TW202116332A

TW202116332A - 抗alpp car-t細胞療法

Info

Publication number: TW202116332A
Application number: TW109121381A
Authority: TW
Inventors: 陳銳; 彼得亞歷山大; 趙麗霞; 布魯克沃夫; 瑞安農洛亞克
Original assignee: 大陸商廣東天科雅生物醫藥科技有限公司; 美商天科雅生物醫藥有限公司
Priority date: 2019-06-23
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2021-05-01
Also published as: JP2022537068A; CN114555099A; WO2020263796A1; US20220125845A1

Abstract

本公開涉及用於治療患有ALPP陽性癌症的癌症患者的抗ALPP CAR-T細胞療法，所述ALPP陽性癌症包括例如卵巢癌、子宮內膜癌、宮頸癌、睾丸癌等。

Description

抗ALPP　CAR-T細胞療法

對優先權的要求

本申請要求於2019年6月23日提交的美國臨時申請號62/865,244的權益。將前述申請的全部內容以引用方式併入本文。發明領域

本公開涉及用於治療癌症患者的抗ALPP CAR-T細胞療法。

發明背景

卵巢癌占女性所有癌症的大約3%，並且是美國女性中癌症相關死亡的第五大主要原因。由於缺乏早期症狀和有效的卵巢癌篩查測試，因此它在所有女性生殖系統癌症中具有最高的死亡率。已經報導ALPP(鹼性磷酸酶，胎盤的)的表達與卵巢癌之間存在許多關聯。在正常組織中，僅在足月胎盤和子宮內膜中可檢測到ALPP。相比之下，ALPP在卵巢癌中(尤其是在卵巢腺癌、漿液性囊腺癌、未分化癌和無性細胞瘤中)強烈表達。此外，在一些其他惡性腫瘤中(特別是在睾丸精原細胞瘤和子宮內膜癌中)也檢測到ALPP。

免疫細胞療法的最新臨床和商業成功已引起人們對這個領域的極大興趣。儘管在癌症治療方面取得了這種進步，但是針對某些癌症的各種治療的功效仍然相對較差。因此，對有效的抗癌療法存在未滿足的需求。

發明概要

本公開涉及用於治療患有ALPP陽性癌症的癌症患者的抗ALPP CAR-T細胞療法，所述ALPP陽性癌症包括例如卵巢癌、子宮內膜癌、宮頸癌、睾丸癌等。基因工程化T細胞可以識別並攻擊靶細胞。可以將這些T細胞從宿主中分離，並使用例如合適的病毒介導的轉染或非病毒的轉染手段進行遺傳修飾。此後，可以將經修飾的T細胞作為過繼細胞療法輸注回所述患者體內。

在一個方面，本公開涉及治療癌症的方法，所述方法包括向患者施用有效量的基因工程化抗腫瘤人T細胞，以治療所述患者的癌症。在一些實施方案中，已經通過將編碼CAR的重組DNA序列摻入從患者中提取的T細胞中獲得了抗腫瘤人T細胞。在一些實施方案中，編碼的CAR包含與癌細胞中表達的ALPP結合的ALPP抗原結合結構域。

在一些實施方案中，癌症是肺癌。在一些實施方案中，癌症是胃癌。在一些實施方案中，癌症是胰腺癌。在一些實施方案中，癌症是頭頸癌。在一些實施方案中，癌症是結直腸癌。在一些實施方案中，癌症是尿路上皮癌。在一些實施方案中，癌症是腎癌。在一些實施方案中，癌症是生殖器官癌。在一些實施方案中，所述生殖器官癌是卵巢癌。在一些實施方案中，所述生殖器官癌是子宮內膜癌。在一些實施方案中，所述生殖器官癌是宮頸癌。在一些實施方案中，所述生殖器官癌是睾丸癌。

在一個方面，本公開涉及治療癌症的方法，所述方法包括向患者施用有效量的基因工程化抗腫瘤人T細胞，以治療所述患者的癌症。在一些實施方案中，已經通過將編碼CAR的重組DNA序列摻入從患者中提取的T細胞中獲得了抗腫瘤人T細胞。在一些實施方案中，編碼的CAR包含ALPP抗原結合結構域。在一些實施方案中，CAR-T細胞抗原結合結構域由抗體或抗體片段組成。在一些實施方案中，所述抗體具有選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3的可變重鏈區；以及選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的可變輕鏈區。

在一個方面，本公開涉及治療如本文所述的癌症的方法。在一些實施方案中，所述抗體是具有可變重鏈區SEQ ID NO: 1和可變輕鏈區SEQ ID NO: 2的針對ALPP的鼠抗體。

在一個方面，本公開涉及治療如本文所述的癌症的方法。在一些實施方案中，所述抗體是具有可變重鏈區SEQ ID NO: 3和可變輕鏈區SEQ ID NO: 4的針對ALPP的人源化抗體。

在一個方面，本公開涉及嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包含：(a) 特異性地識別鹼性磷酸酶(胎盤的)(ALPP)的細胞外抗原結合結構域；(b) 跨膜結構域；和 (c) 細胞內信號傳導區。

在一些實施方案中，所述抗原結合結構域包含重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)。

在一些實施方案中，所述VH包含重鏈互補決定區(CDR)1、2和3，並且所述VL包含VL CDR 1、2和3。在一些實施方案中，所述VH CDR 1、2和3氨基酸序列以及所述VL CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一者： (1) 所述VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 45、46和47中列出，並且所述VL CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 48、49和50中列出； (2) 所述VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 51、52和53中列出，並且所述VL CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 54、55和56中列出； (3) 所述VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 57、58和59中列出，並且所述VL CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 60、61和62中列出； (4) 所述VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 63、64和65中列出，並且所述VL CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 66、67和68中列出；和 (5) 所述VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 81、82和83中列出，並且所述VL CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 84、85和86中列出。

在一些實施方案中，所述VH包含如下氨基酸序列或由其組成：所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11或13具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；並且所述VL包含如下氨基酸序列或由其組成：所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12或14具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。

在一些實施方案中，所述VH包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 2具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述VH包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 4具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述VH包含與SEQ ID NO: 5具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 6具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述VH包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述VH包含與SEQ ID NO: 9具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 10具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述VH包含與SEQ ID NO: 11具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 12具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述VH包含與SEQ ID NO: 13具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 14具有至少90%同一性的氨基酸序列。

在一些實施方案中，抗原結合結構域包含scFv。

在一些實施方案中，所述VH區和所述VL區通過柔性接頭連接。

在一些實施方案中，柔性接頭包含EKGRSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 37)的氨基酸序列。在一些實施方案中，柔性接頭包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 87)的氨基酸序列。

在一些實施方案中，嵌合抗原受體還包含鉸鏈區。在一些實施方案中，鉸鏈區包含來自IgG、CD8或CD28的膜近端區。在一些實施方案中，鉸鏈區包含CD8膜近端區。在一些實施方案中，跨膜結構域包含CD4、CD8或CD28的跨膜區。在一些實施方案中，跨膜結構域包含CD8跨膜區。在一些實施方案中，鉸鏈區和/或跨膜區來自人CD8。在一些實施方案中，嵌合抗原受體包含在SEQ ID NO: 38中列出的氨基酸序列、或與SEQ ID NO: 38為至少90%相同的氨基酸序列。

在一些實施方案中，細胞內信號傳導區包含活化的細胞質信號傳導結構域。在一些實施方案中，活化的細胞質信號傳導結構域能夠在T細胞中誘導初級活化信號，是T細胞受體(TCR)組分，和/或包含基於免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。在一些實施方案中，細胞內信號傳導區是或包含CD3ζ的功能性信號傳導結構域。在一些實施方案中，CD3ζ是人CD3ζ。在一些實施方案中，細胞內信號傳導區是或包含在SEQ ID NO: 40中列出的氨基酸序列、或與SEQ ID NO: 40為至少90%序列相同的氨基酸序列。

在一些實施方案中，細胞內信號傳導區還包含共刺激信號傳導區。在一些實施方案中，共刺激信號傳導區位於跨膜結構域與細胞內信號傳導區之間。

在一些實施方案中，共刺激信號傳導區包含來自蛋白質的功能性信號傳導結構域，所述蛋白質選自由以下組成的組：MHC I類分子、TNF受體蛋白質、免疫球蛋白樣蛋白質、細胞因子受體、整聯蛋白、信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化的NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、CD11a/CD18、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD 11b、ITGAX、CD 11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(觸覺)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp和CD19a。

在一些實施方案中，共刺激信號傳導區是或包含來自OX40、CD28、4-1BB、ICOS的功能性信號傳導結構域或其信號傳導部分。在一些實施方案中，共刺激信號傳導區包含4-1BB的細胞內信號傳導結構域。在一些實施方案中，4-1BB是人4-1BB。在一些實施方案中，共刺激信號傳導區是或包含在SEQ ID NO: 39中列出的氨基酸序列、或與SEQ ID NO: 39為至少90%相同的氨基酸序列。

在一些實施方案中，共刺激信號傳導區包含CD28和4-1BB的細胞內信號傳導結構域。在一些實施方案中，CD28是人CD28，並且4-1BB是人4-1BB。在一些實施方案中，共刺激信號傳導區是或包含在SEQ ID NO: 90中列出的氨基酸序列、或與SEQ ID NO: 90為至少90%相同的氨基酸序列。

在一個方面，本公開涉及嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包含與SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28、30、91、92或93具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 18為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。在一些實施方案中，所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 20為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。在一些實施方案中，所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 22為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。在一些實施方案中，所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 24為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。在一些實施方案中，所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 26為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。在一些實施方案中，所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 28為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。在一些實施方案中，所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 30為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。在一些實施方案中，所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 91為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。在一些實施方案中，所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 92為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。在一些實施方案中，所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 93為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。

在一個方面，本公開涉及編碼如本文所述的嵌合抗原受體的多核苷酸。

在一個方面，本公開涉及包含如本文所述的多核苷酸的載體。

在一些實施方案中，載體還包含編碼抗PD-1抗體或其抗原結合片段的核酸。在一些實施方案中，載體還包含編碼抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的核酸。

在一些實施方案中，載體是病毒載體。在一些實施方案中，病毒載體是逆轉錄病毒載體或慢病毒載體。

在一個方面，本公開涉及工程化細胞，其包含如本文所述的嵌合抗原受體。

在一個方面，本公開涉及工程化細胞，其包含如本文所述的多核苷酸或載體。

在一些實施方案中，工程化細胞是從受試者(例如人受試者)獲得的原代細胞。在一些實施方案中，工程化細胞是細胞系。在一些實施方案中，工程化細胞是免疫細胞。在一些實施方案中，免疫細胞是NK細胞或T細胞。在一些實施方案中，工程化細胞是T細胞。在一些實施方案中，T細胞是CD8+的。在一些實施方案中，T細胞是CD4+的。在一些實施方案中，T細胞是從人受試者分離的。

在一些實施方案中，工程化細胞表達嵌合抗原受體。

在一些實施方案中，工程化細胞表達細胞因子和/或共刺激配體。在一些實施方案中，細胞因子和/或共刺激配體是膜拴系的。在一些實施方案中，細胞因子和/或共刺激配體是分泌的。在一些實施方案中，細胞因子是IL-2、IL-5或IL-12。在一些實施方案中，共刺激配體是CD40L(CD154)或41-BBL(CD137L)。在一些實施方案中，工程化細胞表達抗體或其抗原結合片段(例如scFv)。

在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段是免疫檢查點抑制劑。在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段特異性地結合PD-1、PD-L1或CTLA-4。

在一個方面，本公開涉及用於生產工程化細胞的方法，所述方法包括將如本文所述的載體在體外或離體引入細胞中。

在一些實施方案中，載體是病毒載體，並且所述引入通過轉導來進行。

在一個方面，本公開涉及產生細胞群的方法，所述方法包括將核酸引入細胞中，其中所述核酸包含如本文所述的多核苷酸、或編碼如本文所述的嵌合抗原受體的核酸。

在一個方面，本公開涉及治療受試者中的ALPP相關的疾病或障礙的方法，所述方法包括向所述受試者施用如本文所述的工程化細胞。

在一些實施方案中，ALPP相關的疾病或障礙是癌症。在一些實施方案中，所述癌症是睾丸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、宮頸癌、尿路上皮癌、胰腺癌、肝癌或胃癌。

在一些實施方案中，所述方法還包括向受試者施用檢查點抑制劑。在一些實施方案中，檢查點抑制劑是抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、或抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段。

在一個方面，本公開涉及抗ALPP抗體或其抗原結合片段，所述抗ALPP抗體或其抗原結合片段包含：含有互補決定區(CDR)1、2和3的重鏈可變區(VH)、以及含有CDR 1、2和3的輕鏈可變區(VL)。在一些實施方案中，所述VH CDR1區包含與選擇的VH CDR1氨基酸序列為至少80%相同的氨基酸序列，所述VH CDR2區包含與選擇的VH CDR2為至少80%相同的氨基酸序列，並且所述VH CDR3區包含與選擇的VH CDR3氨基酸序列為至少80%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述VL CDR1區包含與選擇的VL CDR1氨基酸序列為至少80%相同的氨基酸序列，所述VL CDR2區包含與選擇的VL CDR2氨基酸序列為至少80%相同的氨基酸序列，並且所述VL CDR3區包含與選擇的VL CDR3氨基酸序列為至少80%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述選擇的VH CDR 1、2和3氨基酸序列以及所述選擇的VL CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一者： (1) 所述選擇的VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 51、52和53中列出，並且所述選擇的VL CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 54、55和56中列出； (2) 所述選擇的VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 57、58和59中列出，並且所述選擇的VL CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 60、61和62中列出； (3) 所述選擇的VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 63、64和65中列出，並且所述選擇的VL CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 66、67和68中列出；和 (4) 所述選擇的VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 81、82和83中列出，並且所述選擇的VL CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 84、85和86中列出。

在一個方面，本公開涉及與ALPP結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH包含與選擇的VH序列為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列，並且所述VL包含與選擇的VL序列為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11和13，並且所述選擇的VL序列選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12和14。

在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段特異性地結合人ALPP。

在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段是人源化抗體或其抗原結合片段。

在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段是單鏈可變片段(scFv)。

在一個方面，本公開涉及抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含如本文所述的抗體或其抗原結合片段的VH CDR 1、2和3以及VL CDR 1、2和3。

在一個方面，本公開涉及嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包含如本文所述的抗體或其抗原結合片段的VH CDR 1、2和3以及VL CDR 1、2和3。

如本文所用，術語“基因工程化細胞”或“遺傳修飾的細胞”是指在細胞中具有核酸序列的修飾的細胞，包括但不限於在其基因組中具有一個或多個核苷酸的插入、缺失、取代、或修飾的細胞、和/或具有外源核酸序列(例如載體)的細胞，其中所述外源核酸序列不一定整合到基因組中。

如本文所用，術語“外周血細胞”是指通常在外周血中發現的細胞，包括但不限於嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、T細胞、單核細胞、K細胞、粒細胞和B細胞。

如本文所用，術語“癌症”或“癌細胞”是指以不受控制的方式分裂(例如在血液中形成實體瘤或過量的腫瘤細胞)的細胞。此類細胞的實例包括具有以迅速增殖的細胞生長為特徵的異常狀態或狀況的細胞。所述術語意在包括癌性生長(例如腫瘤)、致癌過程、轉移性組織、以及惡性轉化的細胞、組織或器官，而不管組織病理類型或浸潤期。癌細胞可以在血液中形成實體瘤或過多的腫瘤細胞(例如血液癌)。另選地或另外地，其可以包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉化的細胞、組織或器官，而不管組織病理類型或浸潤期。實體瘤的實例包括各種器官系統的惡性腫瘤(例如肉瘤)、腺癌和癌，諸如累及肝、肺、乳腺、淋巴、胃腸道(例如結腸)、泌尿生殖道(例如腎、尿路上皮細胞)、前列腺和咽的那些。腺癌包括惡性腫瘤，諸如大多數結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、肺非小細胞癌、小腸癌和食管癌。可以通過本文所述的方法治療的癌症的實例包括例如骨癌、胰腺癌、皮膚癌(例如黑素瘤)、頭或頸癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性髓樣白血病、慢性髓樣白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病)、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅生物、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、和/或T細胞淋巴瘤。

如本文所用，術語“載體”是指可以通過其將多核苷酸序列(例如外來基因)引入宿主細胞中以便獲得所引入的核苷酸序列的所需基因表達的運載體。選殖載體可以包括例如質粒、噬菌體、病毒等。載體的最流行類型是“質粒”，其是指可以將包含目的基因的額外DNA區段連接到其中的閉合環狀雙鏈DNA環。載體的另一種類型是將要運輸的核酸構建體連接到病毒基因組中的病毒載體。病毒載體能夠在它們被引入的宿主細胞中自主複製，或者可以將它們自身整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導與它們可操作地連接的基因的表達。此類載體在本文中被稱為“重組表達載體”或簡稱為“表達載體”。在一些實施方案中，載體是病毒載體(例如複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。在一些實施方案中，載體是逆轉錄病毒載體。在一些實施方案中，載體可以通過去除逆轉錄病毒gag、pol和env基因並替代上目的基因來創建。

如本文所用，“受試者”是哺乳動物，諸如人或非人動物。在一些實施方案中，向其施用細胞、細胞群或組合物的受試者(例如患者)是哺乳動物，通常是靈長類動物，諸如人。在一些實施方案中，靈長類動物是猴子或猿。受試者可以是男性或女性，並且可以是任何合適的年齡，包括嬰兒、少年、青少年、成年和老年受試者。在一些實施方案中，受試者是非靈長類哺乳動物，諸如狗、貓、馬、齧齒動物、大鼠或小鼠。

如本文所用，術語“T細胞”是指屬於在胸腺中發育並在免疫應答中起重要作用的淋巴細胞類型的細胞。通過在細胞表面上存在T細胞受體，可以將T細胞與其他淋巴細胞區分開。

如本文所用，術語“約”是指可測量的值，諸如量、持續時間等，並且涵蓋指定值的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或±0.1%的變化。

如本文所用，術語“抗體”是指含有至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個或六個)互補決定區(CDR)(例如，來自免疫球蛋白輕鏈的三個CDR中的任何一個或來自免疫球蛋白重鏈的三個CDR中的任何一個)並且能夠特異性地結合表位的任何抗原結合分子。抗體的非限制性實例包括：單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、單鏈抗體、嵌合抗體、人抗體和人源化抗體。在一些實施方案中，抗體可以含有人抗體的Fc區。術語抗體還包括由抗體片段形成的衍生物，例如雙特異性抗體、單鏈抗體、雙抗體、線性抗體和多特異性抗體。

如本文所用，術語“抗原結合片段”是指全長抗體的一部分，其中所述抗體的所述部分能夠特異性地結合抗原。在一些實施方案中，抗原結合片段含有至少一個可變結構域(例如，重鏈的可變結構域或輕鏈的可變結構域)。抗體片段的非限制性實例包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。

如本文所用，術語“人源化抗體”是指含有源自非人(例如小鼠)免疫球蛋白的最小序列並且含有源自人免疫球蛋白的序列的非人抗體。在非限制性實例中，人源化抗體是人抗體(接受者抗體)，其中所述接受者抗體的高變(例如CDR)區殘基被來自非人抗體(例如，供體抗體)(例如具有所需特異性、親和力和能力的小鼠、大鼠或兔抗體)的高變(例如CDR)區殘基替代。在一些實施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被對應的非人(例如小鼠)免疫球蛋白殘基替代。在一些實施方案中，人源化抗體可以含有在接受者抗體或在供體抗體中未發現的殘基。可以進行這些修飾以進一步改善抗體性能。在一些實施方案中，人源化抗體含有至少一個且通常是兩個可變結構域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高變環(CDR)對應於非人(例如小鼠)免疫球蛋白的那些，並且全部或基本上全部的框架區是人免疫球蛋白的那些。人源化抗體還可以含有免疫球蛋白恒定區(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定區)的至少一部分。可以使用本領域已知的分子生物學方法生產人源化抗體。本文描述了用於產生人源化抗體的方法的非限制性實例。

如本文所用，術語“單鏈抗體”是指含有能夠特異性地結合抗原的至少兩個免疫球蛋白可變結構域(例如，哺乳動物免疫球蛋白重鏈或輕鏈的可變結構域)的單個多肽。本文描述了單鏈抗體的非限制性實例。

如本文所用，當提及抗體或抗體相關分子(例如CAR)時，短語“特異性地結合”(“specifically binding”和“specifically binds”)意指抗體相對於其他分子優選與其靶分子(例如ALPP)相互作用，因為相互作用取決於靶分子上特定結構(即抗原決定簇或表位)的存在；換句話說，所述試劑正在識別並結合包括特定結構的分子而不是通常的全部分子上。特異性地結合靶分子的抗體可以被稱為靶標特異性抗體。例如，可以將與ALPP分子特異性地結合的抗體稱為ALPP特異性抗體或抗ALPP抗體。

如本文所用，術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”可互換使用，是指具有至少兩個氨基酸的任何長度的氨基酸聚合物。

如本文所用，術語“多核苷酸”、“核酸分子”和“核酸序列”在本文中可互換使用，是指具有至少兩個核苷酸的任何長度的核苷酸聚合物，並且包括但不限於DNA、RNA、DNA/RNA雜合體及其修飾。

除非另有定義，否則本文所用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。本文描述了用於在本發明中使用的方法和材料，也可以使用本領域已知的其他合適的方法和材料。材料、方法和實例僅僅是說明性的，而不意圖進行限制。本文提及的全部出版物、專利申請、專利、序列、資料庫條目和其他參考文獻均全文以引用方式併入。在發生衝突的情況下，以本說明書(包括定義)為準。

根據以下具體實施方式和附圖以及根據申請專利範圍，本發明的其他特徵和優點將顯而易見。

具體實施方式

人免疫系統能夠識別和消除已被感染或損傷的細胞以及已經癌變的那些細胞。免疫細胞療法利用了人免疫系統的優勢，並且正在徹底改變癌症療法。其涉及將免疫細胞轉移到患者體內。所述細胞最常見源自免疫系統，並且可以來源於患者或另一個個體。在自體癌症免疫療法中，從患者提取免疫細胞，將所述免疫細胞進行遺傳修飾和體外培養，並且再返回到同一患者。比較而言，同種異體療法涉及從供體受試者分離並擴增的細胞。免疫細胞療法中使用了許多不同種類的免疫細胞。這些細胞療法包括例如腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)療法、工程化T細胞受體(TCR)療法、嵌合抗原受體(CAR)T細胞療法、和自然殺傷(NK)細胞療法。

嵌合抗原受體T細胞(也稱為CAR-T細胞)是已經進行基因工程化以生產用於在免疫療法中使用的人工T細胞受體的T細胞。在CAR-T細胞療法中，用編碼嵌合抗原受體的載體轉染所述細胞。嵌合抗原受體可以結合癌症抗原，並且不需要癌症抗原由MHC呈遞。一些其他免疫細胞也可以用於這些細胞療法。例如，天然殺傷細胞也可以用編碼嵌合抗原受體的載體轉染。

胎盤鹼性磷酸酶(PLAP或ALPP)是一種質膜定位的酶，其正常人體組織表達僅限於胎盤、子宮頸和子宮。然而，ALPP也在卵巢癌、宮頸癌和睾丸癌中表達，使得ALPP被認為是這些腫瘤類型的分子標記。理論上，ALPP在正常組織中的這種受限制的表達及其在上述癌症中的上調可以成功地用於改善癌症的診斷和預後預測，以及開發沒有重大副作用的新治療。

本公開涉及用於治療患有ALPP陽性腫瘤的癌症患者的抗ALPP CAR-T細胞療法。此外，本發明公開了生產抗ALPP CAR-T細胞的方法，所述抗ALPP CAR-T細胞可以用作患有ALPP陽性癌症的患者的基於細胞的療法。

在一個方面，本文提供了抗ALPP CAR-T療法作為針對ALPP陽性腫瘤患者開發的新型治療。這種抗ALPP CAR被工程化為可以作為單一治療劑進行遞送的患者特異性T細胞。此外，這些患者特異性抗ALPP CAR-T細胞展現出針對各種ALPP相關癌症的改善的功效和特異性。如上所述，ALPP表達在正常人體組織中受到高度限制，表明靶向這種蛋白質的CAR-T細胞療法可以被很好地耐受。實際上，這裡使用宮頸癌的動物模型進行的研究表明，抗ALPP CAR-T細胞療法實際上是安全且有效的。

在一些實施方案中，本公開提供了用於個性化抗腫瘤免疫療法的方法，其中所述抗ALPP CAR工程化T細胞是從患者血液生產的。這些工程化T細胞可以作為細胞療法產品重新輸注到患者體內。然後可以將這樣的產品應用於具有ALPP陽性腫瘤的任何患者，包括患有卵巢癌、子宮內膜癌、宮頸癌或睾丸癌等的患者。

在一些實施方案中，本公開提供了生產工程化T細胞的方法，其中將這些T細胞用含有抗ALPP CAR轉基因的逆轉錄病毒載體進行轉染，然後在體外擴增。將這些擴增的細胞輸注回患者體內，在那裡工程化T細胞鑒定並破壞ALPP陽性腫瘤細胞。

在一些實施方案中，使用標準分子生物學技術產生MP71逆轉錄病毒構建體。此外，A02(圖1A)和A03(圖1B)公開了根據本公開的逆轉錄病毒質粒圖，其中A02(圖1A)是基於識別ALPP的鼠H17E2單株抗體，而A03(圖1B)是H17E2的人源化版本。

此外，本公開提供了檢測CAR-T細胞對不同類型的癌症的效果的體外方法。可以使用ALPP陽性SiHa宮頸癌細胞評估CAR-T細胞活化對於ALPP抗原的反應，其中Jurkat和PBMC CAR-T細胞二者在與SiHa細胞共培養後均被特異性地活化。可以通過建立的T細胞活化標記CD69(圖3)和IFN-γ(圖5和6)的表達來測量CAR-T細胞活化。

此外，本公開提供了檢測CAR-T細胞對不同類型的癌症的效果的體內方法。為此，將SiHa細胞腹膜內地接種到免疫缺陷型NSG小鼠中，以允許ALPP陽性腫瘤的形成。隨後，將A02、A03或未經轉導的CAR-T細胞作為抗腫瘤療法施用。雖然用未經轉導的T細胞治療的小鼠中的腫瘤迅速進展而導致動物死亡，但是用A02或A03 CAR-T細胞治療顯著改善了動物存活(圖9)，而沒有可觀察到的由這種治療引起的毒性(圖8)。這些發現表明，對於生殖器官的ALPP陽性腫瘤而言，抗ALPP CAR-T細胞療法是一種安全且有效的治療。

根據本公開的實施方案，抗ALPP CAR-T細胞療法可以用於不同類型的ALPP表達升高的癌症，包括但不限於宮頸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮癌、睾丸癌、腦癌、甲狀腺癌、肺癌、胰腺癌、頭頸癌、胃癌、結直腸癌、腎癌和尿路上皮細胞癌。

根據一些實施方案，CAR包含單鏈抗體片段，所述單鏈抗體片段包含原始的鼠抗ALPP結合結構域。所述抗體包含具有由SEQ ID NO: 1表示的序列的可變重鏈區、和具有由SEQ ID NO: 2表示的序列的可變輕鏈區。

在一些實施方案中，CAR包含人源化的抗ALPP結合結構域。所述抗原結合結構域包含具有由SEQ ID NO: 3表示的序列的可變重鏈區、和具有由SEQ ID NO: 4表示的序列的可變輕鏈區。

在一些實施方案中，逆轉錄病毒質粒A02(圖1A)轉染的細胞表達具有鼠抗ALPP結合結構域的CAR。抗體(H17E2)片段包含可變重鏈區SEQ ID NO: 1和可變輕鏈區SEQ ID NO: 2。

在一個方面，本公開還提供了對人ALPP具有特異性的人源化抗體或抗體片段。在一些實施方案中，通過將互補決定區(CDR)從鼠抗體(例如H17E2)轉移到人抗體可變區框架中來生產人源化抗體或抗體片段。這種開發的分子可以用於治療或診斷癌症。

在一些實施方案中，逆轉錄病毒質粒A03(圖1B)轉染的細胞表達具有人源化抗ALPP結合結構域的CAR。人源化抗體片段包含可變重鏈區SEQ ID NO: 3和可變輕鏈區SEQ ID NO: 4。

臨床上，可以將抗ALPP CAR工程化為患者特異性T細胞，並作為單一治療劑進行遞送。基於本文所示的體外和體內結果，此策略可以具有針對各種ALPP相關癌症的改善的功效和特異性。ALPP 和癌症

鹼性磷酸酶(胎盤的)(ALPP)也稱為胎盤鹼性磷酸酶(PLAP)(NCBI GENE ID: 250))，是一種質膜定位酶，其正常人體組織表達僅限於胎盤、子宮頸和子宮。ALPP是一種同二聚體的膜相關糖蛋白酶。它屬於由四個鹼性磷酸酶同工酶構成的多基因家族。所述酶起同二聚體的作用，並且具有含有其酶促功能所必需的一個鎂離子和兩個鋅離子的催化位點。它在特定炎性疾病過程的調節中起著重要作用。有至少四種不同但相關的鹼性磷酸酶：腸、胎盤、類胎盤、和肝/骨骼/腎。胎盤鹼性磷酸酶(ALPP)與妊娠晚期期間在胎盤中出現的ALPP膜結合同工酶(Regan和Nagao類型)發生反應。胎盤鹼性磷酸酶可用於鑒定睾丸生殖細胞腫瘤。與生殖細胞腫瘤不同，ALPP陽性體細胞腫瘤一致地表達上皮膜抗原(EMA)。

通常在卵巢癌、宮頸癌和睾丸癌中發現ALPP表達升高。還已在睾丸精原細胞瘤、原發性顱內胚組織瘤、上皮性卵巢癌、卵巢腺癌、漿液性囊腺癌、未分化癌、無性細胞瘤、子宮癌、子宮內膜癌、尿路上皮癌、胃癌(stomach cancer)、肺癌、胰腺癌、骨肉瘤和胃癌(gastric cancer)中觀察到ALPP表達。由於其受限制的表達模式，ALPP可以被視為ALPP陽性癌症的分子標記和治療靶標。

本公開涉及用於治療患有ALPP陽性癌症的癌症患者的抗ALPP CAR-T細胞療法。本公開還提供了靶向ALPP的抗體或抗原結合片段。嵌合抗原受體和結合分子

嵌合抗原受體(CAR)將正常T細胞活化的許多方面特徵組合成單個蛋白質。它們將細胞外抗原識別結構域連接至細胞內信號傳導結構域，所述細胞內信號傳導結構域當結合抗原時活化T細胞。CAR通常由四個區域構成：抗原結合結構域、細胞外鉸鏈區、跨膜結構域、和細胞內T細胞信號傳導結構域。

抗原結合結構域在受體的胞外結構域部分中暴露於細胞外部。其與潛在的靶分子相互作用，並且負責將CAR-T細胞靶向表達匹配分子的任何細胞。抗原結合結構域通常源自作為單鏈可變片段(scFv)連接在一起的單株抗體的可變區。scFv是由用短接頭肽連接的免疫球蛋白的輕鏈(VL)和重鏈(VH)組成的嵌合蛋白。兩條鏈之間的接頭由親水性殘基組成，其中的一段甘氨酸和絲氨酸用於柔性，以及一段谷氨酸和賴氨酸用於增加溶解度。在一些實施方案中，抗原結合結構域特異性地結合腫瘤相關抗原，例如BCMA、CD19、CD22、CD30、CD33、CD56、CD123(也稱為IL-3R)、CEA、EBV相關抗原(例如LMP2)、EGFR、GD2、GPC3、HER2、HPV相關抗原(例如E6)、MAGE抗原、間皮素、MUC-1、NY-ESO-1、PSCA、PSMA、ROR1、WT1、或Claudin 18.2。在一些實施方案中，抗原結合結構域特異性地結合ALPP。

鉸鏈，也稱為間隔子，是位於抗原結合結構域與細胞外膜之間的小結構的結構域。理想的鉸鏈增強scFv受體頭部的柔性，從而減少CAR與其靶抗原之間的空間限制。這促進了CAR-T細胞與靶細胞之間的抗原結合和突觸形成。鉸鏈序列通常是基於來自免疫分子(包括例如IgG、CD8和CD28)的膜近端區。

跨膜結構域是一種結構組分，由橫跨細胞膜的疏水性α螺旋組成。它將CAR錨定在質膜上，將細胞外鉸鏈和抗原結合結構域與細胞內信號傳導區橋接。此結構域對於整個受體的穩定性至關重要。通常，使用來自胞內結構域的最接近膜的組分的跨膜結構域，但是不同的跨膜結構域導致不同的受體穩定性。已知CD28跨膜結構域導致高度表達的穩定受體。

細胞內T細胞信號傳導結構域位於細胞內部的受體胞內結構域中。在抗原結合外部抗原結合結構域之後，CAR受體聚集在一起並傳輸活化信號。然後，受體的內部細胞質末端使T細胞內部的信號傳導永久化。正常的T細胞活化依賴於CD3-ζ細胞質結構域中存在的基於免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)的磷酸化。為了模擬此過程，通常將CD3-ζ的細胞質結構域用作主要的CAR胞內結構域組分。T細胞除CD3信號傳導外還需要共刺激分子，以便在活化之後持續存在。由於這個原因，CAR受體的胞內結構域通常還包括來自共刺激蛋白的一個或多個嵌合結構域。已經成功地測試了來自多種共刺激分子的信號傳導結構域，包括CD28、CD27、CD134(OX40)和CD137(4-1BB)。

多種CAR分子和表達這些CAR分子的載體可以用於本文所述的方法。在一些實施方案中，CAR分子特異性地結合腫瘤相關抗原，例如ALPP。在一些實施方案中，CAR包含在SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28、30、34、36、91、92或93中任一者中列出的氨基酸序列；或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的氨基酸序列。

抗原受體的示例性結構(包括鉸鏈、跨膜結構域和細胞內T細胞信號傳導結構域)，以及將此類受體工程化並引入細胞中的方法 描述於以下文獻中：例如Chandran等人, “T cell receptor‐based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance.” Immunological reviews 290.1 (2019): 127-147；Cartellieri, Marc, 等人, “Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of cancer.” BioMed Research International 2010 (2010)；以及PCT公開號WO2017173256A1；US2002/131960、US2013/287748、US2013/0149337、U.S. 6,451,995、U.S. 7,446,190、U.S. 8,252,592；將所述文獻中每一者全文以引用方式併入本文。

本公開提供了特異性地結合ALPP的嵌合抗原受體(CAR)或其片段。本文所述的CAR或其片段能夠結合ALPP。

本公開提供了CAR或其片段，所述CAR或其片段包含 (a) 特異性地識別鹼性磷酸酶(胎盤的)(ALPP)的細胞外抗原結合結構域；(b) 跨膜結構域；和 (c) 細胞內信號傳導區。在一些實施方案中，所述抗原結合結構域包括重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)。在一些實施方案中，本文所述的CAR或其片段的VH和VL與本文所述的小鼠抗ALPP抗體(例如A02)的VH和VL相同。在一些實施方案中，本文所述的CAR或片段的VH和VL與本文所述的人源化抗ALPP抗體(例如，A03、A04、A05、A06、A07或A08)的VH和VL相同。

A02 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域(例如scFv)的CDR序列包括分別包含SEQ ID NO: 45、46和47或由其組成的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及分別包含SEQ ID NO: 48、49和50或由其組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。

A03 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域(例如scFv)的CDR序列包括分別包含SEQ ID NO: 51、52和53或由其組成的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及分別包含SEQ ID NO: 54、55和56或由其組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。

A04 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域(例如scFv)的CDR序列包括分別包含SEQ ID NO: 57、58和59或由其組成的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及分別包含SEQ ID NO: 60、61和62或由其組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。

A05 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域(例如scFv)的CDR序列包括分別包含SEQ ID NO: 63、64和65或由其組成的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及分別包含SEQ ID NO: 66、67和68或由其組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。

A06 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域(例如scFv)的CDR序列包括分別包含SEQ ID NO: 69、70和71或由其組成的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及分別包含SEQ ID NO: 72、73和74或由其組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。

A07 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域(例如scFv)的CDR序列包括分別包含SEQ ID NO: 75、76和77或由其組成的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及分別包含SEQ ID NO: 78、79和80或由其組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。

A08 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域(例如scFv)的CDR序列包括分別包含SEQ ID NO: 81、82和83或由其組成的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，以及分別包含SEQ ID NO: 84、85和86或由其組成的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。

A02 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VH的氨基酸序列在SEQ ID NO: 1中列出。A02 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VL的氨基酸序列在SEQ ID NO: 2中列出。

A03 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VH的氨基酸序列在SEQ ID NO: 3中列出。A03 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VL的氨基酸序列在SEQ ID NO: 4中列出。

A04 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VH的氨基酸序列在SEQ ID NO: 5中列出。A04 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VL的氨基酸序列在SEQ ID NO: 6中列出。

A05 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VH的氨基酸序列在SEQ ID NO: 7中列出。A05 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VL的氨基酸序列在SEQ ID NO: 8中列出。

A06 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VH的氨基酸序列在SEQ ID NO: 9中列出。A06 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VL的氨基酸序列在SEQ ID NO: 10中列出。

A07 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VH的氨基酸序列在SEQ ID NO: 11中列出。A07 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VL的氨基酸序列在SEQ ID NO: 12中列出。

A08 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VH的氨基酸序列在SEQ ID NO: 13中列出。A08 CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域中的VL的氨基酸序列在SEQ ID NO: 14中列出。

在一些實施方案中，將CAR、相關抗體或其抗原結合片段的抗原結合結構域的VH和VL的氨基酸序列人源化(例如，可以用不同的氨基酸取代來修飾序列)。在一些實施方案中，VH和VL可以具有超過一個版本的人源化序列。在一些實施方案中，人源化VH與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11或13為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在一些實施方案中，人源化VL與SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12或14為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。

此外，在一些實施方案中，本文所述的CAR、相關抗體或其抗原結合片段還可以含有一個、兩個或三個重鏈可變區CDR，所述重鏈可變區CDR選自下組：SEQ ID NO: 45-47、SEQ ID NO: 51-53、SEQ ID NO: 57-59、SEQ ID NO: 63-65、SEQ ID NO: 69-71、SEQ ID NO: 75-77和SEQ ID NO: 81-83；和/或一個、兩個或三個輕鏈可變區CDR，所述輕鏈可變區CDR選自下組：SEQ ID NO: 48-50、SEQ ID NO: 54-56、SEQ ID NO: 60-62、SEQ ID NO: 66-68、SEQ ID NO: 72-74、SEQ ID NO: 78-80和SEQ ID NO: 84-86。

在一些實施方案中，本文所述的CAR、相關抗體或其抗原結合片段可以具有包含互補決定區(CDR)1、2、3的重鏈可變區(VH)，其中所述CDR1區包含與選擇的VH CDR1氨基酸序列為至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由其組成，所述CDR2區包含與選擇的VH CDR2氨基酸序列為至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由其組成，並且所述CDR3區包含與選擇的VH CDR3氨基酸序列為至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由其組成。在一些實施方案中，所述CAR、相關抗體或其抗原結合片段可以具有包含CDR 1、2、3的輕鏈可變區(VL)，其中所述CDR1區包含與選擇的VL CDR1氨基酸序列為至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由其組成，所述CDR2區包含與選擇的VL CDR2氨基酸序列為至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由其組成，並且所述CDR3區包含與選擇的VL CDR3氨基酸序列為至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由其組成。所述選擇的VH CDR 1、2、3氨基酸序列以及所述選擇的VL CDR 1、2、3氨基酸序列顯示在圖 14 中。

在一些實施方案中，本文所述的CAR、相關抗體或其抗原結合片段包含VH，所述VH含有以下中的一者、兩者或三者：具有零個、一個或兩個氨基酸插入、缺失或取代的VH CDR1；具有零個、一個或兩個氨基酸插入、缺失或取代的VH CDR2；具有零個、一個或兩個氨基酸插入、缺失或取代的VH CDR3。

在一些實施方案中，本文所述的CAR、相關抗體或其抗原結合片段包含VL，所述VL含有以下中的一者、兩者或三者：具有零個、一個或兩個氨基酸插入、缺失或取代的VL CDR1；具有零個、一個或兩個氨基酸插入、缺失或取代的VL CDR2；具有零個、一個或兩個氨基酸插入、缺失或取代的VL CDR3。

所述插入、缺失和取代可以在CDR序列內，或者在CDR序列的一個或兩個末端。在一些實施方案中，基於Kabat編號方案來確定CDR。

本公開還提供了結合ALPP的CAR或其片段。所述CAR、相關抗體或其抗原結合片段含有重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH包含與選擇的VH序列為至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由其組成，並且所述VL包含與選擇的VL序列為至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由其組成。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 1，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 2。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 3，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 4。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 5，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 6。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 7，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 8。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 9，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 10。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 11，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 12。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 13，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 14。

A02 CAR的核酸序列和所編碼的氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18中列出。

A03 CAR的核酸序列和所編碼的氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 19和SEQ ID NO: 20中列出。

A04 CAR的核酸序列和所編碼的氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 21和SEQ ID NO: 22中列出。

A05 CAR的核酸序列和所編碼的氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24中列出。

A06 CAR的核酸序列和所編碼的氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26中列出。

A07 CAR的核酸序列和所編碼的氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 27和SEQ ID NO: 28中列出。

A08 CAR的核酸序列和所編碼的氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 30中列出。

第三代A02 CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO: 91中列出。

第三代A03 CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO: 92中列出。

第三代A06 CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO: 93中列出。

在一些實施方案中，本文提供了多肽或其片段，所述多肽或其片段包含與SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28、30、34、36、91、92或93為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，本文所述的多肽包含如SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28、30、34、36、91、92或93中列出的氨基酸序列；任選地具有約或不超過0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50個氨基酸插入、缺失或取代。

在一些實施方案中，本文所述的抗原結合結構域包含scFv。在一些實施方案中，本文所述的VH和VL通過柔性接頭連接。在一些實施方案中，柔性接頭包含EKGRSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 37)的氨基酸序列。在一些實施方案中，柔性接頭包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 87)的氨基酸序列。在一些實施方案中，柔性接頭包含GGGGS(SEQ ID NO: 88)的至少1、2、3、4、5或6個重複。在一些實施方案中，柔性接頭包含1、2、3、4或5個氨基酸插入、缺失或取代。

在一些實施方案中，本文所述的嵌合抗原受體(CAR)或其片段包含鉸鏈區。在一些實施方案中，鉸鏈區是來自IgG、CD8、CD28或其任何組合的膜近端區。在一些實施方案中，鉸鏈區是CD8(例如人CD8)的膜近端區。在一些實施方案中，本文所述的嵌合抗原受體(CAR)或其片段包含跨膜區。在一些實施方案中，跨膜結構域是4-1BB/CD137的跨膜結構域、T細胞受體的α鏈、T細胞受體的β鏈、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD19、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或T細胞受體的ζ鏈、或其任何組合。在一些實施方案中，跨膜區是來自CD8(例如人CD8)的跨膜區。在一些實施方案中，鉸鏈區和跨膜區直接連接。在一些實施方案中，所連接的鉸鏈區和跨膜區包含與SEQ ID NO: 38為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同的氨基酸序列。

在一些實施方案中，本文所述的嵌合抗原受體(CAR)或其片段包含細胞內信號傳導區。在一些實施方案中，細胞內信號傳導區包含能夠在免疫細胞(例如T細胞)中誘導初級活化信號的活化的細胞質信號傳導結構域。在一些實施方案中，活化的細胞質信號傳導結構域是T細胞受體(TCR)組分。在一些實施方案中，活化的細胞質信號傳導結構域包含基於免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。在一些實施方案中，細胞內信號傳導區包含源自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FceRI、CD66d、DAP10、DAP12或其組合的氨基酸序列。在一些實施方案中，細胞內信號傳導區包含CD3ζ(例如人CD3ζ)的功能性信號傳導結構域。在一些實施方案中，細胞內信號傳導區包含與SEQ ID NO: 40為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同的氨基酸序列。

在一些實施方案中，本文所述的嵌合抗原受體(CAR)或其片段包含共刺激信號傳導區。在一些實施方案中，共刺激信號傳導區位於跨膜結構域與細胞內信號傳導區之間。在一些實施方案中，共刺激信號傳導區包含來自蛋白質的功能性信號傳導結構域，所述蛋白質選自由以下組成的組：MHC I類分子、TNF受體蛋白質、免疫球蛋白樣蛋白質、細胞因子受體、整聯蛋白、信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化的NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、CD11a/CD18、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD 11b、ITGAX、CD 11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(觸覺)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和CD83配體。在一些實施方案中，共刺激信號傳導區包含來自OX40、CD28、4-1BB、ICOS的功能性信號傳導結構域或其信號傳導部分。在一些實施方案中，共刺激信號傳導區包含4-1BB(例如人4-1BB)的細胞內信號傳導結構域。在一些實施方案中，共刺激信號傳導區包含CD28(例如人CD28)的細胞內信號傳導結構域。在一些實施方案中，共刺激信號傳導區包含CD28(例如人CD28)和4-1BB(例如人4-1BB)二者的細胞內信號傳導結構域。

在一些實施方案中，4-1BB細胞內信號傳導結構域包含與SEQ ID NO: 39為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，CD28細胞內信號傳導結構域包含與SEQ ID NO: 89為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，共刺激信號傳導區包含與SEQ ID NO: 39為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，共刺激信號傳導區包含與SEQ ID NO: 90為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%相同的氨基酸序列。抗ALPP 抗體、抗原結合片段和抗原結合結構域

本公開提供了特異性地結合ALPP的抗體及其抗原結合片段。本文所述的抗體和抗原結合片段能夠結合ALPP。本文所述的CAR或其片段的抗原結合結構域可以源自這些抗體或其抗原結合片段。

本公開提供了例如小鼠抗ALPP抗體(例如，A02或H17E2抗體)及其嵌合抗體、及其人源化抗體(例如，A03、A04、A05、A06、A07、A08或A09抗體)。在圖 14 中提供了A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08抗體及其衍生的抗體或其抗原結合片段的CDR序列。

還提供了人源化抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列。由於存在不同的方式來使小鼠抗體人源化(例如，可以用不同的氨基酸取代來修飾序列)，因此抗體的重鏈和輕鏈可以具有超過一個版本的人源化序列。在一些實施方案中，重鏈可變區與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11或13為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。在一些實施方案中，輕鏈可變區與SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12或14為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。重鏈可變區序列可以與輕鏈可變區序列配對，並且它們一起結合至ALPP。

人源化百分比意指如與國際免疫遺傳學資訊系統(International Immunogenetics Information System，IMGT)資料庫中的人抗體序列相比，重鏈或輕鏈可變區序列的同一性百分比。在一些實施方案中，人源化百分比為大於80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%或95%。關於如何確定人源化百分比和如何確定高命中的詳細描述是本領域已知的，並且例如在以下文獻中進行了描述：Jones等人“The INNs and outs of antibody nonproprietary names.” MAbs. 第 8卷第1期 Taylor & Francis, 2016，將其全文以引用方式併入本文。高的人源化百分比通常具有各種優勢，例如，在人類中更安全且更有效、更有可能被人受試者耐受、和/或更不太可能具有副作用。

此外，在一些實施方案中，本文所述的抗體或其抗原結合片段還可以含有一個、兩個或三個重鏈可變區CDR，所述重鏈可變區CDR選自下組：SEQ ID NO: 45-47、SEQ ID NO: 51-53、SEQ ID NO: 57-59、SEQ ID NO: 63-65、SEQ ID NO: 69-71、SEQ ID NO: 75-77和SEQ ID NO: 81-83；和/或一個、兩個或三個輕鏈可變區CDR，所述輕鏈可變區CDR選自下組：SEQ ID NO: 48-50、SEQ ID NO: 54-56、SEQ ID NO: 60-62、SEQ ID NO: 66-68、SEQ ID NO: 72-74、SEQ ID NO: 78-80和SEQ ID NO: 84-86。

本公開還提供了結合ALPP的抗體或其抗原結合片段。所述抗體或其抗原結合片段含有重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH包含與選擇的VH序列為至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由其組成，並且所述VL包含與選擇的VL序列為至少80%、85%、90%或95%相同的氨基酸序列或由其組成。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 1，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 2。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 3，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 4。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 5，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 6。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 7，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 8。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 9，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 10。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 11，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 12。在一些實施方案中，所述選擇的VH序列是SEQ ID NO: 13，並且所述選擇的VL序列是SEQ ID NO: 14。

抗ALPP抗體和抗原結合片段也可以是抗體或抗體片段以及多特異性(例如雙特異性)抗體或抗體片段的抗體變體(包括衍生物和綴合物)。本文提供的另外的抗體是多株的、單株的、多特異性的(多聚體的，例如雙特異性)、人抗體、嵌合抗體(例如人-小鼠嵌合體)、單鏈抗體、細胞內製造的抗體(即，體內抗體)及其抗原結合片段。抗體或其抗原結合片段可以是任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段是IgG抗體或其抗原結合片段。

抗體的片段適合於在所提供的方法中使用，只要它們保留了全長抗體的所需親和力和特異性即可。因此，結合ALPP的抗體的片段將保留結合ALPP的能力。Fv片段是含有完整抗原識別和結合位點的抗體片段。此區域由緊密締合的一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域的二聚體組成，所述緊密締合在本質上可以是共價的，例如在scFv中。在這種配置中，每個可變結構域的三個CDR發生相互作用以在VH-VL二聚體的表面上限定抗原結合位點。總之，六個CDR或其子集共同賦予針對抗體的抗原結合特異性。然而，即使單個可變結構域(或僅包含對抗原特異的三個CDR的一半Fv)也可以具有識別和結合抗原的能力，但是通常親和力低於整個結合位點。單鏈Fv或(scFv)抗體片段包含抗體的VH和VL結構域(或區域)，其中這些結構域存在於單個多肽鏈中。通常，scFv多肽還包含在VH結構域與VL結構域之間多肽接頭(例如本文所述的柔性接頭)，這使得scFv能夠形成所需結構進行抗原結合。

本公開還提供了與如本文所述的任何抗體或抗原結合片段交叉競爭的抗體或其抗原結合片段。交叉競爭測定是本領域已知的，並且例如在以下文獻中進行了描述：Moore等人, “Antibody cross-competition analysis of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 exterior envelope glycoprotein.” Journal of Virology 70.3 (1996): 1863-1872，將其全文以引用方式併入本文。在一個方面，本公開還提供了與如本文所述的任何抗體或抗原結合片段結合相同的表位或區域的抗體或其抗原結合片段。表位結合測定是本領域已知的，並且例如在以下文獻中進行了描述：Estep等人 “High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.” MAbs. 第 5卷第2期 Taylor & Francis, 2013，將其全文以引用方式併入本文。

在一個方面，本公開提供了抗ALPP抗體或其抗原結合片段(例如scFv)，所述抗ALPP抗體或其抗原結合片段包含：(a) 輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含含有選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12或14的VL的氨基酸序列；和 (b) 重鏈可變區，所述重鏈可變區包含含有選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11或13的VH的氨基酸序列；其中所述抗體或其抗原結合片段特異性地結合ALPP(例如內源ALPP)。

在一些實施方案中，本公開提供了抗PD-1抗體或其抗原結合片段(例如scFv)，所述抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含：(a) 輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO: 16的VL的氨基酸序列；和 (b) 重鏈可變區，所述重鏈可變區包含含有SEQ ID NO: 15的VH的氨基酸序列；其中所述抗體或其抗原結合片段阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用。

在一些實施方案中，本公開提供了抗PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如scFv)，所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含：(a) 輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO: 32的VL的氨基酸序列；和 (b) 重鏈可變區，所述重鏈可變區包含含有SEQ ID NO: 31的VH的氨基酸序列；其中所述抗體或其抗原結合片段阻斷PD-1與PD-L1之間的相互作用。

在一些實施方案中，VH和VL通過柔性接頭連接。在一些實施方案中，VH和VL以VH-柔性接頭-VL的順序連接。在一些實施方案中，VH和VL以VL-柔性接頭-VH的順序連接。在一些實施方案中，柔性接頭包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 87)的氨基酸序列。在一些實施方案中，柔性接頭包含GGGGS(SEQ ID NO: 88)的至少1、2、3、4、5或6個重複。在一些實施方案中，將PD-1或PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如scFv)連接至前導肽。在一些實施方案中，前導肽是分泌信號肽。在一些實施方案中，前導肽是人IL-2前導肽(SEQ ID NO: 42)。

本公開提供了衍生自本文所述抗體的多種抗體及其抗原結合片段。通常，抗體(也稱為免疫球蛋白)由兩類多肽鏈組成：輕鏈和重鏈。本公開的抗體的非限制性實例可以是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的完整的四條免疫球蛋白鏈抗體。抗體的重鏈可以是任何同種型(包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD)或亞同種型(包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等)。輕鏈可以是κ輕鏈或λ輕鏈。抗體可以包含兩個相同拷貝的輕鏈和兩個相同拷貝的重鏈。重鏈(每一條重鏈含有一個可變結構域(或可變區，V_H )和多個恒定結構域(或恒定區))在其恒定結構域內通過二硫鍵彼此結合以形成抗體的“莖”。輕鏈(每一條輕鏈含有一個可變結構域(或可變區，V_L )和一個恒定結構域(或恒定區))各自通過二硫鍵結合至一條重鏈。每條輕鏈的可變區與其所結合的重鏈的可變區對齊。輕鏈和重鏈二者的可變區均含有夾在更保守的框架區(FR)之間的三個高變區。

這些高變區稱為互補決定區(CDR)，形成包含抗體的抗原結合表面的環。四個框架區主要採用β-折疊構象，並且CDR形成連接所述β-折疊結構的環，並且在一些情況下形成所述β-折疊結構的一部分。每條鏈中的CDR通過框架區緊密結合，並且與另一條鏈中的CDR一起有助於形成抗原結合區。

通過分析抗體的氨基酸序列來鑒定抗體的CDR區的方法是熟知的，並且CDR的許多定義是常用的。Kabat定義是基於序列變異性，並且Chothia定義是基於結構環區域的位置。這些方法和定義在以下文獻中進行了描述：例如Martin, “Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains,” Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439；Abhinandan, 等人 “Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains,” Molecular immunology 45.14 (2008): 3832-3839；Wu, T.T.和Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250；Martin等人, Methods Enzymol. 203:121-53 (1991)；Morea等人, Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (1997年10月)；Morea等人, J Mol Biol. 275(2):269-94 (1998年1月)；Chothia等人, Nature 342(6252):877-83 (1989年12月)；Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007)；將所述文獻中每一者全文以引用方式併入本文。

CDR對於識別抗原表位很重要。如本文所用，“表位”是能夠被抗體的抗原結合結構域特異性地結合的靶分子的最小部分。表位的最小大小可能為約三個、四個、五個、六個或七個氨基酸，但這些氨基酸不一定位於抗原一級結構的連續線性序列中，因為表位可能取決於以抗原的二級和三級結構為基礎的抗原的三維構型。

在一些實施方案中，抗體是完整的免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亞類(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是高度保守的，區別在於它們的恒定區，尤其是它們的鉸鏈和上部CH2結構域。IgG亞類的序列和差異是本領域已知的，並且例如在以下文獻中進行了描述：Vidarsson, 等人, “IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.” Frontiers in immunology 5 (2014)；Irani, 等人 “Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases.” Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182；Shakib, Farouk, 編輯 The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016；將所述文獻中每一者全文以引用方式併入本文。

抗體也可以是源自任何物種(例如人、齧齒動物、小鼠、駱駝科動物)的免疫球蛋白分子。本文公開的抗體還包括但不限於多株、單株、單特異性、多特異性抗體、和包括與另一個多肽融合的免疫球蛋白結合結構域的嵌合抗體。術語“抗原結合結構域”或“抗原結合片段”是保留了完整抗體的特異性結合活性的抗體的一部分，即能夠與完整抗體的靶分子上的表位特異性地結合的任何抗體部分。其包括例如Fab、Fab'、F(ab')2以及這些片段的變體。因此，在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段可以是例如scFv、Fv、Fd、dAb、雙特異性抗體、雙特異性scFv、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子、由抗體片段形成的多特異性抗體、以及包含是抗體結合結構域或與抗體結合結構域同源的結合結構域的任何多肽。抗原結合結構域的非限制性實例包括例如完整抗體的重鏈和/或輕鏈CDR、完整抗體的重鏈和/或輕鏈可變區、完整抗體的全長重鏈或輕鏈、或來自完整抗體重鏈或輕鏈的單個CDR。

還提供了適合於在本文所述的方法中使用的抗體片段。Fab片段含有輕鏈的可變和恒定結構域以及重鏈的可變結構域和第一恒定結構域(CH1)。F(ab')2抗體片段包含一對Fab片段，所述一對Fab片段通常在它們的羧基末端附近通過它們之間的鉸鏈半胱氨酸共價地連接。抗體片段的其他化學偶聯也是本領域已知的。

線性抗體包含一對串聯的Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)，其與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區。線性抗體可以是雙特異性或單特異性的。

可以在Fc區中修飾本公開的抗體和抗體片段，以提供所需的效應子功能或血清半衰期。

在一些實施方案中，多特異性抗體是雙特異性抗體。可以通過將一對抗體分子之間的介面工程化以最大化從重組細胞培養物中回收的異二聚體的百分比來製備雙特異性抗體。例如，介面可以含有抗體恒定結構域的CH3結構域的至少一部分。在此方法中，將來自第一抗體分子介面的一個或多個小的氨基酸側鏈替代為較大的側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)。通過用較小的氨基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替代大的氨基酸側鏈，在第二抗體分子的介面上產生了與一個或多個大的側鏈相同或相似大小的補償“腔”。這提供了增加異二聚體的產量而不是其他不需要的終產物諸如同二聚體的一種機制。例如在WO 96/27011中描述了此方法，將其全文以引用方式併入。

在一些實施方案中，抗體或抗原結合片段可以增強APC(例如DC細胞)功能，例如誘導共刺激分子和MHC分子的表面表達、誘導促炎性細胞因子的產生、和/或增強T細胞觸發功能。

在一些實施方案中，Fc區是人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。在一些實施方案中，抗體是人IgG1抗體。

在一些實施方案中，抗體或抗原結合片段不具有功能性Fc區。例如，所述抗體或抗原結合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。在一些實施方案中，Fc區具有LALA突變(EU編號中的L234A和L235A突變)或LALA-PG突變(EU編號中的L234A、L235A、P329G突變)。

在一些實施方案中，抗原結合片段可以形成嵌合抗原受體(CAR)的一部分。在一些實施方案中，嵌合抗原受體是與CD3-ζ胞內結構域融合的、如本文所述的單鏈可變片段(scFv)的融合物。在一些實施方案中，scFv具有一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域。在一些實施方案中，scFv具有兩個重鏈可變結構域和兩個輕鏈可變結構域。在一些實施方案中，嵌合抗原受體還包含來自多種共刺激蛋白受體(例如，CD28、41BB、ICOS)的細胞內信號傳導結構域。在一些實施方案中，嵌合抗原受體包含多個信號傳導結構域(例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40)以增加效力。因此，在一個方面，本公開還提供了表達如本文所述的嵌合抗原受體的細胞(例如T細胞)。CAR 、抗體、抗原結合片段特徵

在一些實施方案中，如本文所述的CAR、抗體或其抗原結合片段可以將免疫應答、免疫細胞(例如，T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、巨噬細胞、抗原呈遞細胞)的活性或數量增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。

在一些實施方案中，抗體(其抗原結合片段、或從其衍生的分子(例如CAR))以小於0.1 s^-1 、小於0.01 s^-1 、小於0.001 s^-1 、小於0.0001 s^-1 或小於0.00001 s^-1 的解離速率(koff)特異性地結合ALPP。在一些實施方案中，解離速率(koff)為大於0.01 s^-1 、大於0.001 s^-1 、大於0.0001 s^-1 、大於0.00001 s^-1 或大於0.000001 s^-1 。

在一些實施方案中，動力學締合速率(kon)為大於1 x 10² /Ms、大於1 x 10³ /Ms、大於1 x 10⁴ /Ms、大於1 x 10⁵ /Ms或大於1 x 10⁶ /Ms。在一些實施方案中，動力學締合速率(kon)為小於1 x 10⁵ /Ms、小於1 x 10⁶ /Ms或小於1 x 10⁷ /Ms。

可以從動力學速率常數的商(KD = koff/kon)推導親和力。在一些實施方案中，KD(Kd)為小於1 x 10^-6 M、小於1 x 10^-7 M、小於1 x 10^-8 M、小於1 x 10^-9 M或小於1 x 10^-10 M。在一些實施方案中，KD為小於50 nM、30 nM、20 nM、15 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.9 nM、0.8 nM、0.7 nM、0.6 nM、0.5 nM、0.4 nM、0.3 nM、0.2 nM或0.1 nM。在一些實施方案中，KD為大於1 x 10^-7 M、大於1 x 10^-8 M、大於1 x 10^-9 M、大於1 x 10^-10 M、大於1 x 10^-11 M或大於1 x 10^-12 M。

測量抗體對抗原的親和力的通用技術包括例如ELISA、RIA和表面等離子體共振(SPR)。在一些實施方案中，抗體結合人ALPP。

在一些實施方案中，本公開的抗體以0.5 μg/ml或更低的EC₅₀ 結合ALPP蛋白，以0.4 μg/ml或更低的EC₅₀ 結合ALPP蛋白，以0.3 μg/ml或更低的EC₅₀ 結合ALPP蛋白，以0.2 μg/ml或更低的EC₅₀ 結合ALPP蛋白，以0.1 μg/ml或更低的EC₅₀ 結合ALPP蛋白，以0.02 μg/ml或更低的EC₅₀ 結合ALPP蛋白，以0.01 μg/ml或更低的EC₅₀ 結合ALPP蛋白，以0.005 μg/ml或更低的EC₅₀ 結合ALPP蛋白，以0.004 μg/ml或更低的EC₅₀ 結合ALPP蛋白，以0.003 μg/ml或更低的EC₅₀ 結合ALPP蛋白，以0.0.002 μg/ml或更低的EC₅₀ 結合ALPP蛋白，以0.001 μg/ml或更低的EC₅₀ 結合ALPP蛋白。可以通過本文所述的方法(例如ELISA或細胞流式細胞術)來確定EC₅₀ 。工程化細胞

本公開提供了表達CAR和/或如本文所述的各種蛋白質的工程化細胞(例如，免疫細胞、T細胞、NK細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞)。這些工程化細胞可以用於治療如本文所述的各種障礙或疾病(例如，ALPP相關的癌症)。

在各種實施方案中，被工程化的細胞可以從例如人和非人動物中獲得。在各種實施方案中，被工程化的細胞可以從細菌、真菌、人、大鼠、小鼠、兔、猴、豬或任何其他物種獲得。優選地，所述細胞來自人、大鼠或小鼠。在一些實施方案中，所述細胞是小鼠淋巴細胞，並且被工程化(例如轉導)以表達CAR或其抗原結合片段。在一些實施方案中，所述細胞從人獲得。在各種實施方案中，被工程化的細胞是血細胞。優選地，所述細胞是白細胞(例如T細胞)、淋巴細胞或任何其他合適的血細胞類型。在一些實施方案中，所述細胞是外周血細胞。在一些實施方案中，所述細胞是腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。在一些實施方案中，所述細胞是T細胞、B細胞或NK細胞。在一些實施方案中，所述細胞是人外周血單核細胞(PBMC)。在一些實施方案中，人PBMC是CD3+細胞。在一些實施方案中，人PBMC是CD8+細胞。

在一些實施方案中，所述細胞是T細胞。在一些實施方案中，T細胞可以表達識別靶細胞表面上的特異性抗原部分的細胞表面受體。細胞表面受體可以是野生型或重組T細胞受體(TCR)、嵌合抗原受體(CAR)或能夠識別與靶細胞相關的抗原部分的任何其他表面受體。T細胞可以通過本領域已知的各種方法獲得，例如，通過從患者中分離的T細胞(例如，腫瘤浸潤性淋巴細胞)的體外培養獲得。可以通過用病毒載體轉導T細胞(例如，從患者外周血中分離的)來獲得遺傳修飾的T細胞。在一些實施方案中，T細胞是CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或調節性T細胞。在一些實施方案中，T細胞是1型T輔助細胞和2型T輔助細胞。在一些實施方案中，表達此受體的T細胞是αβ-T細胞。在替代性實施方案中，表達此受體的T細胞是γδ-T細胞。在一些實施方案中，T細胞是中樞記憶T細胞。在一些實施方案中，T細胞是效應記憶T細胞。在一些實施方案中，T細胞是幼稚T細胞。

在一些實施方案中，所述細胞是NK細胞。在一些實施方案中，工程化細胞的製備包括一個或多個培養和/或製備步驟。可以從樣品(諸如生物樣品，例如從受試者獲得或來源的生物樣品)中分離用於引入結合分子(例如CAR)的細胞。在一些實施方案中，從其分離細胞的受試者是患有疾病或病症或需要細胞療法、或將向其施用細胞療法的受試者。在一些實施方案中，受試者是需要特定治療干預(諸如針對其分離、處理細胞和/或對細胞進行工程化的過繼細胞療法)的人。

在一些實施方案中，所述細胞是幹細胞，諸如多潛能和多能幹細胞，包括誘導的多能幹細胞(iPSC)。所述細胞可以是原代細胞，諸如直接從受試者中分離和/或從受試者中分離並冷凍的那些細胞。在一些實施方案中，將幹細胞與另外的分化因子一起培養以獲得所需的細胞類型(例如T細胞)。

可以從適當的分離方法中獲得不同的細胞類型。所述分離方法包括基於一種或多種特定分子(諸如表面標記，例如表面蛋白、細胞內標記、或核酸)在細胞中的表達或存在來分離不同的細胞類型。在一些實施方案中，可以使用基於此類標記的任何已知的分離方法。在一些實施方案中，所述分離是基於親和力或免疫親和力的分離。例如，在一些方面，所述分離包括例如基於一種或多種標記(通常是細胞表面標記)的細胞表達或表達位準，通過與特異性地結合此類標記的抗體或結合伴侶一起孵育，隨後通常是洗滌步驟和將已經結合抗體或結合伴侶的細胞從未結合抗體或結合伴侶的細胞分開而分離細胞和細胞群。

此類分離步驟可以是基於陽性選擇，其中已經結合試劑的細胞被保留以供進一步使用，和/或基於陰性選擇，其中未結合抗體或結合伴侶的細胞被保留。在一些實例中，兩個級分均被保留供進一步使用。在一些方面，在沒有可用的抗體特異性地鑒定異源群體中的細胞類型，使得最好基於由除所需群體以外的細胞表達的標記來進行分離的情況下，陰性選擇可能特別有用。

還提供了用於表達結合分子並用於生產表達此類結合分子的基因工程化細胞的方法、核酸、組合物和試劑盒。基因工程化通常涉及諸如通過逆轉錄病毒轉導、轉染或轉化將編碼治療分子(例如CAR，例如TCR樣CAR、多肽、融合蛋白)的核酸引入細胞中。在一些實施方案中，通過以下方式來實現基因轉移：首先刺激細胞，諸如通過將其與誘導反應(諸如增殖、存活和/或活化，例如通過細胞因子或活化標記的表達所測量的)的刺激物組合，隨後轉導活化的細胞並在培養物中擴增至足以用於臨床應用的數量。

在一些實施方案中，使用重組感染性病毒顆粒(諸如，例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相關病毒(AAV)的載體)，將重組核酸轉移到細胞中。在一些實施方案中，使用重組慢病毒載體或逆轉錄病毒載體(諸如γ-逆轉錄病毒載體)，將重組核酸轉移到T細胞中。在一些實施方案中，逆轉錄病毒載體具有長末端重複序列(LTR)，例如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎幹細胞病毒(MESV)、鼠幹細胞病毒(MSCV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的逆轉錄病毒載體。大多數逆轉錄病毒載體衍生自鼠逆轉錄病毒。在一些實施方案中，所述逆轉錄病毒包括衍生自任何禽類或哺乳動物細胞來源的那些。所述逆轉錄病毒通常是雙嗜性的，這意味著它們能夠感染包括人在內的若干個物種的宿主細胞。在一些實施方案中，載體是慢病毒載體。在一些實施方案中，重組核酸通過電穿孔轉移到T細胞中。在一些實施方案中，重組核酸通過轉座轉移到T細胞中。在免疫細胞中引入和表達遺傳物質的其他方法包括磷酸鈣轉染、原生質體融合、陽離子脂質體介導的轉染；鎢粒子促進的微粒轟擊和磷酸鍶DNA共沉澱。例如在WO2019195486中描述了這些方法中的許多，將所述專利全文以引用方式併入本文。

還提供了工程化細胞群、含有此類細胞和/或富集此類細胞(諸如其中表達結合分子的細胞組成至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高百分比的在組合物中的總細胞或某種類型的細胞(諸如T細胞、CD8+或CD4+細胞))的組合物。

在一些實施方案中，將工程化細胞(例如CAR-T細胞)與靶細胞(例如抗原呈遞細胞)一起共培養至少或約1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時、18小時、1天、2天、3天或更長時間，使得可以活化工程化細胞(例如CAR-T細胞)。在一些實施方案中，靶細胞是Jurkat細胞。

在一些實施方案中，工程化細胞可以表達IL-12和經修飾的IL-12。例如，例如當融合蛋白是膜拴系蛋白時，包含本文所述的經修飾的IL-12的融合蛋白可以在工程化細胞的細胞表面上表達。在一些情形下，例如當融合蛋白是可溶蛋白時，可以表達和分泌包含本文所述的經修飾的IL-12的融合蛋白。IL-12在工程化細胞中的表達提供了一些另外的益處。例如，它可以增加從NK和T細胞的IFN-γ(其是IL-12作用的最強介體)產生，刺激活化的NK細胞、CD8+和CD4+ T細胞的生長和細胞毒性，將CD4+ Th0細胞的分化朝向Th1表型改變，增加針對腫瘤細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，並誘導IgG和將從B細胞的IgE產生抑制例如至少或約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或20倍。

在一些實施方案中，如與沒有共培養的工程化細胞的細胞因子分泌位準相比，與靶細胞一起共培養可以使工程化細胞的細胞因子(例如IFNγ)分泌增加至少或約1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10000倍或更多。

在一些實施方案中，細胞是人PBMC，並且被工程化(例如轉導)以表達CAR或其抗原結合片段。

在一些實施方案中，當將工程化細胞與靶細胞(例如表達ALPP的細胞)一起共培養時，工程化細胞可以使細胞因子(例如IFNγ)的表達或分泌增加至少或約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。在一些實施方案中，當將工程化細胞與靶細胞(例如表達ALPP的細胞)一起共培養時，使活化的T細胞群增加了至少或約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。在一些實施方案中，可以通過CD69表達位準來測量T細胞活化狀態。重組載體

本公開還提供了包括本文公開的分離的多核苷酸(例如編碼本文公開的多肽的多核苷酸)的重組載體(例如表達載體)、向其中引入重組載體(即，使得宿主細胞含有多核苷酸和/或包含多核苷酸的載體)的宿主細胞、以及通過重組技術生產重組多肽或其片段。

載體是當將載體引入宿主細胞時能夠將一種或多種目的多核苷酸遞送至宿主細胞的構建體。“表達載體”能夠在已經引入表達載體的宿主細胞中遞送一種或多種目的多核苷酸和將其表達為編碼的多肽。因此，通過在目的多核苷酸的整合位點處或附近或側翼與載體內或宿主細胞基因組中的調控元件諸如啟動子、增強子和/或聚A尾巴可操作地連接使得目的多核苷酸將在與表達載體一起引入的宿主細胞中翻譯，將目的多核苷酸定位在載體中用於表達。

可以通過本領域已知的方法將載體引入宿主細胞中，例如電穿孔、化學轉染(例如DEAE-葡聚糖)、轉化、轉染、以及感染和/或轉導(例如用重組病毒)。因此，載體的非限制性實例包括病毒載體(其可以用於產生重組病毒)、裸DNA或RNA、質粒、黏粒、噬菌體載體、以及與陽離子縮合劑相關的DNA或RNA表達載體。

本公開提供了包含適合於對細胞進行遺傳修飾的核酸構建體的重組載體，其可以用於治療病理性疾病或病症。

任何載體或載體類型均可以用於將遺傳物質遞送至細胞。這些載體包括但不限於質粒載體、病毒載體、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)和人類人工染色體(HAC)。病毒載體可以包括但不限於重組逆轉錄病毒載體、重組慢病毒載體、重組腺病毒載體、泡沫病毒載體、重組腺相關病毒(AAV)載體、雜交載體、和質粒轉座子(例如，睡美人(sleeping beauty)轉座子系統和PiggyBac轉座子系統)或基於整合酶的載體系統。也可以結合本文所述的方法使用本領域已知的其他載體。

在一些實施方案中，載體是病毒載體。可以將病毒載體在對病毒載體製造具有特異性的培養基中生長。根據本文所述的實施方案，可以使用任何合適的生長培養基和/或用於使病毒載體生長的補充劑。在一些實施方案中，使用MP71載體。

在一些實施方案中，所使用的載體是重組逆轉錄病毒載體。逆轉錄病毒載體能夠指導目的核酸分子的表達。逆轉錄病毒以RNA形式存在於其病毒膜中，並且當在宿主細胞中複製時形成雙鏈DNA中間體。類似地，逆轉錄病毒載體以RNA和雙鏈DNA兩種形式存在。逆轉錄病毒載體還包括含有重組DNA片段的DNA形式和含有重組RNA片段的RNA形式。載體可以包括至少一種轉錄啟動子/增強子、或控制基因表達的其他元件。此類載體還可以包括包裝信號、長末端重複序列(LTR)或其部分、以及適合於所使用的逆轉錄病毒的正鏈和負鏈引物結合位點。長末端重複序列(LTR)是在逆轉錄轉座子或通過逆轉錄病毒RNA的逆轉錄形成的前病毒DNA的末端發現的重複許多次(例如數百或數千次)的相同的DNA序列。病毒使用它們將其遺傳物質插入宿主基因組中。任選地，載體還可以包括指導聚腺苷酸化的信號、可選擇標記(諸如氨苄青黴素抗性、新黴素抗性、TK、潮黴素抗性、腐草黴素抗性、組氨醇抗性、或DHFR)、以及一個或多個限制位點和翻譯終止序列。例如，此類載體可以包括5' LTR、前導序列、tRNA結合位點、包裝信號、第二鏈DNA合成的起點、和3' LTR或其一部分。另外，本文所用的逆轉錄病毒載體還可以是指通過去除逆轉錄病毒gag、pol和env基因並用目的基因替代而產生的重組載體。

在一些實施方案中，載體或構建體可以含有驅動一個或多個核酸分子的表達的單個啟動子。在一些實施方案中，此類啟動子可以是多順反子(雙順反子或三順反子)。例如，在一些實施方案中，轉錄單元可以是工程化為含有IRES(內部核糖體進入位點)的雙順反子單元，其允許通過來自單一啟動子的消息共表達基因產物(例如編碼CAR和抗體或其抗原結合片段)。可替代地，在一些情況下，單一啟動子可引導RNA的表達，所述RNA在單一開放閱讀框(ORF)中含有兩個或三個基因(例如，編碼CAR和/或抗體或其抗原結合片段)，所述兩個或三個基因通過編碼自切割肽(例如P2A或T2A)的序列或蛋白酶識別位點(例如弗林蛋白酶(furin))彼此分開。因此，ORF編碼單個多蛋白，所述多蛋白在翻譯期間(在2A(例如T2A)的情況下)或之後被切割成單個蛋白質。在一些情況下，肽(諸如T2A)可以引起核糖體跳過2A元件C末端處肽鍵的合成(核糖體跳躍)，從而導致在2A序列末端與下游相鄰肽之間分開。

可以結合如本文所述的載體使用各種細胞系。可以用於表達多肽的示例性真核細胞包括但不限於COS細胞，包括COS 7細胞；293細胞，包括293-6E細胞；CHO細胞，包括CHO-S、DG44。Lec13 CHO細胞和FUT8 CHO細胞；PER.C6®細胞；和NSO細胞。在一些實施方案中，特定的真核宿主細胞基於其對結合分子進行所需的翻譯後修飾的能力來選擇。例如，在一些實施方案中，CHO細胞產生的多肽的唾液酸化位準高於在293細胞中產生的相同多肽。在一個方面，本公開涉及包含如本文所述的載體或載體對的細胞。在一些實施方案中，所述細胞是T細胞。

在一些實施方案中，本文提供了編碼CAR或其片段的載體。在一些實施方案中，載體包含與SEQ ID NO: 17、19、21、23、25、27、29、33或35為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核酸序列。在一些實施方案中，載體編碼與SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28、30、34、36、91、92或93為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，載體的序列是密碼子優化的。

在一個方面，本公開提供了載體，其包含編碼免疫檢查點(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIRI、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCNl)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I類、MHC II類、GAL9、腺苷或TGFR(例如TGFRβ)抑制劑的核酸。在一些實施方案中，免疫檢查點抑制劑是抗PD-1或抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，載體包含編碼特異性地結合PD-1(例如人PD-1)或PD-L1(例如人PD-L1)的scFv的核酸。在一些實施方案中，scFv包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，並且所述VH和VL通過柔性接頭連接。在一些實施方案中，VH和VL以VH-柔性接頭-VL的順序連接。在一些實施方案中，VH和VL以VL-柔性接頭-VH的順序連接。在一些實施方案中，抗PD-1抗體或抗原結合片段(例如scFv)的VH的氨基酸序列在SEQ ID NO: 15中列出。在一些實施方案中，抗PD-1抗體或抗原結合片段(例如scFv)的VL的氨基酸序列在SEQ ID NO: 16中列出。在一些實施方案中，抗PD-L1抗體或抗原結合片段(例如scFv)的VH的氨基酸序列在SEQ ID NO: 31中列出。在一些實施方案中，抗PD-1抗體或抗原結合片段(例如scFv)的VL的氨基酸序列在SEQ ID NO: 32中列出。在一些實施方案中，柔性接頭包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 87)的氨基酸序列。在一些實施方案中，柔性接頭包含GGGGS(SEQ ID NO: 88)的至少1、2、3、4、5或6個重複。在一些實施方案中，載體還包含編碼前導肽的核酸。在一些實施方案中，前導肽是人IL-2前導肽(SEQ ID NO: 42)。在一些實施方案中，載體包含與SEQ ID NO: 33為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%相同的核酸序列。在一些實施方案中，載體包含編碼與SEQ ID NO: 34為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%相同的氨基酸序列的核酸序列。在一些實施方案中，載體包含與SEQ ID NO: 35為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%相同的核酸序列。在一些實施方案中，載體包含編碼與SEQ ID NO: 36為至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%或100%相同的氨基酸序列的核酸序列。

在一些實施方案中，載體編碼包含CAR(例如，A02、A03、A04、A05、A06、A07或A08 CAR)和免疫檢查點抑制劑(例如抗PD-1或抗-PD-L1 scFv)的融合多肽。在一些實施方案中，載體還包含編碼T2A(SEQ ID NO: 41)的核酸。在一些實施方案中，CAR和免疫檢查點抑制劑通過包含T2A的氨基酸序列連接。

本公開還提供了核酸序列，所述核酸序列包含編碼任何CAR、其抗原結合片段、和/或CAR衍生的結合分子(包括例如本文所述的其功能部分和功能變體、多肽或蛋白質)的核苷酸序列。如本文所用，“核酸”可以包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，並且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可以是單鏈或雙鏈的、合成的或獲得自天然來源，其可以含有天然、非天然或改變的核苷酸。此外，核酸包含互補DNA(cDNA)。通常優選的是，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或取代。然而，如本文所討論的，在一些情形下，核酸包含一個或多個插入、缺失、倒位和/或取代可能是合適的。

可以使用本領域已知的程序基於化學合成和/或酶促連接反應來構建如本文所述的核酸。例如，可以使用天然存在的核苷酸或各種經修飾的核苷酸來化學地合成核酸。在一些任何此類實施方案中，核苷酸序列是密碼子優化的。

本公開還提供了核酸，所述核酸包含與本文所述的任何核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列或者在嚴格條件下與本文所述的任何核酸的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。

在一些實施方案中，編碼α鏈的核苷酸序列和編碼β鏈的核苷酸序列被引起核糖體跳躍的肽序列分開。在一些實施方案中，引起核糖體跳躍的肽是P2A或T2A肽。在一些實施方案中，核酸是合成的。在一些實施方案中，核酸是cDNA。

在一些實施方案中，載體可以另外包括編碼檢查點抑制劑(CPI)(例如抑制蛋白)的核酸序列。在一些實施方案中，檢查點抑制劑是例如本文所述的任何抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段可以特異性地結合PD-1、PD-L1、PD-L2、2B4(CD244)、4-1BB、A2aR、B7.1、B7.2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BTLA、嗜乳脂蛋白、CD160、CD48、CTLA4、GITR、gp49B、HHLA2、HVEM、ICOS、ILT-2、ILT-4、KIR家族受體、LAG-3、OX-40、PIR-B、SIRPα(CD47)、TFM-4、TIGIT、TIM-1、TIM-3、TIM-4、或VISTA。在一些實施方案中，抑制蛋白是scFv(例如抗PD-1 scFv)。在一些實施方案中，載體可以另外包括編碼雙功能陷阱融合蛋白的核酸序列。在一些實施方案中，雙功能陷阱蛋白靶向PD-1和TGF-β二者。在一些實施方案中，雙功能陷阱蛋白靶向PD-L1和TGF-β二者。在一些實施方案中，雙功能融合蛋白設計成阻斷PD-L1和螯合(sequester)TGF-β。基於人IgG1單株抗體(mAb)阿維魯單抗(avelumab)，M7824(MSB0011395C)包含與人抗PD-L1 scFv的C末端連接的人TGF-β受體II(TGFβRII)的細胞外結構域。在一些實施方案中，雙功能融合蛋白包含與人抗PD-1 scFv的C末端連接的人TGF-β受體II(TGFβRII)的細胞外結構域。

在一些任何此類實施方案中，CAR或其抗原結合片段由已經進行密碼子優化的核苷酸序列編碼。在某些實施方案中，所述多肽包含信號肽。在一些實施方案中，多肽和/或融合蛋白是重組的。

本公開還提供了與本文所述的任何核苷酸序列為至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的核酸序列、以及與本文所述的任何氨基酸序列為至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，本公開涉及編碼本文所述的任何肽的核苷酸序列、或由本文所述的任何核苷酸序列編碼的任何氨基酸序列。

在一些實施方案中，核酸序列為至少或約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500、或600個核苷酸。在一些實施方案中，氨基酸序列為至少或約5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、或900個氨基酸殘基。在一些實施方案中，核酸序列為小於10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500、或600個核苷酸。在一些實施方案中，氨基酸序列為小於5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、或900個氨基酸殘基。

為了確定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分比，出於最佳比較目的，對序列進行比對(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或兩者中引入缺口以進行最佳比對，並且出於比較目的可以忽略非同源序列)。然後比較在相應的氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置被與第二序列中的相應位置相同的氨基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在所述位置是相同的。考慮了缺口數量和每個缺口的長度(需要將其引入以實現兩個序列的最佳比對)，兩個序列之間的同一性百分比是由序列所共用的相同位置的數量的函數。用於製備工程化細胞的方法

本公開提供了用於製備、製造工程化細胞和/或使用工程化細胞來治療病理性疾病或病症的方法或過程。

可以從樣品(諸如生物樣品，例如從受試者獲得或來源的生物樣品)中分離用於引入本文所述的蛋白質(例如CAR)的細胞。在一些實施方案中，從其分離細胞的受試者是患有疾病或病症或需要細胞療法、或將向其施用細胞療法的受試者。在一些實施方案中，受試者是需要特定治療干預(諸如針對其分離、處理細胞和/或對細胞進行工程化的過繼細胞療法)的人。

因此，在一些實施方案中，所述細胞是原代細胞，例如原代人細胞。樣品包括直接取自受試者的組織、流體和其他樣品，以及來自一個或多個處理步驟(諸如分離、離心、基因工程化(例如用病毒載體轉導)、洗滌和/或孵育)的樣品。生物樣品可以是直接從生物來源獲得的樣品或經過處理的樣品。生物樣品包括但不限於體液(諸如血液、血漿、血清、腦脊液、滑液、尿液和汗液)、組織和器官樣品，包括由其衍生的經處理樣品。

在一些方面，細胞從其中衍生或分離的樣品是血液或血液衍生的樣品，或者是或源自單采術或白細胞分離術產物。示例性樣品包括全血、外周血單核細胞(PBMC)、白細胞、骨髓、胸腺、組織活檢、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾、其他淋巴組織、肝、肺、胃、腸、結腸、腎、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宮頸、睾丸、卵巢、扁桃體或其他器官和/或由其衍生的細胞。在細胞療法(例如過繼細胞療法)的背景下，樣品包括來自自體和同種異體來源的樣品。

在一些實施方案中，所述細胞衍生自細胞系，例如T細胞系。在一些實施方案中，所述細胞獲得自異種來源，例如獲得自小鼠、大鼠、或非人靈長類動物。在一些實施方案中，所述細胞從小鼠淋巴結中分離。

在一些實施方案中，洗滌從受試者收集的血細胞，例如以去除血漿級分並將細胞置於適當的緩衝液或介質中以用於隨後的加工步驟。在一些實施方案中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌所述細胞。在一些實施方案中，洗滌溶液缺乏鈣和/或鎂和/或許多或所有二價陽離子。在一些方面，通過半自動化“流通式”離心完成洗滌步驟。在一些方面，通過切向流過濾(TFF)完成洗滌步驟。在一些實施方案中，洗滌後將細胞重懸於多種生物相容性緩衝液(諸如，例如不含Ca²⁺ /Mg²⁺ 的PBS)中。在某些實施方案中，去除血細胞樣品的組分並將所述細胞直接重懸於培養基中。在一些實施方案中，所述方法包括基於密度的細胞分離方法，如通過裂解紅細胞並通過Percoll或Ficoll梯度進行離心來從外周血製備白細胞。

在一些實施方案中，所述方法包括以下中的一個或多個步驟：例如，從患者血液中分離T細胞；用病毒載體轉導群體T細胞，所述病毒載體包括編碼基因工程化抗原受體的核酸構建體；體外擴增經轉導的細胞；和/或將擴增的細胞輸注到患者體內，在那裡工程化T細胞將尋找並破壞抗原陽性的腫瘤細胞。在一些實施方案中，核酸構建體還包括編碼抑制蛋白的序列。在一些實施方案中，這些工程化T細胞可以阻斷PD-1/PD-L1免疫抑制並增強抗腫瘤免疫應答。所述方法還包括：用含有核酸構建體的病毒載體轉染T細胞。

在一些實施方案中，所述方法涉及將本文所述的任何載體體外或離體引入細胞中。在一些實施方案中，載體是病毒載體，並且所述引入通過轉導來進行。在一些實施方案中，將細胞轉導持續至少或約1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時、18小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或更長時間。在一些實施方案中，所述方法還涉及將一種或多種藥劑引入細胞中，其中所述一種或多種藥劑中的每一種獨立地能夠誘導T細胞受體α鏈恒定區(TRAC)基因和/或T細胞受體β鏈恒定區(TRBC)基因的遺傳破壞。在一些實施方案中，所述一種或多種藥劑是抑制核酸(例如siRNA)。在一些實施方案中，所述一種或多種藥劑是包含DNA靶向蛋白和核酸酶或RNA指導的核酸酶的融合蛋白(例如，成簇的規律間隔短回文核酸(CRISPR)相關的核酸酶)。

熟練技術人員通過使用任何標準方法諸如磷酸鈣、電穿孔、脂質體介導的轉移、顯微注射、生物彈顆粒遞送系統、或任何其他已知方法可以實現T細胞的轉染。在一些實施方案中，使用磷酸鈣方法進行T細胞的轉染。

本公開提供了創建個性化抗腫瘤免疫療法的方法。基因工程化T細胞可以從患者的血細胞產生。然後，將這些工程化T細胞作為細胞療法產品重新輸注到患者體內。治療方法

本文公開的方法可以用於各種治療目的。在一個方面，本公開提供了用於治療受試者的癌症的方法，降低受試者中腫瘤體積隨時間增加的速率的方法，降低發生轉移的風險的方法、或降低受試者中發生額外轉移的風險的方法。在一些實施方案中，治療可以停止、減慢、延緩或抑制癌症的進展。在一些實施方案中，治療可以導致受試者中癌症的一種或多種症狀的數量、嚴重性和/或持續時間的減少。

在一個方面，本公開的特徵在於方法，其包括將治療有效量的表達CAR、其抗原結合片段的工程化細胞施用至有需要的受試者(例如，患有或鑒定為或診斷為患有癌症的受試者)。

在一些實施方案中，受試者患有ALPP陽性癌症。在一些實施方案中，受試者患有卵巢癌、宮頸癌或睾丸癌。在一些實施方案中，受試者患有睾丸精原細胞瘤、原發性顱內胚組織瘤、上皮性卵巢癌、卵巢腺癌、漿液性囊腺癌、未分化癌、無性細胞瘤、卵巢癌、子宮癌、子宮內膜癌、宮頸癌、尿路上皮癌、胃癌(stomach cancer)、肺癌、胰腺癌、睾丸癌、骨肉瘤和胃癌(gastric cancer)中觀察到ALPP表達。

在一些實施方案中，與不表達IL-12的類似工程化細胞相比，由本文所述的工程化細胞表達的IL-12(例如經修飾的IL-12)可以將治療異源性癌症改善(例如殺傷癌細胞或減少腫瘤體積)至少或約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。

在一些實施方案中，本文公開的組合物和方法可以用於治療處於患癌症風險的患者。癌症患者可以通過本領域已知的各種方法來鑒定。

如本文所用，“有效量”意指足以實現有益或期望結果(包括停止、減慢、延緩或抑制疾病(例如癌症)的進展)的量或劑量。有效量將根據例如將要向其施用治療劑和/或治療組合物的受試者的年齡和體重、症狀的嚴重性和施用途徑而變化，並且因此可以在個體基礎上確定施用。

如本文所用，術語“延遲疾病的發展”是指推遲、阻礙、減慢、延緩、穩定、抑制和/或延期疾病(例如癌症)的發展。該延遲可以具有不同的時間長度，這取決於病史和/或所治療的個體。對於本領域技術人員顯而易見的是，足夠或顯著的延遲實際上可以涵蓋預防，因為個體不會患上疾病。例如，可能延遲晚期癌症，諸如轉移的發展。

有效量可以在一次或多次給藥中進行施用。舉例來說，組合物的有效量是足以改善、停止、穩定、逆轉、抑制、減慢和/或延遲患者癌症進展的量，或者是足以在體外改善、停止、穩定、逆轉、減慢和/或延遲細胞(例如，活檢的細胞、本文所述的任何癌細胞、或細胞系(例如癌細胞系))的增殖的量。如本領域中所理解的，有效量可以根據尤其是患者病史以及其他因素諸如所使用的組合物的類型(和/或劑量)而變化。

可以根據經驗確定施用的有效量和時間表，並且進行這種確定在本領域技術範圍內。本領域技術人員將理解，必須施用的劑量將根據例如將接受治療的哺乳動物、施用途徑、向哺乳動物施用的治療劑和其他藥物的特定類型而變化。選擇適當劑量的指南可以在文獻中找到。此外，治療不一定導致對疾病或病症的100%或完全治療或預防。有多種具有不同程度治療效果的治療/預防方法可用，本領域普通技術人員將其視為潛在有利的治療手段。

在一些方面，本公開還提供了診斷哺乳動物中的疾病/病症的方法，其中所述CAR、抗體或抗原結合片段與從受試者獲得的一個或多個樣品發生相互作用以形成複合物，其中所述樣品可以包含一種或多種細胞、多肽、蛋白質、核酸、抗體、或抗原結合部分；血液、全細胞、其裂解物、或全細胞裂解物的級分，例如細胞核或細胞質級分、全蛋白級分、或其核酸級分，其中對複合物的檢測指示哺乳動物中病症的存在，其中所述病症是癌症或感染。此外，對複合物的檢測可以通過任何數量的本領域已知的方式，但不限於ELISA、流式細胞術、螢光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈反應(PCR)、微陣列、Southern印跡、電泳、噬菌體分析、色譜等。因此，治療方法可以還包括例如通過確定受試者是否患有感染或癌症來確定受試者是否可以從本文公開的治療中受益。

在本文所述的任何方法中，工程化細胞和、和/或至少一種另外的治療劑可以每週至少一次(例如，每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次、每天一次、每天兩次或每天三次)施用至受試者。在一些實施方案中，將至少兩種不同的工程化細胞(例如表達不同結合分子的細胞)以同一組合物(例如液體組合物)施用。在一些實施方案中，將工程化細胞和至少一種另外的治療劑以同一組合物(例如液體組合物)施用。在一些實施方案中，將工程化細胞和至少一種另外的治療劑以兩種不同的組合物施用。在一些實施方案中，將所述至少一種另外的治療劑以丸劑、片劑或膠囊劑施用。在一些實施方案中，將所述至少一種另外的治療劑以持續釋放的口服配製品施用。

在一些實施方案中，可以在將工程化細胞施用至受試者之前、同時或之後，將一種或多種另外的治療劑施用至受試者。

在一些實施方案中，可以將一種或多種另外的治療劑施用至受試者。所述另外的治療劑可以是檢查點抑制劑(CPI)。在一些實施方案中，檢查點抑制劑是抑制蛋白，例如抗體或其抗原結合片段。檢查點抑制劑可以抑制或阻斷一個或多個免疫檢查點，包括例如PD-1、PD-L1、PD-L2、2B4(CD244)、4-1BB、A2aR、B7.1、B7.2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BTLA、嗜乳脂蛋白、CD160、CD48、CTLA4、GITR、gp49B、HHLA2、HVEM、ICOS、ILT-2、ILT-4、KIR家族受體、LAG-3、OX-40、PIR-B、SIRPα(CD47)、TFM-4、TIGIT、TIM-1、TIM-3、TIM-4、VISTA及其組合。在一些實施方案中，抑制蛋白阻斷PD-1或PD-L1。在各種實施方案中，抑制蛋白包含抗PD-1 scFv或抗PD-L1 scFv。抑制蛋白能夠導致群體的T細胞中PD-1或PD-L1的表達降低和/或抑制PD-1或PD-L1的上調、和/或在物理上阻礙PD-1/PD-L1複合物的形成和隨後的信號轉導。在一些實施方案中，抑制蛋白阻斷PD-1。在一些實施方案中，另外的治療劑是抗OX40抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗LAG-3抗體、抗TIGIT抗體、抗BTLA抗體、抗CTLA-4抗體、或抗GITR抗體。在一些實施方案中，另外的治療劑是抗CTLA4抗體(例如易普利姆瑪)、抗CD20抗體(例如利妥昔單抗)、抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗)、抗CD319抗體(例如埃羅妥珠單抗(elotuzumab))或抗PD1抗體(例如納武單抗)。

在一些實施方案中，另外的治療劑是雙功能陷阱融合蛋白。雙功能陷阱蛋白可以靶向免疫檢查點和TGF-β負調控途徑二者。除了表達免疫檢查點外，腫瘤微環境還含有其他免疫抑制分子。特別令人感興趣的是在癌症中具有多種功能的細胞因子TGF-β(TGFB)。TGF-β在腫瘤發展的早期阻止腫瘤細胞的增殖並促進分化和凋亡。然而，在腫瘤進展期間，由於TGF-β受體表達的喪失或下游信號傳導元件的突變而引起腫瘤TGF-β不敏感性。然後，TGF-β通過其對血管生成、上皮-間充質轉化(EMT)的誘導和免疫抑制的作用來促進腫瘤進展。高的TGF-β血清位準和在腫瘤上TGF-β受體(TGFβR)表達的喪失與不良預後相關。TGFβ靶向療法已展示出有限的臨床活性。在一些實施方案中，雙功能陷阱蛋白靶向PD-1和TGF-β二者。在一些實施方案中，雙功能陷阱蛋白靶向PD-L1和TGF-β二者。在一些實施方案中，雙功能融合蛋白設計成阻斷PD-L1和螯合(sequester)TGF-β。基於人IgG1單株抗體(mAb)阿維魯單抗(avelumab)，M7824(MSB0011395C)包含與人抗PD-L1 scFv的C末端連接的人TGF-β受體II(TGFβRII)的細胞外結構域。在一些實施方案中，雙功能融合蛋白包含與人抗PD-1 scFv的C末端連接的人TGF-β受體II(TGFβRII)的細胞外結構域。這些雙功能陷進融合蛋白例如在以下文獻中進行了描述：Knudson等人, "M7824, a novel bifunctional anti-PD-L1/TGFβ Trap fusion protein, promotes anti-tumor efficacy as monotherapy and in combination with vaccine.” Oncoimmunology 7.5 (2018): e1426519；將所述文獻全文以引用方式併入本文。在一些實施方案中，用表達本文所述的CAR或抗原結合分子的細胞和一種或多種雙功能陷阱融合蛋白治療受試者。

在一些實施方案中，所述另外的治療劑可以包含一種或多種抑制劑，所述一種或多種抑制劑選自由以下組成的組：B-Raf的抑制劑、EGFR抑制劑、MEK抑制劑、ERK抑制劑、K-Ras抑制劑、c-Met抑制劑、間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑、磷脂醯肌醇3激酶(PI3K)抑制劑、Akt抑制劑、mTOR抑制劑、PI3K/mTOR雙重抑制劑、布魯頓氏酪氨酸激酶(BTK)抑制劑、以及異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)和/或異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)的抑制劑。在一些實施方案中，所述另外的治療劑是吲哚胺2,3-二加氧酶-1)(IDO1)的抑制劑(例如艾卡哚司他(epacadostat))。在一些實施方案中，所述另外的治療劑可以包含一種或多種抑制劑，所述一種或多種抑制劑選自由以下組成的組：HER3抑制劑、LSD1抑制劑、MDM2抑制劑、BCL2抑制劑、CHK1抑制劑、活化的hedgehog信號傳導途徑的抑制劑，以及選擇性地降解雌激素受體的藥劑。

在一些實施方案中，所述另外的治療劑可以包含一種或多種治療劑，所述一種或多種治療劑選自由以下組成的組：曲貝替定、白蛋白結合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、Trebananib、帕唑帕尼、西地尼布、帕博昔布、依維莫司、氟嘧啶、IFL、瑞戈非尼、Reolysin、力比泰(Alimta)、Zykadia、索坦(Sutent)、坦西莫司、阿昔替尼、依維莫司、索拉非尼、Votrient、帕唑帕尼、IMA-901、AGS-003、卡博替尼、長春氟寧、Hsp90抑制劑、Ad-GM-CSF、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、長春堿、沙立度胺(Thalomid)、達卡巴嗪、環磷醯胺、來那度胺、氮雜胞苷、來那度胺、硼替佐米、氨柔比星(amrubicine)、卡非佐米、普拉曲沙和恩紮妥林。

在一些實施方案中，所述另外的治療劑可以包含一種或多種治療劑，所述一種或多種治療劑選自由以下組成的組：佐劑、TLR激動劑、腫瘤壞死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗劑、IL-4拮抗劑、IL-13拮抗劑、IL-17拮抗劑、HVEM拮抗劑、ICOS激動劑、靶向CX3CL1的治療、靶向CXCL9的治療、靶向CXCL10的治療、靶向CCL5的治療、LFA-1激動劑、ICAM1激動劑和選擇素(Selectin)激動劑。

在一些實施方案中，將卡鉑、白蛋白結合型紫杉醇、紫杉醇、順鉑、培美曲塞、吉西他濱、FOLFOX或FOLFIRI施用至受試者。在一些實施方案中，所述另外的治療劑選自天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅黴素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔單抗、長春堿、長春新堿和/或其組合。

在一些實施方案中，如與使用不表達CAR或其片段的效應細胞時對靶細胞競爭性殺傷百分比相比，當由效應細胞(例如T細胞)表達時，本文所述的CAR或片段(任選地與一種或多種免疫檢查點抑制劑(例如抗PD-1或抗PD-L1抗體)組合)，將靶細胞(例如SiHa細胞)的競爭性殺傷百分比增加了至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或更多。

在一些實施方案中，如與未施用CAR或其片段的受試者相比，本文所述的CAR或片段(任選地與一種或多種免疫檢查點抑制劑(例如抗PD-1或抗PD-L1抗體)組合)將受試者(例如小鼠或人患者)的存活率增加了至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%或更多。

在一些實施方案中，如與未施用CAR或其片段的受試者相比，本文所述的CAR或片段(任選地與一種或多種免疫檢查點抑制劑(例如抗PD-1或抗PD-L1抗體)組合)將受試者(例如小鼠或人患者)的體重增加減少了小於50%、小於40%、小於30%、小於20%、小於10%、小於5%、小於1%。組合物和配製品

本公開提供了含有通過本文公開的方法生產的工程化細胞及其群體的組合物(包括藥物組合物和治療組合物)。還提供了用於向受試者(例如患者或動物模型(例如小鼠))施用工程化細胞及其組合物的方法(例如治療方法)。

提供了包括用於施用的工程化細胞的組合物，包括藥物組合物和配製品，諸如包括用於以給定劑量或其部分施用的細胞數量的單位劑型組合物。藥物組合物和配製品可以包括一種或多種任選的藥學上可接受的載體或賦形劑。在一些實施方案中，所述組合物包括至少一種另外的治療劑。

藥學上可接受的載體是指藥物組合物中除活性成分以外的成分。藥學上可接受的載體不干擾活性成分並且對受試者無毒。藥學上可接受的載體可以包括但不限於緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。藥物配製品是指將不同的物質和/或藥劑組合以產生最終藥物產品的過程。配製品研究涉及開發對於患者可接受的藥物製劑。另外，是這樣的製劑，其處於使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，並且不含對給予配製品的受試者具有不可接受的毒性的另外的組分。

在一些實施方案中，載體的選擇部分地由特定細胞(例如T細胞或NK細胞)和/或由施用方法來確定。多種合適的配製品是可用的。例如，藥物組合物可以含有防腐劑。合適的防腐劑可以包括例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉和苯紮氯銨。在一些實施方案中，使用兩種或更多種防腐劑的混合物。所述防腐劑或其混合物通常以按總組合物的重量計約0.0001%至約2%的量存在。載體描述於例如Remington’s Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編輯 (1980)中。藥學上可接受的載體在所用的劑量和濃度下通常對接受者無毒，並且包括但不限於：緩衝劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲氯銨；苯扎氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；烷基對羥基苯甲酸酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬絡合物(例如鋅-蛋白質絡合物)；和/或非離子表面活性劑，如聚乙二醇(PEG)。

合適的緩衝劑包括例如檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀和各種其他酸和鹽。在一些實施方案中，使用兩種或更多種緩衝劑的混合物。所述緩衝劑或其混合物通常以按總組合物的重量計約0.001%至約4%的量存在。用於製備可給予的藥物組合物的方法是已知的。示例性方法在例如以下文獻中有更詳細的描述：Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 第21版 (2005年5月1日)。

配製品可以包括水性溶液。所述配製品或組合物還可以含有可用於正在用工程化細胞治療的特定適應症、疾病或病症的超過一種活性成分，優選地具有與所述細胞互補的活性的那些成分，其中各自的活性不會彼此產生不利影響。此類活性成分以有效用於既定目的的量以合適的方式組合存在。因此，在一些實施方案中，藥物組合物還可以包括其他藥物活性藥劑或藥物，諸如檢查點抑制劑、融合蛋白、化學治療劑，例如天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅黴素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔單抗、長春鹼和/或長春新鹼。

在一些實施方案中，藥物組合物含有有效治療或預防疾病或病症的量(諸如治療有效量或預防有效量)的細胞。在一些實施方案中，通過定期評估所治療的受試者來監測治療或預防功效。所需劑量可以通過細胞的單次推注施用、通過細胞的多次推注施用或通過細胞的連續輸注施用來遞送。

細胞和組合物可以使用標準給藥技術、配製品和/或裝置來施用。所述細胞的施用可以是自體的或異源的。例如，免疫應答T細胞或祖細胞可以獲得自一名受試者，並且在根據本文所述的各種實施方案將其進行遺傳修飾之後，將其施用至同一受試者或不同的相容受試者。外周血衍生的免疫應答T細胞或其後代(例如，體內、離體或體外衍生的)可以通過局部注射施用，包括導管施用、全身注射、局部注射、靜脈內注射或腸胃外施用。通常，當施用治療性組合物(例如，含有遺傳修飾的免疫應答細胞的藥物組合物)時，通常將其配製成單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液、乳液)。

本文公開的配製品包括用於口服、靜脈內、腹膜內、皮下、經肺、透皮、肌內、鼻內、經頰、舌下或栓劑施用的那些。在一些實施方案中，腸胃外地施用所述細胞群。如本文所用，術語“腸胃外”包括靜脈內、肌內、皮下、直腸、陰道和腹膜內施用。在一些實施方案中，通過靜脈內、腹膜內或皮下注射使用外周全身遞送將細胞施用至受試者。

在一些實施方案中，組合物作為無菌液體製劑提供，所述無菌液體製劑例如為等滲水性溶液、懸浮液、乳液、分散體或黏性組合物，其在一些方面可以緩衝至選擇的pH。液體製劑一般比凝膠、其他黏性組合物和固體組合物製備起來更容易。另外地，液體組合物稍微更方便施用，特別是通過注射。在另一方面，黏性組合物可以配製在適當的黏度範圍內，以提供與特定組織的更長的接觸時間。液體或黏性組合物可以包含載體，所述載體可以是溶劑或分散介質，所述溶劑或分散介質含有例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及其合適的混合物。

無菌可注射溶液可以通過將細胞摻入溶劑中來製備，例如與合適的載體、稀釋劑或賦形劑(如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖等)混合。所述組合物可以含有輔助物質，諸如潤濕劑、分散劑或乳化劑(例如甲基纖維素)、pH緩衝劑、膠凝或黏度增強添加劑、防腐劑、調味劑和/或顏料，這取決於施用途徑和所需的製劑。在一些方面，可以參考標準文本來製備合適的製劑。

可以添加增強所述組合物的穩定性和無菌性的各種添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑和緩沖劑。可以通過各種抗細菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)來確保防止微生物作用。可以通過使用延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)實現可注射藥物形式的延長吸收。

用於進行體內 施用的配製品通常是無菌的。可以例如通過經無菌濾膜過濾容易地實現無菌性。

本文所述的組合物或藥物組合物可以與施用說明書一起包含在容器、包裝或分配器中。施用方法

還提供了施用細胞、群體和組合物的方法，以及此類細胞、群體和組合物治療或預防疾病、病症和障礙(包括癌症)的用途。在一些實施方案中，本文所述的方法可以降低發生本文所述的疾病、病症和障礙的風險。

在一些實施方案中，將本文所述的細胞、群體和組合物施用至受試者或患者，所述受試者或患者患有將要例如通過過繼細胞療法(諸如過繼T細胞療法)治療的特定疾病或病症。在一些實施方案中，將通過所提供的方法製備的細胞和組合物(諸如孵育和/或其他處理步驟後的工程化組合物和最終生產組合物)施用至受試者，諸如患有疾病或病症或具有患上疾病或病症的風險的受試者。在一些方面，所述方法由此治療疾病或病症(例如，改善疾病或病症的一種或多種症狀)，諸如通過減輕表達由工程化T細胞識別的抗原的癌症中的腫瘤負荷來治療。

用於施用過繼細胞療法的細胞的方法是已知的，並且可以與所提供的方法和組合物結合使用。例如，過繼T細胞療法的方法描述於例如U.S. 2003/0170238；美國專利號4,690,915；Rosenberg, “Cell transfer immunotherapy for metastatic solid cancer—what clinicians need to know.” Nature reviews Clinical oncology 8.10 (2011): 577；Themeli等人, “Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy.” Nature biotechnology 31.10 (2013): 928；Tsukahara等人, “CD19 target-engineered T cells accumulate at tumor lesions in human B-cell lymphoma xenograft mouse models.” Biochemical and biophysical research communications 438.1 (2013): 84-89；Davila等人, “CD19 CAR-targeted T cells induce long-term remission and B Cell Aplasia in an immunocompetent mouse model of B cell acute lymphoblastic leukemia.” PloS one 8.4 (2013)；將所述文獻中每一者全文以引用方式併入本文。

在一些實施方案中，通過自體轉移進行細胞療法(例如過繼T細胞療法)，其中從將要接受細胞療法的受試者中或從衍生自這樣的受試者的樣品中分離和/或以其他方式製備T細胞。因此，在一些方面，所述細胞源自於需要治療的受試者(例如患者)，並且在分離和處理後將所述細胞施用至同一受試者。

在一些實施方案中，通過同種異體轉移進行細胞療法(例如過繼T細胞療法)，其中從除將要接受或最終接受細胞療法的受試者以外的受試者(例如第一受試者)分離和/或以其他方式製備T細胞。在此類實施方案中，細胞隨後被施用至同一物種的不同受試者(例如第二受試者)。在一些實施方案中，所述第一受試者和第二受試者在遺傳上是相同的。在一些實施方案中，所述第一受試者和第二受試者在遺傳上是相似的。在一些實施方案中，所述第二受試者與所述第一受試者表達相同的HLA類別或超類型。

在一些實施方案中，在施用細胞或含有細胞的組合物之前，已經用靶向疾病或病症(例如腫瘤)的治療劑對受試者進行過治療。在一些方面，受試者對其他治療劑是難治的或無反應。在一些實施方案中，受試者例如在用另一種治療性干預進行治療後具有持續性或復發性疾病，所述治療性干預包括化學療法、放射線和/或造血幹細胞移植(HSCT)(例如同種異體HSCT)。在一些實施方案中，儘管受試者已經對另一種療法產生抗性，但施用仍有效地治療受試者。

在一些實施方案中，受試者對其他治療劑有反應，並且用所述治療劑進行治療降低了疾病負荷。在一些方面，受試者最初對所述治療劑有反應，但是隨著時間的推移展現出疾病或病症的復發。在一些實施方案中，受試者尚未復發。在一些此類實施方案中，確定受試者處於復發的風險中，諸如處於高復發風險中，因此預防性地施用細胞，例如以降低復發的可能性或防止復發。在一些實施方案中，受試者尚未接受用另一種治療劑的先前治療。

在一些實施方案中，細胞以所需劑量施用，所述所需劑量在一些方面包括所需劑量或數量的細胞或一種或多種細胞類型和/或所需比率的細胞類型。因此，在一些實施方案中，細胞劑量基於細胞總數(或每kg體重的細胞數量)和所需的單個群體或亞型的比率，諸如CD4+與CD8 +的比率。在一些實施方案中，細胞劑量基於所需的單個群體中的細胞或單個細胞類型的總數(或每kg體重的細胞數量)。在一些實施方案中，劑量基於此類特徵的組合，諸如所需的總細胞數、所需比率、和單個群體中所需的細胞總數。

在一些實施方案中，以所需劑量的總細胞(諸如所需劑量的T細胞)的耐受差異或在所述耐受差異之內施用細胞的群體或亞型(諸如CD8+和CD4+ T細胞)。在一些實施方案中，所需劑量是所需細胞數或被施用所述細胞的受試者的每單位體重的所需細胞數(例如細胞/kg)。在一些實施方案中，所需劑量等於或高於最小細胞數或每單位體重的最小細胞數。在一些實施方案中，在以所需劑量施用的總細胞中，單個群體或亞型以等於或接近所需輸出比率(諸如CD4+與CD8+的比率)(例如在這種比率的一定耐受差異或誤差內)存在。

在一些實施方案中，以所需劑量的一種或多種單個細胞群體或亞型(諸如所需劑量的CD4+細胞和/或所需劑量的CD8+細胞)的耐受差異或在所述耐受差異之內施用細胞。在一些實施方案中，所需劑量是所需的所述亞型或群體的細胞數或所需的被施用所述細胞的受試者的每單位體重的此類細胞數(例如細胞/kg)。在一些實施方案中，所需劑量等於或高於最小的所述群體或亞型的細胞數或每單位體重的最小的所述群體或亞型的細胞數。

因此，在一些實施方案中，劑量基於所需的總細胞固定劑量和所需比率，和/或基於所需固定劑量的一種或多種(例如每一種)單個亞型或亞群。因此，在一些實施方案中，劑量基於所需固定劑量或最小劑量的T細胞和所需的CD4+與CD8+細胞的比率，和/或基於所需固定劑量或最小劑量的CD4+和/或CD8+細胞。

在某些實施方案中，將細胞、或細胞的單個群體或亞型以約100萬至約1000億個細胞(諸如，例如100萬至約500億個細胞(例如，約500萬個細胞、約2500萬個細胞、約5億個細胞、約10億個細胞、約50億個細胞、約200億個細胞、約300億個細胞、約400億個細胞或由前述值中的任兩個值所限定的範圍)，諸如約1000萬至約1000億個細胞(例如，約2000萬個細胞、約3000萬個細胞、約4000萬個細胞、約6000萬個細胞、約7000萬個細胞、約8000萬個細胞、約9000萬個細胞、約100億個細胞、約250億個細胞、約500億個細胞、約750億個細胞、約900億個細胞或由前述值中的任兩個值所限定的範圍)，並且在一些情況下約1億個細胞至約500億個細胞(例如，約1.2億個細胞、約2.5億個細胞、約3.5億個細胞、約4.5億個細胞、約6.5億個細胞、約8億個細胞、約9億個細胞、約30億個細胞、約300億個細胞、約450億個細胞或在這些範圍之間的任何值)施用至受試者。

在一些實施方案中，總細胞的劑量和/或單個細胞亞群的劑量在以下範圍內：在為或約10⁴ 與為或約10⁹ 個細胞/千克(kg)體重之間，諸如在10⁵ 與10⁶ 個細胞/kg體重之間，例如，至少或至少約或為或約1×10⁵ 個細胞/kg體重、1.5×10⁵ 個細胞/kg體重、2×10⁵ 個細胞/kg體重、或1×10⁶ 個細胞/kg體重。例如，在一些實施方案中，以在為或約10⁴ 與為或約10⁹ 個T細胞/千克(kg)體重之間，諸如在10⁵ 與10⁶ 個T細胞/kg體重之間，例如，至少或至少約或者為或約1×10⁵ 個T細胞/kg體重、1.5×10⁵ 個T細胞/kg體重、2×10⁵ 個T細胞/kg體重、或1×10⁶ 個T細胞/kg體重，或在其一定誤差範圍內施用細胞。

在一些實施方案中，以在為或約10⁴ 與為或約10⁹ 個CD4+和/或CD8+細胞/千克(kg)體重之間，諸如在10⁵ 與10⁶ 個CD4+和/或CD8+細胞/kg體重之間，例如，至少或至少約或者為或約1×10⁵ 個CD4+和/或CD8+細胞/kg體重、1.5×10⁵ 個CD4+和/或CD8+細胞/kg體重、2×10⁵ 個CD4+和/或CD8+細胞/kg體重、或1×10⁶ 個CD4+和/或CD8+細胞/kg體重，或在其一定誤差範圍內施用細胞。

在一些實施方案中，以大於、和/或至少約1×10⁶ 、約2.5×10⁶ 、約5×10⁶ 、約7.5×10⁶ 、或約9×10⁶ 個CD4+細胞、和/或至少約1×10⁶ 、約2.5×10⁶ 、約5×10⁶ 、約7.5×10⁶ 、或約9×10⁶ 個CD8+細胞、和/或至少約1×10⁶ 、約2.5×10⁶ 、約5×10⁶ 、約7.5×10⁶ 、或約9×10⁶ 個T細胞，或在其一定誤差範圍內施用細胞。在一些實施方案中，以在約10⁸ 與10¹² 個之間或在約10¹⁰ 與10¹¹ 個之間的T細胞、在約10⁸ 與10¹² 個之間或在約10¹⁰ 與10¹¹ 個之間的CD4+細胞，和/或在約10⁸ 與10¹² 個之間或在約10¹⁰ 與10¹¹ 個之間的CD8+細胞，或在其一定誤差範圍內施用細胞。

在一些實施方案中，在多種細胞群或亞型(諸如CD4+和CD8+細胞或亞型)的所需輸出比率的耐受範圍下或在其耐受範圍內施用細胞。在一些方面，所需比率可以是特定比率或可以是比率範圍。例如，在一些實施方案中，所需比率(例如，CD4+與CD8+細胞的比率)在為或約1 : 5與為或約5 : 1之間(或大於約1 : 5且小於約5 : 1)，或在為或約1 : 3與為或約3 : 1之間(或大於約1 : 3且小於約3 : 1)，如在為或約2 : 1與為或約1 : 5之間(或大於約1 : 5且小於約2 : 1)，或例如為或約5 : 1、4.5 : 1、4 : 1、3.5 : 1、3 : 1、2.5 : 1、2 : 1、1.9 : 1、1.8 : 1、1.7 : 1、1.6 : 1、1.5 : 1、1.4 : 1、1.3 : 1、1.2 : 1、1.1 : 1、1 : 1、1 : 1.1、1 : 1.2、1 : 1.3、1 : 1.4、1 : 1.5、1 : 1.6、1 : 1.7、1 : 1.8、1 : 1.9、1 : 2、1 : 2.5、1 : 3、1 : 3.5、1 : 4、1 : 4.5或1 : 5。在一些方面，耐受差異在所需比率的約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%內，包括在這些範圍之間的任何值。在一些方面，這裡所述的CAR提供了改善的表達和活性，從而即使在低的效應子與靶標(E:T)比率下也提供治療效果。

對療法的最佳反應可能取決於工程化重組受體(諸如CAR)在細胞表面上一致且可靠地表達和/或結合靶抗原的能力。例如，在一些情況下，當在一些情況下在細胞(諸如人T細胞)中表達，用於細胞療法時，某些重組受體(例如CAR)的特性可能影響重組受體的表達和/或活性。在一些情境下，特定重組受體(例如CAR)的表達位準可能很低，並且表達此類重組受體的工程化細胞(諸如人T細胞)的活性可能由於表達不良或信號傳導活性不佳而受到限制。在一些情況下，重組受體的表達的一致性和/或效率以及受體的活性在可用的治療方法的某些細胞或某些細胞群中受到限制。在一些情況下，需要大量的工程化T細胞(高的效應子與靶標(E:T)比率)來展現出功能活性。在一些實施方案中，所需比率(E:T比率)在為或約1:10與為或約10:1之間(或大於約1:10且小於約10:1)、或在為或約1:1與為或約10:1之間(或大於約1:1且小於約5:1)，諸如在為或約2:1與為或約10:1之間。在一些實施方案中，E:T比率為大於或約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、或10:1。

為了預防或治療疾病，適當的劑量可能取決於待治療的疾病類型、細胞或重組受體的類型、疾病的嚴重性和病程、細胞是否針對預防或治療目的而被施用、先前療法、受試者的臨床病史和對細胞的應答以及主治醫師的決斷。在一些實施方案中，適合將組合物和細胞一次或在一系列治療中施用至受試者。

本文所述的細胞可以通過任何合適的手段施用，例如通過推注輸注，通過注射例如靜脈內或皮下注射、眼內注射、眼周注射、視網膜下注射、玻璃體內注射、經中隔注射、鞏膜下注射、脈絡膜內注射、前房注射、結膜下(subconjectval)注射、結膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、球後注射、球周注射或後近鞏膜(posterior juxtascleral)遞送。在一些實施方案中，將它們通過腸胃外、肺內和鼻內施用以及(如果需要用於局部治療的話)病灶內施用。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。在一些實施方案中，將給定劑量通過細胞的單次推注給藥來施用。在一些實施方案中，給定劑量通過細胞的多次推注給藥例如在不超過3天的時間段內來施用，或通過細胞的連續輸注給藥。

在一些實施方案中，所述細胞作為組合治療的一部分施用，如與另一種治療性干預如抗體或工程化細胞或受體或藥劑(如細胞毒性劑或治療劑)同時施用或以任何順序依次施用。在一些實施方案中，所述細胞與一種或多種另外的治療劑共同施用或與另一種治療性干預結合施用(同時或以任何順序依次施用)。在一些情境下，將所述細胞與另一種療法在時間上足夠接近地共同施用，使得所述細胞群增強一種或多種另外的治療劑的效果，或反之亦然。在一些實施方案中，在一種或多種另外的治療劑之前施用細胞。在一些實施方案中，在一種或多種另外的治療劑之後施用細胞。在一些實施方案中，一種或多種另外的藥劑包括細胞因子(如IL-2)，例如以增強持久性。在一些實施方案中，所述方法包括施用化學治療劑。

在一些實施方案中，在施用細胞後，例如通過許多已知方法中的任一種測量工程化細胞群的生物學活性。待評估的參數包括工程化T細胞與抗原的特異性結合，其在體內例如通過成像進行評估，或者離體例如通過ELISA或流式細胞術進行評估。在某些實施方案中，可以使用本領域已知的任何合適的方法測量工程化細胞破壞靶細胞的能力，所述方法諸如描述於例如Kochenderfer等人, "Construction and pre-clinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor.” Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md.: 1997) 32.7 (2009): 689以及Hermans等人, “The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL-and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targetsin vitro andin vivo .” Journal of immunological methods 285.1 (2004): 25-40中。在某些實施方案中，通過測定一種或多種細胞因子(諸如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表達和/或分泌來測量細胞的生物活性。在一些方面，通過評估臨床結果(諸如腫瘤負荷或負擔的減少)來測量生物活性。

提供了重複給藥方法，其中給予第一劑量的細胞，隨後給予一個或多個第二連續劑量。當以過繼療法方法施用至受試者時，通常設計細胞的多個劑量的時間安排和大小以增加如本文所述的工程化細胞的功效和/或活性和/或功能。所述方法涉及施用第一劑量，通常隨後是一個或多個連續劑量，在不同劑量之間具有特定的時間範圍。

在過繼細胞療法的情境下，給定“劑量”的施用包括以單一組合物和/或單次不間斷給藥的方式(例如以單次注射或連續輸注的方式)施用給定量或數量的細胞，並且還涵蓋在指定時間段(例如不超過3天)內以在多種單獨組合物或多次單獨輸注中提供的分割劑量的方式施用給定量或數量的細胞。因此，在一些情境下，第一或連續劑量是在單個時間點給予或開始的對指定數量的細胞的單次或連續施用。然而，在一些情境下，將第一或連續劑量在受限的時間段(例如不超過三天)內以多次注射或輸注的方式施用，諸如每天一次施用持續三天或兩天或者通過在一天的時間段內多次輸注的方式施用。

第一劑量的細胞以單一藥物組合物施用。在一些實施方案中，連續劑量的細胞以單一藥物組合物施用。

在一些實施方案中，第一劑量的細胞以共同含有第一劑量的細胞的多種組合物施用。在一些實施方案中，連續劑量的細胞以共同含有連續劑量的細胞的多種組合物施用。在一些方面，可以在不超過3天的時間段內以多種組合物施用另外的連續劑量。

關於先前劑量，諸如第一劑量，術語“連續劑量”是指在先前(例如第一)劑量之後暫時沒有向受試者施用任何介入劑量的情況下向同一受試者施用的劑量。但是，所述術語不涵蓋在單個分割劑量內包含的一系列輸注或注射中的第二次、第三次和/或等等注射或輸注。因此，除非另有說明，否則在一天、兩天或三天時間段內的第二次輸注不被視為如本文所用的“連續”劑量。同樣，在“連續”劑量的意義的情境下，在分割劑量內的一系列多次劑量中的第二次、第三次等等也不被視為“介入”劑量。因此，除非另有說明，否則只要在第一或先前劑量開始後的三天時間段內發生了第二次或隨後的注射或輸注，即使受試者在第一劑量開始後接受了細胞的第二次或隨後的注射或輸注，在開始第一或先前劑量之後大於三天的一定時間段內施用的劑量都被視為“連續”劑量。

因此，除非另有說明，否則在長達3天的時間段內多次施用相同細胞被視為單一劑量，並且在初次施用的3天內施用細胞不被視為連續劑量，並且也不被視為出於確定第二劑量是否與第一劑量“連續”的目的使用的介入劑量。

在一些實施方案中，在一些方面，使用與關於在第一劑量與第一連續劑量之間的時間安排指南相同的時間安排指南，例如通過施用第一和多個連續劑量，給予多個連續劑量。

在一些實施方案中，在第一劑量與第一連續劑量、或者第一與多個連續劑量之間的時間安排為使得在大於約5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天或更長時間的時間段內給予每個連續劑量。在一些實施方案中，在施用第一劑量或緊接先前劑量之後少於約28天的時間段內給予連續劑量。另外的多個另外一個或多個連續劑量也被稱為後續劑量或後續連續劑量。

將細胞的第一劑量和/或一個或多個連續劑量的大小通常設計為提供改善的功效和/或降低的毒性風險。在一些方面，第一劑量或任何連續劑量的劑量量或大小是如上所述的任何劑量或量。在一些實施方案中，在第一劑量或任何連續劑量中的細胞數在約0.5×10⁶ 個細胞/kg受試者體重與5×10⁶ 個細胞/kg之間、在約0.75×10⁶ 個細胞/kg與3×10⁶ 個細胞/kg之間、或在約1×10⁶ 個細胞/kg與2×10⁶ 個細胞/kg之間。

如本文所用，“第一劑量”用於描述在施用連續或後續劑量之前的給定劑量的時間安排。所述術語不一定暗示受試者以前從未接受過一定劑量的細胞療法或，或者甚至受試者以前沒有接受過一定劑量的相同細胞或表達相同重組受體或靶向相同抗原的細胞。

在一些實施方案中，可以在延長的時間段內(例如，在至少1周、2周、3周、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、1年、2年、3年、4年或5年的時間段內)向受試者施用多個劑量。熟練的醫療專業人員可以使用本文所述的用於診斷或跟蹤治療有效性(例如觀察至少一種癌症症狀)的任何方法來確定治療期的長度。實施例

在以下實施例中進一步描述本發明，所述實施例並不限制申請專利範圍中所描述的本發明的範圍。實施例 1. 構建體設計

構建MP71逆轉錄病毒載體，以編碼包括單鏈可變片段(scFv)、鉸鏈區、跨膜區、共刺激信號傳導區和細胞內信號傳導區的A02-A09 CAR。圖1A-1C顯示了分別編碼A02、A03和A06 CAR的逆轉錄病毒載體的質粒圖。在每個CAR中，scFv包括通過接頭肽(SEQ ID NO: 37)與輕鏈可變區(VL)連接的重鏈可變區(VH)。鉸鏈區和跨膜區二者均來自人CD8。共刺激信號傳導區來自人CD137(4-1BB)，並且細胞內T細胞信號傳導結構域來自CD247(CD3ζ)的細胞質結構域。

圖1D顯示了進一步編碼通過T2A序列(SEQ ID NO: 41)與A02 CAR連接的抗PD-1 scFv的A02P03載體的逆轉錄病毒載體質粒圖。更具體地，抗PD-1 scFv包含人IL-2前導序列(SEQ ID NO: 42)，隨後是通過接頭肽(SEQ ID NO: 87)與輕鏈可變區(VL；SEQ ID NO: 16)連接的重鏈可變區(VH；SEQ ID NO: 15)。

類似地，圖1E顯示了進一步編碼通過T2A序列(SEQ ID NO: 41)與A02 CAR連接的抗PD-L1 scFv的A02PL01載體的逆轉錄病毒載體質粒圖。更具體地，抗PD-L1 scFv包含人IL-2前導序列(SEQ ID NO: 42)，隨後是通過接頭肽(SEQ ID NO: 87)與重鏈可變區(VH；SEQ ID NO: 31)連接的輕鏈可變區(VL；SEQ ID NO: 32)。

上述逆轉錄病毒載體還包含5'LTR(5'長末端重複序列)、Ψ RNA包裝信號(或逆轉錄病毒Ψ(psi)包裝元件)、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)和3'LTR(長末端重複序列)。WPRE是一種DNA序列，當轉錄時其形成增強表達的三級結構。逆轉錄病毒載體還包含選擇標記基因，即氨苄青黴素抗性基因。實施例 2. 逆轉錄病毒載體生產、 T 細胞轉導和擴增

在補充有10%胎牛血清(FBS)的達爾伯克改良的伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)、補充有10% FBS的羅斯威爾公園紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)培養基、或補充有5%人血清A/B的X-Vivo(Lonza，目錄號：04-418Q)中培養HEK-293T、Jurkat、SiHa或外周血單核細胞(PBMC)。通過使用標準磷酸鈣沉澱方案短暫轉染293T細胞來製備逆轉錄病毒載體。在48小時之後收穫病毒上清液，並將其用於轉導T細胞。為了進行轉導，通過在32℃下以2,000 g離心2小時，將新鮮收穫的逆轉錄病毒上清液旋轉載入到每孔用25 μg RetroNectin塗覆的經非組織培養物處理過的24孔板上(Clontech Laboratories)。將活化的PBMC載入到板上，並在32℃下以600 g旋轉30分鐘。

將T細胞在37℃和5% CO₂ 下孵育。每2天補充一次培養基。在轉導後4天，通過蛋白L染色，隨後進行流式細胞術分析來檢測重組CAR的表達(圖2和圖4)。確定在Jurkat細胞(圖2)或人PBMC(圖4)中的CAR表達在70-90%之間的範圍內。實施例 3. CAR-T 細胞活化

將0.2x 10⁶ 個表達A02或A03 CAR的Jurkat細胞與0.4 x 10⁶ 個SiHa或293T細胞共培養過夜，其後通過流式細胞術測量CD3⁺ Jurkat細胞中的CD69表達。如圖3所示，當與SiHa細胞共培養時，約70-80%的表達A02或A03 CAR的Jurkat細胞被活化。相比執行，當與293T細胞共培養時，A02或A03 CAR-T細胞未被活化。實施例 4. 體外 INF-γ 產生和競爭性殺傷測定

將0.2 x 10⁶ 個人A02或A03 CAR-T細胞與0.4x10⁶ 個SiHa或HEK293T靶細胞以1:2的效應子與靶標比率共培養過夜。將T細胞用佈雷菲德菌素A(Thermo Fisher Scientific，00-4506-51)和莫能菌素(Thermo Fisher Scientific，00-4505-51)處理4小時，其後收集T細胞以使用流式細胞術測量細胞內IFN-γ表達(圖5和圖6)。使用活的CD4⁺ 或CD8⁺ 淋巴細胞門控策略。細胞內IFN-γ表達結果表明，含有A02或A03 CAR的CAR-T細胞被ALPP陽性SiHa細胞特異性地活化。

此外，分別用CellTrace CFSE和CellTrace紫色標記0.03 x 10⁶ 個SiHa細胞和0.03 x 10⁶ 個HEK293T細胞。然後將標記的SiHa和293T細胞混合，並以各種比率與未經轉導的、A02或A03 CAR-T細胞共培養過夜。通過流式細胞術分析活的SiHa和293T細胞，並且基於實驗之前的活細胞總數中剩餘的活的SiHa和293T細胞的數量來計算競爭性殺傷效率(圖7)。此外，結果表明A02和A03 CAR-T細胞特異性地殺傷SiHa細胞。因此，以上發現表明抗ALPP CAR-T細胞療法是治療ALPP陽性腫瘤的有效治療方法。實施例 5. 體內腫瘤植入和治療

向6-8周齡的雌性NSG小鼠腹膜內植入5.0 x 10⁶ 個SiHa細胞。34天后(研究第0天)，基於體重和指示腫瘤生長的臨床體征的存在對動物進行分組。在研究第0天，向所有動物腹膜內注射10⁶ 個CAR⁺ A02細胞、A03細胞或相當數量的未經轉導的細胞(11.78 x 10⁶ 個細胞/小鼠)。此外，基於動物達到研究終點的情況評估總體存活。研究終點被定義為死亡、垂死、身體狀況嚴重下降且身體狀況得分低於2、妨礙動物正常行走能力的嚴重腹脹、或體重增加超過20%。如圖8所示，結果表明沒有毒性與CAR-T治療相關。圖9中的結果表明用A02或A03 CAR-T細胞進行治療顯著提高了存活率。實施例 6. 抗 ALPP 抗體的人源化

通常，將來自小鼠親本抗體H17E2(或A02)的抗體特異性序列(CDR)移植到人供體序列上。根據生物資訊學軟體選擇供體序列，所述軟體利用廣泛的抗體資料庫來計算每種組合的獨特人性得分。將這些抗體選殖到表達載體中，並轉染到細胞系中進行重組蛋白表達。通過ELISA和基於細胞的結合測定在體外測試對靶蛋白ALPP的抗體親和力。

通過CDR移植和表面置換策略來實現抗體的人源化。此外，還使用了取消免疫策略。利用生物資訊學工具(包括抗體建模和關鍵框架殘基鑒定)來設計人源化的重鏈和輕鏈。組合具有最大人源化得分的那些，以獲得人源化抗體A03、A04、A05、A06、A07、A08和A09。

將人源化的VH和VL選殖到短暫表達載體中。通過測序確認最終的構建體。此外，將編碼重鏈和輕鏈候選對(包括一個用於對照的嵌合對)的質粒共轉染到CHO或HEK293細胞中進行短暫表達。純化表達的抗體，隨後通過ELISA或基於細胞的結合測定測量其表位特異性和親和力。實施例 7. 人源化 抗 ALPP 抗體的結合親和力

通過ELISA或基於細胞的結合測定確定抗ALPP抗體的親和力，所述抗ALPP抗體包括親本小鼠抗體A02和人源化抗體A04、A05、A06、A07、A08和A09。將嵌合抗體用作對照。詳細方法提供如下。ELISA

將酶聯免疫吸附測定(ELISA)板用125 ng ALPP抗原包被。封閉板之後，將抗ALPP抗體(包括A02(H17E2)、A04、A05、A06、A07、A08、A09或嵌合抗體)的連續稀釋液添加到對應的孔中。然後，將生物素-SP-AffiniPure山羊抗人抗體添加到含有人源化抗體A04、A05、A06、A07、A08、A09或嵌合抗體的孔中。同時，將生物素-SP-AffiniPure山羊抗小鼠Fc抗體添加到含有小鼠抗體H17E2的孔中。接下來，將綴合HRP的鏈黴親和素用於生物素檢測。在添加3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)底物之後，通過評估OD₄₅₀ 完成最終檢測。分別在圖10A和下表中顯示了結合曲線和計算的EC₅₀ 值。獲得了嵌合和人源化抗ALPP抗體相對於親本小鼠抗ALPP抗體H17E2的可比較EC₅₀ 值。表1

抗體	H17E2	嵌合Ab	A04Ab	A09Ab	A05Ab	A06Ab	A07Ab	A08Ab
EC₅₀ (μg/ml)	0.01079	0.00308	0.00589	0.00564	0.00491	0.00370	0.00534	0.00481

基於細胞的結合測定

如本文所述，將0.2 x 10⁶ 個SiHa細胞與連續稀釋的抗FLAA抗體一起孵育。之後，使用AF488山羊抗人二抗或AF488山羊抗小鼠IgG(Fcγ片段特異性的)對細胞進行染色。然後，通過流式細胞術檢測螢光染色的細胞。分別在圖10B和下表中顯示了結合曲線和計算的EC₅₀ 值。通過基於細胞的結合測定，獲得了嵌合和人源化抗ALPP抗體相對於親本小鼠抗ALPP抗體H17E2的可比較EC₅₀ 值。表2

抗體	H17E2	嵌合Ab	A04Ab	A09Ab	A05Ab	A06Ab	A07Ab	A08Ab
EC₅₀ (μg/ml)	0.2113	0.1542	0.2864	0.3382	0.2253	0.2572	0.3022	0.2334

實施例 8. 人源化 抗 ALPP CAR 在 T 細胞中的表達和活性 人 T 細胞中的 CAR 表達位準

用由對應的人源化抗體構建的、表達A02、A03、A05、A06、或A07 CAR的逆轉錄病毒質粒轉導人PBMC。轉導後12天，通過蛋白L測定來測量CAR表達位準。如圖11A所示，所有人源化CAR均在經轉導的PBMC中表達。IFN-γ 表達測定

將0.2 x 10⁶ 個未經轉導的(UT)、A02、A03、A05、A06或A07 CAR-T細胞與0.4 x 10⁶ 個SiHa或293T細胞共培養過夜。然後將細胞用佈雷菲德菌素A和莫能菌素處理4小時，其後通過流式

細胞術測量細胞內IFN位準。分別如圖11B和圖11C所示，分析了CD8⁺ 和CD4⁺ T細胞群。競爭性殺傷測定

將0.03 x 10⁶ 個SiHa細胞用CellTrace^TM CFSE標記，並且將0.03 x 10⁶ 個293T細胞用CellTrace^TM 紫色標記。將標記的SiHa細胞和293T細胞混合，並且與未經轉導的(UT)、A02、A03、A05、A06或A07 CAR-T細胞以漸增的效應細胞與靶細胞比率共培養過夜，如圖11D所示。在96孔板中進行了4次重複實驗。通過流式細胞術定量活的SiHa和293T細胞，並且基於活的SiHa和293T細胞的數量來計算競爭性殺傷功效。實施例 9. 人源化 抗 ALPP CAR 的表達和活性結合免疫檢查點抑制 人 T 細胞中的 CAR 表達位準

將人PBMC用A02、A02P03或A02PL01逆轉錄病毒轉導。轉導後12天，通過蛋白L測定來測量CAR表達位準。如圖12A所示，在經轉導的PBMC中檢測到CAR表達。IFN-γ 表達測定

將0.2 x 10⁶ 個未經轉導的(UT)、A02、A02P03、或A02PL01 CAR-T細胞與0.4 x 10⁶ 個SiHa或293T細胞共培養過夜。然後將細胞用佈雷菲德菌素A和莫能菌素處理4小時，其後通過流式細胞術測量細胞內IFN-γ位準。分別如圖12B和圖12C所示，分析了CD8⁺ 和CD4⁺ T細胞群。競爭性殺傷測定

將0.03 x 10⁶ 個SiHa細胞用CellTrace^TM CFSE標記，並且將0.03 x 10⁶ 個293T細胞用CellTrace^TM 紫色標記。將標記的SiHa細胞和293T細胞混合，並且與未經轉導的(UT)、A02、A02P03或A02PL01 CART細胞以漸增的效應細胞與靶細胞比率共培養過夜，如圖12D所示。在96孔板中進行了4次重複實驗。通過流式細胞術定量活的SiHa和293T細胞，並且基於活的SiHa和293T細胞的數量來計算競爭性殺傷功效。實施例 10. 抗 ALPP CAR-T 細胞的體內功效和毒性

將總共39只10周齡的雌性NSG小鼠腹膜內植入200 ul PBS中的5.0 x 10⁶ 個SiHa細胞。40天后(在研究第0天)，基於體重和指示腫瘤生長的臨床體征的存在將動物分選到幾組，然後腹膜內注射10⁶ 個CAR陽性A02、A02P03、A02PL01、A03、A06或等效數量的未經轉導的細胞(17.08x10⁶ 個細胞/小鼠)。基於動物達到研究終點的時間繪製總體存活，如通過以下所確定的：死亡、垂死、身體狀況嚴重下降且身體狀況得分低於2、妨礙動物正常行走能力的嚴重腹脹、或體重增加超過20%。分別在圖13A和圖13B中顯示了如通過動物存活和小鼠體重所測量的抗腫瘤功效和毒性。確定身體狀況得分的細節可以在例如以下文獻中找到：Ullman-Culleré等人, “Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice.” Comparative Medicine 49.3 (1999): 319-323；Charmaine等人, “Guidelines for assessing the health and condition of mice.” Lab Animal 28.5 (1999)；將所述文獻中的二者全文以引用方式併入本文。其他實施方案

應當理解，儘管已經結合本發明的具體實施方式描述了本發明，但是前述描述旨在說明而不限制本發明的範圍，本發明的範圍由所附申請專利範圍的範圍限定。其他方面、優點和修改在以下申請專利範圍的範圍內。

在附圖中展示了示例性實施方案。旨在將本文公開的實施方案和附圖視為說明性的而非限制性的。圖1A顯示了A02 CAR質粒的序列圖。圖1B顯示了A03 CAR質粒的序列圖。圖1C顯示了A06 CAR質粒的序列圖。圖1D顯示了A02P03 CAR質粒的序列圖。T2A編碼2A自切割肽。圖1E顯示了A02PL01 CAR質粒的序列圖。T2A編碼2A自切割肽。圖2顯示了Jurkat T細胞中的A02和A03 CAR表達。Jurkat細胞是未經轉導的(UT)，或被轉導以表達A02或A03 CAR。轉導後4天通過蛋白L染色來測量CAR表達位準。圖3顯示了A02和A03 CAR-T細胞活化。將未經轉導的(UT)Jurkat細胞和僅Jurkat細胞(空白)用作對照。圖4顯示了人T細胞中的A02和A03 CAR表達。人PBMC被轉導以表達A02或A03 CAR。轉導後4天通過蛋白L染色來測量CAR表達。圖5顯示了CD4⁺ A02和A03 CAR-T細胞活化。通過流式細胞術測量人CD4⁺ T細胞中的細胞內IFN-γ表達。將未經轉導的(UT)T細胞和僅T細胞(空白)用作對照。圖6顯示了CD8⁺ A02和A03 CAR-T細胞活化。通過流式細胞術測量人CD8⁺ T細胞中的細胞內IFN-γ表達。將未經轉導的(UT)T細胞和僅T細胞(空白)用作對照。圖7顯示了A02和A03 CAR-T細胞的競爭性殺傷活性。每個96孔板含有4個重複。通過流式細胞術分析活的SiHa和293T細胞，並且基於剩餘的活的SiHa和293T細胞的數量來計算競爭性殺傷效率。圖8顯示了A02和A03 CAR-T細胞的體內毒性。通過測量體重變化來評估體內毒性。圖9顯示了A02和A03 CAR-T細胞的體內抗腫瘤功效。***，與未經轉導的相比，p = 0.0009；*，與未經轉導的相比，p = 0.0281。圖10A顯示了如通過ELISA所確定的抗ALPP抗體與ALPP結合的一組結合曲線。圖10B顯示了如通過基於細胞的結合測定所確定的抗ALPP抗體與ALPP結合的一組結合曲線。圖11A是顯示如通過蛋白L測定所確定的，未經轉導的(UT)、A02、A03、A05、A06或A07 CAR-T細胞的CAR表達位準的圖。圖11B是顯示未經轉導的(UT)、A02、A03、A05、A06或A07 CAR-T細胞中的IFNγ表達的一組流式細胞術結果。將CAR-T細胞與SiHa或293T細胞共培養。通過流式細胞術分析CD8⁺ 細胞。圖11C是顯示未經轉導的(UT)、A02、A03、A05、A06或A07 CAR-T細胞中的IFNγ表達的一組流式細胞術結果。將CAR-T細胞與SiHa或293T細胞共培養。通過流式細胞術分析CD4⁺ 細胞。圖11D顯示了在各種效應細胞與靶細胞比率下的競爭性殺傷曲線。圖12A是顯示如通過蛋白L測定所確定的，未經轉導的(UT)、A02、A02P03、或A02PL01 CAR-T細胞的CAR表達位準的圖。圖12B是顯示未經轉導的(UT)、A02、A02P03、或A02PL01 CAR-T細胞中的IFNγ表達的一組流式細胞術結果。將CAR-T細胞與SiHa或293T細胞共培養。通過流式細胞術分析CD8⁺ 細胞。圖12C是顯示未經轉導的(UT)、A02、A02P03、或A02PL01 CAR-T細胞中的IFNγ表達的一組流式細胞術結果。將CAR-T細胞與SiHa或293T細胞共培養。通過流式細胞術分析CD4⁺ 細胞。圖12D顯示了在各種效應細胞與靶細胞比率下的競爭性殺傷曲線。圖13A顯示了植入了SiHa細胞並注射了未經轉導的、A02、A02P03、A02PL01、A03或A06 CAR-T細胞的NSG小鼠(The Jackson Laboratory)的存活曲線。圖13B顯示了植入了SiHa細胞並注射了未經轉導的、A02、A02P03、A02PL01、A03或A06 CAR-T細胞的NSG小鼠的小鼠體重變化的百分比。圖14顯示了重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的CDR1、2、3序列。圖15提供了在本公開中所描述的序列。

(無)

Claims

一種治療癌症的方法，所述方法包括：向患者施用有效量的基因工程化抗腫瘤人T細胞以治療所述患者的癌症，其中通過將編碼CAR的重組DNA序列摻入從所述患者中提取的T細胞中獲得了所述抗腫瘤人T細胞，其中所述編碼的CAR包含與在癌細胞中表達的ALPP結合的ALPP抗原結合結構域。
如請求項1所述的治療患者的方法，其中所述癌症是肺癌。
如請求項1所述的治療患者的方法，其中所述癌症是胃癌。
如請求項1所述的治療患者的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
如請求項1所述的治療患者的方法，其中所述癌症是頭頸癌。
如請求項1所述的治療患者的方法，其中所述癌症是結直腸癌。
如請求項1所述的治療患者的方法，其中所述癌症是尿路上皮癌。
如請求項1所述的治療患者的方法，其中所述癌症是腎癌。
如請求項1所述的治療患者的方法，其中所述癌症是生殖器官癌。
如請求項8所述的治療患者的方法，其中所述生殖器官癌是卵巢癌。
如請求項8所述的治療患者的方法，其中所述生殖器官癌是子宮內膜癌。
如請求項8所述的治療患者的方法，其中所述生殖器官癌是宮頸癌。
如請求項8所述的治療患者的方法，其中所述生殖器官癌是睾丸癌。
一種治療癌症的方法，所述方法包括：向患者施用有效量的基因工程化抗腫瘤人T細胞以治療所述患者的癌症，其中通過將編碼CAR的重組DNA序列摻入從所述患者中提取的T細胞中獲得了所述抗腫瘤人T細胞，其中所述編碼的CAR包含ALPP抗原結合結構域；其中所述CAR-T細胞抗原結合結構域由抗體或抗體片段組成；其中所述抗體具有選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3的可變重鏈區；以及選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的可變輕鏈區。
如請求項14所述的治療癌症的方法，其中所述抗體是具有可變重鏈區SEQ ID NO: 1和可變輕鏈區SEQ ID NO: 2的針對ALPP的鼠抗體。
如請求項14所述的治療癌症的方法，其中所述抗體是具有可變重鏈區SEQ ID NO: 3和可變輕鏈區SEQ ID NO: 4的針對ALPP的人源化抗體。
一種嵌合抗原受體，其包含：(a) 特異性地識別胎盤的鹼性磷酸酶(ALPP)的細胞外抗原結合結構域；(b) 跨膜結構域；和 (c) 細胞內信號傳導區。
如請求項17所述的嵌合抗原受體，其中所述抗原結合結構域包含重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL)。
如請求項18所述的嵌合抗原受體，其中所述VH包含重鏈互補決定區(CDR)1、2和3，並且所述VL包含VL CDR 1、2和3，其中所述VH CDR 1、2和3氨基酸序列以及所述VL CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一者： (1) 所述VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 45、46和47中列出，並且所述VL CDR 1、 2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 48、49和50中列出； (2) 所述VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 51、52和53中列出，並且所述VL CDR 1、 2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 54、55和56中列出； (3) 所述VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 57、58和59中列出，並且所述VL CDR 1、 2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 60、61和62中列出； (4) 所述VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 63、64和65中列出，並且所述VL CDR 1、 2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 66、67和68中列出；和 (5) 所述VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 81、82和83中列出，並且所述VL CDR 1、 2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 84、85和86中列出。
如請求項18或19所述的嵌合抗原受體，其中所述VH包含如下氨基酸序列或由其組成：所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11或13具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；並且所述VL包含如下氨基酸序列或由其組成：所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12或14具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。
如請求項20所述的嵌合抗原受體，其中所述VH包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 2具有至少90%同一性的氨基酸序列。
如請求項20所述的嵌合抗原受體，其中所述VH包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 4具有至少90%同一性的氨基酸序列。
如請求項20所述的嵌合抗原受體，其中所述VH包含與SEQ ID NO: 5具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 6具有至少90%同一性的氨基酸序列。
如請求項20所述的嵌合抗原受體，其中所述VH包含與SEQ ID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 8具有至少90%同一性的氨基酸序列。
如請求項20所述的嵌合抗原受體，其中所述VH包含與SEQ ID NO: 9具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 10具有至少90%同一性的氨基酸序列。
如請求項20所述的嵌合抗原受體，其中所述VH包含與SEQ ID NO: 11具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 12具有至少90%同一性的氨基酸序列。
如請求項20所述的嵌合抗原受體，其中所述VH包含與SEQ ID NO: 13具有至少90%同一性的氨基酸序列，並且所述VL包含與SEQ ID NO: 14具有至少90%同一性的氨基酸序列。
如請求項17-27中任一項所述的嵌合抗原受體，其中所述抗原結合結構域包含scFv。
如請求項17-28中任一項所述的嵌合抗原受體，其中所述VH區和所述VL區通過柔性接頭連接。
如請求項29所述的嵌合抗原受體，其中所述柔性接頭包含EKGRSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 37)的氨基酸序列。
如請求項29所述的嵌合抗原受體，其中所述柔性接頭包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 87)的氨基酸序列。
如請求項17-31中任一項所述的嵌合抗原受體，其中所述嵌合抗原受體還包含鉸鏈區。
如請求項32所述的嵌合抗原受體，其中所述鉸鏈區包含來自IgG、CD8或CD28的膜近端區。
如請求項33所述的嵌合抗原受體，其中所述鉸鏈區包含CD8膜近端區。
如請求項17-34中任一項所述的嵌合抗原受體，其中所述跨膜結構域包含CD4、CD8或CD28的跨膜區。
如請求項35所述的嵌合抗原受體，其中所述跨膜結構域包含CD8跨膜區。
如請求項34或36所述的嵌合抗原受體，其中所述鉸鏈區和/或所述跨膜區來自人CD8。
如請求項17-37中任一項所述的嵌合抗原受體，其中所述嵌合抗原受體包含在SEQ ID NO: 38中列出的氨基酸序列、或與SEQ ID NO: 38為至少90%相同的氨基酸序列。
如請求項17-38中任一項所述的嵌合抗原受體，其中所述細胞內信號傳導區包含活化的細胞質信號傳導結構域。
如請求項39所述的嵌合抗原受體，其中所述活化的細胞質信號傳導結構域能夠在T細胞中誘導初級活化信號，是T細胞受體(TCR)組分，和/或包含基於免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。
如請求項17-40所述的嵌合抗原受體，其中所述細胞內信號傳導區是或包含CD3ζ的功能性信號傳導結構域。
如請求項41所述的嵌合抗原受體，其中所述CD3ζ是人CD3ζ。
如請求項42所述的嵌合抗原受體，其中所述細胞內信號傳導區是或包含在SEQ ID NO: 40中列出的氨基酸序列、或與SEQ ID NO: 40為至少90%序列相同的氨基酸序列。
如請求項17-43中任一項所述的嵌合抗原受體，其中所述細胞內信號傳導區還包含共刺激信號傳導區。
如請求項44所述的嵌合抗原受體，其中所述共刺激信號傳導區位於所述跨膜結構域與所述細胞內信號傳導區之間。
如請求項44或45所述的嵌合抗原受體，其中所述共刺激信號傳導區包含來自蛋白質的功能性信號傳導結構域，所述蛋白質選自由以下組成的組：MHC I類分子、TNF受體蛋白質、免疫球蛋白樣蛋白質、細胞因子受體、整聯蛋白、信號傳導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化的NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、CD11a/CD18、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD 11b、ITGAX、CD 11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(觸覺)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp和CD19a。
如請求項46所述的嵌合抗原受體，其中所述共刺激信號傳導區是或包含來自OX40、CD28、4-1BB、ICOS的功能性信號傳導結構域或其信號傳導部分。
如請求項47所述的嵌合抗原受體，其中所述共刺激信號傳導區包含4-1BB的細胞內信號傳導結構域。
如請求項48所述的嵌合抗原受體，其中所述4-1BB是人4-1BB。
如請求項49所述的嵌合抗原受體，其中所述共刺激信號傳導區是或包含在SEQ ID NO: 39中列出的氨基酸序列、或與SEQ ID NO: 39為至少90%相同的氨基酸序列。
如請求項47所述的嵌合抗原受體，其中所述共刺激信號傳導區包含CD28和4-1BB的細胞內信號傳導結構域。
如請求項50所述的嵌合抗原受體，其中所述CD28是人CD28，並且所述4-1BB是人4-1BB。
如請求項52所述的嵌合抗原受體，其中所述共刺激信號傳導區是或包含在SEQ ID NO: 90中列出的氨基酸序列、或與SEQ ID NO: 90為至少90%相同的氨基酸序列。
一種嵌合抗原受體，其包含與SEQ ID NO: 18、20、22、24、26、28、30、91、92或93具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。
如請求項54所述的嵌合抗原受體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 18為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
如請求項54所述的嵌合抗原受體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 20為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
如請求項54所述的嵌合抗原受體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 22為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
如請求項54所述的嵌合抗原受體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 24為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
如請求項54所述的嵌合抗原受體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 26為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
如請求項51所述的嵌合抗原受體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 28為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
如請求項54所述的嵌合抗原受體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 30為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
如請求項54所述的嵌合抗原受體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 91為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
如請求項54所述的嵌合抗原受體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 92為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
如請求項54所述的嵌合抗原受體，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO: 93為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
一種多核苷酸，其編碼如請求項17-64中任一項所述的嵌合抗原受體。
一種載體，其包含如請求項65所述的多核苷酸。
如請求項66所述的載體，其中所述載體還包含編碼抗PD-1抗體或其抗原結合片段的核酸。
如請求項66所述的載體，其中所述載體還包含編碼抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的核酸。
如請求項66-68中任一項所述的載體，其中所述載體是病毒載體。
如請求項69所述的載體，其中所述病毒載體是逆轉錄病毒載體或慢病毒載體。
一種工程化細胞，其包含如請求項17-64中任一項所述的嵌合抗原受體。
一種工程化細胞，其包含如請求項65所述的多核苷酸或如請求項66-70中任一項所述的載體。
如請求項71或72所述的工程化細胞，其中所述工程化細胞是從受試者(例如人受試者)獲得的原代細胞。
如請求項71或72所述的工程化細胞，其中所述工程化細胞是細胞系。
如請求項71-74中任一項所述的工程化細胞，其中所述工程化細胞是免疫細胞。
如請求項75所述的工程化細胞，其中所述免疫細胞是NK細胞或T細胞。
如請求項71-76中任一項所述的工程化細胞，其中所述工程化細胞是T細胞。
如請求項77所述的工程化細胞，其中所述T細胞是CD8+。
如請求項77所述的工程化細胞，其中所述T細胞是CD4+。
如請求項76-79中任一項所述的工程化細胞，其中所述T細胞是從人受試者分離的。
如請求項71-80中任一項所述的工程化細胞，其中所述工程化細胞表達所述嵌合抗原受體。
如請求項71-81中任一項所述的工程化細胞，其中所述工程化細胞表達細胞因子和/或共刺激配體。
如請求項82所述的工程化細胞，其中所述細胞因子和/或所述共刺激配體是膜拴系的。
如請求項82所述的工程化細胞，其中所述細胞因子和/或共刺激配體是分泌的。
如請求項82-84中任一項所述的工程化細胞，其中所述細胞因子是IL-2、IL-5或IL-12。
如請求項82-84中任一項所述的工程化細胞，其中所述共刺激配體是CD40L(CD154)或41-BBL(CD137L)。
如請求項71-86中任一項所述的工程化細胞，其中所述工程化細胞表達抗體或其抗原結合片段(例如scFv)。
如請求項87中任一項所述的工程化細胞，其中所述抗體或其抗原結合片段是免疫檢查點抑制劑。
如請求項88所述的工程化細胞，其中所述抗體或其抗原結合片段特異性地結合PD-1、PD-L1或CTLA-4。
一種生產工程化細胞的方法，所述方法包括將如請求項66-70所述的載體體外或離體引入細胞中。
如請求項90所述的方法，其中所述載體是病毒載體，並且所述引入通過轉導進行。
一種產生細胞群的方法，所述方法包括將核酸引入細胞中，其中所述核酸包含如請求項65所述的多核苷酸或編碼如請求項17-64中任一項所述的嵌合抗原受體的核酸。
一種治療受試者中的ALPP相關的疾病或障礙的方法，所述方法包括向所述受試者施用如請求項71-89中任一項所述的工程化細胞。
如請求項93所述的方法，其中所述ALPP相關的疾病或障礙是癌症。
如請求項94所述的方法，其中所述癌症是睾丸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、宮頸癌、尿路上皮癌、胰腺癌、肝癌或胃癌。
如請求項93-95中任一項所述的方法，其中所述方法還包括向所述受試者施用檢查點抑制劑。
如請求項96所述的方法，其中所述檢查點抑制劑是抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、或抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段。
一種抗ALPP抗體或其抗原結合片段，所述抗ALPP抗體或其抗原結合片段包含：包含互補決定區(CDR)1、2和3的重鏈可變區(VH)，其中所述VH CDR1區包含與選擇的VH CDR1氨基酸序列為至少80%相同的氨基酸序列，所述VH CDR2區包含與選擇的VH CDR2氨基酸序列為至少80%相同的氨基酸序列，並且所述VH CDR3區包含與選擇的VH CDR3氨基酸序列為至少80%相同的氨基酸序列；以及包含CDR 1、2和3的輕鏈可變區(VL)，其中所述VL CDR1區包含與選擇的VL CDR1氨基酸序列為至少80%相同的氨基酸序列，所述VL CDR2區包含與選擇的VL CDR2氨基酸序列為至少80%相同的氨基酸序列，並且所述VL CDR3區包含與選擇的VL CDR3氨基酸序列為至少80%相同的氨基酸序列，其中所述選擇的VH CDR 1、2和3氨基酸序列以及所述選擇的VL CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一者： (1) 所述選擇的VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 51、52和53中列出，並且所述選擇的VL CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 54、55和56中列出； (2) 所述選擇的VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 57、58和59中列出，並且所述選擇的VL CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 60、61和62中列出； (3) 所述選擇的VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 63、64和65中列出，並且所述選擇的VL CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 66、67和68中列出；和 (4) 所述選擇的VH CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 81、82和83中列出，並且所述選擇的VL CDR 1、2和3氨基酸序列分別在SEQ ID NO: 84、85和86中列出。
一種與ALPP結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區(VH)，所述VH包含與選擇的VH序列為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列，以及輕鏈可變區(VL)，所述VL包含與選擇的VL序列為至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列，其中所述選擇的VH序列選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11和13，並且所述選擇的VL序列選自SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12和14。
如請求項98或99所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段特異性地結合人ALPP。
如請求項98-100中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是人源化抗體或其抗原結合片段。
如請求項98-101中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是單鏈可變片段(scFv)。
一種抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含如請求項98-102中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的所述VH CDR 1、2和3以及所述VL CDR 1、2和3。
一種嵌合抗原受體，其包含如請求項98-103中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的所述VH CDR 1、2和3以及所述VL CDR 1、2和3。