TW202413632A

TW202413632A - 工程化免疫細胞

Info

Publication number: TW202413632A
Application number: TW112127831A
Authority: TW
Inventors: 立峰張; 竇浪; 李思; 馮俊杰; 蘇震波
Original assignee: 大陸商廣東天科雅生物醫藥科技有限公司; 美商天科雅生物醫藥有限公司
Priority date: 2022-07-25
Filing date: 2023-07-25
Publication date: 2024-04-01

Abstract

本公開涉及表現細胞膜結合的IL15的工程化免疫細胞(例如，臍帶血來源的NK細胞)，該細胞膜結合的IL15可以促進自主生長(例如，在不存在支持細胞介素的情況下)和持久性。在一些實施方案中，所述免疫細胞還可以表現和/或分泌能夠與靶細胞(例如，癌細胞)上的抗原/受體特異性結合的抗體或肽體，所述靶細胞可以經由Fc介導的ADCC/ADCP/CDC活性來清除。

Description

工程化免疫細胞

優先權的要求

本申請要求2022年7月25日提交的申請號為63/392,016的美國臨時申請的權益。前述申請的全部內容藉由引用併入本文。發明領域

本發明係有關於工程化免疫細胞。

使用靶向B細胞表面上的CD19的自體CAR-T細胞在B細胞相關腫瘤的治療中取得了開創性的臨床成功，從而拉開了基於基因和細胞的藥物設計新紀元的序幕。CAR-T細胞攜帶被稱為“嵌合抗原受體”(CAR)的人工蛋白質，該CAR是藉由將用於識別靶點的所選抗體的抗原識別結構域與用於活化T細胞的所選細胞內訊息結構域相組合而工程改造的。將CAR導入T細胞中，使所述細胞具有識別預選的癌症靶點的能力。由於免疫排斥，如果沒有進一步操作，基於T細胞的療法通常是自體的，這意味著藥物細胞無法作為現成的藥物出售，而是要以昂貴、緩慢、繁瑣和低效的方式一次一例地提供治療服務。而且，各個樣本之間也難以保持品質一致性。這是當前CAR-T技術所面臨的緊迫問題。

自然殺手(NK)細胞是具有細胞毒性且適合同種異體使用的先天性淋巴細胞，來自文獻和臨床試驗的大量證據已經證明了NK細胞在同種異體使用中的安全性。NK細胞的成藥性已在Liu E等人, Use of CAR-Transduced Natural Killer Cells in CD19-Positive Lymphoid Tumors. N Engl J Med2020; 382:545-553中得到證明，其中針對CD19的臍帶血來源的CAR-NK細胞在治療B細胞相關腫瘤方面顯示出強大的臨床療效。即使在低至1 × 10 ⁵個細胞/千克體重的藥物劑量下，也觀察到完全緩解(CR)的病例。儘管長期臨床結果仍有待證實，但數據顯示，至少在短期內，CAR-NK細胞的臨床療效與CAR-T細胞相當。同時，與CAR-T相比，CAR-NK在治療中出現的不良事件水平更低。

NK細胞是抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的效應細胞。CD16是成熟NK細胞的細胞表面蛋白，作為Fc受體起作用，它識別抗體的片段可結晶(Fc)區，並且使NK細胞能夠透過抗體的引導來識別靶細胞。相比之下，T細胞不具備ADCC能力。

T細胞可形成免疫記憶，因此在輸注後能夠長期存在，相比之下，NK細胞無法形成類似記憶的強免疫反應，因此在輸注後無法長期存活。若干細胞介素，例如介白素，如IL-2、IL-15、IL-12、IL-21和IL-18，已被用於在體外擴增初代NK細胞。然而，這些細胞介素的使用具有以下不足。首先，這些細胞介素的半衰期通常極短。其次，這些細胞介素中的大多數(如果不是全部的話)需要間接的且看似迂迴的訊息呈現機制才能發揮作用。這些不足使得在培養和/或擴增時必須經常重新應用這些細胞介素，從而導致品質不一致，對以這種方式培養的NK細胞的成藥性產生負面影響。

本公開提供了工程化免疫細胞(例如，NK細胞)，其在體外能夠自主生長並具有長期持久性，使得這些細胞可以作為理想的現成和/或同種異體細胞藥物平台。在一些實施方案中，所述免疫細胞可以表現工程化的細胞膜結合的IL15，其藉由將細胞介素配體IL15與膜結合的部分(例如，IL15受體α次單位(即，IL15Rα))融合而獲得。即使在不存在細胞介素補充劑(例如，IL-2、IL-15等)的情況下，在免疫細胞的細胞膜上，工程化的膜結合IL15也能直接活化下游細胞介素訊息路徑，其實現可能是由於工程化的膜結合IL15-IL15Rα與IL15訊息複合物的另外兩個次單位形成功能性複合物的能力，所述另外兩個次單位包括β次單位(“IL15Rβ”，其實質上是IL-2受體的β次單位或“IL2Rβ”；IL15Rβ和IL2Rβ這兩個術語被認為在整個公開內容中可以互換)和γ次單位(IL15Rγ，其實質上是IL-2受體的γ次單位或IL2Rγ或γC；術語IL15Rγ、IL2Rγ和γC被認為在整個公開內容中可以互換)。

本公開還提供了表現和/或分泌一種或多種含Fc的抗體和/或含Fc的肽體(peptibodies)的工程化免疫細胞(例如，NK細胞)，所述抗體和/或肽體能夠選擇性地識別並結合在一種或多種靶細胞(例如，癌細胞)上特異性表現的相應的細胞表面靶分子。在一些實施方案中，所述細胞可以表現抗PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如，scFv)，或與IL13Rα2特異性結合的配體多肽。當分泌時，此類分子可以標記靶細胞，並募集免疫細胞(例如，NK細胞)以經由ADCC、ADCP和/或CDC活性特異性地清除靶細胞(例如，癌細胞)。

在一方面，本公開涉及一種工程化免疫細胞，其表現包含介白素15(IL15)結構域和介白素15受體α次單位(IL15Rα)結構域的嵌合多肽。在一些實施方案中，當表現時，所述嵌合多肽是細胞膜結合的，並且當所述工程化免疫細胞群體在體外培養時，在沒有任何支持細胞介素的情況下培養至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天、至少31天、至少32天、至少33天、至少34天或至少35天後，其細胞總數保持增加或基本不變。

如本文所用的，“支持細胞介素”或“支持細胞介素補充劑”可包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-21和IL-18中的任一種，或它們的任何組合。

如本文所用的，片語“保持基本不變”是指與參考培養第0天的細胞總數(N ₀)相比，培養第 i天( i＞ 0)的細胞總數(N _i)在N0的方差的10%以內，即，N _i在N ₀的90%-110%以內；片語“保持增加”、“保持較高”、“保持升高”或類似片語是指N _i＞N ₀的110%；而片語“保持減少”、“保持較低”或類似片語是指N _i＜N ₀的90%。

在一些實施方案中，當表現時，所述嵌合多肽能夠與介白素15受體β次單位(IL15Rβ，其實質上是IL2Rβ)和介白素15受體γ次單位(IL15Rγ，其實質上是IL2Rγ或γC)可操作地形成功能性複合物，從而能夠在不存在IL-2或IL-15的情況下活化所述工程化免疫細胞中的下游γC訊息傳導。

在一些實施方案中，所述免疫細胞是自然殺手(NK)細胞、T細胞或腫瘤浸潤細胞(TIL)，優選NK細胞。在一些實施方案中，所述免疫細胞是NK細胞。在一些實施方案中，所述工程化免疫細胞當在體外培養時能夠自主生長。在一些實施方案中，所述IL15結構域具有與SEQ ID NO: 2至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述IL15結構域在與SEQ ID NO: 2的Asn72相對應的位置處包含Asp殘基。在一些實施方案中，所述IL15結構域具有與SEQ ID NO: 3至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述IL15Rα結構域具有與SEQ ID NO: 5至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述IL15結構域和所述IL15α結構域經由工程化連接子融合，在一些實施方案中，所述工程化連接子包含與SEQ ID NO: 4至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述嵌合多肽包含與SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，當所述免疫細胞的群體在體外培養時，在沒有任何支持細胞介素的情況下培養至少35天後，其細胞總數可能保持基本不變。在一些實施方案中，所述NK細胞從臍帶血獲得。

在一些實施方案中，所述工程化免疫細胞可以進一步表現和/或分泌一種或多種多肽，每種所述多肽都包含靶標結合域，在一些實施方案中，所述靶標結合域能夠特異性識別並結合在靶細胞的細胞表面上表現或呈現的靶分子。在一些實施方案中，所述一種或多種多肽中的每種多肽進一步包含Fc結構域，在一些實施方案中，所述Fc結構域能夠介導對於所述工程化免疫細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。在一些實施方案中，所述Fc結構域包含根據EU編號的Ser239Asp、Ala330Leu、Ile332Glu、Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile、Pro396Leu、Met428Leu或Asn434Ser中的至少一種。在一些實施方案中，所述Fc結構域包含以下至少一組：(a)Ser239Asp、Ala330Leu和Ile332Glu；(b)Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile和Pro396Leu；或(c)Met428Leu和Asn434Ser。在一些實施方案中，所述Fc結構域包含Ser239Asp、Ala330Leu、Ile332Glu、Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile、Pro396Leu、Met428Leu和Asn434Ser的組合。

在一些實施方案中，所述一種或多種多肽中的每種多肽進一步包含經由第一柔性連接子(flexible linker)在所述抗原結合域的N末端或所述Fc結構域的C末端融合的第一掩蔽肽(masking peptide)，在一些實施方案中，所述第一掩蔽肽被配置為阻斷所述多肽的所述Fc結構域，並且所述第一柔性連接子被配置為在靶組織中可裂解。在一些實施方案中，所述靶組織是腫瘤組織，並且所述第一柔性連接子被配置為可被基質金屬蛋白酶1(MMP1)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、基質金屬蛋白酶3(MMP3)、基質金屬蛋白酶7(MMP7)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)和/或基質金屬蛋白酶14(MMP14)降解。在一些實施方案中，所述第一柔性連接子被配置為可被MMP9降解，並且所述第一柔性連接子具有選自SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 27的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述第一柔性連接子被配置為可被外源提供給所述靶組織的蛋白酶降解。在一些實施方案中，所述一種或多種多肽中的每種多肽進一步包含經由第二柔性連接子在所述抗原結合域的N末端或所述Fc結構域的C末端融合的第二掩蔽肽，在一些實施方案中，所述第二掩蔽肽被配置為阻斷所述多肽的所述抗原結合域，並且所述第二柔性連接子被配置為在靶組織中可裂解。在一些實施方案中，所述靶組織是腫瘤組織，並且所述第二柔性連接子被配置為可被MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9或MMP14降解。在一些實施方案中，所述第二柔性連接子被配置為可被MMP9降解，並且所述第二柔性連接子具有選自SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 27的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述第二柔性連接子被配置為可被外源提供給所述靶組織的蛋白酶降解。

在一些實施方案中，所述一種或多種多肽包含抗體或其抗原結合片段，在一些實施方案中，所述靶標結合域是抗原結合域，該抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)結構域或單個單體可變抗體結構域。在一些實施方案中，所述靶分子選自PD-L1、BCMA、Caudin18.2、CCR4、CD10、CD123、CD147、CD171、CD19、CD20、CD22、CD276、CD319、CD33、CD38、CD70、CLL-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、FLT3、FRα、GD2、GPC3、HER2、HGFR、IL13Ralpha2、間皮素、MG7、MUC1、MUC16、黏連蛋白4 (Nectin4)、PSCA、ROR1、ROR2、TACI、TRBC1、TSLPR和VEGFR。在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段是抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含scFv結構域，在一些實施方案中，所述scFv結構域包含具有與SEQ ID NO: 9至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VL結構域，並且/或者包含具有與SEQ ID NO: 10至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VH結構域。在一些實施方案中，所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的所述scFv結構域包含與SEQ ID NO: 12至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含scFv結構域，在一些實施方案中，所述scFv結構域包含具有與SEQ ID NO: 13至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VL結構域，並且/或者包含具有與SEQ ID NO: 14至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VH結構域。在一些實施方案中，所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的所述scFv結構域具有與SEQ ID NO: 15至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。

在一些實施方案中，所述一種或多種多肽包含肽體，在一些實施方案中，所述靶標結合域包含配體多肽。在一些實施方案中，所述靶分子是所述配體多肽能夠特異性識別並結合的受體，在一些實施方案中，所述受體選自IL13Rα2、APN/CD13、APP、PD-L1、CD44、P32/gC1qR、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、CD21、EGFR、Epha2、EphB4、HER2、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、VEGFR1、VEGFR3、PSMA、GPC3、IL-10RA、IL-11Rα、IL-6Rα、GP130、VEGFR2、MUC18、Met、MMP9、Thomsen-Friedenreich碳水化合物抗原、NRP-1、PDGFRβ、CD133、PTPRJ、HSPG、E-選擇蛋白、Tie2、VPAC1、ActRIIB、CD163、CXCR4、肝配蛋白A4 (Ephrin A4)、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2、肝配蛋白B3、促性腺素釋放激素受體、G蛋白偶聯受體55、鈴蟾肽受體2、IL4受體、低密度脂蛋白受體、瘦素受體、LRP1、黑皮質素1受體、黑皮質素4受體、CD206、尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物受體、神經激肽-1受體、VPAC2、ITGB1、CD27、ITGB5、ITGA1、CD27、LRP1、ACVR2B、COL13A1、NOTCH3、EGFR、VEGFR2、VEGFR3、PDGFR、HER2、ErbB3、ErbB4、RET和FGFR102。在一些實施方案中，所述肽體是抗IL13Rα2肽體，在一些實施方案中，其配體多肽包含與SEQ ID NO: 21至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述配體多肽包含一個或多個與SEQ ID NO: 21的位置11、90、107、103和108-111相對應的置換。在一些實施方案中，所述配體多肽在與SEQ ID NO: 21的Glu11相對應的位置處包含Tyr殘基。在一些實施方案中，所述配體多肽包含與SEQ ID NO: 22至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述配體多肽包含配體模擬肽和/或人工肽。

在一方面，本公開涉及一種用於治療有需要的受試者的癌症的藥物組合物，其包含：治療有效數量的如本文所述的工程化免疫細胞；以及藥學上可接受的佐劑。

在一方面，本公開涉及一種用於治療有需要的受試者的癌症的方法，其包括：向所述受試者施用治療有效數量的如本文所述的工程化免疫細胞。

在一方面，本公開涉及一種用於獲得體外培養的免疫細胞的自主生長的方法，其包括：將編碼包含介白素15(IL15)結構域和介白素15受體α次單位(IL15Rα)結構域的嵌合多肽的轉基因轉導到所述免疫細胞中，使得當在所述免疫細胞中表現時，所述嵌合多肽是細胞膜結合的並且與介白素15受體β次單位(IL15Rβ)和介白素15受體γ次單位(IL15Rγ)可操作地形成功能性複合物，在一些實施方案中，所述轉導的免疫細胞的特徵是，在沒有任何支持細胞介素的情況下培養至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天、至少31天、至少32天、至少33天、至少34天或至少35天後，其細胞總數可能保持較高或基本不變。在一些實施方案中，所述免疫細胞是自然殺手(NK)細胞、T細胞或腫瘤浸潤細胞(TIL)。在一些實施方案中，所述免疫細胞是NK細胞。在一些實施方案中，所述IL15結構域具有與SEQ ID NO: 2至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述IL15結構域在與SEQ ID NO: 2的Asn72相對應的位置處包含Asp殘基。在一些實施方案中，所述IL15結構域具有與SEQ ID NO: 3至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述IL15Rα結構域具有與SEQ ID NO: 5至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述IL15結構域和所述IL15α結構域經由工程化連接子融合，在一些實施方案中，所述工程化連接子具有與SEQ ID NO: 4至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述嵌合多肽具有與SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，在轉導後，在沒有任何支持細胞介素的情況下培養至少35天後，所述轉導的NK細胞的細胞總數保持較高或基本不變。在一些實施方案中，所述NK細胞從臍帶血獲得。

在一方面，本公開涉及一種工程化免疫細胞，其表現和/或分泌一種或多種多肽，每種所述多肽都包含靶標結合域，在一些實施方案中，所述靶標結合域能夠特異性識別並結合在靶細胞的細胞表面上表現或呈現的靶分子。在一些實施方案中，所述免疫細胞是自然殺手(NK)細胞、T細胞或腫瘤浸潤細胞(TIL)。在一些實施方案中，所述免疫細胞是NK細胞。在一些實施方案中，所述一種或多種多肽中的每種多肽進一步包含Fc結構域，在一些實施方案中，所述Fc結構域能夠介導對於所述工程化免疫細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。在一些實施方案中，所述Fc結構域包含根據EU編號的Ser239Asp、Ala330Leu、Ile332Glu、Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile、Pro396Leu、Met428Leu或Asn434Ser中的至少一種。在一些實施方案中，所述Fc結構域包含以下至少一組：(a)Ser239Asp、Ala330Leu和Ile332Glu；(b)Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile和Pro396Leu；或(c)Met428Leu和Asn434Ser。在一些實施方案中，所述Fc結構域包含Ser239Asp、Ala330Leu、Ile332Glu、Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile、Pro396Leu、Met428Leu和Asn434Ser的組合。在一些實施方案中，所述一種或多種多肽中的每種多肽進一步包含經由第一柔性連接子在所述抗原結合域的N末端或所述Fc結構域的C末端融合的第一掩蔽肽，在一些實施方案中，所述第一掩蔽肽被配置為阻斷所述多肽的所述Fc結構域，並且所述第一柔性連接子被配置為在靶組織中可裂解。在一些實施方案中，所述第一柔性連接子被配置為可被在所述靶組織中特異性或豐富表現的蛋白酶降解。在一些實施方案中，所述蛋白酶是MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9或MMP14。在一些實施方案中，所述蛋白酶是MMP9，並且所述第一柔性連接子具有選自SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 27的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述第一柔性連接子被配置為可被外源提供給所述靶組織的蛋白酶降解。在一些實施方案中，所述一種或多種多肽中的每種多肽進一步包含經由第二柔性連接子在所述抗原結合域的N末端或所述Fc結構域的C末端融合的第二掩蔽肽，在一些實施方案中，所述第二掩蔽肽被配置為阻斷所述多肽的所述抗原結合域，並且所述第二柔性連接子被配置為在靶組織中可裂解。在一些實施方案中，所述第二柔性連接子被配置為可被在所述靶組織中特異性或豐富表現的蛋白酶降解。在一些實施方案中，所述蛋白酶是MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9或MMP14。在一些實施方案中，所述蛋白酶是MMP9，並且所述第二柔性連接子具有選自SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 27的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述第二柔性連接子被配置為可被外源提供給所述靶組織的蛋白酶降解。

在一些實施方案中，所述一種或多種多肽包含抗體或其抗原結合片段，在一些實施方案中，所述靶標結合域是抗原結合域，該抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)結構域或單個單體可變抗體結構域。在一些實施方案中，所述靶分子選自PD-L1、BCMA、Caudin18.2、CCR4、CD10、CD123、CD147、CD171、CD19、CD20、CD22、CD276、CD319、CD33、CD38、CD70、CLL-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、FLT3、FRα、GD2、GPC3、HER2、HGFR、IL13Ralpha2、間皮素、MG7、MUC1、MUC16、黏連蛋白4、PSCA、ROR1、ROR2、TACI、TRBC1、TSLPR和VEGFR。在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段是抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含scFv結構域，在一些實施方案中，所述scFv結構域包含具有與SEQ ID NO: 9至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VL結構域，並且/或者包含具有與SEQ ID NO: 10至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VH結構域。在一些實施方案中，所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的所述scFv結構域具有與SEQ ID NO: 12至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含scFv結構域，在一些實施方案中，所述scFv結構域包含具有與SEQ ID NO: 13至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VL結構域，並且/或者包含具有與SEQ ID NO: 14至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VH結構域。在一些實施方案中，所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的所述scFv結構域具有與SEQ ID NO: 15至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。

在一些實施方案中，所述一種或多種多肽包含肽體，在一些實施方案中，所述靶標結合域包含配體多肽。在一些實施方案中，所述靶分子是所述配體多肽能夠特異性識別並結合的受體，在一些實施方案中，所述受體選自IL13Rα2、APN/CD13、APP、PD-L1、CD44、P32/gC1qR、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、CD21、EGFR、Epha2、EphB4、HER2、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、VEGFR1、VEGFR3、PSMA、GPC3、IL-10RA、IL-11Rα、IL-6Rα、GP130、VEGFR2、MUC18、Met、MMP9、Thomsen-Friedenreich碳水化合物抗原、NRP-1、PDGFRβ、CD133、PTPRJ、HSPG、E-選擇蛋白、Tie2、VPAC1、ActRIIB、CD163、CXCR4、肝配蛋白A4、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2、肝配蛋白B3、促性腺素釋放激素受體、G蛋白偶聯受體55、鈴蟾肽受體2、IL4受體、低密度脂蛋白受體、瘦素受體、LRP1、黑皮質素1受體、黑皮質素4受體、CD206、尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物受體、神經激肽-1受體、VPAC2、ITGB1、CD27、ITGB5、ITGA1、CD27、LRP1、ACVR2B、COL13A1、NOTCH3、EGFR、VEGFR2、VEGFR3、PDGFR、HER2、ErbB3、ErbB4、RET和FGFR102。在一些實施方案中，所述肽體是抗IL13Rα2肽體，在一些實施方案中，其配體多肽包含與SEQ ID NO: 21至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述配體多肽包含一個或多個與SEQ ID NO: 21的位置11、90、107、103和108-111相對應的置換。在一些實施方案中，所述配體多肽在與SEQ ID NO: 21的Glu11相對應的位置處包含Tyr殘基。在一些實施方案中，所述配體多肽包含與SEQ ID NO: 22至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述配體多肽包含配體模擬肽和/或人工肽。在一些實施方案中，所述工程化NK細胞當在體外培養時能夠自主生長。

在一些實施方案中，所述細胞進一步表現包含介白素15(IL15)結構域和介白素15受體α次單位(IL15Rα)結構域的嵌合多肽，在一些實施方案中，當表現時，所述嵌合多肽是細胞膜結合的。在一些實施方案中，當在體外培養所述NK細胞的群體時，在沒有任何支持細胞介素的情況下培養至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天、至少31天、至少32天、至少33天、至少34天或至少35天後，其細胞總數能夠保持較高或基本不變。在一些實施方案中，當表現時，所述嵌合多肽能夠與IL15Rβ/IL2Rβ和IL15Rγ/IL2Rγ/γC可操作地形成功能性複合物，以活化所述工程化NK細胞中的下游細胞介素訊息傳導。在一些實施方案中，所述工程化NK細胞從臍帶血獲得。

在一方面，本公開涉及一種能與PD-L1結合的抗體或其抗原結合片段，其包含與PD-L1特異性結合的抗原結合域，在一些實施方案中，所述抗原結合域包含scFv結構域，在一些實施方案中，所述scFv結構域包含具有與SEQ ID NO: 9至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VL結構域，並且/或者包含具有與SEQ ID NO: 10至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VH結構域。在一些實施方案中，所述抗PD-L1抗體的所述scFv結構域具有與SEQ ID NO: 12至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。

在一方面，本公開涉及一種能與PD-L1結合的抗體或其抗原結合片段，其包含與PD-L1特異性結合的抗原結合域，在一些實施方案中，所述抗原結合域包含scFv結構域，在一些實施方案中，所述scFv結構域包含具有與SEQ ID NO: 13至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VL結構域，並且/或者包含具有與SEQ ID NO: 14至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VH結構域。在一些實施方案中，所述抗PD-L1抗體的所述scFv結構域具有與SEQ ID NO: 15至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，本文所述的抗體或其抗原結合片段進一步包含Fc結構域，在一些實施方案中，所述Fc結構域能夠介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。在一些實施方案中，所述Fc結構域包含根據EU編號的Ser239Asp、Ala330Leu、Ile332Glu、Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile、Pro396Leu、Met428Leu或Asn434Ser中的至少一種。在一些實施方案中，所述Fc結構域包含以下至少一組：(a)Ser239Asp、Ala330Leu和Ile332Glu；(b)Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile和Pro396Leu；或(c)Met428Leu和Asn434Ser。在一些實施方案中，所述Fc結構域包含Ser239Asp、Ala330Leu、Ile332Glu、Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile、Pro396Leu、Met428Leu和Asn434Ser的組合。

在一方面，本公開涉及一種能與程式性死亡配體1(PD-L1)結合的抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區(VH)，其包含互補決定區(CDR)1、2和3，在一些實施方案中，所述VH CDR1區包含與所選VH CDR1胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列，所述VH CDR2區包含與所選VH CDR2胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列，並且所述VH CDR3區包含與所選VH CDR3胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列；以及輕鏈可變區(VL)，其包含CDR 1、2和3，在一些實施方案中，所述VL CDR1區包含與所選VL CDR1胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列，所述VL CDR2區包含與所選VL CDR2胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列，並且所述VL CDR3區包含與所選VL CDR3胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列，在一些實施方案中，所選VH CDR 1、2和3胺基酸序列和所選VL CDR 1、2和3胺基酸序列是以下之一：(1)所選VH CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 31、32、33中示出，並且所選VL CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 34、35、36中示出；(2)所選VH CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 37、38、39中示出，並且所選VL CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 40、41、42中示出；(3)所選VH CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 43、44、45中示出，並且所選VL CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 46、47、48中示出；以及(4)所選VH CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 49、50、51中示出，並且所選VL CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 52、53、54中示出。在一些實施方案中，根據Kabat定義，所述VH包含分別具有SEQ ID NO: 31、32和33所示胺基酸序列的CDR 1、2、3，並且所述VL包含分別具有SEQ ID NO: 34、35和36所示胺基酸序列的CDR 1、2、3。在一些實施方案中，根據Kabat定義，所述VH包含分別具有SEQ ID NO: 37、38和39所示胺基酸序列的CDR 1、2、3，並且所述VL包含分別具有SEQ ID NO: 40、41和42所示胺基酸序列的CDR 1、2、3。在一些實施方案中，根據North/Aho定義，所述VH包含分別具有SEQ ID NO: 43、44和45所示胺基酸序列的CDR 1、2、3，並且所述VL包含分別具有SEQ ID NO: 46、47和48所示胺基酸序列的CDR 1、2、3。在一些實施方案中，根據North/Aho定義，所述VH包含分別具有SEQ ID NO: 49、50和51所示胺基酸序列的CDR 1、2、3，並且所述VL包含分別具有SEQ ID NO: 52、53和54所示胺基酸序列的CDR 1、2、3。在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段與人PD-L1特異性結合。在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段是人或人源化抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段是單鏈可變片段(scFv)或多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。

在一方面，本公開涉及一種核酸，其包含編碼多肽的多核苷酸，該多肽包含： (1)免疫球蛋白重鏈或其片段，其包含重鏈可變區(VH)，該VH包含互補決定區(CDR)1、2和3，所述CDR 1、2和3包含分別由SEQ ID NO: 31、32和33(或分別由SEQ ID NO: 43、44和45)所示的胺基酸序列，並且在一些實施方案中，所述VH當與包含SEQ ID NO: 13所示胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時能與PD-L1結合； (2)免疫球蛋白輕鏈或其片段，其包含VL，該VL包含CDR 1、2和3，所述CDR 1、2和3包含分別由SEQ ID NO: 34、35和36(或分別由SEQ ID NO: 46、47和48)所示的胺基酸序列，並且在一些實施方案中，所述VL當與包含SEQ ID NO: 14所示胺基酸序列的VH配對時能與PD-L1結合； (3)免疫球蛋白重鏈或其片段，其包含重鏈可變區(VH)，該VH包含互補決定區(CDR)1、2和3，所述CDR 1、2和3包含分別由SEQ ID NO: 37、38和39(或分別由SEQ ID NO: 49、50和51)所示的胺基酸序列，並且在一些實施方案中，所述VH當與包含SEQ ID NO: 9所示胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時能與PD-L1結合；或者 (4)免疫球蛋白輕鏈或其片段，其包含VL，該VL包含CDR 1、2和3，所述CDR 1、2和3包含分別由SEQ ID NO: 40、41和42(或分別由SEQ ID NO: 52、53和54)所示的胺基酸序列，並且在一些實施方案中，所述VL當與包含SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列的VH配對時能與PD-L1結合。

在一些實施方案中，所述VH當與VL配對時特異性結合人PD-L1，或者所述VL當與VH配對時特異性結合人PD-L1。在一些實施方案中，所述免疫球蛋白重鏈或其片段是人或人源化免疫球蛋白重鏈或其片段，並且所述免疫球蛋白輕鏈或其片段是人或人源化免疫球蛋白輕鏈或其片段。在一些實施方案中，所述核酸編碼單鏈可變片段(scFv)、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)或嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施方案中，所述核酸是cDNA。

在一方面，本公開涉及一種載體，其包含一種或多種如本文所述的核酸。在一方面，本公開涉及一種載體，其包含兩種如本文所述的核酸，在一些實施方案中，所述載體編碼一起能與PD-L1結合的VH區和VL區。在一方面，本公開涉及一對載體，在一些實施方案中，每個載體包含一種如本文所述的核酸，在一些實施方案中，這對載體一起編碼一起能與PD-L1結合的VH區和VL區。

在一方面，本公開涉及一種細胞，其包含如本文所述的載體或一對載體。在一些實施方案中，所述細胞是CHO細胞。在一方面，本公開涉及一種細胞，其包含一種或多種如本文所述的核酸。

在一方面，本公開涉及一種產生抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括(a)在足以使本文所述的細胞產生所述抗體或抗原結合片段的條件下培養所述細胞；以及(b)收集由所述細胞產生的所述抗體或抗原結合片段。

在一方面，本公開涉及一種能與PD-L1結合的抗體或其抗原結合片段，其包含：包含與所選重鏈可變區(VH)序列至少80%相同的胺基酸序列的VH，以及包含與所選輕鏈可變區(VL)序列至少80%相同的胺基酸序列的VL，在一些實施方案中，所選VH序列和所選VL序列是以下之一：(1)所選VH序列是SEQ ID NO: 14，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 13；以及(2)所選VH序列是SEQ ID NO: 10，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 9。在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段與人PD-L1特異性結合。在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段是人或人源化抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段是單鏈可變片段(scFv)或多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。

在一方面，本公開涉及一種與本文所述的抗體或其抗原結合片段交叉競爭的抗體或其抗原結合片段。

在一方面，本公開涉及一種能與PD-L1結合的抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區(VH)，其包含與所選VH序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相同的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；以及輕鏈可變區(VL)，其包含與所選VL序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3相同的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，在一些實施方案中，所選VH序列和所選VL序列是以下之一：(1)所選VH序列是SEQ ID NO: 14，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 13；以及(2)所選VH序列是SEQ ID NO: 10，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 9。

在一方面，本公開涉及一種抗體-藥物綴合物，其包含與治療劑共價結合的本文所述的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，所述治療劑是細胞毒性劑或細胞抑制劑。

在一方面，本公開涉及一種治療患有癌症的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效劑量的組合物，該組合物包含本文所述的抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物。在一些實施方案中，所述受試者患有乳癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、白血病和/或淋巴瘤。

在一方面，本公開涉及一種降低腫瘤生長速度的方法，所述方法包括使腫瘤細胞與有效劑量的組合物接觸，該組合物包含本文所述的抗體或其抗原結合片段或抗體-藥物綴合物。在一方面，本公開涉及一種殺傷腫瘤細胞的方法，所述方法包括使腫瘤細胞與有效劑量的組合物接觸，該組合物包含本文所述的抗體或其抗原結合片段或抗體-藥物綴合物。

在一方面，本公開涉及一種藥物組合物，其包含本文所述的抗體或其抗原結合片段，以及藥學上可接受的載劑。在一方面，本公開涉及一種藥物組合物，其包含本文所述的抗體藥物綴合物，以及藥學上可接受的載劑。

本文還提供了一種融合蛋白，其包含與SEQ ID NO: 6、7、19、20或25至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。

本公開還涉及治療患有癌症的受試者的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效數量的工程化免疫細胞(例如，本文所述的任何工程化免疫細胞)。本公開還涉及降低腫瘤生長速度的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效數量的工程化免疫細胞(例如，本文所述的任何工程化免疫細胞)。本公開還涉及殺傷腫瘤細胞的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效數量的工程化免疫細胞(例如，本文所述的任何工程化免疫細胞)。在一些實施方案中，所述受試者具有在細胞表面上表現PD-L1和/或IL13Rα2的癌細胞。在一些實施方案中，所述癌症是乳癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、白血病和淋巴瘤。

如本文所用的，術語“嵌合蛋白”或“嵌合多肽”是指這樣的蛋白質或多肽：其具有來源於兩個或更多個不同來源的序列的至少一部分。在一些實施方案中，本文所述的嵌合蛋白或嵌合多肽是融合蛋白或融合多肽。

如本文所用的，術語“藥物細胞”是指可用於治療疾病(例如，癌症)的工程化細胞(例如，任何工程化免疫細胞)。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語的含義均與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同。本文描述了供本發明使用的方法和材料；也可以使用本領域已知的其他合適的方法和材料。這些材料、方法和實例僅是示例說明性的，而並非旨在限制。本文提及的所有出版物、專利申請、專利、序列、數據庫條目和其他參考文獻均藉由引用整體併入本文。如有衝突，以包括定義的本說明書為準。

從以下詳細描述和附圖以及申請專利範圍中將會明顯看出本發明的其他特徵和優點。

本公開具有兩個目的。首先是開發一種現成的和/或同種異體的NK細胞藥物平台，該平台針對體外自主生長和體內長期持久性進行優化。其次是建立一種NK細胞藥物平台，該平台可以充分利用NK細胞的抗癌能力，並可定制用於治療多種癌症類型。自主生長的NK細胞藥物平台

介白素-15(IL-15或IL15)是14-15 kDa的醣蛋白，在人類中由染色體4q31的34 kb區域編碼，而在小鼠中處於8號染色體的中心區域。儘管IL-15 mRNA可在包括肥大細胞、癌細胞或成纖維細胞在內的許多細胞和組織中發現，但這種細胞介素主要作為成熟蛋白質由樹突細胞、單核細胞和巨噬細胞產生。

Il15是一種4-a螺旋束細胞介素，在先天性免疫細胞和適應性免疫細胞的刺激中發揮關鍵作用。IL15誘導T細胞的活化、增殖和存活，並有助於高親合力、抗原特異性CD8+記憶T細胞的產生和長期維持。另外，IL15還參與NK和NKT以及γ/δ T細胞的發育、持續存在和活化。

IL15受體(IL15R)由三個不同的分子組成，分別被稱為α鏈(CD215；IL15R特有的)、β鏈(CD122)和γ鏈(CD132)。特別是，CD122也是IL2R的一種成分，而CD132，也稱為共同γ鏈(γ _c)，是包括IL2、IL4、IL7、IL9和IL21在內的不同細胞介素所共有的。IL15Rβγ複合物存在於靶細胞上，而IL15Rα可在許多細胞類型的表面上表現為與IL15複合的膜結合複合物，所述細胞類型包括活化的單核細胞、樹突細胞(DC)和內皮細胞。這樣的異源二聚體被反式呈遞給鄰近的α/β、γ/δ T細胞或NK細胞。或者，它還可以作為可溶性因子脫落和釋放。研究表明，人和小鼠血清中幾乎所有的循環IL15都與IL15Rα複合。該受體的觸發活化了下游訊息路徑，包括JAK1和JAK3以及STAT3和STAT5，隨後是PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF/MAPK–ERK級聯的募集。藉由誘導FOS/JUN、MYC、NF-κB和BCL2基因的表現以及降低BIM和PUMA的表現，IL15對T細胞增殖和存活具有刺激作用。

由於共有該受體的β和γ成分，IL2和IL15對T細胞發揮類似的功能。實際上，兩者均刺激T細胞的增殖，促進細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的分化，並誘導NK細胞的生成和維持。儘管如此，缺乏IL2或IL15的小鼠具有不同的表型，而向小鼠、靈長類動物或人類施用IL2和IL15導致對免疫系統的細胞有不同的影響。關於抗原活化的效應細胞，IL2促進終末分化，並最終藉由活化誘導的細胞死亡(AICD)促進其清除，而IL15則抑制AICD，並促進長壽命記憶T細胞的生成，及其藉由恆定增殖的維持。

IL15及其IL15Rα鏈由單核細胞/巨噬細胞和樹突細胞共同表現，隨後展示為細胞表面IL15:IL15Rα複合物，其被反式呈遞給表現IL2Rβγ _c的鄰近免疫細胞。因此，IL15不支持Treg的維持。IL15並不誘導活化CD8+ T細胞的凋亡，而是提供抗凋亡訊息。IL15還在NK細胞的發育、增殖和活化中發揮非多餘的作用。IL15在小鼠或非人靈長類動物(NHP)中不誘發明顯的毛細血管滲漏症候群，提示基於IL15的療法可以提供IL2的免疫刺激益處，而不良作用較少。

介白素15受體α次單位(CD215)，又稱為IL15RA或IL15Rα，是介白素15受體的次單位，在人類中由 IL15RA基因編碼。Il-15受體由以下三個次單位組成：IL-15Rα、CD122和CD132。其中的兩個次單位，CD122和CD132，與IL-2的受體共有，但IL-2受體還具有另外的次單位(CD25)。共有的次單位含有訊息轉導所需的細胞質模體，這構成了IL15和IL2的許多重疊生物活性的基礎，儘管在體內這兩種細胞介素具有不同的生物效應。IL-15Rα以極高的親和力特異性結合IL15，並且能夠獨立於其他次單位結合IL-15。有人提出，這種性質允許IL-15由一種細胞產生，被另一種細胞內吞，然後再呈遞給第三方細胞。據報導，該受體增強細胞增殖和凋亡抑制因子BCL2L1/BCL2-XL和BCL2的表現。已經報導了該基因的多種可變剪接的轉錄物變體。

IL-15Rα可在T細胞或NK細胞的表面上表現，形成IL-15Rα/IL-2Rβ/γc三聚體受體。然而，IL-15Rα似乎主要由抗原呈遞細胞表現。它以高親和力結合IL-15，允許生產細胞經由IL-15Rα向表現IL-2Rβ/γc複合物的鄰近細胞反式呈遞IL-15。這種原始作用機制被稱為IL-15反式呈遞。因此，IL-15既可以像IL-2一樣順式作用，也可以反式作用。另外，可溶性(s)形式的IL-15Rα(sIL-15Rα)既可以充當IL-15作用的拮抗劑，與膜結合的IL-15Rα競爭結合IL-15，也可以充當促效劑，形成IL-15Rα/IL-15複合物，比單獨的IL-15更有效地活化IL-2Rβ/γc二聚體受體。因此，許多實驗室將後一觀察結果轉化為治療應用，以模擬可溶性IL-15Rα/IL-15的反式呈遞(sIL-15Rα/IL-15，也稱為IL-15Rα/IL-15的“反式訊息傳導”)。

關於IL15、IL15RA及其功能的詳細描述，可參見，例如，Pilipow K.等人, "IL15 and T-cell Stemness in T-cell–Based Cancer Immunotherapy." Cancer Research75.24 (2015): 5187-5193；Rhode P.R.等人, "Comparison of the superagonist complex, ALT-803, to IL15 as cancer immunotherapeutics in animal models." Cancer Immunology Research4.1 (2016): 49-60；Mishra, A.等人, "Molecular pathways: interleukin-15 signaling in health and in cancer." Clinical Cancer Research20.8 (2014): 2044-2050；以及Quéméner, A.等人, "IL-15Rα membrane anchorage in either cis or trans is required for stabilization of IL-15 and optimal signaling." Journal of Cell Science133.5 (2020): jcs236802；其中每一篇均藉由引用而整體併入。

在一方面，為了實現上述第一目的，本公開提供了在體外能夠自主生長並具有長期持久性的工程化NK細胞，所述特徵使得工程化NK細胞能夠充當理想的現成和/或同種異體NK細胞藥物平台。

如本文所用的，術語“自主生長”是指當在體外培養細胞群體時，在沒有任何支持細胞介素的情況下培養至少7天(例如，至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天、至少31天、至少32天、至少33天、至少34天或至少35天)後，與第0天的初始細胞數相比，其細胞總數能夠保持增加或保持基本不變。術語“長期持久性”可被視為與“自主生長”具有類似的定義。NK細胞的示例性支持細胞介素包括，例如，IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、FMS樣酪胺酸激酶3配體(Flt-3L)、人類幹細胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)和I型干擾素。在一些實施方案中，本文所述的支持細胞介素不包括血清替代物(例如，Gibco，目錄號：A2506101)中所含的細胞介素。關於支持細胞介素的詳細資訊，可參見，例如，Zwirner, N. W.等人, "Cytokine regulation of natural killer cell effector functions." Biofactors36.4 (2010): 274-288；以及Wu, S.Y.等人, "Natural killer cells in cancer biology and therapy." Molecular Cancer19 (2020): 1-26，其中每一篇均藉由引用整體併入本文。

具體來說，對從特定來源(例如，臍帶血)分離的NK細胞進行工程改造，以表現編碼IL15受體α次單位(IL15RA)連接的IL15(即，“Recast-IL15”)的轉基因。Recast-IL15實質上是介白素15(即IL-15或IL15)和其受體的α次單位(即IL15Rα)的嵌合蛋白，兩者藉由工程化連接子區相連。該轉基因構築體的結構域和序列在圖 1和以下表 1中示出。該構築體還可包括訊息肽，該訊息肽連接至Recast-IL15的N末端，並且被配置為由於IL15Rα的跨膜結構域而確保Recast-IL15在NK細胞的細胞表面上的正確定位。在NK細胞中細胞內表現時，訊息肽可被切下。因此，Recast-IL15可在NK細胞的細胞表面上正確表現，並保持為膜結合的。Recast-IL15使NK細胞能夠自主生長並提高NK細胞的體內持久性的工作機制在圖 2中示出。表1. Recast-IL15的結構域和序列資訊。

結構域	胺基酸序列 (SEQ ID NO)
訊息肽	MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITAPP(SEQ ID NO: 1)
IL-15結構域	NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:2；野生型IL15) NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILAN D SLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO: 3；突變IL15，N72D突變以粗體和下劃線示出)
連接子區	GSGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSGSLQI(SEQ ID NO: 4)
IL-15Rα(IL-15RA)結構域	TCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL(SEQ ID NO: 5)
Recast-IL15(全長)	MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITAPPNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGSGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL(SEQ ID NO: 6；版本1，含有野生型IL15) NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGSGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL(SEQ ID NO: 7；不含訊息肽的嵌合多肽)

作為比較，野生型IL15的工作機制在Waldmann, T. A. "The shared and contrasting roles of IL2 and IL15 in the life and death of normal and neoplastic lymphocytes: implications for cancer therapy." Cancer Immunology Research3.3 (2015): 219-227中進行了討論，該文獻藉由引用整體併入本文。野生型IL15可增加NK藥物細胞在體外和體內的持久性。NK細胞通常表現膜結合的IL15Rβ和IL15Rγ次單位，並且當IL-15接合的IL15Rα(其形成IL15-IL15Rα複合物)在諸如單核細胞、樹突細胞等呈現IL15的細胞上結合後，IL15Rβ和IL15Rγ的細胞內訊息傳導被活化，從而維持NK細胞的生長。

在本文提供的實施例中進一步證明，這類表現Recast-IL15的NK細胞在沒有任何支持細胞介素的情況下培養時，能夠實現優化的自主生長長達約一個月。

Recast-IL15設計可以克服通常與使用野生型細胞介素IL15維持靶NK細胞在培養中的生長相關的若干不足。首先，由於Recast-IL15在NK細胞上是膜結合的，並且被NK細胞不斷表現，因此與使用野生型細胞介素IL15相比，Recase-IL15的半衰期不再成為問題。其次，工程化連接子區允許Recast-IL15直接與IL2/15Rβ和IL15Rγ(即γC)相互作用，以觸發下游訊息路徑。因此，Recast-IL15的訊息機制是自主的，不再依賴於間接訊息呈現機制。

應當指出，在Recast-IL15中，訊息肽、IL-15結構域、連接子區和IL-15Rα結構域中的每一者都可以具有不同的實施方案，只要該工程化細胞介素能夠在NK細胞的細胞表面上穩定地表現並且能夠在沒有任何支持細胞介素的情況下維持NK細胞的自主生長至少18天即可。例如，根據一些實施方案，IL-15結構域可包含IL15N72D突變(SEQ ID NO: 3，另見表 1)，該突變已被證明可使IL-15變體表現出超促效劑活性。詳情可參見WO2008143794A1，其藉由引用整體併入本文。

由於表現Recast-IL15的NK細胞的上述優點，它實質上提供了一種優化但通用的NK細胞藥物平台，在該平台的基礎上可以開發出一系列針對不同目的的特異性NK細胞藥物。

以下幾點值得注意。(1)除NK細胞外，其他免疫細胞如淋巴細胞、T細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)等也可被工程改造為表現Recast-IL15，Recast-IL15也可使這些工程化免疫細胞具有更好的自主生長潛力，或在體內時或在體外培養時具有更好的持續性。(2)可以改變表 1中列出的每個結構域/區域，只要在NK細胞中表現的Recast-IL15嵌合蛋白能夠賦予NK細胞所定義的自主生長能力即可。例如，可以使用不同的訊息肽或不同的連接子區。可以採用不同版本的IL-15結構域或IL-15Rα(IL-15RA)結構域，如IL-15和/或IL-15Rα的功能片段或序列變體。(3)除本文公開的嵌合Recast-IL15外，還可以採用膜結合的IL-15蛋白(即，IL15與IL-15Rα以外的細胞膜錨定分子融合)，只要這類膜結合IL-15蛋白的表現導致NK細胞的自主生長即可。

在一些實施方案中，與參考NK細胞(例如，不表現Recast-IL15的NK細胞)相比，表現Recast-IL15(例如，本文所述的任何Recast-IL15)的NK細胞的細胞擴增率至少為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍或10000倍。

在一些實施方案中，表現Recast-IL15(例如，本文所述的任何Recast-IL15)的NK細胞可在培養基(例如，不含任何支持細胞介素)中保持細胞總數至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天或35天。在本文中，術語“保持細胞總數”是指與參考培養第0天相比，細胞總數保持較高或基本不變。

在一方面，本公開涉及一種表現融合多肽的工程化免疫細胞，該融合多肽任選地從N末端到C末端包含：包含介白素15(IL15)的全部或一部分的第一部分，以及包含介白素15受體α次單位(IL15Rα)的全部或一部分的第二部分。在一些實施方案中，該融合多肽可與介白素15受體β次單位(IL15Rβ)和介白素15受體γ次單位(IL15Rγ)形成功能性複合物，以活化工程化免疫細胞中的IL-15訊息傳導。在一些實施方案中，該免疫細胞是自然殺手(NK)細胞(例如，從臍帶血獲得的NK細胞)、T細胞或腫瘤浸潤細胞(TIL)。

在一些實施方案中，第一部分包含與人IL-15蛋白(NCBI參考號：NP_000576.1)的胺基酸49-162相對應的序列或由該序列組成。在一些實施方案中，第一部分不包括人IL-15蛋白的訊息肽。在一些實施方案中，第一部分包含與SEQ ID NO: 2或3至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，第二部分包含與人IL-15Rα蛋白(NCBI參考號：NP_002180.1)的胺基酸32-267相對應的序列或由該序列組成。在一些實施方案中，第二部分包含人IL-15Rα蛋白的胞外區、跨膜區和/或胞質區，或由以上區域組成。在一些實施方案中，第二部分不包括人IL-15Rα的訊息肽。在一些實施方案中，第二部分包含與SEQ ID NO: 5至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，第一部分和第二部分經由連接子肽(例如，柔性連接子)融合。在一些實施方案中，該連接子肽包含與SEQ ID NO: 4至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，該融合多肽進一步包含N末端訊息肽。在一些實施方案中，該訊息肽包含與人IL-15Rα蛋白(NCBI參考號：NP_002180.1)的胺基酸1-35相對應的序列或由該序列組成，任選地，該訊息肽在與人IL-15Ra蛋白的Cys33相對應的位置處包含Ala殘基。在一些實施方案中，該訊息肽包含人IL-15Rα蛋白的訊息肽。在一些實施方案中，該訊息肽包含與SEQ ID NO: 1至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，該融合多肽包含與SEQ ID NO: 6或7至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，該融合多肽從N末端到C末端包含IL15-Rα訊息肽、人IL-15(不含IL15的訊息肽)、柔性連接子以及人IL-15Rα的胞外區、跨膜區和胞質區。在一些實施方案中，當在體外培養免疫細胞群體時，在不存在支持細胞介素(例如，本文所述的任何支持細胞介素)的情況下培養至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天、至少31天、至少32天、至少33天、至少34天或至少35天後，其細胞總數能夠保持增加或基本不變。在一些實施方案中，所述工程化免疫細胞可以進一步表現和/或分泌一種或多種多肽，每種多肽都包含靶標結合域和Fc結構域，其中該靶標結合域能夠與靶細胞的細胞表面上的靶分子特異性結合，並且/或者該Fc結構域能夠介導對於工程化免疫細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。在一些實施方案中，所述一種或多種多肽包含能與癌細胞表面上表現的一種或多種抗原(例如，PD-L1或表 2中的任何抗原)結合的抗體或其抗原結合片段，和/或能與癌細胞表面上表現的一種或多種受體(例如，IL13Rα2或表 4中的任何受體)結合的肽體。 Ab-NK細胞藥物平台

在第二方面，為了實現上述第二目的，本公開進一步提供了一種工程化NK細胞藥物平台，被稱為“Ab-NK細胞”，它基本上被工程改造為表現和分泌一種或多種含Fc的抗體和/或肽體，所述抗體和/或肽體可以選擇性地識別並結合在一種或多種靶細胞群體上特異性表現的相應的細胞表面靶分子(即，與含Fc的抗體相對應的細胞表面抗原，和/或與含Fc的肽體相對應的細胞表面受體)。

在受試者中施用這些工程化Ab-NK細胞後，由其分泌的一種或多種抗體和/或肽體可以特異性識別並基本上標記表現相應細胞表面靶分子的一種或多種靶細胞，進而觸發針對這些標記的靶細胞的下游細胞毒性活性，從而另外實現對於這些NK細胞藥物和來自患者免疫系統的內源細胞的細胞毒性潛力。這些細胞毒性活性可包括以下活性中的一種或其任何組合： (a)由受試者中存在的效應免疫細胞如NK細胞(包括外源和內源NK細胞)、巨噬細胞、駐留單核細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞等介導的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性(例如，對於含Fc的抗體)或類似活性(例如，對於含Fc的肽體)，所述細胞被這些覆蓋在靶細胞表面的抗體和/或肽體募集； (b)同樣由上述效應免疫細胞介導的抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)活性(例如，對於含Fc的抗體)或類似活性(例如，對於含Fc的肽體)；和/或 (c)由受試者的內源補體系統介導的補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。

因此，當聯合使用時，分泌的一種或多種抗體和NK細胞可以基本上以協同方式作用，從而相互增強彼此的治療效果。

具體來說，從特定來源(例如，臍帶血)分離的NK細胞可以被工程改造為表現一種或多種目標轉基因，所述轉基因編碼一種或多種可分泌的抗體和/或一種或多種可分泌的肽體。每種抗體或肽體都可以是單多肽蛋白質或由多種多肽形成的蛋白質複合物，當分泌到NK細胞之外時，它們能夠(1)選擇性地識別並結合在靶細胞的細胞表面上特異性表現的靶分子，並且還能夠(2)介導針對靶細胞的細胞毒性活性(例如，ADCC、ADCP和CDC活性中的至少一種)。為了實現上述兩種功能，所編碼的抗體或肽體可以包含至少一個靶標結合域，每個靶標結合域都被配置為選擇性地結合與之相對應的細胞表面駐留靶分子，並且另外包含能夠介導一種或多種細胞毒性活性的片段可結晶(Fc)結構域。在一些實施方案中，本文所述的靶標結合域是本文所述的抗體或其抗原結合片段的抗原結合域。在一些實施方案中，本文所述的靶標結合域是本文所述的肽體的配體多肽。

根據本公開的不同實施方案，分別對抗體主題和肽體主題提供了以下描述。 (1)“抗體”主題

根據一些實施方案，工程化Ab-NK細胞被配置為表現和分泌一種或多種抗體。如本文所用的，術語“抗體”(或“多種抗體”)是指單多肽蛋白質或由多個多肽形成的蛋白質複合物，其能夠特異性識別靶細胞的相應細胞表面抗原，並且根據不同的實施方案，可以是不同的形式或類型，如單多肽抗體、多重多肽抗體(即，免疫球蛋白(Ig))單元(例如，包含兩條輕鏈和兩條重鏈的Y形抗體單元)或其他形式。 (A)“單多肽”抗體

根據一些實施方案，抗體可包括單多肽蛋白質，其包含抗原結合域和Fc結構域。為了確保轉譯後的抗體多肽正確地分泌到NK細胞外，另外將訊息肽與抗體構築體的抗原結合域的N末端融合( 圖3A)，或者與抗體構築體的Fc結構域的N末端融合( 圖3B)。每兩個相鄰結構域可以藉由柔性連接子連接，也可以不使用連接子而直接連接。

在一些實施方案中，抗原結合域被配置為特異性識別靶細胞上相應的細胞表面抗原，從而允許抗體與該抗原特異性結合。在NK細胞中表現的抗體中的抗原結合域可以有不同的實施方案。根據一些實施方案，抗原結合域可包含單鏈可變片段(scFv)結構域，該scFv結構域可與靶細胞上相應的細胞表面抗原特異性結合。在本文中，scFv結構域被解釋為在分別來自常規抗體的輕鏈和重鏈的兩個可變域之間融合的融合多肽。根據其他一些實施方案，抗原結合域可包含單個單體可變抗體結構域。抗原結合域還可以有其他的實施方案，在此沒有限制。

在一些實施方案中，Fc結構域被配置為能夠提供細胞毒性，使Ab-NK細胞表現和分泌的抗體多肽能夠介導針對靶細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)活性和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)活性中的至少一種。每種這樣的多肽中的Fc結構域可以有不同的實施方案。

任選地，Fc結構域可包含IgG、IgA、IgD、IgM和IgE的序列。Fc結構域可進一步包含IgG1 Fc區的一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)下列突變：根據EU編號，Ser239Asp、Ala330Leu、Ile332Glu、Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile、Pro396Leu、Met428Leu和Asn434Ser。具有含有這些突變的某些組合的Fc結構域的抗體已被證明導致抗體多肽具有增強的ADCC活性、增強的ADCP活性、增強的CDC活性和/或延長的半衰期(參見，例如，US7317091B2、US8039592B2、US20040132101A1、US7786270B2、WO2009086320A1、WO2006053301A2、US8088376B2和US8394925B2，其公開內容藉由引用整體併入本文)。EU編號系統的詳情可參見，例如，Lobner, E.等人, "Engineered IgG1‐Fc–one fragment to bind them all." Immunological Reviews270.1 (2016): 113-131，以及Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版" National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)；其中每一篇均藉由引用整體併入本文。

根據一些實施方案，IgG1 Fc結構域可包含Ser239Asp和Ile332Glu和/或Ala330Leu的組合(根據EU編號)，以賦予含有此類修飾Fc結構域的抗體多肽增強的ADCC和ADCP。

根據一些實施方案，IgG1 Fc結構域可包含Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile和/或Pro396Leu的組合(根據EU編號)，以賦予含有此類修飾Fc結構域的抗體多肽增強的ADCC。

根據一些實施方案，IgG1 Fc結構域可包含Met428Leu和/或Asn434Ser的組合(根據EU編號)，以賦予含有此類修飾Fc結構域的抗體多肽延長的半衰期。

根據一些優選實施方案，Ab-NK細胞所攜帶的抗體多肽的Fc結構域可包含以上所有這10種突變的組合( 圖4)。

應當指出，Fc結構域還可以有其他突變/修飾，使含有這類工程化Fc結構域的抗體或抗體樣多肽具有優化的ADCC活性、ADCP活性、補體依賴性細胞毒性(CDC)活性和/或半衰期。這些突變可包括Cys221Asp、Asp222Cys、Leu234Tyr、Gly236Ala、Gly236Trp、Ser267Glu、His268Phe、Ser298Ala、Ser324Thr、Lys325Trp、Lys326Ala、Lys326Met、Glu333Ala、Glu333Ser、Lys334Ala和/或Glu345Arg(根據EU編號)。

由於所述一種或多種抗體多肽中的每種抗體多肽中都存在功能性Fc結構域，因此當所述一種或多種抗體從Ab-NK細胞中分泌出來時，它們可以介導NK細胞對表現相應抗原的靶細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。同時，該抗體還觸發多層免疫反應，如ADCC、ADCP和CDC。此外，該抗體還可提供靶標識別以外的藥物功能，例如中和、阻斷和/或促效某些訊息路徑。 (B)“多重多肽”抗體

根據一些實施方案，所述抗體可包含多重多肽蛋白質複合物。這樣的蛋白質複合物任選地可以是包含藉由二硫鍵連接的兩條輕鏈和兩條重鏈並且呈Y形的傳統免疫球蛋白(Ig)的形式。這樣的多重多肽抗體基本上包含兩個抗原結合域，每個抗原結合域包含來自輕鏈和重鏈中的每一個的三個互補決定區(CDR)。這樣的多重多肽抗體進一步包含一個或多個Fc結構域，每個Fc結構域包含來自一條重鏈的恆定域。多重多肽抗體任選地可以是不同的形式，如只包含一條輕鏈和一條重鏈、包含免疫球蛋白(Ig)的部分版本等等。

在本文所述的多重多肽抗體的任何實施方案中，其中所含的Fc結構域可被工程改造為包含一個或多個如上所述的突變，以具有改善的ADCC/ADCP/CDC活性和/或半衰期。

任選地，由Ab-NK細胞表現和分泌的單多肽抗體或多重多肽抗體可包含如表2列出的參考文獻之一中公開的抗原結合域或其修飾。這些引用的參考文獻的內容整體併入本公開中。表2. 目前開發的抗體可靶向的抗原列表。

名稱	全名、別名或其他備註	參考文獻
BCMA	B細胞成熟抗原	US9273141B2，WO2014068079A1，WO2014122144A1
Caudin18.2		US20150252103A1，US10053512B2，WO2016165762A1
CCR4	C-C模體趨化因子受體4	US10023649B2，US9675625B2
CD10		JP2007129903A，CN103880960A
CD123	介白素3受體的α鏈	WO2016201065A1，US9969807B2
CD147	basigin	US20170037129A1，US20170101469A1
CD171	神經細胞黏附分子L1	US10400037B2，US9777060B2，US8138313B2
CD19		US7902338B2，US8097703B2，US9260530B2，US7109304B2
CD20		US8101179B2，US7682612B1
CD22		US9139649B2，US8591889B2，CN103214578B，US20160229911A1
CD276	B7同系物3 (B7-H3)	CA2680111A1，EP3193933A1，US10604583B2
CD319	SLAMF7	EP2068874B1，US8603477B2
CD33		US11136390B2，US10787514B2，US8759494B2
CD38	環ADP核糖水解酶	US8153765B2，US8926969B2，US10766965B2
CD70	CD27的配體	US8663642B2，US7491390B2，US20190338039A1
CLL-1	C型凝集素樣分子-1	US20130295118A1，US10501545B2，US8536310B2，US11084877B2
DLL3	Delta樣配體3	US20120328624A1，US9107961B2，US20210380715A1
EGFR	表皮生長因子受體	US10759860B2，US7598350B2，
EGFRvIII	EGFR的活性突變體	US9676858B2，US20170327585A1
EpCAM	上皮細胞黏附分子	US8637017B2；CN101970497B
FLT3	FLT3編碼III類受體酪胺酸激酶，是參與正常造血的重要細胞介素受體	US8071099B2；CN102770453B
FRα	一種膜蛋白，與葉酸結合	CN107011439B；US9624297B2
GD2	GD2是在神經外胚層來源的腫瘤上表現的雙唾液酸神經節苷脂	US10287365B2；AU2014228772B2
GPC3	磷脂醯肌醇聚糖3	JP6579640B2；US9926377B2
HER2	人表皮生長因子受體2	CN107074962B；US9518118B2
HGFR	肝細胞生長因子受體	EP1641828B1；US6207152B1
IL13Ralpha2	IL13受體alpha2	KR101763499B1；WO2008146911A9
間皮素		US10022452B2；JP5788443B2
MG7	來自癌胚抗原(CEA)的醣基化蛋白質序列	CN110684107B
MUC1	黏蛋白1	US8722856B2；JP6895890B2
MUC16	黏蛋白16	US11066480B2
黏連蛋白4	黏連蛋白細胞黏附分子4	US11292837B2；US11274160B2
PSCA	前列腺幹細胞抗原	US6790939B2；US8013128B2
ROR1	受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1	US11155615B2; CN103429618B
ROR2	受體酪胺酸激酶樣孤兒受體2	US20180127503A1; US20210347892A1
TACI	跨膜活化物和CAML相互作用物(TACI)是主要存在於B細胞表面上的TNF受體超家族的跨膜蛋白	US20050043516A1
TRBC1	T細胞受體β恆定1	US20200140549A1
TSLPR	胸腺基質淋巴細胞生成素	US8344110B2
VEGFR	血管內皮生長因子受體	US10138300B2；US8128932B2

任選地，由Ab-NK細胞表現和分泌的單多肽抗體或多重多肽抗體可被配置為前藥形式，其保持無活性，直到滿足特定條件，此時無活性前藥被活化成為功能性藥物形式。

在一種情境下，前藥形式的抗體可以保持無活性，直到到達靶組織，此時抗體從無活性前藥形式轉化為活性藥物形式。這樣，Ab-NK細胞對正常組織中的細胞(其也可表現低水平的靶抗原)的不需要的脫靶效應可以得到改善、減少，甚至完全避免。這類靶抗原的實例可包括EGFR和Her2。

根據一些實施方案，從Ab-NK細胞表現和分泌的抗體進一步包含掩蔽肽，並且掩蔽肽和多肽的其餘部分經由柔性連接子彼此融合，該柔性連接子可被在靶細胞所處的病變組織中特異性或豐富表現的蛋白水解酶降解(例如，病變組織是腫瘤，並且蛋白水解酶基本上是腫瘤相關酶)。在一個實例中，柔性連接子可包含一個或多個基質金屬蛋白酶9(MMP9)可降解/切割位點，即VPLSLYS(SEQ ID NO: 26)或SPLGLA(SEQ ID NO: 27)。其他蛋白水解酶可包括MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP14，並且它們的特異性切割位點在WO2002038796A2中公開，其藉由引用整體併入本文。每個切割位點都可以用作柔性連接子的疾病特異性切割位點。或者，柔性連接子可包含對外源提供的酶具有特異性的切割位點。在一些實施方案中，本文所述的掩蔽肽可阻斷抗體或其抗原結合片段(例如，本文所述的任何抗體或其抗原結合片段)或肽體(例如，本文所述的任何肽體)的Fc結構域。在一些實施方案中，掩蔽肽可阻斷Fc結構域與Fc受體(例如，CD16)之間的相互作用，從而降低或沉默一種或多種Fc效應子活性(例如，ADCC)。在一些實施方案中，本文所述的掩蔽肽可阻斷抗體或其抗原結合片段(例如，本文所述的任何抗體或其抗原結合片段)或肽體(例如，本文所述的任何肽體)的靶標結合域(例如，抗原結合域)。在一些實施方案中，掩蔽肽可阻斷靶標結合域(例如，抗原結合域)與其靶分子(例如，抗原)的結合。

具體來說，在從Ab-NK細胞分泌後，由於(1)抗原結合域中的抗原識別位點(例如，互補決定區(CDR))被阻塞，並且/或者(2)抗體多肽的Fc結構域被掩蔽肽阻塞，因此前藥形式的抗體在循環中或在病變組織以外的組織中保持無活性。然而，當抗體處於目標病變組織中時，掩蔽肽透過相應蛋白水解酶對柔性連接子的降解而去除，使先前被阻斷的抗原結合域或先前被阻斷的Fc結構域暴露並可及，從而將抗體從原來的前藥形式活化為活化藥物形式。根據不同的方式，這樣活化的藥物形式抗體可以： (1)選擇性地識別並結合在靶細胞的細胞表面上特異性表現的相應靶抗原，這是因為藉由去除原來被掩蔽肽的阻塞而暴露出抗體多肽的抗原結合域；或者 (2)使在靶細胞的細胞表面上積累的抗體的現在暴露的Fc結構域能夠募集效應免疫細胞(例如，外源Ab-NK細胞，或內源NK細胞巨噬細胞、駐留單核細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞等，藉由與其上表現的Fc受體(FcγR)結合)或活化補體系統，共同導致針對靶細胞的ADCC/ADCP/CDC活性的活化。

在本文中，根據第一實施方案，掩蔽肽被配置為阻斷抗體多肽的抗原結合域中的抗原識別位點，因此，掩蔽肽可布置在訊息肽與抗原結合域或Fc結構域的C末端之間，並且可降解的柔性連接子可連接掩蔽肽與抗原結合域。這樣的設計已成功應用於EGFR和Her2單株抗體，如US8895702B2和US11186642B2所述，其內容，包括掩蔽肽和MMP9可降解的柔性連接子的序列資訊，藉由引用整體併入本文。

根據第二實施方案，掩蔽肽被配置為阻斷抗體多肽的Fc結構域，因此，掩蔽肽可布置在Fc結構域的C末端或抗原結合域的N末端，並且可降解的柔性連接子被布置為連接Fc結構域和掩蔽肽。Elter, A.等人, "Protease-activation of fc-masked therapeutic antibodies to alleviate off-tumor cytotoxicity." Frontiers in Immunology12 (2021): 715719中描述了這樣的設計，其內容，包括掩蔽肽和MMP9可降解的柔性連接子的序列資訊，藉由引用整體併入本文。

在另一種情境下，前藥形式的抗體可以保持無活性，直到被某種活化劑如活化酶的受控供應所活化，該活化劑如活化酶特異性地降解在掩蔽部分與抗體之間的可降解連接子(正如上述實例一樣)。其他情境也是可能的。

特別是，應當指出，根據一些實施方案，Ab-NK細胞被工程改造為表現和分泌抗PD-L1抗體(也稱為PD-L1抗體)，該抗體實質上是一種“單多肽”抗體(參見圖 5A- 圖5B)，並且這類Ab-NK細胞可被稱為“PD-L1引導且細胞溶解相關的NK(在下文中簡稱為“Pluck-NK”)”細胞，所述細胞被設計為現成的通用細胞藥物，其可應用於廣泛的癌症類型，包括，例如，肺癌、膀胱癌、TN乳癌、肝癌和肝轉移癌等。

在此，根據一些實施方案，抗PD-L1抗體可具有如圖 5A- 圖5B和以下表 3中所示的結構和序列。表3. 抗PD-L1抗體的結構域和序列資訊。

結構域	胺基酸序列 (SEQ ID NO)
訊息肽	MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO: 8)
scFv結構域	版本 1 ：人源化的 (L8 殖株 ) VL 結構域AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMHWYQQKPGKAPKLWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQESGYPLTFGGGTKLTVL(SEQ ID NO: 9) VH 結構域QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKGLEYMGYISFTGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKREWILHPMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 10) 柔性連接子GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 11) 完整 scFv 結構域AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMHWYQQKPGKAPKLWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQESGYPLTFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKGLEYMGYISFTGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKREWILHPMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 12) 版本 2 ：鼠 (L2 殖株 ) VL 結構域ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSLTSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNFYSLTISSMEAEDVATYYCFQESGYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO: 13) VH 結構域EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPENKLEYMGYISFTGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARKREWILHPMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO: 14) 完整 scFv 結構域ENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSLTSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNFYSLTISSMEAEDVATYYCFQESGYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPENKLEYMGYISFTGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARKREWILHPMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO: 15)
鉸鏈區	EPKSCDKTHTCP(SEQ ID NO: 16)
Fc-CH2結構域	PCPAPELLAGPDVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSFEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSILTVLHQDWLNGKEYKCKVTNKALPLPEEKTISKAK(SEQ ID NO: 17)
Fc-CH3結構域	GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 18)
抗PD-L1 (全長)	MYRMQLLSCIALSLALVTNSAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMHWYQQKPGKAPKLWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQESGYPLTFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSITSGYWNWIRQPPGKGLEYMGYISFTGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKREWILHPMDYWGQGTLVTVSS EPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSFEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSILTVLHQDWLNGKEYKCKVTNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 19) MYRMQLLSCIALSLALVTNSENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSLTSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNFYSLTISSMEAEDVATYYCFQESGYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPENKLEYMGYISFTGSTYYNPSLKSRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCARKREWILHPMDYWGQGTSVTVSS EPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSFEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSILTVLHQDWLNGKEYKCKVTNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 20)

Pluck-NK細胞藥物的作用機制(MOA)詳述如下。對PD-1/PD-L1免疫檢查點的阻斷已顯示出明顯且持久的臨床療效。PD-1/PD-L1免疫檢查點可被針對PD-1或PD-L1的抗體阻斷。Pluck-NK細胞配備有自分泌全長抗PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如，scFv)。選擇PD-L1而不是PD-1作為靶點，因為PD-L1位於腫瘤細胞表面上，因此是腫瘤靶點。為了與NK細胞聯合使用，抗PD-L1抗體不僅可以充當免疫檢查點抑制劑，而且可以經由ADCC將NK細胞引導至目標癌細胞。這種設計可以更好地利用NK細胞和抗PD-L1抗體兩者。在ADCC中，NK細胞表面上的Fc受體(CD16)識別抗體的Fc區。因此，Pluck-NK細胞配備有全長抗PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如，scFv)。抗體的Fc區可被配置為攜帶工程化胺基酸改變的三個簇，如以上所述並且如圖 4所示。這些特徵旨在：(1)延長抗體的半衰期；(2)增強ADCC；(3)增強抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP，巨噬細胞介導的免疫反應)；(4)增強補體依賴性細胞毒性(CDC，由補體級聯介導的免疫反應)。這些設計旨在藉由觸發多層免疫反應來靶向腫瘤細胞，從而使NK細胞和抗PD-L1抗體兩者的治療能力最大化。

在此，需要進一步指出，根據一些實施方案，Pluck-NK細胞可以優選地與上述自主生長的NK細胞藥物平台進一步組合，即這樣的NK細胞：其被工程改造為同時表現“Recast IL15”，從而能夠實現優化的自主生長，並表現“抗PD-L1”抗體，從而獲得以上提及的免疫檢查點阻斷(ICB)的多重功能，以及與ADCC/ADCP/CDC相關的細胞毒性。這類工程化的NK細胞被稱為“Pluck-NK”細胞，並且圖 6和圖 7分別總結並示出了Pluck-NK細胞的主要特徵和作用機制(MOA)。

在一方面，本公開涉及一種工程化免疫細胞，其表現和/或分泌融合多肽，該融合多肽任選地從N末端到C末端包含：包含能與癌細胞表面上表現的抗原(例如，PD-L1或表 2中的任何抗原)結合的單鏈可變片段(scFv)的第一部分，以及包含片段可結晶(Fc)區的第二部分。在一些實施方案中，免疫細胞在細胞表面上表現Fc受體(例如，CD16)，該Fc受體可以識別融合多肽的Fc區並介導對於工程化免疫細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。在一些實施方案中，該免疫細胞是自然殺手(NK)細胞(例如，從臍帶血獲得的NK細胞)、T細胞或腫瘤浸潤細胞(TIL)。在一些實施方案中，所述scFv任選地從N末端到C末端包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，該VL具有與SEQ ID NO: 9或13至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列，該VH具有與SEQ ID NO: 10或14至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，該VL和VH經由連接子肽(例如，柔性連接子)連接。在一些實施方案中，該連接子肽包含與SEQ ID NO: 11至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述scFv包含與SEQ ID NO: 12或15至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述Fc區包含人IgG(例如，IgG1)的鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域。在一些實施方案中，該鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 16至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列，該CH2結構域包含與SEQ ID NO: 17至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列，並且/或者該CH3結構域包含與SEQ ID NO: 18至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述Fc區包含本文所述的任何置換或突變(例如，圖 4中的任何突變)。在一些實施方案中，所述融合多肽進一步包含N末端訊息肽。在一些實施方案中，該訊息肽包含與人IL-2蛋白(NCBI參考號：NP_000577.2)的胺基酸1-20相對應的序列或由該序列組成。在一些實施方案中，該訊息肽是人IL-2的訊息肽。在一些實施方案中，該訊息肽包含與SEQ ID NO: 8至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，該融合多肽包含與SEQ ID NO: 19或20至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，本文所述的工程化免疫細胞還表現另一種融合多肽，該融合多肽任選地從N末端到C末端包含：包含介白素15(IL15)的全部或一部分的第一部分，以及包含介白素15受體α次單位(IL15Rα)的全部或一部分的第二部分，在一些實施方案中，該融合多肽可與IL15Rβ和IL15Rγ形成功能性複合物，以活化該工程化免疫細胞中的IL-15訊息傳導。 (2)“肽體”主題：

除表現和分泌如以上主題(A)中描述的一種或多種抗體外，根據一些實施方案，工程化Ab-NK細胞還被配置為替代地或組合地表現和分泌一種或多種肽體。如本文所用的，術語“肽體”(或“多種肽體”)是指這樣的多肽或蛋白質複合物：其包含與Fc結構域融合的生物活性多肽結構域：該生物活性多肽結構域(即，靶標結合域)被配置為選擇性地識別並結合靶細胞的細胞表面上的靶分子，而該Fc結構域類似地被配置為能夠提供細胞毒性。

肽體的靶標結合域和Fc結構域基本上使從Ab-NK細胞表現和分泌的肽體能夠識別、結合並標記靶細胞，然後募集效應免疫細胞(包括Ab-NK細胞本身)和補體系統，針對靶細胞發揮ADCC樣細胞毒性活性、ADCP樣吞噬活性和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。另外，肽體多肽還可以以與以上所示抗體構築體類似的方式與訊息肽融合。肽體的不同結構域的構築體結構在圖 8A- 圖8B中示出。

根據這類Ab-NK分泌的肽體的一些實施方案，靶標結合域包含衍生自配體多肽的序列，該配體多肽可以選擇性地識別並結合在靶細胞的細胞表面上特異性或豐富表現的一種或多種靶分子(例如，靶受體)。在本文中，這樣的配體多肽任選地可以是靶受體的天然配體，或其功能變體或片段，或者可以是經篩選展現出對靶受體的結合活性的配體模擬肽或人工肽。

表4中列出了已知與某些人類疾病(例如，腫瘤)相關的配體、受體或配體-受體對的實例。基於該表中直接提供的配體資訊(即，提供配體資訊)或間接提供的配體資訊(即，只提供受體資訊，但配體資訊可從受體資訊獲得)，可以設計將由Ab-NK細胞表現和分泌的肽體的靶標結合域。表4. 與人類疾病(例如，腫瘤)相關的配體、受體或配體-受體對的實例

在生物學術語中，“配體”是指訊息分子，而“受體”是指能夠與相應的配體結合，以將訊息向下游傳遞到接收細胞中的細胞膜蛋白。在本公開的上下文中，配體/受體蛋白對中的任何一種蛋白質都可以充當靶標結合蛋白，只要該對中的另一種蛋白質是有價值的治療靶標即可。因此，藉由將表 4中直接或間接提供的靶標結合蛋白的功能序列與功能性Fc結構域融合，可以構建和工程改造出將在Ab-NK細胞中表現和分泌的肽體。施用後，由此分泌的肽體可以選擇性地與靶細胞上相應的細胞表面靶標結合，從而標記這些靶細胞，並因此，在靶細胞的細胞表面上積累的肽體的功能性Fc結構域隨後可以募集效應免疫細胞和補體系統，從而活化針對這些靶細胞的ADCC/ADCP/CDC樣細胞毒性。

在此，提供了肽體的一個具體實施方案(即，抗IL13Rα2)，其靶標結合域包含介白素IL13(E13Y)配體或其功能片段或變體，這使得從NK細胞分泌的肽體能夠選擇性地結合被發現在惡性神經膠質瘤和腎細胞癌細胞中限制性表現的受體IL13Rα2。詳情可參見US 7514537B，其藉由引用整體併入本文。其他同樣顯示出與腫瘤限制性IL13Rα2受體的強選擇性結合的IL13變體可在E13(例如，置換為Y或R)、E92(例如，置換為L)、K105(例如，置換為R)、R109(例如，置換為K)、E110、G111、R112和F113(這些位置分別對應於SEQ ID NO: 21的位置11、90、107、103和108-111)處包含某些殘基置換，如在WO2016044811A1、WO2021183960A1和Madhankumar, A.B.等人, "Interleukin 13 mutants of enhanced avidity toward the glioma-associated receptor, IL13Rα2." Neoplasia6.1 (2004): 15-22中所報告的(這些引用的參考文獻的內容藉由引用整體併入本公開中)。因此，根據肽體的不同實施方案，靶標結合域可包含具有上述置換之一或其任何組合的IL13配體區。表 5中提供了這種抗IL13Rα2肽體的結構域結構和序列。預計抗IL13Rα2肽體可使表現該肽體的Ab-NK細胞藥物在諸如神經膠質瘤或腎癌等腫瘤組織中IL13Rα2表現增加的患者中具有治療效果。表5. 抗IL13Rα2肽體的結構域和序列資訊。

結構域	胺基酸序列 (SEQ ID NO)
訊息肽結構域	MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITAPP(SEQ ID NO: 1) MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO: 8；針對全長構築體挑選)
靶標結合域	GPVPPSTALR E LIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKI E VAQFVKDLLLHL K KLF REGRF N(SEQ ID NO: 21；野生型IL13，作為參考) GPVPPSTALR YLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN (SEQ ID NO: 22；IL13(E13Y，對應於SEQ ID NO: 21的位置11))
連接子/鉸鏈區	GGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGSS(SEQ ID NO: 23) EPKSCDKTHTCP(SEQ ID NO: 16；針對全長構築體挑選) GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO: 28)
Fc結構域	PCPAPELLAGPDVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSFEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSILTVLHQDWLNGKEYKCKVTNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 24；含有CH2和CH3結構域，其序列分別在SEQ ID NO: 17和18中提供)
抗IL13Rα2肽體(全長)	MYRMQLLSCIALSLALVTNSGPVPPSTALR YLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNEPKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSFEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSILTVLHQDWLNGKEYKCKVTNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 25；衍生自SEQ ID NO: 8、22、16和24)

除上述天然配體外，肽體還可包含衍生自經過電腦預測和實驗篩選(例如，在噬菌體展示中)的肽的人工肽序列，從而對靶細胞的細胞表面上的靶分子表現出很強的選擇性結合活性。

此外，為了降低脫靶效應，還可以藉由可降解的連接子將掩蔽肽與肽體類似地進行融合。這種設計的細節可參見以上提供的關於抗體的掩蔽肽的相關討論。

在此，應當指出，除NK細胞外，還可以工程改造其他免疫細胞，如淋巴細胞、T細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)等，使其表現上述這些特異性抗體或肽體，從而也可以使這些工程化的免疫細胞具有額外的ADCC/ADCP/CDC活性。

以上兩種NK細胞藥物平台具有以下特點。

1)除了諸如ADCC/ADCP/CDC活性或類似活性的免疫效應子功能外，被工程改造為在Ab-NK細胞中表現和分泌的抗體或肽體還可以發揮其他功能，包括中和某些藥劑、阻斷和/或促效某些訊息路徑等。

2)根據一些實施方案，抗體/肽體構築體可被工程改造為多價的，包含與一個單功能性Fc結構域融合的至少兩個靶標結合域(即，抗原結合域也可被視為靶標結合域)。這樣的多價靶標結合蛋白一旦表現和分泌，就可以識別至少兩種不同的細胞表面靶分子，由此獲得的一種單Ab-NK細胞藥物可以使一名施用該Ab-NK細胞的受試者中表現多種腫瘤靶標的靶細胞或多種不同類型的靶細胞(在腫瘤問題中，一種腫瘤細胞和一種基質細胞)被清除，從而導致更好的治療效果。

3)任選地，為了加強抗體的產生，NK細胞可以任選地被配置為共表現分泌型蛋白質生產加強劑如SRP14和其他訊息識別顆粒蛋白以及易位子複合物的蛋白質成員，如SEC61A、TRAP複合物和醣基轉移酶。

4)在如上所述的任何NK細胞藥物平台中，NK細胞可以是任何來源的。根據一些優選實施方案，NK細胞可以從臍帶血獲得，臍帶血提供易於在體外擴增和工程改造的細胞。其他來源可包括外周血NK細胞、iPSC衍生的NK細胞或NK細胞系如NK-92。

5)為了建立以上提及的兩種NK細胞藥物平台中的任何一種或兩種，可將至少一種上述轉基因轉導到從上述任何來源獲得的NK細胞中。簡言之，可以使用所有可用的基因工程方法，如CRISPR/Cas9、TALEN、鋅指蛋白、重組酶介導的基因打靶或病毒載體，將轉基因插入NK細胞基因組中。要獲得NK細胞藥物，需要表現一種或多種轉基因。如果使用逆轉錄病毒載體，則任選地且優選地，對該逆轉錄病毒載體進行修飾(例如，使用突變的WPRE)，以提高臨床安全性。如果要轉導超過一種轉基因，則這些轉基因任選地可以在同一載體中，也可以在不同的載體中，而如果在同一載體中，可以任選地在不同的轉錄物中轉錄並轉譯，也可以任選地轉錄並轉譯成單個多肽，由2A自切割肽(“2A”)隔開。應當指出，關於以上提及的轉基因構建和轉導方法，可以有其他不同的實施方案。

在一方面，本公開涉及一種工程化免疫細胞，其表現和/或分泌融合多肽，該融合多肽任選地從N末端到C末端包含：包含能夠與癌細胞表面上表現的受體(例如，IL13Rα2或表 4中的任何受體)結合的配體多肽的第一部分，以及包含片段可結晶(Fc)區的第二部分。在一些實施方案中，免疫細胞在細胞表面上表現Fc受體(例如，CD16)，該受體可以識別融合多肽的Fc區並介導對於工程化免疫細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。在一些實施方案中，該免疫細胞是自然殺手(NK)細胞(例如，從臍帶血獲得的NK細胞)、T細胞或腫瘤浸潤細胞(TIL)。在一些實施方案中，所述配體多肽包含野生型人IL-13(SEQ ID NO: 21)或由野生型人IL-13(SEQ ID NO: 21)組成。在一些實施方案中，該人IL-13在與SEQ ID NO: 21的Glu11相對應的位置處包含Tyr殘基。在一些實施方案中，所述Fc區包含人IgG(例如，IgG1)的CH2和CH3結構域。在一些實施方案中，所述配體多肽包含與SEQ ID NO: 21或22至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列，並且所述Fc區包含與SEQ ID NO: 17、18或24至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述Fc區包含本文所述的任何置換或突變(例如，圖 4中的任何突變)。在一些實施方案中，所述配體多肽和Fc區經由連接子肽(例如，柔性連接子)或鉸鏈區融合，其中該連接子肽或鉸鏈區包含與SEQ ID NO: 16、23或28至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述融合多肽進一步包含N末端訊息肽。在一些實施方案中，該訊息肽包含與人IL-2蛋白(NCBI參考號：NP_000577.2)的胺基酸1-20相對應的序列或由該序列組成。在一些實施方案中，該訊息肽是人IL-2的訊息肽。在一些實施方案中，該訊息肽包含與人IL-15Rα蛋白(NCBI參考號：NP_002180.1)的胺基酸1-35相對應的序列或由該序列組成，任選地，該訊息肽在與人IL-15Rα蛋白的Cys33相對應的位置處包含Ala殘基。在一些實施方案中，該訊息肽包含人IL-15Rα蛋白的訊息肽。在一些實施方案中，該訊息肽包含與SEQ ID NO: 1或8至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述融合多肽包含與SEQ ID NO: 25至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，本文所述的工程化免疫細胞進一步表現另一種融合多肽，該融合多肽任選地從N末端到C末端包含：包含介白素15(IL15)的全部或一部分的第一部分，以及包含IL15Rα的全部或一部分的第二部分，在一些實施方案中，該融合多肽可與IL15Rβ和IL15Rγ形成功能性複合物，以活化該工程化免疫細胞中的IL-15訊息傳導。抗體和抗原結合片段

本公開提供了能與PD-L1(例如，人PD-L1)特異性結合的抗體及其抗原結合片段。本文所述的抗體和抗原結合片段能夠與PD-L1結合。在一些實施方案中，這些抗體可以阻斷人PD-L1與PD-L1配體(例如，PD-1)的結合。在一些實施方案中，這些抗體可以啓動ADCC、ADCP和/或CDC活性。在一些實施方案中，這些抗體與表現PD-L1的細胞(例如，癌細胞)結合。

本公開提供了，例如，抗PD-L1抗體L8和L2，及其修飾抗體，包括，例如，嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。

L2和L2衍生抗體(例如，人源化抗體)的CDR序列包括重鏈可變域的CDR——SEQ ID NO: 31、32、33，和輕鏈可變域的CDR——SEQ ID NO: 34、35、36，如根據Kabat定義所定義的。CDR也可以用North/Aho系統來定義。根據North/Aho定義，重鏈可變域的CDR序列在SEQ ID NO: 43、44、45中示出，而輕鏈可變域的CDR序列在SEQ ID NO: 46、47、48中示出。

L8和L8衍生抗體(例如，人源化抗體)的CDR序列包括重鏈可變域的CDR——SEQ ID NO: 37、38、39，和輕鏈可變域的CDR——SEQ ID NO: 40、41、42，如根據Kabat定義所定義的。CDR也可以用North/Aho系統來定義。根據North/Aho定義，重鏈可變域的CDR序列在SEQ ID NO: 49、50、51中示出，而輕鏈可變域的CDR序列在SEQ ID NO: 52、53、54中示出。

L8抗體的重鏈可變區的胺基酸序列在SEQ ID NO: 10中示出。L8抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列在SEQ ID NO: 9中示出。L2抗體的重鏈可變區的胺基酸序列在SEQ ID NO: 14中示出。7B5抗體的輕鏈可變區的胺基酸序列在SEQ ID NO: 13中示出。

還提供了修飾抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列。在一些實施方案中，重鏈可變區與SEQ ID NO: 10或14至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在一些實施方案中，輕鏈可變區與SEQ ID NO: 9或13至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。重鏈可變區序列可與相應的輕鏈可變區序列配對，並且它們一起與PD-L1結合。

此外，在一些實施方案中，本文所述的抗體或其抗原結合片段還可以包含一個、兩個或三個選自SEQ ID NO: 31-33、SEQ ID NO: 37-39、SEQ ID NO: 43-45和SEQ ID NO: 49-51的重鏈可變區CDR；和/或一個、兩個或三個選自SEQ ID NO: 34-36、SEQ ID NO: 40-42、SEQ ID NO: 46-48和SEQ ID NO: 52-54的輕鏈可變區CDR。

在一些實施方案中，所述抗體可以具有包含互補決定區(CDR)1、2、3的重鏈可變區(VH)，其中CDR1區包含與所選VH CDR1胺基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由該序列組成，CDR2區包含與所選VH CDR2胺基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由該序列組成，並且CDR3區包含與所選VH CDR3胺基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由該序列組成。在一些實施方案中，所述抗體可以具有包含CDR 1、2、3的輕鏈可變區(VL)，其中CDR1區包含與所選VL CDR1胺基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由該序列組成，CDR2區包含與所選VL CDR2胺基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由該序列組成，並且CDR3區包含與所選VL CDR3胺基酸序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由該序列組成。所選VH CDR 1、2、3胺基酸序列和所選VL CDR 1、2、3胺基酸序列在圖 21(Kabat定義下的CDR)和圖 22(North/Aho定義下的CDR)中示出。

在一些實施方案中，本文所述的抗體或抗原結合片段可包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含一個、兩個或三個以下序列的CDR：SEQ ID NO: 31，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 32，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 33，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換。

在一些實施方案中，本文所述的抗體或抗原結合片段可包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含一個、兩個或三個以下序列的CDR：SEQ ID NO: 37，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 38，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 39，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換。

在一些實施方案中，本文所述的抗體或抗原結合片段可包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含一個、兩個或三個以下序列的CDR：SEQ ID NO: 43，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 44，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 45，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換。

在一些實施方案中，本文所述的抗體或抗原結合片段可包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含一個、兩個或三個以下序列的CDR：SEQ ID NO: 49，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 50，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 51，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換。

在一些實施方案中，本文所述的抗體或抗原結合片段可包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含一個、兩個或三個以下序列的CDR：SEQ ID NO: 34，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 35，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 36，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換。

在一些實施方案中，本文所述的抗體或抗原結合片段可包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含一個、兩個或三個以下序列的CDR：SEQ ID NO: 40，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 41，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 42，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換。

在一些實施方案中，本文所述的抗體或抗原結合片段可包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含一個、兩個或三個以下序列的CDR：SEQ ID NO: 46，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 47，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 48，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換。

在一些實施方案中，本文所述的抗體或抗原結合片段可包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含一個、兩個或三個以下序列的CDR：SEQ ID NO: 52，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 53，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換；SEQ ID NO: 54，具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或置換。

所述插入、缺失和置換可在CDR序列內，或在CDR序列的一個或兩個末端處。在一些實施方案中，CDR根據Kabat定義方案來確定。在一些實施方案中，CDR根據North/Aho定義方案來確定。在一些實施方案中，CDR根據Kabat和North/Aho定義方案的組合來確定。在一些實施方案中，CDR根據IMGT定義來確定。在一些實施方案中，CDR根據接觸定義來確定。在一些實施方案中，CDR根據Chothia定義來確定。在一些實施方案中，CDR使用電腦工具ABodyBuilder2 (詳情可參見https://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/sabpred)來確定。

本公開還提供了能與PD-L1結合的抗體或其抗原結合片段。所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，該VH包含與所選VH序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由該序列組成，該VL包含與所選VL序列至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列或由該序列組成。在一些實施方案中，所選VH序列是SEQ ID NO: 10，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 9。在一些實施方案中，所選VH序列是SEQ ID NO: 14，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 13。

為了確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分比，為了最佳比較目的對這些序列進行比對(例如，為了最佳比對可以在第一和第二胺基酸或核酸序列的一個或兩個序列中引入空位，並且為了比較目的可以忽略非同源序列)。然後比較相應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置與第二序列中的相應位置被相同的胺基酸殘基或核苷酸占據時，這兩個分子在該位置處是相同的。兩個序列之間的同一性百分比是這兩個序列共有的相同位置的數目的函數，其中考慮為了兩個序列的最佳比對而需要引入的空位的數目和每個空位的長度。例如，可以使用Blossum 62評分矩陣，採用以下參數來進行序列的比較並確定兩個序列之間的同一性百分比：空位罰分為12，空位延伸罰分為4，且框移空位罰分為5。

本公開還提供了包含編碼多肽的多核苷酸的核酸，該多肽包含免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈。該免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈包含如圖 21或圖 22所示的CDR，或表 3所示的VH/VL。當多肽與相應的多肽(例如，相應的重鏈可變區或相應的輕鏈可變區)配對時，配對後的多肽能與PD-L1結合。

所述抗PD-L1抗體和抗原結合片段還可以是抗體或抗體片段的抗體變體(包括衍生物和綴合物)以及多特異性(例如，雙特異性)抗體或抗體片段。本文提供的其他抗體有多株抗體、單株抗體、多聚抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、人抗體、嵌合抗體(例如，人-小鼠嵌合抗體)、單鏈抗體、細胞內產生的抗體(即，胞內抗體)及其抗原結合片段。所述抗體或其抗原結合片段可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段是IgG抗體或其抗原結合片段。

抗體的片段適合在所提供的方法中使用，只要其保留了全長抗體的所需親和力和特異性即可。因此，能與PD-L1結合的抗體的片段將保留與PD-L1結合的能力。Fv片段是含有完整抗原識別和結合位點的抗體片段。該區域由緊密締合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成，該締合在性質上可以是共價的，例如在scFv中。正是以這種構型，每個可變域的三個CDR相互作用，從而在VH-VL二聚體的表面上限定出抗原結合位點。這六個CDR或其子集共同地給抗體賦予抗原結合特異性。然而，甚至單可變域(或者Fv的一半，其只包含三個對抗原具有特異性的CDR)也可具有識別並結合抗原的能力，儘管親和力通常低於完整的結合位點。單鏈Fv或(scFv)抗體片段包含抗體的VH和VL結構域(或區)，其中這些結構域存在於單條多肽鏈中。通常，scFv多肽進一步在VH和VL結構域之間包含多肽連接子，這使得scFv能夠形成用於抗原結合的所需結構。

本公開還提供了一種與本文所述的任何抗體或抗原結合片段交叉競爭的抗體或其抗原結合片段。交叉競爭試驗是本領域已知的，並且例如在Moore等人, "Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein." Journal of Virology70.3 (1996): 1863-1872中描述，其藉由引用整體併入本文。在一方面，本公開還提供了一種抗體或其抗原結合片段，其與本文所述的任何抗體或抗原結合片段結合相同的表位或區域。表位分型(binning)試驗是本領域已知的，並且例如在Estep等人. "High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning." MAbs. Vol. 5. No. 2. Taylor & Francis, 2013中描述，其藉由引用整體併入本文。

本公開提供了由本文所述的抗PD-L1抗體衍生的各種抗體及其抗原結合片段。通常，抗體(也稱為免疫球蛋白)由兩類多肽鏈組成，即輕鏈和重鏈。本公開的抗體的一個非限制性實例可以是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的完整的四免疫球蛋白鏈抗體。抗體的重鏈可以是任何同種型，包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD，或任何亞同種型，包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等。輕鏈可以是κ輕鏈或λ輕鏈。抗體可包含兩個相同拷貝的輕鏈和兩個相同拷貝的重鏈。各自含有一個可變域(或可變區，VH)和多個恆定域(或恆定區)的重鏈經由其恆定域內的二硫鍵彼此結合，從而形成抗體的“莖(stem)”。各自含有一個可變域(或可變區，VL)和一個恆定域(或恆定區)的輕鏈各自經由二硫鍵與一條重鏈結合。每條輕鏈的可變區同與之結合的重鏈的可變區對齊。輕鏈和重鏈的可變區都含有三個高變區，這些高變區夾在更保守的框架區(FR)之間。

這些被稱為互補決定區(CDR)的高變區形成環，所述環構成抗體的抗原結合表面。四個框架區主要採取β-折疊構象，而CDR形成連接β-折疊結構的環，在某些情況下形成β-折疊結構的一部分。每條鏈中的CDR藉由框架區緊密靠近，並與來自另一條鏈的CDR一起促進抗原結合區的形成。

藉由分析抗體的胺基酸序列來確定抗體的CDR區的方法是公知的，並且CDR的許多定義是常用的。Kabat定義基於序列可變性，而Chothia定義基於結構環區的位置。這些方法和定義例如在以下文獻中描述： Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439；Abhinandan等人, "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains," Molecular immunology 45.14 (2008): 3832-3839；Wu, T.T.和Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250；Martin等人, Methods Enzymol. 203:121-53 (1991)；Morea等人, Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (1997年10月)；Morea等人, J Mol Biol. 275(2):269-94 (1998年1月)；Chothia等人, Nature 342(6252):877-83 (1989年12月)；Ponomarenko和Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007)；其中每一篇均藉由引用整體併入本文。

CDR對於識別抗原的表位而言至關重要。如本文所用的，“表位”是靶分子中能夠被抗體的抗原結合域特異性結合的最小部分。表位的最小尺寸可以是大約三個、四個、五個、六個或七個胺基酸，但是這些胺基酸不一定是抗原的一級結構的連續線性序列，因為表位可以依賴於基於抗原二級和三級結構的抗原三維構型。

在一些實施方案中，抗體是完整的免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亞類(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)高度保守，在其恆定區，特別是在其鉸鏈和CH2結構域上部存在差異。IgG亞類的序列和差異是本領域已知的，並且例如在以下文獻中描述：Vidarsson等人, "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions." Frontiers in immunology 5 (2014)；Irani等人, "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases." Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182；Shakib, Farouk編著, The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016；其中每一篇均藉由引用整體併入本文。

抗體還可以是來源於任何物種(例如，人、齧齒動物、小鼠、駱駝科動物)的免疫球蛋白分子。本文公開的抗體還包括但不限於多株抗體、單株抗體、單特異性抗體、多特異性抗體和包含與另一多肽融合的免疫球蛋白結合域的嵌合抗體。術語“抗原結合域”或“抗原結合片段”是抗體中保留完整抗體的特異性結合活性的部分，即抗體中能夠與完整抗體的靶分子上的表位特異性結合的任何部分。它包括，例如，Fab、Fab'、F(ab') ₂和這些片段的變體。因此，在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段可以是，例如，scFv、Fv、Fd、dAb、雙特異性抗體、雙特異性scFv、雙抗體(diabody)、線性抗體、單鏈抗體分子、由抗體片段形成的多特異性抗體，以及包含作為抗體結合域或與抗體結合域同源的結合域的任何多肽。抗原結合域的非限制性實例包括，例如，完整抗體的重鏈和/或輕鏈CDR、完整抗體的重鏈和/或輕鏈可變區、完整抗體的全長重鏈或輕鏈，或來自完整抗體的重鏈或輕鏈的單個CDR。

還提供了適合在本文所述的方法中使用的抗體片段。Fab片段含有輕鏈的可變域和恆定域以及重鏈的可變域和第一恆定域(CH1)。F(ab') ₂抗體片段包含一對Fab片段，它們通常在其羧基端附近藉由它們之間的鉸鏈半胱胺酸共價連接。抗體片段的其他化學偶聯也是本領域已知的。

雙抗體(diabodies)是具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，所述片段包含在同一多肽鏈中與VL連接的VH(VH和VL)。藉由使用因太短而不允許在同一條鏈上的兩個結構域之間配對的連接子，迫使所述結構域與另一條鏈的互補結構域配對，並形成兩個抗原結合位點。

線性抗體包含一對串聯的Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)，所述區段與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。

本公開的抗體和抗體片段可在Fc區中進行修飾，以提供所需的效應子功能或血清半衰期。

抗體的多聚化可透過抗體的自然聚集或透過本領域已知的化學或重組連接技術來實現。例如，一定比例的純化抗體製品(例如，純化的IgG ₁分子)自發形成包含抗體同源二聚體和其他更高階抗體多聚體的蛋白質聚集體。

或者，抗體同源二聚體可透過本領域已知的化學連接技術來形成。例如，可以使用包括但不限於SMCC(4-(馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺酯)和SATA(N-琥珀醯亞胺基S-乙醯基硫基-乙酸酯)的異雙功能交聯劑來形成抗體多聚體。Ghetie等人( Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.94: 7509-7514, 1997)描述了用於形成抗體同源二聚體的示例性方案。抗體同源二聚體可透過用胃蛋白酶消化轉化為Fab’ ₂同源二聚體。另一種形成抗體同源二聚體的方法是透過使用Zhao等人( J. Immunol.25:396-404, 2002)描述的自親性(autophilic)T15肽。

在一些實施方案中，多特異性抗體是雙特異性抗體。雙特異性抗體可藉由工程改造一對抗體分子之間的界面，以使從重組細胞培養物中回收的異源二聚體的百分比最大化來製備。例如，該界面可包含抗體恆定域的CH3結構域的至少一部分。在該方法中，來自第一抗體分子的界面的一個或多個小胺基酸側鏈被更大的側鏈(例如，酪胺酸或色胺酸)代替。藉由用較小的胺基酸側鏈(例如，丙胺酸或蘇胺酸)代替大胺基酸側鏈，在第二抗體分子的界面上創建與大側鏈具有相同或相似大小的補償“空腔”。這提供了相對於其他不需要的終產物如同源二聚體增加異源二聚體的產量的機制。該方法例如在WO 96/27011中描述，其藉由引用而整體併入。

雙特異性抗體包括交聯抗體或“異綴合”抗體。例如，異綴合物中的一個抗體可以與抗生物素蛋白偶聯，而另一個抗體可以與生物素偶聯。異綴合抗體還可以使用任何方便的交聯方法來製備。合適的交聯劑和交聯技術是本領域公知的，並且在第4,676,980號美國專利中公開，其藉由引用整體併入本文。

本文所述的任何抗體或抗原結合片段均可與穩定分子(例如，延長抗體或其抗原結合片段在受試者或溶液中的半衰期的分子)綴合。穩定分子的非限制性實例包括：聚合物(例如，聚乙二醇)或蛋白質(例如，血清白蛋白，如人血清白蛋白)。穩定分子的綴合可延長抗體或抗原結合片段在體外(例如，在組織培養中或當作為藥物組合物儲存時)或體內(例如，在人體中)的半衰期或擴展其生物活性。

在一些實施方案中，本文所述的抗體或抗原結合片段可與治療劑綴合。包含抗體或其抗原結合片段的抗體-藥物綴合物可與治療劑共價或非共價結合。在一些實施方案中，該治療劑是細胞毒性劑或細胞抑制劑(例如，松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼、多柔比星、柔紅黴素、二羥基蒽醌(dihydroxyanthracin)、諸如DM-1和DM-4等美登木素生物鹼、二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-脫氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤黴素、表柔比星和環磷醯胺及類似物)。

在一些實施方案中，抗原結合片段可構成嵌合抗原受體(CAR)的一部分。在一些實施方案中，該嵌合抗原受體是本文所述的單鏈可變片段(scFv)與CD3-zeta跨膜域和胞內域(endodomain)融合的融合體。在一些實施方案中，該嵌合抗原受體還包含來自各種共刺激蛋白受體(例如，CD28、41BB、ICOS)的細胞內訊息結構域。在一些實施方案中，該嵌合抗原受體包含多個訊息結構域，例如，CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以提高效力。因此，在一方面，本公開進一步提供了表現本文所述的嵌合抗原受體的細胞(例如，T細胞)。

在一些實施方案中，scFv具有一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域。在一些實施方案中，scFv具有兩個重鏈可變域和兩個輕鏈可變域。

在一些實施方案中，可以使用本文所述的抗體或其抗原結合片段的序列(例如，CDR或VH/VL序列)生成靶向PD-L1和另外的抗原的雙特異性抗體。

在一些實施方案中，本文所述的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段可與表現PD-L1的細胞結合，其Kd值小於約0.1 μg/mL、小於約0.09 μg/mL、小於約0.08 μg/mL、小於約0.07 μg/mL、小於約0.06 μg/mL、小於約0.05 μg/mL、小於約0.04 μg/mL或小於約0.03 μg/mL。在一些實施方案中，本文所述的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段可與表現PD-L1的細胞結合，其Kd值與參考抗PD-L1抗體(例如，阿特珠單抗(atezolizumab))相當(小於約120%、小於約150%、小於約180%、小於約200%、小於約250%或小於約300%)。

在一些實施方案中，本文所述的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段可與重組人PD-L1蛋白結合，其Kd值小於約0.1 μg/mL、小於約0.09 μg/mL、小於約0.08 μg/mL、小於約0.07 μg/mL、小於約0.06 μg/mL、小於約0.05 μg/mL、小於約0.04 μg/mL、小於約0.03 μg/mL、小於約0.02 μg/mL或小於約0.01 μg/mL。在一些實施方案中，本文所述的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段可與重組人PD-L1蛋白結合，其Kd值與參考抗PD-L1抗體(例如，阿特珠單抗)相當(小於約120%、小於約150%、小於約180%、小於約200%、小於約250%、小於約300%、小於約340%、小於約400%、小於約450%或小於約500%)。

在一些實施方案中，本文所述的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段可以阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用，其EC ₅₀值小於約0.1 μg/mL、小於約0.09 μg/mL、小於約0.08 μg/mL、小於約0.07 μg/mL、小於約0.06 μg/mL、小於約0.05 μg/mL、小於約0.04 μg/mL、小於約0.03 μg/mL、小於約0.02 μg/mL或小於約0.01 μg/mL。在一些實施方案中，本文所述的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段可以阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用，其Kd值與參考抗PD-L1抗體(例如，阿特珠單抗)相當(小於約120%、小於約150%、小於約180%、小於約200%、小於約250%或小於約300%)。

在一些實施方案中，本文所述的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段可與PD-L1特異性結合。在一些實施方案中，本文所述的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段不與SSTR4或FCGR蛋白(例如，FCGR1A、FCGR3B或FCGR2B)特異性結合。工程化細胞

本公開提供了表現細胞膜結合的IL15(例如，本文所述的任何膜結合的IL15構築體)並且/或者表現/分泌含Fc的抗體或其抗原結合片段和/或肽體(例如，本文所述的任何抗體或其抗原結合片段，或本文所述的任何肽體)的工程化細胞(例如，NK細胞)。這些工程化細胞可用於治療如本文所述的各種病症或疾病(例如，癌症)。

在各個實施方案中，工程化的細胞可從例如人類和非人類動物獲得。在各個實施方案中，工程化的細胞可從細菌、真菌、人類、大鼠、小鼠、兔、猴、豬或任何其他物種獲得。優選地，該細胞來自人類、大鼠或小鼠。更優選地，該細胞從人類獲得。在各個實施方案中，工程化的細胞是血細胞。優選地，該細胞是白血球、淋巴細胞或任何其他合適的血細胞類型。在一些實施方案中，該細胞是外周血細胞。在一些實施方案中，該細胞是T細胞、腫瘤浸潤細胞(TIL)或NK細胞。在一些實施方案中，該細胞是免疫細胞，如臍帶血來源的NK細胞。

在一些實施方案中，所述細胞是NK細胞。在一些實施方案中，工程化細胞的製備包括一個或多個培養和/或製備步驟。用於工程改造為表現嵌合多肽(或融合多肽)、抗體或其抗原結合片段和/或肽體的細胞可分離自樣品，如生物樣品，例如，從受試者獲得或衍生的樣品。在一些實施方案中，從中分離出細胞的受試者是患有疾病或病狀或需要細胞療法或將向其施用細胞療法的受試者。在一些實施方案中，受試者是需要特定治療性干預如過繼細胞療法(對其進行細胞分離、處理和/或工程改造)的人。

在一些實施方案中，所述細胞是T細胞。在一些實施方案中，所述T細胞可表現識別靶細胞表面上的特定抗原部分的細胞表面受體。該細胞表面受體可以是野生型或重組T細胞受體(TCR)、嵌合抗原受體(CAR)或能夠識別與靶細胞相關的抗原部分的任何其他表面受體。T細胞可藉由本領域已知的各種方法獲得，例如，從患者分離的T細胞(例如，腫瘤浸潤淋巴細胞)的體外培養。TCR基因修飾的T細胞可藉由用病毒載體轉導(例如，從患者的外周血中分離的)T細胞而獲得。在一些實施方案中，所述T細胞是TCR基因修飾的T細胞。在一些實施方案中，所述T細胞是CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或調節性T細胞。在一些實施方案中，所述T細胞是1型T輔助T細胞和2型T輔助T細胞。在一些實施方案中，表現這種受體的T細胞是αβ-T細胞。在替代實施方案中，表現這種受體的T細胞是γδ-T細胞。

在一些實施方案中，所述細胞是幹細胞，如多能(multipotent)幹細胞和萬能(pluripotent)幹細胞，包括誘導萬能幹細胞(iPSC)。所述細胞可以是初代細胞，如直接從受試者分離的細胞和/或從受試者分離並冷凍的細胞。在一些實施方案中，幹細胞與額外的分化因子一起培養，以獲得所需的細胞類型(例如，NK細胞)。

不同的細胞類型可從適當的分離方法獲得。分離方法包括基於一種或多種特定分子(如表面標誌物，例如表面蛋白，細胞內標誌物，或核酸)在細胞中的表現或存在來分離不同的細胞類型。在一些實施方案中，可以使用任何已知的基於此類標誌物進行分離的方法。在一些實施方案中，分離是基於親和力或免疫親和力的分離。例如，在一些方面，分離包括基於一種或多種標誌物(通常是細胞表面標誌物)的細胞表現或表現水平來分離細胞和細胞群體，例如，藉由與特異性結合此類標誌物的抗體或結合配偶體一起孵育，隨後通常進行洗滌步驟，並將已結合該抗體或結合配偶體的細胞與未結合該抗體或結合配偶體的細胞分離開。

這樣的分離步驟可基於陽性選擇和/或陰性選擇，在陽性選擇中，保留已與試劑結合的細胞以供進一步使用，而在陰性選擇中，保留未與抗體或結合配偶體結合的細胞。在一些實例中，兩個級分都被保留以供進一步使用。在一些方面，當無法獲得特異性識別異質群體中的某種細胞類型的抗體，因此最好基於所需群體以外的細胞所表現的標誌物來進行分離時，陰性選擇可能是特別有用的。

還提供了用於表現本文所述的嵌合多肽(或融合多肽)、抗體或其抗原結合片段和/或肽體以及用於產生表現這類分子的基因工程免疫細胞(例如，NK細胞)的方法、核酸、組合物和試劑盒。基因工程通常包括將編碼這些分子的核酸引入細胞中，例如藉由逆轉錄病毒轉導、轉染或轉形。在一些實施方案中，基因轉移藉由以下步驟來完成：首先刺激細胞，例如將細胞與誘導諸如增殖、存活和/或活化等反應的刺激物相組合，例如，如藉由細胞介素或活化標誌物的表現所衡量的，隨後轉導活化的細胞，並在培養中擴增到足以用於臨床應用的數量。

在一些實施方案中，使用重組感染性病毒顆粒，例如，從猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相關病毒(AAV)衍生的載體，將重組核酸轉移到細胞中。在一些實施方案中，使用重組慢病毒載體或逆轉錄病毒載體，如γ-逆轉錄病毒載體，將重組核酸轉移到T細胞中。在一些實施方案中，該逆轉錄病毒載體具有長末端重複序列(LTR)，例如，從Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎幹細胞病毒(MESV)、鼠幹細胞病毒(MSCV)或脾病灶形成病毒(SFFV)衍生的逆轉錄病毒載體。大多數逆轉錄病毒載體都衍生自鼠逆轉錄病毒。在一些實施方案中，逆轉錄病毒包括來自任何禽類或哺乳動物細胞來源的逆轉錄病毒。逆轉錄病毒通常是雙嗜性的，這意味著它們能夠感染包括人類在內的若干物種的宿主細胞。在一些實施方案中，該載體是慢病毒載體。在一些實施方案中，經由電穿孔將重組核酸轉移到T細胞中。在一些實施方案中，經由轉位將重組核酸轉移到T細胞中。在免疫細胞中引入並表現遺傳物質的其他方法包括磷酸鈣轉染、原生質體融合、陽離子脂質體介導的轉染、鎢粒子促進的微粒轟擊和磷酸鍶DNA共沉澱。這些方法中的許多方法例如在WO2019195486中描述，其藉由引用整體併入本文。

還提供了工程化細胞的群體、含有此類細胞和/或富集此類細胞的組合物，例如，其中表現結合分子的細胞占該組合物中的總細胞或特定類型細胞如NK細胞、T細胞或TIL的至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高百分比。重組載體

本公開還提供了包含分離的本文公開的多核苷酸(例如，編碼本文公開的多肽的多核苷酸)的重組載體(例如，表現載體)，引入所述重組載體的宿主細胞(即，使得宿主細胞含有該多核苷酸和/或包含該多核苷酸的載體)，以及藉由重組技術產生重組多肽或其片段。

如本文所用的，“載體”是指當載體被引入宿主細胞中時，能夠將一種或多種感興趣的多核苷酸遞送至宿主細胞的任何構築體。“表現載體”能夠在已經引入該表現載體的宿主細胞中遞送一種或多種感興趣的多核苷酸並將其表現為編碼的多肽。因此，在表現載體中，感興趣的多核苷酸藉由以下方式定位以供在載體中表現：與載體內或宿主細胞基因組中位於感興趣多核苷酸的整合位點之處或附近或側翼的調節元件如啟動子、增強子和/或聚A尾可操作地連接，使得感興趣的多核苷酸將在引入該表現載體的宿主細胞中轉譯。在一些實施方案中，本文所述的載體可具有圖 3A-3B 、5A 和圖8A-8B所示的示意結構。

載體可藉由本領域已知的方法引入宿主細胞中，例如，藉由電穿孔、化學轉染(例如，DEAE-葡聚糖)、轉形、轉染以及感染和/或轉導(例如，採用重組病毒)。因此，載體的非限制性實例包括病毒載體(可用於生成重組病毒)、裸DNA或RNA、質體、黏質體、噬菌體載體以及與陽離子縮合劑關聯的DNA或RNA表現載體。

本公開提供了一種包含適合對細胞進行遺傳修飾的核酸構築體的重組載體，其可用於治療病理性疾病或病狀。

任何載體或載體類型都可用於向細胞遞送遺傳物質。這些載體包括但不限於質體載體、病毒載體、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)和人類人工染色體(HAC)。病毒載體可包括但不限於重組逆轉錄病毒載體、重組慢病毒載體、重組腺病毒載體、泡沫病毒載體、重組腺相關病毒(AAV)載體、雜交載體和質體轉位子(例如，睡美人(sleeping beauty)轉位子系統和PiggyBac轉位子系統)或基於整合酶的載體系統。本領域已知的其他載體也可與本文所述的方法結合使用。

在一些實施方案中，所述載體是病毒載體。病毒載體可以在製備病毒載體專用的培養基中生長。根據本文所述的實施方案，可以使用任何合適的用於生長病毒載體的生長培養基和/或補充劑。

在一些實施方案中，所使用的載體是重組逆轉錄病毒載體。逆轉錄病毒載體能夠引導感興趣的核酸分子的表現。逆轉錄病毒以RNA形式存在於其病毒衣殼(capsule)中，並且當在宿主細胞中複製時形成雙鏈DNA中間體。類似地，逆轉錄病毒載體以RNA和雙鏈DNA兩種形式存在。逆轉錄病毒載體還包括含有重組DNA片段的DNA形式和含有重組RNA片段的RNA形式。載體可包含至少一個轉錄啟動子/增強子或其他控制基因表現的元件。這類載體還可包含包裝訊息、長末端重複序列(LTR)或其部分，以及適合於所使用的逆轉錄病毒的正鏈和負鏈引子結合位點。長末端重複序列(LTR)是在藉由逆轉錄病毒RNA的逆轉錄形成的逆轉錄轉位子或前病毒DNA的任一端處發現的、重複多次(例如，數百次或數千次)的相同DNA序列。病毒利用它們將其遺傳物質插入宿主基因組中。任選地，載體還可包含引導聚腺苷酸化的訊息，選擇性標記，如胺苄青黴素抗性、新黴素抗性、TK、潮黴素抗性、腐草黴素抗性、組胺醇抗性或DHFR，以及一個或多個限制位點和轉譯終止序列。例如，這類載體可包含5' LTR、前導序列、tRNA結合位點、包裝訊息、第二鏈DNA合成起點和3' LTR或其部分。另外，本文使用的逆轉錄病毒載體還可指藉由去除逆轉錄病毒gag、pol和env基因並用感興趣的基因替換而產生的重組載體。

在一些實施方案中，所述載體可包含編碼抑制蛋白(例如，檢查點抑制劑)的另外的核酸。在各個實施方案中，所述細胞表現基因工程抗原受體和抑制蛋白。在各個實施方案中，該抑制蛋白是組成型表現的。

在一些實施方案中，所述載體或構築體可包含驅動一種或多種核酸分子的表現的單個啟動子。在一些實施方案中，這樣的啟動子可以是多順反子的(雙順反子或三順反子的)。例如，在一些實施方案中，可將轉錄單元工程改造為含有IRES(內部核糖體進入位點)的雙順反子單元，這允許由資訊從單個啟動子共表現基因產物(例如，編碼TCR的α鏈和/或β鏈)。或者，在某些情況下，單個啟動子可引導RNA的表現，該RNA在單個開放閱讀框(ORF)中含有兩個或三個基因，這些基因被編碼自切割肽(self-cleavage peptide)(例如，P2A或T2A)或蛋白酶識別位點(例如，弗林蛋白酶)的序列彼此隔開。因此，ORF編碼單個多聚蛋白，在轉譯過程中(在2A例如T2A的情況下)或在轉譯後，該多聚蛋白被裂解成單獨的蛋白質。在某些情況下，諸如T2A的肽可導致核糖體跳過(核糖體跳躍)2A元件的C末端處肽鍵的合成，從而導致2A序列的末端與下游下一個肽之間的分離。

各種細胞系均可與本文所述的載體結合使用。可用於表現多肽的示例性真核細胞包括但不限於：COS細胞，包括COS 7細胞；293細胞，包括293-6E細胞；CHO細胞，包括CHO-S、DG44.Lec13 CHO細胞和FUT8 CHO細胞；PER.C6®細胞；以及NSO細胞。在一些實施方案中，特定的真核宿主細胞基於其對結合分子進行所需轉譯後修飾的能力進行選擇。例如，在一些實施方案中，CHO細胞產生的多肽比293細胞中產生的相同多肽具有更高水平的唾液酸化。

如本文所用的術語“連接子”(L)或“連接子肽”是指長度約為1至100個胺基酸的寡肽或多肽區，其將任何結構域/區域連接在一起。連接子可由柔性殘基如甘胺酸和絲胺酸組成，使得相鄰的蛋白質結構域可相對於彼此自由移動。當需要確保兩個相鄰的結構域不會相互空間干擾時，可以使用較長的連接子。連接子可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解連接子的實例包括2A連接子(例如P2A、T2A)、2A樣連接子或其功能等同物，及其組合。在一些實施方案中，連接子包括小RNA病毒2A樣連接子、豬鐵士古病毒的CHYSEL序列(P2A)、Thosea asigna病毒(T2A)或其組合、變體和功能等同物。其他連接子對於本領域技術人員來說是顯而易見的，並且可在本文所述的方法中使用。

重組融合蛋白的成功構建通常需要兩個要素：成分蛋白質和連接子。成分蛋白質的選擇基於融合蛋白產物的所需功能，並且在大多數情況下相對簡單。另一方面，選擇合適的連接子將蛋白質結構域連接在一起可能是複雜的，並且在融合蛋白的設計中往往被忽視。不使用連接子而直接融合功能結構域可導致許多不良後果，包括融合蛋白的錯折疊、蛋白質產量低或生物活性受損。因此，選擇或合理設計連接子來連接融合蛋白結構域是重組融合蛋白技術中一個重要但尚未充分開發的領域。連接子設計的細節，尤其是柔性連接子與剛性連接子之間的選擇，可參見，例如，Chen, X.等人, "Fusion protein linkers: property, design and functionality." Advanced Drug Delivery Reviews65.10 (2013): 1357-1369，其藉由引用整體併入本文。

在一些實施方案中，本文所述的融合蛋白或融合多肽包含連接第一部分與第二部分的連接子。在一些實施方案中，該連接子是柔性連接子，例如，具有與SEQ ID NO: 4、11或28至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列的連接子。在一些實施方案中，該連接子包含與GGGGS(SEQ ID NO: 29)或GGGS(SEQ ID NO: 30)的一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7或8個)重複序列至少80%、85%、90%、95%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，柔性連接子中至少50%、60%、70%、80%或90%的胺基酸殘基是甘胺酸殘基。

本公開還提供了一種核酸序列，其包含編碼本文所述的任何嵌合多肽(或融合多肽)、抗體或其抗原結合片段和/或肽體的核苷酸序列。如本文所用的“核酸”可包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，並且通常是指DNA或RNA的聚合物，其可以是單鏈或雙鏈的，合成的或從天然來源獲得的，可以含有天然、非天然或改變的核苷酸。此外，核酸還包含互補DNA(cDNA)。通常，優選地，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或置換。然而，如本文所討論的，在某些情況下，核酸包含一個或多個插入、缺失、倒位和/或置換可能是合適的。

如本文所述的核酸可使用本領域已知的程序基於化學合成和/或酶促連接反應來構建。例如，核酸可以使用天然存在的核苷酸或不同修飾的核苷酸來化學合成。在任何一些這樣的實施方案中，核苷酸序列是經過密碼子優化的。

本公開還提供了核酸，其包含與本文所述的任何核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列，或在嚴格條件下與本文所述的任何核酸的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在一些實施方案中，該核酸是合成的。在一些實施方案中，該核酸是cDNA。

在任何一些這樣的實施方案中，本文所述的嵌合多肽(或融合多肽)、抗體或其抗原結合片段和/或肽體由已經經過密碼子優化的核苷酸序列編碼。

本公開還提供了與本文所述的任何核苷酸序列至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的核酸序列，以及與本文所述的任何胺基酸序列至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，本公開涉及編碼本文所述的任何肽的核苷酸序列，或由本文所述的任何核苷酸序列編碼的任何胺基酸序列。

在一些實施方案中，所述核酸序列至少為或約為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500或600個核苷酸。在一些實施方案中，所述胺基酸序列至少為或約為5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200個胺基酸殘基。在一些實施方案中，所述核酸序列為少於10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500或600個核苷酸。在一些實施方案中，所述胺基酸序列為少於5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200個胺基酸殘基。

為了確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分比，為了最佳比較目的對這些序列進行比對(例如，為了最佳比對可以在第一和第二胺基酸或核酸序列的一個或兩個序列中引入空位，並且為了比較目的可以忽略非同源序列)。然後比較相應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置與第二序列中的相應位置被相同的胺基酸殘基或核苷酸占據時，這兩個分子在該位置處是相同的。兩個序列之間的同一性百分比是這兩個序列共有的相同位置的數目的函數，其中考慮為了兩個序列的最佳比對而需要引入的空位的數目和每個空位的長度。用於製備工程化細胞的方法

本公開提供了一種製備和使用工程化細胞來治療病理性疾病或病狀的方法或過程。

用於引入分子，例如本文所述的嵌合多肽(或融合多肽)、抗體或其抗原結合片段和/或肽體的細胞可分離自樣品，如生物樣品，例如，從受試者獲得或衍生的樣品。在一些實施方案中，從中分離出細胞的受試者是患有疾病或病狀或需要細胞療法或將向其施用細胞療法的受試者。在一些實施方案中，受試者是需要特定治療性干預如過繼細胞療法(對其進行細胞分離、處理和/或工程改造)的人。

因此，在一些實施方案中，所述細胞是初代細胞，例如初代人細胞。在一些實施方案中，所述細胞是臍帶血來源的NK細胞。樣品包括直接取自受試者的組織、體液和其他樣品，以及經過一個或多個處理步驟如分離、離心、基因工程改造(例如，用病毒載體轉導)、洗滌和/或孵育而得到的樣品。生物樣品可以是直接從生物來源獲得的樣品，或經過處理的樣品。生物樣品包括但不限於體液，如血液、血漿、血清、腦脊液、滑液、尿液和汗液，組織和器官樣品，包括從其衍生的經處理的樣品。

在一些方面，衍生或分離出細胞的樣品是血液或血液衍生的樣品，或者是或衍生自血液成分分離術(apheresis)或白血球分離術(leukapheresis)產物。示例性樣品包括全血、外周血單核細胞(PBMC)、白血球、骨髓、胸腺、組織活檢物、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾臟、其他淋巴組織、肝臟、肺、胃、腸、結腸、腎臟、胰腺、乳腺、骨骼、前列腺、子宮頸、睾丸、卵巢、扁桃體或其他器官，和/或由其衍生的細胞。在細胞療法，例如過繼細胞療法的背景下，樣品包括來自自體和同種異體來源的樣品。

在一些實施方案中，所述細胞來源於細胞系，例如，NK細胞系。在一些實施方案中，所述細胞獲自異種來源，例如，獲自小鼠、大鼠或非人靈長類動物。

在一些實施方案中，洗滌從受試者採集的血細胞，例如，以去除血漿成分並將細胞置於合適的緩衝液或培養基中，以用於隨後的處理步驟。在一些實施方案中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在一些實施方案中，洗滌溶液缺少鈣和/或鎂和/或許多或所有二價陽離子。在一些方面，藉由半自動“流過式(flow-through)”離心機完成洗滌步驟。在一些方面，藉由切向流過濾(TFF)完成洗滌步驟。在一些實施方案中，在洗滌後將細胞重懸於各種生物相容性緩衝液中，例如不含Ca ²⁺/Mg ²⁺的PBS中。在某些實施方案中，去除血細胞樣品的成分，並將細胞直接重懸於培養基中。在一些實施方案中，所述方法包括基於密度的細胞分離方法，例如藉由裂解紅血球並通過Percoll或Ficoll梯度離心從外周血製備白血球。

在一些實施方案中，所述方法包括一個或多個以下步驟：例如，從患者的臍帶血中分離NK細胞；用病毒載體轉導NK細胞群體，該病毒載體包括編碼本文所述的嵌合多肽(或融合多肽)、抗體或其抗原結合片段和/或肽體的核酸構築體；在體外擴增經轉導的細胞；以及/或者將擴增的細胞輸注到患者體內，其中工程化的NK細胞將尋找並破壞表現靶抗原或受體的腫瘤細胞。在一些實施方案中，該方法進一步包括：用含有該核酸構築體的病毒載體轉染NK細胞。

在一些實施方案中，所述方法包括在體外或離體地將本文所述的任何載體引入細胞中。在一些實施方案中，該載體是病毒載體，並且該引入藉由轉導來進行。在一些實施方案中，所述方法進一步包括向細胞中引入一種或多種藥劑，其中所述一種或多種藥劑中的每種藥劑都獨立地能夠誘導基因破壞。在一些實施方案中，所述一種或多種藥劑是抑制性核酸(例如，siRNA)。在一些實施方案中，所述一種或多種藥劑是包含DNA靶向蛋白和核酸酶或RNA引導的核酸酶(例如，成簇的規律間隔的短迴文核酸(CRISPR)相關核酸酶)的融合蛋白。

免疫細胞(例如，NK細胞)的轉染可採用任何標準方法來實現，如磷酸鈣、電穿孔、脂質體介導的轉移、顯微注射、生物射彈顆粒遞送系統或技術人員已知的任何其他方法。在一些實施方案中，免疫細胞的轉染採用磷酸鈣法來進行。

製備工程化細胞並將這些工程化細胞施用至受試者的方法是本領域已知的，並且例如在以下文獻中描述：Schmidt, P.等人, "Engineering NK cells for CAR therapy-recent advances in gene transfer methodology." Frontiers in Immunology11 (2021): 611163；以及Savan, R.等人, "Lentiviral gene transduction in human and mouse NK cell lines." Natural Killer Cell Protocols: Cellular and Molecular Methods. Totowa, NJ: Humana Press, 2009. 209-221；這兩篇文獻均藉由引用而整體併入。治療方法

本文公開的方法可用於多種治療目的。在一方面，本公開提供了用於治療受試者的癌症的方法、降低受試者中的腫瘤體積隨時間增加的速度的方法、降低發生轉移的風險的方法或降低受試者發生額外轉移的風險的方法。在一些實施方案中，該治療可以阻止、減緩、延遲或抑制癌症的進展。在一些實施方案中，該治療可以導致受試者癌症的一種或多種症狀的數量、嚴重程度和/或持續時間降低。

在一方面，本公開表徵了以下方法：其包括向有需要的受試者(例如，患有癌症或被確定或診斷為患有癌症的受試者)施用治療有效劑量(例如，數目)的工程化細胞(例如，本文所述的任何工程化免疫細胞)。

本發明提供了使用本文所述的工程化免疫細胞(例如，NK細胞)和/或本文所述的藥物組合物治療癌症的方法。這些方法可用於治療多種癌症，包括實體瘤、淋巴瘤和白血病。待治療的癌症類型最好與抗體或其抗原結合片段或肽體(例如，本文所述的任何抗體或其抗原結合片段或任何肽體)所結合的癌細胞類型相匹配。例如，表現PD-L1和/或IL13Rα2的癌症最好使用本文所述的表現和/或分泌抗PD-L1抗體或其抗原結合片段和/或抗IL13Rα2肽體的工程化免疫細胞(例如，NK細胞)來治療。以下描述了治療方法的其他方面和實施方案。

因此，本公開的一個方面提供了一種治療患者的癌症的方法，其中該方法包括向有需要的患者施用治療有效數量的本文所述的工程化免疫細胞(例如，NK細胞)以治療癌症。供治療的示例性癌症包括實體瘤、白血病和淋巴瘤。

治療方法可以根據待治療的癌症來表徵。例如，在某些實施方案中，該癌症是實體瘤。在某些其他實施方案中，該癌症是腦癌、膀胱癌、乳癌、宮頸癌、結腸癌、結直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、白血病、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、胃癌、睾丸癌或子宮癌。在另外一些實施方案中，該癌症是血管化腫瘤、鱗狀細胞癌、腺癌、小細胞癌、黑色素瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、肉瘤(例如，血管肉瘤或軟骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、膽管癌、甲狀腺癌、肢端雀斑樣痣性黑色素瘤、光化性角化病、急性淋巴細胞白血病、急性髓樣白血病、腺樣囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鱗癌、肛管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星形細胞瘤、巴氏腺癌、基底細胞癌、膽道癌、骨癌、骨髓癌、支氣管癌、支氣管腺癌、類癌、膽管上皮癌、軟骨肉瘤、脈絡膜叢乳頭狀瘤/癌、慢性淋巴細胞白血病、慢性髓樣白血病、透明細胞癌、結締組織癌、囊腺瘤、消化系統癌、十二指腸癌、內分泌系統癌、內胚層竇瘤、子宮內膜增生、子宮內膜間質肉瘤、子宮內膜樣腺癌、內皮細胞癌、室管膜癌、上皮細胞癌、尤因肉瘤、眼及眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性結節性增生、膽囊癌、胃竇癌、胃底癌、胃泌素瘤、膠質母細胞瘤、胰高血糖素瘤、心臟癌、血管母細胞瘤、血管內皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝膽癌、肝細胞癌、霍奇金病、迴腸癌、胰島素瘤、上皮內瘤樣變、上皮間鱗狀細胞腫瘤、肝內膽管癌、浸潤性鱗狀細胞癌、空腸癌、關節癌、卡波西肉瘤、盆腔癌、大細胞癌、大腸癌、平滑肌肉瘤、惡性雀斑樣痣黑色素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、惡性黑色素瘤、惡性間皮瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、腦膜癌、間皮癌、轉移癌、口癌、黏液表皮樣癌、多發性骨髓瘤、肌肉癌、鼻腔癌、神經系統癌、神經上皮腺癌、結節性黑色素瘤、非上皮性皮膚癌、非霍奇金淋巴瘤、燕麥細胞癌、寡突膠質細胞癌、口腔癌、骨肉瘤、乳頭狀漿液性腺癌、陰莖癌、咽癌、垂體瘤、漿細胞瘤、假性肉瘤、肺胚細胞瘤、直腸癌、腎細胞癌、呼吸系統癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、漿液性癌、竇癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑肌癌、軟組織癌、分泌生長抑素的腫瘤、脊柱癌、鱗狀細胞癌、橫紋肌癌、間皮下癌、淺表擴散性黑色素瘤、T細胞白血病、舌癌、未分化癌、輸尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿系統癌、子宮頸癌、子宮體癌、葡萄膜黑色素瘤、陰道癌、疣狀癌、VlPoma、外陰癌、分化良好癌或腎母細胞瘤。

在某些其他實施方案中，所述癌症是非霍奇金淋巴瘤，如B細胞淋巴瘤或T細胞淋巴瘤。在某些實施方案中，該非霍奇金淋巴瘤是B細胞淋巴瘤，如瀰漫性大B細胞淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、結外邊緣區B細胞淋巴瘤、結節邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、毛細胞白血病或原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤。在某些其他實施方案中，該非霍奇金淋巴瘤是T細胞淋巴瘤，如前體T淋巴母細胞性淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、結外自然殺手細胞/T細胞淋巴瘤、腸病型T細胞淋巴瘤、皮下脂膜炎樣T細胞淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤或外周T細胞淋巴瘤。

待治療的癌症可以根據癌細胞表面上表現的特定抗原是否存在來表徵。在某些實施方案中，癌細胞表現以下一種或多種：PD-L1、BCMA、Caudin18.2、CCR4、CD10、CD123、CD147、CD171、CD19、CD20、CD22、CD276、CD319、CD33、CD38、CD70、CLL-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、FLT3、FRα、GD2、GPC3、HER2、HGFR、IL13Ralpha2、間皮素、MG7、MUC1、MUC16、黏連蛋白4、PSCA、ROR1、ROR2、TACI、TRBC1、TSLPR和VEGFR。在一些實施方案中，癌細胞表現以下一種或多種：IL13Rα2、APN/CD13、APP、PD-L1、CD44、P32/gC1qR、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、CD21、EGFR、Epha2、EphB4、HER2、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、VEGFR1、VEGFR3、PSMA、GPC3、IL-10RA、IL-11Rα、IL-6Rα、GP130、VEGFR2、MUC18、Met、MMP9、Thomsen-Friedenreich碳水化合物抗原、NRP-1、PDGFRβ、CD133、PTPRJ、HSPG、E-選擇蛋白、Tie2、VPAC1、ActRIIB、CD163、CXCR4、肝配蛋白A4、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2、肝配蛋白B3、促性腺素釋放激素受體、G蛋白偶聯受體55、鈴蟾肽受體2、IL4受體、低密度脂蛋白受體、瘦素受體、LRP1、黑皮質素1受體、黑皮質素4受體、CD206、尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物受體、神經激肽-1受體、VPAC2、ITGB1、CD27、ITGB5、ITGA1、CD27、LRP1、ACVR2B、COL13A1、NOTCH3、EGFR、VEGFR2、VEGFR3、PDGFR、HER2、ErbB3、ErbB4、RET和FGFR102。在一些實施方案中，癌細胞表現表 2中的一種或多種抗原和/或表 4中的一種或多種受體。

在一些實施方案中，本文公開的組合物和方法可用於治療有患癌症風險的患者。癌症患者可用本領域已知的各種方法來確定。

如本文所用的，“有效劑量”是指足以實現有益的或所需的結果的量或劑量，所述結果包括阻止、減緩、延遲或抑制疾病(例如，癌症)的進展。有效劑量根據例如將要施用治療劑和/或治療性組合物的受試者的年齡和體重、症狀的嚴重程度和施用途徑而不同，因此可根據個體情況確定施用量。

有效劑量可藉由一次或多次給藥來施用。舉例來說，組合物的有效劑量是足以改善、終止、穩定、逆轉、抑制、減緩和/或延遲患者癌症進展的量，或者是足以改善、終止、穩定、逆轉、減緩和/或延遲細胞(例如，活檢細胞，本文所述的任何癌細胞，或細胞系(例如，癌細胞系))體外增殖的量。正如本領域所理解的，有效劑量可能尤其根據患者的病史以及其他因素如所用組合物的類型(和/或劑量)而不同。

施用的有效劑量和時間表可根據經驗確定，並且作出這樣的確定在本領域的技術範圍內。本領域技術人員將會理解，必須施用的劑量將根據例如將接受治療的哺乳動物、施用途徑、治療劑的特定類型以及向哺乳動物施用的其他藥物而不同。選擇適當劑量的指南可參見文獻。另外，治療並不一定導致100%或完全治療或預防疾病或病狀。存在多種可用的治療/預防方法，其具有不同程度的治療效果，本領域普通技術人員認為是潛在有利的治療手段。

在本文所述的任何方法中，工程化細胞和/或至少一種附加治療劑可以至少每周一次(例如，每周一次、每周兩次、每周三次、每周四次、每天一次、每天兩次或每天三次)施用於受試者。在一些實施方案中，至少兩種不同的工程化細胞(例如，表現不同結合分子的細胞)在同一組合物(例如，液體組合物)中施用。在一些實施方案中，工程化細胞和至少一種附加治療劑在同一組合物(例如，液體組合物)中施用。在一些實施方案中，工程化細胞和至少一種附加治療劑在兩種不同的組合物中施用。在一些實施方案中，所述至少一種附加治療劑以丸劑、片劑或膠囊的形式施用。在一些實施方案中，所述至少一種附加治療劑以持續釋放口服製劑的形式施用。

可作為聯合治療的一部分用於治療癌症的示例性治療劑包括，例如，輻射、絲裂黴素、維甲酸、ribomustin、吉西他濱、長春新鹼、依託泊苷、克拉屈濱、二溴甘露醇、胺甲蝶呤、多柔比星、卡波醌、噴司他丁、尼曲吖啶、淨司他丁、西曲瑞克、來曲唑、雷替曲塞、柔紅黴素、法倔唑、福莫司汀、胸腺法新、索布佐生、奈達鉑、阿糖胞苷、比卡魯胺、長春瑞濱、維司力農、胺魯米特、安吖啶、丙谷胺、依利醋銨、酮色林、去氧氟尿苷、依曲替酯、異維甲酸、鏈脲菌素、尼莫司汀、長春地辛、氟他胺、氟他米特(drogenil)、butocin、卡莫氟、雷佐生、西左非蘭(sizofilan)、卡鉑、二溴衛矛醇、替加氟、異環磷醯胺、潑尼莫司汀、畢西巴尼(picibanil)、左旋咪唑、替尼泊苷、英丙舒凡、依諾他濱、利舒脲、羥甲烯龍、他莫昔芬、孕酮、美雄烷、環硫雄醇、福美坦、干擾素-α、干擾素-2 α、干擾素-β、干擾素-γ、集落刺激因子-1、集落刺激因子-2、地尼介白素(denileukin diftitox)、介白素-2、黃體生成素釋放因子，以及上述藥劑的變化形式，它們可能表現出與其同源受體的差異性結合以及延長或縮短的血清半衰期。

可以選擇本文所述的工程化免疫細胞(例如，NK細胞)和附加治療劑的數量以及相對施用時機，以達到所需的聯合治療效果。例如，當對需要這種施用的患者施用聯合治療時，該組合中的治療劑或包含所述治療劑的一種或多種藥物組合物可按任何順序施用，例如，依次、並行、一起、同時等。此外，例如，本文所述的蛋白質可在附加治療劑發揮其預防或治療效果時施用，反之亦然。

在一些實施方案中，可以向受試者施用一種或多種附加治療劑。該附加治療劑可以是檢查點抑制劑(CPI)。在一些實施方案中，該檢查點抑制劑是抑制蛋白，例如，抗體或其抗原結合片段。該檢查點抑制劑可抑制或阻斷一個或多個免疫檢查點，包括，例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、2B4(CD244)、4-1BB、A2aR、B7.1、B7.2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BTLA、嗜乳脂蛋白、CD160、CD48、CTLA4、GITR、gp49B、HHLA2、HVEM、ICOS、ILT-2、ILT-4、KIR家族受體、LAG-3、OX-40、PIR-B、SIRPalpha(CD47)、TFM-4、TIGIT、TIM-1、TIM-3、TIM-4、VISTA及其組合。在一些實施方案中，該抑制蛋白阻斷PD-1或PD-Ll。在各個實施方案中，該抑制蛋白包含抗PD-1 scFv。該抑制蛋白能夠導致PD-1或PD-L1的表現降低，並且/或者抑制群體中T細胞中的PD-1或PD-L1的上調，並且/或者物理阻礙PD-1/PD-L1複合物的形成及隨後的訊息轉導。在一些實施方案中，該抑制蛋白阻斷PD-1。在一些實施方案中，附加治療劑是抗OX40抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗LAG-3抗體、抗TIGIT抗體、抗BTLA抗體、抗CTLA-4抗體或抗GITR抗體。在一些實施方案中，附加治療劑是抗CTLA4抗體(例如，伊匹木單抗(ipilimumab))、抗CD20抗體(例如，利妥昔單抗(rituximab))、抗EGFR抗體(例如，西妥昔單抗(cetuximab))、抗CD319抗體(例如，依洛珠單抗(elotuzumab))或抗PD1抗體(例如，納武單抗(nivolumab))。

其他可作為聯合療法的一部分用於治療癌症的藥劑還有靶向非檢查點靶點的單株抗體藥劑(例如，赫賽汀(herceptin))和非細胞毒性劑(例如，酪胺酸激酶抑制劑)。

在其中一個實施方案中，附加治療劑可包括一種或多種選自下組的抑制劑：B-Raf抑制劑、EGFR抑制劑、MEK抑制劑、ERK抑制劑、K-Ras抑制劑、c-Met抑制劑、間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑、磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑、Akt抑制劑、mTOR抑制劑、PI3K/mTOR雙重抑制劑、布魯頓酪胺酸激酶(BTK)抑制劑和異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)和/或異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)抑制劑。在一些實施方案中，附加治療劑是吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(IDO1)的抑制劑(例如，epacadostat)。在一些實施方案中，附加治療劑可包括一種或多種選自下組的抑制劑：HER3抑制劑、LSD1抑制劑、MDM2抑制劑、BCL2抑制劑、CHK1抑制劑、活化hedgehog訊息路徑抑制劑和選擇性降解雌激素受體的藥劑。其他類別的抗癌劑還包括，例如：(i)抑制劑，選自ALK抑制劑、ATR抑制劑、A2A拮抗劑、鹼基切除修復抑制劑、Bcr-Abl酪胺酸激酶抑制劑、布魯頓酪胺酸激酶抑制劑、CDC7抑制劑、CHK1抑制劑、細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑、DNA-PK抑制劑、DNA-PK和mTOR兩者的抑制劑、DNMT1抑制劑、DNMT1抑制劑加2-氯-脫氧腺苷、HDAC抑制劑、Hedgehog訊息路徑抑制劑、IDO抑制劑、JAK抑制劑、mTOR抑制劑、MEK抑制劑、MELK抑制劑、MTH1抑制劑、PARP抑制劑、磷脂醯肌醇3-激酶抑制劑、PARP1和DHODH兩者的抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓撲異構酶-II抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、VEGFR抑制劑和WEE1抑制劑；(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS的促效劑；以及(iii)選自IL-12、IL-15、GM-CSF和G-CSF的細胞介素。

在一些實施方案中，附加治療劑可包括一種或多種選自下組的治療劑：曲貝替定、白蛋白結合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、Trebananib、帕唑帕尼(Pazopanib)、西地尼布、帕博西尼(Palbociclib)、依維莫司、氟嘧啶、IFL、瑞戈非尼(regorafenib)、Reolysin、Alimta、Zykadia、Sutent、坦羅莫司(temsirolimus)、阿西替尼(axitinib)、依維莫司、索拉非尼、Votrient、帕唑帕尼、IMA-901、AGS-003、卡博替尼(cabozantinib)、長春氟寧(Vinflunine)、Hsp90抑制劑、Ad-GM-CSF、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、長春鹼、沙立度胺(Thalomid)、達卡巴𠯤、環磷醯胺、來那度胺、氮雜胞苷、來那度胺、硼替佐米(bortezomid)、氨柔比星(amrubicine)、卡非佐米、普拉曲沙和恩扎妥林。

在一些實施方案中，附加治療劑可包括一種或多種選自下組的治療劑：佐劑、TLR促效劑、腫瘤壞死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗劑、IL-4拮抗劑、IL-13拮抗劑、IL-17拮抗劑、HVEM拮抗劑、ICOS促效劑、靶向CX3CL1的治療、靶向CXCL9的治療、靶向CXCL10的治療、靶向CCL5的治療、LFA-1促效劑、ICAM1促效劑和選擇素促效劑。

在一些實施方案中，向受試者施用卡鉑、白蛋白結合型紫杉醇、紫杉醇、順鉑、培美曲塞、吉西他濱、FOLFOX或FOLFIRI。在一些實施方案中，附加治療劑選自天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅黴素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、胺甲蝶呤、紫杉醇、利妥昔單抗、長春鹼、長春新鹼和/或其組合。組合物和製劑

本公開提供了含有藉由本文公開的方法產生的工程化細胞及其群體的組合物(包括藥物組合物和治療性組合物)。還提供了向受試者(例如，患者)施用工程化免疫細胞(例如，NK細胞)及其組合物的方法，例如，治療方法。

提供了包含用於施用的工程化免疫細胞的組合物，包括藥物組合物和製劑，如包含用於以給定劑量或部分劑量施用的細胞數的單位劑量形式的組合物。藥物組合物和製劑可包含一種或多種可選的藥學上可接受的載劑或輔料。在一些實施方案中，該組合物包含至少一種附加治療劑。

藥學上可接受的載劑是指藥物組合物中除活性成分以外的成分。藥學上可接受的載劑不會干擾活性成分，並且對受試者無毒。藥學上可接受的載劑可以包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。藥物配製是指將不同物質和/或試劑組合起來以產生最終藥物產品的過程。製劑研究涉及開發患者可接受的藥物製品。另外，製品的形式允許其中所含的活性成分的生物活性有效，並且不含對將會施用該製劑的受試者具有不可接受的毒性的其他成分。

在一些實施方案中，載劑的選擇部分取決於特定細胞(例如，T細胞或NK細胞)和/或施用方法。有多種合適的製劑是可用的。例如，藥物組合物可含有防腐劑。合適的防腐劑可包括，例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉和苯扎氯銨。在一些實施方案中，使用兩種或更多種防腐劑的混合物。按重量計，防腐劑或其混合物通常以總組合物的約0.0001%至約2%的量存在。例如，Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編著(1980)描述了載劑。藥學上可接受的載劑在所用劑量和濃度下對接受者通常是無毒的，並且包括但不限於：緩衝劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單醣、雙醣和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬絡合物(例如，Zn-蛋白質絡合物)；和/或非離子型表面活性劑，如聚乙二醇(PEG)。

合適的緩衝劑包括，例如，檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀以及其他各種酸和鹽。在一些實施方案中，使用兩種或更多種緩衝劑的混合物。按重量計，緩衝劑或其混合物通常以總組合物的約0.001%至約4%的量存在。製備可施用的藥物組合物的方法是已知的。例如，在Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 第21版(2005年5月1日)中更詳細地描述了示例性方法。

製劑可包括水溶液。製劑或組合物還可含有超過一種活性成分，這些活性成分對用工程化細胞治療的特定適應症、疾病或病狀有用，優選那些活性與細胞互補的活性成分，其中各自的活性不會對彼此產生不利影響。此類活性成分適當地以對預期目的有效的量組合存在。因此，在一些實施方案中，藥物組合物可進一步包含其他藥學活性劑或藥物，如檢查點抑制劑、融合蛋白、化療劑，例如天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅黴素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、胺甲蝶呤、紫杉醇、利妥昔單抗、長春鹼和/或長春新鹼。

在一些實施方案中，藥物組合物含有有效治療或預防疾病或病狀的量的細胞，如治療有效劑量或預防有效劑量的細胞。在一些實施方案中，藉由定期評估接受治療的受試者來監測治療或預防功效。可藉由單次團注(bolus)施用細胞、藉由多次團注施用細胞或藉由連續輸注施用細胞來遞送所需劑量。

細胞和組合物可使用標準施用技術、製劑和/或裝置來施用。細胞的施用可以是自體的或異種的。例如，免疫反應性T細胞或祖細胞可以從一個受試者獲得，並在根據本文所述的各個實施方案對其進行遺傳修飾後施用於同一受試者或不同的相容受試者。外周血來源的免疫反應性T細胞或其後代(例如，體內、離體或體外衍生的)可以經由局部注射施用，包括導管施用、全身注射、局部注射、靜脈內注射或腸胃外施用。通常，當施用治療性組合物(例如，含有遺傳修飾的免疫反應性細胞的藥物組合物)時，通常將其配製成單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液、乳液)。

本文公開的製劑包括用於口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肺部、經皮、肌肉內、鼻內、頰部、舌下或栓劑施用的製劑。在一些實施方案中，腸胃外施用細胞群體。如本文所用的術語“腸胃外”包括靜脈內、肌肉內、皮下、直腸、陰道和腹膜內施用。在一些實施方案中，藉由靜脈內、腹膜內或皮下注射，使用外周全身性遞送向受試者施用細胞。

在一些實施方案中，組合物以無菌液體製品的形式提供，例如等滲水溶液、懸浮液、乳劑、分散劑或黏性組合物，在一些方面它們可以緩衝至選定的pH。液體製品通常比凝膠、其他黏性組合物和固體組合物更容易製備。另外，液體組合物在某種程度上更便於施用，尤其是藉由注射。另一方面，黏性組合物可以配製到適當的黏度範圍內，以提供較長的與特定組織的接觸時間。液體或黏性組合物可包含載劑，所述載劑可以是溶劑或分散介質，含有，例如，水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液態聚乙二醇)及其適當的混合物。

無菌注射溶液可藉由將細胞併入溶劑中，例如與合適的載劑、稀釋劑或輔料如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖等混合來製備。根據施用途徑和所需的製品，組合物可含有輔助物質，如潤溼劑、分散劑或乳化劑(例如，甲基纖維素)、pH緩衝劑、膠凝劑或黏度增強添加劑、防腐劑、調味劑和/或顏料。在一些方面，可以參考標準文本來製備合適的製品。

可以添加各種增強組合物的穩定性和無菌性的添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑和緩衝劑。可用各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸來確保防止微生物的作用。可注射藥物形式可藉由使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來實現延長的吸收。

用於體內施用的製劑通常是無菌的。無菌性可藉由例如經除菌過濾膜過濾而容易地實現。

如本文所述的組合物或藥物組合物可與施用說明書一起包含在容器、包裝或分配器中。施用方法

還提供了施用細胞、群體和組合物的方法，以及這類細胞、群體和組合物在治療或預防包括癌症在內的疾病、病狀和病症中的用途。在一些實施方案中，本文所述的方法可降低罹患本文所述疾病、病狀和病症的風險。

在一些實施方案中，將本文所述的細胞、群體和組合物施用於將要例如經由過繼細胞療法如過繼NK細胞療法進行治療的患有特定疾病或病狀的受試者或患者。在一些實施方案中，將藉由所提供的方法製備的細胞和組合物，如在孵育和/或其他處理步驟後得到的工程化組合物和生產結束點(end-of-production)組合物，施用於受試者，如患有疾病或病狀或具有患疾病或病狀風險的受試者。在一些方面，所述方法因此可治療疾病或病狀，例如，改善疾病或病狀的一種或多種症狀，例如藉由減輕表現被工程化T細胞所識別的抗原的癌症中的腫瘤負荷。

用於過繼細胞療法的細胞施用方法是已知的，並且可與所提供的方法和組合物結合使用。例如，過繼細胞治療方法在以下文獻中描述：例如，U.S. 2003/0170238；第4,690,915號美國專利；Rosenberg, "Cell transfer immunotherapy for metastatic solid cancer-what clinicians need to know." Nature reviews Clinical oncology 8.10 (2011): 577；Themeli等人, "Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy." Nature biotechnology 31.10 (2013): 928；Tsukahara等人, "CD19 target-engineered T-cells accumulate at tumor lesions in human B-cell lymphoma xenograft mouse models." Biochemical and biophysical research communications 438.1 (2013): 84-89；Davila等人, "CD19 CAR-targeted T cells induce long-term remission and B Cell Aplasia in an immunocompetent mouse model of B cell acute lymphoblastic leukemia." PloS one 8.4 (2013)；其中每一篇均藉由引用整體併入本文。

在一些實施方案中，細胞療法，例如過繼細胞療法，藉由自體轉移來進行，其中，T細胞是從將要接受該細胞療法的受試者，或從來源於該受試者的樣品中分離和/或以其他方式製備的。因此，在一些方面，細胞來源於需要治療的受試者，例如患者，並且細胞在分離和處理後施用於同一受試者。

在一些實施方案中，細胞療法，例如過繼細胞療法，藉由同種異體轉移來進行，其中，T細胞是從將要接受或最終接受該細胞療法的受試者以外的受試者(例如，第一受試者)分離和/或以其他方式製備的。在這樣的實施方案中，然後將細胞施用於同一物種的不同受試者，例如第二受試者。在一些實施方案中，第一和第二受試者在遺傳上是相同的。在一些實施方案中，第一和第二受試者在遺傳上是相似的。在一些實施方案中，第二受試者與第一受試者表現相同的HLA類別或超類型。

在一些實施方案中，受試者的HLA類別或HLA超類型得到鑑定。在一些實施方案中，用可識別HLA類別或HLA超類型背景中的抗原的細胞療法治療受試者。

在一些實施方案中，在施用細胞或含有細胞的組合物之前，受試者已用針對疾病或病狀例如腫瘤的治療劑進行了治療。在一些方面，受試者對其他治療劑而言是難治性的或無反應的。在一些實施方案中，受試者例如在用另一種治療性干預治療後病情持續或復發，該治療性干預包括化療、放療和/或造血幹細胞移植(HSCT)，例如，異體HSCT。在一些實施方案中，所述施用可有效地治療受試者，儘管受試者對另一種療法已經產生抗性。

在一些實施方案中，受試者對另一種治療劑有反應，並且採用該治療劑的治療減輕了疾病負擔。在一些方面，受試者最初對治療劑有反應，但隨著時間的推移，表現出疾病或病狀的復發。在一些實施方案中，受試者沒有復發。在一些這樣的實施方案中，受試者被確定為具有復發風險，例如具有高復發風險，因此預防性地施用細胞，例如，以降低復發的可能性或防止復發。在一些實施方案中，受試者尚未接受採用其他治療劑的既往治療。

在一些實施方案中，以所需劑量施用細胞，在一些方面，該劑量包括細胞或細胞類型的所需劑量或數目和/或細胞類型的所需比率。因此，在一些實施方案中，細胞的劑量是基於細胞總數(或每千克體重的細胞數)。在一些實施方案中，細胞的劑量是基於單獨群體或單獨細胞類型中所需的細胞總數(或每千克體重的細胞數)。在一些實施方案中，劑量是基於這類特徵的組合，如所需的細胞總數、所需的比率和單獨群體中所需的細胞總數。

在一些實施方案中，NK細胞群體，如CD56+細胞群體，以總細胞的所需劑量或在所需劑量的容許差值內施用。在一些實施方案中，所需劑量是所需的細胞數或施用細胞的受試者每單位體重的所需細胞數，例如，細胞/kg。在一些實施方案中，所需劑量等於或高於最小細胞數或每單位體重的最小細胞數。

在一些實施方案中，細胞以一個或多個單獨細胞群體或細胞亞型的所需劑量(如CD56+細胞的所需劑量)或在所需劑量的容許差值內施用。在一些實施方案中，所需劑量是該亞型或群體的所需細胞數或施用細胞的受試者每單位體重的所需的此類細胞數目，例如，細胞/kg。在一些實施方案中，所需劑量等於或高於該群體或亞型的最小細胞數或每單位體重的該群體或亞型的最小細胞數。

因此，在一些實施方案中，劑量是基於總細胞的所需固定劑量，和/或基於一個或多個(例如每個)單獨亞型或亞群的所需固定劑量。因此，在一些實施方案中，劑量是基於NK細胞的所需固定或最小劑量，和/或基於CD56+細胞的所需固定或最小劑量。

在某些實施方案中，細胞或細胞亞型的單獨群體以如下範圍的數目施用於受試者：約100萬至約1000億個細胞，例如，100萬至約500億個細胞(例如，約500萬個細胞、約2500萬個細胞、約5億個細胞、約10億個細胞、約50億個細胞、約200億個細胞、約300億個細胞、約400億個細胞，或上述值中的任意兩個所限定的範圍)，如約1000萬至約1000億個細胞(例如，約2000萬個細胞、約3000萬個細胞、約4000萬個細胞、約6000萬個細胞、約7000萬個細胞、約8000萬個細胞、約9000萬個細胞、約100億個細胞、約250億個細胞、約500億個細胞、約750億個細胞、約900億個細胞，或上述值中的任意兩個所限定的範圍)，以及在某些情況下，約1億個細胞至約500億個細胞(例如，約1.2億個細胞、約2.5億個細胞、約3.5億個細胞、約4.5億個細胞、約6.5億個細胞、約8億個細胞約9億個細胞、約30億個細胞、約300億個細胞、約450億個細胞)或這些範圍之間的任何值。

在一些實施方案中，總細胞的劑量和/或單獨細胞亞群的劑量在10 ⁴或約10 ⁴至10 ⁹或約10 ⁹個細胞/千克(kg)體重的範圍內，例如在10 ⁵至10 ⁶個細胞/千克體重之間，例如，至少為或至少約為或等於或約為1 × 10 ⁵個細胞/千克、1.5× 10 ⁵個細胞/千克、2 × 10 ⁵個細胞/千克或1 × 10 ⁶個細胞/千克體重。例如，在一些實施方案中，細胞以如下劑量或在如下劑量的特定誤差範圍內施用：在10 ⁴或約10 ⁴至10 ⁹或約10 ⁹個NK細胞/千克(kg)體重之間，例如在10 ⁵至10 ⁶個NK細胞/千克體重之間，例如，至少為或至少約為或等於或約為1 × 10 ⁵個NK細胞/千克、1.5× 10 ⁵個NK細胞/千克、2 × 10 ⁵個NK細胞/千克或1 × 10 ⁶個NK細胞/千克體重。在一些實施方案中，殘餘CD3+細胞以低於2 × 10 ⁵個細胞/千克、1 × 10 ⁵個細胞/千克、5 × 10 ⁴個細胞/千克或1 × 10 ⁴個細胞/千克體重施用。

在一些實施方案中，細胞以如下劑量或在如下劑量的特定誤差範圍內施用：高於和/或至少約為1×10 ⁶、約1×10 ⁷、約1×10 ⁹、約1×10 ⁹或約1×10 ¹⁰個CD56+細胞，和/或不高於約1×10 ⁶、約1×10 ⁷、約1×10 ⁹、約1×10 ⁹或約1×10 ¹⁰個CD3+細胞。在一些實施方案中，細胞以如下劑量或在如下劑量的特定誤差範圍內施用：約10 ⁸至10 ¹²個NK細胞之間或約10 ¹⁰至10 ¹¹個NK細胞之間，約10 ⁸至10 ¹²個CD56+細胞之間或約10 ¹⁰至10 ¹¹個CD56+細胞之間，和/或約10 ⁶至10 ¹⁰個CD3+細胞之間或約10 ⁸至10 ⁹個CD3+細胞之間。

在一些實施方案中，細胞以多個細胞群體或亞型(如CD56+和CD3+細胞或亞型)的所需輸出比率或在其容許範圍內施用。在一些方面，所需比率可以是特定的比率，或者可以是比率的範圍。例如，在一些實施方案中，所需比率(例如，CD56+與CD3+細胞之比)介於500: 1或約500: 1至20:1或約20:1之間，例如，約500: 1、約400: 1、約300: 1、約200: 1、約100: 1、約90: 1、約80: 1、約70: 1、約60: 1、約50: 1、約40: 1、約30: 1或約20: 1。在一些方面，容許差值在所需比率的約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%以內，包括這些範圍之間的任何值。

對治療的最佳反應可取決於工程化重組受體(例如本文所述的嵌合多肽(或融合多肽)、抗體或其抗原結合片段和/或肽體)在細胞表面上持續且可靠地表現和/或結合靶抗原的能力。例如，在某些情況下，當在細胞療法中使用的細胞如人NK細胞中表現時，在某些情況下，某些嵌合多肽(或融合多肽)、抗體或其抗原結合片段和/或肽體的性質可影響該多肽或蛋白質的表現和/或活性。在某些情景下，特定多肽或蛋白質的表現水平可能較低，並且表現此類多肽或蛋白質的工程化細胞如人NK細胞的活性可因表現不佳或訊息活性不佳而受到限制。在某些情況下，多肽或蛋白質表現的一貫性和/或效率以及多肽或蛋白質的活性在可用治療方法的某些細胞或某些細胞群體中受到限制。在某些情況下，需要大量的工程化NK細胞(高效:靶(E:T)比)才能表現出功能活性。在一些實施方案中，所需比率(E:T比)介於1:10或約1:10至10:1或約10:1之間(或大於約1:10且小於約10:1)，或介於1:1或約1:1至10:1或約10:1之間(或大於約1:1且小於約5:1)，如介於2:1或約2:1至10:1或約10:1之間。在一些實施方案中，E:T比大於或約為1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。

對於疾病的預防或治療，適當的劑量可取決於待治療疾病的類型、細胞或重組受體的類型、疾病的嚴重程度和病程、細胞的施用是用於預防目的還是治療目的、既往治療、受試者的臨床病史和對細胞的反應，以及主治醫生的判斷。在一些實施方案中，組合物和細胞適當地一次性或透過一系列治療施用於受試者。

本文所述的細胞可藉由任何合適的手段施用，例如，藉由團注輸注，藉由注射，例如靜脈內或皮下注射、眼內注射、眼周注射、視網膜下注射、玻璃體內注射、經中隔注射、鞏膜下注射、脈絡膜內注射、前房內注射、結膜下(subconjectval)注射、結膜下(subconjuntival)注射、筋膜下(sub-Tenon's)注射、眼球後注射、眼球周注射或後鞏膜旁(posterior juxtascleral)遞送。在一些實施方案中，其藉由腸胃外、肺內和鼻內施用，並且如果需要局部治療的話，藉由病灶內施用來進行施用。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。在一些實施方案中，給定劑量藉由單次團注施用細胞來施用。在一些實施方案中，其藉由例如在不超過3天的時間內多次團注施用細胞，或藉由連續輸注施用細胞來施用。

在一些實施方案中，細胞作為聯合治療的一部分來施用，例如與另一種治療性干預(如抗體或工程化細胞或受體或藥劑，如細胞毒性劑或治療劑)同時施用或以任何順序依次施用。在一些實施方案中，細胞與一種或多種附加治療劑共施用，或與另一種治療性干預關聯施用，所述施用或者同時進行，或者以任何順序依次進行。在某些情景下，細胞與另一種療法在足夠近的時間內共施用，使得細胞群體增強一種或多種附加治療劑的效果，反之亦然。在一些實施方案中，細胞在一種或多種附加治療劑之前施用。在一些實施方案中，細胞在一種或多種附加治療劑之後施用。在一些實施方案中，所述一種或多種附加治療劑包括細胞介素，如IL-2，例如，以增強持久性。在一些實施方案中，所述方法包括施用化療劑。

在一些實施方案中，在施用細胞後，工程化細胞群體的生物活性例如藉由多種已知方法中的任何方法來測量。待評估的參數包括工程化T細胞與抗原在體內(例如，藉由成像)或離體(例如，藉由ELISA或流式細胞術)的特異性結合。在某些實施方案中，工程化細胞破壞靶細胞的能力可以使用本領域已知的任何合適的方法來測量，例如以下文獻中描述的細胞毒性測定：例如，Kochenderfer等人, "Construction and pre-clinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor." Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md.: 1997) 32.7 (2009): 689和Hermans等人, "The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL-and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo." Journal of immunological methods 285.1 (2004): 25-40。在某些實施方案中，藉由測定一種或多種細胞介素如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF的表現和/或分泌來測量細胞的生物活性。在一些方面，藉由評估臨床結果如腫瘤負擔或負荷的減少來測量生物活性。實施例

在以下實施例中進一步描述了本發明，所述實施例並不限制在申請專利範圍中描述的本發明的範圍。實施例1：Pluck-NK細胞的生成

在以下實施例中，實質上建立並測試了根據如上所述實施方案並且在圖 6和圖 7中示出的Pluck-NK細胞，即配備有Recast-IL15和攜帶工程化Fc區的自分泌全長抗PD-L1抗體的臍帶血來源的NK細胞。

第0天，在工程化飼養細胞系的支持下培養來自臍帶血的單個核細胞。在為期兩週的細胞培養過程中，在選定的時間點進行轉導。第14天收穫成熟的產物細胞。圖 9A- 圖9B顯示了兩個代表性臍帶血樣品的細胞生長曲線( 圖9A)和25個臍帶血樣品在第14天的細胞擴增倍數( 圖9B)。平均而言，在病毒轉導後，臍帶血來源的NK細胞在第14天可以體外擴增超過3,000倍。這種體外擴增能力與基準報告(Liu E等人, Use of CAR-Transduced Natural Killer Cells in CD19-Positive Lymphoid Tumors. N Engl J Med2020; 382:545-553；或“Liu等人, 2020”)相當，如果不是更好的話。實施例2：細胞純度

產物細胞包括超過90%的NK細胞(CD56 ⁺)和少於1%的殘餘T細胞(CD3 ⁺)( 圖10A)。這些參數與我們的基準(Liu等人, 2020)相當。殘餘CD3 ⁺細胞也是藥物輸注劑量的一個決定因素。CD3 ⁺細胞不適用於同種異體使用。同種異體CD3 ⁺細胞輸注的安全性標準是每千克體重少於2 × 10 ⁵(Liu等人, 2020)。為了安全估算Pluck-NK的輸注劑量，如果患者體重為50 kg且最終產品中有1%殘餘CD3 ⁺細胞，則患者的最大輸注劑量為1 × 10 ⁹個Pluck-NK細胞。實際上，每名患者1 × 10 ⁹個細胞落入免疫細胞療法的高劑量範圍內。因此，對於較高輸注劑量，作為選擇可以考慮多輪輸注。實施例3：轉導效率

用逆轉錄病毒載體轉導Pluck-NK細胞。當使用新鮮病毒時，轉導效率在70%至90%的範圍內( 圖10B)。當使用由穩定生產細胞系產生的冷凍病毒時，轉導效率可能下降。我們將產品放行標準(或轉導效率，表示被逆轉錄病毒載體成功轉導的細胞的百分比；詳情可見Liu等人, 2020)設定為20%。在基準報告中，CAR-NK產品的轉導效率在22%至67%的範圍內，產品放行標準為15%(Liu等人, 2020)。實施例4：Pluck-NK細胞的生產力

一份臍帶血樣品約為50 ml，含有約1 × 10 ⁸個白血球。5-30%的白血球是NK細胞。考慮到當前NK細胞平台在冷凍保存後的細胞擴增能力、轉導效率、細胞純度和細胞活力，估計每個臍帶血樣品可產生100億個藥物細胞(10 ¹⁰個)。實施例5：Pluck-NK的功能性評估

為了評估Pluck-NK細胞的功能性，我們研究了Pluck-NK在NK細胞活化後的細胞介素概況，進行了靶細胞殺傷試驗，監測了Pluck-NK在沒有支持細胞介素的情況下培養中的長期生長，監測了抗PD-L1抗體的產生，並測試了可冷凍保存性。每個實驗描述如下。 NK細胞活化後的細胞介素概況

為了評估Pluck-NK的功能性，我們對IFNγ和CD107A這兩種與NK細胞活化有關的細胞介素進行了細胞內染色，隨後進行了螢光活化細胞分選(FACS)。CD107a和INFγ是NK細胞在活化後產生的兩種重要的細胞介素，它們的產生與NK細胞活化密切相關。在圖 11A- 圖11B所示的實驗中使用了三種靶細胞系。K562細胞是不表現MHC I類抗原的癌細胞。因此，K562細胞可被所有具有錯誤自殺能力的成熟NK細胞(包括未轉導的來自臍帶血的NK細胞(CB-NK細胞)和Pluck-NK細胞)識別並殺死。ES-2(卵巢癌)和H441(肺癌)是兩種在細胞表面表現PD-L1的癌細胞系。因此，Pluck-NK細胞應當能夠識別並藉由抗PD-L1 ADCC殺死H441和ES-2細胞。為了進一步研究並提供關於抗PD-L1 ADCC的直接證據，我們使用以Pluck-NK條件化的培養基處理未轉導的CB-NK細胞。該條件培養基不含細胞，但含有細胞分泌產物，包括抗PD-L1抗體。透過ADCC，該條件培養基可以賦予CB-NK細胞識別並殺死H441和ES-2細胞的能力。如圖 11A- 圖11B所示，結果顯示Pluck-NK細胞能識別並殺死所有三種靶細胞系。而且，含有由Pluck-NK細胞分泌的抗PD-L1抗體的條件培養基使得CB-NK細胞能夠識別並殺死H441和ES-2細胞，從而提供了Pluck-NK細胞的抗PD-L1 ADCC的直接證據。細胞殺傷試驗

為了評估Pluck-NK的功能性，進行了細胞殺傷試驗。在細胞殺傷試驗中使用了與以上所述相同的三種靶細胞系，以直接監測靶細胞殺傷。在細胞殺傷試驗中也使用了條件培養基，以收集抗PD-L1 ADCC的直接證據。如圖 12所示，結果證實Pluck-NK細胞能識別並殺死所有三種靶細胞系。而且，如條件培養基( 圖12)和Fc阻斷劑( 圖13)的效果所證明的，H441和ES-2的殺傷由抗PD-L1 ADCC介導。 Pluck-NK在培養中的自主生長

我們先前的數據(Liu, E.等人, 2020)表明，野生型IL15細胞介素的分泌使得在不存在任何細胞介素補充劑的情況下體外培養的NK細胞具有一定水平的自主生長能力。如圖 14B所示，當兩個細胞群體在沒有任何細胞介素補充劑的情況下體外培養時，與對照NT-NK細胞(即，未轉導的NK細胞)相比，分泌野生型IL15的CAR-NK細胞表現出相對更好的持久性。具體來說，分泌IL15的CAR-NK細胞的細胞總數在大約9天內保持高於第0天的細胞總數，然後從第12天開始，細胞總數變得低於第0天的細胞總數，並且在培養近一個月(即27-30天)後，與第0天相比，培養物中僅剩下約25%的CAR-NK細胞。相比之下，在相同條件下培養的未配備自分泌IL15的NK細胞從第0天開始就沒有顯示出任何持久性或細胞擴增的跡象，並且細胞群體隨著時間的推移急劇減少，並在培養約兩週後消失( 圖14B)。

進一步評價了Recast-IL15給在沒有任何支持細胞介素或飼養細胞的情況下體外培養的NK細胞提供的自主生長能力。還在與對照相同的實驗條件下監測了CB-NK——未轉導的NK細胞。在該實驗中，Pluck-NK和CB-NK的起始群體都是從第14天培養物中收穫的成熟細胞產物。令人感興趣且出乎意料的是，如圖 14A所示，與分泌的野生型IL15(數據在圖 14B中示出)相比，Recast-IL15可支持Pluck-NK細胞當在沒有任何支持細胞介素的情況下體外培養時更長期的自主生長。更具體地，在開始無細胞介素補充劑的體外培養後，Pluck-NK細胞的細胞總數從第0天開始增加，到第9天幾乎增至三倍，隨後，即使在培養大約25天後，細胞總數仍持續高於第0天，然後在培養大約28-35天後，細胞總數與第0天相比基本保持不變(即，細胞總數不低於90%)( 圖14A)。相比之下，在相同條件下培養的對照CB-NK細胞甚至在第0天細胞數就開始減少，並且在9天後幾乎全部死亡( 圖14A)。該結果表明了Recast-IL15在增強NK細胞的持久性方面的明顯功能。

因此，就Recast-IL15和分泌的野生型IL15在維持NK細胞持久性方面的作用而言，儘管預計它們在機理上在同一訊息路徑上發揮作用，但與分泌的野生型IL15相比，膜結合的Recast-IL15賦予NK細胞當在不存在任何細胞介素補充劑(例如，IL-2、IL-15、IL-21等)的情況下體外培養時出乎意料地更好的自主生長能力。分泌的野生型IL15只能支持NK細胞自主生長大約10天(即，分泌IL15的NK細胞的細胞總數保持不低於培養第0天的細胞總數)，而Recast-IL15出乎意料地可支持在體外和無細胞介素補充劑的條件下培養的NK細胞更有利的長期自主生長，其細胞總數在培養近一個月內保持不低於第0天的細胞總數(即，表現Recast-IL15的NK細胞的細胞總數保持高於或基本上等於(即不低於90%)第0天的細胞總數)。抗PD-L1抗體的產生

藉由ELISA檢測Pluck-NK細胞產生抗PD-L1抗體，結果在圖 15中示出。簡言之，在含有2 ml培養基的24孔板的每個孔中接種1 × 10 ⁶個藥物細胞。在三個選定的時間點(接種後24小時、48小時和72小時)，使用細胞培養基藉由ELISA檢測抗PD-L1抗體的分泌。 Pluck-NK細胞對冷凍保存誘導的凋亡的抗性

冷凍保存可誘導免疫細胞的凋亡，並且這種現象可削弱過繼細胞療法的治療功效。為了研究冷凍保存是否能夠誘導Pluck-NK細胞的凋亡，對新鮮和冷凍保存的Pluck-NK細胞進行了凋亡試驗。具體來說，將Pluck-NK細胞從冷凍保存中復甦，並在細胞培養基中孵育2小時。7-AAD(7-胺基放線菌素D)是一種能與DNA結合，但能被完好細胞有效排除的染料。膜聯蛋白-V常用於凋亡細胞的染色。因此，膜聯蛋白-V ⁺且AAD ^-細胞是早發凋亡且細胞膜完整性良好的細胞。

結果顯示，冷凍保存在約35%的Pluck-NK細胞中引起凋亡(膜聯蛋白-V ⁺7-AAD ^-)( 圖16A- 圖16B)。進一步的分析表明，在凋亡NK細胞群體中，大多數細胞(＞95%)不攜帶轉基因(IL15RA ^-)，因此不是Pluck-NK細胞( 圖16C)。只有約5%的凋亡NK細胞是Pluck-NK細胞(IL15RA ⁺)，與所有凋亡NK細胞相比，它們也顯示出更高的復甦率( 圖16D)。結果表明，雖然在正常NK細胞(不攜帶轉基因的NK細胞)中觀察到冷凍保存誘導的凋亡，但是具有Recast-IL15的Pluck-NK細胞能抵抗該凋亡過程。實施例6：體內安全性和功效

為了研究冷凍保存的Pluck-NK細胞的體內功效和安全性，使用NCG(NOD/ShiLtJGpt-Prkdc ^em26Cd52Il2rg ^em26Cd22/Gpt)小鼠(Gempharmatech品系號T001475)進行了動物實驗。藉由皮下注射1 × 10 ⁷個CaSki細胞進行了腫瘤發生。腫瘤發生七天後，藉由向成年小鼠的側尾靜脈中靜脈內(IV)注射1 × 10 ⁷個Pluck-NK細胞進行藥物細胞輸注。監測腫瘤大小以評估體內功效( 圖17A)。對於體內安全性，監測注射Pluck-NK細胞的小鼠的體重，並與注射PBS的小鼠進行比較( 圖17B)。結果證實了Pluck-NK的體內功效和安全性。藉由設計，Pluck-NK細胞可觸發多層免疫反應，包括錯誤自殺、ADCP、CDC和免疫檢查點阻斷(ICB)。在這些動物實驗中只評估了ADCC。實施例7：肽體-NK細胞的製備

為了證明工程化治療性NK細胞可以藉由工程化ADCC特異性地針對目標癌細胞這一概念，在此舉例說明了一種示例性的肽體-NK設計。肽體是一種類型的蛋白質，其包括與抗體的Fc區融合的生物活性肽，並且Fc區負責抗體的長半衰期和高親和力，這使得肽體對於治療應用而言具有吸引力。在這個具體實施例中，抗IL13Rα2肽體的靶標結合域包含介白素IL13(E13Y)配體或其功能片段或變體，這使得從NK細胞分泌的肽體能夠選擇性地結合被發現在惡性神經膠質瘤和腎細胞癌細胞中限制性表現的受體IL13Rα2。

具體來說，IL13(E13Y)配體(SEQ ID NO: 22)與Fc區(SEQ ID NO: 24)融合，從而生成分泌型融合蛋白(即下文中的“IL13-Fc”)。SEQ ID NO: 25所示的序列提供了與訊息肽SEQ ID NO: 8融合的全長融合蛋白。IL13(E13Y)配體提供了針對IL13Rα2 ⁺靶細胞的靶向機制。IL13-Fc NK細胞來源於臍帶血，並且配備有Recast-IL15和IL13-Fc肽體( 表5)。

IL13-Fc轉基因成功插入臍帶血來源的NK細胞中( 圖18A)。為了驗證IL13-Fc NK的治療功效，CB-NK(未轉導的NK細胞)和IL13-Fc NK細胞分別與IL13Ra2 ⁺膠質母細胞瘤細胞系U251以不同的效:靶比(10:1、5:1、2.5:1或1:1)共培養。結果表明，IL13-Fc NK的細胞毒性強於CB-NK，尤其是在E:T比為10:1時，這證明自分泌抗IL13Rα2肽體增強了NK對膠質母細胞瘤細胞系U251的活性( 圖18B)。然而，以目前的轉導效率，獲得了明確的結果，證明了分泌的IL13-Fc肽體引導NK細胞殺傷腫瘤細胞這一概念( 圖18B)。實施例8：抗PD-L1抗體的表徵 細胞結合試驗

將表現PD-L1的細胞(0.03 × 10 ⁶/孔)與不同濃度的抗PD-L1抗體(包括阿特珠單抗(Ate)、TCRC-L1、TCRC-L2(或以上所述的L2殖株)、TCRC-L4、TCRC-L5、TCRC-L7、TCRC-L8(或以上所述的L8殖株)和TCRC-L10)於4°C孵育60分鐘。然後用第二抗體對細胞染色30分鐘(1:50)(APC-抗人IgG Fc)，隨後進行流式細胞分析。結果透過Prism 7進行分析，並藉由程式確定Kd值。結果在圖 19A中示出，而Kd值在下表中示出。表6. 藉由細胞結合試驗確定的Kd

抗體	Kd (μg/mL)
Ate	0.03
TCRC-L1	0.053
TCRC-L2	0.074
TCRC-L4	0.078
TCRC-L5	0.088
TCRC-L7	0.083
TCRC-L8	0.058
TCRC-L10	0.088

板上ELISA結合試驗

用100 µl包被緩衝液(coating buffer)中的0.2 µg/ml重組人PD-L1(rhPD-L1)蛋白在微孔中於4°C包被過夜。按照ELISA程序，將5倍連續稀釋的抗PD-L1抗體加入用rhPD-L1預包被的測定板中。然後用HRP綴合的抗IgG-Fc試劑檢測結合的抗PD-L1抗體。結果透過Prism 7進行分析，並藉由程式確定Kd值。結果在圖 19B中示出，而Kd值在下表中示出。表7. 藉由板上ELISA結合試驗確定的Kd

抗體	Kd (μg/mL)
Ate	0.0065
TCRC-L1	0.047
TCRC-L2	0.04
TCRC-L4	0.035
TCRC-L5	0.037
TCRC-L7	0.046
TCRC-L8	0.036
TCRC-L10	0.024

細胞阻斷試驗

將表現PD-L1的細胞(0.03e6/孔)與1 μg/ml生物素-PD-1和5 μg/ml抗PD-L1抗體(4倍稀釋)於4°C孵育30分鐘。之後，用第二抗體對細胞染色30分鐘(PE-鏈黴親和素)。結果在圖 19C中示出，而EC ₅₀值在下表中示出。表8. 藉由細胞阻斷試驗確定的EC ₅₀

抗體	EC ₅₀(μg/mL)
Ate	0.023
TCRC-L1	0.053
TCRC-L2	0.074
TCRC-L4	0.078
TCRC-L5	0.088
TCRC-L7	0.083
TCRC-L8	0.058
TCRC-L10	0.088

實施例9：抗PD-L1抗體TCRC-L8的結合特異性 MPA篩選

如圖 20A所示，使用從試驗設置確定的條件在MPA(膜蛋白質組陣列)上篩選測試物。在HEK-293T細胞中表現MPA，並藉由流式細胞術確定測試物的結合。一式兩份檢測每種靶標的結合。抗PD-L1 TCRC-L8顯示與已知的結合配偶體PD-L1結合。測試物還結合三種FCGR蛋白(FCGR2B、FCGR3B和FCGR1A)，這是意料之中的，因為FCGR蛋白能夠結合人Fc並在該試驗中充當陽性對照。MPA篩選鑑定了SSTR4具有結合相互作用，這在滴定研究中進行了驗證。任何在MPA上鑑定的潛在結合相互作用，如果沒有在滴定實驗中進行驗證，均從圖上去除。虛線代表計算出的背景的3個SD。結果表明TCRC-L8可能與SSTR4結合(脫靶)。藉由滴定實驗驗證

如圖 20B所示，抗PD-L1 TCRC-L8顯示與陽性對照蛋白A和PD-L1有強結合，其MFI訊息分別比陰性對照高出106倍和138倍以上。抗PD-L1 TCRC-L8還結合三種不同的FCGR蛋白，其MFI訊息比陰性對照高出2倍以上(FCGR1A 64倍，FCGR3B 52倍，FCGR2B 2倍)。與FCGR蛋白的結合是意料之中的，因為測試物含有可與FCGR蛋白結合的人Fc蛋白。與其同源受體PD-L1相比，抗PD-L1 TCRC-L8與SSTR4的結合在該驗證試驗設置中非常弱。總之，滴定實驗驗證了MPA篩選試驗的結果，表明TCRC-L8不與SSTR4結合，而能夠特異性地與PD-L1結合。其他實施方案

應當理解，儘管本發明已經結合具體實施方式進行了描述，但是前述描述只是說明性的，並非限制本發明的範圍，本發明的範圍藉由所附申請專利範圍來定義。其他方面、優點和修改均在所附申請專利範圍內。

無

圖1是根據本公開的一些實施方案，Recast-IL15的構築體結構和相應胺基酸序列的示意圖。Recast-IL15構築體從N末端到C末端包含訊息肽、IL-15結構域、連接子區和IL-15Rα(或IL-15RA)結構域。圖2顯示了“Recast-IL15”的示意圖及其維持NK細胞的自主生長的工作機制。Recast-IL15是包含與IL15融合的膜結合IL15Rα的工程化蛋白質。與細胞介素IL15的傳統工作機制相比，這種設計具有以下優點：例如，IL15在體外和體內的持續時間延長(即，“長半衰期”)，是自主的(即，“不依賴於呈現IL15的細胞”)，以及IL15基本上以自分泌方式起作用，以維持宿主NK細胞的生長(即，“來自細胞，用於細胞”)。圖3A-圖3B顯示了在NK細胞中表現並由NK細胞分泌的抗體的兩個實施方案的結構示意圖，這些抗體能夠識別靶細胞上的靶抗原，並且能夠進行ADCC/ADCP/CDC。圖4顯示了Ab-NK所攜帶的抗體/抗體樣多肽的工程化Fc區。分別顯示了沿Ab-NK所攜帶的抗體或抗體樣多肽的Fc區的三組工程化胺基酸。胺基酸根據IgG1 Fc區的共有序列進行注釋，根據EU編號，起始胺基酸為Glu216，終止胺基酸為Lys447。圖5A-圖5B顯示了全長自分泌PD-L1抗體的結構和序列。(A)抗PD-L1抗體的構築體設計，其包括訊息肽“IL2SP”、抗原結合域“PD-L1 scFv”和“Fc(設計)”結構域，其序列根據本文所述的實施方案進行工程改造，以延長半衰期並增強ADCC、ADCP和CDC活性。它實現兩種類型的針對癌細胞的功能：免疫檢查點抑制劑和抗體介導的免疫細胞反應。這種設計旨在使PD-L1抗體和NK細胞兩者的治療能力最大化。(B)顯示了全長抗PD-L1抗體的結構及其胺基酸序列。圖6顯示了根據本公開的一些實施方案的Pluck-NK細胞的設計，所述細胞是臍帶血來源的NK細胞，配備有兩種轉基因成分：Recast-IL15和攜帶工程化Fc區的自分泌全長抗PD-L1抗體。圖7顯示了Pluck-NK的作用機制(MOA)。Pluck-NK細胞被設計為刺激多層免疫反應以對抗癌細胞，包括抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、免疫檢查點阻斷(ICB)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)和補體依賴性細胞毒性(CDC)。圖8A-圖8B顯示了在NK細胞中表現並由NK細胞分泌的抗體的兩個實施方案的結構示意圖，這些抗體能夠識別靶細胞上的靶抗原，並且能夠進行ADCC/ADCP/CDC。圖9A-圖9B顯示了細胞在培養中的擴增結果。(A)兩份臍帶血樣品的細胞生長曲線。(B)25份臍帶血樣品的最終細胞擴增倍數(第14天)。圖10A-圖10B顯示了NK細胞產品在第14天的純度和轉導效率。圖11A-圖11B分別顯示了NK細胞活化後的CD107A和IFNγ概況。CB-NK細胞是來源於臍帶血的NK細胞，未用任何轉基因進行工程改造。K562細胞不表現MHC I類抗原。H441(肺癌)和ES2(卵巢癌)是兩種表現PD-L1的細胞系。為了提供ADCC的直接證據，在實驗中使用了用Pluck-NK細胞進行條件化的細胞培養基。該條件培養基只含有“上清液”和細胞分泌物(如果有的話)。移除了在培養基中培養的細胞。圖12顯示了細胞殺傷試驗的結果。移除了在培養基中培養的細胞。E:T比是效應細胞與靶細胞之比。圖13顯示了CD16阻斷試驗的結果。為了證實Pluck-NK能夠透過CD16介導的ADCC來清除腫瘤細胞，在對PD-L1 ⁺ES-2細胞系進行殺傷試驗之前，將Pluck NK細胞(“NK”)與CD16阻斷抗體(殖株：B73.1；BioLegend目錄號：360702)一起預孵育。圖14A顯示了Pluck-NK細胞的生長曲線。CB-NK細胞是來源於臍帶血的NK細胞，未用轉基因進行工程改造(“NT NK”)，並且用作對照。Pluck-NK細胞攜帶Recast-IL15。圖14B顯示了CAR-NK的生長曲線。該圖直接複製自我們的基準技術平台的出版物(Liu, E.等人, "Cord blood NK cells engineered to express IL-15 and a CD19-targeted CAR show long-term persistence and potent antitumor activity." Leukemia32.2 (2018): 520-531；或“Doi:10.1038/leu.2017.226”)，其中NT-NK為未轉導的NK細胞，而CAR-NK為攜帶野生型自分泌IL15轉基因的經轉導的NK細胞。圖15顯示了接種後24h、48h和72h的抗PD-L1抗體產生。所分泌的抗體的濃度藉由ELISA進行測定。圖16A顯示了新鮮NK細胞和冷凍保存的NK細胞的代表性流式細胞術結果。在一部分pluck-NK細胞中觀察到冷凍保存誘導的凋亡(膜聯蛋白-V ⁺7-AAD ^-群體)。圖16B顯示了新鮮的和冷凍保存的pluck-NK細胞中凋亡細胞的百分比。使用集體數據(n=3)計算平均值和誤差槓。圖16C顯示了凋亡NK細胞群體中IL15RA ^-和IL15RA ⁺的百分比。IL-15RA ^-表示沒有轉基因的NK細胞。IL-15RA ⁺表示具有轉基因的NK細胞。圖16D顯示了所有NK細胞(左)和IL-15RA ⁺NK細胞(右)的24小時復甦率。使用了來自三個不同供體的NK細胞(NK1、NK2和NK3)。圖17A-圖17B顯示了Pluck-NK細胞的體內藥物功效和安全性。(A)藉由腫瘤生長測量的Pluck-NK的體內功效。(B)藉由小鼠體重測量監測的Pluck-NK的體內安全性。每組有5隻小鼠。圖18A-圖18B顯示了肽體-NK的體外活性。為了評估肽體-NK的體外功效，進行了細胞毒性試驗。(A)肽體-NK的轉導功效。CB-NK(“CBNK”)表示未轉導的NK細胞。IL13-Fc NK表示肽體-NK細胞。(B)在不同效:靶比下針對IL13Ra2 ⁺膠質母細胞瘤細胞系U251的細胞毒性。圖19A顯示了抗PD-L1抗體的細胞結合試驗結果。圖19B顯示了抗PD-L1抗體的板上ELISA結合試驗結果。圖19C顯示了抗PD-L1抗體的細胞阻斷試驗結果。圖20A顯示了使用膜蛋白質組陣列對於抗PD-L1 TCRC-L8的篩選結果。圖20B顯示了藉由滴定實驗對於抗PD-L1 TCRC-L8的驗證結果。圖21列出了抗PD-L1抗體的Kabat CDR序列。圖22列出了抗PD-L1抗體的North/Aho CDR序列。

Claims

一種工程化免疫細胞，其表現包含介白素15(IL15)結構域和介白素15受體α次單位(IL15Rα)結構域的嵌合多肽，其中：當表現時，所述嵌合多肽是細胞膜結合的，並且當所述工程化免疫細胞的群體在體外培養時，在沒有任何支持細胞介素的情況下培養至少7天後，其細胞總數保持較高或基本不變。
如請求項1所述的工程化免疫細胞，其中所述免疫細胞是自然殺手(NK)細胞、T細胞或腫瘤浸潤細胞(TIL)，優選NK細胞。
如請求項1或2所述的工程化免疫細胞，其中所述工程化免疫細胞是NK細胞。
如請求項1-3中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述IL15結構域具有與SEQ ID NO: 2至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項4所述的工程化免疫細胞，其中所述IL15結構域在與SEQ ID NO: 2的Asn72相對應的位置處包含Asp殘基。
如請求項5所述的工程化免疫細胞，其中所述IL15結構域具有與SEQ ID NO: 3至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項1-6中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述IL15Rα結構域具有與SEQ ID NO: 5至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項1-7中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述IL15結構域和所述IL15α結構域經由工程化連接子融合，其中所述工程化連接子包含與SEQ ID NO: 4至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項1-8中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述嵌合多肽包含與SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項1-9中任一項所述的工程化免疫細胞，當所述免疫細胞的群體在體外培養時，在沒有任何支持細胞介素的情況下培養至少35天後，其細胞總數較高或保持基本不變。
如請求項2-10中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述NK細胞從臍帶血獲得。
如請求項1-11中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述工程化免疫細胞進一步表現和/或分泌一種或多種多肽，每種所述多肽都包含靶標結合域，其中所述靶標結合域能夠特異性識別並結合在靶細胞的細胞表面上表現或呈現的靶分子。
如請求項12所述的工程化免疫細胞，其中所述一種或多種多肽中的每種多肽進一步包含Fc結構域，其中所述Fc結構域能夠介導對於所述工程化免疫細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
如請求項13所述的工程化免疫細胞，其中所述Fc結構域包含根據EU編號的Ser239Asp、Ala330Leu、Ile332Glu、Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile、Pro396Leu、Met428Leu或Asn434Ser中的至少一種。
如請求項14所述的工程化免疫細胞，其中所述Fc結構域包含以下至少一組： (a)Ser239Asp、Ala330Leu和Ile332Glu； (b)Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile和Pro396Leu；或 (c)Met428Leu和Asn434Ser。
如請求項14或15所述的工程化免疫細胞，其中所述Fc結構域包含Ser239Asp、Ala330Leu、Ile332Glu、Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile、Pro396Leu、Met428Leu和Asn434Ser的組合。
如請求項13-16中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述一種或多種多肽中的每種多肽進一步包含經由第一柔性連接子在所述抗原結合域的N末端或所述Fc結構域的C末端融合的第一掩蔽肽，其中所述第一掩蔽肽被配置為阻斷所述多肽的所述Fc結構域，並且所述第一柔性連接子被配置為在靶組織中可裂解。
如請求項17所述的工程化免疫細胞，其中所述靶組織是腫瘤組織，並且所述第一柔性連接子被配置為可被基質金屬蛋白酶1(MMP1)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、基質金屬蛋白酶3(MMP3)、基質金屬蛋白酶7(MMP7)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)和/或基質金屬蛋白酶14(MMP14)降解。
如請求項18所述的工程化免疫細胞，其中所述第一柔性連接子被配置為可被MMP9降解，並且所述第一柔性連接子具有選自SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 27的胺基酸序列。
如請求項17所述的工程化免疫細胞，其中所述第一柔性連接子被配置為可被外源提供給所述靶組織的蛋白酶降解。
如請求項13-20中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述一種或多種多肽中的每種多肽進一步包含經由第二柔性連接子在所述抗原結合域的N末端或所述Fc結構域的C末端融合的第二掩蔽肽，其中所述第二掩蔽肽被配置為阻斷所述多肽的所述抗原結合域，並且所述第二柔性連接子被配置為在靶組織中可裂解。
如請求項21所述的工程化免疫細胞，其中所述靶組織是腫瘤組織，並且所述第二柔性連接子被配置為可被MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9或MMP14降解。
如請求項22所述的工程化免疫細胞，其中所述第二柔性連接子被配置為可被MMP9降解，並且所述第二柔性連接子具有選自SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 27的胺基酸序列。
如請求項21所述的工程化免疫細胞，其中所述第二柔性連接子被配置為可被外源提供給所述靶組織的蛋白酶降解。
如請求項12-24中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述一種或多種多肽包含抗體或其抗原結合片段，其中所述靶標結合域是抗原結合域，該抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)結構域或單個單體可變抗體結構域。
如請求項20所述的工程化免疫細胞，其中所述靶分子選自PD-L1、BCMA、Caudin18.2、CCR4、CD10、CD123、CD147、CD171、CD19、CD20、CD22、CD276、CD319、CD33、CD38、CD70、CLL-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、FLT3、FRα、GD2、GPC3、HER2、HGFR、IL13Ralpha2、間皮素、MG7、MUC1、MUC16、黏連蛋白4 (Nectin4)、PSCA、ROR1、ROR2、TACI、TRBC1、TSLPR和VEGFR。
如請求項25或26所述的工程化免疫細胞，其中所述抗體或其抗原結合片段是抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。
如請求項27所述的工程化免疫細胞，其中所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含scFv結構域，其中所述scFv結構域包含具有與SEQ ID NO: 9至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VL結構域，並且/或者包含具有與SEQ ID NO: 10至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VH結構域。
如請求項28所述的工程化免疫細胞，其中所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的所述scFv結構域包含與SEQ ID NO: 12至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項27所述的工程化免疫細胞，其中所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含scFv結構域，其中所述scFv結構域包含具有與SEQ ID NO: 13至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VL結構域，並且/或者包含具有與SEQ ID NO: 14至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VH結構域。
如請求項30所述的工程化免疫細胞，其中所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的所述scFv結構域具有與SEQ ID NO: 15至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項12-24中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述一種或多種多肽包含肽體，其中所述靶標結合域包含配體多肽。
如請求項32所述的工程化免疫細胞，其中所述靶分子是所述配體多肽能夠特異性識別並結合的受體，其中所述受體選自IL13Rα2、APN/CD13、APP、PD-L1、CD44、P32/gC1qR、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、CD21、EGFR、Epha2、EphB4、HER2、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、VEGFR1、VEGFR3、PSMA、GPC3、IL-10RA、IL-11Rα、IL-6Rα、GP130、VEGFR2、MUC18、Met、MMP9、Thomsen-Friedenreich碳水化合物抗原、NRP-1、PDGFRβ、CD133、PTPRJ、HSPG、E-選擇蛋白、Tie2、VPAC1、ActRIIB、CD163、CXCR4、肝配蛋白A4、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2、肝配蛋白B3、促性腺素釋放激素受體、G蛋白偶聯受體55、鈴蟾肽受體2、IL4受體、低密度脂蛋白受體、瘦素受體、LRP1、黑皮質素1受體、黑皮質素4受體、CD206、尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物受體、神經激肽-1受體、VPAC2、ITGB1、CD27、ITGB5、ITGA1、CD27、LRP1、ACVR2B、COL13A1、NOTCH3、EGFR、VEGFR2、VEGFR3、PDGFR、HER2、ErbB3、ErbB4、RET和FGFR102。
如請求項33所述的工程化免疫細胞，其中所述肽體是抗IL13Rα2肽體，其中其配體多肽包含與SEQ ID NO: 21至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項34所述的工程化免疫細胞，其中所述配體多肽包含一個或多個與SEQ ID NO: 21的位置11、90、107、103和108-111相對應的置換。
如請求項35所述的工程化免疫細胞，其中所述配體多肽在與SEQ ID NO: 21的Glu11相對應的位置處包含Tyr殘基。
如請求項36所述的工程化免疫細胞，其中所述配體多肽包含與SEQ ID NO: 22至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項32所述的工程化免疫細胞，其中所述配體多肽包含配體模擬肽和/或人工肽。
一種用於治療有需要的受試者的癌症的藥物組合物，其包含：治療有效數量的如請求項1-38中任一項的工程化免疫細胞；以及藥學上可接受的佐劑。
一種用於治療有需要的受試者的癌症的方法，其包括：向所述受試者施用治療有效數量的如請求項1-38中任一項的工程化免疫細胞。
一種用於獲得體外培養的免疫細胞的自主生長的方法，其包括：將編碼包含介白素15(IL15)結構域和介白素15受體α次單位(IL15Rα)結構域的嵌合多肽的轉基因轉導到所述免疫細胞中，使得當在所述免疫細胞中表現時，所述嵌合多肽是細胞膜結合的，其中：所述轉導的免疫細胞的特徵是，在沒有任何支持細胞介素的情況下在體外培養至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天、至少31天、至少32天、至少33天、至少34天或至少35天後，其細胞總數保持較高或基本不變。
如請求項41所述的方法，其中所述免疫細胞是自然殺手(NK)細胞、T細胞或腫瘤浸潤細胞(TIL)。
如請求項42所述的方法，其中所述免疫細胞是NK細胞。
如請求項41-43中任一項所述的方法，其中所述IL15結構域具有與SEQ ID NO: 2至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項44所述的方法，其中所述IL15結構域在與SEQ ID NO: 2的Asn72相對應的位置處包含Asp殘基。
如請求項45所述的方法，其中所述IL15結構域具有與SEQ ID NO: 3至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項41-46中任一項所述的方法，其中所述IL15Rα結構域具有與SEQ ID NO: 5至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項41-47中任一項所述的方法，其中所述IL15結構域和所述IL15α結構域經由工程化連接子融合，其中所述工程化連接子具有與SEQ ID NO: 4至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項41-48中任一項所述的方法，其中所述嵌合多肽具有與SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項41-49中任一項所述的方法，其中在轉導後，在沒有任何支持細胞介素的情況下培養至少35天後，所述轉導的NK細胞的細胞總數保持較高或基本不變。
如請求項42-50中任一項所述的方法，其中所述NK細胞從臍帶血獲得。
一種工程化免疫細胞，其表現和/或分泌一種或多種多肽，每種所述多肽都包含靶標結合域，其中所述靶標結合域能夠特異性識別並結合在靶細胞的細胞表面上表現或呈現的靶分子。
如請求項52所述的工程化免疫細胞，其中所述免疫細胞是自然殺手(NK)細胞、T細胞或腫瘤浸潤細胞(TIL)。
如請求項53所述的工程化免疫細胞，其中所述免疫細胞是NK細胞。
如請求項52-54中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述一種或多種多肽中的每種多肽進一步包含Fc結構域，其中所述Fc結構域能夠介導對於所述工程化免疫細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
如請求項55所述的工程化免疫細胞，其中所述Fc結構域包含根據EU編號的Ser239Asp、Ala330Leu、Ile332Glu、Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile、Pro396Leu、Met428Leu或Asn434Ser中的至少一種。
如請求項56所述的工程化免疫細胞，其中所述Fc結構域包含以下至少一組： (a)Ser239Asp、Ala330Leu和Ile332Glu； (b)Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile和Pro396Leu；或 (c)Met428Leu和Asn434Ser。
如請求項56或57所述的工程化免疫細胞，其中所述Fc結構域包含Ser239Asp、Ala330Leu、Ile332Glu、Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile、Pro396Leu、Met428Leu和Asn434Ser的組合。
如請求項52-58中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述一種或多種多肽中的每種多肽進一步包含經由第一柔性連接子在所述抗原結合域的N末端或所述Fc結構域的C末端融合的第一掩蔽肽，其中所述第一掩蔽肽被配置為阻斷所述多肽的所述Fc結構域，並且所述第一柔性連接子被配置為在靶組織中可裂解。
如請求項59所述的工程化免疫細胞，其中所述第一柔性連接子被配置為可被在所述靶組織中特異性或豐富表現的蛋白酶降解。
如請求項60所述的工程化免疫細胞，其中所述蛋白酶是MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9或MMP14。
如請求項61所述的工程化免疫細胞，其中所述蛋白酶是MMP9，並且所述第一柔性連接子具有選自SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 27的胺基酸序列。
如請求項59所述的工程化免疫細胞，其中所述第一柔性連接子被配置為可被外源提供給所述靶組織的蛋白酶降解。
如請求項52-63中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述一種或多種多肽中的每種多肽進一步包含經由第二柔性連接子在所述抗原結合域的N末端或所述Fc結構域的C末端融合的第二掩蔽肽，其中所述第二掩蔽肽被配置為阻斷所述多肽的所述抗原結合域，並且所述第二柔性連接子被配置為在靶組織中可裂解。
如請求項64所述的工程化免疫細胞，其中所述第二柔性連接子被配置為可被在所述靶組織中特異性或豐富表現的蛋白酶降解。
如請求項65所述的工程化免疫細胞，其中所述蛋白酶是MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9或MMP14。
如請求項66所述的工程化免疫細胞，其中所述蛋白酶是MMP9，並且所述第二柔性連接子具有選自SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 27的胺基酸序列。
如請求項64所述的工程化免疫細胞，其中所述第二柔性連接子被配置為可被外源提供給所述靶組織的蛋白酶降解。
如請求項52-68中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述一種或多種多肽包含抗體或其抗原結合片段，其中所述靶標結合域是抗原結合域，該抗原結合域包含單鏈可變片段(scFv)結構域或單個單體可變抗體結構域。
如請求項69所述的工程化免疫細胞，其中所述靶分子選自PD-L1、BCMA、Caudin18.2、CCR4、CD10、CD123、CD147、CD171、CD19、CD20、CD22、CD276、CD319、CD33、CD38、CD70、CLL-1、DLL3、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、FLT3、FRα、GD2、GPC3、HER2、HGFR、IL13Ralpha2、間皮素、MG7、MUC1、MUC16、黏連蛋白4、PSCA、ROR1、ROR2、TACI、TRBC1、TSLPR和VEGFR。
如請求項69或請求項70所述的工程化免疫細胞，其中所述抗體或其抗原結合片段是抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。
如請求項71所述的工程化免疫細胞，其中所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含scFv結構域，其中所述scFv結構域包含具有與SEQ ID NO: 9至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VL結構域，並且/或者包含具有與SEQ ID NO: 10至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VH結構域。
如請求項72所述的工程化免疫細胞，其中所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的所述scFv結構域具有與SEQ ID NO: 12至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項71所述的工程化免疫細胞，其中所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含scFv結構域，其中所述scFv結構域包含具有與SEQ ID NO: 13至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VL結構域，並且/或者包含具有與SEQ ID NO: 14至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VH結構域。
如請求項74所述的工程化免疫細胞，其中所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的所述scFv結構域具有與SEQ ID NO: 15至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項52-68中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述一種或多種多肽包含肽體，其中所述靶標結合域包含配體多肽。
如請求項76所述的工程化免疫細胞，其中所述靶分子是所述配體多肽能夠特異性識別並結合的受體，其中所述受體選自IL13Rα2、APN/CD13、APP、PD-L1、CD44、P32/gC1qR、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、CD21、EGFR、Epha2、EphB4、HER2、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、VEGFR1、VEGFR3、PSMA、GPC3、IL-10RA、IL-11Rα、IL-6Rα、GP130、VEGFR2、MUC18、Met、MMP9、Thomsen-Friedenreich碳水化合物抗原、NRP-1、PDGFRβ、CD133、PTPRJ、HSPG、E-選擇蛋白、Tie2、VPAC1、ActRIIB、CD163、CXCR4、肝配蛋白A4、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2、肝配蛋白B3、促性腺素釋放激素受體、G蛋白偶聯受體55、鈴蟾肽受體2、IL4受體、低密度脂蛋白受體、瘦素受體、LRP1、黑皮質素1受體、黑皮質素4受體、CD206、尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物受體、神經激肽-1受體、VPAC2、ITGB1、CD27、ITGB5、ITGA1、CD27、LRP1、ACVR2B、COL13A1、NOTCH3、EGFR、VEGFR2、VEGFR3、PDGFR、HER2、ErbB3、ErbB4、RET和FGFR102。
如請求項77所述的工程化免疫細胞，其中所述肽體是抗IL13Rα2肽體，其中其配體多肽包含與SEQ ID NO: 21至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項78所述的工程化免疫細胞，其中所述配體多肽包含一個或多個與SEQ ID NO: 21的位置11、90、107、103和108-111相對應的置換。
如請求項79所述的工程化免疫細胞，其中所述配體多肽在與SEQ ID NO: 21的Glu11相對應的位置處包含Tyr殘基。
如請求項80所述的工程化免疫細胞，其中所述配體多肽包含與SEQ ID NO: 22至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項76所述的工程化免疫細胞，其中所述配體多肽包含配體模擬肽和/或人工肽。
如請求項53-82中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述工程化NK細胞當在體外培養時能夠自主生長。
如請求項83所述的工程化免疫細胞，其中所述細胞進一步表現包含介白素15(IL15)結構域和介白素15受體α次單位(IL15Rα)結構域的嵌合多肽，其中：當表現時，所述嵌合多肽是細胞膜結合的，並且能夠與介白素15受體β次單位(IL15Rβ)和介白素15受體γ次單位(IL15Rγ)可操作地形成功能性複合物，以活化所述工程化NK細胞中的IL-15訊息傳導。
如請求項53-84中任一項所述的工程化免疫細胞，其中當所述NK細胞的群體在體外培養時，在沒有任何支持細胞介素的情況下培養至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天、至少31天或至少32天後，其細胞總數能夠保持基本不變。
如請求項53-85中任一項所述的工程化免疫細胞，其中所述工程化NK細胞從臍帶血獲得。
一種用於治療有需要的受試者的癌症的藥物組合物，其包含：治療有效數量的如請求項52-86中任一項的工程化免疫細胞；以及藥學上可接受的佐劑。
一種用於治療有需要的受試者的癌症的方法，其包括：向所述受試者施用治療有效數量的如請求項52-86中任一項的工程化免疫細胞。
一種能與PD-L1結合的抗體或其抗原結合片段，其包含與PD-L1特異性結合的抗原結合域，其中所述抗原結合域包含scFv結構域，其中所述scFv結構域包含具有與SEQ ID NO: 9至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VL結構域，並且/或者包含具有與SEQ ID NO: 10至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VH結構域。
如請求項89所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-L1抗體的所述scFv結構域具有與SEQ ID NO: 12至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
一種能與PD-L1結合的抗體或其抗原結合片段，其包含與PD-L1特異性結合的抗原結合域，其中所述抗原結合域包含scFv結構域，其中所述scFv結構域包含具有與SEQ ID NO: 13至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VL結構域，並且/或者包含具有與SEQ ID NO: 14至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列的VH結構域。
如請求項91所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-L1抗體的所述scFv結構域具有與SEQ ID NO: 15至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的胺基酸序列。
如請求項89-92中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其進一步包含Fc結構域，其中所述Fc結構域能夠介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
如請求項93所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述Fc結構域包含根據EU編號的Ser239Asp、Ala330Leu、Ile332Glu、Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile、Pro396Leu、Met428Leu或Asn434Ser中的至少一種。
如請求項94所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述Fc結構域包含以下至少一組： (a)Ser239Asp、Ala330Leu和Ile332Glu； (b)Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile和Pro396Leu；或 (c)Met428Leu和Asn434Ser。
如請求項94或請求項95所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述Fc結構域包含Ser239Asp、Ala330Leu、Ile332Glu、Phe243Leu、Arg292Pro、Tyr300Leu、Val305Ile、Pro396Leu、Met428Leu和Asn434Ser的組合。
一種能與程式性死亡配體1(PD-L1)結合的抗體或其抗原結合片段，其包含：重鏈可變區(VH)，其包含互補決定區(CDR)1、2和3，其中所述VH CDR1區包含與所選VH CDR1胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列，所述VH CDR2區包含與所選VH CDR2胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列，並且所述VH CDR3區包含與所選VH CDR3胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列；以及輕鏈可變區(VL)，其包含CDR 1、2和3，其中所述VL CDR1區包含與所選VL CDR1胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列，所述VL CDR2區包含與所選VL CDR2胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列，並且所述VL CDR3區包含與所選VL CDR3胺基酸序列至少80%相同的胺基酸序列，其中所選VH CDR 1、2和3胺基酸序列和所選VL CDR 1、2和3胺基酸序列是以下之一： (1)所選VH CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 31、32、33中示出，並且所選VL CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 34、35、36中示出； (2)所選VH CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 37、38、39中示出，並且所選VL CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 40、41、42中示出； (3)所選VH CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 43、44、45中示出，並且所選VL CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 46、47、48中示出；以及 (4)所選VH CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 49、50、51中示出，並且所選VL CDR 1、2、3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 52、53、54中示出。
如請求項97所述的抗體或其抗原結合片段，其中根據Kabat定義，所述VH包含分別具有SEQ ID NO: 31、32和33所示胺基酸序列的CDR 1、2、3，並且所述VL包含分別具有SEQ ID NO: 34、35和36所示胺基酸序列的CDR 1、2、3。
如請求項97所述的抗體或其抗原結合片段，其中根據Kabat定義，所述VH包含分別具有SEQ ID NO: 37、38和39所示胺基酸序列的CDR 1、2、3，並且所述VL包含分別具有SEQ ID NO: 40、41和42所示胺基酸序列的CDR 1、2、3。
如請求項97所述的抗體或其抗原結合片段，其中根據North/Aho定義，所述VH包含分別具有SEQ ID NO: 43、44和45所示胺基酸序列的CDR 1、2、3，並且所述VL包含分別具有SEQ ID NO: 46、47和48所示胺基酸序列的CDR 1、2、3。
如請求項97所述的抗體或其抗原結合片段，其中根據North/Aho定義，所述VH包含分別具有SEQ ID NO: 49、50和51所示胺基酸序列的CDR 1、2、3，並且所述VL包含分別具有SEQ ID NO: 52、53和54所示胺基酸序列的CDR 1、2、3。
如請求項97-101中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段與人PD-L1特異性結合。
如請求項97-102中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是人或人源化抗體或其抗原結合片段。
如請求項97-103中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是單鏈可變片段(scFv)或多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。
一種核酸，其包含編碼多肽的多核苷酸，該多肽包含： (1)免疫球蛋白重鏈或其片段，其包含重鏈可變區(VH)，該VH包含互補決定區(CDR)1、2和3，所述CDR 1、2和3包含分別由SEQ ID NO: 31、32和33(或分別由SEQ ID NO: 43、44和45)所示的胺基酸序列，並且其中所述VH當與包含SEQ ID NO: 13所示胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時能與PD-L1結合； (2)免疫球蛋白輕鏈或其片段，其包含VL，該VL包含CDR 1、2和3，所述CDR 1、2和3包含分別由SEQ ID NO: 34、35和36(或分別由SEQ ID NO: 46、47和48)所示的胺基酸序列，並且其中所述VL當與包含SEQ ID NO: 14所示胺基酸序列的VH配對時能與PD-L1結合； (3)免疫球蛋白重鏈或其片段，其包含重鏈可變區(VH)，該VH包含互補決定區(CDR)1、2和3，所述CDR 1、2和3包含分別由SEQ ID NO: 37、38和39(或分別由SEQ ID NO: 49、50和51)所示的胺基酸序列，並且其中所述VH當與包含SEQ ID NO: 9所示胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)配對時能與PD-L1結合；或者 (4)免疫球蛋白輕鏈或其片段，其包含VL，該VL包含CDR 1、2和3，所述CDR 1、2和3包含分別由SEQ ID NO: 40、41和42(或分別由SEQ ID NO: 52、53和54)所示的胺基酸序列，並且其中所述VL當與包含SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列的VH配對時能與PD-L1結合。
如請求項105所述的核酸，其中所述VH當與VL配對時能特異性結合人PD-L1，或者所述VL當與VH配對時能特異性結合人PD-L1。
如請求項105或106所述的核酸，其中所述免疫球蛋白重鏈或其片段是人或人源化免疫球蛋白重鏈或其片段，並且所述免疫球蛋白輕鏈或其片段是人或人源化免疫球蛋白輕鏈或其片段。
如請求項105-107中任一項所述的核酸，其中所述核酸編碼單鏈可變片段(scFv)、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)或嵌合抗原受體(CAR)。
如請求項105-108中任一項所述的核酸，其中所述核酸是cDNA。
一種載體，其包含一種或多種如請求項105-109中任一項的核酸。
一種載體，其包含兩種如請求項105-109中任一項的核酸，其中所述載體編碼一起能與PD-L1結合的VH區和VL區。
一對載體，其中每個載體包含一種如請求項105-109中任一項的核酸，其中這對載體一起編碼一起能與PD-L1結合的VH區和VL區。
一種細胞，其包含如請求項110或111的載體或如請求項112的一對載體。
如請求項113所述的細胞，其中所述細胞是CHO細胞。
一種細胞，其包含一種或多種如請求項105-109中任一項的核酸。
一種產生抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括 (a)在足以使如請求項113-115中任一項的細胞產生所述抗體或抗原結合片段的條件下培養所述細胞；以及 (b)收集由所述細胞產生的所述抗體或抗原結合片段。
一種能與PD-L1結合的抗體或其抗原結合片段，其包含包含與所選重鏈可變區(VH)序列至少80%相同的胺基酸序列的VH，以及包含與所選輕鏈可變區(VL)序列至少80%相同的胺基酸序列的VL，其中所選VH序列和所選VL序列是以下之一： (1)所選VH序列是SEQ ID NO: 14，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 13；以及 (2)所選VH序列是SEQ ID NO: 10，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 9。
如請求項117所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段與人PD-L1特異性結合。
如請求項117或118所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是人或人源化抗體或其抗原結合片段。
如請求項117-119中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是單鏈可變片段(scFv)或多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。
一種與如請求項97-104和117-120中任一項的抗體或其抗原結合片段交叉競爭的抗體或其抗原結合片段。
一種能與PD-L1結合的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)，其包含與所選VH序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相同的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；以及輕鏈可變區(VL)，其包含與所選VL序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3相同的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所選VH序列和所選VL序列是以下之一： (1)所選VH序列是SEQ ID NO: 14，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 13；以及 (2)所選VH序列是SEQ ID NO: 10，並且所選VL序列是SEQ ID NO: 9。
一種抗體-藥物綴合物，其包含與治療劑共價結合的如請求項97-104和117-122中任一項的抗體或其抗原結合片段。
如請求項123所述的抗體藥物綴合物，其中所述治療劑是細胞毒性劑或細胞抑制劑。
一種治療患有癌症的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效劑量的組合物，該組合物包含如請求項97-104和117-122中任一項的抗體或其抗原結合片段，或如請求項123或124的抗體-藥物綴合物。
如請求項51所述的方法，其中所述受試者患有乳癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、白血病和/或淋巴瘤。
一種降低腫瘤生長速度的方法，所述方法包括使腫瘤細胞與有效劑量的組合物接觸，該組合物包含如請求項97-104和117-122中任一項的抗體或其抗原結合片段，或如請求項123或124的抗體-藥物綴合物。
一種殺傷腫瘤細胞的方法，所述方法包括使腫瘤細胞與有效劑量的組合物接觸，該組合物包含如請求項97-104和117-122中任一項的抗體或其抗原結合片段，或如請求項123或124的抗體-藥物綴合物。
一種藥物組合物，其包含如請求項97-104和117-122中任一項的抗體或其抗原結合片段，以及藥學上可接受的載劑。
一種藥物組合物，其包含如請求項123或124的抗體藥物綴合物，以及藥學上可接受的載劑。