TW202142561A - 抗ｈｐｖ ｔ細胞受體和工程化細胞 - Google Patents

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保羅 拜森
李思
吳海洋
周杰
蘇震波
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Abstract

本公開涉及識別或結合人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原的T細胞受體、基因工程化細胞和基於細胞的療法。

Description

抗HPV　T細胞受體和工程化細胞
對優先權的要求
本申請要求於2020年2月5日提交的國際申請號PCT/CN2020/074366的權益。將前述申請的全部內容以引用方式併入本文。 發明領域
本公開涉及識別或結合癌症抗原的T細胞受體、工程化細胞和基於細胞的療法。
發明背景
癌症是由生物學和環境因素(諸如年齡、性別、基因突變、環境暴露(諸如UV輻射)、職業危險因素、致癌物、石棉、放射性物質和病毒感染(例如，HPV、EBV、HBV、HCV、HTLV-1和KSHV))引起的最廣泛的細胞異常之一(Margaret E等人, “Viruses Associated With Human Cancer,” Biochimica et Biophysica Acta.1782:127–150 (2008))。特別地，一些癌症(例如，宮頸癌)主要是由病毒(例如，人乳頭狀瘤病毒，HPV)感染引起的(Stanley等人, “HPV: From Infection To Cancer.” Biochemical Society Transactions: 35: 第6部分(2007))。
儘管諸如化學療法等治療取得了進步，但是針對包括HPV相關癌在內的各種癌症治療的功效相對較差。因此，對於針對癌症的有效療法存在未滿足的需求。
發明概要
本公開涉及識別或結合腫瘤抗原人乳頭狀瘤病毒(HPV)E6的T細胞受體、基因工程化細胞以及用於治療HPV相關癌症的細胞療法。
在一個方面，本公開涉及T細胞受體(TCR)或其抗原結合片段，所述TCR或其抗原結合片段包含含有可變α(Va)區的α鏈和含有可變β(Vb)區的β鏈。在一些實施方案中，所述Va區包含互補決定區1(CDR-1)、互補決定區2(CDR-2)和互補決定區3(CDR-3)；在一些實施方案中，所述Va區CDR-1包含與選擇的Va區CDR-1胺基酸序列相同的胺基酸序列，所述Va區CDR-2包含與選擇的Va區CDR-2胺基酸序列相同的胺基酸序列，並且所述Va區CDR-3包含與選擇的Va區CDR-3胺基酸序列相同的胺基酸序列；並且在一些實施方案中，所述Vb區包含互補決定區1(CDR-1)、互補決定區2(CDR-2)和互補決定區3(CDR-3)；在一些實施方案中，所述Vb區CDR-1包含與選擇的Vb區CDR-1胺基酸序列相同的胺基酸序列，所述Vb區CDR-2包含與選擇的Vb區CDR-2胺基酸序列相同的胺基酸序列，並且所述Vb區CDR-3包含與選擇的Vb區CDR-3胺基酸序列相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述選擇的Va區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列和所述選擇的Vb區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列是以下中的一者： (1) 所述選擇的Va區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 5、6和7中列出，並且所述選擇的Vb區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 8、9和10中列出； (2) 所述選擇的Va區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 27、28和29中列出，並且所述選擇的Vb區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 30、31和32中列出； (3) 所述選擇的Va區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 33、34和35中列出，並且所述選擇的Vb區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 36、37和38中列出； (4) 所述選擇的Va區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 39、40和41中列出，並且所述選擇的Vb區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 42、43和44中列出。
在一些實施方案中，所述Va區包含具有分別在SEQ ID NO: 5、6和7中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3；並且所述Vb區包含具有分別在SEQ ID NO: 8、9和10中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3。
在一些實施方案中，所述Va區包含在SEQ ID NO: 1中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且所述Vb區包含在SEQ ID NO: 2中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述Va區包含具有分別在SEQ ID NO: 27、28和29中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3；並且所述Vb區包含具有分別在SEQ ID NO: 30、31和32中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3。
在一些實施方案中，所述Va區包含在SEQ ID NO: 45中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且所述Vb區包含在SEQ ID NO: 46中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述Va區包含具有分別在SEQ ID NO: 33、34和35中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3；並且所述Vb區包含具有分別在SEQ ID NO: 36、37和38中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3。
在一些實施方案中，所述Va區包含在SEQ ID NO: 47中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且所述Vb區包含在SEQ ID NO: 48中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述Va區包含具有分別在SEQ ID NO: 39、40和41中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3；並且所述Vb區包含具有分別在SEQ ID NO: 42、43和44中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3。
在一些實施方案中，所述Va區包含在SEQ ID NO: 49中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且所述Vb區包含在SEQ ID NO: 50中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述α鏈包含小鼠α鏈恆定區，並且所述β鏈包含小鼠β鏈恆定區。
在一些實施方案中，所述α鏈包含在SEQ ID NO: 15中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且所述β鏈包含在SEQ ID NO: 16中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述α鏈包含在SEQ ID NO: 51中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且所述β鏈包含在SEQ ID NO: 52中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述α鏈包含在SEQ ID NO: 53中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且所述β鏈包含在SEQ ID NO: 54中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述α鏈包含在SEQ ID NO: 55中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且所述β鏈包含在SEQ ID NO: 56中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，TCR或其抗原結合片段結合或識別由主要組織相容性複合物(MHC)分子呈遞的E6肽表位(SEQ ID NO: 19)。
在一些實施方案中，MHC分子是HLA-A2分子。
在一些實施方案中，TCR或其抗原結合片段當在T細胞表面上表現時刺激針對靶癌細胞的細胞毒性活性。
在一些實施方案中，靶癌細胞包含HPV DNA序列或表現E6。
在一個方面，本公開涉及T細胞受體(TCR)或其抗原結合片段，所述TCR或其抗原結合片段包含含有可變α(Va)區的α鏈和含有可變β(Vb)區的β鏈；在一些實施方案中，所述Va區包含互補決定區1(CDR1)、互補決定區2(CDR2)和互補決定區3(CDR3)，並且所述Vb區包含CDR1、CDR2和CDR3；在一些實施方案中， (1) 所述Va區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 1中的互補決定區1、2和3相同，並且所述Vb區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 2中的互補決定區1、2和3相同； (2) 所述Va區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 1中的互補決定區45、2和3相同，並且所述Vb區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 2中的互補決定區1、46和3相同； (3) 所述Va區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 47中的互補決定區1、2和3相同，並且所述Vb區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 48中的互補決定區1、2和3相同；或 (4) 所述Va區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 49中的互補決定區1、2和3相同，並且所述Vb區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 50中的互補決定區1、2和3相同。
在一個方面，本公開涉及載體，所述載體包含編碼如本文所述的TCR或其抗原結合片段的核酸。
在一些實施方案中，所述載體是表現載體、病毒載體、反轉錄病毒載體或慢病毒載體。
在一個方面，本公開涉及載體，所述載體包括：a) 編碼包含人抗E6 TCR的α鏈可變區和α鏈恆定區的TCR α鏈的第一核酸序列；和 b) 編碼包含人抗E6 TCR的β鏈可變區和β鏈恆定區的TCR β鏈的第二核酸序列。
在一些實施方案中，所述α鏈恆定區是人TCR α鏈恆定區，並且所述β鏈恆定區是人TCR β鏈恆定區。
在一些實施方案中，所述α鏈恆定區是小鼠TCR α鏈恆定區，並且所述β鏈恆定區是小鼠TCR β鏈恆定區。
在一些實施方案中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過連接子序列連接。在一些實施方案中，所述連接子序列是P2A序列。
在一些實施方案中，所述第一核酸序列包含在SEQ ID NO: 17中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列；並且所述第二核酸序列包含在SEQ ID NO: 18中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列。在一些實施方案中，所述第一核酸序列包含在SEQ ID NO: 57中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核酸序列；所述第二核酸序列包含在SEQ ID NO: 58中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列；在一些實施方案中，所述第一核酸序列包含在SEQ ID NO: 59中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列；所述第二核酸序列包含在SEQ ID NO: 60中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列。在一些實施方案中，所述第一核酸序列包含在SEQ ID NO: 61中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列；並且所述第二核酸序列包含在SEQ ID NO: 62中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列。
在一些實施方案中，如本文所述的載體還包括編碼檢查點抑制劑的第三核酸序列。
在一些實施方案中，所述檢查點抑制劑是抗體。
在一些實施方案中，所述檢查點抑制劑是抗PD-1抗體scFv或抗CTLA4抗體scFv。
在一些實施方案中，所述抗體包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含與SEQ ID NO: 11為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；所述輕鏈可變結構域包含與SEQ ID NO: 12為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述第三核酸序列包含與SEQ ID NO: 13為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列；以及與SEQ ID NO: 14為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列。
在一些實施方案中，所述載體是表現載體、病毒載體、反轉錄病毒載體或慢病毒載體。在一些實施方案中，反轉錄病毒載體是pMP71。
在一些實施方案中，所述載體包含 (1) 與SEQ ID NO: 20為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列；(2) 與SEQ ID NO: 63為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列；(3) 與SEQ ID NO: 64為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列；或 (4) 與SEQ ID NO: 65為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列。
在一個方面，本公開涉及包含如本文所述的載體的工程化細胞。
在一個方面，本公開涉及包含如本文所述的TCR或其抗原結合片段的工程化細胞。
在一些實施方案中，所述TCR或其抗原結合片段與細胞異源。
在一些實施方案中，工程化細胞是細胞系。
在一些實施方案中，工程化細胞是從受試者(例如人受試者)獲得的初代細胞。
在一些實施方案中，工程化細胞是T細胞。在一些實施方案中，T細胞是從人受試者中分離的。在一些實施方案中，T細胞是CD8+的。在一些實施方案中，T細胞是CD4+的。
在一個方面，本公開涉及用於生產工程化細胞的方法，所述方法包括將如本文所述的載體在體外或離體引入細胞中。
在一些實施方案中，載體是病毒載體，並且所述引入通過轉導來進行。
在一個方面，本公開涉及治療疾病或障礙的方法，所述方法包括將如本文所述的工程化細胞施用至患有與HPV相關的疾病或障礙的受試者。
在一些實施方案中，與HPV相關的疾病或障礙是癌症。在一些實施方案中，所述癌症是頭頸癌、子宮頸癌、口咽癌、肛門癌、肛管癌、直腸肛門癌、陰道癌、外陰癌或陰莖癌。
在一個方面，本公開涉及治療受試者的腫瘤的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用 (a) 工程化T細胞，所述工程化T細胞包含：編碼與HPV抗原特異性地結合的TCR或其抗原結合片段的核酸；和 (b) 檢查點抑制劑。
在一些實施方案中，所述腫瘤是HPV誘發的腫瘤。
在一個方面，本公開涉及TCR或其抗原結合片段，所述TCR或其抗原結合片段與如本文所述的TCR或其抗原結合片段交叉競爭。
在一個方面，本公開提供了向患者施用有效量的基因工程化抗癌人T細胞以治療所述患者的疾病、障礙或病症的方法，其中所述基因工程化抗癌人T細胞表現針對HPV E6抗原的抗腫瘤T細胞受體。在一些實施方案中，抗腫瘤T細胞受體的α鏈由SEQ ID NO: 3的核苷酸序列編碼，並且β鏈由SEQ ID NO: 4的核苷酸序列編碼 。在一些實施方案中，抗腫瘤T細胞受體的α鏈由SEQ ID NO: 78的核苷酸序列編碼，並且β鏈由SEQ ID NO: 79的核苷酸序列編碼 。在一些實施方案中，抗腫瘤T細胞受體的α鏈由SEQ ID NO: 80的核苷酸序列編碼，並且β鏈由SEQ ID NO: 81的核苷酸序列編碼 。在一些實施方案中，抗腫瘤T細胞受體的α鏈由SEQ ID NO: 82的核苷酸序列編碼，並且β鏈由SEQ ID NO: 83的核苷酸序列編碼 。在一些實施方案中，抗腫瘤T細胞受體的α鏈具有包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的可變α(Vα)區，並且抗腫瘤人T細胞受體的β鏈具有包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的可變β(Vβ)區 。在一些實施方案中，抗腫瘤T細胞受體的α鏈具有包含SEQ ID NO: 45的胺基酸序列的可變α(Vα)區，並且抗腫瘤人T細胞受體的β鏈具有包含SEQ ID NO: 46的胺基酸序列的可變β(Vβ)區 。在一些實施方案中，抗腫瘤T細胞受體的α鏈具有包含SEQ ID NO: 47的胺基酸序列的可變α(Vα)區，並且抗腫瘤人T細胞受體的β鏈具有包含SEQ ID NO: 48的胺基酸序列的可變β(Vβ)區 。在一些實施方案中，抗腫瘤T細胞受體的α鏈具有包含SEQ ID NO: 49的胺基酸序列的可變α(Vα)區，並且抗腫瘤人T細胞受體的β鏈具有包含SEQ ID NO: 50的胺基酸序列的可變β(Vβ)區 。所述疾病、障礙或病症可以是癌症相關的，所述癌症諸如宮頸癌、頭頸癌、口咽癌、肛門癌、陰莖癌、陰道癌和外陰癌。
在一個方面，本公開還提供了T細胞受體。在一些情形下，抗腫瘤人T細胞受體的α鏈具有可變α(Vα)區的序列(SEQ ID NO: 1)，並且抗腫瘤人T細胞受體的β鏈具有可變β(Vβ)區的序列(SEQ ID NO: 2)。在一些情形下，抗腫瘤人T細胞受體的α鏈具有可變α(Vα)區的序列(SEQ ID NO: 45)，並且抗腫瘤人T細胞受體的β鏈具有可變β(Vβ)區的序列(SEQ ID NO: 46)。在一些情形下，抗腫瘤人T細胞受體的α鏈具有可變α(Vα)區的序列(SEQ ID NO: 47)，並且抗腫瘤人T細胞受體的β鏈具有可變β(Vβ)區的序列(SEQ ID NO: 48)。在一些情形下，抗腫瘤人T細胞受體的α鏈具有可變α(Vα)區的序列(SEQ ID NO: 49)，並且抗腫瘤人T細胞受體的β鏈具有可變β(Vβ)區的序列(SEQ ID NO: 50)。在一些情形下，抗腫瘤人T細胞受體的可變α(Vα)區與小鼠T細胞受體α鏈的恆定區融合。在一些情形下，抗腫瘤人T細胞受體的可變β(Vβ)區與小鼠T細胞受體β鏈的恆定區融合。
在一個方面，本公開提供了工程化T細胞，所述工程化T細胞包含編碼與人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原E6特異性地結合的基因工程化抗原受體的核酸。
在一個方面，本公開還提供了用於患者特異性T細胞療法的方法，其中將基因進行工程化成患者特異性T細胞並作為治療劑遞送回患者體內。
本公開還提供了診斷疾病/病症的方法，其中所述病症可以包括癌症，並且其中可以通過分析由於T細胞受體與來自待診斷患者/哺乳動物的樣品之間的接觸而形成的複合物來診斷所述疾病，並且其中所述複合物可以通過本領域熟知的任何手段來檢測。在一些實施方案中，所述結果可以用於確定細胞療法是否將是有效的。
本公開還提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含對人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原E6具有抗原特異性的工程化T細胞受體(TCR)或其抗原結合片段以及藥學上可接受的載體。
本公開還提供了用於用嵌合基因轉染細胞的載體系統，其中所述載體系統包括編碼人抗E6 TCR的α鏈的可變區的核酸序列、編碼同一人抗E6 TCR的β鏈的可變區的核酸序列和一個連接子序列。
如本文所用，術語“約”是指可測量的值，諸如量、持續時間等，並且涵蓋指定值的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或±0.1%的變化。
如本文所用，術語“HPV抗原”是指源自人乳頭狀瘤病毒(HPV)的多肽分子。在一些實施方案中，所述HPV是HPV1、HPV2、HPV3、HPV4、HPV6、HPV10、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV27、HPV28、HPV29、HPV30、HPV31、HPV33、HPV34、HPV35、HPV39、HPV40、HPV41、HPV42、HPV43、HPV45、HPV49、HPV51、HPV52、HPV54、HPV55、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59、HPV68、或HPV69。特別地，HPV可以是高風險HPV，例如，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68或HPV69。在一些實施方案中，HPV多肽分子選自E6。
如本文所用，術語“周邊血液細胞”是指通常在周邊血液中發現的細胞，包括但不限於嗜酸性白血球、嗜中性白血球、T細胞、單核細胞、K細胞、顆粒性白細胞和B細胞。
如本文所用，術語“基因工程化細胞”或“遺傳修飾的細胞”是指在細胞中具有核酸序列的修飾的細胞，包括但不限於在其基因組中具有一個或多個核苷酸的插入、缺失、取代、或修飾的細胞、和具有外源核酸序列(例如載體)的細胞，其中所述外源核酸序列不一定整合到基因組中。
如本文所用，術語“癌症”或“癌細胞”是指以不受控制的方式分裂的細胞。此類細胞的實例包括具有以迅速增殖的細胞生長為特徵的異常狀態或狀況的細胞。所述術語意在包括癌性生長(例如腫瘤)、致癌過程、轉移性組織、以及惡性轉化的細胞、組織或器官，而不管組織病理類型或浸潤期。癌細胞可以在血液中形成實體瘤或過多的腫瘤細胞(例如血液癌)。另選地或另外地，其可以包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉移性組織或惡性轉化的細胞、組織或器官，而不管組織病理類型或浸潤期。實體瘤的實例包括各種器官系統的惡性腫瘤(例如肉瘤)、腺癌和癌，諸如累及肝、肺、乳腺、淋巴、胃腸道(例如結腸)、泌尿生殖道(例如腎、尿路上皮細胞)、前列腺和咽的那些。腺癌包括惡性腫瘤，諸如大多數結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、肺非小細胞癌、小腸癌和食管癌。可以通過本文所述的方法治療的癌症的實例包括例如骨癌、胰腺癌、皮膚癌(例如黑素瘤)、頭或頸癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌、睾丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性髓樣白血病、慢性髓樣白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病)、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅生物、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、和/或T細胞淋巴瘤。
如本文所用，術語“HPV相關的癌症”是指與HPV感染相關或由HPV感染引起的癌症。
如本文所用，術語“載體”是指可以通過其將多核苷酸序列(例如外來基因)引入宿主細胞中以便獲得所引入的核苷酸序列的所需基因表現的運載體。選殖載體可以包括例如質體、噬菌體、病毒等。載體的最流行類型是“質體”，其是指可以將包含目的基因的額外DNA區段連接到其中的閉合環狀雙鏈DNA環。載體的另一種類型是將要運輸的核酸構建體連接到病毒基因組中的病毒載體。病毒載體能夠在它們被引入的宿主細胞中自主複製，或者可以將它們自身整合到宿主細胞的基因組中，從而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導與它們可操作地連接的基因的表現。此類載體在本文中被稱為“重組表現載體”或簡稱為“表現載體”。在一些實施方案中，載體是病毒載體(例如複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。
如本文所用，“受試者”是哺乳動物，諸如人或非人動物。在一些實施方案中，向其施用細胞、細胞群或組合物的受試者(例如患者)是哺乳動物，通常是靈長類動物，諸如人。在一些實施方案中，靈長類動物是猴子或猿。受試者可以是男性或女性，並且可以是任何合適的年齡，包括嬰兒、少年、青少年、成年和老年受試者。在一些實施方案中，受試者是非靈長類哺乳動物，諸如狗、貓、馬、齧齒動物、大鼠或小鼠。
除非另有定義，否則本文所用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。本文描述了用於在本發明中使用的方法和材料，也可以使用本領域已知的其他合適的方法和材料。材料、方法和實例僅僅是說明性的，而不意圖進行限制。本文提及的全部出版物、專利申請、專利、序列、資料庫條目和其他參考文獻均全文以引用方式併入。在發生衝突的情況下，以本說明書(包括定義)為準。
根據以下具體實施方式和附圖以及根據申請專利範圍，本發明的其他特徵和優點將顯而易見。
較佳實施例之詳細說明
人乳頭狀瘤病毒(HPV)是小的(大約8000對鹼基)雙鏈DNA病毒，其感染鱗狀上皮並誘發增生性病變，諸如皮膚疣(Xavier, “Natural History And Epidemiology Of Hpv Infection And Cervical Cancer”. Gynecologic Oncology 110 (2008) S4–S7；Hausen等人, "Human Papilloma Viruses." Annu. Rev. Microbial. 1994. 48;427-47)。HPV具有良好保守的遺傳組織，並且所有潛在的開放閱讀框(ORF)都位於一條DNA鏈中，所述DNA鏈的閱讀框被指定為早期(E)或晚期(L)基因。早期基因(E1-E8)在感染後立即被活化，而晚期基因則編碼在上皮顆粒層中表現的結構蛋白。早期基因的基因產物參與控制病毒DNA的複製和表現(Mannarini等人.“Human Papilloma Virus (HPV) In Head And Neck Region: Review Of Literature”. Acta Otorhinolaryngol Ital 2009;29:119-126)。
嵌合抗原受體(CAR)T細胞是具有融合了細胞內T細胞訊息傳導和共刺激結構域的細胞外抗原識別結構域的工程化細胞。CAR能以獨立于主要組織相容性類別(MHC)的方式直接地和選擇性地識別細胞表面腫瘤相關抗原(TAA)。儘管已記錄CAR T細胞療法在血液系統惡性腫瘤患者中取得了成功，但在實體瘤中僅觀察到適度的反應。這可以部分歸因於在實體瘤中免疫抑制性微環境的建立。這種環境涉及由T細胞中的與其在腫瘤內的相關配體反應的抑制性受體(IR)的表現增加介導的幾種內在抑制途徑的上調(Ping等人, "T-cell receptor-engineered T cells for cancer treatment: current status and future directions." Protein & cell 9.3 (2018): 254-266.)。
過繼細胞轉移(ACT)是已在治療血液系統惡性腫瘤和惡性黑色素瘤方面表現出顯著成功的一種癌症免疫療法形式。ACT的一種特別有效的形式(其使用表現嵌合抗原受體(CAR)的基因修飾的T細胞來特異性地靶向腫瘤相關抗原(TAA)，諸如CD19和GD2)已經在治療諸如B細胞惡性腫瘤和神經母細胞瘤等疾病的臨床試驗中顯示出令人鼓舞的結果(Simon等人, "CAR-T cell therapy in melanoma: A future success story?." Experimental dermatology 27.12 (2018): 1315-1321)。多年來，使用經修飾的TCR來治療不同疾病已實現顯著的成果，並且已成為許多研究的重點領域。
本公開提供了可以用於細胞療法的T細胞受體(TCR)工程化T細胞。工程化T細胞受體能夠識別在細胞受體上的表面抗原，其原本不被正常的T細胞識別。工程化T細胞可以用於針對多種靶標，諸如表現適當抗原的癌細胞。
理論上，T細胞受體可以對任何HPV抗原具有抗原特異性。HPV中的E6和E7癌蛋白對於細胞的惡性轉化是必需的。HPV E7蛋白主要通過滅活視網膜母細胞瘤蛋白來促進癌症的發展，從而導致組成型癌細胞週期活化。在一些實施方案中，經修飾的T細胞能夠以MHC依賴性方式識別HPV的表位(例如，HPV的高風險血清型(諸如HPV-16)的HLA-A 02:01-限制性表位)。在這種情況下，HPV抗原陽性腫瘤細胞可以被工程化TCR-T細胞殺死。T 細胞受體和結合分子
T細胞是通常在胸腺中發育並在免疫反應中發揮主要作用的一種淋巴細胞類型。其在“適應性免疫反應”中起重要作用。通過在細胞表面上T細胞受體的存在，可以將T細胞與其他淋巴細胞區分開。分化的T細胞在控制免疫反應中具有重要作用。CD8+ T細胞(也稱為“殺傷細胞”)具有細胞毒性。一旦它們識別出靶細胞，它們便能夠直接殺死靶細胞(例如，病毒感染的細胞或癌細胞)。CD8+ T細胞還可以產生細胞介素並募集其他細胞(例如，巨噬細胞和自然殺傷(NK)細胞)以活化免疫反應。CD4+ T細胞(也稱為“輔助細胞”)可以例如通過促進B細胞成熟為漿細胞和記憶B細胞以及活化細胞毒性T細胞和巨噬細胞而間接地殺死靶細胞。當輔助T細胞被MHC II類分子與肽抗原一起呈遞時，它們變成活化的，所述MHC II類分子在抗原呈遞細胞(APC)的表面上表現。一旦活化，它們便迅速地分裂並分泌調節或協助免疫反應的細胞介素。調節性T細胞對於耐受性很重要，從而阻止或抑制自身免疫反應。調節性T細胞的主要作用是在免疫反應結束時關閉T細胞介導的免疫力，並抑制逃避在胸腺中的負選擇過程的自身反應性T細胞。
T細胞在癌症免疫力方面起重要作用，其中來自癌細胞的抗原被吸收並呈遞到被稱為抗原呈遞細胞(APC)的特殊免疫細胞的細胞表面上，從而使其他免疫細胞可以識別所關注的抗原。在淋巴結中，APC活化T細胞並活化它們以識別腫瘤細胞。然後，活化的T細胞可以穿過血管到達腫瘤，使其浸潤，識別癌細胞並殺死它們。
T細胞的活化需要T細胞受體。“T細胞受體”或“TCR”是含有可變a(或α)鏈和b(或β)鏈(分別稱為TCRα和TCRβ)或可變g(或γ)鏈和d(或δ)鏈(也分別稱為TCRγ和TCRδ)或其抗原結合部分並且能夠特異性地結合抗原(例如，與主要組織相容性複合物(MHC)分子結合的肽抗原或肽表位)的一種分子。
本公開提供了T細胞受體(TCR)或其抗原結合片段、以及衍生自TCR的結合分子。在一些實施方案中，TCR呈ab形式。以αβ和γδ形式存在的TCR通常在結構上相似，但是表現它們的T細胞可能具有獨特的解剖位置或功能。通常，TCR發現於T細胞(或T淋巴細胞)的表面，在此處其通常負責識別抗原(諸如與主要組織相容性複合物(MHC)分子結合的肽)。
在一些實施方案中，TCR是完整或全長TCR，諸如含有a鏈和b鏈的TCR。在一些實施方案中，TCR是小於全長TCR但與結合在MHC分子中的特定肽結合(諸如與MHC-肽複合物結合)的抗原結合部分。在一些情況下，TCR的抗原結合部分或片段可以僅含有全長或完整TCR的結構性結構域的一部分，但仍能夠結合完整TCR所結合的肽表位(諸如MHC-肽複合物)。在一些情況下，抗原結合部分含有TCR的可變結構域(諸如TCR的可變a(Va或Vα)鏈和可變b(Vb或Vβ)鏈)、或其足以形成用於與特定的MHC-肽複合物結合的結合位點的抗原結合片段。
TCR的可變結構域含有互補決定區(CDR)，其通常是抗原識別以及肽、MHC和/或MHC-肽複合物的結合能力和特異性的主要貢獻者。在一些實施方案中，TCR的CDR或其組合形成給定TCR分子的全部或基本上全部抗原結合位點。在TCR鏈的可變區內的各種CDR通常被框架區(FR)隔開，所述框架區與CDR相比在TCR分子之間通常顯示出較小的變異性。在一些實施方案中，CDR3是負責抗原結合或特異性的主要CDR，或者在給定TCR可變區上的三個CDR中對於抗原識別和/或對於與肽-MHC複合物的加工過的肽部分相互作用而言是最重要的。在一些情境下，α鏈的CDR1可以與某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情況下，β鏈的CDR1可以與肽的C末端部分相互作用。在一些情境下，CDR2最有力地促進了與MHC-肽複合物的MHC部分的相互作用或對MHC-肽複合物的MHC部分的識別，或者是負責與MHC-肽複合物的MHC部分相互作用或識別MHC-肽複合物的MHC部分的主要CDR。
TCR的a鏈和/或b鏈還可以含有恆定結構域、跨膜結構域和/或短細胞質尾巴。在一些方面，TCR的每條鏈(例如α或β)可以擁有一個N末端免疫球蛋白可變結構域、一個免疫球蛋白恆定結構域、跨膜區和在C末端的短細胞質尾巴。在一些實施方案中，TCR例如經由細胞質尾巴與參與介導訊息轉導的CD3複合物的不變蛋白質相關。在一些情況下，所述結構允許TCR與其他分子如CD3及其亞基締合。例如，包含具有跨膜區的恆定結構域的TCR可以將蛋白質錨定在細胞膜中，並與CD3訊息傳導裝置或複合物的不變亞基締合。CD3訊息傳導亞基(例如CD3γ、CD3δ、CD3e和CD3z鏈)的細胞內尾巴含有一個或多個基於免疫受體酪胺酸的活化基序或ITAM，並且通常參與TCR複合物的訊息傳導能力。
結構域或區域的確切位點可以根據用於描述特定結構域的特定結構或同源性建模或其他特徵而有所不同。應當理解，提及胺基酸(包括用於描述TCR的結構域組織的以SEQ ID NO列出的特定序列)是出於說明性目的，並不意味著限制所提供的實施方案的範圍。在一些情況下，特定結構域(例如可變或恆定)可以是更長或更短的幾個胺基酸(諸如一個、兩個、三個或四個)。在一些方面，TCR的殘基是已知的或可以根據國際免疫遺傳學資訊系統(International Immunogenetics Information System，IMGT)編號系統來鑒定(參見例如www.imgt.org；Lefranc等人. "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains." Developmental & Comparative Immunology 27.1 (2003): 55-77)。TCR的結構和變化是本領域已知的，並且描述於例如WO 2019 /195486中，將所述專利全文以引用方式併入本文。
在一些實施方案中，TCR的a鏈和b鏈各自還含有恆定結構域。在一些實施方案中，a鏈恆定結構域(Ca)和b鏈恆定結構域(Cb)單獨地是哺乳動物恆定結構域，諸如是人恆定結構域或非人恆定結構域(例如，小鼠恆定結構域)。在一些實施方案中，恆定結構域與細胞膜相鄰。例如，在一些情況下，由兩條鏈形成的TCR的細胞外部分含有兩個膜近端恆定結構域和兩個膜遠端可變結構域，所述可變結構域各自含有CDR。
在一些方面，如本文所述的TCR可以含有人恆定區，諸如含有人Ca區的α鏈和含有人Cb區的β鏈。在一些實施方案中，TCR是完全人的。在一些實施方案中，TCR的表現和/或活性，諸如當在人細胞(例如人T細胞，諸如原代人T細胞)中表現時，不受或基本上不受內源性人TCR的影響。
在一些實施方案中，與在相似的人細胞(但其中內源性TCR的表現已經被降低或被消除)中的相同TCR的表現位準、功能活性和/或抗腫瘤活性相比，當工程化TCR被含有或表現內源性人TCR的人細胞(諸如人T細胞)表現時，所述工程化TCR在細胞表面上以相似或改善的位準表現，表現出相似或更高的功能活性(例如，細胞溶解活性)和/或表現出相似或更高的抗腫瘤活性。在一些實例中，當在人T細胞中表現時，如本文所述的工程化TCR在細胞表面上以如下的位準表現，所述位準為當在相似的人T細胞(但其中內源性TCR的表現已經被降低或被消除)中表現時的相同TCR的表現位準的至少或至少約80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%或120%。
在一些實施方案中，Ca結構域和Cb結構域中的每一者都是人的。在一些實施方案中，Ca由TRAC基因(IMGT命名法)編碼或為其變體。在一些實施方案中，Ca的變體含有至少一個非天然半胱胺酸的替代。
在一些實施方案中，TCR可以是諸如通過一個或多個二硫鍵連接的兩條鏈a和b的異二聚體。在一些實施方案中，TCR的恆定結構域可以含有短連接序列，其中半胱胺酸殘基形成二硫鍵，從而連接TCR的兩條鏈。在一些實施方案中，TCR可以在a鏈和b鏈的每一者中具有另外的半胱胺酸殘基，使得TCR在恆定結構域中含有兩個二硫鍵。在一些實施方案中，恆定結構域和可變結構域中的每一者都含有由半胱胺酸殘基形成的二硫鍵。
在一些實施方案中，TCR包含CDR、Va和/或Vb以及如本文所述的恆定區序列。
在一些實施方案中，TCR是二聚體TCR(dTCR)。在一些實施方案中，dTCR含有其中與所提供的TCR a鏈可變區序列對應的序列融合至與TCR a鏈恆定區細胞外序列對應的序列的N末端的第一多肽、以及其中與所提供的TCR b鏈可變區序列對應的序列融合至與TCR b鏈恆定區細胞外序列對應的序列的N末端的第二多肽，所述第一多肽和所述第二多肽通過二硫鍵連接。
在一些實施方案中，TCR可以是細胞結合的或呈可溶的形式。在一些實施方案中，TCR呈在細胞表面上表現的細胞結合形式。
在一些實施方案中，TCR是單鏈TCR(scTCR)。scTCR是含有能夠與MHC-肽複合物結合的a鏈和b鏈的一條單胺基酸鏈。通常，可以使用本領域技術人員已知的方法來產生scTCR。這些方法描述於例如WO 96/13593、WO 96/18105、W099/18129、WO 04/033685、W02006/037960、WO2011/044186；WO 2019 /195486；美國專利號7,569,664中；將所述專利中每一者全文以引用方式併入本文。
TCR、其抗原結合片段和TCR衍生的結合分子可以結合或識別與所關注的抗原(例如，癌症抗原)相關的肽表位。在一些實施方案中，抗原可以是在癌細胞和/或感染病毒(例如HPV)的細胞的表面上表現的肽表位。在一些實施方案中，在MHC分子的背景下呈遞抗原。此類結合分子包括例如T細胞受體(TCR)及其抗原結合片段、抗體及其抗原結合片段、和TCR樣CAR。它們表現出結合或識別此類肽表位的抗原特異性。在一些方面，表現所提供的結合分子(例如TCR或抗原結合片段)的工程化細胞對表現肽表位的靶細胞(諸如癌細胞或感染HPV的細胞)表現出細胞毒性活性。
在一些方面，TCR、其抗原結合片段和TCR衍生的結合分子識別或結合在MHC分子(諸如MHC I類分子或MHC II類分子)的背景下的表位。MHC I類分子或MHC II類分子兩者都是人白細胞抗原(HLA)。它們扮演著適應性免疫系統的重要組分。HLA表現受位於6號染色體上的基因的控制。其編碼專門向T細胞上的T細胞受體呈遞抗原肽的細胞表面分子。
在一些實施方案中，TCR、其抗原結合片段和TCR衍生的結合分子識別或結合在MHC I類分子的背景下的表位。MHC I類分子是人白細胞抗原(HLA)-A2分子，包括其任何一種或多種亞型，例如HLA-A*020l、*0202、*0203、*0206或*0207。人白細胞抗原A2(HLA-A2)是最常見的人血清型之一。在一些情況下，不同群體之間亞型的頻率可能有所不同。例如，HLA-A2陽性的白種人群中超過95%是HLA-A*020l，然而據報導在中國人群中，HLA-A*020l的頻率為大約23%、HLA-A*0207的頻率為45%，HLA-A*0206的頻率為8%、並且HLA-A*0203的頻率為23%。在一些實施方案中，MHC分子是HLA-A*020l。在一些實施方案中，本公開提供了結合HPV-EB6/HLA-A2複合物的TCR或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，結合分子(例如TCR或其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子)是分離的或純化的，或者是重組的。在一些方面，結合分子(例如TCR或其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子)是完全人的。在一些實施方案中，結合分子是單株的。在一些方面，結合分子是單鏈。在其他實施方案中，結合分子含有兩條鏈。在一些實施方案中，結合分子(例如TCR、其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子)在細胞表面上表現。
TCR、其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子可以具有Va和Vb、或與Va相似的區域和與Vb相似的區域。在一些實施方案中，Va區包含在SEQ ID NO: 1、45、47、49中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，Vb區包含在SEQ ID NO: 2、46、48、50中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，Va區包含一個或多個如本文所述的Va CDR序列。在一些實施方案中，Vb區包含一個或多個如本文所述的Vb CDR序列。
在一些實施方案中，TCR、TCR衍生的結合分子或其抗原結合片段，包含含有可變α(Va)區的α鏈和含有可變β(Vb)區的β鏈，其中所述Va區可以具有互補決定區(CDR)1、2、3，其中所述CDR1區包含或由與選擇的Va CDR1胺基酸序列為至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列組成，所述CDR2區包含或由與選擇的Va CDR2胺基酸序列為至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列組成，並且所述CDR3區包含或由與選擇的Va CDR3胺基酸序列為至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列組成，並且可變β(Vb)區包含CDR 1、2、3，其中所述CDR1區包含或由與選擇的Vb CDR1胺基酸序列為至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列組成，所述CDR2區包含或由與選擇的Vb CDR2胺基酸序列為至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列組成，並且所述CDR3區包含或由與選擇的Vb CDR3胺基酸序列為至少80%、85%、90%或95%相同的胺基酸序列組成。所述選擇的Va CDR 1、2、3胺基酸序列以及所述選擇的Vb CDR 1、2、3胺基酸序列顯示在圖20中。
在一些實施方案中，本文所述的TCR、其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子可以含有可變區(例如，Va)，所述可變區(例如，Va)含有具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 5；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 6；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 7的CDR中的一者、兩者或三者。
在一些實施方案中，本文所述的TCR、其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子可以包含可變區(例如，Vb)，所述可變區(例如，Vb)含有具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 8；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 9；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 10的CDR中的一者、兩者或三者。
在一些實施方案中，本文所述的TCR、其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子可以含有可變區(例如，Va)，所述可變區(例如，Va)含有具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 27；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 28；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 29的CDR中的一者、兩者或三者。
在一些實施方案中，本文所述的TCR、其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子可以包含可變區(例如，Vb)，所述可變區(例如，Vb)含有具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 30；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 31；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 32的CDR中的一者、兩者或三者。
在一些實施方案中，本文所述的TCR、其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子可以含有可變區(例如，Va)，所述可變區(例如，Va)含有具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 33；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 34；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 35的CDR中的一者、兩者或三者。
在一些實施方案中，本文所述的TCR、其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子可以包含可變區(例如，Vb)，所述可變區(例如，Vb)含有具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 36；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 37；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 38的CDR中的一者、兩者或三者。
在一些實施方案中，本文所述的TCR、其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子可以含有可變區(例如，Va)，所述可變區(例如，Va)含有具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 39；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 40；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 41的CDR中的一者、兩者或三者。
在一些實施方案中，本文所述的TCR、其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子可以包含可變區(例如，Vb)，所述可變區(例如，Vb)含有具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 42；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 43；具有零個、一個或兩個胺基酸插入、缺失或取代的SEQ ID NO: 44的CDR中的一者、兩者或三者。
本公開還提供了如本文所述的TCR a(α)和/或b(β)鏈。在一些實施方案中，所述a鏈包含在SEQ ID NO: 15、51、53、55中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述b鏈包含在SEQ ID NO: 16、52、54、56中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述a鏈包含一個或多個如本文所述的Va CDR序列。在一些實施方案中，所述b鏈包含一個或多個如本文所述的Vb CDR序列。
在一些實施方案中，TCR可能是諸如通過一個或多個二硫鍵連接的兩條鏈a和b的異二聚體。在一些實施方案中，TCR的恆定結構域可能含有短連接序列，其中半胱胺酸殘基形成二硫鍵，從而連接TCR的兩條鏈。在一些實施方案中，TCR可能在a鏈和b鏈的每一者中具有另外的半胱胺酸殘基，使得TCR在恆定結構域中含有兩個二硫鍵。在一些實施方案中，恆定結構域和可變結構域中的每一者都含有由半胱胺酸殘基形成的二硫鍵。
在一些實施方案中，天然二硫鍵不存在。在一些實施方案中，形成天然鏈間二硫鍵的一個或多個天然半胱胺酸(例如在a鏈和b鏈的恆定結構域中)被取代為另一種殘基，諸如取代為絲胺酸或丙胺酸。在一些實施方案中，可以通過將在α鏈和β鏈上(諸如在a鏈和b鏈的恆定結構域中)的非半胱胺酸殘基突變為半胱胺酸來形成引入的二硫鍵。TCR a鏈和b鏈中相對的半胱胺酸提供了一個二硫鍵，所述二硫鍵將經取代的TCR的TCR a鏈和b鏈的恆定區彼此連接並且在包含其中存在天然二硫鍵的未經取代的恆定區(諸如未經取代的天然人恆定區或未經取代的天然小鼠恆定區)的TCR中不存在。在一些實施方案中，在重組TCR中非天然半胱胺酸殘基的存在(例如導致一個或多個非天然二硫鍵)可能有利於在引入其的細胞中產生所需的重組TCR，而不是含有天然TCR鏈的錯配的TCR對的表現。
在一些實施方案中，編碼α鏈的核酸和編碼β鏈的核酸可以通過連接子(諸如本文其他地方所描述的任何連接子)連接。
本公開還提供了包含編碼多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含TCR a鏈可變區、TCR b鏈可變區、免疫球蛋白重鏈可變區或免疫球蛋白輕鏈可變區。可變區包含如圖 20 所示的CDR。當多肽與對應的多肽(例如，對應的a鏈可變區或對應的b鏈可變區)配對時，所述配對的多肽與所關注的抗原(例如，HPV E6)結合。
在一些實施方案中，通過與所關注的抗原結合，TCR或其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子可以活化T細胞(例如，通過活化TCR訊息傳導途徑)。在一些實施方案中，活化可以上調免疫反應，增加細胞介素(例如IFNγ)和/或CD107a的表現，促進T細胞增殖和T細胞介導的殺傷。
在一些實施方案中，如本文所述的TCR或其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子可以使T細胞的免疫反應、活性或數量增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。在一些實施方案中，當存在所關注的抗原時，TCR或其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子可以增加IFN-γ的血清濃度。在一些實施方案中，活化可以誘發IFN-γ的血清濃度增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在一些實施方案中，活化可以誘發對靶細胞的特異性殺傷增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。在一些實施方案中，使用本文所述的方法，通過對靶細胞(例如用HPV肽脈衝的APC)的絕對或競爭性殺傷效力來確定對靶細胞的特異性殺傷。
在一些方面，提供的重組TCR包括至少部分地獨立於CD8的TCR。在一些方面，提供的重組TCR包括至少部分地依賴於CD8的TCR。
在一些實施方案中，如本文所述的TCR或其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子特異性地結合HPV E6表位。在一些實施方案中，表位具有SEQ ID NO: 19的序列。在一些實施方案中，表位具有HPV E6(SEQ ID NO: 75)的胺基酸29-38的序列。可以從動力學速率常數的商(KD=k解離 /k締合 )推導結合親和力。在一些實施方案中，KD為小於1 x 10-6 M、小於1 x 10-7 M、小於1 x 10-8 M、小於1 x 10-9 M或小於1 x 10-10 M。在一些實施方案中，KD為小於50 nM、30 nM、20 nM、15 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM或1 nM。在一些實施方案中，KD為大於1 x 10-7 M、大於1 x 10-8 M、大於1 x 10-9 M、大於1 x 10-10 M、大於1 x 10-11 M或大於1 x 10-12 M。用於測量結合分子對抗原的親和力的一般技術包括例如ELISA、RIA和表面電漿子共振(SPR)。
在一些實施方案中，表現如本文所述的TCR、其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子的T細胞特異性地結合HPV肽脈衝的APC。在一些實施方案中，將T細胞和APC以1:1的效應子與靶細胞比率共培養。在一些實施方案中，可以通過測量細胞內IFN-γ表現來確定EC50。在一些實施方案中，在CD4+ T細胞群體中確定EC50。在一些實施方案中，在CD8+ T細胞群體中確定EC50。在一些實施方案中，EC50為小於50 ng/ml、小於45 ng/ml、小於40 ng/ml、小於35 ng/ml、小於30 ng/ml、小於25 ng/ml、小於20 ng/ml、小於15 ng/ml、小於10 ng/ml、小於5 ng/ml、小於4 ng/ml、小於3 ng/ml、小於2 ng/ml、或小於1 ng/ml。
在一些實施方案中，TCR或其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子具有相對高的表現效率。例如，在相同條件下，本文所述的TCR或其抗原結合片段或TCR衍生的結合分子的表現效率可以比參考分子(例如，內源性TCR)高至少10%、20%、30%、40%、50%或100%。
在一些實施方案中，結合分子(例如TCR)不表現出交叉反應性或脫靶結合，諸如不期望的脫靶結合，例如與健康或正常組織或細胞中存在的抗原的脫靶結合。
在一些實施方案中，Va區的CDR由來自人TRAV基因區段和人TRAJ基因區段的序列編碼。在一些實施方案中，TRAV基因區段是TRAV38-2/DV8(例如，TRAV38-2/DV8*01)、TRAV4(例如，TRAV4*01)或TRAV27(TRAV27*01)。在一些實施方案中，TRAJ基因區段是TRAJ18(例如，TRAJ18*01)、TRAJ12(例如，TRAJ12*01)、TRAJ17(例如，TRAJ17*01)、或TRAJ31(例如，TRAJ31*01)。在一些實施方案中，Vb區的CDR由來自人TRBV基因區段、人TRBD基因區段和人TRBJ基因區段的序列編碼。在一些實施方案中，TRBV基因區段是TRBV12-4(例如，TRBV12-4*01)或TRBV29-1(例如，TRBV29-1*01)。在一些實施方案中，TRBD基因區段是TRBD2(例如，TRBD2*02)。在一些實施方案中，TRBJ基因區段是TRBJ1-1(例如，TRBJ1-1*01)。
在一些實施方案中，TCR的Va區的CDR由來自人TRAV38-2/DV8(例如，TRAV38-2/DV8*01)基因區段和人TRAJ18(例如，TRAJ18*01)基因區段的序列編碼。在一些實施方案中，TCR的Vb區的CDR由來自人TRBV28(例如，TRAV28*01)基因區段、人TRBD1(例如，TRBD1*01)基因區段、和人TRBJ1-1(例如，TRAJ1-1*01)基因片段。
在一些實施方案中，TCR的Va區的CDR由來自人TRAV4(例如，TRAV4*01)基因區段和人TRAJ12(例如，TRAJ12*01)基因區段的序列編碼。在一些實施方案中，TCR的Vb區的CDR由來自人TRBV12-4(例如，TRAV12-4*01)基因區段、人TRBD2(例如，TRBD2*02)基因區段、和人TRBJ1-1(例如，TRAJ1-1*01)基因區段的序列編碼。
在一些實施方案中，TCR的Va區的CDR由來自人TRAV4(例如，TRAV4*01)基因區段和人TRAJ17(例如，TRAJ17*01)基因區段的序列編碼。在一些實施方案中，TCR的Vb區的CDR由來自人TRBV12-4(例如，TRAV12-4*01)基因區段、人TRBD2(例如，TRBD2*02)基因區段、和人TRBJ1-1(例如，TRAJ1-1*01)基因區段的序列編碼。
在一些實施方案中，TCR的Va區的CDR由來自人TRAV27(例如，TRAV27*01)基因區段和人TRAJ31(例如，TRAJ31*01)基因區段的序列編碼。在一些實施方案中，TCR的Vb區的CDR由來自人TRBV29-1(例如，TRAV29-1*01)基因區段、人TRBD2(例如，TRBD2*02)基因區段、和人TRBJ1-1(例如，TRAJ1-1*01)基因區段的序列編碼。HPV 感染和癌症
人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是人類最常見的性傳播病毒感染類型之一。在大多數情況下，HPV感染的症狀溫和並且會自然消退；然而，長期感染可能導致生殖器疣和癌症。與HPV相關的已知癌症類型包括宮頸癌、頭頸癌、口咽癌、肛門癌、陰莖癌、陰道癌和外陰癌。
HPV屬由小型無包膜的去氧核糖核酸(DNA)病毒組成的乳頭狀瘤病毒科(Papillomaviridae)。HPV基因組由雙鏈DNA組成，並且編碼六個早期蛋白(E1、E2、E4、E5、E6和E7)和兩個晚期蛋白(L1和L2)的DNA序列。E1和E2蛋白是病毒複製和轉譯所需的早期病毒蛋白，E2也調節E6和E7的表現，E4和E5參與病毒組裝和生長刺激，然而晚期蛋白L1和L2是次要和主要的衣殼蛋白。HPV有超過100種病毒株，並且基於它們的序列，它們可以被分為α、β、γ、δ和μ。感染子宮頸和口咽的大多數乳頭狀瘤病毒屬α病毒屬。此外，取決於其致癌潛力，這些病毒可以被分為高風險和低風險HPV類型。其中，HPV 16被認為具有最高的致癌能力。
HPV的E6和E7基因產物促進了癌症的發病機理。HPV病毒整合到細胞核內的宿主DNA中，並且從而使癌蛋白E6和E7的表現失調。E6誘發p53降解，從而導致p53活性喪失。其降解通過在p53、E6和E6AP之間形成複合物來實現(Bernard等人"Proteasomal degradation of p53 by human papillomavirus E6 oncoprotein relies on the structural integrity of p53 core domain." PloS one 6.10 (2011): e25981)。在生理狀態下，p53的功能是將細胞阻滯在細胞週期的G1期以修復宿主DNA，並且在嚴重DNA損傷的條件下，p53還可以誘發細胞凋亡。除了抑制p53外，E7還與某些細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑結合，從而導致細胞週期控制進一步喪失。
HPV通常感染具有增殖能力的鱗狀上皮細胞，並且在創傷或擦傷期間也可進入基底細胞。在基底細胞中，HPV感染誘發協助病毒複製的病毒基因表現。
儘管HPV最普遍是通過性傳播的，但已經知道會發生通過污染物的非性傳播和偶發性傳播。可能促進HPV感染的風險因素可能是過早開始性活動、多個性伴侶以及口服避孕藥的使用。此外，已經報導，低社會經濟地位和吸煙習慣會增加獲得感染的風險。儘管在大多數情況下，感染是亞臨床的，並且可以通過免疫系統清除，但是持續性感染與腫瘤發生有關聯。
檢測HPV感染的各種方法是本領域已知的。可以通過靶標擴增、訊號放大和探針擴增來檢測HPV感染。靶標擴增是基於靶標基因序列中HPV DNA片段的重複。靶標擴增技術包括病毒基因(例如，衣殼L1基因)的聚合酶鏈反應(PCR)、amplicor人乳頭狀瘤病毒測試、線性陣列人乳頭狀瘤病毒基因分型測試、乳頭檢查、即時聚合酶鏈反應、和APTIMA人乳頭狀瘤病毒測定。訊號放大技術利用DNA技術或雜交捕獲將DNA訊號增加到可檢測的位準。這些包括雜交捕獲、Care人乳頭狀瘤病毒測試以及Cervista(一種可以檢測14種高風險HPV類型的FDA批準的基因分型測試)。探針擴增方法利用可以與指定的HPV DNA序列雜交的標記的分子探針。
HPV和癌症之間的關係以及各種HPV檢測方法在以下文獻中有進一步描述：Bansal等人, “Human papillomavirus-associated cancers: A growing global problem,” International Journal of Applied and Basic Medical Research 6.2 (2016): 84；Brianti等人, “Review of HPV-related diseases and cancers,” New Microbiol 40.2 (2017): 80-85；Chan等人, “Human Papillomavirus Infection and Cervical Cancer: Epidemiology, Screening, and Vaccination—Review of Current Perspectives,” Journal of oncology 2019 (2019)；將所述文獻中每一者全文以引用方式併入本文。
在一些方面，本公開提供了預防或降低處於HPV感染風險中的受試者的HPV感染和HPV相關癌症的風險的方法。在一些方面，本公開還提供了預防或降低在表現出HPV感染的受試者中發展出HPV相關癌症的風險的方法。
在一些實施方案中，TCR、其抗原結合片段和TCR衍生的結合分子可以結合由HPV編碼的抗原。除了其他變體以外，HPV亞型可以選自HPV1、HPV2、HPV3、HPV4、HPV6、HPV10、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV27、HPV28、HPV29、HPV30、HPV31、HPV33、HPV34、HPV35、HPV39、HPV40、HPV41、HPV42、HPV43、HPV45、HPV49、HPV51、HPV52、HPV54、HPV55、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59、HPV68和HPV69。在一些實施方案中，被結合分子靶向的HPV的亞型選自至少一種高風險HPV：例如，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68和HPV69。
在一些實施方案中，HPV抗原包括但不限於E1、E2、E3、E4、E6、E7、L1和L2蛋白。在一些實施方案中，抗原是E6抗原。在又另一個實施方案中，抗原是E7抗原。在一些實施方案中，抗原是HPV16 E6抗原。在一些實施方案中，識別的表位是E6抗原肽，並且具有SEQ ID NO: 19的序列。工程化細胞
本公開提供了工程化細胞(例如，T細胞)，其包含如本文所述的TCR或其抗原結合片段、或其他類似的抗原結合分子。這些工程化細胞可以用於治療如本文所述的各種障礙或疾病(例如，病毒感染、癌症、病毒誘發的障礙)。
在各種實施方案中，被工程化的細胞可以從例如人和非人動物中獲得。在各種實施方案中，被工程化的細胞可以從細菌、真菌、人、大鼠、小鼠、兔、猴、豬或任何其他物種獲得。優選地，所述細胞來自人、大鼠或小鼠。更優選地，所述細胞獲自人。在各種實施方案中，被工程化的細胞是血細胞。優選地，所述細胞是白細胞(例如T細胞)、淋巴細胞或任何其他合適的血細胞類型。在一些實施方案中，所述細胞是周邊血液細胞。在一些實施方案中，所述細胞是T細胞、B細胞或NK細胞。
在一些實施方案中，所述細胞是T細胞。在一些實施方案中，T細胞可以表現識別靶細胞表面上的特異性抗原部分的細胞表面受體。細胞表面受體可以是野生型或重組T細胞受體(TCR)、嵌合抗原受體(CAR)或能夠識別與靶細胞相關的抗原部分的任何其他表面受體。T細胞可以通過本領域已知的各種方法獲得，例如，通過從患者中分離的T細胞(例如，腫瘤浸潤性淋巴細胞)的體外培養獲得。可以通過用病毒載體轉導T細胞(例如，從患者周邊血液中分離的)來獲得TCR基因修飾的T細胞。在一些實施方案中，T細胞是TCR基因修飾的T細胞。在一些實施方案中，T細胞是CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或調節性T細胞。在一些實施方案中，T細胞是1型T輔助細胞和2型T輔助細胞。在一些實施方案中，表現此受體的T細胞是αβ-T細胞。在替代性實施方案中，表現此受體的T細胞是γδ-T細胞。
在一些實施方案中，所述細胞是NK細胞。在一些實施方案中，工程化細胞的製備包括一個或多個培養和/或製備步驟。可以從樣品(諸如生物樣品，例如從受試者獲得或來源的生物樣品)中分離用於引入結合分子(例如TCR)的細胞。在一些實施方案中，從其分離細胞的受試者是患有疾病或病症或需要細胞療法、或將向其施用細胞療法的受試者。在一些實施方案中，受試者是需要特定治療干預(諸如針對其分離、處理細胞和/或對細胞進行工程化的過繼細胞療法)的人。
在一些實施方案中，所述細胞是幹細胞，諸如多潛能和多能幹細胞，包括誘發的多能幹細胞(iPSC)。所述細胞可以是初代細胞，諸如直接從受試者中分離和/或從受試者中分離並冷凍的那些細胞。在一些實施方案中，將幹細胞與另外的分化因子一起培養以獲得所需的細胞類型(例如T細胞)。
可以從適當的分離方法中獲得不同的細胞類型。所述分離方法包括基於一種或多種特定分子(諸如表面標記，例如表面蛋白、細胞內標記、或核酸)在細胞中的表現或存在來分離不同的細胞類型。在一些實施方案中，可以使用基於此類標記的任何已知的分離方法。在一些實施方案中，所述分離是基於親和力或免疫親和力的分離。例如，在一些方面，所述分離包括例如基於一種或多種標記(通常是細胞表面標記)的細胞表現或表現位準，通過與特異性地結合此類標記的抗體或結合伴侶一起孵育，隨後通常是洗滌步驟和將已經結合抗體或結合伴侶的細胞從未結合抗體或結合伴侶的細胞分開而分離細胞和細胞群。
此類分離步驟可以是基於陽性選擇，其中已經結合試劑的細胞被保留以供進一步使用，和/或基於陰性選擇，其中未結合抗體或結合伴侶的細胞被保留。在一些實例中，兩個級分均被保留供進一步使用。在一些方面，在沒有可用的抗體特異性地鑒定異源群體中的細胞類型，使得最好基於由除所需群體以外的細胞表現的標記來進行分離的情況下，陰性選擇可能特別有用。
還提供了用於表現結合分子並用於生產表現此類結合分子的基因工程化細胞的方法、核酸、組合物和套組。基因工程化通常涉及諸如通過反轉錄病毒轉導、轉染或轉化將編碼治療分子(例如TCR、CAR，例如TCR樣CAR、多肽、融合蛋白)的核酸引入細胞中。在一些實施方案中，通過以下方式來實現基因轉移：首先刺激細胞，諸如通過將其與誘發反應(諸如增殖、存活和/或活化，例如通過細胞介素或活化標記的表現所測量的)的刺激物組合，隨後轉導活化的細胞並在培養物中擴增至足以用於臨床應用的數量。
在一些實施方案中，使用重組感染性病毒顆粒(諸如，例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相關病毒(AAV)的載體)，將重組核酸轉移到細胞中。在一些實施方案中，使用重組慢病毒載體或反轉錄病毒載體(諸如γ-反轉錄病毒載體)，將重組核酸轉移到T細胞中。在一些實施方案中，反轉錄病毒載體具有長末端重複序列(LTR)，例如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎幹細胞病毒(MESV)、鼠幹細胞病毒(MSCV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的反轉錄病毒載體。大多數反轉錄病毒載體衍生自鼠反轉錄病毒。在一些實施方案中，所述反轉錄病毒包括衍生自任何禽類或哺乳動物細胞來源的那些。所述反轉錄病毒通常是雙嗜性的，這意味著它們能夠感染包括人在內的若干個物種的宿主細胞。在一些實施方案中，載體是慢病毒載體。在一些實施方案中，重組核酸通過電穿孔轉移到T細胞中。在一些實施方案中，重組核酸通過轉座轉移到T細胞中。在免疫細胞中引入和表現遺傳物質的其他方法包括磷酸鈣轉染、原生質體融合、陽離子脂質體介導的轉染；鎢粒子促進的微粒轟擊和磷酸鍶DNA共沉澱。例如在WO2019195486中描述了這些方法中的許多，將所述專利全文以引用方式併入本文。
在一些方面，人源化和/或完全人源重組TCR的開發提出了技術挑戰。例如，在一些方面，人源化和/或完全人源
重組TCR受體當被工程化為人T細胞時可以與內源性TCR複合物競爭和/或可以與內源性TCRa鏈和/或TCRb鏈形成錯誤配對，這在某些方面可能降低重組TCR訊息傳導、活性和/或表現，並最終導致工程化細胞的活性降低。可以對工程化細胞進行基因修飾。在一些實施方案中，工程化細胞可以包含T細胞受體α恆定(TRAC)基因和/或T細胞受體β恆定(TRBC)基因的遺傳破壞。在一些實施方案中，TRBC基因是T細胞受體β恆定1(TRBCJ)或T細胞受體β恆定2(TRBC2)基因中的一者或兩者。在一些實施方案中，工程化細胞不表現內源性TCR a鏈和/或TRC b鏈。在一些其他方面，使用非人恆定結構域，例如齧齒動物(例如小鼠)恆定結構域。使用非人恆定結構域可以有效地降低配對錯誤的可能性。
還提供了工程化細胞群、含有此類細胞和/或富集此類細胞(諸如其中表現結合分子的細胞組成至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高百分比的在組合物中的總細胞或某種類型的細胞(諸如T細胞、CD8+或CD4+細胞))的組合物。重組載體
本公開還提供了包括本文公開的分離的多核苷酸(例如編碼本文公開的多肽的多核苷酸)的重組載體(例如表現載體)、向其中引入重組載體(即，使得宿主細胞含有多核苷酸和/或包含多核苷酸的載體)的宿主細胞、以及通過重組技術生產重組多肽或其片段。
如本文所用，“載體”是當將載體引入宿主細胞時能夠將一種或多種目的多核苷酸遞送至宿主細胞的任何構建體。“表現載體”能夠在已經引入表現載體的宿主細胞中遞送一種或多種目的多核苷酸和將其表現為編碼的多肽。因此，通過在目的多核苷酸的整合位點處或附近或側翼與載體內或宿主細胞基因組中的調控元件諸如啟動子、增強子和/或聚A尾巴可操作地連接使得目的多核苷酸將在與表現載體一起引入的宿主細胞中轉譯，將目的多核苷酸定位在載體中用於表現。
可以通過本領域已知的方法將載體引入宿主細胞中，例如電穿孔、化學轉染(例如DEAE-葡聚糖)、轉化、轉染、以及感染和/或轉導(例如用重組病毒)。因此，載體的非限制性實例包括病毒載體(其可以用於產生重組病毒)、裸DNA或RNA、質體、黏接質體、噬菌體載體、以及與陽離子縮合劑相關的DNA或RNA表現載體。
本公開提供了包含適合於對細胞進行遺傳修飾的核酸構建體的重組載體，其可以用於治療病理性疾病或病症。
任何載體或載體類型均可以用於將遺傳物質遞送至細胞。這些載體包括但不限於質體載體、病毒載體、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)和人類人工染色體(HAC)。病毒載體可以包括但不限於重組反轉錄病毒載體、重組慢病毒載體、重組腺病毒載體、泡沫病毒載體、重組腺相關病毒(AAV)載體、雜交載體、和質體轉座子(例如，睡美人(sleeping beauty)轉座子系統和PiggyBac轉座子系統)或基於整合酶的載體系統。也可以結合本文所述的方法使用本領域已知的其他載體。
在一些實施方案中，載體是病毒載體。可以將病毒載體在對病毒載體製造具有特異性的培養基中生長。根據本文所述的實施方案，可以使用任何合適的生長培養基和/或用於使病毒載體生長的補充劑。
在一些實施方案中，所用的載體是重組反轉錄病毒載體。反轉錄病毒載體能夠指導目的核酸分子的表現。反轉錄病毒以RNA形式存在於其病毒膜中，並且當在宿主細胞中複製時形成雙鏈DNA中間體。類似地，反轉錄病毒載體以RNA和雙鏈DNA兩種形式存在。反轉錄病毒載體還包括含有重組DNA片段的DNA形式和含有重組RNA片段的RNA形式。載體可以包括至少一種轉錄啟動子/增強子、或控制基因表現的其他元件。此類載體還可以包括包裝訊息、長末端重複序列(LTR)或其部分、以及適合於所使用的反轉錄病毒的正鏈和負鏈引物結合位點。長末端重複序列(LTR)是在反轉錄轉座子或通過反轉錄病毒RNA的反轉錄形成的前病毒DNA的末端發現的重複許多次(例如數百或數千次)的相同的DNA序列。病毒使用它們將其遺傳物質插入宿主基因組中。任選地，載體還可以包括指導聚腺苷酸化的訊息、可選擇標記(諸如胺苄青黴素抗性、新黴素抗性、TK、潮黴素抗性、腐草黴素抗性、組胺醇抗性、或DHFR)、以及一個或多個限制位點和轉譯終止序列。例如，此類載體可以包括5' LTR、前導序列、tRNA結合位點、包裝訊息、第二鏈DNA合成的起點、和3' LTR或其一部分。另外，本文所用的反轉錄病毒載體還可以是指通過去除反轉錄病毒gag、pol和env基因並用目的基因替代而產生的重組載體。
在一些實施方案中，使用MP71載體。使用標準分子生物學技術產生MP71反轉錄病毒載體構建體。在一些實施方案中，MP71反轉錄病毒載體含有通過P2A序列連接的兩個基因：(1) 與小鼠TCR α鏈恆定區融合的人抗E6 TCR的α鏈可變區；(2) 與小鼠TCR β鏈恆定區融合的同一人抗E6 TCR的β鏈可變區。(圖1 )
在一些實施方案中，載體可以包括編碼抑制蛋白(例如，檢查點抑制劑)的另外的核酸。在各種實施方案中，細胞表現基因工程化抗原受體和抑制蛋白。在各種實施方案中，組成型表現抑制蛋白。
在一些實施方案中，載體或構建體可以含有驅動一個或多個核酸分子的表現的單個啟動子。在一些實施方案中，此類啟動子可以是多順反子(雙順反子或三順反子)。例如，在一些實施方案中，轉錄單元可以是工程化為含有IRES(內部核糖體進入位點)的雙順反子單元，其允許通過來自單一啟動子的消息共表現基因產物(例如編碼TCR的α鏈和/或β鏈)。可替代地，在一些情況下，單一啟動子可引導RNA的表現，所述RNA在單一開放閱讀框(ORF)中含有兩個或三個基因(例如，編碼TCR的α鏈和/或β鏈)，所述兩個或三個基因通過編碼自切割肽(例如P2A或T2A)的序列或蛋白酶識別位點(例如弗林蛋白酶(furin))彼此分開。因此，ORF編碼單個多蛋白，所述多蛋白在轉譯期間(在2A(例如T2A)的情況下)或之後被切割成單個蛋白質。在一些情況下，肽(諸如T2A)可以引起核糖體跳過2A元件C末端處肽鍵的合成(核糖體跳躍)，從而導致在2A序列末端與下游相鄰肽之間分開。
可以結合如本文所述的載體使用各種細胞系。可以用於表現多肽的示例性真核細胞包括但不限於COS細胞，包括COS 7細胞；293細胞，包括293-6E細胞；CHO細胞，包括CHO-S、DG44。Lec13 CHO細胞和FUT8 CHO細胞；PER.C6?細胞；和NSO細胞。在一些實施方案中，特定的真核宿主細胞基於其對結合分子進行所需的轉譯後修飾的能力來選擇。例如，在一些實施方案中，CHO細胞產生的多肽的唾液酸化位準高於在293細胞中產生的相同多肽。
在一個方面，本公開還涉及包含編碼多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含：
(1)  含有a鏈可變區(Va)的TCR a鏈或其片段，所述Va包含分別含有在SEQ ID NO: 5、6和7中列出的胺基酸序列的互補決定區(CDR)1、2和3，並且其中所述Va當與含有在SEQ ID NO: 2中列出的胺基酸序列的b鏈可變區(Vb)配對時與E6結合；
(2)  含有b鏈可變區(Vb)的TCR b鏈或其片段，所述Vb包含分別含有在SEQ ID NO: 8、9和10中列出的胺基酸序列的互補決定區(CDR)1、2和3，並且其中所述Vb當與含有在SEQ ID NO: 1中列出的胺基酸序列的a鏈可變區(Va)配對時與E6結合；
(3)含有a鏈可變區(Va)的TCR a鏈或其片段，所述Va包含分別含有在SEQ ID NO: 27、28和29中列出的胺基酸序列的互補決定區(CDR)1、2和3，並且其中所述Va當與含有在SEQ ID NO: 46中列出的胺基酸序列的b鏈可變區(Vb)配對時與E6結合；
(4)含有b鏈可變區(Vb)的TCR b鏈或其片段，所述Vb包含分別含有在SEQ ID NO: 30、31或32中列出的胺基酸序列的互補決定區(CDR)1、2和3，並且其中所述Vb當與含有在SEQ ID NO: 45中列出的胺基酸序列的a鏈可變區(Va)配對時與E6結合；
(5)含有a鏈可變區(Va)的TCR a鏈或其片段，所述Va包含分別含有在SEQ ID NO: 33、34或35中列出的胺基酸序列的互補決定區(CDR)1、2和3，並且其中所述Va當與含有在SEQ ID NO: 48中列出的胺基酸序列的b鏈可變區(Vb)配對時與E6結合；
(6) 含有b鏈可變區(Vb)的TCR b鏈或其片段，所述Vb包含分別含有在SEQ ID NO: 36、37或38中列出的胺基酸序列的互補決定區(CDR)1、2和3，並且其中所述Vb當與含有在SEQ ID NO: 47中列出的胺基酸序列的a鏈可變區(Va)配對時與E6結合；
(7) 含有a鏈可變區(Va)的TCR a鏈或其片段，所述Va包含分別含有在SEQ ID NO: 39、40或41中列出的胺基酸序列的互補決定區(CDR)1、2和3，並且其中所述Va當與含有在SEQ ID NO: 50中列出的胺基酸序列的b鏈可變區(Vb)配對時與E6結合；或
(8) 含有b鏈可變區(Vb)的TCR b鏈或其片段，所述Vb包含分別含有在SEQ ID NO: 42、43或44中列出的胺基酸序列的互補決定區(CDR)1、2和3，並且其中所述Vb當與含有在SEQ ID NO: 49中列出的胺基酸序列的a鏈可變區(Va)配對時與E6結合。
在一些實施方案中，所述VH當與VL配對時與HPV E6特異性地結合，或者所述VL當與VH配對時與HPV E6特異性地結合。在一些實施方案中，核酸是cDNA。
在一個方面，本公開涉及包含一種或多種如本文所述的核酸的載體。在一個方面，本公開還涉及包含兩種如本文所述的核酸的載體。在一些實施方案中，所述載體編碼一起結合HPV抗原的Va區和Vb區。
在一個方面，本公開涉及載體對，其中每個載體包含一種如本文所述的核酸，其中所述所述載體對一起編碼一起與HPV抗原結合的所述Va區和所述Vb區。
在一個方面，本公開涉及包含如本文所述的載體或載體對的細胞。在一些實施方案中，所述細胞是T細胞。
在一些情況下，某些TCR可能表現出不良的表現或活性，部分原因是與內源性TCR鏈的錯誤配對和/或競爭和/或其他因素。解決這些挑戰的一種方法是設計具有小鼠恆定結構域的重組TCR，以防止與內源性人TCR a鏈或b鏈錯誤配對。然而，將重組TCR與小鼠序列一起使用可能帶來免疫反應的風險。在一些實施方案中，例如通過基因編輯在編碼一個或多個TCR鏈的內源基因上引入遺傳破壞。
如圖1 中所示，將核酸構建體選殖到反轉錄病毒載體pMP71中，所述反轉錄病毒載體pMP71含有通過P2A序列連接的兩個基因：(1) 與小鼠TCR α鏈恆定區融合的人抗E6 TCR的α鏈可變區；(2) 與小鼠TCR β鏈恆定區融合的同一人抗E6 TCR的β鏈可變區。在一些實施方案中，核酸構建體還包含編碼訊息肽的序列。
參考圖 6B ， 核酸構建體包含三個序列，其中所述三個序列包括：(a) 與小鼠TCR α鏈的恆定區融合的人TCR α鏈的可變區，標識為“Va-Ca” ，其中Va 對應於人TCR α鏈的可變區並且Ca 對應於小鼠TCR α鏈的恆定區；(b) 與小鼠TCR β鏈的恆定區融合的同一人TCR β鏈的可變區，標識為“Vb-Cb” ，其中Vb 對應於同一人TCR β鏈的可變區並且Cb 對應於小鼠TCR β鏈的恆定區；以及 (c) 用GS連接子(例如，SEQ ID NO: 76)連接的免疫檢查點抑制劑(ICI)的重鏈和輕鏈的可變區。在一些實施方案中，核酸構建體還包含編碼訊息肽的序列。在一些實施方案中，TCR是抗E6 TCR。在一些實施方案中，免疫檢查點抑制劑是抗PD-1抗體scFv。核酸構建體還可以包括可以協助和/或實現構建體的轉染、轉導、整合、複製、轉錄、轉譯、表現和/或穩定的其他序列。在一些實施方案中，核酸構建體包含連接序列(a)、(b) 和/或 (c)的連接子序列，例如，P2A 和/或T2A 序列。
在一些實施方案中，GS連接子包含至少或約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、或50個胺基酸殘基。在一些實施方案中，GS連接子包含至少或約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、20、25、30或40個甘胺酸殘基。在一些實施方案中，GS連接子包含至少或約1、2、3、4、5、6、7或8個絲胺酸殘基。在一些實施方案中，GS連接子包含或由甘胺酸和絲胺酸殘基組成。在一些實施方案中，GS連接子包含以下序列或由以下序列組成：所述序列與GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 76)為至少或約70%、至少或約75%、至少或約80%、至少或約85%、至少或約90%、至少或約95%、至少或約99%或100%相同。在一些實施方案中，GS連接子包含GGGGS(SEQ ID NO: 77)的至少1、2、3、4、5、6、7或8個重複。在一些實施方案中，GS連接子具有不超過10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40或50個胺基酸殘基。
本公開還提供了編碼如本文所述的TCR a鏈和/或b鏈的核酸。在一些實施方案中，編碼a鏈的核酸包含在SEQ ID NO: 15、51、53、55中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列。在一些實施方案中，編碼b鏈的核酸包含在SEQ ID NO: 16、52、54、56中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列。在一些實施方案中，所述a鏈包含一個或多個如本文所述的Va CDR序列。在一些實施方案中，所述b鏈包含一個或多個如本文所述的Vb CDR序列。在一些實施方案中，載體包含與SEQ ID NO: 20、63、64、65、26、66、67或68為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
在一些實施方案中，抑制蛋白是抗PD-1抗體(例如，抗PD-1 scFV)。
在一些實施方案中，抗體包含重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含與SEQ ID NO: 11為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；所述輕鏈可變結構域包含與SEQ ID NO: 12為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在一些實施方案中，載體包含編碼抗PD-1 scFV的序列。在一些實施方案中，載體包含編碼與SEQ ID NO: 24、69、70或71為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的序列。在一些實施方案中，載體包含與SEQ ID NO: 25、72、73或74為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列。
如本文所用，術語“連接子”(L)或“連接子結構域”或“連接子區域”是指將任何結構域/區域連接在一起的長度為約1至100個胺基酸的寡聚或多肽區域。連接子可以由柔性殘基(如甘胺酸和絲胺酸)構成，使得相鄰的蛋白質結構域可以相對于彼此自由移動。當期望確保兩個相鄰結構域彼此之間不發生空間干擾時，可以使用較長的連接子。連接子可以是可切割的或不可切割的。可切割連接子的實例包括2A連接子(例如P2A、T2A)、2A樣連接子或其功能等同物、以及它們的組合。在一些實施方案中，連接子包括小核糖核酸病毒2A樣連接子；豬捷申病毒(P2A)、明脈扁刺蛾β四體病毒(Thosea asigna virus)(T2A)的CHYSEL序列；或它們的組合、變體和功能等同物。其他連接子對本領域技術人員將是顯而易見的，並且可以在本文所述的方法中使用。
本公開還提供了核酸序列，所述核酸序列包含編碼任何TCR、其抗原結合片段、和/或TCR衍生的結合分子(包括例如本文所述的其功能部分和功能變體、多肽或蛋白質)的核苷酸序列。如本文所用，“核酸”可以包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，並且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可以是單鏈或雙鏈的、合成的或獲得自天然來源，其可以含有天然、非天然或改變的核苷酸。此外，核酸包含互補DNA(cDNA)。通常優選的是，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或取代。然而，如本文所討論的，在一些情形下，核酸包含一個或多個插入、缺失、倒位和/或取代可能是合適的。
可以使用本領域已知的程序基於化學合成和/或酶促連接反應來構建如本文所述的核酸。例如，可以使用天然存在的核苷酸或各種經修飾的核苷酸來化學地合成核酸。在一些任何此類實施方案中，核苷酸序列是密碼子優化的。
本公開還提供了核酸，所述核酸包含與本文所述的任何核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列或者在嚴格條件下與本文所述的任何核酸的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
在一些實施方案中，編碼α鏈的核苷酸序列和編碼β鏈的核苷酸序列被引起核糖體跳躍的肽序列分開。在一些實施方案中，引起核糖體跳躍的肽是P2A或T2A肽。在一些實施方案中，核酸是合成的。在一些實施方案中，核酸是cDNA。
在一些實施方案中，載體可以另外包括編碼檢查點抑制劑(CPI)(例如抑制蛋白)的核酸序列。在一些實施方案中，檢查點抑制劑是例如本文所述的任何抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段可以特異性地結合PD-1、PD-L1、PD-L2、2B4(CD244)、4-1BB、A2aR、B7.1、B7.2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BTLA、嗜乳脂蛋白、CD160、CD48、CTLA4、GITR、gp49B、HHLA2、HVEM、ICOS、ILT-2、ILT-4、KIR家族受體、LAG-3、OX-40、PIR-B、SIRPα(CD47)、TFM-4、TIGIT、TIM-1、TIM-3、TIM-4、或VISTA。在一些實施方案中，抑制蛋白是scFv(例如抗PD-1 scFv)。在一些實施方案中，抗PD-1 scFV具有與SEQ ID NO: 22為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列。本公開還提供了編碼抗PD-1 scFV的核酸序列。在一些實施方案中，核酸具有與SEQ ID NO: 23為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列。
在一些實施方案中，載體可以另外包括編碼雙功能陷阱融合蛋白的核酸序列。在一些實施方案中，雙功能陷阱蛋白靶向PD-1和TGF-β二者。在一些實施方案中，雙功能陷阱蛋白靶向PD-L1和TGF-β二者。在一些實施方案中，雙功能融合蛋白設計成阻斷PD-L1和螯合(sequester)TGF-β。基於人IgG1單株抗體(mAb)阿維魯單抗(avelumab)，M7824(MSB0011395C)包含與人抗PD-L1 scFv的C末端連接的人TGF-β受體II(TGFβRII)的細胞外結構域。在一些實施方案中，雙功能融合蛋白包含與人抗PD-1 scFv的C末端連接的人TGF-β受體II(TGFβRII)的細胞外結構域。
在一些任何此類實施方案中，TCR或其抗原結合片段由已經進行密碼子優化的核苷酸序列編碼。在某些實施方案中，α鏈和/或β鏈還包含訊息肽。在特定實施方案中，TCR或其抗原結合片段是分離的或純化的或者是重組的。在一些任何此類實施方案中，TCR或抗原結合片段是重組的。在一些任何此類實施方案中，TCR或其抗原結合片段是人的。
本公開還提供了與本文所述的任何核苷酸序列為至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的核酸序列、以及與本文所述的任何胺基酸序列為至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相同的胺基酸序列。在一些實施方案中，本公開涉及編碼本文所述的任何肽的核苷酸序列、或由本文所述的任何核苷酸序列編碼的任何胺基酸序列。
在一些實施方案中，核酸序列為至少或約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500、或600個核苷酸。在一些實施方案中，胺基酸序列為至少或約5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200個胺基酸殘基。在一些實施方案中，核酸序列為小於10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500、或600個核苷酸。在一些實施方案中，胺基酸序列為小於5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200個胺基酸殘基。
為了確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分比，出於最佳比較目的，對序列進行比對(例如，可以在第一和第二胺基酸或核酸序列中的一者或兩者中引入缺口以進行最佳比對，並且出於比較目的可以忽略非同源序列)。然後比較在相應的胺基酸位置或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置被與第二序列中的相應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在所述位置是相同的。考慮了缺口數量和每個缺口的長度(需要將其引入以實現兩個序列的最佳比對)，兩個序列之間的同一性百分比是由序列所共享的相同位置的數量的函數。產生T 細胞受體和TCR 樣分子的方法
本公開還提供了鑒定和產生可以識別靶抗原的T細胞受體的方法。在一些方面，所述方法涉及使含有T細胞(諸如原代T細胞)的生物樣品(包括來自正常供體或患有所關注的疾病或病症的患者的那些生物樣品)經受多輪抗原暴露和評估。在一些方面，所述多輪涉及使用人工或工程化抗原呈遞細胞，諸如自體樹突狀細胞或用所需肽抗原脈衝的其他APC來促進在MHC(諸如I類或II類MHC)上的呈遞。
在一些方面，進行多輪抗原暴露，並且在一些方面，例如基於結合所需抗原(諸如肽-MHC四聚體)的能力，在一輪或多輪之後分選T細胞。
可以通過本領域已知的方法例如流式細胞術進行分選。例如，通過單細胞測序方法分析了可以與所需抗原結合的細胞(陽性級分)和不能與所需抗原有效地結合的細胞(陰性級分)。在一些實施方案中，進行測序以在單細胞位準上鑒定每個樣品中存在的TCR對。在一些方面，所述方法可以定量在樣品中存在的給定TCR對的拷貝數，並且因此可以評估在給定樣品中給定TCR的豐度、和/或其在另一樣品中的富集，諸如例如經過一輪或多輪，例如與陰性級分相比，在陽性(抗原結合)級分中的富集或豐度。可以進行此類測定以產生抗原特異性T細胞受體(TCR)。在一些方面，產生選殖T細胞系，並且使用高通量配對TCR測序在單細胞的基礎上確定各個群體中單個配對TCR α鏈和β鏈的序列及其豐度。
可以進一步修飾TCR或其抗原結合片段。在一些實施方案中，與結合分子(例如本文所述的任何TCR)的序列相比，結合分子(例如TCR或其抗原結合片段)包括一個或多個胺基酸變異，例如取代、缺失、插入和/或突變。示例性變體包括設計用於改善結合分子的結合親和力和/或其他生物學特性的那些變體。可以通過將適當的修飾引入編碼結合分子的核苷酸序列中或通過肽合成來製備結合分子的胺基酸序列變體。此類修飾包括例如結合分子胺基酸序列內的殘基的缺失和/或插入和/或取代。可以進行缺失、插入和取代的任何組合以得到最終的構建體，條件是最終的構建體擁有所需的特徵，例如與抗原特異性地結合。
各種結合分子可以由TCR製成。與本文所述的結合分子(例如TCR)序列相比和/或與天然庫(例如人類庫)的序列相比，結合分子(例如TCR或其抗原結合片段)可以包括一個或多個胺基酸取代。取代誘變的所關注位點包括CDR、FR和/或恆定區。可以將胺基酸取代引入所關注的結合分子中，並且針對所需活性(例如，保留/改善的抗原親和力或親合力、降低的免疫原性、改善的半衰期、獨立於CD8的結合或活性、表面表現、促進TCR鏈配對和/或其他改善的特性或功能)篩選產物。
在一些實施方案中，母體結合分子(例如TCR)的CDR內的一個或多個殘基被取代。在一些實施方案中，進行取代以將序列或序列中的位置還原為種系序列，諸如在種系(例如人種系)中發現的結合分子序列，例如，以便例如在向人受試者施用後降低免疫原性的可能性。
在一些實施方案中，功能變體由TCR或TCR衍生的結合分子製成。如本文所用，術語“功能變體”是指與母體分子具有足夠或顯著的序列同一性的結合分子。此外，功能變體保留了與母體蛋白質相同的生物活性。功能變體涵蓋本文所述的TCR蛋白(母體TCR、多肽或蛋白質)的那些變體，其保留了與母體TCR具有抗原特異性或母體多肽或蛋白質特異性地結合的HPV表位特異性地結合的能力。此外，功能變體的結合區域(例如，可變結構域)可以為與母體TCR蛋白相似的程度、相同的程度或更高的程度。關於母體TCR、多肽或蛋白質，功能變體可以例如與母體TCR、多肽或蛋白質在胺基酸序列上為至少約30%、50%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同。
可以對一個或多個CDR進行取代、插入或缺失，只要此類改變基本上不降低結合分子(例如TCR或其抗原結合片段)結合抗原的能力即可。例如，可以在CDR中進行基本上不降低結合親和力的保守改變(例如，如本文提供的保守取代)。此類改變可以例如在CDR中的抗原接觸殘基之外。在本文提供的可變序列的某些實施方案中，每個CDR要麼不改變，要麼含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。TCR 衍生的抗體
本公開還提供了含有如上所述的任何一個或多個CDR的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段含有可變的重鏈和輕鏈，所述可變的重鏈和輕鏈包含在α鏈中含有的CDR1、CDR2和/或CDR3以及在β鏈中含有的CDR1、CDR2和/或CDR3。在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段包含與圖 20 中的CDR序列為至少為或約80%、85%、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%相同的一個或多個CDR。
在一些實施方案中，所述抗體和其抗原結合片段(例如TCR樣抗體)特異性地識別在MHC分子(諸如MHC I類)的背景下的肽表位(例如，HPV抗原)。在一些情況下，MHC I類分子是HLA-A2分子，例如HLA-A2*01。
在一些實施方案中，所述抗體及其抗原結合片段可以特異性地識別以獨立于MHC分子的方式的肽表位(例如，HPV抗原)。
通常，抗體(也稱為免疫球蛋白)由兩類多肽鏈組成：輕鏈和重鏈。本公開的非限制性抗體可以是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的完整的四條免疫球蛋白鏈抗體。抗體的重鏈可以是任何同種型(包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD)或亞同種型(包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等)。輕鏈可以是κ輕鏈或λ輕鏈。抗體可以包含兩個相同拷貝的輕鏈和兩個相同拷貝的重鏈。重鏈(每一條重鏈含有一個可變結構域(或可變區，VH)和多個恆定結構域(或恆定區))在其恆定結構域內通過二硫鍵彼此結合以形成抗體的“莖”。輕鏈(每一條輕鏈含有一個可變結構域(或可變區，VL)和一個恆定結構域(或恆定區))各自通過二硫鍵結合至一條重鏈。每條輕鏈的可變區與其所結合的重鏈的可變區對齊。輕鏈和重鏈二者的可變區均含有夾在更保守的框架區(FR)之間的三個高變區。
在一些實施方案中，抗體是完整的免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亞類(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是高度保守的，區別在於它們的恆定區，尤其是它們的鉸鏈和上部CH2結構域。IgG亞類的序列和差異是本領域已知的，並且例如在以下文獻中進行了描述：Vidarsson, 等人, “IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions.” Frontiers in immunology 5 (2014)；Irani, 等人 “Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases.” Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182；Shakib, Farouk, 編輯 The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016；將所述文獻中每一者全文以引用方式併入本文。
抗體也可以是源自任何物種(例如人、齧齒動物、小鼠、駱駝科動物)的免疫球蛋白分子。本文公開的抗體還包括但不限於多株、單株、單特異性、多特異性抗體、和包括與另一個多肽融合的免疫球蛋白結合結構域的嵌合抗體。術語“抗原結合結構域”或“抗原結合片段”是保留了完整抗體的特異性結合活性的抗體的一部分，即能夠與完整抗體的靶分子上的表位特異性地結合的任何抗體部分。其包括例如Fab、Fab'、F(ab')2以及這些片段的變體。因此，在一些實施方案中，抗體或其抗原結合片段可以是例如scFv、Fv、Fd、dAb、雙特異性抗體、雙特異性scFv、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子、由抗體片段形成的多特異性抗體、以及包含是抗體結合結構域或與抗體結合結構域同源的結合結構域的任何多肽。抗原結合結構域的非限制性實例包括例如完整抗體的重鏈和/或輕鏈CDR、完整抗體的重鏈和/或輕鏈可變區、完整抗體的全長重鏈或輕鏈、或來自完整抗體重鏈或輕鏈的單個CDR。
在一些實施方案中，抗原結合片段可以形成嵌合抗原受體(CAR)的一部分。在一些實施方案中，嵌合抗原受體是與CD3-ζ跨膜結構域和胞內結構域融合的、如本文所述的單鏈可變片段(scFv)的融合物。在一些實施方案中，嵌合抗原受體還包含來自多種共刺激蛋白受體(例如，CD28、41BB、ICOS)的細胞內訊息傳導結構域。在一些實施方案中，嵌合抗原受體包含多個訊息傳導結構域(例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40)以增加效力。因此，在一個方面，本公開還提供了表現如本文所述的嵌合抗原受體的細胞(例如T細胞)。
在一些實施方案中，scFV包含一個重鏈可變結構域和一個輕鏈可變結構域。在一些實施方案中，scFV包含兩個重鏈可變結構域和兩個輕鏈可變結構域。TCR 衍生的CAR
所述抗體或其抗原結合部分可以作為重組受體(諸如抗原受體)的一部分在細胞上表現。抗原受體包括功能性非TCR抗原受體，諸如嵌合抗原受體(CAR)。通常，含有表現出針對在MHC分子的背景下的肽的TCR樣特異性的抗體或抗原結合片段的CAR也可以被稱為TCR樣CAR。因此，所提供的結合分子(例如HPV結合分子)包括抗原受體，諸如包括所提供的抗體之一(例如TCR樣抗體)的那些抗原受體。在一些實施方案中，抗原受體和其他嵌合受體與抗原(例如TCR樣抗體)的區域或表位特異性地結合。抗原受體包括功能性非TCR抗原受體，諸如嵌合抗原受體(CAR)。還提供了表現CAR的細胞及其在過繼細胞療法中的用途，所述過繼細胞療法諸如與HPV抗原表現相關的疾病和障礙的治療。
含有非TCR分子的TCR樣CAR當在MHC分子的背景下顯示或呈現時表現出T細胞受體特異性，諸如對T細胞表位或肽表位。在一些實施方案中，TCR樣CAR可以含有抗體或其抗原結合部分，例如TCR樣抗體，諸如本文所述的。在一些實施方案中，抗體或其抗體結合部分對在MHC分子的背景下的特定肽表位具有反應性，其中所述抗體或抗體片段可以將在MHC分子的背景下的特異性肽與單獨的MHC分子、單獨的特異性肽、以及在一些情況下在MHC分子的背景下的不相關肽區分開。在一些實施方案中，抗體或其抗原結合部分可以表現出比T細胞受體更高的結合親和力。
示例性抗原受體(包括CAR)以及將此類受體工程化並引入細胞中的方法，包括描述於例如US2002/131960、US2013/287748、US2013/0149337、U.S. 6,451,995、U.S. 7,446,190、U.S. 8,252,592中的那些；將所述專利中每一者全文以引用方式併入本文。
在一些實施方案中，CAR通常包括在一些方面經由連接子和/或一個或多個跨膜結構域與一種或多種細胞內訊息傳導組分連接的對肽具有特異性的細胞外抗原(或配體)結合結構域，包括例如抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，此類分子通常可以模擬或接近通過天然抗原受體(諸如TCR)的訊息，以及任選地通過與共刺激受體組合的這樣的受體的訊息。
在一些實施方案中，CAR通常在其細胞外部分中包括一個或多個抗原結合分子，諸如一個或多個抗原結合片段、結構域或部分、或一個或多個抗體可變結構域、和/或抗體分子。在一些實施方案中，CAR包括抗體分子的一個或多個抗原結合部分，諸如從單株抗體(mAh)的可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)衍生的單鏈抗體片段(scFv)。在一些實施方案中，CAR含有TCR樣抗體，諸如特異性地識別存在於細胞表面上的在MHC分子的背景下的肽表位的抗體或抗原結合片段(例如，scFv)。
在某些實施方案中，細胞內訊息傳導結構域包含與CD3(例如，CD3ζ)細胞內結構域連接的CD28跨膜和訊息傳導結構域。在一些實施方案中，細胞內訊息傳導結構域包含與CD3ζ細胞內結構域連接的嵌合CD28和CD137(4-lBB、TNFRSF9)共刺激結構域。
在一些實施方案中，結合分子還可以是基因工程化T細胞受體(TCR)、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、C型凝集素受體、白細胞免疫球蛋白樣受體(LILR)、1型細胞介素受體、2型細胞介素受體、腫瘤壞死因子家族、TGFβ受體、趨化因子受體、或免疫球蛋白超家族(IgSF)的成員。
在一些實施方案中，以任何數量的方式進一步修飾工程化細胞，使得其治療或預防功效增加。例如，被群體表現的工程化TCR或其他結合分子可以通過連接子直接或間接地偶聯至靶向部分。將結合分子(例如CAR或TCR)綴合至靶向部分的實踐是本領域已知的，並且例如在以下文獻中進行了描述：Wadhwa等人 “Receptor mediated glycotargeting.” Journal of drug targeting 3.2 (1995): 111-127；以及美國專利 號5,087,616；將所述文獻全文以引用方式併入本文。用於製備工程化細胞的方法
本公開提供了用於製備、製造工程化細胞和/或使用工程化細胞來治療病理性疾病或病症的方法或過程。
可以從樣品(諸如生物樣品，例如從受試者獲得或來源的生物樣品)中分離用於引入結合分子(例如TCR)的細胞。在一些實施方案中，從其分離細胞的受試者是患有疾病或病症或需要細胞療法、或將向其施用細胞療法的受試者。在一些實施方案中，受試者是需要特定治療干預(諸如針對其分離、處理細胞和/或對細胞進行工程化的過繼細胞療法)的人。
因此，在一些實施方案中，所述細胞是初代細胞，例如原代人細胞。樣品包括直接取自受試者的組織、流體和其他樣品，以及來自一個或多個處理步驟(諸如分離、離心、基因工程化(例如用病毒載體轉導)、洗滌和/或孵育)的樣品。生物樣品可以是直接從生物來源獲得的樣品或經過處理的樣品。生物樣品包括但不限於體液(諸如血液、血漿、血清、腦脊液、滑液、尿液和汗液)、組織和器官樣品，包括由其衍生的經處理樣品。
在一些方面，細胞從其中衍生或分離的樣品是血液或血液衍生的樣品，或者是或源自單采術或白細胞分離術產物。示例性樣品包括全血、周邊血液單核細胞(PBMC)、白細胞、骨髓、胸腺、組織活檢、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾、其他淋巴組織、肝、肺、胃、腸、結腸、腎、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宮頸、睾丸、卵巢、扁桃體或其他器官和/或由其衍生的細胞。在細胞療法(例如過繼細胞療法)的背景下，樣品包括來自自體和同種異體來源的樣品。
在一些實施方案中，所述細胞衍生自細胞系，例如T細胞系。在一些實施方案中，所述細胞獲得自異種來源，例如獲得自小鼠、大鼠、或非人靈長類動物。
在一些實施方案中，洗滌從受試者收集的血細胞，例如以去除血漿級分並將細胞置於適當的緩衝液或介質中以用於隨後的加工步驟。在一些實施方案中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌所述細胞。在一些實施方案中，洗滌溶液缺乏鈣和/或鎂和/或許多或所有二價陽離子。在一些方面，通過半自動化“流通式”離心完成洗滌步驟。在一些方面，通過切向流過濾(TFF)完成洗滌步驟。在一些實施方案中，洗滌後將細胞重懸于多種生物相容性緩衝液(諸如，例如不含Ca2+ /Mg2+ 的PBS)中。在某些實施方案中，去除血細胞樣品的組分並將所述細胞直接重懸於培養基中。在一些實施方案中，所述方法包括基於密度的細胞分離方法，如通過裂解紅細胞並通過Percoll或Ficoll梯度進行離心來從周邊血液製備白細胞。
在一些實施方案中，所述方法包括以下中的一個或多個步驟：例如，從患者血液中分離T細胞；用病毒載體轉導群體T細胞，所述病毒載體包括編碼基因工程化抗原受體的核酸構建體；體外擴增經轉導的細胞；和/或將擴增的細胞輸注到患者體內，在那裡工程化T細胞將尋找並破壞抗原陽性的腫瘤細胞。在一些實施方案中，核酸構建體還包括編碼抑制蛋白的序列。在一些實施方案中，這些工程化T細胞可以阻斷PD-1/PD-L1免疫抑制並增強抗腫瘤免疫反應。所述方法還包括：用含有核酸構建體的病毒載體轉染T細胞。
在一些實施方案中，所述方法涉及將本文所述的任何載體體外或離體引入細胞中。在一些實施方案中，載體是病毒載體，並且所述引入通過轉導來進行。在一些實施方案中，所述方法還涉及將一種或多種藥劑引入細胞中，其中所述一種或多種藥劑中的每一種獨立地能夠誘發T細胞受體α鏈恆定區(TRAC)基因和/或T細胞受體β鏈恆定區(TRBC)基因的遺傳破壞。在一些實施方案中，所述一種或多種藥劑是抑制核酸(例如siRNA)。在一些實施方案中，所述一種或多種藥劑是包含DNA靶向蛋白和核酸酶或RNA指導的核酸酶的融合蛋白(例如，成簇的規律間隔短回文核酸(CRISPR)相關的核酸酶)。
熟練技術人員通過使用任何標準方法諸如磷酸鈣、電穿孔、脂質體介導的轉移、顯微注射、生物彈顆粒遞送系統、或任何其他已知方法可以實現T細胞的轉染。在一些實施方案中，使用磷酸鈣方法進行T細胞的轉染。
根據本文所述的各種實施方案，本公開提供了針對腫瘤(特別是HPV相關癌症)的免疫療法。工程化T細胞識別腫瘤相關的HPV抗原，並同時分泌阻斷程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)的單鏈抗體(scFv)融合蛋白。這些工程化T細胞表現出更強的抗腫瘤反應和減少的T細胞衰竭。從實驗上已經發現，PD-1檢查點阻斷在本文所述的方法中更有效，因為抗PD-1藥劑的遞送位於腫瘤部位，因此在腫瘤部位具有更高的濃度。而且，因為抗PD-1藥物的遞送位於腫瘤部位，因此降低了由於非特異性炎症引起的毒性。本公開提供了與現有替代方案相比，抗HPV TCR和抗PD-1抗體的組合改善了T細胞活化和/或防止了T細胞衰竭。
本公開提供了創建個性化抗腫瘤免疫療法的方法。基因工程化T細胞可以從患者的血細胞產生。然後，將這些工程化T細胞作為細胞療法產品重新輸注到患者體內。該產品可以應用於患有HPV相關腫瘤的任何患者，所述HPV相關腫瘤包括但不限於宮頸癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌和口咽癌。
製備工程化細胞並將這些工程化細胞施用至受試者的方法是本領域已知的，並且描述於例如美國專利 號10,174,098和Draper等人 “Targeting Of HPV-16+ Epithelial Cancer Cells By Tcr Gene Engineered t Cells Directed Against e6.” Clinical Cancer Research 21.19 (2015): 4431-4439中，將所述文獻中的二者全文以引用方式併入。治療方法
本文公開的方法可以用於各種治療目的。在一個方面，本公開提供了用於治療受試者的癌症的方法，降低受試者中腫瘤體積隨時間增加的速率的方法，降低發生轉移的風險的方法、或降低受試者中發生額外轉移的風險的方法。在一些實施方案中，治療可以停止、減慢、延緩或抑制癌症的進展。在一些實施方案中，治療可以導致受試者中癌症的一種或多種症狀的數量、嚴重性和/或持續時間的減少。
在一個方面，本公開的特徵在於方法，其包括將治療有效量的表現TCR、其抗原結合片段和TCR衍生的結合分子的工程化細胞施用至有需要的受試者(例如，患有或鑒定為或診斷為患有癌症(例如HPV相關的癌症)的受試者)。在一些實施方案中，所述HPV相關的癌症是宮頸癌、頭頸癌、口咽癌、肛門癌、陰莖癌、陰道癌或外陰癌。
在一些實施方案中，所述受試者患有實體瘤。在一些實施方案中，所述受試者患有乳腺癌(例如三陰性乳腺癌)、類癌、宮頸癌、子宮內膜癌、神經膠質瘤、頭頸癌、肝癌、肺癌、小細胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、腎癌、結直腸癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、膀胱癌、尿道癌或血液系統惡性腫瘤。在一些實施方案中，所述癌症是不可切除的黑色素瘤或轉移性黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、膀胱癌或轉移性激素難治性前列腺癌。
在一些實施方案中，本文公開的組合物和方法可以用於治療處於患癌症風險的患者。癌症患者可以通過本領域已知的各種方法來鑒定。
此外，本公開提供了用於治療受試者的感染或感染相關病症的方法。在一些實施方案中，治療可以停止、減慢、延緩或抑制疾病的進展。這些方法通常涉及將治療有效量的本文公開的基因工程化細胞施用至有需要的受試者。在一些實施方案中，待治療的疾病或病症是感染性疾病或病症，諸如但不限於病毒、反轉錄病毒、細菌和原生動物感染、免疫缺陷、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、巨細胞病毒(CMV)、愛潑斯坦巴爾病毒(EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。
如本文所用，“有效量”意指足以實現有益或期望結果(包括停止、減慢、延緩或抑制疾病(例如癌症)的進展)的量或劑量。有效量將根據例如將要向其施用治療劑和/或治療組合物的受試者的年齡和體重、症狀的嚴重性和施用途徑而變化，並且因此可以在個體基礎上確定施用。
如本文所用，術語“延遲疾病的發展”是指推遲、阻礙、減慢、延緩、穩定、抑制和/或延期疾病(例如癌症)的發展。該延遲可以具有不同的時間長度，這取決於病史和/或所治療的個體。對於本領域技術人員顯而易見的是，足夠或顯著的延遲實際上可以涵蓋預防，因為個體不會患上疾病。例如，可能延遲晚期癌症，諸如轉移的發展。
有效量可以在一次或多次給藥中進行施用。舉例來說，組合物的有效量是足以改善、停止、穩定、逆轉、抑制、減慢和/或延遲患者癌症進展的量，或者是足以在體外改善、停止、穩定、逆轉、減慢和/或延遲細胞(例如，活檢的細胞、本文所述的任何癌細胞、或細胞系(例如癌細胞系))的增殖的量。如本領域中所理解的，有效量可以根據尤其是患者病史以及其他因素諸如所使用的組合物的類型(和/或劑量)而變化。
可以根據經驗確定施用的有效量和時間表，並且進行這種確定在本領域技術範圍內。本領域技術人員將理解，必須施用的劑量將根據例如將接受治療的哺乳動物、施用途徑、向哺乳動物施用的治療劑和其他藥物的特定類型而變化。選擇適當劑量的指南可以在文獻中找到。此外，治療不一定導致對疾病或病症的100%或完全治療或預防。有多種具有不同程度治療效果的治療/預防方法可用，本領域普通技術人員將其視為潛在有利的治療手段。
在一些方面，本公開還提供了診斷哺乳動物中的疾病/病症的方法，其中所述TCR、抗原結合片段、TCR衍生的結合分子與從受試者獲得的一個或多個樣品發生相互作用以形成複合物，其中所述樣品可以包含一種或多種細胞、多肽、蛋白質、核酸、抗體、或抗原結合部分；血液、全細胞、其裂解物、或全細胞裂解物的級分，例如細胞核或細胞質級分、全蛋白級分、或其核酸級分，其中對複合物的檢測指示哺乳動物中病症的存在，其中所述病症是癌症、HPV感染或HPV陽性初癌。此外，對複合物的檢測可以通過任何數量的本領域已知的方式，但不限於ELISA、流式細胞術、螢光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈反應(PCR)、微陣列、南方印漬術、電泳、噬菌體分析、層析等。因此，治療方法可以還包括例如通過確定受試者是否患有HPV感染或HPV相關的癌症來確定受試者是否可以從本文公開的治療中受益。
在本文所述的任何方法中，工程化細胞和、和/或至少一種另外的治療劑可以每週至少一次(例如，每週一次、每週兩次、每週三次、每週四次、每天一次、每天兩次或每天三次)施用至受試者。在一些實施方案中，將至少兩種不同的工程化細胞(例如表現不同結合分子的細胞)以同一組合物(例如液體組合物)施用。在一些實施方案中，將工程化細胞和至少一種另外的治療劑以同一組合物(例如液體組合物)施用。在一些實施方案中，將工程化細胞和至少一種另外的治療劑以兩種不同的組合物施用。在一些實施方案中，將所述至少一種另外的治療劑以丸劑、片劑或膠囊劑施用。在一些實施方案中，將所述至少一種另外的治療劑以持續釋放的口服配製品施用。
在一些實施方案中，可以在將工程化細胞施用至受試者之前、同時或之後，將一種或多種另外的治療劑施用至受試者。
在一些實施方案中，可以將一種或多種另外的治療劑施用至受試者。所述另外的治療劑可以是檢查點抑制劑(CPI)。在一些實施方案中，檢查點抑制劑是抑制蛋白，例如抗體或其抗原結合片段。檢查點抑制劑可以抑制或阻斷一個或多個免疫檢查點，包括例如PD-1、PD-L1、PD-L2、2B4(CD244)、4-1BB、A2aR、B7.1、B7.2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BTLA、嗜乳脂蛋白、CD160、CD48、CTLA4、GITR、gp49B、HHLA2、HVEM、ICOS、ILT-2、ILT-4、KIR家族受體、LAG-3、OX-40、PIR-B、SIRPα(CD47)、TFM-4、TIGIT、TIM-1、TIM-3、TIM-4、VISTA及其組合。在一些實施方案中，抑制蛋白阻斷PD-1或PD-Ll。在各種實施方案中，抑制蛋白包含抗PD-1 scFv。抑制蛋白能夠導致群體的T細胞中PD-1或PD-L1的表現降低和/或抑制PD-1或PD-L1的上調、和/或在物理上阻礙PD-1/PD-L1複合物的形成和隨後的訊息轉導。在一些實施方案中，抑制蛋白阻斷PD-1。在一些實施方案中，另外的治療劑是抗OX40抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗LAG-3抗體、抗TIGIT抗體、抗BTLA抗體、抗CTLA-4抗體、或抗GITR抗體。在一些實施方案中，另外的治療劑是抗CTLA4抗體(例如易普利姆瑪)、抗CD20抗體(例如利妥昔單抗)、抗EGFR抗體(例如西妥昔單抗)、抗CD319抗體(例如埃羅妥珠單抗(elotuzumab))或抗PD1抗體(例如納武單抗)。
在一些實施方案中，另外的治療劑是雙功能陷阱融合蛋白。雙功能陷阱蛋白可以靶向免疫檢查點和TGF-β負調控途徑二者。除了表現免疫檢查點外，腫瘤微環境還含有其他免疫抑制分子。特別令人感興趣的是在癌症中具有多種功能的細胞介素TGF-β(TGFB)。TGF-β在腫瘤發展的早期阻止腫瘤細胞的增殖並促進分化和凋亡。然而，在腫瘤進展期間，由於TGF-β受體表現的喪失或下游訊息傳導元件的突變而引起腫瘤TGF-β不敏感性。然後，TGF-β通過其對血管生成、上皮-間充質轉化(EMT)的誘發和免疫抑制的作用來促進腫瘤進展。高的TGF-β血清位準和在腫瘤上TGF-β受體(TGFβR)表現的喪失與不良預後相關。TGFβ靶向療法已展示出有限的臨床活性。在一些實施方案中，雙功能陷阱蛋白靶向PD-1和TGF-β二者。在一些實施方案中，雙功能陷阱蛋白靶向PD-L1和TGF-β二者。在一些實施方案中，雙功能融合蛋白設計成阻斷PD-L1和螯合(sequester)TGF-β。基於人IgG1單株抗體(mAb)阿維魯單抗(avelumab)，M7824(MSB0011395C)包含與人抗PD-L1 scFv的C末端連接的人TGF-β受體II(TGFβRII)的細胞外結構域。在一些實施方案中，雙功能融合蛋白包含與人抗PD-1 scFv的C末端連接的人TGF-β受體II(TGFβRII)的細胞外結構域。這些雙功能陷阱融合蛋白描述於例如Knudson, 等人 “M7824, a novel bifunctional anti-PD-L1/TGFβ Trap fusion protein, promotes anti-tumor efficacy as monotherapy and in combination with vaccine.” Oncoimmunology 7.5 (2018): e1426519；將所述文獻全文以引用方式併入本文。在一些實施方案中，用表現本文所述的TCR或抗原結合分子的細胞和一種或多種雙功能陷阱融合蛋白治療受試者。
在一個一些實施方案中，所述另外的治療劑可以包含一種或多種抑制劑，所述一種或多種抑制劑選自由以下組成的組：B-Raf的抑制劑、EGFR抑制劑、MEK抑制劑、ERK抑制劑、K-Ras抑制劑、c-Met抑制劑、間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑、磷脂醯肌醇3激酶(PI3K)抑制劑、Akt抑制劑、mTOR抑制劑、PI3K/mTOR雙重抑制劑、布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)抑制劑、以及異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)和/或異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)的抑制劑。在一些實施方案中，所述另外的治療劑是吲哚胺2,3-二加氧酶-1)(IDO1)的抑制劑(例如艾卡哚司他(epacadostat))。在一些實施方案中，所述另外的治療劑可以包含一種或多種抑制劑，所述一種或多種抑制劑選自由以下組成的組：HER3抑制劑、LSD1抑制劑、MDM2抑制劑、BCL2抑制劑、CHK1抑制劑、活化的hedgehog訊息傳導途徑的抑制劑，以及選擇性地降解雌激素受體的藥劑。
在一些實施方案中，所述另外的治療劑可以包含一種或多種治療劑，所述一種或多種治療劑選自由以下組成的組：曲貝替定、白蛋白結合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、Trebananib、帕唑帕尼、西地尼布、帕博昔布、依維莫司、氟嘧啶、IFL、瑞戈非尼、Reolysin、力比泰(Alimta)、Zykadia、索坦(Sutent)、坦西莫司、阿昔替尼、依維莫司、索拉非尼、Votrient、帕唑帕尼、IMA-901、AGS-003、卡博替尼、長春氟寧、Hsp90抑制劑、Ad-GM-CSF、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、長春鹼、沙立度胺(Thalomid)、達卡巴嗪、環磷醯胺、來那度胺、氮雜胞苷、來那度胺、硼替佐米、氨柔比星(amrubicine)、卡非佐米、普拉曲沙和恩扎妥林。
在一些實施方案中，所述另外的治療劑可以包含一種或多種治療劑，所述一種或多種治療劑選自由以下組成的組：佐劑、TLR促效劑、腫瘤壞死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗劑、IL-4拮抗劑、IL-13拮抗劑、IL-17拮抗劑、HVEM拮抗劑、ICOS促效劑、靶向CX3CL1的治療、靶向CXCL9的治療、靶向CXCL10的治療、靶向CCL5的治療、LFA-1促效劑、ICAM1促效劑和選擇素(Selectin)促效劑。
在一些實施方案中，將卡鉑、白蛋白結合型紫杉醇、紫杉醇、順鉑、培美曲塞、吉西他濱、FOLFOX或FOLFIRI施用至受試者。在一些實施方案中，所述另外的治療劑選自天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅黴素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔單抗、長春鹼、長春新鹼和/或其組合。組合物和配製品
本公開提供了含有通過本文公開的方法生產的工程化細胞及其群體的組合物(包括藥物組合物和治療組合物)。還提供了用於向受試者(例如患者)施用工程化細胞及其組合物的方法(例如治療方法)。
提供了包括用於施用的工程化T細胞的組合物，包括藥物組合物和配製品，諸如包括用於以給定劑量或其部分施用的細胞數量的單位劑型組合物。藥物組合物和配製品可以包括一種或多種任選的藥學上可接受的載體或賦形劑。在一些實施方案中，所述組合物包括至少一種另外的治療劑。
藥學上可接受的載體是指藥物組合物中除活性成分以外的成分。藥學上可接受的載體不干擾活性成分並且對受試者無毒。藥學上可接受的載體可以包括但不限於緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。藥物配製品是指將不同的物質和/或藥劑組合以產生最終藥物產品的過程。配製品研究涉及開發對於患者可接受的藥物製劑。另外，是這樣的製劑，其處於使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，並且不含對給予配製品的受試者具有不可接受的毒性的另外的組分。
在一些實施方案中，載體的選擇部分地由特定細胞(例如T細胞或NK細胞)和/或由施用方法來確定。多種合適的配製品是可用的。例如，藥物組合物可以含有防腐劑。合適的防腐劑可以包括例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉和苯扎氯銨。在一些實施方案中，使用兩種或更多種防腐劑的混合物。所述防腐劑或其混合物通常以按總組合物的重量計約0.0001%至約2%的量存在。載體描述於例如Remington’s Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編輯 (1980)中。藥學上可接受的載體在所用的劑量和濃度下通常對接受者無毒，並且包括但不限於：緩衝劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲氯銨；苯扎氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；烷基對羥基苯甲酸酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬絡合物(例如鋅-蛋白質絡合物)；和/或非離子表面活性劑，如聚乙二醇(PEG)。
合適的緩衝劑包括例如檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀和各種其他酸和鹽。在一些實施方案中，使用兩種或更多種緩衝劑的混合物。所述緩衝劑或其混合物通常以按總組合物的重量計約0.001%至約4%的量存在。用於製備可給予的藥物組合物的方法是已知的。示例性方法在例如以下文獻中有更詳細的描述：Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 第21版 (2005年5月1日)。
配製品可以包括水性溶液。所述配製品或組合物還可以含有可用於正在用工程化細胞治療的特定適應症、疾病或病症的超過一種活性成分，優選地具有與所述細胞互補的活性的那些成分，其中各自的活性不會彼此產生不利影響。此類活性成分以有效用於既定目的的量以合適的方式組合存在。因此，在一些實施方案中，藥物組合物還可以包括其他藥物活性藥劑或藥物，諸如檢查點抑制劑、融合蛋白、化學治療劑，例如天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅黴素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔單抗、長春鹼和/或長春新鹼。
在一些實施方案中，藥物組合物含有有效治療或預防疾病或病症的量(諸如治療有效量或預防有效量)的細胞。在一些實施方案中，通過定期評估所治療的受試者來監測治療或預防功效。所需劑量可以通過細胞的單次推注施用、通過細胞的多次推注施用或通過細胞的連續輸注施用來遞送。
細胞和組合物可以使用標準給藥技術、配製品和/或裝置來施用。所述細胞的施用可以是自體的或異源的。例如，免疫反應T細胞或祖細胞可以獲得自一名受試者，並且在根據本文所述的各種實施方案將其進行遺傳修飾之後，將其施用至同一受試者或不同的相容受試者。周邊血液衍生的免疫反應T細胞或其後代(例如，體內、離體或體外衍生的)可以通過局部注射施用，包括導管施用、全身注射、局部注射、靜脈內注射或腸胃外施用。通常，當施用治療性組合物(例如，含有遺傳修飾的免疫反應細胞的藥物組合物)時，通常將其配製成單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液、乳液)。
本文公開的配製品包括用於口服、靜脈內、腹膜內、皮下、經肺、透皮、肌內、鼻內、經頰、舌下或栓劑施用的那些。在一些實施方案中，腸胃外地施用所述細胞群。如本文所用，術語“腸胃外”包括靜脈內、肌內、皮下、直腸、陰道和腹膜內施用。在一些實施方案中，通過靜脈內、腹膜內或皮下注射使用外周全身遞送將細胞施用至受試者。
在一些實施方案中，組合物作為無菌液體製劑提供，所述無菌液體製劑例如為等滲水性溶液、懸浮液、乳液、分散體或黏性組合物，其在一些方面可以緩衝至選擇的pH。液體製劑一般比凝膠、其他黏性組合物和固體組合物製備起來更容易。另外地，液體組合物稍微更方便施用，特別是通過注射。在另一方面，黏性組合物可以配製在適當的黏度範圍內，以提供與特定組織的更長的接觸時間。液體或黏性組合物可以包含載體，所述載體可以是溶劑或分散介質，所述溶劑或分散介質含有例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及其合適的混合物。
無菌可注射溶液可以通過將細胞摻入溶劑中來製備，例如與合適的載體、稀釋劑或賦形劑(如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖等)混合。所述組合物可以含有輔助物質，諸如潤濕劑、分散劑或乳化劑(例如甲基纖維素)、pH緩衝劑、膠凝或黏度增強添加劑、防腐劑、調味劑和/或顏料，這取決於施用途徑和所需的製劑。在一些方面，可以參考標準文本來製備合適的製劑。
可以添加增強所述組合物的穩定性和無菌性的各種添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑和緩衝劑。可以通過各種抗細菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)來確保防止微生物作用。可以通過使用延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)實現可注射藥物形式的延長吸收。
用於進行體內 施用的配製品通常是無菌的。可以例如通過經無菌濾膜過濾容易地實現無菌性。
本文所述的組合物或藥物組合物可以與施用說明書一起包含在容器、包裝或分配器中。施用方法
還提供了施用細胞、群體和組合物的方法，以及此類細胞、群體和組合物治療或預防疾病、病症和障礙(包括癌症)的用途。在一些實施方案中，本文所述的方法可以降低發生本文所述的疾病、病症和障礙的風險。
在一些實施方案中，將本文所述的細胞、群體和組合物施用至受試者或患者，所述受試者或患者患有將要例如通過過繼細胞療法(諸如過繼T細胞療法)治療的特定疾病或病症。在一些實施方案中，將通過所提供的方法製備的細胞和組合物(諸如孵育和/或其他處理步驟後的工程化組合物和最終生產組合物)施用至受試者，諸如患有疾病或病症或具有患上疾病或病症的風險的受試者。在一些方面，所述方法由此治療疾病或病症(例如，改善疾病或病症的一種或多種症狀)，諸如通過減輕表現由工程化T細胞識別的抗原的癌症中的腫瘤負荷來治療。
用於施用過繼細胞療法的細胞的方法是已知的，並且可以與所提供的方法和組合物結合使用。例如，過繼T細胞療法的方法描述於例如U.S. 2003/0170238；美國專利 號4,690,915；Rosenberg, “Cell transfer immunotherapy for metastatic solid cancer—what clinicians need to know.” Nature reviews Clinical oncology 8.10 (2011): 577；Themeli等人 “Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy.” Nature biotechnology 31.10 (2013): 928；Tsukahara等人 “CD19 target-engineered T-cells accumulate at tumor lesions in human B-cell lymphoma xenograft mouse models.” Biochemical and biophysical research communications 438.1 (2013): 84-89；Davila等人 “CD19 CAR-targeted T cells induce long-term remission and B Cell Aplasia in an immunocompetent mouse model of B cell acute lymphoblastic leukemia.” PloS one 8.4 (2013)；將所述文獻中每一者全文以引用方式併入本文。
在一些實施方案中，通過自體轉移進行細胞療法(例如過繼T細胞療法)，其中從將要接受細胞療法的受試者中或從衍生自這樣的受試者的樣品中分離和/或以其他方式製備T細胞。因此，在一些方面，所述細胞源自於需要治療的受試者(例如患者)，並且在分離和處理後將所述細胞施用至同一受試者。
在一些實施方案中，通過同種異體轉移進行細胞療法(例如過繼T細胞療法)，其中從除將要接受或最終接受細胞療法的受試者以外的受試者(例如第一受試者)分離和/或以其他方式製備T細胞。在此類實施方案中，細胞隨後被施用至同一物種的不同受試者(例如第二受試者)。在一些實施方案中，所述第一受試者和第二受試者在遺傳上是相同的。在一些實施方案中，所述第一受試者和第二受試者在遺傳上是相似的。在一些實施方案中，所述第二受試者與所述第一受試者表現相同的HLA類別或超類型。
在一些實施方案中，在施用細胞或含有細胞的組合物之前，已經用靶向疾病或病症(例如腫瘤)的治療劑對受試者進行過治療。在一些方面，受試者對其他治療劑是難治的或無反應。在一些實施方案中，受試者例如在用另一種治療性干預進行治療後具有持續性或復發性疾病，所述治療性干預包括化學療法、放射線和/或造血幹細胞移植(HSCT)(例如同種異體HSCT)。在一些實施方案中，儘管受試者已經對另一種療法產生抗性，但施用仍有效地治療受試者。
在一些實施方案中，受試者對其他治療劑有反應，並且用所述治療劑進行治療降低了疾病負荷。在一些方面，受試者最初對所述治療劑有反應，但是隨著時間的推移展現出疾病或病症的復發。在一些實施方案中，受試者尚未復發。在一些此類實施方案中，確定受試者處於復發的風險中，諸如處於高復發風險中，因此預防性地施用細胞，例如以降低復發的可能性或防止復發。在一些實施方案中，受試者尚未接受用另一種治療劑的先前治療。
在一些實施方案中，細胞以所需劑量施用，所述所需劑量在一些方面包括所需劑量或數量的細胞或一種或多種細胞類型和/或所需比率的細胞類型。因此，在一些實施方案中，細胞劑量基於細胞總數(或每kg體重的細胞數量)和所需的單個群體或亞型的比率，諸如CD4+與CD8 +的比率。在一些實施方案中，細胞劑量基於所需的單個群體中的細胞或單個細胞類型的總數(或每kg體重的細胞數量)。在一些實施方案中，劑量基於此類特徵的組合，諸如所需的總細胞數、所需比率、和單個群體中所需的細胞總數。
在一些實施方案中，以所需劑量的總細胞(諸如所需劑量的T細胞)的耐受差異或在所述耐受差異之內施用細胞的群體或亞型(諸如CD8+和CD4+ T細胞)。在一些實施方案中，所需劑量是所需細胞數或被施用所述細胞的受試者的每單位體重的所需細胞數(例如細胞/kg)。在一些實施方案中，所需劑量等於或高於最小細胞數或每單位體重的最小細胞數。在一些實施方案中，在以所需劑量施用的總細胞中，單個群體或亞型以等於或接近所需輸出比率(諸如CD4+與CD8+的比率)(例如在這種比率的一定耐受差異或誤差內)存在。
在一些實施方案中，以所需劑量的一種或多種單個細胞群體或亞型(諸如所需劑量的CD4+細胞和/或所需劑量的CD8+細胞)的耐受差異或在所述耐受差異之內施用細胞。在一些實施方案中，所需劑量是所需的所述亞型或群體的細胞數或所需的被施用所述細胞的受試者的每單位體重的此類細胞數(例如細胞/kg)。在一些實施方案中，所需劑量等於或高於最小的所述群體或亞型的細胞數或每單位體重的最小的所述群體或亞型的細胞數。
因此，在一些實施方案中，劑量基於所需的總細胞固定劑量和所需比率，和/或基於所需固定劑量的一種或多種(例如每一種)單個亞型或亞群。因此，在一些實施方案中，劑量基於所需固定劑量或最小劑量的T細胞和所需的CD4+與CD8+細胞的比率，和/或基於所需固定劑量或最小劑量的CD4+和/或CD8+細胞。
在某些實施方案中，將細胞、或細胞的單個群體或亞型以約100萬至約1000億個細胞(諸如，例如100萬至約500億個細胞(例如，約500萬個細胞、約2500萬個細胞、約5億個細胞、約10億個細胞、約50億個細胞、約200億個細胞、約300億個細胞、約400億個細胞或由前述值中的任兩個值所限定的範圍)，諸如約1000萬至約1000億個細胞(例如，約2000萬個細胞、約3000萬個細胞、約4000萬個細胞、約6000萬個細胞、約7000萬個細胞、約8000萬個細胞、約9000萬個細胞、約100億個細胞、約250億個細胞、約500億個細胞、約750億個細胞、約900億個細胞或由前述值中的任兩個值所限定的範圍)，並且在一些情況下約1億個細胞至約500億個細胞(例如，約1.2億個細胞、約2.5億個細胞、約3.5億個細胞、約4.5億個細胞、約6.5億個細胞、約8億個細胞、約9億個細胞、約30億個細胞、約300億個細胞、約450億個細胞或在這些範圍之間的任何值)施用至受試者。
在一些實施方案中，總細胞的劑量和/或單個細胞亞群的劑量在以下範圍內：在為或約104 與為或約109 個細胞/千克(kg)體重之間，諸如在105 與106 個細胞/kg體重之間，例如，至少或至少約或為或約1×105 個細胞/kg體重、1.5×105 個細胞/kg體重、2×105 個細胞/kg體重、或1×106 個細胞/kg體重。例如，在一些實施方案中，以在為或約104 與為或約109 個T細胞/千克(kg)體重之間，諸如在105 與106 個T細胞/kg體重之間，例如，至少或至少約或者為或約1×105 個T細胞/kg體重、1.5×105 個T細胞/kg體重、2×105 個T細胞/kg體重、或1×106 個T細胞/kg體重，或在其一定誤差範圍內施用細胞。
在一些實施方案中，以在為或約104 與為或約109 個CD4+和/或CD8+細胞/千克(kg)體重之間，諸如在105 與106 個CD4+和/或CD8+細胞/kg體重之間，例如，至少或至少約或者為或約1×105 個CD4+和/或CD8+細胞/kg體重、1.5×105 個CD4+和/或CD8+細胞/kg體重、2×105 個CD4+和/或CD8+細胞/kg體重、或1×106 個CD4+和/或CD8+細胞/kg體重，或在其一定誤差範圍內施用細胞。
在一些實施方案中，以大於、和/或至少約1×106 、約2.5×106 、約5×106 、約7.5×106 、或約9×106 個CD4+細胞、和/或至少約1×106 、約2.5×106 、約5×106 、約7.5×106 、或約9×106 個CD8+細胞、和/或至少約1×106 、約2.5×106 、約5×106 、約7.5×106 、或約9×106 個T細胞，或在其一定誤差範圍內施用細胞。在一些實施方案中，以在約108 與1012 個之間或在約1010 與1011 個之間的T細胞、在約108 與1012 個之間或在約1010 與1011 個之間的CD4+細胞，和/或在約108 與1012 個之間或在約1010 與1011 個之間的CD8+細胞，或在其一定誤差範圍內施用細胞。
在一些實施方案中，在多種細胞群或亞型(諸如CD4+和CD8+細胞或亞型)的所需輸出比率的耐受範圍下或在其耐受範圍內施用細胞。在一些方面，所需比率可以是特定比率或可以是比率範圍。例如，在一些實施方案中，所需比率(例如，CD4+與CD8+細胞的比率)在為或約1 : 5與為或約5 : 1之間(或大於約1 : 5且小於約5 : 1)，或在為或約1 : 3與為或約3 : 1之間(或大於約1 : 3且小於約3 : 1)，如在為或約2 : 1與為或約1 : 5之間(或大於約1 : 5且小於約2 : 1)，或例如為或約5 : 1、4.5 : 1、4 : 1、3.5 : 1、3 : 1、2.5 : 1、2 : 1、1.9 : 1、1.8 : 1、1.7 : 1、1.6 : 1、1.5 : 1、1.4 : 1、1.3 : 1、1.2 : 1、1.1 : 1、1 : 1、1 : 1.1、1 : 1.2、1 : 1.3、1 : 1.4、1 : 1.5、1 : 1.6、1 : 1.7、1 : 1.8、1 : 1.9、1 : 2、1 : 2.5、1 : 3、1 : 3.5、1 : 4、1 : 4.5或1 : 5。在一些方面，耐受差異在所需比率的約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%內，包括在這些範圍之間的任何值。在一些方面，這裡所述的TCR提供了改善的表現和活性，從而即使在低的效應子與靶標(E:T)比率下也提供治療效果。
對療法的最佳反應可能取決於工程化重組受體(諸如TCR)在細胞表面上一致且可靠地表現和/或結合靶抗原的能力。例如，在一些情況下，當在一些情況下在細胞(諸如人T細胞)中表現，用於細胞療法時，某些重組受體(例如TCR)的特性可能影響重組受體的表現和/或活性。在一些情境下，特定重組受體(例如TCR)的表現位準可能很低，並且表現此類重組受體的工程化細胞(諸如人T細胞)的活性可能由於表現不良或訊息傳導活性不佳而受到限制。在一些情況下，重組受體的表現的一致性和/或效率以及受體的活性在可用的治療方法的某些細胞或某些細胞群中受到限制。在一些情況下，需要大量的工程化T細胞(高的效應子與靶標(E:T)比率)來展現出功能活性。在一些實施方案中，所需比率(E:T比率)在為或約1:10與為或約10:1之間(或大於約1:10且小於約10:1)、或在為或約1:1與為或約10:1之間(或大於約1:1且小於約5:1)，諸如在為或約2:1與為或約10:1之間。在一些實施方案中，E:T比率為大於或約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、或10:1。
為了預防或治療疾病，適當的劑量可能取決於待治療的疾病類型、細胞或重組受體的類型、疾病的嚴重性和病程、細胞是否針對預防或治療目的而被施用、先前療法、受試者的臨床病史和對細胞的反應以及主治醫師的決斷。在一些實施方案中，適合將組合物和細胞一次或在一系列治療中施用至受試者。
本文所述的細胞可以通過任何合適的手段施用，例如通過推注輸注，通過注射例如靜脈內或皮下注射、眼內注射、眼周注射、視網膜下注射、玻璃體內注射、經中隔注射、鞏膜下注射、脈絡膜內注射、前房注射、結膜下(subconjectval)注射、結膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、球後注射、球周注射或後近鞏膜(posterior juxtascleral)遞送。在一些實施方案中，將它們通過腸胃外、肺內和鼻內施用以及(如果需要用於局部治療的話)病灶內施用。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下施用。在一些實施方案中，將給定劑量通過細胞的單次推注給藥來施用。在一些實施方案中，給定劑量通過細胞的多次推注給藥例如在不超過3天的時間段內來施用，或通過細胞的連續輸注給藥。
在一些實施方案中，所述細胞作為組合治療的一部分施用，如與另一種治療性干預如抗體或工程化細胞或受體或藥劑(如細胞毒性劑或治療劑)同時施用或以任何順序依次施用。在一些實施方案中，所述細胞與一種或多種另外的治療劑共同施用或與另一種治療性干預結合施用(同時或以任何順序依次施用)。在一些情境下，將所述細胞與另一種療法在時間上足夠接近地共同施用，使得所述細胞群增強一種或多種另外的治療劑的效果，或反之亦然。在一些實施方案中，在一種或多種另外的治療劑之前施用細胞。在一些實施方案中，在一種或多種另外的治療劑之後施用細胞。在一些實施方案中，一種或多種另外的藥劑包括細胞介素(如IL-2)，例如以增強持久性。在一些實施方案中，所述方法包括施用化學治療劑。
在一些實施方案中，在施用細胞後，例如通過許多已知方法中的任一種測量工程化細胞群的生物學活性。待評估的參數包括工程化T細胞與抗原的特異性結合，其在體內例如通過成像進行評估，或者離體例如通過ELISA或流式細胞術進行評估。在某些實施方案中，可以使用本領域已知的任何合適的方法測量工程化細胞破壞靶細胞的能力，所述方法諸如描述於例如Kochenderfer等人 “Construction and pre-clinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor.” Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md.: 1997) 32.7 (2009): 689以及Hermans等人 “The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL-and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.” Journal of immunological methods 285.1 (2004): 25-40中。在某些實施方案中，通過測定一種或多種細胞介素(諸如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表現和/或分泌來測量細胞的生物活性。在一些方面，通過評估臨床結果(諸如腫瘤負荷或負擔的減少)來測量生物活性。給藥時間表和治療方案
提供了重複給藥方法，其中給予第一劑量的細胞，隨後給予一個或多個第二連續劑量。當以過繼療法方法施用至受試者時，通常設計細胞的多個劑量的時間安排和大小以增加如本文所述的工程化細胞的功效和/或活性和/或功能。在一些實施方案中，重複給藥減少了當抑制性免疫分子(諸如PD-1和/或PD-L1)在工程化T細胞上被上調時可能發生的下調或抑制活性。所述方法涉及施用第一劑量，通常隨後是一個或多個連續劑量，在不同劑量之間具有特定的時間範圍。
在過繼細胞療法的情境下，給定“劑量”的施用包括以單一組合物和/或單次不間斷給藥的方式(例如以單次注射或連續輸注的方式)施用給定量或數量的細胞，並且還涵蓋在指定時間段(例如不超過3天)內以在多種單獨組合物或多次單獨輸注中提供的分割劑量的方式施用給定量或數量的細胞。因此，在一些情境下，第一或連續劑量是在單個時間點給予或開始的對指定數量的細胞的單次或連續施用。然而，在一些情境下，將第一或連續劑量在受限的時間段(例如不超過三天)內以多次注射或輸注的方式施用，諸如每天一次施用持續三天或兩天或者通過在一天的時間段內多次輸注的方式施用。
第一劑量的細胞以單一藥物組合物施用。在一些實施方案中，連續劑量的細胞以單一藥物組合物施用。
在一些實施方案中，第一劑量的細胞以共同含有第一劑量的細胞的多種組合物施用。在一些實施方案中，連續劑量的細胞以共同含有連續劑量的細胞的多種組合物施用。在一些方面，可以在不超過3天的時間段內以多種組合物施用另外的連續劑量。
術語“分割劑量”是指被分割使得其可以在超過一天的時間內施用的劑量。這種類型的給藥涵蓋在本發明的方法中，並且被認為是單劑量。因此，在一些實施方案中，第一劑量和/或一個或多個連續劑量可以作為分割劑量施用。例如，在一些實施方案中，可以在2天或3天內將劑量施用至受試者。用於分割給藥的示例性方法包括在第一天施用25%的劑量並在第二天施用剩餘75%的劑量。在其他實施方案中，可以在第一天施用第一劑量的33%並且在第二天施用剩餘的67%。在一些方面，在第一天施用10%的劑量，在第二天施用30%的劑量，並且在第三天施用60%的劑量。在一些實施方案中，分割劑量分佈不超過3天內。
關於先前劑量，諸如第一劑量，術語“連續劑量”是指在先前(例如第一)劑量之後暫時沒有向受試者施用任何介入劑量的情況下向同一受試者施用的劑量。但是，所述術語不涵蓋在單個分割劑量內包含的一系列輸注或注射中的第二次、第三次和/或等等注射或輸注。因此，除非另有說明，否則在一天、兩天或三天時間段內的第二次輸注不被視為如本文所用的“連續”劑量。同樣，在“連續”劑量的意義的情境下，在分割劑量內的一系列多次劑量中的第二次、第三次等等也不被視為“介入”劑量。因此，除非另有說明，否則只要在第一或先前劑量開始後的三天時間段內發生了第二次或隨後的注射或輸注，即使受試者在第一劑量開始後接受了細胞的第二次或隨後的注射或輸注，在開始第一或先前劑量之後大於三天的一定時間段內施用的劑量都被視為“連續”劑量。
因此，除非另有說明，否則在長達3天的時間段內多次施用相同細胞被視為單一劑量，並且在初次施用的3天內施用細胞不被視為連續劑量，並且也不被視為出於確定第二劑量是否與第一劑量“連續”的目的使用的介入劑量。
在一些實施方案中，在一些方面使用與關於第一劑量和第一連續劑量之間的時間安排的相同的時間安排指南例如通過施用第一劑量和多個連續劑量來給予多個連續劑量，其中在抑制性免疫分子(諸如PD-1和/或PD-L1)已在受試者的細胞中從所施用的第一劑量開始被上調的一個時間段內給予每個連續劑量。諸如通過評估在來自周邊血液或其他體液的抗原表現細胞諸如TCR表現細胞中PD-1和/或PD-L1的位準來憑經驗確定何時提供連續劑量是在本領域技術人員的位準之內。
在一 些實施 方案中，在第一劑量與第一連續劑量、或者第一與多個連續劑量之間的時間安排為使得在大於約5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天或更長時間的時間段內給予每個連續劑量。在一些實施方案中，在施用第一劑量或緊接先前劑量之後少於約28天的時間段內給予連續劑量。另外的多個另外一個或多個連續劑量也被稱為後續劑量或後續連續劑量。
將細胞的第一劑量和/或一個或多個連續劑量的大小通常設計為提供改善的功效和/或降低的毒性風險。在一些方面，第一劑量或任何連續劑量的劑量量或大小是如上所述的任何劑量或量。在一些實施方案中，在第一劑量或任何連續劑量中的細胞數在約0.5×106 個細胞/kg受試者體重與5×106 個細胞/kg之間、在約0.75×106 個細胞/kg與3×106 個細胞/kg之間、或在約1×106 個細胞/kg與2×106 個細胞/kg之間。
如本文所用，“第一劑量”用於描述在施用連續或後續劑量之前的給定劑量的時間安排。所述術語不一定暗示受試者以前從未接受過一定劑量的細胞療法或，或者甚至受試者以前沒有接受過一定劑量的相同細胞或表現相同重組受體或靶向相同抗原的細胞。
在一些實施方案中，可以在延長的時間段內(例如，在至少1周、2周、3周、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、1年、2年、3年、4年或5年的時間段內)向受試者施用多個劑量。熟練的醫療專業人員可以使用本文所述的用於診斷或跟蹤治療有效性(例如觀察至少一種癌症症狀)的任何方法來確定治療期的長度。
在一些實施方案中，由連續劑量中的細胞表現的工程化受體(例如TCR)含有至少一個免疫反應性表位作為由第一劑量的細胞表現的受體(例如TCR)。在一些實施方案中，由在連續劑量中施用的細胞表現的受體(例如TCR)與由第一劑量表現的受體(例如TCR)相同，或者與由在第一劑量中施用的細胞表現的受體(例如TCR)基本上相同。
由以各種劑量施用至受試者的細胞表現的受體(例如TCR)通常識別或特異性地結合在所治療的疾病或病症或其細胞中表現、與所治療的疾病或病症或其細胞相關和/或對所治療的疾病或病症或其細胞具有特異性的分子。在與分子(例如抗原)特異性地結合後，受體通常將免疫刺激訊息(諸如ITAM轉導的訊息)遞送到細胞中，從而促進針對疾病或病症的免疫反應。例如，在一些實施方案中，第一劑量中的細胞表現特異性地結合所表現的抗原的TCR。 實施例
在以下實施例中進一步描述本發明，所述實施例並不限制申請專利範圍中所描述的本發明的範圍。實施例1 ：載體構建體、細胞系和培養基
對於E202 TCR-T細胞，產生了含有2個編碼區的MP71反轉錄病毒載體構建體：(1) 與小鼠TCR α鏈的恆定區融合的人抗E6 TCR的α鏈的可變區；(2) 與小鼠TCR β鏈的恆定區融合的同一人抗E6 TCR的β鏈的可變區(圖1)。所述序列在SEQ ID NO: 20中列出 。完整的載體序列在SEQ ID NO: 26中列出 。
HEK-293T、Ca Ski和T2細胞購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。來自匿名供體的周邊血液單核細胞(PBMC)購自Hemacare。Ca Ski E6/E7細胞是通過用過表現人E6和E7的載體反轉錄病毒轉導Ca Ski細胞而產生的。將細胞在DMEM(達爾伯克改良的伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium) + 10% FBS(胎牛血清)或RPMI(羅斯威爾公園紀念研究所培養基(Roswell Park Memorial Institute medium)) + 10% FBS中培養。實施例2 ：反轉錄病毒載體產生、T 細胞轉導和擴增、以及TCR 染色
通過使用標準磷酸鈣沉澱方案暫態轉染HEK-293T細胞來製備反轉錄病毒載體。在48小時之後收穫病毒上清液，並將其用於轉導T細胞。在反轉錄病毒轉導之前，通過與T細胞活化珠和人IL-2一起培養將PBMC活化2天。為了進行轉導，通過在32℃下以2,000 g離心2小時，將新鮮收穫的反轉錄病毒上清液旋轉裝載到每孔用15 μg RetroNectin塗覆的經非組織培養物處理過的24孔板上(Clontech Laboratories)。將活化的PBMC裝載到板上，並在32℃下以600 g旋轉30分鐘。
將T細胞在37℃和5% CO2 下孵育。每2天補充一次培養基。所有抗體均購自Biolegend。轉導後48小時檢測到重組TCR的表現。小鼠TCR β鏈被抗體染色，隨後進行流式細胞術分析。同時進行CD3、CD4和CD8染色。結果表明抗E6 TCR在人T細胞中大量表現(圖2A-2B)。實施例3 ：體外 TCR-T 細胞內IFN-γ 產生
將TCR-T細胞與HPV肽脈衝的T2細胞以各種效應子與靶標比率進行共培養。根據製造商的說明，通過流式細胞術測量細胞內IFN-γ表現。發現含有抗E6 TCR的TCR-T細胞可以被靶細胞特異性地活化，這可以通過細胞內IFN-γ表現來測量(圖3A-3B)。實施例4 ：通過肽滴定確定E202 TCR 的EC50
將另外的TCR-T細胞與脈衝進入T2抗原呈遞細胞中的不同濃度的HPV肽一起共培養過夜。將TCR-T細胞和APC細胞以1:1的效應子與靶標比率進行共培養。然後收集T細胞，並測量細胞內IFN-γ表現以確定EC50。
如圖4所示，E202 TCR-T細胞以0.045 μg/mL的EC50識別用E6肽脈衝的APC。實施例5 ：E202 TCR-T 細胞的體外 特異性殺傷
對於E202 TCR-T細胞殺傷測定，將Ca Ski E6/E7細胞用CFSE(羧基螢光素琥珀醯亞胺酯)預染色，並且然後與未轉導的或TCR轉導的T細胞以1:2、1:1、3:1或10:1的效應子與靶標比率共培養過夜。通過膜聯蛋白V/7-AAD染色測量T細胞對靶細胞的細胞毒性。如圖5所示，E202 TCR-T細胞以特定的方式殺死E6+靶細胞(Ca Ski E6/E7)。在較高E:T比率的情況下，TCR-T細胞具有較高的殺傷能力。實施例6 ：構建體設計
對於E202P03 TCR-T細胞，使用標準分子生物學技術產生了含有3個編碼區的MP71反轉錄病毒載體構建體：(1) 與小鼠TCR α鏈的恆定區融合的人抗HPV16 E6 TCR α鏈的可變區；(2) 與小鼠TCR β鏈的恆定區融合的同一人抗HPV16 E6 TCR的β鏈的可變區；(3) 用GS連接子連接的免疫檢查點抑制劑(ICI)的重鏈和輕鏈的可變區(圖6A-6B)。E202P03的序列在SEQ ID NO: 25中列出 。實施例7 ：TCR 染色
用E202或E202P03 TCR的構建體轉導原代T細胞。轉導後13天檢測到重組TCR的表現。小鼠TCR β鏈被抗體染色，隨後進行流式細胞術分析。同時進行CD3、CD4和CD8染色。結果顯示在未轉導的原代T細胞中，未檢測到重組TCR(圖7A)。抗E6 TCR在用E202或E202P03的構建體轉導的人T細胞中大量表現(圖7B-7C)。所有抗體均購自BioLegend。使用了活的CD3+ 淋巴細胞門控策略。實施例8 ：體外細胞內IFN-γ 產生
將TCR-T細胞與HPV肽脈衝的T2細胞以各種效應子與靶標比率進行共培養。根據製造商的說明，通過流式細胞術測量細胞內IFN-γ表現。發現由E202或E202P03的構建體轉導以表現抗E6 TCR的TCR-T細胞可以被靶細胞特異性地活化，這可以通過細胞內IFN-γ表現來測量(圖8B-8C)。未轉導的T細胞未被靶細胞活化(圖8A)。實施例9 ：體外TCR-T IFN-γ 分泌
將TCR-T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以1:0、1:1、3:1或10:1的效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集細胞培養上清液，並根據製造商的說明使用人IFN-γ ELISA套組測量上清液中的IFN-γ表現(圖9)。
含有E6 TCR的TCR-T細胞可以被靶細胞活化，如通過IFN-γ表現所測量的。通過肽脈衝的APC或E6+靶細胞(Ca Ski E6/E7)刺激，E202和E202P03 TCR-T細胞比未轉導的T細胞具有高得多的IFN-γ產生。實施例10 ：體外TCR-T CD107a 表現
將TCR-T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以1:1效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集T細胞，並通過流式細胞術測量在CD8(圖10A-10C)或CD4(圖10D-10F)亞群中的CD107a表現。結果表明，CD107a在CD8亞群中表現，但在CD4亞群中不表現。實施例11 ：E202 或E202P03 TCR-T 細胞的體外特異性殺傷
用CFSE對表現HPV E6抗原的靶細胞進行預染色，然後將其與TCR-T細胞以1:1、3:1或10:1的效應子與靶標比率共培養過夜。通過7-AAD染色來測量T細胞對靶細胞的細胞毒性。
E202和E202P03 TCR-T細胞均以特異性方式殺死LMP2+靶細胞(Ca Ski)。未轉導的T細胞比E202和E202P03 TCR-T細胞更弱地殺死靶細胞(圖11)。因此，E202和E202P03 TCR-T細胞比未轉導的TCR-T細胞具有更高的殺傷能力。實施例12 ：在E202P03 TCR-T 細胞培養物中的體外抗PD-1 scFv 表現
將E202或E202P03 TCR-T細胞以3 × 106 /ml接種到24孔板中持續48小時。然後從細胞培養物中收集上清液，並測量上清液中的抗PD-1表現。結果表明，E202P03 TCR-T細胞比E202 TCR-T細胞表現更多的抗PD-1 scFv(圖12)。實施例13 ：E203 、E204 和E205 TCR-T 細胞的TCR 染色
還使用如本文所述的方法產生反轉錄病毒載體構建體，以表現E203、E204或E205 TCR。用E203、E204或E205 TCR的構建體轉導人PBMC。轉導後5天檢測到重組TCR的表現。小鼠TCR β鏈被抗體染色，隨後進行流式細胞術分析。同時進行CD3染色。結果表明，在未轉導的人PBMC中，未檢測到重組TCR(圖13A)。抗E6 TCR在用E203、E204或E205 TCR的構建體轉導的人PBMC中大量表現(圖13B-13D)。使用了活的CD3+淋巴細胞門控策略。實施例14 ：E203 、E204 和E205 TCR-T 細胞的體外細胞內IFN-γ 產生
將0.2 × 106 個未轉導的(UT)、E203、E204或E205 TCR-T細胞與0.4 × 106 個Ca Ski E6/E7細胞(HPV E6和E7過表現的Ca Ski細胞)、Ca Ski細胞或293T細胞一起共培養過夜。然後將細胞用佈雷菲德菌素A和莫能菌素處理4小時，其後通過流式細胞術測量細胞內IFN-γ位準。分析了CD4+(圖14A-14P)和CD8+(圖15A-15P)T細胞群二者。特別是對於CD8+ T細胞，結果表明，由E203或E205構建體轉導以表現抗E6 TCR的TCR-T細胞可以被Ca Ski E6/E7細胞特異性地活化，如通過細胞內IFN-γ表現所確定的(圖15F和圖15N)。相比之下，未轉導的T細胞未被Ca Ski E6/E7細胞活化(圖15B)。實施例15 ：E203 、E204 或E205 TCR-T 細胞的體外特異性殺傷
將0.03 × 106 個Ca Ski E6/E7細胞用CellTraceTM CFSE標記，並且將0.03 × 106 個293T細胞用CellTraceTM 紫色標記。將標記的Ca Ski E6/E7細胞和標記的293T細胞混合，並與未轉導的(UT)、E203、E204或E205 TCR-T細胞以0:1、0.4:1、2:1或10:1的效應子與靶細胞比率共培養過夜(在96孔板中重複4次)。此後，通過流式細胞術對Ca Ski E6/E7活細胞和293T活細胞進行定量。添加珠作為流式細胞術分析的參考。基於Ca Ski E6/E7活細胞與珠的比率來計算絕對殺傷效力(圖16A)，並且基於Ca Ski E6/E7活細胞與293T活細胞的比率來計算競爭殺傷效力(圖16B)。結果表明靶細胞(Ca Ski E6/E7)殺傷特異性排名為：E203 TCR-T細胞 ＞ E205 TCR-T細胞 ＞ E204 TCR-T細胞。實施例16 ：通過肽滴定確定E203 TCR 的EC50
將E203 TCR-T細胞與抗原呈遞細胞(APC)以1:1的效應子與靶細胞比率共培養過夜。用不同濃度的HPV肽對APC進行脈衝處理。然後收集T細胞，並測量細胞內IFN-γ表現以確定EC50。
如圖17A所示，當使用CD8+ E203 TCR-T細胞識別HPV肽脈衝的APC時，EC50為1.045 ng/ml。如圖17B所示，當使用CD4+ E203 TCR-T細胞識別HPV肽脈衝的APC時，EC50為17.62 ng/ml。實施例17. 通過肽滴定確定E204 TCR 的EC50
將E204 TCR-T細胞與抗原呈遞細胞(APC)以1:1的效應子與靶細胞比率共培養過夜。用不同濃度的HPV肽對APC進行脈衝處理。然後收集T細胞，並測量細胞內IFN-γ表現以確定EC50。
如圖18A-18B所示，E204 TCR-T細胞(包括CD8+和CD4+ T細胞)沒有表現出HPV肽依賴性活化。未確定E204 TCR-T細胞的EC50。實施例18 ：通過肽滴定確定E205 TCR 的EC50
將E205 TCR-T細胞與抗原呈遞細胞(APC)以1:1的效應子與靶細胞比率共培養過夜。用不同濃度的HPV肽對APC進行脈衝處理。然後收集T細胞，並測量細胞內IFN-γ表現以確定EC50。
如圖19A所示，當使用CD8+ E205 TCR-T細胞識別HPV肽脈衝的APC時，EC50為0.9167 ng/ml。如圖19B所示，當使用CD4+ E205 TCR-T細胞識別HPV肽脈衝的APC時，EC50為10.42 ng/ml。其他實施方案
應當理解，儘管已經結合本發明的具體實施方式描述了本發明，但是前述描述旨在說明而不限制本發明的範圍，本發明的範圍由所附申請專利範圍的範圍限定。其他方面、優點和修改在以下申請專利範圍的範圍內。
無
在附圖中展示了示例性實施方案。旨在將本文公開的實施方案和附圖視為說明性的而非限制性的。 圖1是顯示pMP71反轉錄病毒載體構建體的示意圖。P2A編碼2A自切割肽；Va編碼人抗E6 TCR的α鏈的可變區；Vb編碼同一人抗E6 TCR的β鏈的可變區；Ca編碼小鼠TCR α鏈的恆定區；Cb編碼小鼠TCR β鏈的恆定區。Ψ表示病毒RNA上的包裝序列。5’LTR和3’LTR是長末端重複序列。 圖2A顯示了TCR在未轉導的人原代T細胞中的表現。NT是未轉導的對照。在培養48小時之後，通過對小鼠TCR β鏈染色來檢測重組TCR的表現。使用了活的CD3+ 淋巴細胞門控策略。 圖2B顯示了在用E202構建體轉導的人原代T細胞中的E202 TCR表現。在培養48小時之後，通過對小鼠TCR β鏈染色來檢測重組TCR的表現。使用了活的CD3+ 淋巴細胞門控策略。 圖3A是顯示在抗原特異性刺激後未轉導的人T細胞的細胞內IFN-γ表現的圖。NT是未轉導的對照。將未轉導的人T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以1:1的效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集T細胞，並通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖3B是顯示在抗原特異性刺激後E202 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現的圖。將TCR-T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以1:1效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集T細胞，並通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖4是顯示含有E202 TCR的TCR-T細胞的活化曲線的圖。將TCR-T細胞與不同濃度的HPV肽脈衝APC以1:1效應子/靶標比率共培養過夜。然後收集T細胞，並測量細胞內IFN-γ表現以確定EC50。 圖5是顯示E202 TCR-T細胞對靶細胞的特異性殺傷百分比和E:T比率的關係的圖。用CFSE對表現HPV E6抗原的靶細胞進行預染色，然後將其與TCR-T細胞以1:2、1:1、3:1和10:1的效應子與靶標比率共培養過夜。通過7-AAD染色來測量T細胞對靶細胞的細胞毒性。NT是未轉導的對照。 圖6A是顯示pMP71反轉錄病毒載體構建體的示意圖。P2A編碼2A自切割肽；Va編碼人抗HPV16 E6 TCR的α鏈的可變區；Vb編碼同一人抗HPV16 E6 TCR的β鏈的可變區；Ca編碼小鼠TCR α鏈的恆定區；Cb編碼小鼠TCR β鏈的恆定區。Ψ表示病毒RNA上的包裝序列。5’LTR和3’LTR是長末端重複序列。 圖6B是顯示pMP71反轉錄病毒載體構建體(E202P03)的示意圖。P2A和T2A編碼2A自切割肽；Va編碼人抗HPV16 E6 TCR的α鏈的可變區；Vb編碼同一人抗HPV16 E6 TCR的β鏈的可變區；Ca編碼小鼠TCR α鏈的恆定區；Cb編碼小鼠TCR β鏈的恆定區；VH編碼免疫檢查點抑制劑(ICI)的重鏈的可變區；VL編碼免疫檢查點抑制劑(ICI)的輕鏈的可變區。VH和VL通過GS連接子來連接。Ψ表示病毒RNA上的包裝序列。5’LTR和3’LTR是長末端重複序列。 圖7A顯示了TCR在未轉導的人原代T細胞中的表現。NT是未轉導的對照。在培養13天之後，通過對小鼠TCR β鏈染色來檢測重組TCR的表現。使用了活的CD3+ 淋巴細胞門控策略。 圖7B顯示了在用E202構建體轉導的人原代T細胞中的E202 TCR表現。在培養13天之後，通過對小鼠TCR β鏈染色來檢測重組TCR的表現。使用了活的CD3+ 淋巴細胞門控策略。 圖7C顯示了在用E202P03構建體轉導的人原代T細胞中的E202P03 TCR表現。在培養13天之後，通過對小鼠TCR β鏈染色來檢測重組TCR的表現。使用了活的CD3+ 淋巴細胞門控策略。 圖8A是顯示在抗原特異性刺激後未轉導的人T細胞的細胞內IFN-γ表現的圖。NT是未轉導的對照。將未轉導的人T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以1:1的效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集T細胞，並通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖8B是顯示在抗原特異性刺激後E202 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現的圖。將TCR-T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以1:1效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集T細胞，並通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖8C是顯示在抗原特異性刺激後E202P03 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現的圖。將TCR-T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以1:1效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集T細胞，並通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖9是顯示在細胞培養上清液中抗原特異性刺激後E202和E202P03 TCR-T細胞的IFN-γ表現的直方圖。將TCR-T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以指定的效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集細胞培養上清液，並測量上清液中的IFN-γ表現。NT是未轉導的對照。 圖10A是顯示在抗原特異性刺激後未轉導的人T細胞的CD107a表現的圖。NT是未轉導的對照。將未轉導的人T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以1:1的效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集T細胞，並通過流式細胞術確定在CD8亞群中的CD107a表現。 圖10B是顯示在抗原特異性刺激後E202 TCR-T細胞的CD107a表現的圖。將TCR-T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以1:1效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集T細胞，並通過流式細胞術確定在CD8亞群中的CD107a表現。 圖10C是顯示在抗原特異性刺激後E202P03 TCR-T細胞的CD107a表現的圖。將TCR-T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以1:1效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集T細胞，並通過流式細胞術確定在CD8亞群中的CD107a表現。 圖10D是顯示在抗原特異性刺激後未轉導的人T細胞的CD107a表現的圖。NT是未轉導的對照。將未轉導的人T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以1:1的效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集T細胞，並通過流式細胞術確定在CD4亞群中的CD107a表現。 圖10E是顯示在抗原特異性刺激後E202 TCR-T細胞的CD107a表現的圖。將TCR-T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以1:1效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集T細胞，並通過流式細胞術確定在CD4亞群中的CD107a表現。 圖10F是顯示在抗原特異性刺激後E202P03 TCR-T細胞的CD107a表現的圖。將TCR-T細胞與表現HPV E6抗原的靶細胞以1:1效應子與靶標比率共培養過夜。然後收集T細胞，並通過流式細胞術確定在CD4亞群中的CD107a表現。 圖11是顯示E202或E202P03 TCR-T細胞對靶細胞的特異性殺傷百分比和E:T比率的關係的圖。用CFSE對表現HPV E6抗原的靶細胞進行預染色，然後將其與TCR-T細胞以1:1、3:1和10:1的效應子與靶標比率共培養過夜。通過7-AAD染色來測量T細胞對靶細胞的細胞毒性。NT是未轉導的對照。 圖12是顯示在細胞培養上清液中抗PD-1 scFv表現的直方圖。將E202或E202P03 TCR-T細胞以3 × 106 /ml接種到24孔板中持續48小時。然後收集細胞培養上清液，並確定上清液中的抗PD-1表現。 圖13A顯示了TCR在未轉導的(UT)人PBMC中的表現。通過染色小鼠TCR β鏈來檢測重組TCR的表現。使用了活的CD3+淋巴細胞門控策略。 圖13B顯示了E203 TCR在用E203構建體轉導的人PBMC中的表現。在轉導後5天，通過對小鼠TCR β鏈染色來檢測重組TCR的表現。使用了活的CD3+淋巴細胞門控策略。 圖13C顯示了E204 TCR在用E204構建體轉導的人PBMC中的表現。在轉導後5天，通過對小鼠TCR β鏈染色來檢測重組TCR的表現。使用了活的CD3+淋巴細胞門控策略。 圖13D顯示了E205 TCR在用E205構建體轉導的人PBMC中的表現。在轉導後5天，通過對小鼠TCR β鏈染色來檢測重組TCR的表現。使用了活的CD3+淋巴細胞門控策略。 圖14A顯示了在沒有抗原特異性刺激的情況下未轉導的(UT)人CD4+ T細胞的細胞內IFN-γ表現。 圖14B顯示了與Ca Ski E6/E7細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的未轉導的(UT)人CD4+ T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖14C顯示了與Ca Ski細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的未轉導的(UT)人CD4+ T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖14D顯示了與293T細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的未轉導的(UT)人CD4+ T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖14E顯示了在沒有抗原特異性刺激的情況下人CD4+ E203 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。 圖14F顯示了與Ca Ski E6/E7細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD4+ E203 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖14G顯示了與Ca Ski細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD4+ E203 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖14H顯示了與293T細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD4+ E203 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖14I顯示了在沒有抗原特異性刺激的情況下人CD4+ E204 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。 圖14J顯示了與Ca Ski E6/E7細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD4+ E204 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖14K顯示了與Ca Ski細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD4+ E204 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖14L顯示了與293T細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD4+ E204 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖14M顯示了在沒有抗原特異性刺激的情況下人CD4+ E205 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。 圖14N顯示了與Ca Ski E6/E7細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD4+ E205 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖14O顯示了與Ca Ski細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD4+ E205 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖14P顯示了與293T細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD4+ E205 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖15A顯示了在沒有抗原特異性刺激的情況下未轉導的(UT)人CD8+ T細胞的細胞內IFN-γ表現。 圖15B顯示了與Ca Ski E6/E7細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的未轉導的(UT)人CD8+ T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖15C顯示了與Ca Ski細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的未轉導的(UT)人CD8+ T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖15D顯示了與293T細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的未轉導的(UT)人CD8+ T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖15E顯示了在沒有抗原特異性刺激的情況下人CD8+ E203 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。 圖15F顯示了與Ca Ski E6/E7細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD8+ E203 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖15G顯示了與Ca Ski細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD8+ E203 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖15H顯示了與293T細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD8+ E203 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖15I顯示了在沒有抗原特異性刺激的情況下人CD8+ E204 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。 圖15J顯示了與Ca Ski E6/E7細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD8+ E204 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖15K顯示了與Ca Ski細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD8+ E204 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖15L顯示了與293T細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD8+ E204 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖15M顯示了在沒有抗原特異性刺激的情況下人CD8+ E205 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。 圖15N顯示了與Ca Ski E6/E7細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD8+ E205 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖15O顯示了與Ca Ski細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD8+ E205 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖15P顯示了與293T細胞以1:2的效應子與靶細胞比率共培養過夜的人CD8+ E205 TCR-T細胞的細胞內IFN-γ表現。通過流式細胞術確定細胞內IFN-γ表現。 圖16A顯示了未轉導的(UT)、E203、E204和E205 TCR-T細胞對Ca Ski E6/E7細胞的絕對殺傷效力。將CellTraceTM CFSE標記的Ca Ski E6/E7細胞和CellTraceTM 紫色標記的293T細胞混合，並與TCR-T細胞以0:1、0.4:1、2:1或10:1的效應子與靶細胞比率共培養。添加珠作為流式細胞術分析的參考。 圖16B顯示了未轉導的(UT)、E203、E204和E205 TCR-T細胞對Ca Ski E6/E7細胞的競爭性殺傷效力。將CellTraceTM CFSE標記的Ca Ski E6/E7細胞和CellTraceTM 紫色標記的293T細胞混合，並與TCR-T細胞以0:1、0.4:1、2:1或10:1的效應子與靶細胞比率共培養。 圖17A顯示了含有E203 TCR的CD8+ TCR-T細胞的活化曲線。測量細胞內IFN-γ表現以確定EC50。 圖17B顯示了含有E203 TCR的CD4+ TCR-T細胞的活化曲線。測量細胞內IFN-γ表現以確定EC50。 圖18A顯示了含有E204 TCR的CD8+ TCR-T細胞的活化曲線。測量細胞內IFN-γ表現以確定EC50。 圖18B顯示了含有E204 TCR的CD4+ TCR-T細胞的活化曲線。測量細胞內IFN-γ表現以確定EC50。 圖19A顯示了含有E205 TCR的CD8+ TCR-T細胞的活化曲線。測量細胞內IFN-γ表現以確定EC50。 圖19B顯示了含有E205 TCR的CD4+ TCR-T細胞的活化曲線。測量細胞內IFN-γ表現以確定EC50。 圖20是顯示E202、E203、E204和E205 TCR的序列的表。CDR1α、CDR2α和CDR3α分別是TCR α鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3。CDR1β、CDR2β和CDR3β分別是TCR β鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3。TRA_VJ是編碼TCR α鏈可變結構域的重新排列的V和J區段。TRB_VDJ是編碼TCR β鏈可變結構域的重新排列的V、D和J區段。 圖21提供了如本公開所描述的幾個序列。
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Claims (52)

  1. 一種T細胞受體(TCR)或其抗原結合片段，所述TCR或其抗原結合片段包含含有可變α(Va)區的α鏈和含有可變β(Vb)區的β鏈，其中： 所述Va區包含互補決定區1(CDR-1)、互補決定區2(CDR-2)和互補決定區3(CDR-3)，其中所述Va區CDR-1包含與選擇的Va區CDR-1胺基酸序列相同的胺基酸序列，所述Va區CDR-2包含與選擇的Va區CDR-2胺基酸序列相同的胺基酸序列，並且所述Va區CDR-3包含與選擇的Va區CDR-3胺基酸序列相同的胺基酸序列；並且 所述Vb區包含互補決定區1(CDR-1)、互補決定區2(CDR-2)和互補決定區3(CDR-3)，其中所述Vb區CDR-1包含與選擇的Vb區CDR-1胺基酸序列相同的胺基酸序列，所述Vb區CDR-2包含與選擇的Vb區CDR-2胺基酸序列相同的胺基酸序列，並且所述Vb區CDR-3包含與選擇的Vb區CDR-3胺基酸序列相同的胺基酸序列； 其中所述選擇的Va區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列和所述選擇的Vb區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列是以下中的一者： (1) 所述選擇的Va區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 5、6和7中列出，並且所述選擇的Vb區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 8、9和10中列出； (2) 所述選擇的Va區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 27、28和29中列出，並且所述選擇的Vb區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 30、31和32中列出； (3) 所述選擇的Va區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 33、34和35中列出，並且所述選擇的Vb區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 36、37和38中列出； (4) 所述選擇的Va區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 39、40和41中列出，並且所述選擇的Vb區CDR-1、CDR-2和CDR-3胺基酸序列分別在SEQ ID NO: 42、43和44中列出。
  2. 如請求項1所述的TCR或其抗原結合片段，其中所述Va區包含具有分別在SEQ ID NO: 5、6和7中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3；並且所述Vb區包含具有分別在SEQ ID NO: 8、9和10中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3。
  3. 如請求項2所述的TCR或其抗原結合片段，其中： 所述Va區包含在SEQ ID NO: 1中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且 所述Vb區包含在SEQ ID NO: 2中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
  4. 如請求項1所述的TCR或其抗原結合片段，其中所述Va區包含具有分別在SEQ ID NO: 27、28和29中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3；並且所述Vb區包含具有分別在SEQ ID NO: 30、31和32中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3。
  5. 如請求項4所述的TCR或其抗原結合片段，其中： 所述Va區包含在SEQ ID NO: 45中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且 所述Vb區包含在SEQ ID NO: 46中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
  6. 如請求項1所述的TCR或其抗原結合片段，其中所述Va區包含具有分別在SEQ ID NO: 33、34和35中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3；並且所述Vb區包含具有分別在SEQ ID NO: 36、37和38中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3。
  7. 如請求項6所述的TCR或其抗原結合片段，其中： 所述Va區包含在SEQ ID NO: 47中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且 所述Vb區包含在SEQ ID NO: 48中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
  8. 如請求項1所述的TCR或其抗原結合片段，其中所述Va區包含具有分別在SEQ ID NO: 39、40和41中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3；並且所述Vb區包含具有分別在SEQ ID NO: 42、43和44中列出的胺基酸序列的CDR-1、CDR-2和CDR-3。
  9. 如請求項8所述的TCR或其抗原結合片段，其中： 所述Va區包含在SEQ ID NO: 49中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且 所述Vb區包含在SEQ ID NO: 50中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
  10. 如請求項1-9中任一項所述的TCR或其抗原結合片段，其中： 所述α鏈包含小鼠α鏈恆定區，並且所述β鏈包含小鼠β鏈恆定區。
  11. 如請求項1所述的TCR或其抗原結合片段，其中： 所述α鏈包含在SEQ ID NO: 15中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且 所述β鏈包含在SEQ ID NO: 16中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
  12. 如請求項1所述的TCR或其抗原結合片段，其中： 所述α鏈包含在SEQ ID NO: 51中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且 所述β鏈包含在SEQ ID NO: 52中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
  13. 如請求項1所述的TCR或其抗原結合片段，其中： 所述α鏈包含在SEQ ID NO: 53中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且 所述β鏈包含在SEQ ID NO: 54中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
  14. 如請求項1所述的TCR或其抗原結合片段，其中： 所述α鏈包含在SEQ ID NO: 55中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；並且 所述β鏈包含在SEQ ID NO: 56中任一者中列出的胺基酸序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
  15. 如請求項1-14中任一項所述的TCR或其抗原結合片段，其中所述TCR或其抗原結合片段結合或識別由主要組織相容性複合物(MHC)分子呈遞的E6肽表位(SEQ ID NO: 19)。
  16. 如請求項15所述的TCR或其抗原結合片段，其中所述MHC分子是HLA-A2分子。
  17. 如請求項1-16中任一項所述的TCR或其抗原結合片段，其中所述TCR或其抗原結合片段當在T細胞表面上表現時刺激針對靶癌細胞的細胞毒性活性。
  18. 如請求項17所述的TCR或其抗原結合片段，其中所述靶癌細胞包含HPV DNA序列或表現E6。
  19. 一種T細胞受體(TCR)或其抗原結合片段，所述TCR或其抗原結合片段包含含有可變α(Va)區的α鏈和含有可變β(Vb)區的β鏈，其中： 所述Va區包含互補決定區1(CDR1)、互補決定區2(CDR2)和互補決定區3(CDR3)，並且所述Vb區包含CDR1、CDR2和CDR3，其中 (1) 所述Va區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 1中的互補決定區1、2和3相同，並且所述Vb區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 2中的互補決定區1、2和3相同； (2) 所述Va區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 1中的互補決定區45、2和3相同，並且所述Vb區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 2中的互補決定區1、46和3相同； (3) 所述Va區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 47中的互補決定區1、2和3相同，並且所述Vb區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 48中的互補決定區1、2和3相同；或 (4) 所述Va區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 49中的互補決定區1、2和3相同，並且所述Vb區CDR1、CDR2和CDR3分別與SEQ ID NO: 50中的互補決定區1、2和3相同。
  20. 一種載體，所述載體包含編碼如請求項1-19中任一項所述的TCR或其抗原結合片段的核酸。
  21. 如請求項20所述的載體，其中所述載體是表現載體、病毒載體、反轉錄病毒載體或慢病毒載體。
  22. 一個載體，所述載體包含： a) 編碼TCR α鏈的第一核酸序列，所述TCR α鏈包含人抗E6 TCR的α鏈可變區和α鏈恆定區；以及 b) 編碼TCR β鏈的第二核酸序列，所述TCR β鏈包含人抗E6 TCR的β鏈可變區和β鏈恆定區。
  23. 如請求項22所述的載體，其中所述α鏈恆定區是人TCR α鏈恆定區，並且所述β鏈恆定區是人TCR β鏈恆定區。
  24. 如請求項22所述的載體，其中所述α鏈恆定區是小鼠TCR α鏈恆定區，並且所述β鏈恆定區是小鼠TCR β鏈恆定區。
  25. 如請求項22-24中任一項所述的載體，其中所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過連接子序列連接。
  26. 如請求項25所述的載體，其中所述連接子序列是P2A序列。
  27. 如請求項22-26中任一項所述的載體，其中 (1) 所述第一核酸序列包含在SEQ ID NO: 17中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列；並且所述第二核酸序列包含在SEQ ID NO: 18中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列； (2) 所述第一核酸序列包含在SEQ ID NO: 57中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列；並且所述第二核酸序列包含在SEQ ID NO: 58中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列； (3) 所述第一核酸序列包含在SEQ ID NO: 59中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列；並且所述第二核酸序列包含在SEQ ID NO: 60中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列；或 (4) 所述第一核酸序列包含在SEQ ID NO: 61中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列；並且所述第二核酸序列包含在SEQ ID NO: 62中列出的序列、或者與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的核酸序列。
  28. 如請求項22-27中任一項所述的載體，所述載體還包含編碼檢查點抑制劑的第三核酸序列。
  29. 如請求項28所述的載體，其中所述檢查點抑制劑是抗體。
  30. 如請求項28所述的載體，其中所述檢查點抑制劑是抗PD-1抗體scFv或抗CTLA4抗體scFv。
  31. 如請求項29所述的載體，其中所述抗體包含 重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包含與SEQ ID NO: 11為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；以及 輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包含與SEQ ID NO: 12為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
  32. 如請求項28-31中任一項所述的載體，其中所述第三核酸序列包含 與SEQ ID NO: 13為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列；以及 與SEQ ID NO: 14為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列。
  33. 如請求項22-32中任一項所述的載體，其中所述載體是表現載體、病毒載體、反轉錄病毒載體或慢病毒載體。
  34. 如請求項33所述的載體，其中所述反轉錄病毒載體是pMP71。
  35. 如請求項22-34中任一項所述的載體，其中所述載體包含 (1) 與SEQ ID NO: 20為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列 ； (2) 與SEQ ID NO: 63為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列 ； (3) 與SEQ ID NO: 64為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列；或 (4) 與SEQ ID NO: 65為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的核酸序列。
  36. 一種工程化細胞，所述工程化細胞包含如請求項20-35中任一項所述的載體。
  37. 一種工程化細胞，所述工程化細胞包含如請求項1-19中任一項所述的TCR或其抗原結合片段。
  38. 如請求項37所述的工程化細胞，其中所述TCR或其抗原結合片段與所述細胞是異源的。
  39. 如請求項36-38中任一項所述的工程化細胞，其中所述工程化細胞是細胞系。
  40. 如請求項36-38中任一項所述的工程化細胞，其中所述工程化細胞是從受試者(例如，人受試者)獲得的初代細胞。
  41. 如請求項36-40中任一項所述的工程化細胞，其中所述工程化細胞是T細胞。
  42. 如請求項41所述的工程化細胞，其中所述T細胞是從人受試者分離的。
  43. 如請求項41所述的工程化細胞，其中所述T細胞是CD8+。
  44. 如請求項41所述的工程化細胞，其中所述T細胞是CD4+。
  45. 一種用於生產工程化細胞的方法，所述方法包括將如請求項20-35所述的載體在體外或離體引入細胞中。
  46. 如請求項45所述的方法，其中所述載體是病毒載體，並且所述引入通過轉導進行。
  47. 一種治療疾病或障礙的方法，所述方法包括將如請求項36-44中任一項所述的工程化細胞施用至患有與HPV相關的疾病或障礙的受試者。
  48. 如請求項47所述的方法，其中所述與HPV相關的疾病或障礙是癌症。
  49. 如請求項48所述的方法，其中所述癌症是頭頸癌、子宮頸癌、口咽癌、肛門癌、肛管癌、直腸肛門癌、陰道癌、外陰癌或陰莖癌。
  50. 一種治療受試者的腫瘤的方法，所述方法包括 向有需要的受試者施用 (a) 工程化T細胞，所述工程化T細胞包含：編碼與HPV抗原特異性地結合的TCR或其抗原結合片段的核酸；和 (b) 檢查點抑制劑。
  51. 如請求項50所述的方法，其中所述腫瘤是HPV誘發的腫瘤。
  52. 一種TCR或其抗原結合片段，所述TCR或其抗原結合片段與如請求項1-19中任一項所述的TCR或其抗原結合片段交叉競爭。
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