CN117693528A - 抗cll1抗体及其构建体 - Google Patents

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朱延亮
周楠楠
杨帅
武术
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Abstract

本申请提供了靶向CLL1的抗体及其抗原结合片段，以及具有一个或多个抗CLL1抗原结合片段的嵌合抗原受体(例如，单价CAR和包括双表位CAR的多价CAR)。本申请进一步提供了表达嵌合抗原受体的工程化免疫效应细胞(例如，T细胞)及其使用方法。

Description

抗CLL1抗体及其构建体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年7月30日提交的标题为“ANTIBODIES AGAINST CLL1ANDCONSTRUCTS THEREOF[抗CLL1抗体及其构建体]”的国际申请号PCT/CN 2021/109838的优先权权益，其内容通过引用以其全文并入本文。
序列声明
以下以ASCII文本文件提交的内容通过引用以其全文并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：P11219-PCT.220801.Sequence listing.xml，记录日期：2022年8月1日，大小：199千字节)。
技术领域
本公开涉及靶向CLL1的抗体、靶向CLL1的嵌合抗原受体及其使用方法。
背景技术
急性髓系白血病(AML)是髓系血细胞的癌症，其特征是未成熟血细胞(“母细胞”)的快速生长，这些未成熟血细胞在骨髓和血液中积聚并干扰正常血细胞。AML可能扩散到其他器官，如肝脏、脾脏和大脑。AML的临床症状包括疲劳、呼吸急促、容易瘀伤和出血以及感染风险增加。如果不进行治疗，AML进展迅速，通常在数周或数月内致命(De Kouchkovsky,I.等人,2016,Blood Cancer J 6(7):e441.)。AML有几种亚型，这些亚型的治疗和结果可能会有所不同。通常，AML最初采用化疗进行治疗，有时与靶向治疗药物一起进行治疗。然后，患者可以继续接受干细胞移植、额外的化疗、手术或放疗。AML最常见于老年人，其中一些人不够健壮，无法接受强化化疗，因此临床结果不佳(H.等人,2015,N Engl J Med373(12):1136-1152；和Medinger,M.等人,2019,Ther Umsch 76(9):481-486)。几乎所有接受目前AML治疗的患者最终都会复发。因此，需要有效的免疫治疗剂来治疗AML。
发明内容
本公开涉及与CLL1结合的抗体及其抗原结合片段。本公开还涉及用于治疗患有CLL1阳性癌症(包括例如急性髓系白血病(AML))的癌症患者的抗CLL1 CAR-T细胞疗法。基因工程化T细胞可以识别和攻击靶细胞。这些T细胞可以从宿主中分离出来，并使用例如合适的病毒介导或非病毒转染手段进行基因修饰。此后，可以将修饰的T细胞输回患者体内作为过继细胞疗法。
在一方面，本公开涉及与CLL1(C型凝集素样分子1，或C型凝集素结构域家族12成员A)结合的抗体或其抗原结合片段，其包含：包含互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，其中该VH CDR1区包含与所选VH CDR1氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，该VHCDR2区包含与所选VH CDR2氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，以及该VH CDR3区包含与所选VH CDR3氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；以及包含CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)，其中该VL CDR1区包含与所选VL CDR1氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，该VL CDR2区包含与所选VL CDR2氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，以及该VL CDR3区包含与所选VL CDR3氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，其中所选VH CDR 1、2和3氨基酸序列以及所选VL CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一个：(1)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ IDNO:4、5和6中列出；(2)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:11、12和13中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:14、15和16中列出；(3)所选VH CDR1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:21、22和23中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:24、25和26中列出；(4)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:31、32和33中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:34、35和36中列出；(5)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:41、42和43中列出，以及所选VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:44、45和46中列出；(6)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:51、52和53中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQID NO:54、55和56中列出；(7)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:61、62和63中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:64、65和66中列出；(8)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:71、72和73中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:74、75和76中列出；(9)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:81、82和83中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:84、85和86中列出；(10)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:91、92和93中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:94、95和96中列出；(11)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:101、102和103中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:104、105和106中列出；(12)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ IDNO:111、112和113中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:114、115和116中列出；以及(13)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:121、122和123中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:124、125和126中列出。
在一方面，本公开涉及与CLL1结合的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含与所选VH序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列，该轻链可变区包含与所选VL序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列，其中所选VH序列和所选VL序列是以下中的一个：(1)所选VH序列是SEQ ID NO:10，以及所选VL序列是SEQ ID NO:9；(2)所选VH序列是SEQ ID NO:20，以及所选VL序列是SEQ ID NO:19；(3)所选VH序列是SEQ ID NO:30，以及所选VL序列是SEQ ID NO:29；(4)所选VH序列是SEQ ID NO:40，以及所选VL序列是SEQ ID NO:39；(5)所选VH序列是SEQ ID NO:50，以及所选VL序列是SEQ ID NO:49；(6)所选VH序列是SEQ ID NO:60，以及所选VL序列是SEQ ID NO:59；(7)所选VH序列是SEQ ID NO:70，以及所选VL序列是SEQ ID NO:69；(8)所选VH序列是SEQ ID NO:80，以及所选VL序列是SEQ ID NO:79；(9)所选VH序列是SEQ ID NO:90，以及所选VL序列是SEQ ID NO:89；(10)所选VH序列是SEQ ID NO:100，以及所选VL序列是SEQ ID NO:99；(11)所选VH序列是SEQ ID NO:110，以及所选VL序列是SEQ IDNO:109；(12)所选VH序列是SEQ ID NO:120，以及所选VL序列是SEQ ID NO:119；以及(13)所选VH序列是SEQ ID NO:130，以及所选VL序列是SEQ ID NO:129。
在一方面，本公开涉及与CLL1结合的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该重链可变区包含与所选VH序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3相同的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，该轻链可变区包含与所选VL序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3相同的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所选VH序列和所选VL序列是以下中的一个：(1)所选VH序列是SEQ ID NO:10，以及所选VL序列是SEQ ID NO:9；(2)所选VH序列是SEQID NO:20，以及所选VL序列是SEQ ID NO:19；(3)所选VH序列是SEQ ID NO:30，以及所选VL序列是SEQ ID NO:29；(4)所选VH序列是SEQ ID NO:40，以及所选VL序列是SEQ ID NO:39；(5)所选VH序列是SEQ ID NO:50，以及所选VL序列是SEQ ID NO:49；(6)所选VH序列是SEQID NO:60，以及所选VL序列是SEQ ID NO:59；(7)所选VH序列是SEQ ID NO:70，以及所选VL序列是SEQ ID NO:69；(8)所选VH序列是SEQ ID NO:80，以及所选VL序列是SEQ ID NO:79；(9)所选VH序列是SEQ ID NO:90，以及所选VL序列是SEQ ID NO:89；(10)所选VH序列是SEQID NO:100，以及所选VL序列是SEQ ID NO:99；(11)所选VH序列是SEQ ID NO:110，以及所选VL序列是SEQ ID NO:109；(12)所选VH序列是SEQ ID NO:120，以及所选VL序列是SEQ IDNO:119；以及(13)所选VH序列是SEQ ID NO:130，以及所选VL序列是SEQ ID NO:129。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段特异性地与人CLL1肽结合，该肽包含与SEQID NO:147的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的序列。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段特异性地结合人CLL1的胞外结构域(ECD)。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是嵌合抗体或其抗原结合片段或人抗体或其抗原结合片段。
在一方面，本公开涉及与本文所述的抗体或其抗原结合片段中的任一个交叉竞争的抗体或其抗原结合片段。
在一方面，本公开涉及抗体-药物缀合物，其包含本文所述的抗体或其抗原结合片段。
在一方面，本公开涉及药物组合物，其包含本文所述的抗体或其抗原结合片段、或本文所述的抗体-药物缀合物以及药学上可接受的载剂。
在一方面，本公开涉及核酸，其包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
在一方面，本公开涉及包含本文所述的核酸的载体。
在一方面，本公开涉及包含本文所述的载体的细胞。
在一方面，本公开涉及产生抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括：(a)在足以使包含本文所述载体的细胞产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养该细胞；以及(b)收集由该细胞产生的抗体或其抗原结合片段。
在一方面，本公开涉及包含本文所述的其抗原结合片段的工程化受体。
在一些实施例中，工程化受体进一步包含跨膜区和胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(“CAR”)。
在一些实施例中，工程化受体进一步包含铰链区。
在一些实施例中，跨膜区包含CD4、CD8和/或CD28的跨膜区或其一部分。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导序列。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域是或包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含来自选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、CD11a/CD18、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和CD83配体。
在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含4-1BB和/或CD28的胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，工程化受体包含信号肽。
在一些实施例中，信号肽与SEQ ID NO:146至少80％、85％、90％、95％或100％相同。
在一些实施例中，工程化受体包含在SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127中任一个中列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127中任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，氨基酸序列与SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127中任一个相同。
在一方面，本公开涉及工程化受体，其包含：(a)第一抗原结合片段，其如本文所述的任一种抗原结合片段；和(b)与CD33结合的第二抗原结合片段。
在一些实施例中，第一抗原结合片段和第二抗原结合片段通过接头连接。
在一些实施例中，工程化受体进一步包含跨膜区和胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，工程化受体是嵌合抗原受体(“CAR”)。
在一些实施例中，工程化受体进一步包含铰链区。
在一些实施例中，跨膜区包含CD4、CD8和/或CD28的跨膜区或其一部分。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导序列。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域是或包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含来自选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、CD11a/CD18、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和CD83配体。
在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含4-1BB和/或CD28的胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，工程化受体包含信号肽。在一些实施例中，信号肽与SEQ ID NO:146至少80％、85％、90％、95％或100％相同。
在一些实施例中，工程化受体是嵌合T细胞受体(“cTCR”)。
在一些实施例中，跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的TCR亚基的跨膜结构域：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε和CD3δ。
在一些实施例中，跨膜结构域衍生自CD3ε的跨膜结构域。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域衍生自选自由以下组成的组的TCR亚基的胞内信号传导结构域：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε和CD3δ。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域衍生自CD3ε的胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，本文所述的工程化受体进一步包含TCR亚基的胞外结构域的至少一部分。
在一些实施例中，抗原结合片段与CD3ε的N末端融合(“eTCR”)。
在一方面，本公开涉及双受体系统，其包含：(a)第一工程化受体，该第一工程化受体包含可以是本文所述的任一种抗原结合片段的第一抗原结合片段(例如，与CLL1结合的抗原结合片段)；和(b)第二工程化受体，该第二工程化受体包含与CD33结合的第二抗原结合片段。
在一些实施例中，第一工程化受体和第二工程化受体中的每一个进一步包含跨膜区和胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，第一工程化受体和第二工程化受体都是嵌合抗原受体(“CAR”)。
在一些实施例中，第一工程化受体和第二工程化受体中的每一个进一步包含铰链区。
在一些实施例中，跨膜区包含CD4、CD8和/或CD28的跨膜区或其一部分。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导序列。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域是或包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。
在一些实施例中，胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含来自选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、CD11a/CD18、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和CD83配体。
在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含4-1BB和/或CD28的胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，第一工程化受体和第二工程化受体中的每一个包含信号肽。
在一些实施例中，信号肽与SEQ ID NO:146至少80％、85％、90％、95％或100％相同。
在一些实施例中，第一工程化受体包含在SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127中任一个中列出的氨基酸序列，或与7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，第二工程化受体包含SEQ ID NO:159、163、167或171中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:159、163、167或171至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，第一工程化受体包含SEQ ID NO:27或97中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27或97至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，第二工程化受体包含SEQ ID NO:163中列出的氨基酸序列，且第一工程化受体包含SEQ ID NO:97中列出的氨基酸序列。
在一些实施例中，第二工程化受体包含SEQ ID NO:163中列出的氨基酸序列，且第一工程化受体包含SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列。
在一些实施例中，第二工程化受体包含SEQ ID NO:171中列出的氨基酸序列，且第一工程化受体包含SEQ ID NO:97中列出的氨基酸序列。
在一些实施例中，第二工程化受体包含SEQ ID NO:171中列出的氨基酸序列，且第一工程化受体包含SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列。
在一些实施例中，第一工程化受体和第二工程化受体都是嵌合T细胞受体(“cTCR”)。
在一方面，本公开涉及编码本文所述的任一种工程化受体或双受体系统的工程化受体的多核苷酸。
在一些实施例中，本文所述的多核苷酸编码包含SEQ ID NO:132-145中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:132-145至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽。
在一方面，本公开涉及包含本文所述的多核苷酸的载体。
在一些实施例中，载体是病毒载体。
在一方面，本公开涉及表达本文所述的任一种工程化受体或双受体系统的工程化细胞。
在一些实施例中，本文所述的工程化细胞包含编码SEQ ID NO:132-145中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:132-145至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多核苷酸。
在一些实施例中，工程化细胞是免疫细胞。
在一些实施例中，免疫细胞是NK细胞或T细胞。
在一些实施例中，工程化细胞是T细胞。
在一些实施例中，T细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T(NK-T)细胞、αβT细胞和γδT细胞。
在一方面，本公开涉及生产工程化细胞的方法，其包括在体外或离体将本文所述的载体引入细胞中。
在一些实施例中，载体是病毒载体，并且引入通过转导进行。
在一方面，本公开涉及治疗受试者中癌症的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的本文所述的抗体或其抗原结合片段、本文所述的抗体-药物缀合物、本文所述的药物组合物或本文所述的工程化细胞。
在一些实施例中，癌症是急性髓系白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)或骨髓增生异常综合征(MDS)。
如本文所用，术语“抗体”是指含有至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)互补决定区(CDR)(例如，来自免疫球蛋白轻链的三个CDR中的任一个或来自免疫球蛋白重链的三个CDR中的任一个)并且能够特异性结合抗原中的表位的任何抗原结合分子。抗体的非限制性实例包括：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、单可变结构域(VHH)抗体、嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在一些实施例中，抗体可以含有人抗体的Fc区。术语抗体还包括衍生物，例如，多特异性抗体、双特异性抗体、单链抗体、双抗体和由这些抗体或抗体片段形成的线性抗体。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指全长抗体的一部分，其中抗体的该部分能够特异性结合抗原。在一些实施例中，抗原结合片段含有至少一个可变结构域(例如，重链的可变结构域、轻链的可变结构域或VHH)。抗体片段的非限制性实例包括，例如，Fab、Fab'、F(ab’)2和Fv片段、scFv和VHH。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并描述根据本公开的方法向其提供治疗的动物，人类或非人类。在本公开中设想了兽医和非兽医应用。人类患者可以是成年人或青少年(例如，18岁以下的人类)。除人类外，患者包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、雪貂、猫、狗和灵长类动物。例如，包括非人类灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(例如，大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔子)、兔形目动物、猪(例如，猪、小型猪)、马、犬、猫、牛和其他家养动物、农场动物和动物园动物。
如本文所用，当提及抗体或抗原结合片段时，短语“特异性结合(specificallybinding和specifically binds)”意味着抗体或抗原结合片段与其他分子相比优选地与其靶分子相互作用，因为这种相互作用取决于靶分子上特定结构(即抗原决定簇或表位)的存在；换句话说，试剂识别并结合包含特定结构的分子，而不是一般的所有分子。特异性结合靶分子的抗体可称为靶点特异性抗体。例如，特异性结合CLL1的抗体可称为CLL1抗体、CLL1特异性抗体或抗CLL1抗体。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合两个不同表位的抗体。表位可以位于同一抗原上或位于不同抗原上。
如本文所用，术语“三特异性抗体”是指结合三个不同表位的抗体。表位可以位于同一抗原上或位于不同抗原上。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指结合两个或更多个不同表位的抗体。表位可以位于同一抗原上或位于不同抗原上。多特异性抗体可以是例如双特异性抗体或三特异性抗体。在一些实施例中，多特异性抗体结合两个、三个、四个、五个或六个不同表位。
如本文所用，“VHH”是指仅重链抗体的可变结构域。在一些实施例中，VHH是人源化VHH。
如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域和包含一个或多个衍生自信号转导蛋白的胞内信号传导结构域的胞内区。这些胞内信号传导结构域通常与衍生胞外结构域的多肽不同。胞外结构域可以是可以特异性结合预定抗原的任何蛋白质分子或其部分。在一些实施例中，胞外结构域包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，胞内信号传导结构域可以是已知的任何寡肽或多肽结构域，其功能是传递引起细胞中生物过程的激活或抑制的信号，例如免疫细胞如T细胞或NK细胞的激活。
如本文所用，“串联CAR”是指包含两个或更多个能够结合抗原的胞外结构域的CAR。在一些实施例中，串联CAR可以具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个能够结合抗原的胞外结构域。这些抗原结合结构域可以相同或不同。在一些实施例中，这些抗原结合结构域可以结合相同或不同抗原。在一些实施例中，这些抗原结合结构域可以结合同一抗原上的不同表位。
如本文所用，“双受体系统”或“双CAR系统”是指包含两个或多个工程化受体(例如CAR)的系统，每个靶向不同的分子或不同的表位。每个工程化受体(例如，CAR)还可以包括跨膜区；和/或胞内信号传导结构域。在一些实施例中，本文所述的双CAR系统包括两个工程化受体。在一些实施例中，本文所述的双CAR系统包括靶向CLL1的第一CAR和靶向CD33的第二CAR。在一些实施例中，工程化受体在单个载体中表达。在一些实施例中，工程化受体通过自切割肽(例如，P2A蛋白)连接。在一些实施例中，两个工程化受体在不同载体中表达。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述的方法和材料用于本公开；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和示例仅供说明之用，无意限制。文中提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过引用以其全文并入本文。如有冲突，将以包括定义的本说明书为准。
从下面的详细描述和附图以及权利要求中可以明显看出本公开的其他特征和优点。
附图说明
示例性实施例在附图中示出。本文所公开的实施例和附图应被视为说明性的，而不是限制性的。
图1A显示了使用酶联免疫吸附测定(ELISA)实验在不同时间点进行的免疫动物血清与固定化的人CLL1的结合。
图1B显示了使用ELISA进行的分离的免疫前和免疫后免疫球蛋白与固定化的人CLL1的结合。
图2显示了13种抗CLL1 IgG1抗体与人CLL1的结合亲和力。
图3显示了与BM CAR-T细胞相比，抗CLL1 CAR-T细胞对CLL1-HEK293T细胞的细胞毒性。
图4A显示了与BM CAR-T细胞相比，抗CLL1 CAR-T细胞对CLL1-HEK293T细胞的细胞因子分泌(IFN-γ产生)。
图4B显示了与BM CAR-T细胞相比，抗CLL1 CAR-T细胞对CLL1-HEK293T细胞的细胞因子分泌(GM-CSF产生)。
图5A显示了抗CLL1 CAR-T细胞的杀伤功效，如长期共培养测定(重复肿瘤刺激测定)中残留肿瘤细胞(CFSE-THP-1)所标志的，其中肿瘤细胞与抗CLL1 CAR-T细胞共培养。
图5B显示了长期共培养测定(重复肿瘤刺激测定)中的T细胞增殖速率，其中肿瘤细胞与抗CLL1 CAR-T细胞共培养。
图6显示了U937-Luc异种移植小鼠模型中抗CLL1 CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性。
图7是与CD33和CLL1结合的抗CD33/CLL1串联CAR的示例示意图。
图8显示了与抗CLL1单靶点CAR相比，抗CD33/CLL1串联CAR对THP-1细胞的体外细胞毒性。
图9A显示了与抗CLL1单靶点CAR相比，在长期共培养测定(重复肿瘤刺激测定)中各种抗CD33/CLL1串联CAR-T细胞的杀伤功效，其中肿瘤细胞与抗CD33/CLL1串联CAR-T细胞共培养。
图9B显示了与抗CLL1单靶点CAR相比，在长期共培养测定(重复肿瘤刺激测定)中抗CD33/CLL1串联CAR的T细胞增殖速率，其中肿瘤细胞与抗CD33/CLL1串联CAR-T细胞共培养。
图10A显示了与抗CLL1单靶点CAR-T细胞相比，抗CD33/CLL1串联CAR-T细胞的细胞因子释放(IFN-γ产生)。
图10B显示了与抗CLL1单靶点CAR-T细胞相比，抗CD33/CLL1串联CAR-T细胞的细胞因子释放(GM-CSF产生)。
图10C是示例性双CAR系统的示意图。
图11显示了U937-Luc异种移植小鼠模型中抗CD33/CLL1串联CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性。
图12显示了与抗CLL1单靶点CAR-T细胞相比，使用体外LDH(乳酸脱氢酶)测定评估的双CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
图13显示了与抗CLL1单靶点CAR-T细胞相比，U937-Luc异种移植小鼠模型中双CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性。
图14A显示了本文所述的抗CLL1抗体和抗原结合片段的实例的VL CDR和VH CDR的氨基酸序列。
图14B显示了本文所述的抗CD33抗体和抗原结合片段的实例的VL CDR和VH CDR的氨基酸序列。
图15显示了本文所述的单靶点CAR、scFv、VL、VH、信号肽和人CLL1的实例的氨基酸序列。
具体实施方式
急性髓系白血病(AML)是成人急性白血病最常见的类型之一。标准化疗可在选定的患者中诱导完全缓解；然而，大多数患者最终会复发并死于这种疾病。因此，迫切需要开发新型AML治疗。人C型凝集素样分子-1(CLL1)是II型跨膜糖蛋白，其表达限于髓系细胞和大多数AML母细胞。此外，CLL1在白血病干细胞(LSC)中表达，但在造血干细胞(HSC)中不存在，这可能为AML治疗提供潜在的治疗靶点。由于CLL1在髓系细胞上选择性表达，因此识别并结合CLL1的组合物可用于血液恶性肿瘤(尤其是髓系来源的那些血液恶性肿瘤)的此类治疗。
本公开提供了以高亲和力结合CLL1表位的分离的抗体或其免疫功能抗体片段(即抗原结合片段)，这些抗体可用于治疗CLL1所涉及(例如，过表达)的各种疾病，例如血液恶性肿瘤，包括白血病。在一些实施例中，抗体或其抗体片段与灵长类动物和人CLL1结合。在一些实施例中，抗体和抗原结合片段以高亲和力与人CLL1结合。
CLL1和癌症
CLL1在92％ AML上表达，在粒细胞巨噬细胞祖细胞(GMP)上不存在(Bakker AB,等人Cancer Res.2004；64:8443-50)。更重要的是，CLL1也在白血病干细胞(LSC)上表达，白血病干细胞具有无限期自我更新和产生大量具有CLL1、CD123、CD44、CD96、CD90、CD32、CD25和TIM-3的特定表型的子母细胞的能力，作为白血病复发的最重要原因之一(Siveen KS,等人Mol Cancer.2017；16:13.Yoshida GJ,等人Cancer Sci.2016；107:5-11.Zhou J,等人World J Stem Cells.2014；6:473-84)。因此，其差异特征允许将CLL1视为AML治疗的靶点。CLL1也称为c型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、髓系抑制性c型凝集素样受体(MICL)、树突状细胞(DC)相关C型凝集素2(DCAL-2)或CD371。
人类非血液组织很少表达CLL1/hMICL。在造血树中，CLL1主要在几乎所有的粒细胞和单核细胞上表达，在约61.8％的粒细胞和单核细胞前体上表达；在41.6％的祖细胞和仅在定义为CD34+CD38-的2.5％的HSC上表达，但不在T、B、NK细胞和红细胞及其前体上表达(Wang J,等人J Hematol Oncol.2018；11:7.)。
CLL1因其在母细胞和白血病干细胞(LSC)中的过表达而成为AML的极好治疗靶点。本公开提供了靶向CLL1的抗体、靶向CLL1的嵌合抗原受体及其使用方法。
抗体和抗原结合片段
本公开提供了与CLL1结合的抗体及其抗原结合片段。一般来说，抗体(也称为免疫球蛋白)由两类多肽链组成，轻链和重链。本公开的非限制性抗体可以是完整的四个免疫球蛋白链抗体，包括两个重链和两个轻链。抗体的重链可以是任何同种型，包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD或亚同种型，包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等。轻链可以是к轻链或λ轻链。抗体可以具有两个相同拷贝的轻链和两个相同拷贝的重链。重链各自包含一个可变结构域(或可变区，VH)和多个恒定结构域(或恒定区)，通过其恒定结构域内的二硫键相互结合，形成抗体的“茎”。轻链各自包含一个可变结构域(或可变区，VL)和一个恒定结构域(或恒定区)，每个轻链通过二硫键结合一个重链。每个轻链的可变区与其结合的重链的可变区对齐。轻链和重链的可变区包含三个夹在更保守的框架区(FR)之间的高变区。
这些高变区称为互补决定区(CDR)，形成包含抗体的主要抗原结合表面的环。四个框架区主要采用β折叠构象，CDR形成连接β折叠结构，并在某些情况下形成其一部分的环。每个链中的CDR被框架区保持在非常接近的位置，并且与来自另一链的CDR一起，有助于抗原结合区的形成。
通过分析抗体的氨基酸序列来鉴定抗体的CDR区的方法是众所周知的，并且通常使用CDR的许多定义。Kabat定义基于序列变异性，Chothia定义基于结构环区的位置。这些方法和定义在以下中描述：例如，Martin,Antibody engineering,Springer BerlinHeidelberg,2001.422-439；Abhinandan,等人,Molecular immunology 45.14(2008):3832-3839；Wu,T.T.和Kabat,E.A.(1970)J.Exp.Med.132:211-250；Martin等人,MethodsEnzymol.203:121-53(1991)；Morea等人,Biophys Chem.68(1-3):9-16(1997年10月)；Morea等人,J Mol Biol.275(2):269-94(1998年1月)；Chothia等人,Nature342(6252):877-83(1989年12月)；Ponomarenko和Bourne,BMC Structural Biology 7:64(2007)；其每一个通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，使用Kabat定义。在一些实施例中，使用Chothia定义。在一些实施例中，使用Kabat和Chothia的组合，和/或本领域公知的一些其他定义。
CDR对于识别抗原的表位是重要的。如本文所用，“表位”是靶分子中能够被抗体的抗原结合结构域特异性结合的最小部分。表位的最小大小可以是约三个、四个、五个、六个或七个氨基酸，但这些氨基酸不需要在抗原一级结构的连续线性序列中，因为表位可能取决于基于抗原的二级和三级结构的抗原的三维构型。
在一些实施例中，抗体是完整的免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)高度保守，其恒定区不同，特别是其铰链和上部CH2结构域。IgG亚类的序列和差异在本领域中是已知的，并且在以下中描述：例如，Vidarsson,等人,Frontiers in immunology 5(2014)；Irani,等人,Molecularimmunology 67.2(2015):171-182；Shakib,Farouk,编辑The human IgG subclasses:molecular analysis of structure,function and regulation.Elsevier,2016；其每一个通过引用以其全文并入本文。
抗体也可以是衍生自任何物种(例如，人类、啮齿动物、小鼠、骆驼)的免疫球蛋白分子。本文公开的抗体还包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性抗体和包括与另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域的嵌合抗体。术语“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是抗体中保留完整抗体特异性结合活性的部分，即抗体中能够特异性结合完整抗体靶分子上表位的任何部分。例如，它包括Fab、Fab'、F(ab')2以及这些片段的变体。因此，在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段可以是例如scFv、Fv、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性scFv、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体以及包括作为抗体结合结构域与抗体结合结构域同源的结合结构域的任何多肽。抗原结合结构域的非限制性实例包括例如，完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链或来自完整抗体的重链或轻链的单个CDR。
在一些实施例中，抗原结合片段可以形成嵌合抗原受体(CAR)的一部分。在一些实施例中，嵌合抗原受体是本文所述的单链可变片段(scFv)的融合体，其融合到CD3ζ跨膜结构域和胞内域。在一些实施例中，嵌合抗原受体还包含来自各种共刺激蛋白受体(例如，CD28、41BB、ICOS)的胞内信号传导结构域。在一些实施例中，嵌合抗原受体包含多个信号传导结构域，例如，CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以增加效力。因此，在一方面，本公开还提供了表达本文所述的嵌合抗原受体的细胞(例如，T细胞)。在一些实施例中，scFv具有一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域。
本公开提供了特异性结合CLL1的抗体及其抗原结合片段。本公开提供了例如抗体及其抗原结合片段、其嵌合抗体及其人源化抗体(例如，如图14A和15所示的抗体)。在一些实施例中，本公开提供了AS138628、AS138658、AS138943、AS138993、AS141286、AS141297、AS141330、AS141522、AS141553、AS141567、AS141641、AS141701和AS141819的抗体及其抗原结合片段。
AS138628的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:1、2和3，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:4、5和6。
AS138658的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:11、12和13，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:14、15和16。
AS138943的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:21、22和23，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:24、25和26。
AS138993的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:31、32和33，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:34、35和36。
AS141286的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:41、42和43，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:44、45和46。
AS141297的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:51、52和53，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:54、55和56。
AS141330的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:61、62和63，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:64、65和66。
AS141522的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:71、72和73，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:74、75和76。
AS141553的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:81、82和83，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:84、85和86。
AS141567的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:91、92和93，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:94、95和96。
AS141641的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:101、102和103，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:104、105和106。
AS141701的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:111、112和113，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:114、115和116。
AS141819的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:121、122和123，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:124、125和126。
此外，在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段还可以包含选自图14A-14B中VH CDR的一个、两个或三个重链可变区CDR，以及选自图14A-14B中VL CDR的一个、两个或三个轻链可变区CDR。在一些实施例中，VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3由Kabat定义确定。
在一些实施例中，抗体可以具有包含互补决定区(CDR)1、2、3的重链可变区(VH)，其中CDR1区包含或由与所选VH CDR1氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成，CDR2区包含或由与所选VH CDR2氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成，以及CDR3区包含或由与所选VH CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。在一些实施例中，抗体可以具有包含CDR 1、2、3的轻链可变区(VL)，其中CDR1区包含或由与所选VL CDR1氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成，CDR2区包含或由与所选VL CDR2氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成，以及CDR3区包含或由与所选VL CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。由Kabat确定的所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列和所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列如图14A-14B所示。
在一些实施例中，本文所述的抗体或抗原结合片段可以包含含有图14A-14B中CDR的一个、两个或三个的重链可变结构域，在每个CDR中具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或置换。在一些实施例中，本文所述的抗体或抗原结合片段可以包含含有图14A-14B中CDR的一个、两个或三个的轻链可变结构域，在每个CDR中具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或置换。
还提供了多种抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。由于人源化抗体的方法不同(例如，可以用不同的氨基酸置换来修饰序列)，因此抗体的重链和轻链可以具有一种以上形式的人源化序列。
本公开还提供了与CLL1结合的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段含有包含或由与所选VH序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成的重链可变区(VH)，以及包含或由与所选VL序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成的轻链可变区(VL)。在一些实施例中，所选VH序列和所选VL序列衍生自AS138628、AS138658、AS138943、AS138993、AS141286、AS141297、AS141330、AS141522、AS141553、AS141567、AS141641、AS141701和AS141819。
抗体AS138628的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中列出。抗体AS138628的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中列出。
抗体AS138658的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:20中列出。抗体AS138658的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:19中列出。
抗体AS138943的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:30中列出。抗体AS138943的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:29中列出。
抗体AS138993的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:40中列出。抗体AS138993的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:39中列出。
抗体AS141286的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:50中列出。抗体AS141286的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:49中列出。
抗体AS141297的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:60中列出。抗体AS141297的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:59中列出。
抗体AS141330的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:70中列出。抗体AS141330的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:69中列出。
抗体AS141522的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:80中列出。抗体AS141522的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:79中列出。
抗体AS141553的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:90中列出。抗体AS141553的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:89中列出。
抗体AS141567的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:100中列出。抗体AS141567的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:99中列出。
抗体AS141641的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:110中列出。抗体AS141641的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:109中列出。
抗体AS141701的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:120中列出。抗体AS141701的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:119中列出。
抗体AS141819的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:130中列出。抗体AS141819的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:129中列出。
本公开还提供了人源化抗体或其抗原结合片段。人源化百分比是指与国际免疫遗传学信息系统(IMGT)数据库中的人抗体序列相比，重链或轻链可变区序列的同一性百分比。在一些实施方案中，人源化百分比大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。关于如何确定人源化百分比和如何确定最高命中率的详细描述是本领域已知的，并且在以下中描述：例如，Jones,Tim D.,等人,MAbs.第8卷.第1期.Taylor&Francis,2016，将其通过引用以其全文并入本文。高人源化百分比通常具有各种优点，例如，对人类更安全且更有效，更可能被人类受试者耐受，和/或不太可能产生副作用。
此外，在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段还可以包含选自图14A-14B和15中所列的每个抗体或抗原结合片段的SEQ ID NO组的一个、两个或三个重链可变区CDR(以任意顺序)，和/或选自图14A-14B和15中所列的每个抗体或抗原结合片段的SEQID NO组的一个、两个或三个轻链可变区CDR(以任意顺序)。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可以包含重链可变结构域，其包含本文所述的抗体或其抗原结合片段的重链CDR中任一个的一个、两个或三个CDR，具有零、一或两个氨基酸插入、缺失或置换。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可以包含轻链可变结构域，其包含本文所述的抗体或其抗原结合片段的轻链CDR中任一个的一个、两个或三个CDR，具有零、一或两个氨基酸插入、缺失或置换。插入、缺失和置换可以在CDR序列内，或在CDR序列的一个或两个末端。
本公开还提供了与CLL1结合的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段含有包含或由与所选VH序列或所选scFv的VH至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成的重链可变区(VH)，以及包含或由与所选VL序列或所选scFv的VL至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成的轻链可变区(VL)。
在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:10，以及所选VL序列是SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:8。
在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:20，以及所选VL序列是SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:18。
在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:30，以及所选VL序列是SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:28。
在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:40，以及所选VL序列是SEQ ID NO:39。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:38。
在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:50，以及所选VL序列是SEQ ID NO:49。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:48。
在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:60，以及所选VL序列是SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:58。
在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:70，以及所选VL序列是SEQ ID NO:69。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:68。
在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:80，以及所选VL序列是SEQ ID NO:79。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:78。
在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:90，以及所选VL序列是SEQ ID NO:89。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:88。
在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:100，以及所选VL序列是SEQ ID NO:99。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:98。
在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:110，以及所选VL序列是SEQ ID NO:109。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:108。
在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:120，以及所选VL序列是SEQ ID NO:119。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:118。
在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:130，以及所选VL序列是SEQ ID NO:129。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:128。
本公开还提供了包含编码包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的多肽的多核苷酸的核酸。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链包含本文所述的抗体或其抗原结合片段中任一个的CDR，或具有本文所述的抗体或其抗原结合片段中任一个的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的序列。当多肽与相应的多肽(例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区)配对时，配对的多肽结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:1、2和3中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQID NO:4、5或6中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:4、5和6中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:1、2或3中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:11、12和13中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:14、15或16中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:14、15和16中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:11、12或13中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:21、22和23中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:24、25或26中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:24、25和26中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:21、22或23中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:31、32和33中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:34、35或36中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:34、35和36中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:31、32或33中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:41、42和43中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:44、45或46中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:44、45和46中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:41、42或43中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:51、52和53中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:54、55或56中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:54、55和56中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:51、52或53中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:61、62和63中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:64、65或66中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:64、65和66中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:61、62或63中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:71、72和73中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:74、75或76中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:74、75和76中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:71、72或73中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:81、82和83中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:84、85或86中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:84、85和86中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:81、82或83中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:91、92和93中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:94、95或96中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:94、95和96中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:91、92或93中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:101、102和103中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:104、105或106中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:104、105和106中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:101、102或103中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:111、112和113中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:114、115或116中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:114、115和116中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:111、112或113中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)121、122和123，它们分别包含SEQ ID NO:1、2和3中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:124、125或126中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CLL1。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:124、125和126中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:121、122或123中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CLL1。
本公开提供了特异性结合CD33的抗体及其抗原结合片段。本公开提供了例如抗体及其抗原结合片段、其嵌合抗体及其人源化抗体(例如，如图14B和15所示的抗体)。在一些实施例中，本公开提供了AS141869、AS199772、AS200728C和AS188893的抗体及其抗原结合片段。
AS141869的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:175、176和177，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:178、179和180。
AS199772的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:181、182和183，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:184、185和186。
AS200728C的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:187、188和189，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:190、191和192。
AS188893的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:193、194和195，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:196、197和198。
本公开还提供了与CD33结合的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段含有包含或由与所选VH序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成的重链可变区(VH)，以及包含或由与所选VL序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成的轻链可变区(VL)。在一些实施例中，所选VH序列和所选VL序列衍生自AS141869、AS199772、AS200728C和AS188893。
抗体AS141869的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:162中列出。抗体AS141869的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:161中列出。
抗体AS199772的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:166中列出。抗体AS199772的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:165中列出。
抗体AS200728C的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:170中列出。抗体AS200728C的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:169中列出。
抗体AS188893的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:174中列出。抗体AS188893的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:173中列出。
本公开还提供了与CD33结合的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段含有包含或由与所选VH序列或所选scFv的VH至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成的重链可变区(VH)，以及包含或由与所选VL序列或所选scFv的VL至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成的轻链可变区(VL)。在一些实施例中，所选VH序列是SEQ IDNO:162，以及所选VL序列是SEQ ID NO:161。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:160。在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:166，以及所选VL序列是SEQ ID NO:165。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:164。在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:170，以及所选VL序列是SEQ ID NO:169。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:168。在一些实施例中，所选VH序列是SEQ ID NO:174，以及所选VL序列是SEQ ID NO:173。在一些实施方案中，所选scFv是SEQ ID NO:172。在一些实施例中，免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链包含本文所述的任一种抗体或其抗原结合片段的CDR。
本公开还提供了包含编码包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的多肽的多核苷酸的核酸。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链包含本文所述的抗体或其抗原结合片段中任一个的CDR，或具有本文所述的抗体或其抗原结合片段中任一个的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的序列。当多肽与相应的多肽(例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区)配对时，配对的多肽结合CD33。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:175、176和177中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:178、179和180中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CD33。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:178、179和180中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:175、176和177中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CD33。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:181、182和183中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:184、185和186中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CD33。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:184、185和186中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:181、182和183中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CD33。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:187、188和189中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:190、191和192中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CD33。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:190、191和192中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:187、188和189中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CD33。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白重链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白重链包含重链可变区(VH)，该重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:193、194和195中列出的氨基酸序列，其中VH当与包含SEQ ID NO:196、197和198中列出的氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合CD33。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含编码包含免疫球蛋白轻链或其片段的多肽的多核苷酸，该免疫球蛋白轻链包含VL，该VL包含CDR 1、2和3，它们分别包含SEQ ID NO:196、197和198中列出的氨基酸序列，其中VL当与包含SEQ ID NO:193、194和195中列出的氨基酸序列的VH配对时结合CD33。
嵌合抗原受体和结合分子
嵌合抗原受体(CAR)将正常T细胞激活的许多方面组合成单个蛋白质。它们将胞外抗原识别结构域与胞内信号传导结构域连接，当结合抗原时，从而激活T细胞。CAR通常具有以下区：抗原结合结构域、胞外铰链区、跨膜区和胞内区。在一些实施例中，胞内区包括胞内信号传导结构域或胞内信号传导区。CAR可以使用基因转染技术在T细胞表面表达。在与靶肿瘤抗原结合后，CAR可以激活T细胞，以抗原依赖性方式启动特异性抗肿瘤反应，而不受靶肿瘤抗原特异性主要组织相容性复合物(MHC)可用性的限制。
抗原结合结构域暴露于细胞外部，在受体的胞外结构域部分中。它与潜在的靶分子相互作用，并负责将CAR-T细胞靶向表达匹配分子的任何细胞。抗原结合结构域通常衍生自作为单链可变片段(scFv)连接在一起的单克隆抗体的可变区。scFv是嵌合蛋白，由免疫球蛋白的轻链(VL)和重链(VH)组成，通过短接头肽连接。
在一些实施例中，接头肽包含至少或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40或50个氨基酸残基。在一些实施例中，接头肽包含至少或约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、20、25、30或40个甘氨酸残基。在一些实施例中，接头肽包含至少或约1、2、3、4、5、6、7或8个丝氨酸残基。在一些实施例中，接头肽包含或由甘氨酸和丝氨酸残基组成。在一些实施例中，接头肽包含或由与GGGGS(SEQ ID NO:200)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:201)至少或约70％、至少或约75％、至少或80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约99％或100％相同的序列组成。在一些实施例中，接头序列包含GGGGS(SEQ ID NO:200)的至少1、2、3、4、5、6、7或8个重复。在一些实施例中，接头序列具有不超过10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40或50个氨基酸残基。在一些实施例中，接头肽包含1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失或置换。
在一些实施例中，抗原结合结构域特异性地结合CLL1(例如，人CLL1或猴(食蟹猴)CLL1)。在一些实施例中，抗原结合结构域特异性地结合CLL1的胞外结构域(ECD)。
铰链，也称为间隔物，是位于抗原结合结构域和细胞外膜之间的小结构域。理想的铰链增强抗原结合结构域的灵活性，减少CAR与其靶抗原之间的空间限制。这促进了CAR-T细胞和靶细胞之间的抗原结合和突触形成。铰链序列通常基于IgG铰链区，或来自免疫分子的膜近端区，包括例如CD8和CD28。在一些实施例中，铰链区衍生自CD8和/或CD28，并且包含与SEQ ID NO:153或155至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。
跨膜区是由跨越细胞膜的疏水性α螺旋组成的结构成分。它将CAR锚定在质膜上，将胞外铰链和抗原结合结构域与胞内信号传导结构域桥接。该结构域对于整个受体的稳定性至关重要。通常，使用来自胞内域的最接近膜的成分的跨膜结构域，但不同的跨膜结构域导致不同的受体稳定性。已知CD28跨膜结构域产生高度表达的稳定受体。在一些实施例中，跨膜区衍生自CD8和/或CD28，并且包含与SEQ ID NO:154或156至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。
胞内T细胞信号传导区位于受体的胞内域，在细胞内。抗原与外部抗原结合结构域结合后，CAR受体聚集在一起并传递激活信号。然后受体的内部细胞质末端维持T细胞内的信号传导。正常的T细胞激活依赖于CD3ζ胞内结构域中存在的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的磷酸化。为了模拟这一过程，CD3ζ胞内结构域通常用作CAR胞内域的主要成分。除了CD3信号传导外，T细胞还需要共刺激分子，以便在激活后持续存在。因此，CAR受体的胞内域通常还包括一个或多个来自共刺激蛋白的嵌合结构域。来自各种共刺激分子的信号传导结构域已成功测试，包括CD28、CD27、CD134(OX40)、ICOS、造血细胞信号转换器(DAP10)和/或CD137(4-1BB)。在一些实施例中，共刺激结构域衍生自4-1BB和/或CD28(例如，融合肽)，并且包含与SEQ ID NO:152、157或158至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。
各种CAR分子和表达这些CAR分子的载体可用于本文所述的方法。在一些实施例中，CAR分子特异性地结合CLL1(例如，人CLL1)。在一些实施例中，CAR包含SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127和132-145中任一个中列出的氨基酸序列；或与其具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
抗原受体的示例性结构，包括铰链、跨膜结构域和胞内T细胞信号传导结构域，以及将这种受体工程化和引入细胞的方法在以下中描述：例如，Chandran等人,Immunological Reviews 290.1(2019):127-147；Cartellieri,Marc,等人,BioMedResearch International 2010(2010)；以及PCT公开号WO 2017173256A1；US2002/131960、US 2013/287748、US2013/0149337、U.S.6,451,995、U.S.7,446,190和U.S.8,252,592；其每一个通过引用以其全文并入本文。
本公开提供了特异性地结合CLL1的嵌合抗原受体(CAR)或其片段。本文所述的CAR或其片段能够结合CLL1。
本公开提供了CAR或其片段，其包含(a)特异性地识别CLL1的胞外抗原结合结构域；(b)跨膜区；和/或(c)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，本文所述的CAR的抗原结合结构域或其片段与本文所述的任一种抗原结合片段(例如，AS138628、AS138658、AS138943、AS138993、AS141286、AS141297、AS141330、AS141522、AS141553、AS141567、AS141641、AS141701和AS141819)或其人源化抗体相同。在一些实施例中，本文所述的CAR的抗原结合结构域或其片段包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)与本文所述的接头肽连接的scFv。
AS138628CAR的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:1、2和3，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:4、5和6。
AS138658CAR的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:11、12和13，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:14、15和16。
AS138943CAR的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:21、22和23，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:24、25和26。
AS138993CAR的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:31、32和33，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:34、35和36。
AS141286CAR的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:41、42和43，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:44、45和46。
AS141297CAR的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:51、52和53，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:54、55和56。
AS141330CAR的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:61、62和63，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:64、65和66。
AS141522CAR的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:71、72和73，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:74、75和76。
AS141553CAR的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:81、82和83，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:84、85和86。
AS141567CAR的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:91、92和93，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:94、95和96。
AS141641CAR的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:101、102和103，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:104、105和106。
AS141701CAR的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:111、112和113，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:114、115和116。
AS141819CAR的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:121、122和123，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:124、125和126。
本文还提供工程化受体(CAR)，其包括(a)第一抗原结合片段，其与本文所述的特异性地识别CLL1的任一个抗原结合结构域相同；和(b)与CD33结合的第二抗原结合片段。
本公开还提供了CAR或其片段，其包含(a)特异性地识别CLL1的第一胞外抗原结合结构域；(b)特异性地识别CD33的第二胞外抗原结合结构域；(c)跨膜区；和/或(d)胞内信号传导结构域。在一些实施例中，每个scFv的重链和轻链(分别为VH和VL)按顺序放置。在一些实施例中，特异性地识别CD33的抗原结合结构域位于N末端。在一些实施例中，特异性地识别CLL1的抗原结合结构域位于N末端。在一些实施例中，一个scFv的重链和轻链插入另一个scFv的VH和VL之间。
在一些实施例中，本文所述的CAR的第一抗原结合结构域或其片段与本文所述的任一种抗原结合片段(例如，AS138628、AS138658、AS138943、AS138993、AS141286、AS141297、AS141330、AS141522、AS141553、AS141567、AS141641、AS141701和AS141819)或其人源化抗体相同。在一些实施例中，本文所述的CAR的抗原结合结构域或其片段包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)与本文所述的接头肽连接的scFv。
在一些实施例中，本文所述的CAR的第二抗原结合结构域或其片段与AS141869、AS199772、AS200728C和AS188893的任一个抗原结合片段或其人源化抗体相同。在一些实施例中，本文所述的CAR的抗原结合结构域或其片段包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)与本文所述的接头肽连接的scFv。
抗体AS141869的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:162中列出。抗体AS141869的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:161中列出。抗体AS141869的scFv的氨基酸序列在SEQ ID NO:160中列出。
AS141869的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:175、176和177，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:178、179和180。
抗体AS199772的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:166中列出。抗体AS199772的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:165中列出。抗体AS199772的scFv的氨基酸序列在SEQ ID NO:164中列出。
AS199772的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:181、182和183，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:184、185和186。
抗体AS200728C的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:170中列出。抗体AS200728C的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:169中列出。抗体AS200728C的scFv的氨基酸序列在SEQ ID NO:168中列出。
AS200728C的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:187、188和189，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:190、191和192。
抗体AS188893的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:174中列出。抗体AS188893的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:173中列出。抗体AS188893的scFv的氨基酸序列在SEQ ID NO:172中列出。
AS188893的抗原结合结构域或其相关抗原结合片段的CDR序列包括重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:193、194和195，以及轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:196、197和198。
在一些实施例中，第一胞外抗原结合结构域和第二胞外抗原结合结构域通过接头连接。本文所述的任何合适的接头都可用于连接两个胞外抗原结合结构域。在一些实施例中，接头包含SGGGGS(SEQ ID NO:148)的氨基酸序列。在一些实施例中，接头包含GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:149)的氨基酸序列。
在一些实施例中，插入在另一个scFv的VH和VL之间的一个scFv的VH和VL通过接头连接。本文所述的任何合适的接头都可用于连接VH和VL。在一些实施例中，接头包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:199)的氨基酸序列。在一些实施例中，一个scFv的VH和另一个scFv的VL通过接头连接。本文所述的任何合适的接头都可用于连接一个scFv的VH和另一个scFv的VL。在一些实施例中，接头包含GGGGS(SEQ ID NO:200)的氨基酸序列。
在一些实施例中，插入在另一个scFv的VH1和VL1之间的一个scFv的VH2和VL2通过接头连接。本文所述的任何合适的接头都可用于连接VH2和VL2。在一些实施例中，VH2和VL2之间的接头包含GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:199)的氨基酸序列。在一些实施例中，VL1和VH2通过接头连接。本文所述的任何合适的接头都可用于连接VL1和VH2。在一些实施例中，VL1和VH2之间的接头包含GGGGS(SEQ ID NO:200)的氨基酸序列。在一些实施例中，VL2和VH1通过接头连接。本文所述的任何合适的接头都可用于连接VL2和VH1。在一些实施例中，VL2和VH1之间的接头包含GGGGS(SEQ ID NO:200)的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文所述的CAR的第二抗原结合结构域或其片段与本文所述的任一种抗原结合片段(例如，AS138628、AS138658、AS138943、AS138993、AS141286、AS141297、AS141330、AS141522、AS141553、AS141567、AS141641、AS141701和AS141819)或其人源化抗体相同。在一些实施例中，本文所述的CAR的抗原结合结构域或其片段包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)与本文所述的接头肽连接的scFv。
在一些实施例中，CAR的抗原结合结构域的scFv或其相关抗原结合片段的氨基酸序列被人源化(例如，序列可以用不同的氨基酸取代来修饰)。在一些实施例中，scFv可以具有多个版本的人源化序列。
在一些实施例中，本文所述的CAR、相关抗体或其抗原结合片段可以具有重链可变结构域(VH)，其包含互补决定区(CDR)1、2、3，其中CDR1区包含或由与所选VH CDR1氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成，CDR2区包含或由与所选VH CDR2氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成，以及CDR3区包含或由与所选VH CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，本文所述的CAR、相关抗体或其抗原结合片段可以具有轻链可变结构域(VL)，其包含互补决定区(CDR)1、2、3，其中CDR1区包含或由与所选VL CDR1氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成，CDR2区包含或由与所选VL CDR2氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成，以及CDR3区包含或由与所选VL CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成。
所选VH和VL CDR 1、2、3氨基酸序列如图14A-14B所示。
在一些实施例中，本文所述的CAR、相关抗体或其抗原结合片段含有VH，该VH含有具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或置换的VH CDR1；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或置换的VH CDR2；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或置换的VH CDR3中的一个、两个或三个。
在一些实施例中，本文所述的CAR、相关抗体或其抗原结合片段含有VL，该VL含有具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或置换的VL CDR1；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或置换的VL CDR2；具有零个、一个或两个氨基酸插入、缺失或置换的VL CDR3中的一个、两个或三个。
本公开还提供了与CLL1结合的CAR或其片段。在一些实施例中，CAR、相关抗体或其抗原结合片段含有重链可变区(VH)，其包含或由与所选VH序列至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所选VH序列选自SEQ ID NO:10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120和130。
在一些实施例中，CAR、相关抗体或其抗原结合片段含有轻链可变区(VL)，其包含或由与所选VL序列至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所选VL序列选自SEQ ID NO:9、19、29、39、49、59、69、79、89、99、109、119和129。
AS138628CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:7中列出。AS138658CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:17中列出。AS138943CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:27中列出。AS138993CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:37中列出。AS141286CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:47中列出。AS141297CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:57中列出。AS141330CAR的氨基酸序列在SEQ IDNO:67中列出。AS141522CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:77中列出。AS141553CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:87中列出。AS141567CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:97中列出。AS141641CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:107中列出。AS141701CAR的氨基酸序列在SEQ IDNO:117中列出。AS141819CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:127中列出。
本文还提供了包含两个与本文所述的接头肽连接的scFv的CAR(即串联CAR)。例如，Tan1-R-893-943CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:132中列出。Tan2-S-893-943CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:133中列出。Tan3-T-893-943CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:134中列出。Tan4-R-772-943CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:135中列出。Tan5-S-772-943CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:136中列出。Tan6-T-772-943CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:137中列出。Tan7-R-728C-943CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:138中列出。Tan8-S-728C-943CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:139中列出。Tan9-T-728C-943CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:140中列出。Tan10-R-869-567CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:141中列出。
本公开还提供了双受体系统，其包含：(a)第一工程化受体，该第一工程化受体包含本文所述的第一抗原结合片段；和(b)第二工程化受体，该第二工程化受体包含与CD33结合的第二抗原结合片段。
在一些实施例中，双受体系统包含第一CAR，其包含(a)特异性识别CLL1的第一胞外抗原结合结构域；第一跨膜区；和/或第一胞内信号传导结构域；和第二CAR，其包含(b)特异性识别CD33的第二胞外抗原结合结构域；第二跨膜区；和/或第二胞内信号传导结构域。
本文还提供了包含两个本文所述的CAR的双受体系统(双CAR系统)，并且两个CAR靶向不同的分子(即靶向CD33和CLL1的双CAR)。例如，Dual1-Para-943-893CAR和Dual2-Para-943-772CAR中AS138943CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:27中列出，Dual3-Para-567-893CAR和Dual4-Para-567-772CAR中AS141567CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:97中列出，Dual1-Para-943-893和Dual3-Para-567-893中AS188893CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:171中列出，Dual4-Para-567-772中AS199772CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:163中列出。
本文还提供了包含与例如本文所述的自切割肽(例如P2A)连接的两个CAR多肽的双CAR多肽，并且两个CAR可以靶向不同的分子(即靶向CD33和CLL1的双CAR)。例如，Dual1-Para-943-893CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:142中列出。Dual2-Para-943-772CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:143中列出。Dual3-Para-567-893CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:144中列出。Dual4-Para-567-772CAR的氨基酸序列在SEQ ID NO:145中列出。
在一些实施例中，本文提供的CAR或其片段包含与SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127和132-145中任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所述的CAR包含SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127和132-145中任一个中列出的氨基酸序列；任选地具有约或不多于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸插入、缺失或置换。
在一些实施例中，本文所述的嵌合抗原受体(CAR)或其片段包含铰链区。在一些实施例中，铰链区是来自CD8和/或CD28的膜近端区、或IgG铰链区、或其任何组合。在一些实施例中，铰链区是CD8(例如，人CD8)的膜近端区。在一些实施例中，铰链区是融合肽，其包含CD28(例如，人CD28)的全部或部分膜近端区和CD8(例如，人CD8)的全部或部分膜近端区。在一些实施例中，铰链区包含CD8和CD28的膜近端区。
在一些实施例中，本文所述的嵌合抗原受体(CAR)或其片段包含跨膜区。在一些实施例中，跨膜结构域是4-1BB/CD137、T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD19、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或T细胞受体的ζ链的跨膜结构域、或其任何组合。在一些实施例中，跨膜区是来自CD8(例如，人CD8)的跨膜区。在一些实施例中，铰链区和跨膜区直接连接。在一些实施例中，连接的铰链区和跨膜区包含与SEQ ID NO:151至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，跨膜区是融合肽，其包含CD28(例如，人CD28)的全部或部分跨膜区和CD8(例如，人CD8)的全部或部分跨膜区。在一些实施例中，跨膜区包含CD8和CD28的跨膜区。
在一些实施例中，本文所述的嵌合抗原受体(CAR)或其片段包含胞内信号传导结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含激活胞内信号传导结构域，其能够在免疫细胞(例如，T细胞)中诱导初级激活信号。在一些实施例中，激活胞内信号传导结构域是T细胞受体(TCR)成分。在一些实施例中，激活胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(ICOS)、FceRI、CD66d、DAP10、DAP12或其组合的氨基酸序列。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含CD3ζ(例如，人CD3ζ)的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，胞内信号传导结构域包含与SEQ ID NO:150至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文所述的嵌合抗原受体(CAR)或其片段包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域位于跨膜结构域和胞内信号传导结构域之间。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含来自选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、CD11a/CD18、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和CD83配体。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含来自OX40、CD28、4-1BB、ICOS或其信号传导部分的功能性信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含4-1BB(例如，人4-1BB)的胞内信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含与SEQ ID NO:152至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含CD28(例如，人CD28)的胞内信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域包含CD28(例如，人CD28)和4-1BB(例如，人4-1BB)的胞内信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激信号传导结构域是融合肽，其包含CD28(例如，人CD28)的全部或部分胞内信号传导结构域和4-1BB(例如，人4-1BB)的全部或部分胞内信号传导结构域。
在一些实施例中，本文所述的CAR或其片段的铰链区、跨膜区和/或胞内信号传导结构域(例如，共刺激信号传导结构域和/或激活胞内信号传导结构域)衍生自一代、二代、三代或四代CAR结构。CAR的结构特征的细节可以例如在Jackson,Hollie J.,等人,NatureReviews Clinical Oncology 13.6(2016):370；和Subklewe,Marion,等人,TransfusionMedicine and Hemotherapy 46.1(2019):15-24中找到；其每一个通过引用并入文中。
在一些实施例中，CAR是双链CAR、基于配体的CAR、T细胞受体融合构建体(TRuC)、通用免疫受体(UIR)或串联CAR(tanCAR)。在一些实施例中，CAR与双特异性T细胞接合物(BiTE)结合使用。这些CAR构建体描述在以下中：例如，Hughes-Parry等人,Internationaljournal of molecular sciences 21.1(2020):204，将其通过引用以其全文并入本文。
CAR、抗体、抗原结合片段特征
在一些实施例中，与不表达CAR、抗体或其抗原结合片段的免疫细胞相比，本文所述的CAR、抗体或其抗原结合片段可将免疫细胞(例如，T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、抗原呈递细胞)的免疫应答、活性或数量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍、或20倍。
在一些实施中，抗体(或其抗原结合片段)特异性结合CLL1，其解离速率(koff或Kd)小于0.1s-1、小于0.01s-1、小于0.001s-1、小于0.0001s-1或小于0.00001s-1。在一些实施例中，解离速率(koff)大于0.01s-1、大于0.001s-1、大于0.0001s-1、大于0.00001s-1或大于0.000001s-1。
在一些实施例中，动力学缔合速率(kon或Ka)大于1×102/Ms、大于1×103/Ms、大于1×104/Ms、大于1×105/Ms或大于1×106/Ms。在一些实施例中，动力学缔合速率(kon)小于1×105/Ms、小于1×106/Ms或小于1×107/Ms。
结合亲和力可以从动力学速率常数的商(KD＝koff/kon)推导出来。在一些实施例中，抗体、其抗原结合片段或其衍生的分子(例如CAR)的KD(Kd)小于1×10-6M、小于1×10- 7M、小于1×10-8M、小于1×10-9M或小于1×10-10M。在一些实施例中，KD小于100nM、50nM、30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM。在一些实施例中，KD大于1×10-7M、大于1×10- 8M、大于1×10-9M、大于1×10-10M、大于1×10-11M或大于1×10-12M。
用于测量抗体对抗原的亲和力的一般技术包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选(FACS)和表面等离子体共振(SPR)。在一些实施例中，抗体与人CLL1结合。在一些实施例中，抗体与人CLL1的胞外结构域(ECD)结合。在一些实施例中，抗体与猴CLL1(例如，食蟹猴)结合。在一些实施例中，抗体与表达CLL1的细胞结合。
工程化细胞
本公开提供了表达本文所述的CAR和/或各种蛋白质的工程化细胞(例如，免疫细胞、T细胞、NK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞)。这些工程化细胞可用于治疗本文所述的各种病况或疾病(例如，CLL1相关癌症)。
在各种实施例中，被工程化的细胞可以从例如人类和非人类动物中获得。在各种实施例中，被工程化的细胞可以从细菌、真菌、人类、大鼠、小鼠、兔子、猴子、猪或任何其他物种中获得。优选地，细胞来自人类、大鼠或小鼠。在一些实施例中，细胞是小鼠淋巴细胞并被工程化(例如转导)以表达CAR或其抗原结合片段。在一些实施例中，细胞是从人类获得的。在各种实施例中，被工程化的细胞是血细胞。优选地，细胞是白细胞(例如，T细胞)、淋巴细胞或任何其他合适的血细胞类型。在一些实施例中，细胞是外周血细胞。在一些实施例中，细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施例中，细胞是T细胞、B细胞或NK细胞。在一些实施例中，细胞是人外周血单个核细胞(PBMC)。在一些实施例中，人PBMC是CD3+细胞。在一些实施例中，人PBMC是CD8+细胞或CD4+细胞。
在一些实施例中，细胞是T细胞。在一些实施例中，T细胞可以表达识别靶细胞表面特定抗原部分的细胞表面受体。细胞表面受体可以是野生型或重组T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)或能够识别与靶细胞相关的抗原部分的任何其他表面受体。T细胞可以通过本领域已知的各种方法获得，例如，体外培养从患者分离的T细胞(例如肿瘤浸润淋巴细胞)。基因修饰的T细胞可以通过用病毒载体转导T细胞(例如，从患者的外周血中分离)来获得。在一些实施例中，T细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞或调节性T细胞。在一些实施例中，T细胞是T辅助1型T细胞和T辅助2型T细胞。在一些实施例中，T细胞是αβT细胞。在替代实施例中，T细胞是γδT细胞。在一些实施例中，T细胞是中央记忆T细胞。在一些实施例中，T细胞是效应记忆T细胞。在一些实施例中，T细胞是幼稚T细胞。
在一些实施例中，细胞是NK细胞。在一些实施例中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入结合分子例如CAR的细胞可以从样品中分离，例如生物样品，例如，从受试者获得或衍生的样品。在一些实施例中，从中分离细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法的受试者。在一些实施例中，受试者是需要特定治疗干预的人，例如正在分离、处理和/或工程化细胞的过继细胞疗法。
在一些实施例中，细胞是干细胞，例如多能和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞可以是原代细胞，例如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的细胞。在一些实施例中，用额外的分化因子培养干细胞以获得所需的细胞类型(例如，T细胞)。
从适当的分离方法可以获得不同的细胞类型。分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(诸如表面标记物，例如，表面蛋白、胞内标记物或核酸)的表达或存在来分离不同细胞类型。在一些实施例中，可以使用基于此类标记的任何已知的分离方法。在一些实施例中，分离是基于亲和或免疫亲和的分离。例如，在一些方面，分离包括基于细胞对一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与特异性结合此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，随后通常进行洗涤步骤并将结合有抗体或结合配偶体的细胞与未结合抗体或结合配偶体的那些细胞分离。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中结合有试剂的细胞被保留以供进一步使用)和/或基于阴性选择(其中未与抗体或结合配偶体结合的细胞被保留)。在一些实例中，两个部分都保留以供进一步使用。在一些方面，当无抗体可用于特异性鉴定异质群中的细胞类型时，阴性选择可能特别有用，使得可基于除所需群外的细胞表达的标记进行最佳分离。
还提供了用于表达结合分子和用于产生表达这种结合分子的基因工程化细胞的方法、核酸、组合物和套件(试剂盒)。基因工程通常涉及将编码治疗分子(例如，CAR、多肽、融合蛋白)的核酸引入细胞，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化。在一些实施例中，基因转移是通过首先刺激细胞来完成的，例如通过将其与诱导诸如增殖、存活和/或活化的反应的刺激物组合，例如，通过细胞因子或活化标记物的表达所测量的，然后转导活化细胞，并在培养中扩增至足以临床应用的数量。
在一些实施例中，使用重组感染性病毒颗粒，例如衍生自猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体，将重组核酸转移到细胞中。在一些实施例中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(例如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中。在一些实施例中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，衍生自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增殖性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体衍生自鼠逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒包括衍生自任何禽或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人类在内的几种物种的宿主细胞。在一些实施例中，载体是慢病毒载体。在一些实施例中，重组核酸通过电穿孔转移到T细胞中。在一些实施例中，重组核酸通过转座转移到T细胞中。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染、钨颗粒促进的微粒轰击和磷酸锶DNA共沉淀。许多这些方法在例如WO 2019195486中描述，将其通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，T细胞在转导前例如使用抗CD3/CD28颗粒预活化约12小时、约24小时、约36小时、约48小时或约60小时。在一些实施例中，转导的T细胞在转导后第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天或第12天收集。
在一些实施例中，本文所述的病毒感染的T细胞的转染效率为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％。在一些实施例中，在转导后第0天、第1天、第2天、第3天、第4天或第5天，转导的T细胞的活力为至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％。在一些实施例中，在转导后第0天、第1天、第2天、第3天、第4天或第5天(例如，第5天)，与未转导的T细胞的活力相比，转导的T细胞的活力为至少或约80％、至少或约90％、至少或约100％、至少或约110％、至少或约120％。
在一些实施例中，在转导后第0天、第1天、第2天、第3天、第4天或第5天，T细胞扩增倍数为至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。在一些实施例中，在转导后第0天、第1天、第2天、第3天、第4天或第5天(例如，第5天)，与未转导的T细胞相比，转导的T细胞的T细胞扩增倍数为至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、至少或约90％。
还提供了工程化细胞群、含有此类细胞和/或富集此类细胞的组合物，例如其中表达CAR的细胞占组合物中总细胞或某种类型的细胞(例如T细胞，CD8+或CD4+细胞)的至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比。
在一些实施例中，工程化细胞(例如，CAR-T细胞)与靶细胞共培养至少或约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、16小时、18小时、1天、2天、3天或更长时间，使得工程化细胞(例如CAR-T细胞)可以被激活。
在一些实施例中，测定本文所述的工程化细胞(例如CAR-T细胞)的体外细胞毒性。在一些实施例中，工程化细胞以约1:0.1、约1:0.2、约1:0.3、约1:0.5、约1:1、约1:2、约1:5、约1:10、约1:20、约1:50的E:T比率与靶细胞一起孵育。在一些实施例中，孵育为约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约20小时、约22小时、约24小时、约36小时或约48小时。
在一些实施例中，细胞毒性通过以下公式计算([LDH]E+T：从E/T共孵育释放的LDH，[LDH]E：仅从效应子释放的LDH，[LDH]max：用Triton X-100处理的靶细胞释放的LDH，[LDH]min：从未处理的靶细胞释放的LDH)：
在一些实施例中，本文所述的工程化细胞(例如CAR-T细胞)的体外细胞毒性为至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。
在一些实施例中，工程化细胞(例如，CAR-T细胞)的长期细胞毒性是例如通过再攻击工程化细胞来测定的。CAR-T细胞的示例性再攻击程序可以在例如Wang,Dongrui,等人,Journal of Visualized Experiments:JoVE 144(2019)；Wang D,等人,JCI Insight2018,3(10)；Lange等人,Cancer Discov.2021年2月9日,candisc.0896.2020中找到；其每一个通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，工程化细胞被激发至少1、2、3、4、5或6次。在一些实施例中，计算的细胞毒性(细胞毒性％)是在每次激发后测定的。在一些实施例中，在第一次激发后，本文所述的工程化细胞的计算的细胞毒性为至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，在第二次激发后，本文所述的工程化细胞的计算的细胞毒性为至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，在第三次激发后，本文所述的工程化细胞的计算的细胞毒性为至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，在第四次激发后，本文所述的工程化细胞的计算的细胞毒性为至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，在第五次激发后，本文所述的工程化细胞的计算的细胞毒性为至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，在第六次激发后，本文所述的工程化细胞的计算的细胞毒性为至少0％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，本文所述的工程化细胞的最大激发次数(即肿瘤细胞生长前的激发次数)为至少5次、6次、7次、8次、9次或10次。
在一些实施例中，在1次激发、2次激发、3次激发、4次激发、5次激发或6次激发后，与具有含单个胞外scFv的CAR的工程化细胞相比，具有本文所述的串联CAR的工程化细胞的计算的细胞毒性是至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。
在一些实施例中，当工程化细胞(例如CAR-T细胞)与靶细胞共培养时，在1次激发、2次激发、3次激发、4次激发、5次激发或6次激发后，与初始工程化细胞群相比，工程化细胞群增加至少或约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍或更多。
在一些实施例中，本文所述的工程化细胞(例如，CAR-T细胞)释放的细胞因子(例如，IFN-γ、GM-CSF和/或TNF-α)的浓度通过均相时间分辨荧光(HTRF)测定法来测定。
在一些实施例中，与未转导细胞(例如，T细胞)的细胞因子表达或分泌水平相比，当与靶细胞共培养时，本文所述的工程化细胞(例如，CAR-T细胞)将细胞因子(例如，IFN-γ、GM-CSF和/或TNF-α)表达或分泌增加至少或约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、500倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、10000倍或更多。
在一些实施例中，当与靶细胞共培养时，本文所述的工程化细胞(例如，CAR-T细胞)释放至少5000pg/mL INF-γ、至少6000pg/mL INF-γ、至少7000pg/mL INF-γ、至少8000pg/mL INF-γ、至少9000pg/mL INF-γ、至少10000pg/mL INF-γ、至少11000pg/mLINF-γ、至少12000pg/mL INF-γ、至少13000pg/mL INF-γ、至少14000pg/mL INF-γ或至少15000pg/mL INF-γ。
在一些实施例中，当与靶细胞共培养时，本文所述的工程化细胞(例如，CAR-T细胞)释放至少1000pg/mL GM-CSF、至少1200pg/mL GM-CSF、至少1400pg/mL GM-CSF、至少1600pg/mL GM-CSF、至少1800pg/mL GM-CSF、至少2000pg/mL GM-CSF、至少2200pg/mL GM-CSF、至少2400pg/mL GM-CSF、至少2600pg/mL GM-CSF、至少2800pg/mL GM-CSF、至少3000pg/mL GM-CSF、至少3200pg/mL GM-CSF、至少3400pg/mL GM-CSF。
在一些实施例中，当与靶细胞共培养时，本文所述的工程化细胞(例如，CAR-T细胞)释放至少100pg/mL INF-γ、至少200pg/mL INF-γ、至少300pg/mL INF-γ、至少400pg/mL INF-γ、至少500pg/mL INF-γ、至少600pg/mL INF-γ、至少700pg/mL INF-γ、至少800pg/mL INF-γ、至少900pg/mL INF-γ、至少1000pg/mL INF-γ、至少1200pg/mL INF-γ、至少1400pg/mL INF-γ、至少1600pg/mL INF-γ、至少1800pg/mL INF-γ、至少2000pg/mL INF-γ、至少2200pg/mL INF-γ、至少2400pg/mL INF-γ、至少2600pg/mL INF-γ、至少2800pg/mL INF-γ、至少3000pg/mL INF-γ、至少3500pg/mL INF-γ、至少4000pg/mL INF-γ、至少4500pg/mL INF-γ、至少5000pg/mL INF-γ、至少5500pg/mL INF-γ或至少6000pg/mL INF-γ。
在一些实施例中，当与靶细胞共培养时，本文所述的工程化细胞(例如，CAR-T细胞)释放至少200pg/mL GM-CSF、400pg/mL GM-CSF、600pg/mL GM-CSF、800pg/mL GM-CSF、1000pg/mL GM-CSF、1200pg/mL GM-CSF、1400pg/mL GM-CSF、1600pg/mL GM-CSF、1800pg/mLGM-CSF、2000pg/mL GM-CSF、2200pg/mL GM-CSF、2400pg/mL GM-CSF、2600pg/mL GM-CSF、2800pg/mL GM-CSF、3000pg/mL GM-CSF、3200pg/mL GM-CSF、3400pg/mL GM-CSF、3600pg/mLGM-CSF、3800pg/mL GM-CSF、4000pg/mL GM-CSF、4500pg/mL GM-CSF、5000pg/mL GM-CSF、5500pg/mL GM-CSF、6000pg/mL GM-CSF、6500pg/mL GM-CSF、7000pg/mL GM-CSF、7500pg/mLGM-CSF或8000pg/mL GM-CSF。
在一些实施例中，在1次激发、2次激发、3次激发、4次激发、5次激发或6次激发后，与具有含单个胞外scFv的CAR的工程化细胞相比，具有本文所述的串联或双靶向CAR(例如，Tan1-R-893-943、Tan2-S-893-943、Tan3-T-893-943、Tan4-R-772-943、Tan5-S-772-943、Tan6-T-772-943、Tan7-R-728C-943、Tan8-S-728C-943、Tan9-T-728C-943、Tan10-R-869-567、Dual1-Para-943-893、Dual2-Para-943-772、Dual3--567-893、Dual4-Para-567-772CAR中任一个)的工程化细胞的细胞因子(例如，IFN-γ、GM-CSF和/或TNF-α)表达是至少或约100％、至少或约110％、至少或约120％、至少或约130％、至少或约140％、至少或约150％或更多。
在一些实施例中，细胞是人PBMC并被工程化(例如转导)以表达CAR或其抗原结合片段。
在一些实施例中，测定本文所述的工程化细胞(例如CAR-T细胞)的体外细胞毒性。在一些实施例中，使用U937-Luc小鼠异种移植模型测定本文所述的工程化细胞(例如CAR-T细胞)的体外细胞毒性。在一些实施例中，用本文所述的工程化细胞(例如，CAR-T细胞)处理的小鼠在治疗后2周后、3周后、4周后或5周后无肿瘤。
重组载体
本公开还提供了重组载体(例如，表达载体)，其包括本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)，将重组载体引入其中的宿主细胞(即，使得宿主细胞含有多核苷酸和/或包含多核苷酸的载体)，以及通过重组技术生产重组多肽或其片段。
载体是当将载体引入宿主细胞时能够将一个或多个感兴趣的多核苷酸递送到宿主细胞的构建体。“表达载体”能够在引入表达载体的宿主细胞中递送和表达一个或多个感兴趣的多核苷酸作为编码多肽。因此，在表达载体中，感兴趣的多核苷酸通过与调节元件如启动子、增强子和/或多聚A尾可操作地连接而定位用于在载体中表达，该调节元件在载体内或在宿主细胞的基因组中在感兴趣的多核苷酸的整合位点处或附近或侧翼，使得感兴趣的多核苷酸将在引入表达载体的宿主细胞中翻译。
载体可以通过本领域已知的方法引入宿主细胞，例如电穿孔、化学转染(例如DEAE-葡聚糖)、转化、转染以及感染和/或转导(例如，用重组病毒)。因此，载体的非限制性实例包括病毒载体(其可用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体以及与阳离子缩合剂结合的DNA或RNA表达载体。
本公开提供了包含适用于基因修饰细胞的核酸构建体的重组载体，其可用于治疗病理性疾病或病症。
任何载体或载体类型都可用于将遗传物质递送到细胞。这些载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和人类人工染色体(HAC)。病毒载体可以包括但不限于重组逆转录病毒载体、重组慢病毒载体、重组腺病毒载体、泡沫病毒载体、重组腺相关病毒(AAV)载体、杂交载体和质粒转座子(例如，睡美人转座子系统和PiggyBac转座子系统)或基于整合酶的载体系统。本领域已知的其他载体也可以与本文所述的方法结合使用。
在一些实施例中，载体是病毒载体。病毒载体可以在病毒载体生产专用的培养基中生长。根据本文所述的实施例，可以使用用于生长病毒载体的任何合适的生长培养基和/或补充剂。在一些实施例中，病毒载体含有用以促进表达的组成型启动子，本文考虑的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)以及与CMV早期增强子偶联的鸡β-肌动蛋白启动子(CAGG)。在一些实施例中，组成型启动子是hEF1α启动子。
在一些实施例中，使用的载体是重组逆转录病毒载体。逆转录病毒载体能够指导感兴趣的核酸分子的表达。逆转录病毒以RNA形式存在于其病毒包膜中，并在宿主细胞中复制时形成双链DNA中间体。类似地，逆转录病毒载体以RNA和双链DNA形式存在。逆转录病毒载体还包括含有重组DNA片段的DNA形式和含有重组RNA片段的RNA形式。载体可以包括至少一个转录启动子/增强子，或其他控制基因表达的元件。这种载体还可以包括包装信号、长末端重复序列(LTR)或其部分，以及适合所用逆转录病毒的正链和负链引物结合位点。长末端重复序列(LTR)是在逆转录转座子或通过逆转录病毒RNA的逆转录形成的前病毒DNA的任一端发现的重复多次(例如，数百或数千次)的相同DNA序列。它们被病毒用来将其遗传物质插入宿主基因组。任选地，载体还可以包括指导聚腺苷酸化的信号、选择性标记物如氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、TK、潮霉素抗性、腐草霉素抗性、组氨醇抗性或DHFR，以及一个或多个限制性位点和翻译终止序列。例如，此类载体可以包括5'LTR、前导序列、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点以及3'LTR或其一部分。此外，本文所用的逆转录病毒载体还可以指通过去除逆转录病毒gag、pol和env基因并用感兴趣的基因替换而产生的重组载体。
在一些实施例中，载体或构建体可以包含单个启动子，其驱动一个或多个核酸分子的表达。在一些实施例中，这样的启动子可以是多顺反子(双顺反子或三顺反子)。例如，在一些实施例中，转录单元可以被工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单个启动子的消息进行共表达基因产物(例如，编码CAR和抗体或其抗原结合片段)。替代地，在一些情况下，单个启动子可以指导在单个开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如，编码CAR和/或抗体或其抗原结合片段)的RNA的表达，这些基因通过编码自切割肽(例如，P2A或T2A)或蛋白酶识别位点(例如，弗林蛋白酶)的序列彼此分离。因此，ORF编码单个多蛋白，其在翻译期间(在2A的情况下，例如T2A)或翻译后被切割成单个蛋白质。在一些情况下，肽(例如T2A)可导致核糖体跳跃(核糖体跳跃)2A元件C末端肽键的合成，导致2A序列末端与下游下一个肽之间的分离。
各种细胞系可以与本文所述的载体结合使用。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；HEK293细胞，包括HEK293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S、DG44.Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；PER.细胞；和NSO细胞。在一些实施例中，根据其对抗体或CAR分子进行所需的翻译后修饰的能力来选择特定的真核宿主细胞。例如，在一些实施例中，CHO细胞产生的多肽比HEK293细胞中产生的相同多肽具有更高水平的唾液酸化。在一方面，本公开涉及包含本文所述的载体或一对载体的细胞。
本公开还提供了包含编码任何抗体、CAR、其抗原结合片段和/或CAR衍生的结合分子(包括例如本文所述的其功能部分和功能变体、多肽或蛋白质)的核苷酸序列的核酸序列。本文所用的“核酸”可以包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常是指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的，合成或从天然来源获得，其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。此外，核酸包含互补DNA(cDNA)。通常优选的是，核酸不包含任何插入、缺失、倒置和/或置换。然而，如本文所述，在一些情况下，核酸包含一个或多个插入、缺失、倒置和/或置换可以是合适的。
本文所述的核酸可以使用本领域已知的程序基于化学合成和/或酶促连接反应来构建。例如，核酸可以使用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸进行化学合成。在一些任何这样的实施例中，核苷酸序列是密码子优化的。
本公开还提供了包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严格条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的核酸。
在一些实施例中，编码CAR的核苷酸序列被导致核糖体跳跃的肽序列分离。在一些实施例中，导致核糖体跳跃的肽是P2A或T2A肽。在一些实施例中，核酸是合成的。在一些实施例中，核酸是cDNA。
在某些实施例中，多肽包含信号肽。在一些实施例中，信号肽包含与SEQ ID NO:146至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的序列。
本公开还提供了与本文所述的任何核苷酸序列至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列，以及与本文所述的任何氨基酸序列至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开涉及编码本文所述的任何肽的核苷酸序列，或由本文所述的任何核苷酸序列编码的任何氨基酸序列。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，对这些序列比对以进行最佳比较(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个中引入空位以获得最佳比对，并且可以忽略非同源序列以进行比较)。出于比较目的而比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少80％，并且在一些实施例中为至少90％、95％或100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数量的函数，同时考虑到空位的数量和每个空位的长度，需要引入空位来实现两个序列的最佳比对。例如，可以使用空位罚分为12，空位延伸罚分为4和移码空位罚分为5的Blossum 62评分矩阵来完成序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定。
在一些实施例中，核酸序列为至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500或600个核苷酸。在一些实施例中，氨基酸序列为至少或约5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800或900个氨基酸残基。在一些实施例中，核酸序列少于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500或600个核苷酸。在一些实施例中，氨基酸序列少于5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800或900个氨基酸残基。
工程化细胞的制备方法
本公开提供了用于制备、制造和/或使用工程化细胞来治疗病理性疾病或病症的方法或过程。
用于引入本文所述蛋白质例如CAR的细胞可以从样品中分离，例如生物样品，例如，从受试者获得或衍生的样品。在一些实施例中，从中分离细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法的受试者。在一些实施例中，受试者是需要特定治疗干预的人，例如正在分离、处理和/或工程化细胞的过继细胞疗法。
因此，在一些实施例中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及由一个或多个处理步骤产生的样品，例如分离、离心、基因工程(例如，使用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液，例如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液、组织和器官样品，包括由此衍生的加工样品。
在一些方面，从中衍生或分离细胞的样品是血液或血液衍生的样品，或衍生自单采或白细胞分离产物。示例性样品包括全血、外周血单个核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠道相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰腺、乳腺、骨骼、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施例中，细胞衍生自细胞系，例如T细胞系。在一些实施例中，细胞是从异种来源获得的，例如，来自小鼠、大鼠或非人灵长类动物。在一些实施例中，细胞是从小鼠淋巴结中分离出来的。
在一些实施例中，将从受试者收集的血细胞洗涤，例如，除去血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施例中，洗涤溶液缺少钙和/或镁和/或许多或全部二价阳离子。在一些方面，洗涤步骤是通过半自动“直流式”离心机完成的。在一些方面，洗涤步骤是通过切向流过滤(TFF)完成的。在一些实施例中，在洗涤后将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如不含Ca2+/Mg2+的PBS。在某些实施例中，去除血细胞样品的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。在一些实施例中，方法包括基于密度的细胞分离方法，例如通过裂解红细胞和通过Percoll或Ficoll梯度离心从外周血制备白细胞。
在一些实施例中，方法包括以下一个或多个步骤：例如，从患者的血液中分离T细胞；用包括编码基因工程化抗原受体的核酸构建体的病毒载体转导T细胞群；在体外扩增转导的细胞；和/或将扩增的细胞注入患者体内，其中工程化T细胞将寻找并破坏抗原阳性肿瘤细胞。在一些实施例中，方法还包括：用含有核酸构建体的病毒载体转染T细胞。
在一些实施例中，方法涉及在体外或离体将本文所述的任何载体引入细胞中。在一些实施例中，载体是病毒载体，并且引入通过转导进行。在一些实施例中，将细胞转导至少或约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或更长时间。在一些实施例中，方法还涉及将一种或多种药剂引入细胞中，其中一种或多种药剂中的每一种能够独立地诱导T细胞受体α常数(TRAC)基因和/或T细胞受体β常数(TRBC)基因的遗传破坏。在一些实施例中，一种或多种药剂是抑制性核酸(例如，siRNA)。在一些实施例中，一种或多种药剂是融合蛋白，其包含靶向DNA的蛋白和核酸酶或RNA引导的核酸酶(例如，成簇的规则间隔短回文核酸(CRISPR)相关核酸酶)。
T细胞的转染可以通过使用任何标准方法来实现，例如磷酸钙、电穿孔、脂质体介导的转移、显微注射、生物发射颗粒递送系统或本领域技术人员的任何其他已知方法。在一些实施例中，T细胞的转染使用磷酸钙方法进行。
本公开提供了创建个性化抗肿瘤免疫疗法的方法。基因工程化T细胞可以从患者的血细胞中产生。然后，将这些工程化T细胞作为细胞治疗产品重新输注到患者体内。
治疗方法
本文公开的抗体及其抗原结合片段、CAR和免疫细胞可用于多种治疗目的。在一方面，本公开提供了用于治疗受试者的癌症的方法、降低受试者中肿瘤体积随时间增加的速率的方法、降低发生转移的风险的方法、或降低受试者中发生另外的转移的风险的方法。在一些实施例中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制癌症的进展。在一些实施例中，治疗可以导致受试者中癌症的一种或多种症状的数量、严重程度和/或持续时间降低。
在一方面，本公开的特征在于方法，该方法包括向有需要的受试者(例如，患有或被鉴定或诊断患有癌症的受试者)施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段，或表达CAR的工程化细胞。
在一些实施例中，受试者患有CLL1阳性癌症。在一些实施例中，受试者患有急性髓系白血病(AML)。在一些实施例中，受试者患有肝癌(例如，肝细胞癌)、胶质瘤、肺癌、结直肠癌、头颈癌、胃癌、肾癌、尿路上皮癌、睾丸癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌和/或卵巢癌。在一些实施例中，受试者患有鳞状细胞肺癌或实体瘤。在一些实施例中，受试者患有CNS肿瘤、甲状腺癌、胃肠道癌、皮肤癌、肉瘤、泌尿生殖器癌和/或生殖细胞肿瘤。
在一些实施例中，本文公开的组合物和方法可用于治疗有癌症风险的患者。患有癌症的患者可以用本领域已知的各种方法进行鉴定。
如本文所用，“有效量”是指足以实现有益或期望结果的量或剂量，包括停止、减缓、延缓或抑制疾病(例如癌症)的进展。有效量将取决于例如，要施用治疗剂和/或治疗组合物的受试者的年龄和体重、症状的严重程度和施用途径，因此施用可以根据个体来确定。
如本文所用，术语“延迟疾病的发展”是指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定、抑制和/或延缓疾病(如癌症)的发展。该延迟可以具有不同的时间长度，其取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。对本领域技术人员显而易见的是，足够的或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为该个体没有患上该疾病。例如，可延迟晚期癌症(例如转移的发展)。
有效量能够以一次或多次施用来进行施用。例如，组合物的有效量是足以改善、停止、稳定、逆转、抑制、减缓和/或延迟患者癌症进展的量，或者足以改善、停止、稳定、逆转、减缓和/或延迟细胞(例如，活检细胞、本文所述的任何癌细胞、或细胞系(例如癌细胞系))体外增殖的量。如本领域所理解的，有效性可以变化，特别取决于患者病史以及诸如所用组合物的类型(和/或剂量)的其他因素。
施用的有效量和时间表可以根据经验确定，并且做出这样的确定在本领域技术人员的范围内。本领域技术人员将理解，必须施用的剂量将取决于例如将接受治疗的哺乳动物、施用途径、施用给哺乳动物的特定类型的治疗剂和其他药物。选择适当剂量的指导可以在文献中找到。此外，治疗并不一定导致100％或完全治疗或预防疾病或病症。存在多种具有不同程度治疗效果的治疗/预防方法，本领域普通技术人员认为这是潜在的有利治疗手段。
在一些方面，本公开还提供了诊断哺乳动物疾病/病症的方法，其中CAR、抗体或抗原结合片段与从受试者获得的一种或多种样品相互作用以形成复合物，其中样品可以包含一种或多种细胞、多肽、蛋白质、核酸、抗体或抗原结合部分、血液、全细胞、其裂解物、或全细胞裂解物的一部分，例如，其细胞核部分或胞内部分、全蛋白部分或核酸部分，其中复合物的检测指示哺乳动物中存在病症，其中该病症是癌症或感染。此外，复合物的检测可以采用本领域已知的任意多种方式，但不限于ELISA、流式细胞仪、荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链式反应(PCR)、微阵列、Southern印迹法、电泳、噬菌体分析、色谱等。因此，治疗方法还可以包括确定受试者是否可以受益于本文公开的治疗，例如，通过确定受试者是否患有感染或癌症。
在本文所述的任何方法中，工程化细胞任选地与至少一种额外治疗剂一起，可以每周至少一次(例如，每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每天一次、每天两次或每天三次)施用给受试者。在一些实施例中，至少两种不同的工程化细胞(例如，表达不同CAR的细胞)在相同的组合物(例如，液体组合物)中施用。在一些实施例中，工程化细胞和至少一种额外治疗剂在相同的组合物(例如，液体组合物)中施用。在一些实施例中，工程化细胞和至少一种额外治疗剂在两种不同的组合物中施用。在一些实施例中，至少一种额外治疗剂以丸剂、片剂或胶囊的形式施用。在一些实施例中，至少一种额外治疗剂以缓释口服配制品施用。在一些实施例中，一种或多种额外治疗剂可以在向受试者施用工程化细胞之前、同时或之后施用给受试者。
在一些实施例中，额外治疗剂可以包含一种或多种选自由以下组成的组的抑制剂：B-Raf抑制剂、EGFR抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、K-Ras抑制剂、c-Met抑制剂、间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂、Akt抑制剂、mTOR抑制剂、双重PI3K/mTOR抑制剂、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂以及异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)和/或异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)抑制剂。在一些实施例中，额外治疗剂是吲哚胺2,3-双加氧酶-1(IDO1)抑制剂(例如，艾卡哚司他)。在一些实施例中，额外治疗剂可以包括一种或多种选自由HER3抑制剂、LSD1抑制剂、MDM2抑制剂、BCL2抑制剂、CHK1抑制剂、激活刺猬信号传导通路抑制剂和选择性降解雌激素受体的药剂组成的组的抑制剂。
在一些实施例中，额外治疗剂可以包含一种或多种选自由以下组成的组的治疗剂：曲贝替定、nab-紫杉醇、特伯纳尼、帕唑帕尼、西地尼布、帕博西尼、依维莫司、氟嘧啶、IFL、瑞戈非尼、Reolysin、力比泰、赞可达、索坦、替西罗莫司、阿昔替尼、依维莫司、索拉非尼、维全特、帕唑帕尼、IMA-901、AGS-003、卡博替尼、长春氟宁、Hsp90抑制剂、Ad-GM-CSF、替莫唑胺、IL-2、IFNa、长春花碱、沙利度胺、达卡巴嗪、环磷酰胺、来那度胺、阿扎胞苷、来那度胺、硼替佐米、氨柔比星、卡非佐米、普拉曲沙和恩扎妥林。
在一些实施例中，额外治疗剂可以包括一种或多种选自由以下组成的组的治疗剂：佐剂、TLR激动剂、肿瘤坏死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、IL-17拮抗剂、HVEM拮抗剂、ICOS激动剂、靶向CX3CL1的治疗、靶向CXCL9的治疗、靶向CXCL10的治疗、靶向CCL5的治疗、LFA-1激动剂、ICAM1激动剂和选择素激动剂。
在一些实施例中，将卡铂、nab-紫杉醇、紫杉醇、顺铂、培美曲塞、吉西他滨、FOLFOX或FOLFIRI施用给受试者。在一些实施例中，额外治疗剂选自天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱、长春新碱和/或其组合。
在一些实施例中，额外治疗剂是抗OX40抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体或抗GITR抗体。
组合物和配制品
本公开提供了包含通过本文公开的方法生产的工程化细胞及工程化细胞群的组合物(包括药物和治疗组合物)。还提供了用于将工程化细胞及其组合物施用给受试者(例如，患者或动物模型(例如小鼠))的方法，例如治疗方法。
提供的组合物包括用于施用的工程化细胞，包括药物组合物和配制品，例如单位剂型组合物，其包括以给定剂量或其部分施用的细胞数量。药物组合物和配制品可包括一种或多种任选的药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施例中，组合物包括至少一种额外治疗剂。
药学上可接受的载剂是指药物组合物中除活性成分以外的成分。药学上可接受的载剂不会干扰活性成分并对受试者无毒。药学上可接受的载剂可以包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。药物配制是指将不同物质和/或药剂组合以生产最终医药产品的过程。配制品研究涉及开发患者可接受的药物制剂。此外，一种制剂，其形式允许其中所含活性成分的生物活性有效，并且不含对施用配制品的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。
在一些实施例中，载剂的选择部分由特定细胞(例如，T细胞或NK细胞)和/或施用方法决定。有多种合适的配方可供选择。例如，药物组合物可含有防腐剂。合适的防腐剂可包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些实施例中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物典型地以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载剂例如由Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980)描述。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下通常对受体无毒，包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些实施例中，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物典型地以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。制备可施用药物组合物的方法是已知的。示例性方法在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中更详细地描述。
配制品可包括水溶液。配制品或组合物还可以含有一种以上的活性成分，可用于用工程化细胞治疗的特定适应症、疾病或病症，优选具有与细胞互补活性的那些，其中各自的活性不会相互不利影响。这些活性成分以对预期目的有效的量适当地组合存在。因此，在一些实施例中，药物组合物还可以包括其他药学活性剂或药物，例如检查点抑制剂、融合蛋白、化疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱和/或长春新碱。
在一些实施例中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量，例如治疗有效或预防有效量的细胞。在一些实施例中，治疗或预防功效通过定期评估治疗的受试者来监测。所需剂量可以通过单次推注施用细胞、多次推注施用细胞或连续输注施用细胞来递送。
细胞和组合物可以使用标准施用技术、配制和/或装置进行施用。细胞的施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答性T细胞或祖细胞可以从一个受试者获得，并在根据本文所述的各种实施例对它们进行基因修饰后施用给同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫应答性T细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生)可以通过局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。通常，当施用治疗组合物(例如，含有基因修饰的免疫应答性细胞的药物组合物)时，通常以单位剂量的可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)配制。
本文公开的配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌内、鼻内、口腔、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施例中，细胞群通过肠胃外施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施例中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送将细胞施用给受试者。
无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载剂、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等的混合物。根据施用途径和所需的制剂，组合物可以含有辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或色素。在一些方面可以查阅标准文本以制备适当的制剂。
可以添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保预防微生物的作用。可注射药物形式的延长吸收可以通过使用延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
用于体内施用的配制品通常是无菌的。无菌可以很容易地实现，例如，通过无菌过滤膜进行过滤。
本文所述的组合物或药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
施用方法
还提供了施用细胞、细胞群和组合物的方法，以及这些细胞、细胞群和组合物用于治疗或预防疾病、病症和病况(包括癌症)的用途。在一些实施例中，本文所述的方法可以降低发生本文所述的疾病、病症和病况的风险。
在一些实施例中，将本文所述的细胞、细胞群和组合物施用给患有待治疗的特定疾病或病症的受试者或患者，例如通过过继细胞疗法，例如过继T细胞疗法。在一些实施例中，将通过所提供的方法制备的细胞和组合物(例如在孵育和/或其他处理步骤之后的工程化组合物和生产结束组合物)施用给受试者，例如患有或面临疾病或病症风险的受试者。在一些方面，这些方法由此治疗疾病或病症，例如，改善其一种或多种症状，例如通过减轻表达工程化T细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负荷。
用于过继细胞疗法的细胞的施用方法是已知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，过继T细胞治疗方法在以下中描述：例如，U.S.2003/0170238；美国专利号4,690,915；Rosenberg,Nature reviews Clinical oncology 8.10(2011):577；Themeli等人,Nature biotechnology 31.10(2013):928；Tsukahara等人,Biochemical andbiophysical research communications 438.1(2013):84-89；Davila等人,PloS one 8.4(2013)；其每一个通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，细胞疗法(例如过继T细胞疗法)通过自体转移进行，其中T细胞从待接受细胞疗法的受试者或源自这样的受试者的样品分离和/或以其他方式制备。因此，在一些方面，细胞源自需要治疗的受试者(例如患者)，并且在分离和处理后，将细胞施用给同一受试者。
在一些实施例中，细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中T细胞从待接受或最终接受细胞疗法的受试者之外的受试者(例如第一受试者)分离和/或以其他方式制备。在这样的实施例中，然后将细胞施用于相同物种的不同受试者，例如，第二受试者。在一些实施例中，第一受试者和第二受试者基因相同。在一些实施例中，第一受试者和第二受试者基因相似。在一些实施例中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类型或超型。
在一些实施例中，受试者在施用细胞或含有细胞的组合物之前，已用靶向疾病或病症(例如肿瘤)的治疗剂进行治疗。在一些方面，受试者对其他治疗剂而言是难治性的或无反应性的。在一些实施例中，受试者患有持续性或复发性疾病，例如，在用另一种治疗干预治疗后，包括化疗、放疗和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如同种异体HSCT。在一些实施例中，尽管受试者对另一种治疗变得耐受，但施用有效地治疗受试者。
在一些实施例中，受试者对另一种治疗剂有反应，并且用治疗剂治疗减少了疾病负荷。在一些方面，受试者最初对治疗剂有反应，但随着时间的推移表现出疾病或病症的复发。在一些实施例中，受试者没有复发。在一些这样的实施例中，受试者被鉴定为处于复发的风险，例如处于复发的高风险中，并且因此预防性地施用细胞，例如，以降低复发的可能性或预防复发。在一些实施例中，受试者之前没有接受过另一种治疗剂的治疗。
在一些实施例中，细胞以期望的剂量施用，其在一些方面包括期望剂量或数量的细胞或一种或多种细胞类型和/或期望比率的细胞类型。因此，在一些实施例中，细胞的剂量基于细胞总数(或每千克体重的数量)和单个细胞群或亚型的期望比率，例如CD4+与CD8+的比率。在一些实施例中，细胞的剂量基于单个细胞群或单个细胞类型中细胞的期望总数(或每千克体重的数量)。在一些实施例中，剂量基于这些特征的组合，例如在单个细胞群中期望的总细胞数、期望比率和期望的细胞总数。
在一些实施例中，细胞群或亚型，例如CD8+和CD4+T细胞，在期望总细胞剂量(例如期望T细胞剂量)的容许差异下或在其内施用。在一些实施例中，期望剂量是期望细胞数或施用细胞的受试者每单位体重期望细胞数，例如，细胞/kg。在一些实施例中，期望剂量等于或高于最小细胞数或每单位体重最小细胞数。在一些实施例中，在以期望剂量施用的总细胞中，单个细胞群或亚型以或接近期望输出比率(诸如CD4+与CD8+比率)存在，例如，在这种比率的一定容许差异或误差内。
在一些实施例中，细胞在期望剂量的一种或多种细胞单个细胞群或亚型的容许差异下或在其内施用，例如期望剂量的CD4+细胞和/或期望剂量的CD8+细胞。在一些实施例中，期望剂量是期望数量的细胞群或亚型，或待施用细胞的受试者每单位体重期望数量的此类细胞，例如，细胞/kg。在一些实施例中，期望剂量等于或高于细胞群或亚型的最小数目，或每单位体重的细胞群或亚型的最小数目。
因此，在一些实施例中，剂量基于期望的固定剂量的总细胞和期望比率，和/或基于期望的固定剂量的一种或多种(例如，每个)单个亚型或亚群。因此，在一些实施例中，剂量基于期望的固定或最小剂量的T细胞和所需的CD4+与CD8+细胞的比率，和/或基于期望的固定或最小剂量的CD4+和/或CD8+细胞。
在某些实施例中，细胞或亚型细胞的单个群体以约100万至约1000亿个细胞的范围施用给受试者，例如，100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由上述任两个值定义的范围)，例如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由上述任两个值定义的范围)，在某些情况下，约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或介于这些范围之间的任何值。
在一些实施例中，总细胞的剂量和/或细胞的单个亚群的剂量在等于或约104至等于或约109个细胞/千克(kg)体重的范围内，例如在105至106个细胞/kg体重之间，例如至少或至少约或等于或约1×105个细胞/kg、1.5×105个细胞/kg、2×105个细胞/kg或1×106个细胞/kg体重。例如，在一些实施例中，细胞在等于或约104至等于或约109个T细胞/千克(kg)体重下或在其一定误差范围内施用，例如在105至106个T细胞/kg体重之间，例如至少或至少约或等于或约1×105个T细胞/kg、1.5×105个T细胞/kg、2×105个T细胞/kg或1×106个T细胞/kg体重。
在一些实施例中，细胞在等于或约104个至等于或约109个CD4+和/或CD8+细胞/千克(kg)体重下或在其一定误差范围内施用，例如在105个至106个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重之间，例如至少或至少约或等于或约1×105个CD4+和/或CD8+细胞/kg、1.5×105个CD4+和/或CD8+细胞/kg、2×105个CD4+和/或CD8+细胞/kg、或1×106个CD4+和/或CD8+细胞/kg体重。
在一些实施例中，细胞在大于和/或至少约1×106、约2.5×106、约5×106、约7.5×106、或约9×106个CD4+细胞、和/或至少约1×106、约2.5×106、约5×106、约7.5×106、或约9×106个CD8+细胞，和/或至少约1×106、约2.5×106、约5×106、约7.5×106或约9×106个T细胞下或在其一定误差范围内施用。在一些实施例中，细胞在约108至1012或约1010至1011个T细胞、约108至1012或约1010至1011个CD4+细胞、和/或约108至1012或约1010至1011个CD8+细胞下或在其一定误差范围内施用。
在一些实施例中，细胞在多个细胞群或亚型(例如CD4+和CD8+细胞或亚型)的期望输出比率下或在其容许范围内施用。在一些方面，期望比率可以是特定比率或者可以是比率的范围。例如，在一些实施例中，期望比率(例如，CD4+与CD8+细胞的比率)在等于或约1:5至等于或约5:1之间(或大于约1:5至小于约5:1之间)，或在等于或约1:3至等于或约3:1之间(或大于约1:3至小于约3:1)，例如在等于或约2:1至等于或约1:5之间(或大于约1:5至小于约2:1之间，例如等于或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，容许差异在期望比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包括这些范围之间的任何值。在一些方面，文中描述的CAR提供了改进的表达和活性，因此即使在低效应子与靶细胞(E:T)比率下也能提供治疗效果。
对治疗的最佳反应可取决于工程化重组受体(如CAR)在细胞表面一致可靠地表达和/或结合靶抗原的能力。例如，在一些情况下，某些重组受体(例如CAR)的性质可以影响重组受体的表达和/或活性，在某些情况下，当在细胞(例如人T细胞)中表达时，用于细胞治疗。在一些情况下，特定重组受体(例如CAR)的表达水平可能较低，并且表达这种重组受体的工程化细胞(例如人T细胞)的活性可能由于表达不良或信号传导活性差而受到限制。在一些情况下，重组受体表达的一致性和/或效率以及受体的活性在可用治疗方法的某些细胞或某些细胞群中受到限制。在一些情况下，需要大量的工程化T细胞(高效应子与靶细胞(E:T)比率)才能表现出功能活性。在一些实施例中，期望比率(E:T比率)在等于或约1:10至等于或约10:1之间(或大于约1:10至小于约10:1之间)，或在等于或约1:1至等于或约10:1之间(或大于约1:1至小于约5:1之间)，例如在等于或约2:1至等于或约10:1之间。在一些实施例中，E:T比率大于或约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。在一些实施例中，E:T比率为约3:1、约1:1或约0.3:1。
对于疾病的预防或治疗，适当剂量可以取决于待治疗的疾病的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、施用细胞是否用于预防或治疗目的、先前疗法、受试者的临床病史和对细胞的反应、以及主治医师的判断。在一些实施例中，组合物和细胞在一次或在一系列治疗中适当地施用于受试者。
本文所述的细胞可以通过任何合适的方式施用，例如通过推注输注、通过注射，例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、结膜下注射、眼球筋膜下注射、眼球后注射、球周注射或后近巩膜递送。在一些实施例中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果需要局部治疗，则通过病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施例中，给定剂量通过单次推注施用细胞来施用。在一些实施例中，通过多次推注施用(例如，在不超过3天的时间内)或通过连续输注施用细胞来施用。
在一些实施例中，细胞作为组合治疗的一部分施用，诸如与另一种治疗干预(诸如抗体或工程化细胞或受体或药剂，诸如细胞毒性剂或治疗剂)同时或以任何顺序依次施用。在一些实施例中，细胞与一种或多种另外的治疗剂共同施用或与另一种治疗干预联合施用，同时或以任何顺序依次施用。在一些情况下，细胞与另一种疗法在足够接近的时间共同施用，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或反之亦然。在一些实施例中，细胞在一种或多种另外的治疗剂之前施用。在一些实施例中，细胞在一种或多种另外的治疗剂之后施用。在一些实施例中，一种或多种另外的药剂包括细胞因子，例如IL-2，以增强持久性。在一些实施例中，方法包括施用化疗剂。
在施用细胞之后，在一些实施例中，例如通过许多已知方法中的任一种来测量工程化细胞群的生物活性。评估的参数包括体内(例如，通过成像)或离体(例如，通过ELISA或流式细胞术)工程化T细胞与抗原的特异性结合。在某些实施例中,工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，诸如在以下中描述的细胞毒性测定法：例如Kochenderfer等人,Journal of immunotherapy(Hagerstown,Md.:1997)32.7(2009):689以及Hermans等人,Journal of immunological methods 285.1(2004):25-40。在某些实施例中，细胞的生物活性通过测定一种或多种细胞因子诸如CD107a、IFN-γ、IL-2和TNF的表达和/或分泌来测量。在一些方面，生物活性通过评估临床结果诸如肿瘤负荷或负荷的减少来测量。
提供了重复给药方法，其中给予第一剂细胞，然后给予一个或多个第二连续剂量。当以过继治疗方法施用给受试者时，多剂量细胞的时间和大小通常被设计以增加本文所述的工程化细胞的功效和/或活性和/或功能。这些方法涉及施用第一剂，通常随后是一个或多个连续剂量，不同剂量之间有特定时间范围。
在过继细胞疗法的上下文下，给定“剂量”的施用包括将给定量或数量的细胞作为单一组合物施用和/或单次不间断施用，例如，作为单次注射或连续输注，并且还包括以分剂量施用给定量或数量的细胞，在指定的时间段内(例如，不超过3天)以多个单独的组合物或输注提供。因此，在一些情况下，第一或连续剂量是在单个时间点给予或开始的指定数量的细胞的单次或连续施用。然而，在一些情况下，第一或连续剂量在有限的时间内(例如，不超过三天)以多次注射或输注施用，例如每天一次，持续三天或两天，或在一天内多次输注。
第一剂量的细胞在单一药物组合物中施用。在一些实施例中，连续剂量的细胞在单一药物组合物中施用。
在一些实施例中，第一剂量的细胞在多个组合物中施用，共同包含第一剂量的细胞。在一些实施例中，连续剂量的细胞在多个组合物中施用，共同包含连续剂量的细胞。在一些方面，额外的连续剂量可以在不超过3天的时间内在多个组合物中施用。
关于先前的剂量，例如第一剂量，术语“连续剂量”是指在先前例如第一剂量之后施用给同一受试者的剂量，在此期间没有向受试者施用任何干预剂量。然而，该术语不包括包含在单个分割剂量内的一系列输注或注射中的第二、第三和/或以此类推注射或输注。因此，除非另有说明，否则在一天、二天或三天内的第二次输注不被视为本文所用的“连续”剂量。同样，在“连续”剂量的含义中，分割剂量内一系列多剂量中的第二剂、第三剂等也不被视为“干预”剂量。因此，除非另有说明，否则在第一剂量或先前剂量开始后超过三天的一定时间内施用的剂量被认为是“连续”剂量，即使受试者在第一剂量开始后接受第二次或随后的细胞注射或输注，只要第二次或随后的注射或输注发生在第一剂量或先前剂量开始后的三天内。
因此，除非另有说明，否则在长达3天的时间内多次施用相同细胞被认为是单个剂量，并且在初始施用的3天内施用细胞不被视为连续剂量，并且不被视为干预剂量，以确定第二剂量是否与第一剂量“连续”。
在一些实施例中，给予多个连续剂量，在一些方面使用与关于第一剂量和第一连续剂量之间的时间相同的时间指南，例如，通过施用第一和多个连续剂量。
在一些实施例中，第一剂量和第一连续剂量之间的时间，或第一和多次连续剂量之间的时间，使得每个连续剂量在大于约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天或更长时间的一段时间内给予。在一些实施例中，连续剂量在施用第一剂量或紧接前一剂量后少于约28天的时间段内给予。额外的多个额外连续剂量也称为后续剂量或后续连续剂量。
第一剂量和/或一个或多个连续剂量的细胞的大小通常被设计为提供改进的功效和/或降低毒性风险。在一些方面，第一剂量或任何连续剂量的剂量或大小是如上所述的任何剂量或量。在一些实施例中，第一剂量或任何连续剂量中的细胞数量在约0.5×106个细胞/kg受试者体重至5×106个细胞/kg之间，在约0.75×106个细胞/kg至3×106个细胞/kg之间或在约1×106个细胞/kg至2×106个细胞/kg之间。
如本文所用，“第一剂量”用于描述在连续或后续剂量施用之前的给定剂量的时间。该术语并不一定意味着受试者以前从未接受过一定剂量的细胞治疗，或甚至受试者以前从未接受过一定剂量的相同细胞或表达相同重组受体或靶向相同抗原的细胞。
在一些实施例中，可以在延长的时间段内(例如，在至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年或5年)向受试者施用多个剂量。熟练的医学专业人员可以使用本文所述的任何方法来确定治疗期的长度，以诊断或跟踪治疗的有效性(例如，观察至少一种癌症症状)。
实例
在以下实例中进一步描述本公开，这些实例不限制权利要求中所述的本公开的范围。
实例1：抗CLL1 IgG1的产生
CLL1蛋白的重组胞外结构域的制备
来自人或食蟹猴的CLL1蛋白的胞外蛋白结构域(ECD)通过在用编码相应氨基酸序列的质粒转染的人胚胎肾HEK293细胞中瞬时表达来制备。
将每个表达质粒与293FECTINTM(Life Technologies)复合，并添加到悬浮培养的293-F细胞(衍生自HEK293细胞)中。转染后8天，收集培养物上清液，并通过IMAC(GEHealthcare)纯化相应的可溶性蛋白，以产生蛋白质批次。
免疫
根据所有现行的动物福利法规，用CLL1的每种重组ECD免疫骆驼。对于免疫，将抗原配制为含有CFA(完全弗氏佐剂；初级免疫)或IFA(不完全弗氏佐剂；加强免疫)的乳液。抗原在颈部皮下施用。每只动物接受6次乳液注射，在CFA乳液中含有200μg CLL1-His蛋白，随后间隔两周注射5次IFA乳液中的CLL1-His蛋白。在免疫期间的不同时间点，从该动物收集10ml的血液样品并且制备血清。使用固定化CLL1-His蛋白的基于ELISA的测定，使用血清样品验证抗原特异性体液免疫反应的诱导。如图1A-1B所示，免疫后血清和免疫球蛋白(包括4链抗体和仅重链抗体)以浓度依赖性方式特异性结合CLL1-His蛋白。最后一次免疫后四天，收集180ml的血样。外周血淋巴细胞(PBL)作为传统和骆驼重链免疫球蛋白的遗传来源，使用Ficoll-Paque梯度(Amersham Biosciences)从血液样品中分离，产生2.5×108个PBL。
文库构建
从PBL中提取的RNA作为RT-PCR扩增编码IgG1的基因片段的起始材料。将这些片段克隆到内部噬菌体载体中。该载体编码与每个IgG1编码序列同框的C末端His-Tag。文库大小为约3×109。根据标准方案制备噬菌体文库，并在4℃下过滤灭菌后储存以供进一步使用。
选择和高通量筛选
噬菌体文库通过固体淘选和基于细胞的淘选来筛选。对于两种淘选条件中的每一种仅进行单轮选择。基于ELISA结果分析每个选择输出以确定富集因子(即相对于对照洗脱液中存在的噬菌体数量)、多样性和CLL1阳性克隆的百分比。基于这些参数，选择最佳克隆进行进一步分析。为此，将每个选择的输出作为池重新克隆到可溶性表达载体中，用于高通量筛选。该表达载体编码与每个IgG1编码序列同框的C末端His-tag。挑取菌落并在96深孔板(1mL体积/孔)中生长，并通过添加IPTG和0.1％ Triton诱导上清液中的IgG1表达。
首先使用ELISA测定筛选上清液与相应CLL1蛋白结合的能力。对阳性结合蛋白进行测序，并选择独特的克隆进行进一步表征。
将独特的克隆在2YT培养基中生长，并通过IPTG诱导上清液中的IgG1表达。使用FACS测定法分析独特结合蛋白的上清液与表达CLL1的HEK293/huCLL1细胞系和癌细胞系AML193结合的能力。在T200仪器上通过表面等离子体共振(SPR)测定上清液中所选结合蛋白与重组人和食蟹猴CLL1蛋白的亲和力。解离阶段用于计算每个IgG1的kd值。所选抗CLL1 IgG1与重组人CLL1蛋白的结合数据如图2所示。
实例2.抗CLL1单CAR构建体的产生和评估
慢病毒的制备
将包括pCMV-ΔR-8.47和pMD2.G(Addgene，目录号12259)的慢病毒包装质粒混合物与包含CAR构建体的每个载体PLLV-hEF1α-CLL1以与聚乙烯亚胺的预优化比率预混合。然后将混合物加入到HEK293细胞中。孵育过夜后收集来自细胞的上清液。通过0.45μm PES过滤器过滤含病毒的上清液，然后进行超离心以沉淀慢病毒。将病毒沉淀用预先冷却的PBS冲洗。将病毒等分并且立即储存在-80℃。使用流式细胞术测定通过测量转导至supT1细胞系的效率来测定病毒效价。
T淋巴细胞的收集及转导
通过单采自健康供体收集白细胞。使用FICOLL-PAQUETMPLUS培养基(GEHealthcare，目录号17-5442-02)，根据制造商方案，分离外周血单个核细胞(PBMC)。使用Pan-T细胞分离试剂盒(Miltenyi，目录号130-096-535)，根据制造商方案，自PBMC纯化人T细胞。经纯化的T细胞随后用人T细胞活化/扩增试剂盒(Miltenyi，目录号130-091-441)，根据制造商方案预先活化48小时，其中抗CD3/CD28MACSiBead颗粒以1:2的珠粒与细胞比率添加。在7μg/ml聚凝胺存在下将预先激活的T细胞用每种慢病毒原液转导。接着将转导细胞转移至细胞培育箱中，以在合适条件下表达转基因。
体外细胞毒性测定
为了在体外快速评估CAR-T细胞的抗肿瘤活性，进行了LDH(乳酸脱氢酶)细胞毒性测定。在转导后第6天或第11天，收集转导的T细胞，并以10:1的E/T比率(效应子:CAR-T/靶细胞)与靶细胞(CLL1-HEK293T)共孵育12小时。使用来自同一批次的未转导的T细胞(“UnT”)作为阴性对照。按照制造商手册(Roche，11644793001)进行测定。细胞毒性通过以下公式计算([LDH]E+T：从E/T共孵育释放的LDH，[LDH]E：仅从效应子释放的LDH，[LDH]max：用Triton X-100处理的靶细胞释放的LDH，[LDH]min：从未处理的靶细胞释放的LDH)：
使用基于sdAb的CAR T作为基准(“BM CAR”，SEQ ID NO:131)。BM CAR在WO 2020/052543 A1中进行了描述，其通过引用以其全文并入本文。如图3所示，大多数基于抗CLL1scFv的CAR-T细胞对CLL1-HEK293T细胞显示出比BM CAR-T细胞更强的细胞毒性。
HTRF检测IFN-γ和GM-CSF分泌
效应T细胞激活和增殖的另一个量度是效应细胞因子如IFN-γ和GM-CSF的产生。收集来自体外细胞毒性测定的上清液以评估CAR诱导的细胞因子释放。根据制造商手册进行IFN-γ(Cisbio，目录号62HIFNGPEH)和GM-CSF的HTRF测定。
相应的细胞因子释放结果如图4A-4B所示。所有抗CLL1 CAR-T细胞都表现出针对CLL1-HEK293T细胞的有效杀伤活性，并应答于CLL1-HEK293T细胞而释放IFN-γ和GM-CSF。
长期共培养测定
为了评估CAR-T细胞的长期杀伤功效，进行了长期共培养测定，其模拟体内动态杀伤过程。肿瘤细胞系(例如，THP-1)用CFSE(SIGMA-ALDRICH，目录号21888-25MG-F)标记。在不存在外源细胞因子(IL-2)的情况下，将转导或未转导的T细胞(2×105个/孔)与肿瘤细胞系(例如，CFSE-THP-1细胞，2×105或4×105个/孔)以1:1或1:2的E:T比率在24孔板中共培养。2或3天的共培养后，收集这些细胞中的一部分并针对CD3进行染色。通过CFSE信号鉴定肿瘤细胞。对于系列共培养测定，然后以相同的E:T比率用新鲜CFSE-THP-1细胞激发剩余T细胞。进行共培养，直到肿瘤细胞长得超出。每个时间点的T细胞增殖率通过将该时间点的T细胞数除以前一时间点的T细胞数来计算。
通过FACS检测的长期共培养测定的代表性结果显示于图5A中。来自相同实验的经计算的T细胞增殖率分别显示于图5B中。数据表明，基于抗CLL1 scFv的CAR-T的持久性和增殖表现良好。
小鼠异种移植模型中的体内功效评估
培养U937-Luc，重悬于HBSS-/-中，并以每只小鼠2×106个细胞静脉注射。肿瘤接种后每周或每两周进行生物发光成像(BLI)，以监测模型的发展。基于BLI光子数和动物体重对动物进行随机分组。随机分组后，静脉内输注单一剂量的CAR-T细胞或UnT细胞。每周进行BLI成像以记录肿瘤生长。
如图6所示，用AS141297或AS141567CAR-T细胞处理的小鼠在输注后4周后无肿瘤(BLI约106)，而用UnT或媒介物处理的小鼠表现出快速的肿瘤进展，并且必须在实验结束前被安乐死。
实例3.抗CD33/CLL1串联CAR构建体的产生和评估
如图7所示的示例性串联CAR是通过经由肽接头融合特异性识别不同靶点(CD33和CLL1)的两个结合结构域以在单个CAR分子中形成胞外结构域来构建的。将抗CD33/CLL1串联CAR克隆到具有CD28的胞内共刺激序列和CD3ζ的胞内结构域的慢病毒表达载体中。将CAR构建体克隆到具有EF1α启动子的表达载体中进行表达。
抗CD33/CLL1串联CAR-T细胞的产生
编码串联CAR(Tan 1-Tan 10)的慢病毒如实例2所述制备。根据实例2中方案收集T淋巴细胞并用慢病毒转导。
抗CD33/CLL1串联CAR-T细胞的体外活性的评估
使用实例2中所述的体外LDH测定法评估串联CAR-T细胞的抗肿瘤活性。如图8所示，串联CAR对THP-1的体外细胞毒性与任何抗CLL1单个CAR-T细胞相当，这表明针对两个靶点的串联CAR对肿瘤消除更有效。
长期共培养测定
为了评估CAR-T细胞的长期杀伤功效，进行了长期共培养测定，其模拟体内动态杀伤过程。AML肿瘤细胞系(例如，U937)用CFSE(SIGMA-ALDRICH，目录号21888-25MG-F)标记。在不存在外源细胞因子(IL-2)的情况下，将转导或未转导的T细胞(1×105个/孔)与肿瘤细胞(例如，CFSE-U937细胞，4×105个/孔)以1:4的E:T比率在24孔板中共培养。2或3天的共培养后，收集这些细胞中的一部分并针对CD3进行染色。通过CFSE+信号鉴定肿瘤细胞。对于系列共培养测定，然后以相同的E:T比率用新鲜CFSE-U937细胞激发剩余T细胞。进行共培养，直到肿瘤细胞长得超出。每个时间点的T细胞增殖率通过将该时间点的T细胞数除以T细胞的初始数来计算。
各种串联CAR-T细胞在重复肿瘤刺激测定中的杀伤功效显示于图9A中。单靶点抗CLL1 CAR-T细胞在3轮肿瘤刺激后耗尽，而大多数串联CAR-T细胞持续到4或5轮肿瘤刺激。此外，串联CAR-T细胞在体外比AS138943、AS141567CAR-T细胞增殖更快(图9B)。这些结果表明，CD33/CLL1串联CAR-T细胞在体外比单靶点CAR-T细胞具有更强的抗肿瘤活性。
HTRF检测IFN-γ和GM-CSF分泌
效应T细胞激活和增殖的另一个量度是效应细胞因子如IFN-γ和GM-CSF的产生。收集来自长期共培养测定的上清液以评估CAR诱导的细胞因子释放。根据制造商手册进行IFN-γ(Cisbio，目录号62HIFNGPEH)和GM-CSF(Cisbio，目录号62HGMCSFPEG)的HTRF测定。代表性细胞因子释放测定的结果如图10A-10B所示。当在体外与U937细胞共培养时，串联CAR-T细胞释放的细胞因子水平与单靶点CAR-T细胞(AS138943、AS141567CAR-T)相当。
小鼠异种移植模型中的体内功效评估
如实例2所述，在U937-Luc异种移植小鼠模型中评估串联CAR-T细胞的体内功效。如图11所示，用串联CAR-T细胞处理的小鼠在注射后5周后无肿瘤(BLI约106)，而用UnT细胞或媒介物的小鼠表现出快速的肿瘤进展，并且必须在实验结束前被安乐死。
实例4.抗CD33/CLL1双CAR构建体的产生和评估
抗CD33/CLL1双CAR构建体的克隆
图10C所示的示例性双CAR是通过分别表达两种针对CD33和CLL1的全功能CAR来构建的。将CAR构建体克隆到具有EF1α启动子的表达载体中进行表达。示例性双CAR的序列如图15所示。
抗CD33/CLL1双CAR-T细胞的产生
如实例2中所述制备编码双CAR构建体的慢病毒以及其中包含的单个CAR。根据实例2中方案收集T淋巴细胞并用慢病毒转导。
抗CD33/CLL1双CAR-T细胞的体外活性的评估
使用实例2中所述的体外LDH(乳酸脱氢酶)测定法评估双CAR-T细胞的抗肿瘤活性。如图12所示，双CAR对U937的体外细胞毒性与抗CLL1 CAR-T细胞相当。这些数据表明，针对两个不同靶点(例如，CD33和CLL1)的双CAR-T细胞在肿瘤消除方面比单靶点CAR-T细胞更有效。
抗CD33/CLL1双CAR-T体内小鼠模型的评估
如实例2所述，在U937-Luc异种移植小鼠模型中评估双CAR-T细胞的体内功效。如图13所示，用双CAR-T细胞或单靶点CAR-T细胞处理的小鼠在注射后3-4周后无肿瘤(BLI约106)，而用UnT细胞或媒介物的小鼠表现出快速的肿瘤进展，并且必须在实验结束前被安乐死。用双CAR-T细胞处理的小鼠中的肿瘤生长明显慢于用单靶点CAR-T细胞(AS188893CAR和AS138943CAR)处理的小鼠。结合实例4的结果，这些数据表明，双靶点CAR-T细胞(串联CAR或双CAR)作为肿瘤治疗比单靶点CAR-T细胞更有效。
其他实施例
应当理解，虽然本公开已经结合其详细描述进行了描述，但上述描述旨在说明而不是限制本公开的范围，该范围由所附权利要求的范围定义。其他方面、优点和修改均在以下权利要求的范围内。

Claims (79)

1.一种与CLL1结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
包含互补决定区(CDR)1、2和3的重链可变区(VH)，其中所述VH CDR1区包含与所选VHCDR1氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，所述VH CDR2区包含与所选VH CDR2氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，以及所述VH CDR3区包含与所选VH CDR3氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；以及
包含CDR 1、2和3的轻链可变区(VL)，其中所述VL CDR1区包含与所选VL CDR1氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，所述VL CDR2区包含与所选VL CDR2氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，以及所述VL CDR3区包含与所选VL CDR3氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，
其中所选VH CDR 1、2和3氨基酸序列和所选VL CDR 1、2和3氨基酸序列是以下中的一个：
(1)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2和3中列出，以及所选VL CDR1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5和6中列出；
(2)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:11、12和13中列出，以及所选VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:14、15和16中列出；
(3)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:21、22和23中列出，以及所选VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:24、25和26中列出；
(4)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:31、32和33中列出，以及所选VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:34、35和36中列出；
(5)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:41、42和43中列出，以及所选VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:44、45和46中列出；
(6)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:51、52和53中列出，以及所选VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:54、55和56中列出；
(7)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:61、62和63中列出，以及所选VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:64、65和66中列出；
(8)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:71、72和73中列出，以及所选VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:74、75和76中列出；
(9)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:81、82和83中列出，以及所选VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:84、85和86中列出；
(10)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:91、92和93中列出，以及所选VLCDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:94、95和96中列出；
(11)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:101、102和103中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:104、105和106中列出；
(12)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:111、112和113中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:114、115和116中列出；以及
(13)所选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:121、122和123中列出，以及所选VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:124、125和126中列出。
2.一种与CLL1结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含
重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含与所选VH序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与所选VL序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列，其中所选VH序列和所选VL序列是以下中的一个：
(1)所选VH序列是SEQ ID NO:10，以及所选VL序列是SEQ ID NO:9；
(2)所选VH序列是SEQ ID NO:20，以及所选VL序列是SEQ ID NO:19；
(3)所选VH序列是SEQ ID NO:30，以及所选VL序列是SEQ ID NO:29；以及
(4)所选VH序列是SEQ ID NO:40，以及所选VL序列是SEQ ID NO:39；
(5)所选VH序列是SEQ ID NO:50，以及所选VL序列是SEQ ID NO:49；
(6)所选VH序列是SEQ ID NO:60，以及所选VL序列是SEQ ID NO:59；
(7)所选VH序列是SEQ ID NO:70，以及所选VL序列是SEQ ID NO:69；
(8)所选VH序列是SEQ ID NO:80，以及所选VL序列是SEQ ID NO:79；
(9)所选VH序列是SEQ ID NO:90，以及所选VL序列是SEQ ID NO:89；
(10)所选VH序列是SEQ ID NO:100，以及所选VL序列是SEQ ID NO:99；
(11)所选VH序列是SEQ ID NO:110，以及所选VL序列是SEQ ID NO:109；
(12)所选VH序列是SEQ ID NO:120，以及所选VL序列是SEQ ID NO:119；以及
(13)所选VH序列是SEQ ID NO:130，以及所选VL序列是SEQ ID NO:129。
3.一种与CLL1结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含
重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含与所选VH序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3相同的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，
所述轻链可变区包含与所选VL序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3相同的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3，其中所选VH序列和所选VL序列是以下中的一个：
(1)所选VH序列是SEQ ID NO:10，以及所选VL序列是SEQ ID NO:9；
(2)所选VH序列是SEQ ID NO:20，以及所选VL序列是SEQ ID NO:19；
(3)所选VH序列是SEQ ID NO:30，以及所选VL序列是SEQ ID NO:29；
(4)所选VH序列是SEQ ID NO:40，以及所选VL序列是SEQ ID NO:39；
(5)所选VH序列是SEQ ID NO:50，以及所选VL序列是SEQ ID NO:49；
(6)所选VH序列是SEQ ID NO:60，以及所选VL序列是SEQ ID NO:59；
(7)所选VH序列是SEQ ID NO:70，以及所选VL序列是SEQ ID NO:69；
(8)所选VH序列是SEQ ID NO:80，以及所选VL序列是SEQ ID NO:79；
(9)所选VH序列是SEQ ID NO:90，以及所选VL序列是SEQ ID NO:89；
(10)所选VH序列是SEQ ID NO:100，以及所选VL序列是SEQ ID NO:99；
(11)所选VH序列是SEQ ID NO:110，以及所选VL序列是SEQ ID NO:109；
(12)所选VH序列是SEQ ID NO:120，以及所选VL序列是SEQ ID NO:119；以及
(13)所选VH序列是SEQ ID NO:130，以及所选VL序列是SEQ ID NO:129。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地与人CLL1肽结合，所述肽包含与SEQ ID NO:147的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％相同的序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性地结合人CLL1的胞外结构域(ECD)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
8.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是嵌合抗体或其抗原结合片段或人抗体或其抗原结合片段。
9.一种与如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段交叉竞争的抗体或其抗原结合片段。
10.一种抗体-药物缀合物，所述抗体-药物缀合物包含与治疗剂共价结合的如权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或如权利要求10所述的抗体-药物缀合物、以及药学上可接受的载剂。
12.一种核酸，所述核酸包含编码如权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
13.一种包含如权利要求12所述的核酸的载体。
14.一种包含如权利要求13所述的载体的细胞。
15.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
(a)在足以使如权利要求14所述的细胞产生所述抗体或其抗原结合片段的条件下培养所述细胞；以及
(b)收集由所述细胞产生的抗体或其抗原结合片段。
16.一种包含如权利要求1-9中任一项所述的抗原结合片段的工程化受体。
17.如权利要求16所述的工程化受体，其中所述工程化受体进一步包含跨膜区和胞内信号传导结构域。
18.如权利要求16或17所述的工程化受体，其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(“CAR”)。
19.如权利要求16-18中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体进一步包含铰链区。
20.如权利要求16-19中任一项所述的工程化受体，其中所述跨膜区包含CD4、CD8和/或CD28的跨膜区或其一部分。
21.如权利要求16-20中任一项所述的工程化受体，其中所述胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导序列。
22.如权利要求21所述的工程化受体，其中所述胞内信号传导结构域是或包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。
23.如权利要求16-22中任一项所述的工程化受体，其中所述胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号传导结构域。
24.如权利要求23所述的工程化受体，其中所述共刺激信号传导结构域包含来自选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、CD11a/CD18、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和CD83配体。
25.如权利要求24所述的工程化受体，其中所述共刺激信号传导结构域包含4-1BB和/或CD28的胞内信号传导结构域。
26.如权利要求16-25中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体包含信号肽。
27.如权利要求26所述的工程化受体，其中所述信号肽与SEQ ID NO:146至少80％、85％、90％、95％或100％相同。
28.如权利要求16-27中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体包含在SEQ IDNO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127中任一个中列出的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127中任一个至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
29.如权利要求28所述的工程化受体，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117和127中任一个相同。
30.一种工程化受体，所述工程化受体包含：
(a)第一抗原结合片段，其中第一抗原结合片段如权利要求1-9中任一项所述；以及
(b)与CD33结合的第二抗原结合片段。
31.如权利要求30所述的工程化受体，其中所述第一抗原结合片段和所述第二抗原结合片段通过接头连接。
32.如权利要求30或31所述的工程化受体，其中所述工程化受体进一步包含跨膜区和胞内信号传导结构域。
33.如权利要求30-32中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体是嵌合抗原受体(“CAR”)。
34.如权利要求30-33中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体进一步包含铰链区。
35.如权利要求30-34中任一项所述的工程化受体，其中所述跨膜区包含CD4、CD8和/或CD28的跨膜区或其一部分。
36.如权利要求30-35中任一项所述的工程化受体，其中所述胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导序列。
37.如权利要求36所述的工程化受体，其中所述胞内信号传导结构域是或包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。
38.如权利要求30-37中任一项所述的工程化受体，其中所述胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号传导结构域。
39.如权利要求38所述的工程化受体，其中所述共刺激信号传导结构域包含来自选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、CD11a/CD18、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和CD83配体。
40.如权利要求39所述的工程化受体，其中所述共刺激信号传导结构域包含4-1BB和/或CD28的胞内信号传导结构域。
41.如权利要求30-40中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体包含信号肽。
42.如权利要求41所述的工程化受体，其中所述信号肽与SEQ ID NO:146至少80％、85％、90％、95％或100％相同。
43.如权利要求16-30中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体是嵌合T细胞受体(“cTCR”)。
44.如权利要求43所述的工程化受体，其中所述跨膜结构域衍生自选自由以下组成的组的TCR亚基的跨膜结构域：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε和CD3δ。
45.如权利要求44所述的工程化受体，其中所述跨膜结构域衍生自CD3ε的跨膜结构域。
46.如权利要求43-45中任一项所述的工程化受体，其中所述胞内信号传导结构域衍生自选自由以下组成的组的TCR亚基的胞内信号传导结构域：TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3γ、CD3ε和CD3δ。
47.如权利要求46所述的工程化受体，其中所述胞内信号传导结构域衍生自CD3ε的胞内信号传导结构域。
48.如权利要求43-47中任一项所述的工程化受体，所述工程化受体进一步包含TCR亚基的胞外结构域的至少一部分。
49.如权利要求48所述的工程化受体，其中所述抗原结合片段与CD3ε的N末端融合(“eTCR”)。
50.一种双受体系统，所述双受体系统包含：
(a)第一工程化受体，所述第一工程化受体包含第一抗原结合片段或是如权利要求16-29中任一项所述的工程化受体，其中第一抗原结合片段如权利要求1-9中任一项所述；以及
(b)第二工程化受体，所述第二工程化受体包含与CD33结合的第二抗原结合片段。
51.如权利要求50所述的双受体系统，其中所述第一工程化受体和所述第二工程化受体中的每一个进一步包含跨膜区和胞内信号传导结构域。
52.如权利要求50或51所述的双受体系统，其中所述第一工程化受体和所述第二工程化受体都是嵌合抗原受体(“CAR”)。
53.如权利要求50-52中任一项所述的双受体系统，其中所述第一工程化受体和所述第二工程化受体中的每一个进一步包含铰链区。
54.如权利要求50-53中任一项所述的双受体系统，其中所述跨膜区包含CD4、CD8和/或CD28的跨膜区或其一部分。
55.如权利要求51-54中任一项所述的双受体系统，其中所述胞内信号传导结构域包含免疫效应细胞的初级胞内信号传导序列。
56.如权利要求55所述的双受体系统，其中所述胞内信号传导结构域是或包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。
57.如权利要求51-56中任一项所述的双受体系统，其中所述胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号传导结构域。
58.如权利要求57所述的双受体系统，其中所述共刺激信号传导结构域包含来自选自由以下组成的组的蛋白质的功能性信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、CD11a/CD18、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和CD83配体。
59.如权利要求58所述的双受体系统，其中所述共刺激信号传导结构域包含4-1BB和/或CD28的胞内信号传导结构域。
60.如权利要求50-59中任一项所述的双受体系统，其中所述第一工程化受体和所述第二工程化受体中的每一个包含信号肽。
61.如权利要求60所述的双受体系统，其中所述信号肽与SEQ ID NO:146至少80％、85％、90％、95％或100％相同。
62.如权利要求50-61中任一项所述的双受体系统，其中所述第二工程化受体包含SEQID NO:159、163、167或171中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:159、163、167或171至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
63.如权利要求50-61中任一项所述的双受体系统，其中所述第一工程化受体包含SEQID NO:27或97中列出的氨基酸序列或与SEQ ID NO:27或97至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
64.如权利要求50-61中任一项所述的双受体系统，其中(1)所述第二工程化受体包含SEQ ID NO:163中列出的氨基酸序列，且所述第一工程化受体包含SEQ ID NO:97中列出的氨基酸序列；(2)所述第二工程化受体包含SEQ ID NO:163中列出的氨基酸序列，且所述第一工程化受体包含SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列；(3)所述第二工程化受体包含SEQID NO:171中列出的氨基酸序列，且所述第一工程化受体包含SEQ ID NO:97中列出的氨基酸序列；(4)所述第二工程化受体包含SEQ ID NO:171中列出的氨基酸序列，且所述第一工程化受体包含SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列。
65.如权利要求50-64中任一项所述的双受体系统，其中所述第一工程化受体和第二工程化受体都是嵌合T细胞受体(“cTCR”)。
66.一种编码如权利要求16-65中任一项所述的工程化受体或双受体系统的多核苷酸。
67.如权利要求66所述的多核苷酸，所述多核苷酸编码包含以下的多肽：SEQ ID NO:132-145中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:132-145至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
68.一种包含如权利要求66或67所述的多核苷酸的载体。
69.如权利要求68所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
70.一种表达如权利要求16-65中任一项所述的工程化受体或双受体系统的工程化细胞。
71.如权利要求70所述的工程化细胞，所述工程化细胞包含编码SEQ ID NO:132-145中任一个的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:132-145至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多核苷酸。
72.如权利要求70或71所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是免疫细胞。
73.如权利要求72所述的工程化细胞，其中所述免疫细胞是NK细胞或T细胞。
74.如权利要求73所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是T细胞。
75.如权利要求74所述的工程化细胞，其中所述T细胞选自由以下组成的组：细胞毒性T细胞、辅助T细胞、自然杀伤T(NK-T)细胞、αβT细胞和γδT细胞。
76.一种生产工程化细胞的方法，所述方法包括在体外或离体将如权利要求68或69所述的载体引入细胞中。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述载体是病毒载体，并且所述引入通过转导进行。
78.一种治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求10所述的抗体-药物缀合物、如权利要求11所述的药物组合物或如权利要求70-75中任一项所述的工程化细胞。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述癌症是急性髓系白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)或骨髓增生异常综合征(MDS)。
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