CN110225756A - 与用于穿透实体瘤的细胞系统相关的组合物和方法 - Google Patents

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R.J.迪恩斯
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Abstract

本披露提供了例如用于治疗癌症例如实体瘤的组合物和方法。在实施例中，这些组合物包含表达外源多肽的红系细胞，例如该外源多肽是促进该红系细胞向该实体瘤渗透的多肽。

Description

与用于穿透实体瘤的细胞系统相关的组合物和方法
相关申请
本申请要求2016年12月2日提交的美国序列号62/429,275的优先权，将该美国申请的内容通过引用以其全文并入本文。
背景技术
已经考虑将红细胞用作药物递送系统，例如以降解毒性代谢物或灭活异生物质，以及用于其他生物医学应用。
序列表
本申请含有一份已经以ASCII格式电子递交的序列表并且将该序列表通过引用以其全文特此结合。创建于2017年12月1日的所述ASCII副本被命名为R2081-7018WO_SL.txt，并且大小是220,057字节。
发明内容
本发明包括用于例如通过杀死癌细胞和/或通过刺激对癌症的免疫应答来治疗癌症的细胞系统。治疗实体瘤的一个挑战是治疗剂(尤其是大试剂如细胞疗法)有时不能穿透肿瘤块。本披露尤其显示，包含结合剂的红系细胞可递送至脉管系统，然后离开脉管系统并在实体瘤中累积。本披露还显示包含抗癌剂(例如，抗体)的红系细胞可以治疗仅对抗体具有抗性的癌症。因此，本披露提供例如与用于穿透实体瘤的细胞系统相关的组合物和方法。
在一些实施例中，细胞系统涉及表达一种或多种具有靶向功能、癌细胞杀伤功能、免疫检查点抑制和/或共刺激的外源多肽的红系细胞。
在一些方面，本披露提供了治疗患有癌症(例如，本文所述的癌症)的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予包含多个红系细胞(例如，本文所述的红系细胞)的制剂，每个红系细胞包含抗癌剂(例如，本文所述的抗癌剂)。抗癌剂可以是结合肿瘤部分的试剂(例如，多肽，例如结合细胞表面肿瘤部分的抗体)和/或具有抗肿瘤作用的试剂，例如免疫刺激细胞因子、肿瘤饥饿酶(例如天冬酰胺酶、甲硫氨酸γ裂解酶或丝氨酸脱氢酶)、细胞毒性小分子、放射性核素、化学治疗剂、毒素、小分子、蛋白质治疗剂、癌症疫苗、检查点调节剂、促细胞凋亡剂、补体依赖性细胞毒性(CDC)刺激剂或其片段或变体。在实施例中，免疫刺激细胞因子是1型细胞因子或2型细胞因子、或其片段或变体。在一些实施例中，一种试剂可具有肿瘤结合活性和抗肿瘤作用两者。在一些实施例中，多个红系细胞中的每个红系细胞具有肿瘤结合剂和抗肿瘤作用的不同试剂，并且所述试剂可以是分开的或连接的，例如，表达为单独的试剂(例如，单独的多肽)或如连接的序列，例如融合)。
在一些方面，本披露提供了治疗患有抗性(例如难治性或复发性)癌症的受试者的方法，该方法包括：
以足以治疗该癌症的量向该受试者给予(例如，给予至受试者的血流)包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞)的制剂，该多个细胞的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而治疗该癌症。
在一些方面，本披露提供了将试剂(例如结合剂)递送至受试者中的抗性(例如难治性或复发性)癌症的细胞的方法，该包括：
向该受试者给予(例如，给予至该受试者的血流)包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞)的制剂，该多个细胞的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而将该试剂递送到该抗性癌症的细胞中。
在一些方面，本披露还提供了治疗患有天然抗治疗性抗性癌症的受试者的方法，该方法包括：
以足以治疗该癌症的量向该受试者给予(例如，给予至该受试者的血流)包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞)的制剂，该多个细胞的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而治疗该癌症。
在一些方面，本披露还提供了将试剂(例如，结合剂)递送至受试者中的天然抗治疗性癌症的细胞中的方法，该方法包括：
向该受试者给予(例如，给予至该受试者的血流)包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞)的制剂，该多个细胞的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而将该试剂递送到该天然抗治疗性癌症的细胞中。
在一些方面，本披露还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，其中该癌症包含致癌突变(例如将细胞周期基因置于组成型启动子控制下的易位)，该方法包括：
以足以治疗该癌症的量向该受试者给予(例如，给予至该受试者的血流)包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞)的制剂，该多个细胞的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而治疗该癌症。
在一些方面，本披露还提供了将试剂(例如，结合剂)递送至受试者中的癌症的细胞的方法，其中该癌症包含致癌突变(例如将细胞周期基因置于组成型启动子控制下的易位)，该方法包括：
向该受试者给予(例如，给予至该受试者的血流)包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞)的制剂，该多个细胞的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而将该试剂递送到该癌症的细胞中。
在一些方面，本披露还提供了治疗患有B细胞癌的受试者或将试剂递送至受试者的癌性的B细胞的方法，其中该受试者已经对选自表1的抗体(例如，抗CD20抗体)产生抗性，该方法包括：
向该受试者给予包含融合蛋白的细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞)的制剂，该融合蛋白包含跨膜结构域和结合肿瘤抗原的结合结构域(例如，其中该结合结构域是抗CD20抗体结构域)，其中：
a)在工程化的红系细胞外表面上的融合蛋白的数量大于104，例如，大于2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104or大于105，例如，大于2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、5x106、或1x107(并任选地高达1x107或1x108)、或约1x104-3x104、1x104-5x104、1x104-7x104、1x104-9x104，或者
b)在工程化的红系细胞的外表面上的融合蛋白的数量或者结合结构域对于肿瘤抗原的亲和力足以诱导：
i)聚集肿瘤抗原，例如本文所述的抗原，例如，表1的抗原，例如，在靶癌细胞(例如，B细胞)的表面上的CD20分子，
ii)超聚集肿瘤抗原，例如，本文所述的抗原，例如，表1的抗原，例如，在靶癌细胞(例如，B细胞)表面上的CD20，
iii)交联肿瘤抗原，例如，本文所述的抗原，例如，表1的抗原，例如，在靶癌细胞(例如，B细胞)表面上的CD20，
iv)超交联肿瘤抗原，例如，本文所述的抗原，例如，表1的抗原，例如，在靶癌细胞(例如，B细胞)表面上的CD20，
v)靶癌细胞(例如，B细胞)的细胞凋亡，例如，半胱天冬酶非依赖性细胞凋亡和/或半胱天冬酶依赖性细胞凋亡，
vi)在靶癌细胞(例如，B细胞)中活化Src家族酪氨酸激酶、聚集Fas分子、抑制或下调BCL2、和/或抑制或下调BCLxl、或其组合，
从而治疗该受试者或将该试剂递送至该癌性B细胞。
在一些方面，本披露还提供了包含融合蛋白的细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞))，该融合蛋白包含跨膜结构域和结合肿瘤抗原的结合结构域(例如，其中该结合结构域是抗CD20抗体结构域或抗PD-L1抗体结构域)，其中：
a)在红系细胞外表面上的融合蛋白的数量大于104，例如，大于2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104or大于105，例如，大于2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、5x106、或1x107(并任选地高达1x107或1x108)、或约1x104-3x104、1x104-5x104、1x104-7x104、1x104-9x104，或者
b)红系细胞的外表面上的融合蛋白的数量或者结合结构域对于肿瘤抗原的亲和力足以诱导：
i)聚集肿瘤抗原，例如本文所述的抗原，例如，表1的抗原，例如，在靶癌细胞(例如，B细胞)的表面上的CD20分子，
ii)超聚集肿瘤抗原，例如，本文所述的抗原，例如，表1的抗原，例如，在靶癌细胞(例如，B细胞)表面上的CD20，
iii)交联肿瘤抗原，例如，本文所述的抗原，例如，表1的抗原，例如，在靶癌细胞(例如，B细胞)表面上的CD20，
iv)超交联肿瘤抗原，例如，本文所述的抗原，例如，表1的抗原，例如，在靶癌细胞(例如，B细胞)表面上的CD20，
v)靶癌细胞(例如，B细胞)的细胞凋亡，例如，半胱天冬酶非依赖性细胞凋亡和/或半胱天冬酶依赖性细胞凋亡，
vi)在靶癌细胞(例如，B细胞)中活化Src家族酪氨酸激酶、聚集Fas分子、抑制或下调BCL2、和/或抑制或下调BCLxl、或其组合。
在某些方面，本披露还提供了治疗受试者中血管化实体瘤的方法，该方法包括：
以足以治疗该血管化实体瘤的量向该受试者的血流给予包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞)的制剂，该多个细胞的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而治疗该血管化实体瘤。
在一些方面，本披露还提供了将试剂(例如，结合剂)递送至受试者中血管化实体瘤的肿瘤细胞的方法，该方法包括：
以足以将该结合剂递送至血管化实体瘤的肿瘤细胞的量向该受试者的血流给予包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞)的制剂，该多个细胞的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而将该试剂(例如，结合剂)递送至该血管化实体瘤的肿瘤细胞。
在一些方面，本披露还提供了将抗癌剂(例如，抗癌症抗体)在受试者的实体瘤处富集、或治疗该受试者中实体瘤的方法，该方法包括：
以足以治疗该实体瘤的量向该受试者的血流给予包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞))的制剂，该多个细胞的每个细胞包含该抗癌剂，
其中任选地，该抗癌剂包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而富集抗癌剂或治疗实体瘤。
在一些方面，本披露还提供了将抗癌剂(例如，抗癌症抗体)在受试者的实体瘤处富集、或治疗该受试者中实体瘤的方法，该方法包括：
以足以治疗该实体瘤的量向该受试者的血流给予包含多个细胞例如红系细胞的制剂，该多个细胞的每个细胞包含该抗癌剂，
其中该抗癌剂包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而富集抗癌剂或治疗实体瘤。
在某些方面，本披露进一步提供了将红系细胞递送至受试者中血管外位点的方法，该方法包括：
向该受试者的血流给予有效量的包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞))的制剂，该多个细胞中的每个细胞在其表面包含含有针对存在于该血管外位点的抗原(例如，肿瘤抗原)的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而将该红系细胞递送至该血管外位点。
在某些方面，本披露进一步提供了将试剂(例如，结合剂)递送至受试者中血管外位点的方法，该方法包括：
向该受试者的血流给予有效量的包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞))的制剂，该多个细胞中的每个细胞在其表面包含含有针对存在于该血管外位点的抗原(例如，肿瘤抗原)的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而将该试剂(例如，结合剂)递送至该血管外位点。
在一些方面，本披露还提供了治疗受试者中非血管化(例如，预血管化)实体瘤的方法，该方法包括：
以足以治疗该非血管化实体瘤的量向该受试者的血流给予包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞)的制剂，该多个细胞的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而治疗预血管化实体瘤。
在一些方面，本披露还提供了将试剂(例如，结合剂)递送至受试者中非血管化(例如，预血管化)实体瘤的肿瘤细胞的方法，该方法包括：
以足以将该结合剂递送至该非血管化实体瘤的肿瘤细胞的量向该受试者的血流给予包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞)的制剂，该多个细胞的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而将该试剂递送至该非血管化实体瘤的肿瘤细胞。
在一些方面，本披露还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：
向该受试者给予(例如，给予至该受试者的血流)包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞)的制剂，该多个细胞的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
其中在红系细胞表面上的结合剂的密度是充足的，使得在该结合剂与肿瘤细胞抗原结合后，肿瘤抗原在脂筏中累积，抗肿瘤细胞抗原的分布被充分扰动以改变肿瘤细胞中的信号传导，癌细胞表面上的肿瘤抗原的密度被显著改变，抗细胞凋亡途径(例如，BCL2和/或BCLxl途径)被抑制，癌细胞的细胞凋亡途径被诱导，癌细胞的坏死途径被诱导，或癌细胞的膜特性显著改变，或其组合，
从而治疗该癌症。
在一些方面，本披露还提供了细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞))，该细胞包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
其中在红系细胞表面上的结合剂的密度是充足的，使得在该结合剂与肿瘤细胞抗原结合后，肿瘤抗原在脂筏中累积，抗肿瘤细胞抗原的分布被充分扰动以改变肿瘤细胞中的信号传导，癌细胞表面上的肿瘤抗原的密度被显著改变，抗细胞凋亡途径(例如，BCL2和/或BCLxl途径)被抑制，癌细胞的细胞凋亡途径被诱导，癌细胞的坏死途径被诱导，或癌细胞的膜特性显著改变，或其组合
在一些方面，本披露还提供了治疗受试者中肿瘤(例如，血管化肿瘤)的方法，该方法包括：
向该受试者给予(例如，给予至该受试者的血流)红系细胞(例如，去核红系细胞)，该红系细胞例如在其表面包含，
干扰免疫检查点-配体(例如，PD-L1)功能性接合免疫检查点分子(例如PD1，例如在肿瘤浸润淋巴细胞上表达的免疫检查点分子)的能力的部分，
其中如果该部分表达为融合蛋白：
i)在该红系细胞表面上的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白具有相同的序列，
ii)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白具有相同的跨膜区，
iii)该融合蛋白不包括全长内源性膜蛋白，例如包含全长内源性膜蛋白的区段，该区段缺少该全长内源性膜蛋白的至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、200或500个氨基酸；
iv)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白彼此之间相差不超过1、2、3、4、5、10、20或50个氨基酸，
v)该部分缺乏分选酶转移特征(即，可以通过分选酶反应产生的序列)，如LPXTG，
vi)该部分存在于少于1、2、3、4或5个的序列不同的融合多肽上；
vii)该部分存在于单一融合多肽上；
viii)该融合蛋白在内源性跨膜蛋白和该部分的连接处不含有Gly-Gly；或
ix)该融合蛋白不含有Gly-Gly或在胞外区中不含有Gly-Gly，在跨膜区段的1、2、3、4、5、10、20、50或100个氨基酸内的胞外区中不含有Gly-Gly；或其组合，
从而治疗该肿瘤。
在一些方面，本披露还提供了例如在其表面上包含以下的红系细胞：
干扰免疫检查点-配体(例如，PD-L1)功能性接合免疫检查点分子(例如PD1，例如在肿瘤浸润淋巴细胞上表达的免疫检查点分子)的能力的部分，
其中如果该部分表达为融合蛋白：
i)在该红系细胞表面上的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白具有相同的序列，
ii)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白具有相同的跨膜区，
iii)该融合蛋白不包括全长内源性膜蛋白，例如包含全长内源性膜蛋白的区段，该区段缺少该全长内源性膜蛋白的至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、200或500个氨基酸；
iv)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白彼此之间相差不超过1、2、3、4、5、10、20或50个氨基酸，
v)该部分缺乏分选酶转移特征，
vi)该部分存在于少于1、2、3、4或5个的序列不同的融合多肽上；
vii)该部分存在于单一融合多肽上；
viii)该融合蛋白在内源性跨膜蛋白和该部分的连接处不含有Gly-Gly；或
ix)该融合蛋白不含有Gly-Gly或在胞外区中不含有Gly-Gly，在跨膜区段的1、2、3、4、5、10、20、50或100个氨基酸内的胞外区中不含有Gly-Gly，或其组合。
在一些方面，本披露还提供了治疗受试者中肿瘤(例如，血管化肿瘤)的方法，该方法包括：
向该受试者给予(例如，给予至该受试者的血流)红系细胞(例如，去核红系细胞)，该红系细胞例如在其表面包含刺激分子(例如，共刺激分子，例如，4-1BBL)或其片段，其中
该刺激分子(例如，共刺激分子)的水平或者该刺激分子(例如，共刺激分子)对于免疫细胞(例如，T细胞)上的结合配偶体的亲和力足以：诱导免疫细胞增殖，增加细胞因子(例如，IL2或IFN-γ)的分泌，或减少免疫细胞(例如肿瘤浸润淋巴细胞和/或T细胞)中活化诱导的细胞死亡，
其中如果该部分表达为融合蛋白：
i)在该红系细胞表面上的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白具有相同的序列，
ii)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白具有相同的跨膜区，
iii)该融合蛋白不包括全长内源性膜蛋白，例如包含全长内源性膜蛋白的区段，该区段缺少该全长内源性膜蛋白的至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、200或500个氨基酸；
iv)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白彼此之间相差不超过1、2、3、4、5、10、20或50个氨基酸，
v)该部分缺乏分选酶转移特征，
vi)该部分存在于少于1、2、3、4或5个的序列不同的融合多肽上；
vii)该部分存在于单一融合多肽上；
viii)该融合蛋白在内源性跨膜蛋白和该部分的连接处不含有Gly-Gly；或
ix)该融合蛋白不含有Gly-Gly，或该融合蛋白不含有Gly-Gly或在胞外区中不含有Gly-Gly，在跨膜区段的1、2、3、4、5、10、20、50或100个氨基酸内的胞外区中不含有Gly-Gly；或其组合，
从而治疗该肿瘤。
在一些方面，本披露还提供了红系细胞，该红系细胞例如在其表面包含刺激分子(例如，共刺激分子，例如，4-1BBL)或其片段，其中
该刺激分子(例如，共刺激分子)的水平或者该刺激分子(例如，共刺激分子)对于免疫细胞(例如，T细胞)上的结合配偶体的亲和力足以：诱导免疫细胞增殖，增加细胞因子(例如，IL2或IFN-γ)的分泌，或减少免疫细胞(例如肿瘤浸润淋巴细胞和/或T细胞)中活化诱导的细胞死亡，
其中如果该部分表达为融合蛋白：
i)在该红系细胞表面上的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白具有相同的序列，
ii)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白具有相同的跨膜区，
iii)该融合蛋白不包括全长内源性膜蛋白，例如包含全长内源性膜蛋白的区段，该区段缺少该全长内源性膜蛋白的至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、200或500个氨基酸；
iv)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合蛋白彼此之间相差不超过1、2、3、4、5、10、20或50个氨基酸，
v)该部分缺乏分选酶转移特征，
vi)该部分存在于少于1、2、3、4或5个的序列不同的融合多肽上；
vii)该部分存在于单一融合多肽上；
viii)该融合蛋白在内源性跨膜蛋白和该部分的连接处不含有Gly-Gly；
ix)该融合蛋白不含有Gly-Gly，或该融合蛋白不含有Gly-Gly或在胞外区中不含有Gly-Gly，在跨膜区段的1、2、3、4、5、10、20、50或100个氨基酸内的胞外区中不含有Gly-Gly；或其组合。
在一些方面，本披露还提供了刺激受试者中免疫效应细胞(例如，T细胞)的方法，该方法包括：
以足以刺激该免疫效应细胞的量向该受试者给予(例如，给予至受试者的血流)包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞))的制剂，该多个细胞的每个细胞在其表面包含含有共刺激分子(例如，4-1BB-L、OX40-L、GITR-L、或ICOS-L)的外源多肽，
从而刺激免该疫效应细胞。
在一些方面，本披露还提供了检测癌症(例如，实体瘤)的方法，该方法包括：
向该受试者给予(例如，给予至该受试者的血流)包含多个细胞(例如，红系细胞(例如，去核红系细胞)的制剂，该多个细胞的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
其中该多个细胞中的每个细胞还包含(例如，在细胞内部的细胞表面上)通过体内成像可检测的标记，例如放射性核素、荧光团、生物发光剂或MRI造影剂；并且
检测该标记，例如，通过MRI或放射性检测，
从而检测该癌症。
在一些方面，本披露还提供了包含以下的红系细胞(例如，去核红系细胞)：
在其表面的包含针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，以及
通过体内成像可检测的标记，例如放射性核素、荧光团、生物发光剂或MRI造影剂(例如，在细胞内部的细胞表面上)。
在一些方面，本披露提供了递送、呈现、或表达抗癌剂的方法，该方法包括提供本文所述的红系细胞。
在一些方面，本披露提供了生产本文所述的红系细胞(例如，去核红系细胞)的方法，该方法提供使红系细胞前体与编码外源多肽的一种或多种核酸进行接触，并将该细胞置于允许发生去核的条件下。
在一些方面，本披露提供了一种制剂，例如药物制剂，其包含本文所述的多个红系细胞(例如，去核红系细胞)，例如，至少108、109、1010、1011或1012个细胞。
以下实施例可适用于本文的任何方面，例如，上文中的任何组合物和方法。
在一些实施例中，试剂是治疗剂(例如，抗癌剂)或诊断剂(例如，可通过体内成像检测的标记)。在实施例中，试剂促进T细胞活化、刺激或增殖。在实施例中，试剂抑制癌细胞生长或存活。在实施例中，该试剂具有本文所述的试剂的两种或更多种特性。
在一些实施例中，细胞(例如，红系细胞)是自体的。在一些实施例中，细胞是同种异体的。
在一些实施例中，将细胞系统以一定的量并持续一定时间给予以有效地产生以下的一种(或多种，例如，2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种)：(a)减小的肿瘤尺寸、(b)降低的肿瘤生长速率、(c)增加的肿瘤细胞死亡、(d)降低的肿瘤进展、(e)减少的转移数量、(f)降低的转移速率、(g)减少的肿瘤复发、(h)增加的受试者存活、(i)增加的受试者无进展存活。
在实施例中，肿瘤是非转移性的。在实施例中，肿瘤是转移性的。在实施例中，肿瘤是血管化的和非转移性的。在实施例中，肿瘤包含一个或多个肿瘤血管。在实施例中，肿瘤(例如，血管化肿瘤)分泌VEGF或bFGF。在实施例中，肿瘤(例如，非血管化肿瘤)不产生VEGF或bFGF。在实施例中，肿瘤(例如，非血管化肿瘤)产生抗VEGF酶(如PGK)。在实施例中，肿瘤(例如，血管化肿瘤)不产生抗VEGF酶(如PGK)。在实施例中，肿瘤包含坏死区域。在实施例中，肿瘤表达促血管生成因子。
在实施例中，癌症表达本文的一种或多种肿瘤抗原，例如CD19、CD20、CD30、CD33、CD52、EGFR、GD2、HER2/neu、或VEGF、或其组合。
在实施例中，癌症是表1的癌症，并且癌症抗原是表1的癌症抗原。在实施例中，癌症是表3的癌症。在实施例中，癌症缺乏功能性半胱天冬酶细胞凋亡途径。在实施例中，实体瘤是表3的实体瘤。在实施例中，实体瘤是原发性肿瘤或转移性肿瘤病变。在实施例中，原发性肿瘤的位置是已知的。在实施例中，癌症不是原发性未知的癌症。
在实施例中，在给予后，红系细胞停留或持久存在于肿瘤的血管外区域、肿瘤的非坏死区域、或肿瘤的间质区域。在实施例中，在肿瘤中持续存在的红系细胞在肿瘤中停留至少3、6、或12小时或者1、2、3、4、5、6、7、14、21、或28天(例如，高达14或28天)。
在实施例中，在红系细胞表面上的结合剂的量是足够的，或者结合剂对于其靶的结合亲和力是足够的，或者将红系细胞以足够的量给予至受试者，使得：
a)肿瘤(或在肿瘤的1、2、5、10、20、50、100、200、500、或1000mm3区域)中的红系细胞与肿瘤细胞比率是至少约100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:20、1:50、或1:100(例如，高达约100:1或10:1)；
b)肿瘤中红系细胞与内源红系细胞的比率是至少2:1、5:1、10:1、20:1、50:1、100:1、1,000:1、或10,000:1(例如，高达100:1、1,000:1或10,000:1)；
c)诱导癌细胞表面蛋白质(例如，CD20)的超交联；
d)例如，在给予细胞后至少1小时或12小时或者1天、3天、5天、或7天或者在肿瘤中红系细胞聚集的峰时，肿瘤中停留的红系细胞与受试者的血流中红系细胞的数量的比率大于1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、20:1、或100:1(并且任选地高达10:1或100:1)；
e)停留在肿瘤(或在肿瘤的1、2、5、10、20、50、100、200、500、或1000mm3区域)中的结合剂(例如，抗体)的量是在其他方面相似的结合剂(例如，不与红系细胞相关联的抗体，例如，游离抗体)的量的至少2、3、4、5、10、20、50、或100倍更高(并且任选地高达10或100倍更高)；
f)与参照(例如，与缺乏结合剂的相似的红系细胞)相比，增加红系细胞在肿瘤中的持久存在性(例如，增加至少2、3、4、5、10、20、50、100、200、或500倍)；
g)与肿瘤外隔室相比，肿瘤中或肿瘤的1、2、5、10、20、50、100、200、500、或1000mm3区域的红系细胞的浓度是富集的，例如，发现受试者中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％(并任选地高达95％或99％)的红系细胞在肿瘤中，并且发现少于30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％的红系细胞在第二隔室(例如，肝)中；例如，在给予细胞至少1小时或12小时或者1天、3天、5天、或7天后或者在红系细胞在肿瘤中积累的峰时；
h)与肿瘤的远离血管的区域(例如，1、2、5、10、20、50、100、200、500、或1000mm3区域)相比，肿瘤的血管邻接的区域(例如，1、2、5、10、20、50、100、200、500、或1000mm3区域)中红系细胞的浓度是富集的，例如，发现受试者中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％(并任选地高达95％或99％)的红系细胞在血管邻接的区域中，并且发现少于30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％、或不可检测的量的红系细胞在远离血管的区域；例如，在给予细胞后至少1小时或12小时或者1天、3天、5天、或7天或者在肿瘤中红系细胞积累的峰时，其中任选地血管邻接的区域是在血管的0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、或5cm(例如，高达5cm)并且肿瘤的远离血管的区域远离血管2、3、4、5、或10cm；
j)循环中的红系细胞数量足够低，使得患者不会经历输注反应、严重的皮肤粘膜反应、乙型肝炎病毒再激活、或进展性多灶性白质脑病、或其组合；
k)在将红系细胞给予至受试者后，红系细胞在肿瘤位点存在和/或有活性至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月(并任选地高达6、9或12个月)；或
l)在红系细胞的存在下癌细胞经历细胞死亡(例如，ADCC或细胞凋亡，例如，半胱天冬酶非依赖性细胞凋亡)比在相同量的不由红系细胞组成的相同结合剂的存在下的癌细胞经历细胞死亡的速率更高，或其任何组合)。
在实施例中，循环中在表面上包含结合剂的红系细胞的数量足够低，使得患者不会经历与游离结合剂相关的副作用，例如，与红系细胞无关的抗体。在实施例中(例如，其中结合剂结合CD20，例如，其中结合剂包含利妥昔单抗或其片段或变体)，循环中的红系细胞数量足够低，使得患者不会经历输注反应、严重的皮肤粘膜反应、乙型肝炎病毒再激活、或进展性多灶性白质脑病、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合CD52，例如，其中结合剂包含阿仑单抗(alemtuzumab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历血球减少、输注反应、感染、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合HER2/neu，例如，其中结合剂包含阿多-曲妥单抗(ado-Trastuzumab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历肝毒性、肝衰竭、左心室射血分数减少、胚胎-胎儿毒性或、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合HER2/neu，例如，其中结合剂包含曲妥单抗或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历心肌病、输注反应、肺毒性、或胚胎-胎儿毒性、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合EGFR，例如，其中结合剂包含尼妥珠单抗或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历肌痛、困倦、定向障碍、血尿症、和升高的肝功能酶、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合EGFR，例如，其中结合剂包含西妥昔单抗或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历输注反应或心肺骤停、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合VEGF，例如，其中结合剂包含贝伐单抗或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历胃肠穿孔、手术和伤口愈合的并发症、出血、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合CD33，例如，其中结合剂包含吉妥珠单抗或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历包括过敏反应的超敏反应、输注反应、肺事件、肝毒性、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合CD20，例如，其中结合剂包含替伊莫单抗或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历严重的输注反应、血球减少(例如，延长的和/或严重的)、或严重的皮肤和皮肤黏膜反应、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合CD20，例如，其中结合剂包含托西莫单抗或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历严重的变态反应或血球减少(例如，延长的和/或严重的)、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合EGFR，例如，其中结合剂包含帕尼单抗或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历皮肤毒性。在实施例中(例如，其中结合剂结合CD20，例如，其中结合剂包含奥法木单抗或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历乙型肝炎病毒再激活、或进展性多灶性白质脑病、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合CTLA-4，例如，其中结合剂包含伊匹单抗或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历免疫介导的不良反应(例如，小肠结肠炎、肝炎、皮肤炎、神经病、或内分泌病)或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合CD30，例如，其中结合剂包含本妥昔单抗或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历进展性多灶性白质脑病、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合Her2，例如，其中结合剂包含帕妥珠单抗或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历左心室功能紊乱、或胚胎-胎儿毒性、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合CD20，例如，其中结合剂包含奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历乙型肝炎病毒再激活、或进展性多灶性白质脑病、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合PD-1，例如，其中结合剂包含纳武单抗或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历免疫介导的事件(例如，肺炎、结肠炎、肝炎、内分泌病、肾炎和肾功能不全、皮肤不良反应、或脑炎)、输注反应、同种异体HSCT的并发症、或胚胎-胎儿毒性、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合PD-1，例如，其中结合剂包含帕博利珠单抗(pembrolizumab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历免疫介导的不良反应(例如，结肠炎、肝炎、下垂体炎、肾炎、甲状腺机能亢进、甲状腺功能减退)或胚胎-胎儿毒性、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合PDGF-Rα，例如，其中结合剂包含奥拉木单抗(olaratumab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历输注相关的反应、或胚胎-胎儿毒性、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合PD-L1，例如，其中结合剂包含阿特朱单抗(atezolizumab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历免疫相关的不良反应(例如，肺炎、肝炎、结肠炎、内分泌病、肌无力综合征、重症肌无力、格林巴利综合症(Guillain-Barré)或脑膜脑炎、胰腺炎)、眼部炎性反应毒性、感染、输注反应、或胚胎-胎儿毒性、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合SLAMF7，例如，其中结合剂包含艾洛珠单抗(elotuzumab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历输注反应、感染、第二原发肿瘤、肝毒性、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合EGFR，例如，其中结合剂包含奈西妥木单抗(necitumumab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历心肺骤停、低镁血症、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合CD38，例如，其中结合剂包含达雷木单抗(daratumumab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历输注反应、粒细胞减少症、或血小板减少、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合VEGFR2，例如，其中结合剂包含雷姆赛卢单抗(ramucirumab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历出血、动脉血栓栓塞事件、高血压、输注相关的反应、胃肠穿孔、患有肝硬化患者临床恶化、可逆性后部白质脑病综合征、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合GD2，例如，其中结合剂包含地努妥昔单抗(dinutuximab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历输注反应、或神经病、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合CD19和CD3，例如，其中结合剂包含博纳吐单抗(blinatumomab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历细胞因子释放综合征、或神经性毒性、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合IL-6，例如，其中结合剂包含司妥昔单抗(siltuximab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历输注相关的反应、或胃肠穿孔、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合RANK配体，例如，其中结合剂包含地诺单抗(denosumab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历感染、皮肤反应、颌骨坏死、或骨更新的抑制、或其组合。在实施例中(例如，其中结合剂结合EpCAM和CD3，例如，其中结合剂包含卡妥索单抗(catumaxomab)或其片段或变体)，循环中红系细胞的量足够低使得患者不会经历腹部疼痛、发热、疲乏、或恶心/呕吐、或其组合。
在实施例中，将至少约1x1010、2x1010、5x1010、1x1011、2x1011、5x1011(例如，高达1x1012)的红系细胞给予至受试者。
在实施例中，包含结合剂的外源多肽进一步包含跨膜结构域。在实施例中，结合剂是抗体、抗体片段、单链抗体、scFv、或纳米抗体。在实施例中，结合剂包含抗CD20抗体或抗PL-L1抗体。
在实施例中，结合剂不是抗CD20抗体(除了利妥昔单抗)、或不是针对癌症干细胞抗原(例如，CD44、CD47、MET、EpCam、Her2、EGFR、或CD19)的抗体。在实施例中，结合剂不是针对CD133、CD3、CD、CD16、CD19、CD20、CD56、CD44、CD24、或CD133的抗体。
在实施例中，肿瘤细胞抗原是膜蛋白，例如膜磷蛋白。
在实施例中，红系细胞与非坏死肿瘤细胞的结合或相关比在其他方面相似的非遗传工程化的红系细胞(例如，具有低至少2、5、10、20、50、或100倍的Kd(并任选地低于高达10倍或100倍))具有更高的亲和力。
在实施例中，结合剂具有靶向活性(例如，导致红系细胞在肿瘤中以比缺乏结合剂的在其他方面相似的红细胞更高的水平积累)并且具有抗癌活性(例如，与未治疗的癌症相比导致癌细胞死亡、或减缓肿瘤生长)。在实施例中，结合剂具有靶向活性并不具有抗癌活性。
在实施例中，本文所述的抗癌剂包含免疫刺激细胞因子、肿瘤饥饿酶(例如天冬酰胺酶、蛋氨酸γ裂合酶、或丝氨酸脱氢酶)、细胞毒性小分子、放射性核素、化学治疗剂、毒素、小分子、蛋白质治疗剂、检查点调节剂、或促细胞凋亡剂、或其片段或变体的或多种。在实施例中，免疫刺激细胞因子是1型细胞因子或2型细胞因子、或其片段或变体。在实施例中，免疫刺激细胞因子是IL-2或IL-12、或其片段或变体。
在实施例中，红系细胞进一步包含第二试剂。在实施例中，第二试剂是抗癌剂(例如，第二抗癌剂)和/或第二外源多肽。在实施例中，第二试剂包含放射性核素、化学治疗剂、毒素、小分子、或蛋白质治疗剂。在实施例中，第二外源多肽包含检查点调节剂、促细胞凋亡剂、或肿瘤饥饿酶(例如，天冬酰胺酶)。在实施例中，第二试剂促进免疫功能，例如，第二试剂包含促炎细胞因子或免疫检查点分子的抑制剂。
在实施例中，与相同量的不被红系细胞包含的在其他方面相似的第二试剂相比，当被红系细胞包含时第二试剂显示出改善的安全性或降低的副作用。
在实施例中，结合剂或第二试剂增加针对癌细胞的免疫细胞活性、向癌症募集免疫细胞、增加免疫细胞活化、增加免疫细胞对免疫检查点抑制的抗性、或其组合。在实施例中，结合剂或第二试剂增加细胞凋亡。在实施例中，结合剂或第二试剂调节癌细胞中的离子水平，例如，增加或减少给定离子的水平，例如，增加钙水平。在实施例中，结合剂或第二试剂调节肿瘤细胞中的钙通道活性。
在一些实施例中，抗性癌症对抗体治疗剂(例如，表1的抗体治疗剂)具有抗性。在一些实施例中，抗性癌症对小分子药物具有抗性。在实施例中，小分子药物是化学治疗剂，例如，本文所述的化学治疗剂。在实施例中，例如，涉及抗性受试者的实施例，受试者未能对表1的抗体治疗作出反应。在实施例中，受试者对表1的抗体是初试的。在实施例中，抗体是抗CD20抗体，例如，利妥昔单抗。在实施例中，抗体结构域结合表1的靶。在实施例中，抗体结构域包含来自表2的CDR或VR，例如，使用Kabat或Chothia定义。
在实施例中，本文的方法(例如，治疗抗性癌症的方法)包括向受试者给予包含融合蛋白的红系细胞的制剂，该融合蛋白包含跨膜结构域和抗体结构域，其中该抗体结构域结合至肿瘤抗原。在实施例中，癌症已经变得对结合该抗原的抗体具有抗性。在实施例中，红系细胞包含的抗体结构域相对于癌症抗性的抗体治疗剂(例如，患者在用该抗体治疗剂治疗后复发)，具有相同的CDR或不同的CDR(具有不超过1、2、3、4或5个突变)。
在实施例中，例如，涉及抗性受试者的实施例，患者包含针对抗癌症抗体治疗剂的内源性抗体，例如，患者包含HAMA(人抗小鼠抗体)。在实施例中，与抗药物抗体(例如，HAMA)治疗前水平的相比，在用红系细胞处理后患者显示出降低水平的抗药物抗体。在实施例中，患者具有受损的半胱天冬酶依赖性细胞凋亡途径，例如，在半胱天冬酶(例如起始或执行半胱天冬酶)中具有突变。在实施例中，突变在半胱天冬酶2、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、或半胱天冬酶7中。在实施例中，至少一部分癌细胞不具有影响由抗癌症抗体治疗剂(例如，CD20或表1的靶)结合的蛋白质的突变(例如，缺失)。
在实施例中，例如，涉及治疗具有致癌突变的癌症的实施例，该方法包括获得癌症具有突变的知识。在实施例中，癌症包含第二致癌突变，例如，选自表8的突变。
在实施例中，外源多肽(例如，共刺激分子)的水平或者外源多肽对于免疫细胞(例如，T细胞)上的结合配偶体的亲和力足以诱导免疫细胞增殖。
在实施例中，红系细胞在0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％NaCl下具有小于50％细胞裂解的渗透脆性。在一些实施例中，去核红系细胞具有与野生型未处理的红系细胞(例如，网织红细胞)近似的直径或体积。在一些实施例中，红系细胞包含超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或超过10％的胎儿血红蛋白。在一些实施例中，去核红系细胞在其细胞膜的外叶上具有与野生型未处理的红系细胞大致相同的磷脂酰丝氨酸含量。
在实施例中，跨膜结构域包含血型糖蛋白A(GPA)、血型糖蛋白B、血型糖蛋白C、血型糖蛋白D、kell、带3、水通道蛋白1、glut 1、kidd抗原蛋白、或恒河猴抗原的跨膜部分。
在实施例中，在涉及免疫检查点调节的实施例中，该部分是表4的抗体，其是结合表4的抗原的抗体。在实施例中，该部分(例如，结合PD-L1的部分)是抗PD-L1抗体、或PD1的细胞外片段。在实施例中，该部分结合免疫检查点-配体(例如，PD-L1)。
在实施例中，本文的组合物包含(或者方法包括给予)缺乏外源多肽的红系细胞群体，例如，与包含外源多肽的多个红系细胞混合在一起。在实施例中，组合物包含(或者方法包含给予)以低于100％的效率转染或转导的细胞群。
在实施例中，例如，涉及共刺激分子的实施例，红系细胞进一步包含靶向部分，例如，包含结合部分的外源多肽。在实施例中，结合部分结合免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)上的抗原。在实施例中，结合部分结合肿瘤细胞上的或存在于肿瘤微环境中的抗原。在实施例中，共刺激分子是4-1BB-L、OX40-L、GITR-L、或ICOS-L。
在实施例中，刺激分子是刺激免疫效应细胞(例如，T细胞)的分子。在实施例中，刺激分子是主要刺激物或共刺激分子。在实施例中，红系细胞包含共刺激分子和主要刺激物。在其他实施例中，红系细胞包含共刺激分子并不包含主要刺激物。在实施例中，红系细胞包含共刺激分子并不包含外源主要刺激物。
在实施例中，例如，涉及抗性受试者的实施例，工程化的红系细胞外表面上的融合蛋白的数量或结合结构域对肿瘤抗原的亲和力足以诱导红系细胞与靶细胞(例如，B细胞)的结合。
在实施例中，全身或局部地给药。在实施例中，给予至血流，例如静脉内给药，例如静脉内输注。在实施例中，给予至肿瘤。
在一些实施例中，红系细胞在其表面包含：
i)第一共刺激分子(例如，本文所述的共刺激分子，例如，表5共刺激分子)，和
ii)第二共刺激分子(例如，表5的共刺激分子)，和
iii)任选地，第三或更多个共刺激分子(例如，表5的共刺激分子)，和
iv)任选地，结合肿瘤抗原的靶向部分。
在一些实施例中，红系细胞在其表面包含：
i)结合第一免疫检查点分子的第一试剂(例如，结合本文所述的免疫检查点分子的试剂，例如，结合表4的免疫检查点分子的试剂，例如，表4的抗体或其他结合剂)，和
ii)结合第二免疫检查点分子的第二试剂(例如，结合表4的免疫检查点分子的试剂，例如，表4的抗体或其他结合剂)，和
iii)任选地，结合免疫检查点分子(例如，表4的免疫检查点分子)的第三或更多个试剂，和
iv)任选地，结合肿瘤抗原的靶向部分。
在一些实施例中，红系细胞在其表面包含：
i)共刺激分子(例如，本文所述的共刺激分子，例如，表5的共刺激分子，例如，4-1BBL)，和
ii)结合免疫检查点分子的试剂(例如，结合本文所述的免疫检查点分子的试剂，例如，结合表4的免疫检查点分子的试剂，例如，表4的抗体或其他结合剂，例如，抗PD-L1)，和
iii)任选地，结合肿瘤抗原的靶向部分。
在实施例中，例如，涉及用于体内成像的红系细胞的实施例，红系细胞包含标记，该标记包含PET同位素，例如，11C、13N、15O、18F、64Cu、62Cu、124I、76Br、82Rb、89Zr、和68Ga。在实施例中，红系细胞包含标记，该标记包含生物发光剂，例如，荧光素酶。
在一些实施例中，一种或多种外源多肽由一种或多种未被去核红系细胞保留的外源核酸编码。
在实施例中，例如通过PBMC增殖测定，例如实例5的测定，红系细胞将T细胞增殖(例如，of CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、或CD4+ T细胞和CD8+ T细胞两者的增殖)例如促进至少约2、3、4、5、6、7、8、或10倍，例如，与缺乏红系细胞的样品相比。在实施例中，红系细胞促进CD8+ T细胞增殖比促进CD4+ T细胞增殖更强，例如，经相同的时间量(例如，5天)倍数增加差异为至少2倍或3倍。在一些实施例中，在测定开始时红系细胞与PMBC的比率为约1:1。
在实施例中，例如通过流式细胞术测定，例如实例5的测定，红系细胞促进细胞因子在T细胞的样品中分泌，例如，分泌IFNg、TNFa、或IFNg和TNFa两者。在实施例中，与用缺乏外源蛋白质的在其他方面相似的红系细胞处理的在其他方面相似的细胞样品相比，红系细胞促进细胞因子分泌增加，例如增加至少2、3、4或5倍。在一些实施例中，增加的细胞因子分泌至少部分是由于分泌细胞因子的细胞(例如，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、或CD4+ T细胞和CD8+ T细胞两者)的增殖增加。
在实施例中，将红系细胞(例如，表达抗PD-L1抗体的红系细胞)用于治疗表达PD-L1的癌症。在一些实施例中，将癌细胞以例如足以增加PD-L1在肿瘤细胞中表达的量暴露于IFN-γ，例如，内源性IFN-γ。在一些实施例中，肿瘤表达至少100,000、125,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、或400,000个拷贝的PD-L1/细胞。
在相关的方面，本披露提供了一种方法，该方法包括：
(a)获得(例如，直接地或间接地)关于肿瘤上PD-L1的存在或水平的信息，例如，肿瘤细胞每细胞具有的PD-L1多肽的数量是否大于参考值，例如，其中参考值是以下之一100,000、125,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、或400,000，并且
(b)响应于(a)，选择治疗或给予包含本文所述的多个去核红系细胞(例如，在其表面包含外源多肽的去核红系细胞，该外源多肽包含抗PD-L1结合剂，例如，抗PD-L1抗体)的治疗。
本文所述的细胞体系可以与不是该细胞体系的一部分的另一种(一种或多种)抗增殖、抗瘤或抗肿瘤药物或治疗组合使用。此类药物或治疗包括化学治疗药物，例如细胞毒性药物(例如，烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇)；癌症生长阻滞剂，诸如酪氨酸激酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂；T细胞疗法(例如，CAR-T细胞疗法)(参见，例如，PMID：26611350)、自然杀伤(NK)细胞免疫调节(参见，例如，PMID：26697006)；和癌症疫苗(PMID：26579225)；其他化学药物，如L-天冬酰胺酶和硼替佐米可以使用激素疗法(或抗激素疗法)，例如用于激素敏感性癌症。
本文所述的细胞体系还可以与用于癌症的非药物疗法如手术、放射疗法或冷冻疗法组合使用。在一些情况下，本发明的治疗方法可以包括本文所述的细胞体系与2种或更多种其他疗法或药物的组合，例如，可以用本文所述的细胞体系与手术或放射疗法和化学治疗混合物或生物制剂(例如抗HER2抗体)的组合治疗乳腺癌。
本披露考虑了任何一个或多个前述方面和/或实施例的所有组合，以及在具体实施方式和实例中提出的任何一个或多个实施例的组合。
虽然类似或等同于本文中描述的那些的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考(例如，序列数据库参考号)通过引用以其全文而结合。例如，本文提及的所有GenBank、Unigene、NCBI和Entrez序列(例如，在本文的任一表中)均通过引用而结合。除非另外指明，否则本文指定的序列登录号(包括本文任一表中)是指截至2016年12月2日的数据库条目。当一个基因或蛋白质参考多个序列登录号时，涵盖所有的序列变体。
附图说明
图1是显示用单独的抗CD20抗体、与第二抗同种型抗体“交联”的抗CD20抗体、对照RCT-HA-GPA(1:1或1:5)、或单独RCT-抗CD20(1:1或1:5)抗体处理的(从左至右)四种淋巴瘤细胞系中细胞凋亡水平的图。
图2是显示在存在或不存在半胱天冬酶依赖性细胞凋亡抑制剂(FMK)的情况下用RCT-抗CD20或对照RCT-HA-GPA处理的CD20+淋巴瘤细胞中细胞凋亡水平的图。1-1和1-5分别指示淋巴瘤细胞与RCT的1:1和1:5比率。
图3显示来自用RCT-抗CD20或对照RCT-HA-GPA治疗的小鼠的CD20+肿瘤的组织切片。H&E(苏木精和曙红)检测有核细胞、内源红血细胞、和工程化的红系细胞。CD31染色检测内皮血管。CD20染色检测Ramos肿瘤细胞。HA检测工程化的红系细胞。
图4是用对照RCT-HA-GPA(上图)或RCT-抗CD20(下图)治疗的小鼠中异种移植肿瘤的荧光图像。
图5是显示通过包含免疫检查点抑制剂的RCT拯救IL-2分泌的图。从左到右，这些条对应于Jurkat(单独的Jurkat细胞，基线)、Jurkat/Z138(与NHL Z138细胞共培养的Jurkat细胞，显示抑制IL-2分泌)、Jurkat/Z138/未转导的RCT(与NHL Z138细胞和未转导的对照红系细胞共培养的Jurkat细胞，显示未拯救IL-2分泌)、Jurkat/Z138/atezo-flag RCT(与NHL Z138细胞和RCT-抗PDL1共培养的Jurkat细胞，显示拯救IL-2分泌)、Jurkat/Z138/Ipi-flag RCT(与NHL Z138细胞和RCT-抗CTLA4共培养的Jurkat细胞，显示拯救IL-2分泌)。接下来的五个条显示在没有Jurkat细胞的情况下低IL-2分泌或没有IL-2分泌。当Jurkat细胞与未转导的对照红系细胞共培养时，最右边的条显示IL-2分泌的基线水平。
图6是显示标准抗原回忆测定中干扰素-γ分泌的图。最左边的条，仅PBMC显示基线干扰素-γ分泌。接下来的5个条，与指定数量的对照RCT-HA-GPA细胞共培养的PBMC显示与基线相似的干扰素γ分泌水平。最右边的5个条，与指定数量的RCT-抗PD1细胞共培养的PBMC显示出增加的干扰素γ分泌水平。
图7是显示当Jurkat细胞与RCT-41BBL或未转导的对照红系细胞共培养时，在RLU中测量的荧光素酶活性所示的NFκB活化的图。
图8是显示由具有4-1BB-L的指定拷贝数/细胞的红系细胞产生的NFκB活化的图。
图9是显示与抗-4-1BB抗体相比，由指定数量的4-1BB-L RCT细胞产生的NFκB活化的图。
图10是显示以下的一对图：与抗4-1BB抗体相比由4-1BB-L RCT细胞诱导的CD4+ T细胞的倍数变化(在左图中)，以及CD8+ T细胞的倍数变化(在右图中)。
图11是显示以下的一对图：与抗4-1BB抗体相比由4-1BB-L RCT细胞诱导的IFN-γ分泌(在左图中)，以及TNF-α分泌(在右图中)。
图12是显示用41BBL-RCT和未处理对照治疗的小鼠的肿瘤尺寸的时间过程。
图13显示了针对具有抗PD-L1抗体或同种型对照抗体的红系细胞，肿瘤中红系细胞与血管中红系细胞的比率。
图14是总结由指示的RCT诱导的信号传导、增殖、细胞因子水平、和抗原回忆活性的近似倍数变化水平的图表。
图15是定量指定的红系细胞与指定的肿瘤细胞的结合的图。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质或其部分，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“抗体”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施例中，抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。抗体的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、由抗体片段形成的多特异性抗体(如包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)、抗体的分离表位结合片段、大抗体、微抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv。
如本文所用，“组合疗法”或“组合地给予”意指将两种(或更多种)不同试剂或治疗给予受试者作为特定疾病或病症的治疗方案的一部分。治疗方案包括给予每种试剂使得独立试剂对受试者的效果重合的剂量和周期。在一些实施例中，同时或并行递送两种或更多种试剂，并且这些试剂可以共同配制。在其他实施例中，这两种或更多种试剂不是共同配制，而是作为规定方案的一部分按顺序施用。在一些实施例中，组合施用两种或更多种试剂或治疗，使得症状或与病症相关的其他参数的下降大于单独递送一种试剂或治疗或没有另一者的情况下将观察到的结果。两种治疗的效果可以部分累加、完全累加或大于累加(例如，协同)。顺序或基本上同时给予各治疗剂可以通过包括但不限于口服途径、静脉内途径、肌肉内途径以及通过粘膜组织直接吸收的任何适当途径来实现。这些治疗剂可以通过相同途径或通过不同途径给予。例如，可以通过静脉内注射施用该组合的第一治疗剂，同时可以经口施用该组合的第二治疗剂。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸序列。例如，一般来说，每个重链可变区中存在三个CDR(例如HCDRl、HCDR2、和HCDR3)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDRl、LCDR2、和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种来确定，包括以下中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学兴趣的蛋白质序列],”第5版.Public Health Service[公共卫生服务],NationalInstitutes of Health[国立卫生研究院],Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)，Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)，或其组合。
根据Kabat编号方案，在一些实施例中，将重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDRl)、50-65(HCDR2)、和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDRl)、50-56(LCDR2)、和89-97(LCDR3)。根据Chothia编号方案，在一些实施例中，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDRl)、52-56(HCDR2)、和95-102(HCDR3)；并将VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDRl)、50-52(LCDR2)、和91-96(LCDR3)。在组合的Kabat和Chothia编号方案中，在一些实施例中，CDR对应于为Kabat CDR、Chothia CDR或两者的一部分的氨基酸残基。例如，在一些实施例中，CDR对应于VH(例如哺乳动物VH，例如人VH)中的氨基酸残基26-35(HCDRl)、50-65(HCDR2)、和95-102(HCDR3)；和VL(例如哺乳动物VL，例如人VL)中的氨基酸残基24-34(LCDRl)、50-56(LCDR2)、和89-97(LCDR3)。
如本文所用，“去核的”是指缺乏核的细胞，例如，通过分化为成熟红细胞而失去其核的细胞。
在此使用的“红系细胞”包括有核血红细胞，血红细胞前体和去核血红细胞。例如，脐带血干细胞、CD34+细胞、造血干细胞(HSC)、脾集落形成(CFU-S)细胞、髓共同祖细胞(CMP)、胚细胞集落形成细胞、爆发集落形成单位红细胞(BFU-E)、巨核细胞红祖细胞(MEP)、红细胞菌落形成单位(CFU-E)、网织红细胞、红细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、多染性成红细胞、晚正成红细胞(orthochromatic normoblast)的任何是红系细胞。红系细胞的制剂可包括任何这些细胞或其组合。在一些实施例中，红系细胞是永生的或永生化的细胞。例如，永生化的成红细胞可以通过CD34+造血祖细胞的逆转录病毒转导产生，以表达Oct4、Sox2、Klf4、cMyc，并且抑制TP53(例如，如黄(Huang)等人，分子治疗(MolTher)2013，电子版先于印刷版9月3日中所述)。此外，这些细胞可以旨在用于自体使用或提供同种异体输注的来源。在一些实施例中，培养红系细胞。在实施例中，红系细胞是去核红血细胞。
如本文所用，术语“外源多肽”是指不由该类型的野生型细胞产生或以在野生型细胞中比在含有外源多肽的细胞中更低的含量存在的多肽。在一些实施例中，外源多肽是由被引入细胞的核酸编码的多肽，该核酸任选地不被该细胞保留。
如本文所用，肿瘤抗原的“超交联”是指使抗原聚集在细胞表面上或重新分布到去污剂不溶性细胞膜复合物或信号处理中心中。这种再分布可以进行测定，例如，描述在以下：Polyak等人,“Identification of a Cytoplasmic Region of CD20Required for ItsRedistribution to a Detergent-Insoluble Membrane Compartment[鉴定CD20重新分布于洗涤剂不溶性膜室所需的CD20细胞质区域]”The Journal of Immunology[免疫学杂志],1998年10月1日,第161卷第7期3242-3248。超交联不需要在肿瘤抗原之间形成共价键。
如本文所用，在关于试剂停留在肿瘤中提及的术语“停留”是指试剂存在于肿瘤边界内，例如，在肿瘤细胞之间或在肿瘤细胞内。
如本文所用，在关于试剂在肿瘤中持续存在提及的术语“持续存在”是指试剂在肿瘤中持续存在延长或预定时间。例如，如果试剂包含结合肿瘤抗原的靶向部分，则如果包含靶向部分的试剂在肿瘤中持续存在的时间长于缺乏靶向部分的在其他方面相似的试剂(例如，未修饰的红系细胞)，则该试剂在肿瘤中是持续存在。在实施例中，在肿瘤中持续存在的试剂在肿瘤中停留至少3、6、或12小时或者1、2、3、4、5、6、7、14、21、或28天(例如，高达14或28天)。
如本文所用，“抗性”肿瘤是指对治疗无应答的肿瘤。抗性肿瘤可以是用疗法治疗的受试者中的肿瘤，并且该肿瘤未显示对疗法的反应，例如，患者对与治疗是难治性的，例如，患者表现出进展性疾病，没有应答期。抗性肿瘤也可以是用疗法治疗的并且显示初始应答(例如，完全应答或部分应答)的受试者中的肿瘤，但随后患者停止表现出改善(例如，患者的应答进入平台期)或复发(例如，患者在应答期后表现出进展性疾病)。抗性肿瘤也可以是初试治疗抗性肿瘤，例如，未用疗法治疗的受试者中的肿瘤，例如，其中确定肿瘤对疗法具有抗性，例如，通过肿瘤测序使用肿瘤活组织检查的体外测定法。抗性肿瘤也可以是具有特征(例如突变或阶段)的肿瘤，这表明它对疗法具有抗性。在实施例中，由本文所述的红系细胞递送的治疗剂比自由递送(即不是通过本文所述的红系细胞)的相同治疗剂更有效并且有用于例如治疗对用该治疗剂治疗有抗性的肿瘤。在实施例中，给予由本文所述的红系细胞递送的治疗剂以治疗对用不同治疗剂治疗有抗性的肿瘤。在实施例中,在抗性前开始用红系细胞治疗。在实施例中，在抗性后开始用红系细胞治疗。
如本文所用，“难治性”肿瘤是指用疗法治疗但未显示出足够应答的肿瘤，例如，患者在治疗后被分类为无应答(NR)或进展性疾病(PD)。在实施例中，由本文所述的红系细胞递送的治疗剂比自由递送(即不是通过本文所述的红系细胞)的相同治疗剂更有效并且有用于例如治疗对该治疗剂是难治性的或变得对该治疗剂是难治性的肿瘤。在实施例中，给予由本文所述的红系细胞递送的治疗剂以治疗对不同治疗剂治疗是难治性或变得对不同治疗剂是难治性的肿瘤。在实施例中，在肿瘤变得难治的之前开始用红系细胞治疗。在实施例中，在肿瘤变得难治的之后开始用红系细胞治疗。
如本文所用，“复发的”肿瘤是指进入缓解(例如，在用疗法治疗后，例如完全应答或部分应答)然后进展的肿瘤。在实施例中，由本文所述的红系细胞递送的治疗剂比自由递送(即不是通过本文所述的红系细胞)的相同治疗剂更有效并且有用于例如治疗用该治疗剂治疗后复发的肿瘤。在实施例中，给予由本文所述的红系细胞递送的治疗剂以治疗用不同治疗剂治疗后复发的肿瘤。在实施例中，在缓解期间开始用红系细胞治疗。在实施例中,在复发后开始用红系细胞治疗。
如本文所用，“肿瘤”是指具有不受控制的生长的多个异常细胞。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换地使用，例如，这两个术语涵盖固体和液体，例如弥漫性或循环性肿瘤。在实施例中，癌症或肿瘤是癌变前的。在实施例中，癌症或肿瘤是恶性的。本文描述了各种癌症的实例，并且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
术语“肿瘤细胞”和“癌细胞”在本文中可互换使用是指细胞或肿瘤或癌症。
本文中与“癌症抗原”可互换使用的“肿瘤抗原”是指肿瘤细胞所包含的部分(例如，肽或蛋白质)，例如存在于肿瘤表面上的部分。在实施例中，肿瘤抗原也存在于一种或多种类型的非癌细胞上(例如，患有癌症的受试者中的非癌细胞)，例如，以相同水平或不同水平。在实施例中，肿瘤抗原在肿瘤细胞上的平均数高于在非肿瘤细胞上的平均数。在实施例中，抗原是存在于肿瘤细胞上的多肽或其部分。抗原可以被结合配偶体(例如，抗体或非抗体结合配偶体)结合。
如本文所用，术语多肽的“变体”是指与该多肽相比具有至少一个序列差异的多肽，例如一个或多个取代、插入或缺失。在一些实施例中，变体与该多肽具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体包括片段。在一些实施例中，与全长多肽相比，片段在N-末端、C-末端或二者(各自独立地)上缺少多达1、2、3、4、5、10、20或100个氨基酸。
如本文所用，关于肿瘤，“血管化的”是指已诱导血管生成和/或包含肿瘤血管的肿瘤。肿瘤血管与正常血管不同，并且可以通过组织学来区分，例如通过不规则的形状和扩张；并且可以包含肿瘤细胞和内皮细胞。
外源蛋白质
一种或多种外源蛋白质可具有真核细胞(例如哺乳动物细胞，例如人细胞)的翻译后修饰特征。在一些实施例中，一种或多种外源蛋白质是糖基化的、磷酸化的或两者。使用改变的高碘酸-席夫(PAS)方法，在SDS-PAGE凝胶和蛋白质印迹上常规实现糖蛋白的体外检测。可以利用本领域已知的凝集素荧光缀合物来完成糖蛋白的细胞定位。可以使用磷酸特异性抗体通过蛋白质印迹来评估磷酸化。
翻译后修饰还包括与疏水基团缀合(例如，豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、异戊烯化或糖基磷脂酰肌醇化)，与辅因子缀合(例如，脂化黄素部分(例如，FMN或FAD)、血红素C附着、磷酸泛酰巯基乙胺基化(phosphopantetheinylation)、或亚视黄基席夫碱形成)，白喉酰胺形成，乙醇胺磷酸甘油附着，羟丁赖氨酸(hypusine)形成，酰化(例如，O-酰化、N-酰化或S-酰化)，甲酰化，乙酰化，烷基化(例如，甲基化或乙基化)，酰胺化，丁酰化，γ-羧基化，丙二酰化，羟基化，碘化，核苷酸添加如ADP-核糖基化，氧化，磷酸酯(O-连接)或氨基磷酸酯(N-连接)形成(例如，磷酸化或腺苷酰化)，丙酰化，焦谷氨酸酯形成，S-谷胱甘肽化，S-亚硝基化，琥珀酰化，硫酸化，ISG化，SUMO化，泛素化，类泛素化(Neddylation)或氨基酸的化学修饰(例如，瓜氨酸化、脱酰胺化、消去化(eliminylation)或氨甲酰化)，二硫键的形成，外消旋化(例如，脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸的外消旋化)。在实施例中，糖基化包括向精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、羟赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或色氨酸添加糖基基团，从而产生糖蛋白。在实施例中，糖基化包括例如O-连接的糖基化或N-连接的糖基化。
在一些实施例中，本文所述的外源多肽的长度是至少200、300、400、500、600、700、或800个氨基酸。在一些实施例中，外源多肽的长度是200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、或700-800个之间的氨基酸。在一些实施例中，外源多肽的长度小于500、450、400、350、或300个氨基酸。
在实施例中，本文所述的红系细胞包含本文所述的外源多肽的至少1,000、5,000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、50,000、100,000、200,000、或500,000个拷贝。在实施例中，本文所述的红系细胞包含本文所述的外源多肽(例如，包含4-1BBL的外源多肽)的约200,000、150,000-250,000、100,000-300,000、或200,000-300,000个拷贝。
在实施例中，本文所述的外源多肽形成多聚体，例如，二聚体、三聚体、四聚体、或六聚体。在实施例中，外源多肽(例如，包含4-1BBL)形成三聚体，例如，在红系细胞的表面上的三聚体。
在一些实施例中，红系细胞包含试剂(例如，外源多肽，例如，表面暴露的外源多肽，例如，包含跨膜结构域的表面暴露的多肽)，该试剂结合本文所述的肿瘤抗原(例如，表1的肿瘤抗原)。在实施例中，红系细胞包含试剂(例如，外源多肽)，该试剂包含表1或表2的抗体或其他结合剂，或其片段或变体。例如，片段或变体可以是对应于表1或表2的抗体的单结构域抗体，例如，scFv。作为另一个实例，片段或变体可以是表1或表2的抗体的抗原结合片段，例如轻链可变片段、重链可变片段、或两者。作为另一个实例，片段或变体可以是表1或表2的结合剂的活性片段。作为另一个实例，片段或变体可以是与表1或表2的抗体具有少于100％序列同一性的抗体，例如，与表1或表2的抗体，或者轻链可变片段、重链可变片段、或两者具有至少70％、75％、80％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％同一性的抗体。例如，片段或变体与表1或表2的抗体可以具有相同的CDR，但是在框架和/或恒定区中具有一个或多个突变。作为另一个实例，片段或变体可以是与表1或表2的结合剂具有少于100％序列同一性的结合剂，例如，与表1或表2的结合剂或其活性部分具有至少70％、75％、80％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％同一性的结合剂。
在一些实施例中，一种或多种外源多肽是融合蛋白，例如，是与内源红血细胞蛋白或其片段的融合物。在实施例中，外源多肽包含跨膜蛋白，例如，I型、II型、或III型红血细胞跨膜蛋白或其跨膜片段。在实施例中，跨膜蛋白是GPA或其跨膜片段。
在实施例中，跨膜结构域包含GPA或其跨膜部分(例如本文SEQ ID NO:1所示或其跨膜部分)，或与任一上述项具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的多肽。在实施例中，GPA多肽位于结合结构域的C-末端。在实施例中，GPA多肽具有以下序列：
LSTTEVAMHTSTSSSVTKSYISSQTNDTHKRDTYAATPRAHEVSEISVRTVYPPEEETGERVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRLIKKSPSDVKPLPSPDTDVPLSSVEIENPETSDQ(SEQ ID NO:1)
或其跨膜部分，或与任何上述物具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的多肽。在实施例中，GPA多肽位于抗体结构域的C-末端。
在实施例中，外源多肽包含SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:81的多肽、或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％同一性的氨基酸序列、或其功能片段。在实施例中，4-1BBL的功能片段是4-1BB结合片段。在实施例中，抗PD-L1的功能片段是PD-L1结合片段。
在实施例中，外源多肽包含介导细胞凋亡的细胞受体的配体。在实施例中，配体是TRAIL受体配体，例如，野生型或突变TRAIL多肽、结合TRAIL受体的抗体，并且诱导靶细胞中细胞凋亡。在一些实施例中，去核红系细胞包含一种或多种(例如，两种或三种)TRAIL受体配体。在一些实施例中，包含一种或多种TRAIL受体配体的去核红系细胞进一步包含靶向部分，例如，本文所述的靶向部分。
TRAIL(TNF相关凋亡诱导配体)是诱导细胞凋亡的TNF家族的成员。TRAIL具有至少两种受体，TRAIL R1和TRAIL R2。TRAIL受体激动剂，例如结合一种或多种受体的TRAIL突变体或结合TRAIL R1或TRAIL R2中的一者或两者的抗体(参见例如，Gasparian等人,Apoptosis[细胞凋亡]2009年6月14(6)，Buchsbaum等人Future Oncol[未来肿瘤学]2007年8月3(4))，已经开发作为广泛癌症的临床疗法。在实施例中，去核红系细胞包含TRAIL R1配体和TRAIL R2配体。
在一些实施例中，外源多肽的一种或多种包含TNF超家族的成员或其部分。在一些实施例中，外源多肽结合死亡受体DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)中的一者或两者。在一些实施例中，外源多肽结合TNFRSF10A/TRAILR1、TNFRSF10B/TRAILR2、TNFRSF10C/TRAILR3、TNFRSF10D/TRAILR4或TNFRSF11B/OPG中的一种或多种。在一些实施例中，外源多肽活化MAPK8/JNK、半胱天冬酶8和半胱天冬酶3中的一种或多种。
在一些实施例中，TRAIL多肽是TRAIL激动剂，其具有本文SEQ ID NO:2-6中任一项所述的序列，或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。例如通过BLAST(基本局部比对搜索工具)来测量序列同一性。SEQ ID No.2-6进一步被描述于Mohr等人BMC Cancer[生物医学中心癌症](2015)15:494中，将该文献通过引用以其全文并入本文。
SEQ ID NO:2
可溶性TRAIL变体DR4-1
MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRRRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG
SEQ ID NO:3
可溶性TRAIL变体DR4-2
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SEQ ID NO:4
可溶性TRAIL变体DR4-3
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SEQ ID NO:5
可溶性TRAIL变体DR5-1
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SEQ ID NO:6
可溶性TRAIL变体DR5-2
MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQERIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMHHEASFFGAFLVG
在一些实施例中，TRAIL受体配体包含抗体，例如抗体片段。在实施例中，抗体识别TRAIL R1和TRAIL R2中的一者或两者。抗体可以是例如马帕木单抗(人抗DR4 mAb)、加珠单抗(Tigatuzumab)(人源化抗DR5 mAb)、来沙木单抗(人抗DR5 mAb)、坎妥木单抗(Conatumumab)(人抗DR5 mAb)或阿扑单抗(Apomab)(人抗DR5 mAb)。在一些实施例中，红系细胞包含至少一个抗体(其结合TRAIL受体)和至少一个TRAIL多肽。
在一些实施例中，红系细胞包含具有靶向活性的结合剂。在实施例中，结合剂还具有抗癌活性，例如，相同的外源多肽是抗癌剂和靶向剂。在实施例中，红系细胞包含具有抗癌活性的第二试剂(例如，第二外源多肽)。在实施例中，靶向剂在癌细胞(例如实体瘤细胞)处或其附近结合，且第二试剂(例如第二多肽)具有抗癌功能。在一些实施例中，作用部位是肿瘤脉管系统。在实施例中，靶向剂结合新血管系统的标志物，例如结合整合蛋白如avB1、avB3或avB5或a4b1整合蛋白，例如合成的肽打结素(Kim等人，JACS 2016，137(1))或者内源性或天然配体，例如锯鳞蝰素、RGD、EETI2.5F或VCAM-1，或结合前列腺特异性膜抗原，其也在新血管系统中大量发现。在一些实施例中，靶向剂结合癌细胞标志物，如CD269(例如在多发性骨髓瘤细胞中表达)或CD123(例如在ALM细胞中表达)、CD28(例如在T细胞中表达；CD28可以被CD80/CD86结合)、NY-ESO-1(例如在卵巢癌中表达)。
在实施例中，抗癌剂包含降解肿瘤细胞选择性生长所需的代谢物的酶，例如，天冬酰胺酶、甲硫氨酸γ裂解酶(MGL)、丝氨酸脱氢酶、或其片段或变体。抗癌剂可以是血管生成抑制剂，例如血管生成素抑制剂或者VEGF或VEGFR抑制剂以防止血管进一步生长。抗癌剂可以是活化T细胞的免疫刺激分子(例如共刺激分子(例如，表5的共刺激分子))、免疫检查点抑制剂(参见例如表4)或细胞因子或T细胞活化配体。抗癌剂可以结合免疫效应细胞，例如T细胞或炎性巨噬细胞，并且可以捕获效应细胞并使其邻近肿瘤。抗癌剂可以是细胞杀伤的直接介质，例如TRAIL或FAS-L或其他死亡配体或毒素。在一些实施例中，抗癌剂包含TRAIL受体的激动剂，例如激动性抗体。在实施例中，抗癌剂是促凋亡剂。在实施例中，抗癌剂包含辅助剂。对于这些抗癌剂中的任何一种，净结果是红细胞治疗剂(RCT)定位于肿瘤部位并因此将其抗肿瘤效果集中在增加其功效的位置。
在一些实施例中，外源多肽抑制免疫检查点分子。在实施例中，外源多肽位于红系细胞(例如，包含跨膜部分和表面暴露部分)的表面并且结合免疫检查点分子。
在一些实施例中，外源多肽抑制免疫检查点分子。在一个实施例中，免疫检查点分子的抑制剂是抑制性抗体(例如抗体，如单特异性抗体、单克隆抗体或单链抗体)。抗体可以是例如人源化的或可以完全是人的。在其他实施例中，免疫检查点分子的抑制剂是融合蛋白，例如Fc-受体融合蛋白。在一些实施例中，免疫检查点分子的抑制剂是与免疫检查点蛋白相互作用的试剂，例如抗体。在一些实施例中，免疫检查点分子的抑制剂是与免疫检查点受体的配体相互作用的试剂，例如抗体。在一个实施例中，免疫检查点分子的抑制剂是CTLA-4的抑制剂(例如，抑制性抗体或小分子抑制剂)(例如，抗CTLA4抗体，如伊匹木单抗/Yervoy或曲美木单抗)。在一个实施例中，免疫检查点分子的抑制剂是PD-1的抑制剂(例如，抑制性抗体或小分子抑制剂)(例如，皮地利珠单抗(pidilizumab)/CT-011)。在一个实施例中，免疫检查点分子的抑制剂是PD-L1的抑制剂(例如，抑制性抗体或小分子抑制剂)(例如，MPDL3280A/RG7446；MEDI4736；MSB0010718C；BMS 936559)。在一个实施例中，免疫检查点分子的抑制剂是PDL2的抑制剂(例如，抑制性抗体或Fc融合体或小分子抑制剂)(例如，PDL2/Ig融合蛋白，如AMP 224)。在一个实施例中，免疫检查点分子的抑制剂是B7-H3(例如MGA271)、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合的抑制剂(例如抑制性抗体或小分子抑制剂)。
免疫检查点分子的抑制剂可以分成至少4个主要类别：i)直接在T细胞或自然杀伤(NK)细胞上阻断抑制性途径的试剂，如抗体(例如靶向PD-1的抗体如纳武单抗和派姆单抗，靶向TIM-3的抗体以及靶向LAG-3、2B4、CD160、A2aR、BTLA、CGEN-15049或KIR的抗体)，ii)直接在T细胞或NK细胞上活化刺激性途径的试剂，如抗体(例如靶向OX40、GITR或4-1BB的抗体)，iii)在免疫细胞上阻断抑制性途径或依靠抗体依赖性细胞毒性以消耗抑制性免疫细胞群的试剂，如抗体(例如靶向CTLA-4的抗体如伊匹木单抗，靶向VISTA的抗体以及靶向PD-L2、Gr1或Ly6G的抗体)，和iv)直接在癌细胞上阻断抑制性途径或依靠抗体依赖性细胞毒性以增强对癌细胞的细胞毒性的试剂，如抗体(例如利妥昔单抗，靶向PD-L1的抗体，靶向B7-H3、B7-H4、Gal-9或MUC1的抗体)。可以设计和生产本文所述的试剂，例如，在Templeton,Gene and Cell Therapy[基因和细胞疗法],2015；Green和Sambrook,Molecular Cloning[分子克隆],2012中描述的。
在一些实施例中，红系细胞包含试剂(例如，外源多肽，例如，表面暴露的外源多肽，例如，包含跨膜结构域的表面暴露的多肽)，该试剂结合表4的免疫检查点分子的。在实施例中，红系细胞包含试剂(例如，外源多肽)，该试剂包含表4的抗体或其他结合剂，或其片段或变体。例如，片段或变体可以是对应于表4的抗体的单结构域抗体，例如，scFv。作为另一个实例，片段或变体可以是表4的抗体的抗原结合片段，例如轻链可变片段、重链可变片段、或两者。作为另一个实例，片段或变体可以是表4的结合剂的活性片段。作为另一个实例，片段或变体可以是与表4的抗体具有少于100％序列同一性的抗体，例如，与表4的抗体，或者轻链可变片段、重链可变片段、或两者具有至少70％、75％、80％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％同一性的抗体。例如，片段或变体与表4的抗体可以具有相同的CDR，但是在框架和/或恒定区中具有一个或多个突变。作为另一个实例，片段或变体可以是与表4的结合剂具有少于100％序列同一性的结合剂，例如，与表4的结合剂或其活性部分具有至少70％、75％、80％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％同一性的结合剂。
在一些实施例中，红系细胞包含试剂(例如，外源多肽，例如，表面暴露的外源多肽，例如，包含跨膜结构域的表面暴露的多肽)，该试剂包含表5的共刺激分子或其片段或变体。在实施例中，红系细胞包含试剂(例如，外源多肽)，该试剂包含表5的共刺激分子或其片段或变体。例如，片段或变体可以是与表5的共刺激分子具有少于100％序列同一性的蛋白质序列，例如，与共刺激分子具有至少70％、75％、80％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％同一性的共刺激分子。在实施例中，片段或变体是共刺激分子的同种型，例如，表5的共刺激分子的同种型1、2、3、4、或5，或其片段或变体。在实施例中，片段或变体是表5的共刺激分子的成熟形式，例如，具有表5的共刺激分子加工形式的序列。
在实施例中，共刺激分子包含MHC I类分子、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、和4-1BB(CD137)、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、和CD19a、或其片段或变体的一种或多种。
作为另一个实例，红系细胞使免疫效应细胞(例如T细胞)和癌细胞彼此紧密邻近以促进免疫效应细胞杀死癌细胞。因此，在一些实施例中，第一多肽结合癌细胞的细胞表面标志物，并且第二多肽结合免疫效应细胞的细胞表面标志物。第一和第二多肽可以包含例如抗体。在一些实施例中，癌细胞标志物选自CD19(例如在急性白血病B细胞中表达)、EpCAM(例如在CTC中表达)、CD20(例如在急性白血病B细胞中表达)、CD45(例如在CTC中表达)、EGFR、HER2(例如在乳腺癌细胞中表达)。在一些实施例中，免疫细胞标志物是CD3。
本文所述的多肽的媒介物
尽管在本文的许多实施例中，一种或多种外源多肽位于红系细胞上或红系细胞中，但应理解，本文所述的任何一种或多种外源多肽也可以位于另一媒介物上或另一媒介物中。媒介物可以包含例如细胞、红系细胞、小体、纳米颗粒、胶束、脂质体或外来体。媒介物可以是例如颗粒，如纳米颗粒或直径大于100、200、300、400、500、1,000、1,500、2,000或2,500nm的颗粒。例如，在一些方面，本披露提供了例如在其表面上包含本文所述的一种或多种试剂的媒介物(例如，细胞、红系细胞、小体、纳米颗粒、胶束、脂质体或外来体)。在一些实施例中，一种或多种试剂包含选自表2、表4或表5任一个中的多肽或其片段或变体、或其激动剂或拮抗剂、或其抗体的试剂。在一些实施例中，媒介物包含本文所述的两种或更多种试剂，例如本文所述的任何试剂对。
在一些实施例中，媒介物包含红系细胞。在实施例中，红系细胞是有核红细胞、红细胞前体或去核红细胞。在实施例中，红系细胞是脐带血干细胞、CD34+细胞、造血干细胞(HSC)、脾集落形成(CFU-S)细胞、普通髓系祖细胞(CMP)、胚细胞集落形成细胞、爆发集落形成单位红细胞(BFU-E)、巨核细胞红祖细胞(MEP)、红细胞集落形成单位(CFU-E)、网织红细胞、红细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)、多染性正成红细胞、正染性正成红细胞(orthochromatic normoblast)、或其组合。在一些实施例中，红系细胞是永生的或永生化的细胞。在一些实施例中，媒介物包含免疫效应细胞，例如B细胞、T细胞或NK细胞。在一些实施例中，细胞是自体或同种异体的。
细胞的异质群体
尽管在本文的许多实施例中，一种或多种(例如两种或更多种)外源多肽位于单个细胞上或单个细胞中，但应理解，本文所述的任何多肽或多肽的组合也可以位于多个细胞上。例如，在一些方面，本披露提供了多个红系细胞，其中该多个细胞的第一细胞包含第一外源多肽，并且该多个细胞的第二细胞包含第二外源多肽。在一些实施例中，该多个细胞包含本文所述的两种或更多种多肽，例如，本文所述的多肽的任何对。在一些实施例中，群体中少于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、或1％的细胞包含第一外源多肽和第二外源多肽两者。
包封在膜中的细胞
在一些实施例中，本文所述的去核类红细胞或其他媒介物被包封在膜，例如半透膜中。在实施例中，膜包含多糖，例如阴离子多糖藻酸盐。在实施例中，半透膜不允许细胞穿过，但允许小分子或大分子例如代谢物、蛋白质或DNA通过。在实施例中，膜是Lienert等人，“Synthetic biology in mammalian cells:next generation research tools andtherapeutics[哺乳动物细胞中的合成生物学：下一代研究工具和治疗剂]”NatureReviews Molecular Cell Biology[自然评论与分子细胞生物学]15,95–107(2014)中所描述的膜，将其通过引用以其全文并入本文。尽管不希望受理论束缚，但是在一些实施例中，膜使细胞屏蔽免疫系统和/或保持多个细胞接近，从而促进彼此或彼此的产物的相互作用。
去核红系细胞的物理特性
在一些实施例中，本文所述的去核红系细胞具有本文所述的一种或多种(例如2、3、4种或更多种)物理特性，例如渗透脆性、细胞大小、血红蛋白浓度或磷脂酰丝氨酸含量。尽管不希望受理论束缚，但在一些实施例中，表达外源蛋白质的去核红系细胞具有类似于野生型未处理的红系细胞的物理特性。相反，低渗负荷的红系细胞有时表现出异常的物理特性，例如渗透脆性增加、细胞大小改变、血红蛋白浓度降低或细胞膜外叶中磷脂酰丝氨酸水平增加。
在一些实施例中，去核红系细胞包含由未被细胞保留的外源核酸编码的、尚未纯化或还没有完全存在于红系细胞外部的外源蛋白质。在一些实施例中，红系细胞处于缺乏稳定剂的组合物中。
渗透脆性
在一些实施例中，去核红系细胞表现出与不包含外源多肽的分离的未培养的去核红系细胞基本相同的渗透膜脆性。在一些实施例中，去核红系细胞群体在0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％NaCl下具有小于50％细胞裂解的渗透脆性。在一些实施例中，利用WO2015/073587的实例59的方法测定渗透脆性。
细胞大小
在一些实施例中，去核红系细胞具有与野生型未处理的红系细胞近似的直径或体积。
在一些实施例中，红系细胞群体具有约4、5、6、7或8微米的平均直径，并且任选地，群体的标准差小于1、2或3微米。在一些实施例中，这一种或多种红系细胞具有约4-8、5-7或约6微米的直径。在一些实施例中，红系细胞的直径小于约1微米，大于约20微米，在约1微米和约20微米之间、在约2微米和约20微米之间、在约3微米和约20微米之间、在约4微米和约20微米之间、在约5微米和约20微米之间、在约6微米和约20微米之间、在约5微米和约15微米之间、或在约10微米和约30微米之间。在一些实施例中，使用Advia 120血液系统测量细胞直径。
在一些实施例中，红系细胞的平均红细胞体积的容积大于10fL、20fL、30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、或大于150fL。在一个实施例中，红系细胞的平均红细胞体积小于30fL、40fL、50fL、60fL、70fL、80fL、90fL、100fL、110fL、120fL、130fL、140fL、150fL、160fL、170fL、180fL、190fL、200fL、或小于200fL。在一个实施例中，红系细胞的平均红细胞体积在80-100、100-200、200-300、300-400或400-500飞升(fL)之间。在一些实施例中，红系细胞群体具有此段落所列出的平均红细胞体积，并且群体的标准差小于50fL、40fL、30fL、20fL、10fL、5fL或2fL。在一些实施例中，使用血液学分析仪(例如，Coulter计数器)测量平均红细胞体积。
血红蛋白浓度
在一些实施例中，去核红系细胞具有与野生型未经处理的红系细胞类似的血红蛋白含量。在一些实施例中，红系细胞包含超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或超过10％的胎儿血红蛋白。在一些实施例中，红系细胞包含至少约20、22、24、26、28或30pg，且任选地高达约30pg的总血红蛋白。在一些实施例中，使用WO 2015/073587的实例33的德拉布坎(Drabkin's)试剂方法测定血红蛋白水平。
磷脂酰丝氨酸含量
在一些实施例中，去核红系细胞在其细胞膜的外叶上具有与野生型未处理的红系细胞大致相同的磷脂酰丝氨酸含量。磷脂酰丝氨酸主要位于野生型未处理的红系细胞细胞膜的内叶上，并且低渗负荷可以导致磷脂酰丝氨酸分布至它可以引发免疫应答的外叶中。在一些实施例中，红系细胞群体包含对膜联蛋白V染色呈阳性的少于约30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞。在一些实施例中，通过染色优先结合PS的膜联蛋白-V-FITC和通过流式细胞术测量FITC荧光，例如使用WO 2015/073587的实例54的方法，来评估磷脂酰丝氨酸暴露。
其他特征
在一些实施例中，红系细胞群体包含对GPA呈阳性的至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％(并且任选地高达90％或100％)的细胞。在一些实施例中，使用FACS检测GPA的存在。
在一些实施例中，去核红系细胞在受试者中具有至少30、45或90天的半衰期。
在一些实施例中，包含红系细胞的细胞群包含少于约10％、5％、4％、3％、2％或1％的棘状红细胞。
在一些实施例中，红系细胞是去核的。在一些实施例中，细胞(例如红系细胞)含有无功能(例如已经失活)的核。
通用供体红系细胞
在一些实施例中，本文所述的红系细胞对将给予该细胞的受试者是自体的和/或同种异体的。例如，对受试者同种异体的红系细胞包括一种或多种血型特异性红系细胞(例如，该细胞可以与受试者具有相同的血型)或一种或多种通用供体红系细胞。在一些实施例中，与参考细胞相比，本文所述的去核红系细胞具有降低的免疫原性，例如，具有降低的水平的一种或多种血型抗原。
当同种异体细胞用于输血时，可以选择相容的ABO血型来预防急性血管内溶血性输血反应。基于血型抗原A和B的存在或不存在定义ABO血型，在红细胞表面上与糖蛋白和糖脂有关的寡糖链末端处发现单糖碳水化合物结构(在刘(Liu)等人，Nat.Biotech[自然生物技术].25:454-464(2007)中综述)。因为O型红细胞既不包含A抗原也不包含B抗原，它们能够安全输注到具有任何ABO血型的受体中，例如，A、B、AB、或O型受体。O型红细胞被认为是通用的，并且可以用于所有输注。因此，在一些实施例中，本文所述的红系细胞是O型。相比之下，可以将A型红系细胞给到A和AB型受体，可以将B型红系细胞给到B和AB型受体，并且可以将AB型红系细胞给到AB型受体。
在一些情况下，可能有益的是将非O型红系细胞转化为通用血型。酶促去除A型和B型红细胞表面上的免疫显性单糖可以用来产生表达O型样红系细胞的群体(参见，例如，Liu等人,Nat.Biotech.[自然生物技术]25:454-464(2007))。可以使用衍生自绿咖啡豆的α半乳糖苷酶转化B型红系细胞。可替代地或此外，如果存在于红系细胞上的话，衍生自脑膜炎黄杆菌(E.Meningosepticum)细菌的α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-半乳糖苷酶酶活性可以用来分别去除免疫显性A和B抗原(Liu等人,Nat.Biotech.[自然生物技术]25:454-464(2007))。在一个实例中，在26℃下，将如本文中描述的堆积的红系细胞在α-N-乙酰半乳糖胺酶或α-半乳糖苷酶(约300μg/ml堆积的红系细胞)存在下在200mM甘氨酸(pH 6.8)和3mM NaCl中孵育60min。在处理后，在盐水中通过3-4次冲洗洗涤这些红系细胞，伴随离心并且根据标准血库技术进行ABO分类。
尽管ABO血型系统在输血和移植中是最重要的，但在一些实施例中，可以在与待给予的红系细胞与受体之间匹配其他血型相、或者选择或制造对一种或多种其他(例如，次要)血型通用的红系细胞。第二个血型是Rh系统，其中个体可以是Rh+或Rh-。因此，在一些实施例中，本文所述的红系细胞是Rh-。在一些实施例中，红系细胞是O型和Rh-。
在一些实施例中，本文所述的红系细胞对一种或多种次要血型抗原(例如Le(a-b-)(对于Lewis抗原系统)、Fy(a-b-)(对于Duffy系统)、Jk(a-b-)(对于Kidd系统)、M-N-(对于MNS系统)、K-k-(对于Kell系统)、Lu(a-b-)(对于Lutheran系统)、和H-抗原阴性(Bombay表型)，或其任何组合)是阴性的。在一些实施例中，红系细胞也是O型和/或Rh-。小血型描述于例如Agarwal等人“Blood group phenotype frequencies in blood donors from atertiary care hospital in north India[来自印度北部三级医院的献血者的血型表型频率]”Blood Res.[血液研究]2013年3月；48(1):51–54和Mitra等人“Blood groupssystems[血型系统]”Indian J Anaesth.[印度麻醉杂志]2014年9月-10月；58(5):524–528，其每个通过引用以其全文并入本文。
制造去核红系细胞的方法
制造包含外源多肽的去核红系细胞的方法描述在，例如，WO 2015/073587和WO2015/153102中，其每个通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，使造血祖细胞(例如CD34+造血祖细胞)与编码一种或多种外源多肽的一种或多种核酸接触，并使细胞在培养中扩增并分化。
核酸可以例如是DNA或RNA。许多病毒可以用作基因转移媒介物，包括例如逆转录病毒、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒如人免疫缺陷病毒1(HIV 1)和泡沫病毒(spumaviruse)如泡沫病毒(foamy viruse)。
在一些实施例中，使用例如WO 2014/183071或WO 2014/183066中所描述的缀合(例如，分类法)来产生这些细胞，将这些文献各自通过引用以其全文并入。
在一些实施例中，红系细胞被扩增至少1000、2000、5000、10,000、20,000、50,000或100,000倍(并且任选地高达100,000、200,000或500,000倍)。在一些实施例中，使用自动化细胞计数器测量细胞数量。
在一些实施例中，红系细胞群体包含至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％(并且任选地高达约80％、90％或100％)的去核红系细胞。在一些实施例中，红系细胞群体含有少于1％的活的去核细胞，例如，不含有可检测的活的去核细胞。在一些实施例中，使用核染色通过FACS测量去核。在一些实施例中，群体中至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％(并且任选地高达约70％、80％、90％或100％)的红系细胞包含一种或多种(例如2、3、4种或更多种)外源多肽。在一些实施例中，使用针对多肽的标记抗体通过FACS测量多肽的表达。在一些实施例中，群体中至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、或80％(并任选地高达约70、80、90、或100％)的红系细胞是去核的并且包含一种或多种外源多肽。在一些实施例中，红系细胞群体包含约1x109–2x109、2x109–5x109、5x109–1x1010、1x1010–2x1010、2x1010–5x1010、5x1010–1x1011、1x1011–2x1011、2x1011–5x1011、5x1011–1x1012、1x1012–2x1012、2x1012–5x1012或5x1012–1x1013个细胞。
用本文组合物(例如，红系细胞)处理的方法
给予包含(例如，表达)外源试剂(例如，多肽)的方法描绘在例如WO 2015/073587和WO 2015/153102中，将其各自通过引用以其全文并入。
在实施例中，将本文所述的红系细胞给予受试者，例如哺乳动物，例如人。可以治疗的示例性哺乳动物包括但不限于：人、家畜(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。本文所述的方法适用于人疗法和兽医应用两者。
在一些实施例中，每1、2、3、4、5或6个月向患者给予红系细胞。
在一些实施例中，红系细胞的剂量包含约1x109–2x109、2x109–5x109、5x109–1x1010、1x1010–2x1010、2x1010–5x1010、5x1010–1x1011、1x1011–2x1011、2x1011–5x1011、5x1011–1x1012、1x1012–2x1012、2x1012–5x1012或5x1012–1x1013个细胞。
在一些方面，本披露提供了治疗本文所述的疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者给予本文所述的组合物，例如本文所述的红系细胞。在一些实施例中，该疾病或病症是癌症，例如本文所述的癌症。在一些方面，本披露提供了本文所述的红系细胞用于治疗本文所述疾病或病症(例如，癌症)的用途。在一些方面，本披露提供了本文所述的红系细胞用于制造治疗本文所述疾病或病症(例如，癌症)的药物的用途。
癌症的类型包括急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑肿瘤、乳腺癌、未知原发癌症、扩散至骨的癌症、扩散至脑的癌症、扩散至肝的癌症、扩散至肺的癌症、良性肿瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、眼癌、胆囊癌、胃部癌症、妊娠滋养细胞瘤(GTT)、毛细胞白血病、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、B-细胞淋巴瘤、黑色素瘤皮肤癌、间皮瘤、男性癌症、葡萄胎妊娠、口腔和口咽癌、骨髓瘤、鼻和鼻窦癌、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、罕见癌症、直肠癌、唾液腺癌、继发性癌症、皮肤癌(非黑色素瘤)、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、未知原发癌、子宫癌、阴道癌、和外阴癌。
在一些实施例中，癌症是高度免疫原性的癌症，例如，癌症具有(例如，通过分析癌症活组织检查确定的)一种或多种以下特征：(a)肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，例如，至少1、5、10、100个TIL/1000个肿瘤细胞；(b)突变，例如，0.1或更多体细胞突变/兆碱基肿瘤基因组DNA；(c)新抗原，例如，具有一种或多种内源T细胞受体的一种或多种新抗原和/或一种或多种识别新抗原的加工和呈递部分的独特型克隆；(d)三级淋巴结构；(e)炎性基因表达的高表达，例如，细胞因子表达增加高于非癌组织中基线表达之上2倍；和(f)表现出免疫抑制表型的免疫细胞，例如缺乏细胞因子表达的树突细胞。评估癌症的这些特征的方法是已知的(参见，例如，Clin Cancer Res.[癌症临床研究]2000 May；6(5):1875-81；Nature.[自然]2013年8月22日；500(7463):415-21.doi:10.1038/nature12477.电子版2013年8月14日；Nature.[自然]2014年11月27日；515(7528):577-81.doi:10.1038/nature13988；Trends Immunol.[免疫趋势]2014年11月；35(11):571-80.doi:10.1016/j.it.2014.09.006.Epub 2014年10月22日；Front Immunol.[免疫学前沿]2013 Dec 11；4:438.doi:10.3389/fimmu.2013.00438；Eur J Cancer.[欧洲癌症杂志]2009年1月；45(2):228-47.doi:10.1016/j.ejca.2008.10.026。
在一些实施例中，肿瘤细胞是在原发性肿瘤中。在一些实施例中，肿瘤细胞不是循环肿瘤细胞。
在一些实施例中，肿瘤包含表8的基因中的突变。在一些实施例中，表8的基因中的突变是表8的第三列中指定的突变。在实施例中，癌症包含至少两种不同的突变，例如表8中基因的突变(例如，表8的第三列中指定的突变)和第二突变。在实施例中，第二突变是表8中基因的突变，例如，表8的第三列中指定的突变。在实施例中，肿瘤中的一些细胞包含突变而其他细胞不包含突变。
在一些实施例中，肿瘤不包含p53-裸细胞。在实施例中，患有肿瘤的患者对于p53无效突变不是杂合的。
肿瘤突变状态可以通过许多方法(如PCR、微阵列或核酸测序，例如高通量DNA测序)确定。
在一些实施例中，肿瘤包含选自以下中的一种或多种的肿瘤抗原：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319、以及19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，细胞表面相关的(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关的(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关的抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白(prostein)；存活素；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖蛋白8)、T细胞1识别的黑色素瘤抗原(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白(Brother of the Regulator of Imprinted Sites))，T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一些实施例中，肿瘤对包含表1或表2的抗体、或其片段或变体的疗法具有抗性，例如，已经用其进行治疗但对其无应答。例如，片段或变体可以是对应于表1或表2的抗体的单结构域抗体，例如，scFv。作为另一个实例，片段或变体可以是表1或表2的抗体的抗原结合片段，例如轻链可变片段、重链可变片段、或两者。作为另一个实例，片段或变体可以是表1或表2的结合剂的活性片段。作为另一个实例，片段或变体可以是与表1或表2的抗体具有少于100％序列同一性的抗体，例如，与表1或表2的抗体，或者轻链可变片段、重链可变片段、或两者具有至少70％、75％、80％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％同一性的抗体。例如，片段或变体与表1或表2的抗体可以具有相同的CDR，但是在框架和/或恒定区中具有一个或多个突变。作为另一个实例，片段或变体可以是与表1或表2的结合剂具有少于100％序列同一性的结合剂，例如，与表1或表2的结合剂或其活性部分具有至少70％、75％、80％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％同一性的结合剂。
在一些实施例中，红系细胞包含化学治疗剂。在一些实施例中，将红系细胞与化学治疗剂组合给予，例如，将红系细胞在化学治疗剂之前、之后、或同时给予。在一些实施例中，将红系细胞和化学治疗剂混合，并且在一些实施例中，他们在分开的制剂中。红系细胞和化学治疗剂可以通过相同的给药途径(例如，静脉内)或不同的给药途径(例如，静脉内和口服)给药。
在实施例中，化学治疗剂是微管抑制剂、DNA复制抑制剂、光敏剂、或酶抑制剂。在实施例中，化学治疗剂是微管抑制剂(例如，阻断微管组装(例如长春花生物碱)、或阻断微管解组装(如紫杉烷或埃坡霉素))。在实施例中，化学治疗剂是DNA复制抑制剂(例如，抗代谢物，如叶酸、嘌呤、嘧啶或DNA的抗代谢物；拓扑异构酶抑制剂，如拓扑异构酶I或II的抑制剂；或DNA交联剂，如烷化剂、铂基试剂、非经典DNA交联剂、或嵌入剂)。在实施例中，光敏剂是卟啉衍生物。
更具体地，在一些实施例中，长春花生物碱选自长春碱、长春新碱、长春氟宁、长春地辛、或长春瑞滨。在一些实施例中，紫杉烷选自卡巴他赛、多西他赛、拉罗他赛、奥他赛、紫杉醇(Paclitaxel)、或替司他赛。在一些实施例中，叶酸抗代谢物选自二氢叶酸还原酶抑制剂(例如，氨蝶呤、甲氨蝶呤、培美曲塞、或普拉曲沙(Pralatrexate))或胸苷酸合酶抑制剂(例如，雷替曲塞(Raltitrexed)或培美曲塞(Pemetrexed))。在一些实施例中，嘌呤抗代谢物选自腺苷脱氨酶抑制剂(例如，喷司他丁(Pentostatin))、卤化/核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如克拉屈滨(Cladribine)、氯法拉滨(Clofarabine)、氟达拉滨(Fludarabine))、或硫代嘌呤(例如硫鸟嘌呤或巯基嘌呤)。在一些实施例中，嘧啶抗代谢物选自胸苷酸合酶抑制剂(例如氟尿嘧啶、卡培他滨、替加氟、卡莫氟、或氟尿嘧啶)、DNA聚合酶抑制剂(例如，阿糖胞苷)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如，吉西他滨)、或低甲基化剂(例如，地西他滨的阿扎胞苷)。在一些实施例中，脱氧核糖核苷酸抗代谢物是核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如，羟基脲)。在实施例中，拓扑异构酶抑制剂是拓扑异构酶I的抑制剂，例如喜树碱化合物，例如喜树碱、Cositecan、贝洛替康(Belotecan)、吉马替康、依喜替康、伊立替康、勒托替康(Lurtotecan)、Silatecan、拓扑替康、或卢比替康(Rubitecan)。在实施例中，拓扑异构酶抑制剂是拓扑异构酶II的抑制剂，例如鬼臼化合物(例如，依托泊苷或替尼泊苷)。在实施例中，拓扑异构酶抑制剂具有插入活性，例如蒽环霉素(例如，阿克拉霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、氨柔比星、吡柔比星、戊柔比星、或佐柔比星)或蒽二酮(例如，米托蒽醌或匹杉琼(Pixantrone))。
在实施例中，烷化剂是氮芥气(Nitrogen mustard)，例如，氮芥(Mechlorethamine)、环磷酰胺(例如，异环磷酰胺或曲洛磷胺)、苯丁酸氮芥(例如，美法仑或前列莫司汀)、苯达莫司汀、乌拉莫司汀、或雌莫司汀。在实施例中，烷化剂是亚硝基脲，例如卡莫司汀、洛莫司汀、福莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、或链脲佐菌素。在实施例中，烷化剂是烷基磺酸酯，例如白消安(例如，甘露舒凡(Mannosulfan)或曲奥舒凡(Treosulfan))。在实施例中，烷化剂是氮丙啶，例如卡波醌(Carboquone)、噻替派(ThioTEPA)、三乙撑亚胺苯醌(Triaziquone)、或曲他胺(Triethylenemelamine)。在实施例中，铂基试剂选自卡铂、顺铂、双环铂、奈达铂(Nedaplatin)、奥沙利铂、或沙铂。在实施例中，非经典DNA交联剂是肼(例如，丙卡巴肼)、三氮烯(例如，达卡巴嗪(Dacarbazine)、或替莫唑胺(Temozolomide))、六甲蜜胺(Altretamine)、二溴甘露醇(Mitobronitol)、或哌泊溴烷(Pipobroman)。在实施例中，嵌入剂是链霉菌属化合物(例如，放线菌素、博来霉素、丝裂霉素、或光辉霉素(Plicamycin))。
在实施例中，光敏剂选自氨基乙酰丙酸/氨基乙酰戊酸甲酯、乙丙昔罗(aproxiral)、卟啉衍生物(例如卟吩姆钠(Porfimer sodium)、他拉泊芬(Talaporfin)、替莫卟吩(Temoporfin)、或维替泊芬(Verteporfin))。
在实施例中，酶抑制剂选自法呢基转移酶(Farnesyltransferase)抑制剂(例如，替吡法尼(Tipifarnib))、CDK抑制剂(例如，阿伏西地(Alvocidib)、塞利西利(Seliciclib)、或帕博西尼(Palbociclib))、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(Bortezomib)、卡非佐米(Carfilzomib)、或伊沙佐米(Ixazomib))、磷酸二酯酶抑制剂(例如，阿那格雷(Anagrelide))、IMP脱氢酶抑制剂(例如，噻唑呋林(Tiazofurin))、花生四烯酸5-脂氧合酶抑制剂(例如，马索罗酚(Masoprocol))、PARP抑制剂(例如，奥拉帕尼(Olaparib)或卢卡帕尼(Rucaparib))、HDAC抑制剂(例如，贝利司他(Belinostat)、帕比司他(Panobinostat)、罗米地新(Romidepsin)、或伏立诺他(Vorinostat))、或磷酸肌醇3-激酶抑制剂(例如，艾代拉里斯(Idelalisib))。
在实施例中，化学治疗剂是受体拮抗剂。在实施例中，受体拮抗剂选自内皮素受体拮抗剂(例如，阿曲生坦(Atrasentan))、类视黄醇X受体拮抗剂(例如，贝沙罗汀(Bexarotene))、或性类固醇(例如，睾内酯(Testolactone))。在实施例中，化学治疗剂选自安吖啶(Amsacrine)、曲贝替定(Trabectedin)、类视黄醇(例如，阿里维A酸或维甲酸)、三氧化二砷、天冬酰胺耗尽剂(例如，培门冬酶(Pegaspargase)的天冬酰胺酶)。塞来昔布(Celecoxib)、地美可辛(Demecolcine)、伊利司莫(Elesclomol)、依沙芦星(Elsamitrucin)、依托格鲁(Etoglucid)、氯尼达明(Lonidamine)、硫蒽酮(Lucanthone)、米托胍腙(Mitoguazone)、米托坦(Mitotane)、奥利莫森(Oblimersen)、高三尖杉酯碱(Omacetaxine mepesuccinate)、或艾日布林(Eribulin)。
表
表1.治疗性抗癌抗体。此表包含已获得监管部门批准和/或已进入临床试验的抗体。
表2.抗体VH和VL序列。此表中的序列是从公开可获得的来源获得的，并且如果本文的序列与命名抗体的序列之间存在差异，则实际抗体为准。
表3.示例性癌症
表4.免疫检查点分子、和与其结合的试剂。
表5.共刺激分子、和与其结合的试剂。
表6：与CD20细胞系结合的αCD20-RCT；结合的细胞百分比
细胞类型 αCD20-RCT结合 HA-GPA对照RCT结合
Raji 83.6％ 7.2％
Ramos 83.0％ 5.59％
Z138 43.7％ 3.92％
Granta-519 76.0％ 8.95％
Toledo 37.1％ 5.96％
SU-DHL4 91.3％ 36.1％
DOHH-2 86.7％ 7.18％
表7：暴露于RCT-抗CD20或对照RCT-HA-GPA的癌细胞中BCL-xL和BCL-2水平
表8：在某些癌症中突变的基因
表9.另外的外源多肽序列
实例
实例1：表达包含肿瘤抗原的结合剂的外源多肽的红系细胞结合并促进表达肿瘤抗原的细胞的细胞凋亡、并穿透实体瘤
产生了在其表面上表达融合蛋白的去核红系细胞，该融合蛋白从N末端至C末端包含利妥昔单抗CD20scFv结构域、HA表位标签和全长GPA(包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域)(RCT-抗CD20)。产生了在其表面上仅表达HA表位标签(与全长GPA的N末端融合)的对照去核红系细胞(RCT-HA-GPA)。用于生产表达外源蛋白质的红系细胞的方法描述在，例如，WO 2015/073587中。
如流式细胞术所示，RCT-抗CD20与许多表达CD20的细胞系结合(参见表6)。结合的量与细胞系的CD20水平相关(数据未显示)。
还通过免疫荧光显现RCT-抗CD20与表达Ramos CD20的细胞的结合。将细胞染色CD20(例如，在Ramos细胞上)、HA(αCD20-RCT上和对照RCT-HA-GPA的标签)、和DNA(使用DAPI)。CD20+Ramos细胞和RCT-抗CD20的共培养显示CD20和HA的广泛共定位，表明RCT结合CD20+细胞并诱导CD20的超交联(数据未显示)。相反，CD20+Ramos细胞和对照RCT-HA-GPA的共培养显示CD20和HA的最小共定位。
通过将RCT-抗CD20细胞与代表多种淋巴瘤亚型；DoHH2(滤泡性淋巴瘤)、Ramos(伯基特淋巴瘤)、Granta-519(套细胞淋巴瘤)和SU-DHL-4(弥漫性大B细胞淋巴瘤)的一组CD20+人淋巴瘤细胞系共培养来进一步评估RCT-抗CD20与表达CD20的细胞之间的相互作用是否可诱导细胞凋亡。在所有情况下，相对于RCT-HA-GPA或可溶性利妥昔单抗单克隆抗体，RCT-抗CD20共培养导致细胞凋亡增加(图1)。尽管希望不受理论舒服，但是由于CD20在淋巴瘤细胞上的超交联，假设体外直接的肿瘤细胞杀伤比单独的单克隆抗体更有效。
相对于可溶性利妥昔单抗，RCT-抗CD20的表现被量化。在上述细胞凋亡实验中，通过定量流式细胞术测量RCT-抗CD20上的抗CD20分子的数量。在具有1:1比率的RCT-抗CD20与淋巴瘤细胞的样品中，尽管诱导细胞凋亡水平相似，但RCT上的抗CD20分子比可溶性抗体条件少约11.6倍。在具有1:5比率的RCT-抗CD20与淋巴瘤细胞的样品中，RCT上的抗CD20分子比可溶性抗体条件少约2.3倍，尽管RCT-抗CD20诱导的细胞凋亡强得多。因此，即使可溶性抗体以比红系细胞封固的抗体的存在水平显著更高，红系细胞也显示出更强的效果。
利妥昔单抗被认为通过半胱天冬酶介导的细胞凋亡杀伤CD20+细胞，因此在用单独的抗CD20抗体或RCT-抗CD20处理的CD20+细胞中检查该途径。RCT-抗CD20细胞或对照RCT-HA-GPA添加至表达CD20的靶细胞。共培养物用Z-VAD-FMK(半胱天冬酶介导的细胞凋亡抑制剂)、或作为对照的DMSO处理。测量靶细胞的细胞凋亡。如图2所示，即使存在半胱天冬酶介导的细胞凋亡的抑制剂，RCT-抗CD20也强烈促进Ramos细胞的细胞凋亡。这一令人惊讶的结果表明RCT-抗CD20通过与对应的单独抗体的不同的机制杀伤CD20+癌细胞。结果表明，对于抗体(如抗CD20抗体)复发或难治疗的患者，例如由于半胱天冬酶依赖性细胞凋亡途径受损，仍然可以对红系细胞上呈递的抗体敏感。
为了进一步表征RCT-抗CD20触发细胞凋亡的机制，研究了BCL-xL和BCL-2水平。将RCT-抗CD20或对照RCT-HA-GPA细胞与三种癌细胞系(Raji、Ramos、或DoHH2)中的每一种一起培养。通过流式细胞术测量癌细胞上的BCL-xL和BCL-2的表面水平。在每个系中，RCT-抗CD20但不是对照RCT-HA-GPA降低BCL-xL和BCL-2水平(参见表7)。BCL2和BCLxl抗凋亡途径的抑制是剂量依赖性的。
还测试了RCT-抗CD20穿透实体瘤的能力。因为红系细胞比抗体大得多，所以预计红系细胞不能有效地穿透实体瘤。(参见，例如，Newick等人DOI:10.1146/annurev-med-062315-120245，Thurber等人doi:10.1016/j.addr.2008.04.012)通过将Ramos细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠中形成异种移植肿瘤。向小鼠静脉内给予mRBC-抗CD20或对照mRBC-HA-GPA。与mRBC-HA-GPA相比，mRBC-抗CD20显示出广泛的肿瘤穿透，例如通过H&E染色和HA染色(图3)。特别地，mRBC-抗CD20进入肿瘤的非坏死区域，而mRBC-HA-GPA通常局限于肿瘤的脉管系统或坏死区域(图3)。与对照mRBC-HA-GPA相比，使用荧光标记的RCT-抗CD20也显示出特异性肿瘤穿透(图4)。肿瘤内mRBC-抗CD20的平均荧光强度是对照mRBC-HA-GPA的两倍多。这些数据支持包含肿瘤-结合部分(如抗CD20抗体)的红系细胞的治疗用途。它们还支持使用肿瘤结合部分(如抗CD20抗体)作为靶向工具来将红系细胞样细胞引入肿瘤(例如CD20阳性肿瘤)。
实例2：表达免疫检查点抑制剂的红系细胞防止T细胞的免疫检查点抑制
产生了在其表面表达融合蛋白的去核红系细胞，该融合蛋白从N末端至C末端包含scFv抗体结构域、表位标签(HA或Flag)、和全长GPA(胞外结构域、跨膜结构域、和胞质结构域)。scFv结构域是PD-1(RCT-抗PD1)、PD-L1(RCT-抗PDL1)、或CTLA4(RCT-抗CTLA4)的特异性结合物。抗PD-1抗体结构域是基于帕博利珠单抗的。抗PD-L1抗体结构域是基于阿特朱单抗的。抗CTLA4抗体结构域是基于伊匹单抗的。
在流式细胞术测定中观察到抗PD-L1和抗CTLA4多肽的强烈表达，在用编码抗PD-L1的载体转染后超过95.7％的细胞表达抗PD-L1。相似地，在用编码抗-CTLA4的载体转染后，超过95.2％的细胞表达抗-CTLA4。
在Jurkat/IL-2测定中测试细胞。Jurkat T淋巴细胞通常分泌IL-2，并且在刺激后也表达PD-1、PD-L1和CTLA4。Jurkat细胞与NHL细胞(Z138)的共培养通过PD-1、PD-L1、和CTLA4信号传导触发免疫检查点，导致Jurkat细胞IL-2分泌的下调。将测试剂(如RCT)添加到共培养物中。通过维持高IL-2分泌水平来检测测试试剂抑制免疫检查点从而保持T细胞活性的能力。
在Jurkat IL-2测定中观察到与Z-138(NHL)和Jurkat细胞共培养后IL-2分泌的60％抑制(图5)。未转导的对照RCT不能拯救抑制作用。然而，RCT-抗PDL1显示拯救和恢复T细胞IL-2分泌，RCT-抗CTLA4也是如此(图5)。此实验表明，表达免疫检查点抑制剂的RCT可以通过阻止T细胞的检查点抑制来促进免疫应答。
测定了RCT-抗PD1和RCT-抗PDDL1在标准抗原回忆测定中引发活化的能力。用CMV肽刺激来自CMV阳性供体的PBMC。通过与RCT-抗PD-1或RCT-抗PD-L1进行共培养(与对照PBMC或对照RCT相比较)，测试对免疫检查点抑制敏感的记忆T细胞的活化和γ干扰素分泌素。在抗原回忆测定中，外周血单核细胞(PBMC)的干扰素-γ分泌显示出3-4倍增加(图6)。对照RCT-HA-GPA未增加干扰素-γ水平。在此测定中RCT-抗PDL1显示干扰素-γ分泌增加3-6倍(数据未显示)。此实验表明，表达免疫检查点抑制剂的RCT可以通过阻止T细胞的检查点抑制来促进免疫应答。
测试RCT-抗PDL1促进PBMC增殖的能力。与单独的PBMC相比，PBMC与RCT-抗-PDL1的共培养导致PBMC细胞增加3.6倍。PBMC与对照RCT-HA-GPA的共培养仅导致2.3倍的增加。此实验表明另外的机制，通过其表达免疫检查点抑制剂的RCT可以促进免疫应答。
实例3：表达共刺激分子的红系细胞促进T细胞活性
产生了在其表面表达融合蛋白的去核红系细胞，该融合蛋白从N末端至C末端包含4-1BBL结构域、表位标签(HA或Flag)、和全长GPA(胞外结构域、跨膜结构域、和胞质结构域)(RCT-41BBL)。41-BB-L是在抗原呈递细胞上表达并结合T细胞上的41-BB受体的共刺激蛋白。
使用流式细胞术测定RCT-41-BB-L与重组体41-BB的结合。
通过与过表达4-1BB和NFkB-Luc2P(NFκB-调节的荧光素酶报道构建体)的JurkatT细胞共培养来测定RCT-41BBL。在结合4-1BBL后，T细胞通常显示出升高的NFκB信号传导、增加的增殖、增加的IL-2和干扰素-γ的分泌、以及针对活化诱导的细胞死亡的保护。在测定中，与对照相比，RCT-41BBL刺激NFκB活化30倍，如通过荧光素酶活性测量的(图7)。未转导的去核红系细胞不会提高荧光素酶水平。
此外，PBMC与RCT-41BBL的共培养显示出与单独的PBMC相比，T细胞增殖增加1.7倍。
这些实验表明去核的红系细胞能够以促进PBMC增殖和活化负责免疫细胞活化的T细胞细胞内信号传导途径的方式成功地呈递共刺激分子。
实例4：共表达肿瘤抗原的结合剂和TRAIL配体的红系细胞促进表达肿瘤抗原的癌细胞中的细胞凋亡
使用以上描述的方法，当红系细胞被工程化以同时表达抗CD20以及Trail配体(细胞凋亡诱导剂)时，Ramos细胞与RCT抗CD20、RCT-Trail和RCT抗CD20+Trail(共表达)的共培养在48小时后分别发挥32％、47％和76％的细胞凋亡，这表明共表达RCT对肿瘤细胞杀伤的协同作用。
实例5：表达共刺激分子的红系细胞促进T细胞活性
如本文所述，通过电穿孔增加量的4-1BB-L-HA的mRNA的进入成熟期RCT，产生表达不同量的4-1BB-L-HA的红系细胞，如下表所示。当以表达细胞的百分比和每个细胞表达的拷贝测量时，更大量的电穿孔mRNA导致编码的蛋白的更高表达。表10总结了基于2个重复的表达水平。
表10
电穿孔后，在NFkB荧光素酶测定中测试红系细胞的活性。简言之，将红系细胞与可商购的Jurkat细胞一起孵育，该Jurkat细胞在荧光素酶启动子(Promega)下表达4-1BB和NFkB。在此系统中，通过可商购的试剂盒(Promega)测量的增加的荧光素酶活性表明NFkB的活化。将100,000个Jurkat 4-1BB NFkB/Luc细胞与在细胞膜上表达不同量的4-1BB-L的50,000个RCT孵育。将细胞孵育6小时，然后测量荧光素酶活性。图8中显示的数据显示荧光素酶活性的强烈增加最初是剂量依赖性的，然后在每个细胞中表达200,000个拷贝的4-1BB-L后平稳。此数据表明，在这些测定条件下，在每个细胞约200,000个拷贝的4-1BB-L时达到最大荧光素酶活性。
在另一个实验中，将4-1BB-L RCT与抗-4-1BB抗体乌托鲁单抗(Utomilumab)进行比较以获得促进T细胞活性的能力。将100,000个Jurkat 4-1BB NFkB/Luc细胞与4-1BB-LRCT或对照RCT(未转导的)(以增加的细胞数(12,500、50,000、100,000、200,000、或400,000))一起孵育。Jurkat 4-1BB NFkB/Luc细胞也与增加浓度的4-1BB激动剂乌托鲁单抗(浓度范围从0.001nM至100nM)在有或没有用于乌托鲁单抗交联的二级抗人IgG(浓度范围从0.0025nM到250nM)情况下一起孵育。结果表明单独的乌托鲁单抗在此测定中没有增加NFkB活性，在任何测试浓度中单独的二抗或对照RCT也没有增加NFkB活性。由第二抗人IgG抗体交联的高浓度乌托鲁单抗(0.1nM及以上)导致荧光素酶活性增加4-6倍，表明NFkB启动子活化。Jurkat 4-1BB NFkB/Luc细胞与4-1BB-L RCT孵育诱导更强的NFkB活化，从12,500RCT开始，导致NFkB活化20倍(图9)。在与Jurkat 4-1BB NFkB/Luc细胞孵育200,000个RCT时观察到最大活性，并导致荧光素酶活性增加90倍，因此导致NFkB活性增加。因此，与交联的抗体相比，表达4-1BBL的红系细胞导致显著更高(约15倍)的T细胞活性。不希望受理论束缚，在红系细胞表面的4-1BBL的三聚化可以有助于其高活性。
还显示4-1BB-L RCT增加PBMC增殖。来自3个不同供体的人外周血单核细胞(PBMC)获自Astrate生物制剂公司(Astrate biologics)，并在增殖测定中进行分析。根据制造商的方案，用Cell Trace Far Red(CTFR，赛默飞世尔公司(Thermo-Fisher))标记PBMC。将100000个CTFR标记的PBMC不处理或用0.5ug/mL CD3抗体刺激。将细胞与12,500、25,000或50,000个RCT(对照或表达4-1BB-L)，或增加剂量的乌托鲁单抗(1nM、10nM或100nM)或同种型对照抗体，在有或没有第二抗人IgG抗体(2.5nM、25nM或250nM)情况下一起孵育。将细胞孵育5天并在流式细胞术中分析。如图10所示，具有交联的抗体的乌托鲁单抗导致CD4和CD8T细胞增殖的小幅增加。另一方面，CTFR PBMC与RCT 4-1BB-L的孵育导致CD4增殖的剂量依赖性增加2-2.5倍，并且CD8细胞增殖的剂量依赖性增加4-7倍。数据表示来自3个不同人供体的PBMC的增殖，并且CD4和CD8增殖的倍数增加的计算相对于来自具有CD3抗体的相同供体的PBMC的增殖。此实验表明RCT 4-1BB-L促进CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的增殖，对CD8+细胞的作用比CD4+细胞更强。
4-1BB-L RCT还显示增加细胞因子分泌。来自3个不同供体的人PBMC获得自Astrate生物制剂公司并在细胞因子分泌测定中进行分析。将100,000个PBMC不处理或用0.5ug/mL CD3抗体刺激。将细胞与12,500、25,000、50,000或100,000个RCT(对照或4-1BB-L)，或增加剂量的乌托鲁单抗(1nM、10nM、100nM或1uM)或同种型对照抗体，在有或没有第二抗人IgG抗体(2.5nM、25nM、250nM或2.5uM)情况下一起孵育。将细胞孵育5天，并根据制造商的方案在基于流式细胞术的细胞因子组(Biolegend legendplex人炎性组)中分析细胞因子分泌。图11中显示的数据表明单独的乌托鲁单抗导致最大分泌400pg/mL的IFNg和600pg/mL(在二抗交联情况下)，而PBMC与RCT-4-1bB-L的孵育导致1500pg/mL的IFNg。在TNFa分泌中观察到相似的效果，其中PBMC与RCT-4-1BB-L的孵育导致TNFa分泌的强烈增加，这在单独使用乌托鲁单抗或使用乌托鲁单抗和二抗中不可见。
实例6：包含41BBL的红系细胞在体内减缓肿瘤生长
将用于结肠癌的MC38小鼠模型系统用于测试包含4-1BBL的红系细胞对肿瘤生长的影响。不受理论束缚，41BBL被认为通过在先天和适应性免疫组两者上引发不同的免疫效应子应答来减缓肿瘤生长。最有效的应答通过增加干扰素γ产生和多种颗粒酶的表达来刺激CD8+细胞毒性T细胞增殖并增加其效应子潜力。相比之下，使用多种4-1BB激动剂的已发表的临床前数据显示在MC38或其他模型中很少或没有单一试剂抗肿瘤活性(Chen等人,2014；Kudo-Saito等人,2006；Kocak等人,Canc Res[癌症研究]2006；Tirapu等人,Int JCancer[国际癌症杂志]2004；John等人,Canc Res[癌症研究]2012)。
将细胞与4-1BBL缀合，使得94.7％的细胞用m4-1BB-L标记。使用流式细胞术定量每个细胞中标记的分子的量。对于给药动物，每剂量平均给予1.1e9m4-1BB-L mRBC，对应于每剂量0.084mg/kg m4-1BB-L，其中平均36,200个m4-1BB-L分子/细胞。
将14只雌性C57/B6 6-8周龄小鼠在左侧腹部用5x 105MC-38个细胞皮下接种。每天记录动物的体重和状况，并且每周测量3次肿瘤。
通过在2维中测量每个肿瘤，每周测量肿瘤三次。使用以下标准公式计算肿瘤体积：(L x W2)/2。在每个时间点计算每组的平均肿瘤重量和平均值的标准误差。
与未处理的对照相比，观察到的m4-1BB-L mRBC的抗肿瘤活性显示在图12中，并证明用m4-1BB-L mRBC治疗的小鼠中肿瘤生长减少。早在研究的第5天和直到第9天，肿瘤体积分布证实了各组之间的统计学显著差异(P<0.05，T检验)。
每天记录体重。相对于第1天记录的体重计算每只小鼠的体重变化。如大多数小鼠的体重总体增加所示，治疗是耐受性良好的。在整个研究中，有一些体重减少的小鼠的体重减少不超过总体重的5％。
这些数据支持通过红系细胞来细胞呈递4-1BB-L的显著功效和效力。
实例7：表达包含针对肿瘤抗原的结合剂的外源多肽的红系细胞穿透实体瘤
将去核红系细胞在其表面上与抗PD-L1结合，并测试其浸润小鼠肿瘤的能力。
将小鼠用B16F10细胞皮下接种。在给药前允许肿瘤生长至400立方毫米。将鼠RBC与来自抗鼠PD-L1和同种型对照的片段抗体(Fab)缀合。根据制造商的方案，用CTFR标记缀合的鼠RBC。将细胞输注到动物体内。输注后一天，收集肿瘤。将肿瘤进行切片并用抗CD31染色以显现肿瘤脉管系统和DAPI以显现细胞核。扫描染色的切片并拍摄照片。使用Halo软件，鉴定肿瘤区域和脉管系统区域。对于同种型对照和抗PD-L1，取这两个区域中标记的RBC的总细胞计数。计算在肿瘤中发现的RBC与在血管中发现的RBC之间的比率。图13中呈现的数据表明，对于同种型对照缀合的RBC，血管中的RBC和肿瘤中的RBC之间的比率是1(来自8只小鼠的肿瘤中的平均测量值)，表明肿瘤和脉管系统中的相似量。对于抗PD-L1治疗的小鼠，血管中的RBC与肿瘤中的RBC之间的比率为1.7，表明与同种型对照小鼠相比，抗PD-L1组中肿瘤中RBC的富集。两组之间的比例差异具有统计学意义，其中P<0.01(学生T检验)。
虽然不希望受理论束缚，但表达较高水平的PD-L1的肿瘤比表达较低水平的PD-L1的肿瘤可以对包含抗PD-L1的RCT更好地应答。当用10ng/ul的IFN-γ刺激时，B16F10细胞表达PD-L1的约300,000个拷贝/细胞。相反，CT26细胞表达PD-L1的约150,000个拷贝/细胞，并且A20细胞表达PD-L1的约100,000个拷贝/细胞。使用Quantum Simply Cellular试剂盒(Bangs Laboratories)测量PD-L1拷贝数。在其表面包含抗PD-L1抗体的红系细胞显示出与IFN-γ处理的B16F10细胞和CT26的结合比与A20细胞的结合更大，这与肿瘤细胞上更高水平的PD-L1表达一致，导致红系细胞与肿瘤细胞结合增加。
实例8：表达两种试剂的红系细胞比单独表达的任一多肽促进更大的免疫效应细胞刺激。
来自1个供体的人外周血单核细胞(PBMC)获得自Astrate生物制剂公司并在IL-2细胞因子分泌测定中进行分析。用5ug/mL CD3抗体刺激500,000个PBMC。将细胞与500,000个RCT对照细胞或者表达抗PD-L1或4-1BB-L的RCT一起孵育。同时，测试了500,000个RCT-抗PD-L1和500,000个表达4-1BB-L的RCT的组合。同时平行地，测试了500,000个表达抗PD-L1和4-1BB-L两者的细胞。24小时后，收集上清液并进行IL-2ELISA以评估由于RCT-抗PD-L1和RCT 4-1BB-L的孵育，IL-2向培养基的分泌。与单独的PBMC相比，RCT抗PD-L1导致IL-2分泌增加4倍。RCT 4-1BB-L导致4-1BB-L分泌增加10倍，而RCT抗PD-L1和RCT-4-1BB-L的组合导致IL-2分泌增加13倍。用抗PD-L1测量到相同的13倍增加，并且在RCT上共表达4-1BB-L，如同PD-L1和4-1BB-L在非重叠细胞群中表达时一样；然而，与非重叠细胞群(总共1,000,000个细胞)相比，共表达细胞在一半剂量(500,000个细胞)下实现了这种效果。
此实验表明，表达两种试剂的红系细胞比单独表达的任一多肽产生更大的免疫效应细胞刺激(通过细胞因子分泌测量)。这里使用的两种试剂是共刺激分子(4-1BBL)和结合免疫检查点分子的试剂(抗PD-L1)。此外，当两种试剂在相同细胞上表达时，与当两种试剂在不同细胞群中表达时相比，效果更大。
实例9：表达抗癌剂的RCT促进信号传导、增殖、细胞因子分泌、和抗原回忆
图14的表总结了用表达4-1BB-L、OX40-L、GITR-L、和ICOS-L的RCT产生的数据。信号传导活性是指如实例5中针对4-1BB-L、OX40-L和GITR-L所述的NFkB/Luc测定(其中Jurkat细胞表达NFkB/Luc和分别对于4-1BB、OX40或GITR的受体)。如实例5中所述进行增殖测定和细胞因子分泌测定。使用来自CMV阳性供体(阿施塔特公司(Astarte))的200,000个PBMC进行抗原回忆测定，将其使用2ug/mL的CMV感染细胞(阿施塔特公司(Astarte))的裂解物进行刺激。然后将PBMC与表达指示的外源蛋白质的100,000个RCT一起孵育4天。用流式细胞术分析细胞中记忆T细胞群的存在，以检测作为CD4+和CD45RO+的细胞。收集来自这些实验的上清液并使用ELISA分析IFNg。这些实验表明，表达多种共刺激分子的红系细胞诱导T细胞活化。
序列表
<110> 鲁比厄斯治疗法股份有限公司
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<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 智人
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Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser Ser Ser Val
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Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His Lys Arg Asp
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Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu Ile Ser Val
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Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg Val Gln Leu
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Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val
65 70 75 80
Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg
85 90 95
Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu Pro Ser Pro
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Ser Asp Gln
130
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 2
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
1 5 10 15
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
20 25 30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
65 70 75 80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
85 90 95
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro
100 105 110
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
115 120 125
Thr Arg Arg Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
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His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
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Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
245 250 255
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
260 265 270
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
275 280
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<212> PRT
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<220>
<221> 来源
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Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
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Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
20 25 30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
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Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
85 90 95
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Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Arg Gly
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His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
165 170 175
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
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Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
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Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
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Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
245 250 255
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
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Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
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Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
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Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
20 25 30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
65 70 75 80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
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Lys Ala Leu Gly Ile Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Arg Gly
145 150 155 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
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His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
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Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
195 200 205
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Asp Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
210 215 220
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
245 250 255
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
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Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
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Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
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Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
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Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
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Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
65 70 75 80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
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Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
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Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
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His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
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Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
195 200 205
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
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Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
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Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
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Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
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Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
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Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
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Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
65 70 75 80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
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Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
115 120 125
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
130 135 140
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
145 150 155 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
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His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
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Gln Glu Arg Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
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Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
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Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
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Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
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Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met His His Glu Ala
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
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<220>
<221> 来源
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<400> 8
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe
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Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
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Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
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115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Lys Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Phe Asn Arg
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 12
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 13
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Gly Leu Trp Phe Asp Ser Asp Gly Arg Gly Phe Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Pro
210 215 220
<210> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Tyr
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
100 105 110
Arg Glu Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 15
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 15
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 16
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 16
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 17
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
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Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 18
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
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Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
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Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
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Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 19
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 19
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Gly Gly Tyr Tyr Gly His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 20
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Gly Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
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Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
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Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Val Ser Ser Pro Pro
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<210> 21
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 21
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
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<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Thr Trp
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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<210> 24
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Ser
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<210> 25
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 25
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser
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Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
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<221> 来源
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
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Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
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His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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<220>
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<220>
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<220>
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<400> 33
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<220>
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<400> 34
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<220>
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<211> 215
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<220>
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<400> 36
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<220>
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290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 38
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 38
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 40
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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<400> 41
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<220>
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
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Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
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Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Lys
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
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Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys
450
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 44
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
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Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
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Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
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Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
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Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
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340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
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Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
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Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 46
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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210
<210> 47
<211> 447
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
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<210> 48
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 48
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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<220>
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Lys
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
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450
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<220>
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<400> 56
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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<211> 214
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<213> 人工序列
<220>
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<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 57
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<400> 58
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 60
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 60
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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85 90 95
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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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<212> PRT
<213> 智人
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210
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 63
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 66
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg
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<220>
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<220>
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<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 68
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<211> 213
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<220>
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<400> 69
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Asn Arg Gly Glu Cys
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<220>
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<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 71
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 71
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 72
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
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Ser Ser Ile Thr Ser Tyr Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
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Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
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Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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<220>
<221> 来源
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<400> 73
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Arg Asp Thr Tyr Gly
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Tyr Tyr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Gly Asp Ser Ser Pro Val Lys
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Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
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Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Phe Tyr
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Phe Ile Pro Ile Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ile Pro Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Asp Tyr Asp Met Asp Val
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Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
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Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
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Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
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Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
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Gly Lys
450
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 75
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Met Tyr
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 76
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Asp Ser Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
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Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Thr Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Gly Met Tyr Phe Cys
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Val Arg Val Gly Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
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Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
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Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
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225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
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290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
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Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
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Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
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Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 77
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 77
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met
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His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
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Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Cys Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu
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Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Phe Pro Leu Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
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Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
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Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
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Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 78
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 78
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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435 440 445
Gly Lys
450
<210> 79
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 79
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
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Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
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Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro
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Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
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Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg
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195 200 205
<210> 81
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成的多肽"
<400> 81
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
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Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp
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Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
130 135 140
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val
145 150 155 160
Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
165 170 175
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
195 200 205
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr
210 215 220
His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235

Claims (20)

1.一种将试剂例如结合剂递送至受试者中血管外位点的方法，该方法包括：
向该受试者的血流给予有效量的包含多个去核红系细胞的制剂，该多个去核红系细胞中的每个细胞在其表面包含含有针对存在于该血管外位点的抗原例如肿瘤抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而将该试剂例如结合剂递送至该血管外位点。
2.一种治疗患有抗性例如难治性或复发性癌症的受试者的方法，该方法包括：
以足以治疗该癌症的量向该受试者给予(例如，给予至该受试者的血流)包含多个去核红系细胞的制剂，该多个去核红系细胞中的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽，
从而治疗该癌症。
3.一种治疗受试者中血管化实体瘤的方法，该方法包括：
以足以治疗该血管化实体瘤的量向该受试者的血流给予包含多个去核红系细胞的制剂，该多个去核红系细胞中的每个细胞在其表面包含含有针对肿瘤细胞抗原的结合剂例如抗体的外源多肽
从而治疗该血管化实体瘤。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该外源多肽包含跨膜结构域和抗体。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该抗体是scFv。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该抗体是抗CD20抗体，并且该肿瘤抗原是CD20。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该抗体是抗PD-L1抗体，并且该肿瘤抗原是PD-L1。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该外源多肽以大于104、105、或106的拷贝数存在。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该红系细胞进一步包含第二外源多肽。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该癌症缺乏功能性半胱天冬酶细胞凋亡途径。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该癌症包含表8的突变。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该癌症对表1的抗体治疗剂具有抗性。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该多个去核红系细胞以一定的量并持续一定时间给予以有效地产生以下的一种(或多种，例如，2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种)：(a)减小的肿瘤尺寸、(b)降低的肿瘤生长速率、(c)增加的肿瘤细胞死亡、(d)降低的肿瘤进展、(e)减少的转移数量、(f)降低的转移速率、(g)减少的肿瘤复发、(h)增加的受试者存活、(i)增加的受试者无进展存活。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该多个去核红系细胞以一定的量并持续一定时间给予以有效地导致靶癌细胞例如B细胞的细胞凋亡，例如，半胱天冬酶非依赖性细胞凋亡和/或半胱天冬酶依赖性细胞凋亡。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该抗体是抗CD20抗体，并且该多个去核红系细胞诱导癌细胞表面上CD20的超交联。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中例如，在肿瘤中红系细胞积累的峰时，(i)在肿瘤中停留的表达外源蛋白质的去核红系细胞与(ii)该受试者的血流中表达外源蛋白质的去核红系细胞的数量的比率大于1:1。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中(i)表达外源蛋白质的去核红系细胞与(ii)肿瘤中的内源红系细胞的比率是至少2:1。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中肿瘤中停留的结合剂例如抗体的量比不与红系细胞相关的在其他方面相似的结合剂，例如抗体，例如游离抗体的量大至少2倍。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中与缺乏该结合剂的在其他方面相似的去核红系细胞相比，表达外源蛋白质的去核红系细胞在肿瘤中的的持续存在增加至少2倍。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该受试者是人受试者。
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