CN110818803B

CN110818803B - 分泌表达il15ra-il15融合蛋白、ccl21趋化因子的嵌合抗原受体-t细胞及应用

Info

Publication number: CN110818803B
Application number: CN201910669740.7A
Authority: CN
Inventors: 高基民; 魏成; 赵爱
Original assignee: Zhejiang Kai Xin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Kai Xin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-07-24
Filing date: 2019-07-24
Publication date: 2023-01-03
Anticipated expiration: 2039-07-24
Also published as: CN110818803A

Abstract

本发明公开了一种分泌表达IL15RA‑IL15融合蛋白、CCL21趋化因子的嵌合抗原受体‑T细胞及应用。超级IL15能够促进T(尤其是记忆T)、NK、NKT细胞的活化和增殖，CCL‑21可以募集外周CCR7阳性的初始T细胞、记忆T细胞和DC(树突状细胞)进入淋巴组织或肿瘤病灶，进而激活机体内在的主动抗肿瘤免疫反应(如癌症记忆T细胞)，从而显著提高有效率和缓解率、降低治疗缓解后的复发率。

Description

分泌表达IL15RA-IL15融合蛋白、CCL21趋化因子的嵌合抗原受体-T细胞及应用

技术领域

本发明属于生物技术工程领域，具体涉及到第四代嵌合抗原受体(CAR)-T细胞(分泌表达IL15Rα(sushi domain)-IL15(N72D)融合蛋白和CCL21趋化因子)的构建与应用(主要以针对B细胞恶性肿瘤为例)。

背景技术

CAR-T疗法是一种以嵌合型抗原受体(CAR)为基础的细胞免疫疗法。通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(CAR)的基因序列转导入T细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。第四代CAR-T细胞通过完备的第一(肿瘤相关抗原)、第二(协同共刺激因子)和第三信号(如IL-7和CCL19)，能显著改善肿瘤病灶免疫抑制微环境，进而激活机体内在的主动抗肿瘤免疫反应，在多种实体瘤小鼠模型中实现了肿瘤完全消除。

近年来，靶向CD19的第二代CAR-T细胞治疗难治/复发性B细胞恶性肿瘤已在美国用于临床，其中急性B淋巴母细胞白血病完全缓解率70％以上、B细胞型非霍奇金淋巴瘤完全缓解率40％以上。但CAR-T疗法10-20％初治无效、30-50％完全缓解后一年内复发，且对实体瘤疗效不佳，主要原因是CAR-T细胞在体内持续时间短、免疫逃逸、肿瘤病灶免疫抑制微环境等。

发明内容

为解决上述背景技术中的问题和缺陷，本发明针对CAR-T疗法初始治疗无效、易复发等难题，发明了一种分泌表达IL15RA-IL15(N72D)融合蛋白、CCL21趋化因子的嵌合抗原受体-T细胞(以靶向CD19的第四代CAR-T为例)，从而显著提高有效率和缓解率、降低复发率。

通过基因工程技术构建plenti-CD19-IL15Rα(sushi domain)-IL15-CCL21质粒载体，然后利用高滴度，高纯度的慢病毒规模化生产工艺包装出慢病毒载体以转导T细胞，培养五天后通过流式分别检测anti-CD19 CAR的表达率，体外验证CAR-T细胞对表达CD19阳性细胞的体外杀伤作用。

编码的第四代嵌合抗原受体，包括作为第一信号的抗原结合结构域、跨膜结构域和作为第二信号的细胞内传导结构域，以及作为第三信号的IL15RA-IL15融合蛋白和CCL21趋化因子，所述的IL15RA-IL15融合蛋白由SEQ ID NO.1所示用于编码IL15RA的核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示用于编码连接块的核苷酸序列以及SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列共同编码形成，所述的CCL21趋化因子由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列编码得到。

本申请所述的SEQ ID NO.1核苷酸序列是基于人源IL15RA；SEQ ID NO.3核苷酸序列为基于人源IL15的成熟体72位氨基酸N-D突变。

与现有技术相比，本发明涉及如下优点：

1.本发明中的第四代CAR-T细胞分泌IL15Rα(sushi domain)-IL15(N72D)融合蛋白(见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3的核苷酸序列编码，或SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8氨基酸序列)，该超级IL15促进T(尤其是记忆T)、NK、NKT细胞的活化和增殖。

2.本发明中的第四代CAR-T细胞分泌CCL21(见SEQ ID NO.5核苷酸序列编码，或SEQ ID NO.10氨基酸序列)，能募集外周CCR7阳性的初始T细胞、记忆T细胞、以及DC进入淋巴组织或肿瘤病灶，进而激活机体内在的主动抗肿瘤免疫反应。

3.本发明中的第四代CAR-T细胞分泌的IL15Rα(sushi domain)-IL15融合蛋白和CCL21由2A自剪切肽连接。SEQ ID NO.4的核苷酸序列编码或SEQ ID NO.9的氨基酸序列。

本发明中的第四代CAR-T细胞在CD3ζ传导的第一信号和4-1BB共刺激分子传导的第二信号的基础上，选择15RA-IL15(N72D)融合蛋白(所谓超级IL-15)和CCL-21趋化因子作为第三信号。超级IL15能够促进T(尤其是记忆T)、NK、NKT细胞的活化和增殖，CCL-21可以募集外周CCR7阳性的初始T细胞、记忆T细胞、和DC(树突状细胞)进入淋巴组织或肿瘤病灶，进而激活机体内在的主动抗肿瘤免疫反应(如癌症记忆T细胞)，从而显著提高有效率和缓解率、降低治疗缓解后的复发率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1是靶向CD19的第四代CAR的示意图；

图2是利用第三代慢病毒包装体系制备CAR病毒颗粒，以MOI＝40感染人原代T细胞，流式细胞术检测anti-CD19 CAR在T细胞膜上的表达情况；

图3是表达荧光素酶以及GFP荧光报告基因的Raji细胞株的成功构建；

图4是通过荧光素酶法体外验证不同效靶比条件下anti-CD19 CAR，anti-CD19CAR-IL15Rα(sushi domain)-IL15，anti-CD19 CAR-CCL21，anti-CD19 CAR-IL15Rα(sushidomain)-IL15-CCL21这四种第四代CAR-T细胞对表达荧光素酶的Raji细胞的杀伤活性；

图5是通过构建表达荧光素酶的Raji细胞，然后通过尾静脉注射小鼠体内成瘤，然后分别注射不同的CAR-T细胞验证anti-CD19 CAR-IL15Rα(sushi domain)-IL15-CCL21CAR-T细胞杀伤活性优于二代CAR-T细胞。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例

主要实验材料：

EcoRI-HF、MluI-HF、NdeI限制性内切酶(NEB公司)，无缝克隆酶(和元生物)，高保真Prime GXL STAR酶(TAKARA公司)，TransStbl3感受态细胞(全式金生物科技有限公司)，Plasmid Mini Kit I(OMEGA)，

Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)，DMEM、RPMI-1640、Opti-MEM培养基、Gibco FBS(Thermo Fisher Scientific)，Sanger测序(上海桑尼生物有限公司)，Nacl、酵母粉、蛋白胨、EDTA、NaOH(上海生工生物工程股份有限公司)，引物(江苏金唯智生物科技有限公司)。

一、构建重组质粒

①构建Plenti-anti-CD19 CAR-IL15Rα(sushi domain)-IL15-CCL21重组质粒：IL15Rα(sushi domain)-IL15-CCL21(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5核苷酸序列首尾连接)，使用Ndel和MluI-HF双酶切plenti-EF1a-anti-CD19CAR载体以及合成的IL15Rα(sushi domain)-IL15-CCL21基因，使其双方均带有Ndel和MluI粘性末端，反应条件为37℃3h，65℃20min，酶切体系如表3。酶切产物经过1％琼脂糖凝胶电泳获得载体片段，然后用XYGENE胶回收试剂盒回收Plenti载体片段以及IL15Rα(sushidomain)-IL15-CCL21(操作步骤见下表1)，检测浓度和纯度。载体片段和目的片段通过T4克隆(体系如表2)，16℃16-24h，65℃10min，然后进行质粒转化(T4克隆产物在冰上放置5min后，将其转入50ul TransStbl3感受态中，冰上放置30min，42℃45s，再冰上5min，加入500ulLB，在37℃，225rpm/min摇床中活化1h，然后5000rpm/min 20℃离心5min，弃去上清，将剩余菌液混匀后涂板，37℃培养12-14小时)。挑单克隆菌落进行菌液扩增37℃，250rpm/min，12h-14h，质粒提取，最终用AFLII-HF限制性内切酶酶切鉴定，最后进行Sanger测序。

表1.胶回收

表2.T4克隆体系

表3.限制性酶切体系

二、利用Plenti载体质粒及辅助质粒转导293T细胞以包装慢病毒，并将包装出的慢病毒转染Jurkat Cell以计算病毒滴度

(1)在15cm细胞皿中培养293T细胞，等待293T细胞长满至全视野70％时，用1.5mlPBS重悬60ugPEI，1.5ml PBS重悬总质量为20ug的Plenti载体质粒及辅助质粒；

(2)室温静置5min，将PBS-PEI混合液加至PBS-DNA混合液中，室温静置20min；

(3)准备OPTI-DMEM全培于37℃培养箱中复温，吸弃293T细胞中的DMEM原培养基，将OPTI-DMEM沿皿壁加入到293T细胞；

(4)将PEI-DNA-PBS混合液加至培养皿中，37℃培养48h；

(5)收集上清液中的慢病毒于50ml离心管，再加20ml培养基孵育24h，以收集72h内的病毒；

(6)1500rpm离心5min去除细胞碎片，或用针筒通过0.45um过滤器过滤后，3000×g离心12-14h，4℃以浓缩病毒；

(7)吸弃上清，以1:200-1:400加入Vivo全培或AIM-V全培(最好加1％HEPES)，重悬病毒；

(8)将病毒分装于1.5ml Ep管中，保存于-80℃，避免反复冻融(冻融使滴度降低一个数量级)，剩少许病毒用于下步的病毒滴度检测实验；

(9)jurkat细胞1500rpm离心5min后，弃上清，1ml 1640培养基重悬，计数；(10)于96孔板中加入0.5x10⁶jurkat细胞，以1:50、1:500、1:1000、1:2000等梯度比例加入病毒，再补充培养基至每孔总体积为200ul；

(11)每孔加入0.1ul PolybreneB蛋白促转导(0.1ul/200ul体系)；

(12)将96孔板经1200g，90min，32℃离心，离心后，于37℃培养箱孵育4h；

(13)将96孔板各孔的jurkat细胞悬液吹打混匀后转至1.5mlEp管中，1500rpm离心5min后，弃上清，用1ml 1640全培重悬后转至24孔板中扩大培养48h，37℃。

三、密度梯度离心法分离健康人的外周血单个核细胞(PBMC)，慢病毒转染T细胞并检测T细胞表面CAR表达情况

(1)取健康人外周血10ml至EDTA-Na2抗凝管，与DPBS按照1:1的比例混匀；

(2)取四只15ml无菌离心管，分别加入5ml Ficoll分离液，将外周血与DPBS的混合液缓慢加至Ficoll分离液面上，注意不要破坏液面；

(3)水平离心800g，20min，25℃，加减速度均调到“0”；

(4)离心后用巴氏吸管将离心管中的白色絮状层即PBMC层吸出，置于新的无菌离心管中，加入PBS，将PBMC离心洗两遍；

(5)1500rpm/min，5min水平离心，弃掉上清,加入1ml Buffer1(DPBS含5％FBS)重悬计数PBMC；

(6)用流式细胞术确定PBMC中CD3阳性细胞的比例。在细胞悬液中以CD3/CD28dynabeads:CD3阳性细胞＝3:1的比例加入CD3/CD28beads(106个CD3阳性细胞加30ulbeads)，4℃以1rpm速度旋转摇晃30min使磁株与细胞充分接触结合；

(7)30分钟以后，在试管中加足够(大于1ml)Buffer1，然后把试管放于磁力架上左右旋转1～2分钟，吸弃上清；

(8)配制Vivo完全培养基：Vivo空培+5％FBS+1％HEPES+1％丙酮酸钠+1％非必需氨基酸+1:30谷氨酰胺+1:10000IL-2+1:2000IL-7+1:2000IL-15，并用Vivo全培重悬细胞与磁珠，计数；

(9)加培养基使CD3阳性细胞浓度在0.5-1x106/ml之间。铺板细胞浓度为0.5～1.0×106/ml，置于37℃培养箱培养；

(10)T细胞培养24-36h，5％CO2，37℃；

(11)在24-36h内，以MOI值＝5、20、40、80转导CAR慢病毒载体，MOI(病毒感染复数)＝[病毒滴度x病毒体积(ml)]/细胞数；

(12)1200xg，90min，4℃离心后，在37℃培养箱孵育至96孔板长满细胞后转至24孔板中，1,3,5日计数监测细胞生长状况，绘其生长曲线，5-7天时测CAR转导率。结果如图2所示。

四，Raji-Luc细胞系建立。

Raji细胞转导表达luc-GFP慢病毒，第二天观察其GFP绿色荧光表达情况，继续培养，最后通过流式细胞术分选GFP阳性细胞，进一步进行培养，最后分析，结果如图3所示。

五.通过荧光素酶法检测CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用

(1)培养Raji-Luc-GFP细胞至对数生长状态，取一定细胞数离心沉淀后计数；

(2)96孔平底不透明白板中加入10⁴个Raji-Luc-GFP细胞，培养基补充至100uL；

(2)anti-CD19 CAR，anti-CD19 CAR-IL15Rα(sushi domain)-IL15，anti-CD19CAR-CCL21，anti-CD19 CAR-IL15Rα(sushi domain)-IL15-CCL21四种第四代CAR-T细胞与Raji-Luc-GFP细胞数比例设定为5:1、10:1、20:1，将相应的CAR-T细胞加入每孔混合培养；

(4)设置Mock细胞组，T细胞的数目与上述(3)中CAR-T细胞数相同；

(5)同时设置两个对照，阴性对照为CD19-Luc-HT1376细胞在培养基中培养；阳性对照为在培养基加入2.5％的Triton-X 100，两者均不加Mock细胞或CAR-T细胞，作为细胞杀伤的最小和最大化背景值，即Kmin和Kmax。

(6)培养4小时后，96孔板以1500rpm速度离心5min，弃掉上清，用培养基洗一次后重悬细胞；

(7)每孔加入0.5mM的D-荧光素，避光静置10min后，在酶标仪用化学发光模式(Luminometric Measurement)检测荧光强度，每孔检测时间为1000ms；

(8)统计各孔的荧光强度值K，比较CAR-T与Mock细胞对Raji-Luc-GFP细胞的杀伤效率％，计算公式为：杀伤效率％＝(Kmin-K)/(Kmin-Kmax)x100％，结果如图4所示。

六.小鼠白血病模型建立1)将转导了luciferase的Raji细胞用PBS洗三遍后，用PBS重悬，显微镜下计数，将细胞调至20M/ml的浓度。2)将5～6周龄的雌性NSG小鼠从笼内取出，固定于小鼠固定器上。3)用酒精棉球轻轻擦拭小鼠尾静脉，使其充盈。4)用一次性的胰岛素注射器沿尾静脉进针，将4M的细胞缓慢推入尾静脉中。5)按压注射器针孔几分钟至针孔不再出血。6)将小鼠放回笼中，定期观察。结果如图5所示

七.生物发光成像1)将仪器及电脑打开，进入软件2)启动麻醉机：检查麻醉剂罐内药品量，打开氧气罐，调节氧流量至1.5L，将诱导麻醉流量计开至最大，挥发罐的浓度调至5％，开始废气吸收装置。3)小鼠腹腔注射底物(200ul底物/只)，3min后将小鼠放入麻醉室进行麻醉。4)待小鼠呼吸平稳后，将小鼠放至成像室进行成像。

八.统计学分析所有实验数据均以均数±标准差(±SD)表示，组间比较采用t检验，P<0.05表示差异显著，具有统计学意义。作图采用Graphpad prism6.0软件。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 浙江启新生物技术有限公司

<120> 分泌表达IL15RA-IL15融合蛋白、CCL21趋化因子的嵌合抗原受体-T细胞及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggccccgc ggcgggcgcg cggctgccgg accctcggtc tcccggcgct gctactgctg 60

ctgctgctcc ggccgccggc gacgcggggc atcacgtgcc ctccccccat gtccgtggaa 120

cacgcagaca tctgggtcaa gagctacagc ttgtactcca gggagcggta catttgtaac 180

tctggtttca agcgtaaagc cggcacgtcc agcctgacgg agtgcgtgtt gaacaaggcc 240

acgaatgtcg cccactggac aacccccagt ctcaaatgca ttaga 285

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cagcttgcaa 60

<210> 3

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aactgggtca acgtgatcag cgatctgaag aagatcgagg atctgatcca gtccatgcac 60

attgacgcta ccctctatac cgagtccgat gtccatccta gctgcaaggt caccgccatg 120

aagtgctttc tgctggagct gcaagtgatc tctctggaga gcggcgatgc ctccattcac 180

gacaccgtgg agaacctcat cattctggcc aacgactctc tgtcctccaa cggcaatgtc 240

accgaatccg gctgtaagga gtgtgaggag ctggaggaga agaacatcaa ggagtttctg 300

cagtccttcg tccatatcgt gcagatgttc atcaacacct cc 342

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaagcggcg aaggcagagg ctctctgctg acatgtggcg atgtggagga aaaccccggc 60

cct 63

<210> 5

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcccagt ctctggctct gtctctgctg attctggtgc tggccttcgg catccctaga 60

acacaaggca gcgacggcgg cgctcaagac tgctgtctga agtactccca gaggaagatc 120

cccgccaagg tggtgaggtc ctacagaaag caagagccct ctctgggatg cagcatcccc 180

gccattctgt ttctgcctag aaagaggagc caagccgagc tgtgcgctga ccctaaggag 240

ctgtgggtgc agcagctgat gcagcatctg gataagacac ccagccctca gaagcccgcc 300

caaggctgca gaaaggatag aggcgccagc aagaccggca agaagggcaa gggctccaag 360

ggctgcaaga ggaccgagag aagccagacc cctaagggcc cttga 405

<210> 6

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ala Pro Arg Arg Ala Arg Gly Cys Arg Thr Leu Gly Leu Pro Ala

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Pro Pro Ala Thr Arg Gly Ile Thr

20 25 30

Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser

35 40 45

Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys

50 55 60

Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala

65 70 75 80

Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg

85 90 95

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Gln

20

<210> 8

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1 5 10 15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

20 25 30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

35 40 45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

50 55 60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65 70 75 80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

85 90 95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

100 105 110

Thr Ser

<210> 9

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 10

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe

1 5 10 15

Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys

20 25 30

Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr

35 40 45

Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe

50 55 60

Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu

65 70 75 80

Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro

85 90 95

Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr

100 105 110

Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser

115 120 125

Gln Thr Pro Lys Gly Pro

130

Claims

1.编码的第四代嵌合抗原受体，其特征在于：包括作为第一信号的抗原结合结构域、跨膜结构域和作为第二信号的细胞内传导结构域，以及作为第三信号的IL15RA-IL15融合蛋白和 CCL21趋化因子，所述的IL15RA-IL15融合蛋白由SEQ ID NO.1所示用于编码IL15RA的核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示用于编码连接块的核苷酸序列以及SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列共同编码形成，所述的CCL21趋化因子由SEQ ID NO.5 所示的核苷酸序列编码得到，IL15RA-IL15融合蛋白和CCL21由2A自剪切肽连接，该2A自剪切肽由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列编码；所述IL15RA-IL15能够促进T、NK、NKT细胞的活化和增殖，CCL-21可以募集外周CCR7阳性的初始T细胞、记忆T细胞、和树突状细胞进入淋巴组织或肿瘤病灶，进而激活机体内在的主动抗肿瘤免疫反应。

2.一种分泌表达IL15RA-IL15融合蛋白、CCL21趋化因子的嵌合抗原受体-T细胞，其特征在于：其表达一种如权利要求1所述的嵌合抗原受体。