CN111849896B - 一种car-nk细胞培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CAR‑NK细胞培养基及其应用，所述培养基为含有MICA和IL‑12的基础培养基。本发明采用含有MICA和IL‑12的基础培养基培养CAR‑NK细胞，不仅提高了CAR‑NK细胞的扩增数量，而且使CAR‑NK细胞保持良好的肿瘤细胞杀伤毒性，应用于肿瘤生物治疗。

Description

一种CAR-NK细胞培养基及其应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种CAR-NK细胞培养基及其应用。
背景技术
NK细胞(自然杀伤细胞，natural killer cell)又称大颗粒性淋巴细胞，与γδT细胞和NKT细胞共同发挥固有免疫和获得性免疫功能。一方面，当机体发生感染或创伤时，NK细胞以防御者的身份通过非肽-MHC的方式快速、广泛、特异识别抗原，及时清除病原微生物和变异细胞，发挥固有免疫作用；另一方面，NK细胞参与适应性免疫应答，影响αβT细胞和B细胞的效应功能。
在肿瘤的发生发展过程中，NK细胞既可以通过活化性受体识别肿瘤细胞被活化，又可以被单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等辅助细胞活化，上述辅助细胞通过模式识别受体应答内外环境的变化，再通过分泌可溶性因子或直接接触的方式将信号传递给NK细胞。
目前，制约NK细胞临床应用的主要障碍在于难以获得数量充足的NK细胞，在体外实现NK细胞的大规模扩增是NK细胞治疗要解决的关键问题。外周血中NK细胞数量少，而肿瘤病人的外周血中NK细胞的数量和活性明显下降，不同人的NK细胞的性质有很大差别。应用嵌合抗原受体(CAR)修饰NK细胞进行治疗肿瘤，对NK细胞的数量要求高。
现有技术存在着扩增后的NK细胞寿命短、活性不足等问题。因此，寻找更高效的NK细胞大规模扩增方法对NK细胞的临床应用有重大意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了CAR-NK细胞培养基及其应用，所述培养基具有多种活化NK细胞的配体，可以显著提高NK细胞的数量，延长NK细胞的寿命，提高NK细胞的活性。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种CAR-NK细胞培养基，所述培养基为含有MICA和IL-12的基础培养基。
本发明中，MICA是NK细胞表面最主要的活化性受体NKG2D的配体，对NK细胞具有显著的活化作用，IL-12主要由巨噬细胞和树状细胞产生，可以与NK细胞表面的IL-12受体结合，活化NK细胞；本发明采用含有MICA和IL-12的基础培养基培养CAR-NK细胞，不仅提高了CAR-NK细胞的扩增数量，而且使CAR-NK细胞保持良好的肿瘤细胞杀伤毒性，应用于肿瘤生物治疗。
优选地，所述IL-12包括IL-12A和IL-12B。
优选地，所述MICA包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQTFHVSAVAAAAIFVIIIFYVRCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTSDHRDATQLGFQPLMSDLGSTGSTEGA。
优选地，所述IL-12A包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2：
MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS。
优选地，所述IL-12B包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:3：
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS。
优选地，所述MICA的浓度为1～100ng/mL，例如可以是1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL。
优选地，所述IL-12A的浓度为1～100ng/mL，例如可以是1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL。
优选地，所述IL-12B的浓度为1～100ng/mL，例如可以是1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL。
优选地，所述培养基还包括IL-2。
优选地，所述IL-2的浓度为20～40U/mL，例如可以是20U/mL、21U/mL、22U/mL、23U/mL、24U/mL、25U/mL、26U/mL、27U/mL、28U/mL、29U/mL、30U/mL、31U/mL、32U/mL、33U/mL、34U/mL、35U/mL、36U/mL、37U/mL、38U/mL、39U/mL或40U/mL。
优选地，所述培养基还包括血清。
优选地，所述血清的体积百分比为1％～5％，例如可以是1％、2％、3％、4％或5％。
优选地，所述基础培养基包括Eagle培养液、RPMI-1640培养基或Ham’s F-10中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供了一种CAR-NK细胞培养方法，所述方法包括采用第一方面所述的培养基培养CAR-NK细胞的步骤。
优选地，所述CAR-NK细胞的接种密度为(1-5)×104/mL，例如可以是1×104/mL、2×104/mL、3×104/mL、4×104/mL或5×104/mL，优选为(1-3)×104/mL，进一步优选为2×104/mL。
优选地，所述培养的温度为35～40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为37℃。
优选地，所述培养的湿度为90％～98％，例如可以是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％，优选为92％～97％，进一步优选为95％。
作为优选技术方案，本发明提供了一种CAR-NK细胞培养方法，所述方法包括以下步骤：
采用含有1～100ng/mL MICA、1～100ng/mL IL-12A、1～100ng/mL IL-12B、20～40U/mL IL-2和1％～5％血清的基础培养基重悬CAR-NK细胞，使CAR-NK细胞的密度为(1-5)×104/mL；
将细胞悬液置于细胞培养皿中，在90％～98％湿度、35～40℃温度下培养，进行CAR-NK细胞扩增。
第三方面，本发明提供了一种CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞采用第二方面所述的方法制备得到。
第四方面，本发明提供了第三方面所述的CAR-NK细胞在制备肿瘤治疗药物和/或肿瘤预防药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用含有MICA、IL-12A和IL-12B的基础培养基培养CAR-NK细胞，MICA、IL-12A和IL-12B共同活化CAR-NK细胞，提高了CAR-NK细胞的扩增数量，培养2周后，细胞的数量增加到500倍；
(2)本发明培养的CAR-NK细胞具有良好的肿瘤细胞杀伤毒性，在肿瘤的生物治疗领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为CAR-NK细胞的扩增效率；
图2为CAR-NK细胞的杀伤效率。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例采用含有50ng/mL MICA、50ng/mL IL-12A、50ng/mL IL-12B、30U/mL IL-2和5％血清的RPMI-1640培养基重悬CAR-NK细胞，使CAR-NK细胞的密度为3×104/mL；
将细胞悬液置于细胞培养皿中，在95％湿度、37℃温度下培养，进行CAR-NK细胞扩增。
实施例2
采用含有80ng/mL MICA、75ng/mL IL-12A、75ng/mL IL-12B、25U/mL IL-2和4％血清的RPMI-1640培养基重悬CAR-NK细胞，使CAR-NK细胞的密度为2×104/mL；
将细胞悬液置于细胞培养皿中，在92％湿度、36℃温度下培养，进行CAR-NK细胞扩增。
实施例3
采用含有20ng/mL MICA、25ng/mL IL-12A、25ng/mL IL-12B、35U/mL IL-2和3％血清的RPMI-1640培养基重悬CAR-NK细胞，使CAR-NK细胞的密度为4×104/mL；
将细胞悬液置于细胞培养皿中，在97％湿度、38℃温度下培养，进行CAR-NK细胞扩增。
实施例4
采用含有1ng/mL MICA、1ng/mL IL-12A、1ng/mL IL-12B、20U/mL IL-2和2％血清的Eagle培养液重悬CAR-NK细胞，使CAR-NK细胞的密度为5×104/mL；
将细胞悬液置于细胞培养皿中，在90％湿度、35℃温度下培养，进行CAR-NK细胞扩增。
实施例5
采用含有100ng/mL MICA、100ng/mL IL-12A、100ng/mL IL-12B、40U/mL IL-2和1％血清的Ham’s F-10重悬CAR-NK细胞，使CAR-NK细胞的密度为1×104/mL；
将细胞悬液置于细胞培养皿中，在98％湿度、40℃温度下培养，进行CAR-NK细胞扩增。
对比例1
与实施例1相比，培养基中不含有MICA，具体如下：
采用含有50ng/mL IL-12A、50ng/mL IL-12B、30U/mL IL-2和5％血清的RPMI-1640培养基重悬CAR-NK细胞，使CAR-NK细胞的密度为3×104/mL；
将细胞悬液置于细胞培养皿中，在95％湿度、37℃温度下培养，进行CAR-NK细胞扩增。
对比例2
与实施例1相比，培养基中不含有IL-12A，具体如下：
本实施例采用含有50ng/mL MICA、50ng/mL IL-12B、30U/mL IL-2和5％血清的RPMI-1640培养基重悬CAR-NK细胞，使CAR-NK细胞的密度为3×104/mL；
将细胞悬液置于细胞培养皿中，在95％湿度、37℃温度下培养，进行CAR-NK细胞扩增。
对比例3
与实施例1相比，培养基中不含有IL-12B，具体如下：
本实施例采用含有50ng/mL MICA、50ng/mL IL-12A、30U/mL IL-2和5％血清的RPMI-1640培养基重悬CAR-NK细胞，使CAR-NK细胞的密度为3×104/mL；
将细胞悬液置于细胞培养皿中，在95％湿度、37℃温度下培养，进行CAR-NK细胞扩增。
对比例4
与实施例1相比，培养基中不含有MICA、IL-12A和IL-12B，具体如下：
本实施例采用含有30U/mL IL-2和5％血清的RPMI-1640培养基重悬CAR-NK细胞，使CAR-NK细胞的密度为3×104/mL；
将细胞悬液置于细胞培养皿中，在95％湿度、37℃温度下培养，进行CAR-NK细胞扩增。
CAR-NK的扩增效率
分别在第0天和第14天计数实施例和对比例的CAR-NK细胞的数量，计算14天内CAR-NK的扩增倍数。
结果如图1所示，实施例的CAR-NK细胞的扩增效率显著高于对比例，说明MICA、IL-12A和IL-12B共同配合促进了CAR-NK细胞的扩增；实施例1的培养基配方最优、培养条件最优，相较于其他实施例和对比例的CAR-NK细胞的扩增效率最高，14天后细胞数量增长了约500倍。
CAR-NK的杀伤效率
将实施例和对比例制备的CAR19-NK分别与1×104个CD19阳性细胞K562-CD19按E:T为1:1的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO2培养箱共培养18h；
18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较不同实施例和对比例制备的CAR-NK对K562-CD19的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：
100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)
结果如图2所示，实施例的CAR-NK细胞的杀伤效率也显著高于对比例，说明MICA、IL-12A和IL-12B共同配合不仅促进了CAR-NK细胞的扩增，而且增强了CAR-NK的杀伤作用；实施例1的培养基配方最优、培养条件最优，相较于其他实施例和对比例的CAR-NK细胞的杀伤效率最高。
综上所述，本发明采用含有MICA、IL-12A和IL-12B的基础培养基培养CAR-NK细胞，培养2周后，细胞的数量增加到500倍；培养的CAR-NK细胞具有良好的肿瘤细胞杀伤毒性，在肿瘤的生物治疗领域具有广泛的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司
<120> 一种CAR-NK细胞培养基及其应用
<130> 2020
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 383
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1 5 10 15
Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ala Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu
20 25 30
Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Thr Glu
35 40 45
Val His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys
50 55 60
Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys
65 70 75 80
Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu
85 90 95
Arg Met Thr Leu Ala His Ile Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser
100 105 110
Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg
115 120 125
Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn
130 135 140
Leu Glu Thr Lys Glu Trp Thr Met Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ala Met Asn Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr
165 170 175
Lys Thr His Tyr His Ala Met His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg
180 185 190
Arg Tyr Leu Lys Ser Gly Val Val Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Met
195 200 205
Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr
210 215 220
Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn Ile Thr Leu Ser Trp Arg
225 230 235 240
Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val
245 250 255
Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile
260 265 270
Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly
275 280 285
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Phe Val Ile Ile Ile Phe Tyr Val Arg Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser
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85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325

Claims (8)

1.一种CAR-NK细胞培养基，其特征在于，所述培养基为含有MICA和IL-12的基础培养基；
所述IL-12包括IL-12A和IL-12B；
所述MICA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述IL-12A的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述IL-12B的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述MICA的浓度为1～100ng/mL；
所述IL-12A的浓度为1～100ng/mL；
所述IL-12B的浓度为1～100ng/mL；
所述培养基还包括IL-2；
所述IL-2的浓度为20～40U/mL；
所述培养基还包括血清；
所述血清的体积百分比为1％～5％。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基包括Eagle培养液、RPMI-1640培养基或Ham’s F-10中的任意一种或至少两种的组合。
3.一种CAR-NK细胞培养方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1或2所述的培养基培养CAR-NK细胞的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述CAR-NK细胞的接种密度为1×104/mL～5×104/mL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CAR-NK细胞的接种密度为1×104/mL～3×104/mL。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养的温度为35～40℃。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养的湿度为90％～98％。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
采用含有1～100ng/mL MICA、1～100ng/mLIL-12A、1～100ng/mL IL-12B、20～40U/mLIL-2和1％～5％血清的基础培养基重悬CAR-NK细胞，使CAR-NK细胞的密度为1×104/mL～5×104/mL；
将细胞悬液置于细胞培养皿中，在90％～98％湿度、35～40℃温度下培养，进行CAR-NK细胞扩增。
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