fc受体结合，用作间隔区(此后称为Fc-pvaa)。在所有的CAR中，这些间隔区与CD28跨膜域连接，然后连接至含有CD28，OX40和CD3-Zeta胞内域融合的三重胞内域(Pule等，Molecular therapy,2005:Volume 12；Issue5；Pages 933-41)。
图5-以上三种APRIL-CARS的注释的氨基酸序列
A：示出了CD8茎部APRIL CAR的注释的氨基酸序列；B：示出了基于APRIL IgG1铰链区的CAR的注释的氨基酸序列；C：示出了基于APRILFc-pvaa的CAR的注释的氨基酸序列。
图6-基于不同APRIL的CAR的表达和配体结合
A.在逆转录病毒基因载体中受体与标志物基因截短的CD34共表达。在转导的细胞上标志物基因的表达允许对转导的确认。B.使用基于APRIL的CAR(具有CD8茎部间隔区，IgG1铰链或Fc间隔区)转导T细胞。为了测试这些受体是否能够稳定的在细胞表面上表达，接着使用抗APRIL-生物素/链霉亲和素APC和抗CD34染色T细胞。进行了流式细胞分析。在三种CAR中，在细胞表面上等量地检测到了APRIL，提示它们等量地稳定表达。C.接着，测定了CAR识别TACI和BCMA的能力。使用重组BCMA或TACI融合至小鼠IgG2a Fc的融合连同抗小鼠二抗和抗CD34染色转导的T细胞。所有的三种受体形式表现出与BCMA和TACI两者的结合。令人惊讶的发现是与BCMA的结合似乎大于对TACI。进一步令人惊讶的发现是尽管所有三种CAR等量地表达，CD8茎部和IgG1铰链CAR似乎比具有Fc间隔区的CAR更好的识别BCMA和TACI。
图7-不同CAR构建体的功能
对基于三种不同的APRIL的CAR进行了功能性测定。非转导的(NT)或经转导以表达不同CAR的正常供体外周血T细胞。使用等量滴度的上清进行转导。接着，这些细胞CD56耗竭以去除非特异性NK活性并用作效应细胞。非转导的(NT)或经转导以表达BCMA或TACI的SupT1细胞用作靶标。示出的数据是来自5次独立实验的均值和标准偏差。A.使用铬释放测定了对表达BCMA和TACI的T细胞的特异性杀灭。B.也测定了干扰素-γ释放。靶标和效应细胞以1：1的比率共培养。24小时后，通过ELISA测定了上清中的干扰素-γ。C.通过计数再孵育6天的相同共培养物中的CAR T细胞，还测定了CAR T细胞的增殖/存活。所有的3种CAR指导针对表达BCMA和TACI的靶标的应答。对BCMA的应答比对TACI的大。
图8-APRIL CAR T细胞对原代骨髓瘤细胞的杀灭
由于大多数原代骨髓瘤细胞在它们的表面上表达低数量的BCMA分子，研究了尽管低密度的表达，对原代骨髓瘤细胞的杀灭是否发生。选择了三个病例，其代表了图2中描述的BCMA表达的范围：第一个具有暗表达(低于均值)；第二个病例具有中等表达(约为均值表达)和第三个具有明亮表达(高于均值表达)。对于三个病例的相对于同种型对照BCMA染色的柱状图示于左边。在该测定中，仅测试了CD8茎部和铰链APRIL CAR。在左边，示出了在骨髓瘤细胞和CAR T细胞1:1共培养后第3天和第6天，骨髓瘤细胞的存活与起始数量的比较。到第6天，>95％的骨髓瘤细胞被消除，包括具有暗BCMA表达的那些。
图9-用于开发对于BCMA靶向有用的新APRIL突变体的方法
A.候选APRIL分子展示于CD8茎部CAR形式中(但没有信号转导胞内域)并使用口蹄疫2A序列与CD34共表达。B.使用跨越编码密码子简并的寡核苷酸作为引物，通过剪接逐重叠PCR(splicing-by-overlap PCR)，随机化来自晶体学数据对于BCMA特异性或亲和力似乎重要的残基。将这些PCR产物接合至CD8茎部CAR形式中，并用于转化细菌。培养个体细菌菌落(每一个含有单一突变体)。从这些培养物分离质粒DNA并用于转染293T细胞。转染后，分别使用BCMA-Fc融合或TACI-Fc融合，连同标示物基因染色293T细胞。C.筛选期间估算了对BCMA和TACI的相对结合：计算了CD34染色相对于BCMA或TACI的荧光强度的斜率。接着，计算了相对于野生型APRIL的该斜率的比值。该值用作读出。
图10-APRIL突变体-单残基突变的总结
总结了与野生型APRIL比较，表现出改变的对BCMA-Fc和TACI-Fc结合的突变体。
图11-APRIL突变体-多残基突变的总结
将有希望的突变体与其它突变体杂交一次或多次并表征。这里示出了与野生型APRIL相比，改变的对BCMA-Fc和TACI-Fc的结合。
图12-一些选择的突变体的BCMA-FC,TACI-FC和APRIL结合
在表格中示出选择的突变体的流式细胞图。第一栏示出了BCMA-Fc染色相对于CD34染色。第二栏示出了TACI-Fc染色相对于CD34染色。第三栏示出了ARPIL染色相对于CD34染色。第一行示出了作为对照的野生型APRIL染色。第二行示出了单独CD34对照。
图13-共表达基于APRIL的CAR和截短的CD34的载体
将表达用于筛选的载体的细胞系与BCMA-Fc或TACI-Fc孵育并使用抗CD34和抗人Fc PE两者以及FITC缀合的mAb染色。接着通过流式细胞术研究该细胞。这示出了相对于标志物基因CD34，BCMA和TACI的结合的典型模式。
图14A-图示经典CAR的示意图
B：生成的基于不同APRIL的CAR的设计
将信号肽附接至截短的APRIL氨基末端。这融合至不同的间隔区：人IgG1的铰链区，CH2和CH3域，其使用Hombach等人描述的pva/a突变修饰(2010Gene Ther.17:1206-1213)以降低Fc受体结合；人CD8α的茎部；和IgG1的铰链区。这些间隔区连接至含有CD28跨膜域，OX40胞内域和CD3-Zeta胞内域的三重胞内域。
图15-不同CAR的表达
使用IRES序列，将受体与增强的蓝色荧光蛋白2(eBFP2)共表达。转导原代人T细胞并使用抗APRIL-生物素/链霉亲和素APC染色。进行流式细胞分析。相对APRIL检测示出了eBFP2信号。所有三种CAR稳定表达(使用3种不同的正常供体T细胞进行的3次独立实验的代表性实验)。
图16-铬释放测定
使用非转导的(NT)或经转导以表达不同间隔段CAR的正常供体外周血T细胞作为效应细胞，和非转导的(NT)或经转导以表达BCMA或TACI的SupT1细胞作为靶标。T细胞经CD56耗竭以降低NK活性。这是三次独立实验的代表并作为例子示出。累积杀灭数据示于图7A中。看到了对表达BCMA和TACI的T细胞的特异性杀灭而没有针对阴性靶细胞的活性。
图17-干扰素-gamma释放
通过ELISA测量了来自效应细胞和靶标的1:1的共培养物。CD8茎部构建物似乎具有最好的特异性，而铰链区构建物导致最多的干扰素释放，表现出一些非特异性活性。这是3次独立实验的代表并作为例子示出。累积干扰素-gamma释放数据示于图7B中。
图18-原代骨髓瘤细胞上BCMA表达的例子
示出了使用大鼠抗人BCMA mAb Vicky1染色的骨髓瘤样品的四个例子。第一组示出了在患有浆细胞白血病(一种不寻常的，晚期的，和侵袭形式的骨髓瘤)的患者中明亮的BCMA染色。其它三个病例是临床上和形态学上典型的骨髓瘤。它们表现出通常看到的中等或暗淡的染色。叠加了使用同种型对照的染色(灰色)。这些是图2中示出的累积BCMA表达数据的例子。
图19-具有V5表位标签的APRIL-CARS的氨基酸序列
A:dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ
B:dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ
C:dAPRIL-HNG-CD28OXZ
本图中的序列与图5中具有不同信号肽且没有V5标签的那些不同。
图20-筛选BCMA特异性APRIL突变体的总结
改变的对BCMA-Fc和TACI-Fc的结合。这是初始筛选数据小量制备物(miniprep)DNA的例子。分批筛选了突变体，其中通过与每个批次检查(check)的野生型APRIL比较表示APRIL突变体的平均MFI梯度，修正了跨实验变异。
图21-BCMA特异性APRIL突变体的序列比对
通过使用BCMA-Fc和TACI-Fc染色，筛选了随机诱变过程期间选择的小量制备物的表达。通过毛细管序列对具有潜在有用或信息表型的突变体测序，并与它们来源于的原始APRIL序列比对。本图中示出的是这样的筛选过程期间鉴定的突变体例子的比对。
图22-在靶向的残基处使用甘氨酸取代改变的BCMA和TACI结合的图表
图23-APRIL CAR T细胞的体内功能的证明
六只3月龄雌性NSG小鼠通过尾静脉注射接受1x107MM1.s.Fluc细胞。在第8天和第13天，小鼠使用生物发光成像。在第13天成像后，四只小鼠经由尾静脉注射接受5x106APRILCAR T细胞。小鼠在第13天和第18天成像。接受CAR T细胞的小鼠使用(*)标明。到第18天，在所有治疗的小鼠中可以观察到骨髓瘤的缓解，而在未治疗的小鼠中疾病进展。
图24A：设计的和构建的不同APRIL-BiTE版式
(1)OTK3scFv通过IgG1铰链连接至截短的APRIL；(2)OTK3scFv通过(SGGGGS)3接头连接至截短的APRIL；(3)OKT3scFv通过CD8茎部连接至截短的APRIL；(4)截短的APRIL通过IgG1铰链连接至OTK3scFv；(5)截短的APRIL通过(SGGGGS)3接头连接至OTK3scFv；(6)截短的APRIL通过CD8间隔区连接至OTK3scFv。构建体(3)和(6)应当通过CD8间隔区中的二硫键形成同二聚体。
B：经APRILiTE结合后细胞-细胞接触面上分子簇集的示意图。
图25-来自使用不同APRILiTE构建物转染的293T细胞的上清的Western印迹。使用抗APRIL完成印迹。
图26(a)-APRILiTES 1,3和6对野生型SupT1细胞和工程化以表达BCMA和TACI的SupT1细胞的结合。使用抗APRIL生物素/链霉亲和素APC染色。Aprilites表现出对WT SupT1细胞无结合但结合表达BCMA的细胞，且较少程度结合表达TACI的细胞。
图26(b)-APRILiTEs对野生型Jurkats的结合，但不结合没有T细胞受体的Jurkats。这揭示了APRILiTES结合T细胞受体。
图27-在空白培养基或3种APRILiTES的存在下，T细胞1:1非转导的或工程化的SupT1细胞的共培养。
图28-在APRILiTE 1，3和6的存在下共培养3天后观察到表达BCMA的SupT1细胞的完全缺失。
图29-原代骨髓瘤上BCMA表达的例子。示出了使用大鼠抗人BCMAmAb Vicky1染色的骨髓瘤样品的四个例子。第一组示出了在患有浆细胞白血病(一种不寻常的，晚期的，和侵袭形式的骨髓瘤)的患者中明亮的BCMA染色。其它三个病例是临床上和形态学上典型的骨髓瘤。它们表现出通常看到的中等或暗淡的染色。叠加了使用同种型对照的染色(灰色)。
图30-APRILiTEs的氨基酸序列
A:APRILiTE#01；B:APRILiTE#03；C:APRILiTE#06
图31-骨髓瘤样品的BCMA染色(覆盖同种型对照)。这些骨髓瘤细胞表达BCMA但以低水平表达。
图32-在第1天共培养物和对照的低功耗显微术。当在APRILiTE存在下与骨髓瘤细胞培养时可以看到清楚的T细胞结块/活化。
图33-使用单独骨髓瘤细胞，与外周血T细胞共培养，两者一起在APRILiTES#3和#6的不存在和存在下的干扰素-gamma释放
图34-培养物中骨髓瘤细胞的共培养的第6天的存活。在PBMC的存在下两种测试的APRILiTES都有效杀灭原代骨髓瘤细胞。
图35-测试BiTE形式的多种APRIL突变体的功能
在基于WT APRIL或多种变体的不同BiTES的存在下，将四种正常供体PBMCs与SupT1细胞，工程化以表达BCMA的SupT1细胞，工程化以表达TACI的SupT1细胞孵育，或单独孵育。24小时后测量干扰素-gamma水平。
发明简述
本发明人已经活化了开发的BCMA结合的配体APRIL的突变体，其比野生型APRIL具有较高的BCMA:TACI结合比率。这些突变体表现出对BCMA较大程度的特异性，所以提供对BCMA表达的细胞更有针对性的靶向，用于治疗和诊断应用。
因此，在本发明的第一个方面提供变体增殖诱导配体(APRIL)，其具有比野生型APRIL高的对BCMA的结合亲和力；和/或与野生型APRIL相比改变的结合动力学，和/或比野生型APRIL高的BCMA:TACI(跨膜活化子和钙调节物和亲环素配体相互作用分子)结合比率，且在一个或多个以下位置包含突变：A125,V174,T175,M200,P201,S202,H203,D205和R206。
该变体APRIL可以包含以下单突变中的一种：
A125T,
V174T,V174G,
T175H,T175S,T175G,
M200C,M200L,M200G,M200S,M200A,M200N,
P201V,P201A,P201G,P201R,P201Y,P201W,
S202G,S202F,S202D,S202V,S202P,D205P。
该变体APRIL可以包含在以下位置处的突变的组合：V174和T175；或V174和M200；或V174和S202；或V175和M200,或V175和S202；或D205和R206；或V174,T175和M200；或V174,T175和S202；或T175,D205和R206；或M200,D205和R206；或V174,T175,M200和S202；或T175,S202,D205和R206。
该变体APRIL可以包含以下突变组合的一种：
V174T和T175A；或V174T和M200G；或T174S和S202G；或
V174T和S202V；或V174G和S202G,或V174G和S202E；或
V174G和S202A；或V174G和S202G；或V174E和S202Y；或
T175A和S202E；或T175G和S202G；或T175G和S202V；或
T175A和S202P；或T175A和M200G；或T175S和S202G；或
S202V和H203N；或D205H和R206L；或D205P和R206K；或
D205P和R206N；或D205S和R206P；或D205R和R206G；或
D205P和R206I；或D205S和R206H；或
V174T,T175A和S202E；或V174T,T175A和M200G；或
T175A,D205P和R206N；或T175A,D205S和R206H；或
M200G,D205P和R206N；或M200G,D205S和R206H；或
V174T,T175A,M200G和S202E；或
T175A,S202E,D205P和R206N；或
T175A,S202E,D205S和R206H。
本发明还提供变体增殖诱导配体(APRIL)，其包含突变M200G。
本发明还提供嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合域，跨膜域和胞内域，其中所述抗原结合域包含根据本发明的第一个方面的任意变体APRIL。
本发明还提供双特异性T细胞接合子(engager)(BiTE)，其包含抗原结合域和T细胞活化域，其中所述抗原结合域包含根据本发明的第一个方面的变体APRIL。
在第二个方面，本发明提供编码根据本发明的第一个方面的变体APRIL，或包含此类变体APRIL的CAR或BiTE的核酸序列。
在第三个方面，本发明提供包含根据本发明的第二个方面的核酸序列的载体。
本发明还提供包含嵌合抗原受体的细胞，所述嵌合抗原受体包含根据本发明的第一个方面的变体APRIL。
本发明还提供用于制造此类细胞的方法，其包括使用根据本发明的第三个方面的载体转导或转染细胞，所述载体包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。
在第四个方面，本发明提供治疗剂，其包含根据本发明的第一个方面的变体APRIL，包含此类变体APRIL的CAR或BiTE，包含此类CAR的细胞，根据本发明的第二个方面的核酸，或根据本发明的第三个方面的载体。
还提供用于治疗浆细胞病症的方法，其包括向受试者施用根据本发明的第四个方面的治疗剂的步骤。
还提供根据本发明的第四个方面的治疗剂用于治疗浆细胞病症的用途。
还提供根据本发明的第四个方面的治疗剂在制造用于浆细胞病症的药物中的用途。
在第五个方面，本发明提供用于检测浆细胞的诊断试剂，其包含根据本发明的第一个方面的变体APRIL。
还提供根据本发明的第五个方面的诊断试剂用于诊断浆细胞病症。
还提供用于在受试者中体内诊断浆细胞病症的方法，其包括向所述受试者施用根据本发明的第五个方面的诊断试剂的步骤。
还提供用于在受试者中诊断浆细胞病症的方法，其包括体外将根据本发明的第五个方面的诊断试剂添加至来自所述受试者的样品的步骤。
所述样品可以是血液样品，或来源于血液样品。
所述浆细胞病症可以选自：浆细胞瘤，浆细胞白血病，多发性骨髓瘤，巨球蛋白血症，淀粉样变性，华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)，孤立性骨浆细胞瘤，髓外浆细胞瘤，骨硬化性骨髓瘤(osteosclerotic myeloma)，重链病，意义未明的单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance)和郁积型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma)。
所述浆细胞病症可以是多发性骨髓瘤。
发明详述
APRIL
本发明涉及变体增殖诱导配体(APRIL)，其具有比野生型APRIL高的对BCMA的结合亲和力；和/或与野生型APRIL相比改变的结合动力学，和/或比野生型APRIL高的BCMA:TACI(跨膜活化子和钙调节物和亲环素配体相互作用分子)结合比率。APRIL也称为TNFSF13。
术语“变体”与“突变体”或“工程化的”同义，并表示APRIL包含一个或多个突变，例如取代，添加或缺失。典型地，所述突变是取代。
APRIL的野生型序列在UNIPROT/O75888可获得，并在以下示出(SEQ ID No.1)。它不是经典的分泌蛋白，因为它没有信号肽。它具有弗林蛋白酶(furin)剪切位点“KQKKQK”(在SEQ ID No.1中下划线)。氨基末端参与蛋白聚糖结合。
Kimberley等(2009,FASEB J 23:1584-1595)是调查APRIL信号转导中，硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)相互作用的角色的研究。如下生成了点突变：
1)APRIL-三重(指定为WT-三重)，含有3个点突变：R146S,R189S,H220E；
2)APRIL-HSPG(指定为HSPG)，在疏水基序(QKQKK113Q)中含有三个点突变；
3)APRIL-HSPG-三重(指定为HSPG-三重)，其中在两者这些位点的所有6个氨基酸突变。
4)APRIL-R231A，能够结合HSPG但缺乏结合TACI或BCMA的能力的APRIL的形式(图2)，其在受体结合区中包含关键的精氨酸到丙氨酸突变。
除了APRIL-R231A之外的所有突变体保留了结合BCMA和TACI两者的能力。R231A突变体表现出结合两种受体的完全丧失，但保留了其结合HSPG的能力。
本发明的变体APRIL可以包含APRIL的BCMA结合位点。变体APRIL可以包含APRIL的片段，其包含BCMA结合位点。
变体APRIL可以包含截短的APRIL，其缺少该分子的氨基末端。截短的APRIL可以保留BCMA和TACI结合但丢失蛋白聚糖结合。截短的APRIL可以在弗林蛋白酶剪切位点处或仅紧接之后剪切。截短的APRIL可以缺少来自如SEQ ID No.1所示的野生型APRIL分子的氨基末端116个氨基酸。截短的APRIL可以包含如SEQ ID No.2所示的序列(其对应SEQ ID No.1加粗示出的部分)或其变体。这对应该分子对于BCMA和TACI结合需要的部分。
SEQ ID No.1
SEQ ID No.2
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
变体APRIL或变体截短的APRIL具有结合特性，其使得它比野生型APRIL更特异性。例如，在一些实施方案或应用中，变体APRIL比野生型APRIL对BCMA具有更高的亲和力。在一些实施方案中或应用中，变体APRIL具有比野生型APRIL不同的对BCMA的结合动力学。在一些应用中，变体APRIL具有比野生型APRIL更高的BCMA:TACI结合比率或其组合。突变体APRIL在一个或多个以下位置包含突变：A125,V174,T175,M200,P201,S202,H203,D205和R206(在SEQ ID No.1中以灰色示出)。
具体的，变体APRIL可以包含一种以下单突变(SEQ IDs 3至26)：
A125T,
V174T,V174G,
T175H,T175S,T175G,
M200C,M200L,M200G,M200S,M200A,M200N,
P201V,P201A,P201G,P201R,P201Y,P201W,
S202G,S202F,S202D,S202V,S202P,D205P。
已经确定了这些突变以可能有用于BCMA靶向的方式改变对BCMA和TACI的结合。对BCMA和TACI的相对结合示于表1中，图示于图10中，其中一些例子示于图12中。
表1
SEQ ID 3(A125T)
VLHLVPINTTSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 4(V174T)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 5(V174G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDGTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 6(T175H)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVHFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 7(T175S)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVSFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 8(T175G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVGFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 9(M200C)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSCPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 10(M200L)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSLPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 11(M200G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSGPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 12(M200S)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSSPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 13(M200A)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSAPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 14(M200N)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSNPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 15(P201V)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMVSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 16(P201A)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMASHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 17(P201G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMGSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 18(P201Y)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMYSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 19(P201R)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMRSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 20(P201W)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMWSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 21(S202G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPGHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 22(S202F)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPFHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 23(S202D)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPDHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 24(S202V)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPVHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 25(S202P)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPPHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 26(D205P)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPPRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
变体APRIL可以含有以下位置处的突变的组合：V174和T175；或V174和M200；或V174和S202；或V175和M200,或V175和S202；或D205和R206；或V174,T175和M200；或V174,T175和S202；或T175,D205和R206；或M200,D205和R206；或V174,T175,M200和S202；或T175,S202,D205和R206。
具体的，变体APRIL可以包含以下特定组合的突变的一种：
V174T和T175A；或V174T和M200G；或T174S和S202G；或
V174T和S202V；或V174G和S202G,或V174G和S202E；或
V174G和S202A；或V174G和S202G；或V174E和S202Y；或
T175A和S202E；或T175G和S202G；或T175G和S202V；或
T175A和S202P；或T175A和M200G；或T175S和S202G；或
S202V和H203N；或D205H和R206L；或D205P和R206K；或
D205P和R206N；或D205S和R206P；或D205R和R206G；或
D205P和R206I；或D205S和R206H；或
V174T,T175A和S202E；或V174T,T175A和M200G；或
T175A,D205P和R206N；或T175A,D205S和R206H；或
M200G,D205P和R206N；或M200G,D205S和R206H；或
V174T,T175A,M200G和S202E；或
T175A,S202E,D205P和R206N；或
T175A,S202E,D205S和R206H。
已经示出了这些特定组合的突变以可能有用于BCMA靶向的方式改变对BCMA和TACI的结合(见表2和图11)。
表2
SEQ ID 27(V174T,T175A)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTAFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 28(V174T,M200G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSGPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 29(T174S,S202G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDSTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPGHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 30(V174T,S202V)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPVHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 31(V174G,S202G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDGTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPGHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 32(V174G,S202E)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDGTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPEHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 33(V174G,S202A)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDGTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPAHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 34(V174G,S202G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDGTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPGHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 35(V174E,S202Y)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDETFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPYHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 36(T175A,S202E)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPEHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 37(T175G,S202G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVGFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPGHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 38(T175G,S202V)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVGFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPVHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 39(T175A,S202P)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPPHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 40(T175A,M200G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSGPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 41 T175S,S202G
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVSFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPGHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 42(S202V,H203N)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPVNPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 43(D205H,R206L)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPHLAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 44(D205P,R206K)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPPKAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 45(D205P,R206N)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPPNAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 46(D205S,R206P)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPSPAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 47(D205R,R206G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPRGAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 48(D205P,R206I)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPPIAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 49(D205S,R206H)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPSHAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 50(V174T,T175A,S202E)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTAFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPEHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 51(V174T,T175A,M200G)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTAFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSGPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 52(T175A,D205P,R206N)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPPNAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 53(T175A,D205S,R206H)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPSHAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 54(M200G,D205P,R206N)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSGPSHPPNAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 55(M200G,D205S,R206H)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSGPSHPSHAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 56(V174T,T175A,M200G,S202E)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDTAFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSGPEHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 57(T175A,S202E,D205P,R206N)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPEHPPNAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID 58(T175A,S202E,D205S,R206H)
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVAFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPEHPDHAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
T细胞活化
本发明还提供双特异性分子，其包含
(i)第一结构域，其结合B细胞成熟抗原(BCMA)并包含根据本发明的第一个方面的突变体APRIL；和
(ii)第二结构域，其能够活化T细胞。
本发明的分子的第二结构域能够活化T细胞。T细胞在细胞表面上具有T细胞受体(TCR)，当由抗原提呈细胞表面上的MHC分子提呈时，其识别抗原性肽。此类抗原识别导致免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAMs)被Src家族激酶磷酸化，引发进一步的激酶募集，其导致包括Ca2+释放的T细胞活化。
第二结构域可以通过引发与由TCR的抗原特异性识别引发的途径相同的途径引起T细胞活化。
分化群3(CD3)
本发明的双特异性分子的第二结构域可以结合CD3。
CD3是由四条不同链组成的蛋白复合物：CD3γ链，CD3δ链，以及两条CD3ε链。在T细胞表面上，CD3与T细胞受体(TCR)和ζ-链联合，以生成活化信号。TCR，ζ-链，和CD3分子一起组成了TCR复合物。
T细胞上CD3的集群，例如，通过固定化的抗CD3抗体，导致与T细胞受体参与的相似的T细胞活化，但不依赖于其克隆典型特异性。
由于其在调节T细胞活性中的中心作用，已经尝试了开发能够结合TCR/CD3的分子。该工作的大部分已经专注于对于人CD3抗原特异性的抗体的生成。
第二结构域可以包含抗体或其部分，其特异性结合CD3，例如OKT3,WT32,抗leu-4,UCHT-1,SPV-3TA,TR66,SPV-T3B或其亲和力调整的变体。
如本文所述使用的，“抗体”表示具有抗原结合位点的多肽，所述抗原结合位点包含至少一个互补决定区CDR。抗体可以包含3个CDR，并具有抗原结合位点，其与域抗体(dAb)的等同。该抗体可以包含6个CDR并具有抗原结合位点，其与经典抗体分子的等同。该多肽的剩余部分可以是任意序列，其提供对于抗原结合位点适合的支架，并以对于它结合至抗原适合的方式展示它。抗体可以是整个免疫球蛋白分子或其部分例如Fab，F(ab)’2，Fv，单链Fv(ScFv)片段，纳米抗体或单链可变域(其可以是VH或VL链，具有3个CDR)。抗体可以是双功能性抗体。抗体可以是非人的，嵌合的，人源化的或全人的。
或者，第二结构域可以包含CD3结合分子，其不来源于或基于免疫球蛋白。已经开发了一些“抗体模拟”设计的重复蛋白(DRP)以开发非抗体多肽的结合能力。此类分子包括锚蛋白(ankyrin)或富含亮氨酸的重复蛋白，例如DARPins(指定的锚蛋白重复蛋白)，Anticalins,Avimers和Versabodies。
本发明的双特异性分子的第二结构域可以包含全部或部分的单克隆抗体OKT3，其是由FDA批准的第一个单克隆抗体。OKT3可以从ATCC CRL 8001获得。该抗体的序列公开于US 7,381,803中。
第二结构域可以包含来自OKT3的一个或多个CDR。该第二结合域可以包含来自OKT3的重链的CDR3和/或来自OKT3的轻链的CDR3。第二结合域可以包含来自OKT3的所有6个CDR，如以下所示。
重链
CDR1:(SEQ ID No.59)KASGYTFTRYTMH
CDR2:(SEQ ID No.60)INPSRGYTNYNQKFKD
CDR3:(SEQ ID No.61)YYDDHYCLDY
轻链
CDR1:(SEQ ID No.62)SASSSVSYMN
CDR2:(SEQ ID No.63)RWIYDTSKLAS
CDR3:(SEQ ID No.64)QQWSSNPFT
第二结合域可以包含scFv，其包含来自OKT3的CDR序列。第二结合域可以包含如SEQ IN No.65所示的scFv序列，或具有至少80％序列同一性的其变体，其保留了结合CD3的能力。
SEQ ID No.65
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR
来自SEQ ID No.65的变体序列可以具有至少80,85,90,95,98或99％序列同一性并具有与SEQ ID No.65所示的序列等同的或改进的CD3结合和/或TCR活化能力。
双特异性T细胞接合子(BITES)
BiTES是新型的疗法，其使靶抗原接近T细胞受体(TCR)。最初的设计是两个scFvs通过接头连接，其中一个scFv靶向抗原而另一个活化T细胞。
通常，通过将抗CD3scFv经由短的五残基肽接头(GGGGS)融合至抗靶抗原scFv制成BiTEs。在1995年，在CHO细胞中产生了靶向EpCAM(表皮17-1A抗原)和人CD3的串联scFv。使用未刺激的人PBMC在不存在共信号传导的情况下，这一新型的双特异性抗体形式证明是在纳摩尔浓度针对多种细胞系是高度细胞毒性的。随后，创建了鼠抗CD19scFv和鼠抗CD3scFv之间的融合。该分子表现出突出的体外特性，包括有效的细胞毒性，不需要共信号传导(例如，通过CD28)。
Blinatumomab，鼠抗人CD3×抗人CD19是开发的第一种BiTE并是临床试验中最先进的BiTE。该候选物作为淋巴瘤和白血病的治疗正在研究。
MT110，抗人EpCAM×抗人CD3TaFv，是在临床试验中测试的第二种BiTE，并是第一种针对广谱实体瘤的。MT110的体外表征重现了使用MT103在肿瘤细胞系上得到的结果，从而证明了BiTE形式的普遍性。MT110目前在临床试验中用于肺，结直肠和胃肠道癌症患者。
本发明的双特异性分子基于BiTE样形式，但代替具有结合靶抗原的scFv或其它基于抗体的结合域，它具有基于BCMA的配体，也就是APRIL的结合域。
因为多种原因，与经典scFv-scFv形式相比，这一“APRILiTE”形式是有利的：(a)单域-scFv融合很可能比其它形式更稳定并更容易制造；(b)BCMA和APRIL在细胞表面上的组装要求每种结合伴侣的三聚。这诱导了T细胞活化域在蛋白水平的聚集，使得该蛋白高度特异性和高度有效的。
本发明的分子可以包含以下氨基酸序列，但在对应APRIL的序列的一部分中在一个以下位置处具有突变(参考SEQ ID No.1中示出的位置编号)：S202,P201,M200,T175,V174,A125,H203,D205和R206：
SEQ ID No.66
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID No.67
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
SEQ ID No.68
MGTSLLCWMALCLLGADHADGVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRS
本发明的分子可以包含如SEQ ID No.66，67或68所示的序列的变体，具有至少80，85，90，95，98或99％序列同一性，只要所述变体是如本发明的第一方面中定义的分子，即，双特异性分子，其包含：
(i)第一结构域，其结合B细胞成熟抗原(BCMA)，并包含增殖诱导配体(APRIL)的至少一部分；和
(ii)能够活化T细胞的第二结构域。
信号肽
本发明的双特异性分子可以包含信号肽以帮助其产生。所述信号肽可以导致所述双特异性分子被宿主细胞分泌，使得可以从所述宿主细胞的上清收获所述双特异性分子。
信号肽的核心可以含有一长段疏水性氨基酸，其具有形成单个α螺旋的倾向。所述信号肽可以以短的，带正电的氨基酸段开始，其帮助转位期间执行多肽正确的拓扑结构。在所述信号肽的末端，通常是由信号肽酶识别并切割的氨基酸段。信号肽可以在转位期间或转位完成后被切割，以生成游离的信号肽和成熟蛋白。接着，游离的信号肽被特定蛋白酶消化。
所述信号肽可以在所述分子的氨基末端。
所述双特异性分子可以具有以下通式：
信号肽-第一结构域-第二结构域。
所述信号肽可以包含SEQ ID No.69或70或具有5，4，3，2或1个氨基酸突变的其变体(插入，取代或添加)，只要所述信号肽仍然发挥功能以引起所述双功能分子的分泌。
SEQ ID No.69:METDTLLLWVLLLWVPGSTG
SEQ ID No.70:MGTSLLCWMALCLLGADHADG
SEQ ID No.69和70的信号肽是紧密并高度有效的，预测它们在末端甘氨酸之后产生约95％的切割，产生由信号肽酶的有效移除。
间隔区(Spacer)
本发明的分子可以包含间隔区序列以将第一结构域与第二结构域连接并在空间上分离两个结构域。
间隔区序列可以，例如，包含IgG1铰链区或CD8茎部。或者该接头可以包含替换接头序列，其具有与IgG1铰链区或CD8茎部相似的长度和/或结构域间隔特性。
所述间隔区可以是短间隔区，例如包含少于100，少于80，少于60或少于45个氨基酸的间隔区。所述间隔区可以是或包含IgG1铰链区或CD8茎部，或其修饰的版本。
这些接头的氨基酸序列的例子如下给出：
SEQ ID No.71(IgG1铰链区):AEPKSPDKTHTCPPCPKDPKSGGGGS
SEQ ID No.72(CD8茎部):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
CD8茎部可以具有序列，使得它可以诱导同二聚体的形成(见图2)。如果这不是期望的，可以从CD8茎部序列取代或移除一个或多个半胱氨酸残基。本发明的双特异性分子可以包括间隔区，其包含以下序列，或由以下序列组成：如SEQ ID No.72所示的序列或具有至少80，85，90，95，98或99％序列同一性的其变体，只要所述变体序列是引起第一和第二结构域近似等同间隔的分组和/或所述变体序列引起所述双特异性分子的同二聚化。
本发明的分子可以具有以下通式：
信号肽-第一结构域-间隔区-第二结构域
所述间隔区可以包含一个或多个接头基序以引入链断裂(chain-break)。链断裂分开两个不同的结构域，但允许在不同角度的取向。此类序列包括序列SDP，以及序列SGGGSDP(SEQ ID No.73)。
所述接头可以包含丝氨酸-甘氨酸接头，例如SGGGGS(SEQ ID No.74)。
嵌合抗原受体(CARS)
嵌合抗原受体，也称为嵌合T细胞受体，人工T细胞受体和嵌合免疫受体，是工程化的受体，其将任意特异性嫁接到免疫效应细胞上。在经典的CAR中(图3)，将单克隆抗体的特异性嫁接到T细胞或NK细胞上。可以使用例如逆转录病毒将编码CAR的核酸引入T细胞或NK细胞中。以这种方式，可以产生大量癌症特异性的T细胞或NK细胞用于过继细胞转移。该方法的早期临床研究已经表明在一些癌症中的效力，主要是当靶向全B细胞抗原CD19以治疗B细胞恶性肿瘤时。
CAR的靶抗原结合域通常经由间隔区和跨膜域融合至信号转导胞内域。当所述CAR结合靶抗原时，这导致活化信号传输至它在上面表达的T细胞。
所述CAR可以包含：
(i)变体APRIL，作为B细胞成熟抗原(BCMA)结合域作用；
(ii)可选的间隔区
(iii)跨膜域；和
(iv)胞内域。
所述胞内域可以包含胞内T细胞信号转导域或与其相关联。
本发明的CAR可以包含一个以下氨基酸序列，但在对应ARPIL的序列的一部分中在一个以下位置处具有突变(参考SEQ ID No.1中示出的位置编号)：S202,P201,M200,T175,V174,A125,H203,D205和R206：
SEQ ID No.75(dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.76(dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.77(dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.78(dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.79(dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.80(dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
本发明的分子可以包含如SEQ ID No.75,76,77,78,79或80所示的序列的变体，具有至少80，85，90，95，98或99％序列同一性的其变体，只要所述变体序列是本发明的第一个方面定义的分子，即CAR，其包含：
(i)BCMA结合域；
(ii)可选的间隔域
(iii)跨膜域；和
(iv)胞内域；
并在对应ARPIL的序列的一部分中在一个以下位置处具有突变(参考SEQ ID No.1中示出的位置编号)：S202,P201,M200,T175,V174,A125,H203,D205和R206。
可以通过程序例如BLAST容易地确定两个多肽序列之间的百分比同一性，其在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov可以免费获得。
核酸序列
本发明还提供编码如上文所定义的变体APRIL，包含变体APRIL的CAR，或包含变体APRIL的BiTE的核酸序列。
所述核酸可序列可以是RNA或DNA，其可以是双链或单链的。
编码APRIL-BiTEs的核酸序列示于SEQ ID No.81-83中。本发明的核酸序列可以编码如SEQ ID No.81,82或83所编码的氨基酸序列，但在对应ARPIL的序列的一部分中在一个以下位置处具有突变(参考SEQ ID No.1中示出的位置编号)：S202,P201,M200,T175,V174,A125,H203,D205和R206。
SEQ ID No.81(APRILiTE#01)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCCGAGCTGGCCAGACCAGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCCGGTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGGCCAGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCCAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCATCATGAGCGCCAGCCCAGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCCACTTCAGAGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCGGCATGGAGGCCGAGGATGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCTTCACCTTCGGCAGCGGCACCAAGCTGGAGATCAACCGGTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAAAGATCCCAAATCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTGA
SEQ ID No.82(APRILiTE#03)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCCGAGCTGGCCAGACCAGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCCGGTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGGCCAGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCCAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCATCATGAGCGCCAGCCCAGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCCACTTCAGAGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCGGCATGGAGGCCGAGGATGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCTTCACCTTCGGCAGCGGCACCAAGCTGGAGATCAACCGGTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTGA
SEQ ID No.83(APRILiTE#06)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATAGCGGTGGCGGTGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCCGAGCTGGCCAGACCAGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCCGGTACACCATGCACTGGGTGAAGCAGCGGCCAGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGAGGCTACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCTCTGGCGGAGGCGGCAGCCAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCATCATGAGCGCCAGCCCAGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCCACTTCAGAGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCGGCATGGAGGCCGAGGATGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCTTCACCTTCGGCAGCGGCACCAAGCTGGAGATCAACCGGTCGTGA
编码APRIL-CARs的核酸如SEQ ID No.84-89所示，本发明的核酸序列可以编码如SEQ ID No.84,85,86,87,88或89所编码的氨基酸序列，但在对应ARPIL的序列的一部分中在一个以下位置处具有突变(参考SEQ ID No.1中示出的位置编号)：S202,P201,M200,T175,V174,A125,H203,D205和R206。
SEQ ID No.84(dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCAGCGTGCTCCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTT
ATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No.85(dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCAGCGTGCTCCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCC
CTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No.86(dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCAGCACCGGCAGCGTGCTCCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No.87(dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGCAAGCCCATTCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGACTCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No.88(dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGCAAGCCCATTCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGACTCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No.89(dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCCGACCACGCCGACGGCAAGCCCATTCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGACTCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
所述核酸序列可以编码如SEQ ID No.81,82,83,84,85,86,87,88或89编码相同的氨基酸序列，包含上文提及的变异，但可以具有由于遗传密码子的简并性的不同的核酸序列。所述核酸序列可以具有与如SEQ ID No.81至89所示的序列至少80,85,90,95,98或99％的同一性，只要其编码如本发明的第一个方面所定义的分子。
所述核酸序列可以编码如SEQ ID No.81至89所编码的氨基酸序列，但具有以下单突变之一(SEQ ID No.22至45)：
A125T,
V174T,V174G,
T175H,T175S,T175G,
M200C,M200L,M200G,M200S,M200A,M200N,
P201V,P201A,P201G,P201R,P201Y,P201W,
S202G,S202F,S202D,S202V,S202P,D205P。
所述核酸序列可以编码如SEQ ID No.81至89所编码的氨基酸序列，但在以下位置处包含突变的组合：V174和T175；或V174和M200；或V174和S202；或V175和M200,或V175和S202；或D205和R206；或V174,T175和M200；或V174,T175和S202；或T175,D205和R206；或M200,D205和R206；或V174,T175,M200和S202；或T175,S202,D205和R206；
所述核酸序列可以编码如SEQ ID No.81至89所编码的氨基酸序列，但具有以下特定突变组合的一种：
V174T和T175A；或V174T和M200G；或T174S和S202G；或
V174T和S202V；或V174G和S202G,或V174G和S202E；或
V174G和S202A；或V174G和S202G；或V174E和S202Y；或
T175A和S202E；或T175G和S202G；或T175G和S202V；或
T175A和S202P；或T175A和M200G；或T175S和S202G；或
S202V和H203N；或D205H和R206L；或D205P和R206K；或
D205P和R206N；或D205S和R206P；或D205R和R206G；或
D205P和R206I；或D205S和R206H；或
V174T,T175A和S202E；或V174T,T175A和M200G；或
T175A,D205P和R206N；或T175A,D205S和R206H；或
M200G,D205P和R206N；或M200G,D205S和R206H；或
V174T,T175A,M200G和S202E；或
T175A,S202E,D205P和R206N；或
T175A,S202E,D205S和R206H。
载体
本发明还提供载体，其包含根据本发明的核酸序列。此类载体可以用于将所述核酸序列引入宿主细胞中，使得其表达并产生根据本发明的第一个方面的变体APRIL。
所述载体可以是，例如，质粒或合成的mRNA或病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。
所述载体可以能够转染或转导效应细胞。
细胞
本发明还提供宿主细胞，其包含根据本发明的核酸。
本发明还提供细胞，其包含根据本发明的CAR。
所述细胞可以是免疫细胞例如T细胞或天然杀伤(NK)细胞。其可以是原代细胞或来自细胞系的细胞。
本发明还提供细胞组合物，包含多种本发明的表达CAR的细胞。
本发明还提供用于制造根据本发明的细胞的方法，其包括使用本发明的载体转导或转染细胞的步骤，所述载体包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。
可以离体转染或转导所述细胞，然后再移植到相同的或不同的受试者中。
治疗剂
本发明提供治疗剂，其包含如上文所定义的变体APRIL，核酸，载体或表达CAR的细胞或BiTE。
所述治疗剂可以包含变体APRIL作为靶向部分，以将该试剂靶向至表达BCMA的细胞，例如浆细胞。所述治疗剂还可以包含功能域，其发挥治疗效果，例如通过直接作用于浆细胞上或募集免疫系统的其它细胞以作用于浆细胞上。
所述变体APRIL可以缀合至药物，例如细胞毒性药物。
所述变体APRIL可以是嵌合抗原受体，或双特异性T细胞接合子(BiTE)的一部分。
药物组合物
本发明还涉及药物组合物，其含有本发明的治疗剂连同药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂，以及可选的一种或多种进一步的药物活性多肽和/或化合物。此类制剂可以是，例如，以适合用于静脉内输注的形式。
治疗方法
本发明的治疗剂和药物组合物可以用于癌症疾病的治疗，特别是浆细胞病症或B细胞病症，其与提高的BCMA表达相关。
浆细胞病症包括浆细胞瘤，浆细胞白血病，多发性骨髓瘤，巨球蛋白血症，淀粉样变性，华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)，孤立性骨浆细胞瘤，髓外浆细胞瘤，骨硬化性骨髓瘤(POEMS综合症)和重链病以及临床上不清楚的意义未明的单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance)/郁积型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma)。
所述疾病可以是多发性骨髓瘤。
与升高的BCMA表达水平相关的B细胞病症的例子是CLL(慢性淋巴性白血病)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。本发明的双特异性结合试剂也可以用于自身免疫病的治疗像是系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化症(MS)和类风湿性关节炎(RA)。
本发明的方法可以用于治疗癌症疾病，特别是浆细胞病症或B细胞病症，其与提高的BCMA表达相关。
用于疾病治疗的方法涉及本发明的试剂或组合物的治疗用途。在这方面，所述试剂或组合物可以施用至患有存在的疾病或状况的受试者，以减轻，降低，或改善至少一种与所述疾病相关的症状和/或延缓，降低，或阻断所述疾病的进程。本发明的方法可以引起或促进T细胞介导的对表达BCMA的细胞的杀伤，例如浆细胞。
诊断
本发明还提供用于检测浆细胞的诊断试剂，其包含本发明的变体APRIL.
所述诊断试剂也可以包含可检测标签，例如放射性或荧光标签或染料。
所述诊断试剂可以用于诊断浆细胞病症。
可以在体内或体外进行诊断方法。在体内诊断方法中，将所述诊断试剂施用至受试者。
在体外方法中，将变体APRIL体外添加至来自受试者的样品。所述样品可以包含浆细胞。所述样品可以是或来源于血液样品，例如PBMC样品。
通过实施例的方式将进一步描述本发明，其是为了用于或协助本领域的普通技术人员实施本发明，且不意图以任意方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1-BCMA作为靶标用于骨髓瘤的表征
通过在来自多发性骨髓瘤患者的新鲜骨髓样品上进行CD138免疫磁性选择分离了原代骨髓瘤细胞，所述患者已知患有明显的疾病。这些细胞使用缀合至PE的BCMA特异性J6MO mAb(GSK)染色。同时，使用PE Quantibrite珠试剂盒(Becton Dickenson)根据制造商的说明，生成了具有已知数量的结合位点的标准珠。可以通过将来自骨髓瘤细胞的平均荧光强度与来源于该珠的标准曲线相关，得到骨髓瘤细胞上BCMA的拷贝数。发现骨髓瘤细胞表面上BCMA拷贝数的范围低：348.7-4268.4个BCMA拷贝每细胞，其中均值为1181而中位数为1084.9(图2)。这比例如CD18和GD2(CAR的经典靶标)显著低。也使用Vicky-1抗体(AbcamAb17323)确认了原代骨髓瘤细胞上BCMA表达的存在，其例子示于图18中。
实施例2-基于APRIL的CAR的设计和构建
APRIL以其天然形式是II型分泌蛋白。使用APRIL作为用于CAR的BCMA结合域要求将这一II型分泌蛋白转化为I型膜结合蛋白，并且要求此蛋白质是稳定的并且保留以此形式对BCMA的结合。为了生成候选分子，将APRIL的极端氨基末端缺失以去除对蛋白聚糖的结合。接着，添加信号肽以将新生蛋白引导到内质网和从而引导到细胞表面。另外，由于使用的间隔区的性质可以改变CAR的功能，测试了三种不同的间隔域：产生了基于APRIL的CAR，包含(1)改变的人IgG1间隔区以去除Fc结合基序；(ii)CD8茎部；和(iii)单独IgG1铰链区(图4中的图画和图5中的氨基酸序列，图19中也有氨基酸序列，其与图5中的序列不同在于具有不同的信号肽和V5表位标签)。在双顺反子逆转录病毒载体中表达这些CAR(图6A)使得可以共表达标志物蛋白-截短的CD34作为方便的标志物基因。
实施例3-基于APRIL的CAR的表达和功能
本研究的目的是测试已经构建的基于APRIL的CARs是否在细胞表面上表达以及APRIL是否已折叠形成天然蛋白。使用这些不同的CAR构建物转导T细胞，并使用市场上可买到的抗APRIL mAb染色，连同标志物基因的染色，并通过流式细胞术分析。该实验的结果示于图6B中，其中APRIL结合相对于标志物基因荧光作图。这些数据表明在这种形式，基于APRIL的CAR在细胞表面上表达，且APRIL充分折叠以被抗APRIL mAb识别。
接着，确定了APRIL以这种形式是否可以识别BCMA和TACI。以与小鼠IgG2a-Fc的融合物生成重组BCMA和TACI。将这些重组蛋白与转导的T细胞孵育。此后，洗涤细胞并使用荧光团缀合的抗小鼠抗体和缀合不同荧光团的用以检测标志物基因的抗体染色。通过流式细胞术分析细胞，且结果示于图6C中。不同的CARs能够结合BCMA和TACI两者。出人意料的，CARs能够比结合TACI更好地结合BCMA。另外，出人意料的具有CD8茎部或IgG1铰链间隔区的CARs能够比具有Fc间隔区的CAR更好地结合BCMA和TACI。
实施例4-基于APRIL的嵌合抗原受体针对表达BCMA的细胞是有活性的
使用不同的APRIL CARs转导来自正常供体的T细胞并针对野生型，或工程化以表达BCMA和TACI的SupT1细胞测试。使用了几种不同的测定以确定功能。进行了经典的铬释放测定。这里，使用51Cr标记靶细胞(SupT1细胞)并与效应细胞(转导的T细胞)以不同比率混合。通过计数共培养上清中的51Cr，确定靶细胞的裂解(图6A示出了累计数据，使用不同效应细胞:靶细胞比率的单次测定的示例数据示于图16中)。
另外，通过ELISA，测定了来自T细胞与SupT1细胞1:1培养的上清的干扰素-gamma(图6B示出了累计数据，单次测定的示例数据示于图17中)。还进行了与SupT1细胞共培养一周后，T细胞扩增的测量(图6C)。通过流式细胞术计数T细胞，使用计数珠校正。这些实验数据表明基于APRIL的CARs可以杀伤表达BCMA的靶标。此外，这些数据表明基于CA8茎部或IgG1铰链区的CAR表现比基于Fc-pvaa的CAR更好。
实施例5-基于APRIL的CAR能够杀伤原代骨髓瘤细胞
以上数据是令人鼓舞的，因为它们揭示了原则上，制造基于APRIL的CAR是可能的。然而，由于大多数原代骨髓瘤细胞在它们的表面上表达低数量的BCMA分子，研究了此类基于APRIL的CAR是否将引起对原代骨髓瘤细胞的杀伤，特别是在低密度表达的情况下。选择了三个病例，其代表了图2中描述的BCMA表达的范围：第一个具有暗表达(低于均值)；第二个病例具有中等表达(约为均值表达)和第三个具有明亮表达(高于均值表达)。图8在左边示出了对于所有三个病例相对于同种型对照的BCMA染色柱状图以例示BCMA表达。由于当比较具有不同间隔区的基于APRIL的CARs时已经确定了具有CD8茎部间隔区和IgG1铰链间隔区的CARs比Fc-pvaa间隔区的CAR表现更好，在本测定中，仅测试了CD8茎部和铰链APRILCARs。在左边，在骨髓瘤细胞和CAR T细胞1:1共培养后第3天和第6天示出了骨髓瘤细胞的存活与起始数量的比较。到第6天，>95％的骨髓瘤细胞被清除，包括具有暗淡BCMA表达的那些。表达暗淡BCMA的骨髓瘤细胞可以被APRIL CARs靶向，尽管比较高的表达者具有较慢的杀伤速度。
实施例6-系列“APRILITES”的构建
本发明人已经构建了一系列的双特异性接合子，其将来自OKT3的scFv连接至APRIL的胞外域，如图24A中所示。在这些分子的构建期间，做了几项设计考虑：(a)截短了结合蛋白聚糖的APRIL的氨基末端以防止非特异性结合；(b)在构建体4，5和6中，将信号肽附接到APRIL的成熟胞外域；(c)将OKT3改换形式为具有连接重链和轻链可变区的接头的scFv；(d)在scFv和APRIL之间尝试了多种不同的间隔区。
多种不同的形式如下：
OKT3scFv通过IgG1铰链区连接至截短的APRIL；
OKT3scFv通过(SGGGGS)3接头连接至截短的APRIL；
OKT3scFv通过CD8茎部连接至截短的APRIL；
截短的APRIL通过IgG1铰链区连接至OKT3scFv；
截短的APRIL通过(SGGGGS)3接头连接至OKT3scFv；和
截短的APRIL通过CD8茎部连接至OKT3scFv。
构建体(3)和(6)通过CD8间隔区中的二硫键形成同二聚体。
构建体(1)，(3)和(6)的氨基酸序列示于图30中。
实施例7-293T细胞中APRILiTEs的表达
使用编码上文列出的APRILiTE构建体的表达质粒转染293T细胞。在丙烯酰胺凝胶上跑来自293T细胞的上清并将蛋白转移至膜。接着，所述膜使用识别APRIL的抗体染色。结果示于图25中。在预期的分子量检测到了蛋白1，3和6。没有检测到蛋白2，4和5，提示这些构型不稳定。
实施例8-结合TCR和BCMA
接着研究了这些蛋白是否可以在一端结合T细胞受体(TCR)，而在另一端结合BCMA。来自转染的293T细胞的上清用于染色Jurkat T细胞和TCRαβ敲除的Jurkat T细胞克隆。这证明了APRILiTE结合TCR(图26b)。工程化以表达BCMA的SupT1细胞和工程化以表达TAC的SupT1细胞使用以上上清染色，使用二抗抗APRIL生物素接着是链霉亲合素PE。结果示于图26a中，发现APRILiTES 1，3和6结合BCMA，和以较少的程度结合TACI。
实施例9-稳定的APRILITE引发IFNγ释放
将正常供体T细胞以1:1与不同的SupT1s培养。使用的SupT1s是未转导的，工程化以表达BCMA或工程化以表达TACI的。结果示于图27中。发现T细胞仅在APRILiTE的存在下当暴露于使用BCMA或TACI工程化的SupT1细胞时释放IFNγ。对BCMA的反应大于对TACI的反应。
实施例10-稳定的APRILITE引发T细胞介导的对BCMA+靶标的杀伤
将T细胞以1:1与野生型SupT1细胞，表达BCMA的SupT1细胞和表达TACI的SupT1细胞培养，在不存在或存在APRILiTEs 1，3和6下。结果示于图28中。剩下的T细胞表示为在没有添加APRILiTE的条件下存在的SupT1细胞的比例。
实施例11-研究原代骨髓瘤细胞上的BCMA表达
四个不同的骨髓瘤样品使用大鼠抗人BCMA mAb Vicky1染色。结果示于图29中。在临床上和形态学上典型的骨髓瘤中(组2至4)看到了中等或暗淡的染色。
实施例12-研究APRILiTE对原代骨髓瘤细胞的效果
使用了具有已知的多发性BCMA+骨髓瘤的两位患者的诊断骨髓抽出物的剩下的材料。进行了基于CD138磁珠的选择以从抽出物中纯化骨髓瘤细胞。这些细胞在完全培养基中保持48小时并进行对BCMA的染色以检验他们实际上是BCMA阳性的。发现骨髓瘤细胞表达BCMA但以低水平表达(图31)。
接着，已经使用OKT3和CD28.2刺激的正常供体外周单核细胞经CD56耗竭以去除NK细胞。在APRILITE#03和#06不存在或存在下，进行了CD56耗竭的PBMCs和CD138选择的原代骨髓瘤细胞的1:1共培养。存在的材料不足以测试APRILITE#01。通过显微镜观察该共培养物。通过ELISA测量了释放到上清中的干扰素gamma。通过Annexin V/PI染色和珠计数对照的流式细胞术测量了骨髓瘤细胞的存活。
经共培养看到了清楚的凝集(Clear clumping)(T细胞活化的迹象)(见图32)。在APRILiTES的存在下在PBMCs与骨髓瘤细胞培养的条件下观察到了干扰素-gamma释放，尽量以比与SupT1.BCMA细胞共培养低的绝对量(图33)。在共培养6天后，当PBMCs与APRILiTE一起存在时也观察到了对骨髓瘤细胞的杀伤(图34)。
这些发现证明在原代骨髓瘤细胞的存在下，APRILiTEs以足以引起T细胞介导的对骨髓瘤细胞的杀伤的水平引起T细胞活化。
实施例13-体内测试APRILiTES
使用了huSCID模型：使用表达典型水平的BCMA的骨髓瘤细胞系异种移植NSG(nod-scid gamma,NOD-scid IL2Rgammanull)小鼠。这些品系经工程化以表达萤火虫萤光素酶以通过生物发光成像测量疾病。在伴随腹膜内施用APRILiTEs期间，通过尾静脉施用正常供体PBMCs。序贯测量以下项(1)APRILiTEs的血清水平；(2)人干扰素-gamma的血清水平；(3)通过流式细胞术的外周血T细胞扩增，移植和活化；(4)肿瘤的生物体发光测量。移除时，测量以下项：(1)通过骨髓组织学的肿瘤负荷；(2)通过骨髓、脾、血和淋巴结的流式细胞术的T细胞增殖和移植；和(3)剩下的组织总体地且免疫组织化学地检查任何毒性。
实施例14-特别适合于靶向BCMA的APRIL突变体的产生
目标是生成APRIL突变体，其结合可以更适合用于CAR。使用由Hymowitz等人，2004,The Journal of biological chemistry:Volume 280；Issue 8；Pages 7218-27描述的和来自RCSB保藏1XU1和1XU2的晶体学数据，选择了几个残基，其可以改变对BCMA的结合或相对于TACI增加对BCMA的特异性。
鉴定这些残基处具有有用特性的突变的策略概述于图31B中。使用跨用于突变的密码子简并的寡核苷酸，通过剪接逐重叠PCR生成了跨关键突变体随机化的突变体APRIL的文库。将这些文库接合至图31A中示出的支架，其呈递CD8茎部上的APRIL且共表达CD34和口蹄疫2A肽。来自该构建体的典型的表达示于图9中。这些接合产物转化到感受态细菌中，挑选单克隆，分别扩展和提取DNA并转染到293T细胞中。
接着将293T细胞分别与重组人BCMA-Fc或TACI-Fc孵育。接着洗涤细胞并使用Jackson多克隆抗Fc Alexafluor 488二次染色，且标志物基因使用抗CD34APC染色。以这种方式分批筛选APRIL突变体，其中在每个批次中野生型APRIL和仅CD34作为对照。将CD34+ve事件分为4个门，其编号如图31中所示。对于每个门计算Alexafluor 488均值荧光指数(MFI)并使用以下公式计算多个门的MFI之间的平均梯度：[(MFI.1-MFI.2)+(MFI.2-MFI.3)+(MFI.3-MFI.4)]/3(在图31C中说明)。
以这种方式，对于每个APRIL突变体对BCMA和TACI的结合计算平均MFI梯度。对于每个突变体，将BCMA和TACI结合的平均MFI梯度转化为每个批次中对APRIL WT对照结合的比率。通过毛细管测序，将给出潜在有用的突变体的质粒测序。
初始筛选的结果总结于表1中并在图10中说明。
接着通过与用于单突变概括的策略相似的策略，将突变体的类型组合，但编码突变体APRIL的质粒用作模板以引入进一步的突变。该工作的结果总结于表2中并在图11中说明。产生具有比野生型高得多的对BCMA亲和力的突变体是可能的：例如突变体D205R，R206G；我们能够生成具有与野生型APRIL相等的BCMA结合但对TACI无结合的突变体-例如突变体T175A，S202P。我们也能够生成具有比野生型较低的BCMA结合(其可以看似矛盾地改进对低密度抗原的识别)，但对TACI无结合的突变体-例如突变体V174T，T175A，M200G，S202E。
生成了来自最有希望的突变体的大规模的，高质量的质粒DNA，并进行了重复转染和表达数据。这些数据示于图12中。
实施例15-融合至Fc间隔区的分泌的且截短的APRIL识别BCMA和TACI
为了研究以CAR形式的截短的APRIL(即融合至跨膜域并锚定至细胞膜)是否能够结合BCMA和TACI，将基础CAR符合阅读框地与自切割的口蹄疫2A肽和截短的CD34(作为方便的标志物基因)工程化。建立了表达该构建体的稳定SUPT1细胞系。也生成了融合至人(和其它物种，未示出)IgFc域的分泌的，截短的BCMA和TACI并产生了重组蛋白。表明BCMA-Fc和TACI-Fc两者都结合工程化的SUPT1细胞系。发现仅表达CD34标志物基因的细胞结合BCMA-Fc和TACI-Fc(图9)。
实施例16-基于APRIL的嵌合抗原受体稳定表达于T细胞表面上
CAR间隔域可以改变灵敏度和特异性。生成了具有三种间隔域的三种版本的基于APRIL的CAR：(1)改变的人IgG1间隔区以去除Fc结合基序；(ii)CD8茎部；和(iii)单独IgG1铰链区(图14B)。使用这些不同的CARs转导原代人T细胞并使用商品化的抗APRIL mAb染色(图15)。
实施例17-基于APRIL的嵌合抗原受体针对表达同源靶标的细胞是有活性的
使用不同的APRIL CARs转导来自正常供体的T细胞并针对野生型，或工程化以表达BCMA和TACI的SupT1细胞测试。使用了几种不同的测定以确定功能。进行了经典的铬释放测定。这里，使用51Cr标记靶细胞(SupT1细胞)并以不同的比率与效应细胞(转导的T细胞)混合。通过计数共培养上清中的51Cr确定靶细胞的裂解(图16)。
另外，通过ELISA测定了来自T细胞与SupT1细胞1:1培养的上清的干扰素-gamma(图17)。
进行了与SupT1细胞共培养一周后，T细胞扩增的测量。通过流式细胞术计数T细胞，使用计数珠校正。初始数据(未示出)似乎提示基于CD8茎部的构建体比其它构建体导致更多的T细胞增殖。
实施例18-BCMA特异性APRIL突变体的产生
使用靶向特定密码子的简并引物(degenerate primers)产生了APRIL突变体。所述密码子通过APRIL-BCMA和APRIL-TACI结合的计算机模拟分析(in silico analysis)鉴定。从该分析，似乎参与TACI结合但不参与BCMA结合的残基作为目标。
产生了编码以下的质粒(i)细胞表面表达的CD34和(ii)APRIL突变体。接着，将所述质粒转化到细菌中，铺板，挑取单克隆，分别扩增和提取DNA并转染到293T细胞中。
将表达单APRIL突变体和CD34的T细胞各自等分为两份，并分别与0.1μg RND人BCMA-hFc或TACI-hFc嵌合体孵育。接着洗涤细胞并使用Jackson多克隆ahFc Alexa fluor488和BD aCD34APC二次染色。
以这种方式分批筛选APRIL突变体，其中在每个批次中野生型APRIL作为对照。将CD34+ve事件分为4个门，其编号如图9中所示。对于每个门计算Alexafluor 488均值荧光指数(MFI)并使用以下公式计算多个门的MFI之间的平均梯度：[(MFI.1-MFI.2)+(MFI.2-MFI.3)+(MFI.3-MFI.4)]/3。
以这种方式，对于每个APRIL突变体对BCMA和TACI的结合计算平均MFI梯度。对于每个突变体，将BCMA和TACI结合的平均MFI梯度转化为相关的筛选批次中对APRIL WT对照结合的比率。接着，表现出比野生型较高的BCMA:TACI结合比率的突变体测序。
结果示于图20中且关键突变体的序列示于图21中。
接着检查了靶残基处的甘氨酸取代的效果。结果示于图22中，表明APRILwt上的残基S202，P201，M200，T175，V174，A125，H203，D205和R206对于结合TACI比BCMA相对更重要。
实施例19-APRIL CAR T细胞的体内功能的证明
为了证明APRIL CAR T细胞的体内功能，在人/小鼠嵌合模型中测试了APRIL CART细胞。
MM1.s(ATCC CRL-2974)是一种人骨髓瘤细胞系，其表达中等水平的BCMA。本发明人工程化改造了该细胞系以表达萤火虫萤光素酶以派生细胞系MM1.s.FLuc。
NOD scid gamma(NSG:NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠是深度免疫抑制的小鼠，其能够移植几种人细胞系和人外周血淋巴细胞。三月龄的雌性NSG小鼠通过尾静脉注射接受1x107MM1.s.FLuc细胞，而没有任何修复疗法(preparative therapy)。通过系列生物体发光成像确定移植(图23)。在所有小鼠中观察到了强且增加的髓内移植。在第13天，通过尾静脉注射施用5x106APRIL-HNG-CD28OXZ CAR T细胞。进行系列生物体发光，其表明在所有处理的小鼠中MM1.s负荷的快速减少(图23)至完全缓解。通过流式细胞术和免疫组织化学确认了对CAR疗法的这一反应。
实施例20-测试BiTE形式的多种APRIL突变体的功能
将四个正常供体的PBMCs在基于WT ARPIL或多种突变体的不同BiTES的存在下与SupT1细胞，工程化以表达BCMA的SupT1细胞，工程化以表达TACI的SupT1细胞孵育或单独孵育。24小时后测量干扰素-gamma水平。结果示于图35中。突变体M200G表现出比野生型显著改善的BCMAvs TACI特异性。
以上说明书中提及的所有出版物通过提述并入本文。本发明描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域的技术人员将是显而易见的而不脱离本发明的范围和精神。尽管已经与特定的优选实施方案相关联描述本发明，应当理解作为要求保护的本发明不应当不适当地限于这些特定实施方案。的确，对于实现本发明所描述的模式的各种修改对于分子生物学，细胞免疫学或相关领域的技术人员是显而易见的，并旨在以下权利要求书的范围内。

Claims (21)

1.变体增殖诱导配体(APRIL)，其具有比野生型APRIL高的对BCMA的结合亲和力；和/或与野生型APRIL相比改变的结合动力学，和/或比野生型APRIL高的BCMA:TACI(跨膜活化子和钙调节物和亲环素配体相互作用分子)结合比率，且在一个或多个以下位置包含突变：A125,V174,T175,M200,P201,S202,H203,D205和R206。
2.根据权利要求1的变体APRIL，其包含以下单突变中的一种：
A125T,
V174T,V174G,
T175H,T175S,T175G,
M200C,M200L,M200G,M200S,M200A,M200N,
P201V,P201A,P201G,P201R,P201Y,P201W,
S202G,S202F,S202D,S202V,S202P,D205P。
3.根据权利要求1的变体APRIL，其包含在以下位置处的突变的组合：V174和T175；或V174和M200；或V174和S202；或V175和M200,或V175和S202；或D205和R206；或V174,T175和M200；或V174,T175和S202；或T175,D205和R206；或M200,D205和R206；或V174,T175,M200和S202；或T175,S202,D205和R206。
4.根据权利要求1的变体APRIL，其包含以下突变组合的一种：
V174T和T175A；或V174T和M200G；或T174S和S202G；或
V174T和S202V；或V174G和S202G,或V174G和S202E；或
V174G和S202A；或V174G和S202G；或V174E和S202Y；或
T175A和S202E；或T175G和S202G；或T175G和S202V；或
T175A和S202P；或T175A和M200G；或T175S和S202G；或
S202V和H203N；或D205H和R206L；或D205P和R206K；或
D205P和R206N；或D205S和R206P；或D205R和R206G；或
D205P和R206I；或D205S和R206H；或
V174T,T175A和S202E；或V174T,T175A和M200G；或
T175A,D205P和R206N；或T175A,D205S和R206H；或
M200G,D205P和R206N；或M200G,D205S和R206H；或
V174T,T175A,M200G和S202E；或
T175A,S202E,D205P和R206N；或
T175A,S202E,D205S和R206H。
5.变体增殖诱导配体(APRIL)，其包含突变M200G。
6.嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合域，跨膜域和胞内域，其中所述抗原结合域包含根据前述权利要求中任一项的变体APRIL。
7.双特异性T细胞接合子(engager)，其包含抗原结合域和T细胞活化域，其中所述抗原结合域包含根据权利要求1至5任一项的变体APRIL。
8.编码根据权利要求1至5任一项的变体APRIL，根据权利要求6的嵌合抗原受体，或根据权利要求7的双特异性T细胞接合子的核酸序列。
9.包含根据权利要求8的核酸序列的载体。
10.包含根据权利要求6的嵌合抗原受体的细胞。
11.用于制造根据权利要求10的细胞的方法，其包括使用根据权利要求9的载体转导或转染细胞的步骤，所述载体包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。
12.用于治疗浆细胞病症的方法，其包括向受试者施用根据权利要求10的细胞或根据权利要求7的双特异性T细胞接合子的步骤。
13.根据权利要求10的细胞或根据权利要求7的双特异性T细胞接合子用于治疗浆细胞病症的用途。
14.根据权利要求10的细胞或根据权利要求7的双特异性T细胞接合子在制造用于治疗浆细胞病症的药物中的用途。
15.用于检测浆细胞的诊断试剂，其包含根据权利要求1至5任一项的变体APRIL。
16.根据权利要求13的诊断试剂，用于诊断浆细胞病症。
17.用于在受试者中体内诊断浆细胞病症的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1至5任一项的变体APRIL的步骤。
18.用于在受试者中诊断浆细胞病症的方法，其包括体外将根据权利要求1至5任一项的变体APRIL添加至来自所述受试者的样品的步骤。
19.根据权利要求16的方法，其中所述样品是血液样品，或来源于血液样品。
20.根据权利要求10或15至17任一项的方法，其中所述浆细胞病症选自浆细胞瘤，浆细胞白血病，多发性骨髓瘤，巨球蛋白血症，淀粉样变性，华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)，孤立性骨浆细胞瘤，髓外浆细胞瘤，骨硬化性骨髓瘤，重链病，意义未明的单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance)和郁积型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma)。
21.根据权利要求18的方法，其中所述浆细胞病症是多发性骨髓瘤。
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