KR20200140279A - 암 및 감염성 질환을 치료하기 위한 치료 세포 시스템 및 방법 - Google Patents

암 및 감염성 질환을 치료하기 위한 치료 세포 시스템 및 방법 Download PDF

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KR20200140279A
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denuclearized
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constructed
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KR1020207029027A
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토마스 조셉 위컴
시반 엘로울
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루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨.
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Abstract

본 공개는 세포 표면에, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 펩티드를 포함하도록 제작된 적혈구 세포에 관련되며, 여기서 제시된 외부 유래 자극 폴리펩티드는 면역 살상 세포(면역 살상 세포)를 자극하는데 충분하다. 본 공개의 제작된 핵 제거된 세포 (enucleated cells) 는 암 또는 염증성 질환이 있는 개체와 같은 이가 있어야 하는 개체, 및 MHC 유형 I 표현이 하향조절된 특징이 있는 특정한 암 또는 염증성 질환이 있는 개체에서 NK 세포 및/또는 CD8+T-세포를 활성화 시키는 방법에 유용하다.

Description

암 및 염증성 질환 치료를 위한 치료적 세포 시스템 및 방법
관련된 출원 (Related application)
이 출원은 2018년 3월 8일에 제출된 미국 가 출원 특허 (U.S. Provisional Patent Application) No. 62/640,530, 2018년 4월 20일에 제출된 미국 가 출원 특허 (U.S. Provisional Patent Application) No. 62/660,657, 2018년 6월 4일에 제출된 미국 가 출원 특허 (U.S. Provisional Patent Application) No. 62/680,490, 2018년 6월 29일에 제출된 미국 가 출원 특허 (U.S. Provisional Patent Application) No. 62/692,487, 2018년 9월 17일에 제출된 미국 가 출원 특허 (U.S. Provisional Patent Application) No. 62/732,050, 및 2018년 11월 8일에 제출된 미국 가 출원 특허 (U.S. Provisional Patent Application) No. 62/757,717에 우선권을 청구하며, 각각의 그 전문이 모든 목적을 위하여 참고 문헌으로 여기에 병합되었다.
서열 목록 (Sequence Listing)
이 출원은 ASCII 포멧 (format)으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며 및 여기에 그 전문이 참고 문헌으로 병합되었다. 상기 ASCII 카피는, 2019년 3월 5일에 만들어졌으며, 129267-00220_SL.txt로 이름 붙어졌으며 및 그 크기는 127,920 바이트이다.
CD8+ T 세포 및 세포는 면역 시스템의 세포독성 주효 세포 (cytotoxic effector cells) 이다. CD8+ T 세포 및 세포는 서로 다른 기전의 인식 및 신호전달 연쇄반응 (signaling cascades) 을 가졌으나, 이 둘은 모두 감염된 및 형질 전환된 세포를 죽이는 비슷한 목적을 가진 유형의 살생 세포다. 종양에 대한 CD8+ T 세포 및 세포의 반응을 자극하기 위하여 몇 가지 전략이 사용되었다. CD8+ T 세포는 현재의 암 면역치료에 결정적인 역할을 한다. 사이토카인 치료 (Cytosine therapy)는 몇 가지 인간 암 치료에 사용되며, 여기서 인터루킨 (예를 들어, IL-2, IL-12. IL-15, IL-18 및 IL-21) 과 같은 사이토카인 또는 TNFα로 처치하면 국부 CD8+ T 세포 및 세포 활성 (예를 들어, 분화 및 활성화) 을 강화시킨다. 암 환자에서 세포 활성 및 확장에 대한 IL-2 투여 효과가 여러 시험에서 평가되었으며, 암의 유형 및 IL-2를 투여한 컨디션에 따라 뒤섞인 결과가 얻어졌다. 더 나이가, 사이토카인 투여가 관여하는 그러한 치료는 잠재적인 독성과도 연관 된다.
연구에서는 CD8+ 종양 침투 림프구의 양과 면역치료로 진전-없는 생존 사이에 양성적인 상관관계가 있음을 보여준다 ((예를 들어, 사르마 등 (Sharma et al., Science 2015, 348:56-61) 참조)). CAR-T 세포는 암을 없애기 위하여 CD8+ T 세포의 세포독성을 이용한다. 그러나. CAR-T 세포 치료의 도전중에 하나는 CAR-T 세포가 종양 특이적이지 않다는 것이다. CAR-T를 타겟으로 하는 것에 대한 안전성에 대한, 특히 고형암에서, 상당한 우려가 있어왔다 (Junghans, Cancer Gene Therapy (2017) 24, 89-99).
현재, NK 세포를 타겟으로 하는 가장 전망 좋은 접근 방법 중 일부는, 자기조직의 NK 세포, 동종이형 (allogenic) NK 세포, NK 세포주 및 CAR NK 세포 사용을 포함하는, 적응적 세포 이전 (adoptive cell transfer)이 관여된다, 그러나 이 접근방법들은 효능이 낮거나, GVHD를 피하기 위하여 (동종이형 세포를 위하여) 상당한 T 세포 고갈을 요구하고, 개체에서 지속성이 낮고, 및 많은 수의 세포를 확장시키거나 및/또는 제조하는데 어려움이 있는 것과 같은 문제점과 연관되어 있다.
그러므로 이 분야 기술에서 치료 목적으로 면역 살상 세포 (예를 들어, NK 세포 및 CD8+T-세포)를 개발하는 다른 방법들이 아직 필요하다.
본 공개는 면역 살상 세포 (예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+T-세포)를 자극하도록 제작된 적혈구 세포 ((예를 들어, 제작된 적혈구 세포 (제작된 적혈구 세포))와 관련된 것이다. 특히, 본 발명은 적혈구 세포를 제공한다. 특히, 본 발명은 적혈구 세포 표면에 예를 들어, IL-12, IL-15/IL-15RA, 4-1BBL 또는 이들의 조합과 같은 외부 유래 자극성 폴리펩티드를 하나 또는 그 이상을 MK 세포 및/또는 CD8+T-세포를 활성화하고 및/또는 확장시키기에 충분하도록 발현시켜 면역 살상 세포 (예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+T-세포)를 자극하도록 제작된 적혈구 세포를 제공한다. 제작된 적혈구 세포는 핵이 있을 수 있거나, 예를 들어, 적혈구 전구 세포 (적혈구 전구 세포s) ((예를 들어, 적혈구 전구 세포 (erythrocyte precursor cells)), 또는 핵이 없는 적혈구 세포, 예를 들어, 망상 적혈구 (reticulocytes) 또는 적혈구 (erythrocytes) 일 수 있다. 본 발명은 더 나아가 이 제작된 적혈구 세포를, 암을 지닌 개체 또는 감염성 질환을 지닌 개체와 같은, 이를 필요하는 개체에서 NK 세포 및/또는 CD8+T-세포를 활성화 시키는데 사용하는 용도를 제공한다.
여기서 제공되는 제작된 적혈구 세포 (제작된 적혈구 세포s) 는 자연적으로 면역-특권적이고 및 면역 살상 세포의 생체 내 자극을 직접 중개하는 현재의 면역 살상 세포 타겟팅 기술에 대비하여 상당한 장점을 제공하며, 그러므로 면역 살상 세포의 적응성 세포 전이 (adoptive cell transfer) 와 연관된 단점을 피할 수 있다. 본 발명에서 제작된 적혈구 세포는 생체 내에서 이들 세포 집단에 노출되었을 때 NK 세포 및/또는 CD8+T-세포가 동시에 자극되도록 제작될 수 있다. 특히, IL-12, IL-15/IL-15RA, 4-1BBL 또는 이들의 조합을 포함하는 제작된 적혈구 세포는 강력한 일차 CD4+, CD8+, NK 및 NKT 세포 활성을 유도하고 및 NK 세포 세포독성을 유도한다는 것이 본 발명의 발견이다. 생체 내에서 NK 세포 및/또는 CD8+T-세포 둘 다를 자극하는 것은 자극이 생체 밖에서 일어나고 및 전형적으로 한 번에 하나 집단의 면역 세포 (NK 세포 또는 CD8+T-세포) 자극으로 제한하는 현존하는 치료에 비해 중요한 혁신을 나타낸다.
제작된 적혈구 세포는 예를 들어, 단일 적혈구 세포에 세포 표면에 여러 다른 자극 분자 및 아주 상당히 많은 수는 포함하는 것은 물론 자극 신호를 긴 순환 반감기를 가지고 적혈구 세포를 통해 순환 시스템에 직접적으로 전달 및 유지시켜, 이로써 좀 더 안전하고 및 좀 더 효과적인 면역 살생 세포 자극하는 방법을 나타나내는 추가적인 장점을 제공한다. 특별한 실시 예에서, 본 발명의 제작된 적혈구 세포에의 자극 분자는 여기 서술된 대로 면역 살상 세포를 함께 상승적으로 활성화 시키도록 작동한다. 면역세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는, 여기서 서술된 대로, 어떤 실시 예에서, 전이성 암을 포함하는 암을 치료하기 위하여 사용된다. IL-12, IL-15/IL-15RA, 4-1BBL 또는 이들의 조합을 포함하는 제작된 적혈구 세포는 효과적으로 암 성장을 느리게 할 수 있고 및 생체 내에서 종양 부담을 감소시킬 수 있는 것이 본 발명에서의 발견이다.
따라서, 첫 번째 관점에서, 본 공개는 면역 살생 세포를 자극하도록 제작된 핵 제거된 세포 (engineered enucleated cell) 제공하며, 여기서 핵 제거된 세포는 적어도 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하며, 여기서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 면역 살생 세포를 자극하기에 충분하다. 어떤 실시 예에서, 면역 살생 세포는 자연 살상 세포 (natural killer (NK) cell). 어떤 실시 예에서, 면역 살생 세포는 CD8+ T-세포다. 어떤 실시 예에서 핵 제거된 세포는 적어도 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 적어도 외부 유래 자극 폴리펩티드 중 하나는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함한다: IL-1, IL-2, IL-12, IL-15, IL-15/IL-15RA 융합, IL-18, IL-21, 인터페론 알파 (interferon alpha) (IFNα), 4-1BBL, 폴리오바이러스 수용체 (Poliovirus Receptor)(PVR/CD155), CD48, 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigen) (HLA)-A, HLA-C, HLA-G, 헤파린 설페이트 (heparan sulfate) (HS), HLA-E, CpG, 면역글로블린 G (Immunoglobulin G) (IgG), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 (MHC class I chain-related proteins) (MIC), B7-H6, NkP44L, 넥틴 2 (Nectin2), NK-T-B 항원 (NTBA), 활성-유도된 C-형 렉틴 (activation-induced C-type lectin) (AICL), 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1). 어떤 실시 예에서, 적어도 외부 유래 자극 폴리펩티드 중 하나는 IL-15/IL-15RA 융합을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 적어도 외부 유래 자극 폴리펩티드 중 하나는 IL-12를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 적어도 외부 유래 자극 폴리펩티드 중 하나는 4-1BBL을 포함한다. 어떤 실시 예에서, MIC 단백질은: MHC 유형 I 체인-관련 단백질 A (MHC class I chain-related protein A) (MICA), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 B (MHC class I chain-related protein B) (MICB) 및 UL16 결합 단백질 (UL16 binding proteins) (ULBP)로 구성된 군으로부터 선택된다. 어떤 실시 예에서, 적어도 외부 유래 자극 폴리펩티드 중 하나는: IL-15/IL-15RA 융합, MICA, MICB, 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1)으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA를 포함하고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는: IL-1, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, 4-1BBL, IFNα, MICA, MICB, PVR 및 CD48로 구성된 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA를 포함하고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA를 포함하고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12를 포함하고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는: IL-18 및 IL-12, IL-18 및 IL-21, IL-12 및 4-1BBL, IL-12 및 IL-15/IL-15RA 융합, 및 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA 융합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12를 포함하고, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-18을 포함하고 및 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL15/IL-15RA 융합을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12를 포함하고, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-18을 포함하고 및 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 적어도 하나의 외부 유래 폴리펩티드는 카피 수가 104, 105, 또는 106 보다 크게 존재한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상이 아니거나 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배보다 더 크지 않게 존재한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 카피 수는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상이 아니거나 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배보다 더 크지 않게 존재한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 그 존재비가 무게로나 또는 카피 수로 약 1:1, 약 2:1에서 1:2, 약 5:1에서 1:5, 약 10:1에서 1:10, 약 20:1에서 1:20, 약 50:1에서 1:50, 또는 약 100:1에서 1:100를 가진다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드들은 융합 폴리펩티드로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드들은 융합 폴리펩티드로서 존재한다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 적어도 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드들은 제작된 핵 제거된 세포의 표면에 존재한다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 적어도 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드들은 더 나아가 막통과 도메인 (transmembrane domain)을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 막통과 도메인은 글라이코포린 A (glycophorin A) (GPA) 또는 이의 막통과 부위를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 막통과 도메인은 작은 내장된 멤브레인 단백질 1 (small integral membrane protein 1) (SMIM1). 또는 이의 막통과 부위를 포함한다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 NK 세포를 활성화 시킬 능력이 있다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 NK 세포를 확장시킬 수 있다. 어떤 실시 예에서, NK 세포는 메모리-유사 NK 세포 (memory-like NK cell)다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 CD8+ T-세포를 활성화 시킬 능력이 있다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 CD8+ T-세포를 확장시킬 능력이 있다. 어떤 실시 예에서, CD8+ T-세포는 메모리 T-세포이다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 적혈구 세포 (erythroid cell) 이다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 망상적혈구(reticulocyte)이다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 적혈구 (erythrocyte) 이다.
다른 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 핵 제거된 세포를 제공하며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-15 (interleukin-15) (IL-15) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha) (IL-15RA) 폴리펩티드의 세포 밖 부분, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 밖 부분은 한 복합체로 존재한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은, IL-15RA 폴리펩티드 또는 이의 단편의 세포 밖 부분에 링커로 연결되어 있다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번호: 11)를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커는 (GGGGS)3 링커 (서열번호: 12)를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 29 또는 서열번호 37과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인 (IL-15 receptor alpha sushi-binding domain)을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 복합체로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 융합 폴리펩티드로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인에 링커로 연결된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번호: 11)를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커는 (GGGGS)3 링커 (서열번호: 12)를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 31과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 핵 제거된 세포는 더 나아가 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 41과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 43과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12의 p40 및 p35 서브유닛 (subunits)을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 37과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 55와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 핵 제가 세포 (engineered enucleated cell)는 더 나아가 IL-1, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, 인터페론 알파 (interferon alpha) (IFNα), 폴리오바이러스 수용체 (Poliovirus Receptor)(PVR/CD155), CD48, 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigen) (HLA)-A, HLA-C, HLA-G, 헤파린 설페이트 (heparan sulfate) (HS), HLA-E, CpG, 면역글로블린 G (Immunoglobulin G) (IgG), UL16 결합 단백질 (ULBP), ( MHC 유형 I 체인-관련 단백질 (MHC class I chain-related proteins) (MIC), B7-H6, NkP44L, 넥틴 2 (Nectin2), NK-T-B 항원 (NTBA), 활성-유도된 C-형 렉틴 (activation-induced C-type lectin) (AICL), 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, MIC 단백질은 MHC 유형 I 체인-관련 단백질 A (MICA) 또는 MHC 유형 I 체인-관련 단백질 B (MICB) 이다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 제작된 핵 제거 세포의 표면에 존재한다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 면역 살상 세포를 자극하기에 충분하다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 104, 105, 또는 106 보다 큰 카피 수로 존재한다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상 크지 않거나 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배보다 크지 않은 카피 수로 존재한다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상 크지 않거나 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배보다 크지 않은 카피 수로 존재한다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 존재비는 무게로나 또는 카피 수로 약 1:1, 약 2:1에서 1:2, 약 5:1에서 1:5, 약 10:1에서 1:10, 약 20:1에서 1:20, 약 50:1에서 1:50, 또는 약 100:1에서 1:100를 가진다. 어떤 실시 예에서, 제작된 핵 제거된 세포는 더 나아가 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 핵 제거된 세포는 두 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하며 및 이 두 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드로서 존재한다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 핵 제거된 세포는 세 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하며 및 이 세 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드로서 존재한다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 더 나아가 막통과 도메인을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 막통과 도메인은 글라이코포린 A (glycophorin A) (GPA) 또는 이의 막통과 부분을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 막통과 도메인은 작은 내장된 멤브레인 단백질 1 (small integral membrane protein 1) (SMIM1). 또는 이의 막통과 부위를 포함한다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 핵 제거된 세포는 면역 세포를 자극할 능력이 있다. 어떤 실시 예에서, 면역 세포는 살상 면역세포다. 어떤 실시 예에서, 살상 면역 세포는 자연 살상 세포 (natural killer (NK) cell)다. 어떤 실시 예에서, NK 세포는 메모리-유사 NK 세포 (memory-like NK cell)다. 어떤 실시 예에서, 살상 면역 세포는 CD8+ T-세포다. 어떤 실시 예에서, CD8+ T-세포는 메모리 T-세포이다. 어떤 실시 예에서, 자극되는 면역 세포는 활성화 면역 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 자극되는 면역 세포는 확장된 면역 세포를 포함한다. 여기의 어느 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 핵 제거된 세포는 적혈구 세포 (erythroid cell) 이다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 망상적혈구 (reticulocyte)이다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 적혈구 (erythrocyte)다.
다른 관점에서, 본 공개는 적어도: MHC 유형 I 체인-관련 단백질 A (MHC class I chain-related protein A) (MICA), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 B (MHC class I chain-related protein B) (MICB), 및 인슐린-유사 성장 인자 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1):로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 핵 제거된 세포를 제공한다. 어떤 실시 예에서는, 핵 제거된 세포는 더 나아가 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-1, IL-2, IL-12, IL-15, IL-15/IL-15RA 융합, IL-18, IL-21, 인터페론 알파 (interferon alpha) (IFNα), 4-1BBL, 폴리오바이러스 수용체 (Poliovirus Receptor)(PVR/CD155), CD48, HLA-A, HLA-C, HLA-G, 헤파린 설페이트 (heparan sulfate) (HS), HLA-E, CpG, IgG, UL16 결합 단백질 (UL16 binding proteins) (ULBP), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 (MHC class I chain-related proteins) (MIC), B7-H6, NkP44L, 넥틴 2 (Nectin2), NK-T-B 항원 (NTBA), 활성-유도된 C-형 렉틴 (activation-induced C-type lectin) (AICL), 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1)으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다. 여기의 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 제작된 핵 제거된 세포의 표면에 존재한다. 여기의 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 면역 살상 세포를 자극하기에 충분하다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 104, 105, 또는 106 보다 큰 카피 수로 존재한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상 크지 않거나, 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배보다 크지 않은 카피 수로 존재한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상 크지 않거나 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배 보다 크지 않은 카피 수로 존재한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 존재비는 무게로나 또는 카피 수로 약 1:1, 약 2:1에서 1:2, 약 5:1에서 1:5, 약 10:1에서 1:10, 약 20:1에서 1:20, 약 50:1에서 1:50, 또는 약 100:1에서 1:100를 가진다. 어떤 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 더 나아가 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 여기의 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 핵 제거된 세포는 두 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하며 및 이 두 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드로서 존재한다.여기의 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 핵 제거된 세포는 세 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하며 및 이 세 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드로서 존재한다. 여기의 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드들은 막통과 도메인 (transmembrane domain)을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 막통과 도메인은 글라이코포린 A (glycophorin A) (GPA) 또는 이의 막통과 부위를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 막통과 도메인은 작은 내장된 멤브레인 단백질 1 (small integral membrane protein 1) (SMIM1). 또는 이의 막통과 부위를 포함한다. 여기의 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 핵 제거된 세포는 면역 세포를 자극 시킬 능력이 있다. 어떤 실시 예에서, 면역 세포는 살상 면역세포다. 어떤 실시 예에서, 살상 면역 세포는 자연 살상 세포 (natural killer (NK) cell)다. 어떤 실시 예에서, NK 세포는 메모리-유사 NK 세포 (memory-like NK cell)다. 어떤 실시 예에서, 살상 면역 세포는 CD8+ T-세포다. 어떤 실시 예에서, CD8+ T-세포는 메모리 T-세포이다. 어떤 실시 예에서, 자극되는 면역 세포는 활성화 면역 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 자극되는 면역 세포는 확장된 면역 세포를 포함한다.
다른 관점에서, 본 공개는 면역 살상 세포를 자극하는 방법을 제공하며, 여기의 관점 및 실시 예 중 어느 것의 제작된 핵 제거된 세포를, 면역 살상 세포를 자극하기에 효과적인 양으로 면역 살상 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 면역 살상 세포는 NK 세포이다. 어떤 실시 예에서, 면역 살상 세포는 CD8+ T-세포이다. 어떤 실시 예에서, 자극은 NK 세포를 활성화 시키는 것을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 자극은 NK 세포를 확장시키는 것을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 자극은 CD8+ T-세포를 활성화 시키는 것을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 자극은 CD8+ T-세포를 확장시키는 것을 포함한다. 어떤 실시 예에서, CD8+ T-세포는 메모리 T-세포이다. 여기의 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 접촉은 생체 내에서 수행된다. 여기의 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 접촉은 생체 밖에서 수행된다. 여기의 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 접촉은 실험 관 내에서 수행된다. 어떤 실시 예에서, 이 방법은 더 나아가 면역 살상 세포를 필요로 하는 개체에 제작된 핵 제거된 세포 투여를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 개체는 암을 지녔다. 어떤 실시 예에서, 암은 낮은 MHC 유형 1 제시로 특징지어진다. 어떤 실시 예에서, 암은 PD-1-반응성 종양을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 암은 높은 돌연변이 부담(burden)을 가진 종양을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 개체는 MHC 유형 1 제시를 감소시키는 화학요법제제로 처치된다. 어떤 실시 예에서, 암은 폐암, 간세포 암, 흑생종 및 임프종으로부터 선택된다. 어떤 실시 예에서, 암은 림프종을 포함하며, 및 림프종은 호드킨스 림프종 (Hodgkin's lymphoma) 또는 비-호드킨스 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma)을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 개체는 감염성 질환을 지닌다. 어떤 실시 예에서, 감염성 질환은 바이러스 감염에 의해 원인이 된다. 어떤 실시 예에서, 바이러스 감염은 낮은 MHC 유형 1 제시로 특징지어진다.어떤 실시 예에서, 바이러스 감염은: 아데노바이러스 (adenovirus), 엡스타인 바 바이러스 (Epstein barr virus) (EBV), 간염 B 바이러스 (hepatitis B virus) (HBV), 결핵 (tuberculosis), 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus) (HIV), 허피스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus)(HSV), 파필로마 바이러스 (papilloma virus), 및 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus):로 구성된 그룹으로부터 선택된 바이러스에 의해 원인이 된다.
다른 관점에서, 본 공개는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기의 관점 및 실시 예 중 어느 것의 제작된 핵 제거된 세포를, 개체에서 암을 치료하기에 효과적인 양으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 암은 낮은 MHC 유형 I 제시 (MHC class I presentation)를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 암은 PD-1-반응성 종양을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 암은 높은 돌연변이 부담(burden)을 가진 종양을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 암은 폐암, 간세포암, 흑색종 및 림프종으로부터 선택된다. 어떤 실시 예에서, 암은 림프종을 포함하며, 및 림프종은 호드킨스 림프종 (Hodgkin's lymphoma) 또는 비-호드킨스 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma) 으로부터 선택된다.
다른 관점에서, 본 공개는 개체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기의 관점 및 실시 예 중 어느 것의 제작된 핵 제거된 세포를, 개체에서 감염성 질환을 치료하기에 효과적인 양으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 바이러스 감염은 MHC I 제시가 하양 조절되는 특징이 있다. 어떤 실시 예에서, 바이러스 감염은 아데노바이러스 (adenovirus), 엡스타인 바 바이러스 (Epstein barr virus) (EBV), 간염 B 바이러스 (hepatitis B virus) (HBV), 결핵 (tuberculosis), 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus) (HIV), 허피스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus)(HSV), 파필로마 바이러스 (papilloma virus), 및 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus)로부터 선택된 바이러스에 의해 원인이 된다.
다른 관점에서, 본 공개는 면역 세포를 자극하도록 제작된 핵 제거된 적혈구 세포를 제공하며, 여기 포함하는 공정서 면역 세포는 살상 세포이며, 제작된 핵 제거된 세포 표면에 두 개 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 두 개 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 면역 세포를 자극하기에 충분하며, 각 외부 유래 자극 폴리펩티드 중 하나를 암호화하는, 두 개 또는 그 이상의 외부 유래 핵산을 핵이 있는 적혈구 세포에 도입시키고; 및 핵 있는 적혈구 세포에서 핵이 제거되고 및 두 개 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드가 생산되기에 적절한 조건하에서 핵이 있는 적혈구 세포를 배양하는 것을 포함하는 공정으로 생산된다.
다른 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포를 제공하며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하며, IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편에 링커로 연결되어 IL-15/IL-15RA 융합을 형성하고, IL-15/IL-15RA 융합을 암호화하는 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고; 및 핵 있는 적혈구 세포에서 핵이 제거되고 및 IL-15/IL-15RA 융합이 생산되기에 적절한 조건하에서 핵이 있는 적혈구 세포를 배양하는 것을 포함하는 공정으로 생산된다.
다른 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포를 제공하며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하며, IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편에 링커로 연결되어 IL-15/IL-15RA 융합을 형성하고; 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL, 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 세포는 i. 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 첫 번째 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고; ii. 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 두 번째 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고; 및 iii. 핵 있는 적혈구 세포의 핵 제거에 적절한 조건 및 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 생산에 적절한 조건하에서 핵 있는 적혈구 세포를 배양하는 것을 포함하는 공정으로 생산된다.
다른 관점에서, 본 공개는 제작된 핵 제거된 세포를 제공하며, i. 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하고, IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편에 링커로 연결되어 IL-15/IL-15RA 융합을 형성하고; 및 ii. 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12, 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 세포는 i. 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 첫 번째 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고 (introduction); ii. 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 두 번째 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고; 및 iii. 핵 있는 적혈구 세포의 핵 제거에 적절한 조건 및 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 생산에 적절한 조건하에서 핵 있는 적혈구 세포를 배양하는 것을 포함하는 공정으로 생산된다.
다른 관점에서, 본 공개는 제작된 핵 제거된 세포를 제공하며, i. 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL, 또는 이의 단편을 포함하고; 및 ii. 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12, 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 세포는 i. 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 첫 번째 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고; ii. 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 두 번째 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고; 및 iii. 핵 있는 적혈구 세포의 핵 제거에 적절한 조건 및 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 생산에 적절한 조건하에서 핵 있는 적혈구 세포를 배양하는 것을 포함하는 공정으로 생산된다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 도입 단계는 첫 번째 외부 유래 핵산 및 두 번째 외부 유래 핵산을 둘 다 포함하는 단일 렌티바이러스 벡터 (lentiviral vector)를 핵 있는 세포에 형질도입시키는 것을 포함한다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 도입 단계는 첫 번째 외부 유래 핵산을 포함하는 첫 번째 렌티바이러스 벡터 및 두 번째 외부 유래 핵산을 포함하는 두 번째 렌티바이러스 벡터 둘 다를 핵 있는 적혈구 세포에 형질도입시키는 것을 포함한다.
다른 관점에서, 본 공개는 제작된 핵 제거된 적혈구 세포를 제공하며, 제작된 핵 제거된 세포 표면에; IL-15/IL-15RA 융합, MHC 유형 1 체인-관련 단백질 A (MHC class I chain-related protein A) (MICA), MHC 유형 1 체인-관련 단백질 B (MHC class I chain-related protein B) (MICB) 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1) 으로 구성된 군으로부터 선택된, 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 핵 있는 적혈구에 도입시키고; 및 핵 있는 적혈구 세포의 핵 제거에 적절한 조건 및 적어도 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 생산에 적절한 조건하에서 핵 있는 적혈구 세포를 배양하는 것을 포함하는 공정으로 생산된다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 외부 유래 핵산은 DNA를 포함한다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 외부 유래 핵산은 RNA를 포함한다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 도입 단계 (introduction step)는 바이러스 형질전달 (transduction)을 포함한다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 도입 단계는 전기천공법 (electroporation)을 포함한다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 도입 단계는: 리포솜 매개하는 전달 (liposome mediated transfer), 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노-연관된 바이러스 (adeno-associated virus), 허피 바이러스 (herpes virus), 레트로바이러스 근거한 벡터 (retroviral based vector), 리포펙숀 (lipofection), 및 렌티바이러스 벡터 (lentiviral vector) 중 하나 또는 그 이상을 사용하는 것을 포함한다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 도입 단계는 렌티바이러스 벡터의 형질도입에 의해 외부 유래 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 렌티바이러스 벡터는 베타-글로빈 프로모터 (beta-globin promoter), 쥐 줄기세포 바이러스 프로모터 (murine stem cell virus (MSCV) promoter), 깁슨 원숭이 백혈병 바이러스 프로모터(Gibbon ape leukemia virus (GALV) promoter), 인간 연장 인자 1 알파 프로모터 (human elongation factor 1 alpha (EF1 alpha) promoter), CAG CMV 전 초기 증강제 (CAG CMV immediate early enhancer) 및 닭 베타-액틴 (chicken beta-actin) (CAG), 및 인간 포스포글레세레이트 키나아제 1 프로모터 (human phosphoglycerate kinase 1 (PGK) promoter)로 구성된 그룹으로부터 선택된 프로모터를 포함한다.
도 1A는 IL-15 변이체 v3, v4 및 v5를 발현하도록 제작된, 적혈구 세포가, 말초 혈액 단핵구 세포 (peripheral blood mononuclear cells) (PBMCs)와 함께 배양되고 및 자극되지 않았을 때, 총 CD8+ 수의 증가를 유도하는 것을 보여주는 그래프이다. 3 공여자로부터 얻은 100,000 PBMCs를 300,000의 제작된 적혈구 세포와 배양시켰다. 제작된 적혈구 세포 없이 배양된 PBMCs (no RBC) 및 표면에 단지 HA 에피톱 태그 (HA epitope tag)만 발현하는 적혈구와 배양된 PBMCs은 음성 대조군으로 사용되었다. 재조합 인간 IL-15 (rh IL-15) 와 함께 배양된 BMC는 용해성 IL-15와 비교로서 사용되었다. 총 CD8+ 세포 수는 5일 째날에 세었다. 도 1A에 보여준 결과는 2-3 PBMC 공여자로부터 (검사한 총 6 다른 PMBC 공여자 중) 각각의 4번의 독립적인 실험을 대표한다.
도 1B는 IL-15/IL-15RA 변이체 v3, v4 및 v5를 발현하도록 제작된 적혈구 세포가, 말초 혈액 단핵구 세포 (peripheral blood mononuclear cells) (PBMCs)와 함께 배양되고 및 항-CD3 항체 (anti-CD3 antibody)(aCD3)로 자극했을 때, 총 CD8+ 수의 증가를 유도하는 것을 보여주는 그래프이다. 3 공여자로부터 얻은 100,000 PBMCs를 0.5㎍/mL aCD3 플러스 300,000 또는 100,000 제작된 적혈구 세포와 배양시켰다. 도 1B에 보여준 그래프에 있는 두 개의 바 (bar)는 사용된 300,000 (왼쪽) 또는 100,000 (오른쪽)의 제작된 적혈구 세포를 나타낸다. 제작된 적혈구 세포가 없이 배양된 PBMCs (no RBC) 및 표면에 단지 HA 에피톱 태그 (HA epitope tag)만 발현하는 적혈구와 배양된 PBMCs은 음성 대조군도 1A에 보여준 결과는 2-3 PBMC 공여자로부터 (검사한 총 6 다른 PMBC 공여자) 각각의 4번의 독립적인 실험을 대표한다.으로 사용되었다. 재조합 인간 IL-15 (rh IL-15) 와 함께 배양된 PBMC는 양성 대조군으로 사용 되었다. 총 CD8+ 세포 수는 5일 째날에 세었다. 도 1B에 보여준 결과는 2-3 PBMC 공여자로부터 (검사한 총 6 다른 PMBC 공여자 중) 각 4번의 독립적인 실험을 대표한다.
도 2A는 IL-15/IL-15RA 변이체 v3, v4 및 v5를 발현하도록 제작된 적혈구 세포가 정제된 NK 세포와 함께 배양되었을 때 NK 세포를 확장시킬 수 있음을 보여주는 그래프 패널 (i, ii 및 iii) 이다. (i) 한 공여자로부터 정제한 40,000 NK 세포를 두 개로 플레이트하고 및 7일 동안: 제작된 적혈구 세포 (900,000, 300,000, 100,000), rhIL-2 (1000, 100, 10U/mL), rhIL-15 (10, 1, 0.1ng/mL)의 적정량과 배양 시켰다. 제작된 적혈구 세포 없이 배양된 NK 세포 (no RBC) 및 표면에 단지 HA 에피톱 태그 (HA epitope tag)만 발현하는 적혈구 세포와 배양시킨 PBMCs는 음성 대조군으로 사용되었다. 분석은 7일 째날에 수행되었다. 도 2A (ii)에서 NK 세포는 900,000 제작된 적혈구와 배양되었으며, 및 이 세포들에 발현된 카피 수는 세포에 제시된 총 IL-15 카피 수(X-축에 보여줌)를 계산하는데 사용되었다. 도 2A (iii)에서 NK 세포는 300,000 제작된 적혈구와 배양되었으며, 및 이 세포들에 발현된 카피 수는 세포에 제시된 총 IL-15 카피 수(X-축에 보여줌)를 계산하는데 사용되었다.
도 2B는 IL-15/IL-15RA 변이체 v3, v4 및 v5를 발현하도록 제작된 적혈구 세포가 PBMCs와 배양시켰을 때 NK 세포를 확장시킬 수 있음을 보여주는 그래프 패널 (i, ii 및 iii) 이다. 도 2B (i)에서는 두 공여자로부터의 100,000 PBMCs (두 개로 플레이트)는 900,000, 300,000 또는 100,000 제작된 적혈구 세포와 배양되었다. 제작된 적혈구 세포 없이 배양된 PBMCs 세포 (no RBC) 및 표면에 단지 HA 에피톱 태그 (HA epitope tag)만 발현하는 적혈구 세포와 배양시킨 PBMCs는 음성 대조군으로 사용되었다. 유동 세포 분석 (Flow cytometry analysis)은 7일째 날에 수행되었으며, 살아있는/죽은, CD56+CD3- 세포에 대한 게이트를 적용하였다. 도 2B (ii)에서는 PBMCs는 900,000의 제작된 적혈구와 배양되었으며, 및 이 세포들에 발현된 카피 수는 세포에 제시된 총 IL-15 카피 수(X-축에 보여줌)를 계산하는데 사용되었다. 도 2B (iii)에서는 PBMCs 세포는 300,000 제작된 적혈구와 배양되었으며, 및 이 세포들에 발현된 카피 수는 세포에 제시된 총 IL-15 카피 수(X-축에 보여줌)를 계산하는데 사용되었다
도 3A는 생체 밖 (ex vivo) 실험의 결과를 보여주는 그래프로, 여기서 강력한 NK 세포 확장이 생체 밖에서 관찰되었다.
도 3B는 생체 내 (in vivo) 실험 결과를 보여주는 그래프로, 여기서 IL-15/IL-15RA 재조합 단백질과 접합 된 적혈구 세포 (mRBC)로 처치한 생쥐에서 강력한 림프구 증식이 관찰되었다. 증식되는 세포의 마커로서 퍼센트 Ki67 염색으로 측정한 대로 NK 세포 증식을 보여준다.
도 3C는 생체 내 (in vivo) 실험 결과를 보여주는 그래프로, 여기서 IL-15/IL-15RA 재조합 단백질과 접합 된 적혈구 세포 (mRBC)로 처치한 생쥐에서 강력한 림프구 활성이 관찰되었다. 활성화된 세포의 마커로서 퍼센트 그랜자임 B (granzyme B) 발현에 의해 측정한 대로 NK 세포 활성화를 보여준다.
도 4A는 높은 수준의 4-1BB 수용체는 물론 NFκB/Luc를 발현하는 저켓 세포 (Jurkat cells)에서 NFκB 활성화로 측정한 대로 제작된 적혈구 세포의 표면에서 4-1BBL의 이의 자연적인 3배체 구조로의 발현은 아주 강력한 T-세포 활성화를 유도함을 보여주는 그레프이다.
도 4B는 4-1BBL을 발현하는 제작된 적혈구 세포에 의한 NFκB의 활성화는 조정할 수 있음을 보여주는 그래프다.
도 5A는 제작된 적혈구 세포의 표면에서 4-1BBL의 자연적인 3배체 구조로의 발현은 일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포 (primary CD4+ and CD8+ T cells)의 증식 및 활성화로 측정한 대로 아주 강력한 T-세포 활성화를 유도함을 보여주는 그레프이다.
도 5B는 제작된 적혈구 세포의 표면에서 4-1BBL의 자연적인 3배체 구조로의 발현은 ELISA에 의해 측정된, IFNγ 및 TNFα 분비로 측정된 대로 아주 강력한 T-세포 활성활를 유도함을 보여주는 그래프다.
도 6은 4-1BBL을 발현하는 적혈구 세포는 MC38 종양 모델에서 종양의 성장을 억제함을 보여주는 그래프다.
도 7은 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA 둘 다를 발현하는 제작된 적혈구 세포는 CD3 자극과 함께 또는 CD3 자극 없이 지라세포를 강력하게 활성화 시킴을 보여주는 그래프다.
도 8은 200,000 세포 각각에서 4-1BB-L, IL-15/IL-15RA 또는 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA 둘 다의 혼합물을 발현하는 제작된 적혈구 세포 200,000와 배양시킨 NK 세포에 의해 실험관 내에서 K562 인간 만성 골수성 백혈병 (K562 human chronic myelogenous leukemia) (CML) 세포를 죽이는 것을 보여주는 그래프다.
도 9는 4-1BBL을 발현하도록 제조된 쥐 적혈구 세포에 의해 CD8+ T 세포 및 이의 서브세트 (subset)((증식하는 CD8+ 메모리 세포 (CD8+ memory cells);CD8+ 주효 메모리 세포 (CD8+ effector memory cells), 그랜자임 B+ CD8 (granzyme B+ CD8 cells))의 생체 내 (in vivo) 증식을 보여주는 그래프다.
도 10은 4-1BBL을 발현하도록 제조된 쥐 적혈구 세포가 항-41BB mAb, 3H3 와는 반대로 생쥐에서 간 독성을 일으키지 않음을 보여주는 그래프다. 알라닌 트랜스아미네이즈 (alanine transaminase) (ALT; SGPT) 및 아스파르테이트 트랜스아미네이즈 (aspartate transaminase)(AST; SGOT)의 수준이 측정되었다.
도 11은 저켓 세포에서(Jurkat cell) NFκB 활성화로 측정한 대로, 제작된 적혈구 세포 표면에 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL의 함께 발현, 및 4-1BBL 단독 발현이 아주 강력한 T-세포 활성화 결과를 보여주는 그래프다.
도 12는 4-1BBL 또는 IL-15/IL-15RA 단독으로 발현하는 제작된 적혈구 세포와 비교하여 제작된 적혈구 세포 표면에 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL의 발현은 CD8+ T 세포, NK 세포, 및 이들 세포의 서브세트 둘 다를 강력하게 확장하는 것을 보여주는 그래프다.
도 13A 및 도 13C는 쥐 B16F10 폐 전이 모델에서, 적혈구 세포 표면에 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 함께 제시하도록 제조된 적혈구 세포의 효력을 보여 주는 그래프들이다.
도 13B는 쥐 B16F10 폐 전이 모델에서, 적혈구 세포 표면에 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 함께 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포로 처치한 쥐의 폐에서 NK 세포의 침투를 보여주는 그래프다,
도 13D는 쥐 B16F10 폐 전이 모델에서, 적혈구 세포 표면에 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 함께 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포로 처치한 쥐의 종양에서 총 NK 세포 수의 증가를 보여주는 그래프다.
도 13E는 쥐 B16F10 폐 전이 모델에서, 적혈구 세포 표면에 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 함께 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포로 처치한 쥐의 종양에서 성숙된 NK 세포 수의 증가를 보여주는 그래프다.
도 13F는 쥐 B16F10 폐 전이 모델에서, 적혈구 세포 표면에 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 함께 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포로 처치한 쥐의 종양에서 기능적 NK 세포 수의 증가를 보여주는 그래프다.
도 14는 IL-15/IL-15RA (v4), 4-1BBL PBMCs를 발현하는 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL ("co")를 함께-발현하는 적혈구 세포와 장기간 프라임 (primed) 시킨후 (8일) PBMCs의 표현형 분석을 보여주는 그래프 패널이다. 마커 Ki67, 그랜자임 B (Granzyme B), TRAIL, CD69, NKp44 및 41BB는 증강된 NK 세포 생존, 확장 및 활성화를 보여주는 표현형 판독으로 사용되었다.
도 15는 IL-15/IL-15RA ("IL-15TP")를 발현하는 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL ("IL-15TP+41BBL")을 함께-발현하는 적혈구 세포와 8일 동안 프라임(primed) 시킨 NK 세포가 K562 타겟에 대하여 증강된 세포독성을 가졌음을 보여주는 그래프다. K562 세포의 퍼센트 살상 (percent killing)을 보여준다.
도 16은 IL-15/IL-15RA ("IL-15TP")를 발현하는 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL ("IL-15TP+41BBL")을 함께-발현하는 적혈구 세포와 하룻밤 동안 프라임 시킨 NK 세포가 라지 인간 B-림프구 (Raji human B-lymphocyte) 타겟 세포에 대하여 증강된 ADCC 살상을 지니고 있음을 보여주는 그래프다. 라지 세포 (Raji cell)의 퍼센트 특이 살상을 보여준다.
도 17A는 CT26 대장암 쥐 모델에서, 적혈구 세포 표면에 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 함께 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포의 효력을 보여주는 그래프다.
도 17B는 CT26 대장암 쥐 모델에서, 적혈구 세포 표면에 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 함께 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포로 처치한 쥐의 종양으로 증식하는 (왼쪽) 및 기능적 (오른쪽) 세포독성 CD8 T 세포의 침투를 보여주는 두 그래프 패널이다.
도 18A-도 18E는 항-4-1BB mAb, 3H3와는 반대로 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA를 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 쥐에서 간 독성의 원인이 되지 않음을 보여주는 그래프 패널이다. 혈청에서 간 효소 알라닌 트란스아미네이즈 (alanine transaminase) 수준 (도 18A), 간 마크로파지 (liver macrophages) (도 18B), 간 CD8+/Eomes+/KLRG1+ 세포 (도 18C), 및 간 침투하는 T 세포 (CD8+ T 세포) (도 18D)가 측정되었다. 간 염색 및 염증 스코어 (inflammation score)가 또한 결정되었다 (도 18E). 도 18F는 용해성 IL-15와는 반대로 IL-15/IL-15RA를 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 쥐에서 간 독성의 원인이 되지 않음을 보여주는 그래프 패널이다.
도 19는 제작된 적혈구 세포의 표면에 IL-12 및 IL-15/IL-15RA의 발현이, ELISA로 측정한 대로, 상승적으로 INFg 분비를 유도하고 (도 19A), 및 CD8 (도 19B), CD4 (도 19C), NK (도 19D) 및 NKT (도 19E) 세포의 증식을 통해 아주 강력한 면역-반응을 유도함을 보여주는 그래프의 패널이다.
도 20A는 IL-12, IL-15/IL-15RA, 4-1BBL로 접합된 쥐 적혈구 세포의 퍼센트, 또는 클릭 방법 (click methodology)를 사용하여 IL-12 및 IL-15/IL-15RA, IL-12 및 4-1BBL, 및 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL 둘 다를 공동-접합시킨 쥐 적혈구 세포의 퍼센트를 보여주는 그래프이다. 이 세포들은 Cy5 형광으로 유동세포 분석으로 정량되었다.
도 20B는 쥐 B16F10 폐 전이 모델에서, 적혈구 세포 표면에 IL-12, IL-15/IL-15RA, 4-1BBL 및 이들의 조합을 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포의 효력을 보여주는 그래프다.
도 20C는 IL-12, IL-15/IL-15RA, 4-1BBL 및 이의 조합을 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포로 처치된 생쥐에서, 폐 전이의 수의 감소는 증가한 증식하고 있고 및 세포독성인 CD8 T 세포 및 NK 세포의 폐에의 침투와 연관되고 있음을 보여주는 그래프 패널이다.
도 21는 IL-12를 포함하고 있는 적혈구 세포는 MC38 (도 21A) 및 B16F10 (도 21B) 생쥐 모델에서 종양 성장을 억제함을 보여주는 그래프다.
도 22는 재조합 IL-12 (rIL-12) 와는 반대로 IL-12 및 IL-15/IL-15RA, 및 IL-12 및 4-1BBL를 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 쥐에서 간 독성의 원인이 되지 않음을 보여주는 그래프 패널이다. 혈청에서의 간 효소 알라닌 트란스아미네이즈 (alanine transaminase) (ALT) (도 22A)의 수준, 혈청에서의 인터페론 감마 (interferon gamma) (IFNg) (도 22B)의 수준, 간 무게 (도 22C), 및 지라 무게 (도 22D)가 측정되었다.
도 23A는 IL-12, 단독 또는 항-PD1 항체 (anti-PD1 antibody)와 조합하여 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 B16F10 생쥐 모델에서 종양 성장을 억제함을 보여주는 그래프다.
도 23B는 IL-12, IL-15/IL-15RA, 또는 이의 조합을 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 B16F10 생쥐 모델에서 종양 성장을 억제함을 보여주는 그래프다.
도 23C는 IL-12/IL-15/IL-15RA, 단독 또는 항-PD1 항체와 조합하여 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 B16F10 생쥐 모델에서 종양 성장을 억제함을 보여주는 그래프다.
도 23D는 IL-12, 단독 또는 항-PD1 항체 (anti-PD1 antibody)와 조합하여 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 B16F10 생쥐 모델에서, 처치된 생쥐의 생존을 개선시킴을 보여주는 그래프다.
도 23E는 IL-12/IL-15/IL-15RA, 단독 또는 항-PD1 항체와 조합하여 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 B16F10 생쥐 모델에서, 처치된 생쥐의 생존을 개선 시킴을 보여주는 그래프다.
도 23F는 IL-12/IL-15 + a-PD1 군으로 처치된 종양에서 CD8 T 세포의 증가 된 침투, IL-15/IL-15RA mRBC 군에서 NK 세포의 증가 된 침투, 및 IL-12 함유하는 군에서 대식세포 (macrophages)의 M1 표현형을 향한 증가 된 편광, 즉 고전적으로 활성화된 대식세포의 항-종양 표현형을 보여주는 그래프다.
도 24A는 IL-12 또는 IL-12/4-1BBL, 단독으로 또는 항-PD1 항체와 조합하여 제시되도록 제조된 le9 쥐 적혈구 세포로의 처치는 MC38 생쥐 모델에서 종양 성장을 억제함을 보여주는 그래프다.
도 24B는 IL-12 또는 IL-12/4-1BBL, 단독으로 또는 항-PD1 항체와 조합하여 제시되도록 제조된 3e8 쥐 적혈구 세포로의 처치는 MC38 생쥐 모델에서 종양 성장을 억제함을 보여주는 그래프다.
도 24C는 IL-12 또는 IL-12/4-1BBL, 단독으로 또는 항-PD1 항체와 조합하여 제시되도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 MC38 생쥐 모델에서 종양 성장을 억제함을 보여주는 그래프다. 데이터는 이 연구에 사용된 각각의 생쥐에 대한 데이터로 표시된다.
도 24D는 IL-12 또는 IL-12/4-1BBL, 단독으로 또는 항-PD1 항체와 조합하여 제시되도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 MC38 생쥐 모델에서 종양의 위축을 유도함을 보여주는 그래프다. 데이터는 이 연구에 사용된 각각의 생쥐에 대한 데이터로 표시된다.
도 25A는 MC38 생쥐 모델에서, IL-12 또는 IL-12/4-1BBL, 단독으로 또는 항-PD1 항체와 조합하여 제시되도록 제조된 쥐 적혈구 세포로 처치된 종양에서, 증가 된 CD4, CD8 T 세포 침투, 및 고전적으로 활성화된 대식세포로의 (M1 표현형) 증가 된 편광을 보여주는 그래프다.
도 25B는 MC38 생쥐 모델에서, IL-12 또는 IL-12/4-1BBL, 단독으로 또는 항-PD1 항체와 조합하여 제시되도록 제조된 쥐 적혈구 세포로 처치된 종양에서, CD4 T 세포보다 CD8으로 좀 더 이동하고, 및 조절 T 세포 (regulatory T cell)의 손실을 보여주는 그래프다.
도 26A-도 26D는 재조합 IL-12 (rIL-12) 와는 반대로 IL-12 및 IL-15/IL-15RA, 또는 IL-12 및 4-1BBL를 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 생쥐에서 독성의 원인이 되지 않음을 보여주는 그래프 패널이다. 몸무게 (도 26A), 간 무게 (도 26B), 지라 무게 (도 26C), WBC 수 및 헤모글로블린 (hemoglobin) 수준 (도 26D)의 변화가 측정되었다.
도 26E-26F는 재조합 IL-12 (rIL-12) 와는 반대로 IL-12를 제시하도록 접합 된 쥐 적혈구 세포는 생쥐에서 독성의 원인이 되지 않음을 보여주는 그래프 패널이다. 몸무게 변화 (도 26E), 간 무게, 지라 무게, WBC, RBC 수 및 헤모글로블린 (hemoglobin) 수준, ALT 및 IFNg (도 26F)의 변화가 측정되었다.
도 27은 재조합 IL-12 (rIL-12) 와는 반대로 IL-12 및 IL-15/IL-15RA, 또는 IL-12 및 4-1BBL를 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 생쥐에서 독성의 원인이 되지 않음을 보여주는 그래프 패널이다. 효소 IFNg (도 27A), TNFa (도 27B)의 수준의 변화가 측정되었으며, 및 간 효소 ALT 수준과 비교되었다.
도 28은 IL-12, IL-15/IL-15RA, 4-1BBL 또는 이의 조합을 발현하도록 유전적으로 제작된 인간 적혈구 세포가 K562 타겟에 대하여 살상 증강에 의해 (도 28A) 및 라지 세포 타겟 (Raji cell targets)의 살상을 증강된 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)에 의해 (도 28B) NK 세포 세포독성을 유도함을 보여주는 그래프 패널이다.
도 29A는 항-CD3와 조합하여 IL-12 포함하는, 핵 제거 제작된 인간 적혈구 세포는 PBMCs로부터 상당한 양의 IFNg 생산을 유도하고, 및 IL-12/4-1BBL는 가장 높은 수준의 IFNg를 유도하는 것을 보여주는 그래프다.
도 29B는 항-CD3가 없이, IL-12를 포함하는, 핵 제거 제작된 인간 적혈구 세포는 PBMCs로부터 IFNg 생산을 유도함을 보여주는 그래프다.
도 29C는 항-CD3와 조합하여, 41BBL, IL-12/4-1BBL 또는 IL-15/IL-15RA/4-1BBL를 발현하는 핵 제거 제작된 인간 적혈구 세포는, CD4 세포의 증식을 유도함을 보여주는그래프다.
도 29D는 항-CD3와 함께 조합하여, IL-12/IL-15/IL-15RA, IL-12/4-1BBL 또는 IL-15/IL-15RA/4-1BBL를 발현하는 제작된 인간 적혈구 세포가 CD8 세포 증식을 중간 정도로 증강 시킴을 보여주는 그래프다.
도 29E는 항-CD3와 함께 조합하여, IL-12/4-1BBL 또는 IL-15/IL-15RA/4-1BBL를 발현하는 제작된 인간 적혈구 세포가 상당한 NKT 세포 증식을 유도함을 보여주는 그래프다.
도 29F는 항-CD3 없이, IL-12/IL-15/IL-15RA를 발현하는 제작된 인간 적혈구 세포가 제한적인 CD4 세포 증식을 유도함을 보여주는 그래프다.
도 29G는 항-CD3 없이, IL-12/IL-15/IL-15RA, IL-12/4-1BBL 또는 IL-15/IL-15RA/4-1BBL를 발현하는 제작된 인간 적혈구 세포는 CD8 세포 증식을 중간 정도로 증강 시킴을 보여주는 그래프다.
도 29H는 항-CD3 없이, IL-12/IL-15/IL-15RA를 발현하는 제작된 인간 적혈구 세포는 NK 세포 분열을 증강 시키나 세포 수는 증가시키지 않아, 단지 중간 정도의 NK 세포 증식을 제시함을 보여주는 그래프다. IL-12/4-1BBL 및 IL-15/4-1BBL는 대규모로 NK 세포 증식을 유도하며, IL-12/4-1BBL 와는 커다란 세포 수 증가를 초래하며, 및 IL-15/IL-15RA/4-1BBL 효과를 능가한다.
도 29I는 항-CD3 없이, IL-12/IL-15/IL-15RA, IL-12/4-1BBL 또는 IL-15/IL-15RA/4-1BBL 을 발현하는 제작된 인간 적혈구 세포는 NKT 세포에 대하여 중간 정도의 증식 효과를 유도함을 보여주는 그래프다.
도 29J는 IL-12, IL-15/IL-15RA, 4-1BBL을 발현하거나 또는 IL-12/IL-15/IL-15RA, IL-12/4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA/4-1BBL을 함께-발현하는 RBCs가 새로운 (naive) 인간 CD4 세포의 Th1 분화를 유도할 수 있음을 보여 주는 그래프다.
도 30A는 IL-12 V2 (SMIM1에 연결된 IL-12) 가 IL-12 V1 (GPA에 연결된 IL-12) 에 비해, 단독으로 또는 4-1BBL과 조합하여, 세포 표면에 IL_12를 상당히 더 크게 나타내는 것이 관찰되었음을 보여주는 그래프다.
도 30B는 SMIM1가 멤브레인 도메인으로 사용되었을 때, 세포 표면에서 IL-12의 증가된 수준이 NFκB 신호전달의 증강된 활성을 제공함을 보여주는 그래프다.
본 공개는 적혈구 세포의 표면에, NK 세포 및/또는 CD8+T-세포를 활성화 시키고 및/또는 확장시키기에 충분하게, 자극성 사이토카인 (stimulatory cytokines) 과 같은 외부 유래 자극 폴리펩티드 하나 또는 그 이상을 발현시켜, 면역 살상 세포 (예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+T-세포의 확장. 활성화 및/또는 세포독성 활성을 자극하도록) 을 자극하도록 제작된 적혈구 세포의 개발에 근거한다. 어떤 실시 예에서, 본 발명은 IL-12, IL-15/IL-15RA, 4-1BBL, 또는 이들의 조합, 예를 들어, 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA, 4-1BBL 및 IL-12, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA 를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 이는 강력한 CD4+, CD8+ 및 NK 세포 활성을 유도하고, 및 NK 세포 세포독성을 유도하는 것으로 발견되었다. 본 공개의 실시 예에 따르면, 제작된 적혈구 세포는 핵이 있거나, 또는 핵이 제거된 세포이다. 여기서 제공된 제작된 적혈구 세포는 자연적으로 면역-우선적이고 및 생체 내에서 면역 살상 세포 (예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+T-세포)의 자극을 직접적으로 중개하는 현재의 면역 살상 세포 타겟팅 기술에 비해 상당한 장점을 제공하며, 그러므로 면역 살상 세포의 적응성 세포 이전 (adoptive cell transfer)과 관련된 단점을 피하게 한다. 제작된 적혈구 세포는, 예를 들어, 세포 표면에, 하나의 핵 제거된 세포에 몇 가지 다른 자극성 분자를 포함하고, 및 상당히 높은 수의, 예를 들어, 4-1BBL 및 IL-12, 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA를 포함하도록 제시할 수 있는 추가의 장점을 제공함은 물론이고, 적혈구 세포를 통해 자극 신호를 긴 순환 반감기를 가지면서, 순환계 시스템 전체에 전달 및 유지시키는 장점을 제공하며, 그러므로 면역 살상 세포를 좀 더 안전하고 및 좀 더 효과적으로 자극하는 방법을 제공한다.
이 발명이 적용되는 기술분야 전문가에게는 여기서 제시된 본 발명의 많은 수정 및 다른 실시 예들이 앞선 서술 및 관련 그림에서 제시된 알림에 이점이 있음을 쉽게 생각할 수 있을 것이다. 그러므로 본 발명은 공개된 특정한 실시 예에만 국한하지 않음이 이해되어야 하고 및 수반되는 청구항의 범위 내에서 수정 및 다른 실시 예들이 포함될 의도가 있음이 이해되어야 한다. 특정한 용어가 여기에서 사용된다 하더라도, 이들은 포괄적이고 및 서술적인 의미에서만 사용되고 및 제한하려는 목적은 아니다.
정의 (Definitions)
이 명세서 및 수반되는 청구항에서 사용된 대로, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 그 내용이 분명히 달리 구술되지 않는 한 복수 대상도 포함된다.
다른 한편으로 (alternative) (예를 들어, "or") 의 사용은 하나, 둘 다, 또는 다른 한편의 이들의 어느 조합의 하나를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
여기서 사용된 대로, "약 (약)" 이라는 용어는, 양, 일시적인 지속기간, 및 이와 비슷한 것과 같은, 측정할 만한 값을 언급할 때는 특정한 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 좀 더 바람직하게는 ±5%, 더 나아가 좀 더 바람직하게는 ±1%, 및 아직 더 바람직하게는 ±0.1%의 변화를 포함함을 의미하며, 그러한 변화는 공개된 방법을 수행하는데 적절하다.
여기서 사용된 대로, 어느 농도 범위, 퍼센트 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는, 달리 제시되지 않는 한, 인용된 범위 내의 어느 정수의 값, 및 해당할 때는, 이들의 분획 (정수의 10분의 1 또는 100분의 1과 같은)을 포함하는 것으로 이해된다.
여기서 사용된 대로, "포함하다 (comprise)", "포함 (comprising)" 및 "포함하다 (comprises)." 및 "로 포함하다 (comprised of)"는 "포함하다 (include)", "포함 (including)", 포함하다 (includes) 또는 "함유하다 (contain)", "함유 (containing)", "함유하다 (contains)"와 동의어임을 의미하며 및 이어지는 것의 존재를, 예를 들어, 성분의 존재를 명시하는 포괄적이거나 또는 끝이-열려 있는 (open-ended) 용어이며 및 이 분야에서 알려지거나 또는 여기서 공개된 추가의, 비-인용된 성분, 모양, 요소, 멤버, 단계의 존재를 제외하거나 또는 배제하지 않는다.
여기서 사용된 대로, "그와 같이 (such as)", "예를 들어(for example)" 및 이와 유사한 이란 용어는 예시적 실시 예를 의미하려는 의도이며 및 본 공개의 범위를 제한하려는것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 여기서 사용된 모든 기술적인 및 과학적인 용어는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상 전문가 중 하나가 보통 이해하는 것과 같은 의미를 갖는다. 여기서 서술된 것과 비슷한 또는 동동한 방법 및 재료가 본 발명의 테스트를 실행하는데 사용될 수 있으나, 바람직한 재료 및 방법들은 여기에 서술된다.
여기서 사용된 대로, "활성화 CD8+ T 세포 (activating CD8+ T cells)" 또는 "CD8+ T 세포 활성화 (CD8+ T cell activation)" 라는 용어는: 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 주효 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커 발현으로부터 선택된, 하나 또는 그 이상의 CD8+ T 세포 (CTL)의 세포 반응의 원인 또는 결과의 과정 (예를 들어, 신호 전달 과정)을 의미한다. 여기서 사용된 대로, "활성화된 CD8+ T 세포 (activated CD8+ T cell)"는 활성화 신호를 받고, 및 이로써 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 주효 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커 발현으로부터 선택된, 하나 또는 그 이상의 세포 반응을 보이는 CD8+ T 세포를 의미한다. CD8+ T 세포의 활성화를 측정하는 적절한 에세이는 이 분야 기술에서 알려졌으며 및 여가서 서술된다.
여기서 사용된 대로, "CD8+ T 세포를 확장하는 (expanding a CD8+ T cell)" 또는 "CD8+ T 세포 확장 (CD8+ T cell expansion)" 이란 용어는 CD8+ T 세포가 일련의 세포 분열을 거쳐 이로써 세포 수가 확장되는 과정을 의미한다. " 확장된 CD8+ T 세포 (expanded CD8+ T cells)" 란 용어는 CD8+ T 세포 확장을 통해 얻은 CD8+ T 세포와 관련된다. CD8+ T 세포의 확장을 측정하는 적절한 에세이는 이 분야 기술에서 알려졌으며 및 여기서 서술된다.
여기서 사용된 대로, "NK 세포를 활성화하는 (activating an NK cell)" 또는 "NK 세포 활성화 (NK cell activation)" 란 용어는 NK 세포가 MHC 유형 1 발현이 결핍된 세포를 죽일 수 있는 능력이 있게 하거나 또는 죽이는 결과를 가져올 수 있게 하는 과정 (예를 들어, 신호전달 과정)을 의미한다. 여기서 사용된 대로, "활성화된 NK 세포 (activated NK cell)"는 신호를 받고 및 활성화하고, 및 이로써 MHC 유형 1 발현이 결핍된 세포를 죽일 수 있는 NK 세포를 의미한다. NK 세포 활성화를 측정하는 적절한 에세이는 이 분야 기술에서 알려졌으며 및 여기서 서술된다.
여기서 사용된 대로, "NK 세포를 확장하는 (expanding an NK cell)" 또는 "NK 세포 확장 (NK cell expansion)"은 NK 세포가 일련의 세포 분열을 거쳐 이로써 세포 수가 확장되는 과정을 의미한다. " 확장된 NK 세포 (expanded NK cells)" 란 용어는 NK 세포 확장을 통해 얻은 NK 세포와 관련된다. NK 세포의 확장을 측정하는 적절한 에세이는 이 분야 기술에서 알려졌으며 및 여기서 서술된다.
여기서 사용된 대로, "투여 (administration)", 투여하는 (administering)" 및 이의 변이는 조성물 또는 제제를 개체에 도입시키는 것을 의미하며 및 동시 및 순차적으로 조성물 또는 제제를 도입시키는 것을 포함한다. "투여 (administration)"는 예를 들어, 치료적, 약동학적, 진단적, 연구, 위약, 및 실험적 방법을 의미할 수 있다. "투여 (administration)"는 시험관 내 및 체외 처치도 또한, 포함한다. 개체로의 조성물 또는 제제의 도입은, 경구로, 폐로, (pulmonarily), 비강 내로 (intranasally), 비경구로 (parenterally) ((정맥으로 (intravenously), 근육 내로 (intramuscularly), 복강 내로 (intraperitoneally) 또는 피하로 (subcutaneously)), 직장으로 (rectally), 림프 내로 (intralymphatically), 또는 국부적으로 (topically)를 포함하는 어느 적절한 경로 (route)에 의한다. 투여는 자가-투여 및 다른 것에 의한 투여를 포함한다. 투여는 어느 적절한 경로로 수행될 수 있다. 적절한 경로로의 투여는 조성물 또는 제제가 이의 의도된 기능을 수행하도록 한다. 예를 들어, 적절한 경로가 정맥으로이면, 조성물 또는 제제를 개체의 정맥에 도입시켜 조성물이 투여된다.
여기서 사용된 대로, "항체 (antibody)" 란 용어는 넓은 의미에서 사용되며 및 이것에만 국한하지 않으나, 단일클론 항체, 폴리클론 항체, 및 바람직한 항원-결합 활성을 보여주기만 하는 한 항체 조각을 포함하는 여러 가지 항체 구조를 포함한다.
여기서 사용된 대로, "암 (cancer)" 이라는 용어는 비정상적인 세포가 조절되지 않고 분열하는 질환을 의미한다. 어떤 실시 예에서, 암은 다른 조직을 침투할 수 있다. 100개 이상의 다른 타입의 암이 존재한다. 대부분의 암은 기관에 대하여 또는 시작되는 세포의 타입에 대하여 이름 지어진다- 예를 들어, 결장에서 시작되는 암은 결장 (대장) 암이라고 불리고; 피부의 멜라닌 세포 (melanocyte)에서 시작되는 암은 흑색종 (melanoma)이라고 불린다. 암의 타입은 좀 더 넓은 범주로 그룹 지어질 수 있다. 암의 주 범주에는; 상피성 암 (carcinoma)((피부 또는 내부 기관에 라인 되어 (line) 있거나 또는 덮고 있는 조직에서 시작되는 암을 의미하며, 및 이의 아형, 선암 (adenocarcinoma), 기저 세포 암 (basal cell carcinoma), 편평 상피 암 (squamous cell carcinoma), 및 이행세포 암종 (transitional cell carcinoma)을 포함한다)); 육종 (sarcoma) (뼈 연골, 지방, 근육, 혈관, 또는 다른 연결조직 또는 지지조직에서 시작하는 암을 의미한다); 백혈병 (leukemia) ((혈액-생성 조직 (예를 들어, 골수)에서 시작되며 및 많은 수의 비정상 혈액 세포를 생산하게 하고 및 혈액에 들어가게 하는 암을 의미 한다)); 림프종 및 골수종 (lymphoma and myeloma)(면역시스템의 세포에서 시작하는 암을 의미한다); 및 중추신경계 (central nervous system) (CNS) 암 (뇌 및 척수의 조직에서 시작되는 암을 의미한다). "골수 이형성 증후군 (myelodysplastic syndrome)" 이란 용어는 골수가 건강한 혈액 세포 (백혈구 세포, 적혈구 세포, 및 혈소판)를 충분히 만들지 못하고 및 혈액 및/또는 골수에 비정상적인 세포가 있는 유형의 암을 의미한다. 골수 이형성 증후군은 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia) (AML)으로 될 수도 있다. 어떤 실시 예에서는, 암은, 이것에만 국한하지 않으나, 급성 림프아구 백혈병 (UTE lymphoblastic leukemia) (ALL), 급성 골수성 백혈병 (ACUTE myeloid leukemia) (AML), 항문암 (anal cancer), 담관암 (bile duct cancer), 방광암 (bladder cancer), 뼈암 (bone cancer), 장암 (bowel cancer), 뇌종양 (brain tumour), 유방암 (breast cancer), 미지의 일차 암 (cancer of unknown primary), 뼈로 퍼지는 암 (cancer spread to bone), 뇌로 퍼지는 암 (cancer spread to brain), 간으로 퍼지는 암 (cancer spread to liver), 폐로 퍼지는 암 (cancer spread to lung), 암양종 (carcinoid), 자궁암 (cervical cancer), 융모막 암종 (choriocarcinoma), 만성 림프구 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia)(CLL), 만성 골수성 백혈병 (chronic myeloid leukemia) (CML), 결장암 (colon cancer), 직장암 (colorectal cancer), 자궁내막암 (endometrial cancer), 눈암 (eye cancer), 담낭암 (gallbladder cancer), 위암 (gastric cancer), 임신영양암 (gestational trophoblastic tumour) (GTT), 털 세포 백혈병 (hairy cell leukemia), 머리 및 목 암 (head and neck cancer), 호드킨 림프종 (Hodgkin lymphoma), 신장암 (kidney cancer), 후두암 (laryngeal cancer), 백혈병 (leukemia), 간암 (liver cancer), 폐암 (lung cancer), 림프종 (lymphoma), 흑색종 피부암 (melanoma skin cancer), 중피종 (mesothelioma), 남자의 암 (men's cancer), 기태 임신 (molar pregnancy), 입 및 구강인두암 (mouth and oropharyngeal cancer), 골수종 (myeloma), 코 및 부비강 암 (nasal and sinus cancers), 비인두암 (nasopharyngeal cancer), 비 호드킨 림프종 (non hodgkin lymphoma) (NHL), 식도암 (oesophageal cancer), 난소암 (ovarian cancer), 췌장암 (pancreatic cancer), 음경암 (penile cancer), 전립선암 (prostate cancer), 희귀암 (rare cancers), 직장암 (rectal cancer), 침샘암 (salivary gland cancer), 2차암 (secondary cancers), 피부암 (skin cancer) ((비-흑색종 melanoma)), 연조직 육종 (soft tissue sarcoma), 위암 (stomach cancer), 고환암 (testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 미지의 일차암 (unknown primary cancer), 자궁암 (uterine cancer), 질암 (vaginal cancer), 및 외음부 암 (vulval cancer)을 포함하는 암으로부터 선택된다.
여기서 사용된 대로, "클릭 반응 (click reaction)" 이라는 용어는 연결된 생산물을 편리하게 생산하기 위하여, 첫 번째 및 두 번째 잔기를 공유결합으로 연결하기 위하여 사용되는 반응의 범위를 의미한다. 이는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 다음의 특징을 가진다: 빠르고, 특이적이고, 수율이 높고, 효과적이고, 자동적이고, 연결된 것의 생체적합성을 의미 있게 변경시키지는 않고, 높은 반응 비율을 가지고, 안정적인 생산물을 생산하고, 단일 반응 생산물의 생산이 우선적이고, 높은 원소 경제를 가지며, (atom economy), 화학 선택적이고, 모듈 (modular)적이고, 입체 선택적이고 (stereoselective), 산소에 민감하지 않고, 물에 민감하지 않고, 순도가 높고, 비크로마토그래적인 방법 (예를 들어, 결정화 또는 증류)으로 제거될 수 있는 해를 끼치지 않거나 또는 상대적으로 비-독성인 부산물만을 생산하고, 용매가 필요하지 않거나 또는 유해하지 않거나 또는 예를 들어, 물과 같은 생리적으로 무해한 용매에서 수행될 수 있고, 생리적 조건에서 안정적이다. 예시들에는 알킨/아자이드 반응 (alkyne/azide reaction), 디엔/디에노필 반응 (diene/dienophile reaction), 또는 티올/알켄 반응 (thiol/alkene reaction) 이 포함된다. 다른 반응들도 사용될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 클릭 반응은 빠르고, 특이적이고, 및 수율이 높다.
여기서 사용된 대로, "클릭 핸들 (click handle)" 이라는 용어는 클릭 반응에서 클릭 특징을 생산하기 위하여 두 번째 클릭 핸들과 반응할 수 있는 화학적 잔기를 의미한다. 실시 예에서, 클릭 핸들은 커플링 시약 (coupling reagent)을 포함하고, 및 커플링 시약은 더 나아가 기질 반응 잔기를 포함할 수 있다.
여기서 사용된 대로, "사이토카인 (cytokine)"이라는 용어는 세포에 의해 분비되는 다른 세포에서 다양한 효과를 가지는 작은 용해성 단백질 물질을 의미한다. 사이토카인은 성장, 발전, 상처 치유, 및 면역 반응을 포함하는 많은 중요한 생리적 기능을 매개한다. 이들은 세포막에 위치해 있는 이들의 세포-특이 수용체에 결합하여 작용하고, 세포에서 뚜렷한 신호 전달 연쇄 반응을 시작하게 하며, 이는 결국 타겟 세포에서 생화학적 및 표현형 변화를 초래할 것이다. 사이토카인은 방출되는 부위로부터 국부적으로 및 멀리 둘 다 작용할 수 있다. 이들은 많은 인터루킨 (interleukins) 들은 물론 몇 가지 조혈 성장 인자 (hematopoietic growth factors)를 포함하는, 유형 1 사이토카인 (type I cytokines); 인터페론 (interferons) 및 인터루킨-10 (interleukin-10) 을 포함하는, 유형 II 사이토카인 (type II cytokines); TNFα 및 림포톡신 (lymphotoxin) 을 포함하는 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor) ("TNF")-관련 분자; 인터루킨 1 (interleukin 1) ("IL-1")을 포함하는 면역글로불린 슈퍼-계통 멤버(immunoglobulin super-family members); 및 여러 다양한 면역 및 염증 기능에서 결정적인 역할을 하는 분자 계통인, 케모카인 (chemokines)을 포함한다. 같은 사이토카인이 세포의 상태에 따라 다른 효과를 가질 수 있다. 사이토카인은 자주 다른 사이토카인의 발현을 조절하고, 및 연쇄반응을 촉발시킬 수 있다. 사이토카인의 제한적이지 않은 예시에는, 예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12/IL-23 P40, IL13, IL-15, IL-15/IL-15-RA, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23, TGF-β, IFNγ, GM-CSF, Groα, MCP-1 및 TNF-α를 포함한다.
여기서 사용된 대로, "내생적 (endogenous)" 이라는 용어는 화합물 (예를 들어, 작은 분자) 이나 공정의 자연 형태를 언급함을 의미한다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, "내생적 (endogenous)" 이라는 용어는 핵산 또는 펩티드의 원래의 형태가 개체의 원래의 위치 또는 개체의 유전체에 있는 것을 의미한다.
여기서 사용된 대로, "제작된 세포 (an engineered cell)"란 용어는 유전적으로-수정된 세포 또는 이의 자손을 언급함을 의미한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 세포 (예를 들어, 제작된 핵 제거된 세포) 는 커플링 시약을 사용하여 세포 표면에 외부 유래 폴리펩티드를 연결하게 해 생산되게 할 수 있다 (예를 들어, 클릭 화학을 사용하여).
여기서 사용된 대로, "핵 제거된 (enucleated)" 이란 용어는, 세포, 예를 들어, 망상 적혈구 (reticulocyte) 또는 성숙한 적혈구 세포 (mature red blood cell)(적혈구 erythrocyte)의 핵이 없는 세포를 언급함을 의미한다. 한 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 전구 세포, 예를 들어, 조혈 줄기세포 (hematopoietic stem cell) (예를 들어, CD34+ 세포), 보통 골수 전구 세포 (common myeloid progenitor)(CMP), 거핵구 적혈구 전구 세포 (megakaryocyte erythrocyte progenitor cell) (MEP), 대집락 형성 단위 적혈구 (burst-forming unit erythrocyte) (BFU-E), 군집-형성 단위 적혈구 (colony-forming unit erythrocyte) (CFU-E), 전-적혈구 모세포 (pro-erythroblast), 초기 호염기성 적혈구 모세포 (early basophilic erythroblast), 후기 호염기성 적혈구 모세포 (late basophilic erythroblast), 다염성 적혈구 모세포 (polychromatic erythroblast), 또는 정염성 적혈구 모세포 (orthochromatic erythroblast), 또는 유도 만능세포 (induced pluripotent cell) 로부터 망상 적혈구 세포 또는 성숙한 적혈구 세포로 분화를 통해 이의 핵을 잃은 세포이다. 한 실시 예에서 핵 제거된 세포는 시험관 내 (in vitro) 분화를 통해 전구 세포, 예를 들어, 조혈 줄기세포 (hematopoietic stem cell) (예를 들어, CD34+ 세포), 보통 골수 전구 세포 (common myeloid progenitor)(CMP), 거핵구 적혈구 전구 세포 (megakaryocyte erythrocyte progenitor cell) (MEP), 대집락 형성 단위 적혈구 (burst-forming unit erythrocyte) (BFU-E), 군집-형성 단위 적혈구 (colony-forming unit erythrocyte) (CFU-E), 전-적혈구 모세포 (pro-erythroblast), 초기 호염기성 적혈구 모세포 (early basophilic erythroblast), 후기 호염기성 적혈구 모세포 (late basophilic erythroblast), 다염성 적혈구 모세포 (polychromatic erythroblast), 또는 정염성 적혈구 모세포 (orthochromatic erythroblast), 또는 유도 만능세포 (induced pluripotent cell) 로부터 망상 적혈구 세포 또는 성숙한 적혈구 세포로 분화를 통해 이의 핵을 잃은 세포이다. 한 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 DNA가 없다. 한 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 폴리펩티드를 발현할 수 없다, 예를 들어, DNA를 단백질로 전사 및/또는 번역할 수 없고, 예를 들어, DNA를 단백질로 전사 및/또는 번역하는데 필요한 세포 내 기구들이 없다. 어떤 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 적혈구세포, 망상 적혈구 세포, 또는 혈소판이다.
어떤 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 혈소판이 아니며, 및 그러므로 "혈소판 없는 핵 제거된 (platelet free enucleated)" 세포 ("PFE" cells)이다. 혈소판은 핵이 없고, 및 이 특별한 실시 예에서, 혈소판은 포함시키지 않으려는 의도가 있음을 이해하여야 한다.
여기서 사용된 대로, "적혈구 세포 (erythroid cell)" 는 핵 있는 적혈구 세포, 적혈구 세포 전구체, 핵 없는 성숙한 적혈구 세포, 및 망상적혈구 세포 (reticulocyte)을 포함한다. 여기서 사용된 대로, 적혈구 세포는 적혈구 전구 세포, 망상 적혈구 세포 또는 적혈구 세포로 분화될 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적혈구 전구 세포에는 제대혈 줄기세포 (cord blood stem cell), CD34+ 세포, 조혈 줄기세포 (hematopoietic stem cell) (HSC), 지라 군집 형성 세포 (spleen colony forming (CFU-S) cell), 보통 골수 전구 세포 (common myeloid progenitor (CMP) cell), 배아세포 군집 형성 세포(blastocyte colony-forming cell), 대집락 형성 단위 적혈구 (burst forming unit-erythroid)(BFU-E), 거핵구 적혈구 전구 세포 ( megakaryocyte-erythroid progenitor (MEP) cell), 적혈구 군집-형성 유닛트 (erythroid colony-forming unit) (CFU-E), 망상 적혈구 (reticulocyte), 적혈구 (erythrocyte), 유도 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell) (iPSC), 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell) (MSC), 다염성 적혈모구 (polychromatic normoblast), 정염 적혈모구 (orthochromatic normoblast)중 어느 것이 포함된다. 적혈구 세포의 제조는 이들 어느 것 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 전구 세포는 불멸하거나 불멸 화 시킨 세포이다. 예를 들어, 불멸 화 시킨 적혈 모세포는 CD34+ 조혈 전구 세포 (hematopoietic progenitor cell)에 Oct4, Sox2, Klf4, cMyc를 발현하고 및 TP53를 억제하도록 레트로바이러스 형질도입으로 제조될 수 있다 ((예를 들어, 그 전문이 여기 참고 문헌으로 병합된 후앙 등 (Huang et al., (2014) Mol. Ther. 22(2): 451-63) 에서 서술된 대로). 추가로, 세포는 자가 사용할 의도가 있을 수 있으며 및 동종 수혈 (allogeneic transfusion)의 소스를 제공할 수 있다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 배양된다. 한 실시 예에서, 적혈구 세포 (erythroid cells)는 핵 제거된 적혈구 세포 (red blood cell)다.
여기서 사용된 대로, "외부 유래 (exogenous)"라는 용어는, 핵산이란 의미에서 사용될 때는 이식유전자 (transgene) 및 재조합 핵산을 포함한다.
여기서 사용된 대로, "외부 유래 핵산 (exogenous nucleic acid)" 이라는 용어는 세포에 자연적이지 않으나, 세포 또는 세포의 전구 세포에 도입된 핵산 (예를 들어, 유전자)를 의미한다. 외부 유래 핵산은 세포에 자연적인 내생 핵산과 비슷하거나 또는 동등한 부분 또는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame) (예를 들어, 유전자)을 포함할 수 있다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 핵산은 RNA를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 핵산은 DNA를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 핵산은 세포의 유전체에 통합된다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 핵산은 외부 유래 폴리펩티드를 생산하기 위하여 세포 기구에 의해 처리된다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 핵산은 세포 또는 외부 유래 핵산이 도입된 세포의 자손 세포에서 유지되지 않는다.
여기서 사용된 대로, "외부 유래 폴리펩티드 (exogenous polypeptide)" 라는 용어는 그 타입의 야생형 세포 타입에서 생산되지 않는 폴리펩티드이거나 또는 외부 유래 폴리펩티드를 함유하는 세포에서 보다 야생형 세포에서 더 낮게 존재하는 폴리펩티드를 의미한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 폴리펩티드는 세포 내로 또는 세포에 도입되는 폴리펩티드, 또는 외부 유래 폴리펩티드를 암호화하는 외부 유래 핵산을 세포 또는 세포의 전구 세포에 도입시켜 세포에 의해서 발현되게 하는 폴리펩티드를 의미한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 폴리펩티드는 세포 내 또는 세포의 전구 세포 내로 도입된 외부 유래 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드이고, 이 핵산은 선택적으로 세포에 의해서 유지되지 않는다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 폴리펩티드는 화학적 또는 효소적 방법으로 세포의 표면에 접합된 폴리펩티드이다.
여기서 사용된 대로, "외부 유래 자극 폴리펩티드 (exogenous stimulatory polypeptide)" 라는 용어는, 면역 살상 세포와 같은 (예를 들어, NK 세포 또는 CD8+ T 세포) 면역 세포의 고유 폴리펩티드 (예를 들어, 수용체)에 특이적으로 결합하는 제작된 적혈구 세포에 의해 포함되는 (예를 들어, 세포 내부로 또는 세포 표면에) 폴리펩티드를 포함하며, 이로써 증식, 활성화, 확장, 및 면역 세포와 비슷한 것과 같은 면역 세포의 자극을 중개하는 신호를 제공한다. 어떤 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 면역 살상 세포를, 생체 밖 (ex vivo) 또는 생체 내 (in vivo) 에서 자극하기에 충분하다. 예시적인 외부 유래 자극 폴리펩티드는 좀 더 상세히 하기에서 서술된다.
여기서 사용된 대로, " 발현하는 (express)" 또는 "발현 (expression)" 이란 용어는, 전사 및 번역을 포함하는, 폴리펩티드를 생산하는 과정을 의미한다. 발현은, 예를 들어: 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 수를 증가시킴, 유전자의 전사를 증가시킴 (유전자를 상시 발현 프로모터의 조절하에 놓이게 하는 것과 같은), 유전자의 번역을 증가시킴, 경쟁적인 유전자를 적출 (knock out), 또는 이들 및/또는 다른 접근 방법의 조합을 포함하는, 많은 접근 방법으로 증가될 수 있다
여기서 사용된 대로, 외부 유래 자극 폴리펩티드에 관한 한 "첫 번째 ("first)", "두 번째 (second)" 및 세 번째 (third), 등 이란 용어는 한 타입 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드가 있을 때 분별의 편의를 위하여 사용된다. 이러한 용어의 사용은 분명하게 그렇게 언급하지 않는 한 외부 유래 자극 폴리펩티드의 특별한 순서 또는 방향을 언급하려는 의도는 아니다.
여기서 사용된 대로, "단편 (fragment)"이란 용어는 적어도 6 (연속적인) 핵산 또는 적어도 4 (연속적인) 아미노산 서열, 핵산의 경우 특정한 혼성 (specific hybridization)을 허락하기에 충분한 길이 또는 아미노산인 경우에는 에피톱을 특정하게 인식하기에 충분한 길이를 의미하며, 및 전장 서열보다 작은 일부 부분이다. 단편은 선택한 핵산 또는 아미노산 서열의 어느 연속적인 부분으로부터 유래될 수 있다.
여기서 사용된 대로, "유전자 (gene)" 라는 용어는 주어진 RNA 또는 단백질의 발현과 연관된 핵산의 어느 조각을 언급하는데 널리 사용된다. 그러므로 유전자는 발현된 RNAs (전형적으로 폴리펩티드 코딩 서열을 포함한다.)를 암호화하는 부위 및, 자주, 이들의 발현에 요구되는 조절 서열을 포함한다. 유전자는, 관심 있는 소스로부터 클로닝 또는 알려진 또는 예측되는 서열 정보로부터 합성을 포함하는 여러 다양한 소스로부터 얻을 수 있으며, 특정하게 바람직한 요소를 갖게 디자인한 서열을 포함할 수 있다.
여기서 사용된 대로, "IL-15RA의 세포 외 부분 (extracelluar portion of IL-15RA) 이란 용어는 IL-15RA의 막 통과 도메인에 아미노-말단인 IL-15RA의 한 부분을 의미하며 및 세포의 밖 표면에서 발견된다. IL-15RA의 세포 외 부분은 IL-15RA 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 어떤 실시 예에서, IL-15RA의 세포 외 부분은 서열 번호 7 또는 서열 번호 8의 아미노산 서열로 구성된다.
여기서 사용된 대로, "IL-15RA의 스시 도메인 (Sushi domain of IL-15RA)" 이란 용어는 성숙한 IL-15RA 폴리펩티드의 4개의 시스테인 (cysteine) 잔기를 포함하는 아미노 말단의 대략 60 아미노산 잔기 부분을 의미한다. 첫 번째 시스테인 잔기는 세 번째 시스테인과 이황화 결합 (disulfide bond)을 형성하고, 및 두 번째 시스테인은 네 번째 시스테인과 이황화 다리 (disulfide bridge)를 형성한다. IL-15RA의 스시 도메인 (Sushi domain)은 IL-15의 결합에 관여한다. 어떤 실시 예에서, IL-15RA의 스시 도메인은 서열 번호 9의 아미노산 서열로 구성된다.
여기서 사용된 대로, "낮은 MHC I 제시 (low MHC I presentation)" 라는 용어는 세포 표면에 (예를 들어, 종양 세포) MHC I 분자의 수준 낮은 것 (예를 들어, 발현의 하양-조절로) 을 의미한다.
여기서 사용된 대로 "핵산 분자 (nucleic acid molecule)" 라는 용어는 데옥시라이보뉴클레오타이드 또는 라이보뉴클레오타이드 염기의 단일 또는 이중-선의 중합체 (polymer)를 의미한다. 이는 염색체 DNA 및 자가-복제하는 플라스미드, 벡터, mRNA, tRNA, siRNA, 등을 포함하며, 이는 재조합일 수 있으며 및 이 핵산이 세포에 도입되었을 때 이로부터 외부 유래 폴리펩티드가 발현될 수 있다.
하기의 용어들이 두 개 또는 그 이상의 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드 사이의 서열 상관관계를 서술하기 위하여 여기서 사용된다: (a) "참조 서열 (reference sequence)", (b)"비교 창 (comparison window)", (c) "서열 상동성 (sequence identity)", (d) "서열 상동성 퍼센트 (percentage of sequence identity)", 및 (e) "상당한 상동성 (대동소이)(substantial identity)." (a) "참조 서열 (reference sequence)"이라는 용어는 서열 비교의 기본으로서 사용되는 서열을 의미한다. 참조 서열은 특정한 서열의 서브세트 (subset) 또는 전체 (entirety)일 수 있다; 예를 들어, 전장-cDNA 또는 유전자 서열의 한 단편으로서, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열로서. (b) "비교 창 (comparison window)" 이라는 용어는 폴리뉴클레오타이드 서열의 연속적이고 및 특정한 단편을 의미하며, 여기서 폴리뉴클레오타이드 서열은 참조 서열에 비교될 수 있으며 및 여기서 두 서열의 최적 정렬을 위하여 비교 창에 있는 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분은 참조 서열에 (추가의 삽입 또는 삭제를 포함하지 않는) 비교하여 추가의 삽입 또는 삭제(즉, 공백 gap)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 비교 창은 적어도 길이가 20 연속적인 뉴클레오타이드이고, 및 선택적으로 적어도 길이가 30 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 길이가 40 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 길이가 50 연속적인 뉴클레오타이드, 적어도 길이가 100 연속적인 뉴클레오타이드, 또는 더 길 수 있다. 이 분야 기술 전문가들은 폴리뉴클레오타이드 서열에 공백 포함으로 인한 참조 서열과의 높은 유사성을 피하기 위하여, 공백 페널티 (gap penalty)가 전형적으로 도입되고 및 매치 (match) 수로부터 삭감된다는 것을 이해한다. 비교를 위한 서열 정렬은 이 분야 기술에서 잘-알려졌다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 하기에 의해 수행될 수 있다; 스미스 및 워터맨 ((Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981))의 국부 호모로지 알고리즘 (local homology algorithm); 니들맨 및 운쉬 ((Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970))의 호모로지 정렬 알고리즘 (homology alignment algorithm); 피어슨 및 리프만 ((Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 (1988))의 유사성 방법의 탐색; 이것에만 국한하지 않으나: 인텔리제네틱스의 PC/유전자 프로그램에 있는 CLUSTAL (CLUSTAL in the PC/Gene program by Intelligenetics, Mountain View, Calif.)을 포함하는 이들 알고리즘의 컴프터회 된 적용; 위스콘신 제네틱 소프트웨어 패키지에 있는 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA ((GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., USA)); CLUSTAL 프로그램은 히긴스 및 삽 등에의 해 잘 서술 되고 있다 ((Higgins and Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:155-65 (1992), and Pearson, et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994)). 데이터베이스 유사성을 찾기 위하여 사용될 수 있는 BLAST 계통 프로그램에는; 뉴크레오타이드 데이터베이스 서열에 대한 뉴크레오타이드 질문 서열 (nucleotide query sequences)을 위한 BLASTN; 단백질 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 질문서열을 위한 BLASTX; 단백질 데이터베이스 서열에 대한 단백질 질문 서열을 위한 BLASTP; 뉴클레오타이드 데이터베이스 서열에 대한 단백질 질문 서열을 위한 TBLASTN; 및 뉴클레오타이드 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 질문 서열을 위한 TBLASTX 가 포함된다. Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) 참조. 달리 언급되지 않는 한, 여기서 제공된 서열 상동성/유사성 값은 디폴트 계수 (default parameters) 를 사용하여 블라스트 2.0 수윗 (BLAST 2.0 suite) 프로그램을 사용하여 얻은 값을 의미한다. 알트슐 등 ((Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). 블라스트 분석 (BLAST analyses)을 수행하기 위한 소프트웨어는, 예를 들어, 국가 생물공학-정보 센터 (National Center for Biotechnology-Information)를 통하여, 공공적으로 얻을 수 있다. 이 알고리즘은 첫 번째로 질문 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 동정하여 높은 점수의 서열 쌍 (high scoring sequence pairs) (HSPs)을 동정하는 것이 관여하며, 이는 데이터 베이스 서열에서 같은 길이의 단어와 정렬될 때 어떤 양성-값의 임계 점수 (threshold score) T와 매치되거나 (match) 또는 만족시킨다. T는 이웃 단어 점수 임계치 (neighborhood word score threshold) 라고 불린다 (Altschul et al., supra). 이 초기 이웃 단어 히트는 이들을 포함하는 더 긴 HSPs를 찾기 위한 탐색을 시작하는 근원으로 작용한다. 이 단어 히트는 그 후 누적된 정렬 점수가 증가할 수 있을 때까지 각 서열에 따라 양쪽으로 연장된다. 누적된 점수는, 뉴클레오타이드 서열을 위해, 계수 M (매치되는 잔기 쌍의 보상 점수: 항상 >0) 및 N (잘못 매칭된 잔기의 벌 점수; 항상 <0) 을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열을 위해, 누적 점수를 계산하기 위한 점수 매기는 매트릭스 (scoring matrix) 가 사용된다. 각 방향에서 단어 히트의 연장이 다음 같은 때 멈춘다: 누적 정렬 점수가 최대 달성된 값으로부터 양 X로 떨어질 때; 하나 또는 그 이상의 음성-점수 잔기 정렬의 축적 때문에 누적 점수가 0 또는 그 이하 일 때; 또는 각 서열의 끝에 도달했을 때. 블라스트 알고리즘 계수 (BLAST algorithm parameters) W, T, 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. 블라스트엔 프로그램 (BLASTN program) (뉴클레오타이드 서열을 위한)은 디폴트로서 단어 길이 (word length) (W) 11을 사용하고, 기대 (expectation) (E) 10, 컷 어프 (cut off) 100, M=5, N=-4, 및 두 선 모두 비교한다. 아미노산 서열을 위해, 플라스트피 프로그램 (BLASTP program)은 디폴트로서 단어길이 (word length) (W) 3, 기대 (expectation)(E) 10, 및 BLOSUM62 점수 매트릭스 (BLOSUM62 scoring matrix) ((Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 참조))를 사용한다. 퍼센트 서열 상동성을 계산하는 외에도 추가하여, 블라스트 알고리즘 (BLAST algorithm)은 또한 두 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다 ((예를 들어, Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993) 참조)). 블라스트 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 측정은 최소 합산 확률 (smallest sum probability) (P(N))이며, 이는 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 매치 (match)가 우연히 일어나는 확률의 제시를 제공한다. 블라스트 서치 (BLAST searches)는 단백질이 무작위 서열로서 모델 될 수 있음을 가정한다. 그러나, 많은 실제 단백질들은 동종중합체 궤적 (homopolymeric tracts), 짧은-기간 반복, 또는 하나 또는 그 이상의 아미노산이 풍부하게 있는 영역일 수 있는 비무작위 서열 (nonrandom sequences) 부분을 포함한다. 그러한 낮은-복잡도 (low-complexity) 부위는 단백질의 다른 부위가 전적으로 비슷하지 않더라도 관련 없는 단백질들 사이에 정렬될 수 있다. 그러한 낮은-복잡도 정렬을 감소시키기 위하여 여러 낮은-복잡도 여과 프로그램 (low-complexity filter programs)이 적용될 수 있다. 예를 들어, SEG (Wooten and Federhen, Comput. Chem., 17:149-163 (1993)) 및 XNU (Claverie and States, Comput. Chem., 17:191-201 (1993)) 낮은-복잡도 여과 (low-complexity filters)는 단독으로 또는 조합하여 적용될 수 있다. (c) 두 개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 "서열 상동성 (sequence identity)", 또는 "상동성 (identity)" 은 여기서 명시된 비교 창에서 최대 관련성에 대하여 정렬되었을 때 두 서열에 있는 같은 잔기를 의미하기 위하여 사용된다. 단백질과 관련하여 서열 상동성 퍼센트가 사용되었을 때는 동일하지 않은 잔기 위치는 자주 보존적 아미노산 치환 (conservative substitutions)으로 다르다는 것, 즉 여기서 아미노산 잔기는 비슷한 화학적 성질을 가진 (예를 들어, 전하 또는 소수성) 다른 아미노산 잔기로 치환되며 및 그러므로 분자의 기능적 성질은 변하지 않는다는 것이 인식된다. 서열이 보존적 치환 (conservative substitutions)에서 다른 곳에서는, 퍼센트 서열 상동성은 치환의 보존적 성질에 대하여 수정하기 위하여 상향으로 조정될 수 있다. 그러한 보존적 치환에 의해 다른 서열은 "서열 유사성 (sequence similarity)", 또는 "유사성 (similarity)"을 가졌다고 한다. 이러한 조정을 만드는 방법은 이 분야 기술 전문가에게는 잘 알려졌다. 전형적으로, 이는 보존적 치환을 전부 불일치 (mismatch)라고 하기보다는 부분 불일치라고 점수 매기는 것이 관여된다. 그러므로, 예를 들어, 동일한 아미노산이 점수 1로 주어지고 및 비-보존적 치환이 점수 0으로 주어지는 곳에서, 보존적 치환은 0 및 1 사이 점수가 주어진다. 보존적 치환의 점수매김은, 예를 들어, 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Calif., USA)에서 시행된 대로, 메이어 및 밀러의 알고리즘 (Meyers and Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4:11-17 (1988))에 따라 계산된다. (d) "서열 상동성 페센트 (percentage of sequence identity)" 라는 용어는 비교 창에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정된 값을 의미하기 위하여 여기서 사용되며, 여기서 비교 창에서 두 개 서열의 최적 정렬을 위하여 폴리펩티드 서열의 부분은 참조 서열 (삽입 또는 삭제를 포함하지 않는)에 비교하여 삽입 (addition) 또는 삭제 (deletion) (즉, 공백)를 포함할 수 있다. 퍼센트는 매치되는 위치의 수를 얻기 위하여 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 일어나는 위치의 수를 결정하고, 매치된 위치의 수를 비교 창에서 총 위치 수로 나누고, 및 그 결과를 100으로 곱하여 퍼센트 서열 상동성을 얻어 계산된다. (e) 폴리뉴클레오타이드의 "상당한 상동성(substantial identity)" 이란 용어는 서술된 정렬 프로그램 중 하나를 사용하여 표준 계수를 사용하여 참조 서열에 비교하여, 폴리뉴클레오타이드가 적어도 70% 서열 상동성, 적어도 80% 서열 상동성, 적어도 90% 서열 상동성 및 적어도 95% 서열 상동성을 가진 서열을 포함함을 의미한다. 이분야 전문가 중 하나는 코돈 변성, 아미노산 유사성, 리딩 프레임 위치 (reading frame positioning) 및 이와 비슷한 것을 고려하여, 두 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화하는 단백질들의 해당 상동성을 결정하기 위하여 이 값들은 적절히 조정될 수 있음을 인식할 것이다. 이 목적을 위해 아미노산 서열의 상당한 상동성은 보통 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 상동성을 의미한다. 뉴클레오타이드가 상당히 동일하다는 다른 암시는 만약 두 분자가 엄격한 조건하에서 서로 혼성화될 때이다. 그러나, 엄격한 조건하에서 서로 혼성화 되지 않는 핵산은 만약 이들이 암호화하는 폴리펩티드가 상당히 동일하면 아직도 상당히 동일하다. 이는, 예를 들어, 유전자 암호에 의해 허락되는 최대 코돈 변성을 (codon degeneracy) 사용하여 핵산의 카피가 만들어질 때, 일어날 수 있다. 두 핵산 서열들이 상당히 동일하다는 한 암시는 첫 번째 핵산이 암호화하는 폴리펩티드가 두 번째 핵산에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 면역학적으로 상호 반응적일 때이다. 돌연변이도 또한 코돈 변성의 고려를 포함하는, 유전자 암호에 참조하여, 본 단백질의 핵산 서열에 만들어 질 수 있다.
여기서 사용된 대로, "약학적으로 허용 가능한 운반체 (pharmaceutically acceptable carrier) 란 용어는 포스페이트 버퍼된 생리 식염수 용액, 물, 오일/물 또는 물/오일과 같은 에멀션, 및 여러 타입의 습윤제 (wetting agents)와 같은 표준 약학적 운반체 어느 것을 포함한다. 이 용어는 또한 US 연방 정부의 규제기관 (regulatory agency of the US Federal government) 에 의해 인정된 제제 어느 것 또는 사람을 포함하는, 동물에 사용을 위한 US 약전 (US Pharmacopeia) 목록에 있는 어느 것은 물론, 개체에 상당한 자극을 주지 않고 및 투여된 제제의 생물학적 활성이나 성질을 없애지 않는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
여기서 사용된 대로, "폴리펩티드 (polypeptide)", "펩티드 (peptide)" 및 "단백질 (protein)" 이란 용어는 아미노산 잔기의 중합체 (polymer)를 언급하기 위하여 여기서 서로 교환되어 사용된다. 이 용어는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 해당하는 자연에 존재하는 아미노산의 인공적인 화학적 유사체 (artificial chemical analogue)인 아미노산 중합체에는 물론, 자연적으로 존재하는 아미노산 중합체에도 적용된다. 자연적으로 존재하는 아미노산의 그러한 유사체의 필수적인 성질은, 단백질에 병합되었을 때, 그 단백질이 같은 단백질에 대해 일어난 항체에 특별히 활성적이지만 전적으로 자연적으로 존재하는 아미노산으로 구성된다는 것이다. "폴리펩티드 (polypeptide)", "펩티드 (peptide)" 및 "단백질 (protein)" 라는 용어는 또한, 이것에만 국한하지 않으나, 당쇄화 (glycosylation), 지질 부착 (lipid attachment), 황산화 (sulfation), 글루타민 산 잔기의 감마-카복실화 (gamma-carboxylation of glutamic acid residues), 하이드록실화 (hydroxylation), 및 ADP-라이보실화 (ADP-ribosylation) 를 포함하는 수정을 포함한다. 잘 알려졌고 및 상기에서 주목된 대로, 폴리펩티드는 전적으로 직선이 아닐 수 있다는 것이 알려질 것이다. 예를 들어, 폴리펩티드는 유비퀴틴화 (ubiquitination)의 결과로 가지형이 될 수 있으며, 및 일반적으로 자연적으로 일어나는 과정 및 자연적으로 일어나지 않는 인간의 조작으로 이루어지는 과정을 포함하는, 번역 후 일의 결과로, 이들은 가지가 있거나 또는 없이 환형 (circular) 일수 있다. 환형, 가지형 및 가지가 있는 환형 폴리펩티드는 비-번역 자연 과정은 물론 및 전적으로 합성에 의해서도 합성될 수 있다. 어떤 실시 예에 따르면, 펩티드는 어느 길이 또는 어느 크기 일 수 있다.
여기서 사용된 대로, "재조합 (recombinant)" 이라고 언급된 폴리펩티드는, 중합 효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction) (PCR) 및/또는 제한효소를 사용하여 벡터에 클로닝하는 것과 같은 인위적 재조합 방법에 의존하는 과정을 포함하는, 재조합 DNA 방법으로 생산된 폴리펩티드를 의미한다.
여기서 사용된 대로, "면역 세포를 자극하다 (stimulate an immune cell)" 또는 "면역 세포 자극하는 (stimulating an immune cell)" 이란 용어는, 면역 세포, 예를 들어, 살상 면역세포 (예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+ T 세포), 의 활성화, 및/또는 확장과 같은 세포 반응의 원인 또는 결과로 일어나는 과정 (예를 들어, 신호전달 또는 자극하는 일이 관여하는) 을 의미한다. 어떤 실시 예에서, 면역 세포 (예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+ T 세포)를 자극하는 것은 면역 세포의 활성화 및/또는 확장의 결과를 가져오는 자극 또는 신호(예를 들어, 폴리펩티드를 자극하는)를 제공함을 의미한다.
여기서 사용된 대로, "면역 세포를 자극하기에 충분한 (sufficient to stimulate an immune cell)" 이란 용어는 면역 세포의 세포 반응을 촉진하는 신호 전달 일 또는 예를 들어, 외부 유래 자극 펩티드의 자극의 양 또는 수준을 의미한다.
여기서 사용된 대로, "개체 (subject)," "개인 (individual)," "숙주 (host)," 및 "환자 (patient)는 여기서 서로 교환되게 사용되며 및 진단, 처치 또는 치료가 바람직한 어느 포유류 개체, 특히 인간을 의미한다. 여기서 서술된 방법들은 인간 치료 및 수의과적 적용 둘 다에 해당할 수 있다. 어떤 실시 예에서, 개체는 포유류이고, 및 특별한 실시 예에서 개체는 인간이다.
여기서 사용된 대로," 필요로 하는 개체 (subject in need)" 는 문맥상 또는 구절의 사용에서 달리 제시하지 않는 한, (i) 서술된 본 발명에 따라 제작된 적혈구 세포 (또는 제작된 적혈구 세포를 포함하는 약학적 조성물)가 투여될 개체, (ii) 서술된 본 발명에 따라 제작된 적혈구 세포 (또는 제작된 적혈구 세포를 포함하는 약학적 조성물)를 받는 개체, 또는 (iii) 서술된 본 발명에 따라 제작된 적혈구 세포 (또는 제작된 적혈구 세포를 포함하는 약학적 조성물)를 받았던 개체를 의미한다.
여기서 사용된 대로, "억제 (suppress)," "감소 (decrease)," "간섭 (interfere)," "방해 (inhibit)" 및/또는 "감소 (reduce)" (및 이와 비슷한 용어) 라는 용어는 일반적으로 직접적으로 또는 간접적으로, 농도, 수준, 기능, 활성, 또는 행동이 자연적으로, 기대되는, 또는 평균과 대조하여, 또는 대조군 조건과 대조하여 감소하는 행위를 의미한다.
여기서 사용된 대로, "면역 세포 억제하는 (suppressing immune cells)" 또는 "면역 세포를 방해하는 (nhibiting immune cells)" 이란 용어는: 증식 (proliferation), 분화 (differentiation), 사이토카인 분비 (cytokine secretion), 세포독성 주효물질 방출 (cytotoxic effector molecule release), 세포독성 활성 (cytotoxic activity), 및 활성화 마커 발현 (expression of activation markers)으로부터 선택된, 면역 세포의 하나 또는 그 이상의 세포적 반응 또는 활성을 방해 또는 억제하는 원인 또는 결과를 가져오거나, 또는 면역 세포에 활기를 없게 하거나 (anergizing), 면역 세포의 세포 사멸을 유도하는 결과를 가져오는 과정 (예를 들어, 신호전달 일)을 의미한다. 면역 세포 방해 또는 억제를 측정하는 적절한 에세이는 이 분야 기술에서 알려졌으며 및 여기서 서술된다.
여기서 사용된 대로, 활성 제제 (예를 들어, 여기서 서술된 대로 제작된 적혈구 세포)의 "치료적인 양 (therapeutic amount)", "치료적으로 효과 있는 양 (therapeutically effective amount)", "효과적인 양 (amount effective)", 또는" 약학적으로 효과 있는 양 (pharmaceutically effective amount)" 이란 용어는 의도된 치료의 장점을 제공하기에 충분한 양을 의미하는데 서로 교환적으로 사용된다. 그러나 용량 수준은, 상처 타입, 나이, 몸무게, 성별, 환자의 의학적 컨디션, 컨디션의 심각성 정도, 투여 경로, 및 적용되는 특정한 활성 제제를 포함하는 여러 가지 인자들에 근거한다. 그러므로 투약 용량법은 널리 다를 수 있으나, 표준 방법을 사용하여 의사가 일상적으로 결정할 수 있다. 추가로, 치료적인 양 (therapeutic amount)", "치료적으로 효과 있는 양 (therapeutically effective amount)", 또는" 약학적으로 효과 있는 양 (pharmaceutically effective amount)" 이라는 용어는 서술된 발명의 조성물의 예방적 (prophylactic) 또는 방지적 (preventative) 인 양을 포함한다. 서술된 발명의 예방적 또는 방지적인 적용에서, 약학적 조성물 또는 의약품은, 질환, 장애 또는 컨디션에 감수성이 있거나, 또는 달리 취약한 환자에게 서 위험을 제거 또는 감소시키거나, 심각성 정도를 줄이거나, 또는. 질환, 장애 또는 컨디션의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동학적 증상, 이의 합병증, 및 질환, 장애 또는 컨디션이 전개되는 동안에 나타내는 중간 정도의 병리적 표현형을 포함하는 질환, 장애 또는 컨디션의 시작을 연기시키기에 충분한 양이 투여된다. 이는 일반적으로 최대 용량이 사용되는 것이 바람직하며, 즉, 어떤 의학적 판단에 따라 가장 높은 안전한 용량이 바람직하다. "용량 (dose)" 및 "용법 (dosage)"은 여기에서는 서로 교환되게 사용된다.
여기서 사용된 대로, "치료적 효과 (therapeutic effect)" 라는 용어는 치료의 결과를 의미하며, 그 결과는 바람직하고 및 유익한 것으로 판단된다. 치료적 효과는, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 증상의 멈춤, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다. 치료적 효과는 또한 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 증상의 진전의 멈춤, 감소 또는 제거를 포함할 수있다.
여기서 서술된 어느 치료적 제제에 대하여 치료적으로 효과적인 양은 처음에는 예비 시험관 내 연구 및/또는 동물 모델로부터 결정될 수 있다. 치료적으로 효과적인 용량은 또한 인간의 데이터로부터 결정될 수 있다. 적용되는 용량은 투여되는 제제의 상대적 생체이용률 및 효능에 근거하여 조정될 수 있다. 상기 서술된 방법 및 다른 잘 알려진 방법들에 근거한 최대 효력을 달성하기 위한 용량의 조정은 이 분야 통상 전문가의 능력 내에 있다. 치료적인 효과를 결정하는 일반적인 원칙은, 굿맨 및 길만의 '치료제의 약리적 근거' (Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, McGraw-Hill (New York) (2001))의 제1장에서 발견할 수 있으며, 여기에 참고 문헌으로 병합되었고, 하기에 요약된다.
약동학적 원리는 허용될 수 없는 부작용을 최소로 하면서 바람직한 정도의 치료적 효능을 얻기 위하여 용법을 수정하는 근거를 제공한다. 약물의 혈장 농도가 측정될 수 있고 및 치료적 창 (therapeutic window) 에 관련되는 경우에, 용법 수정을 위한 추가의 안내를 얻을 수 있다.
약물 생산품들은 만약 이들이 같은 활성 성분을 함유하고 및 강도 또는 농도, 용법 형태, 및 투여 경로가 동일하면 약학적으로 동등하다고 간주 된다. 두 개의 약학적으로 동등한 약물 생산품들은 두 생산품에서 활성 성분의 생체이용률의 비율 및 정도가 적절한 검사 조건에서 의미 있게 다르지 않으면 생물학적으로 동등하다고 간주 된다.
여기서 사용된 대로, "치료하다 (treat)," "치료하는 (treating)," 및/또는 치료 (treatment)" 라는 용어는 컨디션 (condition) 의 진전을 없애기, 상당히 억제하기, 늦추거나 반대로 하기를 포함하고, 컨디션의 임상적 증상을 상당히 완화 시키기, 또는 컨디션의 임상적 증상의 발현을 상당히 예방하고, 유익하고 및 바람직한 임상 결과를 얻기를 포함한다. 치료는 더 나아가 하나 또는 그 이상의 다음을 달성함을 의미한다: (a) 장애의 심각성 정도를 감소하고; (b) 치료할 장애(들)의 특징인 증상의 전개를 제한하고; (c) 치료할 장애(들)의 특징인 증상의 악화를 제한하고; (d) 장애(들)을 이전에 가졌던 환자에서 장애(들)의 재발을 제한하고; 및 (e) 그 장애에 대해 이전에는 무증상이었던 환자에서 증상의 재발을 제한하는 것을 의미한다.
약리학적 및/또는 생리적 효과와 같은, 유익한 또는 바람직한 임상적 결과에는, 이것에만 국한하지 않으나, 질환, 장애 또는 컨디션에 취약하기는 하나 아직 질환, 장애 또는 컨디션의 증상을 경험하거나 또는 보이지 않는 개체에서 일어나는, 질환, 장애 또는 컨디션을 예방하고 (예방적 치료), 질환, 장애 또는 컨디션의 증상을 완화하고, 질환, 장애 또는 컨디션의 정도를 감소시키고, 질환, 장애 또는 컨디션을 안정화시키고 (즉, 악화시키지 않고), 질환, 장애 또는 컨디션의 퍼짐을 예방하고, 질환, 장애 또는 컨디션의 진전을 연기 또는 늦추고, 질환, 장애 또는 컨디션을 완화 또는 약화시키고, 및 이들의 조합을 포함함은 물론, 이 치료를 받지 않았다면 예상되는 치료에 비교하여 생존기간을 연장 시키는 것을 포함한다.
여기서 사용된 대로 "변이체 (variant)"는 원래의 단백질로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삭제, 삽입 또는 다른 수정에 의해 다른 폴리펩티드를 의미한다. 이 수정은 원래의 단백질의 생물학적 활성을 의미 있게 바꾸지는 않는다. 많은 경우에, 변이체는 원래의 단백질의 생물학적 활성의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%를 유지한다. 변이체 단백질의 생물학적 활성은 또한 원래의 단백질의 활성보다 클 수도 있다. 변이체는 동종 변이 (allelic variation) 또는 다형성 (polymorphism)과 같은 자연적으로 일어나는, 또는 의도적으로 제작된 것일 수 있다.
변이체의 아미노산 서열은 원래의 단백질과 상당히 동일하다. 많은 실시 예에서, 변이체는 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 공유하거나 또는 원래의 단백질과 좀 더 전반적인 서열 상동성 또는 유사성을 공유한다. 서열 상동성 또는 유사성은 기본 국소 정렬 도구 (Basic Local Alignment Tool) (BLAST), 점 메트릭스 분석 (dot matrix analysis), 또는 다이나믹 프로그래밍 방법(the dynamic programming method)과 같은 이 분야 기술에서 알려진 다양한 방법으로 결정될 수 있다. 한 예시에서, 서열 상동성 또는 유사성은 유전적 컴퓨터 그룹 프로그램 GAP ((Genetics Computer Group (GCG) programs GAP (Needleman-Wunsch algorithm))을 사용하여 결정된다. 변이체 및 원래 단백질의 아미노산 서열은 하나 또는 그 이상의 부위에서 상당히 동일할 수 있으나, 다른 부위에서는 다양할 수 있다. 변이체는 단편 (예를 들어, 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 단편)을 포함할 수 있다. 어떤 실시 예에서, 단편은 전장 폴리펩티드에 비교하였을 때, N-말단, C-말단, 또는 양쪽 말단 (각각 독립적으로)에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 아미노산까지 부족할 수 있다.
I. 제작된 적혈구 세포 (제작된 적혈구 세포S)
본 공개는 면역 세포를 자극하도록 제작된 (engineered) 적혈구 세포 및 핵 제거된 세포 (enucleated cells) 를 특징으로 한다. 어떤 실시 예에서 핵 제거된 세포는, 예를 들어, 적혈구 전구 세포로부터 분화를 통해 이의 핵을 잃어버린 적혈구 세포이다. 그러나 모든 핵 제거된 세포가 다 적혈구는 아니라는 것이 이해될 것이며 및, 따라서, 여기서 포함된 핵 제거된 세포는 또한, 예를 들어, 혈소판을 포함할 수도 있다. 어떤 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 혈소판이 아니며 및 그러므로 혈소판이 없는 핵 제거된 세포이다. 본 공개의 어떤 관점에서, 적혈구 세포 (erythroid cell) 는 망상적혈구 (reticulocyte) 또는 적혈구 (erythrocyte) ((적혈구 (red blood cell)(RBC)) 이다. 적혈구 세포는 다른 세포에 비해, 주요 조직적합성 복합체 (major histocompatibility complex) (MHC)가 결핍되어 있기 때문에 비-자가조직이고, 더 긴 순환 시간을 가지고, 및 많은 수의 생산이 가능하다는 것을 포함하는, 많은 장점을 제공한다. 본 공개의 어떤 관점에서, 제작된 적혈구 세포는 핵이 있다.
여기서 제공되는 제작된 적혈구 세포는 자연적으로 면역-특혜적이고 및 생체 내에서 면역 살상 세포의 자극을 직접적으로 매개하는 현존하는 면역 살상 세포 타겟팅 기술보다 상당한 장점을 제공하며, 그러므로 면역 살상 세포의 적응 세포 전이 (adoptive cell transfer)와 관련된 단점을 피하게 한다. 본 발명의 제작된 적혈구 세포는 생체 내에서 NK 세포 및 CD8+ 세포 집단에 노출되었을 때 NK 세포 및 CD8+ 세포를 동시에 자극하도록 제작될 수 있다. 특히, IL-12, IL-15/IL-15RA, 4-1BBL 또는 이의 조합, 예를 들어, 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA, 4-1BBL 및 IL-12, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA 를 포함하는 제작된 적혈구 세포는 일차 CD4+, CD8+, NK 및 NKT 세포의 강력한 활성을 유도하고, 및 NK 세포의 세포 독성을 유도한다는 것이 본 발명의 발견이다.
어떤 관점에서, 본 공개는 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 면역 세포는 면역 살상 세포이고, 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한 외부 유래 자극 폴리펩티드 다수를 포함한다. 면역 살상 세포는 자연 살상 (NK) 세포 및 CD8+ T-세포를 포함한다.
어떤 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-15 (interleukin-15) (IL-15) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha) (IL-15RA) 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 유전적으로 제작된 적혈구 세포는 면역 살상 세포를 포함하는 면역 세포4-1BBL,를 자극할 수 있다. 어떤 실시 예에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-15 (interleukin-15) (IL-15) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha) (IL-15RA) 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하고, 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL, 또는 이의 단편을 포함하는, 제작된 적혈구 세포를 제공한다.
어떤 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-15 (interleukin-15) (IL-15) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha) (IL-15RA) 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하고, 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-12 (interleukin) (IL-12) 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는, 제작된 적혈구 세포를 제공한다.
어떤 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-12 (interleukin-12) (IL-12) 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하고, 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는, 제작된 적혈구 세포를 제공한다.
어떤 관점에서, 본 공개는 MHC 유형 1 체인-관련 단백질 A (MHC class I chain-related protein A) (MICA), MHC 유형 1 체인-관련 단백질 B (MHC class I chain-related protein B) (MICB), 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1) 으로부터 선택된 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공한다.
제작된 적혈구 세포는, 예를 들어, 세포 표면에, 단일 적혈구 세포에 여러 다른 자극 분자를, 및 상당히 높은 수로 포함함은 물론, 자극 신호를 적혈구를 통해 긴 순환 반감기를 가지고 직접적으로 전체 순환 시스템에 전달 및 유지시켜, 그로써, 면역 살상 세포를 자극하는 좀 더 안전하고 및 좀 더 효과적인 방법을 제공하는 것을 제시하는 추가의 장점을 제공한다.
외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포 (제작된 적혈구 세포s Comprising 외부 유래 자극 폴리펩티드)
본 발명의 외부 유래 자극 폴리펩티드는, 단독으로 또는 다른 외부 유래 자극 폴리펩티드와 조합하여, 면역 살상 세포 (예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+ T-세포) 의 자극을 매개한다. 어떤 실시 예에서, 적혈구에 의해 포함되는 외부 유래 자극 폴리펩티드는 한 타입의 면역 살상 세포보다 많은 세포를 자극할 수 있는 것이 본 발명의 특징이다, 예를 들어, 본 발명의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구는 NK 세포 및 CD8+ T 세포 둘 다를 자극할 수 있다.
어떤 실시 예에서, 면역 살상 세포 자극은 면역 살상 세포의 확장을 의미한다. 어떤 실시 예에서, 면역 살상 세포 자극은 면역 살상 세포의 활성화를 의미한다. 어떤 실시 예에서, 면역 살상 세포 자극은 면역 살상 세포의 세포독성의 증가를 의미한다. 특정한 실시 예에서, 면역 살상 세포 자극은 면역 살상 세포의 확장, 활성화 및/또는 증가된 세포독성의 하나 또는 그 이상의 조합을 의미한다. 특정한 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포의 표면에 발현되는 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 면역 살상 세포 (예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+ T-세포) 를 생체 밖에서 (ex vivo) 활성화 및/또는 확장하기에 충분하다. 특정한 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포의 표면에 발현되는 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 면역 살상 세포 (예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+ T-세포) 를 생체 내에서 (in vivo) 활성화 및/또는 확장하기에 충분하다. 외부 유래 자극 폴리펩티드가 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한지를 검출하기 위한 에세이가 여기서 서술된다. 그러므로 본 공개는, 한 관점에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구를 제공하며, 여기서 면역 세포는, 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 면역 살상 세포이다. 어떤 실시 예에서, 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인간 백혈구 항원 (Human Leukocyte Antigens)(HLA), MHC 유형 1 체인-관련 단백질 (MHC class I chain-related proteins) (MIC), 면역글로불린 슈퍼가족 단백질 (proteins of the Immunoglobulin Superfamily)(IgSF), NK 세포 세포독성 촉발하는 수용체 리간드 (NK cell cytotoxicity triggering receptor ligands), 및 인슐린 유사 성장인자 (insulin like growth factors)로부터 선택된다. 어떤 실시 예에서, 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 표 1에 보여준다.
제작된 적혈구 세포 s Comprising 외부 유래 자극 폴리펩티드
표 1: 외부 유래 자극 폴리펩티드
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달리 구체화되지 않는 한, 여기서 구체화된 서열 접근 번호는 여기 표를 포함하여, 2019년 3월 8일 현재의 데이터베이스 항목(entry)을 의미한다. 한 유전자 또는 단백질이 다수의 서열 접근 번호를 언급할 때는, 서열 변이체 모두를 포함한다.
사이토카인 (Cytokines )
어떤 실시 예에서, 본 발명은 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포를 제공한다, 여기서 면역 세포는 면역 살상 세포이고, 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한, 하나 또는 그 이상의 사이토카인을 포함하는, 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 그러므로 본 공개는, 사이토카인의 전장 (full-length), 단편 (fragment), 유사체 (homologue), 변이체 (variant) 또는 돌연변이체 (mutant) 포함하는, 사이토카인을 포함한다. 사이토카인은 다른 세포의 생물학적 기능에 영향을 줄 수 있는 단백질을 포함한다. 사이토카인에 의해 영향을 받을 생물학적 기능은, 이것에만 국한하지 않으나, 세포 성장, 세포 분화 및 사멸을 포함한다. 바람직하게는, 본 공개의 사이토카인은 세포 표면의 특정한 수용체에 결합하는 능력이 있어, 이로써 면역 살상 세포 (예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+T-세포) 를 자극한다.
바람직한 사이토카인에는, 다른 것들 중에서도, 인터루킨, 인터페론, 면역글로불린 슈퍼가족 분자, 종양 괴사 인자 부류 분자 (tumor necrosis factor family molecule) 및/또는 케모카인 (chemokine)이 포함된다. 본 공개의 좀 더 바람직한 사이토카인에는, 인터루킨-1 (interleukin-1) (IL-1), 인터루킨-2 (interleukin-2) (IL-2), 인터루킨-12 (interleukin-12) (IL-12), 인터루킨-15 (interleukin-15) (IL-15), IL-15/IL-15RA 융합 (IL-15/IL-15RA fusion), 인터루킨-18 (interleukin-18) (IL-18), 인터루킨-21 (interleukin-21) (IL-21) 및 인터페론 알파 (interferon alpha) (IFNα) 가 포함된다. 어떤 실시 예에서, 본 공개에서 특별히 바람직한 사이토카인은 IL-15/IL-15RA 융합이다. 어떤 실시 예에서, 본 공개에서 특별히 바람직한 사이토카인은 IL-12이다. 이 분야 기술 전문가는, 일단 여기서 제공되는 가르침을 인지하면, 본 공개가 이 분야 기술에서 잘 알려진 사이토카인은 물론, 미래에 발견될 어느 것도 포함한다는 것을 알게 될 것이다.
어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상) 사이토카인, 또는 이들의 변이체 또는 단편을 포함한다.
인간 백혈구 항원 ( HLA ) 단백질 ((Human Leukocyte Antigen ( HLA ) Proteins))
어떤 실시 예에서, 본 발명은 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포를 제공한다, 여기서 면역 세포는 면역 세포는 면역 살상 세포이고, 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한, 하나 또는 그 이상의 인간 백혈구 항원 단백질 (human leukocyte antigen proteins) 을 포함하는, 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 그러므로 본 공개는, HLA 단백질의 전장 (full-length), 단편 (fragment), 유사체 (homologue), 변이체 (variant) 또는 돌연변이체 (mutant) 포함하는, HLA 단백질을 포함한다. HLA 유전자 부류는 인간 백혈구 항원 (HLA) 복합체라고 알려진 관련 단백질 군을 만드는 안내를 제공한다. HLA는, 많은 종에서 일어나는 유전자 부류인, 주 조직적합성 복합체 (major histocompatibility complex (MHC)의 인간 판이다. 사람에서 M HC 복합체는 염색체 6번에 서로 가까이 놓여 있는 200 유전자 이상으로 구성된다. 이 복합체의 유전자는 세 가지 기본 군으로 분류된다: 유형 1 (class I), 유형 2 (class II), 및 유형 3 (class III). 인간은 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C라고 불리는, 세 가지 주 MHC 유형 1 유전자들을 가진다. 이들 유전자로부터 생산되는 단백질은 거의 모든 세포의 표면에 제시된다. HLA 유전자들은 많은 가능한 변이가 있으며, 및 어떤 HLA 유전자는 수백 개의 변이가 동정 되었으며 (대립형질, allele), 이들의 각각은 특별한 숫자가 주어진다 (HLA-B27와 같은). 가까이 관련된 대립형질은 함께 분류된다; 예를 들어, 적어도 40개의 매우 비슷한 대립 형질이 HLA-B27의 아형 (subtype)이다.
어떤 실시 예에서, HLA 단백질은 인간 백혈구 항원 (HLA)-A이다. 어떤 실시 예에서, HLA 단백질은 인간 백혈구 항원 (HLA)-C이다. 어떤 실시 예에서, HLA 단백질은 인간 백혈구 항원 (HLA)-E이다. 어떤 실시 예에서, HLA 단백질은 인간 백혈구 항원 (HLA)-G이다.
어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상) HLA 단백질, 또는 이들의 변이체 또는 단편을 포함한다.
MHC 유형 1 체인 -관련 단백질 ( MHC class I chain-related proteins) ( MIC )
어떤 실시 예에서, 본 공개는 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포를 포함한다, 여기서 면역 세포는 면역 세포는 면역 살상 세포이고, 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한, 하나 또는 그 이상의 주조직적합성 복합체 (MHC) 유형 I 체인-관련된 (MIC) 단백질 (Major Histocompatibility complex (MHC) class I chain related (MIC) proteins)을 포함하는, 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 그러므로 본 공개는, MIC 단백질의 전장 (full-length), 단편 (fragment), 유사체 (homologue), 변이체 (variant) 또는 돌연변이체 (mutant) 포함하는, MIC 단백질을 포함한다. MIC 단백질은 고전적이 인간 백혈구 항원 (HLA) 분자와 유사성을 보이나, 베타2 마이크로글로빈 (beta2 microglobulin) 과는 섞이지 않고, 펩티드에 결합하지 않고, 및 정상 순환하는 림프구에서 발현되지 않는다. MIC 단백질은 활성화된 자연 살상 세포 수용체 (natural killer cell receptor) NKG2D를 끌어 당긴다.
UL16-결합 단백질 (UL16-binding proteins) (ULBPs)은 인간 사이토메갈로 바이러스 당단백질 (human cytomegalovirus (HCMV) glycoprotein) UL16에 결합하는 능력에 근거하여 동정 된 새로운 부류의 MHC 유형 I-관련된 분자 (MHC class I-related molecules) (MICs)이다. UL16은 또한 MHC 유형 I-유사 분자의 다른 부류의 멤버, MICB 에 결합한다. ULBPs 및 MICs는, 자연 살상 세포 (NK) 및 다른 면역 주효 세포에 의해 발현되는 활성화된 수용체, NKG2D/DAP10 에 대한 리간드 (ligand) 이고, 및 이 상호작용은 UL16에 의해 차단된다. 타겟 세포에서 발현되는 ULBPs 또는 MICs에 의해 NKG2D/DAP10 가 결합하면 NK-세포가 MHC 유형 I 분자를 인식하여 생기는 억제 신호를 극복할 수 있고 및 NK 세포독성을 촉발시킬 수 있다. ULBPs는 NK 세포에 대하여 자너스 키나아제 2 (janus incase 2), 전사 5 (transcription 5)의 신호전달자 및 활성인자, 세포 외-신호-조절된 키나아제 마이토젠-활성화된 단백질 키나아제 (extracellular-signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase) 및 Akt/단백질 키나아제 B 신호 전달 경로를 활성화 시켜 그 효과를 끌어낸다. ULBPs 단독으로 여러 신호전달 경로를 활성화 시키고 및 중간 정도의 사이토카인 생산을 활성화 시키지만, ULBPs는 NK 세포에 의한 인터페론-감마 생산을 위해 인터루킨 12와 강하게 협동 한다.
어떤 실시 예에서, MIC 단백질은 MHC 유형 I 체인-관련 단백질 A (MHC class I chain-related protein A) (MICA) 이다. 어떤 실시 예에서, MIC 단백질은 MHC 유형 I 체인-관련 단백질 B (MHC class I chain-related protein B) (MICA) 이다. 어떤 실시 예에서, MIC 단백질은 UL16 결합 단백질 (ULBP) 이다.
어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상) MIC 단백질, 또는 이들의 변이체 또는 단편을 포함한다.
면역글로블린 슈퍼가족 ( Immunoglobulin Superfamily ) ( IgSF )
어떤 실시 예에서, 본 공개는 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포를 포함한다, 여기서 면역 세포는 면역 세포는 면역 살상 세포이고, 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한, 하나 또는 그 이상의 IgS 부류 (IgS family) 단백질을 포함하는, 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 그러므로 본 공개는, IgS 슈퍼가족 멤버의 전장 (full-length), 단편 (fragment), 유사체 (homologue), 변이체 (variant) 또는 돌연변이체 (mutant) 를 포함하는, IgS 슈퍼가족 멤버를 포함한다. 면역글로블린 슈퍼가족 (immunoglobulin Superfamily) (IgSF)은 세포의 부착, 결합 및 인식 과정과 연관된 부류의 단백질이다. 분자들은 면역글로블린과 구조적 모양의 공통성에 근거하여 이 슈퍼가족의 멤버로 분류된다; 이들은 모두 면역글로블린 도메인 (domain) 또는 폴드 (fold)라고 알려진 도메인을 소유한다. IgSF 멤버에는 세포 표면 항원 수용체, 면역 시스템의 공동-수용체 (co-receptors) 및 공동-자극제 (co-stimulatory) 분자, 림프구에 항원 제시하는데 관련되는 분자, 세포 부착 분자, 특정 사이토카인 수용체 및 세포 내 근육 단백질이 포함된다. IgSF 멤버는 다음과 같이 분류될 수 있다; 항원 수용체 (예를 들어, 항체 또는 면역글로블린: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM); 항원 제시 분자 (antigen presenting molecules) (예를 들어, MHC 유형 I, MHC 유형II); 공동-수용체 (co-receptors) (예를 들어, CD4, CD8); 공동-자극 또는 억제 분자 (co-stimulatory or inhibitory molecules) (예를 들어, CD28, CD80, CD86); 자연 살상 세포에 있는 수용체 (receptors on Natural killer cells) ((예를 들어. 살상-세포 면역글로블린-유사 수용체 (killer-cell immunoglobulin-like receptors) (KIR)); 백혈구 세포에 있는 수용체 (receptors on leukocytes) ((예를 들어, 백혈구 면역글로블린-유사 수용체 (leukocyte immunoglobulin-like receptors) (LILR)); IGSF CAMs (예를 들어, NCAMs, ICAM-1); 사이토카인 수용체; 성장 인자 수용체; 수용체 타이로신 키나아제/포스파타아제 (receptor tyrosine kinases/phosphatases); IgG 결합 수용체.
폴리오바이러스 수용체 (Poliovirus Receptor) (PVR/CD155) 는 면역글로블린 슈퍼가족에 속하는 막통과 당단백질이다. PVR/ CD155는 NK 세포 부착을 매개하고 및 NK 세포 주효 기능 (effector function) 을 촉발한다. PVR/ CD155는 두 개의 다른 NK 세포 수용체: CD96 및 CD226에 결합한다. 이 상호작용은 세포-세포 접촉 부위에 축적되어, NK 세포와 타겟 세포 사이에 성숙 된 면역적 시냅스 (immunological synapse) 의 형성을 유도한다. 이는 부착 (adhesion) 및 용해성 과립 (lytic granules) 및 IFN-감마 (IFN-γ) 의 분비를 촉발할 수 있고 및 활성화된 NK 세포의 세포독성을 활성화 시킬 수 있고, 및 또한 NK 세포-타겟 세포 모듈 교환 (modular exchange)을 촉진 시킬 수 있으며, 및 NK 세포에 PVR 전달을 촉진 시킬 수 있다.
또한, 넥틴-2 (Nectin-2) 라고도 알려진, 폴리오바이러스 수용체-관련 2 (Poliovirus receptor-related 2) (PVRL2) 는 두 개의 Ig-유사 C2-형 도메인 (Ig-like C2-type domains) 및 Ig-유사 V-형 도메인 (Ig-like V-type domain) 을 가진 단일-통과 유형 I 막 당단백질 (single-pass type I membrane glycoprotein) 이다. 이 단백질은 부착 교차점 (adherens junction) 원형질막 (혈장 멤브레인) 성분 중 하나이다.
또한, B-림프구 활성 마커 (B-lymphocyte activation marker) (BLAST-1) 또는 신호전달 림프구 활성 분자 2 (signaling lymphocytic activation molecule 2) (SLAMF2) 라고도 알려진, CD48 항원 (Cluster of Differentiation 48) 은 인간에서 CD448 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. CD48은 IgSF의 CD2 슈퍼가족의 멤버이며, 이는 CD84, CD150, CD229 및 CD244와 같은 SLAM (signaling lymphocyte activation molecules) (신호전달 림프구 활성 분자) 단백질을 포함한다. CD48는 림프구, 및 다른 면역 세포, 수지상 세포 (dendritic cells) 및 내피세포 (endothelial cells)에서 발견되며, 및 이들 세포의 활성화 및 분화 경로에 참여한다.
NK-T-B 항원 (NTBA)은 NK, T, 및 B 세포에서 발현되는 표면 분자이다. 인간 NK 세포에서는, NTBA는 자연 세포독성 수용체 (natural cytotoxicity receptors) (NCR)를 높은 표면 밀도로 발현하는 세포에서만 세포 용해 작용을 촉발시킬 수 있으므로 이는 일차적으로 공동수용체로서 작용하는 것으로 나타났다. NTBA는 이를 CD2 부류에 속하게 하는 구조적 특징으로서 특성이 있는 Ig 슈퍼가족의 한 멤버임이 분자 클로닝으로 드러났다.
어떤 실시 예에서, IgSF 단백질은 IgG이다. 어떤 실시 예에서, IgSF 단백질은 PVR/CD155이다. 어떤 실시 예에서, IgSF 단백질은 CD48이다. 어떤 실시 예에서, IgSF 단백질은 넥틴 2 (Nectin2) 이다. 어떤 실시 예에서, IgSF 단백질은 NK-T-B 항원이다.
어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상) IgSF 단백질, 또는 이들의 변이체 또는 단편을 포함한다.
헤파린 설페이트 /헤파린 설페이트 프로테오글라이칸 ( Heparan Sulfate/ Heparan Sulfate Proteoglycan )
어떤 실시 예에서, 본 발명은 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포를 포함한다, 여기서 면역 세포는 면역 세포는 면역 살상 세포이고, 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한, 하나 또는 그 이상의 헤파린 설페이트/헤파린 설페이트 프로테오글라이칸 (heparan sulfate/ heparin sulfate proteoglycans) 단백질을 포함하는, 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 헤파린 설페이트 (Heparan sulfate) (HS)는 모든 동물 조직에서 발견되는 선상 폴리삭카라이드 (polysaccharide) 이다. 이는 두 개 또는 세 개의 HS 체인이 세포 표면에 또는 세포 외 매트릭스 단백질에 아주 가깝게 붙어 있는 프로테오글라이칸 (proteoglycan) (HSPG)으로서 존재한다. 헤파린 설페이트 프로테오글라이칸 (Heparan sulfate proteoglycans) (HSPGs)은 세포 표면 및 세포 외 매트릭스에 널리 분포되어 있는 당단백질이다. 이들의 헤파린 설페이트 잔기들은 자주 특정한 수용체를 타겟 하는 세포외 단백질의 대체 부착 지점을 나타낸다. 그러므로 HSPGs는 리간드-수용체 접촉을 조정하고 및 수많은 생물학적 과정에 참여한다.
분자 및 세포-근거한 연구에서 헤파린 설페이트는 시험관 내에서 림프구 회귀 (lymphocyte homing) 에 관련되는 L-셀렉틴 (L-selectin), 케모카인 (chemokines), 및 인테그린 (integrins) 을 포함하는 몇 가지 주요한 분자에 결합함을 제시한다. 림프구 회귀에 없어서는 안 되는, 2차 림프의 케모카인 CCL21 (또한, SLC라고도 불리는) 를 포함하는, 대부분의 케모카인들은, 시험관 내에서 헤파린 설페이트 또는 이의 높이 설페이트화 된 유사체 헤파린에 결합한다 (Lortat-Jacob et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99: 1229-1234). 헤파린 설페이트-결합된 케모카인은 CCR6 및 CCR7 과 같은 케모카인 수용체에 의해 인식되며, 이로써 인테그린을 활성화시켜 림프구의 분출을 유도한다 (von Andrian and Mempel, Nat. Rev. Immunol. 2003; 3: 867-878, 이의 전 내용이 여기 참고문헌으로 병합되어 있다). 다양한 증거로, 헤파린은 림프구의 이동을 촉진 시키기 위해, 케모카인의 통과세포외배출 (transcytosis), 제시 (presentation), 및 구배 형성 (gradient formation) 에 기능 하는 것으로 제시되고 있다.
어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상) HS 폴리삭카라이드 (HS polysaccharides), 또는 이들의 변이체 또는 단편을 포함한다.
자연 살상 세포독성 촉발시키는 수용체 리간드 (Natural Killer Cytotoxicity Triggering Receptor Ligands)
어떤 실시 예에서, 본 공개는 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포를 포함한다, 여기서 면역 세포는 면역 세포는 면역 살상 세포이고, 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한, 하나 또는 그 이상의 자연 살상 세포독성 촉발시키는 수용체 리간드를 포함하는, 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. NK 세포는, 몇 가지 자연 세포독성 수용체 (즉, NCR1, NCR2, 및 NCR3, 각각 NKp46, NKp44, 및 NKp30, 로서 가장 잘 알려졌다) 를 포함하는 활성화 수용체를 갖추고 있으며, 이는 직접적으로, 형질전환된 세포를 죽이는데 관련되고 있다. NKp44, 이는 휴지하고 있는 NK 세포에 의해서는 발현되지 않고, 단지 이의 활성화된 상대 (counterpart)에 의해서만 발현된다. NK 수용체 활성화를 위한 리간드의 발현은 현재는 병리학적인 시나리오 (pathological scenario) 의 징후로 간주된다.
어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상) NK 세포독성 촉발하는 수용체 리간드, 또는 이들의 변이체 또는 단편을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 IL-1, IL-2, IL-12, IL-15, IL-15/IL-15RA 융합, IL-18, IL-21, 인터페론 알파 (interferon alpha) (IFNα), 4-1BBL, 폴리오바이러스 수용체 (Poliovirus Receptor) (PVR/CD155), CD48, 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigen) (HLA)-A, HLA-C, HLA-G, 헤파린 설페이트 (heparan sulfate) (HS), HLA-E, CpG, 면역글로블린 G (immunoglobulin G) (IgG), UL16 결합 단백질 (UL16 binding proteins) (ULBP), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 (MHC class I chain-related proteins) (MIC), B7-H6, NkP44L, 넥틴2 (Nectin2), NK-T-B 항원 (NTBA), 활성-유도된 C-형 렉틴 (activation-induced C-type lectin) (AICL) 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1) 로 구성된 군으로부터 선택된 한 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, MIC 단백질은 MHC 유형 I 체인-관련 단백질 A (MHC class I chain-related protein A) (MICA) 또는 MHC 유형 I 체인-관련 단백질 B (MHC class I chain-related protein B) (MICB) 이다.
어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 IL-12 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 구성된 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 4-1BBL 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 구성된 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 구성된 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 IL-15/IL-15RA 융합 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이로 구성된 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 IL-15/IL-15RA 융합, MHC 유형 I 체인-관련 단백질 A (MICA) 또는 MHC 유형 I 체인-관련 단백질 B (MICB), 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1) 으로 구성된 군으로부터 선택된 한 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 적어도 두 개의 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA를 포함하거나 또는 IL-15/IL-15RA로 구성되고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-1, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, 인터페론 알파 (IFNα), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 A (MICA) 또는 MHC 유형 I 체인-관련 단백질 B (MICB), 폴리오바이러스 수용체 (Poliovirus Receptor) (PVR/CD155) 및 CD48로 구성된 군으로부터 선택된 한 폴리펩티드를 포함하거나 또는 폴리펩티드로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-1이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-2이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-12이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-18이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-21이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IFNα 이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 MICA 이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 MICB 이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 PVR 이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 CD48 이다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 및 IL-15/IL-15R, 4-1BBL 및 IL-12, 및 IL_12 및 IL-15/IL-15RA 로 구성된 군으로부터 선택된다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 4-1BBL 이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 4-1BBL이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-12다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-12 이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA이다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-18 및 IL-12, 및 IL-18 및 IL-21로 구성된 군으로부터 선택된다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-18이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-12이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-18 이고 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-21이다.
어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 적어도 세 개의 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12이고, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-18이고 및 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 융합이다. 더 나아간 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 IL-12인 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, IL-18인 두 번째 외부 유래 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA 융합인 세 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 적혈구 세포는 메모리-유사 NK 세포 (memory-like NK cell)를 자극할 수 있다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12이고, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-18이고 및 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15이다. 더 나아간 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 IL-12인 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, IL-18인 두 번째 외부 유래 폴리펩티드 및 IL-15인 세 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 적혈구 세포는 메모리-유사 NK 세포 (memory-like NK cell)를 자극할 수 있다.
이 공개는, 다른 관점에서, 제작된 적혈구 세포는 MHC 유형 I 체인-관련 단백질 A (MICA), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 B (MICB), 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1) 으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 MICA, MICB 및 IGF-1으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 더 나아가 IL-1, IL-2, IL-12, IL-15, IL-15/IL-15RA 융합, IL-18, IL-21, 인터페론 알파 (interferon alpha) (IFNα), 4-1BBL, 폴리오바이러스 수용체 (Poliovirus Receptor) (PVR/CD155), CD48, HLA-A, HLA-C, HLA-G, 헤파린 설페이트 (heparan sulfate) (HS), HLA-E, CpG, IgG, UL16 결합 단백질 (ULBP), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 (MIC), B7-H6, NkP44L, 넥틴2 (Nectin2), NK-T-B 항원 (NTBA), 활성-유도된 C-형 렉틴 (activation-induced C-type lectin) (AICL) 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1) 로 구성된 군으로부터 선택된 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다.
특정 실시 예에서는, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12이다. 어떤 실시 예에서, 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12, 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12이고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12이고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12이고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL이다. 어떤 실시 예에서, IL-12는 IL-12 p40/IL-12 p35 융합 폴리펩티드이다.
어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 세 개 또는 그 이상, 예를 들어, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포 집단은 세 개 또는 그 이상, 예를 들어, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 또는 5000의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 예를 들어, 여기서 이 집단에서 다른 제작된 적혈구 세포는 다른 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하거나 또는 여기서 이 집단에서 다른 제작된 적혈구 세포는 다른 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포이다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포이다.
어떤 실시 예에서, 적어도 두 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드가 하나의 융합 폴리펩티드로 존재한다. 다른 실시 예에서, 적어도 세 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드가 하나의 융합 폴리펩티드로 존재한다.
앵커/ 막통과 도메인 (Anchor/transmembrane domains)
특정 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 적혈구 세포로부터 방출되지 않는다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 유전적으로 제작된 적혈구 세포의 표면에 제시된다, 즉 외부 유래 자극 폴리펩티드가 적혈구 세포막에 부착된다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 더 나아가 폴리펩티드를 적혈구 세포막에 정박하게 (anchor) 하는 막 통과 도메인을 포함한다. 특정 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드를 적혈구 세포막 (예를 들어, 막 통과 도메인) 에 정박시키는 폴리펩티드 서열은 외부 유래 자극 폴리펩티드에 존재하는 폴리펩티드와는 이종적 (heterologous) 이다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드를 적혈구 세포막에 정박시키는 폴리펩티드 서열은 IL-15 폴리펩티드 및/또는 IL-15RA 폴리펩티드, 4-1BBL 폴리펩티드 또는 IL-12 폴리펩티드와는 이종적이다.
어떤 실시 예에서, 막 통과 도메인 (transmembrane domain) 은 유형 1 막 단백질 (type 1 membrane protein) 의 막 통과 도메인을 포함하거나 또는 막 통과 도메인으로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 유형 1 막 단백질은; 글라이코포린 A (Glycophorin A) (GPA); 글라이코포린 B (glycophorin B) (GPB); 바시긴 (Basigin) (또한 CD147로도 알려짐); CD44; CD58 (또한, LFA3 라고도 알려짐); 세포내 부착 분자 4 (Intercellular Adhesion Molecule 4) (ICAM4); 기저 세포 부착 분자 (Basal Cell Adhesion Molecule) (BCAM); CR1; CD99; 적혈모세포 막 연관된 단백질 (Erythroblast Membrane Associated Protein) (ERMAP); 접합부위 부착 분자 A (junctional adhesion molecule A) (JAM-A); 뉴로플라스틴 (neuroplastin) (NPTN); AMIGO2; 및 DS 세포 부착 분자 유사 1 (DS Cell Adhesion Molecule Like 1)(DSCAML1) 으로 구성된 군으로부터 선택된다. 어떤 실시 예에서, 막 통과 도메인은 유형 2 막 단백질 (type 1 membrane protein) 의 막 통과 도메인을 포함하거나 또는 막 통과 도메인으로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 유형 2 막 단백질은 (type 2 membrane protein) 작은 내 막 단백질 1 (small integral membrane protein 1) (SMIM1), 트랜스페린 수용체 (transferrin receptor) (CD71); Fas 리간드(FasL) 막 통과 ((Fas ligand (FasL) transmembrane));및 켈 (Kell) 로 구성된 군으로부터 선택된다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드를 적혈구 세포막에 정박시키는 폴리펩티드의 서열은 GPI-링크된 막 단백질 (GPI-linked membrane protein) 을 포함하거나, 구성되거나, 또는 유래 (예를 들어, 단편의) 한다. 어떤 실시 예에서, GPI-링크된 막 단백질은 CD59; CD55; 및 세마포린 7A (Semaphorin 7A)(SEMA7A)로 구성된 군으로부터 선택된다 .
특별한 실시 예에서, 막 통과 도메인은 글라이코포린 A (glycophorin A) (GPA) 또는 이의 막 통과 부위를 포함한다. 이론에 얽매임 없이, 특정한 실시 예에서, GPA가 바람직하다, 왜냐하면, 이는 세포가 분화하고 및 성숙함에 따라 GPA 를 유지시키는 역할을 하는 망상 세포 세포골격 (reticulocyte cytoskeleton) 과 상호 작용하는 세포질 도메인 (cytoplasmic domain) 을 가졌기 때문이다. 어떤 실시 예에서, 막 통과 도메인은 작은 내 막 단백질 (small integral membrane protein 1) (SMIM1) 또는 이의 막 통과 부분을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 앵커는 표 2에 목록화되어 있는 아미노산 서열로부터 선택된다.
표 2 앵커 서열 (Anchor Sequences)
Figure pct00002
어떤 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 융합 단백질이며, 예를 들어, 내부 유래 적혈구 세포 단백질 또는 이의 단편, 예를 들어, 막 통과 단백질, 예를 들어, GPA 또는 이의 막 통과 단편과의 융합이다. 어떤 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는, 예를 들어, 선택적으로 이량체화 도메인 (dimerization domain) 을 포함하는, 두 번째 융합 외부 유래 자극 폴리펩티드와, 이량체 또는 다량체화 (multimerization) 를 촉진하는 도메인과의 융합이다. 어떤 실시 예에서, 이량체화 도메인은 항체 분자의 한 부분, 예를 들어, Fc 도메인 또는 CH3 도메인, 을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 또는 두 번째 이량체화 도메인은 이형이량체화 (heterodimerization) 를 촉진 시키기 위하여 구멍에-손잡이 돌연변이 (knob-in-hole mutations) ((예를 들어, T366Y 손잡이 (knob) 및 Y407T 홀 (hole)) 를 포함한다.
링커 (Linkers)
본 발명의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 링커를 포함한다. 예를 들어, 링커는 외부 유래 자극 폴리펩티드의 두 폴리펩티드 서열 사이에 ((예를 들어, 사이토카인 폴리펩티드 서열 및 막 통과 도메인 서열 사이, 외부 유래 자극 폴리펩티드의 두 개의 서브유닛 서열 사이 (예를 들어, IL-2의 p40 및 p35 서브유닛 사이), 또는 두 개의 자극 폴리펩티드들 (예를 들어, IL-15 및 IL-15 RA) 사이)) 에 배열될 수 있다.
어떤 실시 예에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 포함하거나 또는 길이고 구성될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 링커는 약 5 및 약 25 아미노산 사이의 길이, 약 5 및 약 20 아미노산 사이의 길이, 약 10 및 약 25 아미노산 사이의 길이, 또는 약 10 및 약 20 아미노산 사이의 길이를 포함하거나 또는 길이로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 본 발명에서 유용한 링커는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 아미노산 길이를 포함하거나 또는 길이로 구성된다. 바람직한 실시 예시에서, 링커는 비-면역성 (non-immunogenic) 이다.
어떤 실시 예에서, 링커는 표 3 에 제시된 아미노산 서열로부터 선택된다.
표 3. 링커 서열
Figure pct00003
어떤 실시 예에서, 링커는 (GGGGS)n (서열번호 75) 를 포함하며, 여기서 n 은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 어떤 실시 예에서, 링커는 (GGGGS)n 링커 (서열번호 75) 로 구성되며, 여기서 n 은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이다. 어떤 실시 예에서, 링커는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 12) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커는 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 아미노산 서열 서열번호 23을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커는 아미노산 서열 서열번호 23으로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 아미노산 서열 서열번호 33을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커는 아미노산 서열 서열번호 33으로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 아미노산 서열 서열번호 39를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커는 아미노산 서열 서열번호 39로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 아미노산 서열 서열번호 51을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커는 아미노산 서열 서열번호 51 로 구성된다
이 분야 기술 전문가에게는 알려진, 다른 적절한 링커가, 예를 들어, 외부 유래 자극 폴리펩티드를 막 통과 도메인에 연결 시키기 위하여, 두 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 연결 시키기 위하여 (예를 들어, IL-15 및 IL-15 RA), 또는 외부 유래 자극 폴리펩티드의 서브유닛 (예를 들어, IL12의 p30 및 p40) 을 연결 시키기 위하여 사용될 수 있다.
리더 서열 (Leader sequences)
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 리더 (leader)((신호) (signal))서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 리더 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 어떤 실시 예에서, 리더 서열은 표 4 에 제시된 서열로부터 선택된다.
표 4. 리더 서열 (Leader Sequences)
Figure pct00004
IL-15/IL- 15RA 를 포함하는 제작된 적혈구 세포 (제작된 적혈구 세포s comprising IL-15/IL- 15RA )
본 공개는, 다른 관점에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-15 (IL-15) 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하며, 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha) (IL-15RA) 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵이 있는 세포다.
어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 복합체로서 존재한다. 다른 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 융합 폴리펩티드로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드는 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분에 링커에 의해서 연결된다.
특정 실시 예에서, 본 발명은 인터루킨-15 (IL-15) 폴리펩티드, 또는 이의 단편 (예를 들어, 인터루킨-15 수용체 결합 단편) 을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드는 신호 펩티드(밑줄 친)를 포함하는 야생형 인간 IL-15의 미성숙 형태를 포함한다:
MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKI
EDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANN
SLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 3).
어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 야생형 인간 IL-15의 미성숙 형태의 변이체 (varient) 를 포함한다. 특별한 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드는 야생형 인간 IL-15의 성숙한 형태를 포함한다:
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS (서열번호 4).
어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 야생형 인간 IL-15의 미성숙 형태의 변이체 (varient)를 포함한다. 특별한 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 야생형 인간 IL-15의 미성숙 형태의 변이체 (varient)를 포함한다. 특별한 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드는 서열 번호 4의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드의 단편은 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 또는 160 아미노산을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드의 단편은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 또는 160 아미노산보다 적은 아미노산을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 예를 들어, ELISA, 비아코아 (Biacore), 또는 동시-면역 침강법 (co-immunoprecipitation) 과 같은, 이 분야 기술에서 잘 알려진 에세이로 측정하였을 때, IL-15 폴리펩티드의 단편 또는 변이체는 야생형 인간 IL-15 폴리펩티드의 IL-15RA 폴리펩티드에 결합하는 기능을 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 유지 한다. 어떤 실시 예에서, 예를 들어, 전기이동력 이동 에세이 (electromobility shift assays), ELISAs 및 다른 면역 에세이 (other immunoassays) 와 같은 이 분야 기술에서 잘 알려진 에세이로 측정하였을 때, IL-15 폴리펩티드의 단편 또는 변이체는 IL-15- 매개하는 신호 전달을 유도하기 위하여 야생형 인간 IL-15 폴리펩티드의 기능을 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 유지한다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-15 수용체 (interleukin-15 receptorα) (IL-15RA) 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 RA는 신호 펩티드 (밑줄 친) 를 포함하는 야생형 인간 IL-15A의 미성숙 형태를 포함한다:
MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICN
SGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTA
KNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVE
MEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL (서열번호 5).
어떤 실시 예에서, IL-15 RA 폴리펩티드는 서열 번호 5의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 미성숙 형태의 야생형 인간 IL-15A의 변이체를 포함한다. 특별한 실시 예에서, IL-15 RA 폴리펩티드는 서열 번호 5 의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, IL-15 RA 폴리펩티드는 야생형 인간 IL-15의 성숙한 형태를 포함한다:
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL (서열번호 6).
어떤 실시 예에서, IL-15 RA 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 야생형 인간 IL-15a의 성숙한 형태의 변이체 (varient) 를 포함한다. 특별한 실시 예에서, IL-15a 폴리펩티드는 서열 번호 6의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, IL-15Ra 폴리펩티드는 IL-15Ra 폴리펩티드의 세포 외 부분(extracellular portion) 을 포함한다. 예를 들어, IL-15Ra 폴리펩티드는 야생형 IL-15Ra의 막 통과 도메인 (transmembrane domain) 및 선택적으로 야생형 IL-15Ra의 내부세포 도메인 (intracellular domain) 이 결핍될 수 있다. 어떤 실시 예에서, IL-15Ra 폴리펩티드는 신호 펩티드(밑줄 친)를 포함하는 세포 외 야생형 인간 IL-15Ra (extracellular wild-type human IL-15Ra)의 미성숙 형태를 포함한다:
MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICN
SGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTA
KNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT (서열번호 7).
어떤 실시 예에서, IL-15Ra 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가진 세포 외 야생형 인간 IL-15Ra (extracellular wild-type human IL-15Ra) 의 미성숙 형태 변이체를 포함한다. 특별한 실시 예에서, IL-15a 폴리펩티드는 서열 번호 7의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, IL-15Ra 폴리펩티드는 세포 외 야생형 인간 IL-15Ra (extracellular wild-type human IL-15Ra) 의 성숙한 형태를 포함한다:
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTT (서열번호 8).
어떤 실시 예에서, IL-15Ra 폴리펩티드는 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가진 세포 외 야생형 인간 IL-15Ra (extracellular wild-type human IL-15Ra) 의 성숙한 형태 변이체를 포함한다. 특별한 실시 예에서, IL-15a 폴리펩티드는 서열 번호 8의 아미노산 서열로 구성된다.
IL-15은 IL-15RA 폴리펩티드 수용체의 세포 외 도메인 엑손 2 의 "스시 도메인 (sushi domain)" 을 통해 높은 친화력을 가지고 IL-15RA 폴리펩티드 수용체에 특별히 결합한다 (Wei et al., J Immunol. 2001; 167:277-282). 어떤 실시 예에서, IL-15Ra 폴리펩티드는 야생형 인간 IL-15A의 스시 도메인을 포함한다:
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR (서열번호 9).
어떤 실시 예에서, IL-15Ra 폴리펩티드는 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가진 야생형 인간 IL-15RA의 스시 도메인의 변이체를 포함한다. 특별한 실시 예에서, IL-15a 폴리펩티드는 서열 번호 8의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, IL-15RA 폴리펩티드는 야생형 인간 IL-15Ra 또는 이의 변이체의 스시 도메인을 포함하고 및 인간 IL-15A의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 의 추가의 아미노산을 포함한다. 특정한 실시 예에서, IL-15RA 폴리펩티드는 야생형 인간 IL-15RA의 스시 도메인 및 인간 IL-15RA의 추가의 아미노산 13개를 포함한다:
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPS (서열번호 10).
어떤 실시 예에서, IL-15RA 폴리펩티드는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시 예에서, IL-15A 폴리펩티드는 서열 번호 10의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, IL-15RA 폴리펩티드의 단편은 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200의 아미노산을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15RA 폴리펩티드의 단편은 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200의 아미노산을 포함하고, 및 스시 도메인 (sushi domain)을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15RA 폴리펩티드의 단편 또는 변이체는 이 분야 기술에서 잘 알려진 에세이, 예를 들어, ELISA, 비아코아 (Biacore), 동시-면역침강 (co-immunoprecipitation), 에세이로 측정했을 때, IL-15 폴리펩티드에 결합하는 야생형 IL-15RA 폴리펩티드의 기능을 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 유지한다. 다른 바람직한 실시 예에서, IL-15RA 폴리펩티드의 변이체 또는 단편은, 예를 들어, 전기이동력 이동 에세이 (electromobility shift assays), ELISAs 및 다른 면역 에세이 (other immunoassays) 와 같은 이 분야 기술에서 잘 알려진 에세이로 측정하였을 때, IL-15-매개하는 신호 전달을 유도하기 위하여 야생형 인간 IL-15RA 폴리펩티드의 기능을 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 유지한다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드 또는 이의 단편 및 IL-15RA 폴리펩티드 또는 이의 단편 (예를 들어, IL-15 결합 단편) 을 포함한다. 여기서 서술된 IL-15 폴리펩티드 어느 것은 외부 유래 자극 폴리펩티드를 형성하기 위하여 여기서 서술된 IL-15RA 폴리펩티드 어느 것과 결합할 수 있다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드는 복합체로서 존재한다. IL-15/IL-15RA 복합체의 구성성분은 비-공유 결합 또는 공유결합을 사용하여 (예를 들어, 펩티드 결합을 통해 아미노산을 결합시켜), 직접적으로 융합할 수 있다. 특정한 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드로서 존재한다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15RA 폴리펩티드 및 신호 펩티드 (signal peptide) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15RA 폴리펩티드 및 신호 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 표 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 아미노산 서열로 구성되는 신호 펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 GPA 신호 펩티드를 포함하는 또는 GPA 신호 펩티드로 구성되는 신호 펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 신호 펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열, IL-15 폴리펩티드, 및 IL-15RA 폴리펩티드를 포함하거나 또는 이로 구성되는 리더 서열 (leader sequence) 을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 성숙된 인간 IL-15 폴리펩티드, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 IL-15RA 폴리펩티드를 포함하거나 또는 이로 구성되는 리더 서열 (leader sequence) 을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 성숙된 인간 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 유연한 링커에 의해 연결된다.
IL-15 및 IL-15RA 폴리펩티드들은 하나 또는 그 이상의 링커를 사용하여 합쳐질 수 있다. 여기서 제공된 어느 링커도 사용될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 아미노산 길이인 펩티드이다. 어느 특정한 실시 예에서, 링커는 IL-15가 IL-15RA에 결합하는 능력을 보존하기에 충분하게 긴 길이이다. 다른 실시 예에서, 링커는 IL-15/IL-15RA 복합체가 βγIL-15 수용체 복합체에 결합하는 능력을 보존하고 및 IL-15 신호 전달을 매개하는 촉진제로서 작용하는 능력을 보존하기에 충분하게 길다. 어떤 실시 예에서, 링커는 표 3에 목록화되어 있는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 아미노산 서열로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 아미노산 서열 (GGGGS)n (서열번호 75) 을 포함하고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 어떤 실시 예에서, 링커는 (GGGGS)n 링커 (서열번호 75)로 구성되며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 특별한 실시 예에서, 링커는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 12) 를 포함한다. 더 나아간 특별한 실시 예에서, 링커는 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된다.
이 분야 기술의 전문가에게 알려진, 다른 적절한 링커가, IL-15 및 IL-15RA 폴리펩티드를 연결하게 하기 위해 사용될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 본 발명에서 유용한 링커는 길이가 5 에서 25 아미노산 사이, 5-20 아미노산 길이, 10-25 아미노산 길이, 또는 10-20 아미노산 길이이다. 어떤 실시 예에서, 본 발명에서 유용한 링커는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 아미노산 길이이다. 바람직한 실시 예에서, 링커는 비-면역원성이다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드의 세포 외 부분을 포함한다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 스시 도메인 (sushi domain) 을 포함한다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, IL-15RA 폴리펩티드, 또는 IL-15/IL-15RA 복합체 또는 융합 폴리펩티드는 적혈구 세포로부터 방출되지 않는다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, IL-15Ra 폴리펩티드, 또는 IL-15/IL-15RA 복합체 또는 융합 폴리펩티드는 적혈구 세포막에 부착된다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 더 나아가, 폴리펩티드를 적혈구 세포막 (여기서 앵커 또는 막 통과 도메인으로서 언급된다) 에 앵커 되게 하는 폴리펩티드 서열 (예를 들어, 막 통과 부위) 을 포함한다. 어떤 특정 실시 예시에서, 폴리펩티드를 적혈구 세포막에 앵커 되게 하는 폴리펩티드 서열은 외부 유래 자극 폴리펩티드에 있는 다른 폴리펩티드에 이종형 (heterologous) 이다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, 폴리펩티드를 적혈구 세포막에 앵커 되게 하는 폴리펩티드 서열은 IL-15 폴리펩티드 및/또는 IL-15RA 폴리펩티드에 이종형이다. 어떤 특정 실시 예시에서, 폴리펩티드를 적혈구 세포막에 앵커 되게 하는 폴리펩티드 서열은 GPA 서열이다.
외부 유래 폴리펩티드를 적혈구 세포막에 앵커 하는데 유용한 다른 폴리펩티드는 전문가에게는 알려졌으며 및 IL-15, IL-15RA, 또는 IL-15/IL-15RA 융합을 포함하는 외부 유래 폴리펩티드에 포함하려는 의도가 있다. 비-제한적인 예시에는 작은 내부 막 단백질 1 (small integral membrane protein 1) (SMIM1), 트란스페린 수용체 (transferrin receptor), Fas 리간드 (Fas ligand) (FasL), 켈 및 밴드 3 (Kell and Band 3) 이 포함 된다. 밴드 3 음이온 운송 단백질 (Band 3 anion transport protein), 절단된 트란스페린 수용체 (truncated transferrin receptor) 및 Fas 리간드 막 통과 도메인 ((Fas Ligand (FasL) transmembrane domain)).
어떤 실시 예에서, 앵커 (anchor) 또는 막 통과 도메인 (transmembrane domain) 은 유형 1 막 단백질 (type 1 membrane protein) 또는 이의 막 통과 부위를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인은: 글라이코포린 A (Glycophorin A) (GPA); 글라이코포린 B (glycophorin B) (GPB); 바시긴 (Basigin) (또한 CD147로도 알려짐); CD44; CD58 (또한, LF A3 라고도 알려짐); 세포 내 부착 분자 4 (Intercellular Adhesion Molecule 4) (ICAM4); 기저 세포 부착 분자 (Basal Cell Adhesion Molecule) (BCAM); CR1; CD99; 적혈모세포 막 연관된 단백질 (Erythroblast Membrane Associated Protein) (ERMAP); 접합부위 부착 분자 A (junctional adhesion molecule A) (JAM-A); 뉴로플라스틴 (neuroplastin) (NPTN); AMIGO2; 및 DS 세포 부착 분자 유사 1 (DS Cell Adhesion Molecule Like 1) (DSCAML1) 으로 구성된 군으로부터 선택된 유형 1 막 단백질 (type 1 membrane protein) 또는 이의 막 통과 부위를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 앵커 (anchor) 또는 막 통과 도메인은 유형 2 막 단백질 (type 2 membrane protein) 또는 이의 막 통과 부위를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인은 작은 내 막 단백질 1 (small integral membrane protein 1) (SMIM1), 트랜스페린 수용체 (transferrin receptor) (CD71); Fas 리간드(FasL) 막 통과 ((Fas ligand (FasL) transmembrane)); 및 켈 (Kell) 로 구성된 군으로부터 선택된 유형 2 막 단백질 (type 2 membrane protein) 또는 이의 막 통과 부분을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 앵커는 GPI-연결된 막 단백질이다. 어떤 실시 예에서, GPI-연결된 막 단백질 앵커는 CD59; CD55; 및 세마포린 7A (Semaphorin 7A) (SEMA7A) 로 구성된 군으로부터 선택된다.
어떤 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인은 작은 내 막 단백질 1 (small integral membrane protein 1) (SMIM1) 또는 이의 막 통과 부위를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인은 글라이코포린 A (glycophorin A) (GPA) 또는 이의 단편을 (예를 들어, 이의 막 통과 부위) 포함하거나 또는 이로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인은 표 2 에서 제공되는 아미노산서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 링커는 앵커 또는 막 통과 도메인 및 IL-15 폴리펩티드, IL-15RA 폴리펩티드, 또는 IL-15/IL-15RA 폴리펩티드 사이에 위치한다. 적절한 링커에는, 제한 없이, 표 3 에 제공된 어느 링커 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인, 예를 들어, GPA, 및 IL-15 폴리펩티드, IL-15RA 폴리펩티드, 또는 IL-15/IL-15RA 폴리펩티드 사이의 링커는 HA 링커 (HA linker) 를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 서열은 포함하는 앵커, 인터루킨-15 (IL-15) 폴리펩티드, 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha) (IL-15RA) 폴리펩티드의 세포 외 부분을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 앵커, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 성숙 된 인간 IL-15, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 성숙 된 인간 세포 외 IL-15RA를 포함하고, 이로써, 성숙 된 인간 IL-15 아미노산 서열 및 성숙 된 인간 세포 외 IL-15RA 아미노산 서열은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 유연한 링커 (flexible linker) 에 의해 연결된다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는: 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 신호 펩티드 (signal peptide) (예를 들어, GPA 신호 펩티드), 서열번호 4를 포함하거나 또는 이로 구성된 성숙 된 인간 IL-15, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 유연한 링커 (예를 들어, 성숙 된 인간 IL-15 및 성숙 된 인간 세포 외 IL-15RA 을 연결하는), 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 성숙 된 인간 세포 외 IL-15RA, 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 링커, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 앵커를, 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 (예를 들어, N-말단에서 C-말단으로): 서열번호 4를 포함하거나 또는 이로 구성된 성숙 된 인간 IL-15, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 유연한 링커 (예를 들어, 성숙 된 인간 IL-15 및 성숙 된 인간 세포 외 IL-15RA 을 연결하는), 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 성숙 된 인간 세포 외 IL-15RA, 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 링커, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 앵커를, 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 37을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
특정한 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 27의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 27의 아미노산 서열로 구성된다.
특정한 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 29의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 29의 아미노산 서열로 구성된다.
특정한 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 31의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 31의 아미노산 서열로 구성된다.
특정한 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 35의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 35의 아미노산 서열로 구성된다.
특정한 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 37의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 37의 아미노산 서열로 구성된다.
IL-15/IL- 15RA 및 4- 1BBL
제작된 적혈구 세포는 여기서 서술된 대로 IL-15 폴리펩티드 및/또는 IL-15RA 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 하나 또는 그 이상의 추가의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제작된 적혈구 세포는 더 나아가 4-1BBL (4-1BB 리간드) 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-15 (IL-15) 폴리펩티드, 또는 이의 단편 (예를 들어, IL-15 수용체 결합 단편), 및 인터루킨-15 수용체 알파 (IL-15RA) 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하고, 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL, 또는 이의 자극 단편을 포함하는, 제작된 적혈구 세포를 제공한다.
여기 전체를 통해 사용된 대로, 한 실시 예에서, "IL-15 폴리펩티드 단편 (IL-15 polypeptide fragment)" 또는 "IL-15 단편 (IL-15 fragment)" 은 IL-15RA에 결합하는 IL-15 단편이다, 즉 IL-15의 IL-15RA-결합 단편이다. 여기 전체를 통해 사용된 대로, 한 실시 예에서, "IL-15 폴리펩티드 단편 (IL-15 polypeptide fragment)" 또는 "IL-15 단편 (IL-15 fragment)" 은 IL-15의 생물학적 활성을 유지하고 있는 IL-15 단편이다.
여기 전체를 통해 사용된 대로, 한 실시 예에서, "IL-15RA 폴리펩티드 단편 (IL-15RA polypeptide fragment)" 또는 "IL-15RA 단편 (IL-15RA fragment)" 은 IL-15 에 결합하는 IL-15RA 단편이다, 즉 IL-15RA의 IL-15-결합 단편이다. 여기 전체를 통해 사용된 대로, 한 실시 예에서, "IL-15RA 폴리펩티드 단편 (IL-15RA polypeptide fragment)" 또는 "IL-15RA 단편 (IL-15RA fragment)" 은 IL-15RA의 생물학적 활성을 유지하고 있는 IL-15RA 단편이다.
4-1BBL은 4-1BB ((또한, 종양 괴사 인자 리간드 슈퍼가족, 멤버 9 (Tumor Necrosis Factor Ligand Superfamily, Member 9) (TNFSF9), 또는 CD137로도 알려짐)) 의 리간드로, 면역 시스템의 세포 표면에서 발견되는 수용체 부류의 한 멤버이다. 앨더슨 등 (Alderson et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:2219-2227) 참조. 4-1BB의 4-1BBL에의 결합은 T 세포, NK 세포, 및 수지상 세포 (dendritic cells) 에서 세포 활성화, 생존, 및 분화를 촉진하는 것으로 나타났다. 4-1BB의 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 에의 결합은, 주로 T 세포, NK 세포, 및 수지상 세포 (DCs) 에서 4-1BB 신호전달 활성을 통해 세포 활성화, 생존, 및 분화를 촉진하는 것으로 증명되었다.
어떤 특정 실시 예에서, 4-1BBL는 이의 자연적인 3 배체 형태로 있다. 더 나아간 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 4-1BBL를 자연적인 3 배체 형태로 발현하며, 여기서 자연적인 3 배체 형태는 제작된 적혈구 세포의 효능 및 활성에 중요하다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인간 4-1BBL, 예를 들어, 인간 4-1BBL의 세포 외 부분을, 포함하거나 또는 이로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 4 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 41을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 41로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 폴리펩티드 및 리더 (신호) 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 폴리펩티드 및 리더 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 어떤 실시 예에서, 리더 서열은 표 4 에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 리더 서열은 GPA 신호 펩티드이다. 어떤 실시 예에서, 리더 서열은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 폴리펩티드 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 리더 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 리더 서열, 및 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 세포 외 4-1BBL를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하고 및 적혈구 세포막에 부착된다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 폴리펩티드 및 앵커 (anchor) 또는 폴리펩티드를 적혈구 세포막에 안착시키는 막 통과 도메인을 포함한다. 어떤 특정 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인은 4-1BBL 폴리펩티드와 이종형 (heterologous) 이다. 어떤 특정 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인은 GPA 또는 이의 막 통과 부분을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 어떤 특정 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인은 SMIM1, 또는 이의 막 통과 부분을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인은 작은 내 막 단백질 1 (small integral membrane protein 1) (SMIM1), 트란스페린 수용체 (transferrin receptor), Fas 리간드 (Fas ligand) (FasL), 켈 또는 밴드 3 (Kellor Band 3), 또는 이의 막 통과 부위 (예를 들어, 막 통과 도메인)를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드는 여기서 서술된 어느 앵커 또는 막 통과 도메인을 포함할 수 있다. 어떤 실시 예에서, 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드는 표 2에서 제시된 앵커 또는 막 통과 도메인을 포함할 수 있다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 앵커 및 4-1BBL 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 앵커 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 4-1BBL 폴리펩티드를 포함한다.
4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 여기서 제공된 어느 링커를 포함할 수 있다 (예를 들어, 표 3에서 제공된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 링커). 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 GPA (또는 이의 막 통과 부위), 4-1BBL 폴리펩티드, 및 GPA (또는 이의 막 통과 부위) 와 4-1BBL 폴리펩티드 사이에 놓여 있는 링커를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 링커를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 39의 아미노산 서열로 구성된 링커를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 신호 펩티드, 4-1BBL 폴리펩티드 및 앵커를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 신호 펩티드, 4-1BBL 폴리펩티드, 링커 및 앵커를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 (N- 말단에서부터 C-말단으로) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 신호 펩티드 (signal peptide), 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 4-1BBL 폴리펩티드, 서열번호 39의 아미노산을 포함하거나 또는 이로 구성된 링커 (예를 들어, 4-1BBL 폴리펩티드 및 앵커 사이에 놓여 있는), 및 서열번호 25의 아미노산을 포함하거나 또는 이로 구성된 앵커를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 펩티드, 링커, 및 앵커를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 (N- 말단에서부터 C-말단으로) 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 4-1BBL 폴리펩티드, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 링커 (예를 들어, 4-1BBL 폴리펩티드 및 앵커 사이에 놓여 있는), 및 서열번호 25의 아미노산을 포함하거나 또는 이로 구성된 앵커를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
특별한 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 43의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 43의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 특정한 실시 예에서, IL-15/IL-15RA를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 4-1BBL를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 조합은 협동적 반응 (synergistic response) (예를 들어, 면역 살상 세포 활성화 동안) 을 유도한다. 예를 들어, 각 IL-15/ IL-15RA 또는 4-1BBL를 포함하는, 외부 유래 자극 폴리펩티드들은, 적혈구 세포에 발현될 때는, 자극 폴리펩티드 각 단독으로의 효과에 비교하여, 면역 살상 세포 (예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+ T-세포) 의 활성화를 좀 더 강력하게 생산하기 위하여 함께 작용할 수 있다. 그러한 협동적 활성은 여기서 제공된 실시예시에서 보여준다. 따라서, 어떤 실시 예에서, 본 발명은 첫 번째 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드들을 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하고, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BB를 포함하고, 및 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 면역 살상 세포를 체외에서 또는 체내에서 협동적인 활성을 가지고 자극한다. 한 실시 예에서, IL-15 및 IL-15RA는 융합 단백질로서, 예를 들어, 세포 표면에 존재한다.
IL-15 독성 (IL-15 Toxicity)
어떤 관점에서, 본 공개는 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 세포는 면역 살상 세포를 자극할 수 있는 능력이 있고, 및 여기서 세포는 개체에게 투여했을 때 분리된 IL-15 폴리펩티드에 비교하여, 좀 더 높은 치료 지수 (therapeutic index) (TI)를 가진다. 어떤 실시 예에서, 세포는 개체에게 투여했을 때 분리된 IL-15 폴리펩티드에 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 더 높은 치료 지수 (therapeutic index) 를 가진다. 어떤 실시 예에서, 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 IL-15 폴리펩티드에 비교하여 적어도 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 더 높은 치료 지수를 가진다.
어떤 관점에서, 본 공개는 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 IL-15 폴리펩티드에 비교하여 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 분리된 폴리펩티드는, 예를 들어, IL-12 폴리펩티드, IL-15 폴리펩티드, 또는 4-1BB 작동제 항체는, 재조합된 폴리펩티드를 의미한다. 어떤 실시 예에서, 분리된 폴리펩티드는, 예를 들어, IL-12 폴리펩티드, IL-15 폴리펩티드, 또는 4-1BB 작동제 폴리펩티드는 (4-1BB 작동제 항체와 같은), 세포 내, 세포막 내에, 세포 표면에 포함되지 않고, 및/또는 세포에 접합 되지 않은 폴리펩티드를 의미한다.
어떤 실시 예에서, 세포는 동량에 해당하는 분리된 IL-15 폴리펩티드에 비교하여 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드의 동량에 해당하는 양은 세포 내에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드와 정량적으로 및 기능적으로 동등한 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드의 동량에 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포에 포함된 IL-15 폴리펩티드의 양과 정량적으로 같은 양 (예를 들어, 카피 수 또는 몰 수) 이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드의 동량에 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포 내에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드의 양과 같은 생물학적 활성을 가진 분리된 IL-15 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드의 동량에 해당하는 양은 IL-15 폴리펩티드를 포함하고 있는 제작된 적혈구 세포와 같은 생물학적 활성을 가지는 분리된 IL-15 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드의 동량에 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포 내에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드의 양과 같은 치료적 효능을 가진 분리된 IL-15 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드의 동량에 해당하는 양은 IL-15 폴리펩티드를 포함하고 있는 제작된 적혈구 세포와 같은 치료적 효능을 가지는 분리된 IL-15 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 복합체로 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 융합 폴리펩티드이다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 은 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편에 링커로 연결되어 (linked) 있다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번호 11) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커는 (GGGGS)3 (서열번호 12) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인 (IL-15 receptor alpha sushi-binding domain) 을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 복합체로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 융합 폴리펩티드로 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은 링커에 의해 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 연결된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번호 11) 를 포함하고, 선택적으로 여기서 링커는 (GGGGS)3 링커 (서열번호 12) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 2 와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 독성은 간 독성을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 독성은 혈액 독성을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성은 증가 된 IFNg 혈청 수준, 증가 된 ALT 혈청 수준, 간에 침투하는 대식세포 (macrophages)의 증가 된 수준, 간에 침투하는 CD8+ T 세포 또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T-세포의 증가 된 수준, 증가 된 간 무게, 증가 된 간 염증 수치 (score), 감소 된 호중구 수 (neutrophil count), 감소 된 림프구 수 (lymphocyte count), 감소 된 단핵구 수 (monocyte count), 및 감소 된 헤모글로빈 수준 (hemoglobin level) 으로 구성된 군으로부터 선택된 간 독성 지표 (indicator of liver toxicity) 에 의해 측정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 인터페론 감마 (interferon gamma) (IFNg)의 증가 된 혈청 수준을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 증가 된 알라닌 트란스아미나제 (alanine transaminase) (ALT)의 혈청 수준을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 간 또는 비장에 침투하는 대식세포 (macrophages)의 증가 된 수준이 포함된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 간에 침투하는 CD8+ T 세포 또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T-세포의 증가 된 수준이 포함된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 증가 된 간 염증 수치가 포함된다. 숫자적인 수치가 조직학적 특성의 반-정량적인 평가를 제공하는데 사용될 수 있다. 조직학적 연구는 등급화 (grading) 및 단계 (staging) 를 정의하는데 도움이 되어 조직학적 활성을 숫자적인 지표로 생산할 수 있게 한다. 등급화 (grading) 는 변성 염증 활성 (necroinflammatory activity) 의 강도를 서술하는데 사용된다. 단계 (staging)는 섬유화 (fibrosis) 및 구조적인 변화 (architectural alteration), 즉, 질환의 구조적인 진행, 의 측정치이다.
어떤 실시 예에서, 간 염증 수치는 이삭 수치 (Ishak score) 이다. 이삭 수치는 조직학적 등급화 및 단계화를 변성 염증의 특성 (necroinflammatory features)의 심각성 정도에 따라 ((문맥주위 또는 격벽주위 접점 간염 (periportal or periseptal interface hepatitis), 융합성 괴사 (confluent necrosis), 초점용액 괴사 (focal (spotty) lytic necrosis), 사멸 및 초점 염증 (apoptosis and focal inflammation), 및 문맥 염증 (portal inflammation)) 0-6 (7단계) 스케일로 수치화하기 위하여 사용된다. 더 높은 이삭 수치는 더 나쁘거나 또는 좀 더 심각한 질병 진행 또는 결과를 암시하며, 및 간 독성을 정의하는 측정치로서 사용될 수 있다 (예를 들어, Ishak K et al., 1995; Goodman ZD et al., 2007 J Hepatol.;47(4):598-607 참조, 그 전문이 여기에 참고 문헌으로 병합되어 있다). 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는, 이삭 수치로 정의한 대로, 증가 된 간 염증이다.
어떤 실시 예에서, 간 독성은 간 독성을 위한 생쥐 모델 (mouse model)을 사용하여 평가된다. 어떤 실시 예에서, 독성 생쥐 모델은 여기 서술된 제작된 적혈구 세포 어느 것의 잠재적인 독성을 평가하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, Niu et al J Immunology 2007 178:4194-4213, 참조, 그 전문이 여기에 참고 문헌으로 병합되어 있다). 간략하게, 간 독성은 면역학적인 이상 (immunological anomalies) 의 전개로 측정될 수 있으며, 이에는, 이것에만 국한하지 않으나, 알라닌 트란스아미나제 (alanine transaminase) (ALT) 간 효소의 증가 된 수준, 대식세포의 간 침투, CD8+ T 세포의 간 침투, 림프구감소 (lymphopenia), 혈소판감소 (thrombocytopenia), 빈혈 (anemia), 헤모글로빈의 더 낮은 수준 (lowered levels of hemoglobin), 비장 비대 (splenomegaly), 림프절장애 (lymphadenopathy), 간비대 (hepatomegaly), 다 초점 간염 (multifocal hepatitis), 빈혈 (anemia), B 세포 및 CD8+ T 세포의 변화된 이동 (altered trafficking of B cells and CD8+ T cells), NK 세포 손실 (loss of NK cells), 및 조혈 줄기세포 (hemopoietic stem cells) 표현형을 지닌 골수 세포 (bone marrow (BM) cells) 의 10-배 증가가 포함될 수 있다. 따라서, 어떤 실시 예에서, 생쥐 모델은 제작된 적혈구 세포를 투여하기 전 및 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 투여 후 한 시간 점 (들)에서 하나 또는 그 이상의 다음을 생쥐에서 측정하여 간 독성을 평가하는데 사용된다: 증가 된 ALT 효소 수준, 대식 세포의 간 침투, CD8+ T 세포의 간 침투, 림프구감소 (lymphopenia), 혈소판감소 (thrombocytopenia), 빈혈 (anemia), 헤모글로빈의 더 낮은 수준 (lowered levels of hemoglobin), 비장 비대 (splenomegaly), 림프절장애 (lymphadenopathy), 간비대 (hepatomegaly), 다 초점 간염 (multifocal hepatitis), 빈혈 (anemia), B 세포 및 CD8+ T 세포의 변화된 이동 (altered trafficking of B cells and CD8+ T cells), NK 세포 손실 (loss of NK cells), 및 조혈 줄기세포 (hemopoietic stem cells) 표현형을 지닌 골수 세포 (bone marrow (BM) cells) 의 10-배 증가.
어떤 실시 예에서, 혈액 독성은 감소 된 호중구 수 (neutrophil count), 감소 된 림프구 수 (lymphocyte count), 감소 된 단핵구 수 (monocyte count), 및 감소 된 헤모글로빈 수준으로 구성된 군으로부터 선택된 혈액 독성의 지표로 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 전 혈액 (whole blood) 샘플에서 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈청 (serum) 샘플에서 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈장 (plasma) 샘플에서 측정된다.
어떤 실시 예에서, 독성은 감소 된 몸무게로 측정된다.
어떤 실시 예에서, 세포를 투여 후에 개체에서 측정된 독성 지표의 수준은 투여 전의 독성 지표의 수준과 비교된다. 어떤 실시 예에서, 세포를 투여 후에 개체에서 측정된 독성 지표의 수준은 독성 지표의 한계치 또는 대조군 수준과 비교된다.
인간에서 전형적인 간 기능의 정상 혈액 검사 결과는 알라닌 트란스아미나제 (alanine transaminase) (ALT) 수준이 혈청 1리터당 약 7에서 55 유닛이 포함된다 (예를 들어, www.mayoclinic.org/tests-procedures/liver-function-tests/약/pac-20394595 참조). 간이 손상되었을 때, 예를 들어, 독성 때문에, ALT가 혈류 (bloodstream) 내로 방출되어 이의 수준이 향상한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 증가 된 알라닌 트란스아미나제 (alanine transaminase) (ALT)의 혈청 수준이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 55 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 60 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 70 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 70 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 80 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 90 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 100 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 200 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 300 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 400 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 500 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 600 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 700 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 800 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 900 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALT의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 1000 유닛보다 더 크다.
인간에서 전형적인 간 기능의 정상 혈액 검사 결과는 아스파르테이트 트란스아미나제 (aspartate transaminase (AST) 수준이 혈청 1리터당 약 8에서 48 유닛이 포함된다 (예를 들어, www.mayoclinic.org/tests-procedures/liver-function-tests/약/pac-20394595 참조). ALT와 비슷하게, AST는 정상적으로 혈액에 낮은 수준으로 존재하며, 및 AST 수준의 증가는 간 손상을 제시한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 48 유닛보다 더 큰 것이다, 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 50 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 50 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 60 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 70 유닛보다 더 큰 것이다. 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 80 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 90 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 100 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 150 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 200 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 300 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 400 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 500 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 600 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 700 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 800 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 900 유닛보다 더 큰 것이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 AST의 혈청 수준이 인간 개체에서 혈액 1리터당 약 1000 유닛보다 더 큰 것이다.
인간에서 전형적인 간 기능의 정상 혈액 검사 결과는 알카라인 포스파타아제 (alkaline phosphates) (ALP) 수준이 혈청 1리터당 약 45 에서 115 이 포함 된다 (예를 들어, WWW.Mayo.orgy/tests-procedures/liver-function-tests/약/pac-20394595 참조). 정상보다 높은 수준 (Higher-than-normal levels)의 ALP는 간 손상 또는 질환을 제시한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 알카라인 포스파타아제 (ALP)의 증가된 혈청 수준이다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 ALP의 혈청 수준이 혈청 리터당의 약 115 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 인간 개체에서 혈액 1리터당 ALP의 혈청 수준이 약 115 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 인간 개체에서 혈액 1리터당 ALP의 혈청 수준이 120 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 인간 개체에서 혈액 1리터당 ALP의 혈청 수준이 150 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 인간 개체에서 혈액 1리터당 ALP의 혈청 수준이 170 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 인간 개체에서 혈액 1리터당 ALP의 혈청 수준이 200 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 인간 개체에서 혈액 1리터당 ALP의 혈청 수준이 300 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 인간 개체에서 혈액 1리터당 ALP의 혈청 수준이 400 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 인간 개체에서 혈액 1리터당 ALP의 혈청 수준이 500 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 인간 개체에서 혈액 1리터당 ALP의 혈청 수준이 600 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 인간 개체에서 혈액 1리터당 ALP의 혈청 수준이 700 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 인간 개체에서 혈액 1리터당 ALP의 혈청 수준이 800 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 인간 개체에서 혈액 1리터당 ALP의 혈청 수준이 900 유닛보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 간 독성의 지표는 인간 개체에서 혈액 1리터당 ALP의 혈청 수준이 1000 유닛보다 더 크다.
인간 성인에서 정상 혈액 검사의 결과는 혈액 1 μL 에 림프구 800 에서 4,800 사이를 포함한다 (예를 들어, www.medicalnewstoday.com/articles/320987.php 참조). 림프구감소 (Lymphocytopenia) 는 혈액 내에 림프구 수(lymphocyte count)가 비정상적으로 감소하는 컨디션이다. 림프구감소는 자주 세포독성 제제의 투여의 결과로부터 얻어진다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 약 800 림프구보다 적은 감소 된 림프구 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 약 700 림프구보다 적은 감소 된 림프구 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 약 600 림프구보다 적은 감소 된 림프구 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 약 500 림프구보다 적은 감소 된 림프구 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 약 400 림프구보다 적은 감소 된 림프구 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 약 300 림프구보다 적은 감소 된 림프구 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 약 200 림프구보다 적은 감소 된 림프구 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 약 100 림프구보다 적은 감소 된 림프구 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 약 50 림프구보다 적은 감소 된 림프구 수이다.
인간 성인에서 정상 혈액 검사 결과는 1 μL의 혈액에 3.9백만에서 5.65백만 세포를 포함한다 (예를 들어, www.mayoclinic.org/tests-procedures/complete-blood-count/약/pac-20384919 참조). 붉은 혈액 세포 수 (red blood cell count) 의 감소는 붉은 혈액 세포가 어떤 특정 화학약품 또는 독성물질 (toxins) 에 의해 과도하게 손상될 때 일어날 수 있다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 감소 된 붉은 혈액 세포 수 (red blood cell count) 로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터 당 (per microliter) 3.9 X 106의 붉은 혈액 세포 수보다 적은 감소 된 붉은 혈액 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터 당 (per microliter) 3 X 106의 붉은 혈액 세포 수보다 적은 감소 된 붉은 혈액 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터 당 1 X 106의 붉은 혈액 세포 수보다 적은 감소 된 붉은 혈액 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터 당 3 X 105의 붉은 혈액 세포 수보다 적은 감소 된 붉은 혈액 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터 당 1 X 105의 붉은 혈액 세포 수보다 적은 감소 된 붉은 혈액 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터 당 3 X 104의 붉은 혈액 세포 수보다 적은 감소 된 붉은 혈액 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터 당 1 X 104의 붉은 혈액 세포 수보다 적은 감소 된 붉은 혈액 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터 당 3 X 103의 붉은 혈액 세포 수보다 적은 감소 된 붉은 혈액 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터 당 1 X 103의 붉은 혈액 세포 수보다 적은 감소 된 붉은 혈액 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터 당 3 X 102의 붉은 혈액 세포 수보다 적은 감소 된 붉은 혈액 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터 당 1 X 102의 붉은 혈액 세포 수보다 적은 감소 된 붉은 혈액 세포 수이다.
인간 성인에서 정상 혈액 검사 결과는 1μL 의 혈액에 3,400에서 9,600 개 세포를 포함한다 (예를 들어, www.mayoclinic.org/tests-procedures/complete-blood-count/약/pac-20384919 참조). 백혈구 감소증 (Leukopenia) 은 혈액에서 백혈구 세포 수 ((white blood cell (leukocyte) count)) 의 감소이며, 이는 독성에 의해 유도될 수 있다 (예를 들어, Xu et al., 2008, Toxicological Sciences. 103 (2): 278-284, 참조). 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 백혈구 세포 수의 감소에 의해 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 (per microliter of blood) 3,400의 백혈구 수보다 적은 감소 된 백혈구 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 (per microliter of blood) 3,300의 백혈구 수보다 적은 감소 된 백혈구 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 3,200의 백혈구 수보다 적은 감소 된 백혈구 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 3,100의 백혈구 수보다 적은 감소 된 백혈구 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 3,000의 백혈구 수보다 적은 감소 된 백혈구 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 2,500의 백혈구 수보다 적은 감소 된 백혈구 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 2,000의 백혈구 수보다 적은 감소 된 백혈구 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 1,500의 백혈구 수보다 적은 감소 된 백혈구 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 1,000의 백혈구 수보다 적은 감소 된 백혈구 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 500의 백혈구 수보다 적은 감소 된 백혈구 세포 수이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈액 마이크로 리터당 100의 백혈구 수보다 적은 감소 된 백혈구 세포 수이다.
인간 성인에서 정상 혈액 검사 결과는 리터의 혈액 당 116 에서 166그램 사이를 포함한다 (예를 들어, www.mayoclinic.org/tests-procedures/complete-blood-count/약/pac-20384919 참조). 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 감소 된 헤모글로빈 수준으로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 리터의 혈액 당 약 116그램보다 적은 헤모글로빈 수준이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 리터의 혈액 당 약 110그램보다 적은 헤모글로빈 수준이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 리터의 혈액 당 약 100그램보다 적은 헤모글로빈 수준이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 리터의 혈액 당 약 90그램보다 적은 헤모글로빈 수준이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 리터의 혈액 당 약 90그램보다 적은 헤모글로빈 수준이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 리터의 혈액 당 약 80그램보다 적은 헤모글로빈 수준이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 리터의 혈액 당 약 70그램보다 적은 헤모글로빈 수준이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 리터의 혈액 당 약 60그램보다 적은 헤모글로빈 수준이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 리터의 혈액 당 약 50그램보다 적은 헤모글로빈 수준이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 리터의 혈액 당 약 40그램보다 적은 헤모글로빈 수준이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 리터의 혈액 당 약 30그램보다 적은 헤모글로빈 수준이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 리터의 혈액 당 약 20그램보다 적은 헤모글로빈 수준이다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 리터의 혈액 당 약 10그램보다 적은 헤모글로빈 수준이다.
어떤 실시 예에서, 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 IL-15보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는, 적어도 100% 더 적은 독성을 보인다. 떤 실시 예에서, 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 IL-15보다 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 또는 적어도 10-배 더 적은 독성을 보인다.
어떤 실시 예에서, 세포는 개체에서 면역 살상 세포를 자극하는 능력이 있다.
4- 1BBL 독성 (4- 1BBL Toxicity)
어떤 관점에서, 현 공개는 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 이 세포는 면역 살상 세포를 자극할 능력이 있고, 및 여기서 이 세포는 개체에 투여되었을 때 분리된 4-1BBL 작동제 항체 (4-1BBL agonist antibody) 에 비교하여 더 높은 치료 지수 (therapeutic index) (TI)를 가진다. 어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에 투여되었을 때 분리된 4-1BBL 작동제 항체 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 더 높은 치료 지수 (therapeutic index) 를 가진다. 이 세포는 개체에 투여되었을 때 분리된 4-1BBL 작동제 항체에 비교하여 적어도 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 더 높은 치료 지수를 가진다.
어떤 관점에서, 현 공개는 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 이 세포는 면역 살상 세포를 자극할 능력이 있고, 및 여기서 이 세포는 개체에 투여되었을 때 분리된 4-1BB 작동제 항체 (4-1BB agonist antibody) 에 비교하여 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 분리된 폴리펩티드, 예를 들어, IL-12 폴리펩티드, IL-15 폴리펩티드, 또는 4-1BB 작동제 항체, 는 재조합된 폴리펩티드를 의미한다. 어떤 실시 예에서, 분리된 폴리펩티드는, 예를 들어, IL-12 폴리펩티드, IL-15 폴리펩티드, 또는 4-1BB 작동제 폴리펩티드는 (4-1BB 작동제 항체와 같은), 세포 내에, 세포막에, 세포표면 위에 포함되지 않고, 및/또는 세포에 접합 되지 않은 폴리펩티드를 의미한다. 어떤 실시 예에서, 세포는 분리된 4-1BB 작동제 항체의 해당하는 양에 비교하여 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체에 해당하는 양은 세포 내에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양에 해당하는 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체에 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양에 해당하는 분리된 4-1BB 작동자 항체의 양 (예를 들어, 카피 수, 무게 또는 몰 수) 이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체에 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양과 똑같은 작동제 활성을 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체에 해당하는 양은 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하고 있는 제작된 적혈구 세포와 똑같은 작동제 활성 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체에 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양과 같은 생물학적 효과를 가지는 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체에 해당하는 양은 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하고 있는 제작된 적혈구 세포와 같은 생물힉적 효과를 가지는 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체에 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양과 똑같은 치료적 효능 (therapeutic potency) 을 가지는 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체에 해당하는 양은 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하고 있는 제작된 적혈구 세포와 똑같은 치료적 효능을 가지는 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다.
어떤 실시 예에서, 4-1BB 작동제 항체 (4-1BB agonist antibody) 는 항체 3H3, 또는 이의 항원-결합 단편이거나, 또는 항체 우토밀루맵 (utomilumab), 또는 이의 항원-결합 단편이다.
어떤 실시 예에서, 독성은 간 독성을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 독성은 혈액 독성을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성은 증가 된 IFNg 혈청 수준, 증가 된 ALT 혈청 수준, 간에 침투하는 대식세포 (macrophages)의 증가 된 수준, 간에 침투하는 CD8+ T 세포 또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T-세포의 증가 된 수준, 증가 된 간 무게, 증가 된 간 염증 수치 (score), 감소 된 호중구 수 (neutrophil count), 감소 된 림프구 수 (lymphocyte count), 감소 된 단핵구 수 (monocyte count), 및 감소 된 헤모글로빈 수준 (hemoglobin level) 으로 구성된 군으로부터 선택된 간 독성 지표 (indicator of liver toxicity) 에 의해 측정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 인터페론 감마 (interferon gamma) (IFNg)의 증가 된 혈청 수준을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 증가 된 알라닌 트란스아미나제 (alanine transaminase) (ALT)의 혈청 수준을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 간 또는 비장에 침투하는 대식세포 (macrophages)의 증가 된 수준이 포함된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 간에 침투하는 CD8+ T 세포 또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T-세포의 증가 된 수준이 포함된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 증가 된 간 염증 수치 (liver inflammation score)가 포함된다.
어떤 실시 예에서, 간 염증 수치는, 여기서 서술된 대로, 이삭 수치 (Ishak score) 이다.
어떤 실시 예에서, 간 염증 수치는, 여기서 서술된 대로, 간 독성을 위한 생쥐 모델을 사용하여 평가 된다.
어떤 실시 예에서, 혈액 독성은 감소 된 호중구 수 (neutrophil count), 감소 된 림프구 수 (lymphocyte count), 감소 된 단핵구 수 (monocyte count), 및 감소 된 헤모글로빈 수준으로 구성된 군으로부터 선택된 혈액 독성의 지표로 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 전 혈액 (whole blood) 샘플에서 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈청 (serum) 샘플에서 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈장 (plasma) 샘플에서 측정된다.
어떤 실시 예에서, 독성은 감소 된 몸무게로 측정된다.
어떤 실시 예에서, 세포를 투여 후에 개체에서 측정된 독성 지표의 수준은 투여 전의 독성 지표의 수준과 비교된다. 어떤 실시 예에서, 세포를 투여 후에 개체에서 측정된 독성 지표의 수준은 독성 지표의 한계치 또는 대조군 수준과 비교된다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 혈청 ALT 수준으로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 여기서 서술된 대로, 증가 된 혈청 ALT 수준이다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 혈청 AST 수준으로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 증가 된 혈청 AST 수준이다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 혈청 ALP 수준으로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 증가 된 혈청 ALP 수준이다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 림프구 수 (lymphocyte count) 로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는 감소된 림프구 수 (lymphocyte count) 로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 붉은 혈액 세포 수 (red blood cell count)로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 감소 된 붉은 혈액 세포 수로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 백혈구 세포 수 (white blood cell count) 로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 감소 된 백혈구 세포 수 (white blood cell count) 로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 헤모글로빈 수준에 의해 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는 감소 된 헤모글로빈 수준에 의해 동정 된다.
어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 4-1BB 작동제 항체 (4-1BB agonist antibody) 보다, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100% 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 4-1BB 작동제 항체 (4-1BB agonist antibody) 보다, 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 또는 적어도 10-배 더 적은 독성을 보인다.
어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에서 면역 살상 세포를 자극하는 능력이 있다.
IL-15 및 4- 1BBL 독성 (IL-15 and 4- 1BBL Toxicity)
어떤 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 이 세포는 면역 살상 세포를 자극할 능력이 있으며, 및 여기서 이 세포는 개체에 투여했을 때, 분리된 4-1BBL 작동제 항체 (4-1BBL agonist antibody), 분리된 IL-15 폴리펩티드, 또는 이들의 조합과 비교하여 더 높은 치료 지수 (therapeutic index) (TI) 를 가진다. 어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에 투여했을 때, 분리된 4-1BBL 작동제 항체, 분리된 IL-15 폴리펩티드, 또는 이들의 조합과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 더 높은 치료 지수 (therapeutic index) (TI) 를 가진다. 어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에 투여했을 때, 분리된 4-1BBL 작동제 항체, 분리된 IL-15 폴리펩티드, 또는 이들의 조합과 비교하여 적어도 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 더 높은 치료 지수를 가진다.
어떤 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 이 세포는 개체에 투여했을 때, 분리된 4-1BBL 작동제 항체, 분리된 IL-15 폴리펩티드, 또는 이들의 조합과 비교하여 더 적은 독성을 보인다.
어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에 투여했을 때, 동량에 해당하는 분리된 4-1BB 작동제 폴리펩티드 (4-1BB agonist polypeptide), 동량에 해당하는 분리된 IL-15 폴리펩티드, 또는 이들의 조합과 비교하여 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 동량에 해당하는 분리된 4-1BB 작동제 항체는 이 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드에 해당하는 양이다. 어떤 실시 예에서, 동량에 해당하는 분리된 4-1BB 작동제 항체는 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양에 해당하는 (예를 들어, 카피 수, 무게 또는 몰 수에서) 분리된 4-1BBL 작동제 항체의 양이다. 어떤 실시 예에서, 동량에 해당하는 분리된 4-1BB 작동제 항체는 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양과 똑같은 작동제 활성 (agonist activity) 을 가지는 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다. 어떤 실시 예에서, 동량에 해당하는 분리된 4-1BB 작동제 항체는 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양과 똑같은 생물학적 효과 (biological effect) 을 가지는 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다. 어떤 실시 예에서, 동량에 해당하는 분리된 4-1BB 작동제 항체는 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양과 똑같은 치료적 효능 (therapeutic potency) 을 가지는 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다. 어떤 실시 예에서, 4-1BB 작동제 항체 (4-1BB agonist antibody) 는 항체 3H3, 또는 이의 항원-결합 단편이거나, 또는 항체 우토밀루맵 (utomilumab), 또는 이의 항원-결합 단편이다. 어떤 실시 예에서, 동량에 해당하는 분리된 IL-15 폴리펩티드는 세포에 포함되어 있는 정량적으로 및 기능적으로 동등한 IL-15 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, 동량에 해당하는 분리된 IL-15 폴리펩티드는 제작된 적혈구 세포에 포함된 IL-15 폴리펩티드의 양과 정량적으로 같은 양 (예를 들어, 카피 수 또는 몰 수에서) 이다. 어떤 실시 예에서, 동량에 해당하는 분리된 IL-15 폴리펩티드는 제작된 적혈구 세포에 포함된 IL-15 폴리펩티드의 양과 똑같은 생물학적 활성을 가진 IL-15 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, 동량에 해당하는 분리된 IL-15 폴리펩티드는 제작된 적혈구 세포에 포함된 IL-15 폴리펩티드의 양과 똑같은 치료적 효능을 가진 IL-15 폴리펩티드의 양이다.
어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 복합체로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 융합 폴리펩티드이다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 은 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편에 링커로 연결되어 (linked) 있다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번호 11) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커는 (GGGGS)3 (서열번호 12) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인 (IL-15 receptor alpha sushi-binding domain) 을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 복합체로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 융합 폴리펩티드로 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은 링커에 의해 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 연결된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번호 11) 를 포함하고, 선택적으로 여기서 링커는 (GGGGS)3 링커 (서열번호 12) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 2 과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 독성은 간 독성을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 독성은 혈액 독성을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성은 증가 된 IFNg 혈청 수준, 증가 된 ALT 혈청 수준, 간에 침투하는 대식세포 (macrophages)의 증가 된 수준, 간에 침투하는 CD8+ T 세포 또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T-세포의 증가 된 수준, 증가 된 간 무게, 증가 된 간 염증 수치 (score), 감소 된 호중구 수 (neutrophil count), 감소 된 림프구 수 (lymphocyte count), 감소 된 단핵구 수 (monocyte count), 및 감소 된 헤모글로빈 수준 (hemoglobin level) 으로 구성된 군으로부터 선택된 간 독성 지표 (indicator of liver toxicity) 에 의해 측정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 인터페론 감마 (interferon gamma) (IFNg)의 증가 된 혈청 수준을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 증가 된 알라닌 트란스아미나제 (alanine transaminase) (ALT)의 혈청 수준을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 간 또는 비장에 침투하는 대식세포 (macrophages)의 증가 된 수준이 포함된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 간에 침투하는 CD8+ T 세포 또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T-세포의 증가 된 수준이 포함된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 증가 된 간 염증 수치가 포함된다.
어떤 실시 예에서, 간 염증 수치는, 여기서 서술된 대로, 이삭 수치 (Ishak score) 이다.
어떤 실시 예에서, 간 독성은, 여기서 서술된 대로, 간 독성을 위한 생쥐 모델 (mouse model)을 사용하여 평가된다.
어떤 실시 예에서, 혈액 독성은 감소 된 호중구 수 (neutrophil count), 감소 된 림프구 수 (lymphocyte count), 감소 된 단핵구 수 (monocyte count), 및 감소 된 헤모글로빈 수준으로 구성된 군으로부터 선택된 혈액 독성의 지표로 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 전 혈액 (whole blood) 샘플에서 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈청 (serum) 샘플에서 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈장 (plasma) 샘플에서 측정된다.
어떤 실시 예에서, 독성은 감소 된 몸무게로 측정된다.
어떤 실시 예에서, 세포를 투여 후에 개체에서 측정된 독성 지표의 수준은 투여 전의 독성 지표의 수준과 비교된다. 어떤 실시 예에서, 세포를 투여 후에 개체에서 측정된 독성 지표의 수준은 독성 지표의 한계치 또는 대조군 수준과 비교된다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 혈청 ALT 수준으로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 여기서 서술된 대로, 증가 된 혈청 ALT 수준이다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 혈청 AST 수준으로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 증가 된 혈청 AST 수준이다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 혈청 ALP 수준으로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 증가 된 혈청 ALP 수준이다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 림프구 수 (lymphocyte count) 로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는 감소된 림프구 수 (lymphocyte count) 로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 붉은 혈액 세포 수 (red blood cell count)로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 감소 된 붉은 혈액 세포 수로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 백혈구 세포 수 (white blood cell count) 로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 감소 된 백혈구 세포 수 (white blood cell count) 로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 헤모글로빈 수준에 의해 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는 감소 된 헤모글로빈 수준에 의해 동정 된다.
어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 4-1BBL 폴리펩티드 및 분리된 IL-15 폴리펩티드보다, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는, 적어도 100% 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 4-1BBL 폴리펩티드 및 분리된 IL-15 폴리펩티드보다 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 또는 적어도 10-배 더 적은 독성을 보인다.
어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에서 면역 살상 세포를 자극하는 능력이 있다.
어떤 특정 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 더 나아가 IL-1, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, 인터페론 알파 (interferon alpha) (IFNα), 폴리오바이러스 수용체 (Poliovirus Receptor) (PVR/CD155), CD48, 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigen) (HLA)-A, HLA-C, HLA-G, 헤파란 설페이트 (heparan sulfate) (HS), HLA-E, CpG, 면역글로블린 G (mmunoglobulin G (IgG), UL16 결합 단백질 (UL16 binding proteins) (ULBP), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 (MHC class I chain-related proteins) (MIC), B7-H6, NkP44L, 넥틴2 (Nectin2), NK-T-B 항원 (NTBA), 활성-유도된 C-유형 렉틴 (activation-induced C-type lectin) (AICL) 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1) 로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다.
어떤 특정 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 항체의 Fc 단편, 을 포함하지 않는다.
핵산 서열 (Nucleic acid sequences)
어떤 특정 실시 예에서, 본 발명은 여기서 서술된 대로 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 포함하는 제작된 적혈구 세포 (예를 들어, 제작된 적혈구 전구 세포) 를 제공한다. 어떤 특정 실시 예에서, 본 발명은 여기서 서술된 대로 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 사용하여 제조된 제작된 적혈구 세포를 제공한다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 IL-15 폴리펩티드를, 예를 들어, 성숙 된 인간 IL-15를, 포함하고 있는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 13 또는 서열번호 14의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드를 포함하고 있는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드를 포함하고 있는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 13 또는 서열번호 14의 핵산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-15RA 폴리펩티드 (예를 들어, 성숙 된 세포 외 인간 IL-15RA) 를 포함하고 있는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서 IL-15RA 폴리펩티드를 포함하고 있는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 15 또는 서열번호 16의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15Ra 폴리펩티드를 포함하고 있는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 15의 핵산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15RA 폴리펩티드를 포함하고 있는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 16의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15RA 폴리펩티드를 포함하고 있는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 15 또는 서열번호 16의 핵산 서열로 구성된다.
특별한 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 19 또는 서열번호 20의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 19의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 20의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 링커 (linker), 예를 들어, (G4S)3 링커 (서열번호 12), 를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 17 또는 서열번호 18의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 17의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 18의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-15 V3 구조체 (IL-15 V3 construct)를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 V3 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 28의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 V3 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 28의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 V3 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 28의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 V3 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 28의 핵산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-15/IL-15Ra V4 구조체 (IL-15/IL-15Ra V4 construct)를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15/IL-15Ra V4 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 30의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15/IL-15Ra V4 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 30의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15/IL-15Ra V4 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 30의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15/IL-15Ra V4 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 30의 핵산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-15/IL-15Ra V5 구조체 (IL-15/IL-15Ra V5 construct)를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15/IL-15Ra V5 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 32의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15/IL-15Ra V5 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 32의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15/IL-15Ra V5 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 32의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15/IL-15Ra V5 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 32의 핵산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-15 V3.1 구조체 (IL-15 V3.1 construct) 를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 V3.1 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 36의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 V3.1 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 36의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 V3.1 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 36의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 V3.1 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 36의 핵산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-15/IL-15Ra V4.1 구조체 (IL-15/IL-15Ra V4.1 construct)를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15/IL-15Ra V4.1 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 38의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15/IL-15Ra V4.1 구조체를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 38의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15/IL-15Ra V4.1 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 38의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15/IL-15Ra V4.1 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 38의 핵산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는, 4-1BBL 폴리펩티드를, 예를 들어, 인간 4-1BBL 폴리펩티드를, 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 42의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 4-1BBL 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 42의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 42의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 42의 핵산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 44의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 44의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 44의 핵산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 44의 핵산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드 또는 이의 구성 성분을 암호화하는 핵산 서열은 코돈 최적화된다 (codon optimized) (예를 들어, 인간 세포에서 발현을 위해 돈 최적화된다). 예를 들어, 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, IL-15RA 폴리펩티드, 4-1BBL 폴리펩티드, 및/또는 링커 (linker) 를 암호화하는 핵산 서열은 코돈 최적화된다. 다른 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드 또는 이의 한 구성 성분을 암호화하는 핵산 서열은 코돈 최적화되지 않는다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, IL-15RA 폴리펩티드, 4-1BBL 폴리펩티드, 및/또는 링커 (linker)를 암호화하는 핵산 서열은 코돈 최적화되지 않는다.
IL-12를 포함하는 제작된 적혈구 세포 (제작된 적혈구 세포s comprising IL-12)
본 공개는, 다른 관점에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-12 폴리펩티드, 또는 이의 단편 (예를 들어, IL-12 수용체 결합 단편) 이다. 어떤 실시 예에서, IL-12 폴리펩티드는 p40 (IL-12 p40) 폴리펩티드, 또는 이의 단편이다. 어떤 실시 예에서, IL-12 폴리펩티드는 p35 (IL-12 p35) 폴리펩티드, 또는 이의 단편이다. 어떤 실시 예에서, IL-12 폴리펩티드는 p40-p35 융합 폴리펩티드 (IL-12 p40-p35) 폴리펩티드, 또는 이의 단편이다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포이다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포이다.
여기 전체를 통해 사용된 대로, 한 실시 예에서, IL-12 단편 또는 IL-12 폴리펩티드 단편은 IL-12 수용체에 결합하는 IL-12 단편, 즉, IL-12의 IL-12 수용체-결합 단편을 의미한다. 여기 전체를 통해 사용된 대로, 한 실시 예에서, IL-12 단편 또는 IL-12 폴리펩티드 단편은 IL-12의 생물학적 활성을 유지하고 있는 IL-12 단편을 의미한다.
어떤 특정 실시 예에서, 본 발명은 IL-12 p40 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공한다:
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS (서열번호 45).
어떤 실시 예에서, IL-12 폴리펩티드는 서열번호 45의 아미노산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 IL-12 p40 변이체를 포함한다. 특별한 실시 예에서, IL-12 p40 폴리펩티드는 서열번호 45의 아미노산 서열로 구성된다.
본 공개는, 다른 관점에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-12 p35 (IL-12 p35) 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포이다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포이다.
어떤 특정 실시 예에서, 본 발명은 IL-12 p35 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 포함한다:
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS (서열번호 47).
어떤 실시 예에서, IL-12 폴리펩티드는 서열번호 47의 아미노산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가진 IL-12 p35 변이체를 포함한다. 특별한 실시 예에서, IL-12 p40 폴리펩티드는 서열번호 47의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 본 공개는, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-12 p40 (IL-12 p40) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 인터루킨-12 p35 (IL-12 p35) 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포이다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포이다.
어떤 실시 예에서, IL-12 p40 폴리펩티드 및 IL-12 p35 폴리펩티드는 복합체로서 존재한다. 다른 실시 예에서, IL-12 p40 폴리펩티드 및 IL-12 p35 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드로 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-12 p40 폴리펩티드는 IL-12 p35 폴리펩티드에 링커로 연결된다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 성숙된 인간 IL-12p40 폴리펩티드, 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 IL-12p35 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 성숙된 인간 IL-12p40 폴리펩티드 및 IL-12p35 폴리펩티드는 링커에 의해 (예를 들어, 유연한 링커에 의해) 연결된다. 여기서 서술된 어느 링커도 사용될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 링커는 아미노산 서열 (GGGGS)n (서열번호 75) 을 포함하고, 여기서 n 은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 어떤 실시 예에서, 링커는 아미노산 서열 (GGGGS)n (서열번호 75) 로 구성되고, 여기서 n 은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 어떤 실시 예에서, 링커는 표 3에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시 예에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 12) 의 아미노산 서열을 포함한다. 더 나아간 특별한 실시 예에서, 링커는 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 유연한 링커 (서열 번호 12) 에 의해 연결된 성숙된 인간 IL-12p40 (서열 번호 45) 및 IL-12p35 (서열번호 47)를 포함한다.
이 분야 기술 전문가에게 알려진, 다른 적절한 링커는 L-12 p40 및 IL-12 p35 폴리펩티드를 연결하기 위하여 사용될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 본 발명에서 유용한 링커는 5 에서 25 사이 아미노산 길이, 5-20 아미노산 길이, 10-25 아미노산 길이, 또는 10-20 아미노산 길이이다. 어떤 실시 예에서, 본 발명에서 유용한 링커는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 아미노산 길이이다. 바람직한 실시 예에서, 링커는 비-면역성이다.
어떤 특정 실시 예에서, 본 발명은 링커 또는 이의 단편에 의해 IL-12 p35 폴리펩티드에 연결된 IL-12 p40 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공한다:
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS (서열번호 57).
어떤 실시 예에서, IL-12 폴리펩티드는 서열번호 57의 아미노산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 IL-12 p40/IL-12 p35 융합의 변이체를 포함한다. 특정 실시 예에서, IL-12 p40 폴리펩티드는 서열번호 57의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, IL-12 p40/IL-12 p35 융합 폴리펩티드의 단편은 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500 또는 510 아미노산을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-12 p40/IL-12 p35 융합 폴리펩티드의 단편은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500 또는 510 아미노산보다 적은 아미노산을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-12 p40/IL-12 p35 융합 폴리펩티드의 단편 또는 변이체는, 이 분야 기술에서 잘 알려진 에세이로, 예를 들어, ELISA, 비아코아 (Biacore), 또는 동시-면역침강법 (co-immunoprecipitation) 으로 측정했을 때, 야생형 인간 IL-12가 IL-12 수용체에 결합하는 기능을 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 유지 한다. 어떤 실시 예에서, IL-12 p40/IL-12 p35 융합 폴리펩티드의 단편 또는 변이체는, 이 분야 기술에서 잘 알려진 에세이로, 예를 들어, 전기이동 변화 에세이 (electromobility shift assays), ELISAs 및 다른 면역 에세이로 (other immunoassays) 측정했을 때, 야생형 인간 IL-12가 IL-12-매개하는 신호 전달을 유도하는 기능을 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 유지한다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12 폴리펩티드 및 신호 펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12 폴리펩티드 및 신호 펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 표 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 신호 펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 G PA 신호 펩티드를 포함하거나 또는 이로 구성된 신호 펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 신호 펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 리더 서열 (leader sequence) 및 인터루킨-12 ((IL-12) 폴리펩티드를 포함한다.
어떤 실시 예에서, IL-12 p40/IL-12 p35 융합 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드는 적혈구 세포막에 부착된다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12 p40/IL-12 p35 융합 폴리펩티드 및 앵커 (anchor) 또는 이 폴리펩티드를 적혈구 세포막에 정박시키는 막 통과 도메인을 포함한다. 어떤 특정 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인은 IL-12 p40/IL-12 p35 융합 폴리펩티드에 이종형(heterologous) 이다. 어떤 특정 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인은 GPA 또는 이의 막 통과 도메인을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 어떤 특정 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인은 SMIM1, 또는 이의 막 통과 부분을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 어떤 특정 실시 예에서, 앵커 또는 막 통과 도메인은 작은 내재 막 단백질 1 (small integral membrane protein 1) (SMIM1), 트란스페린 수용체 (transferrin receptor), Fas 리간드 (FasL), 켈 (Kell), 또는 밴드 3 (Band 3), 또는 이의 막 통과 부분 (예를 들어, 막 통과 도메인) 을 포함하거나 또는 이로 구성된다. IL-12 p40/IL-12 p35 융합 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드는 여기서 서술된 어느 앵커 또는 막 통과 도메인을 포함할 수 있다.
어떤 실시 예에서, IL-12 p40/IL-12 p35 융합 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드는 표 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 앵커 또는 막 통과 도메인을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 45의 아미노산 서열, 링커 (예를 들어, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 유연한 링커), 및 앵커 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 성숙된 인간 IL-12p 40 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 (예를 들어, N-말단으로부터 C-말단으로), 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 앵커 도메인, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 IL-12 p40 폴리펩티드, 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 IL-12 p35 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 (예를 들어, N-말단으로부터 C-말단으로), 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 앵커 도메인, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 링커 (예를 들어, 유연한 링커), 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 IL-12 p40 폴리펩티드, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 링커 (예를 들어, 유연한 링커), 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 IL-12 p35 폴리펩티드를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 앵커 및 IL-12 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 앵커 및 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 IL-12 p40 폴리펩티드, 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 IL-12 p35 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 (예를 들어, N-말단으로부터 C-말단으로) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 앵커, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 IL-12 p40 폴리펩티드, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 링커 (예를 들어, 유연한 링커), 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 IL-12 p35 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 55의 아미노산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, SMIM1 (또는 SMIM1 막 통과 부분) 을 포함하는 앵커에 연결된 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드는 GPA ((또는 GPA 막 통과 부분 (예를 들어, GPA 막 통과 도메인)) 를 포함하는 앵커에 연결된 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드에 비하여 상대적으로 증가 된 세포 표면 발현을 보여준다.
특별한 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 53의 아미노산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 53의 아미노산 서열로 구성된다.
특별한 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 서열번호 55의 아미노산 서열에 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 55의 아미노산 서열로 구성된다.
IL-12 및 4- 1BBL
제작된 적혈구 세포는 여기서 서술된 대로 IL-12 p40/IL-12 p35 융합 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 하나 또는 그 이상의 추가의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제작된 적혈구 세포는 더 나아가 4-1BBL (4-1BB 리간드) 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-12 p40 ((IL-12 p40) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 인터루킨-12 p35 (IL-12 p35) 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 (예를 들어, IL-12 p40-p35 융합 폴리펩티드) 포함하고 및 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL, 또는 이의 자극 단편을 포함한다. 어떤 특정 실시 예에서, 4-1BBL은 이의 자연적인 삼배체 형태 (trimeric form)이다. 더 나아간 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 4-1BBL을 이의 자연적인 삼배체 형태로 발현하며, 여기서 자연적인 삼배체 형태는 제작된 적혈구 세포의 효능 및 활성에 중요하다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인간 4-1BBL, 예를 들어, 인간 4-1BBL의 세포 외 부분을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 4-1BBL 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-12 (IL-12) 폴리펩티드, 예를 들어, 서열 번호 45를 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 IL-12 p40 폴리펩티드 및 서열 번호 47을 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 IL-12 p35 폴리펩티드 (예를 들어, 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 IL-12 p40-p35 융합 폴리펩티드) 를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 (예를 들어, N-말단으로부터 C-말단으로) 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 앵커 (anchor) (예를 들어, SMIM1 앵커), 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 IL-12 p40 폴리펩티드, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 링커 (linker), 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 IL-12 p35 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 인간 세포 외 4-1BBL 폴리펩티드, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 링커 (linker) (예를 들어, 4-1BBL 링커), 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된 GPA 앵커 (anchor) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되고, 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 단일 핵산 분자에 의해 암호화되며, 및 초기에는 단일 융합 폴리펩티드로서 발현되며, 여기서 T2A 스킵 펩티드 (T2A skip peptide) (예를 들어, 서열번호 64) 는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드와 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 사이에 위치한다. 어떤 실시 예에서, 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 단일 핵산 분자에 의해 암호화되며, 및 초기에는 단일 융합 폴리펩티드로서 발현되며, 여기서 T2A 스킵 펩티드 (T2A skip peptide) (예를 들어, 서열번호 64) 는 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드 사이에 위치한다. 2A 스킵 펩티드 (2A skip peptide) 또는 요소 (예를 들어, T2A 서열)의 도입은 번역-후 두 개의 분리된 외부 유래 자극 폴리펩티드로 (4-1BBL 또는 IL-12 폴리펩티드를 포함하는) 쪼개지게 한다 (예를 들어, 그 전문이 참고 문헌으로 병합된, Liu et al. (2017) Sci. Rep. 7(1): 2193, 참조). 어떤 특정 실시 예에 따르면, 번역-후 쪼개진 다음에, 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드는 적혈구 세포 표면에 정박 된다. 다수의 2A 요소 (2A elements) 가 이 분야 기술에서 알려지고 있으며 및 여기서 서술된 대로 사용될 수 있으며, T2A, P2A, E2A, 및 F2A를 포함한다 (예를 들어 Liu et al. 2017 참조).
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 GPA 신호 펩티드 (signal peptide) (서열번호 21), 4-1BBL 폴리펩티드 (서열번호 41), 4-1BBL 링커 (linker) (서열번호 40), GPA 앵커 (anchor) (서열번호 25), T2A 스킵 펩티드 (T2A skip peptide) (서열번호 64), SMIM1 앵커 (서열번호 49), 링커 (서열번호 12), IL12 p40 폴리펩티드 (서열번호 45), 유연한 링커 (flexible linker) (서열번호 12), 및 IL-12 p35 폴리펩티드 (서열번호 47) 를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 폴리펩티드는 서열번호 62를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 폴리펩티드는 서열번호 62로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는, 예를 들어, 5 '으로부터 3'으로, GPA 신호 펩티드 (서열번호 21), 4-1BBL 폴리펩티드 (서열번호 41), 4-1BBL 링커 (서열번호 40), GPA 앵커 (서열번호 25), T2A 스킵 펩티드 (서열번호 64), SMIM1 앵커 (서열번호 49), 링커 (서열번호 12), IL12 p40 폴리펩티드 (서열번호 45), 유연한 링커 (서열번호 12), 및 IL-12 p35 폴리펩티드 (서열번호 47) 를 암호화하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 사용하여 제조된다. 어떤 실시 예에서, 핵산은 서열번호 62를 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 어떤 실시 예에서, 핵산은 서열 번호 63을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
어떤 특정 실시 예에서, IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 4-1BBL를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 조합은 상승 반응 (synergistic response) (예를 들어, 면역 살상 세포 활성 동안에) 을 나타낸다. 예를 들어, IL-12 또는 4-1BBL를 각 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드는, 적혈구 세포 위에서 발현될 때, 각 자극 폴리펩티드 단독으로의 효과에 비교하여, 함께 작용하여 좀 더 탄탄하게 면역 살상 세포 (예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+ T-세포) 를 활성화 시킬 수 있다. 그러한 상승적 활성은 여기서 제공된 실시 예시에서 보여준다. 따라서, 어떤 실시 예에서는, 본 발명은 첫 번째 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하고, 및 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 생체 외 또는 생체 내에서 상승적인 활성으로 면역 살상 세포를 자극한다. 한 실시 예에서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12 p40/IL-12 p35를 융합 단백질로서, 및 예를 들어 세포의 표면에, 포함한다.
다른 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 여기서 서술된 대로 IL-12 p40/IL-12 p35를 융합 단백질을 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 하나 또는 그 이상의 추가의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제작된 적혈구 세포는 더 나아가 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하는 그룹으로부터 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 포함하는, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-12 p40 (IL-12 p40) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 인터루킨-12 p35 (IL-12 p35) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, (예를 들어, IL-12 p40-p35 융합 폴리펩티드) 을 포함하고, 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 의 세포 외 부분, 또는 이의 단편 (예를 들어, IL-15/IL-15RA 융합 폴리펩티드) 을 포함하는, 제작된 적혈구 세포를 제공한다.
어떤 특정 실시 예에서, IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 조합은 상승적 반응 (예를 들어, 면역 살상 세포 활성 동안에) 을 나타낸다. 예를 들어, IL-12 또는 IL-15/IL-15RA를 각 포함하는, 외부 유래 자극 폴리펩티드는, 적혈구 세포 위에서 발현될 때, 각 자극 폴리펩티드 단독으로의 효과에 비교하여, 함께 작용하여 좀 더 탄탄하게 면역 살상 세포 (예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+ T-세포) 를 활성화 시킬 수 있다. 그러한 상승적 활성은 여기서 제공된 실시 예시에서 보여준다. 따라서, 어떤 실시 예에서는, 본 발명은 첫 번째 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 IL-12 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하고, 및 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 생체 외 또는 생체 내에서 상승적인 활성으로 면역 살상 세포를 자극한다. 한 실시 예에서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12 p40/IL-12 p35를 융합 단백질로서, 및 예를 들어 세포의 표면에, 포함한다.
IL-12 독성 (IL-12 Toxicity)
어떤 관점에서, 현 공개는 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 세포는 면역 살상 세포를 자극할 능력이 있으며, 및 여기서 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 IL-12 폴리펩티드에 비교하여 더 높은 치료 지수 (therapeutic index) (TI) 를 가진다. 어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 IL-12 폴리펩티드에 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 더 높은 치료 지수를 가진다. 어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 IL-12 폴리펩티드에 비교하여 적어도 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 더 높은 치료 지수를 가진다.
어떤 관점에서, 본 공개는 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 이 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 IL-12 폴리펩티드에 비교하여 더 적은 독성을 보인다.
어떤 실시 예에서, 분리된 폴리펩티드는, 예를 들어, IL-12 폴리펩티드, IL-15 폴리펩티드, 또는 4-1BB 작동제 항체 (4-1BB agonist antibody) 는, 재조합인 폴리펩티드를 의미한다. 어떤 실시 예에서, 분리된 폴리펩티드는, 예를 들어, IL-12 폴리펩티드, IL-15 폴리펩티드, 또는 4-1BB 작동제 폴리펩티드 (4-1BB 작동제 항체와 같은) 는, 세포 내에, 세포막에, 세포 표면 위에 포함되지 않고 및/또는 세포에 접합 되지 않은 폴리펩티드를 의미한다.
어떤 실시 예에서, 세포는 해당하는 양의 분리된 IL-12 폴리펩티드에 비교하여 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드의 해당하는 양은 정량적으로 또는 기능적으로 세포 내에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드 양과 동등한 양이다. 어떤 실시 예에서, 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드의 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드의 양과 정량적으로 같은 양 (예를 들어, 카피 수 또는 몰 수에서) 이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드의 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드의 양과 똑같은 생물학적 활성을 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드의 해당하는 양은 IL-12 폴리펩티드를 포함하고 있는 제작된 적혈구 세포와 똑같은 생물학적 활성을 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드의 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드의 양과 똑같은 치료 역가 (therapeutic potency) 를 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드의 해당하는 양은 IL-12 폴리펩티드를 포함하고 있는 제작된 적혈구와 똑같은 치료 역가 (therapeutic potency) 를 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드의 양이다.
어떤 실시 예에서, IL-12 폴리펩티드는 p40 폴리펩티드 및 p35 폴리펩티드를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 독성은 간 독성을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 독성은 혈액 독성을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성은 증가 된 IFNg 혈청 수준, 증가 된 ALT 혈청 수준, 간에 침투하는 대식세포 (macrophages)의 증가 된 수준, 간에 침투하는 CD8+ T 세포 또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T-세포의 증가 된 수준, 증가 된 간 무게, 증가 된 간 염증 수치 (score), 감소 된 호중구 수 (neutrophil count), 감소 된 림프구 수 (lymphocyte count), 감소 된 단핵구 수 (monocyte count), 및 감소 된 헤모글로빈 수준 (hemoglobin level) 으로 구성된 군으로부터 선택된 간 독성 지표 (indicator of liver toxicity) 에 의해 측정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 인터페론 감마 (interferon gamma) (IFNg)의 증가 된 혈청 수준을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 증가 된 알라닌 트란스아미나제 (alanine transaminase) (ALT)의 혈청 수준을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 간 또는 비장에 침투하는 대식세포 (macrophages)의 증가 된 수준이 포함된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 간에 침투하는 CD8+ T 세포 또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T-세포의 증가 된 수준이 포함된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 증가 된 간 염증 수치가 포함된다.
어떤 실시 예에서, 간 염증 수치는, 여기서 서술된 대로, 이삭 수치 (Ishak score) 이다.
어떤 실시 예에서, 간 독성은, 여기서 서술된 대로, 간 독성을 위한 생쥐 모델 (mouse model)을 사용하여 평가된다.
어떤 실시 예에서, 혈액 독성은 감소 된 호중구 수 (neutrophil count), 감소 된 림프구 수 (lymphocyte count), 감소 된 단핵구 수 (monocyte count), 및 감소 된 헤모글로빈 수준으로 구성된 군으로부터 선택된 혈액 독성의 지표로 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 전 혈액 (whole blood) 샘플에서 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈청 (serum) 샘플에서 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈장 (plasma) 샘플에서 측정된다.
어떤 실시 예에서, 독성은 감소 된 몸무게로 측정된다.
어떤 실시 예에서, 세포를 투여 후에 개체에서 측정된 독성 지표의 수준은 투여 전의 독성 지표의 수준과 비교된다. 어떤 실시 예에서, 세포를 투여 후에 개체에서 측정된 독성 지표의 수준은 독성 지표의 한계치 또는 대조군 수준과 비교된다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 혈청 ALT 수준으로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 여기서 서술된 대로, 증가 된 혈청 ALT 수준이다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 혈청 AST 수준으로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 증가 된 혈청 AST 수준이다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 혈청 ALP 수준으로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 증가 된 혈청 ALP 수준이다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 림프구 수 (lymphocyte count) 로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는 감소된 림프구 수 (lymphocyte count) 로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 붉은 혈액 세포 수 (red blood cell count)로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 감소 된 붉은 혈액 세포 수로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 백혈구 세포 수 (white blood cell count) 로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 감소 된 백혈구 세포 수 (white blood cell count) 로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 헤모글로빈 수준에 의해 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는 감소 된 헤모글로빈 수준에 의해 동정 된다.
어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 IL-12 폴리펩티드보다, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100% 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 IL-12 폴리펩티드보다, 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배 또는 적어도 10-배 더 적은 독성을 보인다.
어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에서 면역 살상 세포를 자극하는 능력이 있다.
IL-12 및 4- 1BBL 독성
어떤 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 세포는 면역 살상 세포를 자극할 능력이 있으며, 및 여기서 세포는, 개체에 투여하였을 때, 분리된 4-1BBL 작동제 항체, 분리된 IL-12 폴리펩티드, 또는 이들의 조합에 비교하여 더 높은 치료 지수 (therapeutic index) (TI) 를 가진다. 어떤 실시 예에서, 세포는 개체에 투여하였을 때, 분리된 4-1BBL 작동제 항체, 분리된 IL-12 폴리펩티드, 또는 이들의 조합에 비교하여, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 더 높은 치료 지수를 가진다. 어떤 실시 예에서, 세포는 개체에 투여하였을 때, 분리된 4-1BBL 작동제 항체, 분리된 IL-12 폴리펩티드, 또는 이들의 조합에 비교하여, 적어도 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 또는 10-배 더 높은 치료 지수를 가진다.
어떤 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하고, 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 세포는, 개체에 투여하였을 때, 분리된 4-1BBL 작동제 폴리펩티드, 분리된 IL-12 폴리펩티드, 또는 이들의 조합에 비교하여 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 세포는 개체에 투여하였을 때, 해당하는 양 (동량)의 분리된 4-1BBL 작동제 폴리펩티드, 해당하는 양의 분리된 IL-12 폴리펩티드, 또는 이들의 조합에 비교하여 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BBL 작동제 항체의 해당하는 양은 세포 내에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양에 해당하는 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BBL 작동제 항체의 해당하는 양 (예를 들어, 카피 수, 무게 또는 몰 수에서) 은 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양에 해당하는 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BBL 작동제 항체의 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양과 똑같은 작동제 활성을 가진 분리된 4-1BBL 작동제 항체의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BBL 작동제 항체의 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포 내에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양과 똑같은 생물학적 효과를 가지는 분리된 4-1BBL 작동제 항체의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BBL 작동제 항체의 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포 내에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드와 똑같은 치료 역가 (therapeutic potency) 를 갖는 분리된 4-1BBL 작동제 항체의 양이다.
어떤 실시 예에서, 4-1BBL 작동제 항체는 항체 3H3, 또는 이의 항원-결합 단편이거나, 또는 항체 우토밀루맵 (utomilumab), 또는 이의 항원-결합 단편이다.
어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드에 해당하는 양은 세포 내에 포함되어 있는 정량적으로 또는 기능적으로 해당하는 IL-12 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드에 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드의 양과 정량적으로 같은 양 (예를 들어, 카피 수, 또는 몰 수에서) 이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드에 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포 내에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드와 똑같은 생물학적 활성을 가지는 분리된 IL-12 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드에 해당하는 양은 제작된 적혈구 세포 내에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드와 똑같은 치료 역가 (therapeutic potency) 를 갖는 분리된 IL-12 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, IL-12 폴리펩티드는 p40 폴리펩티드 및 p35 폴리펩티드를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 독성은 간 독성을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 독성은 혈액 독성을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성은 증가 된 IFNg 혈청 수준, 증가 된 ALT 혈청 수준, 간에 침투하는 대식세포 (macrophages)의 증가 된 수준, 간에 침투하는 CD8+ T 세포 또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T-세포의 증가 된 수준, 증가 된 간 무게, 증가 된 간 염증 수치 (score), 감소 된 호중구 수 (neutrophil count), 감소 된 림프구 수 (lymphocyte count), 감소 된 단핵구 수 (monocyte count), 및 감소 된 헤모글로빈 수준 (hemoglobin level) 으로 구성된 군으로부터 선택된 간 독성 지표 (indicator of liver toxicity) 에 의해 측정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 인터페론 감마 (interferon gamma) (IFNg)의 증가 된 혈청 수준을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 증가 된 알라닌 트란스아미나제 (alanine transaminase) (ALT)의 혈청 수준을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 간 또는 비장에 침투하는 대식세포 (macrophages)의 증가 된 수준이 포함된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 간에 침투하는 CD8+ T 세포 또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T-세포의 증가 된 수준이 포함된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 증가 된 간 염증 수치가 포함된다.
어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 4-1BBL 폴리펩티드 및 분리된 IL-12 폴리펩티드보다, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100% 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 4-1BBL 폴리펩티드 및 분리된 IL-12 폴리펩티드보다, 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배 또는 적어도 10-배 더 적은 독성을 보인다.
어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에서 면역 살상 세포를 자극하는 능력이 있다.
IL-12 및 IL-15 독성
어떤 관점에서, 본공개는 어떤 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12 폴리펩티드를 포함하고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 세포는, 면역살상 세포를 자극할 능력이 있으며, 및 세포는 개체에 투여하였을 때, 분리된 IL-12 폴리펩티드, 분리된 IL-15 폴리펩티드, 또는 이들의 조합에 비교하여 더 높은 치료 지수 (therapeutic index) (TI) 를 보인다. 어떤 실시 예에서, 세포는 개체에 투여하였을 때, 분리된 IL-12 폴리펩티드, 분리된 IL-15 폴리펩티드, 또는 이들의 조합에 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 더 높은 치료 지수를 가진다. 어떤 실시 예에서, 세포는 개체에 투여하였을 때, 분리된 IL-12 폴리펩티드, 분리된 IL-15 폴리펩티드, 또는 이들의 조합에 비교하여 적어도 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 또는 10-배 더 높은 치료 지수를 가진다.
어떤 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12 폴리펩티드를 포함하고, 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 세포는, 개체에 투여하였을 때, 분리된 IL-12 폴리펩티드, 분리된 IL-15 폴리펩티드, 또는 이들의 조합에 비교하여 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 세포는, 개체에 투여하였을 때, 해당하는 양의 분리된 IL-12 폴리펩티드, 해당하는 양의 분리된 IL-15 폴리펩티드, 또는 이들의 조합에 비교하여, 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 해당하는 양의 분리된 IL-12 폴리펩티드는 세포 내에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드와 정량적 및 기능적으로 동등한 양에 해당하는 양이다. 어떤 실시 예에서, 해당하는 양의 분리된 IL-12 폴리펩티드는 제작된 적혈구 세포 내에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드의 양과 정량적으로 (예를 들어, 카피 수 또는 몰수에서) 같은 양이다. 어떤 실시 예에서, 해당하는 양의 분리된 IL-12 폴리펩티드는 제작된 적혈구 세포 내에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드의 양과 똑같은 생물학적 활성을 가지는 분리된 IL-12 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, 해당하는 양의 분리된 IL-12 폴리펩티드는 제작된 적혈구 세포 내에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드와 똑같은 치료 역가를 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드의 양이다.
어떤 실시 예에서, IL-12 폴리펩티드는 p40 폴리펩티드 및 p35 폴리펩티드를포함한다.
어떤 실시 예에서, 해당하는 양의 분리된 IL-15 폴리펩티드는 세포 내에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드와 정량적 및 기능적으로 동등한 양에 해당하는 양이다. 어떤 실시 예에서, 해당하는 양의 분리된 IL-15 폴리펩티드는 제작된 적혈구 세포 내에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드의 양과 정량적으로 같은 양 (예를 들어, 카피 수 또는 몰 수에서) 이다. 어떤 실시 예에서, 해당하는 양의 분리된 IL-15 폴리펩티드는 제작된 적혈구 세포 내에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드의 양과 똑같은 생물학적 활성을 가진 분리된 IL-15 폴리펩티드의 양이다. 어떤 실시 예에서, 해당하는 양의 분리된 IL-15 폴리펩티드는 제작된 적혈구 세포 내에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드와 똑같은 치료 역가 (therapeutic potency) 를 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드의 양이다.
어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 복합체로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 융합 폴리펩티드이다, 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은, 링커에 의해 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편에 연결되어 있다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번호 11)를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커는 (GGGGS)3 링커를 (서열번호 12) 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 1 과 적어도 95% 동등한 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인 (IL-15 receptor alpha sushi-binding domain) 을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 복합체로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 융합 폴리펩티드로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인에 링커로 연결된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번호: 11)를 포함하고, 선택적으로, 여기서 링커는 (GGGGS)3 링커 (서열번호: 12)를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 독성은 간 독성을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 독성은 혈액 독성을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성은 증가 된 IFNg 혈청 수준, 증가 된 ALT 혈청 수준, 간에 침투하는 대식세포 (macrophages)의 증가 된 수준, 간에 침투하는 CD8+ T 세포 또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T-세포의 증가 된 수준, 증가 된 간 무게, 증가 된 간 염증 수치 (score), 감소 된 호중구 수 (neutrophil count), 감소 된 림프구 수 (lymphocyte count), 감소 된 단핵구 수 (monocyte count), 및 감소 된 헤모글로빈 수준 (hemoglobin level) 으로 구성된 군으로부터 선택된 간 독성 지표 (indicator of liver toxicity) 에 의해 측정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 인터페론 감마 (interferon gamma) (IFNg)의 증가 된 혈청 수준을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 증가 된 알라닌 트란스아미나제 (alanine transaminase) (ALT)의 혈청 수준을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 간 또는 비장에 침투하는 대식세포 (macrophages)의 증가 된 수준이 포함된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 간에 침투하는 CD8+ T 세포 또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T-세포의 증가 된 수준이 포함된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표에는 증가 된 간 염증 수치가 포함된다.
어떤 실시 예에서, 간 염증 수치는, 여기서 서술된 대로, 이삭 수치 (Ishak score) 이다.
어떤 실시 예에서, 간 독성은, 여기서 서술된 대로, 간 독성을 위한 생쥐 모델 (mouse model)을 사용하여 평가된다.
어떤 실시 예에서, 혈액 독성은 감소 된 호중구 수 (neutrophil count), 감소 된 림프구 수 (lymphocyte count), 감소 된 단핵구 수 (monocyte count), 및 감소 된 헤모글로빈 수준으로 구성된 군으로부터 선택된 혈액 독성의 지표로 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 전 혈액 (whole blood) 샘플에서 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈청 (serum) 샘플에서 측정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성의 지표는 혈장 (plasma) 샘플에서 측정된다.
어떤 실시 예에서, 독성은 감소된 몸무게로 측정된다.
어떤 실시 예에서, 세포를 투여 후에 개체에서 측정된 독성 지표의 수준은 투여 전의 독성 지표의 수준과 비교된다. 어떤 실시 예에서, 세포를 투여 후에 개체에서 측정된 독성 지표의 수준은 독성 지표의 한계치 또는 대조군 수준과 비교된다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 혈청 ALT 수준으로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는 여기서 서술된 대로, 증가 된 혈청 ALT 수준이다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 혈청 AST 수준으로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 증가 된 혈청 AST 수준이다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 혈청 ALP 수준으로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 간 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 증가 된 혈청 ALP 수준이다. 어떤 실시 예에서, 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 림프구 수 (lymphocyte count) 로 결정된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는 감소된 림프구 수 (lymphocyte count) 로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 붉은 혈액 세포 수 (red blood cell count)로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 감소 된 붉은 혈액 세포 수로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 백혈구 세포 수 (white blood cell count) 로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 감소 된 백혈구 세포 수 (white blood cell count) 로 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는, 여기서 서술된 대로, 헤모글로빈 수준에 의해 동정 된다. 어떤 실시 예에서, 혈액 독성 지표는 감소 된 헤모글로빈 수준에 의해 동정 된다.
어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 IL-12 폴리펩티드및 분리된 IL-15 폴리펩티드보다 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 100% 더 적은 독성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 세포는 개체에 투여했을 때 분리된 IL-12 폴리펩티드 및 IL-15 폴리펩티드보다 적어도 1.5-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배 또는 적어도 10-배 더 적은 독성을 보인다.
어떤 실시 예에서, 이 세포는 개체에서 면역 살상 세포를 자극하는 능력이 있다.
IL-12 폴리펩티드를 암호화 하는 핵산 서열 (Nucleic acid sequences encoding IL-12 polypeptides)
어떤 특정 실시 예에서, 본 발명은 여기서 서술된 대로 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 제공한다. 어떤 특정 실시 예에서, 본 발명은, 여기서 서술된 대로, IL-12 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 사용하여 (예를 들어, 적혈구 전구 세포로 도입시켜) 제조된 제작된 적혈구 세포를 제공한다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 IL-12 p40 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-12 p40 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 46의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-12 p40 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 46의 핵산 서열과 적어도 60%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-12 p40 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 46의 핵산 서열로 구성된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-12 p35 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, L-12 p35 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 48의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-12 p35 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 48의 핵산 서열과 적어도 60%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-12 p35 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 48의 핵산 서열로 구성된다.
특정 실시 예에서, IL-12 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 58의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-12 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 58의 핵산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시 예에서, 핵산 서열은 IL-12 V1 구조체 (IL-12 V1 construct) 를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화한다. 특정 실시 예에서, IL-12 V1 구조체 (IL-12 V1 construct) 를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 54의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-12 V1 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 54의 핵산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시 예에서, 핵산 서열은 IL-12 V2 구조체 (IL-12 V2 construct) 를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화한다. 특정 실시 예에서, IL-12 V2 구조체 (IL-12 V2 construct) 를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 56의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-12 V2 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 56의 핵산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
특정 실시 예에서, 핵산 서열은 4-1BBL-T2A-IL-12 구조체 (4-1BBL-T2A-IL-12 construct)를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화한다. 특정 실시 예에서, 4-1BBL-T2A-IL-12 구조체 (4-1BBL-T2A-IL-12 construct)를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 63의 핵산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 4-1BBL-T2A-IL-12 구조체를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 63의 핵산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
엔시비아이 블라스트 (NCBI BLAST), 클러스탈 W (Clustal W), 마프트 (MAFFT), 클러스탈 오메가 (Clustal Omega), 얼라인미 (AlignMe), 프랄린 (Praline), 또는 다른 적절한 방법 또는 알고리즘 (algorithm)과 같은, 여러 가지 방법 및 소프트웨어 프로그램들이 두 개 또는 그 이상의 펩티드 또는 핵산 사이에 호모로지 (homology)를 결정하는데 사용될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 퍼센트 상동성은 다음의 계수들에 근거하여 FastDB에 의해 계산된다: 미스매치 벌칙 1 (mismatch penalty of 1); 갭 벌칙 1 (gap penalty of 1); 갭 크기 벌칙 0.33 (gap size penalty of 0.33); 및 연결 벌칙 30 (joining penalty of 30).
유용한 알고리즘의 예는 PILEUP 이다. PILEUP은 점진적, 쌍으로 정렬을 사용하여 관련되는 서열 그룹으로부터 다수의 서열 정렬 (sequence alignment) 을 만들어낸다. 이는 또한 정렬을 만들기 위해 사용되는 클러스터링 관계 (clustering relationships) 를 보여주는 나무를 프럿 (plot) 할 수 있다. 유용한 PILEUP 계수에는 디폴트 갭 무게 (default gap weight) 3.00, 디폴트 갭 길이 무게 (default gap length weight) 0.10, 및 무게 말단 갭 (weighted end gaps) 이 포함한다.
유용한 알고리즘의 다른 예에는 블라스트 알고리즘 (BLAST algorithm) 이 있다. 블라스트 알고리즘의 유용한 예에는 WU-BLAST-2가 있다. WU-BLAST-2는 몇 가지 탐색 계수를 사용하며, 이의 대부분은 디폴트 값 (default values) 에 맞추어져 있다. 조정 가능한 계수들은 다음의 값으로 맞추어진다: 중첩 범위 (overlap span) =1, 중첩 분획 (overlap fraction)=0.125, 단어 한계치 (word threshold) (T)=ll. HSP S 및 HSP S2 계수는 다이나믹한 값 (dynamic value)이고 및 특정한 서열의 조성 및 관심 있는 서열이 탐색될 특정한 데이터베이스의 조성에 따라 프로그램 그 자체에 의해 확립된다: 그러나, 값은 민감도를 증가시키기 위하여 조정될 수 있다.
추가의 유용한 알고리즘은 갭된 BLAST (gapped BLAST) 이다. 갭된 BLAST는 BLOSUM-62 대체 점수 (substitution scores)를 사용한다: 한계치 T 계수 (threshold T parameter)는 9로 맞추고: 갭이 없는 확장 (ungapped extensions)을 촉발하기 위하여 투-히트 (two-hit) 방법, 갭 길이 k를 10+k의 값으로 충전 (charges gap lengths of k a cost of 10+k): Xu 는 16으로 맞추고, 및 Xg는 데이터베이스 탐색 단계를 위해 40으로 맞추고 및 알고리즘의 산출 단계를 위해 67로 맞춘다. 갭된 정렬 (Gapped alignments) 은 약 22바이트 (bits)에 해당하는 점수에 의해 촉발된다.
추가의 유용한 도구는, 다수의 서열 정렬을 위하여 보통 사용되는 컴프터 프로그램 시리즈인, 클러스탈 (Clustal)이다. 클러스탈의 최근 판에는 클러스탈 W (ClustalW), 클러스탈X (ClustalX) 및 클러스탈 오메가 (Clustal Omega) 가 포함된다. 쌍으로 정렬을 위한 디폴트 계수 및 클러스탈 방법을 사용한 단백질 서열 퍼센트 상동성 계산은 KTUPLE=1, 갭 벌칙 (GAP PENALTY)=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5 이다.
폴리펩티드 및 핵산 (Polypeptides and Nucleic Acids)
한 관점에서, 본 공개는 여기서 서술된 분리된 외부 유래 자극 폴리펩티드를 제공한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 여기서 서술된 외부 유래 자극 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 폴리펩티드는 신호 서열 (signal sequence)을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 폴리펩티드는 신호 서열 (signal sequence)이 결여되어 있다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 재조합 적으로 생산된다. 재조합 단백질을 생산하는 방법들이 이 분야 기술에서 알려져 있고 및 여기서 서술된다.
다른 관점에서, 본 공개는 여기서 서술된 외부 유래 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 ((예를 들어, DNA 또는 RNA (예를 들어, mRNA)) 을 제공한다. 어떤 실시 예에서, 핵산은 바람직한 세포 유형에서 (예를 들어, 박테리아 또는 포유류 세포) 발현을 위해 코돈-최적화된다.
폴리펩티드 카피 수 (Polypeptide Copy Number)
이 분야 기술 전문가는 재조합 DNA 기술의 사용으로, 예를 들어, 숙주 세포 내에서 핵산 분자의 카피 수를 조작하여, 형질도입된 핵산 분자의 발현 조절을 개선할 수 있다는 것을 알 것이다.
여기서 논의된 대로, 한 관점에서, 본 공개는 면역 세포를 자극하도록 제작된 적혈구 세포를 특징으로 하며, 여기서 면역 세포는 면역 살상 세포이고, 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포이다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포이다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 적어도 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, 두 번째 외부 유래 폴리펩티드 및 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 적어도 하나의 외부 유래 폴리펩티드는 카피 수가 104, 105, 또는 106 보다 더 크게 존재한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 그 카피 수가 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수의 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 보다 더 크지않게, 또는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수보다 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000 배 이상 크지 않게 존재한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 그 카피 수가 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 보다 더 크지 않은 카피 수로 존재하거나, 또는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수보다 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배 이상 크지 않게 존재한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 존재비 (abundance ratio)는 무게로 또는 카피 수로 약 1:1, 약 2:1 에서부터 약 1:2로, 약 5:1 에서부터 약 1:5로, 약 10:1 에서부터 약 1:10으로, 약 20:1 에서부터 약 1:20으로, 약 50:1 에서부터 약 1:50으로, 또는 약 100:1 에서부터 약 1:100으로이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 약 50,000 에서 약 600,000 사이 카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다, 예를 들어, 약 50,000, 60,000, 60,000, 80,000, 90,000, 100,000, 110,000, 120,000, 130,000, 140,000, 150,000, 155,000, 160,000, 165,000, 170,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 195,000, 200,000, 205,000, 210,000, 215,000, 220,000, 225,000, 230,000, 235,000, 240,000, 245,000, 250,000, 255,000, 260,000, 265,000, 270,000, 275,000, 280,000, 285,000, 290,000, 295,000, 300,000, 305,000, 310,000, 315,000, 320,000, 325,000, 330,000, 335,000, 340,000, 345,000, 350,000, 355,000, 360,000, 365,000, 370,000, 375,000, 380,000, 385,000, 390,000, 395,000, 400,000, 450,000, 500,000, 550,000, 600,000카피의 첫 번째 폴리펩티드. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 약 50,000-600,000 사이, 약 100,000-600,000 사이, 약 100,000-500,000 사이, 약 100,000-400,000 사이, 약 100,000 - 150,000 사이, 약 150,000-300,000 사이, 또는 150,000-200,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 약 75,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 100,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 125,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 150,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 175,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 200,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 250,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 300,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 400,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 500,000카피의 첫 번째 외부 첫유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 약 50,000 에서부터 약 600,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다, 예를 들어 약 50,000, 60,000, 60,000, 80,000, 90,000, 100,000, 110,000, 120,000, 130,000, 140,000, 150,000, 155,000, 160,000, 165,000, 170,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 195,000, 200,000, 205,000, 210,000, 215,000, 220,000, 225,000, 230,000, 235,000, 240,000, 245,000, 250,000, 255,000, 260,000, 265,000, 270,000, 275,000, 280,000, 285,000, 290,000, 295,000, 300,000, 305,000, 310,000, 315,000, 320,000, 325,000, 330,000, 335,000, 340,000, 345,000, 350,000, 355,000, 360,000, 365,000, 370,000, 375,000, 380,000, 385,000, 390,000, 395,000, 400,000, 450,000, 500,000, 550,000, 600,000카피의 두 번째 폴리펩티드. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 약 50,000-600,000 사이, 약 100,000-600,000 사이, 약 100,000-500,000 사이, 약 100,000-400,000 사이, 약 100,000 - 150,000 사이, 약 150,000-300,000 사이, 또는 150,000-200,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 약 75,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 100,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 125,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 150,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 175,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 200,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 250,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 300,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 400,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 500,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다.
여기서 서술된 대로, 다른 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 특징으로 하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-15 (IL-15) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 인터루킨-15 수용체 알파 (IL-15RA) 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함한다, 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포이다. 다른 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 특징으로 하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 특징으로 하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함한다.
상기 관점들의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 더 나아가 하나 또는 그 이상의 추가의 외부 유래 자극 폴리펩티드 (예를 들어, 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA, 4-1BBL 및 IL-12, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA)를 포함한다.
상기 관점들의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 104, 105, 또는 106 보다 더 큰 카피 수로 존재한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 보다 더 크지 않은 카피수로 존재하거나 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배 보다 더 크지 않은 카피 수로 존재 한다.어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 보다 크지않은 카피 수, 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 보다 1000배 보다 더 크지 않은 카피 수로 존재한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 존재비 (abundance ratio)는 무게로 또는 카피 수로 약 1:1, 약 2:1 에서부터 약 1:2로, 약 5:1 에서부터 약 1:5로, 약 10:1 에서부터 약 1:10으로, 약 20:1 에서부터 약 1:20으로, 약 50:1 에서부터 약 1:50으로, 또는 약 100:1 에서부터 약 1:100으로이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 약 50,000 에서 약 600,000 사이 카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다, 예를 들어, 약 50,000, 60,000, 60,000, 80,000, 90,000, 100,000, 110,000, 120,000, 130,000, 140,000, 150,000, 155,000, 160,000, 165,000, 170,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 195,000, 200,000, 205,000, 210,000, 215,000, 220,000, 225,000, 230,000, 235,000, 240,000, 245,000, 250,000, 255,000, 260,000, 265,000, 270,000, 275,000, 280,000, 285,000, 290,000, 295,000, 300,000, 305,000, 310,000, 315,000, 320,000, 325,000, 330,000, 335,000, 340,000, 345,000, 350,000, 355,000, 360,000, 365,000, 370,000, 375,000, 380,000, 385,000, 390,000, 395,000, 400,000, 450,000, 500,000, 550,000, 600,000카피의 첫 번째 폴리펩티드. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 약 50,000-600,000 사이, 약 100,000-600,000 사이, 약 100,000-500,000 사이, 약 100,000-400,000 사이, 약 150,000-300,000 사이, 약 100,000 - 150,000 사이, 또는 150,000-200,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 약 75,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 100,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 125,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 150,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 175,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 200,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 250,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 300,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 400,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 500,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 약 50,000 에서부터 약 600,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다, 예를 들어 약 50,000, 60,000, 60,000, 80,000, 90,000, 100,000, 110,000, 120,000, 130,000, 140,000, 150,000, 155,000, 160,000, 165,000, 170,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 195,000, 200,000, 205,000, 210,000, 215,000, 220,000, 225,000, 230,000, 235,000, 240,000, 245,000, 250,000, 255,000, 260,000, 265,000, 270,000, 275,000, 280,000, 285,000, 290,000, 295,000, 300,000, 305,000, 310,000, 315,000, 320,000, 325,000, 330,000, 335,000, 340,000, 345,000, 350,000, 355,000, 360,000, 365,000, 370,000, 375,000, 380,000, 385,000, 390,000, 395,000, 400,000, 450,000, 500,000, 550,000, 600,000카피의 두 번째 폴리펩티드. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 약 50,000-600,000 사이, 약 100,000-600,000 사이, 약 100,000-500,000 사이, 약 100,000-400,000 사이, 약 150,000-300,000 사이, 약 100,000 - 150,000 사이, 또는 150,000-200,000 사이 카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 약 75,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 100,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 125,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 150,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 175,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 200,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 250,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 300,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 400,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 500,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다.
여기서 서술된 대로, 다른 관점에서, 본 공개는 적어도 MHC 유형 I 체인-관련 단백질 A (MHC class I chain-related protein A) (MICA), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 B (MHC class I chain-related protein B) (MICB), 및 인슐린-유사 성장인자 1 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리팹티드를 포함하는 제작된 적혈구를 특징으로 한다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 적어도 첫 번째 외부 유래 자극 폴리팹티드 및 두 번째 외부 유래 폴리팹티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 폴리팹티드는 104, 105, 또는 106 보다 더 큰 카피 수로 존재한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리팹티드는 두 번째 외부 유래 자극 폴리팹티드의 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상 더 크지 않게, 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배 이상 더 크지 않은 카피 수로 존재한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리팹티드의 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상 더 크지 않게, 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배 이상 더 크지 않은 카피 수로 존재한다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 존재비 (abundance ratio)는 무게로 또는 카피 수로 약 1:1, 약 2:1 에서부터 약 1:2로, 약 5:1 에서부터 약 1:5로, 약 10:1 에서부터 약 1:10으로, 약 20:1 에서부터 약 1:20으로, 약 50:1 에서부터 약 1:50으로, 또는 약 100:1 에서부터 약 1:100으로이다. 어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 약 50,000 에서 약 600,000 사이 카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다, 예를 들어, 약 50,000, 60,000, 60,000, 80,000, 90,000, 100,000, 110,000, 120,000, 130,000, 140,000, 150,000, 155,000, 160,000, 165,000, 170,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 195,000, 200,000, 205,000, 210,000, 215,000, 220,000, 225,000, 230,000, 235,000, 240,000, 245,000, 250,000, 255,000, 260,000, 265,000, 270,000, 275,000, 280,000, 285,000, 290,000, 295,000, 300,000, 305,000, 310,000, 315,000, 320,000, 325,000, 330,000, 335,000, 340,000, 345,000, 350,000, 355,000, 360,000, 365,000, 370,000, 375,000, 380,000, 385,000, 390,000, 395,000, 400,000, 450,000, 500,000, 550,000, 600,000카피의 첫 번째 폴리펩티드. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 약 50,000-600,000 사이, 약 100,000-600,000 사이, 약 100,000-500,000 사이, 약 100,000-400,000 사이, 약 150,000-300,000 사이, 약 100,000 - 150,000 사이, 또는 150,000-200,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 약 75,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 100,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 125,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 150,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 175,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 200,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 250,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 300,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 400,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 500,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 두 번째 외부 유래 폴리펩티드는 약 50,000 에서부터 약 600,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다, 예를 들어 약 50,000, 60,000, 60,000, 80,000, 90,000, 100,000, 110,000, 120,000, 130,000, 140,000, 150,000, 155,000, 160,000, 165,000, 170,000, 175,000, 180,000, 185,000, 190,000, 195,000, 200,000, 205,000, 210,000, 215,000, 220,000, 225,000, 230,000, 235,000, 240,000, 245,000, 250,000, 255,000, 260,000, 265,000, 270,000, 275,000, 280,000, 285,000, 290,000, 295,000, 300,000, 305,000, 310,000, 315,000, 320,000, 325,000, 330,000, 335,000, 340,000, 345,000, 350,000, 355,000, 360,000, 365,000, 370,000, 375,000, 380,000, 385,000, 390,000, 395,000, 400,000, 450,000, 500,000, 550,000, 600,000카피의 두 번째 폴리펩티드. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 약 50,000-600,000 사이, 약 100,000-600,000 사이, 약 100,000-500,000 사이, 약 100,000-400,000 사이, 약 150,000-300,000 사이, 약 100,000 - 150,000 사이, 또는 150,000-200,000 사이 카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 약 75,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 100,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 125,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 150,000카피의 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 175,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 200,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 250,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 300,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 400,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적어도 500,000카피의 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다.
생체 내 반감기 (In Vivo Half-Life)
어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 외부 유래 폴리펩티드는, 제작된 적혈구 세포 내에 또는 위에 또는 핵 제거된 세포에 포함되고 및 개체에 투여될 때, 그 자체로만(즉 여기서 서술된 세포 내 또는 위가 아닌) 투여된 해당하는 외부 유래 폴리펩티드에 비해 생체 내 반감기 (in viva half-life) 가 길어짐을 보여준다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 폴리펩티드는 그 자체로만 투여된 해당하는 외부 유래 폴리펩티드의 생체 내 반감기보다 더 긴 생체 내 반감기를 갖거나, 또는 그 자체만으로 투여된 해당하는 페길화된 형태 (pegylated version)의 외부 유래 폴리펩티드의 생체 내 반감기보다 길다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 폴리펩티드는 24시간에서 240일 사이의 반감기를 갖는다 (예를 들어, 24시간, 36시간, 48시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일, 39일, 40일, 41일, 42일, 43일, 44일, 45일, 46일, 47일, 48일, 49일, 50일, 51일, 52일, 53일, 54일, 55일, 56일, 57일, 58일, 59일, 60일, 61일, 62일, 63일, 64일, 65일, 66일, 67일, 68일, 69일, 70일, 71일, 72일, 73일, 74일, 75일, 76일, 77일, 78일, 79일, 80일, 81일, 82일, 83일, 84일, 85일, 86일, 87일, 88일, 89일, 90일, 91일, 92일, 93일, 94일, 95일, 96일, 97일, 98일, 99일, 100일, 101일, 102일, 103일, 104일, 105일, 106일, 107일, 108일, 109일, 110일, 111일, 112일, 113일, 114일, 115일, 116일, 117일, 118일, 119일, 120일, 121일, 122일, 123일, 124일, 125일, 126일, 127일, 128일, 129일, 130일, 131일, 132일, 133일, 134일, 135일, 136일, 137일, 138일, 139일, 140일, 141일, 142일, 143일, 144일, 145일, 146일, 147일, 148일, 149일, 150일, 151일, 152일, 153일, 154일, 155일, 156일, 157일, 158일, 159일, 160일, 161일, 162일, 163일, 164일, 165일, 166일, 167일, 168일, 169일, 170일, 171일, 172일, 173일, 174일, 175일, 176일, 177일, 178일, 179일, 180일, 181일, 182일, 183일, 184일, 185일, 186일, 187일, 188일, 189일, 190일, 191일, 192일, 193일, 194일, 195일, 196일, 197일, 198일, 919일, 200일, 201일, 202일, 203일, 204일, 205일, 206일, 207일, 208일, 209일, 210일, 211일, 212일, 213일, 214일, 215일, 216일, 217일, 218일, 219일, 220일, 221일, 222일, 223일, 224일, 225일, 226일, 227일, 228일, 229일, 230일, 231일, 232일, 233일, 234일, 235일, 236일, 237일, 238일, 239일, 또는 240일). 어떤 실시 예에서, 외부 유래 폴리펩티드는 생체 내 반감기가 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 25일, 50일, 75일, 100일, 125일, 150일, 175일, 200일, 225일, 235일, 또는 250일보다 더 크다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 폴리펩티드는 생체 내 반감기가 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 또는 그 이상이다.
어떤 실시 예에서, 현 공개에서의 핵 제거된 세포 ((예를 들어, 망상 적혈구 세포 (reticulocytes), 적혈구 세포 (erythrocytes), 또는 혈소판 (platelets)) 는 개체에 투여된 후에 적어도 약 1일에서 약 240일 동안 순환계에 존재한다 (예를 들어, 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4 day, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일, 39일, 40일, 41일, 42일, 43일, 44일, 45일, 46일, 47일, 48일, 49일, 50일, 51일, 52일, 53일, 54일, 55일, 56일, 57일, 58일, 59일, 60일, 61일, 62일, 63일, 64일, 65일, 66일, 67일, 68일, 69일, 70일, 71일, 72일, 73일, 74일, 75일, 76일, 77일, 78일, 79일, 80일, 81일, 82일, 83일, 84일, 85일, 86일, 87일, 88일, 89일, 90일, 91일, 92일, 93일, 94일, 95일, 96일, 97일, 98일, 99일, 100일, 101일, 102일, 103일, 104일, 105일, 106일, 107일, 108일, 109일, 110일, 111일, 112일, 113일, 114일, 115일, 116일, 117일, 118일, 119일, 120일, 121일, 122일, 123일, 124일, 125일, 126일, 127일, 128일, 129일, 130일, 131일, 132일, 133일, 134일, 135일, 136일, 137일, 138일, 139 days 140일, 141일, 142일, 143일, 144일, 145일, 146일, 147일, 148일, 149일, 150일, 151일, 152일, 153일, 154일, 155일, 156일, 157일, 158일, 159일, 160일, 161일, 162일, 163일, 164일, 165일, 166일, 167일, 168일, 169일, 170일, 171일, 172일, 173일, 174일, 175일, 176일, 177일, 178일, 179일, 180일, 181일, 182일, 183일, 184일, 185일, 186일, 187일, 188일, 189일, 190일, 191일, 192일, 193일, 194일, 195일, 196일, 197일, 198일, 199일, 200일, 201일, 202일, 203일, 204일, 205일, 206일, 207일, 208일, 209일, 210일, 211일, 212일, 213일, 214일, 215일, 216일, 217일, 218일, 219일, 220일, 221일, 222일, 223일, 224일, 225일, 226일, 227일, 228일, 229일, 230일, 231일, 232일, 233일, 234일, 235일, 236일, 237일, 238일, 239일, 또는 240일.
면역 살상 세포의 자극 (Stimulation of 면역 살상 세포s)
여기서 서술된 대로, 현 공개는, 예를 들어, 세포 용해 T 세포 (cytolytic T 세포) (CD8+ 세포), 메모리 CD 8+ T 세포 (memory CD8+ T cells), T 도우미 세포 (T helper cells) (CD4+ 세포) 및 NK 세포를 포함하는, 면역 세포를 자극할 수 있는 제작된 적혈구 세포를 제공한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵이 제거된 세포다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵이 있는 세포다. 면역 세포의 자극은 정상적인 세포기능을 강화시킬 수 있거나, 또는 비정상적인 세포에서 정상적인 세포 기능을 시작하게 할 수 있다. 바람직한 실시 예에서, 본 발명은 면역 살상 세포를 자극할 능력이 있는 제작된 적혈구 세포를 제공한다. 자극될 수 있는 면역 살상 세포에는, 예를 들어, 세포 용해 T 세포 (cytolytic T 세포) (CD8+ 세포), 메모리 CD 8+ T 세포, 및 NK 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 살상 면역 세포는 자연 살상 (Natural Killer) (NK)세포이다. 어떤 실시 예에서, NK 세포는 메모리-유사 NK 세포 (memory-like NK cells)이다. 어떤 실시 예에서, 살상 면역 세포는 CD 8+ T-세포이다. 어떤 실시 예에서, CD 8+ T-세포는 메모리 T 세포이다. 따라서, 현 발명은 또한 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포의 자극의 결과로 얻어진 세포 집단을 제공한다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 동시에 하나 이상의 유형의 면역 살상 세포를, 예를 들어, 하나 이상의 세포 용해 T 세포 (cytolytic T 세포) (CD8+ 세포), 메모리 CD 8+ T 세포, 및 NK 세포를, 자극할 능력이 있는 것이 현 발명의 특징이다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 CD8+ T 세포 및 NK 세포 둘 다를 자극할 수 있다. IL-12, IL-15/IL-15RA, 4-1BBL나, 또는 이의 조합, 예를 들어, 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA, 4-1BBL 및 IL-12, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA,을 포함하고 있는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포는, 일차 CD4+, CD8+, NK 및 NKT 세포의 강력한 활성화를 유도하고, 및 NK 세포 세포독성을 유도한다는 것이 현 발명의 발견이다.
어떤 실시 예에서, 면역 살상세포의 자극은 면역 살상 세포의 확장 (expansion) 을 의미한다. 어떤 실시 예에서, 면역 살상 세포의 자극은 면역 살상 세포의 활성화를 의미한다. 어떤 실시 예에서, 면역 살상 세포의 자극은 면역 살상 세포의 세포독성의 증가를 의미한다.
어떤 특정 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 여기서 서술된 대로, 면역 살상 세포를 생체 외 (ex vivo) 에서 자극하기에 충분하다. 다른 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 여기서 서술된 대로 면역 살상 세포를 생체 내 (in vivo) 에서 자극하기에 충분하다.
NK 세포 활성화 및 확장 (NK Cell Activation and Expansion)
어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 NK 세포를 활성화 할 수 있다.
어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 NK 세포를 확장시킬 수 있다.
탈과립/ 세포독성 (Degranulation/ Cytotoxicity)
NK 세포의 기능적 특징을 정의하는 것은 미리 민감화시키지 않고 세포 타겟에 대한 "자연적 살상 (natral killing)"을 수행하는 이들의 내부적 능력에 달렸다.
따라서, 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 NK 세포를 활성화하고 및 확장시킬 능력이 있어, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포에 의해 활성화되고 및 확장된 NK 세포는 대조군 NK 세포에 비교하여 좀 더 높은 탈과립화 활성을 보인다. 예를 들어, 탈과립화 활성은, 예를 들어 유동 세포 분석 (flow cytometry) 에 의한 CD107a 발현의 측정을 통해 예측할 수 있다. CD107a의 표면 발현은 탈과립화 및 세포독성인 과립의 방출과 밀접하게 연관된다. CD107a의 발현으로 측정된 대로의 탈과립화는, NK 세포와 같은, 주효 세포 (effector cell)의 세포독성 활성과 연관된다. CD107a 발현 측정을 통해 탈과립화 활성을 측정하는 방법은 이 분야 기술 전문가에게 잘 알려졌다. 예를 들어, 그 전문이 참고문헌에 병합된 알터 등 (Alter G, Malenfant J M, Altfeld M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 2004; 294: 15-22) 참조.
어떤 실시 예에서, 본 발명의 제작된 적혈구 세포를 사용하여 얻은, 확장되고 및 활성화된 NK 세포는, 예를 들어, 탈과립화 활성에 의해 측정된 대로, 비-확장된 NK 세포에 비교하여, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 90% 증가한 세포독성을 가진다. 어떤 실시 예에서, 확장되고 및 활성화된 NK 세포는 비-확장된 NK 세포에 비교하여 적어도 200% 증가한 세포독성을 가진다. 어떤 실시 예에서, 확장되고 및 활성화된 NK 세포는 비-생체 외 확장된 NK 세포 (non-ex vivo expanded NK cells)에 비교하여 적어도 300% 증가한 세포독성을 가진다. 확장되고 및 활성화된 NK 세포는 비-생체 외 확장된 NK 세포에 비교하여 적어도 400% 증가한 세포독성을 가진다.
어떤 실시 예에서, 본 발명의 제작된 적혈구 세포를 사용으로, 확장되고 및 활성화된 NK 세포는, 비 확장된 NK 세포에 비교하여, 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 증가된 탈과립화 활성을 가진다. 어떤 실시 예에서, 확장되고 및 활성화된 NK 세포는 비 확장된 NK 세포에 비교하여 적어도 약 100% 증가된 탈과립화 활성을 가진다. 어떤 실시 예에서, 확장되고 및 활성화된 NK 세포는 비 확장된 NK 세포에 비교하여 적어도 약 200% 증가된 탈과립화 활성을 가진다. 어떤 실시 예에서, 확장되고 및 활성화된 NK 세포는 비-생체 외 확장된 NK 세포에 비교하여 적어도 약 300% 증가된 탈과립화 활성을 가진다. 어떤 실시 예에서, 확장되고 및 활성화된 NK 세포는 비-생체 외 확장된 NK 세포에 비교하여 적어도 약 400% 증가된 탈과립화 활성을 가진다.
NK 세포 성숙 및 활성화 마커 (Markers of NK Cell Maturation and Activation)
인간 NK 세포는 CD56의 발현 및 CD3 부재 (absence)로 표현형 적으로 성질이 규명되고 및 더 나아가 CD56밝음 (CD56bright) 집단 및 CD56흐림 (CD56dim) 집단으로 더 나누어진다. CD56밝음 (CD56bright) 집단은 인터페론-γ(interferon-γ)(IFNγ), 종양 괴사 인자-베타 (tumor necrosis factor-beta) (TNF-B), 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α)(TNF-α), 과립 대식세포-콜로니 자극 인자 (granulocyte macrophage-colony stimulating factor) (GMCSF), IL-10, 및 IL-13 (4)를 포함하는, 면역조절 사이토카인들을 생산한다. CD56흐림(CD56dim) 서브세트 (subset)는 CD56밝음(CD56bright) 집단의 말단으로 분화된 계승자 (successor)이며 및 일차적으로 세포용해 기능을 행사하는데 책임이 있다. 그러나 CD56흐림(CD56dim) NK 세포는, NLP 30 활성화 수용체의 NKp46를 통해 세포가 촉발된 후 또는 IL-2, IL-12, 및 IL-15의 조합으로 자극 후에, 사이토카인, 특별히 IFNγ를 생산 할 수 있다.
어떤 실시 예에서, NK 세포 성숙 및/또는 활성화의 다양한 마커들은, 예를 들어, 유동 세포분석 (flow cytometric methods) 을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, NK 세포의 고전적인 마커는, 활성화 수용체 FcγRIII이며, 또한 CD16이라고도 불린다.
NK 세포 활성화는 퍼포린 (perforin) 및 다양한 그랜자임 (granzymes)을 함유하는 세포독성 과립의 방출 및 사이토카인 생산, 가장 우세하게는 인터페론-γ (IFN-γ) 생산을 초래하게 한다. 추가로, Fas 리간드 ((FasL) 및 TNF-관련된 세포사멸-유도 리간드 (apoptosis-inducing ligand) (TRAIL)와 같은 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor) (TNF) 부류에 속하는 죽음-유도 리간드 (death-inducing ligands)의 세포 표면에의 발현은 또한 타겟 세포의 소위, Fas, DR4 (TRAIL-RI), 및 DR5 (TRAIL-RII)라고 불리는, 죽음 수용체 (death receptors) (DRs)에의 결합을 통해 카스파제 효소 경로 (caspase enzymatic cascade)의 활성화를 유도한다.
어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 적어도 하나의 NK 활성화 수용체 (예를 들어, 표 5에 목록화되어 있는 활성화 수용체)를 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 300% 또는 그 이상으로 상향조절 한다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 적어도 하나의 NK 세포 활성화 수용체를 적어도 약 75% 상향조절 한다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 적어도 하나의 NK 세포 활성화 수용체를 적어도 약 100% 상향조절 한다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 적어도 하나의 NK 세포 활성화 수용체를 적어도 약 200% 상향조절 한다.
다른 실시 예에 따라, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 억제적 수용체 또는 케모카인 수용체 (chemokine receptor) (예를 들어, CCR7)와 같은, 적어도 하나의 NK 세포 수용체의 발현을 하향 조절한다. 예를 들어, 어떤 특정 NK 세포 억제적 수용체들은 KIRs ((죽이는 억제적 수용체 (Killing Inhibitory Receptors) 또는 CD158)) 이라고 불린다. 제한적이지 않은 억제적 수용체들의 예에는 억제적 살상 면역글로블린-유사 수용체 (inhibitory killer immunoglobulin-like receptors) (KIRs), GL183, KIR2DL 1, Lir-1, NKB1, 및 NKG2A이 있다.
어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 적어도 하나의 NK 억제적 수용체 (예를 들어, 표 5에 목록화되어 있는 억제적 수용체)를 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 300% 또는 그 이상으로 하향조절 한다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 적어도 하나의 NK 세포 억제제 수용체를 적어도 약 75% 하향조절 한다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 적어도 하나의 NK 세포 억제적 수용체를 적어도 약 100% 하향조절 한다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 적어도 하나의 NK 세포 억제적 수용체를 적어도 약 200% 하향조절 한다.
수용체 발현의 변화는 평균 형광 강도 비율 ((mean fluorescence intensity (MFI) ratios)) 로 계산될 수 있다:
MFIdayX/MFIday0
여기서 x는 NK 세포 확장한 일 수이다.
X 일 샘플에 MFI가 0일의 MFI보다 더 높을 때, MFI 비율은 1보다 클 것이며, 이는 그 수용체에서 상향 조절의 상대적 정도를 제시한다. 그러므로 MFI 비율, 예를 들어, 1.5는 그 특정 수용체의 50% 상향 조절을 의미한다. MFI 비율의 계산은 이 분야 기술 전문가에서는 잘 알려졌다.
다양한 NK 세포 활성화 또는 억제적 수용체들이 아래 표 5에 보여준다.
표 5
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표 5에 있는 약어: ACT, 활성화 (activation); BAT-3, HLA-B-관련된 전사체 3 HLA-B-related transcript 3); H, 인간 (human); HA, 헴아글루티닌 (hemagglutinin); HLA, 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigen); INHIB, 억제적 (inhibitory); KIR, 살상 면역글로블린-유사 수용체 (killer immunoglobulin-like receptor); KLRG1, 살상 세포 렉틴-유사 수용체 G1 (killer cell lectin-like receptor G1); LILR, 백혈구 면역글로블린-유사 수용체 (leukocyte immunoglobulin-like receptor); M, 생쥐 (mouse); MHC, 주 조직보완성 복합체 (major histocompatibility complex); MULT-1, 생쥐 UL16-결합-유사 전사체-1 (mouse UL16-binding-like transcript-1); NCR, 자연 세포독성 수용체 (natural cytotoxicity receptor); NK, 자연 살상체 (natural killer); PVR, 폴리오 바이러스 수용체 (polio virus receptor); RAE-1, 레티노익 에시드 조기 전사체-1 (retinoic acid early transcript-1).
CD8+ T 세포 활성화 및 확장 (CD8+ T Cell Activation and Expansion)
어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 CD8+ T-세포를 활성화할 능력이 있다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 CD8+ T-세포를 확장시킬 능력이 있다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 CD8+ T-세포를 활성화 및 확장시킬 능력이 있다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
T 세포 활성화 및 확장은 여기서 서술된 다양한 에세이로 측정될 수 있다. 예를 들어, 측정될 수 있는 T 세포 활성들에는 T 세포 증식의 유도, T 세포에서 신호 전달의 유도, T 세포에서 활성 마커 발현의 유도, T 세포에 의한 사이토카인 분비 유도, 및 T 세포의 세포독성 활성이 포함된다. 예를 들어, 어떤 특정 실시 예에서, CD8+ T 세포의 활성화는 증식 에세이로 측정된다.
사이토카인 분비 (Cytokine Secretion)
본 발명의 제작된 적혈구에 의한 CD8+ T 세포의 활성화는 감마 인터페론 (gamma interferon)(IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파 (tumor necrosis factor alpha) (TNFa), 인터루킨-12 (IL-12) 또는 인터루킨 2 (IL-2) 와 같은, 사이토카인들 분비를 측정하여 평가 또는 측정된다. 어떤 실시 예에서, 사이토카인 분비를, 예를 들어, 감마 인터페론 (gamma interferon)(IFN-γ), 종양 괴사 인자 알파 (tumor necrosis factor alpha) (TNFa), 인터루킨-12 (IL-12) 또는 인터루킨 2 (IL-2) 의 분비를, 측정하기 위하여 ELISA가 사용된다. ELISPOT ((효소-연결된 면역스폿 (enzyme-linked immunospot)) 기술은 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포로의 자극에 따른 반응에서 주어진 사이토카인 ((예를 들어, 감마 인터페론 (IF-γ)) 을 분비하는 T 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. T 세포는 항-IFN-γ 항체로 코팅된 웰 (well)에서 제작된 적혈구 세포와 배양시킨다. 분비된 IFN-γ는 코팅된 항체에 의해 포획되고 (captured) 및 그 후 발색 기질 (chromogenic substrate) 에 커플 된 2차 항체로 드러내 보인다. 그러므로 국소적으로 분비된 사이토카인 분자는 점 (spot)을 형성하며, 각 점은 하나의 IFN-γ 분비하는 세포에 해당한다. 점의 숫자는 분석되는 샘플에서 IFN-γ 분비하는 세포의 빈도를 결정하도록 한다. ELISPOT 에세이도 또한 종양 괴사 인자 알파 (tumor necrosis factor alpha), 인터루킨-4 (IL-4), IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, 과립 세포-대식세포 콜로니-자극 인자 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), 및 그랜자임 B-분비 림프구 (granzyme B-secreting lymphocytes)를 검출하는데 서술되었다 (Klinman D, Nutman T. Current protocols in immunology. New York, N.Y: John Wiley & Sons, Inc.; 1994. pp. 6.19.1-6.19.8, 이 전문이 여기에 참고 문헌으로 병합 되었다).
배양 상등액에 있는 사이토카인을 측정하기 위하여 세포 내 사이토카인의 유동 세포 분석이 사용될 수 있으나, 실제로 사이토카인을 분비하는 T 세포의 수에 대한 정보는 제공하지 못한다. T 세포를 모내신 (monensin) 또는 브레휄딘 A (brefeldin A)와 같은 분비 억제제로 처치시켰을 때, 이들은 활성화되었을 때 (예를 들어, 현 발명의 제작된 적혈구로) 이들의 세포질 내에 사이토카인을 축적한다. 림프구를 고정시키고 및 투과성 있게 한 후, 세포 내 사이토카인은 세포측정법 (cytometry)으로 정량할 수 있다. 이 기술은 생산된 사이토카인, 이 사이토카인을 생산하는 세포의 유형, 및 한 세포당 생산되는 사이토카인의 양을 측정하게 한다.
세포독성 (Cytotoxicity)
본 발명의 제작된 적혈구에 의한 CD8+ T 세포의 활성화는 CD8+ T 세포의 세포독성 활성을 평가하여 평가될 수 있다.
T 세포의 세포독성 활성은 이 분야 기술에 전문가에 알려진 적절한 기술에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 제작된 적혈구 세포에 노출된 T 세포를 포함하는 샘플은 적절한 시간 기간 후에, 표준 세포독성 에세이에서, 세포독성 활성에 대한 에세이를 할 수 있다. 그러한 에세이에는, 이것에만 국한하지 않으나, 크로뮴 방출 CTL 에세이 (chromium release CTL assay) 및 이 기술 분야에서 알려진 알라머 블루TM 형광 에세이 (Alamar BlueTM fluorescence assay)가 포함될 수 있다.
증식/ 확장 (Proliferation/ Expansion)
본 발명의 제작된 적혈구의 T-세포 확장 능력은 CFSE 염색을 사용하여 평가될 수 있다. 제작된 적혈구 세포는 CD8+ T 세포와 혼합된다 (예를 들어, 암과 같은 질환 또는 장애로 고통받고 있는 개체로부터). 초기 세포 확장 비율을 비교하기 위하여, 제작된 적혈구 세포가 얼마나 잘 T 세포의 증식을 유도하는가를 측정하기 위하여 세포는 CFSE 염색을 하게 한다. CFSE 염색은 좀 더 정량적인 종료점 (endpoint)을 제공하며 및 동시에 확장된 세포의 표현형 결정을 하게 한다. 자극 후 매일, 일정 분량 (aliquot)의 세포를 각 배양으로부터 제거하고 및 유동 세포 분석 (flow cytometry) 으로 분석되었다. CFSE 염색은 세포를 높이 형광이 되도록 한다. 세포 분열시, 형광은 반으로 되며 및 그러므로 세포가 좀 더 분열하면 이는 좀 더 적게 형광이 된다. 제작된 적혈구 세포의 T 세포 증식을 유도하는 능력은 한 번, 두 번, 세 번 및 또는 그 이상 분열하는 세포의 수를 측정하여 정량화된다. 특정한 시간 점에서 가장 큰 세포분열 수를 유도하는 제작된 적혈구 세포는 가장 강력한 확장자로서 간주된다.
이들 제작된 적혈구 세포가 얼마나 잘 T 세포의 장기간 성장 (long-term growth) 을 촉진하는가를 결정하기 위하여, 세포 성장 곡선이 만들어질 수 있다. 이 실험은 앞선 CFSE 실험처럼 정해졌으나, CFSE는 사용되지 않는다. 매 2-3일에, T-세포는 해당하는 배양으로부터 제거되고 및 얼마나 많은 세포가 존재하는가를 측정하고 및 세포의 평균 부피를 측정하는 컬터 카운터 (Coulter counter) 를 사용하여 세었다. 평균 세포 부피는 언제 세포를 재자극하는가의 가장 좋은 (best predicator) 근거이다. 일반적으로, T 세포가 적절히 자극될 때, 이들의 세포 부피는 3배가 된다. 이 부피가 초기 아세포 (initial blast) 의 약 반보다 더 감소할 때, 긴 선상 확장 (long linear expansion)을 유지하기 위하여 T-세포를 재자극하는 것이 필요할 수 있다 (Levine et al., 1996, Science 272:1939-1943; Levine et al., 1997, J. Immunol. 159:5921-5930). 각 제작된 적혈구 세포가 20 집단 배가 (doubling)를 유도하는데 걸리는 시간이 계산된다. 이 수준의 T 세포 확장을 유도하기 위한 각 제작된 적혈구 세포의 상대적 차이는 특정한 제작된 적혈구 세포가 평가되는 중요한 기준이다.
추가로, 특정한 서브세트 (subset)가 선호적으로 확장되었는지를 결정하기 위하여 각 제작된 적혈구 세포에 의해 확장된 세포의 표현형이 규명될 수 있다. 각 재자극 전에, 압페이 등 (Appay et al.) (2002, Nature Med. 8, 379-385, 그 전문이 여기 참고 문헌으로 병합됨)에 의해 제안된 CD27 및 CD28 정의 및 살루토 등 (Sallusto et al.) (1999, Nature 401:708-712, 그 전문이 여기 참고 문헌으로 병합됨)에 의해 제안된 CCR7 정의를 사용하여 확장된 T 세포의 분화 상태를 정의하기 위하여 확장된 T 세포 집단의 표현형 분석이 수행되었다. 퍼포린 (Perforin) 및 그랜자임 Granzyme B) 의 세포 내 염색이 세포 용해 잠재성을 예측하기 위한 전체 측정 (gross measure)을 수행하기 위하여 사용될 수 있다.
세포사멸 마커 (Apoptosis Marker)
현 발명의 어떤 특정 실시 예에서, 여기서 서술된 대로 제작된 적혈구 세포를 사용한 T 세포의 자극, 활성화, 및 확장은 세포사멸을 다시 보호하거나 또는 달리 생체 내 또는 시험관 내에서 생존력을 길게 하는 T 세포에서의 어떤 특정 주요 분자들의 발현을 증강한다. 세포사멸은 보통 T 세포에서 특별한 신호의 유도의 결과이다. 그러므로 본 발명의 적혈구 세포는 T 세포의 자극의 결과인 세포 사멸로부터 T 세 포를 보호하기 위하여 제공할 수 있다. 그러므로 또한 현 발명에 포함되는 것은, 미성숙된 사멸로부터 보호하거나 또는 Bcl-xL, 성장 인자 (growth factors), 사이토카인 (cytokines) 또는 T 세포 생존에 정상적으로 필요한 림포카인과 같은 인식된 T 세포 성장 마커들의 비 존재 또는 고갈로부터의 보호는 물론 Fas 또는 종양 괴사 인자 수용체 (Tumor Necrosis Factor Receptor) (TNFR) 크로스-링킹 (cross-linking)으로부터의 보호에 의한 또는 특정한 호르몬 또는 스트레스에 노출시킴에 의한 증강된 T 세포 성장이다.
타일링 (Tiling)
어떤 특정 실시 예에 따라, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 겹치는 아미노산 서열을 가진다. 어떤 특정 실시 예에서, 여기서 서술된 대로 제작된 적혈구 세포는 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 (예를 들어, 하나 또는 그 이상, 둘 또는 그 이상, 셋 또는 그 이상) 포함한다. 어떤 특정 실시 예에서, 여기서 서술된 대로 제작된 적혈구 세포는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하며, 및 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 적어도 2개의 아미노산이 겹치는 아미노산 서열을 가진다. 어떤 특정 실시 예에 따르면, 겹침은 2 아미노산에서 23 아미노산 사이이다, 예를 들어, 겹침은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23 아미노산이다. 한 실시 예에 따르면, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 8-10 사이 아미노산 길이이며, 및 겹침은 6-8 사이 아미노산이다. 다른 실시 예에 따르면, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 14-20 사이 아미노산 길이이며, 및 겹침은 12-18 사이 아미노산이다. 이 방식으로 폴리펩티드 타일링 (tiling) 은 넓은 항원 인식을 제공한다.
폴리펩티드 타일링하는 방법은 이분야 기술에서 알려졌으며, 및 예를 들어, 하딩 등 (Harding et al.)에서 서술되며, 이는 12 아미노산에 의해 겹치고, 인간 CD4+ T-세포-근거한 증식 에세이에서 테스트 되는, (15 머 (15 mer) 폴리펩티드의 개발 및 테스트를 서술한다 (Molecular Cancer Therapeutics, November 2005, Volume 4, Issue 11, 그 전문이 여기서 참고 문헌으로 병합되었다). 스티커 (Sticker, et al.) 등은 어느 단백질에서 기능적인 CD4(+) T-세포 에피톱을 동정하기 위한 인간 세포-근거한 방법을 서술한다 (J Immunol Methods. 2003 Oct 1;281(1-2):95-108, 그 전문이 여기에 참고 문헌으로 병합되었다).
수정 ( Modifications)
하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 단백질은 진핵 세포의, 예를 들어, 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포의, 특징인 번역 후 수정을 가질 수 있다. 어떤 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상) 외부 유래 자극 단백질은 당화 (glycosylated), 인산화 (phosphorylated), 또는 둘 다 된다. 당 단백질의 시험관 내 검출은 주기적- 산- 쉬프 (Periodic acid-Schiff) (PAS) 방법을 사용하여 SDS-PAGE 젤 및 웨스턴 블럿 (Western Blots) 에서 성취될 수 있다. 당단백질의 세포 내 위치는 이분이야 기술에서 알려진 렉틴 형광 접합 (lectin fluorescent conjugates) 을 사용하여 성취될 수 있다. 인산화는 인-특이 항체 (phospho-specific antibodies) 를 사용하여 웨스턴 블럿에 의해 평가 될 수 있다.
번역-후 수정은 또한 소수성 그룹 (hydrophobic group) ((예를 들어, 미리스토일화 (myristoylation), 팔미토일화 (palmitoylation), 이소프레닐화 (isoprenylation), 프레닐화 (prenylation), 또는 글리피화 (glypiation)) 에의 접합, 보조 인자 ((예를 들어, 리포일화 (lipoylation), 플라빈 잔기 (flavin moiety) (예를 들어, FMN 또는 FAD), 헴 C 부착, 포스포판테테이닐화 (phosphopantetheinylation), 또는 레티닐리덴 쉬프 베이스 형성 (retinylidene Schiff base formation))에의 접합, 디프타아마이드 형성 (diphthamide formation), 에탄올아민 포스포글리세롤 부착(ethanolamine phosphoglycerol attachment), 히푸신 형성 (hypusine formation), 아실화 (acylation) ((예를 들어, O-아실화 (O-acylation), N-아실화 (N-acylation), 또는 S-아실화 (S-acylation)), 포밀화 (formylation), 아세틸화 (acetylation), 알킬화 (alkylation) ((예를 들어, 메틸화(methylation) 또는 에틸화 (ethylation)), 아미데이션 (amidation), 부티릴화 (butyrylation), 감마-카복실화 (gamma-carboxylation), 말로닐화 (malonylation), 하이드록실화 (hydroxylation), 요드화 (iodination), ADP-라이보실화 (ADP-ribosylation)와 같은 뉴클레오타이드 첨가 (nucleotide addition), 산화 (oxidation), 포스페이트 에스터 (phosphate ester) (O-연결된) 또는 포스포아미데이트 (phosphoramidate) (N-연결된) 형성, ((예를 들어, 인산화 (phosphorylation) 또는 아데닐화 (adenylylation)), 프로피오닐화 (propionylation), 파이로글루타메이트 형성 (pyroglutamate formation), S-글루타티오닐화 (S-glutathionylation), S-니트로실화 (S-nitrosylation), 석시닐화 (succinylation), 황산화 (sulfation), ISG일레이숀(ISGylation), 스모일레이숀 (SUMOylation), 유비퀴티네이숀 (ubiquitination), 네딜레이숀 (Neddylation), 또는 아미노산의 화학적 수정 ((예를 들어, 시트룰리네이숀 (citrullination), 디아미데이숀 (deamidation), 에리미닐레이숀 (eliminylation), 또는 카바밀레이숀 (carbamylation)), 이황화 브리지 형성 (formation of a disulfide bridge), 라세미화 (racemization) ((예를 들어, 프롤린 (proline), 세린 (serine), 알라닌 (alanine), 또는 메티오닌 ( methionine))를 포함한다. 실시 예에서, 당화 (glycosylation)는 아르기닌 (arginine), 아스파라긴 (asparagine), 시스테인 (cysteine), 하이드록시라이신 (hydroxylysine), 세린 (serine), 트레오닌 (threonine), 타이로신 (tyrosine), 또는 트립토판 (tryptophan)에 글라코실 군 (glycosyl group)을 첨가시켜 당단백질의 결과가 된다. 실시 예에서, 당화는 예를 들어, O-연결된 당화 (O-linked glycosylation) 또는 N-연결된 당화 (N-linked glycosylation) 를 포함한다.
상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
제작된 적혈구 세포의 집단 (Populations of 제작된 적혈구 세포s)
한 관점에서, 본 발명은 본 발명의 제작된 적혈구 세포를, 예를 들어, 제작된 적혈구 세포의 다수 또는 집단을, 포함하는 세포 집단을 특징으로 한다, 다양한 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 대부분 핵 제거된 세포, 대부분 핵 있는 세포, 또는 핵 제거된 세포 및 핵 있는 세포의 혼합을 포함한다. 그러한 세포 집단에서, 핵 제거된 세포는 망상 적혈구 (reticulocytes), 적혈구 (erythrocytes), 또는 망상 적혈구 및 적혈구의 혼합을 포함할 수 있다. 어떤 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 망상 적혈구이다. 어떤 실시 예에서, 핵 제거된 세포는 적혈구 (erythrocytes) 이다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 필수적으로 핵 제거된 세포로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 대부분 또는 상당히 핵 제거된 세포다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포의 집단은 적어도 약 80% 또는 그 이상이 핵 제거된 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 여기서 제공된 집단은 적어도 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99, 또는 약 100%의 핵 제거된 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 여기서 제공된 집단은 약 80%보다 더 큰 핵 제거된 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%보다 더 큰 핵 제거된 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 약 80% 및 약 100% 사이의 핵 제거된 세포를 포함한다, 예를 들어, 약 80% 및 약 95% 사이, 약 80% 및 약 90% 사이, 약 80% 및 약 85% 사이, 약 85 및 약 100% 사이, 약 85% 및 약 95% 사이, 약 85 및 약 90% 사이, 약 90% 및 약 100% 사이, 약 90% 및 약 95% 사이, 또는 약 95% 및 약 100% 사이의 핵 제거된 세포를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 약 20% 미만의 핵 있는 세포를 포함한다. 예를 들어, 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 또는 약 20% 미만의 핵 있는 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 약 1% 미만의 핵 있는 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 약 2% 미만의 핵 있는 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 약 3% 미만의 핵 있는 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 약 4% 미만의 핵 있는 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 약 5% 미만의 핵 있는 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 약 10% 미만의 핵 있는 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 약 15% 미만의 핵 있는 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 0%에서 20% 사이의 핵 있는 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 0%에서 20% 사이의 핵 있는 세포를 포함한다, 예를 들어, 약 0%에서 19% 사이, 약 0%에서 15% 사이, 약 0%에서 10% 사이, 약 0%에서 5% 사이, 약 0%에서 4% 사이, 약 0%에서 3% 사이, 약 0%에서 2% 사이의 핵 있는 세포, 또는 약 5%에서 20% 사이, 약 10%에서 20% 사이, 또는 약 15%에서 20% 사이의 핵 있는 세포를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 본 공개는 본 발명의 제작된 적혈구 세포의 집단을 특징으로 하며, 여기서, 제작된 적혈구 세포의 집단은 20% 미만의 핵 있는 세포 및 적어도 80%의 핵 제거된 세포를 포함하거나, 또는 15% 미만의 핵 있는 세포 및 적어도 85%의 핵 제거된 세포를 포함하거나, 또는 10% 미만의 핵 있는 세포 및 적어도 90%의 핵 제거된 세포를 포함하거나, 또는 5% 미만의 핵 있는 세포 및 적어도 95%의 핵 제거된 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 본 공개는 본 발명의 제작된 적혈구 세포의 집단을 특징으로 하며, 여기서, 제작된 적혈구 세포의 집단은 약 0%의 핵 있는 세포 및 약 100%의 핵 제거된 세포, 약 3%의 핵 있는 세포 및 약 97%의 핵 제거된 세 포, 약 4%의 핵 있는 세포 및 약 96%의 핵 제거된 세포, 약 5% 핵 있는 세포 및 약 95%의 핵 제거된 세포, 약 6%의 핵 있는 세포 및 약 94%의 핵 제거된 세포, 약 7%의 핵 있는 세포 및 약 93%의 핵 제거된 세포, 약 8%의 핵 있는 세포 및 약 92%의 핵 제거된 세포, 약 9%의 핵 있는 세포 및 약 91%의 핵 제거된 세포, 약 10%의 핵 있는 세포 및 약 90%의 핵 제거된 세포, 약 11%의 핵 있는 세포 및 약 89%의 핵 제거된 세포, 약 12%의 핵 있는 세포 및 약 88%의 핵 제거된 세포, 약 13%의 핵 있는 세포 및 약 87%의 핵 제거된 세포, 약 14%의 핵 있는 세포 및 약 86%의 핵 제거된 세포, 약 15%의 핵 있는 세포 및 약 85%의 핵 제거된 세포, 약 16%의 핵 있는 세포 및 약 84%의 핵 제거된 세포, 약 17%의 핵 있는 세포 및 약 83%의 핵 제거된 세포, 약 18%의 핵 있는 세포 및 약 82%의 핵 제거된 세포, 약 19%의 핵 있는 세포 및 약 81%의 핵 제거된 세포, 또는 약 20%의 핵 있는 세포 및 약 80%의 핵 제거된 세포를 포함한다.
다른 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 대부분 또는 상당히 핵 있는 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 근본적으로 핵 있는 세포로 구성된다. 다양한 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단에서 핵 있는 세포는 적혈구 (또는 완전히 성숙된 붉은 혈액 세포) 전구체 세포이다. 실시 예에서, 적혈구 전구체 세포는 만능 조혈 줄기세포 (pluripotent hematopoietic stem cells) (HSCs), 다분화능 골수성 전구 세포 (multipotent myeloid progenitor cells), CFU-S 세포, BFU-E 세포, CFU-E 세포, 전적혈모구 (pronormoblasts), 호염기성 적혈모구 (basophilic normoblasts), 다염성 적혈모구 (polychromatophilic normoblasts) 및 중성가염성 적혈모구 (orthochromatophilic normoblasts)로 구성된 군으로부터 선택된다.
어떤 특정 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 핵 있는 세포를 포함한다.
본 발명의 제작된 적혈구 세포 집단의 제조 동안에, 세포의 어떤 분획은 외부 유래 폴리펩티드와 접합 되지 않게 될 수 있거나 또는 외부 유래 폴리펩티드를 발현하기 위해 형질도입 될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 어떤 실시 예에서, 여기서 제공된 제작된 적혈구 세포 집단은 제작된 적혈구 세포 및 수정 안 된 적혈구 세포의 혼합을 포함한다, 즉, 집단에서 세포의 어떤 분획은 외부 유래 폴리펩티드를 포함, 존재, 또는 발현하지 않을 것이다. 예를 들어, 제작된 적혈구 세포 집단은, 다양한 실시 예에서, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 제작된 적혈구 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 집단의 나머지 적혈구 세포는 제작되지 않은 것이다. 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포의 단일 단위 용량 (single unit dose)은, 다양한 실시 예에서, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 제작된 적혈구 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 용량에 있는 나머지 적혈구 세포는 제작되지 않은 것이다.
II. 제작된 적혈구 세포를 만드는 방법 (METHODS OF MAKING 제작된 적혈구 세포S)
제작된 적혈구 세포를, 예를 들어, 핵 제거된 세포를, 만드는 다양한 방법들이 현 공개에 의해 고려된다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵이 있는 세포다.
한 관점에서, 현 공개는 면역 세포를 자극하도록 제작된 핵 제거된 세포가 특징이며, 여기서 면역 세포는 살상 세포이고, 제작된 핵 제거된 세포의 표면에 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 면역 세포를 자극하기에 충분하고, 각하나 또는 그 이상의 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입하고; 및 핵 있는 적혈구 세포가 핵 제거되기에 적절하고 및 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 생산하기에 적절한 조건하에서 핵 있는 적혈구 세포를 배양하는 것을 포함하는 공정으로 생산된다.
다른 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포가 특징이며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA 융합을 포함하고, IL-15/IL-15RA 융합을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입하고; 및 핵 있는 적혈구 세포가 핵 제거되기에 적절하고 및 IL-15/IL-15RA 융합을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드의 생산에 적절한 조건하에서 핵 있는 적혈구 세포를 배양하는 것을 포함하는 공정으로 생산된다.
다른 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포를 제공하며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL을 포함하고, 4-1BBL을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입하고; 및 핵 있는 적혈구 세포가 핵 제거되기에 적절하고 및 4-1BBL을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드의 생산에 적절한 조건하에서 핵 있는 적혈구 세포를 배양하는 것을 포함하는 공정으로 생산된다.
다른 관점에서, 본 공개는 제작된 핵 제거된 세포가 특징이며, 제작된 핵 제거된 세포 표면에 IL-15/IL-15RA 융합, MHC 유형 I 체인-관련된 단백질 A (MHC class I chain-related protein A) (MICA), 인슐린-유사 성장인자 1 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1), CD48나 또는 CD155를 포함하는 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입하고; 및 핵 있는 적혈구 세포가 핵 제거되기에 적절하고 및 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드의 생산에 적절한 조건하에서 핵 있는 적혈구 세포를 배양하는 것을 포함하는 공정으로 생산된다.
다른 관점에서, 본 공개는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 핵 제거된 세포가 특징이며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12 p40/IL-12 p35 융합을 포함하고, IL-12 p40/IL-12 p35 융합을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입하고; 및 핵 있는 적혈구 세포가 핵 제거되기에 적절하고 및 IL-12 p40/IL-12 p35 융합을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드의 생산에 적절한 조건하에서 핵 있는 적혈구 세포를 배양하는 것을 포함하는 공정으로 생산된다.
다른 관점에서, 본 공개는 제작된 핵 제거된 세포가 특징이며, 제작된 핵 제거된 세포 표면에 IL-12 p40/IL-12 p35 융합이나, IL-15/IL-15RA 융합이나, 4-1BBL 를 포함하는 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입하고; 및 핵 있는 적혈구 세포가 핵 제거되기에 적절하고 및 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드의 생산에 적절한 조건하에서 핵 있는 적혈구 세포를 배양하는 것을 포함하는 공정으로 생산된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 핵 제거된 적혈구 세포는 하나 이상의 (예를 들어, 둘, 셋 또는 그 이상) 외부 유래 자극 폴리펩티드를 제작된 핵 제거된 세포 표면에 포함하며, 및 이 세포는 한 개 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나 (예를 들어, 하나, 둘, 셋 또는 그 이상)의 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입하고; 및 핵 있는 적혈구 세포가 핵 제거되기에 적절하고 및 하나 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드의 생산에 적절한 조건하에서 핵 있는 적혈구 세포를 배양하는 것을 포함하는 공정으로 생산된다.
제작된 적혈구 세포의 물리적 특성 (Physical characteristics of 제작된 적혈구 세포 s)
어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 적혈구 세포는 여기서 서술된 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4, 또는 그 이상) 물리적 특성을, 예를 들어, 삼투적 취약성 (osmotic fragility), 세포 크기 (cell size), 헤모글로빈 농도 (hemoglobin concentration), 또는 포스파티딜세린 함량 (phosphatidylserine content)을 가진다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵이 있는 세포다. 이론에 의해 얽매이지 않기를 바라면서, 어떤 실시 예에서, 외부 유래 단백질을 발현하는 제작된 적혈구 세포는, 예를 들어, 핵 제거된 세포는, 야생형, 처치하지 않은 적혈구 세포와 닮은 물리적 특성이 있다. 반면에, 저삼투압적으로 로드된 (loaded) 적혈구 세포는 때때로 증가된 삼투적 취약성, 변화된 세포 크기, 헤모글로빈 함량 감소, 또는 세포막 외부 리프렛 (outer leaflet)에 증가된 포스파티딜세린 수준과 같은 비정상적인 물리적 특성을 보인다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 세포에 의해 유지되지 않았고, 정제된 적이 없고, 또는 적혈구 세포 밖에서 전적으로 존재하지 않았던 외부 유래 핵산에 의해 암호화되는 외부 유래 단백질을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 안정제가 결핍된 조성물에 있다.
삼투적 취약성 (Osmotic fragility)
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 외부 유래 폴리펩티드를 포함하지 않은 분리된, 배양되지 않은 적혈구와 상당히 같은 삼투적 막 취약성을 보인다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단은 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% NaCl에서 50% 이하의 세포 용해의 삼투적 취약성을 가진다. 삼투적 취약성은 그 전문이 여기에 참고 문헌으로 병합된, WO2015/073587의 실시예시 59의 방법을 사용하여 에세이 될 수 있다.
세포 크기 (Cell size)
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는, 예를 들어, 핵 제거된 세포는, 야생형, 처치되지 않은 적혈구 세포와 대략 같은 지름 또는 부피를 가진다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포 집단은 평균 지름 약 4, 5, 6, 7, 또는 8마이크론 (microns)이고, 및 선택적으로 집단의 표준 편차는 1, 2, 또는 3마이크론 미만이다. 어떤 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 적혈구 세포는 4-8, 5-7, 또는 약 6마이크론의 지름을 가진다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포의 지름은 약 1마이크론 미만이고, 약 20마이크론보다 크고, 약 1마이크론에서 약 20마이크론 사이, 약 2마이크론에서 약 20마이크론 사이, 약 3마이크론에서 약 20마이크론 사이, 약 4마이크론에서 약 20마이크론 사이, 약 5마이크론에서 약 20마이크론 사이, 약 6마이크론에서 약 20마이크론 사이, 약 5마이크론에서 약 15마이크론 사이 또는 약 10마이크론에서 약 30마이크론 사이이다. 세포 지름은, 어떤 실시 예에서, 아드비아 120 헤마톨로지 시스템 (Advia 120 hematology system) 을 사용하여 측정 된다.
어떤 실시 예에서, 적혈구 세포의 평균 미립자의 부피의 부피는 10 fL, 20 fL, 30 fL, 40 fL, 50 fL, 60 fL, 70 fL, 80 fL, 90 fL, 100 fL, 110 fL, 120 fL, 130 fL, 140 fL, 150 fL보다 크고, 또는 150 fL보다 크다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포의 평균 미립자의 부피는 30 fL, 40 fL, 50 fL, 60 fL, 70 fL, 80 fL, 90 fL, 100 fL, 110 fL, 120 fL, 130 fL, 140 fL, 150 fL, 160 fL, 170 fL, 180 fL, 190 fL, 200 fL보다 적고, 또는 200 fL 미만이다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포의 평균 미립자의 부피는 0 - 100, 100-200, 200-300, 300-400, 또는 400-500 펨토 리터 (femtoliters) (fL) 사이이다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포 집단은 이 구절에서 보여준 평균 미립자의 부피를 가지며 및 집단의 표준 편차는 50, 40, 30, 20, 10, 5, 또는 2 fL 미만이다. 평균 미립자 부피는, 어떤 실시 예에서, 혈액학적 분석 기구, 예를 들어, 컬터 카운터 (Coulter counter) 를, 사용하여 측정된다.
헤모글로빈 농도 (Hemoglobin concentration)
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는, 예를 들어, 핵 제거된 세포는, 야생형, 처치되지 않은 적혈구 세포와 비슷한 헤모글로빈 함량을 가진다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%보다 더 크거나 또는 10%보다 더 큰 태아 헤모글로빈을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 적어도 약 20, 22, 24, 26, 28, 또는 30pg, 및 선택적으로 약 30pg의 총 헤모글로빈 (hemoglobin) 을 포함한다. 헤모글로빈 수준은, 어떤 실시 예에서, 그 전문이 여기에 참고 문헌으로 병합된, WO2015/073587의 실시예시 33의 드랩킨즈 시약 방법 (Drabkin's reagent method) 을 사용하여 결정될 수 있다.
포스파디딜세린 함량 (Phosphatidylserine content)
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는, 예를 들어, 핵 제거된 세포는, 야생형, 처치되지 않은 적혈구 세포와 비슷한 포스파티딜세린 함량을 세포막 외부 리프렛 (outer leaflet) 에 갖는다. 포스파티딜세린은 야생형, 처치되지 않은 적혈구 세포막의 내부 리프렛 (inner leaflet) 에 주로 존재하며, 및 저삼투압 로딩 (hypotonic loading) 은 포스파티딜세린이 외부 리프렛으로 분포되게 하며 거기서 이는 면역 반응을 촉발시킬 수 있게 한다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 집단은 약 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 이하의 세포가 아넥신 V (Annexin V) 염색 양성인 세포를 포함한다. 포스파티딜세린 노출은, 어떤 실시 예에서, PS에 우선적으로 결합하는, 아넥신-V-FITC (Annexin-V-FITC) 에 대한 염색, 및 예를 들어, 여기에 그 전문이 참고 문헌으로 병합되어 있는, WO2015/073587의 실시예시 54의 방법을 사용하여, 유동 세포 분석에 의한 FITC 형광 측정에 의해 평가된다.
다른 특징들 (Other characteristics)
어떤 실시 예에서, 적혈구 세포 집단은 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,
또는 95% (및 선택적으로 90 또는 100%까지)의 GPA 양성인 세포를 포함한다. GPA의 존재는, 어떤 실시 예에서, FACS를 사용하여 검출된다.
어떤 실시 예에서, 적혈구 세포를 포함하는 세포 집단은 약 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만의 유극적혈구 (echinocytes) 를 갖는다.
어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 핵 제거되었다, 예를 들어, 여기서 서술된 치료적 제제로서 사용된 적혈구 세포를 포함하는 세포 집단은 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상이 핵 제거되었다. 어떤 실시 예에서, 세포는, 예를 들어, 적혈구 세포는, 기능적이지 않은, 예를 들어, 불활성화된, 핵을 함유한다.
적혈구 분리 (Isolating erythrocytes )
성숙 된 적혈구는, 예를 들어, 세포 세척기 (cell washer), 연속적인 유동 세포 분리기 (continuous flow cell separator), 밀도 구배 분리 (density gradient separation), 형광-활성화된-세포 분류 (fluorescence-activated cell sorting) (FACS), 밀텐니 면역자석 고갈 (Miltenyi immunomagnetic depletion) (MACS), 또는 이 방법들의 조합과 같은 여러 다양한 방법을 사용하여 분리될 수 있다 ((예를 들어, van der Berg et al., Clin. Chem. 33:1081-1082 (1987); Bar-Zvi et al., J. Biol. Chem. 262:17719-17723 (1987); Goodman et al., Exp. Biol. Med. 232:1470-1476 (2007) 참조)).
적혈구는 전 혈액 (whole blood) 으로부터 단순한 원심분리에 의해 분리될 수 있다 ((van der Berg et al., Clin. Chem. 33:1081-1082 (1987) 참조)). 예를 들어, EDTA-항응고 된 전 혈액 (EDTA-anticoagulated whole blood) 은 800x g에서 10분 동안 4o C에서 원심분리시킬 수 있다. 혈소판-풍부한 혈장 (platelet-rich plasma) 및 버피 코트 (buffy coat) 는 제거시키고 및 붉은 혈액 세포는 등장 생리 식염수 (NaCl, 9 g/L) 로 세 번 세척시킨다.
다른 한편으로, 적혈구는, 예를 들어, 피콜 (Ficoll), 하이팩 (Hypaque), 히스토팩 (Histopaque), 퍼콜 (Percoll), 시그마셀 (Sigmacell), 또는 이의 조합과 같은 다양한 분리 매체로 밀도 구배 원심분리 (density gradient centrifugation) 를 사용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 히스토팩-1077 (Histopaque-1077) 의 한 부피를 동일 부피의 히스토팩-1119 (Histopaque-1119) 위에 겹쳐 놓는다. 1:1로 동일 부피의 등장 생리 식염수 (NaCl, 9g/L) 로 희석시킨 EDTA-항응고 된 전 혈액을 히스토팩의 상층에 오려 놓고 및 샘플은 실온에서 700x g로 30분 동안 원심분리한다. 이 조건하에서, 과립 세포는 1077/1119 경계면으로 이동하고, 림프구, 다른 단핵구 세포 및 혈소판은 혈장/1077 경계면에 남아 있고, 및 붉은 혈액 세포는 침전물로 된다. 붉은 혈액 세포는 등장 생리 식염수로 두 번 세척한다.
다른 한편으로, 적혈구는 퍼콜 단계 구배 (Percoll step gradient) 를 사용하여 원심분리로 분리될 수 있다 (예를 들어, Bar-Zvi et al., J. Biol. Chem. 262:17719-17723 (1987) 참조)). 예를 들어, 신선한 혈액을 75 mM 소듐 시트레이트 (sodium citrate) 및 38 mM 시트릭 에시드 (citric acid) 를 함유하는 항응고 용액과 혼합시키고 및 세포는 잠시 헤페스-완충된 식염수 (Hepes-buffered saline) 로 세척시킨다. 백혈구 및 혈소판은 α-셀루로오즈 (α-cellulose) 및 시그마셀 (Sigmacell) (1:1) 혼합물에 흡착시켜 제거시킨다. 적혈구는 더 나아가 45/75% 퍼콜 단계 구배 (Percoll step gradient) 를 통해 10분 동안 2500 rpm로 소발 SS34 (Sorvall SS34 ) 로터에서 원심분리시켜 망상적혈구 및 잔류 흰색 혈액 세포 (백혈구)로부터 분리한다. 적혈구는 침전물에서 회수되고 반면에 망상적혈구는 45/75% 경계면에 밴드를 이루고 및 나머지 흰색 혈액 세포는 0/45% 경계면에 밴드를 이룬다. 퍼콜 (Percoll) 은 헤페스-완충된 식염수 (Hepes-buffered saline) 에서 몇 번 세척하여 적혈구로부터 제거된다. 적혈구를 분리하기 위한 밀도 구배 (density gradient) 를 생성하는데 사용되는 다른 재료들에는 OPTIPREP, 아이오딕사놀 (iodixanol)의 60% 수용액 (Axis-Shield, Dundee, Scotland로 부터)이 포함된다.
적혈구는, 예를 들어, 유동 세포 분석 (flow cytometry) 을 사용하여 망상적혈구로부터 분리될 수 있다 ((예를 들어, Goodman el al., Exp. Biol. Med. 232:1470-1476 (2007) 참조)). 이 경우, 혈장(플라즈마)으로부터 세포를 분리하기 위하여 전 혈액 (whole blood)이 원심분리 된다 (550x g, 20분, 25o C). 세포 침전물은 인산 버퍼 된 식염수 용액 (phosphate buffered saline solution) 에 재현탁시키고 및 더 나아가 흰색 혈액 세포로부터 적혈구를 분리하기 위하여 피콜-팩 (Ficoll-Paque) 1.077 밀도)에서, 예를 들어, 원심분리로 (400x g, 30분, 25o C) 분획시킨다. 결과로 얻어진 침전물은 10% 태아 소 혈청 (fetal bovine serum) 이 보충된 RPMI에 재현탁시키고 및 크기 및 과립성에 근거하여, 예를 들어, 벡톤 디킨손 FACSCalibur (Becton Dickinson FACSCalibur) (BD Biosciences, Franklin Lakes, N.J., USA) FACS 기기에서 분류시킨다.
적혈구는 면역자석 고갈 (immunomagnetic depletion) 로 분리될 수 있다 ((예를 들어, Goodman, el al., (2007) Exp. Biol. Med. 232:1470-1476 참조)). 이 경우, 비-적혈구를 제거하기 위하여 세포-유형 특이 항체 (cell-type specific antibodies) 를 가진 자석 비드 (magnetic beads) 가 사용된다. 예를 들어, 적혈구는 여기서 서술된 대로 밀도 구배 (density gradient) 이어서 어느 잔여 망상적혈구의 면역자석 고갈로 사용하여 대부분의 다른 혈액 성분으로부터 분리된다. 세포는 인간 항체 혈청으로 20분 동안 25o C에서 미리-처치하고 및 그 후, 예를 들어, CD71 및 CD36와 같은 망상적혈구 특이 항원에 대한 항체로 처치한다. 항체는 직접 자석 비드 (magnetic bead) 에 부착시키거나 또는, 예를 들어, 항-PE 항체를 가진 자석 비드가 반응할 PE에 접합시킬 수 있다. 항체-자석 비드 복합체는, 예를 들어, 적혈구 집단으로부터 잔여 망상적혈구를 선택적으로 추출할 수 있다.
적혈구는 또한 성분채집술 (apheresis)을 사용하여 분리될 수 있다. 성분 채집술 과정은 환자 또는 공여자로부터 전 혈액의 제거, 원심분리 또는 세포 분류를 사용하여 혈액 성분을 분리, 분리된 부분 하나 또는 그 이상을 빼어내고, 및 잔여 성분을 환자 또는 공여자에게 다시 수혈하는 것이 포함된다. 이 목적을 위해, 예를 들어, 박스터 (Baxter)로부터의 아미커스 및 아리스 기기 (Amicus and Alyx instruments) (Deerfield, Ill., USA), 갬부로 BCT (Gambro BCT) 로부터의 트리마 엑셀 기기 (Trima Accel instrumen) (Lakewood, Colo., USA), 및 헤모네텍스 (Haemonetics) 로부터의 MCS+9000기기 (MCS+9000 instrument) (Braintree, Mass., USA) 와 같은, 몇 가지 기기들이 현재 사용되고 있다. 적절한 정도의 세포 순도를 달성하기 위하여 추가의 정제 방법들이 필요할 수도 있다.
망상적혈구는 미성숙된 붉은 혈액 세포이고 및 인간 몸에서 붉은 혈액 세포의 1%를 구성한다. 망상적혈구는 골수에서 발달 되고 및 성숙 된다. 일단 순환계로 방출되면, 망상적혈구는 빠르게 최종 분화 (terminal differentiation) 를 거쳐 성숙 된 적혈구로 된다. 성숙 된 적혈구와 같이, 망상적혈구는 세포핵이 없다.
망상적혈구가 성숙함에 따른 세포 밀도의 차이에 근거하여 다양한 나이의 망상적혈구를 말초 혈액으로부터 분리할 수 있다. 다양한 밀도 구배 (density gradients) 를 통한 분획 원심분리 (differential centrifugation) 를 사용하여 망상적혈구는 말초 혈액으로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 망상적혈구를 분리하기 위해 퍼콜 구배 (Percoll gradients) 가 사용될 수 있다 (예를 들어, Noble el al., Blood 74:475-481 (1989) 참조)). 밀도 1.096 및 1.058 g/ml의 멸균된 등장 퍼콜 용액 (isotonic Percoll solutions) 은 퍼콜 (Percoll) ((시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Mo., USA)) 을 최종 농도 10 mM 트리에탄올아민 (triethanolamine), 117 mM NaCl, 5 mM 글루코오즈 (glucose), 및 1.5 mg/ml 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin) (BSA)으로 희석시켜 만든다. 이들 용액은 삼투압이 295 에서 310 mOsm 사이이다. 5밀리리터의, 예를 들어, 첫 번째 퍼콜 용액 (밀도 1.096)을 멸균된 15ml 원추형 원심분리 튜브에 첨가시켰다, 2밀리리터의, 예를 들어, 두 번째 퍼콜 용액 (밀도 1.058) 을 밀도가 더 높은 첫 번째 퍼콜 용액 위에 올려놓는다. 2 에서 4밀리리터의 전 혈액을 튜브의 맨 꼭대기에 올려놓는다. 튜브는 250x g로 30분 동안 스윙-아웃 튜브 홀더 (swing-out tube holders) 가 있는 냉장 원심분리기에서 원심분리시킨다. 망상적혈구 및 일부 흰색 세포는 두 개의 퍼콜 층 사이 경계면으로 이동한다. 경계면에 있는 세포는 새로운 튜브로 옮기고 및 5 mM 글루코오즈, 0.03 mM 소듐 아자이드 (sodium azide) 및 1 mg/ml BSA가 있는 인산-완충된 식염수 (phosphate buffered saline) (PBS)로 두 번 세척 한다. 잔여 흰색 혈액 세포는 크기 배제 컬럼으로 PBS에서 크로마토그래피로 제거한다.
다른 한편으로, 망상적혈구는 면역자석 분리 접근 방법을 사용하여 양성적 선택으로 분리한다 ((예를 들어, Brun et al., Blood 76:2397-2403 (1990) 참조)). 이 접근 방법은 성숙 되기 전에 망상적혈구 표면에서 발현되는 트란스페린 수용체의 수가 적혈구에 비해 상대적으로 많은 장점을 이용한다. 트란스페린 수용체에 대한 항체로 코팅된 자석 비드 (Magnetic beads)는 혼합된 혈액 세포 집단으로부터 망상적혈구를 선택적으로 분리하기에 사용될 수 있다. 인간을 포함한 다양한 포유류 종의 트란스페린 수용체에 대한 항체가 상업적 소스로부터 얻을 수 있다 ((예를 들어, 어피니티 바이오리에젼트 (Affinity BioReagents, Golden, Colo., USA); 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, Saint Louis, Mo., USA)). 트란스페린 항체는 직접적으로 자석 비드에 연결될 수 있다. 다른 한편으로, 트란스페린 항체는 2차 항체를 통해 간접적으로 자석 비드에 연결될 수 있다. 예를 들어, 인간 트란스페린에 대한 생쥐 단일크론 항체 10D2 (Affinity BioReagents, Golden, Colo., USA)는 양 의 항-생쥐 면역글로블린 G (sheep anti-mouse immunoglobulin G) (Dynal/Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA)로 코팅된 면역자석 비드와 혼합될 수 있다. 면역자석 비드는 그 후 백혈구-고갈시킨 붉은 혈액 세포 분획과 배양시킨다. 비드와 붉은 혈액 세포는 22 oC 에서 살살 혼합하면서 60-90분 동안 배양하고 이어서 자장 (magnetic field) 을 사용하여 적혈구가 붙어있는 비드를 분리한다. 분리된 망상적혈구는, 예를 들어, 디테치어비드 용액 (DETACHaBEAD solution) ((인비트로젠 (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA 으로부터))을 사용하여 자석 비드로부터 제거할 수 있다. 다른 한편으로, 망상적혈구는 여기서 서술된 방법을 사용하여 CD34+ 조혈 줄기세포 (CD34+ hematopoietic stem cell)의 시험관 내 성장 및 성숙으로부터 분리될 수 있다.
최종-분화된 핵 제거된 적혈구는 이들의 DNA 함량에 근거하여 다른 세포로부터 분리될 수 있다. 제한적이지 않은 실시예시에서, 세포는 먼저 훽스트 33342 (Hoechst 33342) (Invitrogen Corp.)와 같은 생존 염색으로 라벨 한다. 훽스트 33342는 이중-선 DNA에 결합할 때 청색 형광을 방출하는 세포-침투 핵 대조염색 (cell-permeant nuclear counterstain) 이다. 배양에 있는 미분화된 전구 세포, 대식세포 (macrophages) 또는 다른 핵 있는 세포는 훽스트 (Hoechst) 33342에 의해 염색되며, 반면에 핵 제거된 적혈구는 훽스트-음성이다. 훽스트-양성 세포는 형광 활성화된 세포 분류기 또는 다른 세포 분류 기술을 사용하여 핵 제거된 적혈구로부터 분리될 수 있다. 훽스트 염료는 투석 또는 다른 적절한 방법으로 분리된 적혈구로부터 제거될 수 있다.
여기서 서술된 폴리펩티드를 위한 운반체 (Vehicles for polypeptides described herei )
여기에 많은 실시 예들에서, 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 두 개 또는 그 이상) 외부 유래 폴리펩티드는 핵 제거된 적혈구 세포 위에 또는 세포 내에 위치할 수 있는 반면에, 여기서 서술된 어느 폴리펩티드 또는 외부 유래 폴리펩티드 조합은 또한 다른 운반체 (vehicle) 위에 또는 운반체 내에 위치할 수 있다는 것이 이해된다. 운반체는, 예를 들어, 세포, 적혈구 세포, 혈구 (corpuscle), 나노입자 (nanoparticle), 미셀 (micelle), 리포좀 (liposome), 또는 엑소좀 (exosome), 을 포함할 수 있다. 예를 들어, 어떤 관점에서, 현 공개는 예를 들어, 그 표면 위에 여기서 서술된 하나 또는 그 이상의 제제를 포함하는 운반체를 (예를 들어, 세포, 적혈구 세포, 혈구, 나노입자, 미셀, 리포좀, 또는 엑소좀) 제공한다. 어떤 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 제제는 표 1 또는 8-16의 어느 표의 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체, 또는 이들에 대한 항체 분자로부터 선택된 제제를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 운반체는 여기서 서술된 두 개 또는 그 이상의 제제를, 예를 들어, 여기서 서술된 어느 쌍의 제제를, 포함한다.
한 관점에서, 여기서 서술된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드는 비-세포성의 전달 운반체의 표면에 올려놓거나, 부착시키거나 (예를 들어, 고정화 또는 접합시키는), 및/또는 전달 운반체 내에 포함된다. 이 비-세포성의 전달 운반체는, 예를 들어, 나노리피드젤 (nanolipidgel), 폴리머 입자 (polymeric particle), 아가로즈 입자 (agarose particle), 라텍스 입자 (latex particle), 실리카 입자 (silica particle), 리포좀 (liposome), 또는 다층박막 운반체(multilamellar vesicles) 가 될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 비-세포성의 전달 운반체는 약 1nm에서부터 약 900nm 지름의 나노입자를 포함하거나 또는 이로 구성된다. 어떤 실시 예에서, 비-세포성의 전달 운반체는 평균 약 0.1에서부터 약 20마이크론 ((약 0.5 마이크론에서부터 약 10마이크론까지와 같이, 예를 들어, 약 5마이크론 또는 그 이하 (예를 들어, 약 2.5에서 약 5마이크론)) 의 지름을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 비-세포성의 전달 운반체는 평균 지름 약 1μm 에서부터 약 10μm을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 비-세포성의 전달 운반체는 생분해성 폴리머 (biodegradable polymer) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 비-세포성의 전달 운반체는 자연 폴리머를 포함한다. 합성 폴리머를 포함한다. 대표적인 폴리머에는, 이것에만 국한하지 않으나, 폴리(하이드록시 에시드) ((poly(hydroxy acid)), 폴리하이드록시알카노에이트 (polyhydroxyalkanoate), 폴리카프로락톤 ( polycaprolactone), 폴리카보네이트 (polycarbonate), 폴리아마이드 (polyamide), 폴리에스터아마이드 (polyesteramide), 폴리(아크릴아마이드) ((poly(acrylamide)), 폴리(에스터) ((poly(ester)), 폴리(알킬시아노아크릴레이트 ((poly(alkylcyanoacrylates)), 폴리(락틱 에시드) ((poly(lactic acid)) (PLA), 폴리(글라이콜릭 에시드) ((poly(glycolic acids)) (PGA), 및 폴리(D,L-락틱-코-글라이콜릭 에시드) ((poly(D,L-lactic-co-glycolic acid)) (PLGA), 및 이들의 조합을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 비-세포성의 전달 운반체는 아가로즈 (agarose), 라텍스 (latex), 또는 폴리스티렌 (polystyrene) 을 포함한다. 여기서 서술된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드는 이 분야 기술에서 알려진 표준 방법을 사용하여 비-세포성의 전달 운반체에 접합시킬 수 있다 ((예를 들어, Ulbrich et al. (2016) Chem Rev. 116(9): 5338-431, 참조). 접합은 공유 또는 비-공유적일 수 있다. 예를 들어, 비-세포성의 전달 운반체가 리포좀인 실시 예에서, 여기서 서술된 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글라이콜 (polyethylene glycol) (PEG) 체인을 통해 리포좀에 부착시킬 수 있다. 폴리펩티드의 리포좀에의 접합은 또한 예를 들어, 티올 (thiols) 및 말레이미드 (maleimide) 군의 반응에 의한, 티오에스터 결합이 관여될 수 있다. 크로스-연결 제제 (cross-linking agents) 가 폴리펩티드를 비-세포성의 전달 운반체에의 부착시키기 위한 설프하이드릴 (sulfhydryl) 군을 만드는데 사용될 수 있다 (예를 들어, Paszko and Senge (2012) Curr . Med . Chem . 19(31): 5239-77) 참조)). 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함하는 비-세포성의 전달 운반체는 여기서 제공되는 어느 치료적 방법에 사용될 수 있다.
이종형 집단의 세포 (Heterogeneous populations of cells)
여기에 많은 실시 예들에서, 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 두 개 또는 그 이상) 외부 유래 폴리펩티드는 단일 세포 위에 또는 세포 내에 위치할 수 있는 반면에, 여기서 서술된 어느 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 조합은 또한 다수의 세포 위에 위치할 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들어, 어떤 관점에서, 본 공개는 다수의 적혈구 세포를 제공하며, 여기서 다수의 세포 중 첫 번째 세포는 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함하고 및 두 번째 세포는 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 다수의 세포는 여기에서 서술된 두 개 또는 그 이상의 폴리펩티드, 예를 들어, 여기서 서술된 폴리펩티드 어느 쌍을, 포함한다. 어떤 실시 예에서, 집단에 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 또는 1% 이하의 세포는 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 폴리펩티드 둘 다를 포함한다.
막에 캡슐화된 세포 (Cells encapsulated in a membrane)
어떤 실시 예에서, 핵 제거된 적혈구 세포 또는 여기서 서술된 다른 운반체는 막에, 예를 들어 반-투과성 막 (semi-permeable membrane)에, 캡슐화된다. 어떤 실시 예에서, 막은 폴리삭카라이드 (polysaccharide)를, 예를 들어, 음이온적인 폴리삭카라이드 알기네이트 (polysaccharide alginate)를, 포함한다. 어떤 실시 예에서, 반-투과성 막은 세포는 통과하지 못하게 하지만, 작은 분자 또는 거대분자를, 예를 들어, 대사물 (metabolites), 단백질, 또는 DNA 는 통과하게 한다. 어떤 실시 예에서, 막은, 여기서 그 전문이 참고 문헌에 병합된, 리네르트 등에서 ((Lienert et al., "Synthetic biology in mammalian cells: next generation research tools and therapeutics" Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 95-107 (2014)) 서술된 것이다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 어떤 실시 예에서, 막은 세포를 면역 시스템으로부터 보호하고 및/또는 다수의 세포를 인접에서 유지하여 서로 또는 각자의 생산물과의 상호작용을 촉진한다.
적혈구 전구 세포 (적혈구 전구 세포s)
여기서 제공되는 것은 제작된 적혈구 전구 세포, 및 제작된 적혈구 전구 세포, 망상적혈구 및 적혈구를 만드는 방법이다.
다분화능 줄기세포는 적혈구 생성 과정으로 적혈구가 된다. 줄기세포는 작은 림프구같이 보이며 적혈구의 기능적 능력은 결핍되어 있다. 줄기세포는 성숙 된 세포에는 없는, 무한한 분열능력을 갖는다. 줄기세포로부터 나오는 어떤 딸 세포는 몇 세대 및 시간이 지남에 따라 적혈구 특성을 획득한다. 골수에 있는 대부분의 적혈구 세포는 뚜렷한 모양을 가지나 적혈구 계열의 뚜렷한 모양의 특징을 획득하지 않은 세포에서도 적혈구로 성숙 되려는 의지는 보인다. 이 세포들은 시험관 내에서 이들이 형성하는 콜로니의 유형에 의해 인식된다. 두 개의 그러한 세포가 인식된다. 버스트-형성 유닛 적혈구 (Burst-forming unit erythroid) (BFU-E)는 줄기세포로부터 나오며 및 콜로니-형성 유닛 적혈구 (colony-forming unit erythroid (CFU-E)를 생기게 한다. CFU-E는, 뚜렷한 모양을 가진 가장 미성숙한 적혈구 세포인, 전적혈모구 (pronormoblast)를 생기게 한다. BFU-E 및 CFU-E 형태는 골수 세포의 아주 작은 한 부분이다. 형태적으로 다섯 개의 적혈구 전구체들이 라마노브스키 염색 (Romanovsky stains)으로 골수에서 동정 될 수 있다. 가장 미성숙으로부터 가장 성숙 된 다섯 단계는 전적혈모구 (proerythroblast), 호염기성 적혈모구 (basophilic normoblast) 조기 적혈모세포 (early erythroblast), 다염성 적혈모구 (polychromatophilic normoblast) (중기 적혈모구) (intermediate erythroblast), 정상염색성 적혈모구 (orthochromatophilic normoblast) (후기 적혈모구) (late erythroblast) 및 망상적혈구 (reticulocyte)이다.
하기의 표 6은 적혈구 전구 세포 및 적혈구의 형태적 특징을 요약한다.
표 6
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정상 인간 적혈구는, 단핵세포, 혈소판, 및 내피 세포의 부착 분자인 CD36를 발현한다 (van Schravendijk MR et al., Blood. 1992 Oct 15;80(8):2105-14). 따라서, 여떤 실시 예에서, 항-CD36 항체는 인간 적혈구를 동정하는데 사용될 수 있다.
적혈구로 분화될 능력이 있는 이 분야 기술에서 알려진 어느 유형의 세포, 즉, 어느 적혈구 전구 세포는, 여기서 서술된 방법에 따라 제작된 적혈구 전구 세포를 생산하기 위하여 수정될 수 있다. 어떤 특정 실시 예에서, 여기서 서술된 방법에 따라 수정된 적혈구 전구 세포는 적혈구 세포로 분화되는 과정에 있는 세포다, 즉, 포유류 적혈구 생성 동안에 존재한다고 알려진 유형의 세포다. 예를 들어, 세포는 만능 조혈 줄기세포 (pluripotent hematopoietic stem cells) (HSCs) 또는 CD34+ 세포, 다기능 골수 전구 세포 (multipotent myeloid progenitor cells), CFU-S 세포, BFU-E 세포, CFU-E 세포, 전적혈모구 (pronormoblasts) (proerythroblast), 호염기성 적혈모구 (basophilic normoblasts), 다염성 적혈모구 (polychromatophilic normoblasts) 및 정상염색성 적혈모구 (orthochromatophilic normoblasts) 일 수 있다. 여기서 제공된 수정된 적혈구 전구 세포는, 시험관 내에서 이 분야 기술에서 알려진 방법을 사용하여, 즉, 적혈구 생성을 촉진한다고 알려진 분자, 예를 들어, 하기에 서술된 SCF, 에리스로포에틴 (Erythropoietin), IL-3, 및/또는 GM-CSF를 사용하여, 제작된 망상적혈구 또는 적혈구로 분화될 수 있다. 다른 한편으로, 수정된 적혈구 전구 세포는 본 발명의 조성물로 제공되며, 및 생체 내로 개체에 투여되었을 때 적혈구로 분화될 능력이 있다.
어떤 실시 예에서, 적혈구 전구 세포는, 예를 들어, 조혈 줄기세포는, O-음성 공여자로부터이다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 전구 세포는 A 및/또는 B 항원이 결핍되어 (예를 들어, 발현 또는 암화화 되지 않는) 있다.
배양 (Culturing)
여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위한 재료 (source) 에는 순환하는 적혈구 세포가 포함된다. 적절한 세포 재료는 개체로부터 여기서 서술된 대로 환자-유래 조혈 또는 적혈구 전구 세포로부터 분리될 수 있으며, 불멸 화 된 적혈구 세포주로부터 유래하거나, 또는 유도된 만능 줄기세포로부터 유래할 수 있거나, 선택적으로 배양 및 분화시킬 수 있다. 세포 배양 기술을 사용하여 적혈구를 생성하는 방법들은 이 분야 기술에서 잘 알려졌다, 예를 들어, 기아라타나 등 (Giarratana et al., Blood 2011, 118:5071, Huang et al., Mol Ther 2013, epub ahead of print September 3, 또는 Kurita et al., PLOS One 2013, 8:e59890). 프로토콜은 성장 인자, 시작하는 세포주, 배양 기간, 및 결과로 얻어지는 세포가 특징지어지는 형태적 특성에 따라 다양하다. 배양 시스템은 또한 공급자 수혈을 대체할 수 있는 혈액 생산을 위해 확립되었다 (Fibach et al. 1989 Blood 73:100). 최근에, CD34+ 세포는 망상적혈구 단계로 분화되고, 이어서 인간 개체로 성공적으로 수혈되었다 (Giarratana et al., Blood 2011, 118:5071).
여기서 적혈구 세포 및 제작된 적혈구 세포를 배양하는 방법이 제공된다. 적혈구 세포는, 예를 들어, CD34+ 조혈 전구 세포를 포함하는, 조혈 전구 세포로부터 (Giarratana et al., Blood 2011, 118:5071), 유도된 만능 줄기세포 (Kurita et al., PLOS One 2013, 8:e59890)로부터, 및 배아 줄기세포로부터 (Kurita et al., PLOS One 2013, 8:e59890) 배양될 수 있다. 전구 세포를 확장하고 및 분화시키기에 적절한 성장 및 분화 인자들의 칵테일 (cocktails)은 이 분야 기술에서 알려졌다. 적절한 확장 및 분화 인자들의 예들에는, 이것에만 국한하지 않으나, 줄기세포 인자 (stem cell factor) (SCF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12와 같은 인터루킨 (IL), CSF, G-CSF, 트롬보포에틴 (thrombopoietin) (TPO), GM-CSF, 에리스로포에틴 (erythropoietin) (EPO), Flt3, Flt2, PIXY 321, 및 백혈병 억제 인자 (leukemia inhibitory factor) (LIF)가 포함된다.
적혈구 세포는 CD34+ 세포와 같은 조혈 전구 세포로부터, 전구 세포를 정해진 인자들과 다-단계 배양과정에서 접촉시켜 배양시킬 수 있다. 예를 들어, 적혈구 세포는 조혈 전구세포로부터 3-단계 과정에서 배양될 수 있다.
첫 번째 단계는 세포를 배양에서 1-1000 ng/mL의 줄기세포 인자 (stem cell factor) (SCF), 1-100 U/mL의 에리스토포에틴 (erythropoietin) (EPO), 및 0.1-100 ng/mL의 인터루킨-3 (interleukin-3) (IL-3)로 접촉을 포함할 수 있다. 첫 번째 단계는 선택적으로 세포를 배양에서, 예를 들어, 글루코코르티코이드 수용체 (glucocorticoid receptor), 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor), 프로제스테론 수용체 (progesterone receptor), 안드로겐 수용체 (androgen receptor), 또는 프레그난 X 수용체 (pregnane x receptor) 와 같은 뉴클레어 호르몬 수용체 (nuclear hormone receptor)에 결합하고 및 활성화 시키는 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 수용체들을 위한 리간드에는, 예시로서, 예를 들어 10 nM-100 μM의 덱사메타손 (dexamethasone) 또는 10 nM-100μM의 하이드로코티손 (hydrocortisone) 과 같은 코르티코스테로이드 (corticosteroid); 예를 들어, 10 nM-100μM의 베타-에스트라디올 (beta-estradiol)과 같은 에스트로겐 (estrogen); 예를 들어, 10 nM-100μM의 프로제스테론 (progesterone), 10 nM-100μM의 하이드록시프로제스테론 (hydroxyprogesterone), 10 nM-100μM의 5a-디하이드프로제스테론 (5a-dihydroprogesterone), 10 nM-100μM의 11-데옥시코르티코스테론 (11-deoxycorticosterone)과 같은 프로제스토겐 (progestogen), 또는 예를 들어, 10 nM-100μM의 클로르마디논 아세테이트 (chlormadinone acetate)와 같은 합성 프로제스틴 (progestin); 예를 들어, 10 nM-100μM의 테스토스테론 (testosterone), 10 nM-100μM의 디하이드로테스토스테론 (dihydrotestosterone) 또는 10 nM-100μM의 안드로스테네디온 (androstenedione)과 같은 안드로젠 (androgen); 또는 예를 들어, 10 nM-100μM의 리팜피신 (rifampicin), 10 nM-100μM의 하이퍼포린 (hyperforin), 10 nM-100μM의 성 존스 와트(St. John's Wort) (하이퍼리신) (hypericin), 또는 10 nM-100μM의 토코페롤 (tocopherol)과 같은 비타민 E-유사 분자와 같은 프레그난 x 수용체 리간드 (pregnane x receptor ligand) 가 포함된다. 첫 번째 단계는 또한 선택적으로 배양에서 세포가, 1-50 μ g/mL의 인슐린, 1-50μg/mL의 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1), 1-50μg/mL의 인슐린-유사 성장 인자 2 (insulin-like growth factor 2) (IGF-2), 또는 1-50μg/mL의 메카노-성장인자 (mechano-growth factor)와 같은 인슐린-유사 분자와 접촉하게 함을 포함할 수 있다. 첫 번째 단계는 더 나아가 선택적으로 세포를 배양에서 0.1-5 mg/mL의 트란스페린 (transferrin) 과 접촉하게 함을 포함할 수 있다.
첫 번째 단계는 선택적으로 세포가 배양에서 IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, 과립 세포-콜로니-자극 인자 (granulocyte colony-stimulating factor) (G-CSF), 대식세포 콜로니-자극 인자 (macrophage colony-stimulating factor) (M-CSF), 과립 세포-대식세포 콜로니-자극 인자 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) (GM-CSF), 트롬보포에틴 ( thrombopoietin), 섬유아세포 성장인자 (fibroblast growth factor) (FGF), 혈소판 -유래 성장인자 (platelet-derived growth factor) (PDGF), 형질전환 성장 인자 베타 (transforming growth factor beta) (TGF-B), 종양 괴사 인자 알파 (tumor necrosis factor alpha) (TNF-A), 거핵구 성장 및 발달 인자 (megakaryocyte growth and development factor) (MGDF), 백혈병 억제 인자 (leukemia inhibitory factor) (LIF), 및 Flt3 리간드와 같은 하나 또는 그 이상의 인터루킨 (IL) 또는 성장 인자들과 접촉하는 것을 포함할 수 있다. 각 인터루킨 또는 성장인자는 전형적으로 0.1-100 ng/mL의 농도로 공급될 수 있다. 첫 번째 단계는 또한 선택적으로 세포가 배양에서, 예를 들어, 태아 소 혈청 (fetal bovine serum) (1-20%), 인간 혈장 (human plasma) (1-20%), 플라스마네이트 (plasmanate) (1-20%), 인간 혈청 (human serum) (1-20%), 알부민 (albumin) (0.1-100 mg/mL), 또는 헤파린 (heparin) (0.1-10 U/mL) 과 같은 혈청 단백질 또는 비-단백질 분자와 접촉하는 것을 포함할 수 있다.
두 번째 단계는 세포가 배양에서 1-1000 ng/mL의 줄기세포 인자 (stem cell factor) (SCF) 및 1-100 U/mL의 에리스로포에틴 (erythropoietin) (EPO)와 접촉함을 포함할 수 있다. 두 번째 단계는 또한 선택적으로 세포가 배양에서 예를 들어, 1-50 μg/mL의 인슐린, 1-50μg/mL의 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 2 (IGF-1), 인슐린-유사 성장 인자 2 (insulin-like growth factor 2 (IGF-2), 또는 1-50μg/mL의 메카노-성장인자 (mechano-growth factor)와 같은 인슐린-유사 분자와 접촉하게 함을 포함할 수 있다. 두 번째 단계는 더 나아가 선택적으로 세포를 배양에서 0.1-5 mg/mL의 트란스페린 (transferrin) 과 접촉하게 함을 포함할 수 있다. 두 번째는 또한 선택적으로 세포가 배양에서, 예를 들어, 태아 소 혈청 (fetal bovine serum) (1-20%), 인간 혈장 (human plasma) (1-20%), 플라스마네이트 (plasmanate) (1-20%), 인간 혈청 (human serum) (1-20%), 알부민 (albumin) (0.1-100 mg/mL), 또는 헤파린 (heparin) (0.1-10 U/mL) 과 같은 혈청 단백질 또는 비-단백질 분자와 접촉하는 것을 포함할 수 있다.
세 번째 단계는 세포를 배양에서 1-100 U/mL의 에리스로포에틴 (erythropoietin) (EPO)과 접촉하는 것을 포함할 수 있다. 세 번째 단계는 선택적으로 세포가 배양에서 1-1000 ng/mL의 줄기세포 인자 (stem cell factor) (SCF) 와 접촉하는 것을 포함할 수 있다. 세 번째 단계는 더 나아가 선택적으로 세포가 배양에서 예를 들어, 1-50 μg/mL의 인슐린, 1-50μg/mL의 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 2 (IGF-1), 인슐린-유사 성장 인자 2 (insulin-like growth factor 2 (IGF-2), 또는 1-50μg/mL의 메카노-성장인자 (mechano-growth factor) 와 같은 인슐린-유사 분자와 접촉하게 함을 포함할 수 있다. 세 번째 단계는 또한, 선택적으로 세포를 배양에서 0.1-5 mg/mL의 트란스페린 (transferrin) 과 접촉하게 함을 포함할 수 있다. 세 번째 단계는 또한 선택적으로 세포를 배양에서 예를 들어, 태아 소 혈청 (fetal bovine serum) (1-20%), 인간 혈장 (human plasma) (1-20%), 플라스마네이트 (plasmanate) (1-20%), 인간 혈청 (human serum) (1-20%), 알부민 (albumin) (0.1-100 mg/mL), 또는 헤파린 (heparin) (0.1-10 U/mL) 과 같은 혈청 단백질 또는 비-단백질 분자와 접촉하는 것을 포함할 수 있다.
어떤 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 폴리펩티드를 제시하는 핵 제거된 세포를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 확장 및 분화의 방법은, 제작된 적혈구 세포를 척수증식성 수용체 (myeloproliferative receptor) (mpl) 리간드를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하지 않는다.
배양 과정은 선택적으로 세포를 이 분야 기술에서 알려진 방법으로 예를 들어, DNA 분자, RNA 분자, mRNA, siRNA, 마이크로RNA (microRNA), lncRNA, shRNA, 호르몬, 또는 하나 또는 그 이상의 유전자를 활성화하거나 또는 넉-다운 (knocks down) 시키는, 작은 분자와 같은 분자와 접촉하게 함을 포함할 수 있다. 타겟 유전자는, 예를 들어, 전사 인자 (transcription factor), 성장 인자 (growth factor), 또는 이것에만 국한하지 않으나, 예를 들어, GATA1, GATA2, CMyc, hTERT, p53, EPO, SCF, insulin, EPO-R, SCF-R, 트란스페린-R (transferrin-R), 인슐린-R (insulin-R) 을 포함하는 성장 인자 수용체 (growth factor receptor) 를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다.
어떤 실시 예에서, CD34+ 세포는 다양한 양의 IMDM, FBS, 글루타민 (glutamine), BSA, 홀로트란스페린 (holotransferrin), 인슐린 (insulin), 덱사메타손 (dexamethasone), β-에스트라디올 (β-estradiol), IL-3, SCF, 및 에리스로포에틴 (erythropoietin) 을 포함하는 배양액에, 세 개의 분리된 분화 단계로 총 22일 동안 둔다.
어떤 실시 예에서, CD34+ 세포는 다양한 양의 IMDM, FBS, 글루타민 (glutamine), BSA, 홀로트란스페린 (holotransferrin), 인슐린 (insulin), 덱사메타손 (dexamethasone), 베타-에스트라디올 (beta-estradiol), IL-3, SCF, 및 트롬보포에틴 (thrombopoietin) 을 포함하는 배양액에, 세 개의 분리된 분화 단계로 총 14일 동안 둔다.
어떤 실시 예에서, CD34+ 세포는 다양한 양의 IMDM, FBS, 글루타민 (glutamine), BSA, 홀로트란스페린 (holotransferrin), 인슐린 (insulin), 덱사메타손 (dexamethasone), 베타-에스트라디올 (beta-estradiol), IL-3, SCF, 및 GCSF를 포함하는 배양액에, 세 개의 분리된 분화 단계로 총 15일 동안 둔다.
어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 적어도 100, 1000, 2000, 5000, 10,000, 20,000, 50,000, 또는 100,000배 (및 선택적으로 100,000, 200,000, 또는 500,000배까지) 확장된다. 세포의 수는, 어떤 실시 예에서, 자동 세포 카운터 (automated cell counter) 를 사용하여 측정한다.
어떤 실시 예에서, 적혈구 세포 집단은 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 98% (및 선택적으로 약 80, 90, 또는 100%까지) 의 제작된 적혈구 세포를 포함한다. 핵 제거는, 어떤 실시 예에서, 핵 염색을 사용하여 FACS로 측정된다. 어떤 실시 예에서, 집단에서 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80% (및 선택적으로 약 70, 80, 90, 또는 100%까지) 의 적혈구 세포가 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 그 이상의) 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 발현은, 어떤 실시 예에서, 폴리펩티드에 대한 라벨 된 항체를 사용하여 적혈구 세포로 측정된다. 어떤 실시 예에서, 적어도 집단에서 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 또는 80% (및 선택적으로 약 70, 80, 90, 또는 100%까지) 의 적혈구 세포가 핵 제거되고 및 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 그 이상의) 외부 유래 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 적혈구 세포 집단은 약 1x109 - 2x109, 2x109 - 5x109, 5x109 - 1x1010, 1x1010 - 2x1010, 2x1010 - 5x1010, 5x1010 - 1x1011, 1x1011 - 2x1011, 2x1011 - 5x1011, 5x1011 - 1x1012, 1x1012 - 2x1012, 2x1012 - 5x1012, 또는 5x1012 - 1x1013 의 세포를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 배양하는 동안에, 시험관 내에서, 적혈구 전구 세포가, 예를 들어, 조혈 줄기세포가, 단지 부분적으로만 분화되고, 더 나아간 분화, 예를 들어, 망상적혈구 또는 완전히 성숙 된 적혈구로의 분화는, 개체로 도입될 때 생체 내에서 일어나도록 하는 것이 바람직하다 (예를 들어, Neildez-Nguyen et al., Nature Biotech. 20:467-472 (2002) 참조)). 본 발명의 여러 실시 예에서, 시험관 내 성숙 및/또는 분화는 바람직한 어느 단계에서 멈추게 (arrest) 할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 분리된 CD34+ 조혈 줄기세포는 여기 다른 곳에서 서술된 대로, 시험관 내에서, 예를 들어, 한 예로 인터루킨 3 (interleukin 3), Flt3 리간드, 줄기세포 인자 (stem cell factor), 트롬보포에틴 (thrombopoietin), 에리스로포에틴 (erythropoietin), 트란스페린 (transferrin), 및 인슐린 성장 인자 (insulin growth factor)를 포함하는 다양한 인자들을 함유하는 배지에서, 바람직한 단계의 분화에 도달할 때까지, 확장시킬 수 있다. 결과로 얻어진 제작된 적혈구 세포는 CD36 및 GPA의 표면 발현, 및 특정한 바람직한 세포 유형에 특이적인 다른 특징으로 성질 규명이 될 수 있으며, 및 성숙 된 적혈구로 최종 분화가 일어나도록 하는 개체에게 수혈될 수 있다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적혈구 전구 세포로부터 핵 제거는 포함하지 않는 핵 제거 전까지 만의 성숙의 어느 단계까지 부분적으로 확장되며, 및 그러므로 핵 있는 세포로, 예를 들어, 적혈구 전구 세포로 남아 있다. 어떤 특정 실시 예에서, 결과로 얻어진 세포는 핵 있는 세포이고 및 적혈구 혈통은 제한된다. 어떤 특정 실시 예에서, 결과로 얻어진 세포는 다기능 골수 전구 세포 (multipotent myeloid progenitor cells), CFU-S 세포, BFU-E 세포, CFU-E세포, 전적혈모구 (pronormoblasts) (proerythroblast), 호염기성 적혈모구(basophilic normoblasts), 다염성 적혈모구 (polychromatophilic normoblasts) 및 정상염색성 적혈모구 (orthochromatophilic normoblasts)로부터 선택된다. 핵 제거를 포함하는, 최종 분화 단계는, 제작된 적혈구 세포를 개체에게 투여한 후에만 일어난다, 즉, 그러한 실시 예에서, 핵 제거 단계는 생체 내에서 일어난다. 다른 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는, 시험관 내에서, 핵 제거 단계까지 확장되고 및 분화되어, 예를 들어, 망상적혈구가 된다. 제작된 적혈구 세포가 망상적혈구 단계까지 분화된 그러한 실시 예에서, 적혈구로 되는 최종 분화 단계는 제작된 적혈구 세포를 개체에 투여한 후에만 일어난다, 즉, 최종 분화 단계는 생체 내에서 일어난다. 다른 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 시험관 내에서 최종 분화 단계까지 확장 및 분화되어 적혈구가 된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적혈구 전구 세포로부터, 예를 들어, 조혈 줄기세포로부터, 확장 및 분화되어, 예를 들어, 혈소판이 되는 것과 같은, 다른 계통의 조혈 세포가 된다는 것이 더 나아가 인식될 것이다. 혈소판과 같은, 다양한 계통의 조혈 세포의 성숙 및 분화의 방법들은 이 분야 기술의 전문가에게는 잘 알려졌다. 여기서 서술된 대로 외부 유래 폴리펩티드를 발현하는 그러한 제작된 혈소판은 현 발명에 의해 포함되는 것으로 간주 된다.
상기 관점 및 실시 예들의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 상기 관점 및 실시 예들의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적혈구 전구 세포로부터, 예를 들어, 조혈 줄기세포로부터, 확장 및 분화되어, 예를 들어, 혈소판이 되는 것과 같은, 다른 계통의 조혈 세포가 된다는 것이 더 나아가 인식될 것이다. 혈소판과 같은, 다양한 계통의 조혈 세포의 성숙 및 분화의 방법들은 이 분야 기술의 전문가에게는 잘 알려졌다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 대로 외부 유래 폴리펩티드를 발현하는 그러한 제작된 혈소판은 현 발명에 의해 포함되는 것으로 간주 된다.
상기 관점 및 실시 예들의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 상기 관점 및 실시 예들의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
어떤 실시 예에서, 여기서 제공된 핵 제거된 세포는 혈소판 (platelet) 이다. 시험관 내에서 혈소판을 제조하는 방법은 이 분야 기술에서 잘 알려졌다 (예를 들어, Wang and Zheng (2016) Springerplus 5(1): 787, 및 U.S. Patent No. 9,574,178) 참조)). 외부 유래 폴리펩티드를 포함하는 혈소판 제조 방법들이, 예를 들어, 각각의 전문이 참고문헌으로 병합되어 있는, 국제 특허 출원 발행번호 WO2015/073587 및 WO2015/153102 (International Patent Application Publication Nos. WO2015/073587 및 WO2015/153102) 에 서술되어 있다. 혈소판 생산은 트롬보포에틴 (thrombopoietin) (TPO) 및 이의 세포 수용체인 TPOR/MPUc-MPL 사이의 상호작용에 의해 유도되는 신호전달 기전에 의해 일부 조절된다. 추가로, 다수의 사이토카인이 ((예를 들어, 줄기세포 인자 (stem cell factor) (SCF), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, 백혈병 억제 인자 (leukemia inhibiting factor) (LIF), G-CSF, GM-CSF, M-CSF, 에리스로포에틴 (erythropoietin) (EPO), kit 리간드, 및 인터페론(interferon)) 혈소판 생성 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다.
어떤 실시 예에서, 혈소판은, CD34+ 조혈 줄기세포, 유도된 만능 줄기세포 또는 배아 줄기세포와 같은 조혈 전구 세포로부터 생성된다. 어떤 실시 예에서, 혈소판은 다-단계 배양 과정에서 전구 세포를 정해진 인자들과의 접촉에 의해 생산된다. 어떤 실시 예에서, 다-단계 배양 과정은: 조혈 전구 세포 집단을 거대핵 전구 세포 집단을 생산하기에 적절한 조건하에서 배양, 및 거대핵 전구 세포 집단을 혈소판 생성이 적절한 조건하에서 배양하는 것을 포함한다. 전구 세포를 확장하고 및 분화시키고 및 혈소판을 생성하기에 적절한 성장 및 분화 인자들의 칵테일 (Cocktail)은 이 분야 기술에서 알려졌다. 적절한 확장 및 분화 인자의 예에는, 이것에만 국한하지 않으나, 줄기세포 인자 (stem cell factor) (SCF), Flt-3/Flk-2 리간드 (FL), TPO, IL-11, IL-3, IL-6, 및 IL-9가 포함된다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, 혈소판은 CD34+ HSCs를 무-혈청 배지에 2-4 x 104 세포/mL로 접종하고, 및 배양 4일째 날에 동일 부피의 배지를 첨가하여 배지는 신선하게 한다. 배양 6일째 날에, 세포를 세고 및 분석한다: 5 x 105 세포를 세척하고 및 TPO (30 ng/mL), SCF (1 ng/mL), IL-6 (7.5 ng/mL), 및 IL-9 (13.5 ng/mL)를 포함하는 사이토카인 칵테일로 보충된 1ml의 같은 배지에 넣고 거대핵 세포로 분화를 유도한다. 배양 10일째 날에, 약 1/4 에서 약 1/2의 현탁 배양을 새로운 배지로 대체한다. 세포는 습기 있는 대기 10% CO2), 39o C에서 처음 6일 동안 배양하고, 및 37o C에서 마지막 8일 동안 배양한다. 생존한 핵 있는 세포는 트리판 불루 (trypan blue)로 염색 후 혈구 계산기 (hemocytometer)로 센다. 배양액에서의 혈소판의 분화 상태는 유동세포 분석 (flow cytometry) 또는 여기 참고 문헌으로 병합된, 국제 특허 출원 발행번호 WO2015/073587에 있는 실시예시 44 및 45에 서술된 정량적 PCR로 평가된다.
다른 특징들 (Other characteristics)
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 (예를 들어, 제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포, 또는 제작된 적혈구 세포 또는 제작된 핵 제거된 세포 집단은 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 모두의) 내부 유래 GPA (endogenous GPA) (C235a), 트란스페린 수용체 (transferrin receptor) (CD71), 밴드 3 (Band 3) (CD233), 또는 인테그린 알파4 (integrin alpha4) (C49d)를 포함한다. 이 단백질들은, 여기 그 전문이 참고 문헌으로 병합된, 국제 출원 발행 번호 WO2018/009838 (International Application Publication No. WO2018/009838)의 실시 예시 10에 서술된 대로, 측정될 수 있다. GPA-양성 세포 및 밴드 3-양성 세포의 퍼센트는 적혈구 세포 성숙 동안에 전형적으로 증가하고, 및 인테그린 알파4-양성의 퍼센트는 전형적으로 성숙 되는 내내 높게 남아있다.
어떤 실시 예에서, 적혈구 세포 집단은 GPA 양성이 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% (및 선택적으로 90 또는 100%까지)인 세포를 포함한다. GPA의 존재는, 어떤 실시 예에서, FACS를 사용하여 검출된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 적어도 약 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% GPA+ (즉, CD235a+) 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 약 55%에서 약 100% 사이의 (예를 들어, 약 60%로부터 약 100%, 약 65%로부터 약 100%, 약 70%로부터 약 100%, 약 75%로부터 약 100%까지, 약 80%로부터 약 100%까지, 약 85%로부터 약 100%까지, 약 90%로부터 약 100%까지, 약 95%로부터 약 100%까지, 약 75%로부터 약 99%까지, 약 80%로부터 약 99%까지, 약 85%로부터 약 99%까지, 약 90%로부터 약 99%까지, 약 95%로부터 약 99%까지, 약 75%로부터 약 95%까지, 약 80%로부터 약 95%까지, 약 85%로부터 약 95%까지, 약 90%로부터 약 95%까지, 약 95%로부터 약 98%까지) GPA+ 세포를 포함한다. GPA의 존재는, 어떤 실시 예에서, FACS를 사용하여 검출된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 적어도 약 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% CD71+ 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 약 70%에서 약 100% 사이의 (예를 들어, 약 75%로부터 약 100%까지, 약 80%로부터 약 100%까지, 약 85%로부터 약 100%까지, 약 90%로부터 약 100%까지, 약 95%로부터 약 100%까지, 약 75%로부터 약 99%까지, 약 80%로부터 약 99%까지, 약 85%로부터 약 99%까지, 약 90%로부터 약 99%까지, 약 95%로부터 약 99%까지, 약 75%로부터 약 95%까지, 약 80%로부터 약 95%까지, 약 85%로부터 약 95%까지, 약 90%로부터 약 95%까지, 약 95%로부터 약 98%까지) CD71+ 세포를 포함한다. CD71 (트란스페린 수용체) (transferrin receptor)의 존재는, 어떤 실시 예에서, FACS를 사용하여 검출된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 적어도 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% CD233+ 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 약 70%에서 약 100% 사이 (예를 들어, 약 75%로부터 약 100%까지, 약 80%로부터 약 100%까지, 약 85%로부터 약 100%까지, 약 90%로부터 약 100%까지, 약 95%로부터 약 100% 까지, 약 75%로부터 약 99%까지, 약 80%로부터 약 99%까지, 약 85%로부터 약 99%까지, 약 90%로부터 약 99%까지, 약 95%로부터 약 99%까지, 약 75%로부터 약 95%까지, 약 80%로부터 약 95%까지, 약 85%로부터 약 95%까지, 약 90%부터 약 95%까지, 약 95%로부터 약 98%까지) CD233+ 세포를 포함한다. CD233 (밴드 3) 의 존재는, 어떤 실시 예에서, FACS를 사용하여 검출된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 적어도 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% CD47+ 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 약 70%에서 약 100% 사이의 (예를 들어, 약 75%로부터 약 100%까지, 약 80%로부터 약 100%까지, 약 85%로부터 약 100%까지, 약 90%로부터 약 100%까지, 약 95%로부터 약 100%까지, 약 75%로부터 약 99%까지, 약 80%로부터 약 99%까지, 약 85%로부터 약 99%까지, 약 90%로부터 약 99%까지, 약 95%로부터 약 99%까지, 약 75%로부터 약 95%까지, 약 80%로부터 약 95%까지, 약 85%로부터 약 95%까지, 약 90%부터 약 95%까지, 약 95%로부터 약 98%까지) CD47+ 세포를 포함한다. CD47 (인테그린 연관 단백질) (integrin associate protein)의 존재는, 어떤 실시 예에서, FACS를 사용하여 검출된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 적어도 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% CD36- (CD36-음성) 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 약 70%에서 약 100% 사이의 (예를 들어, 약 75%로부터 약 100%까지, 약 80%로부터 약 100%까지, 약 85%로부터 약 100%까지, 약 90%로부터 약 100%까지, 약 95%로부터 약 100%까지, 약 75%로부터 약 99%까지, 약 80%로부터 약 99%까지, 약 85%로부터 약 99%까지, 약 90%로부터 약 99%까지, 약 95%로부터 약 99%까지, 약 75%로부터 약 95%까지, 약 80%로부터 약 95%까지, 약 85%로부터 약 95%까지, 약 90%부터 약 95%까지, 약 95%로부터 약 98%까지) CD36- (CD36-음성) 세포를 포함한다. CD36의 존재는, 어떤 실시 예에서, FACS를 사용하여 검출된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 적어도 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% CD34- (CD34-음성) 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 약 70%에서 약 100% 사이의 (예를 들어, 약 75%로부터 약 100%까지, 약 80%로부터 약 100%까지, 약 85%로부터 약 100%까지, 약 90%로부터 약 100%까지, 약 95%로부터 약 100%까지, 약 75%로부터 약 99%까지, 약 80%로부터 약 99%까지, 약 85%로부터 약 99%까지, 약 90%로부터 약 99%까지, 약 95%로부터 약 99%까지, 약 75%로부터 약 95%까지, 약 80%로부터 약 95%까지, 약 85%로부터 약 95%까지, 약 90%부터 약 95%까지, 약 95%로부터 약 98%까지) CD34- (CD34-음성) 세포를 포함한다. CD34의 존재는, 어떤 실시 예에서, FACS를 사용하여 검출된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 적어도 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% CD235a+/CD47+/CD233+ 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 약 70%에서 약 100% 사이의 (예를 들어, 약 75%로부터 약 100%까지, 약 80%로부터 약 100%까지, 약 85%로부터 약 100%까지, 약 90%로부터 약 100%까지, 약 95%로부터 약 100%까지, 약 75%로부터 약 99%까지, 약 80%로부터 약 99%까지, 약 85%로부터 약 99%까지, 약 90%로부터 약 99%까지, 약 95%로부터 약 99%까지, 약 75%로부터 약 95%까지, 약 80%로부터 약 95%까지, 약 85%로부터 약 95%까지, 약 90%부터 약 95%까지, 약 95%로부터 약 98%까지) CD235a+/CD47+/CD233+ 세포를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 적어도 50%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% CD235a+/CD47+/CD233+/ CD34-/CD36- 세포를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 약 70%에서 약 100% 사이의 (예를 들어, 약 75%로부터 약 100%까지, 약 80%로부터 약 100%까지, 약 85%로부터 약 100%까지, 약 90%로부터 약 100%까지, 약 95%로부터 약 100%까지, 약 75%로부터 약 99%까지, 약 80%로부터 약 99%까지, 약 85%로부터 약 99%까지, 약 90%로부터 약 99%까지, 약 95%로부터 약 99%까지, 약 75%로부터 약 95%까지, 약 80%로부터 약 95%까지, 약 85%로부터 약 95%까지, 약 90%부터 약 95%까지, 약 95%로부터 약 98%까지) CD235a+/CD47+/CD233+/ CD34-/CD36- 세포를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 적혈구를 포함하는 제작된 핵 제거된 세포는 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하의 유극세포 (echinocytes)를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 적혈구 세포를 포함하는 제작된 적혈구 세포 집단은 (예를 들어, 여기서 서술된 대로 인공 항원을 제시하는 세포) 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하의 유극세포 (echinocytes)를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포 집단 (제작된 핵 제거된 적혈구 세포) 또는 제작된 핵 제거된 세포는 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하의 피레노사이트 (pyrenocytes)를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 적혈구 세포는 핵 제거된다. 예를 들어, 여기서 서술된 치료적 제제로서 사용되는 적혈구 세포를 포함하는 세포 집단은 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 핵 제거된다. 어떤 실시 예에서, 세포, 예를 들어, 적혈구 세포 (erythroid cell), 비-기능적인, 예를 들어, 불활성화된, 핵을 함유한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
외부 유래 자극 폴리펩티드의 발현 (Expression of 외부 유래 자극 폴리펩티드)
어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 (erythroid cells), 예를 들어, 핵 제거된 세포는, 적절한 분리된 세포를, 예를 들어, 적혈구 세포( erythroid cell), 망상적혈구 (reticulocyte), 적혈구 전구 세포 (적혈구 전구 세포), 혈소판 (platelet), 또는 혈소판 전구 세포 (platelet precursor)를, 본 공개의 자극 폴리펩티드를 ((예를 들어, IL-1, IL-2, IL-12, IL-15, IL-15/IL-15RA 융합, IL-18, IL-21, IFNα, 4-1BBL, MICA, MICB, PVR/CD155, CD48, HLA-A, HLA-C, HLA-G, HS, HLA-E, CpG, IgG, ULBP, MIC, B7-H6, NkP44L, 넥틴 2 (nectin2), NTBA, AICL 및 IGF-1)) 암호화하는 외부 유래 핵산과 접촉시켜 생성된다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 DNA에 의해 암호화되며, 이는 핵 있는 적혈구 전구 세포 또는 핵 있는 혈소판 전구 세포와 접촉된다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 RNA에 의해 암호화되며, 이는 혈소판, 핵 있는 적혈구 세포, 핵 있는 혈소판 전구 세포, 또는 망상적혈구와 접촉된다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 폴리펩티드는 일차 혈소판 (primary platelet), 핵 있는 적혈구 전구 세포, 핵 있는 혈소판 전구 세포, 망상적혈구, 또는 적혈구와 접촉된다.
외부 유래 자극 폴리펩티드는 전기천공법, 화학적 또는 중합적 형질도입 (chemical or polymeric transfection), 바이러스 형질도입, 기계적인 막 교란, 또는 다른 방법 의해 적혈구 세포에 도입된 이식유전자 (transgene) 로부터 발현될 수 있거나; 세포에 전기천공법, 화학적 또는 중합적 형질도입 (chemical or polymeric transfection), 바이러스 형질도입, 기계적인 막 교란, 또는 다른 방법 의해 도입된 mRNA로부터 발현되는 외부 유래 폴리펩티드: 예를 들어, 전사 활성 인자, 전사 억제자, 또는 분비 경로 증강인자인 외부 인자를 도입시켜 자연적 부위로부터 과-발현된 외부 유래 폴리펩티드; 및/또는 생산 세포 또는 다른 외부 시스템으로부터 합성, 추출, 또는 생산되고 및 적혈구로 병합된 폴리펩티드.
외부 유래 자극 폴리펩티드는 ((예를 들어, IL-1, IL-2, IL-12, IL-15, IL-15/IL-15RA fusion, IL-18, IL-21, IFNα, 4-1BBL, MICA, MICB, PVR/CD155, CD48, HLA-A, HLA-C, HLA-G, HS, HLA-E, CpG, IgG, ULBP, MIC, B7-H6, NkP44L, 렉틴2 (Nectin2), NTBA, AICL 및 IGF-1)) 단일 또는 다수 카피의 유전자를 형질주입 (transfection), 바이러스로 형질도입 (trnasduction), 또는 DNA 또는 RNA 존재 하에 전기천공 (electroporation) 으로 도입시킬 수 있다. 포유류 세포에서 외부 유래 단백질을 발현하는 방법은 이 분야 기술에서 잘 알려졌다. 예를 들어, 외부 유래 인자 IX의 조혈 세포 (hematopoietic cell) 에서의 발현은 CD34+ 전구 세포의 바이러스성 형질도입에 의해 유도된다, 장 등 (Chang et al., Nat Biotechnol 2006, 24:1017) 참조.
어떤 실시 예에서, 하나 이상의 자극 폴리펩티드 (예를 들어, 두 개 또는 그 이상) 가 있을 때, 자극 폴리펩티드들은 단일 핵산에, 예를 들어, 단일 벡터에, 암호화된다. 실시 예에서, 단일 벡터는 각 유전자에 대해 분리된 프로모터를 가지며, 중간에 프로테아제 분열 부위를 가진 단일 폴리펩티드로 초기에 전사되는 두 개의 단백질을 가지며, 그러므로 이어지는 단백질 분해 과정에서 두 개의 단백질이 나오거나, 또는 어느 다른 적절한 형태로 된다. 어떤 실시 예에서, 두 개 또는 그 이상의 폴리펩티드는 두 개 또는 그 이상의 핵산에서 암호화된다, 예를 들어, 각 벡터는 폴리펩티드들 중 하나를 암호화한다.
DNA 발현 벡터와 같은 핵산 또는 외부 유래 폴리펩티드 생산을 위한 mRNA는 여기서 서술된 외부 유래 폴리펩티드 생산에 적합한 전구 세포로 (예를 들어, 적혈구 전구 세포 또는 혈소판 전구 세포 및 이와 같은 것) 도입될 수 있다. 전구 세포는 원천 소스로부터 분리하거나 또는 여기서 제공된 통상의 재조합 기술을 통하여 확장된 전구 세포 집단으로부터 얻을 수 있다. 어떤 경우에, 발현 벡터는 이들이 상동성 재조합에 의하거나 또는 이 분야 기술에서 알려진 방법에 의한 비-상동성 재조합에 의해 세포의 유전체로 병합될수 있도록 다자인 될 수 있다
어떤 실시 예에서, 조혈 전구 세포는, 예를 들어 CD34+ 조혈 전구 세포는, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 핵산들과 접촉시키고, 및 세포는 배양에서 확장 및 분화하도록 한다.
어떤 실시 에에 따르면, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 형질도입을 위해 플라스미드 구조체에 클론 될 수 있다. 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 생산하기에 적절한 발현 벡터를 세포에 전달하는 방법에는, 이것에만 국한하지 않으나, 바이러스 매개하는 유전자 전달, 리포솜 매개하는 전달, 형질전환(transformation), 유전자 총, (gene gun), 형질감염 (transaction) 및 형질도입 (transaction), 예를 들어, 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노연관된 바이러스 (adenoassociated virus) 및 헤르페스 바이러스 (herpes virus) 는 물론, 레트로바이러스 근거한 벡터와 같은 DNA 바이러스에 근거한 벡터 사용과 같은 바이러스 매개하는 유전자 전달을, 포함한다. 유전자 전달 방식의 예에는, 예를 들어, DNA 자체만 (naked DNA), CaPO4 침전 (CaPO4 precipitation), DEAE 덱스트란 (DEAE dextran), 전기천공 (electroporation), 원형질 융합 (protoplast fusion), 리포펙숀 (lipofection), 및 세포 미세주사 (cell microinjection) 가 포함된다.
어떤 실시 예에 따르면, 각 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 DNA는 적혈구 세포에 통합되기 위하여 랜티바이러스 벡터 플라스미드에 클론 될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 랜티바이러스 벡터는 적혈구 세포에 통합되기 위한 단일 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함한다. 다른 실시 예에서, 랜티바이러스 벡터는 적혈구 세포에 통합되기 위한 여기서 서술된 대로 두 개, 세 개, 네 개, 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함한다. 어떤 실시 예에 따르면, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 DNA는, 항생제 저항성 유전자와 같은, 선택 특성을 암호화하는 플라스미드 구조체에 클론 될 수 있다. 어떤 실시 예에 따르면, 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 DNA는 적혈구 세포에서 각 재조합 단백질을 안정적으로 발현하도록 조정된 플라스미드 구조체에 클론 될 수 있다.
어떤 실시 예에 따르면, 외부 유래 자극 폴리펩티드 서열을 (예를 들어, 하나, 두 개, 세 개, 네 개, 또는 그 이상의 외부 유래 폴리펩티드) 가진 전달 벡터, 포위 벡터 (envelop vector), 및 포장 벡터 (packaging vector) 가 각각 숙주 세포로 형질 감염되는 곳에서는 바이러스 생산을 위해 랜티바이러스 시스템이 적용될 수 있다. 어떤 실시 예에 따르면, 랜티바이러스 벡터는 숙주 세포에 칼슘 포스페이트 침전 형질감염 (Calcium phosphate precipitation transfection), 지질 근거한 형질감염 (lipid based transfection), 또는 전기천공, 및 하룻밤 배양의 어느 것으로 형질감염시킬 수 있다. 외부 유래 자극 폴리펩티드 서열이 형광 리포터를 수반할 수 있는 실시 예에서, 숙주 세포에서의 형광 점검은 하룻밤 배양 후에 체크 될 수 있다. 바이러스 입자를 포함하는 숙주 세포의 배양 배지는 매 8-12 시간마다 2 또는 3번 수확하고 및 떨어진 세포 및 부스러기를 침전시키기 위하여 원심분리시킬 수 있다. 배양 배지는 그 후 바로 사용되거나, 동결 또는 필요한 대로 농축시킬 수 있다.
외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 외부 유래 핵산을 전달하게 되는 전구 세포는 성숙 된 붉은 혈액 세포로 분화되게 하는 적절한 조건하에서 배양될 수 있다, 예를 들어, 여기서 서술된 시험관 내 배양 과정. 결과로 얻어진 붉은 혈액 세포는 성숙 된 적혈구와 연관된 단백질, 예를 들어, 헤모글로빈 (hemoglobin), 글라이코포린 A (glycophorin A), 및 표준 방법 ((예를 들어, 웨스턴 블럿팅 (Western blotting) 또는 FACS 분석))으로 평가되고 및 정량될 수 있는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 보여준다. 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고 있는 분리된 성숙한 붉은 혈액 세포, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하고 있는 분리된 성숙한 붉은 혈액 세포, 및 MICA, MICB, 및 IGF-1로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고 있는 분리된 성숙한 핵 제거된 붉은 혈액 세포는, 본 공개의 제작된 적혈구 세포의 제한적이지 않은 예들이다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적혈구 전구 세포를 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 외부 유래 핵산과 접촉시켜 생성된다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 적혈구 전구 세포와 접촉되는 RNA에 의해 암호화된다.
분리된 적혈구 전구 세포는 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA로 형질감염시킬 수 있다. 메신저 RNA는 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드에 해당하는 코딩 서열 (coding sequence) 을 포함하는 cDNA 플라스미드 구조체의 시험관 내 전사로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 외부 유래 자극 폴리펩티드에 해당하는 cDNA 서열은 특정한 RNA 중합효소 (RNA polymerases) 에 비교할 만한 프로모터를 함유하는 클로닝 벡터에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 클로닝 벡터 ZAP EXPRESS pBK-CMV ((스트라타젠 (Stratagene), La Jolla, Calif., USA)) 는 T3 및 T7 RNA 중합효소와 비교될 만한 T3 및 T7 프로모터 서열을 각각 함유한다. 센스 mRNA (sense mRNA) 의 시험관 내 전사를 위해, 플라스미드는 외부 유래 폴리펩티드의 코딩 서열의 끝에 해당하는 정지 코돈 ((stop codon(s)) 의 아래쪽에 있는 제한효소 부위에서 직선화된다. mRNA는, 예를 들어, RNAMAXX 높은 수율 전사 키트 (RNAMAXX High Yield Transcription Kit) (((스트라타젠 (Stratagene), La Jolla, Calif., USA로부터)) 와 같은 상업적으로 구할 수 있는 키트를 사용하여 직선 DNA 주형 (템플레이트)으로부터 전사된다. 어떤 경우에는, 5'-m7GpppG-capped mRNA를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 그러므로 직선화된 cDNA 주형의 전사는, 예를 들어, 앰비온 ((Ambion (Austin, Tex., USA)) 으로부터의 mMESSAGE mMACHINE 고 수율 캡된 RNA 전사 키트 (mMESSAGE mMACHINE High Yield Capped RNA Transcription Kit) 를 사용하여 수행될 수 있다. 전사는 20-100 μl의 반응 부피에서 37o C에서 30분에서 4시간 동안 수행될 수 있다. 전사된 mRNA는 직선화된 DNA 주형을 제거하기 위하여 DNase I으로 잠시 처치하여 반응 혼합물로부터 분리되고 이어서 리튬 클로라이드 (lithium chloride), 소듐 아세테이트 (sodium acetate) 또는 암모늄 아세테이트 (ammonium acetate) 존재하에서 70% 에탄올로 침전시킨다. 전사된 mRNA의 완전성은 아가로즈-포름알데히드 젤 (agarose-formaldehyde gel) 또는 상업적으로 구할 수 있는 노벡스 미리-성형된 TBE 젤 (Novex pre-cast TBE gels (예를 들어, Novex, Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) 로 전기 영동하여 평가될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 메신저 RNA는, 예를 들어, 리포펙숀 (lipofection) 및 전기천공 (electroporation) (van Tandeloo et al., Blood 98:49-56 (2001)), 을 포함하는 다양한 접근방법을 사용하여 망상적혈구에 도입시킬 수 있다. 리포펙숀 (lipofection) 을 위해, 예를 들어, 5μg의 시험관 내 전사된 mRNA 를 Opti-MEM ((인비트로젠 (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA)) 에서 양이온 지질 DMRIE-C (lipid DMRIE-C) (인비트로젠 (Invitrogen)와 1:4 비율로 5-15분 동안 배양시킨다. 다른 한편으로, 예를 들어, DOTAP, 여러 가지 형태의 폴리에틸렌아민 (polyethylenimine), 및 폴리-라이신 (polyL-lysine) ((시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich), Saint Louis, Mo., USA)), 및 수퍼펙트 (Superfect) ((Qiagen, Inc., Valencia, Calif., USA; See, e.g., Bettinger et al., Nucleic Acids Res. 29:3882-3891 (2001)) 를 포함하는, 다양한 다른 양이온 지질 (cationic lipids) 또는 양이온 폴리머 (cationic polymers) 가 세포를 mRNA로 형질감염시키기 위하여 사용될 수 있다. 결과로 얻어진 mRNA/지질 복합체 (mRNA/lipid complexes) 는 세포와 ((1-2x106 세포/ml) 2시간 동안 37o C에서, 세척시키고 및 다시 배양시킨다. 전기천공을 위해, 예를 들어, 약 5 에서 20x106 세포를 500 μl의 Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) 에서 약 20μg 의 시험관 내 전사된 mRNA르 혼합시키고 및 0.4-cm 큐벳 (cuvette) 에서, 예를 들어, 이지젯트 플러스 장치 (Easyject Plus device) (EquiBio, Kent, United Kingdom) 를 사용하여 전기천공시켰다. 어떤 경우에는, 특정한 mRNA를 망상적혈구에 형질감염시키기에 유용한 조건을 결정하기 위하여 여러 전압, 정전용량(capacitances) 및 전기천공 부피를 검사하는 것이 필요하다. 일반적으로, 세포에 mRNA를 효율적으로 형질감염하기 위하여 요구되는 전기천공 계수는 DNA를 전기천공하는데 요구되는 계수보다 세포에 덜 치명적이다 ((van Tandeloo et al., Blood 98:49-56 (2001)).
다른 한편으로, mRNA는 펩티드-매개하는 RNA 전달 전략을 사용하여 적혈구 전구 세포에 형질감염시킬 수 있다 (예를 들어, Bettinger et al., Nucleic Acids Res. 29:3882-3891 (2001) 참조)). 예를 들어, 특히 분열-후 일차 세포 (post-mitotic primary cells) 에서, mRNA 형질감염 효율을 증가시키기 위하여, 양성 지질 폴리에틸렌아민 2 kDA (polyethylenimine 2 kDA) (시그마-알드리치, Saint Louis, Mo., USA) 가 멜리틴 펩티드 (melittin peptide) (Alta Biosciences, Birmingham, UK) 와 조합될 수 있다. 이 멜리틴 펩티드 (melittin peptide) 는 헤테로-이중기능 크로스-링커 (hetero-bifunctional cross-linker)인 석신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 ((succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate))와 같은 디설피드 크로스-링커 (disulfide cross-linker)를 사용하여 PEI에 접합시킬 수 있다. 시험관 내에서 전사된 mRNA는 RNA/펩티드/지질 복합체 (RNA/peptide/lipid complex) 를 형성시키기 위하여 멜리틴-PEI (mellitin-PEI) 와 5에서 15분 동안 미리 배양시킨다. 이 복합체는 그 후 무-혈청 배양 배지에 있는 세포에 2에서 4시간 동안 37o C에서 5% CO2 습기화된 환경에서 첨가하고, 및 그 후 제거하고 및 형질감염된 세포는 배양에서 계속해서 자라도록 둔다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 적절한 분리된 적혈구 전구 세포 또는 혈소판 전구 세포를 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 외부 유래 핵산과 접촉시켜 생성된다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 DNA에 의해 암호화되며, 이는 핵 있는 적혈구 전구 세포 또는 핵 있는 혈소판 전구 세포로 접촉시킨다. 어떤 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 RNA에 의해 암호화되며, 이는 혈소판, 핵 있는 적혈구 세포, 또는 핵 있는 혈소판 전구 세포와 접촉시킨다. 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는, 일시적 또는 안정적 형질감염 (transfections) 또는 유전자 치료 (gene therapy) 접근 방법을 포함하는 다양한 DNA 기술을 사용하여 최종 분화 이전에 적혈구 전구 세포, 혈소판 전구 세포, 또는 핵 있는 적혈구 세포에 유전적으로 도입시킬 수 있다. 외부 유래 자극 폴리펩티드는 성숙한 붉은 혈액 세포 혈소판의 세포 표면 위 및/또는 세포질에 발현될 수 있다.
바이러스 유전자 전달은 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 세포에 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 유전자 전달 운반체로서 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 (Moloney murine leukemia virus) (MMLV), 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노-연관된 바이러스 (adeno-associated virus) (AAV), 헤르페스 바이러스 (herpes simplex virus) (HSV), 인간 면역결핍 바이러스 1 (human immunodeficiency virus 1) (HIV 1) 과 같은 랜티 바이러스 (lentiviruses),및 예를 들어, 포미 바이러스 (foamy viruses)와 같은 스푸마바이러스(spumaviruses) 를 포함하는 다수의 바이러스가 사용될 수 있다 ((예를 들어, Osten et al., HEP 178:177-202 (2007) 등 참조)). 레트로바이러스는 (Retrovirus), 예를 들어, 효과적으로 인간 세포를 포함하는 포유류 세포에 형질도입하고 및 염색체에 통합하여, 안정적인 유전자 전달을 하게한다.
하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 적혈구 전구 세포, 혈소판 전구 세포, 또는 핵 있는 적혈구 세포에 형질감염될 수 있고, 발현되고 및 이어서 성숙 된 붉은 혈액 세포 또는 혈소판에서 남아있고 및 나타난다. 적절한 벡터는 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 (Moloney murine leukemia virus) (MMLV) 벡터 뼈대이다. 암 유발성 레트로바이러스인, MMLV에 근거한 벡터는, 현재 유전자 치료 임상 시험에 사용되고 있다 (Hossle et al., News Physiol. Sci. 17:87-92 (2002)). 예를 들어, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 함유하는 DNA 구조체가 MMLV 벡터 뼈대에 만들어질 수 있다. 이 구조체는, 예를 들어, PA317 세포와 같은 포장 세포주 (packaging cell line)에 형질감염되고 및 바이러스 상등액은 예를 들어, PG13 세포주와 같은 생산 세포를 형질감염시키기 위하여 사용된다. PG13 바이러스 상등액은 분리되었고 및 배양되었거나 또는 여기서 서술된 대로 신선하게 분리된 적혈구 전구 세포, 혈소판 전구 세포, 또는 핵 있는 적혈구 세포와 배양시킨다. 외부 유래 폴리펩티드의 발현은 FACS 분석 (형광-활성화된 세포 분류) (fluorescence-activated cell sorting)을 사용하여, 예를 들어, 외부 유래 자극 폴리펩티드가 제작된 적혈구 세포의 표면에 위치하여 있다면, 이 외부 유래 자극 폴리펩티드에 대한 형광 라벨 된 항체를 사용하여, 모니터 된다. 비슷한 방법들이 제작된 적혈구 세포의 내부에 위치하여 있는 외부 유래 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있다.
선택적으로, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein) (GFP)과 같은, 추적 분자를 바이러스-근거한 접근방법을 사용하여 (Tao et al., Stem Cells 25:670-678 (2007)) 형질감염시킬 수 있다. 강화된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein) (EGFP) 또는 적색 형광 단백질 (red fluorescent protein) (예를 들어, DsRed-Express)을 암호화하는 DNA를 함유하는 에코토픽 레트로바이러스 벡터 (Ecotopic retroviral vectors) 가, 예를 들어, 포에닉스-에코 세포주 (Phoenix-Eco cell line) (Orbigen, San Diego, Calif. 에 의해 배포) 와 같은 포장 세포 (packaging cell) 를 사용하여 포장될 수 있다. 포장 세포주는 예를 들어, gag, pol, 및 env. 를 포함하는 포장에 필요한 적절한 바이러스 단백질을 안정적으로 발현한다. 바이러스 입자가 흘러나온 포에닉스-에코 세포 (Phoenix-Eco cells) 로부터의 상등액이, 적혈구 전구 세포, 혈소판 전구 세포, 또는 핵 있는 적혈구 세포를 형질도입하는데 사용된다. 어떤 경우에, 형질도입 (transduction)은 레트로바이러스 매개하는 유전자 전달 효율을 개선하기 위하여, 예를 들어, 재조합 피브로넥틴 (fibronectin) 단편에서와 같은 특별히 코팅된 표면에서 수행될 수 있다 (예를 들어, RetroNectin, Takara Bio USA, Madison, Wis.). 세포는 레트로넥틴-코팅된 (RetroNectin-coated) 플레이트에서 레트로바이러스 포에닉스-에코 상등액 (retroviral Phoenix-Eco supernatants) 플러스 보조-인자들과 함께 배양시킨다. 형질도입은 다음날 반복될 수 있다. 이 경우에, EGFP 또는 DsRed-Express를 발현하는 세포의 퍼센트는 FACS로 평가될 수 있다. 형질도입 효율을 평가하기 위하여 사용될 수 있는 다른 리포터 유전자 (reporter genes) 에는, 예를 들어, 베타-갈락토시데이즈 (beta-galactosidase), 클로람페니콜 아세틸트란스훼라제 (chloramphenicol acetyltransferase), 및 루시훼라제 (luciferase) 는 물론 낮은-친화력 신경 성장 인자 수용체 (low--affinity nerve growth factor receptor) (LNGFR), 및 인간 세포 표면 CD24 항원이 포함된다 (Bierhuizen et al., Leukemia 13:605-613 (1999)).
여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여 비바이러스 벡터가 유전자 재료를 적절한 적혈구 세포, 혈소판 또는 이의 전구 세포에 도입시키기 위하여 사용될 수 있다. 비바이러스-매개 유전자 전달은 바이러스-매개 유전자 전달과는 플라스미드 벡터는 단백질을 함유하지 않고, 독성이 더 적고 및 확대하기 (scale-up) 쉽고, 및 숙주 선호 성이 없다는 점에서 다르다. 플라스미드 벡터 "DNA 자체만 (nacked DNA)" 은 혼자서는 폴리펩티드를 암호화하는 유전적 재료를 세포에 전달하는데 비효율적이며 및 그러므로 세포에 들어갈 수 있게 하는 유전자 전달 방법과 조합된다. 화학적 및 물리적 방법을 포함하는 다수의 전달 방법이 비바이러스 벡터를 적절한 적혈구 세포, 혈소판 또는 이의 전구 세포로 전달하는데 사용될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 비바이러스 벡터는 적절한 적혈구 세포, 혈소판 또는 이의 전구 세포에 양이온 지질 (cationic lipids) 및 폴리머 (polymers)와 같은 합성 거대분자를 사용하여 도입시킬 수 있다 (Papapetrou et al., Gene Therapy 12:S118-S130 (2005)). 양이온 리포좀 (Cationic liposomes)은, 예를 들어, 전하 상호작용 (charge interactions)을 통하여 DNA와 복합체를 형성한다. 양성적으로 전하를 띤 DNA/지질 복합체 (DNA/lipid complexes)는 음성 세포 표면에 결합하고 및 세포에 의해 세포 내 도입 (endocytosis)에 의해 흡수된다. 이 접근방법은, 예를 들어, 조혈 세포를 형질감염시키기 위하여 사용된다 (예를 들어, Keller et al., Gene Therapy 6:931-938 (1999) 참조)). 적혈구 세포, 혈소판 또는 이의 전구 세포를 위하여, 플라스미드 DNA ((대략 예를 들어, 0.5 μg을 OptiMEM (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 와 같은 무 혈청 배지 25-100 μ L에)) 는 상업적으로 구할 수 있는 형질감염 시약 리포펙타민 T.M (Lipofectamine. T M.) (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 과 같은 양이온 리포좀 (대략 4 μg을, 25 μL 의 무혈청 배지) 과 혼합시키며 및 복합체를 형성하도록 적어도 20분 동안 배양되게 한다. DNA/리포좀 복합체 (DNA/liposome complex)는 적절한 적혈구 세포, 혈소판 또는 이의 전구 세포에 첨가시키고 및 5-24시간 동안 배양되도록 하며, 이 시간 후에 이 폴리펩티드의 전달유전자 (transgene) 의 발현이 평가된다. 다른 한편으로, 다른 상업적으로 구할 수 있는 리포좀 형질감염 제제 (liposome transfection agent) 가 사용될 수 있다 ((예를 들어, 생체 내 유전자 셔틀 ((GeneSHUTTLE), Qbiogene, Carlsbad, Calif.)).
선택적으로, 예를 들어, 폴리에틸렌아민 (polyethylenimine)과 같은 양이온 폴리머가, 예를 들어, 조혈 및 탯줄 혈액-유래 된 CD34+ 세포와 같은 적혈구 세포 전구 세포를 효율적으로 형질감염시키는데 사용될 수 있다 ((예를 들어, Shin et al., Biochim. Biophys. Acta 1725:377-384 (2005) 참조)). 인간 CD34+ 세포는 인간 탯줄 혈액으로부터 분리되고 및 200 ng/ml의 줄기세포 인자 (stem cell factor) 및 20% 열-불활성화된 태아 소 혈청 (heat-inactivated fetal bovine serum) 으로 보충된 이스코베의 수정된 둘베코 배지 (Iscove's modified Dulbecco's medium)에서 배양된다. 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드 DNA는 0.8K에서 750K (Sigma Aldrich, Saint Louis, Mo., USA; Fermetas, Hanover, Md., USA)의 다양한 크기의 가지형 또는 직선형 PEIs 와 배양시킨다. PEI는 4.2 mg/ml 증류수의 스톡 용액 (stock solution)으로 제조되고 및 HCl를 사용하여 pH 5.0의 약간 산성으로 한다. DNA는 실온에서 PEI와 30분 동안 1μg의 DNA는 3 nmol의 인 (phosphate)을 함유하는 계산에 근거하여 여러 가지 질소/인산 비율로 및 10 nmol의 아민 질소 (amine nitrogen)를 함유하는 1μl의 PEI 스톡 용액에 배양시킬 수 있다. 분리된 CD34+ 세포는 DNA/양이온 복합체 (DNA/cationic complex) 와 접종시키고, 280x g 에서 5분 동안 원심분리시키고 및 4시간 또는 그 이상 동안 배양 배지에서 폴리펩티드의 유전자 발현이 평가될 때까지 배양된다.
플라스미드 벡터는 입자-매개하는 형질감염, "유전자 총 (gene gun)", 바이오리스틱 (biolistics), 또는 입자 충격 기술 (particle bombardment technology) 과 같은 물리적 방법을 사용하여 적절한 적혈구 세포 및 혈소판 또는 이의 전구 세포에 도입시킬 수 있다 (Papapetrou, et al., (2005) Gene Therapy 12:S118-S130). 이 경우에, 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 금 입자에 흡수시키고 및 세포에 입자 총 (particle gun)으로 투여한다. 이 방법은, 예를 들어, 적혈구 전구 세포, 예를 들어, 탯줄 혈액으로부터 유래 된 조혈 줄기세포를 형질감염하는데 사용될 수 있다 ((예를 들어, Verma et al., Gene Therapy 5:692-699 (1998) 참조)). 그러므로 탯줄 혈액이 분리되고 및 인산 버퍼 된 생리 식염수에서 3배 희석시킨다. CD 34+ 세포는 2차 항체로 코팅된 자석 마이크로비드 (magnetic microbeads) 및 자석 분리시스템 (magnetic isolation system) ((예를 들어, 밀테니 미니맥 시스템 (iltenyi MiniMac System, Auburn, Calif., USA))과 함께 조합하여 항-CD34 단일클론 항체를 사용하여 정제된다. CD34+ 강화된 세포는 여기서 서술된 대로 배양될 수 있다. 형질감염을 위하여, 폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드 DNA는 칼슘 클로라이드 (calcium chloride) 및 스퍼미딘 (spermidine) 처치로, 입자에, 예를 들어, 금 비드에, 침전시킨다. DNA-코팅된 비드를 에탄올로 세척 후에, 비드는, 예를 들어 바이오블리스틱 PDS-1000/He 시스템 (Biolistic PDS-1000/He System) (Bio-Rad, Hercules, Calif., USA)을 사용하여, 배양된 세포에 전달될 수 있다. 형질감염 효율을 평가하기 위하여, 예를 들어, 베타-갈락토시데이즈(beta-galactosidase), 클로람페니콜 아세틸트란스페라제 (ramphenicol acetyltransferase), 루시페라아제 (luciferase), 또는 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein) 과 같은 리포터 유전자가 사용될 수 있다.
선택적으로, 플라스미드 벡터를 적절한 적혈구 세포, 혈소판 또는 이의 전구 세포에 도입시키기 위하여 전기천공법이 사용될 수 있다. 전기천공법은 세포막에 일시적인 구멍을 만들어 내어, 예를 들어, DNA 및 RNA는 물론 항체 및 약물을 포함하는, 여러 다양한 분자들이 세포 내로 도입되게 한다. 그러므로 CD34+ 세포가 여기서 서술된 대로 분리되고 및 배양된다. 전기천공 바로 전에, 세포는 실온에서 250x g로 10분 동안 원심분리로 분리되고 및 0.2-10x106 생존세포/ml로, 예를 들어, 1.0% 인간 혈청 알부민 (human serum albumin) (HSA)으로 보충된 X-VIVO 10과 같은 전기천공 버퍼에 재 현탁 된다. 플라스미드 DNA (1-50μg)는 적절한 전기천공 큐벳 (electroporation cuvette)에 500 μl의 세포 현탁액과 함께 첨가된다. 전기천공은, 예를 들어, ECM 600 전기천공기 (electroporator) (Genetronics, San Diego, Calif., USA)를 사용하여, 전압 200V에서 280V 범위 및 펄스 길이 25 에서 70 밀리세칸드 (milliseconds) 범위로 수행될 수 있다. 다수의 대체 전기천공 기기들이 상업적으로 구할 수 있고 및 이 목적으로 사용될 수 있다 (예를 들어, Gene Pulser XCELL, BioRad, Hercules, Calif.; Cellject Duo, Thermo Science, Milford, Mass.). 다른 한편으로, 분리된 CD34+ 세포의 효율적인 전기천공은 하기의 계수들을 사용하여 수행될 수 있다: 4mm 큐벳 (cuvette), 1600 μF, 550 V/cm, 및 1x105 세포/ml에서 500μl 세포 당 10 μg의 DNA (Oldak et al., Acta Biochimica Polonica 49:625-632 (2002)).
전기천공의 한 형태인, 뉴클레오펙숀 (Nucleofection) 은, 또한 적절한 적혈구 세포, 혈소판 또는 이의 전구 세포를 형질감염시키기 위하여 사용될 수 있다. 이 경우에, 형질감염은 DNA (또는 다른 시약들) 가 핵으로 직접 운반되도록 하여 그러므로 세포질에서 가능한 분해의 위험을 감소시키게 하는 세포-유형 특이적인 용액에서 전기적 계수를 사용하여 수행된다. 예를 들어, 인간 CD34 CELL NYCLEOFECTOR 킷트 (from Amaxa Inc.) 가 적절한 적혈구 세포, 혈소판 또는 이의 전구 세포를 형질감염시키기 위하여 사용될 수 있다. 이 경우에, 인간 CD34 CELL NYCLEOFECTOR 용액에 1-5x106 세포가 1-5 ㎍의 DNA와 혼합되고 및 NUCLEOFECTOR 기기에서 제조사에 의해 결정된 미리 프로그램된 세팅 (preprogrammed settings) 을 사용하여 형질감염 (transfected) 된다.
적혈구 세포, 혈소판 또는 이의 전구 세포는 유전체에 통합되지 않는 한 포유류 세포에서 자체-복제될 수 없는 전통적인 발현 벡터로 비-바이러스 적으로 형질감염될 수 있다. 다른 한편으로, 적혈구 세포, 혈소판 또는 이의 전구 세포는 숙주 크로모좀 내로 통합됨이 없이 자기 스스로 복제하는 유전적 유닛으로서 숙주 핵에서 지속 될 수 있는 에피조말 벡터 (episomal vector) 로 형질감염될 수 있다 (Papapetrou et al., Gene Therapy 12:S118-S130 (2005)). 이들 벡터들은 잠복 감염시 세포 내에서 정상적으로 크로모좀 외적으로 복제하는 바이러스로부터, 예를 들어, EBV, 인간 폴리오마바이러스 BK (human polyomavirus BK), 보바인 파필로마 바이러스-1 (bovine papilloma virus-1) (BPV-1), 헤르페스 심플렉스 바이러스-1 (herpes simplex virus-1) (HSV) 및 시미안 바이러스 40 (Simian virus 40) (SV40)로부터, 유래한 유전적 요소들을 이용한다. 포유류 인공 크로모좀도 또한, 비바이러스성 유전자 전달을 위해 사용될 수 있다 (Vanderbyl et al., Exp. Hematol. 33:1470-1476 (2005)).
하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 외부 유래 핵산은, 이 분야 기술에서 알려진 표준 분자 생물학 방법으로, 예를 들어, 제한효소 소화 (restriction digestion), 겹치는-연장 PCR (overlap-extension PCR), 및 깁슨 조립 (Gibson assembly) 으로, 발현 벡터로 조립될 수 있다.
외부 유래 핵산은 정상적으로 세포 표면에, 예를 들어, 적혈구 세포에, 발현되지 않고, 내부 유래 또는 자연 세포막 단백질을 암호화하는 유전자에 융합되어, 외부 유래 자극 폴리펩티드가 세포표면에 발현되는, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 외부 유래 핵산은 유형 1 막 단백질 (type 1 membrane protein)의 리더 서열에 이어서 N 말단에, 유형 2 막 단백질의 C 말단에, 또는 GPI-연결된 막 단백질 (GPI-linked membrane protein)의 GPI 부착 부위 상위부분에 클론될 수 있다.
두 융합 유전자 사이에 유연한 아미노산 링커 (flexible amino acid linkers) 를 도입하는데 표준 클로닝 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유연한 아미노산 링커에는 전장 항체로부터 단일-체인 항체 단편을 생성하는데 보통 사용되는 [Gly4Ser]3과 같은 폴리-글라이신 폴리-세린 링커 (poly-glycine poly-serine linker) (Antibody Engineering: Methods & Protocols, Lo 2004), 또는 단일-체인 Arc 억제자 (single-chain Arc repressors) 를 생성하는데 사용되는 것과 같은 ala-gly-ser-thr 폴리펩티드가 있다 (Robinson & Sauer, PNAS 1998). 어떤 실시 예에서, 유연한 아미노산 링커는 유연한 링커가 없는 해당하는 구조체보다 폴리펩티드에 좀 더 유연성 및 입체적 자유성 제공한다.
예를 들어, HA 에피톱 태그--아미노산 YPYDVPDYA (HA epitope tag--amino acids YPYDVPDYA) (서열번호 78), CMyc-태그--아미노산 EQKLISEEDL ((CMyc tag--amino acids EQKLISEEDL) (서열번호 79), 또는 Flag 태그--아미노산 DYKDDDDK (Flag tag--amino acids DYKDDDDK) (서열번호 80)) 를 암호화하는 핵산 서열과 같은, 두 개의 융합된 유전자 사이에 에피톱 태그가 놓일 수 있다. 에피톱 태그는 유동세포 분석 (flow cytometry), 웨스턴 블럿 (western blot), 또는 면역 침강법 (immunoprecipitation)으로 에피톱 태그에 대한 항체를 사용하여 발현의 손쉬운 검출 및 양을 측정하는데 사용될 수 있다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고 및 적어도 하나의 다른 이종형의 폴리펩티드를 포함한다. 적어도 하나의 다른 이종형의 폴리펩티드 형광 단백질일 수 있다. 형광 단백질은 형질도입 효율을 평가하기 위한 리포터로 사용될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 형광 단백질은 만약 두 개가 같은 전사체로부터 만들어지면 외부 유래 자극 폴리펩티드의 발현 수준을 평가하기 위하여 리포터로 사용된다. 어떤 실시 예에서, 적어도 하나의 다른 폴리펩티드는 이종형이고 및 예를 들어, 다수의 항원, 다수의 캡처 타겟 (multiple capture targets), 효소 캐스케이드 (enzyme cascade)와 같은 기능을 제공한다. 어떤 실시 예에서, 재조합 핵산은 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 한 유전자 및 두 번째 유전자를 포함하며, 여기서 두 번째 유전자는 번역 후에 두 개의 성숙 된 단백질로 쪼개지는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 바이러스-유래 T2A 서열 (viral-derived T2A sequence) (gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggsgsstcccggccct (서열번호 81)) 로 분리 된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여, 적혈구 세포 집단은 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 외부 유래 핵산, pLKO.1 퓨로 (pLKO.1 puro), PLKO.1--TRC 클로닝 벡터, pSico, FUGW, pLVTHM, pLJM1, pLion11, pMD2.G, pCMV-VSV-G, pCI-VSVG, pCMV-dR8.2 dvpr, psPAX2, pRSV-Rev, 및 pMDLg/pRRE을 포함할 수 있는 특별한 플라스미드를 포함하는 랜티바이러스 벡터와 배양된다. 벡터는 0, 100, 1,000, 10,000 pfu 로 투여될 수 있고 및 12 시간 동안 배양된다.
어떤 특정 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드와 접합 된 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 제시하는 핵 제거된 세포이다. 접합은 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 접합은 외부 유래 항원-제시하는 폴리펩티드를 공유 결합에 의해 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드에, 링커 사용을 하거나 또는 하지 않고, 결합시켜 달성될 수 있다. 화학적 접합은, 동시자극 폴리펩티드 및 결합 쌍 멤버 (binding pair member) 를, 링커 사용을 하거나 또는 하지 않고, 공유 결합으로 달성될 수 있다. 화학적 접합은, 동시억제 폴리펩티드 및 결합 쌍 멤버를, 링커 사용을 하거나 또는 하지 않고, 공유 결합으로 달성될 수 있다. 그러한 접합의 형성은 이 분야 기술 전문가 내에 있으며 및 접합 될 재료에 의해서 결정되는 특정한 기술의 선택을 가지는, 접합을 달성하는 다양한 기술이 알려졌다. 이온화 가능한 측 쇄 (side chains)를, 예를 들어, 아스파르틱 에시드 (aspartic acid), 글루타믹 에시드 (glutamic acid), 라이신 (lysine), 아르기닌 (arginine), 시스테인 (cysteine), 히스티딘 (histidine), 또는 타이로신 (tyrosine)를 함유하고, 및 폴리펩티드 서열의 활성화부분에는 함유하지 않는 폴리펩티드에 아미노산의 첨가는 (C-또는 N-말단), 이의 비프로톤화된 상태 (unprotonated state)에서 강력한 친핵성 인자로 작용하는 역할을 하여, 활성화 군이 폴리머에, 예를 들어, 호모- 또는 헤테로-두-기능 PEG (homo- or hetero-bi-functional PEG) (예를 들어, Lutolf and Hubbell, Biomacromolecules 2003; 4:713-22, Hermanson, Bioconjugate Techniques, London. Academic Press Ltd; 1996) 에, 부착되면서, 다양한 생접합 반응 (bioconjugation reactions)에 관여한다.
다른 분자 융합이 외부 유래 자극 폴리펩티드들 사이에서 형성될 수 있으며 및 직접 또는 간접 접합을 포함한다. 외부 유래 폴리펩티드는 직접적으로 서로 접합 되거나 또는 간접적으로 링커를 통해 접합 될 수 있다. 링커는 펩티드 (peptide), 폴리머 (polymer), 압타머 (aptamer), 또는 핵산 (nucleic acid) 일 수 있다. 폴리머는 자연적 (natural), 합성적 (synthetic), 선상 (linear), 또는 가지형 (branched) 일 수 있다. 외부 유래 자극 폴리펩티드는 첫 번째 폴리펩티드 및 두 번째 폴리펩티드가 폴리펩티드들이 직접적으로 서로 연결되거나 또는 중간 링커 서열 및/또는 하나 또는 양쪽 끝에 더 나아간 서열로 연결된 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 이종형 융합 단백질을 포함할 수 있다. 링커에의 접합은 공유결합 또는 이온화 결합을 통해서 일 수 있다.
어떤 특정 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드와 복합체로 있는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 제시하는 핵 제거된 세포다. 다른 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다. 더 나아간 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 복합체 (complex)로서 제시된다. 다른 더 나아간 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 융합 폴리펩티드 (fusion polypeptide) 로서 제시된다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드는 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분에 링커 (linker)로, 예를 들어, GGGGS 링커 (서열번호 11), 특히 (GGGGS)3 링커 (서열번호 12)로, 연결된다.
여기서 서술된 적혈구 세포는 또한 외부 유래 자극 폴리펩티드를 세포에 연결하기 위한 커플링 시약 (coupling reagents) 을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 클릭 화학 (click chemistry) 가 사용될 수 있다. 커플링 시약은, 예를 들어, 외부 유래 폴리펩티드가 복잡하거나 또는 폴리펩티드를 발현하기 어려운 때, 예를 들어, 폴리펩티드, 예를 들어, 다중결합된 폴리펩티드 (multimeric polypeptide); 큰 폴리펩티드; 시험관 내에서 유도체합성 된 (derivatized) 폴리펩티드; 적혈구 세포에 독성을 낼 수도 있는 외부 유래 폴리펩티드, 또는 적혈구 세포에서 효과적으로 발현이 안 되는 폴리펩티드 일 때, 외부 유래 폴리펩티드를 세포에 커플 시키기 위하여 사용될 수 있다. 적혈구 세포를 기능화시키는 (functionalizing) 클릭 화학 및 다른 접합 방법은 그 전문이 여기 참고문헌으로 병합된 국제 출원번호 PCT/US2018/000042, (International Application No. PCT/US2018/000042) 에 서술되어 있으며, 이는 2017년 2월 17일에 제출된 (filed) 미국 가 출원 62/460589 (U.S. Provisional Application No. 62/460589), 및 2017년 7월 8일에 제출된 (filed) 미국 가 출원 62/542142 (U.S. Provisional Application No. 62/542142), 에 우선권을 청구한다.
그러므로 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 적혈구 세포는 세포 당 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000 만큼 많이, 적어도, 이 이상 또는 약 이 정도의 커플링 시약을 포함한다. 어떤 실시 예에서 적혈구 세포는 a) 첫 번째 커플링 시약을 적혈구 세포에 커플 시키고, 이로써 약학적 제제, 생산물, 또는 중간체를 만드는 것을 포함하는 방법에 의해 만들어진다. 한 실시 예에서, 이 방법은 더 나아가: b) 예를 들어, 첫 번째 커플링 시약이 두 번째 커플링 시약과 반응하기에 적절한 조건 아래에서, 두 번째 커플링 시약에 커플 된 외부 유래 자극 폴리펩티드와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 실시 예에서, 두 개 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드가 세포에 커플 된다 (예를 들어, 클릭 화학을 사용하여). 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드가 세포에 커플 되고 (예를 들어, 클릭 화학을 사용하여) 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 외부 유래 핵산으로부터 발현 되는 폴리펩티드를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 커플링 시약은 아자이드 (azide) 커플링 시약을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 아자이드 (azide) 커플링 시약은 아지도알킬 잔기 (azidoalkyl moiety), 아지도아릴 (azidoaryl) 잔기, 또는 아지도헤테로아릴 (azidoheteroaryl) 잔기를 포함한다. 예시적인 아자이드 (azide) 커플링 시약에는 3-아지도프로피오닉 에시드 설포-NHS 에스터 (3-azidopropionic acid sulfo-NHS ester), 아지도아세틱 에시드 NHS 에스터 (azidoacetic acid NHS ester), 아지도-PEG-NHS 에스터 (azido-PEG-NHS ester), 아지도프로필아민 (azidopropylamine), 아지도-PEG-아민 (azido-PEG-amine), 아지도-PEG-말레이미드 (azido-PEG-maleimide), 비스-설폰-PEG-아자이드 (bis-sulfone-PEG-azide), 또는 이의 유도체가 포함된다. 커플링 시약은 또한 알켄 잔기 (alkene moiety), 예를 들어, 트란스사이클로알켄 잔기 (transcycloalkene moiety), 옥사노보나디엔 (oxanorbornadiene) 잔기, 또는 테트라진 (tetrazine) 잔기를 포함한다. 추가의 커플링 시약은 Click Chemistry Tools (https://clickchemistrytools.com/) 또는 Lahann, J (ed) (2009) Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science, 에서 찾을 수 있으며, 각각은 그 전문이 여기에 참고문헌으로 병합되었다.
다른 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 (예를 들어, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드) 제시하는 적혈구를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여 외부 유래 자극 폴리펩티드는 공유결합부착을 통해 적혈구 세포에 부착된다. 예를 들어, 적혈구 세포 또는 혈소판의 친핵성 인자와 반응하여 상호결합된 관계를 형성하는 친전자성 군을 함유하는 커플링 화합물을 사용하여 외부 유래 자극 폴리펩티드는 유도체화 되고 및 적혈구 세포 또는 혈소판에 결합 될 수 있다. 이 친전자성 군의 대표에는 αβ 불포화 카보닐 (αβunsaturated carbonyls), 알킬 할라이드 (alkyl halides) 및 치환된 말레이미드 (maleimides)와 같은 티올(thiol) 시약이 있다. 그 외에, 커플링 화합물은 아미노 (amino), 카복실 (carboxyl) 및 타이로신(tryosine) 군과 같은 폴리펩티드에 있는 하나 또는 그 이상의 기능적 군을 통해 외부 유래 자극 폴리펩티드에 커플될 수 있다. 이 목적을 위해, 커플링 화합물은 유리 카복실 군 (free carboxy group), 유리 아미노 군 (free amino groups), 아로마틱 아미노 군 (aromatic amino groups), 및 효소 기능 군과 반응할 수 있는 다른 군을 함유한다. 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여 예를 들어, 적혈구 세포 또는 혈소판에 고정을 위하여 높은 전하를 띤 (highly charged) 외부 유래 자극 폴리펩티드도 또한 정전기적 결합 (electrostatic bonding) 을 통해 제조될 수 있다. 이 유도체의 예에는 폴리라이실 (polylysyl) 및 폴리글루타밀 (polyglutamyl enzymes)이 포함될 것이다.
유도체에 포함되어 있는 반응 군의 선택은 고정을 위해 친전자성 인자를 적혈구 세포 또는 혈소판에 있는 친핵성 인자 군 커플 하는데 적용되는 반응 조건에 따른다. 조절하는 인자는 적혈구 또는 혈소판에 부착에 의해 고정되는 외부 유래 자극 폴리펩티드의 커플링 전에 커플링 제제가 불활성화되지 않도록 바라는 것이다. 그러한 커플링 고정 반응은 여러 방법으로 진행될 수 있다. 전형적으로, 커플링 제제는 외부 유래 폴리펩티드와 적혈구 세포 또는 혈소판 사이에 다리를 형성하기 위하여 사용될 수 있다. 이 경우에, 커플링 제제는 외부 유래 폴리펩티드와 반응을 할 수 있게 하는 카복실 군과 같은 기능적 군을 소유하여야만 한다. 접합을 위하여 외부 유래 자극 폴리펩티드를 제조하는 한 방법에는 커플링 제제에 있는 카복실 군을 사용하여 외부 유래 폴리펩티드와 반응하는 혼합된 무수물을 형성하는 것을 포함하며, 여기서 사용은 혼합된 무수물을 형성할 수 있는 활성인자로 구성된다. 그러한 활성인자들의 대표에는 5,5'-(디티오비스(2-니트로벤조익 에시드) ((5,5'-(dithiobis(2-nitrobenzoic acid)) (DTNB), p-클로로머큐리벤조에이트 (p-chloromercuribenzoate) (CMB), 또는 m-말레이미도벤조익 에시드 (m-maleimidobenzoic acid) (MBA)와 같은 커플링 제제와 함께 혼합된 무수물을 제공하는 아이소부틸클로로포르메이트 (isobutylchloroformate) 또는 다른 클로로포르메이트 (chloroformate) 가 있다. 커플링 제제의 혼합된 무수물은 외부 유래 폴리펩티드와 반응하여 반응성이 있는 유도체를 만들고 이는 이어서 적혈구 세포 또는 혈소판의 친핵성 군과 반응할 수 있어 외부 유래 자극 폴리펩티드가 고정된다.
카복실 군과 같은, 외부 유래 자극 폴리펩티드에 있는 기능 군은 카보디이미드 (carbodiimides) 및 이와 비슷한 활성인자들로 활성화될 수 있다. 이어서, 아미노 군과 같은 브리징 시약 (bridging reagent) 에 있는 기능 군은 외부 유래 자극 폴리펩티드에 있는 활성화된 군과 반응할 것이며 활성화된 유도체가 형성된다. 추가로, 커플링 제제는 적혈구 세포 또는 혈소판에 있는 적절한 친핵성 군과 반응하여 다리 (bridge)를 형성하는 두 번째 반응 군은 소유한다. 전형적인 그러한 반응 군에는 아이오도아세틱 에시드 (iodoacetic acid) 와 같은 알킬레이팅 제제 (alkylating agents), 아크릴릭 에시드 (acrylic acid) 및 이와 비슷한 것과 같은 αβ 불포화카보닐 화합물 (αβunsaturated carbonyl compounds), 머큐리얼 (mercurials) 같은 티올 제제 (thiol reagents), 치환된 말레이미드 (substituted maleimides) 및 이와 비슷한 것이 있다,
다른 한편으로, 외부 유래 자극 폴리펩티드에 있는 기능 군은 예를 들어, 적혈구 세포 또는 혈소판에 있는 친핵성인자들과 직접 반응하도록 활성화될 수 있어 다리-형성 화합물 (bridge-forming compound) 의 필요를 배제한다. 이 목적으로, 사용은 혼합된 무수물로부터 구별이 되는 바와 같이, 외부 유래 폴리펩티드에 있는 카복실 군이 에놀 에스터 (enol esters) 로 형성되도록 하는 우드워즈 시약 K (Woodward's Reagent K) 또는 이와 비슷한 시약과 같은 활성 인자로 구성된다. 외부 유래 폴리펩티드의 에놀 에스터 유도체는 이어서, 예를 들어, 적혈구 세포 또는 혈소판에 있는 친핵성인자 군과 반응하여 외부 유래 자극 폴리펩티드의 고정에 효과를 주어, 이로서 제작된 적혈구 세포가 창조되게 한다.
어떤 실시 예에서, 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포는 적혈구 세포를 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 선택적으로 탑재 (payload) 와 접촉시켜 생성되며, 여기서 접촉은 밴드 3 (Band 3) (CD233), 아콰포린-1 (aquaporin-1), 글루트-1 (Glut-1), Kidd 항원 (Kidd antigen), RhAg/R1i50 (CD241), Rli (CD240), Rh30CE (CD240CE), Rh30D (CD240D), Kx, 글라이코포린 B (glycophorin B)(CD235b), 글라이코포린 C (glycophorin C) (CD235c), 글라이코포린 D (glycophorin D) (CD235d), Kell (CD238), Duffy/DARCi (CD234), CR1 (CD35), DAF (CD55), 글로보사이드 (Globoside), CD44, ICAM-4 (CD242), Lu/B-CAM (CD239), XG1/XG2 (CD99), EMMPRIN/뉴로텔린 (EMMPRIN/neurothelin) (CD147), JMH, 글라이코실트란스페라제 (Glycosyltransferase), 카트라이트 (Cartwright), 돔브록 (Dombrock), C4A/CAB, 시아나 (Scianna), MER2, 스토마틴 (stomatin), BA-1 (CD24), GPIV (CD36), CD108, CD139, 또는 H 항원 (H antigen) (CD173)을 포함하는 부착 부위를 사용하여 외부 유래 자극 폴리펩티드를 적혈구 세포에 접합시키는 것을 포함하지 않는다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 제시하는 적혈구 세포를 포함하며, 여기서 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 세포에 효소적으로 접합된다.
특정 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는, 이것에만 국한하지 않으나 예를 들어, 일차 아민 군 (primary amine group) 을 환원된 티올 군과 연결 시키기 위하여 NHS 에스터-말레이미드 (NHS ester-maleimide) 이종형두기능적 크로스링커 (heterobifunctional crosslinker)와 같은 두 기능적 크로스-링킹 제제와 화학적 접합을 포함하는, 다양한 화학적 및 효소적 수단으로 적혈구 세포 또는 혈소판의 표면에 접합 될 수 있다. 이 방법들에는 또한 수용체 서열 LPXTG (서열번호 82) 또는 LPXTA (서열번호 83) 를 함유하는 하나의 폴리펩티드를 N-말단 공여자 서열 GGG 를 함유하는 폴리펩티드와 연결하기 위하여, 예를 들어, 소르타제 (sortase) 효소에 의해 매개 되는 트랜스펩티데이즈 반응 (transpeptidase reaction) 과 같은 효소적 전략이 포함된다, 예를 들어, Swee et al., PNAS 2013 참조. 이 방법에는 또한 예를 들어, 소르타제-매개하는 (sortase-mediated) 클릭 화학 핸들 (Click Chemistry handles) ((아자이드 (azide) 및 알킨 (alkyne))의 항원 및 세포에의 각각 접합, 이어서 항원을 세포에 화학적으로 결합하기 위한 환형-삽입 반응 (cyclo-addition reaction) 과 같은, 조합 방법이 포함된다, 예를 들어, Neves et al., Bioconjugate Chemistry, 2013 참조. 소르타제-매개하는 단백질 수정은, 두 개 다 그 전문이 여기에 참고문헌으로 병합되어 있는, 국제 출원 PCT/US2014/037545 (International Application No. PCT/US2014/037545) 및 국제 출원 PCT/US2014/037554 (International Application No. PCT/US2014/037554) 에 서술되어 있다.
어떤 실시 예에서, 단백질은 아미노산, 펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 탄수화물, 태그 (tag), 금속 원자 (metal atom), 대비 제제 (contrast agent), 촉매 (catalyst), 비-펩티드 폴리머 (non-polypeptide polymer), 인식 요소 (recognition element), 저 분자 (small molecule), 지질 (lipid), 링커(linker), 라벨 (label), 에피톱 (epitope), 항원(antigen), 치료적 제제 (therapeutic agent), 톡신 (toxin), 방사성 동위원소 (radioisotope), 입자 (particle), 또는 반응성 화학 군을 포함하는 잔기, 예를 들어, 클릭 화학 핸들 (click chemistry handle) 을 포함하는 소르타제 기질의 접합에 의해 수정된다.
요구되면, 촉매적 결합-형성 도메인은 예를 들어, 적혈구 세포 또는 혈소판 위 또는 내에 세포내적으로 또는 세포외적으로 발현시킬 수 있다. 스트랩토코커스파이로젠 (Streptoccus pyogenes) 으로부터 분리된 단백질인, Spy0128로 부터 유래 된 것들을 포함하는, 트란스펩티데이즈 (transpeptidases), 소르타제 (sortases), 및 이소펩티데이즈 (isopeptidases)를 포함하는 많은 촉매적 결합-형성 폴리펩티드가 존재한다.
어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 폴리펩티드 어느 것도 소르타제를 사용하여 세포에 접합되지 않는다.
Spy 0128의 자가 촉매적인 이소 펩티드 결합-형성 서브유닛 (auto catalytic inspective bond-forming subunit) (CnaB2 도메인)의 분열은 서로에 대한 특이성을 가진 촉매적 활성을 유지하는 두 개의 뚜렷한 폴리펩티드 생성 결과에 이른다는 것이 보여졌다. 이 시스템에서 폴리펩티드는 스파이태그 (SpyTag) 및 스파이캣쳐 (SpyCatcher)로 불린다. 혼합하면, 스파이태그 (SpyTag) 및 스파이캣쳐 (SpyCatcher)는 스파이태그의 Asp117 및 스파이캣쳐의 Lys31 사이에서 이소펩티드 결합형성을 거친다 (Zakeri and Howarth, JACS 2010, 132:4526). 이 반응은 세포적인 환경에서 호환성이 있으며 및 단백질/펩티드 접합에 매우 특이적이다 (Zakeri, B.; Fierer, J. O.; Celik, E.; Chittock, E. C.; Schwarz-Linek, U.; Moy, V. T.; Howarth, M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2012, 109, E690-E697). 스파이태그 (SpyTag) 및 스파이캣쳐 (SpyCatcher)는 엘라스틴-유사 (elastin-like) 단백질에서 번역-후 위상 변경을 지정하는 것으로 보여졌다. 예를 들어, N-말단에 스파이태그 (SpyTag) 및 C-말단에 스파이캣쳐 (SpyCatcher)를 놓아두면, 환형 엘라스틴-유사 단백질 형성을 지시한다 (Zhang et al, Journal of the American Chemical Society, 2013).
스파이태그 (SpyTag) 및 스파이캣쳐 (SpyCatcher)의 구성요소는 서로 바꿀 수 있어 분자 A가 스파이태그 (SpyTag)에 융합되고 및 분자 B가 스파이캣쳐 (SpyCatcher) 에 융합된 시스템은 분자 A가 스파이캣쳐 (SpyCatcher) 에 융합되고 및 분자 B가 스파이태그 (SpyTag)에 융합된 시스템과 기능적으로 동등하다. 이 서류의 목적을 위해, 스파이태그 (SpyTag) 및 스파이캣쳐 (SpyCatcher)가 사용될 때, 보완적인 분자는 이를 대신하여 대체될 수 있다는 것이 이해 되어야 할것이다.
스파이태그 (SpyTag)/스파이캣쳐 (SpyCatcher) 시스템과 같은, 촉매적 결합-형성 폴리펩티드는 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여, 외부 유래 자극 폴리펩티드를, 예를 들어, 적혈구 세포의 표면에 부착시키기 위하여 사용될 수 있다. 스파이태그 (SpyTag) 폴리펩티드 서열은 적혈구 세포의 세포 외 표면에 발현시킬 수 있다. 스파이태그 (SpyTag) 폴리펩티드는, 예를 들어, 유형-1 (type-1) 또는 유형-3 (type-3) 막 통과 단백질의, 예를 들어, 글라이코포린 A (glycophorin A) 의, N-말단에 융합될 수 있고, 유형-2 (type-2) 막 통과 단백질의, 예를 들어, Kell의 C-말단에 융합될 수 있고, 다수-통과 막 통과 단백질 (multi-pass transmembrane protein) 의, 예를 들어, 밴드 3 (Band 3)의, 세포 외 말단 또는 세포 외 루프에 프레임 맞게 (in-frame) 삽입될 수 있고, GPI-수용체 (GPI-acceptor) 폴리펩티드에, 예를 들어, CD55 또는 CD59에, 융합될 수 있고, 지질-체인-앵커 된 폴리펩티드 (lipid-chain-anchored polypeptide) 에 융합될 수 있고, 또는 말초 막 단백질에 융합될 수 있다. 스파이태그 (SpyTag) 융합을 암호화하는 핵산 서열은 제작된 적혈구 세포 내에서 발현될 수 있다. 외부 유래 자극 폴리펩티드는 스파이캣쳐 (SpyCatcher)에 융합될 수 있다. 스파이캣쳐 (SpyCatcher) 융합을 암호화하는 핵산 서열은 스파이태그 (SpyTag) 융합을 발현하는 같은 적혈구 세포에서 발현되고 및 이로부터 분비될 수 있다. 다른 한편으로, 스파이캣쳐 (SpyCatcher) 융합을 암호화하는 핵산 서열은 외부적으로, 예를 들어, 박테리아. 곰팡이, 곤충, 포유류, 또는 세포-없는 (cell-free) 생산 시스템에서, 생산될 수 있다. 스파이태그 (SpyTag) 및 스파이캣쳐 (SpyCatcher) 폴리펩티드의 반응시, 외부 유래 자극 폴리펩티드를 적혈구 세포의 표면에 부착시키는 공유 결합이 생성되어 제작된 적혈구 세포가 형성된다.
어떤 실시 예에서, 스파이태그 (SpyTag) 폴리펩티드는 적혈구 세포 내에서 Gatal 프로모터의 조절하에서 글라이코포린 A (glycophorin A) 의 N-말단에 융합으로서 발현될 수 있다. 스파이캣쳐 (SpyCatcher) 폴리펩티드 서열에 융합된, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 같은 적혈구 세포 내에서 Gatal 프로모터의 조절하에서 발현될 수 있다. 두 융합 폴리펩티드의 발현시, 스파이태그 (SpyTag)와 스파이캣쳐 (SpyCatcher) 폴리펩티드 사이에 이소펩티드 결합 (isopeptide bond) 이 형성될 것이며, 적혈구 세포 표면과 외부 유래 자극 폴리펩티드 사이에 공유 결합이 형성된다.
다른 실시 예에서, 스파이태그 (SpyTag) 폴리펩티드는 적혈구 세포 내에서 Gatal 프로모터의 조절하에서 글라이코포린 A (glycophorin A) 의 N-말단에 융합으로서 발현될 수 있다. 스파이캣쳐 (SpyCatcher) 폴리펩티드 서열에 융합된 외부 유래 자극 폴리펩티드는 적절한 포유류 세포 발현 시스템, 예를 들어, HEK293 세포에서 발현될 수 있다. 적혈구 세포 위에 있는 스파이태그 (SpyTag) 융합 폴리펩티드 발현시, 스파이캣쳐 (SpyCatcher) 융합 폴리펩티드는 세포와 접촉되도록 오게 할 수 있다. 적절한 반응 조건하에서, 스파이태그 (SpyTag)와 스파이캣쳐 (SpyCatcher) 사이에 이소펩티드 결합이 형성될 것이며, 적혈구 세포 표면과 외부 유래 자극 폴리펩티드 사이에 공유 결합이 형성된다.
어떤 특정 실시 예에서, 외부 유래 자극 폴리펩티드는 제작된 적혈구 세포로 넣어진다 (loaded into). 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는, 예를 들어 적혈구 세포 또는 혈소판에 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 넣어, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드가 적혈구 세포 또는 혈소판 내에서 내부로 들어있게 하여 생성된다. 선택적으로, 적혈구 세포 또는 혈소판은 추가로, 예를 들어, 치료 제제와 같은 페이로드 (payload)로 넣어질수 있다.
예를 들어, 적혈구 세포 또는 혈소판에 외부 유래 자극 폴리펩티드를 넣는데 여러 방법이 사용될 수 있다. 적절한 방법에는, 예를 들어, 저 삼투압 용해 (hypotonic lysis), 저 삼투압 투석 (hypotonic dialysis), 삼투 (osmosis), 삼투 펄싱 (osmotic pulsing), 삼투 쇼크 (osmotic shock), 이온이동 (ionophoresis), 전기천공 (electroporation), 초음파분해 (sonication), 미세 주사 (microinjection), 칼슘 침전 (calcium precipitation), 막 삽입 (membrane intercalation), 지질 매개 형질 감염 (lipid mediated transfection), 세제 처치 (detergent treatment), 바이러스 감염 (viral infection), 확산 (diffusion), 수용체 매개 세포 내 도입 (receptor mediated endocytosis), 단백질 형질도입 도메인 사용 (use of protein transduction domains), 입자 발포 (particle firing), 막 융합 (membrane fusion), 냉동-해동 (freeze-thawing), 기계적 파괴) mechanical disruption), 및 여과 (filtration)이 포함된다. 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여 그러한 방법 어느 하나 또는 이의 조합이 사용될 수 있다.
저 삼투압 용해를 위해, 예를 들어, 적혈구 세포는 낮은 이온화 강도의 버퍼에 노출 시켜 이들이 터지게 한다. 외부 유래 자극 폴리펩티드는 세포 내에 분포된다. 적혈구 세포는, 특히 붉은 혈액 세포는, 분리된 붉은 혈액 세포 펠렛 (pellet)에 30-50배 부피의 과량의 5 mM 인산 완충액 (phosphate buffer) (pH 8) 을 첨가시켜 저 삼투압 적으로 용해할 수 있다. 결과로 얻어진 용해된 세포막은 원심분리로 분리된다. 용해된 붉은 혈액 세포막의 펠렛 (pellet)은 재현탁 되고 및 외부 유래 폴리펩티드의 존재하에 낮은 이온 강도 버퍼에서, 예를 들어, 30분 동안 배양한다. 다른 한편으로, 용해된 붉은 혈액 세포막은, 적혈구에 효율적으로 넣도록 결정된 최적의 조건에 따라, 외부 유래 폴리펩티드와 작게는 1분 동안 또는 길게는 며칠 동안 배양될 수 있다.
다른 한편으로, 적혈구 세포는, 특히 붉은 혈액 세포는 조절되는 저 삼투압 적 용액에 대항한 투석을 사용하여 세포가 불어나게 하고 및 세포막에 구멍이 만들어지게 하여 외부 유래 자극 폴리펩티드가 넣어질 수 있다 (예를 들어, U.S. Pat. Nos. 4,327,710; 5,753,221; 및 6,495,351 참조). 예를 들어, 분리된 붉은 혈액 세포의 펠렛은 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 5 mM 글루코오즈 pH 7.4 에 재현탁시키고 및 10 mM NaH2PO4, 10 mM NaHCO3, 20 mM 글루코오즈, 및 4 mM MgCl2, pH 7.4를 포함하는 저이온 강도 버퍼에 대항하여 투석한다. 30-60분 후에, 붉은 혈액 세포는 더 나아가 외부 유래 폴리펩티드를 함유하는 16 mM NaH2PO4, pH 7.4 용액에 대항하여 추가로 30-60분 동안 투석한다. 이 과정 모두는 온도 4o C에서 유리하게 수행될 수 있다. 어떤 경우에, 투석 방법으로는 많은 양의 적혈구 세포를, 특히 붉은 혈액 세포를, 넣는 (load)것이 유리할 수 있으며 및 이 목적을 위해 디자인된 특별한 장치가 사용될 수 있다 (예를 들어, U.S. Pat. Nos. 4,327,710, 6,139,836 및 6,495,351 참조).
탑재된 적혈구 세포 (loaded erythroid cells), 특히 붉은 혈액 세포는, 예를 들어, 0.9% 생리 식염수 (0.9% saline), 인산염 완충 된 생리 식염수 (phosphate buffered saline), 링거 용액 (Ringer's solution), 세포 배양 배지 (cell culture medium), 혈액 혈장 (blood plasma) 또는 림프액 (lymphatic fluid)과 같은 생리적 용액의 존재하에 온화한 가열로 다시 봉인시킬 수 있다. 예를 들어, 잘-봉인된 막은 파괴된 적혈구 세포를, 특히 붉은 혈액 세포를 예를 들어, 100 mM 인산염 (phosphate) (pH 8.0) 및 150 mM 소듐 클로라이드 (sodium chloride)의 150 mM 염 용액 (salt solution)에서 온도 60 o C에서 1-2 분 동안 처치하여 만들어 질 수 있다. 다른 한편으로, 세포는 온도 25-50o C에서 30분에서 4시간 동안 배양시킬 수 있다 (예를 들어, U.S. Patent Application 2007/0243137 A1 참조). 다른 한편으로, 파괴된 붉은 혈액 세포는 5 mM 아데닌 (adenine), 100 mM 이노신 (inosine), 2 mM ATP, 100 mM 글루코오즈 (glucose), 100 mM Na-피루베이트 (Na-pyruvate), 4 mM MgCl2, 194 mM NaCl, 1.6 M KCl, 및 35 mM NaH2PO4, pH 7.4 에서 온도 37 o C 에서 20-30분 동안 배양시켜 다시 봉인될 수 있다 (예를 들어, U.S. Pat. No. 5,753,221 참조).
전기천공을 위하여, 예를 들어, 적혈구 세포 또는 혈소판은 세포막에 일시적인 구멍을 만들게 하는 전기 장 (electrical field) 에 노출 시켜, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드가 세포 내로 확산 되도록 한다 (예를 들어, U.S. Pat. No. 4,935,223 참조). 적혈구 세포, 특히 붉은 혈액 세포는, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드가 첨가되는, 혈소판-없는 혈장 (platelet-free plasma) 과 같은 생리적이고 및 전기적으로 전도성이 있는 배지에 현탁 시킨다. 0.2 에서 1.0 ml 범위의 부피에 있는 혼합물은 전지천공 큐벳 (electroporation cuvett) 에 넣고 및 얼음에서 10분 동안 냉각시킨다. 큐벳은 예를 들어, ECM 830 (BTX Instrument Division, Harvard Apparatus, Holliston, Mass. 부터) 와 같은 전기천공 장치에 놓아둔다. 세포는 대략 2.4 밀리 세컨드 (2.4 milliseconds) 길이의 단일 펄스 (single pulse) 및 대략 2.0 kV/cm의 전기장 강도 (field strength) 로 전기천공 된다. 다른 한편으로, 적혈구 세포, 특히 붉은 혈액 세포의 전기천공은 바이오-레드 진 펄서 장치로 (Bio-Rad Gene Pulsar apparatus) (Bio-Rad, Hercules, Calif., USA) 0.25 .mu.F 에서 전달되는 2.2 kV의 이중 펄스를 사용하여 60% 이상의 탑재 용량 (loading capacity) 이 달성 되게 수행될 수 있다 (Flynn et al., Cancer Lett. 82:225-229 (1994)). 큐벳은 얼음 베스 (ice bath) 에 다시 10-60분 동안 놓아두고 및 그 후 세포막의 재봉합을 유도하기 위해 37o C 물 베스 (water bath)에 놓아둔다. 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여 어느 적절한 전기천공 방법이 사용될 수 있다.
초음파분쇄 (sonication) 를 위하여, 적혈구 세포는, 예를 들어, 고강도의 음파 (high intensity sound waves) 에 노출되어, 일시적인 세포막 파괴를 일으키게 하여, 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드가 세포 내로 확산하도록 한다. 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여, 어느 적절한 초음파 분쇄 방법이 사용될 수 있다.
세제 처치 (detergent treatment) 를 위하여, 적혈구 세포는, 예를 들어, 순한 세제로 처치되며 이는 구멍을 만들어서 일시적으로 세포막을 조율하여 이 구멍을 통해 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드가 확산 될 수 있다. 세포가 탑재된 후에, 세제는 세포로부터 세척된다. 예를 들어, 세제는 사포닌 (saponin) 일 수 있다. 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여, 어느 적절한 세제 처치 방법이 사용될 수 있다.
수용체 매개하는 세포내도입 (receptor mediated endocytosis) 를 위하여, 적혈구 세포는, 예를 들어, 표면 수용체를 가질 수 있으며 이는 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드가 결합할 시 수용체 및 연관된 외부 유래 자극 폴리펩티드의 내부화를 유도한다. 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여, 어느 적절한 세포내도입 (endocytosis) 방법이 사용될 수 있다.
기계적 발포 (mechanical firing) 를 위하여, 적혈구 세포는, 예를 들어, 금 미세운반체 (gold microcarriers) 와 같은 무겁거나 또는 전하를 띤 입자에 부착된 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드로 충격을 주고 및 기계적으로 또는 전기적으로 가속시켜 이들이 세포막을 횡단하도록 한다. 미세입자 충격 (Microparticle bombardment) 은, 예를 들어, 헬리오스 유전자 총 (Helios Gene Gun) (from, e.g., Bio-Rad, Hercules, Calif., USA)을 사용하여 달성할 수 있다. 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여, 어느 적절한 미세입자 충격 방법이 사용될 수 있다.
여과 (filtration) 를 위해, 적혈구 세포 또는 혈소판 및 외부 유래 자극 폴리펩티드는 세포보다 구멍 크기가 더 작은 필터를 강제적으로 통과하도록 하여 세포막의 일시적인 파괴가 되도록 하여 외부 유래 자극 폴리펩티드가 세포로 들어가게 한다. 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여, 어느 적절한 여과 방법이 사용될 수 있다.
냉동-해동 (freeze thawing) 을 위하여, 적혈구 세포는 몇 번의 냉동-해동 사이클을 거치게 하여, 세포막의 파괴의 결과가 얻어진다 (예를 들어, U.S. Patent Application 2007/0243137 A1 참조). 이 경우에, 포장된 붉은 혈액 세포 (0.1-1.0 ml)의 펠렛 (pellet)은 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 함유하는 등장용액 (isotonic solution) (예를 들어, 인산염 완충된 생리식염수) 의 동일 부피 (0.1-1.0 ml) 와 혼합한다. 붉은 혈액 세포는 세포 및 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 함유하는 튜브를 액체 질소에 담가 냉동시킨다. 다른 한편으로, 튜브를 -20 o C 또는 -80 o C 냉동고에 넣어 세포를 냉동할 수 있다. 세포는 그 후, 예를 들어, 23 o C 물 베스 (water bath) 에서 녹이고 및 만약 탑재를 증가시킬 필요가 있으면 사이클은 반복된다. 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 생성하기 위하여, 어느 적절한 냉동-해동 (freeze-thaw) 방법이 사용될 수 있다.
외부 유래 자극 폴리펩티드는 제작된 적혈구 세포 위에서 검출될 수 있다. 외부 유래 자극 폴리펩티드의 존재는 표준 분자 생물학 방법을, 예를 들어, 웨스턴 블럿팅 (Western blotting) 또는 FACS 분석을, 사용하여 평가되고 및 정량화될 수 있다. 세포 내부 환경에 존재하는 외부 유래 자극 폴리펩티드는 세포 용해시 또는 형광 검출을 사용하여 정량화 될 수 있다.
상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
III. 사용 방법 (METHODS OF USE)
여기서 서술된 대로, 현 발명은 면역 세포를, 예를 들어, 세포용해성 T 세포 (cytolytic T cells) (CD8+ cells), 메모리 CD8+ T 세포 (memory CD8+ T cells), T 도우미 세포 T helper cells) (CD4+ cells) 및 NK 세포를, 자극하는 방법을 제공한다. 면역 세포의 자극은 정상 세포 기능을 강화하거나, 또는 비정상적인 세포에서 정상적인 세포 기능을 시작하게 할 수 있다. 이 방법에는 면역세포를 자극하기에 효과적인 양으로, 면역세포가 활성화되도록 여기의 어느 한 관점 및 실시 예에서 제작된 적혈구와의 접촉이 관여한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다. 면역 세포를 자극하는 것은, 면역 세포가, 예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+ T 세포 와 같은 살상 면역 세포 (killer immune cell)가, 활성화 및/또는 확장과 같은, 세포 반응의 결과를 가져오게 하는 과정을 (예를 들어, 신호 또는 자극을 제공) 의미한다. 어떤 실시 예에서, 면역 세포를, 예를 들어, NK 세포 및/또는 CD8+ T 세포 와 같은 살상 면역 세포 (killer immune cell)를, 자극하는 방법은, 자극 폴리펩티드와 같은, 지극 또는 신호를 제공하여, 면역세포의 활성화 및/또는 확장의 결과가 되게 함을 의미한다.
바람직한 실시 예에서, 본 발명은 면역 살상 세포, 예를 들어, 세포 용해 T 세포 (cytolytic T cells) (CD8+ cells), 메모리 CD8+ T 세포 (memory CD8+ T cells), 및 NK 세포를 자극하는 방법을 제공하며, 이는 면역 살상 세포를 자극하기에 효과적인 양으로, 면역 살상 세포를 여기의 어느 한 관점 및 실시 예에의 제작된 적혈구와의 (예를 들어, 제작된 핵 제거된 세포) 접촉을 포함한다. 본 발명의 방법에 의하여 자극될 수 있는 면역 살상 세포에는, 예를 들어, 세포 용해 T 세포 (cytolytic T cells) (CD8+ cells), 메모리 CD8+ T 세포 (memory CD8+ T cells), 및 NK 세포가 포함된다. 어떤 실시 예에서, 살상 면역 세포는 자연 살상 (Natural Killer) (NK)세포다. 어떤 실시 예에서, NK 세포는 메모리-유사 NK 세포다. 어떤 실시 예에서, 살상 면역 세포는 CD8+ T-세포다. 어떤 실시 예에서, CD8+ T-세포는 메모리 T 세포다. 따라서, 현 발명은 또한 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포로 자극하는 방법의 결과로 부터 얻어진 세포 집단을 제공한다.
어떤 특정 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 동시에 한 유형 이상의 살상 면역 세포들을, 예를 들어, 하나 이상의 세포 용해 T 세포 (cytolytic T cells) (CD8+ cells), 메모리 CD8+ T 세포 (memory CD8+ T cells), 및 NK 세포를, 자극하는 방법에 사용된다. 예시적인 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 동시에 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 자극할 능력이 있다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포와의 면역 살상 세포의 접촉은 생체 내(in vivo) 에서 수행된다. 접촉이 생체 내에서 수행될 때, 하나 이상의 면역 살상 세포 집단이 활성화될 수 있다는 것이, 본 발명의 장점이다. 예를 들어, 접촉이 생체 내에서 수행될 때, NK 세포 및 CD8+ T 세포 둘 다 활성화 및/또는 확장될 수 있다.
다른 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포와의 면역 살상 세포의 접촉은 생체 밖 (ex vivo) 에서 수행된다. 그러므로, 어떤 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 자연 살상 세포가 본 발명의 제작된 적혈구 세포와 생체 밖 (ex vivo) 에서 접촉된다.
NK 세포는 어느 전통적인 소스로부터 얻을 수 있으며 및 바람직하게는 말초 혈액, 골수, 제대혈 (cord blood), 세포주 또는 사이토카인 자극된 말초 혈액으로부터 유래한다. NK 세포는, 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells) (PBMCs)로부터 확장될 수 있다. PBMCs는 단핵구 세포(monocytes) 및 림프구(lymphocytes) 의 혼합물이다: 혈액 백혈구로 이로부터 과립 세포가 분리되고 및 제거된다. 세포 (예를 들어, PBMCs)를 배양하기 전에, 이들은 이 분야 전문가에게 잘 알려진 방법에 따라 정제되고 및 분리된다. 세포독성 세포의 확장을 위한 배양 조건은 이전에 건강한 개인으로부터 얻은 PBMCs에 대해 최적화되었다 ((Carlens et al., Hum. Immunol. 2001; 62:1092-1098)). 어떤 특정 실시 예에서, NK 세포는 약 100에서 약 1,000,000배 사이, 또는 약 1,000에서 1,000,000배 사이, 예를 들어, 1000에서 약 100,00배 사이로 확장된다.
이어서, 확장된 NK 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 면역 세포 자극을 필요로 하는 개체, 에게 투여될 수 있다, 투여는 한번 수행되거나 또는 몇 번 반복될 수 있다.
다른 실시 예에서, 하나 또는 그 이상의 CD8+ T 세포가 본 발명의 제작된 적혈구 세포(s)와 생체 외에서 접촉된다.
생체 외 (Ex vivo) T 세포 활성화 및 확장은 T 세포의 분리 및 이어서 자극 그 다음에 더 나아가 확장으로 수행될 수 있다. 확장 전에, T 세포의 소스 (source)는 개체로부터 얻어진다. T 세포는 말초 혈액 단 핵 세포, 골수 (bone marrow), 림프 노드 조직 (lymph node tissue), 비장 조직, 및 종양을 포함하는 많은 소스(source)로부터 얻어질 수 있다. 현 발명의 어떤 특정 실시 예에서, 이 분야 기술에서 구할 수 있는 어느 수의 T 세포 주가 사용될 수 있다. 현 발명의 어떤 특정 실시 예에서, T 세포는 개체로부터 수집된 한 유닛의 혈액으로부터 이 분야 전문가에게 알려진 어느 수의 기술을, 예를 들어 피콜 분리 (ficoll separation)와 같은, 사용하여 얻을 수 있다. 어떤 실시 예에서, 한 개인의 순환하는 혈액으로부터의 세포는 성분채집술(apheresis) 또는 백혈구성분채집술 (leukapheresis) 로 부터 얻을 수 있다. 성분채집술 산물은 전형적으로 T 세포를 포함하는, 림프구, 단핵세포, 과립 세포, B 세포, 다른 핵 있는 하얀 혈액 세포, 붉은 혈액 세포, 및 혈소판을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 성분채집 술로 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하기 위하여 세척될 수 있으며 및 세포는 다음 과정 단계를 위하여 적절한 버퍼 또는 배지에 넣어질 수 있다. 본 발명의 어떤 실시 예에서, 세포는 인산염 완충된 생리 식염수 (phosphate buffered saline)(PBS)로 세척한다. 이 분야 통상 전문가로서는 세척 단계는 제조사의 안내에 따라 반-자동 "흘려 내림 (flow-through)" 원심분리 ((예를 들어, Cobe 2991 세포 공정기 (cell processor))를 사용하는 것과 같은, 이 분야 기술에서 알려진 방법과 같은 방법으로 달성할 수 있을 것이라는 것을 쉽게 인지할 것이다. 세척 후에, 세포는, 예를 들어, Ca-없는, Mg-없는 PBS (Ca-free, Mg-free PBS)와 같은 다양한 생체적합한 버퍼에 재현탁될 수 있다. 다른 한편으로, 성분채집술에서 바람직하지 않은 성분들은 제거되고 및 세포는 직접적으로 배양 배지에 재현탁될 수 있다.
다른 실시 예에서, T 세포는 붉은 혈액 세포를 용해하고 및 예를 들어, 퍼콜 구배 (PERCOLL gradient)를 통한 원심분리로 단핵구를 고갈시켜 말초 혈액 림프구로부터 분리한다. CD28+, CD4.+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+T 세포와 같은, 특정한 T 세포의 아집단 (subpopulation)은, 더 나아가 양성 또는 음성적 선택 기술에 의해 분리된다. 음성적 선택에 의한 T 세포 집단 강화는 음성적으로 선택될 세포에 유일한 표면 마커에 대한 항체들의 조합으로 달성될 수 있다. 바람직한 방법은 세포 분류 (cell sorting) 및/또는 음성적 자석 면역부착 (negative magnetic immunoadherence)을 통한 선택 또는 음성적으로 선택되는 세포가 제시하는 세포 표면 마커에 대한 단일 클론 항체들의 칵테일을 사용하는 유동 세포분석이다. 양성적 또는 음성적인 선택에 의한 바림직한 세포 집단의 분리를 위하여, 세포의 농도 및 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자)은 다양할 수 있다. 어떤 특정 실시 예에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 확실히 하기 위하여, 비드와 세포가 서로 혼합되는 부피는 상당히 감소하는 것이 바람직하다 (즉, 세포의 농도 증가). 예를 들어, 어떤 실시 예에서, 20억 세포 (2 billion)/ml 이 사용 된다. 더 나아간 실시 예에서, 1억 세 포 (100 million)/ml 더욱더 크게 사용된다. 더 나아간 실시 예에서, 세포 농도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 백만 세포 (million cells)/ml 가 사용된다. 또 다른 실시 예에서, 세포 농도 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 백만 세포 (million cells)/ml로부터 사용된다. 더 나아간 실시 예에서, 125 또는 150 백만 세포(million cells)/ml 농도가 사용될 수 있다. 고농도의 사용은 증가한 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장의 결과가 될 수 있다. 더 나아가, 고 농도의 세포 사용은 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 있는 타겟 힝원을 약하게 발현하는 세포를 좀 더 효과적으로 포획하게 하거나, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)로부 효과적으로 포획하게 한다. 그러한 세포의 집단은 치료적 가치를 가지며 및 얻는 것이 바람직하다. 예를 들어, 고 농도의 세포를 사용하는 것은 정상적으로는 CD28 발현을 더 약하게 하는 CD8+ T 세포를 좀 더 효과적으로 포획하게 한다.
어떤 특정 실시 예에서, T 세포는 약 100 에서 약 1,000,000배 사이, 또는 약 1000에서 약 1,000,000배 사이, 예를 들어, 약 1000에서 약 100,000배 사이로 확장된다.
생체 외 (x viva) 후에 T 세포의 적응은 생체 내 (in vivo) 에서 기능 할 이들의 능력의 아주 우수한 예측 인자이다. 그러므로 어떤 특정한 실시 예에서, 제작된 적혈구의 주요 세포 생존 유전자 Bcl-xL을 유도하는 능력이 또한 측정된다. 확장 과정 동안에 배양에서의 사멸된 세포의 퍼센트는 제작된 적혈구 세포 중 어느 것이 확장된 T 세포에 대해 특별한 생존 장점을 부여하는지를 결정하는데 사용된다. 추가로, 생체 외 (ex vivo) 확장 이후에 세포의 텔로미어 길이 (telomere length)는 특정한 제작된 적혈구 세포가 이것이 확장한 세포의 복제적 잠재력을 보존하는데 좀 더 효과적인지 아니지를 결정하기 위하여 측정 될 수 있다.
현 공개는 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 사용하는 다양한 방법을 고려하고 있다. 이 분야 기술의 전문가가 이해하듯이, 여기서 제공된 공개에 근거하여, 제작된 적혈구 세포의 용량 및 투여 시기는 여기서 서술된 각 적용에 대해 특별히 맞추어 질 수 있다.
유리하게도, 현 발명의 제작된 적혈구 세포의 투여는 간 독성의 결과를 가져오지 않는다. 어떤 실시 예에서, 현 발명의 외부 유래 폴리펩티드를 제시하는 제작된 적혈구 세포의 투여는 해당하는 재조합 단백질(들)을 단독으로 투여하는 것에 비교하여, 또는 외부 유래 폴리펩티드의 타켓 (예를 들어, 수용체)에 결합하는 항체와 같은, 재조합 결합 단백질 단독의 투여에 비교하여, 더 적은 독성의 결과를 가져온다 (예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 4-1BBL 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 더 적은 간 독성의 결과를 보인다; -IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA 를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합의 투여에 비교하여, 더 적은 간 독성의 결과를 보인다; 또는 IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 4-1BBL를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 4-1BBL 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 더 적은 간 독성의 결과를 보인다).
어떤 실시 예에서, 현 발명의 제작된 적혈구 세포의 투여는 해당하는 재조합 단백질(들)을 단독으로 투여하는 것에 비교하여, 또는 외부 유래 폴리펩티드의 타켓 (예를 들어, 수용체)에 결합하는 항체와 같은, 재조합 결합 단백질 단독의 투여에 비교하여, 간 독성이 더 적고 및 치료 효율은 더 큰 결과를 가져온다 (예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 4-1BBL 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 더 적은 간 독성 및 더 큰 치료 효율의 결과를 보인다; IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA 를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합의 투여에 비교하여, 더 적은 간 독성 및 더 큰 치료 효율의 결과를 보인다; 또는 IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 4-1BBL를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 4-1BBL 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 더 적은 간 독성 및 더큰 치료 효율의 결과를 보인다).
치료 지수 (therapeutic index) ((TI, 또는 치료 비율 (therapeutic ratio))는 치료 효과를 야기하는 치료제의 양의 독성을 야기하는 양과의 비교다 (Trevor A et al. (2013). "Chapter 2: Pharmacodynamics". Pharmacology Examination & Board Review (10th ed.). New York: McGraw-Hill Medical. p. 17, 이 전문이 여기 참고 문헌으로 병합됨). 치료지수 (Therapeutic Index)(TI)는 약학적 제제의 치료적으로 효과 있는 용량을 독성 용량에 비교하기 위하여 사용된다. TI는 약물의 상대적 안전성에 대한 서술이다. 이는 독성을 생산하는 용량의 바람직한 치료적 반응을 생산하는데 필요한 용량에 대한 비율이다. TI를 유도하는데 사용되는 보통의 방법은, TD50 ((독성 용량 (toxic dose)) 및 ED50 ((효과 용량 (effective dose))를 포함하는, 50% 용랑-반응 점을 사용하는 것이다.
Figure pct00008
그러므로 좀 더 높은 TI를 가진 약물은 더 낮은 TI를 가진 약물에 비하여 좀 더 안전한 것으로 간주한다 (예를 들어, TI 10을 가진 약물은 TI 3을 가진 약물보다 더 안전한거으로 간주 된다).
어떤 실시 예에서, 현 발명의 제작된 적혈구 세포의 투여는 해당하는 재조합 단백질(들)을 단독으로 투여하는 것에 비교하여, 또는 외부 유래 폴리펩티드의 타켓 (예를 들어, 수용체)에 결합하는 항체와 같은, 재조합 결합 단백질 단독의 투여에 비교하여, 좀 더 높은 치료 지수 (therapeutic index)(TI)의 결과를 가져온다 (예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 4-1BBL 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 더 큰 TI를 가진다; IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA 를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합의 투여에 비교하여, 더 큰 TI를 가진다; 또는 IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 4-1BBL를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 4-1BBL 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 더 큰 TI를 가진다). 어떤 실시 예에서, 치료적 반응은 종양 부담의 감소이다.
어떤 실시 예에서, 현 발명의 제작된 적혈구 세포의 투여는 해당하는 재조합 단백질(들)을 단독으로 투여하는 것에 비교하여, 또는 외부 유래 폴리펩티드의 타켓 (예를 들어, 수용체)에 결합하는 항체와 같은, 재조합 결합 단백질 단독의 투여에 비교하여, 간 독성 생쥐 모텔로 측정한 대로, 더 적은 독성의 결과를 보인다 ((Niu et al J Immunology 2007 178:4194-4213, 이 내용의 전문이 여기 참고 문헌으로 병합되어 있다) (예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 4-1BBL 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 더 적은 간 독성의 결과를 보인다; IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA 를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합의 투여에 비교하여, 더 적은 간 독성의 결과를 보인다; 또는 IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 4-1BBL를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 4-1BBL 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 더 적은 간 독성의 결과를 보인다).
어떤 실시 예에서, 현 발명의 제작된 적혈구 세포의 투여는 해당하는 재조합 단백질(들)을 단독으로 투여하는 것에 비교하여, 또는 외부 유래 폴리펩티드의 타켓 (예를 들어, 수용체)에 결합하는 항체와 같은, 재조합 결합 단백질 단독의 투여에 비교하여 더 적은 독성 및 더 큰 치료적 효율의 결과를 보인다 (예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 4-1BBL 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 더 적은 간 독성 및 더 큰 치료적 효율의 결과를 보인다; 또는 IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합의 투여에 비교하여, 더 적은 간 독성 및 더 큰 치료적 효율의 결과를 보인다; 또는 IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 4-1BBL를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 4-1BBL 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 더 적은 간 독성 및 더 큰 치료적 효율의 결과를 보인다).
어떤 실시 예에서, 현 발명의 제작된 적혈구 세포의 투여는 해당하는 재조합 단백질(들) 단독으로만 투여에 비교하여, 또는 외부 유래 폴리펩티드의 타겟 (예를 들어 수용체)에 결합하는, 항체와 같은, 재조합 결합 단백질 (recombinant binding protein) 단독으로 투여에 비교하여, 알라닌 트란스아미나제 (alanine transaminase) (ALT) 간 효소의 수준에 대한 효과가 더 적거나 또는 효과가 없는 결과가 되며 (즉, 제작된 적혈구 세포를 투여 전의 수준과 비교하여 의미 있는 효과는 없다), 여기서 ALT의 수준은 재조합 단백질(들)의 투여 전 수준과 비교하여 재조합 단백질(들)의 투여에 의하여 증가한다 (예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 4-1BBL 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, ALT 수준에 대하여 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보이며, 여기서 ALT 수준은 투여 전의 수준에 비교하여 재조합 단백질 (들) 투여에 의하여 증가 된다: IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합의 투여에 비교하여, ALT 수준에 대하여 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보이며, 여기서 ALT 수준은 투여 전의 수준에 비교하여 재조합 단백질 (들) 투여에 의하여 증가 된다; IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 4-1BBL를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 4-1BBL 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보인다, 여기서, ALT 수준은 투여 전의 수준에 비교하여 재조합 단백질 (들) 투여에 의하여 증가 된다).
어떤 실시 예에서, 현 발명의 제작된 적혈구 세포의 투여는 해당하는 재조합 단백질(들) 단독으로만 투여에 비교하여, 또는 외부 유래 폴리펩티드의 타겟 (예를 들어 수용체)에 결합하는, 항체와 같은, 재조합 결합 단백질 (recombinant binding protein) 단독으로 투여에 비교하여, 인터페론 감마 (interferon gamma) (IFNg)에 대하여 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보인다 (즉, 제작된 적혈구 세포의 투여 전의 수준에 비교하여 의미 있는 효과는 없다), 여기서 IFNg 수준은 재조합 단백질(들)의 투여 전 수준과 비교하여 재조합 단백질(들)의 투여에 의하여 증가한다 (예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 4-1BBL 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, IFNg 수준에 대하여 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보이며, 여기서 IFNg 수준은 투여 전의 수준에 비교하여 재조합 단백질 (들) 투여에 의하여 증가 된다: -IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합의 투여에 비교하여, IFNg 수준에 대하여 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보이며, 여기서 IFNg 수준은 투여 전의 수준에 비교하여 재조합 단백질 (들) 투여에 의하여 증가 된다; IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 4-1BBL를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 4-1BBL 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, IFNg 수준에 대하여 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보인다, 여기서, IFNg 수준은 투여 전의 수준에 비교하여 재조합 단백질 (들) 투여에 의하여 증가 된다).
대식세포 (macrophages), CD8+ T 세포 및/또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T 세포 간 침투는 간 독성에서 중요한 인자로 간주된다. 어떤 실시 예에서, 현 발명의 제작된 적혈구 세포의 투여는 해당하는 재조합 단백질(들) 단독으로만 투여에 비교하여, 또는 외부 유래 폴리펩티드의 타겟 (예를 들어 수용체)에 결합하는, 항체와 같은, 재조합 결합 단백질 (recombinant binding protein) 단독으로 투여에 비교하여, 침투하는 대식세포 (macrophages), CD8+ T 세포 및/또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T 세포의 수에 대하여 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보인다 (즉, 제작된 적혈구 세포의 투여 전의 수준에 비교하여 의미 있는 효과는 없다), 여기서 침투하는 대식세포 (macrophages), CD8+ T 세포 및/또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T 세포 수는 재조합 단백질(들)의 투여 전의 수준에 비교하여 재조합 단백질(들) 투여에 의하여 증가 된다 (예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 4-1BBL 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 침투하는 대식세포 (macrophages), CD8+ T 세포 및/또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T 세포 수에 대하여 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보이며, 여기서 침투하는 대식세포 (macrophages), CD8+ T 세포 및/또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T 세포 수는 투여 전의 수준에 비교하여 재조합 단백질 (들) 투여에 의하여 증가 된다: IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합의 투여에 비교하여, 침투하는 대식세포 (macrophages), CD8+ T 세포 및/또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T 세포 수에 대하여 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보이며, 여기서 침투하는 대식세포 (macrophages), CD8+ T 세포 및/또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T 세포 수는 투여 전의 수준에 비교하여 재조합 단백질 (들) 투여에 의하여 증가 된다; -IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 4-1BBL를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 재조합 IL-12 단독, 재조합 4-1BBL 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 침투하는 대식세포 (macrophages), CD8+ T 세포 및/또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T 세포 수에 대하여 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보인다, 여기서, 침투하는 대식세포 (macrophages), CD8+ T 세포 및/또는 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T 세포 수에 대하여 투여 전의 수준에 비교하여 재조합 단백질 (들) 투여에 의하여 증가 된다). 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 제작된 적혈구 세포 (예를 들어, 핵 제거된 적혈구 세포) 는, 혈관으로부터 골수로 확산되어 여기서 골수 세포를 활성화하고 및 확장시키고, 이는 이어서 간으로 가서 쿠퍼 세포 (Kupfer cell)이 되고, 및 CD8 세포를 활성화시켜 간 독성의 원인이 되는 것으로 믿어지는, 재조합 단백질 (예를 들어, 항체) 과는 달리, 혈관에서 분리되는 것으로 믿어진다.
어떤 특정 실시 예에서, 염증은 ALT 및 이삭 수치 (Ishak score)에 의해 측정될 수 있다 (Ishak K, Baptista A, Bianchi L, et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol 1995; 22:696, 여기 그 전문이 참고 문헌으로 병합됨). 어떤 실시 예에서, 현 발명의 제작된 적혈구 세포의 투여는 해당하는 재조합 단백질(들) 단독으로만 투여에 비교하여, 또는 외부 유래 폴리펩티드의 타겟 (예를 들어 수용체)에 결합하는, 항체와 같은, 재조합 결합 단백질 (recombinant binding protein) 단독으로 투여에 비교하여, 간 염증 수치 (liver inflammation score) 에 대하여 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보인다 (즉, 제작된 적혈구 세포의 투여 전 수치와 비교하여 의미 있는 효과는 없다), 여기서 간 염증 수치 (liver inflammation score)는 재조합 단백질(들)의 투여 전의 수준에 비교하여 재조합 단백질(들) 투여에 의하여 증가 된다 (예를 들어, 4-1BBL을 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 투여 전의 수치에 대비하여 증가된 간 염증 수치 (liver inflammation score)의 결과를 보이는 재조합 4-1BBL 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 투여 전의 수치에 대비하여 간 염증 수치에 대해 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보인다: IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 투여 전의 수치에 대비하여 증가된 간 염증 수치 (liver inflammation score)의 결과를 보이는 재조합 IL-12 단독, 재조합 IL-15/IL-15RA 단독, 또는 이의 조합의 투여에 비교하여, 투여 전의 수치에 대비하여 간 염증 수치에 대해 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보인다; 또는 IL-12를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 4-1BBL를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 투여는, 투여 전의 수치에 대비하여 증가된 간 염증 수치 (liver inflammation score)의 결과를 보이는 재조합 IL-12 단독, 재조합 4-1BBL 단독, 이의 조합, 또는 항-4-1BB 항체의 투여에 비교하여, 투여 전의 수치에 대비하여 간 염증 수치에 대해 더 적은 효과 또는 효과가 없는 결과를 보인다.
상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 면역 살상 세포를 자극하는 방법을 제공하며, 이는 개체에게 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서, 제작된 적혈구 세포는 면역 살상 세포를 자극하기에 효과적인 양의 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에게 독성을 일으키지 않는다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서, 제작된 적혈구 세포는 암을 치료하기에 효과적인 양의 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에 독성을 일으키지 않는다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서, 제작된 적혈구 세포는 감염성 질환을 치료하기에 효과적인 양의 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에 독성을 일으키지 않는다.
여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 4-1BB 작동제 항체(4-1BB agonist antibody)의 투여보다 개체에 독성이 더 적은 결과를 보인다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 4-1BB 작동제 항체 (4-1BB agonist antibody)와 동등한 양의 투여보다 개체에 독성이 더 적은 결과를 보인다.
여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 동등한 양의 분리된 4-1BB 작동제 항체는 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양과 동등한 (예를 들어, 카피 수, 무게 또는 몰 수) 4-BB 작동제 항체의 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 동등한 양의 분리된 4-1BB 작동제 항체는 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양과 같은 작동제 활성을 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 동등한 양의 분리된 4-1BB 작동제 항체는 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 효과적인 양의 제작된 적혈구와 똑같은 작동제 활성을 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 동등한 양의 분리된 4-1BB 작동제 항체는 효과적인 양의 제작된 적혈구에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양과 똑같은 생물학적 효과를 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 동등한 양의 분리된 4-1BB 작동제 항체는 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 효과적인 양의 제작된 적혈구와 똑같은 생물학적 효과를 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 동등한 양의 분리된 4-1BB 작동제 항체는 효과적인 양의 제작된 적혈구에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드의 양과 똑같은 치료적 효능 (therapeutic potency)을 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 동등한 양의 분리된 4-1BB 작동제 항체는 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 효과적인 양의 제작된 적혈구와 똑같은 치료적 효능을 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체의 양이다.
어떤 관점에서, 본 공개는 본 공개는 개체에서 면역 살상 세포를 자극하는 방법을 제공하며, 이는 개체에게 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서 제작된 적혈구 세포는 면역 살상 세포를 자극하기에 효과적인 양의 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에게 독성을 일으키지 않는다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서, 제작된 적혈구 세포는, 암을 치료하기에 효과적인 양의 IL-15 폴리펩티드를 포함하는, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에 독성을 일으키지 않는다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서, 제작된 적혈구 세포는 감염성 질환을 치료하기에 효과적인 양의 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에 독성을 일으키지 않는다.
어떤 실시 예에서, 상기 투여는 다수의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드의 양과 동등한 분리된 IL-15 폴리펩티드 양을 개체에 투여하는 것보다 독성이 더 적은 결과를 가져온다.
여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 IL-15 폴리펩티드의 투여보다 개체에서 더 적은 독성의 결과를 가져온다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 IL-15 폴리펩티드와 동등한 양의 투여보다 개체에서 더 적은 독성의 결과를 가져온다.
여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드의 양과 정량적으로 같은 양 (예를 들어 카피수 또는 몰수에서)이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드와 똑같은 생물학적 활성을 가진 분리된 IL-15 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드와 동등한 양은 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 효과적인 양의 제작된 적혈구와 똑같은 생물학적 활성을 가진 분리된 IL-15 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드와 똑같은 치료적 효능을 가진 분리된 IL-15 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드와 동등한 양은 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 효과적인 양의 제작된 적혈구와 똑같은 치료적 효능을 가진 분리된 IL-15 폴리펩티드 양이다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 복합체로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 융합 폴리펩티드다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편에, 링커에 의해서 연결된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번로 11) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커는 (GGGGS)3 (서열번호 12)를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 적어도 서열번호 1 과 95% 동동한 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인 (IL-15 receptor alpha sushi-binding domain)을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 복합체로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 융합 폴리펩티드로 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은, IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인에 링커로 연결된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번호: 11) 를 포함하며, 선택적으로 여기서 링커는 (GGGGS)3 (서열번호 12) 링커를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 적어도 서열번호 2 와 95% 동동한 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 관점에서, 본 공개는 본 공개는 개체에서 면역 살상 세포를 자극하는 방법을 제공하며, 이는 개체에게 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서 제작된 적혈구 세포는 면역 살상 세포를 자극하기에 효과적인 양의 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에게 독성을 일으키지 않는다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서, 제작된 적혈구 세포는, 암을 치료하기에 효과적인 양의 IL-12 폴리펩티드를 포함하는, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에 독성을 일으키지 않는다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서, 제작된 적혈구 세포는 감염성 질환을 치료하기에 효과적인 양의 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에 독성을 일으키지 않는다.
여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 IL-12 폴리펩티드의 투여보다 개체에서 더 적은 독성의 결과를 가져온다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 IL-12 폴리펩티드와 동등한 양의 투여보다 개체에서 더 적은 독성의 결과를 가져온다.
여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드의 양과 정량적으로 같은 양 (예를 들어 카피수 또는 몰수에서)이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드와 똑같은 생물학적 활성을 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드와 동등한 양은 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 효과적인 양의 제작된 적혈구와 똑같은 생물학적 활성을 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드와 똑같은 치료적 효능을 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드와 동등한 양은 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 효과적인 양의 제작된 적혈구와 똑같은 치료적 효능을 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드 양이다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 면역 살상 세포를 자극하는 방법을 제공하며, 이는 개체에게 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서 제작된 적혈구 세포는 면역 살상 세포를 자극하기에 효과적인 양의 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에게 독성을 일으키지 않는다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서, 제작된 적혈구 세포는, 암을 치료하기에 효과적인 양의 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에 독성을 일으키지 않는다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서 제작된 적혈구 세포는 감염성 질환을 치료하기에 효과적인 양의 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에 독성을 일으키지 않는다.
여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 4-1BB 작동제 항체 (4-1BB agonist antibody), 분리된 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 조합의 투여보다 개체에서 더 적은 독성의 결과를 가져온다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 4-1BB 작동제 항체에 동등한 양, 분리된 IL-15 폴리펩티드의 동등한 양, 또는 이의 조합의 투여보다 개체에서 더 적은 독성의 결과를 가져온다.
여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드의 양과 정량적으로 같은 양 (예를 들어 카피수 또는 몰수에서)이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드와 똑같은 생물학적 활성을 가진 분리된 IL-15 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드와 동등한 양은 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드와 똑같은 치료적 효능을 가진 분리된 IL-15 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드와 똑같은 작동제 활성을 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드와 똑같은 생물학적 활성을 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드와 똑같은 치료적 효능을 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체 양이다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 복합체로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 융합 폴리펩티드다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편에, 링커에 의해서 연결된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번로 11) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커는 (GGGGS)3 (서열번호 12) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 적어도 서열번호 1 과 95% 동동한 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인 (IL-15 receptor alpha sushi-binding domain)을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 복합체로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 융합 폴리펩티드로 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은, IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인에 링커로 연결된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번호: 11) 를 포함하며, 선택적으로 여기서 링커는 (GGGGS)3 (서열번호 12) 링커를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 적어도 서열번호 2 와 95% 동동한 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 면역 살상 세포를 자극하는 방법을 제공하며, 이는 개체에게 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서 제작된 적혈구 세포는 면역 살상 세포를 자극하기에 효과적인 양의 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에게 독성을 일으키지 않는다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서 제작된 적혈구 세포는, 암을 치료하기에 효과적인 양의 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에 독성을 일으키지 않는다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서 제작된 적혈구 세포는 감염성 질환을 치료하기에 효과적인 양의 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에 독성을 일으키지 않는다.
여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 4-1BB 작동제 항체 (4-1BB agonist antibody), 분리된 IL-12 폴리펩티드, 또는 이의 조합의 투여보다 개체에서 더 적은 독성의 결과를 가져온다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 4-1BB 작동제 항체에 동등한 양, 분리된 IL-12 폴리펩티드의 동등한 양, 또는 이의 조합의 투여보다 개체에서 더 적은 독성의 결과를 가져온다.
여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드의 양과 정량적으로 같은 양 (예를 들어 카피수 또는 몰수에서)이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드와 똑같은 생물학적 활성을 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드와 동등한 양은 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드와 똑같은 치료적 효능을 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드와 똑같은 작동제 활성을 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드와 똑같은 생물학적 활성을 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 4-1BB 작동제 항체와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 4-1BBL 폴리펩티드와 똑같은 치료적 효능을 가진 분리된 4-1BB 작동제 항체 양이다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 면역 살상 세포를 자극하는 방법을 제공하며, 이는 개체에게 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서 제작된 적혈구 세포는 면역 살상 세포를 자극하기에 효과적인 양의 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에게 독성을 일으키지 않는다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서 제작된 적혈구 세포는, 암을 치료하기에 효과적인 양의 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에 독성을 일으키지 않는다.
어떤 관점에서, 본 공개는 개체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 다수의 제작된 적혈구 세포의 투여를 포함하며, 여기서 제작된 적혈구 세포는 감염성 질환을 치료하기에 효과적인 양의 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 및 여기서 효과적인 양은 개체에 독성을 일으키지 않는다.
여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 IL-15 폴리펩티드, 분리된 IL-12 폴리펩티드, 또는 이의 조합의 투여보다 개체에서 더 적은 독성의 결과를 가져온다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 IL-15 폴리펩티드의 동등한 양, 분리된 IL-12 폴리펩티드의 동등한 양, 또는 이의 조합의 투여보다 개체에서 더 적은 독성의 결과를 가져온다.
여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 4-1BB 작동제 항체 (4-1BB agonist antibody), 분리된 IL-12 폴리펩티드, 또는 이의 조합의 투여보다 개체에서 더 적은 독성의 결과를 가져온다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 효과적인 양의 투여는 분리된 4-1BB 작동제 항체에 동등한 양, 분리된 IL-12 폴리펩티드의 동등한 양, 또는 이의 조합의 투여보다 개체에서 더 적은 독성의 결과를 가져온다.
여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드의 양과 정량적으로 같은 양 (예를 들어 카피수 또는 몰수에서)이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드와 똑같은 생물학적 활성을 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-12 폴리펩티드와 동등한 양은 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-12 폴리펩티드와 똑같은 치료적 효능을 가진 분리된 IL-12 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드와 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드와 똑같은 양 (예를 들어, 카피수 또는 몰수에서)을 가진 분리된 IL-15 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15과 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드와 똑같은 생물학적 활성을 가진 분리된 IL-15 폴리펩티드 양이다. 여기서 공개되는 방법의 어떤 실시 예에서, 분리된 IL-15 폴리펩티드의 동등한 양은 효과적인 양의 제작된 적혈구 세포에 포함되어 있는 IL-15 폴리펩티드와 똑같은 치료적 효능을 가진 분리된 IL-15 폴리펩티드 양이다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 복합체로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 융합 폴리펩티드다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편에, 링커에 의해서 연결된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번로 11) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 링커는 (GGGGS)3 (서열번호 12) 를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 적어도 서열번호 1 과 95% 동동한 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 첫 번째 외부 유래 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인 (IL-15 receptor alpha sushi-binding domain)을 포함한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 복합체로서 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 융합 폴리펩티드로 존재한다. 어떤 실시 예에서, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은, IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인에 링커로 연결된다. 어떤 실시 예에서, 링커는 GGGGS (서열번호: 11) 를 포함하며, 선택적으로 여기서 링커는 (GGGGS)3 (서열번호 12) 링커를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 융합 폴리펩티드는 적어도 서열번호 2 와 95% 동동한 아미노산 서열을 포함한다.
면역 살상 세포 활성화로부터 혜택을 받을 조건의 처치 (Treatment of Conditions That Would Benefit From 면역 살상 세포 Activation)
전문이 여기 참고 문헌으로 각 병합된, 예를 들어, WO2015/073587 및 WO2015/153102 에 외부 유래 제제 (예를 들어, 폴리펩티드)를 포함하는 (예를 들어, 제시하는) 제작된 적혈구 세포의 투여 방법이 서술된다,
실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 개체, 예를 들어, 포유류, 예를 들어, 인간에 투여된다. 처치될 수 있는 예시적인 포유류는 제한 없이, 인간, 집 동물 (domestic animals)(예를 들어, 개, 고양이 및 이와 유사한 것), 가축 (farm animas) (예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 및 이와 유사한 것) 및 실험동물 (laboratory animals) (예를 들어, 원숭이, 큰 쥐, 생쥐, 토끼, 기니피그 (guinea pigs) 및 이와 유사한 것)이 포함된다. 여기서 서술되는 방법들은 인간 치료 및 수의학적 적용 둘 다에 적용될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 환자에게 매 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월마다 투여 된다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포의 용량은 약 1x109 - 2x109, 2x109 - 5x109, 5x109- 1x1010, 1x1010- 2x1010, 2x1010- 5x1010, 5x1010 - 1x1011, 1x1011 - 2x1011, 2x1011- 5x1011, 5x1011 - 1x1012, 1x1012- 2x1012, 2x1012 - 5x1012, 또는 5x1012 - 1x1013 세포를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 투여된 적혈구 세포의 기능이 환자의 혈류에서 2주에서 1년의 기간에 걸쳐, 예를 들어, 1개월에서 1년 또는 더 길게, 예를 들어 적어도 2주, 4주, 6주, 8주, 3개월, 6개월, 1년, 2년 동안 유지되기에 충분한 투약 용법 (dosing regimen) (용량 및 주기적 투여)으로 환자에게 투여한다.
한 관점에서, 현 공개는 면역 살상 세포를 자극하는 방법을 제공하고, 이는 면역 살상 세포의 활성화를 필요로 하는 개체에, 면역 세포를 자극하기에 효과적인 양으로, 면역 살상 세포를 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포와 접촉시키는 것을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 개체는 암으로 진단되었다.
어떤 실시 예에서, 개체는 감염성 질환을 가졌다.
어떤 관점에서, 본 공개는 여기서 서술된 질환 또는 컨디션을, 예를 들어, 암 또는 감염성 질환을, 치료하기 위한 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포의 사용을 제공한다. 어떤 관점에서, 본 공개는 여기서 서술된 질환 또는 컨디션을, 예를 들어, 암 또는 감염성 질환을, 치료하기 위한 의약품 제조를 위한 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포의 사용을 제공한다.
암 (cancer)
어떤 관점에서, 본 발명은 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 면역 세포를, 특히 여기서 서술된 대로 NK 세포 또는 CD8+ T 세포와 같은, 살상 면역 세포를 자극하기 위하여 제작된 적혈구 세포를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 제작된 적혈구 세포는 개체에서 암을 치료하기에 효과적인 양이 투여된다. 실시 예에서, 개체는 암을 지녔고 및/또는 암으로 진단되었고, 및 그러므로 치료를 필요로한다.
현 공개는 어떤 특정한 유형의 암에 제한하는 것이 아니고, 오히려 어느 유형의 암도 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포에 의해 치료함을 고려한다. 어떤 특정 실시 예에서, 암은, 이것에만 국한하지 않으나, 하기로부터 선택된 암을 포함한다; 급성 림프아구 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia (ALL), 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia) (AML), 항문암 (anal cancer), 담관암 (bile duct cancer), 방광암 (bladder cancer), 뼈암 (bone cancer), 장암 (bowel cancer), 뇌종양 9brain tumors), 유방암 (breast cancer), 미지의 일차 암 (cancer of unknown primary), 뼈로 퍼진 암 (cancer spread to bone), 뇌로 퍼진 암 (cancer spread to brain), 간으로 퍼진 암 (cancer spread to liver), 폐로 퍼진 암 (cancer spread to lung), 암양종 (carcinoid), 자궁경부암 (cervical cancer), 융모막암종 (choriocarcinoma), 만성 림프성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia) (CLL), 만성 골수성 백혈병 (chronic myeloid leukemia) (CML), 결장암 (colon cancer), 직장암 (colorectal cancer), 자궁내막암 (endometrial cancer), 눈 암 (eye cancer), 담낭암 (gallbladder cancer), 위암 (gastric cancer), 임신 영양성 종양 (gestational trophoblastic tumors) (GTT), 모양 세포성 백혈병 (hairy cell leukaemia), 머리 및 목 암 (head and neck cancer), 호츠킨 림프종 (hodgkin lymphoma), 신장암 (kidney cancer), 후두암 (laryngeal cancer), 백혈병 (leukaemia), 간암 (liver cancer), 폐암 (lung cancer), 림프종 (lymphoma), 흑색종 피부암 (melanoma skin cancer), 중피종 (mesothelioma), 기태임신 (molar pregnancy), 입 및 구강인두암 (mouth and oropharyngeal cancer), 골수종 (myeloma), 코 및 부비강 암 (nasal and sinus cancers), 비인두 암 (nasopharyngeal cancer), 비 호츠킨 림프종 (non hodgkin lymphoma) (NHL), 식도암 (oesophageal cancer), 난소암 (ovarian cancer), 췌장암 (panreatic cancer), 음경암 (penile cancer), 전립선암 (prostate cancer), 희귀 암 (rare cancers), 직장암 (rectal cancer), 침샘 암 (salivary gland cancer), 2차 암 (secondary cancers), 피부암 (skin cancer) ((비 흑색종 (non melanoma)), 연 조직 육종 (soft tissue sarcoma), 위암 (stomach cancer), 고환암 (testicular cancer), 감상선암 (thyroid cancer), 미지의 1차 암 (unknown primary cancer), 자궁암 (uterine cancer), 질암 (vaginal cancer), 및 외음부암 (vulval cancer).
어떤 특정 실시 예에서, 치료될 암은 폐암, 간세포암, 흑색종, 및 림프종으로부터 선택된다. 더 나아간 실시 예에서, 림프종은 호츠킨 림프종 또는 비-호츠킨 림프종으로부터 선택된다, 어떤 실시 예에서, 치료될 암은 폐암이다. 어떤 실시 예에서, 암은 간세포암이다. 어떤 실시 예에서, 암은 흑색종이다. 어떤 실시 예에서, 암은 림프종이다. 어떤 실시 예에서, 암은 호츠킨 림프종이다. 어떤 실시 예에서, 암은 비-호츠킨 림프종이다.
어떤 실시 예에서, 치료될 암은 고형 종양이다. 고형 종양에는, 이것에만 국한하지 않으나, 유방암 (breast cancer), 방광암 (bladder cancer), 결장 및 직장암 (colon and rectal cancer), 자궁내막암 (endometrial cancer), 신장 (신장 세포)암 ((kideny (renal cell) cancer)), 폐암 (lung cancer), 흑색종 (melanoma), 췌장암 (pancreatic cancer), 전립선암 (prostate cancer), 갑상선암 (thyroid cancer), 피부암 (skin cancer), 뼈암 (bone cancer), 뇌암 (brain cancer), 자궁경부암 (cervical cancer), 간암 (liver cancer), 위암 (stomach cancer), 입 및 구강암 (mouth and oral cancers), 신경아세포종 (neuroblastoma), 고환암 (testicular cancer), 자궁암 (uterine cancer), 갑상선암 (thyroid cancer), 머리 및 목 (head and neck), 신장 (kidney), 폐 (lung), 비-소세포 폐 (non-small cell lung), 흑색종 (melanoma), 중피종 (mesothelioma), 난소 (ovary), 육종 (sarcoma), 위 (stomach), 자궁 및 중절모종 (uterus and medulloblastoma), 및 외음부 암 (vulvar cancer) 이 포함된다. 어떤 특정 실시 예에서, 치료될 고형 종양은 폐암, 간세포암 또는 흑색종이다. 어떤 실시 예에서, 고형 종양은 폐암이다. 어떤 실시 예에서, 고형 종양은 간세포암이다. 어떤 실시 예에서, 고형 종양은 흑생종이다.
어떤 특정 실시 예에서, 치료될 암은 혈액학적 암이다. 혈액학적 암은 혈액, 골수 또는 림프 시스템에 영향을 주는 암이다. 혈액학적 암은 다섯 번째로 흔히 일어나는 암이고 및 암 사망의 두 번째 원인을 초래하는 암이다. 혈액학적 암의 가장 흔한 형태에는 백혈병, 림프종 및 골수종을 포함한다. 백혈병은 골수가 비정상적인 백색 혈액 세포를 과량 생산할 때 일어나며, 및 영향을 받는 흰색 혈액 세포의 유형에 따라: 골수성 또는 림프성으로 분류된다. 림프종은 림프 시스템의 암이며 악성 백색 혈액 세포의 조절되지 않는 성장의 결과로 림프절에 종양을 형성한다. 림프종은 두 개의 주 유형으로 분류된다: 호킨스 및 비-호킨스 림프종 (Hodgkin's and Non-Hodgkin's lymphoma)(HL alc NHL). 골수종은 비정상적인 혈장 세포 (항체를 생산하는 흰색 혈액 세포의 한 유형)가 골수에 축적될 때 일어난다.
백혈병은 급성 또는 만성인지에 근거하여 4개의 주 유형으로 분류될 수 있다: 급성 골수성 (또는 골수형성) 백혈병 ((Acute myeloid (or myelogenous) leukemia))(AML); 만성 골수성 (또는 골수형성) 백혈병 ((Chronic myeloid (or myelogenous) leukemia)) (CML); 급성 림프성 (또는 림프아구성) 백혈병 ((Acute lymphocytic (or lymphoblastic) leukemia)) (ALL); 만성 림프성 백혈병 ((Chronic lymphocytic leukemia) (CLL). AML 에 대해 초기 치료 후에 많은 환자가 병의 차도를 보이지만 (사인 또는 징후가 없음), 어떤 환자들은 심층적인 처치 후에도 이들의 골수에 잔여 백혈병 세포를 가지고 있다. 이를 "난치성 백혈병 (refractory leukemia)" 이라고 한다. 어떤 환자들은 소멸 (remission)에 도달하고 및 그 후 골수에 백혈병 세포가 다시 돌아오며 및 정상 혈액 세포가 줄어든다. 이는 "재발하는 백혈병 (relapsed leukemia)" 이라고 불린다.
급성 골수성 백혈병 (Acute myeloid leukemia)은, 또는 골수 아세포의 증식이 특징이다. 골수 아세포는 골수를 대체하여 혈소판, 붉은 세포 및 호중구가 최소로 생성된다. 이는 진단시 평균 나이가 68인 주로 노인 질환이다. 2017년에, 미국에서 20,000 이상의 새로운 케이스의 AML이 있었으며 및 10,000명 이상의 사망이 AML이 원인이었다.
표준 최전선 AML 치료는 40 년 이상 변하지 않았다; 심도있는 유도 및 강화 요법. 대부분의 환자가 반응은 하지만, 대부분이 시간이 지남에 따라 재발한다. 그러므로 많은 젊은 AML 환자들은 조혈 줄기세포 이식, HST, 을 거치며, 이는 만약 이식이 성공적일 경우 치유 가능하다. 2016년에, 미국에서는 3,500 이상의 AML 환자가 allo-HSC를 거쳤으며 및 유럽에서는 ,200 이상 이 과정을 거쳤다.
치료에 반응적인 AML를 가지고 있고 및 생존한 환자는 자주 조혈 줄기세포 이식으로 연결되며, 이는 환자의 2/3 에서 치유적일 수 있다. 타종이식 (allogeneic transplant) 후 재발하는 1/3의 환자에 대해서는 ((2015년에 미국에서 AML 환자에 대해 3,235 타종이식 (allogeneic transplants)이 수행 되었다)), 치료가 제한적이며 및 거의 모든 환자는 일 년 기간 내에 사망한다. 이러한 경우, 환자는 주로 T-세포 기능 및 항-종양 면역을 억제하는 면역 체크포인트 관여 (immune checkpoint engagement)(CTLA4-B7 및 PD-1-PDL-1) 때문에 이식 대비 종양 효과 (graft v. tumor effect)의 혜택을 잃어 버린다.
최근에, AML의 치료를 위해 항-CD33 항체 약물 접합제 (anti-CD33 antibody drug conjugate)인 겜튜쮸맵 오조가마이신 (gemtuzumab ozogamicin), 조합 화학요법제 (combination chemotherapy)인, CPX-351, 및 특별한 돌연변이가 있는 환자를 위한 미도스타우린 (midostaurin) 및 에나시데닙(enasidenib)과 같은 추가의 치료제가 승인되었다. 이 치료제들이 반응 비율을 개선하고 및 더 많은 환자를 이식으로 연결 시킬수는 있으나, 전체적인 생존율은 낮게 남아 있다.
NK 세포 및 선천성 면역시스템의 관여는 AML, 및 조혈 줄기세포 이식 후 (post-hematopoietic stem cell transplantation) (HSCT) 잠재적으로 다른 관련되는 혈액학적 악성의 효과적인 면역적 치료에 핵심으로 간주된다. 골수 삭마 (bone marrow ablation) 및 타종이식 (allogeneic transplantation) 후에, NK 세포는 회복되는 첫 번째 림프구 집단이다, 그러나 이들의 살상 및 사이토카인-분비 기능은 건강한 공여자의 NK 세포와 비교하였을 때 제한적이다. NK 세포의 회복률 및 기능은 post-HSCT의 치료 결과와 상관되며, 그러므로 이식 대비 백혈병 효과 (graft versus leukemia effect)를 촉진하기 위하여 post-HSCT에 NK 세포의 수 및 기능의 향상은 AML 치료를 위해 HSCT를 받은 환자의 생존을 증가시키는 잠재력을 가진다.
따라서, 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 AML의 치료에 사용되며, 특별히 타종 HSCT (allogeneic HSCT)을 받았거나 또는 받으려는 스케줄이 있는 환자에서, 이식 반응 및/또는 전반적인 생존을 개선하기 위하여, NK 세포, CD8+ T 세포, 또는 NK 및 CD8+ T 세포 집단을 활성화시킬 의도를 가지고 치료하는 데 사용된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 대로, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하는 제작된 적혈구 세포는 타종 HSCT(allogeneic HSCT)을 받았거나 또는 받으려는 스케줄이 있는 환자에서 AML의 치료에 사용된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 대로, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편, 및 4-1BBL 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 제작된 적혈구 세포는 타종 HSCT(allogeneic HSCT)을 받았거나 또는 받으려는 스케줄이 있는 환자에서 AML의 치료에 사용된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 대로, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편, 및 4-1BBL 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 제작된 적혈구 세포는 타종 HSCT(allogeneic HSCT)을 받았거나 또는 받으려는 스케줄이 있는 환자에서 AML의 치료에 사용된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 대로, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 IL-12 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포는 타종 HSCT(allogeneic HSCT)을 받았거나 또는 받으려는 스케줄이 있는 환자에서 AML의 치료에 사용된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 대로, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 IL-12 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포는 타종 HSCT(allogeneic HSCT)을 받았거나 또는 받으려는 스케줄이 있는 환자에서 AML의 치료에 사용된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 대로, IL-12 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 4-BBL 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포는 타종 HSCT(allogeneic HSCT)을 받았거나 또는 받으려는 스케줄이 있는 환자에서 AML의 치료에 사용된다.
다른 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 재발하는 또는 난치성 AML의 치료에 사용된다. 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 이식 반응 및 전반적인 생존을 개선하기 위하여, NK 세포, CD8+ T 세포, 또는 NK 및 CD8+ T 세포 집단을 활성화시킬 의도를 가지고 타종 HSCT (allogeneic HSCT)을 받았거나 또는 받으려는 스케줄이 있는 환자에게서 재발하는 또는 난치성 AML의 치료에 사용된다. 어떤 특정 실시 예에서, 여기서 서술된 대로, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포는 재발 또는 난치성 AML 치료에 사용된다. 어떤 특정 실시 예에서, 여기서 서술된 대로, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편, 및 4-1BBL 폴리펩티드 및 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포는 재발 또는 난치성 AML 치료에 사용된다. 어떤 특정 실시 예에서, 여기서 서술된 대로, IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 4-1BBL 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포는 재발 또는 난치성 AML 치료에 사용된다. 어떤 특정 실시 예에서, 여기서 서술된 대로, IL-12 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 4-1BBL 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포는 재발 또는 난치성 AML 치료에 사용된다.
실시 예에서, 치료될 환자는, 이식 반응 및 전반적인 생존을 개선하기 위하여, NK 세포 및 CD8+ T 세포 둘 다를 활성 시킬 의도로, 타종 HSCT (allogeneic HSCT)를 받고 있거나 또는 받으려는 스케줄이 있다.
암 유전체 지도 ((The Cancer Genome Atlas (TCGA)) 데이터세트 (dataset) 의 최근 분석은 종양의 유전체적 경관 (genomic landscape)을 종양 면역과 연결했으며, 이는 T 세포 반응을 유도하는데 새로운 항원의 탑재를 암시하며 ((Brown et al., Genome Res. 2014 May; 24(5):743-50, 2014)) 및 면역 침투와 연관된 체세포 돌연변이를 동정하게 한다 (Rutledge et al., Clin Cancer Res. 2013 Sep 15; 19(18):4951-60, 2013). 루네 등은 ((Rooney et al. ( 2015 Jan 15;160(1-2):48-61))은 새로운 항원 및 바이러스는 세포독성 활성을 유도할 것이며, 및 종양이 면역 공격에 저항하도록 하는 알려진 및 새로운 돌연변이를 보인다고 제안하고 있다. 그러므로 어떤 특정 실시 예에서, 치료될 암은 종양성 바이러스와 연관된 암이다. 제한적이지 않은 종양성 바이러스의 예에는, 예를 들어, 엡스타인 바 바이러스 (Epstein Barr virus) (EBV), 간염 바이러스 B 및 C (hepatitis B and C) (HBV 및 HCV), 인간 파필로마 바이러스 (human papilloma virus) (HPV), 카포시 살코마 바이러스 (Kaposi sarcoma virus) (KSV), 및 폴리오마 바이러스 (polyoma viruses) 가 포함된다. 다른 특정 실시 예에서, 암은 레트로바이러스 에피톱 (retrovirus epitopes) 이 동정 된 암이다. 바이러스와 연관된 암 및 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암은, 이것에만 국한하지 않으나, 자궁경부암, 머리 및 목 암, 림프종, 및 신장 투명 세포 육종(kidney clear cell carcinoma)이 포함된다.
낮은 MHC 유형 I 발현을 지닌 암 (Cancers with low MHC Class I expression)
T-세포에 의한 검출 및 파괴를 위해 암세포에서 MHC I 발현이 요구된다. 세포독성 T 림프구 (Cytotoxic T lymphocytes)(CTLs, CD8+) 는 자기 (self) 및 비-자가 (non-self)를 묘사하기 위해 타겟 세포에 MHC 유형 I에 의한 종양 항원 제시가 필요하다. 종양이 숙주 면역 반응을 회피하는 가장 흔한 방법의 하나는 MHC 유형 I 분자의 발현을 하향 조절하여, 종양이 낮은 MHC 유형 I 분자를 갖게 하고, 이로써 어느 내부 유래 또는 치료적 항-종양 T 세포 반응을 효과가 없게 만드는 것이다 ((Haworth et al., Pediatr Blood Cancer. 2015 Apr; 62(4): 571-576)). 가장 자주, 종양 세포에 MHC 발현의 손실은 MHC 부위 및/또는 항원 처리 기구 (antigen processing machinery)의 후생적 이벤트 (epigenetic events) 및 전사적 하향-조절에 의해 매개된다. 빈 MHC 분자는 세포 표면에서 안정적이지 않기 때문에 처리된 펩티드의 부족은 감소된 MHC 발현을 초래한다.
다양한 성인 종양에서 MHC 유형 I 발현은 하기 표 7 에서 보여준다. 다양한 소아암에서 MHC 유형 I 발현은 하기 표 8 에서 보여준다. MHC 발현에 관한 한 심도있게 연구된 소아암은 신경아세포종이며, 이는 특히 고-위험도 환자에서, 낮은 MHC 유형 I 발현을 가졌다,
표 7
Figure pct00009
표 8
Figure pct00010
NK 세포는 선천성 면역에 기여하는 림프구의 서부세트로, CTLs과 똑같은 살상 기전을 사용하여 사전 민감화 (prior sensitization) 없이 종양세포를 용해할 능력이 있다. 사이토카인 분비 및 세포독성을 포함하는, 자연 살상 반응성은 살상 면역글로블린-유사 수용체 (killer immunoglobulin-like receptors) (KIRs) 및 자연 세포독성 수용체 (natural cytotoxicity receptors) (NCRs) 와 같은 몇 가지 생식-계열에서 암호화하는 억제적 및 활성적 수용체들의 균형에 의해 조절된다. 타겟 세포에 MHC 유형 I 분자의 존재는 NK 세포에의 MHC 유형 I-특이 수용체, 살상 세포 면역글로블린-유사 수용체 (Killer cell Immunoglobulin-like Receptor) (KIR), 에 대한 억제적 리간드와 같이 작용한다. KIR 수용체의 관여는 NK 활성화를 차단하고 및 역설적으로, 불활성화 신호를 촉발하여 연이은 접촉에 대해 반응할 이들의 능력을 보존한다. 그러므로 KIR이 MHC 유형 I에 충분히 결합할 수 있다면, 이의 관여는 살상 신호를 무시하게 되고 및 타겟 세포가 생존하게 한다. 반대로, 만약 NK 세포가 타겟 세포에의 MHC 유형 I에 충분히 결합하지 못하면, 타겟 세포의 살상이 진행 된다. 따라서 MHC 유형 I을 낮게 발현하는 종양 및 T-세포-매개하는 공격을 회피할 능력이 있다고 생각되는 종양은 실제로 NK-세포-매개하는 면역 반응에 대신 민감하다.
그러므로 어떤 특정 실시 예에서, 본 발명의 제작된 적혈구 세포는 낮은 MHC 유형 I 제시의 특징이 있는 암을 치료하는데 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 제작된 적혈구 세포는 표 7 및 8에 제시된 낮은 MHC I 제시로 특징이 있는 암을 치료하는데 사용된다. 어떤 실시 예에서, 본 발명의 제작된 적혈구 세포는 표 7에 제시된 낮은 MHC I 제시로 특징이 있는 암을 치료하는데 사용된다. 다른 실시 예에서, 본 발명의 제작된 적혈구 세포는 표 8에 제시된 낮은 MHC I 제시로 특징이 있는 암을 치료하는데 사용된다. 어떤 실시 예에서, 낮은 MHC I 제시를 가진 암은 결장 종양 (colorectal carcinoma) 이다. 어떤 실시 예에서, 낮은 MHC I 제시를 가진 암은 유방 선암 (breast adenocarcinoma) 이다. 어떤 실시 예에서, 낮은 MHC I 제시를 가진 암은 자궁내막 종양 (endometrial carcinoma) 이다. 어떤 실시 예에서, 낮은 MHC I 제시를 가진 암은 자궁경부 종양 (cervical carcinoma) 이다. 어떤 실시 예에서, 낮은 MHC I 제시를 가진 암은 머리 및 목 종양 (head and neck carcinoma) 이다. 어떤 실시 예에서, 낮은 MHC I 제시를 가진 암은 전립선 종양 (prostate carcinoma) 이다. 어떤 실시 예에서, 낮은 MHC I 제시를 가진 암은 흑색종 (melanoma) 이다. 어떤 실시 예에서, 낮은 MHC I 제시를 가진 암은 폐 종양 (lung carcinoma) 이다. 어떤 실시 예에서, 낮은 MHC I 제시를 가진 암은 신경아세포종 (neuroblastoma) 이다. 어떤 실시 예에서, 낮은 MHC I 제시를 가진 암은 어윙 육종/PNET (Ewing sarcoma/PNET) 이다.
스트레스 리간드의 조절을 지닌 암 (cancers with Modulation of Stress Ligands)
다른 실시 예에서, 본 발명의 제작된 적혈구 세포로 치료되는 암은 NK 수용체 관여를 변경시킬 세포 스트레스의 효과를 보이는 (활성화 또는 억제하는) 종양의 특징이 있다. 예를 들어, 암세포는 일반적으로 저산소 (hypoxia), 만성 증식 신호 (proliferative signals) (즉, Ras 돌연변이를 항상 활성화하기 때문에), 및 진행중인 유전체 불안정성 (ongoing genomic instability) 때문에 항상 세포적 스트레스의 상태로 존재한다. 많은 암세포는 그러므로 세포 표면에 살상 활성화 수용체 (killer activating receptor)(KAR) 리간드를 상향조절하여, 이들이 NK 세포 살상에 민감하게 한다. 그러나 스트레스 리간드의 조정은 NK 세포 인식을 감소시키기 위해 암세포가 사용하는 중요한 회피기전이다. 예를 들어, 스트레스 리간드 ULBP2는 종양 세포에서 자주 과발현되는 RNA-결합 단백질에 의해 억제될 수 있다. 이 종양 단백질 (oncogenic protein)이 ULBP2 mRNA에 결합하여 mRNA의 안정성이 감소하고 및 세포 표면에서 ULBP2의 수준이 하향 조절된다. 그 결과로, 종양세포는 NK 세포 인식으로부터 보호된다 (Schmiedel D, et al. Elife (2016) 5:e13426). NK 세포의 억제는 또한 신경아세포종 (neuroblastoma) 은 물론 머리 및 목 종양 (head and neck carcinoma)에서 보여준 대로, 스트레스 리간드 MICA의 용해성 형태를 통한 NKG2D의 차단으로 일어날 수 있다. 그러므로 어떤 실시 예에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 스트레스 리간드 또는 KAR 리간드가 상향조절 되는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이론에 얽매이지 않기를 바라며, NK 세포 살상에 민감한, 그러한 암은 특히 NK 세포의 수 및/또는 활성의 증가에 특히 반응적일 것으로 기대한다. 다른 실시 예에서, 본 발명은 스트레스 리간드의 수준 또는 활성이 하향조절 되거나 또는 억제된 암을, 예를 들어, 스트레스 리간드 또는 KAR 리간드의 억제자가 발현된 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이론에 얽매이지 않기를 바라며, 억제자의 존재 때문에 NK 세포 살상에 덜 민감한, 그러한 암은 NK 세포의 수 및/또는 활성의 증가로부터 혜택을 받을 것이라고 기대된다.
4-1BB 작동제에 비-반응적인 특징인 암 (Cancers Characterized by Non-responsiveness to 4-1BB Agonists)
다른 실시 예에서, 본 발명의 제작된 적혈구 세포로, 예를 들어, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포로, 치료되는 암은, 4-1BB 작동제에 비-반응적인 특징이 있다. 어떤 실시 예에서, 암의 4-1BB 작동제의 비-반응성은 높은 용량에서 독성, 예를 들어, 간 독성, 때문이다, 따라서, 현 공개는 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포를 투여하여 예를 들어, 4-1BB 작동제에 대한 독성 때문에, 하나 또는 그 이상의 4-1BB 작동제에 비-반응성인 암을 지닌 개체를 치료하는 방법을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 4-1BB 작동제 항체는 이 분야 기술에서 알려진 어느 4-1BB 작동제 항체일 수 있다. 어떤 실시 예에서, 4-1BB 작동제 항체는 우토밀루맵 (utomilumab) 이다 (예를 들어, International Patent Application Publication No. WO2012/032433: 그 전문이 여기에 참고 문헌으로 병합됨, 참조). 어떤 실시 예에서, 4-1BB 작동제 항체는 INBRX-105이다 (예를 들어, International Patent Application Publication No. WO2017/123650; 그 전문이 여기에 참고 문헌으로 병합됨, 참조). 어떤 실시 예에서, 4-1BB 작동제 항체는 ADG106이다 (예를 들어, International Patent Application Publication No. WO2019/036855; 그 전문이 여기에 참고 문헌으로 병합됨, 참조). 어떤 실시 예에서 4-1BB 작동제 항체는 우레루맵 (urelumab) 이다 (예를 들어, International Patent Application Publication No. WO2005/035584; 그 전문이 여기에 참고 문헌으로 병합됨, 참조).
어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 4-1BB 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 4-1BBL 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-12 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 4-1BBL 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다.
체크포인트 억제에 반응적인 특징이 있는 종양 (umors Characterized by Response to Checkpoint Inhibition)
체크포인트 억제제 (checkpoint inhibitors) 가 암 치료를 혁신적으로 만들었으나, 이들의 제한은 점점 분명해지고 있다. 반응은 어떤 특정 종양 유형에 국한되고 및 단지 몇 명의 환자만 치유된다. 현재, 면역요법의 도전은 더 많은 종양 유형에 체크포인트 억제제의 효능을 확장하는 것은 물론 반응의 비율, 깊이, 및 지속성을 증가시키는 데 있다. 면역 시스템의 양쪽 팔을 자극함으로써, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 체크포인트 억제제와 조합하여 사용하여 반응의 개선 및 확장을 둘 다 한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 4-1BBL 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-12 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 4-1BBL 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 IL-12 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다.
어떤 특정 실시 예에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 체크포인트 억제제에의 반응성으로, 예를 들어, 반응적 또는 무반응적으로, 특징지어지는 암을 치료하는데 사용된다.
PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, CCR4, OX40, OX40L, IDO, 및 A2AR 와 같은 면역 체크포인트 분자는 종양 미세환경에서 T-세포 반응을 조절하는데 중요한 역할을 하는 세포 표면의 신호전달 수용체이다. 종양 세포들은 이들의 발현 및 활성을 상향 조절하여 이러한 체크포인트를 이들에게 유리하게 사용하여, 이로써 항-종양 면역 반응을 회피한다.
어떤 인간 종양은, 그러나, 환자의 면역 시스템에서 제거될 수 있다. 예를 들어, CT LA-4 및 PD-1/PD-L1 axis와 같은 체크포인트 분자들을 타겟으로 하는 면역 체크포인트 억제제는 몇 가지 유형의 암에서 임상적 활성을 보였으며 및 완전한 반응 및 종양 소멸을 초래했다. 면역 체크포인트 억제제는 동시-억제적 T-세포 신호전달 (co-inhibitory T-cell signalling) 을 방해함으로써 항-종양 면역 반응에 활기를 불어넣는다. 특히, 항-CTLA-4 및 항-PD-1 항체의 작용 기전은 각각 CTLA-4 및 PD-1의 억제를 통해서이며, 이는 항-종양 면역 반응으로부터 보호로서 종양이 끌어낸다. 이 체크포인트 분자들을 억제함으로써 (예를 들어, 길항적 항체로), 환자의 CD8+ T 세포는 증식하게 될 수 있고 및 종양세포를 파괴할 수 있다. 그러나 체크포인트 억제제 치료를 받은 암 환자의 대부분은 암 및 치료적 중재에 따라 12개월 내에 진전이 될 것이다. MHC 복합체는 면역 시스템에서 중요한 결합 (nexus) 이다; 이는 T 세포가 암세포를 인식하고 및 죽이는 방법이다, 그러나 이는 또한 NK 세포의 살상 기능을 차단한다. 체크포인트 억제제에 저항성을 갖는 흔한 방법은 MHC 발현의 손실로 암을 T 세포에 보이지 않게 만드는 것이다, 그러나 그 결과 이는 NK 세포 의존성 살상에 민감하게 된다. 종양 세포에서 MHC 제시의 하향 조절 및 주변 부위에서 T-세포 소진은 이러한 면역치료 저항성에 기여한다.
따라서, 어떤 실시 예에서, 여기서 서술한 대로 제작된 적혈구 세포는 체크포인트 억제제에 반응했거나, 반응적이거나, 또는 반응적이라고 알려진 암을 (예를 들어, 고형 종양 또는 혈액학적 암) 치료하는데 사용된다. 예를 들어, 세포독성 T-림프구 항원 4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4)(CTLA-4), 프로그램된 죽음-1 (programmed death-1) (PD-1) 또는 이의 리간드 (PD-L1) 와 같은 면역 시스템 체크포인드를 타겟하는 많은 면역조절 제제는, 악성 흑색종 (malignant melanoma), 비-소 세포 폐암 (non-small cell lung cancer), 신장 세포 종양 (renal cell carcinoma), 고전적 호츠킨 림프종 (classical Hodgkin lymphoma), 및 재발하는 또는 전이성 머리 및 목 편평상피 세포 종양 (head and neck squamous cell carcinoma)을 포함하는 다수의 암의 치료에 대해 규제 허가를 받았다. 그러므로 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 PD-1 반응성 종양이 특징인 암을 치료하는데 사용된다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 그러한 암을 치료하기 위하여 체크포인트 억제제와 조합하여 투여하거나 또는 사용된다. 그러한 방법에서 적절한 체크포인트 억제제는 여기서 서술된다.
다른 실시 예에서, 여기서 서술된 대로 제작된 적혈구 세포는 체크포인트 억제제에 더는 반응하지 않는 환자의 고형암을 치료하는데 사용된다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 혼자 단독치료제로서 체크포인트 억제제에 더는 반응하지 않는 환자의 고형암을 치료하는데 사용된다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 체크포인트 억제제와 조합하여 체크포인트 억제제에 더는 반응하지 않는 환자의 고형암을 치료하는데 사용된다. 어떤 실시 예에서, 고형암은 흑색종, 비-소 세포 폐암, 신장 세포 종양, 방광암, 및 머리 및 목 암으로부터 선택된다.
상기 논의된 대로, MHC 복합체는 면역 시스템에서 중요한 결합이다; 이는 T 세포가 암세포를 인식하고 및 죽이는 방법이다, 그러나 이는 또한 NK 세포의 살상 기능을 차단한다. 체크포인트 억제제에 저항성인 흔한 방법은 MHC 발현의 손실로 암세포를 T 세포에 안보이게 만드는 것이다, 그러나 이 결과로 NK 세포 의존성 살상에 민감하게 된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 대로 제작된 적혈구 세포는, MHC 발현의 손실 때문에 체크포인트 억제제 치료요법으로 진전된 환자 집단을 치료하는데 사용된다.
예를 들어, 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 대로 제작된 적혈구 세포는 PD-1 및 PD-L1 또는 PD-L2 중 하나를 차단, 감소 및/또는 억제하는 제제, 및/또는 PD-1의 PD-L1 또는 PD-L2와의 결합을 차단, 감소 및/또는 억제하는 제제와 조합하여 사용될 수 있다 ((비-제한적인 예로서, 하나 또는 그 이상의 니볼루맵 (nivolumab) (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO, BRISTOL MYERS SQUIBB), 펨브롤리쥬맵 (pembrolizumab) (KEYTRUDA, Merck), 피딜리쥬맵 (pidilizumab) (CT-011, CURE TECH), MK-3475 (MERCK), BMS 936559 (BRISTOL MYERS SQUIBB), 및 MPDL328OA (ROCHE)). 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 대로 제작된 적혈구 세포는 CTLA-4의 활성을 및/또는 CTLA-4의 하나 또는 그 이상의 CTLA-4의 수용체 (예를 들어, CD80, CD86, AP2M1, SHP-2, 및 PPP2R5A)와의 결합을 차단, 감소 및/또는 억제하는 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, CTLA-4의 활성을 억제하는 제제는 비-제한적인 방법으로, 이필리무맵 (ipilimumab) (MDX-010, MDX-101, Yervoy, BMS) 및/또는 트래멜리무맵 (tremelimumab) (Pfizer)과 같은, 항체이다. 더 나아가, 여기서 제공되는 제작된 적혈구 세포는, 예를 들어, BTLA, HVEM, TIM3, GALS, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160 (또한, BY55로도 언급됨), CGEN-15049, CHK 1 및 CHK2 키나아제 (kinases), A2aR, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), GITR, GITRL, 갈렉틴-9 (galectin-9), CD244, CD160, TIGIT, SIRPα, ICOS, CD172a, TMIGD2 및 다양한 B-7 계 리간드 (including, 이것에만 국한하지 않으나, B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 및 B7-H7를 포함하는) 와 같은 면역 체크포인트 분자를 타겟으로 하는 차단 항체들 하나 또는 그 이상과 함께 조합으로 사용될 수 있다.
어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 대로 제작된 적혈구 세포는 항-PD-1 항체와 조합하여 투여된다.
여기서 서술된 대로 제작된 적혈구 세포로 치료는 T-세포뿐만 아니라 NK 세포의 활성화를 북돋우게 하는 기능을 할 수 있으며 및 이로써 국부적인 적응적 면역 반응 (local adaptive immune response) 을 재활성화하고, 암을 체크포인트 억제제에 재-감응하게 하고, 및 선천적 면역 반응의 활성화를 통해 추가적으로 또는 협동적으로 종양 살상을 강화한다.
선행 치료 방법의 특정한 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 특정한 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다.
선행 치료 방법의 특정한 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 인터루킨-12 p40 (IL-12 p40) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 인터루킨-12 p35 (IL-12 p35) 폴리펩티드 및 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 특정한 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 인터루킨-12 p40 (IL-12 p40) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 인터루킨-12 p35 (IL-12 p35) 폴리펩티드 및 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다.
선행 치료 방법의 특정한 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 인터루킨-12 p40 (IL-12 p40) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 인터루킨-12 p35 (IL-12 p35) 폴리펩티드 및 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 특정한 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 인터루킨-12 p40 (IL-12 p40) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 인터루킨-12 p35 (IL-12 p35) 폴리펩티드 및 이의 단편을 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 4-1BBL 폴리펩티드를 포함하는 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다.
높은 돌연변이 부담을 지닌 암 (Cancers with High Tumor Mutational Burden)
종양은 이들이 성장함에 따라 이들의 유전적 재료에 돌연변이를 축적할 수 있다. 이러한 체세포 돌연변이는 세포 분열 동안에 새로운 암세포에 전달될 수 있다. 종양 세포에서 얻어진 돌연변이는 단백질의 발현을 바꿀 수 있어, 새로운 항원형성의 결과를 가져온다. 종양 돌연변이 부담 (Tumor mutation burden) (TMB)은 종양 세포에 의해 운반되는 돌연변이의 척도이다. TMB는 진행 암의 범위에서 면역치료요법에 대해 반응을 예측하는 새로운 임상적 마커이다. 단백질-근거한 바이오마커와는 달리, TMB는 종양 유전체 암호화 부분당 총 돌연변이 수의 정량적 척도이다. 더 높은 수준의 TMB를 갖는 종양은 더 많은 신규항원을 발현한다고 믿으며, 이는 좀 더 탄탄한 면역 반응을 하게 하고 및 그러므로 면역치료요법에 좀 더 오랜 반응을 하게 한다. 그러므로, 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 높은 돌연변이 부담을 갖고 있는 특징이 있는 종양을 치료하는데 사용된다.
혈관 생성된 종양/새는 혈관구조 (Vascularized Tumors/ Tumors with Leaky Vasculature)
다른 실시 예에서, 본 공개의 제작된 적혈구 세포는 혈관 생성이 높은 종양을 치료하는데 사용된다. 이론에 얽매임이 없이, 혈관 생성이 더 크면 현 공개의 제작된 적혈구 세포에 종양의 접근이 좀 더 가능하도록 한다. 종양의 혈관분포는, 예를 들어, 모세관 사이의 거리 (종양의 산소화를 반영한다고 생각한다) 및 미세 혈관의 밀도에 (종양 신생혈관 생성의 조직학적 평가를 제공한다) 의해서 측정될 수 있다. 혈관생성이 높은 종양은 맥관 기원의 어느 종양일 수 있다, 예를 들어, 혈관종 (hemangioma), 림프관종 (lymphangioma), 혈관 내피종 (hemangioendothelioma), 카포시육종 (Kaposi sarcoma), 혈관 육종(angiosarcoma), 혈관모 세포종 (hemangioblastoma).
다른 실시 예에서, 본 공개의 제작된 적혈구 세포는 누수가 있는 혈관구조를 가진 종양을 치료하는데 사용된다. 일반적으로 종양에 있는 혈관은 비정상적이라는 것에 동의한다. 이런 비정상에 대한 한 증후는 결함이 있고 및 새는 내피다. 혈관이 새는 것은 종양의 내부 환경에 영향을 줄 뿐만 아니라, 이는 또한 치료제의 접근을 좌우한다. 이론에 얽매임이 없이, 새는 혈관은 현 공개의 제작된 적혈구 세포에 접근을 좀 더 제공한다.
감염성 질병 (Infectious Diseases)
어떤 관점에서, 본 발명은 개체에서 감염병을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 개체에 면역 세포를, 예를 들어, 면역 살상 세포를, 자극하도록 제작된 적혈구 세포를 개체에서 투여하는 것을 포함한다. 제작된 적혈구 세포는 개체에서 감염성 질환을 치료하기에 효과적인 양으로 투여된다.
어떤 특정 실시 예에서, 감염성 질환은 바이러스성 감염에 의해 원인이 된다.
본 발명의 제작된 적혈구 세포로 치료되는 바이러스성 감염에는 아데노바이러스 (adenovirus), 헤르페스 심플렉스 유형 1 (herpes simplex type 1), 헤르페스 심플렉스 유형 2 (herpes simplex type 2), 인간 사이토메갈로바이러스 (human cytomegalovirus), 인간 헤르페스바이러스 유형 8 (human herpesvirus type 8), 바리셀라-조스터 바이러스 (varicella-zoster virus), 간염 B 바이러스 (hepatitis B virus), 간염 C 바이러스 (hepatitis C viruses), 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus) (HIV), 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 홍역 바이러스 (measles virus), 볼거리 바이러스 (mumps virus), 파리인플루엔자 바이러스 (parainfluenza virus), 호흡기 세포융합 바이러스 (respiratory syncytial virus), 유두종 바이러스 (papillomavirus), 공수병 바이러스 (rabies virus), 및 루벨라 바이러스 (Rubella virus) 가 포함된다. 다른 바이러스 타겟에는 파라믹소베리다에 (Paramyxoviridae)((예를 들어, 폐렴 바이러스 (pneumovirus), 모빌리 바이러스 (morbilliv irus), 메타폐렴바이러스 (metapneumovirus), 레스피로바아러스 (respirovirus) 또는 루불라바이러스 ( rubulavirus)), 마데노비리다에 (Adenoviridae) ((예를 들어, 아데노바이러스 ( adenovirus)), 아레나비리다에 (Arenaviridae) ((예를 들어, 림프구성 맥락수막염 바이러스 (lymphocytic choriomeningitis virus)와 같은 아레나바이러스 ( arenavirus)) 아테리비리다에 (Arteriviridae) ((예를 들어, 돼지 호흡기 및 생식 증후군 바이러스 (porcine respiratory and reproductive syndrome virus) 또는 말 동맥염 바이러스 (equine arteritis virus)), 분야비리다에 (Bunyaviridae) ((예를 들어, 플레보바이러스 (phlebovirus) 또는 한타바이러스(hantavirus)), 칼리시비리다에 (Caliciviridae) ((예를 들어, 노루워크 바이러스 (Norwalk virus)), 코로나비리디에 (Coronaviridae) ((예를 들어, 코로나바이러스 (coronavirus) 또는 토로바이러스 torovirus)), 필로비리다에 (Filoviridae) ((예를 들어, 에볼라-유사 바이러스 (Ebola-like viruses)),플라비비리다에 (Flaviviridae) ((예를 들어, 헤파시바이러스 (hepacivirus) 또는 플라비바이러스 (flavivirus)), 헤르페스비리다에 (Herpesviridae)((예를 들어, 심플렉스바이러스 (simplexvirus), 바리셀로바이러스 (varicellovirus), 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus), 로세올로바이러스 (roseolovirus), 또는 림포크립토바이러스 (lymphocryptovirus)), 오르토믹소바이러스 (Orthomyxoviridae) ((예를 들어, 인풀루엔자 바이러스 (influenza virus) 또는 토고토바이러스 (thogotovirus)), 파보비리다에 (Parvoviridae)((예를 들어, 파보바이러스 (parvovirus)), 피코마비리다에 (Picomaviridae) ((예를 들어, 엔테로바이러스 (enterovirus) 또는 헤파토바이러스 (hepatovirus)), 폭스비리다에 (Poxviridae) ((예를 들어, 오르토폭스바이러스 (orthopoxvirus), 아비폭스바이러스 (avipoxvirus), 또는 레포리폭스바이러스 (leporipoxvirus)), 레트로비리다에 (Retroviridae) ((예를 들어, 렌티바이러스 (lentivirus) 또는 스푸마바이러스 ( spumavirus)), 레오비리다에 (Reoviridae) ((예를 들어, 로타바이러스 (rotavirus)), 랩도비리다에 (Rhabdoviridae) ((예를 들어, 리사바이러스 ( lyssavirus), 노비랍도바이러스 (novirhabdovirus), 또는 베시큘로바이러스 (vesiculovirus), 및 토가비리다에 (Togaviridae) ((예를 들어, 알파바이러스 (alphavirus) 또는 루비나이러스 (rubivirus))가 포함 된다. 이러한 바이러스의 특정한 예에는 인간 호흡기 코로나바이러스 (human respiratory coronavirus), 인푸루엔자 바이러스 (A-C), (influenza viruses A-C), 간염 바이러스 A 에서 G (hepatitis viruses A to G), 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 1-9 (herpes simplex viruses 1-9)이 포함된다.
어떤 특정 실시 예에서, 바이러스 감염은 아데노바이러스 (adenovirus), 엡스타인 바 바이러스 (Epstein barr virus) (EBV), 간염 B 바이러스 (hetpatitis B virus) (HBV), 결핵 (tuberculosis), 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficientcy virus) (HIV), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus) (HSV), 파필로마 바이러스 (papilloma virus) 및 사이토메갈로바이러스 ( cytomegalovirus)로부터 산택된 바이러스에 의해 원인이 된다.
다른 실시 예에서, 바이러스감염은 MHC I 제시가 하향-조절 (down-regulation) 인 것이 특징이다. 인간 바이러스는 CTL 용해를 피하기 위하여 MHC 유형 I 경로 (MHC type I pathway) 를 억제하는 다양한 기전을 적용한다. MHC 유형 I 경로를 방해하는 단백질의 예는 아데노바이러스 (adenoviruses) 및 레트로바이러스 (retroviruses ) 에 의해 암호화된다 (Tortorella et al., Annu Rev Immunol. 2000; 18():861-926). 이들에는 아데노바이러스 E3/19K (adenovirus E3/19K) 및 인간면역결핍 바이러스-1 (human immunodeficiency virus-1) (HIV-1) Nef 유전자 산물이 포함된다. 헤르페스 바이러스 (Herpes viruses)는 면역능력이 있는 숙주에서 지속적인 일생 동안의 감염을 확립하고, 및 전부가 아니라면 거의 모든 헤르페스 바이러스는 MHC 유형 I 항원 제시를 억제하는 단백질을 암호화하며, 및 이 단백질들은 바이러스가 CTL에 의해 검출되는 것을 회피하게 하는 중요한 역학을 한다. 이는 인간 사이토메갈로바이러스 (human cytomegalovirus) (HCMV)로 예시가 되며, 여기서 바이러스 유전체의 유일한 짧은 부위에서 MHC 유형 I 경로를 방해하는 적어도 다섯 단백질을((US2, US3, US6, US10 및 US11) 암호화한다.
MICB는 수용체 NKG2D를 활성화하는 자연 살상 (natural killer) (NK) 세포의 스트레스-유도된 리간드이며 및 NK 세포가 바이러스-감염된 세포 및 종양 세포를 죽이는데 대단히 중요하다. NK 세포 살상을 회피하는 다른 예에서, MICB 발현은 바이러스 감염 동안에 하향-조절되어, NKG2D의 결합이 감소하고, 및 NK 세포에 의한 살상이 감소한다. 그러므로 어떤 실시 예에서, 본 발명은 하향 조절된 MICB와 연관된 바이러스 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 NK 세포에 의한 바이러스적으로 감염된 세포의 살상이 증가된다.
어떤 특정 실시 예에서, 감염성 질환은 박테리아 감염에 의한 원인이 된다.
본 발명의 제작된 적혈구 세포로 처치되는 박테리아 감염은, 이것에만 국한하지 않으나, 마이코박테리아 (Mycobacteria), 리케차 (Rickettsia), 마이코플라즈마 (Mycoplasma), 네이세리아 매닌지티데스 (Neisseria meningitides), 네이세리아 고노레오에아에 (Neisseria gonorrheoeae), 레지오넬라 (Legionella), 비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae), 스트렙토콕사이 (Streptococci), 스트렙토코거스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코크스 에피더미스 (Staphylococcus epidermidis), 슈도모나스 아우리기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 코리노박테리아 디프테리아에 (Corynobacteria diphtheriae), 클로스트리디움 spp. (Clostridium spp.), 장 독소 생성 대장균 (enterotoxigenic Eschericia coli), 바실러스 아트락시스 (Bacillus anthracis), 리케차 (Rickettsia), 바토넬라 핸셀라에 (Bartonella henselae), 바토넬라 퀸타나 (Bartonella quintana), 콕시엘라 버네티 (Coxiella burnetii), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 마이코박테리움 레프라에 (Mycobacterium leprae), 살모넬라 (Salmonella);쉬겔라(Shigella); 예르시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica); 예르시니아 슈도튜버큘로시스 (Yersinia pseudotuberculosis); 레지오넬라 뉴모필리아 (Legionella pneumophila); 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis); 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes); 마이코플라스마 속 (Mycoplasma spp.); 슈도모나스 풀루오레센스 (Pseudomonas fluorescens); 비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae); 헤모필러스 인플랜자에 (Haemophilus influenzae); 바실러스 안트락시스 (Bacillus anthracis); 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum); 렙토스피라 (Leptospira); 보렐리아 (Borrelia); 코르네박테리움 디프테리아에 (Corynebacterium diphtheriae); 푸란시셀라 (Francisella); 브루셀라 멜리텐시스 (Brucella melitensis); 캠필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni); 엔테로박터 (Enterobacter); 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis); 프로테우스 (Proteus); 및 크렙시엘라 뉴모니아에 (Klebsiella pneumoniae) 가 포함된다.
개체 (Subjects
여기서 서술된 방법들은 이 방법들로 혜택을 경험할 수 있을 어느 개체에 사용할 의도가 있다. 그러므로, "개체 (subjects)," "환자 (patients)," 및 "개인 (individuals)" (서로 교환될 수 있게 사용) 은 사람은 물론 비-인간 개체, 특히 가축을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 개체 및/또는 동물은 포유류, 예를 들어, 인간, 생쥐 (mouse), 큰 쥐(rat), 기니 피그 (guinea pig), 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 토끼, 양, 또는 원숭이, 침팬지 또는 바본 (baboon)과 같은 비-인간 영장류이다. 다른 실시 예에서, 개체 및/또는 동물은 비-포유류이다. 어떤 실시 예에서, 개체 및/.또는 동물은 인간이다. 어떤 실시 예에서, 인간은 소아 인간 (pediatric human) 이다. 다른 실시 예에서, 인간은 성인 인간 (adult human) 이다. 다른 실시 예에서, 인간은 노인 인간이다. 다른 실시 예에서, 인간은 환자을 의미한다.
어떤 특정 실시 예에서, 인간은 나이가 약 0개월에서부터 약 6개월, 약 6개월에서부터 약 12개월의 나이, 약 6개월에서부터 약 18개월의 나이, 약 18개월에서부터 약 36개월의 나이, 약 1살에서부터 약 5살의 나이, 약 5살에서부터 약 10살의 나이, 약 10살에서부터 약 15살의 나이, 약 15살에서부터 약 20살의 나이, 약 20살에서부터 약 25살의 나이, 약 25살에서부터 약 30살의 나이, 약 30살에서부터 약 35살의 나이, 약 35살에서부터 약 40살의 나이, 약 40살에서부터 약 45살의 나이, 약 45살에서부터 약 50살의 나이, 약 50살에서부터 약 55살의 나이, 약 55살에서부터 약 60살의 나이, 약 60살에서부터 약 65살의 나이, 약 65살에서부터 약 70살의 나이, 약 70살에서부터 약 75살의 나이, 약 75살에서부터 약 80살의 나이, 약 80살에서부터 약 85살의 나이, 약 85살에서부터 약 90살의 나이, 약 90살에서부터 약 95살의 나이, 약 95살에서부터 약 100살의 나이의 범위에 있다.
다른 실시 예에서, 개체는 비-인간 동물이며, 및 그러므로 본 공개는 수의과적인 용도에 적용된다. 특별한 실시 예에서, 비-인간 동물은 집안의 애완동물 (household pet) 이다. 다른 특별한 실시 예에서, -인간 동물은 가축 동물 (livestock animal) 이다. 어떤 특정한 실시 예에서, 개체는 화학요법치료를 받을 수 없는 인간 암 환자이다, 예를 들어, 환자는 화학요법치료에 무반응성이거나 또는 너무 아파서 화학요법치료의 적절한 치료 범위를 가질 수 없는 (예를 들어, 너무 많은 용량- 또는 용법-제한하는 부작용을 경험하는) 환자다. 어떤 특정 실시 예에서는, 개체는 진행된 및/또는 전이된 질환을 가진 인간 암 환자다.
어떤 실시 예에서, 개체는 면역 살상 세포를 자극하기 위하여 제작된 적혈구 세포로 치료를 위하여 선택되며, 이는 현 공개의 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 개체는 면역 살상 세포를 자극하기 위하여 제작된 적혈구 세포로 암을 치료하기 위하여 선택되며, 이는 현 공개의 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 개체는 면역 살상 세포를 자극하기 위하여 제작된 적혈구 세포로 감염성 질환을 치료하기 위하여 선택되며, 이는 현 공개의 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한 다수의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 개체는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포로 치료하기 위하여 선택되며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 현 공개의 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 더 나아가 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를, 예를 들어, 4-1BBL을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 개체는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포로 암을 치료하기 위하여 선택되며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 현 공개의 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 더 나아가 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를, 예를 들어, 4-1BBL을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 개체는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 적혈구 세포로 감염성 질환을 치료하기 위하여 선택되며, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 현 공개의 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 더 나아가 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를, 예를 들어, 4-1BBL을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 개체는 MICA, MICB 및 IGF-1로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 현 공개의 제작된 적혈구 세포로 치료하기 위하여 선택된다.
상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
IV. 약학적 조성물 (PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS)
현 공개는 본 공개의 제작된 적혈구 세포를 활성 성분으로 포함하는 약학적 조성물의 제조 및 용도를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다. 그러한 약학적 조성물은 활성 성분 단독으로, 개체에 투여하기에 적절한 형태에서 적어도 하나의 활성 성분과 (예를 들어, 제작된 적혈구 세포의 효과적인 용량) 조합하여서 구성될 수 있거나, 또는 약학적 조성물은 활성 성분 및 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용할 만한 담체 (carrier), 하나 또는 그 이상의 추가의 (활성 및/또는 불활성) 성분, 또는 이들의 어떤 조합을 포함할 수 있다.
현 공개의 약학적 조성물은 치료될 (또는 예방될) 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 용량은 임상 시험에서 결정될 수 있다 하더라도, 투여의 양 및 횟수는, 환자의 컨디션, 및 환자의 질환의 유형 및 심각성 정도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
약학적 조성물의 투여는 에어로졸 흡입 (aerosol inhalation), 주사 (injection), 섭취 (ingestion), 수혈 (transfusion), 주입 (implantation ) 또는 이식 (transplantation) 을 포함하는, 어느 편리한 방식으로 수행될 수 있다, 현 공개의 조성물은 환자에게 피하로 (intradermally), 근육 내로 (intramuscularly), 정맥 주사로 (by intravenous (i.v.) injection), 또는 복강 내로 (intraperitoneally) 투여될 수 있다. 약학적 조성물은 종양 또는 림프절로 직접 주사될 수 있다.
여기서 사용된 대로, "약학적으로 허용할 만한 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)" 는 이와 함께 활성 성분이 조합되고 및 조합된 후에는 활성 성분을 개체에게 투여하는데 사용될수 있는 화학적 조성물을 의미한다.
여기서 서술된 약학적 조성물의 제형은 약리학의 기술 분야에서 알려진 또는 이후에 개발된 어느 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 그러한 제조 방법은 활성 성분을 담체 또는 하나 또는 그 이상의 다른 보조 성분과 섞이게 하는 단계, 및 그 후, 만약 필요하거나 또는 바람직하면, 모양을 내고 또는 이 생산물을 바람직한 단일- 또는 다수-용량 유닛으로 포장하는 단계를 포함한다.
여기서 제공된 약학적 조성물의 서술은 원칙적으로 인간에게 윤리적으로 투여하기에 적합한 약학적 조성물에 대한 것이지만, 그러한 조성물은 일반적으로 모든 종류의 동물에 투여에도 적절하다는 것을 이 분야 전문가는 이해할 것이다. 조성물을 다양한 동물에게 투여하기에 적절한 조성물로 만들기 위하여 인간에게 투여하기에 적절한 약학적 조성물의 수정은 잘 이해 되며, 및 통상 전문 수의학 약리학자는 그러한 수정을, 만약 있다면, 단지 일상적 실험으로 디자인 또는 수행할 수 있다. 본 공개의 약학적 조성물의 투여가 고려되는 개체는, 이것에만 국한하지는 않으나, 인간 및 다른 영장류, 비-인간 영장류, 소, 돼지, 말, 양, 고양이 및 개와 같은 상업적으로 관련 있는 포유류를 포함하는 포유류, 닭, 오리, 거위, 및 칠면조와 같은 상업적으로 관련 있는 조류를 포함하는 조류, 사육된 (farm-raised) 생선 및 수조-생선을 포함하는 생선, 및 사육된 (farm-raised) 조개와 같은 갑각류 (crustaceans)를 포함한다.
본 공개의 방법에서 유용한 약학적 조성물은 경구로 (oral), 직장으로 (rectal), 질로 (vaginal), 비경구로 (parenteral), 국부로 (topical), 폐로 (pulmonary), 코로 (intranasal), 병변내의 (intra-lesional), 부강의 (buccal), 눈의 (ophthalmic), 정맥 내로 (intravenous), 기관 내로 (intra-organ) 또는 다른 경로 투여되기에 적절한 제형으로 제조되고, 포장되고, 및 팔릴 수 있다. 다른 고려되는 제형에는 투영된 나노입자 (projected nanoparticles), 리포좀 제제 (liposomal preparations), 활성 성분을 포함하는 재봉합된 적혈구 (resealed erythrocytes containing the active ingredient), 및 면역적으로-근거한 제형 (immunologically-based formulation) 이 포함된다.
본 공개의 약학적 조성물은 단일 유닛 용량 (single unit dose) 으로서, 다수의 단일 유닛 용량으로서 제조되고, 포장되고, 또는 대량으로 팔릴 수 있다. 여기서 사용된 대로, "유닛 용량 (unit dose)"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 분리의 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 개체에 투여되는 활성 성분의 용량과 같거나 또는 그러한 용량의 편리한 분획, 예를 들어, 그러한 용량의 1/2 또는 2/3이다.
본 공개의 약학적 조성물에 있어서 활성 성분, 약학적으로 허용 가능한 담체, 및 어느 추가의 성분의 상대적인 양은, 치료될 개체의 동정, 크기 및 컨디션에 따라 다양할 것이며 및 더 나아가 조성물이 투여될 경로에 따라 다양할 것이다. 한 예시로, 조성물은 0.1%에서 100%사이의 활성 성분을 포함한다.
활성 성분 이외에, 본 공개의 약학적 조성물은 더 나아가 하나 또는 그 이상의 추가의 약학적으로 활성인 제제를 포함할 수 있다. 특히 고려되는 추가의 제제에는 시안화물 (cyanide) 및 시안염 제거제 (cyanate scavengers) 및 AZT와 같은 제토제 (anti-emetics) 및 제거제 (scavengers), 프로테아제 억제제 (protease inhibitors), 역 전사 효소 억제제 (reverse transcriptase inhibitors), 인터루킨-2 (interleukin-2), 인터페론 (interferons), 사이토카인 (cytokines), 및 이와 유사한 것이 포함된다.
본 공개의 약학적 조성물 조절된- 또는 지속성-방출 제형은 전통적이 기술을 사용하여 만들어질 수 있다.
여기서 사용된 대로, 약학적 조성물의 "비경구 투여 (parenteral administration)"에는 개체의 조직의 물리적인 파괴가 특징인 어느 투여 경로 및 약학적 조성물을 조직의 파괴를 통해 투여하는 것을 포함한다. 그러므로 비경구 투여는, 이것에만 국한하지 않으나, 조성물의 주사로, 외과적 절개를 통해 조성물을 적용, 조직-침투하는 비-외과적인 조성물의 적용, 및 이와 유사한 약학적 조성물의 투여를 포함한다. 특히, 비경구 투여는, 이것에만 국한하지 않으나, 피하 (subcutaneous), 복강 내 (intraperitoneal), 근육 내 (intramuscular), 흉골 내 주사 (intrasternal injection), 및 신장 투석 주입 기술 (kidney dialytic infusion techniques)을 포함하는 것을 고려한다.
비경구적 투여에 적합한 약학적 조성물의 제형은 멸균 물 또는 멸균 생리 식염수와 같은 약학적으로 허용할 만한 담체와 조합한 활성 성분을 포함한다. 그러한 제형은 한 회분 투여 또는 연속적인 투여에 적합한 형태로 제조되고, 포장되고, 또는 팔릴 수 있다. 주사 가능한 제형은 앰풀에 있는 것과 같은 유닛 용량으로 또는 방부제를 함유하는 다수-용량 용기에서 제조되고, 포장되고, 또는 팔릴 수 있다. 비경구적 투여를 위한 제형에는, 이것에만 국한하지 않으나, 현탁액 (suspensions), 수용액 (solutions), 오일성 또는 수용성 매체에 에멀젼 (emulsions in oily or aqueous vehicles), 페이스트 (pastes), 및 이식 가능한 지속성-방출 (implantable sustained-release) 또는 생분해 가능한 제형 (biodegradable formulations)이 포함된다. 그러한 제형은 더 나아가 하나 또는 그 이상의 추가의 성분, 이것에만 국한하지 않으나, 현탁하는 (suspending), 안정화하는 (stabilizing), 또는 분산하는 제제 (dispersing)를 포함한다.
약학적 조성물은 멸균된 주사 가능한 수용성 또는 오일성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조되고, 포장되고, 또는 팔릴 수 있다. 이 현탁액 또는 용액은 이 분야에서 알려진 기술에 따라 제형 될 수 있으며, 및 활성 성분 이외에, 분산제, 습윤제, 또는 여기서 서술된 현탁제와 같은, 추가의 성분을 포함할 수 있다. 그러한 멸균된 주사 가능한 제형은, 예를 들어, 물 또는 1,3-부탄 디올 (1,3-butane diol) 과 같은, 비-독성 비경구적으로-허용할 수 있는 희석제 또는 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 다른 허용할 수 있는 희석제 또는 용매에는, 이것에만 국한하지 않으나, 링거 용액 (Ringer's solution), 등장 소듐 클로라이드 용액(isotonic sodium chloride solution), 및 합성 모노- 또는 디-글리세라이드 (synthetic mono- or di-glycerides) 와 같은 고정된 오일 (fixed oils)이 포함된다. 유용한 다른 비경구적으로-투여가능한 제형에는 활성 성분을 미세결정 형태 (microcrystalline form)로, 리포좀 제제로 포함하거나, 또는 생체분해가능 한 폴리머 시스템으로서 포함하는 것들이 포함된다. 지속성 방출 (sustained release) 또는 이식 (implantation) 을 위한 조성물은 약학적으로 허용할 수 있는 폴리머 또는 에멀젼 (emulsion), 이온 교환 수지 (ion exchange resin), 겨우 녹는 폴리머 (sparingly soluble polymer), 또는 겨우 녹는 염 (sparingly soluble salt) 과 같은 소수성 재료 (hydrophobic materials)를 포함할 수 있다.
본 공개의 제작된 적혈구 세포는 동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 여기서 제작된 적혈구 세포는 이로써 확장된 T 세포 또는 NK 세포와 함께 또는 없이 투여되며, 이들은 약 100,000에서부터 약 10억 (one billion) 범위의 세포에서 투여될 수 있으며, 여기서 세포는 이를 필요로 하는 동물, 바람직하게, 인간 환자에게 주입된다. 정확한 투여 용량은, 이것에만 국한하지 않으나, 동물 유형 및 치료될 질환의 유형, 동물의 나이 및 투여 경로를 포함하는 어느 수의 인자에 따라 다양 할것이다.
제작된 적혈구 세포는 동물에게 하루에 몇 번과 같이 자주 동물에게 투여될 수 있거나, 또는 하루에 한 번, 일주일에 한 번, 2주에 한 번, 1개월에 한 번과 같이 덜 자주, 또는 몇 개월에 한 번 또는 일 년 또는 일 년 미만에 한 번과 같이 더 덜 자주로도 투여될 수 있다. 용량의 빈도는 이 분야 전문가에게는 쉽게 분명할 것이며 및 이것에만 국한하지 않으나, 치료될 질환의 유형 및 심각성 정도, 동물의 유형 및 나이 등과 같은 어느 수의 인자들에 따를 것이다.
제작된 적혈구 세포는 (또는 이로써 확장된 T 세포 또는 NK 세포) 다양한 다른 화합물과 ((많은 다른 것들 중, 사이토카인, 화학요법제 약물, 체크포인트 억제제 (checkpoint inhibitors) 및/또는 항바이러스 약물)) 함께 동시-투여될 수 있다. 다른 한편으로, 화합물 (들)은 제작된 적혈구 세포 투여에 앞서 한 시간, 하루, 일주일, 1개월, 또는 그 이상 먼저, 또는 이들의 어느 순열로 투여될 수 있다. 더 나아가, 화합물은 제작된 적혈구 세포 (또는 이로써 확장된 T 세포 또는 NK 세포) 투여 후 한 시간, 하루, 일주일, 또는 그 이상까지에도, 또는 이들의 어느 순열로 투여될 수 있다. 투여 용법의 빈도는 이 분야 전문가에게는 쉽게 분명할 것이며 및 이것에만 국한하지 않으나, 치료될 질환의 유형 및 심각성 정도, 동물의 나이 및 건강 상태, 투여될 화합물 또는 화합물들의 정체, 여러 화합물 및 제작된 적혈구 세포 (또는 이로써 확장된 T 세포 또는 NK 세포)의 투여 경로, 및 이와 유사한 것과 같은 어느 수의 인자들에 따를 것이다.
더 나아가, 이 분야 기술 전문가는, 여기서 제공된 본 공개에 근거하여, 제작된 적혈구 세포가 동물에 투여되는 곳에서, 세포는 "성장되지 않는 상태 (state of no growth)"로 있게 처치된다; 즉, 세포는 동물에 투여될 때는 분열될 수 없다는 것을, 인지할 것이다. 여기 다른 곳에서 공개된 대로, 세포는 일단 동물에 투여되면 성장 또는 분열될 수 없게 만들기 위해 방사선 조사될 수 있다. 세포가 자랄 수 없도록 투여, 특히 사람에게 투여, 되도록 만드는 햅탄화 (haptenization) ((예를 들어, 디니트로페닐 (dinitrophenyl) 및 다른 화합물을 사용하여))를 포함하는, 다른 방법들이 이 분야 기술에서 알려졌으며, 및 이 방법들은 여기서는 더는 논의 되지 않는다. 더욱이, 생체 내 (in vivo) 에서 분열할 수 없게 만든 제작된 적혈구 세포의 투여의 안전성은 여기서 논의된 일부 분자를 암호화하는 플라스미드 벡터로 형질감염시킨 (transfected) 제작된 적혈구 세포를 사용한 임상 시험 1 상 (Phase I clinical trials) 에서 확립 되었다.
상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 상기 관점 및 실시 예의 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
어떤 실시 예에서, 본 공개는 여기서 서술된 다수의 제작된 적혈구 세포, 및 약학적 담체를 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 다른 실시 예에서, 본 공개는 여기서 서술된 대로 제작된 적혈구 세포의 집단, 및 약학적 담체를 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 어느 단일 제작된 적혈구 세포, 다수의 제작된 적혈구 세포, 또는 여기 다른 곳에서 서술된 대로 제작된 적혈구 세포의 집단이 본 발명의 약학적 조성물에 존재할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
어떤 실시 예에서, 여기서 제공된 약학적 조성물은 제작된 ((즉, 수정된 (midified)) 적혈구 세포 및 수정되지 않은 적혈구 세포를 포함한다. 예를 들어, 단일 유닛 용량의 적혈구 세포 (예를 들어, 수정된 및 수정되지 않은 적혈구 세포)는, 다양한 실시 예에서, 약, 적어도, 또는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%), 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이하의 제작된 적혈구 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 조성물의 나머지 적혈구 세포는 제작되지 않은 것이다.
어떤 실시 예에서, 여기서 제공된 약학적 조성물은 제작된 핵 제거된 적혈구 세포 및 핵 있는 적혈구 세포를 포함한다. 예를 들어, 단일 유닛 용량의 제작된 적혈구 세포는 (예를 들어, 핵 제거된 및 핵 있는 적혈구 세포), 다양한 실시 예에서, 약, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 핵 제거된 적혈구 세포를 포함할 수 있으며, 여기서 조성물의 나머지 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
조합 치료 (Combination Therapies)
어떤 실시 예에 따라, 본 공개는 추가의 제제를 개체에 투여하는 것을 더 나아가 포함하는 방법을 제공한다. 어떤 실시 예에서, 본 공개는 동시-투여 및/또는 동시-제형화와 관련있다.
어떤 실시 예시에서, 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 항체 의존 세포의 세포독성 (antibody dependent cellular cytotoxicity) (ADCC)을 통하여 종양을 죽이는 단일클론 항체와 조합하여 함께 사용된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 대로 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분 또는 이의 단편을 포함하는 적혈구 세포는 항체 의존 세포의 세포독성 (antibody dependent cellular cytotoxicity) (ADCC)을 통하여 종양을 죽이는 단일클론 항체와 조합하여 함께 사용된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 대로 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분 또는 이의 단편, 및 을 4-1BBL을 포함하는 적혈구 세포는 항체 의존 세포의 세포독성 (antibody dependent cellular cytotoxicity) (ADCC)을 통하여 종양을 죽이는 단일클론 항체와 조합하여 함께 사용된다.
종양 세포의 표면에 있는 종양-선택적 항원을 인식하는 종양-특이 mAbs는, 독성 분자를 타겟 세포로 가도록 하고, 타겟 세포 증식을 억제하고, 면역 세포에 대해 억제 신호를 차단하고, 및 면역 세포가 DCC를 통해 타겟을 죽이게 하는 것을 포함하는, 다양한 기전을 통하여 종양세포를 타겟으로 하고 및 공격한다. ADCC를 통해 기능하는 종양-항원 타겟하는 단일클론 항체의 예시에는, 이것에만 국한하지 않으나, 리툭시맵 (rituximab), 오비누투쮸맵 (obinutuzumab), 디니툭시맵 (dinituximab), 트라스투쮸맵 (trastuzumab)및 세툭시맵 (cetuximab)이 포함된다. 예를 들어, 트라스투쮸맵 (trastuzumab)(Roche)는 유방암 세포 표면에서 발현되는 HER-2 항원에 결합하다. 국부 NK 세포는 항체의 Fc 부분을 인식하고, 및 일단 결합하면 타겟에 프로그램된 세포 죽음 (세포사멸) 신호를 유도하는 세포톡신 (cytotoxins)을 방출한다. 그러한 종양-특이 mAbs를 포함하는 조합 치료는 본 발명의 방법에 포함된다.
어떤 실시 예에서, 다른 제제와 동시-투여되었을 때 제작된 적혈구 세포는 상승적으로 작용하며 및 그런 제제가 단독치료로서 사용될 때에 보통 적용되는 용량보다 더 적은 용량에서 투여된다.
어떤 실시 예시에서, 제한 없이, 암에 적용을 포함하여, 현 공개는 추가의 제제로서 화학요법치료제와 관계 있다. 화학요법치료제의 예시에는, 이것에만 국한하지 않지만, 티오테파 (thiotepa) 및 CYTOXAN 사이클로포스파아마이드 (cyclosphosphamide)와 같은 알킬레이팅 제제 (alkylating agents); 부설판 (busulfan), 임프로설판 (improsulfan) 및 피포설판 (piposulfan)과 같은 알킬 설포네이트 (alkyl sulfonates); 벤조도파 (benzodopa), 카보퀴온 (carboquone), 메투레도파 (meturedopa),및 우레도파 (uredopa) 와 같은 아지리딘 (aziridines); 알트레타민 (altretamine), 트리에틸렌멜아민 (triethylenemelamine), 트리에틸렌포스포아미드 (trietylenephosphoramide), 트리에틸렌티오포스포아미드 (trietylenethiophosphoramide) 및 트리메틸올로멜아민 (trimethylolomelamine)을 포함하는 에틸렌이민 (ethylenimines) 및 메틸아멜아민 (methylamelamine); 아세토게닌즈 (acetogenins)((예를 들어, 블라타신 (bullatacin) 및 블라타시논 (bullatacinone)); 캠토테신(camptothecin) ((합성된 유사체 토포테칸 (topotecan) 포함));브리오스타틴 (bryostatin);캘리 스타틴 (cally statin); CC-1065 (이의 아도젤레신 (adozelesin), 카젤레신 (carzelesin) 및 비젤레신 (bizelesin) 합성 유사체 포함); 크립토피신 (cryptophycins) ((예를 들어, 크립토피신 1 (cryptophycin 1) 및 크립토피신 8 (cryptophycin 8)); 돌라스타틴 (dolastatin); 듀오카르마이신 (duocarmycin) (합성 유사체, KW-2189 및 CB 1-TM1를 포함하는);일루테로빈 (eleutherobin); 판크라티스타틴 (pancratistatin); 사르코딕틴 (sarcodictyin); 스폰지스타틴 (spongistatin); 클로람부실 (chlorambucil), 클로로나파진 (chlornaphazine), 클로로포스파아마이드 (cholophosphamide), 에스트라뮤스틴 (estramustine), 이포스파마이드 (ifosfamide), 메클로에타민 (mechlorethamine), 메클로에타민 옥사이드 하이드로 클로라이드 (mechlorethamine oxide hydrochloride), 메파란 (melphalan), 노뱁비신 (novembichin), 페네스테린 (phenesterine), 프레드니머스틴 (prednimustine), 트로포스파마이드 (trofosfamide), 우라실 머스타드 (uracil mustard)와 같은 나이트로젠 머스타드 (nitrogen mustards); 카무스틴 (carmustine), 클로로조토신 (chlorozotocin), 포테무스틴 (fotemustine), 로무스틴 (lomustine), 니무스틴 (nimustine), 및 레님너스틴 (ranimnustine)과 같은 나이트로조 우레아 (nitrosureas); 에네디인 항생제 (enediyne antibiotics)와 같은 항생제 ((예를 들어, 칼리케아마이신 (calicheamicin), 특히 칼리케아마이신 감말 (calicheamicin gammall) 및 칼리케아마이신 오메갈 (calicheamicin omegall); 다이네마이신 A (dynemicin A)를 포함하는, 다이네마이신 (dynemicin); 크로드로네이트 (clodronate) 와 같은 비스포스포네이트 (bisphosphonates);에스페라마이신 (esperamicin);은 물론 네오카르지노스타틴 크로모포아 (neocarzinostatin chromophore) 및 관련되는 크로모단백질 에네디인 항생제 크로모포아(related chromoprotein enediyne antibiotic chromosomes)), 아크라신노미 신스 (aclacinomy sins), 액티노마이신 (actinomycin), 어트라마이신 (authramycin), 아자세린 (azaserine), 블레오마이신 (bleomycins), 칵티노마이신 (cactinomycin), 카라비신 (carabicin), 카미노마이신 (caminomycin), 카지노필린 (carzinophilin), 크로모마이신 (chromomycinis), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데토루비신 (detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신 (6-diazo-5-oxo-L-norleucine), 아드리아마이신 독소루비신 (ADRIAMYCIN doxorubicin) ((모르포리노-독소루비신 (morpholino-doxorubicin), 시아노모르포리노-독소루비신 (cyanomorpholino-doxorubicin), 2-피롤리노-독소루비신 (2-pyrrolino-doxorubicin) 및 데옥시 독소루비신 (deoxy doxorubicin)을 포함하는)), 에피루비신 (epirubicin), 에소루비신 (esorubicin), 이다루비신 (idarubicin), 마셀로마이신 (marcellomycin), 마이토마이신 C (mitomycin C)와 같은 마이토마이신 (mitomycins), 마이코페놀릭 에시드 (mycophenolic acid), 노갈라마이신 (nogalamycin), 올리보마이신 (olivomycins), 펩로마이신 (peplomycin), 포트휘로마이신 (potfiromycin), 퓨로마이신 (puromycin), 퀘엘라마이신 (quelamycin), 로도루비신 (rodorubicin), 스트렙토니그린 (streptomycin), 스트랩토조신 (streptozocin), 튜버시딘 (tubercidin), 우베니멕스 (ubenimex), 지노스타틴 (zinostatin), 조루비신 (zorubicin); 메토트랙세이트 (methotrexate) 및 5-플루오로 우라실 (5-fluorouracil)(5-FU)과 같은 항-대사제 (anti-metabolite); 데노프테린 (denote), 메토트렉세이트 (methotrexate), 프테로프테린 (pteropterin), 트리메트렉세이트 (trimetrexate)와 같은 엽산 유사체 (folic acid analogues); 훌루다라빈 (fludarabine), 6-머루캅토퓨린 (6-mercaptopurine), 티아미프린 (thiamiprine), 티오구아닌 (thioguanine)과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈 (ancitabine), 아자시티틴 (azacitidine), 6-아자유리딘 (6-azauridine), 카모포아 (carmofur), 시타라빈 (cytarabine), 디데옥시유리딘 (dideoxyuridine), 독시플유리딘 (doxifluridine), 에노시타빈 (enocitabine), 플록스유리딘 (floxuridine)과 같은 피리미딘 유사체 (pyrimidine analogs); 칼로스테론(calusterone), 드로모스타노론 프로피오네이트 (dromostanolone propionate), 에피티오스타놀 (elitist), 메피티오스탠 (mepitiostane), 테스토락톤 (testolactone) 과 같은 안드로젠 (androgens); 미노글루테티미드 (minoglutethimide), 미토탠 (mitotane), 트리로스탠 (trilostane) 과 같은 항-아드레날 (anti-adrenals): 후로리닉 에시드 (frolinic acid) 와 같은 엽산 보충제 (folic acid replenisher);아세그락톤 (aceglatone); 알도포스파아마이드 글라이코사이드 (aldophosphamide glycoside); 아미노레블리닉 에시드 (aminolevulinic acid); 에닐유라실 (eniluraci)l; 암사클린 (amsacrine); 베스트라부실 (bestrabucil); 비스탄트랜 (bisantrene); 이다트랙세이트 (edatraxate); 데메콜신 (demecolcine); 디아지퀴온 (diaziquone); 엘포르미틴 (elformithine); 엘립티니움 아세테이트 (elliptinium acetate); 에포틸론 (epothilone); 에토글루시드 (etoglucid); 갈리움 나이트레이트 (gallium nitrate); 하이드록시 우레아 (hydroxyurea); 랜티난 (lentinan); 로니다이닌 (lonidainine); 메이탄신 (maytansine) 및 안사미토신 (ansamitocins)과 같은 메이탄시노이드 (maytansinoids); 미토구아존 (mitoguazone); 미토잔트론 (mitoxantrone); 모피단몰 (mopidanmol); 니트라에린 (nitraerine); 펜토스타틴 (pentostatin); 페나메트 (phenamet);피라루비신 (pirarubicin); 로속산트론 (losoxantrone); 포도필리닉 에시드 (podophyllinic acid); 2-에틸하이드라자이드 (2-ethylhydrazide); 프로카바진 (procarbazine); PSK 폴리삭카라이드 복합체 (PSK polysaccharide complex); 라족산 (razoxane); 리족산 (rhizoxin); 시조후란 (sizofuran); 스피로게르마니움 (spirogermanium); 테누아조익 에시드 (tenuazonic acid);트리아지퀴논 (triaziquone); 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민) (2,2',2''-trichlorotriethylamine); 트리코테센 (trichothecenes) ((예를 들어, T-2 톡신 (T-2 toxin), 베라쿠린 A (verracurin A), 로리딘 A (roridin A) 및 앤구이딘 (anguidine));우레탄 (urethan); 빈데신 (vindesine); 다카르바진 (dacarbazine); 만노무스틴 (mannomustine); 미토브로니톨 (mitobronitol); 미토락톨 (mitolactol); 피포브로만 (pipobroman); 가시토신 (gacytosine); 아라비노사이드 (arabinoside) ("Ara-C"); 사이클로포스파마이드 (cyclophosphamide); 티오테파 (thiotepa); 탁소이드 (taxoids), 예를 들어, 탁솔 파클리탁셀(TAXOL paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), 아브락산 크레모포아 -없는 (ABRAXANE Cremophor-free), 파클리탁셀의 알부민-제작된 나노입자 제형 (albumin-engineered nanoparticle formulation), 및 탁소테레 독세탁셀 (TAXOTERE doxetaxel);클로란부실 (chloranbucil); 겜자 겜시타빈 (GEMZAR gemcitabine); 6-티오구아닌 (6-thioguanine); 머캅토퓨린 (mercaptopurine); 메토트렉세이트 (methotrexate); 시스플라틴 (isolating), 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 및 카보플라틴 (carboplatin)과 같은 백금 유사체 (platinum analogs); 빈블라스틴 (vinblastine); 백금 (platinum); 에토포사이드 (etoposide) (VP-16); 이포스파아미이드 (ifosfamide); 미토잔트론 (mitoxantrone); 빈크리스틴 (vincristine); 나벨빈. 비노렐빈 (NAVELBINE. interline); 노반트론 (novantrone); 테니포사이드 (teniposide); 에다트렉세이트 (edatrexate); 다우노마이신 (daunomycin); 아미노프테린 (aminopterin); 젤로다 (xeloda); 이반트로네이트 (ibandronate); 이리노테칸 (irinotecan) ((캠토사 (Camptosar, CPT-11))((5-FU 및 루코보린 (leucovorin)과 이리노테칸의 치료 용법 포함하는)); 토포이소머라제 억제제 (topoisomerase inhibitor) RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (difluoromethylornithine) (DMFO); 레티노익 에시드 (retinoic acid) 와 같은 레티노이드 (retinoids); 카페시타빈 (capecitabine);콤브레타스타틴 (combretastatin); 루코보린 (leucovorin) (LV); 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 치료 용법(FOLFOX)을 포함하는 옥살리플라틴 (oxaliplatin);라파티닙 (lapatinib) (TYKERB); 세포 증식을 감소시키는 PKC-α, Raf, H-Ras, EGFR ((예를 들어, 에르로티닙 (erlotinib) (Tarceva)) 및 VEGF-A 억제제 및 상기 어느 것의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 추가로 치료 방법은 더 나아가 방사선의 사용이 포함된다.
어떤 인간 종양은 환자의 면역 시스템에 의해 제거될 수 있다. 예를 들어, 면역 "체크포인트 (checkpoint)" 분자를 타겟으로 한 단일클론 항체의 투여는 완전한 반응 및 종양 퇴치를 유도할 수 있다. 그러한 항체의 작용 방식은 종양이 항-종양 면역 반응로부터의 보호로서 끌어들인 면역 조절 분자의 억제를 통해서이다. 이들 "체크포인트 (checkpoint)" 분자들을 억제함으로써 (예를 들어, 길항적 항체로), 환자의 CD8+ T 세포는 증식되게 하고 및 종양세포를 파괴하게 한다.
예를 들어, 한 예시로서 및 제한 없이, CTLA-4 또는 PD-1를 타겟으로 하는 단일 클론 항체의 투여는 완전한 반응 및 종양 퇴치를 초래한다. 그러한 항체의 작용 방식은 종양이 항-종양 면역 반응로부터의 보호로서 끌어들인 CTLA-4 또는 PD-1의 억제를 통해서이다. 이들 체크포인트 (checkpoint)" 분자들을 억제함으로써 (예를 들어, 길항적 항체로), 환자의 CD8+ T 세포는 증식되게 하고 및 종양세포를 파괴하게 한다.
그러므로 여기서 서술된 제작된 적혈구 세포는 면역 "체크포인트 (checkpoint)" 분자를 타켓으로 하는 하나 또는 그 이상의 차단 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 어떤 실시 예시에서, 여기서 제공된 조성물은 CTLA-4 또는 PD-1와 같은 분자를 타겟으로 하는 차단 항체 하나 또는 그 이상과 조합하여 사용될 수 있다. 에를 들어, 여기서 제공된 조성물은 PD-1 및 PD-L1 또는 PD-L2 및/또는 PD-1의 PD-L1 또는 PD-L2와의 결합을 차단, 감소 및/또는 억제하는 제제와 조합하여 사용될 수 있다 ((비-제한적인 예시로, 하나 또는 그 이상의 니볼루맵 (nivolumab) (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO, BRISTOL MYERS SQUIBB), 팸브롤리쥬맵 (pembrolizumab)(KEYTRUDA, Merck), 피딜리쥬맵 (pidilizumab) (CT-011, CURE TECH), MK-3475 (MERCK), BMS 936559 (BRISTOL MYERS SQUIBB), MPDL328OA (ROCHE)). 한 실시 예에서, 여기서 제공된 조성물은 CT LA-4의 활성을 및/또는 CTLA-4의 하나 또는 그 이상의 수용체 (예를 들어, CD80, CD86, AP2M1, SHP-2, 및 PPP2R5A) 와의 결합을 차단, 감소 및/또는 억제하는 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, 면역-조절하는 제제는, 비-제한적으로, 이필리무맵 (ipilimumab) (MDX-010, MDX-101, Yervoy, BMS) 및/또는 트래멜리무맵 (tremelimumab) (Pfizer)과 같은 항체이다. 이 분자들에 대항하는 차단 항체들은, 예를 들어, 브리스톨 마이어 스퀴브 (Bristol Myers Squibb) (New York, N.Y.), 머크 (Merck) (Kenilworth, N.J.), 메드룸 (Medlmmune) (Gaithersburg, Md.),및 화이자 (Pfizer) (New York, N.Y.) 로부터 구 할 수 있다.
더 나아가, 여기서 제공된 제작된 적혈구 세포 조성물은 BTLA, HVEM, TIM3, GALS, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160 (또한, BY55로도 언급), CGEN-15049, CHK 1 및 CHK2 키나아제 (kinases), A2aR, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), GITR, GITRL, 갈렉틴-9 (galectin-9), CD244, CD160, TIGIT, SIRPα ICOS, CD172a, 및 TMIGD2 및 다양한 B-7 계 리간드 (이것에만 국한하지 않으나, B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H5, B7-H6 및 B7-H7를 포함) 와 같은 면역 체크포이트 분자를 타겟으로 하는 하나 또는 그 이상의 차단 항체와 조합하여 사용될 수 있다.
V. 키트 (KITS)
본 공개는 본 공개의 제작된 적혈구 세포를 포함하고, 및 선택적으로 더 나아가 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 다양한 키트 (kit)를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 제작된 적혈구 세포는 핵 제거된 세포다. 어떤 실시 예에서 제작된 적혈구 세포는 핵 있는 세포다.
예시적인 키트가 하기에 서술되지만, 다른 유용한 키트의 내용도 이 분야 기술 전문가에게는 현 공개에 비추어 분명할 것이다. 이들 키트 각각은 본 공개 내에 포함된다.
어떤 실시 예에서, 키트는 더 나아가 제작된 적혈구 세포를 NK 세포 또는 T 세포에 투여하는데 유용한 작은 도구 (applicator)를 포함한다. 키트에 포함되는 특별한 작은 도구는, 예를 들어, 제작된 적혈구 세포를 투여하기 위하여 사용되는 방법에 의존할 것이며, 및 그러한 작은 도구는 이 분야 기술에서 잘 알려졌으며 및 다른 것들 중에서, 파이펫, 주사기, 점적기 (dropper), 및 이와 같은 것들을 포함할 수 있다. 더욱이, 실시 예에서 키트는 더 나아가 여기서 서술된 방법들을 수행하기 위한 키트의 사용을 서술하는 안내 자료를 포함한다. 이들 안내서는 단순히 여기서 제공된 공개를 담고 있다.
어떤 실시 예에서, 키트는 약학적으로-허용할 만한 담체를 포함한다. 조성물은 여기 다른 곳에서 제시된 적절한 양으로 제공된다. 더 나아가, 투여 경로 및 투여 빈도는 여기 다른 곳에서 이전에 제시된 대로이다.
키트는, 이것에만 국한하지 않으나, 여기서 제시된 외부 유래 자극 폴리펩티드와 같은 넓은 다수의 분자를 포함하는 제작된 적혈구 세포를 포함한다. 그러나, 여기서 제공되는 교훈으로 준비된 이 분야 전문가는 본 공개는 이것들 또는 다른 분자의 조합으로 제한하는 것이 아니라는 것을 인지할 것이다. 오히려, 여기서 제시된 조합은 보여주기적인 목적이 있으며 및 이들은 현 공개에 의해 포함되는 조합을 제한하는 것은 아니다. 더 나아가, 키트는 제작된 적혈구 세포로 도입되는 각 분자는 그 분자를 암호화하는 분리된 핵산으로서, 그 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로서, 및 적어도 두 분자가 연속적인 핵산에 의해 암호화되거나 및/또는 같은 벡터에 의해 암호화되는 것을 포함하는 이의 어느 조합으로서 제공되는 키트를 포함한다.
이 설명서에서 인용된 모든 논문 및 특허 출원은 각 개개의 논문 또는 특허 출원이 특별하게 및 개별적으로 모든 목적의 참고문헌으로 병합되도록 제시하는 것과 같이, 여기서 그 전문이 모든 목적을 위하여 참고 문헌으로서 병합된다. 여기서 논의된 논문들은 현 출원의 출원 일 이전에 이들의 공개를 위하여 단지 제공된다. 여기서 서술된 발명가들은 이전의 공개로 또는 다른 어느 이유로 그러한 공개에 선행하지 않는다는 것을 인정하는 것으로 여기서 해석되지 않는다.
표 9 서열
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
표 10 생쥐 연구를 위한 단백질 구조체 서열
(Protein Construct Sequences for Mouse Studies)
Figure pct00015
실시 예시 (EXAMPLES )
실시 예시 1. IL-15/IL-15-RA 융합 단백질을 발현하도록 유전적으로 제작된 적혈구 세포의 생산 (Generation of erythroid cells genetically engineered to express an IL-15/IL-15-RA fusion protein).
IL-15 및 IL-15/IL-15RA 융합 구조체 (IL-15 and IL-15/IL-15RA fusion constructs)
하기 표 11에서 보는 바와 같이 적혈구 세포에서 발현을 위해 융합 폴리펩티드를 암호화하는 다양한 DNA 구조체 (construct)가 제조되었다:
표 11. IL-15 및 IL-15/IL-15RA 융합 구조체 및 폴리펩티드.
서열번호는 아미노산 서열을 의미한다
Figure pct00016
DNA 구조체 (DNA construct) ((V3, V4, V5, V3.1 또는 V4.1) 는 하기에 서술된 대로 적혈구 TV에서 발현을 위하여 시스템 바이오사이언스 (System Biosciences)로부터 구한 MSCV 프로모터 서열을 가진 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector) pCDH의 다 클로닝 부위 (multiple cloning site)에 클론 되었다.
렌티바이러스 벡터의 생산 (Production of Lentiviral Vector)
IL-15/IL-15-RA 융합 단백질 유전자는 시스템 바이오사이언스 (System Biosciences)로부터 구한 MSCV 프로모터 서열을 가진 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector) pCDH의 다 클로닝 부위 (multiple cloning site)에 클론 되었다. 렌티바이러스는 293T 세포에서 pPACKH1 (System Biosciences) 및 IL-15/IL-15-RA 융합 유전자를 함유하는 pCDH 렌티 바이러스 벡터로 형질감염시켜 생산되었다. 세포는 신선한 배양 배지에 넣었다. 바이러스 상등액은 배지 교환 후 48시간에 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 수집하였다. 상등액은 수집되고, 여과되고, 및 한 몫씩 (aliquotes) -80 o C에서 얼렸다.
IL-15/IL-15RA 융합 단백질은 또한 여기서 IL-15TP 라고도 불린다.
적혈구 세포의 확장 및 분화 (Expansion and differentiation of erythroid cells)
정상 인간 공여자로부터 동원된 말초 혈액에서부터 유래한 인간 CD34+ 세포는 올셀 회사 (AllCells Inc.) 에서 냉동된 채로 구입하였다. 확장/분화 과정은 3단계를 포함한다. 첫 번째 단계에서, 해동된 CD34+ 적혈구 전구 세포는 재조합 인간 인슐린, 인간 트란스훼린 (human transferrin), 재조합 인간 재조합 인간 줄기세포 인자 (recombinant human stem cell factor), 및 재조합 인간 인터루킨 3을 포함하는 이스코브 MDM 배지 (Iscove's MDM medium) 에서 배양시켰다. 두 번째 단계에서는, 적혈구 세포는 재조합 인간 인슐린, 인간 트란스훼린 (human transferrin), 재조합 인간 줄기세포 인자 (recombinant human stem cell factor), 인간 재조합 에리스로포에틴 (human recombinant erythropoietin), 및 L-글루타민 (L-glutamine)으로 보충된 이스코브 MDM 배지 (Iscove's MDM medium) 에서 배양시켰다. 세 번째 단계에서는, 적혈구 세포는 인간 트란스훼린 (human transferrin), 재조합 인간 인슐린, 인간 재조합 에리스로포에틴 (human recombinant erythropoietin), 및 헤파린 (heparin)으로 보충된 이스코브 MDM 배지 (Iscove's MDM medium) 에서 배양시켰다. 배양은 37 oC 에서 5% CO2 배양기에서 유지시켰다.
적혈구 전구 세포의 형질도입 (Transduction of erythroid precursor cells) 적혈구 전구 세포는 상기 서술된 배양 공정 단계 1 동안에 형질도입 되었다. 배양하고 있는 배지에 있는 적혈구 세포는 렌티바이러스 상등액 및 폴리브렌 (polybrene)과 섞었다. 감염은 플레이트를 2000 rpm에서 90분 동안 실온에서 돌리면서, 스피이노큘레이션 (spinoculation)으로 달성하였다. 스피이노큘레이션 후에, 세포는 37°C 에서 하룻 밤 동안 배양 시켰다.
항체 결합 (Antibody Binding)
PE-라벨 된 항-IL-15-RA 항체 (예를 들어, 항-IL-15RA 항체 (JM7A4) (ab91270), AbCam)의 결합이 제작된 적혈구 세포에서 IL-15/IL-15-RA 발현을 평가하기 위하여 사용되었다. 항체의 결합은 APC 형광 또는 PE 형광에 대한 유동 세포분석 (flow cytometry) 으로 측정되었다. 게이트 (gate)는 염색된 형질감염 안 된 세포에 근거하여 설정되었다.
실시 예시 2. IL-15/IL- 15RA를 발현하도록 유전적으로 제작된 적혈구 세포는 시험관 내 ( in vitro) 에서 총 CD8+ 세포의 증가를 유도한다 ( Erythroid cells genetically engineered to express IL-15/IL- 15RA induce an increase in total CD8+ cells in vitro)
IL-15/IL-15RA 변이체인 (variants) IL-15v3 (서열번호27), IL-15v4 (서열 번호29) 및 IL-15v5 (서열번호31) 를 포함하는 적혈구 세포는 일반적으로 실시 예시 1 에서 서술된 대로 제조되었다.
세 공여자로부터의 100,000 말초 혈액 단핵구 세포 (peripheral blood mononuclear cells) (PBMCs) 는 300,000 제작된 적혈구 세포와 함께 배양되었다. 제작된 적혈구 세포 없이 배양된 PBMCs (no RBC) 및 세포 표면에 단지 HA 에피톱 태그 (HA epitope tag) 만 발현하는 적혈구 세포와 함께 배양된 PBMCs는 음성 대조군으로 사용되었다. 도 1A는 IL-15/IL-15RA 변이체인 v3, v4 및 v5를 발현하도록 제작된 적혈구 세포를 보여주는 그래프이며, 말초 혈액 단핵구 세포 (peripheral blood mononuclear cells)(PBMCs)와 배양하고 및 자극하지 않았을 때, 총 CD8+ 세포 수의 증가를 유도한다. 재조합 인간 IL-15 (recombinant human IL-15) (rh IL-15) 와 함께 배양된 PBMCs는 용해성 IL-15와 비교로서 사용되었다. 총 CD8+ 세포의 수는 5일째 날에 세었다. 도 1A에 보여준 결과는 각각 2-3 공여자로 4번의 독립 실험을 대표한다 (검사한 총 6 다른 PMBC 공여자).
다음 실험 세트에서, IL-15/IL-15RA 변이체인 v3, v4 및 v5를 발현하는 제작된 적혈구 세포는 PBMCs 와 배양하고 및 항-CD3 항체 (aCD3) 로 자극 시켰다. 세 공여자로부터의 100,000 PBMCs는 0.5㎍/mL aCD3 와 300,000 또는 100,000 적혈구 세포와 배양시켰다. 제작된 적혈구 세포 없이 배양된 PBMCs (no RBC) 및 세포 표면에 단지 HA 에피톱 태그 (HA epitope tag) 만 발현하는 적혈구 세포와 함께 배양된 PBMCs는 음성 대조군으로 사용되었다. 재조합 인간 IL-15 (recombinant human IL-15) (rh IL-15) 로 배양된 PBMCs는 양성 대조군으로 사용되었다. 도 1B는 IL-15/IL-15RA 변이체인 v3, v4 및 v5를 발현하도록 제작된 적혈구 세포가 PBMCs와 배양되고 및 aCD3로 자극 시켰을 때, 총 CD8+ 세포 수의 증가가 유도됨을 보여준다. 도 1B에서 보여준 그래프에 있는 두 개의 바 (bar)는 사용된 제작된 적혈구 세포 300,000 (왼쪽) 또는 100,000 (오른쪽)을 대표한다. 총 CD8+ 세포의 수는 5일째 날에 세었다. 도 1B에 보여준 결과는 2-3 PBMC 공여자 각각으로 4번의 독립 실험을 대표한다 (검사한 총 6 다른 PMBC 공여자).
이 실시 예시로부터의 결과는 IL-15/IL-15RA를 발현하도록 유전적으로 제작된 적혈구 세포는 자극이 있거나 또는 없거나 총 CD8+ 세포의 증가를 유도함을 보여준다. IL-15/IL-15RA를 포함하는 적혈구 세포는 HA-포함하는 대조군 적혈구에 비교하여, 자극이 있을 때 및 없을 때 둘 다 더 높은 CD8+ 세포의 유도를 초래한다.
실시 예시 3. IL-15/IL- 15RA 변이체를 발현하도록 유전적으로 제작된 적혈구 세포는 시험관 내에서 NK 세포를 확장한다 ( Erythroid cells genetically engineered to express IL-15/IL- 15RA variants expand NK cells in vitro)
IL-15/IL-15RA 변이체인 (variants) IL-15v3, IL-15v4 및 IL-15v5를 포함하는 적혈구 세포는 일반적으로 실시 예시 1 에서 서술된 대로 제조되었다.
IL-15/IL-15RA 변이체의 NK 세포 확장에 대한 효과가 조사되었다. 도 2A는 IL-15/IL-15RA 변이체인 v3, v4 및 v5을 발현하도록 제작된 적혈구 세포는 정제된 NK 세포와 함께 배양했을 때, NK 세포를 확장할 수 있음을 보여주는 그래프 팬널 (i, ii 및 iii) 이다. 도 2A에서 (i) NK 세포는 제작된 적혈구 세포 없이 (no RBC) 배양되었다. 세포 표면에 단지 HA 에피톱 태그 (HA epitope tag) 만 발현하는 적혈구 세포와 함께 배양된 NK 세포는 대조군으로 사용되었다. 한 공여자로부터의 40,000 정제된 NK 세포는 두 개로 플레이팅 하고 및 제작된 적혈구 세포 (engineered erythroid cells) (900,000, 300,000, 100,000), rhIL-2 (1000, 100, 10U/mL), rhIL-15 (10, 1, 0.1ng/mL) 로 적정하면서 7일 동안 배양시켰다. 분석은 7일째 날에 수행되었다. 도 2A에서 (ii) NK 세포는 900,000 제작된 적혈구 세포와 배양시켰으며, 및 세포 표면에 발현되는 카피 수를 세포에 제시되는 총 IL-15 카피 수를 계산하기 위하여 고려한다 (X 축에 보여줌). 도 2A (iii)에서 NK 세포는 300,000 제작된 적혈구 세포와 배양시켰으며, 및 세포 표면에 발현되는 카피 수를 세포에 제시되는 총 IL-15 카피 수를 계산하기 위하여 고려한다 (X 축에 보여줌).
도 2B는 IL-15/IL-15RA 변이체인 v3, v4 및 v5을 발현하는 제작된 적혈구 세포는 PBMCs와 함께 배양했을 때, NK 세포를 확장할 수 있음을 보여주는 그래프 팬널 (i, ii 및 iii) 이다. 도 2B에서 (i) 두 공여자로부터의 100,000 PBMCs가 얻어졌으며 및 두 개로 플레이트 되었다. 음성 대조군으로서 세포는 제작된 적혈구 세포 없이 배양되거나 (no RBC) 또는 세포 표면에 단지 HA 에피톱 태그 (HA epitope tag) 만 발현하는 적혈구 세포와 함께 배양되었다. 두 공여자로부터 100,000 PBMCs 가 얻어졌으며 두 개로 플레이팅하였다. 세포는 900,000, 300,000 또는 100,000 제작된 적혈구 세포와 배양시켰다. 유동 세포 분석 (Flow cytometry analysis) 은 7일째 날에 수행되었으며. 생존/사망, CD56+CD3- 세포에 대한 게이트를 적용하였다. 도 2B (ii)에서, PBMCs는 900,000 제작된 적혈구 세포와 배양시켰으며, 및 이들 세포 표면에 발현되는 카피 수는 세포에 제시되는 총 IL-15 카피 수를 계산하기 위하여 고려한다 (X 축에 보여줌). 도 2B (iii)에서 PBMCs는 300,000 제작된 적혈구 세포와 배양시켰으며, 및 이들 세포 표면에 발현되는 카피 수는 세포에 제시되는 총 IL-15 카피 수를 계산하기 위하여 고려한다 (X 축에 보여줌).
이 실시 예시로부터의 결과는 IL-15/IL-15RA 변이체를 발현하도록 유전적으로 제작된 적혈구 세포는 정제된 NK 세포 집단, 또는 PBMC로부터 NK 세포를 확장할 수 있음을 보여준다. v3 및 v4의 활성을 비교할 때, v3 및 v4 같은 수에서, 다른 활성을 보인다는 것이 보였다. IL-15/IL-15RA를 포함하는 적혈구 세포는, HA-포함하는 대조군 적혈구에 비교하여, 높은 및 낮은 농도 둘 다에서, 더 높은 NK 세포 확장을 유도한다. 더 나아가, 변이체 v4 및 v5에서 용량 반응이 보였다.
실시 예시 4. IL-15/IL-15RA 발현하도록 제조된 적혈구 세포는 시험관 내에서 NK 세포를 활성화한다 (Erythroid cells prepared to express IL-15/IL-15RA Activate NK Cells in vivo).
인간 IL-15/IL-15RA를 세포 표면에 제시하게 제조된 쥐 (murine) 적혈구 세포의 생체 외 (ex vivo ) NK 세포 확장에 대한 효과가 검사되었다. 쥐 적혈구 세포는 클릭 방법을 (click methodology)((적혈구 세포를 기능화하는 클릭 화학은 국제 출원 (International Application) No. PCT/US2018/000042에 서술되어 있으며, 이는 2017년 2월 17일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/460589 및 2017년 7월 8일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/542142에 우선권을 가지며, 그 전문이 여기 참고 문헌으로 병합되었다)) 사용하여 IL-15-RA-Fc와 접합 (conjugate) 시켰다. IL-15/IL-15RA 융합 단백질은 IL-15 체인에 융합된 수용체의 스시 도메인을 포함한다 (여기 표 10에 제시된 단백질 구조체를 참고).
첫 번째로, 한 공여자로부터의 40,000 정제된 NK 세포 (Astsrte Biologics)는 두 플레이트에 플레이팅 하였으며 및 7일 동안 RBCs 적정으로 (900 000, 300 000, 100 000) 배양되었다. 7일 후에, CD56+/CD3-인 생존 세포를 봄으로서 배양액에서 상대적인 NK 세포의 양을 추산하기 위하여 샘플은 유동 세포 분석으로 분석되었다. 도 3A에서 보여준 대로, 세포 표면에 IL-15/IL-15R를 제시하도록 제조된 적혈구 세포는 셍체 외에서 (ex vivo) 에서 강력한 NK 세포 확장을 촉진하였다.
다음에, IL-15/IL-15RA를 세포 표면에 제시하게 제조된 쥐 적혈구 세포의 생체 내 (in vivo) NK 세포 확장에 대한 효과가 검사되었다. IL-15/IL-15RA 적혈구 세포 및 대조군 적혈구 세포는 정맥으로 C57/B6 생쥐에 주사되었다. 주사 후 3일에 비장을 모으고, 단일 세포 현탁액으로 가공하고 및 유동세포 분석을 위해 Ki67 및 그랜자임 B (Granzyme B) 를 염색하였다.
도 3B에서 보여준 대로, IL-15/IL-15RA를 발현하도록 제조한 적혈구 세포(mRBC)로 처치한 생쥐에서 강력한 림프구 증식이 관찰되었다. 증식하는 세포의 마커로서 Ki67 염색 퍼센트로 결정한 대로 NK 세포 증식이 보였다. 더 나아가 도 3C에서 보여준 대로, IL-15/IL-15RA를 제시하도록 제조한 적혈구 세포(mRBC)로 처치한 생쥐에서 강력한 림프구 활성화가 발견되었다. 그랜자임 B (granzyme B) 발현 퍼센트를 세포 활성화 마커로서 결정한 대로 NK 세포 활성화가 보였다.
이 실시 예시에서 제시된 결과는 IL-15/IL-15RA를 제시하도록 제조한 쥐 적혈구 세포는 생체 내 (in vivo)에서 NK 세포의 증식 및 활성을 유도함을 보여준다.
실시 예시 5. IL-15/IL- 15RA를 포함하는 적혈구 세포는 생체 내에서 종양 성장을 늦춘다 ( Erythroid cells comprising IL-15/IL- 15RA slow tumor growth in vivo) .
인간 IL-15/IL-15RA (IL-15 RBC)를 포함하는 쥐(murine) 적혈구 세포의 종양 성장에 대한 효과를 테스트하기 위하여 흑색종 (melanoma)에 대한 B16F10 생쥐 모델 시스템 (mouse model system)이 사용되었다. 피하 주사 후, B16는 5일에서 10일 내에 감지할 수 있을 정도의 종양을 형성할 것이며 및 14일에서 21일에 1x 1x 1cm의 종양으로 성장할 것이다. B16 생쥐 모델 시스템은 오버위죽 및 레스티포 (Overwijk and Restifo (Curr Protoc Immunol. 2001 May; CHAPTER: Unit-20.1, 그 전문이 여기에 참고 문헌으로 표현적으로 병합 되었다)에 의해 서술되었다
쥐 (murine) 적혈구 세포는 클릭 방법을 (click methodology) ((적혈구 세포를 기능화하는 클릭 화학은 국제 출원 (International Application) No. PCT/US2018/000042에 서술되어 있으며, 이는 2017년 2월 17일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/460589 및 2017년 7월 8일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/542142에 우선권을 가지며, 그 전문이 여기 참고 문헌으로 병합되었다)) 사용하여 인간 IL-15/IL-15RA와 접합 (conjugate) 시켰다. IL-15/IL-15RA 융합 단백질은 여기 표 10에 제시된 구조체에서 IL-15 체인에 융합된 수용체의 스시 도메인으로서 발현된다. IL-15/IL-15RA는 유동 세포 분석을 사용하여 정량되었다.
처음에는, 6 에서 12-주령의 여성 C57BL/6 생쥐에 피하로 1x105 B16 세포/생쥐를 접종시켰다. 종양이 대략 그 부피가 100mm3 에 도달되었을 때, 그 동물에게 IL-15/IL-15RA를 제시하는 적혈구 세포 용량, 또는 IL-15/IL-15RA가 없는 적혈구 세포를 주거나, 또는 대조군으로서 생리 식염수를 주었다. 동물에 용법을 위해, 용량당 2ug 또는 0.1 mg/kg IL-15/IL-15RA에 해당하는 세포 당 평균 50,000 IL-15/RA 분자를 가진 평균 1e9 IL-15 RBCs가 용량당 투여된다.
동물의 무게 및 컨디션은 매일 기록되고, 및 종양은 일주일에 세 번 측정된다. 종양은 각 종양을 2차원으로 측정하여 일주일에 세 번 측정된다. 종양 부피는 표준 공식: (L x W2)/2 을 사용하여 계산된다. 평균 종양 무게 및 평균의 표준 오차는 각 그룹에서 각 시간 포인트에서 계산된다.
더 나아가 몸무게는 매일 기록된다. 각 생쥐의 몸무게의 변화는 첫째 날에 기록된 몸무게에 대비하여 계산된다.
IL-15/IL-15RA를 포함하는 제조된 적혈구 세포의 항-종양 활성은 생리 식염수 및 처치되지 않은 대조군과 비교하여 시간이 지남에 따른 종양 부피 및/또는 종양 무게의 변화로 결정된다.
실시 예시 6. 4- 1BBL을 발현하도록 유전적으로 제작된 적혈구의 생성 (Generation of erythroid cells genetically engineered to express 4-1BBL).
4- 1BBL 구조체 (4- 1BBL constructs)
DNA 구조체 (construct)는 하기 표 12에 보여준 대로 적혈구 세포에서 발현을 위하여 제조 되었다:
표 12. 4-1BBL 구조체 (construct). 서열변호는 아미노산 서열을 의미한다.
Figure pct00017
렌티바이러스 벡터 생산 (Production of Lentiviral Vector)
4-1BBL 유전자 구조체는 표 12에 보여준 대로 구성되었다. 유전자는 시스템 바이오사이언스 (System Biosciences)로부터 구한 MSCV 프로모터 서열을 가진 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector) pCDH의 다 클로닝 부위 (multiple cloning site)에 클론 되었다. 렌티바이러스는 293T 세포에서 pPACKH1 (System Biosciences) 및 4-1BBL 유전자를 함유하는 pCDH 렌티 바이러스 벡터로 형질감염시켜 생산되었다. 세포는 신선한 배양 배지에 넣었다. 바이러스 상등액은 배지 교환 후 48시간에 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 수집하였다. 상등액은 수집되고, 여과되고, 및 한 몫씩 (aliquotes) -80 o C에서 얼렸다.
적혈구 세포의 확장 및 분화 (Expansion and differentiation of erythroid cells)
정상 인간 공여자로부터 동원된 말초 혈액에서부터 유래한 인간 CD34+ 세포는 올셀 회사 (AllCells Inc.) 에서 냉동된 채로 구입하였다. 확장/분화 과정은 3단계를 포함한다. 첫 번째 단계에서, 해동된 CD34+ 적혈구 전구 세포는 재조합 인간 인슐린, 인간 트란스훼린 (human transferrin), 재조합 인간 재조합 인간 줄기세포 인자 (recombinant human stem cell factor), 및 재조합 인간 인터루킨 3을 포함하는 이스코브 MDM 배지 (Iscove's MDM medium) 에서 배양시켰다. 두 번째 단계에서는, 적혈구 세포는 재조합 인간 인슐린, 인간 트란스훼린 (human transferrin), 재조합 인간 줄기세포 인자 (recombinant human stem cell factor), 인간 재조합 에리스로포에틴 (human recombinant erythropoietin), 및 L-글루타민 (L-glutamine)으로 보충된 이스코브 MDM 배지 (Iscove's MDM medium) 에서 배양시켰다. 세 번째 단계에서는, 적혈구 세포는 인간 트란스훼린 (human transferrin), 재조합 인간 인슐린, 인간 재조합 에리스로포에틴 (human recombinant erythropoietin), 및 헤파린 (heparin)으로 보충된 이스코브 MDM 배지 (Iscove's MDM medium) 에서 배양시켰다. 배양은 37 oC 에서 5% CO2 배양기에서 유지시켰다.
적혈구 전구 세포의 형질도입 (Transduction of erythroid precursor cells) 적혈구 전구 세포는 상기 서술된 배양 공정 단계 1 동안에 형질도입 되었다. 배양하고 있는 배지에 있는 적혈구 세포는 렌티바이러스 상등액 및 폴리브렌 (polybrene)과 섞었다. 감염은 플레이트를 2000 rpm에서 90분 동안 실온에서 돌리면서, 스피이노큘레이션 (spinoculation)으로 달성하였다. 스피이노큘레이션 후에, 세포는 37°C 에서 하룻 밤 동안 배양 시켰다.
항체 결합 (Antibody Binding)
PE-라벨 된 항-4-1BBL 항체 (예를 들어, 정제된 항-인간 4-1BB 리간드 (CD137L) 항체, 바이오레전드 (BioLegend))의 결합이 제작된 적혈구에서 4-1BBL의 발현을 검증하기 위하여 사용되었다. 항체의 결합은 PE 형광에 대한 유동세포 분석 (flow cytometry)으로 측정되었다. 게이트 (gate)는 염색된 형질감염 안 된 세포에 근거하여 설정되었다.
실시 예시 7. 제작된 적혈구 세포 표면에 4- 1BBL의 발현은 시험관 내 (i n vitro ) 에서 T-세포 활성화를 유도한다 (Expression of 4- 1BBL on the surface of engineered erythroid cells drives T-cell activation in vitro) .
4-1BBL을 포함하는 적혈구는 실시 예시 6에서 서술된 대로 제조되었다.
제작된 적혈구 세포 표면에 4-1BBl의 발현의 T-세포 활성화에 대한 효과는 표준 시험관 내 에세이로 조사되었으며, 여기서 저켓 세포 (Jurkat cells), 인간 T 세포 주를 사용하여 세포 내부 NFκB 신호전달이 측정된다. 형질감염 되지 않은 RBCs (Untransduced RBCs) (UTR RBC)는 활성 단백질을 발현하도록 제작되지 않았으므로 대조군 RBCs를 대표한다. 도 4A에서 보여준 대로, RBC-4-1BBL는 강력한 T-세포 활성화를 유도하며, 4-1BB/NFκB/Luc을 과발현하는 저켓 세포 (Jurkat cells)의 루시페라아제 (luciferase) 활성으로 측정한 대로 NFκB 경로 80-100배 활성화를 자극한다. 반면에, 4-1BB 작동제 (aognist) mAb (α4-1BB Ab)는, 2차 항체와 크로스링크 시켰을 때, 제한적인 6-배 NFκB 활성화를 자극한다. α4-1BB Ab 단독, 또는 2차 항체 단독으로 저켓 세포와 배양시켰을 때는, NFκB 활성화 유도가 없었다. 대조군 RBC가 저켓 세포와 배양되었을 때 비슷한 결과가 얻어졌다. 이 실험은 4-1BB-L을 포함하는 제작된 적혈구 세포가 작동제 4-1BB 단일클론 항체, α4-1BB Ab, 및 처치하지 않은 대조군에 비교하여, >15배 이상 더 높은 NFκB 활성화를 유도함을 보여준다.
다른 실험에서, 적혈구 세포는 증가 되는 양의 4-1BB-L mRNA로 형질 감염 (transfection) 시키고 및 4-1BB-L 발현이 측정되었다 (도 4B). 한 세포 당 4-1BB-L 분자 카피의 수가 x-축에 보인다. 4-1BBL을 포함하는 50,000 제작된 적혈구 세포가 저켓 세포와 동시배양 되었다. 6시간 후에 세포는 수집되고, 및 루시페라아제 활성이 측정되었다. 도 4B는 4-1BBL을 포함하는 제작된 적혈구 세포에 의한 NFκB 활성화는 조정될 수 있음을 보여준다.
그러므로 도 4A 및 도 4B에서 보여준 대로, 표면에 4-1BBL을 발현하도록 제작된 적혈구 세포에 4-1BBL 단백질의 카피 수의 증가는, 활성화에 용량-반응의 결과로 나타난다. 따라서, 적혈구 세포는 T-세포 활성화를 최대로 확실히 하기 위한 4-1BBL 발현이 되도록 제작될 수 있다.
다음은, 일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포 (primary CD4+ and CD8+ T cells)의 증식 및 활성화가 측정되었다. 3 공여자로부터의 100,000 PBMCs가 CTFR로 라벨 되고 및 4-1BB-L ("RBC-4-1BBL"), 대조군 RBC ("RBC-CTL), α4-1BB Ab 단독 또는 2차 항체를 포함하는 제작된 적혈구 세포와 배양되었다. RBC는 50,000, 25,000, 또는 12,500 세포로 존재하였다. α4-1BB Ab 농도는 100nM, 10nM, 1nM 범위였다. 5일째 날에, 상대적인 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 양이 CTFR 희석을 사용하여 평가되었다. 상등액은 수집되고 및 IFNγ 및 TNFα 의 양이 ELISA를 사용하여 평가되었다. 도 5A 및 도 5B에서 보여준 대로, RBC-4-1BBL은 일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 강력하게 증식하도록 자극함은 물론 인간 면역 반응에 중심인 T 세포 활성화에 의해 방출되는 IFNγ 및 TNFα 두 사이토카인의 생산으로 측정한 대로, CD4+ 및 CD8+ T 세포 활성화가 되도록 자극하였다. RBC-41BBL 은 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 각각 4-6-배 및 2-3-배 증가 되도록 자극 시킴은 물론, IFNγ 및 TNFα 생산이 3-배까지 측정한 대로 의미 있는 T-세포 활성화를 자극한다. 반대로, 4-1BBL 작동제 mAb (α4-1BB Ab)는 어느 측정할 만한 증식을 자극하지 못했으며 및 단지 최소의 T 세포 활성화만 하였다. 이론에 얽매이지 않고, RBC-4-1BBL의 강력한 T 세포 자극 활성은 세포 표면에 자연적인, 삼배체 구조로 4-1BBL이 높게 발현되어, 항원 제시하는 세포와 T-세포 사이에 형성된 면역 시납스 (immune synapse) 를 지극하기 때문으로 생각된다.
종합적으로 생각하면, 이 실시 예시에서 제시된 결과는 RBCs 표면에 4-1BBL가 이의 자연적인 삼배체 구조로 발현되어, 4-1BB/NKfB/Luc 저켓 세포 (Jurkat cells)에서 NFκB 활성화로 측정한 대로 아주 강력한 T-세포 활성화를 유도함은 물론 일차 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 강력한 증식 및 활성화를 유도함을 보여준다.
실시 예시 8. 4- 1BBL을 포함하는 적혈구 세포는 전이성 흑색종 생쥐 모델에서 CD8+ T 세포를 자극한다 ( Erythroid cells comprising 4- 1BBL stimulate CD8+ T cells in a metastatic melanoma mouse model).
암 환자에서 개선되고 및 지속적인 임상 반응에 중요한 CD8+ T 세포, 및 CD8+ 메모리 T 세포 (CD8+ memory T cells), CD8+ 주효 T 세포 (CD8+ effector T cells) 및 그랜자임 B+ CD8+ T 세포 (Granzyme B+ CD8+ T cells) 와 같은 CD8+ T 세포 아집단 (subpopulations) 에 대한 쥐 4-1BBL을 포함하는 쥐 적혈구 세포의 효과를 검증하기 위하여 B16F10 폐전이 생쥐 모델이 사용되었다.
쥐 적혈구 세포는 쥐 4-1BBL과 클릭 방법 (적혈구 세포를 기능화하는 클릭 화학은 국제 출원 (International Application) No. PCT/US2018/000042에 서술되어 있으며, 이는 2017년 2월 17일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/460589 및 2017년 7월 8일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/542142에 우선권을 가지며, 그 전문이 여기 참고 문헌으로 병합되었다))으로 접합 되었다 (conjugated). 쥐 4-1BBL 단백질은 여기 표 10에 제시된 구조체에서 발현되었다.
자연적인 삼배체 구조의 4-1BBL (RBC-4-1BBL)에 접합 된 쥐 적혈구 세포는 대략 그 세포 표면에 대략 150,000카피의 4-1BBL을 함유하며, 이는 4-1BBL을 발현하도록 제조한 인간 적혈구 세포보다 2-배 낮다, 그러나 이는 강한 T 세포 활성화 및 증식을 자극하는데 충분하다. 도 9에 보여준 이 결과는, mRBC-4-1BBL가 강력한 T 세포 활성화 및 증식을 자극하는데 충분하다는 것을 암시한다, 왜냐하면, mRBC-4-1BBL가 15-배 더 높은 용량의 항-생쥐 4-1BB 작동제 단일클론 항체 (a4-1BB mAb)인, 3H3와 비슷한 수준의 CD8+ T 세포 활성화 및 증식을 유도하기 때문이며, 이는 삼배체 4-1BBL의 세포 제시는 좀 더 강력함을 암시한다. 음성 대조군 인산염 완충된 생리 식염수 (phosphate buffered saline) (PBS), 및 쥐 대조군 RBC는 활성 단백질 (mRBC-CTRL)을 발현하지 않으며, 생체 내 CD8+ T 세포 증식을 자극하지 않았다.
실시 예시 9. 4- 1BBL을 포함하는 적혈구 세포는 생체 내에서 종양 성장을 늦춘다 ( Erythroid cells comprising 4- 1BBL slow tumor growth in vivo ) .
4-1BBL을 포함하는 쥐 적혈구 세포의 종양 성장에 대한 효과를 검증하기 위하여 대장 종양 (colon carcinoma)에 대해 MC38 동계 생쥐 모델 시스템 (syngeneic mouse model system)이 사용되었다. MC38는 상업적으로 구할 수 있는 대장 종양 생쥐 모델이다 (예를 들어, Selby et al. (2016) PLoS ONE 11(9): e0161779; Altogen Labs; Charles River Laboratories 참조).
쥐 적혈구 세포는 재조합 쥐-4-1BBL 단백질과 클릭 방법을 (적혈구 세포를 기능화하는 클릭 화학은 국제 출원 (International Application) No. PCT/US2018/000042에 서술되어 있으며, 이는 2017년 2월 17일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/460589 및 2017년 7월 8일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/542142에 우선권을 가지며, 그 전문이 여기 참고 문헌으로 병합되었다)) 사용하여 접합 되었다 (conjugated). 쥐 4-1BBL 단백질은 여기 표 10에 제시된 구조체에서 발현되었다.
종양이 대략 100mm3의 부피에 도달했을 때, 동물은 4-1BBL을 제시하는 적혈구 세포로, 또는 4-1BBL가 없는 적혈구 세포, 또는 대조군으로서 생리 식염수를 투여했다. 동물에 투여를 위해, 용량당 평균 e9 4-1BBL RBCs가 세포 당 평균 20,000-65,000 4-1BBL 분자로 투여되었으며 이는 1-3 μg의 4-1BBL, 또는 대략 생쥐 한 마리당 용량당 0.05-0.15 mg/kg 에 해당한다.
동물의 무게 및 컨디션은 매일 기록되고, 및 종양은 2차원으로 각각 측정하여 일주일에 세 번 측정 되었다. 종양 부피는 표준 공식: (L x W2)/2 을 사용하여 계산된다. 평균 종양 무게 및 평균의 표준 오차는 각 그룹에서 각 시간 포인트에서 계산된다.
더 나아가 몸무게는 매일 기록된다. 각 생쥐의 몸무게의 변화는 첫째 날에 기록된 몸무게에 대비하여 계산된다.
4-1BBL을 포함하는 제조된 적혈구 세포의 항-종양 활성은 처치되지 않은 대조군과 비교하여 시간이 지남에 따른 종양 부피 및/또는 종양 무게의 변화로 결정된다. 결과는 도 6에 보여주며, 및 4-1BBL을 포함하는 제조된 적혈구 세포는 시간이 지남에 따라 처치되지 않은 대조군과 비교하여 종양 부피의 증가가 감소하였음을 보여준다.
실시 예시 10. 쥐 RBC -4- 1BBL의 독성 결여 (Lack of toxicity of murine RBC-4-1BBL).
간 독성의 생쥐 모델이 독성의 결여 또는 쥐 RBC-4-1-BBL의 참을성 (tolerability)을 평가하기 위하여 사용되었다 (예를 들어, Niu et al (2007) J. Immunology 178:4194-4213 참조). 도 10에서 보여준 대로, 실시 예시 8에서 서술된 대로 전 임상 연구에서 사용된 같은 용법 스케줄을 따른 후, 쥐 RBC-4-1-BBL의 호의적인 참을성이 관찰되었다. 쥐 RBC-4-1BBL을 투여한 후에, 알라닌 트란스아미네이즈 (alanine transaminase) (ALT) 및 아스파르테이트 트란스아미네이즈 ((aspartate transaminase (AST) 간 효소의 수준은 의미 있게 올라가지는 않았다. 반대로, 4-1BB 작동제 단일클론 항체, 3H3, 의 투여 후에는 상당한 수준의 이들 간 효소들이 증가 되었다. 이는 쥐 RBC-4-1BBL로 생체 내에서 관찰된 CD8 양성 T 세포의 강력한 자극은 다른 4-1BB 작동제의 투여와 관련되었던 간 독성은 수반되지 않음을 암시한다.
실시 예시 11. IL-15/IL-15-RA 융합 단백질 및 4- 1BBL을 발현하도록 유전적으로 제작된 적혈구 세포의 생산 (Generation of erythroid cells genetically engineered to express an IL-15/IL-15-RA fusion protein and 4- 1BBL )
렌티바이러스 벡터의 생산 (Production of Lentiviral Vector)
IL-15/IL-15-RA 융합 단백질 및 4-1BBL 유전자가 구성되었다. 한 벡터는 IL-15/IL-15RA의 유전자를 포함하고, 다른 벡터는 4-1BBL의 유전자를 포함하도록 각 각의 유전자는 MSCV 프로모터 서열의 조절하에 있는 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector) pCDH의 다 클로닝 부위 (multiple cloning site)에 클론 되었다 ((시스템 바이오사이언스 (System Biosciences)). 렌티바이러스는 293T 세포에서 pPACKH1 (System Biosciences) 및 IL-15/IL-15-RA 융합 유전자를 함유하는 pCDH 렌티 바이러스 벡터 및 4-1BBL 유전자를 함유하는 pCDH 렌티 바이러스 벡터로 동시형질감염시켜 생산되었다. 세포는 신선한 배양 배지에 넣었다. 바이러스 상등액은 배지 교환 후 48시간에 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 수집하였다. 상등액은 수집되고, 여과되고, 및 한 몫씩 (aliquotes) -80 o C에서 얼렸다.
다른 한편으로, IL-15/IL-15-RA 융합 단백질 및 4-1BBL 유전자는 구성되고 및 단일 벡터에 IL-15/IL-15-RA의 유전자 및 4-1BBL 유전자를 포함하도록 MSCV 프로모터 서열의 조절하에 있는 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector) pCDH의 다 클로닝 부위 (multiple cloning site)에 클론 되었다. 렌티바이러스는 293T 세포를 pPACKH1 (System Biosciences) 및 IL-15/IL-15-RA 유전자 및 4-1BBL 유전자 둘 다를 함유하는 pCDH 렌티바이러스 벡터로 동시-형질감염시켜 생산하였다. 세포는 신선한 배양 배지에 넣었다. 바이러스 상등액은 배지 교환 후 48시간에 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 수집하였다. 상등액은 수집되고, 여과되고, 및 한 몫씩 (aliquotes) -80 o C에서 얼렸다.
적혈구 세포의 확장 및 분화 (Expansion and differentiation of erythroid cells)
정상 인간 공여자로부터 동원된 말초 혈액에서부터 유래한 인간 CD34+ 세포는 올셀 회사 (AllCells Inc.) 에서 냉동된 채로 구입하였다. 확장/분화 과정은 3단계를 포함한다. 첫 번째 단계에서, 해동된 CD34+ 적혈구 전구 세포는 재조합 인간 인슐린, 인간 트란스훼린 (human transferrin), 재조합 인간 재조합 인간 줄기세포 인자 (recombinant human stem cell factor), 및 재조합 인간 인터루킨 3을 포함하는 이스코브 MDM 배지 (Iscove's MDM medium) 에서 배양시켰다. 두 번째 단계에서는, 적혈구 세포는 재조합 인간 인슐린, 인간 트란스훼린 (human transferrin), 재조합 인간 줄기세포 인자 (recombinant human stem cell factor), 인간 재조합 에리스로포에틴 (human recombinant erythropoietin), 및 L-글루타민 (L-glutamine)으로 보충된 이스코브 MDM 배지 (Iscove's MDM medium) 에서 배양시켰다. 세 번째 단계에서는, 적혈구 세포는 인간 트란스훼린 (human transferrin), 재조합 인간 인슐린, 인간 재조합 에리스로포에틴 (human recombinant erythropoietin), 및 헤파린 (heparin)으로 보충된 이스코브 MDM 배지 (Iscove's MDM medium) 에서 배양시켰다. 배양은 37 oC 에서 5% CO2 배양기에서 유지시켰다.
적혈구 전구 세포의 형질도입 (Transduction of erythroid precursor cells) 적혈구 전구 세포는 상기 서술된 배양 공정 단계 1 동안에 형질도입 되었다. 배양하고 있는 배지에 있는 적혈구 세포는 렌티바이러스 상등액 및 폴리브렌 (polybrene)과 섞었다. 감염은 플레이트를 2000 rpm에서 90분 동안 실온에서 돌리면서, 스피이노큘레이션 (spinoculation)으로 달성하였다. 스피이노큘레이션 후에, 세포는 37°C 에서 하룻 밤 동안 배양 시켰다.
항체 결합 (Antibody Binding)
PE-라벨 된 항-IL-15-RA 항체 (예를 들어, 항-IL-15RA 항체 (JM7A4) (ab91270), AbCam)의 결합이 제작된 적혈구 세포에서 IL-15/IL-15-RA 발현을 평가하기 위하여 사용되었다. PE-라벨 된 항-4-1BBL 항체 ((예를 들어, 정제된 항-인간 4-1BB 리간드 (CD137L) 항체, 바이오레젠드 (BioLegend))의 결합이 적혈구 세포에서 4-1BBL의 발현을 평가하기 위하여 사용되었다. 항체의 결합은 PE 형광에 대해 유동 세포 분석 (flow cytometry) 으로 측정되었다. 게이트 (gate)는 염색된 형질감염 안 된 세포에 근거하여 설정되었다.
실시 예시 12. 제작된 적혈구 세포 표면에 IL-15/IL-15-RA 및 4- 1BBL의 발현은 시험관 ( in vitro ) 에서 T-세포 활성화를 유도한다 (Expression of IL-15/ IL-15RA and 4- 1BBL on the surface of engineered erythroid cells drives T-cell activation in vitro) .
IL-15/IL-15-RA 및 4-1BBL를 포함하는 인간 적혈구 세포가 실시 예시 11에 서술된 대로 제조되었다.
제작된 적혈구 세포 표면에 IL-15/IL-15-RA 및 4-1BBl의 발현의 T-세포 활성화에 대한 효과는 표준 시험관 내 (in vitro) 에세이로 조사되었으며, 여기서 저켓 세포 (Jurkat cells), 인간 T 세포 주를 사용하여 세포 내부 NFκB 신호전달이 측정된다. 형질감염 되지 않은 RBCs (Untransduced RBCs) (UTR RBC)는 활성 단백질을 발현하도록 제작되지 않았으므로 대조군 RBCs를 대표한다. 도 11에서 보여준 대로, RBC-IL-15/IL-15RA-4-1BB는, RBC-4-1 BB에서 관찰된 T-세포 활성화와 비슷한 수준의 (도 4A), 강력한 T-세포 활성화를 유도한다. 4-1BB 작동제 (agonist) mAb (α4-1BB Ab)를 2차 항체와 크로스링크 시켰을 때, 제한적 NFκB 활성화가 보였다. α4-1BB Ab 단독, 또는 2차 항체 단독으로 저켓 세포와 배양시켰을 때는, NFκB 활성화 유도가 없었다. 이 실험은 IL-15/IL-15RA 및 4-1BB-L을 포함하는 제작된 적혈구 세포가 작동제 4-1BB 단일클론 항체, α4-1BB Ab, 및 처치하지 않은 대조군에 비교하여, 강력한 NFκB 활성화를 유도함을 보여준다. 도 11에서 보여준 대로, 적혈구 세포는 증가 되는 양의 IL-15/IL-15RA 및 4-1BB-L로 형질감염시켰으며, 및 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL의 발현이 측정되었다. IL-15/IL-15RA 및 4-1BB-L의 세포 당 카피 수가 x-축에 보인다. 도 11은 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 포함하는 제작된 적혈구 세포에 의한 NFκB의 활성화는 조정될 수 있음을 보여준다.
실시 예시 13. IL-15/IL-15-RA 융합 단백질 및 4- 1BBL을 발현하도록 제작된 적혈구 세포는 CD3 자극과 함께 또는 없이 지라 세포 ( splenocytes )를 강력하 게 활성화한다 ( Erythroid cells engineered to express an IL-15/IL-15-RA fusion protein and 4-1BBL potently activate splenocytes with or without CD3 stimulation).
쥐 적혈구 세포는 IL-15/IL-15-RA 융합 단백질과 함께 및 4-1BBL와 함께 클릭 방법을 ((적혈구 세포를 기능화하는 클릭 화학은 국제 출원 (International Application) No. PCT/US2018/000042에 서술되어 있으며, 이는 2017년 2월 17일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/460589 및 2017년 7월 8일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/542142에 우선권을 가지며, 그 전문이 여기 참고 문헌으로 병합되었다)) 사용하여 접합 되었다.
지라 세포 (Splenocytes) 는 CD8+ T-세포 및 NK 세포를 포함하는, 면역 기능을 가진 다양한 세포 집단으로 구성된다. 지라 세포는 3마리의 순수 생쥐 (naive mice)로부터 분리되었다. 150,000 지라 세포는 4-1BBL 단독이나, IL-15/IL-15RA 단독이나, IL-15/IL-15RA 및 41BBL 둘 다 포함하거나, 또는 단백질을 포함하지 않는 1e7 클릭 된 세포 (1e7 clicked cell); 쥐 4-1BB 작동제 항체 (4-1BB agonist antibody) 3H3 (1ug/mL) 또는 재조합 인간 IL-15 (10ng/mL)와 37 oC에서 2일 동안 동시-배양시켰다. 지라 세포는 항 CD3 (aCD3)로 처치하거나 또는 처치하지 않았다. aCD3는 지라 세포 T-세포를 자극하는데 사용되었다. aCD3 자극이 없을 때는, 활성은 NK 세포 활성화에 기인할 수 있다. 상등액에 생산된 IFNγ는 ELISA로 측정되었다. 인터페론 감마 (Interferon gamma) (IFNγ) 사이토카인 분비는 지라 세포 활성화의 척도로 사용되었다.
도 7에서 보여준 대로, aCD3로 자극되었을 때, IL-15/IL-15-RA 융합 단백질 및 4-1BBL을 제시하도록 제작된 적혈구 세포는, 재조합 인간 IL-15 또는 쥐 4-1BB 작동제 항체 3H3, 단독 또는 조합으로와 비교하여, 우수한 반응을 보였다. 도 7에서 보여준 대로, aCD3 자극이 사용되지 않았을 때, IL-15/ IL-15RA 및 4-1BBL사이에 높은 동반 상승효과가 있고, 및 IL-15/IL-15-RA 융합 단백질 및 4-1BBL을 제시하도록 제작된 적혈구 세포는, 재조합 인간 IL-15에 비교하여 우수한 반응을 보인다. aCD3 자극이 사용되지 않았을 때, 관찰된 효과는 NK 세포 활성화의 결과라고 결론지을 수 있다.
활성화된 NK 세포의 존재를 확인하기 위하여, IFNγ 염색이 수행되었다. 지라 세포가 분리되고 및 브레휄딘 A (brefeldin A)의 존재하에서 PMA/아이오노마이신 (ionomycin) (2ug/mL)으로 37 oC에서 4시간 동안 자극 시켰다. 배양 후에, 세포는 돌려서 침전시키고 및 PBS로 세척하고 실온에서 (RT) 15분 동안 세포 표면 염색을 수행하였다. 세포는 그 후 세척하고, 15분 동안 고정 시키고, 및 IFNγ에 대한 염색을 투과화 버퍼 (permeabilization buffer)에서 30분 동안 실온에서 하였다. IFNγ의 존재는 NK 세포의 활성화를 확인했다.
실시 예시 14. IL-15/IL- 15RA 및 4- 1BBL을 발현하도록 유전적으로 제작된 적혈구 세포는 총 CD8+ 세포의 증가를 유도한다 ( Erythroid cells genetically engineered to express IL-15/IL- 15RA and 4- 1BBL induce an increase in total CD8+ cells).
IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 포함하는 인간 적혈구 세포는 일반적으로 실시 예시 11에서 서술된 대로 제조되었다.
세포 표면에 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 포함하는 적혈구 세포의 CD8+ T 세포, NK 세포, 및 이들 세포의 주요 서브세트 (key subsets) 확장에 대한 효과가 측정되었다. 특히, 세포 표면에 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 둘 다를 포함하는 제작된 적혈구 세포의 세포 확장에 대한 효과가 단일 작동제, 4-1BBL (RBC-4-1-BBL)이나 혹은 IL-15/IL-15RA 융합 단백질을 포함하는 제작된 적혈구 세포의 세포확장에 대한 효과와 비교하여 조사되었다. 도 12에서 보여준 대로, T 세포 수용체 자극 존재하에서 (+aCD3 자극), 동시-배양 5일 후에 6-배 이상의 CD8+ 메모리 T 세포 확장이 관찰되었으며, 이는 α4-1BBAb, 재조합 인간 IL-15 (rhIL-15), α4-1BBAb 및 rhIL-15의 조합, 및 RBC-CTRL에 보다 호의적이다. 항-CD3 항체로의 T 세포 자극이 없을 때는 (aCD3 자극 없이), CD8+ 메모리 T 세포 및 NK 세포 둘 다의 확장에서 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA 조합의 상승작용 효과는 양 8일 후에 대략 9-배였으며, 이는 α4-1BBAb, rhIL-15, α4-1BBAb 및 rhIL-15의 조합, RBC-IL-15/IL-15RA 및 RBC-4-1BB 보다 상당히 더 높다.
종합하면, 이 실시 예시에서 보여준 결과는 표면에 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL를 포함하는 제작된 핵 제거된 세포는 NFκB 활성화는 물론, CD8+ 메모리 T 세포 및 NK 세포 확장으로 측정된 대로, 아주 강력한 T-세포 활성화를 유도한다. 더 나아가, 4-1-BBL 단독 또는 IL-15/IL-15RA 융합 단백질 단독으로 포함하고 있는 제작된 적혈구 세포와 비교하였을 때, IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL의 조합은 CD8+ 메모리 T 세포 및 NK 세포 확장에서 상승 작용효과를 초래한다.
실시 예시 15. IL-15/IL- 15RA 및 4- 1BBL을 포함하는 적혈구 세포는 생체 내에서 폐 전이를 감소시킨다 ( Erythroid cells comprising IL-15/IL- 15RA and 4- 1BBL reduce lung metastases in vivo ) .
흑색종 (melanoma) 을 위한 B16F10 전이 생쥐 모델 시스템이 (Kubo et al. (2017) Cancer Immunology Research 5(9): 1-9, 여기 그 전문이 참고 문헌으로 병합되었다) 인간 IL-15/IL-15RA 및 쥐 4-1BBL (IL-15/RA 4-1BBL RBC)을 포함하는 쥐 적혈구 세포의 전이성 성장 (metastatic growth)에 대한 효과를 검사하기 위하여 사용되었다. 이 모델에서, 종양 세포는 폐에 전이를 확립하기 위하여 정맥으로 주사되고 및 그 후 생쥐는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포 단독으로 또는 항-PD1 항체 (anti-PD1 antibody)와 함께 처치되었다. 피하주사 후, B16는 5일에서 10일에 감지할 만한 종양을 형성하였으며 및 14일에서 21일에 1x 1x 1 cm 종양으로 자랐다.
쥐 적혈구 세포는 클릭 방법을 (적혈구 세포를 기능화하는 클릭 화학은 국제 출원 (International Application) No. PCT/US2018/000042에 서술되어 있으며, 이는 2017년 2월 17일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/460589 및 2017년 7월 8일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/542142에 우선권을 가지며, 그 전문이 여기 참고 문헌으로 병합되었다)) 사용하여 인간 IL-15/IL-15RA, 쥐 4-1BBL로 접합시키거나, 또는 인간 IL-15/IL-15RA 및 쥐 4-1BBL 둘 다로 동시-접합시켰다. IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL 는 유동 세포 분석을 사용하여 정량화되었다. IL-15/IL-15RA 융합 단백질은 표 10에 제시된 구조체에서 IL-15 체인에 융합된 수용체의 스시 도메인으로 발현되었다.
초기에, 7주령 여성 C57BL/6 생쥐는 정맥으로 생쥐 한 마리당 1x 105 B16F10 세포로 접종되었다. 다양한 실험에서, 동물은 그 후 정맥으로 (IV) 다음이 투여되었다: 4-1BBL, IL-15/IL-15 RA를 제시하거나, 또는 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA 둘 다를 제시하는 적혈구 세포; 항-PD1 단일클론 항체 단독으로 (αPD-1 mAb); 정맥으로 주사된 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA를 제시하는 적혈구 세포와 αPD-1 mAb (IP) 와 조합으로; 복강으로 (intraperitoneally) (IP) 투여된 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA를 제시하는 적혈구 세포로; 쥐 4-1BB 작동제 항체 (3H3)로; 또는 대조군으로 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA가 없는 적혈구 세포 (mRBC-CTL)로. 동물에 투약하기 위하여 일 회 용량당 평균 1e9 적혈구 세포 (1e9 erythroid cells)가 투여되었으며, 세포 당 0.2 mg/kg 4-1BBL에 해당하는 평균 100,000 분자의 41BBL 단독으로, 용량당 0.12 mg/kg IL-15/IL-15RA에 해당하는, 세포 당 60,000 분자의 IL-15-RA 단독으로, 또는 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 적혈구를 위하여 각각 0.1-0.12 mg/kg 및 0.06-0.08 mg/kg 해당하는 50,000-60,000 분자의 41BBL 및 30,000-40,000 분자의 IL-15-RA의 용량으로 투여되었다. 작동제 41BB 항체 (3H3)는 용량이 2.5mg/kg이었다. 동물은 접종 후 mRBC 또는 3H3로 1, 5 및 8일에 투여되었다.
동물의 무게 및 컨디션은 매일 기록되었다. 접종 후 14일에 동물은 희생시키고 및 폐가 수집되었다. 폐 전이는 입체경 (stereoscope) 을 사용하여 평가되었다. 전이의 수 (number of metastases) 는 2주 후에 측정되었다. 더 나아가, 몸무게는 매일 기록되었다. 각 생쥐에 대하여 몸무게의 변화는 첫째 날에 기록된 몸무게와 상대적으로 계산되었다. 처치된 생쥐의 분산된 폐 내의 면역 침윤물은 유동세포 분석으로 측정되었다. NK 세포 (NK1.1+) 침윤은 CD45+ 면역 세포 내에 총 세포 수의 퍼센트로 보고되었다.
도 13A에서 보여준 대로, 이들의 세포 표면에 IL-15/IL-15RA + 4-1BBL 둘 다를 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 i.v.로 단독 치료로서 투여는, mRBC CTRL, mRBC 4-1BBL, 및 mRBC IL-15/IL-15RA로 각각 처치한 것에 비교하여, 생쥐에서 종양 부담을 감소시켰으며, 그러므로 이는 적혈구 세포 표면에 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA 둘 다를 포함하여 잠재적 상승효과를 달성할 수 있음을 제시한다. mRBC-4-1BBL+IL-15/IL-15RA로 달성될 수 있는 종양 부담의 감소는 41BB 작동제 단일클론 항체 3H3 로 달성되는 것과 의미 있게 다르지는 않다. 더 나아가, 폐 전이 수의 이 감소는, 도 13B에서 보여준 대로, 폐로의 NK 세포의 증가 된 침투와 또한 연관이 있다 (p=0.02).
별도의 비슷한 연구의 결과가 도 13C에 보여준다. 이 연구는 동물에 투여법을 제외하고는 상기 서술된 대로이다, 평균 1e9 적혈구 세포 (le9 erythroid cells)가 용량당 평균 25,000 분자/세포의 4-1BBL, 및 평균 45,000 분자/세포의 IL-15/IL-15RA로 투여되었다. 도 13C에서 볼 수 있는 대로, IL-15/IL-15RA + 4-1BBL가 제시되도록 제조된 쥐 적혈구 세포는, 항-PD1 항체와 조합하여 i.v.로 투여 되었을 때, 음성 대조군 PBS 및 mRBC CTRL로는 물론, 항-PD1 항체 단독으로 처치한 쥐에 비교하여 생쥐에서 종양부담을 의미 있게 감소시켰다. 쥐 4-1BB 작동제 항체, 3 H3, 는 단일치료 (monotherapy) 로서는 활성적이지 않다. 이 연구에서, i.v로 투여된 IL-15/IL-15RA + 4-1BBL를 제시하는 쥐 적혈구 세포의 노출은 이전의 단일치료 연구에서보다 약 3배 더 낮으므로 (상기에 서술 및 도13A) IL-15/IL-15RA + 4-1BBL를 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 단일치료로서는 활성적이지 않다. 그러나 IL-15/IL-15RA + 4-1BBL를 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포는 이 연구에서, 복강으로 (intraperitoneally), 또는 i.p.로 투여되었을 때, 아마도 혈액에 노출이 더 크고 및/또는 다른 기관으로 (예를 들어, 림프 절) 의 분포가 더 크게 얻어지기 때문에, 단일치료로서 폐전이를 감소시키는 데는 매우 효과적이었다.
추가의 실험에서, IL-15/IL-15RA + 4-1BBL를 제시하도록 제조된 적혈구 세포의 약동학적 효과가 B16F10 모델에서 종양으로의 NK 세포 침투를 정량하여 평가되었다. C57BL/6 생쥐는 B16F10 세포로 피하로 접종하였다. 종양이 대략 50mm3 (cubic millimeter) 부피에 도달했을 때, 동물은 무작위 추출로 1, 4, 및 8일에 정맥으로 1x 109의 mRBC-m4-1BBL, mRBC-IL-15/IL-15RA 또는 mRBC IL-15/IL-15RA + 4-1BBL로 투약하였다. 추가의 군은 음성 대조군으로서 역할을 하는 200 μ l의 인산-완충된 생리 식염수 (phosphate-buffered saline) (PBS)를 투여받았다. 여기서, 상기 이 실시 예시에서 서술된 대로, IL-15/IL-15RA 융합 단백질은 IL-15 체인에 융합된 수용체의 스시 도메인으로서 발현되었다 (표10에 제시된 구조체).
세포당 분자의 평가에서 mRBC-m4-1BBL는 세 포당 150,000 분자를 발현하고, IL-15/IL-15RA는 세포당 90,000 분자를 발현하고 및 mRBC IL-15/IL-15RA + 4-1BBL은 세포당 70,000 분자의 m4-1BBL 및 50,000 분자의 IL-15/IL-15RA를 발현하는 것으로 보였다. 11일째 날에, 종양은 수집되고, 소화되고, 및 종양 현탁액은 NK 세포의 양에 대해서는 물론, NK 성숙 및 분화 마커도 유동 세포 분석으로 분석되었다.
도 13D-F에서 보여준 대로, mRBC IL-15/IL-15RA + 4-1BBL는 PBS-처치한 대조군 생쥐에 비교하여 종양에서 총 NK 세포 수의 증가를 초래했다 (p = 0.013, 도 13D). 더 나아가 분석은 mRBC IL-15/IL-15RA + 4-1BBL 처치한 생쥐에 있는 MK 세포는 대조군 생쥐에 비교하였을 때, 총 최종 분화된 세포 및 그랜자임 B+ (granzyme B+) NK의 수의 증가로 보여준 대로, 좀 더 성숙 (p=0.013; 도. 13E) 하고 및 기능이 매우 높음(p=0.008; 도 13F)을 보여주었다. mRBC IL-15/IL-15RA + 4-1BBL의 효과는 mRBC-m41BBL 및 mRBC-IL-15/IL-15RA의 효과보다 더 깊었다. 이 발견은 m4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 쥐 대리생산물은 쥐에서 매우 기능적이며 종양으로 NK 세포 침투를 유도할 수 있음을 암시한다.
실시 예시 16. IL-15/IL- 15RA , 4- 1BBL를 포함하는, 또는 IL-15/IL- 15RA 및 4-1BBL를 포함하는 적혈구 세포는 시험관 내에서 NK 세포 확장 및 활성화를 제시하는 표현형 마커를 조정한다 ( Erythroid cells comprising IL-15/IL- 15RA , 4- 1BBL or comprising IL-15/IL- 15RA and 4- 1BBL modulate phenotypic markers indicative of NK cell expansion and activation in vitro)
IL-15/IL-15RA 포함하는 적혈구 세포 (v4, 성숙한 세포 외 IL-15 포함하는)는 일반적으로 실시 예시 1 에서 서술된 대로 제조되었다. 4-1BBL를 포함하는 적혈구 세포 일반적으로 실시 예시 6에서 서술된 대로 제조되었다.
냉동된 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMCs; Astarte) 는 해동되고, 10% FBS가 있는 RP MI에 재 현탁 되었으며, 및 98-웰 둥근-바닥 플레이트에 웰당 100,000 세포로 플레이트 하였다. IL-15/IL-15RA (v4; 성숙한 세포 외 IL-15RA를 발현), 4-1BBL를 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL를 포함하는 적혈구 세포를 다양한 양으로 (IL-15/IL-15RA는 250,000 또는 500,000 세포, 4-1BBL는 500,000 세포) 첨가하였다. 배양은 8일 동안 배양되었으며 (장기간 프라이밍) 및 그 후 다음의 항체를 사용하여 유동 세포 분석으로 분석하기 위하여 염색되었다: 바이오레전드 (BioLegend)로부터의 CD69 (FN50), TRAIL(RIK-2), 41BB (4B4-1), NKp44 (P44-8), 및 KLRG1 (14C2A07) 및 죽은 세포 라벨을 위해 인비트로젠 (Invitrogen)으로부터 아콰 다이 (Aqua Dye). 내부세포 염색을 위해, 세포는 고정 시키고 및 Foxp3/전사인자 고정/ 투과화 키트 (Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization kit) (eBioscience)로 투과성 있게 하였으며, Ki67 (B56, BD Biosciences) 및 GZMB (GB11 BioLegend)에 대해 염색하였다. 세포는 유동 세포 분석으로 분석되었다 (Novocyte).
이 실험의 결과는 도 14에 보여준다. NK 세포를 장기간 프라이밍한 후, IL-15/IL-15RA (v4), 41BBL을 포함하는 적혈구 세포, 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 (동시 "co") 적혈구 세포는, HA를 포함하는 대조군 적혈구로 배양한 NK 세포에 비교하여, 배양에서 8일 후에 NK 세포 회복을 강화한다는 것이 발견되었다. 또한, 도 14에서 보여주는 것은, NK 세포 생존, 확장 및 활성화의 표현형 판독으로 사용된 마커 펜널 분석의 결과이다. 각 마커에 대해 얻어진 결과는 아래와 같다.
Ki67: Ki67 염색으로 측정한 대로, HA를 포함하는 대조군 적혈구 세포와 배양된 NK 세포와 비교하여, IL-15/IL-15RA, 41BBL을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포는 NK 세포 증식을 강화한다.
그랜자임 B (Granzyme B): IL-15/IL-15RA, 41BBL을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포는, 대조군 HA에서 관찰된 것과 비교하여, NK 세포독성의 마커로서, NK 세포에서 그랜자임 B 발현의 증가한 비율 및 수준을 초래한다 (오른쪽 맨 위쪽 패널 참조, GZMB에 대해 양성인 NK 세포에서 GZMB의 유동세포 분석 염색의 상대적 강도를 보여준다).
TRAIL: IL-15/IL-15RA, 41BBL을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포는, 대조군 HA에서 관찰된 것과 비교하여, NK 세포 활성화 및 TRAIL-리간드-포함하는 세포 (TRAIL-ligand-comprising cells)에 대한 죽음 유도하는 리간드의 마커로서, TRAIL-포함하는 NK 세포 비율의 증가를 초래한다. TRAIL 발현은 IL-15 자극과 함께 증가하며, 이는 이들 제작된 적혈구 세포가 IL-15 제시 (transpresentation) 효과를 반복하는 것으로 제시된다.
CD69: IL-15/IL-15RA을 포함하는 적혈구는, 대조군 HA에서 관찰된 것과 비교하여, CD69-포함하는 NK 세포 비율의 증가를 초래한다. CD69은 림프구에서 조기 활성화 마커이다.
NKp44: IL-15/IL-15RA, 41BBL을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포는, 대조군 HA에서 관찰된 것과 비교하여, NKp44-포함하는 세포비율의 증가를 초래한다. NKp44는 활성화된 NK 세포에 전적으로 발현되며, 및 일부 바이러스로 감염된 세포 및 종양 세포 살상을 촉진 시킬 수 있다.
41BB: 41BBL을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포는, 대조군 HA에서 관찰된 것과 비교하여, NK 세포에서 증가 된 41BB 발현을초래한다. 41BB는 NK 및 T 세포에 활성화 마커이다.
요약하면, 표현형 마커 패널의 분석으로부터의 결과는 IL-15/IL-15RA, 41BBL 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL 둘 다를 포함하는 적혈구 세포는 시험관 내에서 NK 세포의 생존, 확장 및 활성을 강화 시킨다.
실시 예시 17. 4- 1BBL 및 IL-15/IL- 15RA를 발현하도록 유전적으로 제작된 적혈구 세포는 시험관 내에서 종양 세포 살상을 유도한다 ( Erythroid cells genetically engineered to express 4- 1BBL and IL-15/IL- 15RA induce tumor cell killing in vitro )
IL-15/IL- 15RA (v5, IL- 15RA 스시 도메인) 을 포함하는 적혈구 ( Erythroid cells comprising IL-15/IL- 15RA (v5, IL- 15RA sushi domain)
IL-15/IL-15RA (v5, IL-15RA 스시 도메인을 포함하는)를 포함하는 적혈구 세포는 실시 예시 1 에서 서술된 대로 일반적으로 제조되었다. 4-1BBL를 포함하는 적혈구 세포 일반적으로 실시 예시 6에서 서술된 대로 제조되었다. NK 세포에 의한 K562 인간 만성 골수성 백혈병 (K562 human chronic myelogenous leukemia) (CML)의 시험관 내에서 살상은 각 (i) 4-1BBL 포함하는 적혈구 세포, (ii) IL-15/IL-15RA 포함하는 적혈구 세포; 및 (iii)IL-15/IL-15RA 포함하는 적혈구 세포와 4-1BBL 포함하는 적혈구 세포의 혼합에 대하여 조사되었다. 간략하게, 20,000 정제된 NK 세포 (Astarte Biologics)는 4-1BBL 또는 IL-15/IL-15RA를 포함하는 200,000 RBC 또는 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA 각 200,000으로 혼합하여 함께 16시간 동안 배양되었다. 추가로, 한 처치 군에서, 20,000 NK 세포는 5ng/mL의 재조합 IL-15와 배양시켰다. 16시간 배양 후에, 20,000 K562 세포가 배양에 4시간 동안 첨가되었다. 이러한 세포는 NK 세포에 대한 타겟 세포 집단으로 역할을 한다. 살아 있는 K562 세포 (live K562) 의수는 유동 세포 분석으로 측정되었다. 퍼센트 살상 (Percent killing) 은 대조군에 비교하여 생존 퍼센트에 근거하여 계산되었다. 그 결과는 도 8 에 보인다. 도 8에서 보여준 대로, IL-15/IL-15RA + 4-1BBL를 포함하는 적혈구 세포는 NK 세포에 의한 가장 높은 퍼센트 살상을 보였다.
IL-15/IL- 15RA (v4, 성숙된 세포 외 IL- 15RA ) 및 4- 1BBL를 포함하는 적혈구 세포 (Erythroid cells comprising IL-15/IL- 15RA (v4, mature extracellular IL-15RA) and 4- 1BBL )
상기 서술된 것에 추가의 연구가 수행되었으나, 여기서 (i) 다른 IL-15/IL-15RA 융합, 특히 스시 도메인 (sushi domain) 보다는, 성숙한 세포 외 IL-15RA (mature extracellular IL-15RA)를 포함하는 IL-15/IL-15RA v4, 가 사용되었고, 및 (ii) 적혈구 세포는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL를 동시-발현되도록 제작되었다. IL-15/IL-15RA (v4), 4-1BBL를 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA를 포함하는 적혈구 세포로 장기간 (8시간) NK 세포 프라이밍 및 단기간 (하룻밤) NK 세포 프라이밍 둘 다의 시험관 내 K562 인간 CML 세포 살상 효과에 대해 조사되었다. 이 실험을 위하여, IL-15/IL-15RA (v4), 4-1BBL를 포함하는 적혈구 세포 및 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA (v4)를 포함하는 적혈구 세포는 실시 예시 1, 실시 예시 6, 실시 예시 11에서 서술된 대로 일반적으로 각각 제조되었다.
(i) 장기간 프라이밍 (Long term priming)
장기간 프라이밍을 위해, PBMCs는 신선한 혈액으로부터 피콜 (Ficoll)을 사용하여 분리되었으며, NK 세포는 더 나아가 밀테니 (Miltenyi)로부터의 인간 NK 음성 선택 키트 (Human NK Negative Selection kit)를 사용하여 강화시켰다. 그 후, 5e5 NK 세포는 24-웰 플레이트에서 IL-15/IL-15RA (v4), 4-1BBL를 포함하는 3e6 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15-RA 및 4-1BBL를 포함하는 3e6 적혈구 세포와 함께 8일 동안 배양되었다. 대조군으로 NK 세포는 rhIL-15와 0.1, 1 또는 10ng/mL (Peprotech)로 배양되었다.
8일 후에, 세포는 유동세포분석에 의한 분석을 위해 다음의 항체를 사용하여 염색시켰다: 바이오레전드 (BioLegend)로부터의 CD56 (5.1H11), CD3 (UCHT1), CD8 (RPA-T8), CD69 (FN50), TRAIL(RIK-2), 41BB (4B4-1), 및 NKP 44 (P44-8) 및 죽은 세포 라벨을 위해 인비트로젠 (Invitrogen)으로부터 아콰 다이 (Aqua Dye). 내부세포 염색을 위해, 세포는 고정 시키고 및 Foxp3/전사인자 고정/투과화 키트 (Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization kit) (eBioscience)로 투과성 있게 하였으며 및 Ki67 (B56, BD Biosciences) 및 GZMB (GB11 BioLegend)에 대해 염색하였다. 세포는 유동 세포 분석으로 분석되었다 (Novocyte). NK 세포 생존, 확장 및 활성화를 위한 표현형 판독으로서 사용되는 마커 패널의 분석으로부터의 결과는 실시 예시 16에서 발견된 것과 비슷하다 (데이터 보여주지 않음). 간략게, Ki67 염색으로 측정한 대로, HA를 포함하는 대조군 적혈구 세포와 배양된 NK 세포와 비교하여, 4-1BBL를 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL를 포함하는 적혈구 세포는 NK 세포 증식을 강화시켰다. IL-15/IL-15RA을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포는, 대조군 HA에서 관찰된 것과 비교하여, NK 세포독성의 마커로서, NK 세포에서 그랜자임 B 발현의 증가한 비율 및 수준을 초래한다. IL-15/IL-15RA, 41BBL을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포는, 대조군 HA에서 관찰된 것과 비교하여, NK 세포 활성화 및 TRAIL-리간드-포함하는 세포 (TRAIL-ligand-comprising cells)에 대한 죽음 유도하는 리간드의 마커로서, TRAIL-포함하는 NK 세포 비율의 증가를 초래한다. IL-15/IL-15RA, 41BBL을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포는 대조군 HA에서 관찰된 것과 비교하여, CD69-포함하는 NK 세포 비율의 증가를 초래한다. CD69은 림프구에서 조기 활성화 마커이다. IL-15/IL-15RA, 41BBL을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포는, 대조군 HA에서 관찰된 것과 비교하여, NKp44-포함하는 세포비율의 증가를 초래한다. NKp44는 활성화된 NK 세포에 전적으로 발현되며, 및 일부 바이러스로 감염된 세포 및 종양 세포 살상을 촉진 시킬 수 있다. 41BBL을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포는, 대조군 HA에서 관찰된 것과 비교하여, NK 세포에서 증가 된 41BB 발현을 초래한다. 41BB는 NK 및 T 세포에 활성화 마커이다. 그러므로 표현형 마커 패널의 분석으로부터의 결과는 IL-15/IL-15RA, 41BBL 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL 둘 다를 포함하는 적혈구 세포는 NK 세포의 생존, 확장 및 활성을 강화시켰음을 보여준다.
NK 및 IL-15/IL-15RA, 41BBL을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포의 동시-배양으로부터의 NK 세포는 인간 HK 음성 선택 키트 (Human NK negative selection kit)를 사용하여 다시-정제시켰다. K562 세포와 살상 에세이를 위해, K562 타겟 세포는 셀트레이스 화 레드 (CellTrace Far Red) 로 라벨 시키고 및 20,000 세포를 정제된 NK 세포와 다양한 비율로 (적혈구:타겟 1:1, 또는 5:1) 플레이트하고 및 4시간 동안 배양시켰다. 세포는 그 후 얼음 위에서 CD56 (clone), CD3 (clone), live/dead (Invitrogen) 로 염색시키고, 2% 파라포름 알데히드 (paraformaldehyde)로 고정 시키고, 및 생존 타겟의 수를 결정하기 위하여 유동세포 분석 (Novocyte)으로 분석하였다. 특정한 살상은 자동 타겟 세포 죽음을 고려하여 ("K562+NK" 컨디션에서 % 죽은 K562 타겟 세포) - ("K562 only" 컨디션에서 % 죽은 K562 타겟 세포)로서 계산 되었다.
결과는 도 15에 보여준다. 도 15는 두 PBMC 공여자에 대해 평균 퍼센트 살상을 보여 주며, 특이 살상으로서 플럿 되었고, 및 여기서 E:T ((효능제 (Effector) (NK):타겟 (Target) (tumor)) 세포 비율은 5:1이었다. 도 15에 보여준 대로, IL-15/IL-15RA을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포로 프라임 된 NK 세포는 대조군 HA에 비교하여 K562 타겟 세포에 대하여 강화된 세포독성을 가졌다. 도 8에서 보여준 결과와 비슷하게, IL-15/IL-15RA (v4) + 4-1BB를 포함하는 적혈구 세포는 용해성 IL-15 또는 IL-2로 프라임된 NK 세포에서 관찰된 것에 견줄만하게 가장 높은 퍼센트 살상을 보여주었다. E:T 세포 비율이 1:1일 때 얻은 결과는 비슷하게 IL-15/IL-15RA을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA (v4) 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포로 프라임 된 NK 세포는, 전반적으로 살상이 적은 것으로 관찰되고 및 타겟 살상은 용해성 IL-15 또는 IL-2로 프라임된 NK 세포에서 보여준 것에서처럼 크지는 않더라도, 대조군 HA에 비교하여 562 세포에 대하여 증가 되는 세포독성을 가졌다 (데이터 보여주지 않음).
(ii) 단기간 프라이밍 (Short term priming)
단기간 프라이밍을 위하여, 냉동된, 정제된 NK 세포는 (Astarte)는 해동되고, 배지 (10% FBS가 있는 RPMI, 1% Pen-Step)에 재현탁 되고 및 96-웰 U-바닥 플레이트에서, IL-15/IL-15RA (v4), 4-1BBL를 포함하는 2e5 적혈구 세포, 또는 IL-15/IL-15-RA 및 4-1BBL룰 포함하는 2e5 적혈구 세포와 함께, 웰당 2e4 또는 1e5 로 플레이트 되었다. 대조군으로, NK 세포는 단독으로, 또는 rhIL-15 (0.1, 1 또는 10ng/mL 실험에 따라; Peprotech)와 함께 플레이트 되었다. 추가로, 대조군 웰은 적혈구로만 세트업 되었다. 세포는 37 oC 에서 습기 있는 배양기에서 하룻밤 (16-20시간) 동안 배양되었다.
K562 세포로 살상 에세이 (killing assays)를 위하여, K562 세포는 셀트레이스 화 레드 (CellTrace Far Red)로 라벨 시키고, 및 20,000 타겟 세포를 하룻밤 배양된 NK 세포, NK 및 IL-15/IL-15RA (v4), 4-1BBL를 포함하는 적혈구 세포, 또는 IL-15/IL-15-RA 및 4-1BBL룰 포함하는 적혈구 세포와 함께, 또는 대조군으로서 적혈구만 함유하는 웰에 E:T 비율 5:1로 첨가하였다. 세포는 그 후 얼음 위에서 CD56 (clone), CD3 (clone), live/dead (Invitrogen) 로 염색시키고, 2% 파라포름 알데히드 (paraformaldehyde)로 고정 시키고, 및 생존 타겟의 수를 결정하기 위하여 유동세포 분석 (Novocyte)으로 분석하였다. 특정한 살상은 자동 타겟 세포 죽음을 고려하여 ("K562+NK" 컨디션에서 % 죽은 K562 타겟 세포) - ("K562 only" 컨디션에서 % 죽은 K562 타겟 세포)로서 계산 되었다. 결과는 (데이터 보이지 않음) 하룻밤 동안 IL-15/IL-15RA (v4), 4-1BBL를 포함하는 적혈구 세포, 또는 IL-15/IL-15-RA 및 4-1BBL룰 포함하는 적혈구 세포로 프라임된 NK 세포는 K562 타겟에 대하여, 대조군 또는 4-1BBL룰 포함하는 적혈구 세포에 비교하여 (각 대략 40% 살상) 세포독성 (대략 60% 살상)을 증가시켰다, 그러나 rhIL-15로 프라임된 NK 세포 (적어도 90% 살상)보다는 적다.
종합하면, 이 실시 예시에서의 결과는 IL-15/IL-15RA 단독 또는 4-1BB와 함께 포함하는 적혈구는, 세포 당 베이스에서 NK 세포의 세포독성을 증가하며, 이는 NK 세포가 더 잘 확장될 뿐만 아니라, 결과로 얻어지는 각 NK 세포 그 자체를 좀 더 활성있게 한다.
실시 예시 18. 4- 1BBL 및 IL-15/IL- 15RA (v4)를 발현하도록 유전적으로 제작된 적혈구 세포는 시험관 내에서 ADCC 살상을 유도한다 ( Erythroid cells genetically engineered to express 4- 1BBL and IL-15/IL- 15RA v4) induce ADCC killing in vitro )
단기간 (하룻밤) 동안 IL-15/IL-15RA (v4), 4-1BBL 을 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA (v4) 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포로 NK 세포 프라이밍은 (priming) 실시 예시 17에서 서술된 대로 수행되었다.
항체-의존 세포-매개하는 세포독성 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) (ADCC) 에세이를 위해, 라지 세포 (Raji cell) 을 셀트레이스 화 레드 (CellTrace Far Red) 로 라벨 시키고, 및 그 후 5μg/ml 항-CD20 IgG1 (Invivogen) 또는 IgG1 아이소타입 대조군 항체 (Isotype control antibody) ("iso" BioLegend) 로 15분 동안 37 oC에서 배양시켰다. 라지 세포 (Raji cells)는 그 후 세척하고 및 20,000 세포를 하룻밤 배양된 NK 세포, NK 세포와 IL-15/IL-15RA (v4), 4-1BBL 을 포함하는 적혈구 세포, 또는 IL-15/IL-15RA (v4) 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포, 또는 제작된 적혈구 세포만을 함유하고 있는 웰에 넣고, 및 4시간 동안 배양시켰다. 세포는 그 후 얼음 위에서 CD56 (clone), CD3 (clone), live/dead (Invitrogen) 로 염색시키고, 2% 파라포름 알데히드 (paraformaldehyde)로 고정 시키고, 및 생존 타겟의 수를 결정하기 위하여 유동세포 분석 (Novocyte)으로 분석하였다. 특정한 살상은 자동 타겟 세포 죽음을 고려하여 ("Raji+NK" 컨디션에서 % 죽은 Raji 타겟 세포) - ("Raji only" 컨디션에서 % 죽은 Raji 타겟 세포)로서 계산되었다.
도 16에서 보여준 대로, IL-15/IL-15RA 를 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포로 하룻밤 동안 프라임된 NK 세포는 4-1BBL을 포함하는 적혈구 세포로 또는 대조군으로 하룻밤 프라임된 NK 세포에 비교하여 증가한 라지 (Raji) 세포 살상을 보였다. 이 결과는 그러므로 IL-15/IL-15RA를 포함하는 적혈구 세포 또는 IL-15/IL-15RA 및 41BBL을 포함하는 적혈구 세포는 강화된 라지 (Raji) 세포 타겟의 ADCC 살상을 유도함을 보여주며, 이는 이들 적혈구 세포는 세포 당에 근거하여 NK 세포의 세포독성을 증가시킴을 제시하며, 이는 NK 세포는 더 잘 확장할 뿐만 아니라 결과의 각각의 세포 그 자체는 좀 더 활성적임을 의미한다.
실시 예시 19. IL-15/IL- 15RA 및 4- 1BBL을 포함하는 적혈구 세포는 생체 내에서 대장암에서 종양 부담을 감소시킨다 ( Erythroid cells comprising IL-15/IL-15RA and 4- 1BBL reduce tumor burden in colon cancer mouse model in vivo) .
대장암 (colon cancer)을 위한 CT26 동계 생쥐 모델 시스템 (syngeneic mouse model system)이 인간 IL-15/IL-15RA 및 쥐 4-1BBL을 포함하는 쥐 적혈구 세포의 종양 부담 (tumor burden) 에 대한 효과를 검사하기 위하여 사용되었다. CT26은 상업적으로 구할 수 있는 생쥐 대장 종양 모델이다 ((Zhang et al., Clin Exp Metastasis. 2013 Oct; 30(7):10.1007/s10585-013-9591-8, 여기에 그 전문이 참고문헌으로 병합되어 있다)).
클릭 방법을 (적혈구 세포를 기능화하는 클릭 화학은 국제 출원 (International Application) No. PCT/US2018/000042에 서술되어 있으며, 이는 2017년 2월 17일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/460589 및 2017년 7월 8일에 출원된 미국 가 출원 (U.S. Provisional Application) No. 62/542142에 우선권을 가지며, 그 전문이 여기 참고 문헌으로 병합되었다)) 사용하여 쥐 적혈구 세포는 IL-15/IL-15RA ("IL-15TP") 및 4-1BBL (즉 IL-15TP 및 4-1BBL를 둘 다를 같은 세포에 접합) 와 동시 접합시켰다. IL-15/IL-15RA 융합 단백질은 표 10에 제시된 구조체에서 IL-15 체인에 융합된 수용체의 스시 도메인으로 발현되었다. 쥐 4-1BBL 단백질은 여기 표 10에 제시된 구조체에서 발현되었다.
종양의 부피가 대략 50mm3에 도달했을 때, 동물은 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA ("IL-15TP")을 제시하는 쥐 적혈구 세포로 정맥 (IV)으로 투여하고, 항-PD1 단일클론 항체 (anti-PD1 monoclonal antibody) (αPD-1 mAb; 150μg)로 복강으로(IP) 투여하고, 또는 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA ("IL-15TP") 을 제시하는 쥐 적혈구 세포의 IV로 투여를 αPD-1의 IP 투여와 조합하여 투약하였다. 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA가 없는 쥐 적혈구 세포는 대조군 ("mRBC-CTRL") 으로 사용되었다. 동물에 투약을 위하여, 평균 1e9 적혈구 세포가 한 용량당 한 m4-1BB 세포 당 평균 30,000 분자, 및 한 IL-15TP 세포 당 평균 35,000 분자로 투약되었다.
동물의 무게 및 컨디션은 매일 기록되고, 및 종양은 2차원으로 각각 측정하여 일주일에 세 번 측정 되었다. 종양 부피는 표준 공식: (L x W2)/2 을 사용하여 계산되었다. 평균 종양 무게 및 평균의 표준 오차는 각 그룹에서 각 시간 포인트에서 계산된다.
동물의 몸무게는 매일 기록되었다. 각 생쥐의 몸무게의 변화는 첫째 날 (바람직한 종양 부피가 관찰된 날로부터 시작된 제시된 처치 날짜)에 기록된 몸무게에 대비하여 계산되었다. 종양을 소유하는 생쥐로부터 지라 및 종양을 모으고 및 두 조직으로부터의 세포 현탁액이 유동 세포분석에 의한 분석을 위하여 11일째 날에 만들어졌다. 증식하는 CD8 T 세포 (Ki67+) 및 기능적 CD8 T 세포 ((그랜자임 B + (Granzyme B +))의 총 수가 분석되었다.
4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA를 제시하는 제조된 쥐 적혈구 세포의 항-종양 활성을 대조군에 비교하여 종양 부피 및/또는 종양 무게의 시간에 걸친 변화를 평가하여 측정하였다. 도 17A에서 보여준 대로 (보여준 데이터는 13일째 것이며, 각 점은 하나의 생쥐에게서의 종양을 나타낸다), 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA를 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포를 I.V.로 단일치료로 투여하거나, 또는 항-PD1 항체와 조합하여 투여는 CR26 대장암 생쥐 모델에서 종양 부담을 감소시켰다. 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA를 제시하는 쥐 적혈구 세포와 항-PD1 항체와의 조합으로 처치는 제조된 적혈구 세포 또는 항-PD1 항체 단독으로만의 처치보다 안정적인 질환을 갖거나 또는 종양 퇴치된 생쥐의 수가 더 많은 결과를 보였다. 더 나아가, 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA에 의한 종양 성장 억제는 증식하는 및 세포독성 CD8 T 세포의 종양 침투의 1.7-배 증가를 동반했다 (도 17B).
실시 예시 20: IL-15/IL- 15RA 및 4- 1BBL를 포함하는 쥐 적혈구 세포의 생체 내 ( in vivo ) 에서의 독성의 결여 (Lack of toxicity of murine erythroid cells comprising IL-15/IL-15RA and 4-1BBL in vivo) .
간 독성의 생쥐 모델이 독성의 결여 또는 쥐 RBC-4-1-BBL 및 IL-15/IL-15RA의 참을성 (tolerability)을 평가하기 위하여 사용되었다 (예를 들어, Niu et al (2007) J. Immunology 178:4194-4213 참조, 여기에, 그 전문이 참고 문헌으로 병합됨). 간략하게, 6 에서 12주령 여성 C57BL/6 생쥐가 다음의 용량으로 투약 되었다: RBC-4-1-BBL 및 IL-15/IL-15RA를 제시하는 쥐 적혈구 세포, RBC-4-1-BBL 및 IL-15/IL-15RA가 없는 쥐 적혈구 세포, 항-PD1 항체 150 μg, 또는 RBC-4-1-BBL 및 IL-15/IL-15RA를 제시하는 쥐 적혈구 세포와 항-PD1 항체 150μg. 또는 3H3 항체 50μg 또는 200μg로, 또는 대조군으로 생리 식염수. 동물의 무게 및 컨디션은 매일 기록되었다. 투약은 1, 4, 8 및 11일에 수행되었고, 및 최종 희생은 18일째에 수행되었다. 간 (liver) 및 혈청 (serum)이 수집되고, 및 대식세포 및 CD8 침투의 분석은 간 소화 및 단일세포 현탁액으로의 만든 후에 수행되었다. 추가로 간 트란스아미네이즈 (liver transaminase) ALT의 혈청에서의 수준이 정량되었다.
도 18에서 보여준 대로, 쥐 RBC-4-1-BBL + IL/15/IL-15RA의 호의적인 참을성 (favorable tolerability)이 관찰되었다. RBC-4-1-BBL + IL/15/IL-15RA를 투여한 후에, 알라닌 트란스아미네이즈 (alanine transaminase) (ALT) 간 효소의 수준은 의미 있게 올라가지는 않았다. 반대로, 4-1BB 작동제 단일클론 항체, 3H3, 의 투여 후에는 상당한 수준의 이들 간 효소들이 증가 되었다. 대식세포, CD8+ T 세포, 및 특히 CD8+/Eomes+/KLGR1+ T 세포의 간 침투는 4-1BBL 유도된 간 독성에 결정적인 것을 생각되고 있다. 기대한 대로, 4-1BB 작동제 항체 3H3로 처치한 후에 이 모든 집단의 간 침투의 증가가 관찰되었다. 중요하게, 쥐 RBC-4-1BBL + IL-15/IL-15RA 투여 후에는 이들 집단 어느 것의 간 침투의 증가가 없었다. 이 결과는 생체 내에서 쥐 RBC-4-1BBL + IL-15/IL-15RA에서 관찰된 CD8 양성 T 세포의 강력한 자극은 다른 4-1BB 작동제 투여와 연관된 간 독성을 수반하지 않는다는 것을 제시한다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 4-1BB 작동제 항체는 혈관으로부터 골수로 확산 되고, 거기서 골수 세포를 활성화 및 확장시키고, 이는 이어서 간으로 가서 쿠퍼 (Kuper) 세포가 되고, 및 CD8 세포를 활성화하여 간 독성의 원인이 된다고 믿는 것과는 달리, RBC-41BBL+IL-15/IL-15RA는 혈관으로 분비된다고 믿는다. 여기서 제시된 데이터는 RBC-4-1BBL + IL-15/IL-15RA는 골수에서 유래 된 단핵 세포는 자극하지 않는다는 것을 제시하며, 활성화는, RBC-4-1BBL + IL-15/IL-15RA에의 노출이 제한적인, 골수에서 일어난다는 가설과 일치한다. 그러므로 여기서 제공된 4-1BBL을 제시하는 RBCs는 다른 4-1BB 작동제 (4-1BB agonists)에 비해 의미 있는 치료적인 장점을 제공한다.
예를 들어, 실시 예시 15에서, 생쥐에서 간 독성을 일으키는 용량과 같은 수준의 용량으로 4-1BB 작동제 단일클론 항체의 투여 후에 달성된 종양 부담 감소는, 쥐 RBC-4-1BBL + IL-15/IL-15RA로 달성된 종양 부담 감소와 의미 있게 다르지는 않았다. 비슷하게, 실시 예시 19에서, 생쥐에서 간 독성을 일으키는 용량과 같은 수준의 용량으로 4-1BB 작동제 단일클론 항체의 투여 후에 달성된 항-종양 활성은 쥐 RBC-4-1BBL + IL-15/IL-15RA로 달성된 종양 부담 감소와 의미 있게 다르지는 않았다. 쥐 RBC-4-1BBL + IL-15/IL-15RA는 생쥐에서 간 독성을 일으키지 않으므로, 이 관찰은 쥐 RBC-4-1BBL + IL-15/IL-15RA는 암환자에서 작동제 4-1BB 항체에 비해, 개선된 치료 지수 (therapeutic index), 또는 개선된 위험-유익한점 (risk-benefit) 을 가질 수 있다는 것을 지지한다.
상기 분석에 추가하여, 간 H&E 염색 부분 (liver H&E staining sections) 이 병리학자에 의해 평가되었으며 및 염증 수치가 지정되었다. 이 결과들은 증가 된 염증 수치로 볼 수 있는 것과 같이 3H3 군에서 간 병리가 상당히 증가함을 보였다 도 18 E). 중요하게, RBC-4-1BBL+ IL-15/IL-15RA 군은 mRBC-CTRL 또는 PBS 대조군에 비교하여 증가한 염증 및 독성의 징후는 보이지 않았다. 3H3 군에서, 병리 보고서는 주로 그 성질이 림프성인 것으로 보이는 현저한 혈관주위 침투물을 서술하였다.
종합하면, 제시된 데이터는 RBC-4-1BBL+ IL-15/IL-15RA는 잘 견디고 및 어떤 안전성 문제를 일으키지 않았다. 41BBL 및 IL-15TP를 사용함 에도 불구하고 독성이 결여되는 기전은 RBC-4-1BBL+ IL-15/IL-15RA는 순환계에만 한정하는 생체분포 (biodistribution) 때문 일 수 있으며, 및 그러므로 세포는, 간 독성 캐스케이드를 시작한다고 제시된 과정인, 골수에서 골수 세포와 접촉할 수 없어, 및 다른 4-1BB 작동제에 비해 의미 있는 치료적 장점을 제공한다.
실시 예시 21: IL-12를 발현하도록 유전적으로 제작된 적혈구의 생성 (Generation of erythroid cells genetically engineered to express IL-12).
IL-12 구조체 (IL-12 constructs)
적혈구에 발현을 위한 DNA 구조체는 하기 표 13에 보여준 대로 제조되었다:
표 13. IL-12 구조체 및 폴리펩티드. 서열번호는 아미노산 서열을 의미한다.
Figure pct00018
렌티바이러스 벡터 생산 (Production of Lentiviral Vector)
IL-12 유전자 구조체가 구성되었다 (표 13에 보여진 대로 V1 또는 V2). 유전자는 시스템 바이오사이언스 (System Biosciences)로부터 구한 MSCV 프로모터 서열을 가진 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector) pCDH의 다 클로닝 부위 (multiple cloning site)에 클론 되었다. 렌티바이러스는 293T 세포에서 pPACKH1 (System Biosciences) 및 IL-12 유전자를 함유하는 pCDH 렌티 바이러스 벡터로 형질감염시켜 생산되었다. 세포는 신선한 배양 배지에 넣었다. 바이러스 상등액은 배지 교환 후 48시간에 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 수집하였다. 상등액은 수집되고, 여과되고, 및 한 몫씩 (aliquotes) -80 o C에서 얼렸다.
적혈구 세포의 확장 및 분화 (Expansion and differentiation of erythroid cells)
정상 인간 공여자로부터 동원된 말초 혈액에서부터 유래한 인간 CD34+ 세포는 올셀 회사 (AllCells Inc.) 에서 냉동된 채로 구입하였다. 확장/분화 과정은 3단계를 포함한다. 첫 번째 단계에서, 해동된 CD34+ 적혈구 전구 세포는 재조합 인간 인슐린, 인간 트란스훼린 (human transferrin), 재조합 인간 재조합 인간 줄기세포 인자 (recombinant human stem cell factor), 및 재조합 인간 인터루킨 3을 포함하는 이스코브 MDM 배지 (Iscove's MDM medium) 에서 배양시켰다. 두 번째 단계에서는, 적혈구 세포는 재조합 인간 인슐린, 인간 트란스훼린 (human transferrin), 재조합 인간 줄기세포 인자 (recombinant human stem cell factor), 인간 재조합 에리스로포에틴 (human recombinant erythropoietin), 및 L-글루타민 (L-glutamine)으로 보충된 이스코브 MDM 배지 (Iscove's MDM medium) 에서 배양시켰다. 세 번째 단계에서는, 적혈구 세포는 인간 트란스훼린 (human transferrin), 재조합 인간 인슐린, 인간 재조합 에리스로포에틴 (human recombinant erythropoietin), 및 헤파린 (heparin)으로 보충된 이스코브 MDM 배지 (Iscove's MDM medium) 에서 배양시켰다. 배양은 37 oC 에서 5% CO2 배양기에서 유지시켰다.
적혈구 전구 세포의 형질도입 (Transduction of erythroid precursor cells) 적혈구 전구 세포는 상기 서술된 배양 공정 단계 1 동안에 형질도입 되었다. 배양하고 있는 배지에 있는 적혈구 세포는 렌티바이러스 상등액 및 폴리브렌 (polybrene)과 섞었다. 감염은 플레이트를 2000 rpm에서 90분 동안 실온에서 돌리면서, 스피이노큘레이션 (spinoculation)으로 달성하였다. 스피이노큘레이션 후에, 세포는 37°C 에서 하룻밤 동안 배양시켰다.
항체 결합 (Antibody Binding)
PE-라벨 된 항-IL-12 항체 ((예를 들어, 정제된 항-인간 IL-12-p70 (purified anti-human IL-12-p70) (clone 20C2))의 결합이 제작된 적혈구 세포에서 IL-12 발현을 평가하기 위하여 사용되었다. 항체의 결합은 PE 형광에 대한 유동세포 분석 (flow cytometry) 으로 측정되었다. 게이트 (gate)는 염색된 형질감염 안 된 세포에 근거하여 설정되었다.
실시 예시 22. IL-12 및 4- 1BBL을 발현하도록 유전적으로 제작된 적혈구의 생성 (Generation of erythroid cells genetically engineered to express IL-12 and 4- 1BBL ).
렌티바이러스 벡터 생산 (Production of Lentiviral Vector)
IL-12 (표 13에 보인 대로 V1 또는 V2) 및 4-1BB 유전자들이 구성되었다. 유전자들은 시스템 바이오사이언스 (System Biosciences)로부터 구한 MSCV 프로모터 서열을 가진 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector) pCDH의 다 클로닝 부위 (multiple cloning site)에 한 벡터는 IL-12 유전자를 포함하고 및 한 벡터는 4-1BBL 유전자를 포함하도록 클론 되었다. 렌티바이러스는 293T 세포에서 pPACKH1 (System Biosciences) 및 IL-12 유전자를 함유하는 pCDH 렌티 바이러스 벡터 및 4-1BBL 유전자를 함유하는 pCDH 렌티 바이러스 벡터로 동시-형질감염시켜 생산되었다. 세포는 신선한 배양 배지에 넣었다. 바이러스 상등액은 배지 교환 후 48시간에 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 수집하였다. 상등액은 수집되고, 여과되고, 및 한 몫씩 (aliquotes) -80 o C에서 얼렸다.
다른 한편으로, IL-12 및 4-1BBL 유전자는 시스템 바이오사이언스 (System Biosciences)의 MSCV 프로모터 서열을 가진 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector) pCDH의 다 클로닝 부위 (multiple cloning site)에 한 벡터가 유전자 IL-12 및 유전자 4-1BBL을 포함하도록 구성 및 클론 될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이 경우, 렌티바이러스는 293T 세포에서 pPACKH1 (System Biosciences) 및 IL-12 유전자 및 4-1BBL 유전자를 둘 다를 함유하는 pCDH 렌티 바이러스로 동시-형질감염시켜 생산된다. 세포는 신선한 배양 배지에 넣었다. 바이러스 상등액은 배지 교환 후 48시간에 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 수집한다. 상등액은 수집되고, 여과되고, 및 한 몫씩 (aliquotes) -80 o C에서 얼린다.
적혈구 세포의 확장 및 분화 (Expansion and differentiation of erythroid cells)
정상 인간 공여자로부터 동원된 인간 CD34+ 세포는 실시 예시 21에 서술된 대로 확장 및 분화시켰다.
적혈구 전구 세포의 형질도입 (Transduction of erythroid precursor cells) 적혈구 전구 세포는 상기 서술된 배양 공정 단계 1 동안에 형질도입 되었다. 배양하고 있는 배지에 있는 적혈구 세포는 렌티바이러스 상등액 및 폴리브렌 (polybrene)과 섞었다. 감염은 플레이트를 2000 rpm에서 90분 동안 실온에서 돌리면서, 스피이노큘레이션 (spinoculation)으로 달성하였다. 스피이노큘레이션 후에, 세포는 37°C 에서 하룻밤 동안 배양시켰다.
항체 결합 (Antibody Binding)
PE-라벨 된 항-IL-12 항체 ((예를 들어, 항-IL-12-p70 항체 (IL-12-p70) (clone 20C2))의 결합이 제작된 적혈구 세포에서 IL-12 발현을 평가하기 위하여 사용되었다. PE-라벨 된 항-4-1BBL 항체 ((예를 들어, 정제된 항-인간 4-1BB 리간드 (clone 20C2)) 항체, BioLegend))의 결합이 제작된 적혈구 세포에서 4-1BBL의 발현을 평가하기 위하여 사용되었다. 항체의 결합은 PE 형광에 대한 유동세포 분석 (flow cytometry) 으로 측정되었다. 게이트 (gate)는 염색된 형질감염 안 된 세포에 근거하여 설정되었다.
도 30A에서 보여준 대로, IL-12 V2 (SMIM1에 연결된 IL-12) 는 단독으로, 또는 4-1BBL와 조합하여 IL-12 V1 ( GPA에 연결된 IL-12 )에 비해 상대적으로 의미 있게 더 큰 IL-12를 세포 표면에 보여주는 것으로 관찰되었다. 세포 표면에 이 증가 된 IL-12의 수준은, SMIM1이 막 도메인으로 사용될 때, 적혈구 세포 표면에 기대하지 않은 4-1BBL의 카피 수를 증가시키는 장점을 제공하고, 및 그러므로 증가 된 활성도 기대된다 (도 30B).
실시 예시 23. IL-15/IL-15-RA 융합 단백질 및 IL-12를 발현하도록 유전적으로 제작된 적혈구의 생성 (Generation of erythroid cells genetically engineered to express an IL-15/IL-15-RA fusion protein and IL-12).
렌티바이러스 벡터 생산 (Production of Lentiviral Vector)
IL-15/IL-15-RA (V4.1) 융합 단백질 및 IL-12 유전자들이 구성 (construct) 되었다. 유전자들은 시스템 바이오사이언스 (System Biosciences)로부터 구한 MSCV 프로모터 서열을 가진 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector) pCDH의 다 클로닝 부위 (multiple cloning site)에 한 벡터는 IL-15/IL-15RA 유전자를 포함하고 및 한 벡터는 IL-12 유전자를 포함하도록 클론 되었다. 렌티바이러스는 293T 세포에서 pPACKH1 (System Biosciences) 및 IL-15/IL-15RA 유전자를 함유하는 pCDH 렌티 바이러스 벡터 및 IL-12 유전자를 함유하는 pCDH 렌티 바이러스 벡터로 동시-형질감염시켜 생산되었다. 세포는 신선한 배양 배지에 넣었다. 바이러스 상등액은 배지 교환 후 48시간에 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 수집하였다. 상등액은 수집되고, 여과되고, 및 한 몫씩 (aliquotes) -80 o C에서 얼렸다.
다른 한편으로, IL-15/IL-15-RA 융합 단백질 및 IL-12 유전자는 시스템 바이오사이언스 (System Biosciences)의 MSCV 프로모터 서열을 가진 렌티바이러스 벡터 (lentivirus vector) pCDH의 다 클로닝 부위 (multiple cloning site)에 한 벡터가 IL-15/IL-15RA 유전자 및 IL-12 유전자를 포함하도록 구성 및 클론 될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이 경우, 렌티바이러스는 293T 세포에서 pPACKH1 (System Biosciences) 및 IL-15/IL-15RA 유전자와 IL-12 유전자 둘 다를 함유하는 pCDH 렌티 바이러스로 동시-형질감염시켜 생산된다. 세포는 신선한 배양 배지에 넣었다. 바이러스 상등액은 배지 교환 후 48시간에 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리시켜 수집한다. 상등액은 수집되고, 여과되고, 및 한 몫씩 (aliquotes) -80 o C에서 얼린다.
적혈구 세포의 확장 및 분화 (Expansion and differentiation of erythroid cells)
정상 인간 공여자로부터 동원된 인간 CD34+ 세포는 실시 예시 21에 서술된 대로 확장 및 분화시켰다.
적혈구 전구 세포의 형질도입 (Transduction of erythroid precursor cells)
적혈구 전구 세포는 상기 서술된 배양 공정 단계 1 동안에 형질도입 되었다. 배양하고 있는 배지에 있는 적혈구 세포는 렌티바이러스 상등액 및 폴리브렌 (polybrene)과 섞었다. 감염은 플레이트를 2000 rpm에서 90분 동안 실온에서 돌리면서, 스피이노큘레이션 (spinoculation)으로 달성하였다. 스피이노큘레이션 후에, 세포는 37°C 에서 하룻밤 동안 배양시켰다.
항체 결합 (Antibody Binding)
PE-라벨 된 항-IL-15-RA 항체 ((예를 들어, 항-IL-15RA 항체 (JM7A4) (ab91270)의 결합이 제작된 적혈구 세포에서 IL-15/IL-15-RA 발현을 평가하기 위하여 사용되었다. PE-라벨 된 항-IL-12 항체 ((예를 들어, 정제된 항-인간 IL-12 항체 (IL-12-p70 (clone 20C2)), BioLegend))의 결합이 제작된 적혈구 세포에서 4-1BBL의 발현을 평가하기 위하여 사용되었다. 항체의 결합은 PE 형광에 대한 유동세포 분석 (flow cytometry) 으로 측정되었다. 게이트 (gate)는 염색된 형질감염 안 된 세포에 근거하여 설정되었다.
실시 예시 24. IL-12 및 IL-15/IL- 15RA의 조합을 포함하는 제작된 적혈구 세포는 IFNγ 반응 및 CD4 , CD8, NK 및 NKT 세포의 증식의 상승적 유도를 일으킨다 (Engineered erythroid cells comprising a combination of IL-12 and IL-15/IL-15RA causes synergistic induction of IFNγ response and proliferation of CD4, CD8, NK and NKT cells).
IL-12, IL-15/IL-15RA (V4.1), 및 IL-12 + IL-15/IL-15RA (V4.1) 를 포함하는 적혈구 세포는 실시 예시들 21, 1 및 23에서 각각 서술한 대로 제조되었다.
일차 CD4+, CD8+, NK 및 NKT 세포의 증식 및 활성화가 측정되었다. 3 공여자로부터의 100,000 PBMCs가 CTFR로 라벨 되고 및 L-12 ("RBC-IL-12"), IL-15/IL-15RA ("RBC-IL-15/IL-15RA") 및 IL-12 + IL-15/IL-15RA ("RBC-IL-12 + IL-15/IL-15RA"), 대조군 RBC("RBC-CTRL"), 및 배지 대조군 ("배지 CTRL")을 포함하는 제작된 적혈구 세포와 배양시켰다. RBC는 400,000, 200,000 또는 100,000 세포로 존재한다. 8일째 날에, 활성적으로 분열하는 CD8, CD4, NK 및 NKT 세포의 퍼센트가 CT 희석을 사용하여 평가되었다. 상등액은 수집되고 및 IFNγ의 양이 ELISA를 사용하여 평가되었다. 도 19A-E에서 보여준 대로, 활성화된 세포에서 방출되는 IFNγ 사이토카인의 생산으로 측정한 대로, RBC-IL-12 + IL-15/IL-15RA는 일차 CD4+, CD8+, NK 및 NKT 세포를 자극하여 강하게 증식함은 물론이고 활성화되게 한다. RBC-IL-12 및 RBC-IL-15/IL-15RA는 이들 세포에서 어느 정도의 측정할 만한 증식 및 활성화를 자극한다. 그러나 RBC-IL-12 + IL-15/IL-15RA는 상당히 더 크게, 및 어느 경우에는 상승적으로 CD8+, CD4+, NK 및 NKT 세포의 증식을 자극함은 물론이고 IFNγ의 생산을 현저하게 증가시킴을 보여준다. 종합해 보면, 이 실시 예시에서 보여준 결과는 RBC 표면에서의 RBC-IL-12 + IL-15/IL-15RA의 발현은 일차 CD4+, CD8+, NK 및 NKT 세포의 아주 상승적이고 및 강력한 활성화를 유도함을 보여준다.
실시 예시 25. IL-12, IL-15/IL- 15RA , 4- 1BBL 및 이의 조합을 포함하는 적혈구 세포는 생체 내에서 폐 전이를 감소시킨다 ( Erythroid cells comprising IL-12, IL-15/IL- 15RA , 4- 1BBL and combinations thereof reduce lung metastases in vivo)
흑색종 (melanoma) 을 위한 B16F10 전이 생쥐 모델 시스템이 ((예를 들어, Kubo et al. 2017) 참조)) 세포 표면에 쥐 IL-12, 인간 IL-15/IL-15RA 융합 단백질 및 쥐 4-1BBL을 단독으로, 또는 이의 조합으로 제시하는 쥐 적혈구 세포의 전이성 성장 (metastatic growth)에 대한 효과를 검사하기 위하여 사용되었다. 이 모델에서, 종양 세포는 폐에 전이를 확립하기 위하여 정맥으로 주사되고 및 그 후 생쥐는 IL-12, IL-15/IL-15RA, 또는 4-1BBL 단독으로 제시하도록, 또는 다음의 조합으로 제시하도록 제조된 적혈구 세포로 처치되었다: IL-12 및 IL-15/IL-15RA (IL-12/IL-15 RBC), IL-12 및 4-1BBL (IL-12/4-1BBL RBC), 및 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL (IL-15/4-1BBL RBC).
쥐 적혈구 세포는 클릭 방법을 사용하여 IL-12, IL-15/IL-15RA 융합 단백질 및 4-1BBL을 접합시키거나, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA, IL-12 및 4-1BBL, 및 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL로 둘 다로 동시-접합시켰다. 이 세포들은 Cy5 형광에 대해 유동 세포 분석을 사용하여 정량화되었다 (FIG. 20A). IL-15/IL-15RA 융합 단백질, 쥐 4-1BBL 단백질, 및 쥐 IL-12 단백질의 아미노산 서열이 여기 표 10에 제공된다.
초기에, 7주령 여성 C57BL/6 생쥐는 정맥으로 생쥐 한 마리당 1x 105 B16F10 세포/생쥐로 접종되었다. 다양한 실험에서, 동물은 그 후 정맥으로 (IV) 다음으로 투여되었다: IL-12 제시하는 적혈구 세포로; IL-15/IL-15RA 제시하는 적혈구 세포로; 4-1BBL 제시하는 적혈구 세포로; IL-12 및 IL-15/IL-15RA 둘 다 제시하는 적혈구 세포로; IL-12 및 4-1BBL 제시하는 적혈구 세포로; 및 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL 제시하는 적혈구 세포로; 복강으로 (IP)투여되는 재조합 IL-12 (rIL-12); 복강으로 (IP)투여되는 재조합 IL-15/IL-15RA 융합 단백질; 복강으로 (IP) 투여되는 생쥐 4-1BB 작동제 항체 (3H3); 또는 대조군으로서 IL-12, IL-15/IL-15RA 또는 4-1BBL (mRBC-CTRL)가없는 적혈구 세포. 동물에 투약하기 위하여 일 회 용량당 평균 1e9 적혈구 세포 (1e9 erythroid cells)가 투여되었으며, 용량당 0.14 mg/kg IL-12에 해당하는, IL-12 단독으로 세포당 평균 30.000 분자, 용량당 0.22 mg/kg 4-1BBL에 해당하는, 4-1BBL 단독으로 세포당 평균 120.000 분자, 및 용량당 0.1 mg/kg IL-15/IL-15RA 에 해당하는, IL-15/IL-15RA 단독으로 세포당 평균 60.000 분자; 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 적혈구 세포를 위하여 각각 0.1 mg/kg 및 0.03 mg/kg에 해당하는 20,000 분자의 IL-12 및 20,000 분자의 IL-15-RA; IL-12 및 4-1BBL을 포함하는 적혈구 세포를 위하여 둘 다 0.1 mg/kg 에 해당하는 20,000 분자의 IL-12 및 40,000 분자의 4-1BBL; 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 적혈구 세포를 위하여, 각각 0.11 mg/kg 및 0.07 mg/kg 에 해당하는 60,000 분자의 4-1BBL 및 40,000 분자의 L-15/IL-15RA으로 투여되었다. 작동제 41BB 항체 (3H3)는 2.55mg/kg 용량으로 투여되었다. 동물은 접종 후 1, 4 및 8일에 적혈구 세포 또는 3H3로 투여되었다.
동물의 무게 및 컨디션은 매일 기록되었다. 각 생쥐에 대하여 몸무게의 변화는 첫째 날에 기록된 몸무게와 상대적으로 계산되었다. 접종 후 14일에 동물은 희생시키고 및 폐가 수집되었다. 전이의 수 (number of metastases) 는 현미경을 사용하여 평가되었다. 추가로, 폐 조직은 단일 세포 현탁액으로 가공되고 및 Ki67 및 그랜자임 B (Granzyme B)로 염색하였으며 및 유동세포 분석으로 조사하였다.
도 20B에서 보여준 대로, 이들의 세포 표면에 IL-12 및 IL-15/IL-15 RA, 또는 IL-12 및 4-1BBL, 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL의 조합을 제시하도록 제조한 쥐 적혈구 세포를 I.V.로 단독치료로서의 투여는, mRBC CTR에 비교하여, 생쥐에서 종양 부담을 의미 있게 감소시켰으며, 및 분자들을 개별적으로 제시하는 적혈구 세포, 즉 mRBC IL-12, mRBC IL-15/IL-15RA 및 mRBC 4-1BBL에 비교하여 더 큰 효능을 보였다. 이 데이터는 세포 표면에 이들 단백질의 조합을 포함하는 적혈구 세포의 투여로 치료적 유익 점을 달성할 수 있음을 보여준다. IL-12 및 4-1BBL의 조합으로 달성된 종양부담 감소는 IL-12 또는 4-1BBL 단독으로 달성할 수 있는 것보다 의미 있게 훨씬 더 좋으며, 및 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA의 조합으로 달성할 수 있는 종양부담 감소는 4-1BBL 또는 IL-15/IL-15RA 단독으로 달성할 수 있는 것보다 의미 있게 훨씬 더 좋다
더 나아가, 도 20C에서 보여준 대로, 폐 전이 수의 감소는, 증식하는 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 폐로의 증가된 침투와 연관이 있다 (p=0.0002).
실시예시 26. IL-12를 포함하는 적혈구 세포는 셍체 내에서 종양 성장을 늦춘다 (Erythroid cells comprising IL-12 slow tumor growth in vivo)
세포 표면에 쥐 IL-12를 제시하는 쥐 적혈구 세포의 종양 성장 (예를 들어, 고형 종양 성장) 에 대한 효과를 검증하기 위하여 대장 종양 (colon carcinoma)에 대해 MC38 동계 생쥐 모델 시스템 (syngeneic mouse model system) 은 물론 흑색종에 대한 B16F10 생쥐 모델이 사용되었다. 쥐 적혈구 세포는 인간 IL-15/IL-15RA 및 쥐 4-1BBL나, 쥐 IL-12 및 쥐 4-1BBL나. 또는 쥐 IL-12 및 인간 IL-15/IL-15RA와 클릭 방법을 사용하여 동시 접합시켰다. IL-15/IL-15RA 융합 단백질, 쥐 4-1BBL 단백질, 및 쥐 Il-12 단백질 아미노산 서열은 여기 표 10에 제공된다.
종양이 대략 100mm3의 부피에 도달했을 때 (대략 7-10일), 동물은 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL (mRBC IL-15/IL-15RA + 4-1BBL), IL-12 및 4-1BBL (mRBC IL-12 + 4-1BBL), IL-12 및 IL-15/IL-15RA (mRBC IL-12 + IL-15/IL-15RA)를 제시하는 적혈구 세포로; 이 단백질들 없는 적혈구 세포 (mRBC CTRL); 또는 대조군으로서, 4-1BB 작동제 단일 클론 항체, 3H3로 투여되었다. 용법 투여는 1, 4 및 8일에 수행되었다 (제시된 치료 날은 바람직한 종양 부피가 관찰된 날로부터 시작). 동물에 투여를 위해, 평균 1e9 RBCs가 용량당 투여되었으며, 세포당 평균 분자의 수는 다음과 같이 투여된다; IL-12 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 적혈구 세포는, 각 0.1 mg/kg 및 0.03 mg/kg에 해당하는, 20,000 분자의 IL-12 및 20,000 분자의 IL-15-RA로; IL-12 및 4-1BBL를 포함하는 적혈구 세포는, 0.14 mg/kg 및 0.15 mg/kg에 각각 해당하는, 30,000 분자의 IL-12 및 80,000 분자의 4-1BBL로; 및 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 적혈구 세포는, 0.15 mg/kg 4-BBL 및 0.09 mg/kg에 각각 해당하는 80,000분자의 4-1BBL 및 50,000 분자의 IL-15/IL-15RA로, 용량당 한 생쥐 당 투여된다.
동물의 무게 및 컨디션은 매일 기록되었다. 각 생쥐의 몸무게의 변화는 첫째 날에 기록된 몸무게에 대비하여 계산되었다. 종양은 2차원으로 각각 측정하여 일주일에 세 번 측정 되었다. 종양 부피는 표준 공식: (L x W2)/2 을 사용하여 계산되었다. 평균 종양 무게 및 평균의 표준 오차는 각 그룹에서 각 시간 포인트에서 계산된다.
IL-12를 포함하는 제조된 적혈구 세포의 항-종양 활성은 (즉, IL-12 및 4-1BBL, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA의 조합을 제시하는 적혈구 세포), 처치되지 않은 대조군과 비교하여, 시간이 지남에 따른 종양 부피 및/또는 종양 무게 변화의 평가로 결정된다. 결과는, 도 21A 및 21B에서 보여준 대로, IL-12를 포함하는 제조된 적혈구 세포는 시간이 지남에 따라 처치되지 않은 대조군과 비교하여 종양 진전이 현저히 감소하였음을 보여준다. 더욱이, IL-12 및 4-1BBL를 포함하는 제조된 적혈구 세포는 MC38 생쥐 모델 시스템에서, 3H3에 비하여 종양 부피의 진전을 의미 있게 감소시켰다.
실시 예시 27. IL-12를 포함하는 쥐 적혈구 세포의 생체 내에서 독성 결여 (Lack of toxicity of murine erythroid cells comprising IL-12 in vivo ) .
흑색종에 대한 B16F10 전이 생쥐 모델 시스템이 (metastatic mouse model system) (Kubo et al., 2017; 그 전문이 여기서 참고 문헌으로 병합되었다) 쥐 RBC-IL-12 + IL-15/IL-15RA, 및 RBC-IL-12 + 4-1BBL의 독성 결여 또는 참을성을 평가하기 위하여 사용되었다. 이 실험에서 간 독성을 평가하기 위하여, 다양한 RBCs, 생쥐 모델 및 RBC 용량 스케줄은 실시 예시 25에 서술된 대로이다.
실시 예시 25에서 서술된 대로, 폐 전이 (metastases in lung)를 확립하기 위하여 6에서 12주령 여성 C57BL/6 생쥐에 정맥으로 B16F10 흑색종 세포 (melanoma cells)가 접종 되었으며, 및 그 후 생쥐는 다음 용법으로 투약 되었다; IL-12 및 IL-15/IL-15RA (mRBC IL12 + L-15/IL-15RA)를 제시하는 쥐 적혈구 세포 ((1E9 세포), IL-12 및 4-1BBL (mRBC IL-12 + 4-1BBL)를 제시하는 쥐 적혈구 세포 (1E9 세포), murine erythroid cells without IL-12, IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL 없는 쥐 적혈구 세포 (mRBC CTRL) (1E9 세포), 또는 대조군으로서 3μg의 rIL-12.
동물의 무게 및 컨디션은 매일 기록되었다. 투약은 1, 4 및 8일에 수행되었으며, 및 최종 희생은 10일째 날에 수행되었다. 간, 지라 및 혈청이 수집되었으며, 및 알라닌 트란스아미네이즈 (alanine transaminase) (ALT) 간 효소 및 인터페론 감마 (IFNg) 의 혈청에서의 수준이 정량되었다.
도 22에서 보여준 대로, IL-12 및 IL-15/IL-15RA, 또는 IL-12 및 4-1BBL로 동시 접합 된 쥐 적혈구 세포에서, 재조합 IL12에 비교하여 호의적인 참을성 (favorable tolerability)이 관찰되었다. 지라 및 간 무게 및 ALT 및 IFNg의 수준은 제조된 쥐 적혈구 세포를 투여한 후 의미 있게 상승 되지 않았다. 반대로, 지라 및 간 무게 및 ALT 및 IFNg의 수준, rIL12 투여 후 의미 있게 상승 되었다. 실시 예시 25 및 26의 결과와 함께 요약하면, 데이터는 IL-12를 포함하는 쥐 적혈구 세포는 rIL-12를 투여했을 때 관찰된 독성이 없이, 고형 종양의 성장 및 전이를 감소하는데 효율적임을 제시한다.
이론에 얽매이지 않기를 바라면서, IL-12 및 IL-15/IL-15RA 둘 다, 또는 IL-12 및 4-1BBL 둘 다를 포함하는 적혈구 세포의 독성의 결여는 혈관에 있는 세포의 격리 (sequestration), 즉 혈액 순환에 한정되기, 때문인 것으로 가정한다. 이 한정은 간 독성 캐스케이드가 시작한다고 제시된 과정인 세포가 골수에 있는 골수 세포와 접촉하는 것을 하지 못하게 할 수 있게 한다. 여기서 제시된 데이터는 IL-12를 제시하는 적혈구 세포는 골수-유래한 단핵세포를 자극하지 않고 및 그러므로 이 세포는 rIL-12보다 상당히 치료적 장점을 제공한다고 제시한다.
실시 예시 28. IL-12 또는 IL-12/IL-15를 포함하는 적혈구 세포는 단독으로 또는 항-PD1 항체와 조합으로 생체에서 종양 성장을 억제한다 ( Erythroid cells comprising IL-12 or IL-12/IL-15, either alone or in combination with anti-PD1 antibody, inhibit tumor growth in vivo )
흑색종 B16F10 종양 모델 시스템이 쥐 IL-12 단독으로, 또는 인간 IL-15/IL-15RA와 조합으로 포함하는 쥐 적혈구 세포의, 종양 성장에 대한 효과를 검증하기 위하여 사용되었다. 이 모델에서, B16F10는 생쥐에 피하로 주사하여 약 7일에 감지할만한 종양이 형성되었으며, IL-12, IL-15/IL-15RA, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA 융합 (IL-12/IL-15/IL-15RA)을 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포로, 항-PD1 항체와 조합하여 또는 없이 처치되었다. 피하주사 후에, B16F10 세포는 감지할만한 종양을 5일에서 10일 내에 형성되었으며 및 14일에서 21일에 1x 1x 1cm 종양으로 자랐다.
쥐 적혈구 세포는, 클릭 방법을 사용하여, 인간 IL-15/IL-15RA 단독, 쥐 IL-12 단독으로 접합, 또는 인간 IL-15/IL-15RA 및 쥐 IL-12 둘 다로 동시-접합시켰다. 세포에 접합 된 IL-15/IL-15RA 및 IL-12의 양은 유동 세포 분석을 사용하여 정량하였다. IL-15/IL-15RA 융합 단백질, 쥐 4-1BBL 단백질, 및 쥐 IL-12 단백질 아미노산 서열은 여기 표 10에 제공된다.
종양이 대략 100mm3의 부피에 도달했을 때 (대략 7-10일), 동물은 IL-12 단독 (mRBC IL-12), IL-15/IL-15RA 융합 단독 (mRBC IL-15), 및 IL-12 및 IL-15/IL-15RA 둘 다 (mRBC IL-12 + IL-15/IL-15RA)를 제시하는 적혈구 세포와, 항-PD1 단일클론 항체 (αPD-1 mAb)와 함께 또는 없이; 또는 단백질들 없는 적혈구 세포 (mRBC CTRL)와 4 μg 의 재조합 IL-12, 5 μg 재조합 IL-15/IL-15RA 융합, 및 재조합 IL-12 및 재조합 IL-15/IL-15 RA 융합 둘 다로, 대조군으로서 투여되었다. 용법 투여는 1, 4 및 8일에 수행되었다 (제시된 치료 날은 바람직한 종양 부피가 관찰된 날로부터 시작). 동물에 투여를 위해, 평균 3e8 또는 1e9 적혈구 세포가 용량당 투여되었으며, 세포당 포함되는 평균 분자의 수는 다음과 같이 투여된다; IL-12 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 적혈구 세포는, 각각 0.3 mg/kg 및 0.15 mg/kg에 해당하는, 70,000 분자 IL-12 및 80,000 분자 IL-15/IL-15-RA; IL-12를 포함하는 적혈구 세포는 0.17 mg/kg에 해당하는, 35,000 분자 IL-12; 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 적혈구 세포는, 0.07 mg/kg에 해당하는 40,000분자의 IL-15/IL-15RA로, 용량당 한 생쥐 당 투여된다.
동물의 무게 및 컨디션은 매일 기록되었다. 각 생쥐의 몸무게의 변화는 첫째 날에 기록된 몸무게에 대비하여 계산되었다. 종양은 2차원으로 각각 측정하여 일주일에 세 번 측정 되었다. 종양 부피는 표준 공식: (L x W2)/2 을 사용하여 계산되었다. 평균 종양 무게 및 평균의 표준 오차는 각 그룹에서 각 시간 포인트에서 계산된다. 종양은 11-12일째 날에 수집되었으며 및 조직은 효소적으로 소화시켜 조직 해체기를 (tissue dissociator) 사용하여 균질한 현탁액을 얻었다. 세포는 그 후 염색하고 및 면역 프로화일링을 위하여 다양한 범위의 항체를 사용하여 유동세포 분석기로 분석되었다. M1 세포는 (활성화된 대식세포) CD45+, CD8-, CD11b+, Ly6C low/- 및 MHC 유형 II + (MHC class II +) 인 생존 세포 집단으로 정의한다. M2 세포는 Ly6C+, MHC 유형 II 음성 (negative)(MHC class II negative)인 생존 세포 집단으로 정의한다. M1 세포는 항-종양 세포이고 및 M2 세포는 (면역억제적, immunosuppressive) 친-종양 (pro-tumor) 세포이다. 생쥐 생존은 또한 처치 후 30일까지 모니터 되었다.
IL-12를 포함하는 제조된 적혈구 세포의 항-종양 활성은 (즉, IL-12 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA의 조합을 제시하는 적혈구 세포), 처치되지 않은 대조군과 비교하여, 시간이 지남에 따른 종양 부피 및/또는 종양 무게 변화의 평가로 결정되었다. 결과는, 도 23A-C에서 보여준 대로, IL-12를 포함하는 제조된 적혈구 세포는 시간이 지남에 따라 처치되지 않은 대조군과 비교하여 종양 진전이 현저히 감소하였음을 보여준다. IL-12 단독, 또는 IL-12 와 IL-15를 포함하는 제조된 적혈구 세포는 종양 부피의 진전을 의미 있게 감소하며, 이는 더 나아가, a-PD1와 함께는 더 개선된다. 1e9 세포로의 처치는 3e8 세포로의 처치보다 종양 억제에 더 효과적인 것으로 관찰되었다. 더 나아가, 도 23D-E, 는 IL-12 단독, 또는 IL-12 와 IL-15 함께 포함하는 제조된 적혈구 세포는, a-PD1와 조합하여, 대조군에 비교하여, 생쥐의 생존을 치료 후 30일까지 개선 시켰다. a-PD1 처치가 없을 때는 대조군 mRBC를 받은 생쥐에 비교하여 개선된 생존이 관찰되었다. 흥미롭게도, IL-12 와 IL-15를 포함하는 적혈구 세포로의 처치는, 3e8 세포 용량에서 생쥐의 생존을 의미 있게 개선 시켰다. rIL-12, 및 r-IL-12 + rIL-15로 처치한 군에서 관찰된 현저한 몸무게의 손실과는 반대로, mRBCs로 처치한 어느 군에서도 몸무게의 변화는 관찰되지 않았다 (데이터 보이지 않음).
더 나아가, 도 23F는 IL-12/IL-15 + a-PD1로 처치한 군의 종양에서는 증가 된 CD8 T 세포 침투, 및 IL-15/IL-15RA mRBC 군에서는 증가 된 NK 세포의 침투를 보여준다. IL-12 함유하는 군은 또한 대식세포를 M1 표현형, 즉 고전적으로 활성화된 항-종양 표현형, 쪽으로 향하도록 함이 관찰되었다, 반면에 rIL-12, IL-12 함유하는 군은 높은 수준의 면역 억제적인 IL-10을 유도하지 않았다 (데이터 보이지 않음).
실시 예시 29. IL- 12 ,또는 IL-12/4- 1BBL , 또는 IL-12/IL-15/IL- 15RA 를 포함하는 적혈구 세포 단독으로 또는 항-PD1 항체와 조합하여, 생체에서 종양 성장을 억제한다 ( Erythroid cells comprising IL-12, or IL-12/4- 1BBL , or IL-12/IL-15/IL-15RA alone or in combination with an anti-PD1 antibody, inhibit tumor growth in vivo).
대장 종양에 대한 MC38 동종형 생쥐 모델 시스템 (syngeneic mouse model system)이 IL-12, 또는 IL-12/4-1BBL를 제시하도록 제조된 쥐 적혈구 세포 단독으로, 또는 항-PD1 항체와 조합으로, 종양 성장에 대한 효과를 검증하기 위하여 사용 되었다.
쥐 적혈구 세포는 클릭 방법을 사용하여, 쥐 4-1BBL, IL-12로 접합, 또는 co-conjugated with both 4-1BBL 및 IL-12 둘 다로 동시 접합 되었다. 세포에 접합 된 4-1BBL 및 IL-12의 양은 유동 세포 분석을 사용하여 정량하였다. IL-15/IL-15RA 융합 단백질, 쥐 4-1BBL 단백질, 및 쥐 IL-12 단백질 아미노산 서열은 여기 표 10에 제공된다.
종양이 대략 100mm3의 부피에 도달했을 때 (대략 7-10일), 동물은 IL-12 단독 (mRBC IL-12), 4-1BBL 단독 (mRBC 4-1BBL), IL-15/IL-15RA 융합 단독 (mRBC IL-15), 및 IL-12 및 4-1BBL (mRBC IL-12 + 4-1BBL) 둘 다를 제시하는 적혈구 세포와, 항-PD1 단일클론 항체 (αPD-1 mAb)와 함께 또는 없이; 또는 단백질들 없는 적혈구 세포 (mRBC CTRL)와, 또는 4 μg 의 재조합 IL-12, 50 μg 작동제 41BB 항체 (clone 3H3), 또는 재조합 IL-12 및 41BB 작동제 항체 (3H3) 둘 다, 대조군을 투여되었다. 용법 투여는 1, 4 및 8일에 수행되었다 (제시된 치료 날은 바람직한 종양 부피가 관찰된 날로부터 시작). 동물에 투여를 위해, 평균 3e8 또는 1e9 적혈구 세포가 용량당 투여되었으며, 세포당 포함되는 평균 분자의 수는 다음과 같이 투여된다; IL-12 and 4-1BBL를 포함하는 적혈구 세포는, 각각 0.5 mg/kg and 0.3 mg/kg 에 해당하는, 100,000 분자 IL-12 및 180,000 분자 4-1BBL; IL-12를 포함하는 적혈구 세포는, 0.3 mg/kg에 해당하는, 70,000 분자 IL-12; 및 4-1BBL를 포함하는 혈구 세포는, 0.13 mg/kg에 해당하는, 70,000분자의 4-1BBL로, 용량당 한 생쥐 당 투여된다.
동물의 무게 및 컨디션은 매일 기록되었다. 각 생쥐의 몸무게의 변화는 첫째 날에 기록된 몸무게에 대비하여 계산되었다. 종양은 2차원으로 각각 측정하여 일주일에 세 번 측정 되었다. 종양 부피는 표준 공식: (L x W2)/2 을 사용하여 계산되었다. 평균 종양 무게 및 평균의 표준 오차는 각 그룹에서 각 시간 포인트에서 계산된다. 종양은 11-12일째 날에 수집되었으며 및 조직은 효소적으로 소화시켜 조직 해체기를 (tissue dissociator) 사용하여 균질한 현탁액을 얻었다. 세포는 그 후 염색하고 및 면역 프로화일링을 위하여 다양한 범위의 항체를 사용하여 유동세포 분석기로 분석되었다. M1 및 M2 세포는 상기 실시 예시 28에 서술된 대로 정의된다. 종양 퇴행은 첫 시점에서의 종양 크기에 대비하여 종양크기의 퍼센트 변화를 계산하여 결정되었다.
IL-12를 포함하는 제조된 적혈구 세포의 항-종양 활성은 (즉, IL-12 단독, 또는 IL-12 및 4-1BBL 조합을 제시하는 적혈구 세포), 처치되지 않은 대조군과 비교하여, 시간이 지남에 따른 종양 부피 및/또는 종양 무게 변화의 평가로 결정되었다. 결과는, 도 24A-D에서 보여준 대로, IL-12를 포함하는 적혈구 세포는 시간이 지남에 따라 처치되지 않은 대조군과 비교하여 종양 진전이 현저히 감소하였음을 보여준다. 더욱이, IL-12 및 4-1BBL를 포함하는 제조된 적혈구 세포는 종양 부피의 진전을 의미 있게 감소시켰다. 도 24D는, 더 나아가, IL-12 단독, 또는 IL-12 및 4-1BBL 둘 다를 포함하는 적혈구 세포로 처치한 생쥐는, 처치하지 않은 대조군에 비해, 종양의 위축 (shrinkage) 을 보였다. 종양 크기의 감소는 생쥐가 또한 αPD1-1 mAb로 처치되었을 때 더 악화 되었다. 전체적으로, IL-12 및 4-1BBL를 포함하는 제조된 적혈구 세포는 대장암 생쥐 모델에서 종양을 효과적으로 억제 시켰으며, 이는 αPD1-1 mAb와 조합으로 투여되었을 때, 더 악화 되었다.
더 나아가, 도 25A의 결과는 다른 면역 세포가 종양으로 침투함을 보여준다. CD4+ T 세포의 침투는 mRBC 및 αPD1-1 mAb로, 또는 IL12 및 4-1BBL a-PD1로 처치된 생쥐에서 관찰되었다. CD8+ 세포의 침투는 모든 IL-12 군 (즉, IL-12, 또는 IL-12/4-1BBL, 또는 IL-12/IL-15/IL-15RA)으로 처치된 생쥐에서 관찰되었으며, mRBC IL-12 + 4-1BBL 및 αPD1-1 mAb에서는 증가한 침투가 관찰되었다. 고전적으로 활성화된 대식세포로의 극성은 (Polarization)(M1 표현형)은 mRBC IL-12 + 4-1BBL로 처치된 생쥐에서 및 mRBC-IL-12로 처치된 생쥐에서 관찰되었다. 주목할 만하게, αPD1-1 mAb의 투여는 이 M1 극성을 약화시킨다. 도 25B는 더 나아가 IL-12로 처치된 모든 생쥐 군에서 CD4+ T 세포에 비해 CD8+ T 세포 쪽으로 변경되고 및 주효 CD8+ T 세포에 비해 조절 T 세포 (regulatory T) 의 손실을 보여준다. mRBC로 처치된 생쥐의 생존은, 처치 후 20일까지 종양 억제의 효력과 직접적으로 상관됨이 관찰되었다 (데이터 보이지 않음).
이 실시 예시에서 상기에 서술된 방법을 사용하여, IL-12 단독, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA 둘 다를 포함하는 적혈구 세포, 단독 또는 항-PD1 항체와 조합하여, 생체 내에서 종양의 성장에 대한 효과를 측정하기 위하여 추가의 실험이 수행되었다. 결과는 IL-12를 포함하는 적혈구 세포의 투여는 접합 단백질이 없는 대조군 적혈구 세포의 (즉, mRBC CTRL) 투여에 비교하여, 현저하게 종양 진전을 감소시킨다는 것을 보여주었다. 더 나아가, IL-12 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 제조된 적혈구 세포는, 종양 부피 진전을 상당히 감소시킨다. 결과는 더 나아가, IL-12 단독, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA 둘 다를 포함하는 제조된 적혈구 세포는, 처치되지 않은 대조군에 비교하여, 종양 축소를 보인다는 것을 보여 주었으며, 이는 생쥐가 항-PD1 항체로 처치되었을 때 더 증가 되었다. 전체적으로, IL-12 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 제조된 적혈구 세포는 효과적인 종양 억제를 보이며, 이는 α PD1-1 mAb와 조합하여 투여 되었을 때 더 나아가 개선된다.
실시 예시 30. IL-12 + IL-15/IL- 15RA,또는 IL-12 + 4- 1BBL를 포함하는 쥐 적혈구 세포의 생체 내 ( in vivo) 에서 독성 결여 ( Lack of toxicity of murine erythroid cells comprising IL-12 + IL-15/IL- 15RA , or IL-12 + 4- 1BBL in vivo ) .
IL-12 및 IL-15/IL-15RA (mRBC-IL-12 + IL-15/IL-15RA), 또는 IL12 및 3-1BBL (mRBC-IL-12 + 4-1BBL)로 접합 된 쥐 적혈구 세포의 독성 결여 또는 참을성을 평가하기 위하여 독성 생쥐모델이 사용되었다. 이 실험에서 독성을 평가하기 위하여, 다양한 mRBCs 및 mRBC 용법 스케줄이 실시 예시 20에 서술되었다 독성의 평가는 일반적으로 실시 예시 20에 서술된 대로 수행되었다.
일반적으로, 실시 예시 20에 서술된 대로, 6 에서 12주령 여성 C57BL/6 생쥐가 다음의 용량으로 투약 되었다: IL-12 및 IL-15/IL-15RA (mRBC IL12 + L-15/IL-15RA)를 제시하는 쥐 적혈구 세포 (1E9, 3e8 및 1e8 세포), IL-12 및 4-1BBL (mRBC IL-12 + 4-1BBL)를 제시하는 쥐 적혈구 세포 (1E9, 3e8 및 1e8 세포); 또는 IL-12, IL-15/IL-15RA 또는 4-1BBL (mRBC CTRL) 이 없는 쥐 적혈구 세포 (1E9, 3e8 및 1e8 세포)로, 재조합 IL-12 (rIL-12), 재조합 IL-15) (rIL-15), 작동제(agonist) 4-1BB 항체 (3H3)와 함께, 또는 rIL-12 및 3H3 조합과 함께, 대조군으로 투여되었다.
동물의 무게 및 컨디션은 매일 기록되었다. 투약은 1, 4, 8 및 11일에 수행되었고, 및 최종 희생은 18일째에 수행되었다. 간 (liver), 지라 (spleens), 혈액 (blood) 및 혈청 (serum)이 수집되었다. 알라닌 트란스아미네이즈 (alanine transaminase) (ALT) 간 효소의 수준이 혈청에서 정량되었다. 사이토카인 인터페론 감마 (interferon gamma) (IFNg), TNFa, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, 및 IL-13 의혈청에서의 수준이 사이토카인 비드 에세이 (cytokine bead assay) (CBA)를 사용하여 정량되었다. 비드는 피분석물-특이 항체 (analyte-specific antibodies) (IFNg, TNFa, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, 및 IL-13) 와 접합시키고 및 혈청과 배양되었다. 검출 항체가 첨가되고 및 형광이 정량되고 및 유동세포 분석으로 분석되었다. 완전 혈액 수 (Complete blood count) 도 또한 수행되었다.
도 26A-26C에서 보여준 대로, 호의적 참을성 (favorable tolerability) 이 IL-12 및 IL-15/IL-15RA, 또는 IL-12 및 4-1BBL로 접합 된 쥐 적혈구 세포에서, 대조군에 비교하여 관찰되었다. 검사한 어느 mRBC 조합에서도 몸무게, 지라 또는 간의 무게의 변화는 관찰되지 않았다. 그러나 rIL-12를 받은 모든 군에서 몸무게의 손실이 관찰되었다. 비슷하게, rIL-12 처치된 군에서 지라 및 간 무게의 현저한 증가 관찰이 되었다. 도 26D는 rIL-12-처치된 생쥐는 헤모글로빈 (hemoglobin) 수준이 낮은 빈혈, 림프구감소증 (lymphopenia), 호중구 감소증 (neutropenia)으로 특징지어지는 백색 혈액 세포 (white blood cell) (WBC) 수 (count)의 손실, 및 호산구(eosinophils)의 손실을 보이는 것을 제시한다. 반대로, mRBC 처치를 받은 군에서는 세포 수 (cell counts)의 주된 변화는 관찰되지 않았다. 더 나아가, rIL-12-처치된 생쥐는, IL-12를 포함하는 mRBCs를 투여받은 생쥐에 비해, 낮은 수준의 림프구 및 높은 수준의 ALT (14일 및 18일째 날에 검출된 대로)를 보였다 (데이터는 보이지 않음).
더 나아가, 도 27A는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA, 또는 IL-12 및 4-1BBL로 동시 접합 된 mRBC를 받은 생쥐는, 혈청에서 증가된 IFNg 수준을 3일째 및 10일에 보이며, 이는 각 용량 투여 후 2일째 날에 빨리 감소함을 보인다. 그러므로 mRBC 처치는 처치 후에 반응할 수 있는, 조절되는 IFNg 반응을 유도한다. 반대로, rIL-12로 처치된 생쥐는, 셋째 날과 같이 일찍이, 극적으로 더 높은 ALT 및 IFNg 수준을 보이며, 이는 연구기간 전체 동안에 걸쳐 떨어지지 않았다. 비슷한 수준의 ALT 및 IF Ng가 18일째 날에 관찰되었다 (데이터 보이지 않음). 도 27B에서 보여준 대로, IFNg 수준과는 반대로, TNFa 수준은 각 용량으로 계속 올라간다. 그러나 mRBCs로 처치된 생쥐는, rIL-12로 처치된 생쥐에 비교하여, 더 낮은 TNFa 수준의 증가를 보인다. 더욱이, mRBCs로 처치된 생쥐에서 IL-10 생산에 주 영향이 관찰되지 않았으나, rile-12로 처치된 동물의 혈청에서는 IL-10이 검출되었다 (데이터 보이지 않음).
IL12 단독으로 접합 된 쥐 적혈구 세포의 독성 결여를 검사 및 확인하기 위하여 추가의 실험이 수행되었다. 도 26E-F에 보여준 대로, rIL-12에 비교하여, IL-12로 접합 된 쥐 적혈구 세포로 처치된 생쥐에서 비슷한 호의적 참을성 (favorable tolerability)이 관찰되었다. IL-12로 접합 적혈구 세포로 처치된 어느 생쥐에게서도 몸무게, 지라 또는 간의 무게의 변화는 관찰되지 않았다. 그러나 rIL-12를 받은 모든 군에서 몸무게의 손실이 관찰되었다. 비슷하게, rIL-12로 처치된 생쥐에게서는 지라 및 간 무게의 극적인 증가가 관찰되었다. 도 26F는 더 나아가, rIL-12로 처치된 생쥐는, IL-12로 접합 된 쥐 적혈구 세포로 처치된 생쥐에 비해, 낮은 헤모글로빈 수준의 빈혈, WBC 수 (counts) 손실, 낮은 수준의 림프구 및 붉은 혈액 세포, 높은 수준의 ALT (14일 및 18일째 날에 검출된 대로), 및 높은 수준의 IFNg (10일째 날에 검출된 대로)를 보여주는 것을 제시한다.
이 결과들은 IL-12 단독으로 또는 IL-15/IL-15RA 또는 4-1BBL와 조합하여 포함하고 있는 쥐 적혈구 세포는, rIL-12, rIL-15, 또는 3H3의 투여와 연관된 독성 없이, 고형 종양 성장 및 전이를 감소시키는데 효능적이라는 것을 제시한다.
실시 예시 31. 유전적으로 IL-12, IL-15/IL- 15RA , 4- 1BBL , 또는 이의 조합을 포함하는 유전적으로 제작된 핵 제거된 적혈구는, NK 세포 세포 독성을 유도한다 ( Genentically engineered enucleated erythroid cells genetically comprising IL-12, IL-15/IL- 15RA , 4- 1BBL , or combinations thereof, induce NK cell cytotoxicity).
IL-12 단독, IL-15/IL-15RA 단독 (V4.1), 4-1BBL 단독 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA (V4.1) 와 조합으로, IL-12 및 4-1BBL, 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 포함하는 인간 핵 제거된 적혈구로 인간 NK 세포의 단기간 (하룻밤) 프라이밍이 실시 예시 17에 서술된 대로 수행되었다. 간략하게, 냉동된 NK 공여자 세포를 핵 제거된 적혈구 세포(RBCs)로 하룻밤 동안 5:1 비율로 배양되었다 (100,000 NK 세포 + 500,000 RBC 세포, 40,000 NK 세포 + 200,000 RBC 세포). 다음날, 20,000 CTFR-라벨 된 K562 타겟 세포를 NK 및 RBC 세포와 E: T 비율 5:1 및 2:1로 4시간 동안 접촉시켰다. 염색은 GPA PE, CD56 PE-Cy7, 고정 가능한 생존력 염료 (fixable viability dye) (AmCyan), 셀트레스 하 레드 (CellTrace Far Red) (타겟) 으로 수행되었으며, 및 샘플은 유동세포 분석을 사용하여 분석되었다. 추가의 표현형은 GzmB, PacBlue & CD69 BV605, 로 2:1 E:T 비율을 사용하여 수행되었다.
항체-의존성 세포-매개하는 세포독성 (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) (ADCC) 에세이가 실시 예시 18에 서술된 대로 수행되었다. 간략하게, 100,000 또는 40,000 NK 세포가 라지 타겟 세포(Raji target cells) 와 E: T 비율 5:1 및 2:1로 접촉되었다. 라지 세포 (Raji cells) 는 CTFR-라벨 되고, 및 항-CD20 또는 이소 타입 항체 (isotype antibody)로 사전-처치시키고 및 4시간 동안 배양되었다. 세포는 그 후 추가로 CD16에 대해 염색하였다.
도 28A에 보여준 대로, 결과는 IL-12 단독, IL-15/IL-15RA 단독, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA와 조합으로, IL-12 및 4-1BBL, 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 포함하는 인간 핵 제거된 적혈구로 하룻밤 동안 프라이밍 한 NK 세포는 K562 타겟 세포에 대해 강화된 세포독성 (대략 80% - 90% 살상) 을 보였으며, 이는 rhIL-15 (적어도 90% 살상) 로 5:1 NK:타겟 비율로 프라이밍 한 것에 견줄 만하다는 것을 제시한다. 그러므로 이들 분자들을 포함하는 인간 핵 제거된 적혈구는 세포 당 근거로 NK 세포의 세포독성을 강화하였으며, 즉, NK 세포는 더 잘 확장될 뿐만 아니라, 결과로 얻어진 개별 NK 세포 집단은 좀 더 활성적이었다 (예를 들어, 좀 더 세포독성이 있다).
도 28B에서 보여준 대로, IL-15/IL-15RA 단독으로 포함하는, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA 둘 다를 포함하는 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 포함하는 인간 핵 제거된 적혈구로 하룻밤 동안 프라이밍 한 NK 세포는, IL-12 단독, 4-1BBL 단독으로 포함하는, 또는 단백질 포함하지 않는 (no protein) (대조군) 인간 핵 제거된 적혈구 세포로 하룻밤 동안 프라이밍 한 NK 세포에 비교하여, 라지 세포에 (Raji cells)에 대하여 증가 된 세포독성을 보였다. 세포독성은 5:1 E: T 비율에서 가장 우세하였으며, 및 IL-12 및 IL-15/IL-15RA의 조합, 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL의 조합을 포함하는 핵 제거된 적혈구는, 4-1BBL 단독 또는 IL-12 단독을 포함하는 세포에 비교하여, 강화된 세포독성을 보이지 않았다. 그러므로 ADCC의 강화는 IL-15/IL-15RA에 의해 유도되는 것으로 보인다. 이 결과들은 그러므로 IL-15/IL-15RA 단독으로 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA 둘 다, 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포는 라지 세포 타겟 (Raji cell targets)에 대한 세포 당에 근거하여 (per cell basis) NK 세포의 ADCC 활성을 강화시킨다는 것을 제시한다.
실시 예시 32. IL-12, IL-15/IL- 15RA , 4- 1BBL 또는 이의 조합을 포함하는 제작된 인간 적혈구 세포는, 항-CD3 항체 자극과 함께 또는 없이, IFNg 반응 및 CD4 + 및 CD8+ T세포 , NK 및 NKT 세포의 증식을 유도한다 (Engineered human erythroid cells comprising IL-12, IL-15/IL- 15RA , 4- 1BBL or combinations thereof, with or without anti-CD3 antibody stimulation, induce an IFNg response and the proliferation of CD4+and CD8+ T cells, NK and NKT cells).
IL-12 단독, IL-15/IL-15RA (V4.1) 단독, 4-1BBL 단독, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA (V4.1) 둘 다, IL-12 및 4-1BBL, 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 포함하는 인간 핵 제거된 적혈구 세포의 일차 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, NK 세포, 및 NKT 세포를 대상으로 증식 및 활성화 효과가 항-CD3 항체의 자극과 함께 또는 없이 평가되었다. 간략하게, 3 공여자로부터의 100,000 PBMCs가 CTFR로 라벨 되고 및 IL-12 단독, IL-15/IL-15RA 단독, 4-1BBL 단독, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA의 조합, IL-12 및 4-1BBL, 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포와 배양되고; 또는 대조군으로 PBMC가 외부 유래 단백질이 없는 ((UNT) 핵 제거된 적혈구 세포와 배양되고, 또는 배지로 접촉시켰다 (Media).400,000, 200,000 또는 100,000 핵 제거된 적혈구 세포가 사용되었다. 5일 또는 8일에, 활발하게 분열하는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, NK 세포, 및 NKT 세포의 퍼센트가 CTFR 희석을 사용하여 평가되었다. 상등액은 수집되고 IFNγ의 양이 ELISA 사용하여 평가되었다. 실험은 항-CD3 처치와 조합으로 0.5 ug/mL에서 5일 에세이로서, 또는 항-CD3 항체 처치 없이 수행되었다.
도 29A에서 보여준 대로, 항-CD3 항체 자극과 조합으로 IL-12를 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포로의 처치는, PBMCs에 의한 의미 있는 양의 IFNg 생산을 유도하였으며. 반면에, 항-CD3 항체 자극과 조합으로 IL-12 및 4-1BB을 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포로의 처치는, PBMCs에 의해 가장 높은 수준의 IFNg 생산을 유도하였다. 항-CD3 항체 자극이 없을 때는, 단지 IL-12를 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포만, PBMCs에 의한 IFNg 생산을 유도하였다 (도 29B 참조). 더 나아가, 항-CD3 항체로 자극된 BMC에서, 1BBL 단독, IL-12 및 4-1BBL 둘 다, 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포로의 처치는, CD4+ T 세포의 증식을 유도했다 (도 29C 참조). 그러므로 CD4+ T 세포 증식은 4-BBL에 의해 주도되는 것으로 보인다.
도 29D는 항-CD3 항체와 조합하여 IL-12 및 IL-15/IL-15RA나, IL-12 및 4-1BBL나, 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL를 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포로 처치된 PBMCs는 중간 정도의 증가된 CD8+ T 세포 증식을 보였다 ((세포 수 (cell count)가 대략 5배 증가)). 이 CD8+ T 세포 배수 변화는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포로 처치된 PBMCs에서 다른 핵 제거된 적혈구 세포로 처치한 PBMCs에서보다 좀 더 다양하다. 더욱이, 항-CD3 항체와 조합하여 IL-12 및 4-1BBL 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL를 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포로 처치한 PBMCs는, 의미 있는 NKT 세포 증식을 보였으며, 이는 또한 4-1BBL에 의해 주도되는 것 같다 (도 29E 참조). IL-12 및 IL-15/IL-15RA를 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포로의 PBMCs 처치는 증간 정도의 NKT 세포 증식을 유도하며 이는 PBMCs를 IL-12 단독으로 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포로 처치하였을 때 관찰된 NKT 세포증식을 능가하지 않는다.
도 29F에서 보여준 대로, 항-CD3 항체로 자극되지 않은 PBMCs에서는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA 둘 다를 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포에서만 제한적인 CD4+ T 세포 증식이 유도되었다. 더 나아가, 도 29G에서 보여준 대로, 항-CD3 항체로 자극되지 않은 PBMCs에서는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA, IL-12 및 4-1BBL, 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포에서는, 중간 정도의 CD8+ T 세포 증식 (대략, 10-20% 분열)을 강화하였다. IL-12 및 IL-15/IL-15RA 둘 다를 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포로 PBMCs 처치는 NK 세포 분열을 강화시키나 (대략 59-60%), 그러나 세포 수 (cell count)는 증가하지 않으며, 이는 단지 중간 정도의 NK 세포의 증식을 제시한다 (도 29H 참조). 그러나 IL-12 및 4-1BBL 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포로 PBMCs 처치는, 상당한 (extensiv) NK 세포 증식을 유도한다. 최종으로, 항-CD3 항체로 자극되지 않은 PBMCs에서, IL-12 및 IL-15/IL-15RA, IL-12 및 4-1BBL, 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL를 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포는 NKT 세포에 대해 중간 정도의 증식 효과를 유도한다.
종합하면, 이 실시 예시에서 보여준 결과들은 IL-12 및 IL-15/IL-15RA, IL-12 및 4-1BBL나, 또는 및 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL 을 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포는 강력한 일차 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, NK 세포, 및 NKT 세포 활성화를 유도한다는 것을 보여준다. CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 NKT 세포의 활성화는 더 나아가 PBMCs 가 항-CD3 항체로 자극될 때 더 강화된다.
추가의 실험에서, 밀리테니 마이크로비드 (Miltenyi microbeads)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 음성 선택 (negative selection) 을 사용하여 PBMCs로부터 인간 naive CD4+ T 세포가 분리되었다. 정제된 인간 naive CD4+ T 세포는 IL-12 단독, IL-15/IL-15RA 단독, 4-1BBL 단독, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA 둘 다, IL-12 및 4-1BBL, 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1 BB을 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포로 배양시켰고; 또는 대조군으로서 CD4+ T 세포를 (UNT)로 접촉 또는 배지로 접촉 (media) 시켰다. CD4+ T 세포는 또한 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체로 자극하고 및 접촉은 1:5 (CD4+ T 세포: 제작된 적혈구 세포)의 비율로 5일 동안 수행되었다. IFNg 수준은 ELISA를 사용하여 배지 상등액에서 분석되었다. 데이터는, 도 29J에 3명의 다른 PBMC 공여자로부터의 평균으로 제시된 대로, IL-12 단독, IL-15/IL-15RA 단독, 4-1BBL 단독, 또는 IL-12 및 IL-15/IL-15RA 둘 다, IL-12 및 4-1BBL, 또는 IL-15/IL-15RA 및 4-1BBL을 포함하는 핵 제거된 적혈구 세포는 인간 naive CD4+ T 세포의 Th1 분화를 유도할 수 있었다.
<110> RUBIUS THERAPEUTICS, INC. <120> THERAPEUTIC CELL SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING CANCER AND INFECTIOUS DISEASES <130> 129267-00220 <140> 62/640,530 <141> 2018-03-08 <150> 62/757,717 <151> 2018-11-08 <150> 62/732,050 <151> 2018-09-17 <150> 62/692,487 <151> 2018-06-29 <150> 62/680,490 <151> 2018-06-04 <150> 62/660,657 <151> 2018-04-20 <150> 62/640,530 <151> 2018-03-08 <160> 83 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 304 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln 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agtgcgtgct caataaagct acaaatgtag ctcattggac tactcctagt 180 ctcaaatgca ttcgggaccc cgcgcttgtg caccagagac ctgcgccgcc gtccacagtg 240 acgacagctg gtgtaacccc ccaacctgaa tcccttagtc cgtctggtaa agaaccggcg 300 gcgtcttcac cttccagcaa taatactgcg gcgacaacag ccgcgatagt tcctggatcc 360 caactcatgc cgtcaaagtc tccttcaacg ggaacgacag agatctcttc acatgaaagt 420 tctcatggaa caccgagcca aactacggca aagaactggg aactgactgc ctcagcaagc 480 caccagccgc caggggtgta cccgcaaggg cactcagata ctact 525 <210> 16 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 16 atcacctgcc cgcctcccat gagcgtggaa cacgcggaca tttgggttaa gagctacagt 60 ctttacagcc gggagcgcta tatctgcaac tcagggttta agcggaaagc agggacatca 120 agtttgacag aatgtgtgtt gaacaaggct acaaatgttg ctcactggac cacgccatct 180 ttgaagtgta tccgagatcc cgcgcttgtc catcagcgcc cagcgcctcc ctcc 234 <210> 17 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 17 gggggaggtg gctctggtgg aggcgggagt ggcgggggcg gctca 45 <210> 18 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gatcctctta atttcttacg gtattcgccg actgataaag 300 aaaagcccat ctgatgtaaa acctctcccc tcacctgaca cagacgtgcc tttaagttct 360 gttgaaatag aaaatccaga gacaagtgat caa 393 <210> 27 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 27 Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser 1 5 10 15 Ile Ser Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu 20 25 30 Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser 35 40 45 Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu 50 55 60 Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp 65 70 75 80 Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn 85 90 95 Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu 100 105 110 Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met 115 120 125 Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Pro Tyr 130 135 140 Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ser 145 150 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caaagagtta catctcatca cagacaaatg atacgcacaa acgggacaca 1140 tatgcagcca ctcctagagc tcatgaagtt tcagaaattt ctgttagaac tgtttaccct 1200 ccagaagagg aaaccggaga aagggtacaa cttgcccatc atttctctga accagagata 1260 acactcatta tttttggggt gatggctggt gttattggaa cgatcctctt aatttcttac 1320 ggtattcgcc gactgataaa gaaaagccca tctgatgtaa aacctctccc ctcacctgac 1380 acagacgtgc ctttaagttc tgttgaaata gaaaatccag agacaagtga tcaa 1434 <210> 39 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 39 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Pro Glu Asp Glu Pro Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 40 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 40 ggaggatctg gcgggtctgg aggcggcccc gaggacgagc ccggcagcgg cagcggcgga 60 gggtctggag gcggttcc 78 <210> 41 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro 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Thr 435 440 445 Gly Lys Leu Gly Ile Ala Met Lys Val Leu Gly Gly Val Ala Leu Phe 450 455 460 Trp Ile Ile Phe Ile Leu Gly Tyr Leu Thr Gly Tyr Tyr Val His Lys 465 470 475 480 Cys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 485 490 495 Ser Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp 500 505 510 Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro 515 520 525 Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu 530 535 540 Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala 545 550 555 560 Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu 565 570 575 Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu 580 585 590 Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala 595 600 605 Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser 610 615 620 Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro 625 630 635 640 Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg 645 650 655 Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser 660 665 670 Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp 675 680 685 Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile 690 695 700 Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro 705 710 715 720 Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr 725 730 735 Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val 740 745 750 Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys 755 760 765 Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg 770 775 780 Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val 785 790 795 800 Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 805 810 815 Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro 820 825 830 Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu 835 840 845 Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu 850 855 860 Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala 865 870 875 880 Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg 885 890 895 Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr 900 905 910 Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys 915 920 925 Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp 930 935 940 Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp 945 950 955 960 Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys 965 970 975 Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys 980 985 990 Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val 995 1000 1005 Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser 1010 1015 <210> 63 <211> 3048 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 63 atgtatggaa aaataatctt tgtattacta ttgtcagaaa ttgtgagcat atcagcagcc 60 tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc 120 cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc 180 atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac 240 agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg acggggggcc tgagctacaa agaggacacg 300 aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc tactatgtct tctttcaact agagctgcgg 360 cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg 420 cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc 480 gaggctcgga actcggcctt cggtttccag ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag 540 cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc agggcacgcc atgcctggca gcttacccag 600 ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg acccccgaaa tcccagccgg actcccttca 660 ccgaggtcgg aaggaggatc tggcgggtct ggaggcggcc ccgaggacga gcccggcagc 720 ggcagcggcg gagggtctgg aggcggttcc ttaagtacca ctgaggtggc aatgcacact 780 tcaacctctt cttcagtcac aaagagttac atctcatcac agacaaatga tacgcacaaa 840 cgggacacat atgcagccac tcctagagct catgaagttt cagaaatttc tgttagaact 900 gtttaccctc cagaagagga aaccggagaa agggtacaac ttgcccatca tttctctgaa 960 ccagagataa cactcattat ttttggggtg atggctggtg ttattggaac gatcctctta 1020 atttcttacg gtattcgccg actgataaag aaaagcccat ctgatgtaaa acctctcccc 1080 tcacctgaca cagacgtgcc tttaagttct gttgaaatag aaaatccaga gacaagtgat 1140 caagcggccg ctgagggcag aggaagtctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc 1200 ggcccttccg gaatgcaacc gcaagagagt cacgtacatt attcaagatg ggaagatgga 1260 agtcgggacg gtgtgtctct cggcgctgtt agttcaacgg aggaagcgtc tcgctgtcgc 1320 cggataagtc aacgcctttg tacgggaaaa ctgggtatag ctatgaaggt cctcggcggg 1380 gtggcgttgt tttggattat ctttatactt gggtatctga ccggttacta tgttcacaag 1440 tgtaaaggag gtggaggatc aggtggaggt ggttcaggtg gaggaggtag catctgggag 1500 ctgaagaagg acgtgtacgt ggtggagctg gactggtatc ctgatgcccc aggcgagatg 1560 gtggtgctga cctgcgacac acctgaggag gatggcatca cctggacact ggatcagagc 1620 agcgaggtgc tgggctccgg caagaccctg acaatccagg tgaaggagtt cggcgacgcc 1680 ggccagtaca catgtcacaa gggaggagag gtgctgagcc actccctgct gctgctgcac 1740 aagaaggagg acggcatctg gtctacagac atcctgaagg atcagaagga gcccaagaac 1800 aagaccttcc tgcggtgcga ggccaagaat tatagcggcc ggttcacctg ttggtggctg 1860 accacaatct ctaccgacct gaccttcagc gtgaagtcta gccggggctc ctctgaccct 1920 cagggagtga catgcggagc agccaccctg tccgccgagc gggtgagagg cgataacaag 1980 gagtacgagt atagcgtgga gtgccaggag gactccgcct gtccagcagc agaggagagc 2040 ctgccaatcg aagtgatggt ggatgccgtg cacaagctga agtacgagaa ttatacaagc 2100 tccttcttta tcagggacat catcaagccc gatcccccta agaacctgca gctgaagccc 2160 ctgaagaaca gccggcaggt ggaggtgtct tgggagtacc ccgacacctg gagcacacct 2220 cactcctatt tctctctgac cttttgcgtg caggtgcagg gcaagtccaa gagggagaag 2280 aaggaccgcg tgttcaccga taagacatct gccaccgtga tctgtcggaa gaacgcctct 2340 atcagcgtgc gggcccagga tagatactat tctagctcct ggagcgagtg ggcctccgtg 2400 ccatgttctg gaggaggagg cagcggcgga ggaggctccg gcggcggcgg cagccggaat 2460 ctgccagtgg caaccccaga ccccggaatg ttcccatgcc tgcaccactc tcagaacctg 2520 ctgagggccg tgagcaatat gctgcagaag gcccgccaga cactggagtt ttacccttgt 2580 accagcgagg agatcgacca cgaggacatc acaaaggata agacctccac agtggaggcc 2640 tgcctgccac tggagctgac caagaacgag agctgtctga acagccggga gaccagcttc 2700 atcaccaacg gcagctgcct ggcctccaga aagacatctt ttatgatggc cctgtgcctg 2760 tctagcatct acgaggacct gaagatgtat caggtggagt tcaagaccat gaacgccaag 2820 ctgctgatgg accccaagag gcagattttc ctggaccaga atatgctggc cgtgatcgac 2880 gagctgatgc aggccctgaa ctttaattcc gagacagtgc ctcagaagtc ctctctggag 2940 gagccagatt tctacaagac caagatcaag ctgtgcatcc tgctgcacgc cttccggatc 3000 agagccgtga ccatcgaccg cgtgatgagc tatctgaatg cctcctag 3048 <210> 64 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 64 Ala Ala Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro Ser Gly 20 <210> 65 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 65 gcggccgctg agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60 ccttccgga 69 <210> 66 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 66 Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Ala Ile Val Ser 1 5 10 15 Ile Ser Ala Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser 20 25 30 Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His 35 40 45 Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu 50 55 60 Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg 65 70 75 80 Val Gln Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile 85 90 95 Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr 100 105 110 Gly Ile Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu 115 120 125 Pro Ser Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn 130 135 140 Pro Glu Thr Ser Asp Gln 145 150 <210> 67 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 67 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Glu Asp Glu Asp 1 5 10 15 Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 20 25 <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 68 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 69 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 69 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser <210> 70 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 70 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ser <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 71 Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 72 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 72 Ser Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Ala 20 25 <210> 73 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 73 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 20 <210> 74 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 74 Ser Gly Arg Gly Ala Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gln Lys 1 5 10 15 Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile 20 25 30 Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Val Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met 35 40 45 Leu Trp Gly Ser Gly Met Gln Ser Pro Ala 50 55 <210> 75 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 75 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 76 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 76 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 77 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 77 Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Gly Ala Arg Cys 20 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 78 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 79 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 80 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 80 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 81 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 81 gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg sgsstcccgg ccct 54 <210> 82 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Any amino acid <400> 82 Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5 <210> 83 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Any amino acid <400> 83 Leu Pro Xaa Thr Ala 1 5

Claims (156)

  1. 면역 살상 세포 (immune killer cell)을 자극하도록 제작된 핵 제거된 세포 (enucleated cell)로서, 여기서, 핵 제거된 세포는 적어도 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 외부 유래 자극 폴리펩티드는 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한 특징을 가진, 핵 제거된 세포.
  2. 제1항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 면역 살상 세포는 자연 살상 세포 (natural killer (NK) cell)인, 핵 제거된 세포.
  3. 제1항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 면역 살상 세포는 CD8+ T-세포인, 핵 제거된 세포.
  4. 제1항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서, 핵 제거된 세포는 적어도 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, 및 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 핵 제거된 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 적어도 외부 유래 자극 폴리펩티드 중 하나는; IL-1, IL-2, IL-12, IL-15, IL-15/IL-15RA 융합, IL-18, IL-21, 인터페론 알파 (interferon alpha) (IFNα), 4-1BBL, 폴리오바이러스 수용체 (Poliovirus Receptor) (PVR/CD155), CD48, 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigen) (HLA)-A, HLA-C, HLA-G, 헤파린 설페이트(heparan sulfate) (HS), HLA-E, CpG, 면역글로블린 G (Immunoglobulin G) (IgG), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 (MHC class I chain-related proteins) (MIC), B7-H6, NkP44L, 넥틴 2 (Nectin2), NK-T-B 항원 (NTBA), 활성-유도된 C-형 렉틴 (activation-induced C-type lectin) (AICL), 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1)(IGF-1)로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는, 핵 제거된 세포.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 적어도 외부 유래 자극 폴리펩티드 중 하나는 IL-15/IL-15RA 융합을 포함하는, 핵 제거된 세포.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 적어도 외부 유래 자극 폴리펩티드 중 하나는 IL-12를 포함하는, 핵 제거된 세포.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 적어도 외부 유래 자극 폴리펩티드 중 하나는 4-1BBL를 포함하는, 핵 제거된 세포.
  9. 제5항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 MIC 단백질은: MHC 유형 I 체인-관련된 단백질 A (MHC class I chain-related protein A) (MICA), MHC 유형 I 체인-관련된 단백질 B (MHC class I chain-related protein B) (MICB) 및 UL16 결합 단백질 (UL16 binding proteins) (ULBP)로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵 제거된 세포.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 적어도 외부 유래 자극 폴리펩티드 중 하나는: IL-15/IL-15RA 융합, MICA, MICB, 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1) 으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는, 핵 제거된 세포.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA를 포함하고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드: IL-1, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, 4-1BBL,IFNα, MICA, MICB, PVR 및 CD48로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하는, 핵 제거된 세포.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA를 포함하고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 4-1BBL을 포함하는, 핵 제거된 세포.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15/IL-15RA를 포함하고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12를 포함하는, 핵 제거된 세포.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12를 포함하고 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL을 포함하는, 핵 제거된 세포.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는: IL-18 및 IL-12, IL-18 및 IL-21, IL-12 및 4-1BBL, IL-12 및 IL-15/IL-15RA 융합, 및 4-1BBL 및 IL-15/IL-15RA 융합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 핵 제거된 세포.
  16. 제4항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12를 포함하고, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-18을 포함하고 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL15/IL-15RA를 포함하는, 핵 제거된 세포.
  17. 제4항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12를 포함하고, 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-18을 포함하고 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15를 포함하는, 핵 제거된 세포.
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 104, 105, 또는 106 이상의 카피 수(copy number)로 존재하는, 핵 제거된 세포.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상보다 많지 않은 카피 수로, 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배 이상보다 많지 않은 카피 수로 존재하는, 핵 제거된 세포.
  20. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상보다 많지 않은 카피 수로, 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배 이상보다 많지 않은 카피 수로 존재하는, 핵 제거된 세포.
  21. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 무게 또는 카피 수로 그 존재비 (abundance ratio) 가 약 1:1, 약 2:1에서부터 1:2까지, 약 5:1에서부터 1:5까지, 약 10:1에서부터 1:10까지, 약 20:1에서부터 1:20까지, 약 50:1에서부터 1:50까지, 또는 약 100:1 에서부터 1:100까지인, 핵 제거된 세포.
  22. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드가 융합 폴리펩티드로 존재하는, 핵 제거된 세포.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째, 두 번째, 및 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드가 융합 폴리펩티드로 존재하는, 핵 제거된 세포.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 적어도 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 제작된 핵 제거된 세포의 표면에 존재하는, 핵 제거된 세포.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 적어도 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 더 나아가 막 통과 도메인 (transmembrane domain) 을 포함하는, 핵 제거된 세포.
  26. 제25항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 막 통과 도메인은 글라이코포린 A (glycophorin A) (GPA) 또는 이의 막통과 부분을 포함하는, 핵 제거된 세포.
  27. 제25항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 막 통과 도메인은 작은 막 내재 단백질 1 (small integral membrane protein 1) (SMIM1), 또는 이의 막 통과 부분을 포함하는, 핵 제거된 세포,
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 핵 제거된 세포는 NK 세포를 활성화시킬수 있는 능력이 있는, 핵 제거된 세포.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 핵 제거된 세포는 NK 세포를 확장시킬수 있는 능력이 있는, 핵 제거된 세포.
  30. 제28항 또는 제29항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 NK 세포는 메모리-유사 NK 세포 (memory-like NK cell) 인, 핵 제거된 세포.
  31. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 핵 제거된 세포는 CD8+ T-세포를 활성화 시킬수 있는 능력이 있는, 핵 제거된 세포.
  32. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 핵 제거된 세포는 CD8+ T-세포를 확장시킬수 있는 능력이 있는, 핵 제거된 세포.
  33. 제31항 또는 제32항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 CD8+ T-세포는 메모리-T 세포 (memory T-cell)인, 핵 제거된 세포.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 핵 제거된 세포에 있어서, 핵 제거된 세포는 적혈구 세포 (erythroid cell) 인, 핵 제거된 세포.
  35. 제34항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 적혈구 세포는 망상 적혈구 (reticulocyte) 인, 핵 제거된 세포.
  36. 제34항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 적혈구 세포는 적혈구 (erythrocyte) 인, 핵 제거된 세포.
  37. 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는 제작된 핵 제거된 세포로서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 인터루킨-15 (interleukin-15) (IL-15) 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 인터루킨-15 수용체 알파 (interleukin-15 receptor alpha)(IL-15RA) 폴리펩티드의 세포 외 부분 (extracellular portion), 또는 이의 단편을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  38. 제37항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분은 복합체로서 존재하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  39. 제37항 또는 제38항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
    .
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은 링커 (linker) 에 의해 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분에 연결된, 제작된 핵 제거된 세포.
  41. 제40항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 링커는 GGGGS (서열번호 11) 을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  42. 제40항 또는 제41항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 링커는 (GGGGS)3 (서열번호 12) 를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 융합 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드인, 제작된 핵 제거된 세포.
  44. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 융합 폴리펩티드는 서열번호 29 또는 서열번호 37과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드인, 제작된 핵 제거된 세포.
  45. 제37항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인 (IL-15 receptor alpha sushi-binding domain) 을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  46. 제45항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 복합체로서 존재하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  47. 제45항 또는 제46항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인은 융합 폴리펩티드로서 존재하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편은 IL-15 수용체 알파 스시-결합 도메인에 링커에 의해 연결되는, 제작된 핵 제거된 세포.
  49. 제48항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서는 링커는 GGGGS (서열번호 11) 을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  50. 제48항 또는 제49항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 링커는 (GGGGS)3 (서열번호 12) 를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  51. 제47항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 융합 폴리펩티드는 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드인, 제작된 핵 제거된 세포.
  52. 제47항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 융합 폴리펩티드는 서열번호 31과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드인, 제작된 핵 제거된 세포.
  53. 제37항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 더 나아가 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  54. 제53항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  55. 제54항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 41과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  56. 제54항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 43과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  57. 제53항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  58. 제57항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12의 p40 및 p35 서브유닛 (subunits)을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포
  59. 제57항 또는 제58항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 37과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  60. 제57항 또는 제58항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 서열번호 55와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포
  61. 제37항 내지 제60항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 더 나아가; IL-1, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, 인터페론 알파 (interferon alpha) (IFNα), 폴리오바이러스 수용체 (Poliovirus Receptor) (PVR/CD155), CD48, 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigen) (HLA)-A, HLA-C, HLA-G, 헤파린 설페이트(heparan sulfate) (HS), HLA-E, CpG, 면역글로블린 G (Immunoglobulin G) (IgG), UL16 결합 단백질 (UL16 binding proteins) (ULBP), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 (MHC class I chain-related proteins) (MIC), B7-H6, NkP44L, 넥틴 2 (Nectin2), NK-T-B 항원 (NTBA), 활성-유도된 C-형 렉틴 (activation-induced C-type lectin) (AICL), 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1)(IGF-1)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  62. 제61항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 MIC 단백질은 MHC 유형 I 체인-관련 단백질 A (MHC class I chain-related protein A) (MICA) 또는 MHC 유형 I 체인-관련 단백질 B (MHC class I chain-related protein B) (MICB) 인, 제작된 핵 제거된 세포.
  63. 제37항 내지 제62항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 제작된 핵 제거된 세포의 표면에 존재하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  64. 제37항 내지 제63항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 외부 유래 자극 폴리펩티드는 면역 살상 세포 (immune killer cell) 를 자극하기에 충분한, 제작된 핵 제거된 세포.
  65. 제37항 내지 제64항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 104, 105, 또는 106 이상의 카피 수 (copy number) 로 존재하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  66. 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상보다 많지 않은 카피 수로, 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배 이상보다 많지 않은 카피 수로 존재하는, 핵 제거된 세포.
  67. 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상보다 많지 않은 카피 수로, 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배 이상보다 많지 않은 카피 수로 존재하는, 핵 제거된 세포.
  68. 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 무게 또는 카피 수로 그 존재비 (abundance ratio) 가 약 1:1, 약 2:1에서부터 1:2까지, 약 5:1에서부터 1:5까지, 약 10:1에서부터 1:10까지, 약 20:1에서부터 1:20까지, 약 50:1에서부터 1:50까지, 또는 약 100:1 에서부터 1:100까지인, 제작된 핵 제거된 세포.
  69. 제37항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 더 나아가 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  70. 제53항 내지 제69항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 제작된 핵 제거된 세포는 두 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고 및 이두 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 하나의 융합 폴리펩티드로 존재하는, 제작된 핵 제거된 세포.
    .
  71. 제53항 내지 제69항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 제작된 핵 제거된 세포는 세 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고 및 이두 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 하나의 융합 폴리펩티드로 존재하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  72. 제37항 내지 제71항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 더 나아가 막 통과 도메인 (transmembrane domain) 을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  73. 제72항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 막 통과 도메인은 글라이코포린 A (glycophorin A) (GPA) 또는 이의 막 통과 부분을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  74. 제72항의 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 막 통과 도메인은 작은 막 내재 단백질 1 (small integral membrane protein 1) (SMIM1), 또는 이의 막 통과 부분을 포함하는, 핵 제거된 세포.
  75. 제37항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 제작된 핵 제거된 세포는 면역 세포를 자극할 능력이 있는 특징이 있는, 제작된 핵 제거된 세포.
  76. 제75항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 면역 세포는 살상 면역 세포 (killer immune cell) 인, 제작된 핵 제거된 세포.
  77. 제76항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 살상 면역 세포는 자연 살상 세포 ((natural killer (NK) cell)인, 제작된 핵 제거된 세포.
  78. 제77항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 NK 세포는 메모리-유사 NK 세포인 (memory-like NK cell) 인, 제작된 핵 제거된 세포.
  79. 제76항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 살상 면역 세포는 CD8+ T-세포인, 제작된 핵 제거된 세포.
  80. 제79항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 CD8+ T-세포는 메모리 T 세포인, 제작된 핵 제거된 세포.
  81. 제75항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 면역 세포의 자극은 면역 세포의 활성화를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  82. 제75항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 면역 세포의 자극은 면역 세포의 확장을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  83. 제37항 내지 제82항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 제작된 핵 제거된 세포는 적혈구 세포 (erythroid cell) 인, 제작된 핵 제거된 세포.
  84. 제83항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 적혈구 세포는 망상 적혈구 (reticulocyte) 인, 제작된 핵 제거된 세포.
  85. 제83항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 적혈구 세포 (erythroid cell) 는 적혈구 (erythrocyte) 인, 제작된 핵 제거된 세포.
  86. MHC 유형 I 체인-관련 단백질 A (MICA), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 B (MICB), 및 인슐린-유사 성장 인자 (IGF-1)로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 적어도 하나의 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  87. 제86항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서, 핵 제거된 세포는 더 나아가 두 번째 외부 유래 폴리펩티드를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  88. 제87항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는; IL-1, IL-2, IL-12, IL-15, IL-15/IL-15RA 융합, IL-18, IL-21, 인터페론 알파 (interferon alpha) (IFNα), 4-1BBL, 폴리오바이러스 수용체 (Poliovirus Receptor) (PVR/CD155), CD48, HLA-A, HLA-C, HLA-G, 헤파린 설페이트(heparan sulfate) (HS), HLA-E, CpG, IgG, UL16 결합 단백질 (UL16 binding proteins) (ULBP), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 (MHC class I chain-related proteins) (MIC), B7-H6, NkP44L, 넥틴 2 (Nectin2), NK-T-B 항원 (NTBA), 활성-유도된 C-형 렉틴 (activation-induced C-type lectin) (AICL), 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (insulin-like growth factor 1)(IGF-1)로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 제작된 핵 제거된 세포의 표면에 존재하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  90. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 외부 유래 자극 폴리펩티드는 면역 살상 세포를 자극하기에 충분한, 제작된 핵 제거된 세포.
  91. 제86항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 외부 유래 자극 폴리펩티드 104, 105, 또는 106 이상의 카피 수로 존재하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  92. 제87항 또는 제88항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상보다 많지 않은 카피 수로, 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배 이상보다 많지 않은 카피 수로 존재하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  93. 제87항 또는 제88항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드의 카피 수보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상보다 많지 않은 카피 수로, 또는 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000배 이상보다 많지 않은 카피 수로 존재하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  94. 제87항 또는 제88항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 무게 또는 카피 수로 그 존재비 (abundance ratio) 가 약 1:1, 약 2:1에서부터 1:2까지, 약 5:1에서부터 1:5까지, 약 10:1에서부터 1:10까지, 약 20:1에서부터 1:20까지, 약 50:1에서부터 1:50까지, 또는 약 100:1 에서부터 1:100까지인, 제작된 핵 제거된 세포.
  95. 제87항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 핵 제거된 세포는 더 나아가 세 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포
  96. 제87항 내지 제94항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 제작된 핵 제거된 세포는 두 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하며 및 이 두 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드로 존재하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  97. 제87항 내지 제95항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 제작된 핵 제거된 세포는 세 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하며 및 이 세 개의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드로 존재하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  98. 제87항 내지 제97항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 하나 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 막 통과 도메인 (transmembrane domain)을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  99. 제98항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 막 통과 도메인은 글라이코포린 A (glycophorin A) (GPA) 또는 이의 막 통과 부분을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  100. 제98항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 막 통과 도메인은 작은 막 내재 단백질 1 (small integral membrane protein 1) (SMIM1), 또는 이의 막 통과 부분을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  101. 제86항 내지 제100항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 제작된 핵 제거된 세포는 면역 세포를 자극할 능력이 있는 특징이 있는, 제작된 핵 제거된 세포
  102. 제101항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 면역 세포는 살상 면역 세포 (kller immune cell) 인, 제작된 핵 제거된 세포.
  103. 제102항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 살상 면역 세포는 자연 살상 세포 ((natural killer (NK) cell)인, 제작된 핵 제거된 세포.
  104. 제103항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 NK 세포는 메모리-유사 NK 세포인 (memory-like NK cell) 인, 제작된 핵 제거된 세포.
  105. 제102항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 살상 면역 세포는 CD8+ T-세포인, 제작된 핵 제거된 세포.
  106. 제105항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 CD8+ T-세포는 메모리 T 세포인, 제작된 핵 제거된 세포.
  107. 제101항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 면역 세포의 자극은 면역 세포의 활성화를 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  108. 제101항의 제작된 핵 제거된 세포에 있어서, 여기서 면역 세포의 자극은 면역 세포의 확장을 포함하는, 제작된 핵 제거된 세포.
  109. 면역 살상 세포를 자극하는 방법으로서, 면역 살상 세포를 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포로, 면역 살상 세포를 자극하기에 효과적인 양으로, 접촉하는 것을 포함하는, 방법.
  110. 제109항의 방법에 있어서, 여기서 면역 살상 세포는 NK 세포인, 방법.
  111. 제109항의 방법에 있어서, 여기서 면역 살상 세포는 CD8+ T-세포인, 방법.
  112. 제110항의 방법에 있어서, 여기서 자극은 NK 세포 활성화를 포함하는, 방법.
  113. 제110항의 방법에 있어서, 여기서 자극은 NK 세포 확장을 포함하는, 방법.
  114. 제111항의 방법에 있어서, 여기서 자극은 CD8+ T-세포 활성화를 포함하는, 방법.
  115. 제111항의 방법에 있어서, 여기서 자극은 CD8+ T-세포 확장을 포함하는, 방법.
  116. 제111항의 방법에 있어서, 여기서 CD8+ T-세포는 메모리 T-세포 (memory T-cell)인, 방법.
  117. 제109항 내지 제116항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 여기서 접촉은 생체 내 (in vivo) 에서 수행되는, 방법.
  118. 제109항 내지 제116항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 여기서 접촉은 생체 외 (ex vivo) 에서 수행되는, 방법.
  119. 제109항 내지 제116항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 여기서 접촉은 시험관 내 (in vitro) 에서 수행되는, 방법.
  120. 제109항의 방법에 있어서, 여기서 방법은 더 나아가 제작된 핵 제거된 세포를 면역 살상 세포 활성화를 필요로하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  121. 제120항의 방법에 있어서, 여기서 개체는 암을 지닌, 방법.
  122. 제121항의 방법에 있어서, 여기서 암은 MHC 유형 I 제시 (MHC class I presentation)가 낮은 것을 특징으로 하는 암인, 방법.
  123. 제121항의 방법에 있어서, 여기서 암은 PD-1-반응적인 종양 (PD-1-responsive tumor) 을 포함하는 방법.
    .
  124. 제121항의 방법에 있어서, 여기서 암은 높은 돌연변이 부담 (high mutational burden)을 포함하는 암인, 방법.
  125. 제122항의 방법에 있어서, 여기서 개체는 MHC 유형 I 제시를 감소시키는 화학요법 치료제로 치료받고 있는 개체인, 방법.
  126. 제121항의 방법에 있어서, 여기서 암은 폐암 (lung cancer), 간세포암 (hepatocellular cancer), 흑색종 (melanoma), 및 림프종 (lymphoma)으로부터 선택되는, 방법.
  127. 제121항의 방법에 있어서, 여기서 암은 림프종을 포함하고 및 림프종은 호츠킨스 림프종 (Hodgkin's lymphoma) 또는 비-호츠킨스 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma) 을 포함하는,방법.
  128. 제120항의 방법에 있어서, 여기서 개체는 감염성 질환을 지닌, 방법.
  129. 제128항의 방법에 있어서, 여기서 감염성 질환은 바이러스 감염이 원인인 감염성 질환인, 방법.
  130. 제129항의 방법에 있어서, 여기서 바이러스 감염은 MHC 유형 I 제시가 낮은 것이 특징인, 방법.
  131. 제129항의 방법에 있어서, 여기서 바이러스 감염은: 아데노바이러스 (adenovirus), 엡스타인 바 바이러스 (Epstein barr virus) (EBV), 간염 B 바이러스 (hepatitis B virus) (HBV), 결핵 (tuberculosis), 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus) (HIV), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus) (HSV), 파필로마 바이러스 (papilloma virus), 및 사이토메갈로 바이러스 (cytomegalovirus) 로 구성된 군으로부터 선택된 바이러스가 원인인, 방법.
  132. 개체에서 암을 치료하는 방법으로서, 개체에게 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포를, 개체에서 암을 치료하기에 효과적인 양으로, 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  133. 제132항의 방법에 있어서, 여기서 암은 MHC 유형 I 제시가 낮은 것을 포함하는, 방법.
  134. 제132항의 방법에 있어서, 여기서 암은 PD-1 반응성 종양 (PD-1 responsive tumor)을 포함하는, 방법.
  135. 제132항의 방법에 있어서, 여기서 암은 높은 돌연변이 부담을 가진 종양을 포함하는, 방법.
  136. 제132항의 방법에 있어서, 여기서 암은 폐암 (lung cancer), 간세포암 (hepatocellular cancer), 흑색종 (melanoma), 및 림프종 (lymphoma)으로부터 선택되는, 방법.
  137. 제132항의 방법에 있어서, 여기서 암은 림프종을 포함하고 및 림프종은 호츠킨스 림프종 (Hodgkin's lymphoma) 또는 비-호츠킨스 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma) 으로부터 선택되는, 방법.
  138. 개체에서 감염성 질환을 치료하는 방법으로서, 개체에게 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 세포를, 개체에서 감염성 질환을 치료하기에 효과적인 양으로, 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  139. 제138항의 방법에 있어서, 여기서 감염성 질환은 바이러스 감염이 원인인 감염성 질환인, 방법.
  140. 제139항의 방법에 있어서, 여기서 바이러스 감염은 MHC I 제시를 하향 조절하는 특징이 있는 바이러스 감염인, 방법.
  141. 제139항의 방법에 있어서, 여기서 바이러스 감염은 아데노바이러스 (adenovirus), 엡스타인 바 바이러스 (Epstein barr virus) (EBV), 간염 B 바이러스 (hepatitis B virus) (HBV), 결핵 (tuberculosis), 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus) (HIV), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus) (HSV), 파필로마 바이러스 (papilloma virus), 및 사이토메갈로 바이러스 (cytomegalovirus) 로 구성된 군으로부터 선택된 바이러스가 원인인 감염인, 방법.
  142. 면역 세포를 자극하도록 제작된 핵 제거된 적혈구 세포로서, 여기서 면역 세포는 실상 세포이고, 제작된 핵 제거된 세포의 표면에 두 개 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 두 개 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드는 하기의 과정;
    각 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 두 개 또는 그 이상의 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고; 및
    핵 있는 적혈구 세포를 핵 있는 적혈구 세포에서 핵이 제거되고 및 두 개 또는 그 이상의 외부 유래 자극 폴리펩티드가 생산되기에 적절한 조건하에서 배양하는 것을 포함하여 생산되어,
    면역 세포를 자극하기에 충분한, 핵 제거된 제작된 적혈구 세포.
  143. 제작된 핵 제거된 적혈구 세포로서, 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편이 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편에 링커에 의해 연결되어 형성된 IL-15/IL-15RA 융합을 포함하고, 이는:
    IL-15/IL-15RA 융합을 암호화하는 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고; 및
    핵 있는 적혈구 세포를 핵 있는 적혈구 세포에서 핵이 제거되기에 적절하고 및 IL-15/IL-15RA 융합이 생산되기에 적절한 조건하에서 배양하는 것을, 포함하는 과정으로 생산되는, 제작된 핵 제거된 적혈구 세포.
  144. 제작된 핵 제거된 적혈구 세포로서, 하기를 포함하고:
    i. 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편이 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편에 링커에 의해 연결되어 IL-15/IL-15RA 융합을 형성하고; 및
    ii.두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL, 또는 이의 단편을 포함하고,
    여기서 세포는 하기를 포함하는 과정:
    i. 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 첫 번째 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고;
    ii. 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 두 번째 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고; 및
    iii. 핵 있는 적혈구 세포를 핵 있는 적혈구 세포에서 핵이 제거되기에 적절하고 및 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드가 생산되기에 적절한 조건하에서 배양하는 과정을 거쳐 생산되는, 제작된 핵 제거된 적혈구 세포.
  145. 제작된 핵 제거된 적혈구 세포로서, 하기를 포함하고:
    i. 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-15 폴리펩티드, 또는 이의 단편이 IL-15RA 폴리펩티드의 세포 외 부분, 또는 이의 단편에 링커에 의해 연결되어 IL-15/IL-15RA 융합을 형성하고; 및
    ii. 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12, 또는 이의 단편을 포함하고,
    여기서 세포는 하기를 포함하는 과정:
    i. 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 첫 번째 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고;
    ii. 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 두 번째 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고; 및
    iii. 핵 있는 적혈구 세포를 핵 있는 적혈구 세포에서 핵이 제거되기에 적절하고 및 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드가 생산되기에 적절한 조건하에서 배양하는 과정을 거쳐 생산되는, 제작된 핵 제거된 적혈구 세포.
  146. 제작된 핵 제거된 적혈구 세포로서, 하기를 포함하고:
    i. 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, 여기서 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 4-1BBL, 또는 이의 단편을 포함하고; 및
    ii. 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드, 여기서 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드는 IL-12, 또는 이의 단편을 포함하고,
    여기서 세포는 하기를 포함하는 과정:
    i. 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 첫 번째 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고;
    ii. 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 두 번째 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고; 및
    iii. 핵 있는 적혈구 세포를 핵 있는 적혈구 세포에서 핵이 제거되기에 적절하고 및 첫 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드 및 두 번째 외부 유래 자극 폴리펩티드가 생산되기에 적절한 조건하에서 배양하는 과정을 거쳐 생산되는, 제작된 핵 제거된 적혈구 세포.
  147. 제143항 내지 제146항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 적혈구 세포로서, 여기서 도입 단계는 핵 있는 세포에 첫 번째 외부 유래 핵산 및 두 번째 외부 유래 핵산 둘 다를 포함하는 단일 렌티바이러스 벡터를 형질 감염시키는 것을 포함하는, 제작된 핵 제거된 적혈구 세포.
  148. 제143항 내지 제146항 중 어느 한 항의 제작된 핵 제거된 적혈구 세포로서, 여기서 도입 단계는 핵 있는 세포에 첫 번째 외부 유래 핵산을 포함하는 첫 번째 렌티바이러스 벡터 및 두 번째 외부 유래 핵산을 포함하는 두 번째 렌티바이러스 벡터 둘 다를 형질감염시키는 것을 포함하는, 제작된 핵 제거된 적혈구 세포.
  149. 제작된 핵 제거된 적혈구 세포로서, 제작된 핵 제거된 세포 표면에 적어도 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 포함하고 : IL-15/IL-15RA 융합, MHC 유형 I 체인-관련 단백질 A (MHC class I chain-related protein A) (MICA), MHC 유형 I 체인-관련 단백질 B (MHC class I chain-related protein B) (MICB) 및 인슐린-유사 성장 인자 (insulin-like growth factor 1) (IGF-1), 하기의 과정;
    적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드를 암호화하는 외부 유래 핵산을 핵 있는 적혈구 세포에 도입시키고; 및
    핵 있는 적혈구 세포를 핵 있는 적혈구 세포에서 핵이 제거되기에 적절하고 및 적어도 하나의 외부 유래 자극 폴리펩티드가 생산되기에 적절한 조건하에서 배양하는 것을 포함하는 과정에 의해 생산되는, 제작된 핵 제거된 적혈구 세포:
  150. 제142항 내지 제149항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 여기서 외부 유래 핵산은 DNA를 포함하는, 방법.
  151. 제142항 내지 제149항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 여기서 외부 유래 핵산은 RNA를 포함하는, 방법.
  152. 제142항 내지 제149항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 여기서 도입 단계는 바이러스 형질감염 (viral transduction) 을 포함하는, 방법.
  153. 제142항 내지 제149항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 여기서 도입 단계는 전기천공 (electroporation) 을 포함하는, 방법.
  154. 제142항 내지 제149항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 여기서 도입 단계는 하나 또는 그 이상의: 리포좀 매개하는 전달 (liposome mediated transfer), 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노-연관 바이러스 (adeno-associated virus), 헤르페스 바이러스 (herpes virus), 레트로바이러스 근거한 벡터 (retroviral based vector), 리포펙숀 (lipofection), 및 렌티바이러스 벡터 (lentiviral vector) 의사용을 포함하는, 방법.
  155. 제142항 내지 제149항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 여기서 도입 단계는 렌티바이러스 벡터의 형질감염 (transduction)에 의한 외부 유래 핵산의 도입을 포함하는, 방법.
  156. 제154항 또는 제155항의 방법에 있어서, 여기서 렌티바이러스 벡터는: 베타-글로빈 프로모터 (beta-globin promoter), 쥐 줄기세포 바이러스 ((murine stem cell virus (MSCV)) 프로모터, 깁슨 원숭이 백혈병 바이러스 (Gibbon ape leukemia virus) (GALV)) 프로모터, 인간 연장 인자 1 알파 (human elongation factor 1 alpha) (EF1alpha) 프로모터, CAG CMV 바로 조기 증강인자 (CAG CMV immediate early enhancer) 및 닭 베타-엑틴 chicken beta-actin) (CAG), 및 인간 포스포글리세레이트 키나아제 1 (human phosphorglycerate kinase 1) (PGK) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는, 렌티바이러스 벡터인, 방법.
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