KR20170037626A - 인간화 항-bcma 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 - Google Patents

인간화 항-bcma 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BCMA의 발현과 연관된 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 BCMA에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR), 그를 코딩하는 벡터, 및 BCMA CAR을 포함하는 재조합 T 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 BCMA 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 유전자 변형된 T 세포를 투여하는 방법을 포함한다.

Description

인간화 항-BCMA 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 {TREATMENT OF CANCER USING HUMANIZED ANTI-BCMA CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR}
본 출원은 2014년 11월 6일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/CN2014/090501, 및 2014년 7월 21일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/CN2014/082586을 우선권 주장한다. 이들 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2015년 7월 15일에 생성된 상기 ASCII 카피는 N2067-7045WO3_SL.txt로 명명되고, 771,026 바이트 크기이다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 B-세포 성숙 항원 단백질 (BCMA)의 발현과 연관된 질환을 치료하기 위한, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)의 용도에 관한 것이다.
B-세포 성숙 항원 (BCMA)은 B-세포 계열의 종양 괴사 패밀리 수용체 (TNFR) 구성원 발현 세포이다. BCMA 발현은 최종 분화 B 세포 상에서 가장 높다. BCMA는 장기 체액성 면역을 유지시키기 위해 형질 세포의 생존을 매개하는데 관여한다. BCMA의 발현은 최근에 수많은 암, 자가면역 장애 및 감염성 질환과 연관되어 왔다. BCMA의 증가된 발현을 갖는 암은 일부 혈액암, 예컨대 다발성 골수종, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 다양한 백혈병 및 교모세포종을 포함한다.
제1 측면에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산 분자이며, 여기서 CAR은 인간 항-BCMA 결합 도메인 또는 인간화 항-BCMA 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자를 특색으로 한다. 한 실시양태에서, CAR은 본원에 기재된 인간 항-BCMA 결합 도메인 또는 본원에 기재된 인간화 항-BCMA 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 본원에 기재된 막횡단 도메인, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 BCMA 결합 도메인 (예를 들어, 인간 또는 인간화 항-BCMA 결합 도메인)은 본원에 기재된 인간 또는 인간화 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및/또는 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간 또는 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 인간 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 1에서의) 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 표 1에서의) 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호(SEQ ID NO): 271 또는 273에 제공된 경쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 인간 항-BCMA 결합 도메인은 표 1의 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, 코딩된 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 271 또는 273의 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, 인간 또는 인간화 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 1의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 및 서열식별번호: 149로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 271 또는 서열식별번호: 273로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 인간 또는 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4 (서열식별번호: 26)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역일 수 있다.
다른 실시양태에서, 코딩된 BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 추가로 포함한다. 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 코딩된 BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 중 1, 2개 또는 모두, 및 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 중 1, 2개 또는 모두를 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 16에서의) 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 표 16에서의) 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 259, 서열식별번호: 260, 서열식별번호: 261, 서열식별번호: 262에 제공된 경쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 255, 서열식별번호: 256, 서열식별번호: 257, 서열식별번호: 258에 제공된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인은 표 16의 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 실시양태에서, 인간 또는 인간화 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 서열식별번호: 259, 서열식별번호: 260, 서열식별번호: 261, 서열식별번호: 262에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 서열식별번호: 255, 서열식별번호: 256, 서열식별번호: 257, 서열식별번호: 258에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4 (서열식별번호: 26)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역일 수 있다.
한 실시양태에서, 코딩된 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 263, 서열식별번호: 264, 서열식별번호: 265, 및 서열식별번호: 266으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 CAR은 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함하는 막횡단 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 포함하지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 17의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인은 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 코딩된 힌지 영역은 서열식별번호: 2, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 힌지 영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 13의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 추가로 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1개 이상 (예를 들어, 1개 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상)의 공동자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은, 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인이다. 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은 4-1BB, CD27, CD28, 또는 ICOS를 포함한다.
한 실시양태에서, 4-1BB의 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD28의 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 1104의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 1104의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 1104의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CD28의 공동자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 1105의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD27의 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CD27의 공동자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 19의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ICOS의 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 1106의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은 서열식별번호: 1106의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 1106의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, ICOS의 공동자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 1107의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시양태에서, 코딩된 1차 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 실시양태에서, CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인은 서열식별번호: 9 (돌연변이체 CD3제타) 또는 서열식별번호: 10 (야생형 인간 CD3제타)의 아미노산 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB의 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, 4-1BB의 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및/또는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 21의 CD3 제타 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 CD27의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CD27의 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함하다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 8의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, CD27의 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 19의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및/또는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 21의 CD3 제타 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 CD28의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CD28의 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1104의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1104의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 1104의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1104의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, CD28의 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 1105의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및/또는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 21의 CD3 제타 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 ICOS의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, ICOS의 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1106의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1106의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 1106의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1106의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, ICOS의 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 1107의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및/또는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 21의 CD3 제타 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 리더 서열, 예를 들어 본원에 기재된 리더 서열, 예를 들어 서열식별번호: 1의 아미노산 서열; 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 인간 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, 표 1 또는 16에 기재된 인간 항-BCMA 결합 도메인), 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열; 본원에 기재된 힌지 영역, 예를 들어 서열식별번호: 2의 아미노산 서열; 예를 들어 서열식별번호: 6의 서열을 갖는 본원에 기재된 막횡단 도메인; 및 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 CD27 공동자극 도메인), 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인)을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열식별번호: 1의 핵산 서열, 또는 그에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된 리더 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 리더 서열, 예를 들어 본원에 기재된 리더 서열, 예를 들어 서열식별번호: 1의 아미노산 서열; 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 및/또는 HC CDR3을 포함하는 인간화 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 인간화 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 271 또는 서열식별번호: 273으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 인간화 항-BCMA 결합 도메인); 본원에 기재된 힌지 영역, 예를 들어 서열식별번호: 2의 아미노산 서열; 예를 들어 서열식별번호: 6의 서열을 갖는 본원에 기재된 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 7의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인), 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인)을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열식별번호: 1의 핵산 서열, 또는 그에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된 리더 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 56, 서열식별번호: 57, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 60, 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 62, 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 64, 서열식별번호: 65, 서열식별번호: 66, 서열식별번호: 67, 서열식별번호: 68, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155, 서열식별번호: 156, 서열식별번호: 157, 서열식별번호: 158, 서열식별번호: 159, 서열식별번호: 160, 서열식별번호: 161, 서열식별번호: 162, 서열식별번호: 163, 서열식별번호: 164, 서열식별번호: 165, 서열식별번호: 166, 서열식별번호: 167, 서열식별번호: 168, 서열식별번호: 169, 또는 서열식별번호: 170의 핵산 서열, 또는 그에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된 인간 항-BCMA 결합 도메인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열식별번호: 272, 서열식별번호: 274의 핵산 서열, 또는 그에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된 인간화 항-BCMA 결합 도메인 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 102, 서열식별번호: 103, 서열식별번호: 104, 서열식별번호: 105, 서열식별번호: 106, 서열식별번호: 107, 서열식별번호: 108, 서열식별번호: 109, 서열식별번호: 110, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 216, 서열식별번호: 217, 서열식별번호: 218, 서열식별번호: 219, 서열식별번호: 220, 서열식별번호: 221, 서열식별번호: 222, 서열식별번호: 223, 서열식별번호: 224, 서열식별번호: 225, 서열식별번호: 226, 서열식별번호: 227, 서열식별번호: 228, 서열식별번호: 229, 서열식별번호: 230, 서열식별번호: 231, 서열식별번호: 232, 또는 서열식별번호: 233의 CAR 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 102, 서열식별번호: 103, 서열식별번호: 104, 서열식별번호: 105, 서열식별번호: 106, 서열식별번호: 107, 서열식별번호: 108, 서열식별번호: 109, 서열식별번호: 110, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 216, 서열식별번호: 217, 서열식별번호: 218, 서열식별번호: 219, 서열식별번호: 220, 서열식별번호: 221, 서열식별번호: 222, 서열식별번호: 223, 서열식별번호: 224, 서열식별번호: 225, 서열식별번호: 226, 서열식별번호: 227, 서열식별번호: 228, 서열식별번호: 229, 서열식별번호: 230, 서열식별번호: 231, 서열식별번호: 232, 또는 서열식별번호: 233의 아미노산 서열에 대해 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 그의 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함한다 (예를 들어 그로 이루어진다).
한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 115, 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 118, 서열식별번호: 119, 서열식별번호: 120, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 122, 서열식별번호: 123, 서열식별번호: 124, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 126, 서열식별번호: 127, 서열식별번호: 128, 서열식별번호: 234, 서열식별번호: 235, 서열식별번호: 236, 서열식별번호: 237, 서열식별번호: 238, 서열식별번호: 239, 서열식별번호: 240, 서열식별번호: 241, 서열식별번호: 242, 서열식별번호: 243, 서열식별번호: 244, 서열식별번호: 245, 서열식별번호: 246, 서열식별번호: 247, 서열식별번호: 248, 서열식별번호: 249, 서열식별번호: 250, 서열식별번호: 251, 서열식별번호: 252, 서열식별번호: 253, 또는 서열식별번호: 254의 핵산 서열, 또는 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 115, 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 118, 서열식별번호: 119, 서열식별번호: 120, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 122, 서열식별번호: 123, 서열식별번호: 124, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 126, 서열식별번호: 127, 서열식별번호: 128, 서열식별번호: 234, 서열식별번호: 235, 서열식별번호: 236, 서열식별번호: 237, 서열식별번호: 238, 서열식별번호: 239, 서열식별번호: 240, 서열식별번호: 241, 서열식별번호: 242, 서열식별번호: 243, 서열식별번호: 244, 서열식별번호: 245, 서열식별번호: 246, 서열식별번호: 247, 서열식별번호: 248, 서열식별번호: 249, 서열식별번호: 250, 서열식별번호: 251, 서열식별번호: 252, 서열식별번호: 253, 또는 서열식별번호: 254의 핵산 서열에 대해 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열, 또는 그의 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 핵산 서열을 포함한다 (예를 들어 그로 이루어진다).
한 측면에서, 본 발명은 항-BCMA 결합 도메인을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및/또는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개) 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및/또는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 서열식별번호: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 259, 260, 261, 또는 262에서의) 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 서열식별번호: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 255, 256, 257, 또는 258에서의) 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 263, 서열식별번호: 264, 서열식별번호: 265, 또는 서열식별번호: 266에서의 아미노산 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 서열식별번호: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 259, 260, 261, 또는 262에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 259, 260, 261, 또는 262의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 서열식별번호: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 255, 256, 257, 또는 258에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 255, 256, 257, 또는 258에 제공된 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 및 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 263, 서열식별번호: 264, 서열식별번호: 265, 또는 서열식별번호: 266으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 1 또는 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 표 1 또는 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 4 (서열식별번호: 26)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역일 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인을 코딩하는 단리된 핵산 서열은 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 56, 서열식별번호: 57, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 60, 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 62, 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 64, 서열식별번호: 65, 서열식별번호: 66, 서열식별번호: 67, 서열식별번호: 68, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155, 서열식별번호: 156, 서열식별번호: 157, 서열식별번호: 158, 서열식별번호: 159, 서열식별번호: 160, 서열식별번호: 161, 서열식별번호: 162, 서열식별번호: 163, 서열식별번호: 164, 서열식별번호: 165, 서열식별번호: 166, 서열식별번호: 167, 서열식별번호: 168, 서열식별번호: 169, 및 서열식별번호: 170으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, 코딩된 BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 추가로 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 코딩된 BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 중 1, 2개 또는 모두, 및 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 중 1, 2개 또는 모두를 포함한다.
한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 서열식별번호: 271 또는 273의 경쇄 가변 영역을 포함하는 (또는 그로 이루어진) 아미노산 서열; 및 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 서열식별번호: 271 또는 273의 중쇄 가변 영역을 포함하는 (또는 그로 이루어진) 아미노산 서열; 및 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 4 (서열식별번호: 26)이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드 분자, 예를 들어 단리된 키메라 항원 수용체 (CAR) 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 분자는 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 102, 서열식별번호: 103, 서열식별번호: 104, 서열식별번호: 105, 서열식별번호: 106, 서열식별번호: 107, 서열식별번호: 108, 서열식별번호: 109, 서열식별번호: 110, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 216, 서열식별번호: 217, 서열식별번호: 218, 서열식별번호: 219, 서열식별번호: 220, 서열식별번호: 221, 서열식별번호: 222, 서열식별번호: 223, 서열식별번호: 224, 서열식별번호: 225, 서열식별번호: 226, 서열식별번호: 227, 서열식별번호: 228, 서열식별번호: 229, 서열식별번호: 230, 서열식별번호: 231, 서열식별번호: 232, 및 서열식별번호: 233으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, BCMA에 특이적으로 결합하는 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편), 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 단리된 키메라 항원 수용체 (CAR) 분자 (예를 들어, 폴리펩티드)에 관한 것이다. 한 실시양태에서, CAR은 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA에 특이적으로 결합하는 인간 항체 또는 항체 단편), 본원에 기재된 막횡단 도메인, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간 또는 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에서의) 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에서의) 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에 열거된 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 263, 서열식별번호: 264, 서열식별번호: 265, 또는 서열식별번호: 266으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열; 또는 임의의 상기 서열에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열; 또는 임의의 상기 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 271 또는 서열식별번호: 273로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 1 또는 16, 서열식별번호: 271 또는 서열식별번호: 273에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 표 1 또는 16, 서열식별번호: 271 또는 서열식별번호: 273에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 4 (서열식별번호: 26)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역일 수 있다.
다른 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 추가로 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 중 1, 2개 또는 모두, 및 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 중 1, 2개 또는 모두를 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 코딩된 힌지 영역은 서열식별번호: 2, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 추가로 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다.
실시양태에서, 단리된 CAR 분자의 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 단리된 CAR 분자의 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 단리된 CAR 분자의 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 7의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD28의 공동자극 도메인은 서열식별번호: 1104의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 1104의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 1104의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CD27의 공동자극 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, ICOS의 공동자극 도메인은 서열식별번호: 1106의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 1106의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 1106의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
실시양태에서, 1차 신호전달 도메인은 CD3 제타에 대한 신호전달 도메인을 포함한다. 실시양태에서, CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인은 서열식별번호: 9 (돌연변이체 CD3 제타) 또는 서열식별번호: 10 (야생형 인간 CD3 제타), 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD27의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CD27의 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 8의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD28의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CD28의 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1104의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1104의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 379의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1104의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 ICOS의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, ICOS의 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1106의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 CD3 제타 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1106의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 1106의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1106의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 추가로 리더 서열, 예를 들어 본원에 기재된 리더 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 리더 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 리더 서열, 예를 들어 본원에 기재된 리더 서열, 예를 들어 서열식별번호: 1 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 리더 서열, 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 표 1 또는 16, 서열식별번호: 271 또는 서열식별번호: 273에 기재된 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열의 항-BCMA 결합 도메인, 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지 영역, 예를 들어 서열식별번호: 2 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 힌지 영역, 막횡단 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 막횡단 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 6의 서열 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 막횡단 도메인, 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 단리된 CAR 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 7의 서열 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인, 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 7의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인, 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 102, 서열식별번호: 103, 서열식별번호: 104, 서열식별번호: 105, 서열식별번호: 106, 서열식별번호: 107, 서열식별번호: 108, 서열식별번호: 109, 서열식별번호: 110, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 216, 서열식별번호: 217, 서열식별번호: 218, 서열식별번호: 219, 서열식별번호: 220, 서열식별번호: 221, 서열식별번호: 222, 서열식별번호: 223, 서열식별번호: 224, 서열식별번호: 225, 서열식별번호: 226, 서열식별번호: 227, 서열식별번호: 228, 서열식별번호: 229, 서열식별번호: 230, 서열식별번호: 231, 서열식별번호: 232, 또는 서열식별번호: 233의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 102, 서열식별번호: 103, 서열식별번호: 104, 서열식별번호: 105, 서열식별번호: 106, 서열식별번호: 107, 서열식별번호: 108, 서열식별번호: 109, 서열식별번호: 110, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 216, 서열식별번호: 217, 서열식별번호: 218, 서열식별번호: 219, 서열식별번호: 220, 서열식별번호: 221, 서열식별번호: 222, 서열식별번호: 223, 서열식별번호: 224, 서열식별번호: 225, 서열식별번호: 226, 서열식별번호: 227, 서열식별번호: 228, 서열식별번호: 229, 서열식별번호: 230, 서열식별번호: 231, 서열식별번호: 232, 또는 서열식별번호: 233의 아미노산 서열의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 또는 30개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 60, 50 또는 40개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 102, 서열식별번호: 103, 서열식별번호: 104, 서열식별번호: 105, 서열식별번호: 106, 서열식별번호: 107, 서열식별번호: 108, 서열식별번호: 109, 서열식별번호: 110, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 216, 서열식별번호: 217, 서열식별번호: 218, 서열식별번호: 219, 서열식별번호: 220, 서열식별번호: 221, 서열식별번호: 222, 서열식별번호: 223, 서열식별번호: 224, 서열식별번호: 225, 서열식별번호: 226, 서열식별번호: 227, 서열식별번호: 228, 서열식별번호: 229, 서열식별번호: 230, 서열식별번호: 231, 서열식별번호: 232, 또는 서열식별번호: 233의 아미노산 서열에 대해 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다 (예를 들어 그로 이루어진다).
다른 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 추가로 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 중 1, 2개 또는 모두, 및 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 중 1, 2개 또는 모두를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및/또는 본원에 기재된 BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하는 BCMA 결합 도메인, 예를 들어 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함하는 BCMA 결합 도메인에 관한 것이다.
다른 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 추가로 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3을 포함한다. 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 을 포함한다.
일부 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3 중 1, 2개 또는 모두, 및 표 1 또는 16에 열거된 임의의 BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3 중 1, 2개 또는 모두를 포함한다.
한 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및 본원에 기재된 BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간 또는 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에서의) 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에서의) 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 표 1, 서열식별번호: 271 또는 273에 열거된 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, BCMA 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 1 또는 서열식별번호: 271 또는 273에 제공된 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 263, 서열식별번호: 264, 서열식별번호: 265, 또는 서열식별번호: 266로 이루어진 군으로부터 선택된 서열; 또는 임의의 상기 서열에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열; 또는 임의의 상기 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 271 또는 서열식별번호: 273으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 1 또는 16, 서열식별번호: 271 또는 서열식별번호: 273에서의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 표 1 또는 16, 서열식별번호: 271 또는 서열식별번호: 273에서의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, BCMA 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 4 (서열식별번호: 26)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 한 실시양태에서, 벡터는 추가로 프로모터를 포함한다. 한 실시양태에서, 프로모터는 EF-1 프로모터이다. 한 실시양태에서, EF-1 프로모터는 서열식별번호: 11의 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 프로모터는 PGK 프로모터, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 말단절단된 PGK 프로모터이다.
한 실시양태에서, 벡터는 시험관내 전사되는 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 핵산 분자의 RNA를 전사하는 벡터이다. 한 실시양태에서, 벡터 내의 핵산 서열은 추가로 폴리(A) 테일, 예를 들어 약 150개의 아데노신 염기를 포함하는 예를 들어 본원에 기재된 폴리 A 테일을 포함한다 (서열식별번호: 382). 한 실시양태에서, 벡터 내의 핵산 서열은 추가로 3' UTR, 예를 들어 인간 베타-글로불린으로부터 유래된 3' UTR의 적어도 1개의 반복부를 포함하는 예를 들어 본원에 기재된 3' UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터 내의 핵산 서열은 추가로 프로모터, 예를 들어 T2A 프로모터를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 인간 T 세포 또는 인간 NK 세포, 예를 들어 본원에 기재된 인간 T 세포 또는 본원에 기재된 인간 NK 세포이다. 한 실시양태에서, 인간 T 세포는 CD8+ T 세포이다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 또 다른 작용제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 추가로 발현할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타를 포함한다. 실시양태에서, 작용제는 PD1을 억제하는 작용제이다. 실시양태에서, 작용제는 PD-L1을 억제하는 작용제이다. 한 실시양태에서, 억제 분자를 억제하는 작용제는 본원에 기재된 작용제, 예컨대 예를 들어 양성 신호를 세포에 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제 분자를 포함하는 작용제일 수 있다. 한 실시양태에서, 작용제는 예를 들어 억제 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, PD-L2, LAG3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), CTLA4, VISTA, CD160, BTLA, LAIR1, TIM3, 2B4, TGFR 베타, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TIGIT 또는 임의의 이들의 단편 (예를 들어, 임의의 이들의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 예를 들어 41BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)포함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 PD1 또는 그의 단편 (예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 세포, 예를 들어 본원에 기재된 면역 이펙터 세포, 예를 들어 본원에 기재된 T 세포 또는 NK 세포를 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질도입하는 것을 포함하는, 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 외인성 RNA를 일시적으로 발현하는 RNA-조작된 세포, 예를 들어 본원에 기재된 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 집단을 생성하는 방법을 제공한다. 방법은 시험관내에서 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 RNA는 본원에 기재된 CAR 분자를 코딩하는 핵산을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에게 CAR 분자를 발현하는 세포, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에 항종양 면역을 제공하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 세포는 자가 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 자가 NK 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 면역 이펙터 세포, 예를 들어 동종 T 세포 또는 동종 NK 세포이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간, 예를 들어 혈액암에 걸린 환자이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 BCMA의 발현과 연관된 질환 (예를 들어, 증식성 질환, 전암성 상태, 및 BCMA의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증)을 갖는 포유동물에게 CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간, 예를 들어 혈액암에 걸린 환자이다.
한 실시양태에서, 질환은 본원에 기재된 질환이다. 한 실시양태에서, BCMA 발현과 연관된 질환은 혈액암, 예컨대 급성 골수성 백혈병 (AML)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 급성 백혈병; 골수이형성 증후군; 골수증식성 신생물; 만성 골수성 백혈병 (CML); 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물; 및 BCMA를 발현하는 비정형 및/또는 비-전형적 암, 악성종양, 전암성 상태 또는 증식성 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 BCMA 발현과 연관된 질환; 및 그의 조합으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, BCMA 발현과 연관된 질환은 B-세포 급성 림프성 백혈병 ("BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 급성 백혈병; 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 만성 백혈병; B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 상태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 형질모구성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 골수 혈액 세포의 비유효 생산 (또는 이형성증)과 연관된 혈액 상태의 다양한 집단인 "전백혈병"을 포함하나 이에 제한되지는 않는 추가의 혈액암 또는 혈액 상태, 및 BCMA를 발현하는 비정형 및/또는 비-전형적 암, 악성종양, 전암성 상태 또는 증식성 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 BCMA 발현과 연관된 질환; 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈액암이다.
실시양태에서, BCMA의 발현과 연관된 질환은 형질 세포 증식성 장애, 예를 들어 무증상 골수종 (증상이 없는 다발성 골수종 또는 무통성 골수종), 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질세포종 (예를 들어, 형질 세포 이혼화증, 고립 골수종, 고립 형질세포종, 수질외 형질세포종, 및 다발성 형질세포종), 전신 아밀로이드 경쇄 아밀로이드증, 및 POEMS 증후군 (크로우-푸카세 증후군, 다카츠키병 및 PEP 증후군으로도 공지됨)을 포함한다.
실시양태에서, BCMA의 발현과 연관된 질환은 암, 예를 들어 본원에 기재된 암, 예를 들어 전립선암 (예를 들어, 거세-저항성 또는 요법-저항성 전립선암 또는 전이성 전립선암), 췌장암 또는 폐암을 포함한다.
치료 방법의 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 분자 (예를 들어, BCMA CAR 분자)를 발현하는 세포는 CD19 CAR 분자를 포함하는 세포와 조합되어 투여된다. 한 실시양태에서, BCMA CAR 분자를 발현하는 세포는 CD19 CAR을 발현하는 세포의 투여 전, 그 후 또는 그와 동시에 투여된다. 한 실시양태에서, BCMA CAR 분자를 발현하는 세포 및 CD19 CAR 분자를 발현하는 세포는 단일 조성물의 일부이고, 다른 실시양태에서 BCMA CAR 분자를 발현하는 세포 및 CD19 CAR 분자를 발현하는 세포는 개별 조성물의 일부이다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 분자 (예를 들어, BCMA CAR 분자)를 발현하는 세포는 또한 CD19 CAR 분자를 발현한다. 한 실시양태에서, BCMA와 연관된 질환은 다발성 골수종, 예를 들어 CD19-음성 다발성 골수종이다. 한 실시양태에서, BCMA의 발현과 연관된 질환은 다발성 골수종, 예를 들어 CD19-음성인, 예를 들어 유동 세포측정법 및 RT-PCR 둘 다에 의해 검출된 바와 같이, 예를 들어 대부분 (예를 들어, 99.95%)의 신생물성 형질 세포가 CD19-음성 표현형을 갖는 것인 다발성 골수종이다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 CAR 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제와 조합되어 투여된다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 낮은, 면역 증진 용량 (예를 들어, 면역계를 완전히 억제하기에 불충분하지만 면역 기능을 개선시키기에는 충분한 용량)을 사용한 처리는 PD-1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 감소 또는 PD-1 음성 세포의 증가를 동반하는 것으로 여겨진다. PD-1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포는 PD-1 리간드, 예를 들어 PD-L1 또는 PD-L2를 발현하는 세포에 의한 관여에 의해 고갈될 수 있지만, PD-1 음성 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 그렇지 않다.
한 실시양태에서, 이러한 접근법은 대상체에서 본원에 기재된 CAR 세포의 성능을 최적화하는데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 한 실시양태에서, 내인성, 비-변형된 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 성능이 개선된 것으로 여겨진다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 한 실시양태에서, BCMA CAR 발현 세포의 성능이 개선된 것으로 여겨진다. 다른 실시양태에서, CAR을 발현하도록 조작된 바 있거나 조작될 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 수를 증가시키거나, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포/ PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 비를 증가시키는 양의 mTOR 억제제와 접촉시키는 것에 의해 생체외 처리될 수 있다.
한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001, 또는 촉매 억제제의 투여는 본원에 기재된 CAR 발현 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 투여 전에 개시된다. 한 실시양태에서, CAR 세포는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 수준, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포/PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 비가 적어도 일시적으로 증가하도록 mTOR 억제제의 충분한 시간 또는 충분한 투여 후에 투여된다.
한 실시양태에서, CAR을 발현하도록 조작될 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 대상체 내의 또는 대상체로부터 수거된 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 수준, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포/PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 비가 적어도 일시적으로 증가하도록 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 충분한 시간 후에 또는 충분한 투여 후에 수거된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 대상체의 치료에 사용하기 위한 mTOR 억제제를 제공하며, 여기서 상기 mTOR 억제제는 상기 대상체의 면역 반응을 증진시키고, 여기서 상기 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 BCMA CAR을 발현하는 면역 이펙터 세포를 제공받은 바 있거나, 제공받고 있거나, 또는 제공받을 예정이다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 CAR 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 1종 이상의 부작용을 개선시키는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 BCMA와 연관된 질환을 치료하는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합되어 투여된다.
특정 실시양태에서, BCMA와 연관된 질환은 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양 또는 전암성 상태, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병이거나, 또는 BCMA의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증이다.
특정 실시양태에서, BCMA와 연관된 질환은 급성 골수성 백혈병 (AML)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 급성 백혈병; 골수이형성 증후군; 골수증식성 신생물; 만성 골수성 백혈병 (CML); 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물; 다발성 골수종; 및 BCMA를 발현하는 비정형 및/또는 비-전형적 암, 악성종양, 전암성 상태 또는 증식성 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 BCMA 발현과 연관된 질환; 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈액암이다. 한 실시양태에서, BCMA의 발현과 연관된 질환은 다발성 골수종이다. 실시양태에서, BCMA의 발현과 연관된 질환은 형질 세포 증식성 장애, 예를 들어 무증상 골수종 (증상이 없는 다발성 골수종 또는 무통성 골수종), 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질세포종 (예를 들어, 형질 세포 이혼화증, 고립 골수종, 고립 형질세포종, 수질외 형질세포종, 및 다발성 형질세포종), 전신 아밀로이드 경쇄 아밀로이드증, 및 POEMS 증후군 (크로우-푸카세 증후군, 다카츠키병 및 PEP 증후군으로도 공지됨)을 포함한다. 실시양태에서, BCMA의 발현과 연관된 질환은 암, 예를 들어 본원에 기재된 암, 예를 들어 전립선암 (예를 들어, 거세-저항성 또는 요법-저항성 전립선암 또는 전이성 전립선암), 췌장암 또는 폐암을 포함한다.
실시양태에서, BCMA CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA CAR-발현 세포는 다발성 골수종을 갖는 대상체를 치료하는데 사용된다. 실시양태에서, BCMA CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA CAR-발현 세포는 형질 세포 증식성 장애, 예를 들어 무증상 골수종 (증상이 없는 다발성 골수종 또는 무통성 골수종), 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질세포종 (예를 들어, 형질 세포 이혼화증, 고립 골수종, 고립 형질세포종, 수질외 형질세포종, 및 다발성 형질세포종), 전신 아밀로이드 경쇄 아밀로이드증, 및 POEMS 증후군 (크로우-푸카세 증후군, 다카츠키병 및 PEP 증후군으로도 공지됨)을 갖는 대상체를 치료하는데 사용된다. 실시양태에서, BCMA CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA CAR-발현 세포는 암, 예를 들어 본원에 기재된 암, 예를 들어 전립선암 (예를 들어, 거세-저항성 또는 요법-저항성 전립선암 또는 전이성 전립선암), 췌장암 또는 폐암을 갖는 대상체를 치료하는데 사용된다.
실시양태에서, BCMA CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA CAR-발현 세포는 총 용량의 세포를 대상체에게 용량 분할, 예를 들어 부분 용량의 1, 2, 3회 또는 그 초과의 개별 투여에 의해 투여하는 것을 포함하는 투여 요법에 따라 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 총 용량의 제1 백분율이 처리 제1일에 투여되고, 총 용량의 제2 백분율이 처리의 후속 (예를 들어, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 또는 제7 또는 그 초과)일에 투여되고, 임의로 총 용량의 제3 백분율 (예를 들어, 나머지 백분율)이 처리의 더 후속 (예를 들어, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 또는 그 초과)일에 투여된다. 예를 들어, 세포의 총 용량의 10%가 제1일에 전달되고, 세포의 총 용량의 30%가 제2일에 전달되고, 세포의 총 용량의 나머지 60%가 처리의 제3일에 전달된다. 예를 들어, 총 세포 용량은 1 내지 5 x 107개 또는 1 내지 5 x 108개 BCMA-CART 세포를 포함한다.
실시양태에서, 림프구고갈 요법 (예를 들어 시톡산, 예를 들어 1.5 g/m2으로)이 CAR-발현 세포 투여 전에 대상체에 투여된다. 실시양태에서, CAR-발현 세포 투여 전에 어떠한 림프구고갈 요법 (예를 들어, 시톡산)도 대상체에게 투여되지 않는다.
실시양태에서, 어떠한 림프구고갈 화학요법도 투여되지 않고, 1 내지 5 x 107개의 총 BCMA-CART 세포 용량이 처리 제1일에 10%의 세포 용량, 처리 제2일에 30%, 및 처리 제3일에 60%로 투여된다 (예를 들어, 주입에 의함). 또 다른 실시양태에서, 어떠한 림프구고갈 화학요법도 투여되지 않고, 1 내지 5 x 108개의 총 BCMA-CART 세포 용량이 처리 제1일에 10%의 세포 용량, 처리 제2일에 30%, 및 처리 제3일에 60%로 투여된다 (예를 들어, 주입에 의함). 실시양태에서, 림프구고갈 화학요법 (1.5 g/m2으로의 시톡산)이 BCMA-CART 세포 투여 3일 전에 투여되고, 이어서 1 내지 5 x 107개의 총 BCMA-CART 세포 용량이 처리 제1일에 10%의 세포 용량, 처리 제2일에 30%, 및 처리 제3일에 60%로 투여된다 (예를 들어, 주입에 의함). 실시양태에서, 림프구고갈 화학요법 (1.5 g/m2으로의 시톡산)이 BCMA-CART 세포 투여 3일 전에 투여되고, 이어서 1 내지 5 x 108개의 총 BCMA-CART 세포 용량이 처리 제1일에 10%의 세포 용량, 처리 제2일에 30%, 및 처리 제3일에 60%로 투여된다 (예를 들어, 주입에 의함).
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 본원에 기재된 CAR 분자를 포함하는 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 세포 이식 전에 대상체를 조건화하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 세포 이식은 줄기 세포 이식이다. 줄기 세포 이식은 조혈 줄기 세포 이식 또는 골수 이식이다. 한 실시양태에서, 세포 이식은 동종 또는 자가이다.
한 실시양태에서, 세포 이식 전에 대상체를 조건화하는 것은 대상체 내 BCMA-발현 세포의 수를 감소시키는 것을 포함한다. 대상체 내 BCMA-발현 세포는 BCMA-발현 정상 세포 또는 BCMA-발현 암 세포이고, 일부 경우에 대상체에서의 조건은 세포 이식 전에 BCMA-발현 정상 및 암 세포 둘 다를 감소시킬 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 본 발명의 CAR의 단리된 폴리펩티드 분자, 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터, 및 본 발명의 CAR을 포함하는 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 BCMA를 발현하는 질환, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 BCMA를 발현하는 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 본 발명의 CAR의 단리된 폴리펩티드 분자, 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터, 및 본 발명의 CAR을 포함하는 세포에 관한 것이다.
상기 언급된 조성물 및 방법의 추가의 특색 및 실시양태는 하기 중 1개 이상을 포함한다:
특정 실시양태에서, BCMA CAR 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA CAR 핵산 또는 BCMA CAR 폴리펩티드), 또는 본원에 기재된 바와 같은 BCMA 결합 도메인은 표 20에 제공된 중쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, HC CDR1, HC CDR2 및/또는 HC CDR3); 및/또는 표 21에 제공된 BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, C13F12.1의 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, LC CDR1, LC CDR2 및/또는 LC CDR3); 또는 임의의 상기 서열에 대해 실질적으로 동일한 (예를 들어, 95-99% 동일한, 또는 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이상의 아미노산 변화, 예를 들어 치환 (예를 들어, 보존적 치환)) 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, BCMA CAR 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA CAR 핵산 또는 BCMA CAR 폴리펩티드), 또는 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA 항원 결합 도메인은 표 22에 제공된 중쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, HC CDR1, HC CDR2 및/또는 HC CDR3); 및/또는 표 23에 제공된 BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, C13F12.1의 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, LC CDR1, LC CDR2 및/또는 LC CDR3); 또는 임의의 상기 서열에 대해 실질적으로 동일한 (예를 들어, 95-99% 동일한, 또는 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이상의 아미노산 변화, 예를 들어 치환 (예를 들어, 보존적 치환)) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, BCMA CAR 분자 또는 항-BCMA 항원 결합 도메인은 표 24에 제공된 중쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3); 및/또는 표 25에 제공된 BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, C13F12.1의 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, LC CDR1, LC CDR2 및/또는 LC CDR3); 또는 임의의 상기 서열에 대해 실질적으로 동일한 (예를 들어, 95-99% 동일한, 또는 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이상의 아미노산 변화, 예를 들어 치환 (예를 들어, 보존적 치환)) 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, BCMA CAR 분자 또는 항-BCMA 항원 결합 도메인은
(i) 표 1 또는 16, 서열식별번호: 271 또는 273, 또는 표 21, 23 또는 25에서의 LC CDR에 열거된 임의의 BCMA 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3; 및/또는
(ii) 표 1 또는 16, 서열식별번호: 271 또는 273, 또는 표 20, 22, 또는 24에서의 HC CDR에 열거된 임의의 BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3
을 포함한다.
특정 실시양태에서, BCMA 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA CAR 핵산 또는 BCMA CAR 폴리펩티드), 또는 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA 항원 결합 도메인은
(1) 하기 중 하나로부터 선택된 3개의 경쇄 (LC) CDR:
(i) BCMA-4 CAR (139103)의 서열식별번호: 504의 LC CDR1, 서열식별번호: 544의 LC CDR2 및 서열식별번호: 584의 LC CDR3;
(ii) BCMA-10 CAR (139109)의 서열식별번호: 514의 LC CDR1, 서열식별번호: 554의 LC CDR2 및 서열식별번호: 594의 LC CDR3;
(iii) BCMA-13 CAR (139112)의 서열식별번호: 516의 LC CDR1, 서열식별번호: 556의 LC CDR2 및 서열식별번호: 596의 LC CDR3; 또는
(iv) BCMA-15 CAR (139114)의 서열식별번호: 518의 LC CDR1, 서열식별번호: 558의 LC CDR2 및 서열식별번호: 598의 LC CDR3; 및/또는
(2) 하기 중 하나로부터 선택된 3개의 중쇄 (HC) CDR:
(i) BCMA-4 CAR (139103)의 서열식별번호: 384의 HC CDR1, 서열식별번호: 424의 HC CDR2 및 서열식별번호: 464의 HC CDR3;
(ii) BCMA-10 CAR (139109)의 서열식별번호: 394의 HC CDR1, 서열식별번호: 434의 HC CDR2 및 서열식별번호: 474의 HC CDR3;
(iii) BCMA-13 CAR (139112)의 서열식별번호: 396의 HC CDR1, 서열식별번호: 436의 HC CDR2 및 서열식별번호: 476의 HC CDR3; 또는
(iv) BCMA-15 (139114)의 서열식별번호: 398의 HC CDR1, 서열식별번호: 438의 HC CDR2 및 서열식별번호: 478의 HC CDR3
을 포함한다.
특정 실시양태에서, BCMA CAR 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA CAR 핵산 또는 BCMA CAR 폴리펩티드), 또는 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA 항원 결합 도메인은
(1) 하기 중 하나로부터 선택된 3개의 경쇄 (LC) CDR:
(i) BCMA-4 CAR (139103)의 서열식별번호: 744의 LC CDR1, 서열식별번호: 784의 LC CDR2 및 서열식별번호: 824의 LC CDR3;
(ii) BCMA-10 CAR (139109)의 서열식별번호: 754의 LC CDR1, 서열식별번호: 794의 LC CDR2 및 서열식별번호: 834의 LC CDR3;
(iii) BCMA-13 CAR (139112)의 서열식별번호: 756의 LC CDR1, 서열식별번호: 796의 LC CDR2 및 서열식별번호: 836의 LC CDR3; 또는
(iv) BCMA-15 CAR (139114)의 서열식별번호: 758의 LC CDR1, 서열식별번호: 798의 LC CDR2 및 서열식별번호: 838의 LC CDR3; 및/또는
(2) 하기 중 하나로부터 선택된 3개의 중쇄 (HC) CDR:
(i) BCMA-4 CAR (139103)의 서열식별번호: 624의 HC CDR1, 서열식별번호: 664의 HC CDR2 및 서열식별번호: 704의 HC CDR3;
(ii) BCMA-10 CAR (139109)의 서열식별번호: 634의 HC CDR1, 서열식별번호: 674의 HC CDR2 및 서열식별번호: 714의 HC CDR3;
(iii) BCMA-13 CAR (139112)의 서열식별번호: 636의 HC CDR1, 서열식별번호: 676의 HC CDR2 및 서열식별번호: 716의 HC CDR3; 또는
(iv) BCMA-15 CAR (139114)의 서열식별번호: 638의 HC CDR1, 서열식별번호: 678의 HC CDR2 및 서열식별번호: 718의 HC CDR3
을 포함한다.
특정 실시양태에서, BCMA CAR 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA CAR 핵산 또는 BCMA CAR 폴리펩티드), 또는 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA 항원 결합 도메인은
(1) 하기 중 하나로부터 선택된 3개의 경쇄 (LC) CDR:
(i) BCMA-4 CAR (139103)의 서열식별번호: 984의 LC CDR1 서열식별번호: 1024의 LC CDR2 및 서열식별번호: 1064의 LC CDR3;
(ii) BCMA-10 CAR (139109)의 서열식별번호: 994의 LC CDR1, 서열식별번호: 1034의 LC CDR2 및 서열식별번호: 1074의 LC CDR3;
(iii) BCMA-13 CAR (139112)의 서열식별번호: 996의 LC CDR1, 서열식별번호: 1036의 LC CDR2 및 서열식별번호: 1076의 LC CDR3; 또는
(iv) BCMA-15 CAR (139114)의 서열식별번호: 998의 LC CDR1, 서열식별번호: 1038의 LC CDR2 및 서열식별번호: 1078의 LC CDR3; 및/또는
(2) 하기 중 하나로부터 선택된 3개의 중쇄 (HC) CDR:
(i) BCMA-4 CAR (139103)의 서열식별번호: 864의 HC CDR1, 서열식별번호: 904의 HC CDR2 및 서열식별번호: 944의 HC CDR3;
(ii) BCMA-10 CAR (139109)의 서열식별번호: 874의 HC CDR1, 서열식별번호: 914의 HC CDR2 및 서열식별번호: 954의 HC CDR3;
(iii) BCMA-13 CAR (139112)의 서열식별번호: 876의 HC CDR1, 서열식별번호: 916의 HC CDR2 및 서열식별번호: 956의 HC CDR3;
(iv) BCMA-15 CAR (139114)의 서열식별번호: 878의 HC CDR1, 서열식별번호: 918의 HC CDR2 및 서열식별번호: 958의 HC CDR3
을 포함한다.
특정 실시양태에서, BCMA CAR 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 BCMA CAR 핵산 또는 BCMA CAR 폴리펩티드), 또는 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA 항원 결합 도메인은 서열식별번호: 271 또는 273의 인간화 scFv 아미노산 서열 또는 scFv 또는 그의 항원 결합 도메인 (예를 들어, 그의 VH, VL 또는 1개 이상의 CDR)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열식별번호: 272 또는 274)을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기 기재된다. 본원에 언급된 모든 공개, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 또한, 물질, 방법 및 예는 단지 예시를 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 표제, 하위-표제 또는 숫자화 또는 문자화 요소, 예를 들어 (a), (b), (i) 등은 단지 읽기의 용이성을 위해 제시된다. 본 문서에서 표제 또는 숫자화 또는 문자화 요소의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳 순서로 수행될 것 또는 단계 또는 요소가 반드시 서로 개별적일 것을 요구하지 않는다. 본 발명의 다른 특색, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면으로부터, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a 및 1b를 포함하는 도 1은 정량적 PCR에 의해 결정된 바와 같은 골수종 샘플에서의 BCMA 발현의 2개의 그래프 표현이다. BCMA 발현이 상이한 골수종 세포주에서 결정되었다 (도 1a). BCMA 발현을 정상 형질 세포 및 골수종 환자 샘플 사이에 비교하였다 (도 1b).
도 2a, 2b, 2c, 2d, 및 2e를 포함하는 도 2는 유동 세포측정법에 의한 다발성 골수종 세포주 및 원발성 샘플에서의 BCMA 발현의 일련의 그래프 표현이다. BCMA는 세포주 U266 (도 2a), H929 (도 2b), 및 8226 (도 2c)의 표면 상에서 검출되었다. BCMA는 또한 분석된 10종의 다발성 골수종 환자 중 9종의 대부분의 클론 형질 세포 상에서 균질하게 발현되었다 (도 2d 및 2e).
도 3a 및 3b를 포함하는 도 3은 정상 말초 혈액 세포에서의 및 CD3/CD28 확장 후의 (도 3a) 및 정상 골수 세포 상에서의 (도 3b) BCMA 발현의 결여를 입증하는 일련의 그래프 표현이다.
도 4a, 4b, 4c, 4d, 4e 및 4f를 포함하는 도 4는 정상 조직에서의 BCMA 발현을 제시하는 일련의 사진 및 그래프이다. 면역조직화학적 분석에서 BCMA 발현에 대해 양성으로 염색된 조직은 림프절 (도 4a) 및 편도 (도 4b)였다. BCMA 발현에 대해 염색되지 않은 (BCMA 음성) 대표적인 조직은 폐 (도 4c), 췌장 (도 4d), 및 갑상선 (도 4e)을 포함하였다. 상이한 조직에서의 RNA 계내 혼성화 분석을 또한 수행하였다 (도 4f).
도 5는 pBCMA1, pBCMA2, pBCMA3, 및 pBCMA4로 지정된 인간화 뮤린 항-BCMA scFv를 함유하는 4종의 CAR 구축물의 개략적 표현이다.
도 6은 형질도입 효율 및 T 세포 상에서의 BCMA-CAR 구축물의 발현을 제시하는 일련의 유동 세포측정 플롯이다. SS1-BBz는 음성 대조군으로서의 역할을 하는 항-메소텔린 CAR을 나타낸다.
도 7a 및 도 7b를 포함하는 도 7은 ELISA 검정에 의해 측정된 바와 같은 BCMA-CART의 항원-특이적 시토카인 생산을 입증하는 2개의 그래프이다. IL2 (도 7a) 및 인터페론-감마 (IFNg) (도 7b) 생산이 평가되었다.
도 8a, 도 8b, 도 8c, 및 도 8d를 포함하는 도 8은 제시된 골수종 세포주: K562-발현 BCMA (도 8a); 8226 (도 8b); NCI H929 (도 8c); 및 OPM2 (도 8d)에 대한 BCMA-CART의 세포독성 활성을 입증하는 일련의 그래프이다.
도 9a 및 도 9b를 포함하는 도 9는 전임상 다발성 골수종 동물 모델에서의 BCMA-CART의 항종양 활성을 제시하는 그래프 및 일련의 사진이다. 도 9a는 전체 동물에서의 질환 부담을 나타내는 평균 생물발광의 정량화를 제시한다 (광자/초에 의해 나타내어짐). 도 9b는 처리 5, 15, 및 20일 후에 처리된 마우스에서 검출된 생물발광의 사진을 제시한다.
도 10a 및 10b를 포함하는 도 10은 인간화 뮤린 항-BCMA scFv를 함유하는 도구 BCMA CAR 구축물의 일련의 개략적 표현이다.
도 11은 루시페라제 리포터 검정에 의한 리포터 세포주에 형질도입된 도구 BCMA CAR 구축물의 표적-특이적 활성화를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 12는 도구 BCMA CAR 구축물에 의한 형질도입 전 CD3/CD28 확장 후 T 세포의 CD4+ 및 CD8+ 집단의 분포를 제시하는 유동 세포측정 플롯이다.
도 13은 유동 세포측정 분석에 의한 형질도입 10일 후 BCMA-Fc 항원의 검출에 의한 CART 형질도입 효율을 제시하는 일련의 플롯 및 상응하는 히스토그램이다.
도 14는 제시된 표적 세포 (예를 들어, K562, BCMA를 발현하는 K562, KMS11-luc, MM1-S-luc, NCI-H929, KMs26, RPMI 8226, 및 CD3/CD28 비드)에 의한 자극 후 CFSE 염색에 의한 도구 BCMA CART 세포의 증식을 제시하는 일련의 히스토그램 플롯이다.
도 15a 및 15b를 포함하는 도 15는 제시된 표적 세포에 의한 자극 후, CART-발현 세포 (도 15a) 및 총 수의 세포 (도 15b)의 경우의 세포 카운트 (유동 세포측정법에 의해 측정된 바와 같음)에 의한 도구 BCMA CART 세포의 증식을 제시하는 2개의 그래프이다.
도 16은 루시페라제 검정에 의한, BCMA-발현 표적 세포 KMS11-루시페라제 세포 (좌측) 및 MM1-S-루시페라제 세포 (우측)에 대한 반응으로의 도구 BCMA CART 사멸을 제시하는 그래프이다.
도 17은 CFSE 세포 사멸 검정에 의한, BCMA-발현 표적 세포에 대한 반응으로 도구 BCMA CART 사멸을 제시하는 일련의 그래프이다.
도 18은 루시페라제 리포터 검정에 의한, 리포터 세포주에 형질도입된 인간 항-BCMA scFv를 함유하는 BCMA CAR의 표적-특이적 활성화를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 19는 CD3/CD28 확장 후 및 CAR 형질도입 전 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단의 분포를 제시하는 유동 세포측정 플롯이다.
도 20은 형질도입된 T 세포 상에서의 CAR 발현을 평가함으로써 형질도입 효율을 제시하는 일련의 유동 세포측정 플롯 및 상응하는 히스토그램 플롯이다.
도 21은 CFSE 염색에 의해 측정된 바와 같은, 제시된 표적 세포 (K562, BCMA를 발현하는 K562, RPMI 8226, KM11-luc, 및 NCI-H929)에 의한 자극에 대한 반응으로 BCMA CART 세포의 세포 증식을 제시하는 일련의 히스토그램 플롯이다.
도 22a, 도 22b, 및 도 22c를 포함하는 도 22는 유동 세포측정 분석에 의해 측정된 바와 같은, 제시된 표적 세포 (K562, BCMA를 발현하는 K562, RPMI 8226, KMS11-luc, 및 NCI-H929)에 의한 자극에 대한 반응으로 BCMA CART 세포 증식을 입증하는 일련의 그래프이다. CART 세포의 증식은 CD3 (도 22a), CD4 (도 22b), 및 CD8 (도 22c)를 발현하는 각각의 T 세포 집단에 대해 독립적으로 분석하였다.
도 23a, 23b, 및 23c를 포함하는 도 23은 루시페라제 검정에 의한, BCMA-발현 KMS11-루시페라제 표적 세포에 대한 반응으로 BCMA CART 사멸을 제시하는 일련의 그래프이다. 각각의 BCMA CAR 구축물의 사멸 능력 (사멸된 표적 세포의 퍼센트)을 도 23a에서 각각의 그래프에서 BCMA-3NP 및 BCMA-4NP와 비교하였다. 도 23b에서, 선택된 BCMA CAR 구축물을 서로 비교하였다. 도 23c에서, 이펙터:표적 비를 CAR-발현 세포에 대해 정규화하였다. X-축은 사멸된 표적 세포의 퍼센트를 나타내고; Y-축은 이펙터:표적 (E:T) 비를 나타낸다.
도 24는 NSG 마우스 내 KMS-11-luc 인간 다발성 골수종 이종이식편에서 BCMA CART를 사용한 처리가 질환 진행의 제어를 발생시킨다는 것을 제시하는 그래프이다. 종양 세포의 평균 생물발광 (+/- SEM)은 전체 동물에서의 질환 부담을 제시하며, ROI (관심 영역, 예를 들어 전체 마우스)의 광자/초 (p/s)로서 그래프에 나타어진다. 비히클에 대해 ANOVA에 의해 계산된 유의성; *는 P<0.01을 나타낸다.
도 25a 및 25b를 포함하는 도 25는 2회의 독립적인 실험에서의 KMS-11 인간 다발성 골수종 모델에서의 BCMA CAR T 세포의 항종양 활성을 입증하는 2개의 그래프이다. 종양 세포의 평균 생물발광 (+/- SEM)은 전체 동물에서의 질환 부담을 제시하며, 전체 마우스의 광자/초 (p/s) (또는 총 유동 또는 BLI)로서 그래프에 나타내어진다. 제28일에 비히클에 대해 ANOVA에 의해 계산된 유의성; 도 25a에서 *는 P<0.01을 나타낸다. 도 25b에서, BCMA-4NP*는 제1 실험으로부터의 BCMA-4NP 결과를 나타낸다 (결과는 도 25a에 제시됨).
도 26a, 26b, 26c, 및 26d를 포함하는 도 26은 KMS-11-luc 종양-보유 마우스의 말초 혈액에서의 BCMA-CART 세포 수의 정량화에 의한 BCMA-CART 세포의 증식을 제시하는 그래프이다. 말초 혈액 T 세포를 CAR T 세포 처리 1일, 3일, 7일, 10일, 14일 후 및 그 후 매주 분석하였다. 제1 종양 실험으로부터 (결과는 도 25a에 제시됨), CD4+ CART 집단은 도 26a에서 평가되었고 CD8+ CART 집단은 도 26b에서 평가되었다. 제2 종양 실험으로부터 (결과는 도 25b에 제시됨), CD4+ CART 집단은 도 26c에서 평가되었고 CD8+ CART 집단은 도 26d에서 평가되었다.
도 27a, 27b, 27c, 및 27d를 포함하는 도 27은 제1 종양 실험 (결과는 도 25a에 제시됨)의 말미에 골수 및 비장에서의 BCMA CAR-발현 T 세포의 확장을 제시하는 그래프이다. 골수 (도 27a) 및 비장 (도 27b)에서의 CD4+ BCMA CAR-발현 T 세포의 평균 수를 계산하였다. 골수 (도 27c) 및 비장 (도 27d)에서의 CD4=8+ BCMA CAR-발현 T 세포의 평균 수를 계산하였다. J6MO 샘플은 BCMA-4NP CAR 구축물을 발현하는 CAR T 세포를 나타낸다.
도 28a 및 28b를 포함하는 도 28은 2회의 독립적인 렌티바이러스 실험에서의 선택된 BCMA CAR 구축물에 대한 렌티바이러스 역가를 제시하는 그래프이다. 제1 시험 실행에서, BCMA CAR 구축물의 2종의 상이한 DNA 표본을 시험하였다 (A 및 B) (도 28a). 제2 시험 실행에서, BCMA CAR 구축물의 3종의 상이한 DNA 표본을 시험하였다 (A, B, 및 C) (도 28b).
도 29는 BCMA-4NP와 선택된 BCMA CAR 구축물, BCMA-4 (B4), BCMA-10 (B10), BCMA-13 (B13) 및 BCMA-15 (B15) 사이의 경쟁 검정을 제시하는 그래프이다.
도 30a, 30b, 30c, 30d, 및 30e를 포함하는 도 30은 선택된 BCMA 구축물: BCMA-10 (도 30a); BCMA-13 (도 30b), BCMA-15 (도 30c), BCMA-4 (도 30d), 및 BCMA-4NP (도 30e)에 대한 친화도 검정의 결과를 제시하는 그래프이다.
도 31은 재조합 BCMA에 대한 선택된 BCMA CAR-발현 T 세포의 선택적 결합을 제시하는 그래프이다. BCMA의 재조합 형태 및 Fc 도메인에 융합된 단백질을 포함하는 밀접하게 관련된 패밀리 구성원 BAFFR 및 TACI를 BCMA-4, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15를 발현하는 T 세포와 인큐베이션하였다. 재조합 단백질에 결합된 세포의 백분율 (% 양성 세포)을 검출하였다.
도 32a, 32b, 32c, 32d, 32e, 및 32f를 포함하는 도 32는 뇌 조직에서의 BCMA의 면역조직화학적 염색을 도시한 일련의 영상이다. 시노몰구스 마카크의 소뇌의 오름 섬유에서의 BCMA-염색 (도 32a). 시노몰구스 마카크의 하올리브 핵 내 뉴런 세포체에서의 BCMA-염색 (도 32b). 시노몰구스 마카크 연수에서의 BCMA-염색 (도 32c) 및 Ig 염색 (대조군) (도 32e). 인간 연수에서의 BCMA-염색 (도 32d) 및 Ig 염색 (대조군) (도 32f).
도 33a, 33b, 33c, 33d, 및 33e를 포함하는 도 33은 뇌 조직에서의 BCMA 발현의 RNA 분석을 도시한 일련의 영상 및 그래프이다. 비-인간 영장류 소뇌의 BCMA, DAPB, 및 PPIB RNA 계내 혼성화 (도 33a). 비-인간 영장류 연수의 BCMA, DAPB, 및 PPIB RNA 계내 혼성화 (도 33b). 인간의 소뇌, 연수, 위, 및 신장에서의 BCMA의 정량적 PCR 분석 (도 33c). 시노몰구스 마카크의 백질, 회백질, 연수, 위, 및 신장에서의 BCMA의 정량적 PCR 분석 (도 33d). 인간에서의 정상 조직의 RNAseq 분석 (도 33e); 박스는 소뇌에서의 BCMA-발현을 나타낸다.
도 34는 재발성 및/또는 불응성 골수종에서 BCMA CART 세포 요법의 안전성 및 실현가능성을 평가하기 위한 연구의 시간선을 제시하는 개략적 다이어그램이다.
도 35a 및 35b는 표적 세포와 공동-배양한 경우에 BCMA-10 CART에 의해 분비된 시토카인의 농도를 제시하는 그래프이다. 도 35a는 BCMA-10 CART에 의해 분비된 인터류킨-2 (IL-2) 및 인터페론-감마 (IFNγ)의 농도를 제시하는 그래프이다. 도 35b는 BCMA-10 CART에 의해 분비된 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α)의 농도를 제시하는 그래프이다.
도 36a 및 36b는 성장 곡선 및 T 세포의 huBCMA-BBz 렌티바이러스 형질도입의 효율을 제시하는 그래프/플롯이다. 도 36a는 확장 수일 후에 huBCMA-BBz 벡터로 형질도입된 T 세포의 수를 제시하는 그래프이다. 도 36b는 비-형질도입된 NTD 세포와 비교하여 CART-BCMA 세포 (huBCMA-BBz 벡터로 형질도입된 T 세포) 상에서의 BCMA의 생체외 확장의 제6일째 발현을 제시하는 유동 세포측정 플롯의 패널이다.
도 37은 K562-BCMA 세포 및 다발성 골수종 세포주 NCI H929, U266, RPMI 8226, OPM2 및 MM1S를 비롯한 다양한 세포주 상에서의 BCMA 표면 발현을 제시하는 유동 세포측정법 히스토그램의 패널이다. 모든 플롯의 경우에, 오렌지색으로 채워진 피크는 이소형 대조군을 나타내고, 청색으로 채워진 피크는 BCMA 항체에 의한 염색을 나타낸다.
도 38a 및 38b는 골수종 세포주에 대한 반응으로 CART-BCMA 세포에 의해 생산된 시토카인의 농도를 제시하는 그래프이다. 도 38a는 생산된 IL-2의 농도를 제시하고, 도 38b는 생산된 IFN-γ의 농도를 제시한다. 값은 시토카인 농도를 pg/mL로 나타낸다.
도 39a, 39b, 및 39c는 CART-BCMA 세포에 의한 BCMA+ 다발성 골수종 세포주의 항원-특이적 사멸을 제시하는 그래프이다. 도 39a는 K562-BCMA 세포의 항원-특이적 사멸을 제시하고, 도 39b는 RPMI 8226 세포의 항원 특이적 사멸을 제시하고, 도 39c는 MM1S 세포의 항원 특이적 사멸을 제시한다.
도 40a, 40b, 및 40c는 CART-BCMA 세포가 생체내에서 유효 항골수종 활성을 나타낸다는 것을 제시하는 그래프이다. 도 40a는 비-형질도입된 마우스에서의 총 방사휘도를 제시하는 그래프이고, 도 40b는 CART-BCMA 마우스에서의 총 방사휘도를 제시하는 그래프이다. 도 40c는 T 세포 주사 후 NTD 또는 CART-BCMA 마우스의 퍼센트 생존을 제시하는 그래프이다. RPMI 8226 CBG+ 종양으로부터의 배측 광자 방출을 회색으로 도시된 개별 동물로 제시하고, 중앙 총 방사휘도는 적색으로 제시한다. 각 군의 경우에 n=10. 시간은 T 세포 주사 후 주 단위로 제시된다.
도 41a-41d는 단일 벡터 상에서의 다양한 구성을 제시하며, 예를 들어 여기서 U6 조절 shRNA는 EF1 알파 조절 CAR 코딩 요소의 상류 또는 하류에 있다. 도 41a 및 41b에 도시된 예시적인 구축물에서, 전사는 U6 및 EF1 알파 프로모터를 통해 동일한 방향으로 일어난다. 도 41c 및 41d에 도시된 예시적인 구축물에서, 전사는 U6 및 EF1 알파 프로모터를 통해 상이한 방향으로 일어난다. 도 41e에서, shRNA (및 상응하는 U6 프로모터)는 제1 벡터 상에 존재하고, CAR (및 상응하는 EF1 알파 프로모터)은 제2 벡터 상에 존재한다.
도 42는 2종의 예시적인 RCAR 구성의 구조를 도시한다. 항원 결합 구성원은 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 스위치 도메인을 포함한다. 세포내 결합 구성원은 스위치 도메인, 공동-자극 신호전달 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 2종의 구성은 본원에 기재된 제1 및 제2 스위치 도메인이 항원 결합 구성원 및 세포내 결합 구성원과 관련하여 상이한 배향으로 존재할 수 있음을 입증한다. 다른 RCAR 구성이 본원에 추가로 기재되어 있다.
도 43은 CAR-발현, 형질도입된 T 세포의 증식이 세포 배양 시스템에서 낮은 용량의 RAD001에 의해 증진된다는 것을 제시한다. CART를 상이한 농도의 RAD001의 존재 하에 Nalm-6 세포와 공동-배양하였다. CAR-양성 CD3-양성 T 세포 (흑색) 및 총 T 세포 (회색)의 수를 공동-배양 4일 후에 평가하였다.
도 44는 0.3, 1, 3, 및 10 mg/kg (mpk)으로의 매일 RAD001 투여 또는 비히클 투여에 의한 NALM6-luc 세포의 종양 성장 측정을 도시한다. 원형은 비히클을 나타내고; 사각형은 10 mg/kg 용량의 RAD001을 나타내고; 삼각형은 3 mg/kg 용량의 RAD001을 나타내고, 역삼각형은 1 mg/kg 용량의 RAD001을 나타내고; 다이아몬드형은 0.3 mg/kg 용량의 RAD001을 나타낸다.
도 45a 및 45b는 NALM6 종양을 갖는 NSG 마우스의 혈액 중 RAD001의 양을 제시하는 약동학 곡선을 제시한다. 도 45a는 RAD001의 제1 용량 후 제0일 PK를 제시한다. 도 45b는 최종 RAD001 용량 후 제14일 PK를 제시한다. 다이아몬드형은 10 mg/kg 용량의 RAD001을 나타내고; 사각형은 1 mg/kg 용량의 RAD001을 나타내고; 삼각형은 3 mg/kg 용량의 RAD001을 나타내고; x형은 10 mg/kg 용량의 RAD001을 나타낸다.
도 46a 및 46b는 RAD001 투여의 존재 및 부재 하에서의 인간화 CD19 CART 세포의 생체내 증식을 제시한다. 매일 낮은 용량의 RAD001 (0.003 mg/kg)은 huCAR19 증식의 정상 수준을 초과하는 CAR T 세포 증식에서의 증진으로 이어진다. 도 46a는 CD4+ CAR T 세포를 제시하고; 도 46b는 CD8+ CAR T 세포를 제시한다. 원형은 PBS를 나타내고; 사각형은 huCTL019를 나타내고; 삼각형은 huCTL019와 3 mg/kg RAD001을 나타내고; 역삼각형은 huCTL019와 0.3 mg/kg RAD001을 나타내고; 다이아몬드형은 huCTL019와 0.03 mg/kg RAD001을 나타내고; 원형은 huCTL019와 0.003 mg/kg RAD001을 나타낸다.
도 47은 환자의 종양 세포에서의 CD19 발현을 도시한다. CD138+ CD45dim 종양 세포를 CD19 (x-축) 및 CD38 (y-축)에 대해 염색하였다. 대략 1-2%의 종양 세포가 CD19 항원을 발현하였다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
단수형태 용어는 문장의 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)의 문법적 대상을 지칭한다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
용어 "약"은, 측정가능한 값, 예컨대 양, 시간 기간 등을 언급하는 경우에 명시된 값으로부터 ±20%, 또는 일부 경우에 ±10%, 또는 일부 경우에 ±5%, 또는 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 변동을 포괄하는 것으로 의도되고, 이는 이러한 변동이 개시된 방법의 수행에 적절하기 때문이다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"은 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 하기 정의되는 바와 같은 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인 (본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 포함하는 재조합 폴리펩티드 구축물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드 구축물 내의 도메인은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 있고, 예를 들어 키메라 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 폴리펩티드 구축물 내의 도메인은 서로 인접하지 않고, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 RCAR에 제공된 바와 같이, 예를 들어 상이한 폴리펩티드 쇄 내에 있다.
한 측면에서, CAR의 자극 분자는 T 세포 수용체 복합체와 회합된 제타 쇄이다. 한 측면에서, 세포질 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3-제타의 1차 신호전달 도메인)을 포함한다. 한 측면에서, 세포질 신호전달 도메인은 하기 정의된 바와 같은 적어도 1개의 공동자극 분자로부터 유래된 1개 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 공동자극 분자는 4-1BB (즉, CD137), CD27, ICOS 및/또는 CD28로부터 선택된다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막횡단 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막횡단 도메인 및 공동-자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막횡단 도메인 및 하나 이상의 공동-자극 분자(들)로부터 유래된 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인, 막횡단 도메인 및 하나 이상의 공동-자극 분자(들)로부터 유래된 적어도 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노-말단 (N-ter)에서 임의적인 리더 서열을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인의 N-말단에 리더 서열을 추가로 포함하고, 여기서 리더 서열은 CAR의 세포 프로세싱 및 세포 막으로의 국재화 동안 항원 인식 도메인 (예를 들어, aa scFv)으로부터 임의로 절단된다.
특이적 종양 마커 X (여기서 X는 본원에 기재된 바와 같은 종양 마커일 수 있음)를 표적화하는 항원 결합 도메인 (예를 들어 scFv, 단일 도메인 항체, 또는 TCR (예를 들어, TCR 알파 결합 도메인 또는 TCR 베타 결합 도메인))을 포함하는 CAR은 또한 XCAR로 지칭된다. 예를 들어, BCMA를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR은 BCMACAR로 지칭된다. CAR은 임의의 세포, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)에서 발현될 수 있다.
용어 "신호전달 도메인"은 정보를 세포 내로 전달함으로써 제2 메신저를 생성하거나 또는 이러한 메신저에 반응하여 이펙터로서 기능함으로써 규정된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절하는 작용을 하는 단백질의 기능적 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "BCMA"는 B-세포 성숙 항원을 지칭한다. BCMA (TNFRSF17, BCM 또는 CD269로도 공지됨)는 종양 괴사 수용체 (TNFR) 패밀리의 구성원이고, 최종 분화 B 세포, 예를 들어 기억 B 세포 및 형질 세포 상에서 우세하게 발현된다. 그의 리간드는 TNF 패밀리의 B-세포 활성화제 (BAFF) 및 증식 유도 리간드 (APRIL)로 불린다. BCMA는 장기 체액성 면역을 유지시키기 위해 형질 세포의 생존을 매개하는데 관여한다. BCMA에 대한 유전자는 염색체 16 상에 코딩되어 있고, 이는 184개 아미노산의 단백질 (NP_001183.2)을 코딩하는 994개 뉴클레오티드 길이의 1차 mRNA 전사체 (NCBI 수탁 NM_001192.2)를 생산한다. BCMA 유전자좌로부터 유래된 제2 안티센스 전사체가 기재되어 있고, 이는 BCMA 발현을 조절하는데 역할을 할 수 있다. (Laabi Y. et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22:1147-1154). 추가의 전사체 변이체가 유의성의 공지 없이 기재되어 있다 (Smirnova AS et al. Mol Immunol., 2008, 45(4):1179-1183). TV4로도 공지된 제2 이소형이 확인된 바 있다 (유니프롯 식별자 Q02223-2). 본원에 사용된 "BCMA"는 전장 야생형 BCMA의 돌연변이, 예를 들어 점 돌연변이, 단편, 삽입, 결실 및 스플라이스 변이체를 포함하는 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자로부터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날, 다중 또는 단일 쇄, 또는 무손상 이뮤노글로불린일 수 있고, 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 이뮤노글로불린 분자의 사량체일 수 있다.
용어 "항체 단편"은 무손상 항체 또는 그의 재조합 변이체의 적어도 한 부분를 지칭하고, 표적, 예컨대 항원에 대한 항체 단편의 인식 및 특이적 결합을 부여하는데 충분한 항원 결합 도메인, 예를 들어 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, scFv 항체 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대 sdAb (VL 또는 VH), 낙타류 VHH 도메인, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 분자, 예컨대 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개 이상, 예를 들어 2개의 Fab 단편을 포함하는, 또는 항체의 2개 이상, 예를 들어 2개의 단리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편이 연결된 2가 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 항체 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내에 혼입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005] 참조). 항체 단편은 또한, 피브로넥틴 유형 III (Fn3)과 같이, 폴리펩티드를 기반으로 하는 스캐폴드 내로 그라프팅될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디를 기재한 미국 특허 번호 6,703,199 참조).
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 1개의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 1개의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 짧은 가요성 폴리펩티드 링커를 통해 인접하여 연결되고, 단일 쇄 폴리펩티드로서 발현될 수 있고, 여기서 scFv는 그것이 유래된 무손상 항체의 특이성을 보유한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 scFv는 VL 및 VH 가변 영역을 임의의 순서로 가질 수 있고, 예를 들어 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 단부와 관련하여, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 또는 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 예를 들어, 일반적으로, 각 중쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (예를 들어, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3) 및 각 경쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)이 존재한다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("카바트(Kabat)" 넘버링 스킴), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("코티아(Chothia)" 넘버링 스킴)]에 기재된 것을 비롯하여 널리 공지된 다수의 스킴 중 임의의 것 또는 그의 조합을 사용하여 결정될 수 있다. 카바트 넘버링 스킴 하에, 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인 (VH)에서의 CDR 아미노산 잔기는 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) 및 95-102 (HCDR3)로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인 (VL)에서의 CDR 아미노산 잔기는 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) 및 89-97 (LCDR3)로 넘버링된다. 코티아 넘버링 스킴 하에, 일부 실시양태에서, VH에서의 CDR 아미노산은 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) 및 95-102 (HCDR3)로 넘버링되고; VL에서의 CDR 아미노산 잔기는 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) 및 91-96 (LCDR3)으로 넘버링된다. 조합된 카바트 및 코티아 넘버링 스킴에서, 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR, 또는 둘 다의 일부인 아미노산 잔기에 상응된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CDR은 VH, 예를 들어 포유동물 VH, 예를 들어 인간 VH에서 아미노산 잔기 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3)에 상응하고; VL, 예를 들어 포유동물 VL, 예를 들어 인간 VL에서 아미노산 잔기 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), 및 89-97 (LCDR3)에 상응한다.
항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR 조성물의 부분은, 예를 들어 항원 결합 도메인이 예를 들어 단일 도메인 항체 단편 (sdAb), 단일 쇄 항체 (scFv), 또는 예를 들어 인간화 또는 인간 항체를 비롯한 폴리펩티드 쇄의 부분으로서 발현되는 다양한 형태로 존재할 수 있다 (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). 한 측면에서, 본 발명의 CAR 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자" (본원에서 "항-표적 (예를 들어, BCMA) 결합 도메인"으로도 지칭됨)는 적어도 1개의 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예를 들어 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편을 지칭한다. 용어 "결합 도메인" 또는 "항체 분자"는 항체 및 항체 단편을 포괄한다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 다중특이적 항체 분자이고, 예를 들어 이는 복수개의 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 포함하며, 여기서 복수개 중 제1 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 제1 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖고, 복수개 중 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 제2 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는다. 한 실시양태에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다.
용어 "항체 중쇄"는 그의 자연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하고 통상적으로 항체가 속하는 부류를 결정하는, 폴리펩티드 쇄의 2개의 유형 중 더 큰 것을 지칭한다.
용어 "항체 경쇄"는 그의 자연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하는 폴리펩티드 쇄의 2개의 유형 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파 (κ) 및 람다 (λ) 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체, 예컨대 예를 들어 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체를 지칭한다. 상기 용어는 또한 항체를 코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하고, DNA 분자는 항체 단백질, 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 관련 기술분야에서 이용가능하고 널리 공지된 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득된다.
용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이러한 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적 면역학적-적격 세포의 활성화, 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 통상의 기술자는 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 비롯한 임의의 거대분자가 항원으로서의 역할을 할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 따라서, 통상의 기술자는 면역 반응을 도출하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가, 본원에 사용된 용어 "항원"을 코딩함을 이해할 것이다. 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요는 없음을 이해할 것이다. 본 발명은 1개 초과의 유전자의 부분적인 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니고, 이들 뉴클레오티드 서열은 목적하는 면역 반응을 도출하는 폴리펩티드를 코딩하기 위해 다양한 조합으로 배열됨이 분명하다. 또한, 통상의 기술자는 항원이 "유전자"에 의해 코딩될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원은 합성되어 생성될 수 있거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 또는 폴리펩티드 이외의 거대분자일 수 있음이 분명하다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "항종양 효과"는, 예를 들어 종양 부피의 감소, 종양 세포의 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 종양 세포 증식의 감소, 종양 세포 생존의 감소, 또는 암성 상태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 호전을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 수단에 의해 나타내질 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항종양 효과"는 또한 먼저 종양 발생의 예방에서 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타내질 수 있다.
용어 "항암 효과"는, 예를 들어 종양 부피의 감소, 암 세포의 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 암 세포 증식의 감소, 암 세포 생존의 감소, 또는 암성 상태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 호전을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 수단에 의해 나타내질 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항암 효과"는 또한 먼저 암 발생의 예방에서 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타내질 수 있다. 용어 "항종양 효과"는, 예를 들어 종양 부피의 감소, 종양 세포의 수의 감소, 종양 세포 증식의 감소, 또는 종양 세포 생존의 감소를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 수단에 의해 나타내질 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다.
용어 "자가"는 이후 개체에게 재도입될 예정인, 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "동종"은 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 2종 이상의 개체는 1개 이상의 유전자좌에서의 유전자가 동일하지 않을 때 서로 동종인 것으로 언급된다. 일부 측면에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종 물질은 항원과 상호작용하기에 유전적으로 충분히 다를 수 있다.
용어 "이종"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "분리반출술"은 공여자 또는 환자의 혈액을 공여자 또는 환자에서 제거하고, 선택된 특정한 구성성분(들)을 분리하는 장치를 통과시켜, 나머지를 예를 들어 재수혈에 의해 공여자 또는 환자의 순환으로 되돌리는 기술분야-인식 체외 방법을 지칭한다. 따라서, 문맥상 "분리반출술 샘플"은 분리반출술을 사용하여 수득된 샘플을 지칭한다.
용어 "조합물"은 하나의 투여 단위 형태의 고정 조합물, 또는 본 발명의 화합물과 조합 파트너 (예를 들어 하기 기재된 바와 같은 또 다른 약물, "치료제" 또는 "공동-작용제"로도 지칭됨)가 동시에 독립적으로, 또는 시간 간격 내에 개별적으로 (특히 이들 시간 간격이 조합 파트너가 협동 효과, 예를 들어 상승작용적 효과를 제시하도록 하는 경우) 투여될 수 있는 조합 투여를 지칭한다. 단일 성분은 키트 내에 또는 개별적으로 패키징될 수 있다. 성분 (예를 들어, 분말 또는 액체) 중 하나 또는 둘 다는 투여 전에 목적하는 용량으로 재구성되거나 희석될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "공-투여" 또는 "조합 투여" 등은 선택된 조합 파트너를 그를 필요로 하는 단일 대상체 (예를 들어 환자)에게 투여하는 것을 포괄하는 것으로 의도되고, 작용제들이 반드시 동일한 투여 경로에 의해 또는 동시에 투여되지는 않는 것인 치료 요법을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "제약 조합물"은, 1종 초과의 활성 성분의 혼합 또는 조합으로부터 생성된 생성물을 의미하고, 활성 성분의 고정 및 비-고정 조합물 둘 다를 포함한다. 용어 "고정 조합물"은 활성 성분, 예를 들어 본 발명의 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 단일 엔티티 또는 투여 형태로 환자에게 동시에 투여되는 것을 의미한다. 용어 "비-고정 조합물"은 활성 성분, 예를 들어 본 발명의 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 별개의 엔티티로서 동시에, 공동으로, 또는 특정 시간 제한을 두지 않고 순차적으로 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 여기서 이러한 투여는 환자의 신체에서 2종의 화합물을 치료 유효 수준으로 제공한다. 후자는 또한 칵테일 요법, 예를 들어 3종 이상의 활성 성분의 투여에 적용된다.
용어 "암"은 이상 세포의 신속 및 비제어 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암 세포는 국부로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 다양한 암의 예가 본원에 기재되어 있고, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 방법에 의해 치료되는 바람직한 암은 다발성 골수종, 호지킨 림프종 또는 비-호지킨 림프종을 포함한다.
용어 "종양" 및 "암"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 예를 들어 둘 다의 용어는 고형 및 액상, 예를 들어 미만성 또는 순환성 종양을 포괄한다. 본원에 사용된 용어 "암" 또는 "종양"은 전암성, 뿐만 아니라 악성 암 및 종양을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "로부터 유래된"은 제1 및 제2 분자 사이의 관계를 나타낸다. 이는 일반적으로 제1 분자 및 제2 분자 사이의 구조적 유사성을 지칭하고, 제2 분자로부터 유래된 제1 분자에 대해 방법 또는 공급원 제한을 내포하거나 포함하지 않는다. 예를 들어, CD3제타 분자로부터 유래된 세포내 신호전달 도메인의 경우에, 세포내 신호전달 도메인은 필요한 기능, 즉 적절한 조건 하에 신호를 생성하는 능력을 갖도록 충분한 CD3제타 구조를 보유한다. 이는 세포내 신호전달 도메인을 생성하는 특정한 방법에 대한 제한을 내포하거나 포함하지 않고, 예를 들어 세포내 신호전달 도메인을 제공하기 위해 반드시 CD3제타 서열로 출발하여, 원치않는 서열을 결실시키거나 또는 돌연변이를 부과하여 세포내 신호전달 도메인에 도달해야한다는 것을 의미하지 않는다.
어구 "BCMA의 발현과 연관된 질환"은 BCMA (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 BCMA)를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 BCMA (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 BCMA)를 발현하는 세포와 연관된 상태, 예컨대 예를 들어 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양 또는 전암성 상태, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병; 또는 BCMA (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 BCMA)를 발현하는 세포와 연관된 비-암 관련 적응증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 의심을 피하기 위해, BCMA의 발현과 연관된 질환은 예를 들어 BCMA를 표적화하는 분자, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA 억제제에 의한 처리로 인해 예를 들어 BCMA 발현이 하향조절되었지만 한때 BCMA를 발현한, 현재 BCMA를 발현하지 않는 세포와 연관된 상태를 포함할 수 있다. 한 측면에서, BCMA (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 BCMA)의 발현과 연관된 암은 혈액암이다. 한 측면에서, 혈액암은 백혈병 또는 림프종이다. 한 측면에서, BCMA (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 BCMA)의 발현과 연관된 암은 분화 형질 B 세포의 악성종양이다. 한 측면에서, BCMA (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 BCMA)의 발현과 연관된 암은 예를 들어, 예를 들어 B-세포 급성 림프성 백혈병 ("BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 급성 백혈병; 예를 들어 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 만성 백혈병을 포함하나 이에 제한되지는 않는 암 및 악성종양을 포함한다. BCMA (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 BCMA)의 발현과 연관된 추가의 암 또는 혈액 상태는 예를 들어, B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 상태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 형질모구성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 및 골수 혈액 세포의 비유효 생산 (또는 이형성증)과 연관된 혈액 상태의 다양한 집단인 "전백혈병" 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 암은 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 또는 교모세포종이다. 실시양태에서, BCMA의 발현과 연관된 질환은 형질 세포 증식성 장애, 예를 들어 무증상 골수종 (증상이 없는 다발성 골수종 또는 무통성 골수종), 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질세포종 (예를 들어, 형질 세포 이혼화증, 고립 골수종, 고립 형질세포종, 수질외 형질세포종, 및 다발성 형질세포종), 전신 아밀로이드 경쇄 아밀로이드증, 및 POEMS 증후군 (크로우-푸카세 증후군, 다카츠키병 및 PEP 증후군으로도 공지됨)을 포함한다. BCMA (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 BCMA)의 발현과 연관된 추가의 질환은, 예를 들어 BCMA (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 BCMA)의 발현과 연관된 비정형 및/또는 비-전형적 암, 악성종양, 전암성 상태 또는 증식성 질환, 예를 들어 본원에 기재된 암, 예를 들어 전립선암 (예를 들어, 거세-저항성 또는 요법-저항성 전립선암 또는 전이성 전립선암), 췌장암 또는 폐암을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
BCMA (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 BCMA)와 연관된 비-암 관련 상태는 바이러스 감염; 예를 들어, HIV, 진균 감염, 예를 들어, 씨. 네오포르만스(C. neoformans); 자가면역 질환; 예를 들어 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스 (SLE 또는 루푸스), 심상성 천포창 및 쇼그렌 증후군; 염증성 장 질환, 궤양성 결장염; 점막 면역과 관련된 이식-관련 동종특이적 면역 장애; 및 체액성 면역이 중요한 생물제제 (예를 들어, 인자 VIII)에 대한 원치 않는 면역 반응을 포함한다. 실시양태에서, BCMA의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증은 예를 들어 자가면역 질환, (예를 들어, 루푸스), 염증성 장애 (알레르기 및 천식) 및 이식을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 종양 항원-발현 세포는 종양 항원을 코딩하는 mRNA를 발현하거나 또는 임의의 시점에 발현하였다. 실시양태에서, 종양 항원-발현 세포는 종양 항원 단백질 (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체)을 생산하고, 종양 항원 단백질은 정상 수준 또는 감소된 수준으로 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 종양 항원-발현 세포는 한 시점에 검출가능한 수준의 종양 항원 단백질을 생산하였고, 후속해서 실질적으로 전혀 검출불가능한 종양 항원 단백질을 생산하였다.
용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특징에 유의한 영향을 미치거나 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 관련 기술분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체 또는 항체 단편 내에 도입될 수 있다. 보존적 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 관련 기술분야에서 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 CAR 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 CAR은 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 시험될 수 있다.
용어 "자극"은 자극 분자 (예를 들어, TCR/CD3 복합체)가 그의 동족 리간드와 결합하여 신호 전달 사건, 예컨대 비제한적으로 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달을 매개함으로써 유도되는 1차 반응을 지칭한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현, 예컨대 TGF-β의 하향조절 및/또는 세포골격 구조의 재조직화 등을 매개할 수 있다.
용어 "자극 분자"는 T 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 측면에 대한 자극 방식에서 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 T 세포에 의해 발현되는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, CAR 내의 ITAM-함유 도메인은 내인성 TCR 복합체의 1차 TCR의 신호전달을 독립적으로 재현한다.
한 측면에서, 1차 신호는 예를 들어 펩티드로 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 개시되고, 이것은 증식, 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 T 세포 반응의 매개로 이어진다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열 ("1차 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 본 발명에서 특히 유용한 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 ("ICOS"로도 공지됨), FcεRI 및 CD66d, DAP10, 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 특정 CAR에서, 본 발명의 임의의 1종 이상의 CAR 내의 세포내 신호전달 도메인은 세포내 신호전달 서열, 예를 들어 CD3-제타의 1차 신호전달 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 CAR에서, CD3-제타의 1차 신호전달 서열은 서열식별번호: 9로서 제공된 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다. 본 발명의 특정 CAR에서, CD3-제타의 1차 신호전달 서열은 서열식별번호: 10에 제공된 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 그의 표면 상에 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 복합체화된 외래 항원을 디스플레이하는 면역계 세포, 예컨대 보조 세포 (예를 들어, B-세포, 수지상 세포 등)를 지칭한다. T-세포는 그의 T-세포 수용체 (TCR)를 사용하여 이들 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 프로세싱하고, 이를 T-세포에 제시한다.
본원에 사용된 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 실시양태에서, 세포내 신호 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하고, 세포가 전문화된 기능을 수행하도록 지시한다. 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에서 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 말단절단된 부분이 사용되는 정도로, 이러한 말단절단된 부분은 이펙터 기능 신호를 전달하는 한 무손상 쇄 대신 사용될 수 있다. 용어 세포내 신호전달 도메인은 따라서 이펙터 기능 신호를 전달하는데 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 말단절단된 부분을 포함하는 것으로 의도된다.
세포내 신호전달 도메인은 CAR 함유 세포, 예를 들어 CART 세포의 면역 이펙터 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 예를 들어 CART 세포에서 면역 이펙터 기능의 예는 시토카인의 분비를 비롯하여 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 1차 세포내 신호전달 도메인은 1차 자극, 또는 항원 의존성 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 신호, 또는 항원 비의존성 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, CART의 경우에, 1차 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체의 세포질 서열을 포함할 수 있고, 공동자극 세포내 신호전달 도메인은 보조-수용체 또는 공동자극 분자로부터의 세포질 서열을 포함할 수 있다.
1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 ("ICOS"로도 공지됨), FcεRI, CD66d, DAP10 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타 쇄", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 진뱅크 수탁 번호 BAG36664.1로서 제공된 단백질 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로서 정의되고, "제타 자극 도메인" 또는 대안적으로 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화를 위해 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한 제타 쇄의 세포질 도메인으로부터의 아미노산 잔기로서 정의된다. 한 측면에서, 제타의 세포질 도메인은 진뱅크 수탁 번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164, 또는 그의 기능적 오르토로그인 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 포함한다. 한 측면에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열식별번호: 9로서 제공된 서열이다. 한 측면에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열식별번호: 10으로서 제공된 서열이다.
용어 "공동자극 분자"는 공동자극 리간드에 특이적으로 결합하여, T 세포에 의한 공동자극 반응, 예컨대 비제한적으로 증식을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극 분자는 효율적인 면역 반응에 필요한 항원 수용체 이외의 다른 세포 표면 분자 또는 그의 리간드이다. 공동자극 분자는 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
공동자극 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 부분을 지칭한다.
세포내 신호전달 도메인은 그것이 유래된 분자의 전체 세포내 부분, 또는 전체 천연 세포내 신호전달 도메인, 또는 그의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
용어 "4-1BB"는 진뱅크 수탁 번호 AAA62478.2로서 제공된 아미노산 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기를 갖는 TNFR 수퍼패밀리의 구성원을 지칭하고; "4-1BB 공동자극 도메인"은 진뱅크 수탁 번호 AAA62478.2의 아미노산 잔기 214-255, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기로서 정의된다. 한 측면에서, "4-1BB 공동자극 도메인"은 서열식별번호: 7로서 제공된 서열 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 동등한 잔기이다.
본원에 사용된 용어 "면역 이펙터 세포"는 면역 반응, 예를 들어 면역 이펙터 반응의 촉진에 관여하는 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포의 예는 T 세포, 예를 들어 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 자연 킬러 T (NKT) 세포, 비만 세포 및 골수-유래 식세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "면역 이펙터 기능 또는 면역 이펙터 반응"은, 예를 들어 표적 세포의 면역 공격을 증진시키거나 촉진하는 면역 이펙터 세포의 기능 또는 반응을 지칭한다. 예를 들어, 면역 이펙터 기능 또는 반응은 표적 세포의 사멸, 또는 성장 또는 증식의 억제를 촉진하는 T 또는 NK 세포의 특성을 지칭한다. T 세포의 경우에, 1차 자극 및 공동자극은 면역 이펙터 기능 또는 반응의 예이다.
용어 "이펙터 기능"은 세포의 전문화된 기능을 지칭한다. T 세포의 이펙터 기능은, 예를 들어 시토카인의 분비를 비롯하여 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다.
용어 "코딩하는"은 뉴클레오티드 (예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 규정된 서열 또는 아미노산의 규정된 서열 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 갖는, 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 기능하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA 내의 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA, 또는 RNA는 그러한 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산할 경우에 단백질을 코딩한다. 그의 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에서 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥 둘 다는 그러한 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 코딩하는 것으로서 지칭될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로 축중성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어구 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 본원에 기재된 바와 같이 특정한 생물학적 결과를 달성하는데 유효한 화합물, 제제, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터의, 또는 그 내부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템의 외부로부터 도입되거나 외부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "발현"은 프로모터에 의해 유도되는 특정한 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부에 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 친양쪽성 화합물과 회합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "전달 벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 핵산의 세포 내로의 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예컨대 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 추가로 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 전달 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "발현 벡터"는 발현시킬 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드이거나 또는 리포솜 내에 포함됨) 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 관련 기술분야에 공지된 모든 것을 포함한다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로비리다에(Retroviridae) 패밀리의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 특유한 것이고; 유의한 양의 유전자 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있고, 따라서 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV, 및 FIV가 렌티바이러스의 모든 예이다.
용어 "렌티바이러스 벡터"는 특히 문헌 [Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]에서 제공되는 바와 같은 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터를 비롯한, 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는, 예를 들어 옥스포드 바이오메디카(Oxford BioMedica)로부터의 렌티벡터(LENTIVECTOR)? 유전자 전달 기술, 렌티겐(Lentigen)으로부터의 렌티맥스(LENTIMAX)™ 벡터 시스템 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비임상 유형의 렌티바이러스 벡터가 또한 이용가능하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다.
용어 "상동성" 또는 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 2개의 핵산 분자, 예컨대, 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩티드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 분자 둘 다 내의 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유된 경우; 예를 들어, 각각의 2개의 DNA 분자 내의 위치가 아데닌에 의해 점유된 경우에, 이들은 그 위치에서 상동이거나 동일하다. 2개의 서열 사이의 상동성은 매칭되는 또는 상동성 위치의 수의 직접적인 함수이고; 예를 들어, 2개의 서열 내의 위치의 절반 (예를 들어, 중합체 10개 서브유닛 길이 내의 5개의 위치)이 상동성일 경우에, 2개의 서열은 50% 상동성이고; 90%의 위치 (예를 들어, 10개 중 9개)가 매칭되거나 상동성일 경우에, 2개의 서열은 90% 상동성이다.
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대개, 인간화 항체 및 그의 항체 단편은 수용자의 상보성-결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체/항체 단편은 수용자 항체에서도, 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도, 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 추가로 정밀화하고 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 그의 항체 단편은 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 그것에 상응하고, FR 영역의 모든 또는 유의한 부분은 인간 이뮤노글로불린 서열의 그것이다. 인간화 항체 또는 항체 단편은 또한 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 그것을 포함할 수 있다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992]을 참조한다.
"완전 인간"은 전체 분자가 인간 기원이거나 또는 항체 또는 이뮤노글로불린의 인간 형태와 동일한 아미노산 서열로 이루어진 이뮤노글로불린, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "단리된"은 천연 상태로부터 변경되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 천연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 통상적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 우리딘을 지칭한다.
용어 "작동가능하게 연결된" 또는 "전사 제어"는 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 후자의 발현을 야기한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 위치하는 경우에 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 서로 인접할 수 있고, 예를 들어 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우에, 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다.
용어 면역원성 조성물의 "비경구" 투여는, 예를 들어 피하 (s.c.), 정맥내 (i.v.), 근육내 (i.m.), 또는 흉골내 주사, 종양내, 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 및 그의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명확하게 나타낸 서열 뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환, 예를 들어 보존적 치환), 대립유전자, 오르토로그, SNP, 및 상보적 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환, 예를 들어 보존적 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하고, 단백질 또는 펩티드 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 존재하지 않는다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 상기 용어는 관련 기술분야에서 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 통상적으로 지칭되는 짧은 쇄, 및 많은 종류가 존재하는, 일반적으로 관련 기술분야에서 단백질로 지칭되는 더 긴 쇄 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 또는 그의 조합을 포함한다.
용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시하는데 필요한, 세포의 합성 기구 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다.
용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결된 유전자 산물의 발현을 위해 필요한 핵산 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 다른 예에서 이 서열은 또한 인핸서 서열, 및 유전자 산물의 발현을 위해 필요한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.
용어 "구성적" 프로모터는, 유전자 산물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우에 유전자 산물이 세포의 대부분의 또는 모든 생리학적 조건 하에 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "유도성" 프로모터는, 유전자 산물을 코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우에 실질적으로 프로모터에 상응하는 유도인자가 세포에 존재할 때에만 유전자 산물이 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "조직-특이적" 프로모터는, 유전자에 의해 코딩되거나 특정되는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 경우에 실질적으로 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 유전자 산물이 세포에서 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "암 연관 항원" 또는 "종양 항원"은 상호교환가능하게, 전체로 또는 단편 (예를 들어, MHC/펩티드)으로서 암 세포의 표면 상에서 발현되고 약리학적 작용제의 암 세포에 대한 우선적인 표적화에 유용한 분자 (전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 정상 세포 및 암 세포 둘 다에 의해 발현되는 마커, 예를 들어 계열 마커, 예를 들어 B 세포 상의 CD19이다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 정상 세포와 비교하여 암 세포에서 과다발현, 예를 들어 정상 세포와 비교하여 1-배 과다 발현, 2-배 과다 발현, 3-배 과다 발현 또는 그 초과로 과다발현되는 세포 표면 분자이다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 암 세포에서 부적절하게 합성된 세포 표면 분자, 예를 들어 정상 세포 상에서 발현되는 분자와 비교하여 결실, 부가 또는 돌연변이를 함유하는 분자이다. 일부 실시양태에서, 종양 항원은 전체로 또는 단편 (예를 들어, MHC/펩티드)으로서 암 세포의 세포 표면에서 독점적으로 발현되고 정상 세포의 표면에서는 합성되거나 발현되지 않을 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 MHC 제시 펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)을 포함하는 CAR을 포함한다. 정상적으로는, 내인성 단백질로부터 유래된 펩티드는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 부류 I 분자의 포켓을 채우고, CD8+ T 림프구 상의 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 인식된다. MHC 부류 I 복합체는 모든 유핵 세포에서 구성적으로 발현된다. 암에서, 바이러스-특이적 및/또는 종양-특이적 펩티드/MHC 복합체는 면역요법을 위한 세포 표면 표적의 고유한 부류를 제시한다. 인간 백혈구 항원 (HLA)-A1 또는 HLA-A2와 관련하여 바이러스 또는 종양 항원으로부터 유래된 TCR-유사 항체 표적화 펩티드가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100] 참조). 예를 들어, TCR-유사 항체는 라이브러리, 예컨대 인간 scFv 파지 디스플레이된 라이브러리의 스크리닝으로부터 확인될 수 있다.
용어 "종양-지지 항원" 또는 "암-지지 항원"은 상호교환가능하게, 그 자체가 암성은 아니지만, 예를 들어 암 세포의 성장 또는 생존, 예를 들어 면역 세포에 대한 저항성을 촉진함으로써 암 세포를 지지하는, 세포의 표면 상에서 발현된 분자 (전형적으로 단백질, 탄수화물 또는 지질)를 지칭한다. 이러한 유형의 예시적인 세포는 기질 세포 및 골수-유래 억제 세포 (MDSC)를 포함한다. 종양-지지 항원 그 자체는 항원이 암 세포를 지지하는 세포 상에서 제시되는 한 종양 세포를 지지하는 역할을 할 필요는 없다.
scFv와 관련하여 사용된 용어 "가요성 폴리펩티드 링커" 또는 "링커"는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께 연결하기 위해 단독으로 또는 조합되어 사용되는 아미노산, 예컨대 글리신 및/또는 세린 잔기로 이루어진 펩티드 링커를 지칭한다. 한 실시양태에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이고, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n (서열식별번호: 38)을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5 및 n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10이다. 한 실시양태에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 (Gly4 Ser)4 (서열식별번호: 27) 또는 (Gly4 Ser)3 (서열식별번호: 28)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 실시양태에서, 링커는 (Gly2Ser), (GlySer) 또는 (Gly3Ser) (서열식별번호: 29)의 다중 반복부를 포함한다. 또한, 본원에 참조로 포함되는 WO2012/138475에 기재된 링커가 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본원에 사용된 5' 캡 (RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡으로도 불림)은 전사 개시 직후에 진핵 메신저 RNA의 "전면" 또는 5' 말단에 부가된 변형된 구아닌 뉴클레오티드이다. 5' 캡은 제1 전사되는 뉴클레오티드에 연결된 말단 기로 이루어진다. 그의 존재는 리보솜에 의한 인식 및 RNase로부터의 보호를 위해 중요하다. 캡 부가는 전사와 커플링되고, 각각 서로 영향을 미치도록 공동-전사 방식으로 발생한다. 전사 개시 직후에, 합성 중인 mRNA의 5' 말단은 RNA 폴리머라제와 회합된 캡-합성 복합체에 의해 결합된다. 이러한 효소 복합체는 mRNA 캡핑에 필요한 화학 반응을 촉매한다. 합성은 다단계 생화학적 반응으로서 진행된다. 캡핑 모이어티는 mRNA의 기능성, 예컨대 그의 안정성 또는 번역 효율을 조정하도록 변형될 수 있다.
본원에 사용된 "시험관내 전사된 RNA"는 시험관내에서 합성된 RNA, 바람직하게는 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 시험관내 전사된 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 생성된다. 시험관내 전사 벡터는 시험관내 전사된 RNA를 생성하기 위해 사용되는 주형을 포함한다.
본원에 사용된 "폴리(A)"는 폴리아데닐화에 의해 mRNA에 부착된 일련의 아데노신이다. 일시적 발현을 위한 구축물의 바람직한 실시양태에서, 폴리A는 50 내지 5000개 (서열식별번호: 30), 바람직하게는 64개 초과, 보다 바람직하게는 100개 초과, 가장 바람직하게는 300 또는 400개 초과이다. 폴리(A) 서열은 mRNA 기능성, 예컨대 국재화, 안정성 또는 번역 효율을 조정하기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 "폴리아데닐화"는 폴리아데닐릴 모이어티, 또는 그의 변형된 변이체의 메신저 RNA 분자에 대한 공유 연결을 지칭한다. 진핵 유기체 내에서, 대부분의 메신저 RNA (mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화된다. 3' 폴리(A) 테일은 효소, 폴리아데닐레이트 폴리머라제의 작용을 통해 프리-mRNA에 부가된 아데닌 뉴클레오티드 (종종 수백 개)의 긴 서열이다. 고등 진핵생물에서, 폴리(A) 테일은 특정 서열, 폴리아데닐화 신호를 함유하는 전사체 상에 부가된다. 폴리(A) 테일 및 그에 결합된 단백질은 mRNA를 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호하는 것을 돕는다. 폴리아데닐화는 또한 전사 종결, mRNA의 핵으로부터의 유출, 및 번역에 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA의 RNA로의 전사 직후에 핵에서 일어나지만, 추가로 세포질에서 추후 일어날 수도 있다. 전사가 종결된 후에, mRNA 쇄는 RNA 폴리머라제와 연관된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용을 통해 절단된다. 절단 부위는 통상적으로 절단 부위 근처의 염기 서열 AAUAAA의 존재를 특징으로 한다. mRNA가 절단된 후에, 아데노신 잔기는 절단 부위의 자유 3' 말단에 부가된다.
본원에 사용된 "일시적"은 수시간, 수일 또는 수주의 기간 동안의 비-통합된 트랜스진의 발현을 지칭하고, 여기서 발현 기간은 게놈 내로 통합되거나 숙주 세포 내의 안정한 플라스미드 레플리콘 내에 함유된 경우에 유전자의 발현을 위한 시간 미만이다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 1종 이상의 요법 (예를 들어, 1종 이상의 치료제, 예컨대 본 발명의 CAR)의 투여로부터 생성된 증식성 장애의 진행, 중증도 및/또는 지속기간의 감소 또는 호전, 또는 증식성 장애의 1종 이상의 증상 (바람직하게는, 1종 이상의 식별식별가능한 증상)의 호전을 지칭한다. 구체적 실시양태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 환자에 의해 반드시 식별가능하지 않을 수 있는 증식성 장애의 적어도 하나의 측정가능한 물리적 파라미터, 예컨대 종양의 성장의 호전을 지칭한다. 다른 실시양태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은, 예를 들어 식별가능한 증상의 안정화에 의해 물리적으로, 예를 들어 물리적 파라미터의 안정화에 의해 생리학적으로, 또는 둘 다로의 증식성 장애의 진행의 억제를 지칭한다. 다른 실시양태에서, 용어 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"은 종양 크기 또는 암성 세포 카운트의 감소 또는 안정화를 지칭한다.
용어 "신호 전달 경로"는 신호를 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로의 전달에서 소정의 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 어구 "세포 표면 수용체"는 신호를 수신하고 세포막을 가로질러 신호를 전달할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 도출될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유동물, 인간)를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "실질적으로 정제된" 세포는 다른 세포 유형이 본질적으로 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 그의 자연 발생 상태에서 정상적으로 회합되어 있는 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 다른 경우에, 이 용어는 단순히 그의 천연 상태에서 자연적으로 회합되어 있는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 측면에서, 세포는 시험관내에서 배양된다. 다른 측면에서, 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 치료법을 의미한다. 치료 효과는 질환 상태의 감소, 억제, 완화, 또는 근절에 의해 수득된다.
본원에 사용된 용어 "예방"은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적 치료를 의미한다.
본 발명의 문맥에서, "종양 항원" 또는 "과다증식성 장애 항원" 또는 "과다증식성 장애와 연관된 항원"은 특정 과다증식성 장애에 공통적인 항원을 지칭한다. 특정 측면에서, 본 발명의 과다증식성 장애 항원은 원발성 또는 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암 및 선암종, 예컨대 유방암, 전립선암 (예를 들어, 거세-저항성 또는 요법-저항성 전립선암 또는 전이성 전립선암), 난소암, 췌장암 등, 또는 형질 세포 증식성 장애, 예를 들어 무증상 골수종 (증상이 없는 다발성 골수종 또는 무통성 골수종), 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질세포종 (예를 들어, 형질 세포 이혼화증, 고립 골수종, 고립 형질세포종, 수질외 형질세포종, 및 다발성 형질세포종), 전신 아밀로이드 경쇄 아밀로이드증, 및 POEMS 증후군 (크로우-푸카세 증후군, 다카츠키병 및 PEP 증후군으로도 공지됨)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 암으로부터 유래된다.
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염된, 형질전환된 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 1차 대상체 세포 및 그의 자손을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합한다"는 샘플 내에 존재하는 동족 결합 파트너 (예를 들어, T 세포 상에 제시된 자극 및/또는 공동자극 분자) 단백질을 인식하고 결합하지만 샘플 내의 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체 또는 리간드를 지칭한다.
본원에 사용된 "조절성 키메라 항원 수용체 (RCAR)"는 면역 이펙터 세포에서의 경우에 세포에게 표적 세포, 전형적으로 암 세포에 대한 특이성 및 세포내 신호 생성을 제공하는, 가장 단순한 실시양태에서 전형적으로 2개의, 폴리펩티드의 세트를 지칭한다. 일부 실시양태에서, RCAR은 적어도 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 CAR 분자와 관련하여 본원에 정의된 바와 같은 자극 분자 및/또는 공동자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인 (본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, RCAR에서 폴리펩티드의 세트는 서로 인접해있지 않고, 예를 들어 상이한 폴리펩티드 쇄 내에 있다. 일부 실시양태에서, RCAR은 이량체화 분자의 존재 시 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다. 일부 실시양태에서, RCAR은 본원에 기재된 바와 같은 세포 (예를 들어, 면역 이펙터 세포), 예를 들어 RCAR-발현 세포 (본원에서 "RCARX 세포"로도 지칭됨)에서 발현된다. 한 실시양태에서 RCARX 세포는 T 세포이고, RCART 세포로 지칭된다. 한 실시양태에서, RCARX 세포는 NK 세포이고, RCARN 세포로 지칭된다. RCAR은 RCAR-발현 세포에게 표적 세포, 전형적으로 암 세포에 대한 특이성, 및 조절성 세포내 신호 생성 또는 증식을 제공할 수 있고, 이는 RCAR-발현 세포의 면역 이펙터 특성을 최적화할 수 있다. 실시양태에서, RCAR 세포는 적어도 부분적으로는, 항원 결합 도메인에 의해 결합된 항원을 포함하는 표적 세포에 대한 특이성을 제공하기 위해 항원 결합 도메인에 의존한다.
본원에 사용된 용어 "막 앵커" 또는 "막 테더링 도메인"은 세포외 또는 세포내 도메인을 형질 막에 고정시키기에 충분한 폴리펩티드 또는 모이어티, 예를 들어 미리스토일 기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "스위치 도메인"은, 예를 들어 RCAR을 언급하는 경우에, 이량체화 분자의 존재 하에 또 다른 스위치 도메인과 회합하는 엔티티, 전형적으로 폴리펩티드-기반 엔티티를 지칭한다. 회합은 제1 스위치 도메인에 연결된, 예를 들어 그에 융합된 제1 엔티티, 및 제2 스위치 도메인에 연결된, 예를 들어 그에 융합된 제2 엔티티의 기능적 커플링을 생성한다. 제1 및 제2 스위치 도메인은 집합적으로 이량체화 스위치로서 지칭된다. 실시양태에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 서로 동일하고, 예를 들어 이들은 동일한 1차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 집합적으로 동종이량체화 스위치로 지칭된다. 실시양태에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 서로 상이하고, 예를 들어 이들은 상이한 1차 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 집합적으로 이종이량체화 스위치로 지칭된다. 실시양태에서, 스위치는 세포내 존재한다. 실시양태에서, 스위치는 세포외 존재한다. 실시양태에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드-기반 엔티티, 예를 들어 FKBP 또는 FRB-기반 엔티티이고, 이량체화 분자는 소분자, 예를 들어 라파로그이다. 실시양태에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드-기반 엔티티, 예를 들어 myc 펩티드에 결합하는 scFv이고, 이량체화 분자는 폴리펩티드, 그의 단편, 또는 폴리펩티드의 다량체, 예를 들어 myc 리간드 또는 1개 이상의 myc scFv에 결합하는 myc 리간드의 다량체이다. 실시양태에서, 스위치 도메인은 폴리펩티드-기반 엔티티, 예를 들어 myc 수용체이고, 이량체화 분자는 항체 또는 그의 단편, 예를 들어 myc 항체이다.
본원에 사용된 용어 "이량체화 분자"는, 예를 들어 RCAR을 언급하는 경우에, 제1 스위치 도메인과 제2 스위치 도메인의 회합을 촉진하는 분자를 지칭한다. 실시양태에서, 이량체화 분자는 대상체에서 자연 발생되지 않거나, 또는 유의한 이량체화를 야기할 농도로 발생되지 않는다. 실시양태에서, 이량체화 분자는 소분자, 예를 들어 라파마이신 또는 라파로그, 예를 들어 RAD001이다.
용어 "생물학적 등가"는 참조 용량 또는 참조량의 참조 화합물 (예를 들어, RAD001)에 의해 생성된 효과와 동등한 효과를 생성하는데 요구되는 참조 화합물 (예를 들어, RAD001) 이외의 작용제의 양을 지칭한다. 한 실시양태에서, 효과는 예를 들어 P70 S6 키나제 억제에 의해 측정된 바와 같은, 예를 들어 생체내 또는 시험관내 검정에서 평가된 바와 같은, 예를 들어 본원에 기재된 검정, 예를 들어 불레이(Boulay) 검정에 의해 측정된 바와 같은 mTOR 억제 수준, 또는 웨스턴 블롯에 의한 인산화 S6 수준의 측정이다. 한 실시양태에서, 효과는 세포 분류에 의해 측정된 바와 같은 PD-1 양성/PD-1 음성 T 세포의 비의 변경이다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제의 생물학적 등가 양 또는 용량은 참조 용량 또는 참조량의 참조 화합물과 동일한 수준의 P70 S6 키나제 억제를 달성하는 양 또는 용량이다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제의 생물학적 등가 양 또는 용량은 참조 용량 또는 참조량의 참조 화합물과 동일한 수준의 PD-1 양성/PD-1 음성 T 세포의 비의 변경을 달성하는 양 또는 용량이다.
용어 "낮은, 면역 증진 용량"이 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 RAD001 또는 라파마이신, 또는 촉매 mTOR 억제제와 함께 사용된 경우에, 이는 예를 들어 P70 S6 키나제 활성의 억제에 의해 측정된 바와 같이 부분적이지만 전적이지는 않게 mTOR 활성을 억제하는 mTOR 억제제의 용량을 지칭한다. 예를 들어, P70 S6 키나제의 억제에 의해 mTOR 활성을 평가하는 방법이 본원에서 논의된다. 용량은 완전 면역 억제를 발생시키는데는 불충분하지만, 면역 반응을 증진시키는데 충분하다. 한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제는 PD-1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 개수의 감소 및/또는 PD-1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 개수의 증가, 또는 PD-1 음성 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)/PD-1 양성 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 비의 증가를 발생시킨다.
한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제는 나이브 T 세포의 개수의 증가를 발생시킨다. 한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제는 하기:
예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 하기 마커: CD62L고, CD127고, CD27+, 및 BCL2 중 1개 이상의 발현의 증가;
예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 KLRG1의 발현의 감소; 및
기억 T 세포 전구체, 예를 들어 하기 특징 중 어느 하나 또는 그의 조합을 갖는 세포의 개수의 증가: 증가된 CD62L고, 증가된 CD127고, 증가된 CD27+, 감소된 KLRG1, 및 증가된 BCL2
중 1종 이상을 발생시키며, 여기서 임의의 상기 기재된 변화는, 예를 들어 비-처리 대상체와 비교하여, 예를 들어 적어도 일시적으로 발생한다.
본원에 사용된 "불응성"은 치료에 반응하지 않는 질환, 예를 들어 암을 지칭한다. 실시양태에서, 불응성 암은 치료의 시작 전 또는 시작 시 치료에 저항성일 수 있다. 다른 실시양태에서, 불응성 암은 치료 동안 저항성이 될 수 있다. 불응성 암은 또한 저항성 암으로도 불린다.
본원에 사용된 "재발성" 또는 "재발"은 개선 또는 반응의 기간 후, 예를 들어 요법, 예를 들어 암 요법의 선행 치료 후 질환 (예를 들어, 암) 또는 질환, 예컨대 암의 징후 및 증상의 재출현을 지칭한다. 예를 들어, 반응의 기간은 특정 역치 미만, 예를 들어 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만으로 떨어진 암 세포의 수준을 수반할 수 있다. 재출현은 특정 역치 초과, 예를 들어 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 초과로 상승한 암 세포의 수준을 수반할 수 있다.
범위: 본 개시내용에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면은 범위 포맷으로 제시될 수 있다. 범위 포맷의 기재는 단지 편의 및 간결함을 위한 것임을 이해하여야 하고, 본 발명의 범주에 대한 불변의 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위의 기재는 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 그러한 범위 내의 개별 수치 값을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 범위, 예컨대 1 내지 6의 기재는 구체적으로 개시된 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 그러한 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 또 다른 예로서, 95-99% 동일성과 같은 범위는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 것을 포함하고, 하위범위, 예컨대 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% 및 98-99% 동일성을 포함한다. 이것은 범위의 폭에 상관없이 적용된다.
설명
BCMA 키메라 항원 수용체 (CAR), 예를 들어 CART-BCMA를 발현하는 세포를 사용하는 질환, 예컨대 암의 치료를 위한 물질의 조성물 및 사용 방법이 본원에 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 BCMA 단백질에 대한 증진된 결합을 위해 조작된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 수많은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 CAR을 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)를 제공하고, 여기서 CAR T 세포 ("CART") 또는 CAR NK 세포는 항종양 특성을 나타낸다. 한 측면에서, 세포는 CAR로 형질전환되고, CAR은 세포 표면 상에 발현된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 CAR을 코딩하는 바이러스 벡터로 형질도입된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 이러한 실시양태에서, 세포는 CAR을 안정하게 발현할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포 (예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 CAR을 코딩하는 핵산, 예를 들어 mRNA, cDNA, DNA로 형질감염된다. 일부 이러한 실시양태에서, 세포는 CAR을 일시적으로 발현할 수 있다.
한 측면에서, CAR의 항-BCMA 항원 결합 부분은 scFv 항체 단편이다. 한 측면에서, 이러한 항체 단편은 동등한 결합 친화도를 보유한다는 점에서, 예를 들어 그것이 유래된 IgG 항체와 대등한 효능으로 동일한 항원에 결합한다는 점에서 기능적이다. 다른 실시양태에서, 항체 단편은 더 낮은 결합 친화도를 갖고, 예를 들어 이는 그것이 유래된 항체보다 더 낮은 결합 친화도로 동일한 항원에 결합하지만, 그것이 본원에 기재된 생물학적 반응을 제공한다는 점에서 기능적이다. 한 실시양태에서, CAR 분자는 표적 항원에 대해 10-4 M 내지 10-8 M, 예를 들어 10-5 M 내지 10-7 M, 예를 들어 10-6 M 또는 10-7 M의 결합 친화도 KD를 갖는 항체 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 참조 항체, 예를 들어 본원에 기재된 항체보다 적어도 5-배, 10-배, 20-배, 30-배, 50-배, 100-배 또는 1,000-배 더 낮은 결합 친화도를 갖는다.
한 측면에서, 이러한 항체 단편은 통상의 기술자가 이해할 바와 같이 면역 반응의 활성화, 그의 표적 항원으로부터 신호-전달 발생의 억제, 키나제 활성의 억제 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 생물학적 반응을 제공한다는 점에서 기능적이다. 한 측면에서, CAR의 항-BCMA 항원 결합 도메인은 그것이 유래된 뮤린 scFv 서열과 비교하여 인간화된 scFv 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 항원 결합 도메인은 인간 항-BCMA 항원 결합 도메인이다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 항원 결합 도메인은 인간화 항-BCMA 항원 결합 도메인이다.
일부 측면에서, 본 발명의 항체는 키메라 항원 수용체 (CAR) 내로 혼입된다. 한 측면에서, CAR은 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 263, 서열식별번호: 264, 서열식별번호: 265, 또는 서열식별번호: 266의 서열을 포함하는 BCMA 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, scFv 도메인은 인간 도메인이다. 또 다른 측면에서, scFv 도메인은 인간 BCMA에 특이적으로 결합하는 뮤린 기원의 항체 또는 scFv 단편을 개시한 PCT 공개 번호 WO 2012/163805, 미국 특허 번호 7,083,785, EP 특허 번호 1975231B1, 또는 PCT 공개 번호 WO 13/154760 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 항체 또는 항체 단편의 scFv 도메인의 인간화 변이체이다. 이들 마우스 항체 및/또는 scFv의 인간화는 마우스-특이적 잔기가 CART-BCMA 처리, 예를 들어 항-BCMA CAR 구축물로 형질도입된 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포에 의한 처리를 받은 환자에서 인간-항-마우스 항원 (HAMA) 반응을 유도할 수 있는 임상 세팅의 경우에 바람직할 수 있다.
한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 인간 또는 인간화 scFv, 본 발명의 CAR의 부분은 그의 서열이 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 트랜스진에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 본 발명의 전체 CAR 구축물은 그의 전체 서열이 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 트랜스진에 의해 코딩된다. 코돈 최적화는 코딩 DNA 내의 동의 코돈 (즉, 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈)의 발생 빈도가 상이한 종에서 편향된다는 발견을 지칭한다. 이러한 코돈 축중성은 동일한 폴리펩티드가 다양한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있도록 한다. 다양한 코돈 최적화 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 적어도 미국 특허 번호 5,786,464 및 6,114,148에 개시된 방법을 포함한다.
한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 39에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 40에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 41에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 42에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 43에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 44에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 45에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 46에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 47에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 48에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 49에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 50에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 51에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 52에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 53에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 129에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 130에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 131에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 132에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 133에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 134에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 135에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 136에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 137에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 138에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 139에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 140에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 141에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 142에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 143에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 144에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 145에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 146에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 147에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 148에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 149에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 255에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 257에 제공된 scFv 부분을 포함한다.
한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 263에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 264에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 265에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 266에 제공된 scFv 부분을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 CAR은 특정 항체의 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 분자와 조합한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 세포내 신호전달 분자는 CD3-제타 쇄, 4-1BB 및 CD28 신호전달 모듈 및 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 BCMA에 결합한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 102, 서열식별번호: 103, 서열식별번호: 104, 서열식별번호: 105, 서열식별번호: 106, 서열식별번호: 107, 서열식별번호: 108, 서열식별번호: 109, 서열식별번호: 110, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 216, 서열식별번호: 217, 서열식별번호: 218, 서열식별번호: 219, 서열식별번호: 220, 서열식별번호: 221, 서열식별번호: 222, 서열식별번호: 223, 서열식별번호: 224, 서열식별번호: 225, 서열식별번호: 226, 서열식별번호: 227, 서열식별번호: 228, 서열식별번호: 229, 서열식별번호: 230, 서열식별번호: 231, 서열식별번호: 232, 및 서열식별번호: 233 중 1개 이상에 제공된 서열로부터 선택된 CAR을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 99에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 100에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 101에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 102에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 103에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 104에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 105에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 106에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 107에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 108에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 109에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 110에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 111에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 112에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 213에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 214에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 215에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 216에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 217에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 218에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 219에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 220에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 221에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 222에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 223에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 224에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 225에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 226에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 227에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 228에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 229에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 230에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 231에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 232에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, BCMA CAR은 서열식별번호: 233에 제공된 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 BCMA CAR 조성물, 및 다른 질환 중에서, BCMA를 발현하는 세포 또는 조직을 수반하는 암 또는 임의의 악성종양 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 의약 또는 방법에서의 그의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명의 CAR은 BCMA-발현 정상 세포를 근절시키기 위해 사용될 수 있고, 이에 의해 세포 이식 전에 세포 조건화 요법으로서 사용하기 위해 적용가능할 수 있다. 한 측면에서, BCMA-발현 정상 세포는 BCMA-발현 정상 줄기 세포이고, 세포 이식은 줄기 세포 이식이다.
한 측면에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 제공하며, 여기서 CAR T 세포 ("CART") 또는 CAR NK 세포는 항종양 특성을 나타낸다. 바람직한 항원은 BCMA이다. 한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 인간 항-BCMA 항체 단편 또는 부분적 인간화 항-BCMA 항체 단편을 포함한다. 한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 인간 항-BCMA 항체 단편 또는 scFv를 포함하는 부분적 인간화 항-BCMA 항체 단편을 포함한다. 따라서, 본 발명은 인간화 항-BCMA 결합 도메인을 포함하고 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포 내로 조작된 BCMA-CAR, 및 입양 요법을 위한 그의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, BCMA-CAR은 CD137 (4-1BB) 신호전달 도메인, CD28 신호전달 도메인, CD3제타 신호 도메인, 및 그의 임의의 조합의 군으로부터 선택된 적어도 1개의 세포내 도메인을 포함한다. 한 측면에서, BCMA-CAR은 CD137 (4-1BB) 또는 CD28 이외의 1개 이상의 공동자극 분자(들)로부터의 적어도 1개의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
키메라 항원 수용체 (CAR)
본 발명은 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 인간 또는 인간화 BCMA 결합 도메인), 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR (예를 들어, CAR 폴리펩티드)을 제공하며, 여기서 상기 항-BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 항-BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함한다. CAR의 항-BCMA 결합 도메인은 추가로 표 1 또는 16에 열거된 임의의 항-BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3)을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 예를 들어 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 인간 또는 인간화 BCMA 결합 도메인), 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 코딩하는, 본원에 기재된 바와 같은 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 상기 항-BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 항-BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR의 코딩된 항-BCMA 결합 도메인은 추가로 표 1 또는 16에 열거된 임의의 항-BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3)을 포함할 수 있다.
구체적 측면에서, 본 발명의 CAR 구축물은 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 263, 서열식별번호: 264, 서열식별번호: 265, 및 서열식별번호: 266으로 이루어진 군으로부터 선택된 scFv 도메인을 포함하며, 여기서 scFv는 서열식별번호: 1에 제공된 바와 같은 임의적인 리더 서열이 선행하고, 이어서 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5에 제공된 바와 같은 임의적인 힌지 서열, 서열식별번호: 6에 제공된 바와 같은 막횡단 영역, 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8을 포함하는 세포내 신호전달 도메인 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10을 포함하는 CD3 제타 서열이 뒤따를 수 있으며, 여기서 도메인은 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하여 단일 융합 단백질을 형성한다. 또한, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 263, 서열식별번호: 264, 서열식별번호: 265, 및 서열식별번호: 266으로 이루어진 군으로부터 선택된 각각의 scFv 단편의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 포함된다.
또한, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 263, 서열식별번호: 264, 서열식별번호: 265, 및 서열식별번호: 266으로 이루어진 군으로부터 선택된 각각의 scFv 단편 및 서열식별번호: 1, 2, 및 6-9의 각각의 도메인의 폴리펩티드, 플러스 본 발명의 코딩된 BCMA CAR 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 포함된다.
한 측면에서, 예시적인 BCMA CAR 구축물은 임의적인 리더 서열, 세포외 항원 결합 도메인, 힌지, 막횡단 도메인, 및 세포내 자극 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 예시적인 BCMA CAR 구축물은 임의적인 리더 서열, 세포외 항원 결합 도메인, 힌지, 막횡단 도메인, 세포내 공동자극 도메인 및 세포내 자극 도메인을 포함한다. 본 발명의 인간 scFv 도메인을 함유하는 특정 BCMA CAR 구축물은 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 및 서열식별번호: 149로서 제공된다. 전장 CAR 서열은 또한 표 1에 제시된 바와 같이, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 및 서열식별번호: 149로서 본원에 제공된다.
예시적인 리더 서열은 서열식별번호: 1로서 제공된다. 예시적인 힌지/스페이서 서열은 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5로서 제공된다. 예시적인 막횡단 도메인 서열은 서열식별번호: 6으로서 제공된다. 4-1BB 단백질의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열식별번호: 7로서 제공된다. CD27의 세포내 신호전달 도메인의 예시적인 서열은 서열식별번호: 8로서 제공된다. 예시적인 CD3제타 도메인 서열은 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10으로서 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포괄하며, 여기서 핵산 분자는 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는, 예를 들어 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 56, 서열식별번호: 57, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 60, 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 62, 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 64, 서열식별번호: 65, 서열식별번호: 66, 서열식별번호: 67, 서열식별번호: 68, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155, 서열식별번호: 156, 서열식별번호: 157, 서열식별번호: 158, 서열식별번호: 159, 서열식별번호: 160, 서열식별번호: 161, 서열식별번호: 162, 서열식별번호: 163, 서열식별번호: 164, 서열식별번호: 165, 서열식별번호: 166, 서열식별번호: 167, 서열식별번호: 168, 서열식별번호: 169, 및 서열식별번호: 170 중 1개 이상으로부터 선택된다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 54를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 55를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 56를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 57를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 58를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 59를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 60를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 61를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 62를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 63를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 64를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 65를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 66를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 67를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 68를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 150를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 151를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 152를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 153를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 154를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 155를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 156를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 157를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 158를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 159를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 160를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 161를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 162를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 163를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 164를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 165를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 166를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 167를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 168를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 169를 포함한다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 170를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포괄하며, 여기서 핵산 분자는 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 56, 서열식별번호: 57, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 60, 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 62, 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 64, 서열식별번호: 65, 서열식별번호: 66, 서열식별번호: 67, 서열식별번호: 68, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155, 서열식별번호: 156, 서열식별번호: 157, 서열식별번호: 158, 서열식별번호: 159, 서열식별번호: 160, 서열식별번호: 161, 서열식별번호: 162, 서열식별번호: 163, 서열식별번호: 164, 서열식별번호: 165, 서열식별번호: 166, 서열식별번호: 167, 서열식별번호: 168, 서열식별번호: 169, 및 서열식별번호: 170 중 1개 이상으로부터 선택된 항-BCMA 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 예를 들어 여기서 서열은 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. CAR에 사용될 수 있는 예시적인 세포내 신호전달 도메인은, 예를 들어 CD3-제타, CD28, 4-1BB 등의 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, CAR은 CD3-제타, CD28, 4-1BB 등의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 115, 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 118, 서열식별번호: 119, 서열식별번호: 120, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 122, 서열식별번호: 123, 서열식별번호: 124, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 126, 서열식별번호: 127, 서열식별번호: 128, 서열식별번호: 234, 서열식별번호: 235, 서열식별번호: 236, 서열식별번호: 237, 서열식별번호: 238, 서열식별번호: 239, 서열식별번호: 240, 서열식별번호: 241, 서열식별번호: 242, 서열식별번호: 243, 서열식별번호: 244, 서열식별번호: 245, 서열식별번호: 246, 서열식별번호: 247, 서열식별번호: 248, 서열식별번호: 249, 서열식별번호: 250, 서열식별번호: 251, 서열식별번호: 252, 서열식별번호: 253, 또는 서열식별번호: 254 중 1개 이상으로부터 선택된다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 114이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 115이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 116이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 117이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 118이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 119이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 120이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 121이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 122이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 123이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 124이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 125이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 126이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 127이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 128이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 234이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 235이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 236이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 237이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 238이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 239이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 240이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 241이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 242이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 243이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 244이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 245이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 246이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 247이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 248이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 249이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 250이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 251이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 252이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 253이다. 한 측면에서 CAR 구축물의 핵산 서열은 서열식별번호: 254이다.
목적하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 관련 기술분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득할 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산은 클로닝하기 보다는 합성적으로 생산할 수 있다.
본 발명은 세포 내로 직접 형질도입될 수 있는 CAR을 발현하는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 구축물을 포함한다.
본 발명은 또한 세포 내로 직접 형질감염될 수 있는 RNA 구축물을 포함한다. 형질감염에 사용하기 위한 mRNA를 생성하는 방법은 특수하게 설계된 프라이머를 사용한 주형의 시험관내 전사 (IVT)에 이은 폴리A 첨가를 수반하며, 이는 3' 및 5' 비번역 서열 ("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 발현시킬 핵산, 및 폴리A 테일을 함유하는, 전형적으로 50-2000개 염기 길이의 구축물 (서열식별번호: 35)을 생산한다. 이와 같이 생산된 RNA는 상이한 유형의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 주형은 CAR에 대한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, RNA CAR 벡터는 전기천공에 의해 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포 내로 형질도입된다.
항원 결합 도메인
본 발명의 CAR은 표적-특이적 결합 도메인을 포함한다. 모이어티의 선택은 표적 세포의 표면을 규정하는 리간드의 유형 및 수에 따라 달라진다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 특정한 질환 상태와 연관된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 항원을 인식하도록 선택될 수 있다.
한 측면에서, CAR-매개 T-세포 반응은 목적하는 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 CAR 내로 조작하는 방식에 의해 관심 항원으로 지시될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 CAR은 BCMA에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명의 CAR은 인간 BCMA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다.
항원 결합 도메인은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 및 단일-도메인 항체, 예컨대 중쇄 가변 도메인 (VH), 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 낙타류 유래 나노바디의 가변 도메인 (VHH)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 그의 기능적 단편, 및 항원 결합 도메인으로 기능하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 대안적 스캐폴드, 예컨대 재조합 피브로넥틴 도메인 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 항원에 결합하는 임의의 단백질일 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 도메인은, CAR이 궁극적으로 사용될 종과 동일한 종으로부터 유래되는 것이 유익하다. 예를 들어, 인간에서 사용하기 위해, CAR의 항원 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인에 대한 인간 또는 인간화 잔기를 포함하는 것이 유익할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간 또는 인간화 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 인간 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및/또는 본원에 기재된 인간 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간 항-BCMA 결합 도메인은 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 인간 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간 항-BCMA 결합 도메인은 각각이 본원에 기재된 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 2개의 가변 중쇄 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 1에서의) 인간 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 표 1에서의) 인간 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 1에서의) 인간 중쇄 가변 영역, 예를 들어 본원에 기재된 (예를 들어, 표 1에서의) 적어도 2개의 인간 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 표 1의 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 1에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 11의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 1에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 1의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 및 서열식별번호: 149로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 56, 서열식별번호: 57, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 60, 서열식별번호: 61, 서열식별번호: 62, 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 64, 서열식별번호: 65, 서열식별번호: 66, 서열식별번호: 67, 서열식별번호: 68, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155, 서열식별번호: 156, 서열식별번호: 157, 서열식별번호: 158, 서열식별번호: 159, 서열식별번호: 160, 서열식별번호: 161, 서열식별번호: 162, 서열식별번호: 163, 서열식별번호: 164, 서열식별번호: 165, 서열식별번호: 166, 서열식별번호: 167, 서열식별번호: 168, 서열식별번호: 169, 및 서열식별번호: 170으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통해 본원, 예를 들어 표 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4 (서열식별번호: 26)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역으로 존재할 수 있다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인 부분은 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 및 서열식별번호: 149로부터 선택된 1개 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서 CAR은 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 102, 서열식별번호: 103, 서열식별번호: 104, 서열식별번호: 105, 서열식별번호: 106, 서열식별번호: 107, 서열식별번호: 108, 서열식별번호: 109, 서열식별번호: 110, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 216, 서열식별번호: 217, 서열식별번호: 218, 서열식별번호: 219, 서열식별번호: 220, 서열식별번호: 221, 서열식별번호: 222, 서열식별번호: 223, 서열식별번호: 224, 서열식별번호: 225, 서열식별번호: 226, 서열식별번호: 227, 서열식별번호: 228, 서열식별번호: 229, 서열식별번호: 230, 서열식별번호: 231, 서열식별번호: 232, 및 서열식별번호: 233으로부터 선택된 1개 이상의 서열로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 표 16에서의) 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 표 16에서의) 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 259, 서열식별번호: 260, 서열식별번호: 261, 서열식별번호: 262에 제공된 경쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 255, 서열식별번호: 256, 서열식별번호: 257, 서열식별번호: 258에 제공된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인은 표 16의 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 한 실시양태에서, 인간 또는 인간화 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 서열식별번호: 259, 서열식별번호: 260, 서열식별번호: 261, 서열식별번호: 262에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 서열식별번호: 255, 서열식별번호: 256, 서열식별번호: 257, 서열식별번호: 258에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4 (서열식별번호: 26)이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 임의의 하기 배향: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역일 수 있다.
한 실시양태에서, 인간 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 263, 서열식별번호: 264, 서열식별번호: 265, 및 서열식별번호: 266로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 비-인간 항체는 인간화되고, 항체의 특정 서열 또는 영역은 인간에서 자연적으로 생산되는 항체 또는 그의 단편에 대한 유사성을 증가시키도록 변형된다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간화된다.
인간화 항체는 CDR-그라프팅 (예를 들어, 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 유럽 특허 번호 EP 239,400; 국제 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 5,225,539, 5,530,101, 및 5,585,089 참조), 베니어링 또는 재표면화 (예를 들어, 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 유럽 특허 번호 EP 592,106 및 EP 519,596; 문헌 [Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; 및 Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973] 참조), 쇄 셔플링 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,565,332 참조), 및 예를 들어 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0042664, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0048617, 미국 특허 번호 6,407,213, 미국 특허 번호 5,766,886, 국제 공개 번호 WO 9317105, 문헌 [Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), 및 Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)]에 개시된 기술을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 종종, 프레임워크 영역 내의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경하기 위해, 예를 들어 개선시키기 위해 CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환, 예를 들어 보존적 치환은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정한 위치에서 비통상적인 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다. (예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,585,089 (Queen et al.); 및 문헌 [Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323] 참조).
인간화 항체 또는 항체 단편은 비인간인 공급원으로부터의 것에 남아있는 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로 지칭되고, 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 유래된다. 본원에 제공된 바와 같이, 인간화 항체 또는 항체 단편은 비인간 이뮤노글로불린 분자로부터의 1개 이상의 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하며, 여기서 프레임워크를 포함하는 아미노산 잔기는 완전히 또는 대부분 인간 배선으로부터 유래된다. 항체 또는 항체 단편의 인간화를 위한 다수의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써, 즉 CDR-그라프팅 (EP 239,400; PCT 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 4,816,567; 6,331,415; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 6,548,640, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 의해 본질적으로 윈터(Winter)와 그의 동료들의 방법에 따라 수행될 수 있다 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)). 이러한 인간화 항체 및 항체 단편에서, 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 부분이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 바 있다. 인간화 항체는 종종 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 (FR) 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다. 항체 및 항체 단편의 인간화는 또한 베니어링 또는 재표면화 (EP 592,106; EP 519,596; 문헌 [Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); 및 Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)]) 또는 쇄 셔플링 (미국 특허 번호 5,565,332)에 의해 달성될 수 있고, 상기 참고문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
인간화 항체의 제조에 사용될 경쇄 및 중쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시킨다. 소위 "최적-피트" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 이어서, 설치류의 것과 가장 가까운 인간 서열이 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크 (FR)로서 수용된다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)], 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크가 여러 개의 상이한 인간화 항체에 대해 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역, 예를 들어 모든 4개의 프레임워크 영역은 VH4_4-59 배선 서열로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 프레임워크 영역은 예를 들어 상응하는 뮤린 서열에서의 아미노산으로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형, 예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역, 예를 들어 모든 4개의 프레임워크 영역은 VK3_1.25 배선 서열로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 프레임워크 영역은 예를 들어 상응하는 뮤린 서열에서의 아미노산으로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형, 예를 들어 치환, 예를 들어 보존적 치환을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR 조성물의 부분은 표적 항원에 대한 고친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 보유하면서 인간화된다. 본 발명의 한 측면에 따르면, 인간화 항체 및 항체 단편은 모 및 인간화 서열의 3-차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3-차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3-차원 입체형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 예를 들어 후보 이뮤노글로불린이 표적 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 목적하는 항체 또는 항체 단편 특징, 예컨대 표적 항원에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 수용자 및 유입 서열로부터 선택 및 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다.
인간화 항체 또는 항체 단편은 원래의 항체와 유사한 항원 특이성, 예를 들어 본 발명에서 인간 BCMA에 결합하는 능력을 보유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항체 단편은 인간 BCMA에 대한 개선된 친화도 및/또는 결합 특이성을 가질 수 있다.
한 실시양태에서, CAR의 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 인간화 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3), 및/또는 본원에 기재된 인간화 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 LC CDR 및 1개 이상, 예를 들어 모든 3개의 HC CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 인간화 항-BCMA 결합 도메인의 1개 이상 (예를 들어, 모든 3개)의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 각각이 본원에 기재된 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 2개의 가변 중쇄 영역을 갖는다. 한 실시양태에서, 인간화 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 (예를 들어, 서열식별번호: 255 또는 257) 인간화 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 (예를 들어, 서열식별번호: 255 또는 257) 인간 중쇄 가변 영역을 포함한다.
한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편의 특정한 기능적 특색 또는 특성을 특징으로 한다. 예를 들어, 한 측면에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 CAR 조성물의 부분은 인간 BCMA에 특이적으로 결합한다.
한 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간 BCMA에 대해 마우스 BCMA와 동일하거나 유사한 결합 특이성을 갖는다. 한 측면에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항원 결합 도메인에 관한 것이며, 여기서 항체 결합 도메인은 BCMA 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하고, 여기서 항체 또는 항체 단편은 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 또는 서열식별번호: 149의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄를 포함한다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 또는 서열식별번호: 149로부터 선택된 scFv의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 측면에서, scFv는 리더 서열과 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재한다. 한 측면에서, 리더 서열은 서열식별번호: 1로서 제공된 폴리펩티드 서열이다.
한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 단편, 예를 들어 단일 쇄 가변 단편 (scFv)이다. 한 측면에서, 항-BCMA 결합 도메인은 Fv, Fab, (Fab')2, 또는 이중-기능적 (예를 들어, 이중-특이적) 하이브리드 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)]). 한 측면에서, 본 발명의 항체 및 그의 단편은 야생형 또는 증진된 친화도로 BCMA 단백질에 결합한다.
일부 경우에, scFv는 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-426 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). scFv 분자는 가요성 폴리펩티드 링커를 사용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생산될 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 링커 (예를 들어, Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv의 가변 영역이 폴딩하고 상호작용하는 방식에 크게 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 짧은 폴리펩티드 링커가 사용되면 (예를 들어, 5-10개 아미노산), 쇄내 폴딩이 방지된다. 쇄간 폴딩은 또한 2개의 가변 영역을 함께 모아 기능적 에피토프 결합 부위를 형성하기 위해 필요하다. 링커 배향 및 크기의 예에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448], 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, 및 PCT 공개 번호 WO2006/020258 및 WO2007/024715를 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
scFv는 그의 VL 및 VH 영역 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개, 또는 그 초과의 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열은 임의의 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 반복부의 세트, 예컨대 (Gly4Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다 (서열식별번호: 25). 한 실시양태에서, 링커는 (Gly4Ser)4 (서열식별번호: 27) 또는 (Gly4Ser)3 (서열식별번호: 28)일 수 있다. 링커 길이의 변동은 활성을 유지 또는 증진시켜 활성 연구에서 우월한 효능을 유도할 수 있다.
예시적인 인간 BCMA CAR 구축물 및 항원 결합 도메인
본원에 개시된 예시적인 BCMA CAR 구축물은 임의로 임의적인 리더 서열 (예를 들어, 각각 예시적인 리더 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 대해 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 12)이 선행하는 scFv (예를 들어, 표 1 또는 16에 개시된 바와 같은 scFv)를 포함한다. scFv 단편의 서열 (서열식별번호: 39-53, 129-149, 또는 263-266, 임의적인 리더 서열 포함하지 않음)이 본원의 표 1 또는 16에 제공된다. BCMA CAR 구축물은 추가로 임의적인 힌지 도메인, 예를 들어 CD8 힌지 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 13의 핵산 서열에 의해 코딩됨); 막횡단 도메인, 예를 들어 CD8 막횡단 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드에 의해 코딩됨); 세포내 도메인, 예를 들어 4-1BB 세포내 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드에 의해 코딩됨); 및 기능적 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 20 또는 21의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 도메인은 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하여 단일 융합 단백질을 형성한다. 다른 실시양태에서, 도메인은 별개의 폴리펩티드로, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 RCAR 분자로 존재한다.
특정 실시양태에서, 전장 BCMA CAR 분자는 표 1 또는 16에 제공된 BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, 또는 C13F12.1의 아미노산 서열 또는 그와 실질적으로 (예를 들어, 95-99%) 동일한 서열을 포함하거나, 그의 뉴클레오티드 서열 또는 그와 실질적으로 (예를 들어, 95-99%) 동일한 서열에 의해 코딩된다.
특정 실시양태에서, BCMA CAR 분자 또는 항-BCMA 항원 결합 도메인은 표 1 또는 16에 제공된 (리더 서열의 존재 또는 부재 하의) BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, 또는 C13F12.1의 scFv 아미노산 서열, 또는 임의의 상기 언급된 서열에 대해 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 95-99% 동일, 또는 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 변화, 예를 들어 치환 (예를 들어, 보존적 치환))을 포함한다.
특정 실시양태에서, BCMA CAR 분자 또는 항-BCMA 항원 결합 도메인은 표 1 또는 16에 제공된 BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, 또는 C13F12.1의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역, 또는 임의의 상기 언급된 서열에 대해 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 95-99% 동일, 또는 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 변화, 예를 들어 치환 (예를 들어, 보존적 치환))을 포함한다.
특정 실시양태에서, BCMA CAR 분자 또는 항-BCMA 항원 결합 도메인은 표 20에 제공된 중쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3); 및/또는 표 21에 제공된 BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, 또는 C13F12.1의 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3); 또는 임의의 상기 언급된 서열에 대해 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 95-99% 동일, 또는 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 변화, 예를 들어 치환 (예를 들어, 보존적 치환))을 포함한다.
특정 실시양태에서, BCMA CAR 분자 또는 항-BCMA 항원 결합 도메인은 표 22에 제공된 중쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3); 및/또는 표 23에 제공된 BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, 또는 C13F12.1의 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3); 또는 임의의 상기 언급된 서열에 대해 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 95-99% 동일, 또는 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 변화, 예를 들어 치환 (예를 들어, 보존적 치환))을 포함한다.
특정 실시양태에서, BCMA CAR 분자 또는 항-BCMA 항원 결합 도메인은 표 24에 제공된 중쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, HCDR1, HCDR2 및/또는 HCDR3); 및/또는 표 25에 제공된 BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, 149362, 149363, 149364, 149365, 149366, 149367, 149368, 149369, BCMA_EBB-C1978-A4, BCMA_EBB-C1978-G1, BCMA_EBB-C1979-C1, BCMA_EBB-C1978-C7, BCMA_EBB-C1978-D10, BCMA_EBB-C1979-C12, BCMA_EBB-C1980-G4, BCMA_EBB-C1980-D2, BCMA_EBB-C1978-A10, BCMA_EBB-C1978-D4, BCMA_EBB-C1980-A2, BCMA_EBB-C1981-C3, BCMA_EBB-C1978-G4, A7D12.2, C11D5.3, C12A3.2, 또는 C13F12.1의 경쇄 가변 영역으로부터의 1, 2 또는 3개의 CDR (예를 들어, LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3); 또는 임의의 상기 언급된 서열에 대해 실질적으로 동일한 서열 (예를 들어, 95-99% 동일, 또는 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 변화, 예를 들어 치환 (예를 들어, 보존적 치환))을 포함한다.
scFv 도메인의 인간 CDR 서열의 서열은 중쇄 가변 도메인에 대해 표 20, 22, 및 24에 및 경쇄 가변 도메인에 대해 표 21, 23, 및 25에 제시된다. "ID"는 각각의 CDR에 대한 각각의 서열식별번호를 의미한다.
<표 20> 카바트 넘버링 스킴 (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)에 따른 중쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
<표 21> 카바트 넘버링 스킴 (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)에 따른 경쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00004
Figure pct00005
<표 22> 코티아 넘버링 스킴 (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948)에 따른 중쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00006
Figure pct00007
<표 23> 코티아 넘버링 스킴 (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948)에 따른 경쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00008
Figure pct00009
<표 24> 카바트 넘버링 스킴 (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) 및 코티아 넘버링 스킴 (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948)의 조합에 따른 중쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00010
Figure pct00011
<표 25> 카바트 넘버링 스킴 ((Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) 및 코티아 넘버링 스킴 (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948)의 조합에 따른 경쇄 가변 도메인 CDR
Figure pct00012
Figure pct00013
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 분자 (예를 들어, CAR 핵산 또는 CAR 폴리펩티드) 또는 BCMA 결합 도메인은
(1) 하기 중 1개로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 경쇄 (LC) CDR:
(i) BCMA-4 CAR (139103)의 서열식별번호: 504의 LC CDR1, 서열식별번호: 544의 LC CDR2 및 서열식별번호: 584의 LC CDR3;
(ii) BCMA-10 CAR (139109)의 서열식별번호: 514의 LC CDR1, 서열식별번호: 554의 LC CDR2 및 서열식별번호: 594의 LC CDR3;
(iii) BCMA-13 CAR (139112)의 서열식별번호: 516의 LC CDR1, 서열식별번호: 556의 LC CDR2 및 서열식별번호: 596의 LC CDR3; 또는
(iv) BCMA-15 CAR (139114)의 서열식별번호: 518의 LC CDR1, 서열식별번호: 558의 LC CDR2 및 서열식별번호: 598의 LC CDR3, 및/또는
(2) 하기 중 1개로부터의 1, 2, 또는 3개의 중쇄 (HC) CDR:
(i) BCMA-4 CAR (139103)의 서열식별번호: 384의 HC CDR1, 서열식별번호: 424의 HC CDR2 및 서열식별번호: 464의 HC CDR3;
(ii) BCMA-10 CAR (139109)의 서열식별번호: 394의 HC CDR1, 서열식별번호: 434의 HC CDR2 및 서열식별번호: 474의 HC CDR3;
(iii) BCMA-13 CAR (139112)의 서열식별번호: 396의 HC CDR1, 서열식별번호: 436의 HC CDR2 및 서열식별번호: 476의 HC CDR3; 또는
(iv) BCMA-15 (139114)의 서열식별번호: 398의 HC CDR1, 서열식별번호: 438의 HC CDR2 및 서열식별번호: 478의 HC CDR3
을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 분자 (예를 들어, CAR 핵산 또는 CAR 폴리펩티드)는
(1) 하기 중 1개로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 경쇄 (LC) CDR:
(i) BCMA-4 CAR (139103)의 서열식별번호: 744의 LC CDR1, 서열식별번호: 784의 LC CDR2 및 서열식별번호: 824의 LC CDR3;
(ii) BCMA-10 CAR (139109)의 서열식별번호: 754의 LC CDR1, 서열식별번호: 794의 LC CDR2 및 서열식별번호: 834의 LC CDR3;
(iii) BCMA-13 CAR (139112)의 서열식별번호: 756의 LC CDR1, 서열식별번호: 796의 LC CDR2 및 서열식별번호: 836의 LC CDR3; 또는
(iv) BCMA-15 CAR (139114)의 서열식별번호: 758의 LC CDR1, 서열식별번호: 798의 LC CDR2 및 서열식별번호: 838의 LC CDR3; 및/또는
(2) 하기 중 1개로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 중쇄 (HC) CDR:
(i) BCMA-4 CAR (139103)의 서열식별번호: 624의 HC CDR1, 서열식별번호: 664의 HC CDR2 및 서열식별번호: 704의 HC CDR3;
(ii) BCMA-10 CAR (139109)의 서열식별번호: 634의 HC CDR1, 서열식별번호: 674의 HC CDR2 및 서열식별번호: 714의 HC CDR3;
(iii) BCMA-13 CAR (139112)의 서열식별번호: 636의 HC CDR1, 서열식별번호: 676의 HC CDR2 및 서열식별번호: 716의 HC CDR3; 또는
(iv) BCMA-15 CAR (139114)의 서열식별번호: 638의 HC CDR1, 서열식별번호: 678의 HC CDR2 및 서열식별번호: 718의 HC CDR3
을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 분자 (예를 들어, CAR 핵산 또는 CAR 폴리펩티드)는
(1) 하기 중 1개로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 경쇄 (LC) CDR:
(i) BCMA-4 CAR (139103)의 서열식별번호: 984의 LC CDR1 서열식별번호: 1024의 LC CDR2 및 서열식별번호: 1064의 LC CDR3;
(ii) BCMA-10 CAR (139109)의 서열식별번호: 994의 LC CDR1, 서열식별번호: 1034의 LC CDR2 및 서열식별번호: 1074의 LC CDR3;
(iii) BCMA-13 CAR (139112)의 서열식별번호: 996의 LC CDR1, 서열식별번호: 1036의 LC CDR2 및 서열식별번호: 1076의 LC CDR3; 또는
(iv) BCMA-15 CAR (139114)의 서열식별번호: 998의 LC CDR1, 서열식별번호: 1038의 LC CDR2 및 서열식별번호: 1078의 LC CDR3; 및/또는
(2) 하기 중 1개로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 중쇄 (HC) CDR:
(i) BCMA-4 CAR (139103)의 서열식별번호: 864의 HC CDR1, 서열식별번호: 904의 HC CDR2 및 서열식별번호: 944의 HC CDR3;
(ii) BCMA-10 CAR (139109)의 서열식별번호: 874의 HC CDR1, 서열식별번호: 914의 HC CDR2 및 서열식별번호: 954의 HC CDR3;
(iii) BCMA-13 CAR (139112)의 서열식별번호: 876의 HC CDR1, 서열식별번호: 916의 HC CDR2 및 서열식별번호: 956의 HC CDR3;
(iv) BCMA-15 CAR (139114)의 서열식별번호: 878의 HC CDR1, 서열식별번호: 918의 HC CDR2 및 서열식별번호: 958의 HC CDR3
을 포함한다.
실시양태에서, 항-BCMA CAR 구축물, 예를 들어 인간 또는 인간화 항-BCMA CAR 구축물은, 예를 들어 실시예 4에 기재된 바와 같은 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된다. 예시적인 항-BCMA scFv는 BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, 및 BCMA-15를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 인간 항-BCMA scFv 단편의 서열 (서열식별번호: 39-52)이 표 1에 제공된다 (그리고 명칭 지정은 표 2에 제공됨).
실시양태에서, 전장 BCMA CAR 구축물 (예를 들어, 서열식별번호: 99-113)은 scFv 단편, 예를 들어 인간 scFv 단편 (예를 들어, 서열식별번호: 39-52)을 하기 제시된 것과 같은 추가의 서열과 조합하여 사용하여 생성된다.
리더 서열이 없는 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 12의 뉴클레오티드 서열이 없는) 본원, 예를 들어 표 1 및 16 또는 서열식별번호: 39-53, 129-149, 263-266, 271 또는 273에 기재된 scFv 단편이 본 발명에 포괄됨을 주목한다. 다른 실시양태에서, 리더 서열이 있는 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 12의 뉴클레오티드 서열이 없는) 본원, 예를 들어 표 1 및 16 또는 서열식별번호: 39-53, 129-149, 263-266, 271 또는 273에 기재된 scFv 단편이 또한 본 발명에 포괄된다.
리더 (아미노산 서열) (서열식별번호: 1)
Figure pct00014
리더 (핵산 서열) (서열식별번호: 12)
Figure pct00015
CD8 힌지 (아미노산 서열) (서열식별번호: 2)
Figure pct00016
CD8 힌지 (핵산 서열) (서열식별번호: 13)
Figure pct00017
CD8 막횡단 (아미노산 서열) (서열식별번호: 6)
Figure pct00018
CD8 막횡단 (핵산 서열) (서열식별번호: 17)
Figure pct00019
4-1BB 세포내 도메인 (아미노산 서열) (서열식별번호: 7)
Figure pct00020
4-1BB 세포내 도메인 (핵산 서열) (서열식별번호: 18)
Figure pct00021
CD28 세포내 도메인 (아미노산 서열) (서열식별번호: 1104)
Figure pct00022
CD28 세포내 도메인 (뉴클레오티드 서열) (서열식별번호: 1105)
Figure pct00023
ICOS 세포내 도메인 (아미노산 서열) (서열식별번호: 1106)
Figure pct00024
ICOS 세포내 도메인 (뉴클레오티드 서열) (서열식별번호: 1107)
Figure pct00025
CD3 제타 도메인 (아미노산 서열) (서열식별번호: 9)
Figure pct00026
CD3 제타 (핵산 서열) (서열식별번호: 20)
Figure pct00027
CD3 제타 도메인 (아미노산 서열; NCBI 참조 서열 NM_000734.3) (서열식별번호: 10)
Figure pct00028
CD3 제타 (핵산 서열; NCBI 참조 서열 NM_000734.3); (서열식별번호: 21)
Figure pct00029
IgG4 힌지 (아미노산 서열) (서열식별번호: 36)
Figure pct00030
IgG4 힌지 (뉴클레오티드 서열) (서열식별번호: 37)
Figure pct00031
실시양태에서, CAR scFv 단편은 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝되어 단일 코딩 프레임 내에서, 발현을 위한 프로모터, 예를 들어 EF1 알파 프로모터 (서열식별번호: 11)를 사용하여 전장 CAR 구축물을 생성한다.
EF1 알파 프로모터
Figure pct00032
Gly/Ser (서열식별번호: 25)
Figure pct00033
Gly/Ser (서열식별번호: 26): 이 서열은 1-6개의 "Gly Gly Gly Gly Ser" 반복 단위를 포괄할 수 있다
Figure pct00034
Gly/Ser (서열식별번호: 27)
Figure pct00035
Gly/Ser (서열식별번호: 28)
Figure pct00036
Gly/Ser (서열식별번호: 29)
Figure pct00037
폴리A: (A)5000 (서열식별번호: 30)
폴리A: (T)100 (서열식별번호: 31)
폴리A: (T)5000 (서열식별번호: 32)
폴리A: (A)5000 (서열식별번호: 33)
폴리A: (A)400 (서열식별번호: 34)
폴리A: (A)2000 (서열식별번호: 35)
Gly/Ser (서열식별번호: 38): 이 서열은 1-10개의 "Gly Gly Gly Ser" 반복 단위를 포괄할 수 있다
Figure pct00038
예시적인 BCMA scFv 도메인 및 예시적인 BCMA CAR 분자의 아미노산 및 핵산 서열이 표 1에 제공된다.
하기 표 2는 또한 표 1에 열거된 DNA ID 번호와 관련하여 BCMA CAR 구축물에 대한 별칭을 지정한다.
<표 2> CAR 구축물 ID
Figure pct00039
<표 1> 예시적인 항-BCMA scFv 도메인 및 BCMA CAR 분자의 아미노산 및 핵산 서열
각각의 scFv에 대한 아미노산 서열 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열이 또한 제공된다. 표 2는 여러 BCMA CAR에 대한 명칭 및 CAR 구축물 ID를 열거한다.
Figure pct00040
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Figure pct00083
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Figure pct00085
실시양태에서, 추가의 예시적인 BCMA CAR 구축물이, 예를 들어 실시예 2 및 3에 기재된 pBCMA3 및 pBCMA4 CAR로부터의 결과에 기초하여 PCT 공개 WO2012/0163805 (그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)로부터의 VH 및 VL 서열을 사용하여 생성된다. 예시적인 BCMA 구축물 (BCMA-3NP 및 BCMA-4NP)의 개략도가 도 10a에 제시된다. 2개의 구축물은 VH 및 VL 쇄의 배향에서 상이하다 (도 10b). 예시적인 BCMA CAR 구축물 및 그의 상응하는 DNA ID를 하기 표 3에 제시한다.
<표 3> 도구 CAR 구축물 ID
Figure pct00086
실시양태에서, 표 16에서 확인되는 VH 및 VL 서열을 사용하여 추가의 예시적인 BCMA CAR 구축물이 또한 생성될 수 있다. VH 및 VL 도메인 및 링커 서열을 포함하는 예시적인 scFv 도메인, 및 전장 CAR의 아미노산 서열이 또한 표 16에서 확인된다.
<표 16> 추가의 예시적인 BCMA CAR 서열
Figure pct00087
Figure pct00088
실시양태에서, VH가 VL을 선행하는 예시적인 인간화 항-BCMA scFv (H2L, 예를 들어, pBCMA 2 및 pBCMA 4)의 핵산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00089
Vh가 VL을 선행하는 예시적인 인간화 항-BCMA scFv (H2L, 예를 들어, pBCMA 2 및 pBCMA 4)에 대한 상응하는 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00090
실시양태에서, VL이 VH를 선행하는 예시적인 인간화 항-BCMA scFv (L2H, 예를 들어, pBCMA1 및 pBCMA3)의 핵산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00091
VL이 VH를 선행하는 예시적인 인간화 항-BCMA scFv (L2H, 예를 들어, pBCMA1 및 pBCMA3)의 상응하는 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00092
CAR scFv 단편은 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝되어 단일 코딩 프레임 내에서, 발현을 위한 EF1 알파 프로모터 (서열식별번호: 11)를 사용하여 전장 CAR 구축물을 생성할 수 있다.
CAR 구축물은 하기 서열: GGGGS (서열식별번호: 25); 1-6개의 "Gly Gly Gly Gly Ser" 반복 단위를 포괄하는 것, 예를 들어 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (서열식별번호: 26); GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (서열식별번호: 27); GGGGSGGGGS GGGGS (서열식별번호: 28); GGGS (서열식별번호: 29); 또는 1-10개의 "Gly Gly Gly Ser" 반복 단위를 포괄하는 것, 예를 들어 GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS (서열식별번호: 38) 중 1개 이상을 갖는 Gly/Ser 링커를 포함할 수 있다. 실시양태에서, CAR 구축물은 폴리 A 서열, 예를 들어 50-5000개 또는 100-5000개의 아데닌을 포괄하는 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34 또는 서열식별번호: 35), 또는 50-5000개의 티민을 포괄하는 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32)을 포함한다. 대안적으로, CAR 구축물은 예를 들어 서열 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열식별번호: 1108)를 포함하는 링커를 포함할 수 있다.
이중특이적 CAR
한 실시양태에서, 다중특이적 항체 분자는 이중특이적 항체 분자이다. 이중특이적 항체는 2개 이하의 항원에 대해 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 단백질 (또는 다랑체 단백질의 서브유닛) 상에 존재한다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩된다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩되지 않는다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 항원, 예를 들어 상이한 단백질 (또는 다랑체 단백질의 상이한 서브유닛) 상에 존재한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 그의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 절반 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 그의 단편, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 그의 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 분자는 다중-특이적 (예를 들어, 이중특이적 또는 삼중특이적) 항체 분자이다. 이중특이적 또는 이종이량체 항체 분자를 생성하기 위한 프로토콜은 관련 기술분야에 공지되어 있고; 예를 들어 US 5731168에 기재된 "노브 인 홀" 접근법; 예를 들어 WO 09/089004, WO 06/106905 및 WO 2010/129304에 기재된 정전기적 스티어링 Fc 쌍형성; 예를 들어 WO 07/110205에 기재된 바와 같은 가닥 교환 조작된 도메인 (SEED) 이종이량체 형성; 예를 들어 WO 08/119353, WO 2011/131746, 및 WO 2013/060867에 기재된 바와 같은 Fab 아암 교환; 예를 들어 US 4433059에 기재된 바와 같은, 아민-반응성 기 및 술프히드릴 반응성 기를 갖는 이종이관능성 시약을 사용하여 이중특이적 구조를 생성하는 항체 가교에 의한 이중 항체 접합체; 예를 들어 US 4444878에 기재된 바와 같은, 2개의 중쇄 사이의 디술피드 결합의 환원 및 산화 주기를 통해 상이한 항체로부터 절반 항체 (중쇄-경쇄 쌍 또는 Fab)를 재조합시킴으로써 생성된 이중특이적 항체 결정기; 삼관능성 항체, 예를 들어 US5273743에 기재된 바와 같은, 예를 들어 술프히드릴 반응성 기를 통해 가교된 3개의 Fab' 단편; 생합성 결합 단백질, 예를 들어 US5534254에 기재된 바와 같은, 예를 들어 C-말단 꼬리를 통해, 바람직하게는 디술피드 또는 아민-반응성 화학적 가교를 통해 가교된 scFv의 쌍; 이중기능적 항체, 예를 들어 US5582996에 기재된 바와 같은, 예를 들어 불변 도메인을 대체한 류신 지퍼 (예를 들어, c-fos 및 c-jun)를 통해 이량체화된 상이한 결합 특이성을 갖는 Fab 단편; 이중특이적 및 올리고특이적 1가- 및 올리고가 수용체, 예를 들어 US5591828에 기재된 바와 같은, 예를 들어 한 항체의 CH1 영역과 전형적으로 경쇄와 회합된 다른 항체의 VH 영역 사이에 폴리펩티드 스페이서를 통해 연결된 2개의 항체 (2개의 Fab 단편)의 VH-CH1 영역; 이중특이적 DNA-항체 접합체, 예를 들어 US5635602에 기재된 바와 같은, 예를 들어 DNA의 이중 가닥 조각을 통한 항체 또는 Fab 단편의 가교; 이중특이적 융합 단백질, 예를 들어 US5637481에 기재된 바와 같은, 예를 들어 2개의 scFv를, 이들과 전체 불변 영역 사이의 친수성 나선 펩티드 링커와 함께 함유하는 발현 구축물; 다가 및 다중특이적 결합 단백질, 예를 들어 US5837242에 기재된 바와 같은, 예를 들어 일반적으로 디아바디로 불리는, Ig 중쇄 가변 영역의 결합 영역을 갖는 제1 도메인, 및 Ig 경쇄 가변 영역의 결합 영역을 갖는 제2 도메인을 갖는 폴리펩티드의 이량체 (이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적 분자를 생성하는 보다 고차원의 구조가 또한 포괄됨); 예를 들어 US5837821에 기재된 바와 같은, 연결된 VL 및 VH 쇄가, 이량체화되어 이중특이적/다가 분자를 형성할 수 있는 항체 힌지 영역 및 CH3 영역에 펩티드 스페이서에 의해 추가로 연결된, 미니바디 구축물; 예를 들어 US5844094에 기재된 바와 같은, 이중특이적 디아바디를 형성하기 위한 이량체, 삼량체 및 사량체를 형성할 수 있는, 짧은 펩티드 링커 (예를 들어, 5 또는 10개 아미노산)를 사용하거나 또는 링커가 전혀 없이 어느 하나의 배향으로 연결된 VH 및 VL 도메인; 예를 들어 US5864019에 기재된 바와 같은, 일련의 FV (또는 scFv)를 형성하기 위해 VL 도메인과 추가로 회합된, C-말단에서 가교가능한 기에 의해 펩티드 연결에 의해 연결된 VH 도메인 (또는 패밀리 구성원 내의 VL 도메인)의 스트링; 및 예를 들어 US5869620에 기재된 바와 같은, scFV 또는 디아바디 유형 포맷 둘 다를 사용하여, 예를 들어 동종2가, 이종2가, 3가 및 4가 구조를 형성하기 위해 비-공유 또는 화학적 가교를 통해 다가 구조로 조합된, 펩티드 링커를 통해 연결된 VH 및 VL 도메인 둘 다를 갖는 단일 쇄 결합 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 추가의 예시적인 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 그의 제조 방법은, 예를 들어 US5910573, US5932448, US5959083, US5989830, US6005079, US6239259, US6294353, US6333396, US6476198, US6511663, US6670453, US6743896, US6809185, US6833441, US7129330, US7183076, US7521056, US7527787, US7534866, US7612181, US2002004587A1, US2002076406A1, US2002103345A1, US2003207346A1, US2003211078A1, US2004219643A1, US2004220388A1, US2004242847A1, US2005003403A1, US2005004352A1, US2005069552A1, US2005079170A1, US2005100543A1, US2005136049A1, US2005136051A1, US2005163782A1, US2005266425A1, US2006083747A1, US2006120960A1, US2006204493A1, US2006263367A1, US2007004909A1, US2007087381A1, US2007128150A1, US2007141049A1, US2007154901A1, US2007274985A1, US2008050370A1, US2008069820A1, US2008152645A1, US2008171855A1, US2008241884A1, US2008254512A1, US2008260738A1, US2009130106A1, US2009148905A1, US2009155275A1, US2009162359A1, US2009162360A1, US2009175851A1, US2009175867A1, US2009232811A1, US2009234105A1, US2009263392A1, US2009274649A1, EP346087A2, WO0006605A2, WO02072635A2, WO04081051A1, WO06020258A2, WO2007044887A2, WO2007095338A2, WO2007137760A2, WO2008119353A1, WO2009021754A2, WO2009068630A1, WO9103493A1, WO9323537A1, WO9409131A1, WO9412625A2, WO9509917A1, WO9637621A2, WO9964460A1에서 발견된다. 상기 참조된 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
이중특이적 항체 분자의 각각의 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv) 내에서, VH는 VL의 상류 또는 하류일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상류 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv)은 그의 VL (VL1)의 상류의 그의 VH (VH1)와 배열되고, 하류 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv)은 그의 VH (VH2)의 상류의 그의 VL (VL2)과 함께 배열되어, 전체적인 이중특이적 항체 분자는 배열 VH1-VL1-VL2-VH2를 갖는다. 다른 실시양태에서, 상류 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv)은 그의 VH (VH1)의 상류의 그의 VL (VL1)과 배열되고, 하류 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv)은 그의 VL (VL2)의 상류의 그의 VH (VH2)와 배열되어, 전체적인 이중특이적 항체 분자는 배열 VL1-VH1-VH2-VL2를 갖는다. 임의로, 링커는 2개의 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv) 사이, 예를 들어 구축물이 VH1-VL1-VL2-VH2로 배열된 경우에 VL1과 VL2 사이, 또는 구축물이 VL1-VH1-VH2-VL2로 배열된 경우에 VH1과 VH2 사이에 배치된다. 링커는 본원에 기재된 바와 같은 링커일 수 있고, 예를 들어 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 4 (서열식별번호: 26)이다. 일반적으로, 2개의 scFv 사이의 링커는 2개의 scFv의 도메인 사이의 쌍형성오류를 피하기 위해 충분히 길어야 한다. 임의로, 링커는 제1 scFv의 VL과 VH 사이에 배치된다. 임의로, 링커는 제2 scFv의 VL과 VH 사이에 배치된다. 다중 링커를 갖는 구축물에서, 링커 중 임의의 2개 이상은 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이중특이적 CAR은 VL, VH, 및 임의로 1개 이상의 링커를 본원에 기재된 바와 같은 배열로 포함한다.
한 측면에서, 이중특이적 항체 분자는 제1 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열 (예를 들어 BCMA에 대해 결합 특이성을 갖는 scFv, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 표 1 또는 표 16에 기재된 바와 같은 scFv 포함, 또는 본원에 기재된 BCMA scFv로부터의 경쇄 CDR 및/또는 중쇄 CDR 포함), 및 상이한 항원 상의 제2 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 일부 측면에서 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 AML 세포 상에 발현된 항원, 예를 들어 BCMA 이외의 항원에 대해 결합 특이성을 갖는다. 예를 들어, 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 CD123에 대해 결합 특이성을 갖는다. 또 다른 예로서, 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 CLL-1에 대해 결합 특이성을 갖는다. 또 다른 예로서, 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 CD34에 대해 결합 특이성을 갖는다. 또 다른 예로서, 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 FLT3에 대해 결합 특이성을 갖는다. 예를 들어, 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 폴레이트 수용체 베타에 대해 결합 특이성을 갖는다. 일부 측면에서, 제2 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열은 B-세포 상에 발현된 항원, 예를 들어 CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b, 또는 CD79a에 대해 결합 특이성을 갖는다.
키메라 TCR
한 측면에서, 본 발명의 항-BCMA 항체 및 항체 단편 (예를 들어, 표 1 및 16에 개시된 것)은 T 세포 수용체 ("TCR") 쇄, 예를 들어 TCR 알파 또는 TCR 베타 쇄의 1개 이상의 불변 도메인에 그라프팅되어 BCMA에 특이적으로 결합하는 키메라 TCR을 생성할 수 있다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 키메라 TCR은 항원 결합 시 TCR 복합체를 통해 신호를 전달할 것으로 여겨진다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 BCMA scFv는 TCR 쇄, 예를 들어 TCR 알파 쇄 및/또는 TCR 베타 쇄의 불변 도메인, 예를 들어 세포외 불변 도메인의 적어도 일부, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인에 그라프팅될 수 있다. 또 다른 예로서, BCMA 항체 단편, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 VL 도메인은 TCR 알파 쇄의 불변 도메인에 그라프팅될 수 있고, BCMA 항체 단편, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 VH 도메인은 TCR 베타 쇄의 불변 도메인에 그라프팅될 수 있다 (또는 대안적으로, VL 도메인은 TCR 베타 쇄의 불변 도메인에 그라프팅될 수 있고, VH 도메인은 TCR 알파 쇄에 그라프팅될 수 있음). 또 다른 예로서, 항-BCMA 항체 또는 항체 단편의 CDR, 예를 들어 표 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25에 기재된 바와 같은 항-BCMA 항체 또는 항체 단편의 CDR은 TCR 알파 및/또는 베타 쇄에 그라프팅되어 BCMA에 특이적으로 결합하는 키메라 TCR을 생성할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 LCDR은 TCR 알파 쇄의 가변 도메인에 그라프팅될 수 있고, 본원에 개시된 HCDR은 TCR 베타 쇄의 가변 도메인에 그라프팅될 수 있거나, 또는 그 반대이다. 이러한 키메라 TCR은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Willemsen RA et al., Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al., Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al., Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74]).
막횡단 도메인
막횡단 도메인과 관련하여, 다양한 실시양태에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 부착된 막횡단 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 막횡단 도메인은 막횡단 영역에 인접한 1개 이상의 추가의 아미노산, 예를 들어 막횡단 도메인이 유래된 단백질의 세포외 영역과 회합된 1개 이상의 아미노산 (예를 들어, 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산) 및/또는 막횡단 도메인이 유래된 단백질의 세포내 영역과 회합된 1개 이상의 추가의 아미노산 (예를 들어, 세포내 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 최대 15개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 막횡단 도메인은 사용된 CAR의 다른 도메인 중 1개와 회합된 것이다. 일부 경우에, 막횡단 도메인은 이러한 도메인이 동일 또는 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 결합하는 것을 피하기 위해, 예를 들어 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 선택될 수 있거나 또는 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 한 측면에서, 막횡단 도메인은 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART 세포, 표면 상의 또 다른 CAR과 동종이량체화가 가능하다. 상이한 측면에서, 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 동일한 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART에 존재하는 천연 결합 파트너의 결합 도메인과의 상호작용을 최소화하기 위해 변형되거나 치환될 수 있다.
막횡단 도메인은 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우에, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 한 측면에서, 막횡단 도메인은 CAR이 표적에 결합할 때마다 세포내 도메인(들)에 신호전달을 할 수 있다. 본 발명에서 특히 유용한 막횡단 도메인은 예를 들어 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8 (예를 들어, CD8 알파, CD8 베타), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 적어도 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 공동자극 분자, 예를 들어 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드의 적어도 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 막횡단 도메인은 힌지, 예를 들어 인간 단백질로부터의 힌지를 통해 CAR의 세포외 영역, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인에 부착될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 힌지는 인간 Ig (이뮤노글로불린) 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지 또는 CD8a 힌지일 수 있다. 한 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다). 한 측면에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 막횡단 도메인을 포함한다 (예를 들어, 그로 이루어진다).
한 측면에서, 힌지 또는 스페이서는 IgG4 힌지를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 하기 아미노산 서열의 힌지를 포함한다:
Figure pct00093
일부 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 하기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 힌지를 포함한다:
Figure pct00094
한 측면에서, 힌지 또는 스페이서는 IgD 힌지를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 하기 아미노산 서열의 힌지를 포함한다:
Figure pct00095
일부 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 하기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 힌지를 포함한다:
Figure pct00096
한 측면에서, 막횡단 도메인은 재조합일 수 있고, 이 경우에 이는 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 우세하게 포함할 것이다. 한 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 재조합 막횡단 도메인의 각각의 말단에서 발견될 수 있다.
임의로, 2 내지 10개 아미노산 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 CAR의 막횡단 도메인과 세포질 영역 사이에 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중체는 특히 적합한 링커를 제공한다. 예를 들어, 한 측면에서, 링커는 GGGGSGGGGS (서열식별번호: 5)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (서열식별번호: 16)의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
한 측면에서, 힌지 또는 스페이서는 KIR2DS2 힌지를 포함한다.
세포질 도메인
본 발명의 CAR의 세포질 도메인 또는 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 일반적으로 CAR이 도입된 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 1종의 활성화를 담당한다.
본 발명의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 항원 수용체 관여 후에 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 T 세포 수용체 (TCR) 및 보조-수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 동일한 기능적 능력을 갖는 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 임의의 재조합 서열을 포함한다.
TCR을 통해 생성된 신호 단독은 T 세포의 완전한 활성화를 위해 불충분하고 2차 및/또는 공동자극 신호가 또한 필요함이 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 2개의 별개의 부류에 의해 매개된다고 언급될 수 있다: TCR을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것 (1차 세포내 신호전달 도메인) 및 2차 또는 공동자극 신호를 제공하기 위해 항원-비의존성 방식으로 작용하는 것 (2차 세포질 도메인, 예를 들어 공동자극 도메인).
1차 신호전달 도메인은 TCR 복합체의 1차 활성화를 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에 특히 유용한 1차 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 ("ICOS"으로도 공지됨), FcεRI, DAP10, DAP12 및 CD66d의 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CAR은 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3-제타의 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 1차 신호전달 도메인은 천연 ITAM 도메인과 비교하여 변경된 (예를 들어, 증가된 또는 감소된) 활성을 갖는 변형된 ITAM 도메인, 예를 들어 돌연변이된 ITAM 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 1차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM-함유 1차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 최적화된 및/또는 말단절단된 ITAM-함유 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 1차 신호전달 도메인은 1, 2, 3 또는 4개 또는 그 초과의 ITAM 모티프를 포함한다.
본 발명에 특히 유용한 1차 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 분자의 추가의 예는 DAP10, DAP12, 및 CD32의 것을 포함한다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3-제타 신호전달 도메인을 단독으로 포함할 수 있거나, 또는 본 발명의 CAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 신호전달 도메인(들)과 조합될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타 쇄 부분 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 도메인은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 공동자극 분자는 항원 수용체 이외의 세포 표면 분자 또는 림프구의 항원에 대한 효율적인 반응을 위해 필요한 그의 리간드이다. 이러한 분자의 예는 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 예를 들어, CD27 공동자극은 시험관내에서 인간 CART 세포의 확장, 이펙터 기능, 및 생존을 증진시키고, 생체내에서 인간 T 세포 지속성 및 항종양 활성을 증대시키는 것으로 입증된 바 있다 (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706).
본 발명의 CAR의 세포질 부분 내의 세포내 신호전달 서열은 서로 무작위로 또는 명시된 순서로 연결될 수 있다. 임의로, 예를 들어 2 내지 10개 아미노산 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산) 길이의 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 세포내 신호전달 서열 사이에 연결을 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 글리신-세린 이중체가 적합한 링커로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 단일 아미노산, 예를 들어 알라닌, 글리신이 적합한 링커로서 사용될 수 있다.
한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 공동자극 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 실시양태에서, 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 공동자극 신호전달 도메인은 링커 분자, 예를 들어 본원에 기재된 링커 분자에 의해 분리된다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 분자는 글리신 잔기이다. 일부 실시양태에서, 링커는 알라닌 잔기이다.
한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, 4-1BB의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 신호전달 도메인이다. 한 측면에서, CD3-제타의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 9 (돌연변이체 CD3제타) 또는 서열식별번호: 10 (야생형 인간 CD3제타)의 신호전달 도메인이다.
한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD27의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, CD27의 신호전달 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00097
한 측면에서, CD27의 신호전달 도메인은 하기의 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00098
한 측면에서, 세포내는 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, CD28의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1104의 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD28의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1105의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
한 측면에서, 세포내는 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 ICOS의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, ICOS의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1106의 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, ICOS의 신호전달 도메인은 서열식별번호: 1107의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
한 측면에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 제2 CAR, 예를 들어, 예를 들어 동일한 표적 (BCMA) 또는 상이한 표적 (예를 들어, CD19, CD20, 또는 CS-1, 또는 다른 다발성 골수종 표적, 예를 들어 카파 경쇄, CD138, 루이스 Y 항원, 또는 CD38 (Garfall et al., Discovery Medicine, 2014, 17(91):37-46))에 대한 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 CAR을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포는 제1 항원을 표적화하고 공동자극 신호전달 도메인을 갖지만 1차 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 제2의 상이한 항원을 표적화하고 1차 신호전달 도메인을 갖지만 공동자극 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 공동자극 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB, CD28, CD27, ICOS, 또는 OX-40을 제1 CAR에, 및 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3 제타를 제2 CAR에 배치하면, CAR 활성을 둘 다의 표적이 발현되는 세포로 제한할 수 있다. 한 실시양태에서, CAR 발현 세포는 BCMA 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하는 제1 BCMA CAR, 및 BCMA 이외의 항원 (예를 들어, 백혈병 또는 림프종 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CD19, CD20, CS-1, 카파 경쇄, CD139, 루이스 Y 항원, 또는 CD38)을 표적화하고 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CAR 발현 세포는 BCMA 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제1 BCMA CAR, 및 BCMA 이외의 항원 (예를 들어, 백혈병 또는 림프종 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CD19, CD20, CS-1, 카파 경쇄, CD139, 루이스 Y 항원, 또는 CD38)을 표적화하고 항원에 대한 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포는 본원에 기재된 BCMA CAR 및 CD19를 표적화하는 CAR (CD19 CAR)을 포함한다.
한 실시양태에서, CAR-발현 세포는 본원에 기재된 BCMA CAR 및 억제 CAR을 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 CAR은, 암 세포 상에서는 발견되지 않지만 정상 세포, 예를 들어 메소텔린을 또한 발현하는 정상 세포 상에서는 발견되는 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 CAR은 억제 분자의 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 예를 들어, 억제 CAR의 세포내 도메인은 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타의 세포내 도메인일 수 있다.
한 실시양태에서, CAR-발현 세포가 2개 이상의 상이한 CAR을 포함하는 경우에, 상이한 CAR의 항원 결합 도메인은 항원 결합 도메인이 서로 상호작용하지 않도록 하는 것일 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 CAR을 발현하는 세포는 제1 CAR의 항원 결합 도메인을, 예를 들어 제2 CAR의 항원 결합 도메인과 회합을 형성하지 않는 단편, 예를 들어 scFv로서 가질 수 있고, 예를 들어 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 VHH이다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 그의 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 분자를 포함하는 단일 도메인 항원 결합 (SDAB) 분자를 포함한다. 예는 중쇄 가변 도메인, 자연적으로 경쇄가 결여된 결합 분자, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인, 조작된 도메인 및 항체로부터 유래된 것 이외의 단일 도메인 스캐폴드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. SDAB 분자는 임의의 관련 기술 분야의 것, 또는 임의의 미래의 단일 도메인 분자일 수 있다. SDAB 분자는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 어류, 상어, 염소, 토끼, 및 소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 또한 낙타과 및 상어 이외의 종으로부터의 자연 발생 단일 도메인 항체 분자를 포함한다.
한 측면에서, SDAB 분자는 어류에서 발견된 이뮤노글로불린의, 예컨대 예를 들어 상어의 혈청에서 발견된 신규 항원 수용체 (NAR)로서 공지된 이뮤노글로불린 이소형으로부터 유래된 가변 영역으로부터 유래될 수 있다. NAR의 가변 영역으로부터 유래된 단일 도메인 분자 ("IgNAR")를 생산하는 방법은 WO 03/014161 및 문헌 [Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909]에 기재되어 있다.
또 다른 측면에 따르면, SDAB 분자는 경쇄가 결여된 중쇄로서 공지된 자연 발생 단일 도메인 항원 결합 분자이다. 이러한 단일 도메인 분자는 예를 들어 WO 9404678 및 문헌 [Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448]에 개시되어 있다. 명확성을 위해, 자연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 분자로부터 유래된 이러한 가변 도메인은 4쇄 이뮤노글로불린의 통상적인 VH와 구별하기 위해 본원에서 VHH 또는 나노바디로 공지된다. 이러한 VHH 분자는 낙타과 종으로부터, 예를 들어 낙타, 라마, 단봉낙타, 알파카 및 구아나코에서 유래될 수 있다. 낙타과 외에도 다른 종이 자연적으로 경쇄가 결여된 중쇄 분자를 생산할 수 있고; 이러한 VHH는 본 발명의 범주 내에 포함된다.
SDAB 분자는 재조합, CDR-그라프팅, 인간화, 낙타화, 탈-면역화 및/또는 시험관내 생성될 (예를 들어, 파지 디스플레이에 의해 선택될) 수 있다.
또한, 예를 들어 수용체의 항원 결합 도메인 사이의 상호작용은 항원 결합 도메인 중 1종 이상이 그의 동족 항원에 결합하는 능력을 억제하기 때문에, 항원 결합 도메인을 포함하는 복수의 키메라 막 포매된 수용체를 갖는 세포는 바람직하지 않을 수 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 따라서, 이러한 상호작용을 최소화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 및 제2 비-자연 발생 키메라 막 포매된 수용체를 갖는 세포가 본원에 개시된다. 또한, 이러한 상호작용을 최소화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 및 제2 비-자연 발생 키메라 막 포매된 수용체를 코딩하는 핵산, 뿐만 아니라 이러한 세포 및 핵산의 제조 및 사용 방법이 본원에 개시된다. 한 실시양태에서, 상기 제1 및 상기 제2 비-자연 발생 키메라 막 포매된 수용체 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 것은 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타류, 상어, 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 및 제2 CAR을 포함하며, 여기서 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 포함하지 않다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv이고, 다른 것은 scFv가 아니다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타류, 상어, 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 나노바디를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 낙타류 VHH 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 것은 단일 VH 도메인, 예를 들어 낙타류, 상어, 또는 칠성장어 단일 VH 도메인, 또는 인간 또는 마우스 서열로부터 유래된 단일 VH 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 것은 나노바디를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR 중 하나의 항원 결합 도메인은 scFv를 포함하고, 다른 것은 낙타류 VHH 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포의 표면 상에 존재하는 경우에, 상기 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원에 대한 결합은 상기 제2 CAR의 존재에 의해 실질적으로 감소되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 CAR의 존재 하에서의 상기 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원에 대한 결합은 상기 제2 CAR의 부재 하에서의 상기 제1 CAR의 항원 결합 도메인의 그의 동족 항원에 대한 결합의 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.
일부 실시양태에서, 세포의 표면 상에 존재하는 경우에, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 둘 다 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 더 낮은 정도로 서로 회합한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 CAR 및 상기 제2 CAR의 항원 결합 도메인은 둘 다 scFv 항원 결합 도메인인 경우보다 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 더 낮은 정도로 서로 회합한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 또 다른 작용제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 추가로 발현할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자를 억제하는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제일 수 있다. 억제 분자, 예를 들어 PD1은 일부 실시양태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타를 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 분자를 억제하는 작용제는 양성 신호를 세포에 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 예를 들어 억제 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타, 또는 임의의 이들의 단편 (예를 들어, 임의의 이들의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27, ICOS 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인) 포함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 PD1 또는 그의 단편 (예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 2013/019615에 기재된 바와 같은 스위치 공동자극 수용체를 포함한다. PD1은 CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA를 또한 포함하는 CD28 패밀리의 수용체의 억제 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에서 발현된다 (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). PD1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2는 PD1에 결합 시 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 제시된 바 있다 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1은 인간 암에서 풍부하다 (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). 면역 억제는 PD1과 PD-L1의 국부 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있다.
한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자의 세포외 도메인 (ECD)을 포함하고, 예를 들어 프로그램화된 사멸 1 (PD1)은 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 41BB 및 CD3 제타에 융합될 수 있다 (본원에서 PD1 CAR로도 지칭됨). 한 실시양태에서, PD1 CAR은 본원에 기재된 BCMA CAR과 조합되어 사용되는 경우에 CAR-발현 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 지속성을 개선시킨다. 한 실시양태에서, CAR은 서열식별번호: 24에 밑줄로 표시한 PD1의 세포외 도메인을 포함하는 PD1 CAR이다. 한 실시양태에서, PD1 CAR은 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함한다.
Figure pct00099
한 실시양태에서, PD1 CAR은 하기 제공된 아미노산 서열 (서열식별번호: 22)을 포함한다.
Figure pct00100
한 실시양태에서, 작용제는 PD1 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 PD1 CAR을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, PD1 CAR에 대한 핵산 서열이 하기 제시되고, 여기서 PD1 ECD는 하기 서열식별번호: 23에서 밑줄로 표시된다.
Figure pct00101
또 다른 측면에서, 본 발명은 CAR-발현 세포, 예를 들어 CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, CAR-발현 세포의 집단은 상이한 CAR을 발현하는 세포의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, CAR-발현 세포 (예를 들어, CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)의 집단은 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 제1 세포에 의해 발현된 CAR 내의 항-BCMA 결합 도메인과 상이한, 상이한 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, CAR-발현 세포의 집단은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 BCMA 이외의 표적 (예를 들어, CD19, CD20, CS-1, 카파 경쇄, CD139, 루이스 Y 항원, 또는 CD38)에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포의 집단은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 CD19를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR (CD19 CAR)을 발현하는 제2 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포의 집단은 예를 들어 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포, 및 2차 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 집단 내의 적어도 1종의 세포는 본원에 기재된 항-BCMA 도메인을 갖는 CAR을 발현하고 제2 세포는 또 다른 작용제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 발현하는 세포의 집단을 제공한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 억제 분자는 예를 들어 일부 실시양태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타를 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 분자를 억제하는 작용제 양성 신호를 세포에 제공하는 제2 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인과 회합된 제1 폴리펩티드, 예를 들어 억제 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 예를 들어 억제 분자, 예컨대 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타, 또는 임의의 이들의 단편 (예를 들어, 임의의 이들의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 예를 들어 41BB, CD27, ICOS 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인) 포함)인 제2 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 작용제는 PD1 또는 그의 단편 (예를 들어, PD1의 세포외 도메인의 적어도 일부)의 제1 폴리펩티드, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본원에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩티드를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 CAR-발현 세포 (예를 들어, CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)의 집단, 예를 들어 상이한 CAR을 발현하는 세포의 혼합물을 또 다른 작용제, 예를 들어 키나제 억제제, 예컨대 본원에 기재된 키나제 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 집단 내의 적어도 1종의 세포가 본원에 기재된 바와 같은 항암 연관 항원 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하고, 제2 세포는 또 다른 작용제, 예를 들어 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제를 발현하는 것인 세포의 집단을 또 다른 작용제, 예를 들어 키나제 억제제, 예컨대 본원에 기재된 키나제 억제제와 조합하여 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
자연 킬러 세포 수용체 (NKR) CAR
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 분자는 자연 킬러 세포 수용체 (NKR)의 1종 이상의 성분을 포함하며, 그에 의해 NKR-CAR을 형성한다. NKR 성분은 임의의 하기 자연 킬러 세포 수용체: 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR), 예를 들어, KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1, 및 KIR3DP1; 천연 세포독성 수용체 (NCR), 예를 들어, NKp30, NKp44, NKp46; 면역 세포 수용체의 신호전달 림프구 활성화 분자 (SLAM) 패밀리, 예를 들어, CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRACC, BLAME, 및 CD2F-10; Fc 수용체 (FcR), 예를 들어, CD16, 및 CD64; 및 Ly49 수용체, 예를 들어, LY49A, LY49C로부터의 막횡단 도메인, 힌지 도메인, 또는 세포질 도메인일 수 있다. 본원에 기재된 NKR-CAR 분자는 어댑터 분자 또는 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 DAP12와 상호작용할 수 있다. NKR 성분을 포함하는 CAR 분자의 예시적인 구성 및 서열은 국제 공개 번호 WO2014/145252에 기재되어 있고, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
키메라 항원 수용체를 조절하기 위한 전략
CAR 활성을 조절할 수 있는 많은 방식이 존재한다. 일부 실시양태에서, CAR 활성이 제어될 수 있는 조절성 CAR (RCAR)은 CAR 요법의 안전성 및 효능을 최적화하는데 바람직하다. 예를 들어, 이량체화 도메인에 융합된 카스파제를 사용하여 예를 들어 아폽토시스를 유도하는 것 (예를 들어, 문헌 [Di et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683] 참조)은 본 발명의 CAR 요법에서 안전성 스위치로서 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, CAR-발현 세포는 또한 유도성 카스파제-9 (i카스파제-9) 분자를 발현할 수 있고, 이는 이량체화 약물 (예를 들어, 리미두시드 (AP1903 (벨리쿰 파마슈티칼스(Bellicum Pharmaceuticals)) 또는 AP20187 (아리아드(Ariad))로도 불림)의 투여 시, 카스파제-9의 활성화 및 세포의 아폽토시스로 이어진다. i카스파제-9 분자는 CID의 존재 하에 이량체화를 매개하는 이량체화 (CID) 결합 도메인의 화학적 유도제를 함유한다. 이는 CAR-발현 세포의 유도적 및 선택적 고갈을 발생시킨다. 일부 경우에, i카스파제-9 분자는 CAR-코딩 벡터(들)와 별개의 핵산 분자에 의해 코딩된다. 일부 경우에, i카스파제-9 분자는 CAR-코딩 벡터와 동일한 핵산 분자에 의해 코딩된다. i카스파제-9는 CAR-발현 세포의 임의의 독성을 피하기 위한 안전성 스위치를 제공할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75; Clinical Trial Id. No. NCT02107963; 및 Di Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83]을 참조한다.
본 발명의 CAR 요법을 조절하기 위한 대안적 전략은 예를 들어 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 유도함으로써, 예를 들어 CAR-발현 세포를 결실시킴으로써 CAR 활성을 비활성화시키거나 턴 오프하는 소분자 또는 항체를 이용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 또한 세포 사멸, 예를 들어 ADCC 또는 보체-유도 세포 독성을 유도할 수 있는 분자에 의해 인식되는 항원을 발현할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 또한 항체 또는 항체 단편에 의해 표적화될 수 있는 수용체를 발현할 수 있다. 이러한 수용체의 예는 EpCAM, VEGFR, 인테그린 (예를 들어, 인테그린 ανβ3, α4, αI¾β3, α4β7, α5β1, ανβ3, αν), TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원 (예를 들어, TRAIL-R1 , TRAIL-R2), PDGF 수용체, 인터페론 수용체, 폴레이트 수용체, GPNMB, ICAM-1 , HLA-DR, CEA, CA-125, MUC1 , TAG-72, IL-6 수용체, 5T4, GD2, GD3, CD2, CD3, CD4, CD5, CD1 1 , CD1 1 a/LFA-1 , CD15, CD18/ITGB2, CD19, CD20, CD22, CD23/lgE 수용체, CD25, CD28, CD30, CD33, CD38, CD40, CD41, CD44, CD51, CD52, CD62L, CD74, CD80, CD125, CD147/바시긴, CD152/CTLA-4, CD154/CD40L, CD195/CCR5, CD319/SLAMF7, 및 EGFR, 및 그의 말단절단된 버전 (예를 들어, 1개 이상의 세포외 에피토프는 보존되었지만 세포질 도메인 내 1개 이상의 영역이 결여된 버전)을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 또한 신호전달 능력은 결여되었지만 ADCC를 유도할 수 있는 분자, 예를 들어 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX)?)에 의해 인식되는 에피토프를 보유하는 말단절단된 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 발현할 수 있어서, 세툭시맙의 투여는 ADCC를 유도하고 이어서 CAR-발현 세포를 고갈시킨다 (예를 들어, WO2011/056894, 및 문헌 [Jonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860] 참조). 또 다른 전략은 본원에 기재된 CAR-발현 세포에서 CD32 및 CD20 항원 둘 다로부터의 표적 에피토프를 합한 고도로 치밀한 마커/자살 유전자를 발현시키는 것을 포함하고, 이는 리툭시맙에 결합하고, 예를 들어 ADCC에 의해 CAR-발현 세포의 선택적 고갈을 발생시킨다 (예를 들어, 문헌 [Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287] 참조). 본원에 기재된 CAR-발현 세포를 고갈시키는 다른 방법은 예를 들어 ADCC를 유도함으로써 파괴를 위해 성숙한 림프구, 예를 들어 CAR-발현 세포에 선택적으로 결합하고 표적화하는 모노클로날 항-CD52 항체인 캄파트(CAMPATH)?의 투여를 포함한다. 다른 실시양태에서, CAR-발현 세포는 CAR 리간드, 예를 들어 항-이디오타입 항체를 사용하여 선택적으로 표적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-이디오타입 항체는 이펙터 세포 활성, 예를 들어 ADCC 또는 ADC 활성을 유발하여 CAR-발현 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, CAR 리간드, 예를 들어 항-이디오타입 항체는 세포 사멸을 유도하는 작용제, 예를 들어 독소에 커플링되어 CAR-발현 세포의 수를 감소시킬 수 있다. 대안적으로, CAR 분자 그 자체가 활성이 조절될 수 있도록, 예를 들어 하기 기재된 바와 같이 턴 온 및 오프될 수 있도록 구성될 수 있다.
일부 실시양태에서, RCAR은 가장 단순한 실시양태에서 전형적으로 2개인 폴리펩티드의 세트를 포함하며, 여기서 본원에 기재된 표준 CAR의 성분, 예를 들어 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 개별 폴리펩티드 또는 구성원 상에 분할된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 세트는 이량체화 분자의 존재 시 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는, 예를 들어 항원 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 커플링시킬 수 있는 이량체화 스위치를 포함한다. 이러한 조절성 CAR의 추가의 설명 및 예시적인 구성이 본원, 및 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 공개 번호 WO 2015/090229에서 제공된다.
한 실시양태에서, RCAR은 2개의 폴리펩티드 또는 구성원: 1) 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성원, 및 제1 스위치 도메인; 2) 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 본원에 기재된 종양 항원을 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원, 및 제2 스위치 도메인을 포함한다. 임의로, RCAR은 본원에 기재된 막횡단 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 세포내 신호전달 구성원에, 항원 결합 구성원에, 또는 둘 다에 배치될 수 있다. (달리 나타내지 않는 한, RCAR의 구성원 또는 요소가 본원에 기재된 경우에, 순서는 제공된 바와 같을 수 있지만, 다른 순서가 또한 포함된다. 다시 말해서, 한 실시양태에서 순서는 텍스트에 제시된 바와 같지만, 다른 실시양태에서 순서는 상이할 수 있다. 예를 들어, 막횡단 영역의 한 측면 상의 요소의 순서는 예와 상이할 수 있고, 예를 들어 세포내 신호전달 도메인에 대해 스위치 도메인의 배치는 상이하고, 예를 들어 반대로 될 수 있다).
한 실시양태에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 세포내 또는 세포외 이량체화 스위치를 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 이량체화 스위치는 예를 들어 제1 및 제2 스위치 도메인이 동일한 동종이량체화 스위치, 또는 예를 들어 제1 및 제2 스위치 도메인이 서로 상이한 이종이량체화 스위치일 수 있다.
실시양태에서, RCAR은 "다중 스위치"를 포함할 수 있다. 다중 스위치는 이종이량체화 스위치 도메인 또는 동종이량체화 스위치 도메인을 포함할 수 있다. 다중 스위치는 제1 구성원, 예를 들어 항원 결합 구성원, 및 제2 구성원, 예를 들어 세포내 신호전달 구성원 상에 독립적으로 복수의, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 스위치 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 구성원은 복수의 제1 스위치 도메인, 예를 들어 FKBP-기반 스위치 도메인을 포함할 수 있고, 제2 구성원은 복수의 제2 스위치 도메인, 예를 들어 FRB-기반 스위치 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 구성원은 제1 및 제2 스위치 도메인, 예를 들어 FKBP-기반 스위치 도메인 및 FRB-기반 스위치 도메인을 포함할 수 있고, 제2 구성원은 제1 및 제2 스위치 도메인, 예를 들어 FKBP-기반 스위치 도메인 및 FRB-기반 스위치 도메인을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 세포내 신호전달 구성원은 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 1차 세포내 신호전달 도메인 및 1개 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 1개 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 본원에 기재된, 예를 들어 4-1BB, CD28, CD27, ICOS, 및 OX40으로부터 선택된 복수의, 예를 들어 2 또는 3개의 공동자극 신호전달 도메인을 포함하고, 실시양태에서 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 세포외로부터 세포내 방향으로 하기 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다: 4-1BB-CD27; 4-1BB-CD27; CD27-4-1BB; 4-1BB-CD28; CD28-4-1BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-4-1BB; 또는 4-1BB-CD28. 이러한 실시양태에서, 세포내 결합 구성원은 CD3제타 도메인을 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, RCAR은 (1) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 2개의 공동자극 도메인 및 제1 스위치 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원; 및 (2) 막횡단 도메인 또는 막 테더링 도메인 및 적어도 1개의 1차 세포내 신호전달 도메인, 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
한 실시양태는 항원 결합 구성원이 CAR 세포의 표면에 테더링되지 않은 RCAR을 제공한다. 이는 세포를 항원 결합 구성원을 코딩하는 서열로 형질전환시키지 않으면서, 세포내 신호전달 구성원을 갖는 세포가 1개 이상의 항원 결합 도메인과 편리하게 쌍형성되도록 한다. 이러한 실시양태에서, RCAR은 1) 제1 스위치 도메인, 막횡단 도메인, 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 1차 세포내 신호전달 도메인, 및 제1 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성원; 및 2) 항원 결합 도메인, 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원 (여기서 항원 결합 구성원은 막횡단 도메인 또는 막 테더링 도메인을 포함하지 않고, 임의로, 세포내 신호전달 도메인을 포함하지 않음)을 포함한다. 일부 실시양태에서, RCAR은 3) 제2 항원 결합 도메인, 예를 들어 항원 결합 도메인에 의해 결합되는 것과 상이한 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인; 및 제2 스위치 도메인을 포함하는 제2 항원 결합 구성원을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 항원 결합 구성원이 이중특이적 활성화 및 표적화 능력을 포함하는 RCAR이 본원에 제공된다. 이러한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 복수의, 예를 들어 2, 3, 4, 또는 5개의 항원 결합 도메인, 예를 들어 scFv를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 항원 결합 도메인은 표적 항원, 예를 들어 상이한 항원 또는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 항원 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 복수의 항원 결합 도메인은 탠덤으로 존재하고, 임의로 링커 또는 힌지 영역이 각각의 항원 결합 도메인 사이에 배치된다. 적합한 링커 및 힌지 영역이 본원에 기재되어 있다.
한 실시양태는 증식의 전환을 가능하게 하는 구성을 갖는 RCAR을 제공한다. 이러한 실시양태에서, RCAR은 1) 임의로, 막횡단 도메인 또는 막 테더링 도메인; 예를 들어 4-1BB, CD28, CD27, ICOS, 및 OX40으로부터 선택된 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인, 및 스위치 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 구성원; 및 2) 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 1차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CD3제타 도메인을 포함하는 항원 결합 구성원 (여기서 항원 결합 구성원은 스위치 도메인을 포함하지 않거나, 또는 세포내 신호전달 구성원 상의 스위치 도메인과 이량체화하는 스위치 도메인을 포함하지 않음)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 구성원은 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 구성원은 동종이량체화 스위치로부터의 스위치 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 구성원은 이종이량체화 스위치의 제1 스위치 도메인을 포함하고, RCAR은 이종이량체화 스위치의 제2 스위치 도메인을 포함하는 제2 세포내 신호전달 구성원을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 제2 세포내 신호전달 구성원은 세포내 신호전달 구성원과 동일한 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 이량체화 스위치는 세포내에 존재한다. 한 실시양태에서, 이량체화 스위치는 세포외에 존재한다.
본원에 기재된 임의의 RCAR 구성에서, 제1 및 제2 스위치 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 FKBP-FRB-기반 스위치를 포함한다.
또한, 본원에 기재된 RCAR을 포함하는 세포가 본원에 제공된다. RCAR을 발현하도록 조작된 임의의 세포가 RCARX 세포로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서 RCARX 세포는 T 세포이고, RCART 세포로서 지칭된다. 한 실시양태에서, RCARX 세포는 NK 세포이고, RCARN 세포로서 지칭된다.
또한, RCAR 코딩 서열을 포함하는 핵산 및 벡터가 본원에 제공된다. RCAR의 다양한 요소를 코딩하는 서열은 동일한 핵산 분자, 예를 들어 동일한 플라스미드 또는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 배치될 수 있다. 한 실시양태에서, (i) 항원 결합 구성원을 코딩하는 서열 및 (ii) 세포내 신호전달 구성원을 코딩하는 서열은 동일한 핵산, 예를 들어 벡터 상에 존재할 수 있다. 상응하는 단백질의 생산은, 예를 들어 개별 프로모터의 사용에 의해, 또는 비시스트론 전사 산물 (단일 번역 산물의 절단에 의해 또는 2개의 개별 단백질 산물의 번역에 의해 2개의 단백질의 생산을 발생시킬 수 있음)의 사용에 의해 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 절단가능한 펩티드를 코딩하는 서열, 예를 들어 P2A 또는 F2A 서열은 (i)과 (ii) 사이에 배치된다. 한 실시양태에서, IRES, 예를 들어 EMCV 또는 EV71 IRES를 코딩하는 서열이 (i)과 (ii) 사이에 배치된다. 이들 실시양태에서, (i) 및 (ii)는 단일 RNA로서 전사된다. 한 실시양태에서, (i) 및 (ii)가 개별 mRNA로서 전사되도록, 제1 프로모터는 (i)에 작동가능하게 연결되고, 제2 프로모터는 (ii)에 작동가능하게 연결된다.
대안적으로, RCAR의 다양한 요소를 코딩하는 서열은 상이한 핵산 분자, 예를 들어 상이한 플라스미드 또는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 배치될 수 있다. 예를 들어, (i) 항원 결합 구성원을 코딩하는 서열은 제1 핵산, 예를 들어 제1 벡터 상에 존재할 수 있고, (ii) 세포내 신호전달 구성원을 코딩하는 서열은 제2 핵산, 예를 들어 제2 벡터 상에 존재할 수 있다.
이량체화 스위치
이량체화 스위치는 비-공유 또는 공유일 수 있다. 비-공유 이량체화 스위치에서, 이량체화 분자는 스위치 도메인 사이의 비-공유 상호작용을 촉진한다. 공유 이량체화 스위치에서, 이량체화 분자는 스위치 도메인 사이의 공유 상호작용을 촉진한다.
한 실시양태에서, RCAR은 FKBP/FRAP 또는 FKBP/FRB-기반 이량체화 스위치를 포함한다. FKBP12 (FKBP 또는 FK506 결합 단백질)는 천연 생성물 면역억제 약물인 라파마이신에 대한 초기 세포내 표적으로서 기능하는 풍부한 세포질 단백질이다. 라파마이신은 FKBP 및 대형 PI3K 상동체 FRAP (RAFT, mTOR)에 결합한다. FRB는 FKBP-라파마이신 복합체에 결합하는데 충분한 FRAP의 93개의 아미노산 부분이다 (Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51.)
실시양태에서, FKBP/FRAP, 예를 들어 FKBP/FRB 기반 스위치는 이량체화 분자, 예를 들어 라파마이신 또는 라파마이신 유사체를 사용할 수 있다.
FKBP의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00102
실시양태에서, FKBP 스위치 도메인은 라파마이신 또는 라파로그의 존재 하에 FRB 또는 그의 단편 또는 유사체에 결합하는 능력을 갖는 FKBP의 단편, 예를 들어 하기인, 서열식별번호: 275의 밑줄친 부분을 포함할 수 있다:
Figure pct00103
FRB의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00104
본원에 사용된 용어 "FKBP/FRAP, 예를 들어 FKBP/FRB 기반 스위치"는 라파마이신 또는 라파로그, 예를 들어 RAD001의 존재 하에 FRB, 또는 그의 단편 또는 유사체에 결합하는 능력을 갖는 FKBP 단편 또는 그의 유사체를 포함하고, 서열식별번호: 275 또는 276의 FKBP 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖거나 또는 그와 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 제1 스위치 도메인; 및 라파마이신 또는 라파로그의 존재 하에 FRB, 또는 그의 단편 또는 유사체에 결합하는 능력을 갖는 FRB 단편 또는 그의 유사체를 포함하고, 서열식별번호: 277의 FRB 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖거나 또는 그와 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산 잔기만큼 상이한 제2 스위치 도메인을 포함하는 이량체화 스위치를 지칭한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 RCAR은 서열식별번호: 275 (또는 서열식별번호: 276)에 개시된 아미노산 잔기를 포함하는 1개의 스위치 도메인 및 서열식별번호: 277에 개시된 아미노산 잔기를 포함하는 1개의 스위치 도메인을 포함한다.
실시양태에서, FKBP/FRB 이량체화 스위치는 FRB-기반 스위치 도메인, 예를 들어 변형된 FRB 스위치 도메인, FKBP-기반 스위치 도메인과 이량체화 분자, 예를 들어 라파마이신 또는 라파로그, 예를 들어 RAD001 사이에 변경된, 예를 들어 증진된 복합체 형성을 나타내는 변형된 FRB 스위치 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형된 FRB 스위치 도메인은 아미노산 위치(들) L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105, 및 F2108에서의 돌연변이로부터 선택된, 1개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 돌연변이를 포함하며, 여기서 야생형 아미노산은 임의의 다른 자연-발생 아미노산으로 돌연변이된다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 E2032에서 돌연변이를 포함하고, 여기서 E2032는 페닐알라닌 (E2032F), 메티오닌 (E2032M), 아르기닌 (E2032R), 발린 (E2032V), 티로신 (E2032Y), 이소류신 (E2032I), 예를 들어 서열식별번호: 278, 또는 류신 (E2032L), 예를 들어 서열식별번호: 279로 돌연변이된다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 T2098에서 돌연변이를 포함하고, 여기서 T2098은 페닐알라닌 (T2098F) 또는 류신 (T2098L), 예를 들어 서열식별번호: 280으로 돌연변이된다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 E2032 및 T2098에서 돌연변이를 포함하고, 여기서 E2032는 임의의 아미노산으로 돌연변이되고, 여기서 T2098은 임의의 아미노산, 예를 들어 서열식별번호: 281로 돌연변이된다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 E2032I 및 T2098L 돌연변이, 예를 들어 서열식별번호: 282를 포함한다. 한 실시양태에서, 돌연변이체 FRB는 E2032L 및 T2098L 돌연변이, 예를 들어 서열식별번호: 283을 포함한다.
<표 17> 이량체화 분자에 대해 증가된 친화도를 갖는 예시적인 돌연변이체 FRB
Figure pct00105
다른 적합한 이량체화 스위치는 GyrB-GyrB 기반 이량체화 스위치, 지베렐린-기반 이량체화 스위치, 태그/결합제 이량체화 스위치, 및 할로-태그/스냅-태그 이량체화 스위치를 포함한다. 본원에 제공된 안내에 따라, 이러한 스위치 및 관련 이량체화 분자는 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
이량체화 분자
스위치 도메인 사이의 회합은 이량체화 분자에 의해 촉진된다. 이량체화 분자의 존재 하에, 스위치 도메인 사이의 상호작용 또는 회합은 제1 스위치 도메인과 회합된, 예를 들어 융합된 폴리펩티드와 제2 스위치 도메인과 회합된, 예를 들어 융합된 폴리펩티드 사이의 신호 전달을 허용한다. 비-제한적 수준의 이량체화 분자의 존재 하에, 신호 전달은 예를 들어 본원에 기재된 시스템에서 측정 시 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 5, 10, 50, 100배 증가된다.
라파마이신 및 라파마이신 유사체 (때때로 라파로그로 지칭됨), 예를 들어 RAD001은 본원에 기재된 FKBP/FRB-기반 이량체화 스위치에서 이량체화 분자로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이량체화 분자는 라파마이신 (시롤리무스), RAD001 (에베롤리무스), 조타롤리무스, 템시롤리무스, AP-23573 (리다포롤리무스), 비올리무스 및 AP21967로부터 선택될 수 있다. FKBP/FRB-기반 이량체화 스위치와 함께 사용하기에 적합한 추가의 라파마이신 유사체는 섹션 표제 "조합 요법", 또는 서브섹션 표제 "낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제와의 조합"에 추가로 기재되어 있다.
스플릿 CAR
일부 실시양태에서, CAR-발현 세포는 스플릿 CAR을 사용한다. 스플릿 CAR 접근법은 본원에 참조로 포함되는 공개 WO2014/055442 및 WO2014/055657에 보다 상세하게 기재되어 있다. 간략하게, 스플릿 CAR 시스템은 제1 항원 결합 도메인 및 공동자극 도메인 (예를 들어, 41BB)을 갖는 제1 CAR을 발현하는 세포를 포함하고, 세포는 또한 제2 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3 제타)을 갖는 제2 CAR을 발현한다. 세포가 제1 항원을 만난 경우에, 공동자극 도메인이 활성화되고 세포는 증식한다. 세포가 제2 항원을 만난 경우에, 세포내 신호전달 도메인이 활성화되고 세포-사멸 활성이 개시된다. 따라서, CAR-발현 세포는 오직 둘 다의 항원의 존재 하에서만 활성화된다. 실시양태에서 제1 항원 결합 도메인은 BCMA를 인식하고, 예를 들어 본원에 기재된 항원 결합 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 급성 골수성 백혈병 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CD123, CLL-1, CD34, FLT3, 또는 폴레이트 수용체 베타를 인식한다. 실시양태에서 제1 항원 결합 도메인은 BCMA를 인식하고, 예를 들어 본원에 기재된 항원 결합 도메인을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 B-세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b, 또는 CD79a를 인식한다.
안정성 및 돌연변이
항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv 분자 (예를 들어, 가용성 scFv)의 안정성은 통상적인 대조군 scFv 분자 또는 전장 항체의 생물물리학적 특성 (예를 들어, 열적 안정성)을 참조하여 평가될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간화 scFv는 기재된 검정에서 대조군 결합 분자 (예를 들어 통상적인 scFv 분자)보다 약 0.1, 약 0.25, 약 0.5, 약 0.75, 약 1, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 또는 약 15℃ 더 큰 열적 안정성을 갖는다.
항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 개선된 열적 안정성은 후속적으로 전체 CART-BCMA 구축물에 부여되어, CART-BCMA 구축물의 개선된 치료 특성으로 이어진다. 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 열적 안정성은 통상적인 항체와 비교하여 적어도 약 2℃ 또는 3℃ 개선될 수 있다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 통상적인 항체와 비교하여 1℃ 개선된 열적 안정성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 통상적인 항체와 비교하여 2℃ 개선된 열적 안정성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, scFv는 통상적인 항체와 비교하여 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15℃ 개선된 열적 안정성을 갖는다. 비교는, 예를 들어 본원에 개시된 scFv 분자와 scFv VH 및 VL이 유래된 항체의 scFv 분자 또는 Fab 단편 사이에 이루어질 수 있다. 열적 안정성은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, Tm이 측정될 수 있다. Tm 측정 방법 및 단백질 안정성을 결정하는 다른 방법이 하기에 보다 상세하게 기재되어 있다.
scFv에서의 돌연변이 (가용성 scFv의 인간화 또는 직접 돌연변이유발을 통해 발생)는 scFv의 안정성을 변경시키고, scFv 및 CART33 구축물의 전체적인 안정성을 개선시킨다. 인간 scFv의 안정성은 Tm, 온도 변성 및 온도 응집과 같은 측정을 사용하여 뮤린 scFv에 대해 비교될 수 있다.
돌연변이체 scFv의 결합 능력은 실시예에 기재된 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 돌연변이된 scFv가 CART-BCMA 구축물에 대해 개선된 안정성을 부여하도록 인간화 과정을 통해 발생한 적어도 1개의 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 돌연변이된 scFv가 CART-BCMA 구축물에 대해 개선된 안정성을 부여하도록 인간화 과정으로부터 발생한 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 돌연변이를 포함한다.
단백질 안정성의 평가 방법
항원 결합 도메인의 안정성은 예를 들어 하기 기재된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 방법은 가장 덜 안정한 도메인이 먼저 언폴딩되거나 또는 협동적으로 언폴딩되는 다중도메인 유닛 (예를 들어, 단일 언폴딩 전이를 나타내는 다중도메인 단백질)의 전체적인 안정성 역치를 제한하는 다중 열적 언폴딩 전이의 결정을 가능하게 한다. 가장 덜 안정한 도메인은 수많은 추가의 방식으로 확인될 수 있다. 돌연변이유발은 도메인이 전체 안정성을 제한하는지 프로빙하기 위해 수행될 수 있다. 추가로, 다중도메인 단백질의 프로테아제 저항성은, 가장 덜 안정한 도메인이 DSC 또는 다른 분광학적 방법을 통해 본질적으로 언폴딩되는 것으로 공지된 조건 하에 수행될 수 있다 (Fontana, et al., (1997) Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi et al. (2009) J. Mol. Biol. 393: 672-692). 가장 덜 안정한 도메인이 확인되면, 이러한 도메인 (또는 그의 부분)을 코딩하는 서열을 방법에서 시험 서열로서 사용할 수 있다.
a) 열적 안정성
조성물의 열적 안정성은 관련 기술분야에 공지된 많은 비-제한적 생물물리학적 또는 생화학적 기술을 사용하여 분석될 수 있다. 특정 실시양태에서, 열적 안정성은 분석적 분광분석법에 의해 평가된다.
예시적인 분석적 분광분석 방법은 시차 주사 열량측정 (DSC)이다. DSC는 대부분의 단백질 또는 단백질 도메인의 언폴딩을 수반하는 열 흡광도에 감수성인 열량계를 사용한다 (예를 들어, 문헌 [Sanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988] 참조). 단백질의 열적 안정성을 결정하기 위해, 단백질의 샘플을 열량계 내로 삽입하고, 온도를 Fab 또는 scFv가 언폴딩될 때까지 상승시킨다. 단백질이 언폴딩되는 온도는 전체적인 단백질 안정성을 나타낸다.
또 다른 예시적인 분석적 분광분석 방법은 원형 이색성 (CD) 분광분석법이다. CD 분광측정법은 증가하는 온도의 함수로서 조성물의 광학 활성을 측정한다. 원형 이색성 (CD) 분광분석법은 구조적 비대칭으로 인해 발생하는 좌선회 편광 대 우선회 편광의 흡수에서의 차이를 측정한다. 불규칙적 또는 언폴딩된 구조는 규칙적 또는 폴딩된 구조의 것과 매우 상이한 CD 스펙트럼을 생성한다. CD 스펙트럼은 증가하는 온도의 변성 효과에 대한 단백질의 감수성을 반영하고, 따라서 단백질의 열적 안정성을 나타낸다 (문헌 [van Mierlo and Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000] 참조).
열적 안정성을 측정하기 위한 또 다른 예시적인 분석적 분광분석 방법은 형광 방출 분광분석법이다 (상기 문헌 [van Mierlo and Steemsma] 참조). 열적 안정성을 측정하기 위한 또 다른 예시적인 분석적 분광분석 방법은 핵 자기 공명 (NMR) 분광분석법이다 (예를 들어 상기 문헌 [van Mierlo and Steemsma] 참조).
조성물의 열적 안정성은 생화학적으로 측정될 수 있다. 열적 안정성을 평가하기 위한 예시적인 생화학적 방법은 열 챌린지 검정이다. "열 챌린지 검정"에서, 조성물은 설정된 시간 동안 소정의 범위의 상승된 온도에 적용된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 시험 scFv 분자 또는 scFv 분자를 포함하는 분자는 소정의 범위의 증가하는 온도에, 예를 들어 1-1.5시간 동안 적용된다. 이어서, 단백질의 활성이 관련 생화학적 검정에 의해 검정된다. 예를 들어, 단백질이 결합 단백질 (예를 들어 scFv 또는 scFv-함유 폴리펩티드)인 경우에, 결합 단백질의 결합 활성은 기능적 또는 정량적 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
이러한 검정은 이. 콜라이 및 고처리량 스크리닝을 사용하여 고처리량 포맷 및 실시예에 개시된 포맷으로 수행될 수 있다. 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv 변이체의 라이브러리는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv 발현이 유도될 수 있고, 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 열 챌린지에 적용될 수 있다. 챌린지된 시험 샘플은 결합에 대해 검정될 수 있고, 안정한 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 스케일-업되어 추가로 특징화될 수 있다.
열적 안정성은 임의의 상기 기술 (예를 들어 분석적 분광분석 기술)을 사용하여 조성물의 용융 온도 (Tm)를 측정함으로써 평가된다. 용융 온도는 조성물의 분자의 50%가 폴딩된 상태로 존재하는 열 전이 곡선의 중간점에서의 온도이다 (예를 들어, 문헌 [Dimasi et al. (2009) J. Mol Biol. 393: 672-692] 참조). 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv에 대한 Tm 값은 약 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃이다. 한 실시양태에서, IgG에 대한 Tm 값은 약 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃이다. 한 실시양태에서, 다가 항체에 대한 Tm 값은 약 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃이다.
열적 안정성은 또한 분석적 열량측정 기술 (예를 들어 DSC)을 사용하여 조성물의 비열 또는 열 용량 (Cp)을 측정함으로써 평가된다. 조성물의 비열은 1mol의 물의 온도를 1℃ 상승시키기 위해 필요한 에너지 (예를 들어 kcal/mol 단위)이다. 큰 Cp는 변성된 또는 불활성 단백질 조성물의 특징이다. 조성물의 열 용량의 변화 (ΔCp)는 그의 열 전이 전 및 후에 조성물의 비열을 결정함으로써 측정된다. 열적 안정성은 또한 언폴딩의 깁스(Gibbs) 자유 에너지 (ΔG), 언폴딩의 엔탈피 (ΔH), 또는 언폴딩의 엔트로피 (ΔS)를 비롯한 열역학적 안정성의 다른 파라미터를 측정하거나 결정함으로써 평가될 수 있다. 상기 생화학적 검정 중 1종 이상 (예를 들어 열 챌린지 검정)이, 조성물의 50%가 그의 활성 (예를 들어 결합 활성)을 보유하는 온도 (즉, TC 값)를 결정하는데 사용된다.
또한, 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv에 대한 돌연변이는 비돌연변이된 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv와 비교하여 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 열적 안정성을 변경시킨다. 인간 또는 인간화 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv가 BCMA 구축물 내로 혼입된 경우에, 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 인간화 scFv는 전체적인 항-BCMA CART 구축물에 열적 안정성을 부여한다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv에 열적 안정성을 부여하는 단일 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv에 열적 안정성을 부여하는 다중 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv 내의 다중 돌연변이는 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 열적 안정성에 대해 상가적 효과를 갖는다.
b) % 응집
조성물의 안정성은 그의 응집 성향을 측정함으로써 결정될 수 있다. 응집은 수많은 비-제한적인 생화학적 또는 생물물리학적 기술에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피, 예를 들어 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 조성물의 응집이 평가될 수 있다. SEC는 분자를 크기를 기초로 하여 분리한다. 칼럼은, 이온 및 소분자는 그의 내부에 수용하지만 큰 것은 수용하지 않을 중합체 겔의 반-고체 비드로 채워진다. 단백질 조성물이 칼럼의 상단에 적용되는 경우에, 치밀하게 폴딩된 단백질 (즉, 비-응집된 단백질)은 큰 단백질 응집체에 이용가능한 것보다 더 큰 부피의 용매 전반에 분포된다. 그 결과, 큰 응집체는 칼럼을 통해 보다 신속하게 이동하고, 이러한 방식으로 혼합물이 그의 성분으로 분리되거나 분획화될 수 있다. 각각의 분획은 겔로부터 용리됨에 따라 별개로 정량화될 수 있다 (예를 들어 광 산란에 의해). 따라서, 조성물의 % 응집은 분획의 농도를 겔에 적용된 단백질의 총 농도와 비교함으로써 결정될 수 있다. 안정한 조성물은 칼럼으로부터 본질적으로 단일 분획으로서 용리되고, 용리 프로파일 또는 크로마토그램에서 본질적으로 단일 피크로서 출현한다.
c) 결합 친화도
조성물의 안정성은 그의 표적 결합 친화도를 결정함으로써 평가될 수 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 매우 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 예시적인 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용한다. 표면 플라즈몬 공명은 예를 들어 비아코어(BIAcore) 시스템 (파마시아 바이오센서 아베(Pharmacia Biosensor AB), 스웨덴 웁살라 및 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도에서의 변경을 검출함으로써 실시간 생물특이적 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상이다. 추가의 설명에 대해서는, 문헌 [Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; 및 Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277]을 참조한다.
한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 항원 결합 도메인 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 항-BCMA 항체 단편의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 하나의 구체적 측면에서, 본 발명의 CAR 조성물은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, 그러한 항체 단편은 scFv를 포함한다.
다양한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 1개 또는 둘 다의 가변 영역 (예를 들어, VH 및/또는 VL) 내의, 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역 내의 및/또는 1개 이상의 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 조작된다. 하나의 구체적 측면에서, 본 발명의 CAR 조성물은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, 그러한 항체 단편은 scFv를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은, 아미노산 서열은 변경되지만 (예를 들어, 야생형으로부터) 목적하는 활성은 변경되지 않도록 추가로 변형될 수 있음을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 예를 들어, "비필수" 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환, 예를 들어 보존적 치환으로 이어지는 추가의 뉴클레오티드 치환, 예를 들어 보존적 치환이 단백질에 대해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 분자 내 비필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성에서 상이한 구조적으로 유사한 스트링으로 대체될 수 있고, 예를 들어 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 보존적 치환이 이루어질 수 있다.
유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되어 있고, 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 퍼센트 동일성은 동일한 2개 이상의 서열을 지칭한다. 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 측정된 바와 같은 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 상응을 위해 비교 및 정렬했을 때, 2개의 서열이 명시된 백분율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 가질 경우에 (예를 들어, 명시된 영역에 걸쳐, 또는 명시되지 않은 경우에 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 임의로 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성), 2개의 서열은 "실질적으로 동일하다". 임의로, 동일성은 길이가 적어도 약 50개 뉴클레오티드 (또는 10개 아미노산)인 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 길이가 100 내지 500 또는 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 20, 50, 200개 또는 그 초과의 아미노산)인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 1개의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우에 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기초로 하여 참조 서열 대비 시험 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 (위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 (예를 들어, 문헌 [Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위해 적합한 알고리즘의 2가지 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이것은 각각 문헌 [Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 및 Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물 정보 센터를 통해 공중 이용가능하다.
2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하는, ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된 문헌 [E. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com에서 이용가능) 내의 GAP 프로그램에 통합된 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453] 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 기능적으로 동등한 분자를 생성하는 출발 항체 또는 단편 (예를 들어, scFv) 아미노산 서열의 변형을 고려한다. 예를 들어, CAR 내에 포함된 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 VH 또는 VL은 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 출발 VH 또는 VL 프레임워크 영역의 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 보유하도록 변형될 수 있다. 본 발명은 기능적으로 동등한 분자를 생성하기 위해 전체 CAR 구축물의 변형, 예를 들어 CAR 구축물의 다양한 도메인의 1개 이상의 아미노산 서열의 변형을 고려한다. CAR 구축물은 출발 CAR 구축물의 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 보유하도록 변형될 수 있다.
RNA 형질감염
시험관내 전사된 RNA CAR을 생산하는 방법이 본원에 개시된다. 본 발명은 또한 세포 내로 직접 형질감염될 수 있는 CAR 코딩 RNA 구축물을 포함한다. 형질감염에 사용하기 위한 mRNA을 생성하는 방법은 특수하게 설계된 프라이머를 사용한 주형의 시험관내 전사 (IVT)에 이은 폴리A 첨가를 수반할 수 있으며, 이는 3' 및 5' 비번역 서열 ("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 발현시킬 핵산, 및 폴리A 테일을 함유하는, 전형적으로 50-2000개 염기 길이의 구축물 (서열식별번호: 35)을 생산한다. 이와 같이 생산된 RNA는 상이한 유형의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 한 측면에서, 주형은 CAR에 대한 서열을 포함한다.
한 측면에서, 항-BCMA CAR은 메신저 RNA (mRNA)에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-BCMA CAR을 코딩하는 mRNA는 CAR-발현 세포 (예를 들어 CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)의 생산을 위해 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포 내로 도입된다.
한 실시양태에서, 시험관내 전사된 RNA CAR은 일시적 형질감염의 형태로서 세포에 도입될 수 있다. RNA는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)-생성 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생산된다. 임의의 공급원으로부터의 관심 DNA는 적절한 프라이머 및 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 PCR에 의해 직접 전환될 수 있다. DNA의 공급원은 예를 들어 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 임의의 다른 적절한 DNA 공급원일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 목적하는 주형은 본 발명의 CAR이다. 예를 들어, RNA CAR을 위한 주형은 항종양 항체의 단일 쇄 가변 도메인을 포함하는 세포외 영역; 힌지 영역, 막횡단 도메인 (예를 들어, CD8a의 막횡단 도메인); 및 예를 들어 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 오픈 리딩 프레임을 함유한다. DNA는 유기체의 게놈으로부터 자연 발생 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 일부 또는 모두의 5' 및/또는 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함할 수 있다. 핵산은 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 인간 핵산 서열이다. 또 다른 실시양태에서, PCR을 위해 사용되는 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 핵산 서열이다. DNA는 대안적으로 자연 발생 유기체에서 정상적으로는 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적인 인공 DNA 서열은 함께 라이게이션되어 융합 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 형성하는 유전자의 부분을 함유하는 것이다. 함께 라이게이션되는 DNA의 부분은 단일 유기체로부터 또는 1종 초과의 유기체로부터 유래될 수 있다.
PCR은 형질감염을 위해 사용되는 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해 사용된다. PCR을 수행하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머는 PCR을 위한 주형으로서 사용되는 DNA의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 설계된다. 본원에 사용된 "실질적으로 상보적인"은 프라이머 서열 내의 대부분의 또는 모든 염기가 상보적이거나 또는 1개 이상의 염기가 비-상보적이거나 미스매치된 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열은 PCR을 위해 사용되는 어닐링 조건 하에서 의도된 DNA 표적과 어닐링하거나 혼성화할 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 5' 및 3' UTR을 포함하는, 세포에서 정상적으로 전사되는 핵산의 부분 (오픈 리딩 프레임)을 증폭하도록 설계될 수 있다. 프라이머는 또한 특정한 관심 도메인을 코딩하는 핵산의 부분을 증폭하도록 설계될 수 있다. 한 실시양태에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 모두 또는 일부를 포함하는 인간 cDNA의 코딩 영역을 증폭하도록 설계될 수 있다. PCR을 위해 유용한 프라이머는 관련 기술분야에 널리 공지된 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. "정방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 상류에 존재하는 DNA 주형 상의 뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "상류"는 코딩 가닥과 관련하여 증폭시킬 DNA 서열에 대해 5' 위치를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭시킬 DNA 서열의 하류에 존재하는 이중-가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "하류"는 코딩 가닥과 관련하여 증폭시킬 DNA 서열의 3' 위치를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
PCR에 유용한 임의의 DNA 폴리머라제가 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 시약 및 폴리머라제는 수많은 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진하는 능력을 갖는 화학 구조도 사용될 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 한 실시양태에서, 5' UTR은 1 내지 3000개 뉴클레오티드 길이이다. 코딩 영역에 부가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 상이한 영역에 어닐링하는 PCR용 프라이머의 설계를 포함하나 이에 제한되지는 않는 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 전사된 RNA의 형질감염 후에 최적 번역 효율을 달성하기 위해 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 핵산에 대한 자연 발생, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열은 UTR 서열을 정방향 및 역방향 프라이머 내로 혼입시킴으로써 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 부가될 수 있다. 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율의 변형을 위해 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열 내의 AU-풍부 요소가 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다고 공지되어 있다. 따라서, 3' UTR은 관련 기술분야에 널리 공지된 UTR의 특성을 기초로 하여 전사되는 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나 설계될 수 있다.
한 실시양태에서, 5' UTR은 내인성 핵산의 코작(Kozak) 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 내인성이 아닌 5' UTR이 상기 기재된 바와 같이 PCR에 의해 부가되는 경우에, 컨센서스 코작 서열은 5' UTR 서열의 부가에 의해 재설계될 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 효율적인 번역을 가능하게 하기 위해 모든 RNA에 필요한 것으로 보이지는 않는다. 많은 mRNA에 대한 코작 서열의 필요성은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 다른 실시양태에서, 5' UTR은 그의 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스의 5' UTR일 수 있다. 다른 실시양태에서, 다양한 뉴클레오티드 유사체가 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 저해하기 위해 3' 또는 5' UTR에 사용될 수 있다.
유전자 클로닝을 필요로 하지 않으면서 RNA를 DNA 주형으로부터 합성할 수 있기 위해, 전사 프로모터는 전사시킬 서열의 상류의 DNA 주형에 부착되어야 한다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터로서 기능하는 서열이 정방향 프라이머의 5' 말단부에 부가되는 경우에, RNA 폴리머라제 프로모터는 전사되는 오픈 리딩 프레임의 상류의 PCR 생성물 내로 혼입된다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 T7 폴리머라제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는 T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 컨센서스 뉴클레오티드 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
바람직한 실시양태에서, mRNA는 세포에서 리보솜 결합, 번역의 개시 및 mRNA의 안정성을 결정하는 5' 말단 및 3' 폴리(A) 테일 상에 둘 다의 캡을 갖는다. 원형 DNA 주형, 예를 들어 플라스미드 DNA에서, RNA 폴리머라제는 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 콘카테머 생성물을 생산한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사 후에 폴리아데닐화된 경우에도 진핵 형질감염에 유효하지 않은 정상 크기의 mRNA를 생성한다.
선형 DNA 주형 상에서, 파지 T7 RNA 폴리머라제는 주형의 마지막 염기를 넘어 전사체의 3' 말단을 연장시킬 수 있다 (Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)).
폴리A/T 스트레치의 DNA 주형 내로의 통상적인 통합 방법은 분자 클로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA 내로 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발할 수 있고, 이것은 박테리아 세포로부터 수득된 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 다른 이상에 의해 고도로 오염되는 이유이다. 이는 클로닝 절차를 어렵고 시간 소모적으로 만들 뿐만 아니라 종종 신뢰할 수 없게 만든다. 이러한 이유 때문에, 클로닝 없이 폴리A/T 3' 스트레치를 갖는 DNA 주형의 구축을 가능하게 하는 방법이 매우 바람직하다.
전사 DNA 주형의 폴리A/T 절편은 폴리T 테일, 예컨대 100T 테일 (서열식별번호: 31) (크기는 50-5000 T일 수 있음 (서열식별번호: 32))을 함유하는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 동안, 또는 DNA 라이게이션 또는 시험관내 재조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 다른 방법에 의해 PCR 후에 생산될 수 있다. 폴리(A) 테일은 또한 안정성을 RNA에 제공하고, 그의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 테일의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관관계가 있다. 한 실시양태에서, 폴리(A) 테일은 100 내지 5000개 아데노신 (서열식별번호: 33)이다.
RNA의 폴리(A) 테일은 폴리(A) 폴리머라제, 예컨대 이. 콜라이 폴리A 폴리머라제 (E-PAP)를 사용하여 시험관내 전사 후에 추가로 연장될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리(A) 테일의 길이를 100개의 뉴클레오티드로부터 300 내지 400개의 뉴클레오티드 (서열식별번호: 34)로 증가시키는 것은, RNA의 번역 효율의 약 2-배 증가를 발생시킨다. 추가로, 상이한 화학기의 3' 말단에 대한 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형된/인공 뉴클레오티드, 압타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 폴리(A) 테일 내로 혼입될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
5' 캡이 또한 RNA 분자에게 안정성을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 관련 기술분야에 공지되고 본원에 기재된 기술을 사용하여 제공된다 (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
본원에 개시된 방법에 의해 생산된 RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열을 함유할 수 있다. IRES 서열은 mRNA에 대한 캡-비의존성 리보솜 결합을 개시하고 번역의 개시를 용이하게 하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다. 세포 투과성 및 생존을 용이하게 하는 인자, 예컨대 당, 펩티드, 지질, 단백질, 항산화제, 및 계면활성제를 함유할 수 있는, 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질이 포함될 수 있다.
RNA는 임의의 수많은 상이한 방법, 예를 들어 전기천공 (아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector)-II (아막사 바이오시스템즈(Amaxa Biosystems), 독일 쾰른), (ECM 830 (BTX) (하버드 인스트루먼츠(Harvard Instruments), 매사추세츠주 보스턴) 또는 진 펄서(Gene Pulser) II (바이오라드(BioRad), 콜로라도주 덴버), 멀티포레이터(Multiporator) (에펜도르프(Eppendort), 독일 함부르크), 리포펙션을 사용한 양이온성 리포솜 매개 형질감염, 중합체 캡슐화, 펩티드 매개 형질감염, 또는 바이오리스틱 입자 전달 시스템, 예컨대 "유전자 총" (예를 들어, 문헌 [Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 상업적으로 입수가능한 방법을 사용하여 표적 세포 내로 도입될 수 있다.
비-바이러스 전달 방법
일부 측면에서, 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산을 세포 또는 조직 또는 대상체 내로 전달하는데 비-바이러스 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-바이러스 방법은 트랜스포손 (전위가능 요소로도 불림)의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스포손은 게놈 내 위치에서 그 자체를 삽입할 수 있는 DNA 조각, 예를 들어 자기-복제 및 그의 카피의 게놈 내로의 삽입이 가능한 DNA 조각, 또는 보다 긴 핵산으로부터의 스플라이싱 및 게놈 내 또 다른 위치 내로의 삽입이 가능한 DNA 조각이다. 예를 들어, 트랜스포손은 전위를 위한 역전된 반복부 플랭킹 유전자로 구성된 DNA 서열을 포함한다.
트랜스포손을 사용한 핵산 전달의 예시적인 방법은 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템(Sleeping Beauty transposon system) (SBTS) 및 피기백(piggyBac) (PB) 트랜스포손 시스템을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; 및 Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83]을 참조하고, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다.
SBTS는 2개의 성분: 1) 트랜스진을 함유하는 트랜스포손 및 2) 트랜스포사제 효소의 공급원을 포함한다. 트랜스포사제는 트랜스포손을 캐리어 플라스미드 (또는 다른 공여자 DNA)로부터 표적 DNA, 예컨대 숙주 세포 염색체/게놈으로 전위시킬 수 있다. 예를 들어, 트랜스포사제는 캐리어 플라스미드/공여자 DNA에 결합하고, 플라스미드로부터 트랜스포손 (트랜스진(들) 포함)을 잘라내고, 이를 숙주 세포의 게놈 내로 삽입한다. 예를 들어, 상기 문헌 [Aronovich et al.]을 참조한다.
예시적인 트랜스포손은 pT2-기반 트랜스포손을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47; 및 Singh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971]을 참조하고, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 예시적인 트랜스포사제는 Tc1/마리너-유형 트랜스포사제, 예를 들어 SB10 트랜스포사제 또는 SB11 트랜스포사제 (예를 들어 시토메갈로바이러스 프로모터로부터 발현될 수 있는 과다활성 트랜스포사제)를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Aronovich et al.; Kebriaei et al.; 및 Grabundzija et al.]을 참조하고, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다
SBTS의 사용은 트랜스진, 예를 들어 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산의 효율적인 통합 및 발현을 허용한다. 예를 들어 트랜스포손 시스템, 예컨대 SBTS를 사용하여 본원에 기재된 CAR을 안정적으로 발현하는 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 생성하는 방법이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 방법에 따라, 일부 실시양태에서, 1종 이상의 핵산, 예를 들어 SBTS 성분을 함유하는 플라스미드가 세포 (예를 들어, T 또는 NK 세포)에게 전달된다. 예를 들어, 핵산(들)은 핵산 (예를 들어, 플라스미드 DNA) 전달의 표준 방법, 예를 들어 본원에 기재된 방법, 예를 들어 전기천공, 형질감염 또는 리포펙션에 의해 전달된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 트랜스진, 예를 들어 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스포손을 함유한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 트랜스진 (예를 들어, 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산) 뿐만 아니라 트랜스포사제 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포손을 함유한다. 다른 실시양태에서, 2개의 핵산을 갖는 시스템, 예를 들어 이중-플라스미드 시스템이 제공되며, 예를 들어 여기서 제1 플라스미드는 트랜스진을 포함하는 트랜스포손을 함유하고, 제2 플라스미드는 트랜스포사제 효소를 코딩하는 핵산 서열을 함유한다. 예를 들어, 제1 및 제2 핵산은 숙주 세포 내로 공동-전달된다.
일부 실시양태에서, SBTS를 사용한 유전자 삽입 및 뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), CRISPR/Cas 시스템, 또는 조작된 메가뉴클레아제 재조작된 귀소 엔도뉴클레아제)를 사용한 유전자 편집의 조합을 사용하는 것에 의해, 본원에 기재된 CAR을 발현하는 세포, 예를 들어 T 또는 NK 세포가 생성된다.
일부 실시양태에서, 비-바이러스 전달 방법의 사용은 세포, 예를 들어 T 또는 NK 세포의 재프로그래밍 및 세포의 대상체 내로의 직접 주입을 허용한다. 비-바이러스 벡터의 이점은 환자 집단을 충족시키는데 필요한 충분한 양을 생산하는 것의 용이성 및 상대적으로 낮은 비용, 저장 동안의 안정성, 및 면역원성의 결여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
CAR을 코딩하는 핵산 구축물
본 발명은 또한 본원에 기재된 1개 이상의 CAR 구축물을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 핵산 분자는 메신저 RNA 전사체로서 제공된다. 한 측면에서, 핵산 분자는 DNA 구축물로서 제공된다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 CAR은 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, 인간 항-BCMA 결합 도메인), 막횡단 도메인, 및 자극 도메인, 예를 들어 공동자극 신호전달 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인, 예를 들어 제타 쇄를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148 또는 서열식별번호: 149로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항-BCMA 결합 도메인이다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인이다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인이다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 7의 서열 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열식별번호: 8의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 CD27 공동자극 도메인 또는 서열식별번호: 379의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 CD28 공동자극 도메인 또는 서열식별번호: 381의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 ICOS 공동자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8의 서열 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 리더 서열, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148 또는 서열식별번호: 149로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 scFv 도메인, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)의 힌지 영역, 서열식별번호: 6의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 막횡단 도메인, 서열식별번호: 7의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인 또는 서열식별번호: 8의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 CD27 공동자극 도메인 또는 서열식별번호: 1104의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 CD28 공동자극 도메인 또는 서열식별번호: 1106의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 ICOS 공동자극 도메인, 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함하는 CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 분자는 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148 및 서열식별번호: 149로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항-BCMA 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 분자를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 상기 항-BCMA 결합 도메인은 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148 및 서열식별번호: 149로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 CAR 분자는 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 예를 들어 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된, 예를 들어 본원에 기재된 단백질의 기능적 신호전달 도메인이다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열식별번호: 7의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 예를 들어 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으부터 선택된, 예를 들어 본원에 기재된 단백질의 막횡단 도메인이다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열식별번호: 6의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열식별번호: 7의 서열 및 서열식별번호: 9의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, 항-BCMA 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 서열식별번호: 2를 포함한다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 1의 리더 서열, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148 및 서열식별번호: 149로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 scFv 도메인, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5의 힌지 영역, 서열식별번호: 6의 서열을 갖는 막횡단 도메인, 서열식별번호: 7의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인, 또는 서열식별번호: 8의 서열을 갖는 CD27 공동자극 도메인, 또는 서열식별번호: 1104의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 CD28 공동자극 도메인 또는 서열식별번호: 1106의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 ICOS 공동자극 도메인, 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함하는 코딩된 CAR 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 코딩된 CAR 분자는 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 102, 서열식별번호: 103, 서열식별번호: 104, 서열식별번호: 105, 서열식별번호: 106, 서열식별번호: 107, 서열식별번호: 108, 서열식별번호: 109, 서열식별번호: 110, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113 , 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 216, 서열식별번호: 217, 서열식별번호: 218, 서열식별번호: 219, 서열식별번호: 220, 서열식별번호: 221, 서열식별번호: 222, 서열식별번호: 223, 서열식별번호: 224, 서열식별번호: 225, 서열식별번호: 226, 서열식별번호: 227, 서열식별번호: 228, 서열식별번호: 229, 서열식별번호: 230, 서열식별번호: 231, 서열식별번호: 232, 및 서열식별번호: 233으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
목적하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 관련 기술분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 표준 기술을 사용하여 이를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득할 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 클로닝하기 보다는 합성적으로 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA가 삽입된 벡터를 제공한다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 딸세포에서 트랜스진의 장기간의 안정한 통합 및 그의 증식을 가능하게 하기 때문에 장기간의 유전자 전달을 달성하기 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 비-증식 세포, 예컨대 간세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 종양-레트로바이러스, 예컨대 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가의 이점을 갖는다. 이는 또한 낮은 면역원성의 추가의 이점을 갖는다. 레트로바이러스 벡터는 또한, 예를 들어 감마레트로바이러스 벡터일 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는, 예를 들어 프로모터, 패키징 신호 (Ψ), 프라이머 결합 부위 (PBS), 1개 이상 (예를 들어, 2개)의 긴 말단 반복부 (LTR), 및 관심 트랜스진, 예를 들어 CAR을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 감마레트로바이러스 벡터는 바이러스 구조 유전자, 예컨대 gag, pol, 및 env가 결여되어 있을 수 있다. 예시적인 감마레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV), 비장-초점 형성 바이러스 (SFFV), 및 골수증식성 육종 바이러스 (MPSV), 및 그로부터 유래된 벡터를 포함한다. 다른 감마레트로바이러스 벡터가, 예를 들어 문헌 [Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713]에 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 목적하는 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노바이러스 벡터 (A5/35)이다. 또 다른 실시양태에서, CAR을 코딩하는 핵산의 발현은 트랜스포손, 예컨대 슬리핑 뷰티, CRISPR, CAS9, 및 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하여 달성할 수 있다. 하기 문헌 [June et al. 2009Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716]을 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
간단히 요약하면, CAR을 코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩티드 또는 그의 부분을 코딩하는 핵산을 프로모터에 작동가능하게 연결하고, 구축물을 발현 벡터 내로 혼입시킴으로써 달성된다. 벡터는 진핵세포에서의 복제 및 통합 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 목적하는 핵산 서열의 발현의 조절을 위해 유용한 프로모터를 함유한다.
본 발명의 발현 구축물은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용한 핵산 면역화 및 유전자 요법을 위해 사용될 수 있다. 유전자 전달을 위한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함하는 미국 특허 번호 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466을 참조한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 유전자 요법 벡터를 제공한다.
핵산은 수많은 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특정한 관심 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 서열분석 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY], 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 포진 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 적합한 벡터는 적어도 1종의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 1개 이상의 선택 마커를 함유한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
수많은 바이러스 기반 시스템이 포유동물 세포 내로의 유전자 전달을 위해 개발된 바 있다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입되고 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고, 생체내에서 또는 생체외에서 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 수많은 레트로바이러스 시스템이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 수많은 아데노바이러스 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 개시 부위의 30-110 bp 상류의 영역에 위치하지만, 수많은 프로모터는 기능적 요소를 또한 개시 부위의 하류에 함유하는 것으로 밝혀진 바 있다. 프로모터 요소 사이의 간격은 빈번하게 탄력적이어서, 프로모터 기능은 요소가 역전되거나 서로에 대해 이동할 때 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전 50 bp까지 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화하기 위해 협동적 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다.
포유동물 T 세포에서 CAR 트랜스진을 발현할 수 있는 프로모터의 예는 EF1a 프로모터이다. 천연 EF1a 프로모터는 아미노아실 tRNA의 리보솜으로의 효소적 전달을 담당하는 신장 인자-1 복합체의 알파 서브유닛의 발현을 구동한다. EF1a 프로모터는 포유동물 발현 플라스미드에서 광범하게 사용된 바 있고, 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝된 트랜스진으로부터 CAR 발현을 구동하는데 유효한 것으로 밝혀진 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 한 측면에서, EF1a 프로모터는 서열식별번호: 11로서 제공된 서열을 포함한다.
프로모터의 또 다른 예는 극초기 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 그에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 그러나, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 극초기 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 예컨대 비제한적으로 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 신장 인자-1α 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터인 인간 유전자 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용으로 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현을 목적으로 하는 경우에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 턴 온할 수 있거나, 또는 발현을 목적으로 하지 않는 경우에 발현을 턴 오프할 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라시클린 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
프로모터의 또 다른 예는 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터이다. 실시양태에서, 말단절단된 PGK 프로모터 (예를 들어, 야생형 PGK 프로모터 서열과 비교하여 1개 이상, 예를 들어 1, 2, 5, 10, 100, 200, 300 또는 400개의 뉴클레오티드 결실을 갖는 PGK 프로모터)가 바람직할 수 있다. 예시적인 PGK 프로모터의 뉴클레오티드 서열이 하기 제공된다.
WT PGK 프로모터
Figure pct00106
예시적인 말단절단된 PGK 프로모터:
PGK100:
Figure pct00107
PGK200:
Figure pct00108
PGK300:
Figure pct00109
PGK400:
Figure pct00110
벡터는 또한, 예를 들어 분비를 용이하게 하는 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자 (예를 들어, 소 성장 호르몬 (BGH) 유전자로부터), 에피솜 복제 및 원핵생물에서의 복제를 가능하게 하는 요소 (예를 들어 SV40 기원 및 ColE1 또는 관련 기술분야에 공지되어 있는 다른 것) 및/또는 선택을 가능하게 하는 요소 (예를 들어, 암피실린 저항성 유전자 및/또는 제오신 마커)를 포함할 수 있다.
CAR 폴리펩티드 또는 그의 부분의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입되는 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염되거나 감염될 것이 모색되는 세포의 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 하기 위한 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 다를 함유할 수 있다. 다른 측면에서, 선택 마커는 DNA의 개별 조각 상에 보유되고, 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택 마커 및 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서 발현이 가능하도록 하는 적절한 조절 서열과 플랭킹될 수 있다. 유용한 선택 마커는 예를 들어 항생제-저항성 유전자, 예컨대 neo 등을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로 리포터 유전자는, 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않고, 그의 발현이 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어 효소적 활성에 의해 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제를 코딩하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 널리 공지되어 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조하거나 상업적으로 입수할 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 수준의 발현을 보이는, 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 구축물은 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고, 프로모터-구동 전사를 조정하는 능력에 대해 작용제를 평가하는데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 벡터는 제2 CAR을 코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 제2 CAR은 급성 골수성 백혈병 세포 상에서 발현되는 표적, 예컨대 예를 들어, CD123, CD34, CLL-1, 폴레이트 수용체 베타, 또는 FLT3; 또는 B 세포 상에서 발현되는 표적, 예를 들어 CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b, 또는 CD79a에 대한 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 제1 항원에 특이적으로 결합하고 공동자극 신호전달 도메인을 갖지만 1차 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR을 코딩하는 핵산 서열, 및 제2의, 상이한 항원에 특이적으로 결합하고 1차 신호전달 도메인을 갖지만 공동자극 신호전달 도메인은 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 BCMA 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하는 제1 BCMA CAR을 코딩하는 핵산 및 BCMA 이외의 항원 (예를 들어, AML 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CD123, CD34, CLL-1, 폴레이트 수용체 베타, 또는 FLT3; 또는 B 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b, 또는 CD79a)을 표적화하고 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 벡터는 BCMA 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제1 BCMA CAR을 코딩하는 핵산 및 BCMA 이외의 항원 (예를 들어, AML 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CD123, CD34, CLL-1, 폴레이트 수용체 베타, 또는 FLT3; 또는 B 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어, CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b, 또는 CD79a)에 특이적으로 결합하고 항원에 대한 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다.
한 실시양태에서, 벡터는 본원에 기재된 BCMA CAR을 코딩하는 핵산 및 억제 CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 CAR은, 암 세포에서는 발견되지 않지만 정상 세포, 예를 들어 BCMA를 또한 발현하는 정상 세포에서 발견되는 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 억제 CAR은 억제 분자의 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 예를 들어, 억제 CAR의 세포내 도메인은 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타의 세포내 도메인일 수 있다.
실시양태에서, 벡터는 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA CAR 및 제2 CAR, 예를 들어 억제 CAR 또는 BCMA 이외의 항원 (예를 들어, AML 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CD123, CLL-1, CD34, FLT3, 또는 폴레이트 수용체 베타; 또는 B 세포 상에서 발현된 항원, 예를 들어 CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b, 또는 CD79a)에 특이적으로 결합하는 CAR을 코딩하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, CAR을 코딩하는 2개 이상의 핵산 서열은 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 단일 핵산 분자에 의해 코딩된다. 이러한 측면에서, 2개 이상의 CAR은, 예를 들어 1개 이상의 펩티드 절단 부위 (예를 들어, 세포내 프로테아제에 대한 자가-절단 부위 또는 기질)에 의해 분리될 수 있다. 펩티드 절단 부위의 예는 하기를 포함하며, 여기서 GSG 잔기는 임의적이다:
Figure pct00111
유전자를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 관련 기술분야의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 옮겨질 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY]을 참조한다. 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드의 도입을 위한 바람직한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
숙주 세포 내로 관심 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362를 참조한다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀, 및 리포솜을 비롯한 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜 (예를 들어, 인공 막 소포)이다. 핵산의 최신 기술의 표적화된 전달, 예컨대 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 마이크로미터-미만 크기의 전달 시스템을 사용한 폴리뉴클레오티드의 전달을 위한 다른 방법이 이용가능하다.
비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제제의 사용은 숙주 세포 내로의 핵산의 도입 (시험관내, 생체외 또는 생체내)을 위해 고려된다. 또 다른 측면에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 점재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜 내에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질 함유 용액 중에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 내에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함께 함유 또는 복합체화되거나, 또는 지질과 달리 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합 조성물은 용액 중의 임의의 특정한 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조로, 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액 중에 점재되고, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연 발생하는 지방 액적, 뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 그의 유도체, 예컨대 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜, 및 알데히드를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다.
사용하기 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 미주리주 세인트 루이스의 시그마(Sigma)로부터 수득할 수 있고; 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 케이 & 케이 래보러토리즈(K & K Laboratories) (뉴욕주 플레인뷰)로부터 수득할 수 있고; 콜레스테롤 ("Chol")은 칼바이오켐-베링(Calbiochem-Behring)으로부터 수득할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 다른 지질은 아반티 폴라 리피즈, 인크.(Avanti Polar Lipids, Inc.) (앨라배마주 버밍엄)로부터 수득할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 내의 지질의 원액은 약 -20℃에서 저장될 수 있다. 클로로포름이 메탄올보다 더 용이하게 증발되기 때문에, 클로로포름이 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 둘러싸는 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다층막 지질 비히클을 포괄하는 일반적 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이들은 인지질이 과량의 수용액 중에 현탁될 경우에 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄된 구조의 형성 전에 자기-재배열을 거치고, 물 및 지질 이중층들 사이의 용해된 용질을 포획한다 (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 정상 소포 구조가 아니라 용액 중에서 상이한 구조를 갖는 조성물도 포괄된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 가정할 수 있거나 또는 단지 지질 분자의 불균일 응집체로서 존재할 수 있다. 또한, 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 또는 달리 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키기 위해 사용된 방법과 상관없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 "분자 생물학적" 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 발명의 범주 내에 포함되는 작용제를 확인하기 위해 본원에 기재된 검정에 의해, 예컨대 특정한 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 "생화학적" 검정을 포함한다.
본 발명은 CAR 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 한 측면에서, CAR 벡터는 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포 내로 직접 형질도입될 수 있다. 한 측면에서, 벡터는 클로닝 또는 발현 벡터, 예를 들어 1종 이상의 플라스미드 (예를 들어, 발현 플라스미드, 클로닝 벡터, 미니서클, 미니벡터, 이중 미세 염색체), 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 구축물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 벡터이다. 한 측면에서, 벡터는 포유동물 T 세포 또는 NK 세포에서 CAR 구축물을 발현할 수 있다. 한 측면에서, 포유동물 T 세포는 인간 T 세포이다. 한 측면에서, 포유동물 NK 세포는 인간 NK 세포이다.
세포의 공급원
확장 및 유전적 변형 전에, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)의 공급원을 대상체로부터 수득한다. 용어 "대상체"는 면역 반응이 도출될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유동물)를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 그의 트랜스제닉 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 비롯한 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 관련 기술분야에서 입수가능한 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)주의 임의의 수가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, T 세포는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 많은 기술, 예컨대 피콜(Ficoll)™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있다. 하나의 바람직한 측면에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 분리반출술에 의해 수득된다. 분리반출술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포를 비롯한 림프구, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다. 한 측면에서, 분리반출술에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하고 세포를 후속 프로세싱 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지에 두기 위해 세척될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세척한다. 대안적 측면에서, 세척 용액은 칼슘이 결여되어 있고, 마그네슘이 결여될 수 있거나 또는 모두는 아니지만 많은 2가 양이온이 결여될 수 있다.
칼슘의 부재 하에 초기 활성화 단계는 확대된 활성화로 이어질 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백한 바와 같이, 세척 단계는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 반-자동화 "관통형" 원심분리기 (예를 들어, 코브(Cobe) 2991 셀 프로세서, 박스터 시토메이트(Baxter CytoMate), 또는 해모네틱스 셀 세이버 5(Haemonetics Cell Saver 5))를 제조업체의 지침에 따라 사용하는 것에 의해 달성할 수 있다. 세척 후에, 세포를 다양한 생체적합성 완충제, 예컨대 Ca-무함유, Mg-무함유 PBS, 플라스마라이트 A(PlasmaLyte A), 또는 완충제 존재 또는 부재 하의 다른 염수 용액 중에 재현탁시킬 수 있다. 대안적으로, 분리반출술 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지 내에 직접 재현탁시킬 수 있다.
본 출원의 방법은 5% 이하, 예를 들어 2%의 인간 AB 혈청을 포함하는 배양 배지 조건을 이용할 수 있고, 공지된 배양 배지 조건 및 조성, 예를 들어 문헌 [Smith et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement" Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31]에 기재된 것을 사용할 수 있는 것으로 인식된다.
한 측면에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 퍼콜(PERCOLL)™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 분리에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다.
T 세포의 특정 하위집단, 예컨대 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, T 세포는 항-CD3/항-CD28 (예를 들어, 3x28)-접합된 비드, 예컨대 디나비즈(DYNABEADS)? M-450 CD3/CD28 T와 함께 목적하는 T 세포의 양성 선택을 위한 충분한 시간 동안 인큐베이션함으로써 단리된다. 한 측면에서, 시간은 약 30분이다. 추가 측면에서, 시간은 30분 내지 36시간 또는 그 초과 및 그 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 추가 측면에서, 시간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 또 다른 바람직한 측면에서, 시간은 10 내지 24시간이다. 한 측면에서, 인큐베이션 시간은 24시간이다. 다른 세포 유형과 비교하여 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서, 예컨대 종양 조직으로부터 또는 면역손상 개체로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 단리하는데 있어서, T 세포를 단리하기 위해 보다 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 또한, 보다 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 단순히 시간을 단축하거나 연장함으로써 T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 하고/거나, 비드 대 T 세포의 비를 증가시키거나 감소시킴으로써 (본원에 추가로 기재된 바와 같음), 배양 개시 시 또는 과정 동안의 다른 시점에 T 세포의 하위집단을 우선적으로 선택할 수 있다. 추가로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단은 배양 개시 시 또는 다른 목적하는 시점에 우선적으로 선택될 수 있다. 통상의 기술자는 다중 선택 라운드가 또한 본 발명과 관련하여 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 특정 측면에서, 활성화 및 확장 과정에서 선택 절차를 수행하고 "비선택된" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "비선택된" 세포는 또한 추가 라운드의 선택에 적용될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 지시된 항체의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 1가지 방법은 음성 선택된 세포 상에 제시된 세포 표면 마커에 대해 지시된 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유동 세포측정법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 측면에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 풍부화하거나 또는 양성 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 특정 측면에서, T 조절 세포는 항-C25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
본원에 기재된 방법은, 예를 들어 본원에 기재된 예를 들어 음성 선택 기술을 사용하여, 예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 특정 하위집단, T 조절 세포-고갈 집단, CD25+ 고갈 세포의 선택을 포함할 수 있다. 바람직하게는, T 조절 고갈 세포의 집단은 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만의 CD25+ 세포를 함유한다.
한 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포는 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드, IL-2를 사용하여 집단으로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드는 기질, 예를 들어 비드에 접합되거나, 또는 달리 기질, 예를 들어 비드 상에 코팅된다. 한 실시양태에서, 항-CD25 항체 또는 그의 단편은 본원에 기재된 바와 같은 기질에 접합된다.
한 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포는 밀테니(Miltenyi)™로부터의 CD25 고갈 시약을 사용하여 집단으로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 세포 대 CD25 고갈 시약의 비는 1e7개 세포 대 20 uL, 또는 1e7개 세포 대 15 uL, 또는 1e7개 세포 대 10 uL, 또는 1e7개 세포 대 5 uL, 또는 1e7개 세포 대 2.5 uL, 또는 1e7개 세포 대 1.25 uL이다. 한 실시양태에서, 예를 들어 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 고갈을 위해, 5억개 초과의 세포/ml가 사용된다. 추가 측면에서, 6억, 7억, 8억, 또는 9억개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다.
한 실시양태에서, 고갈될 면역 이펙터 세포의 집단은 약 6 x 109개의 CD25+ T 세포를 포함한다. 다른 측면에서, 고갈될 면역 이펙터 세포의 집단은 약 1 x 109개 내지 1x 1010개의 CD25+ T 세포, 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함한다. 한 실시양태에서, T 조절 고갈 세포의 생성된 집단은 2 x 109개의 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포, 또는 그 미만 (예를 들어, 1 x 109개, 5 x 108개, 1 x 108개, 5 x 107개, 1 x 107개, 또는 그 미만의 CD25+ 세포)을 갖는다.
한 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포는 고갈 튜빙 세트, 예컨대 예를 들어 튜빙 162-01이 구비된 클리니맥(CliniMAC) 시스템을 사용하여 집단으로부터 제거된다. 한 실시양태에서, 클리니맥 시스템은 고갈 설정, 예컨대 예를 들어, DEPLETION2.1로 가동된다.
특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 분리반출술 전 또는 CAR-발현 세포 생성물의 제조 동안 대상체에서 면역 세포의 음성 조절자의 수준을 감소시키는 것 (예를 들어, 원치않는 면역 세포, 예를 들어 TREG 세포의 수를 감소시키는 것)은 대상체의 재발 위험을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, TREG 세포를 고갈시키는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. TREG 세포를 감소시키는 방법은 시클로포스파미드, 항-GITR 항체 (본원에 기재된 항-GITR 항체), CD25-고갈 및 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 제조 방법은 CAR-발현 세포의 제조 전에 TREG 세포의 수를 감소시키는 것 (예를 들어, 고갈시키는 것)을 포함한다. 예를 들어, 제조 방법은, 예를 들어 CAR-발현 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포) 산물의 제조 전에 TREG 세포를 고갈시키기 위해 샘플, 예를 들어 분리반출술 샘플을 항-GITR 항체 및/또는 항-CD25 항체 (또는 그의 단편 또는 CD25-결합 리간드)와 접촉시키는 것을 포함한다
한 실시양태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 TREG 세포를 감소시키는 1종 이상의 요법으로 사전-처리되고, 그에 의해 CAR-발현 세포 처리에 대한 대상체의 재발 위험이 감소된다. 한 실시양태에서, TREG 세포를 감소시키는 방법은 대상체에게 시클로포스파미드, 항-GITR 항체 중 1종 이상의 투여, CD25-고갈, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 시클로포스파미드, 항-GITR 항체 중 1종 이상의 투여, CD25-고갈, 또는 그의 조합은 CAR-발현 세포 생성물의 주입 전, 그 동안 또는 그 후에 일어날 수 있다.
한 실시양태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 시클로포스파미드로 사전-처리되고, 그에 의해 CAR-발현 세포 처리에 대한 대상체의 재발 위험이 감소된다. 한 실시양태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 생성물 제조를 위한 세포의 수집 전에 항-GITR 항체로 사전-처리되고, 그에 의해 CAR-발현 세포 처리에 대한 대상체의 재발 위험이 감소된다.
한 실시양태에서, 제거될 세포의 집단은 조절 T 세포도 또는 종양 세포도 아니지만, CART 세포의 확장 및/또는 기능에 달리 음의 영향을 미치는 세포, 예를 들어 CD14, CD11b, CD33, CD15, 또는 잠재적으로 면역 억제 세포에 의해 발현되는 다른 마커를 발현하는 세포이다. 한 실시양태에서, 이러한 세포는 조절 T 세포 및/또는 종양 세포와 공동으로, 또는 상기 고갈 후에, 또는 또 다른 순서로 제거되는 것이 고려된다.
본원에 기재된 방법은 1개 초과의 선택 단계, 예를 들어 1개 초과의 고갈 단계를 포함할 수 있다. 음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는, 예를 들어 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커로 지시되는 항체의 조합에 의해 달성될 수 있다. 1가지 방법은 음성 선택된 세포의 표면 상에 존재하는 세포 표면 마커로 지시되는 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유동 세포측정법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 종양 항원, 예를 들어 CD25를 포함하지 않는 종양 항원, 예를 들어 CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 또는 CD11b를 발현하는 집단으로부터 세포를 제거하여 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 CAR의 발현에 적합한 T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 및 종양 항원 고갈 세포의 집단을 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 종양 항원 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어, 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 및 항종양 항원 항체 또는 그의 단편은 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 동일한 기질, 예를 들어 비드에 부착될 수 있거나, 또는 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 항종양 항원 항체 또는 그의 단편은 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 혼합물인 개별 비드에 부착될 수 있다. 다른 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포의 제거 및 종양 항원 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 하나의 순서로 일어날 수 있다.
또한, 체크 포인트 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 체크 포인트 억제제를 발현하는 집단으로부터 세포, 예를 들어 PD1+ 세포, LAG3+ 세포, 및 TIM3+ 세포 중 1종 이상을 제거하여, T 조절 고갈, 예를 들어 CD25+ 고갈 세포 및 체크 포인트 억제제 고갈 세포, 예를 들어 PD1+, LAG3+ 및/또는 TIM3+ 고갈 세포의 집단을 제공하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 예시적인 체크 포인트 억제제는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타를 포함한다. 실시양태에서, 체크보인트 억제제는 PD1 또는 PD-L1이다. 한 실시양태에서, 체크 포인트 억제제 발현 세포는 T 조절, 예를 들어 CD25+ 세포와 동시에 제거된다. 예를 들어, 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 및 항체크 포인트 억제제 항체 또는 그의 단편은 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 동일한 비드에 부착될 수 있거나, 또는 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 항체크 포인트 억제제 항체 또는 그의 단편은 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 혼합물인 개별 비드에 부착될 수 있다. 다른 실시양태에서, T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ 세포의 제거 및 체크 포인트 억제제 발현 세포의 제거는 순차적이고, 예를 들어 어느 하나의 순서로 일어날 수 있다.
한 실시양태에서, IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B 및 퍼포린, 또는 다른 적절한 분자, 예를 들어 다른 시토카인 중 1종 이상을 발현하는 T 세포 집단이 선택될 수 있다. 세포 발현에 대해 스크리닝하는 방법은 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2013/126712에 기재된 방법에 의해 결정될 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의한 세포의 목적하는 집단의 단리를 위해, 세포의 농도 및 표면 (예를 들어, 입자, 예컨대 비드)은 변할 수 있다. 특정 측면에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는 (예를 들어, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 20억개/ml의 농도가 사용된다. 한 측면에서, 10억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가 측면에서, 1억개 초과/ml가 사용된다. 추가 측면에서, 1천만, 1천5백만, 2천만, 2천5백만, 3천만, 3천5백만, 4천만, 4천5백만, 또는 5천만개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 한 측면에서, 7천5백만, 8천만, 8천5백만, 9천만, 9천5백만, 또는 1억개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가 측면에서, 1억2천5백만 또는 1억5천만개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다.
높은 농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 발생시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T 세포의, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플 (예를 들어, 백혈병성 혈액, 종양 조직 등)로부터의 보다 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포의 집단은 치료 가치를 가질 수 있고, 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어 높은 농도의 세포를 사용하는 것은, 정상적으로는 보다 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 가능하게 한다.
관련 측면에서, 보다 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면 (예를 들어, 입자, 예컨대 비드)의 혼합물을 유의하게 희석시킴으로써, 입자와 세포 사이에 상호작용이 최소화된다. 이것은 입자에 결합되는 다량의 목적하는 항원을 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 보다 높은 수준의 CD28을 발현하고, 희석 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 한 측면에서, 사용된 세포의 농도는 5 X 10e6개/ml이다. 다른 측면에서, 사용된 농도는 약 1 X 105개/ml 내지 1 X 106개/ml, 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
다른 측면에서, 세포를 2-10℃ 또는 실온에서 상이한 속도로 상이한 시간 길이 동안 회전장치 상에서 인큐베이션할 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포는 동결 용액 중에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 파라미터가 관련 기술분야에 공지되어 있고 이러한 맥락에서 유용할 것이지만, 한 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라스마라이트-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO, 또는 예를 들어, 헤스판(Hespan) 및 플라스마라이트 A를 함유하는 다른 적합한 세포 동결 매질을 함유하는 배양 배지를 사용하는 것을 수반하고, 세포는 이어서 1분에 1℃의 속도로 -80℃로 동결되고, 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 저장된다. 다른 제어 동결 방법 뿐만 아니라 -20℃에서의 또는 액체 질소 내의 즉각적인 비제어 동결이 사용될 수 있다.
특정 측면에서, 동결보존된 세포는 본원에 기재된 바와 같이 해동 및 세척되고, 1시간 동안 실온에서 휴지되도록 한 후, 본 발명의 방법을 사용하여 활성화된다.
또한, 본 발명과 관련하여 본원에 기재된 바와 같은 확장된 세포가 필요할 수 있을 때 그 전의 일정 기간에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 분리반출술 생성물을 수집하는 것이 고려된다. 따라서, 확장시킬 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에 수집될 수 있고, 목적하는 세포, 예컨대 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포가 단리되고, 세포 요법, 예를 들어 T 세포 요법으로부터 이익을 얻을 임의의 수많은 질환 또는 상태, 예컨대 본원에 기재된 것에 대한 세포 요법, 예를 들어 T 세포 요법에 추후 사용하기 위해 동결될 수 있다. 한 측면에서, 혈액 샘플 또는 분리반출술은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취된다. 특정 측면에서, 혈액 샘플 또는 분리반출술은 질환이 발생할 위험이 있지만 아직 질환이 발생하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채취되고, 관심 세포가 단리되고, 추후 사용을 위해 동결된다. 특정 측면에서, 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 확장, 동결되고, 나중에 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 특정한 질환의 진단 직후에, 그러나 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가 측면에서, 세포는 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역절제제, 예컨대 캄파트, 항-CD3 항체, 시톡산, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228과 같은 작용제, 및 방사선조사를 사용하는 치료를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 수많은 관련 치료 양식 전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 분리반출술로부터 단리된다.
본 발명의 추가 측면에서, T 세포는 기능적 T 세포를 사용한 대상체의 치료 후에 환자로부터 직접 수득된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물을 사용한 치료 후, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복되는 기간 동안의 치료 직후에, 수득된 T 세포의 품질은 생체외에서 확장되는 그의 능력이 최적화되거나 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 사용한 생체외 조작 후에, 이들 세포는 증진된 생착 및 생체내 확장을 위한 바람직한 상태로 존재할 수 있다. 따라서, 이러한 회복기 동안 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계열의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 문맥 내에서 고려된다. 추가로, 특정 측면에서, 특히 요법 후의 규정된 시간 윈도우 동안 특정한 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생, 및/또는 확장이 유리한 조건을 대상체에서 생성하기 위해 가동화 (예를 들어, GM-CSF를 사용한 가동화) 및 조건화 요법이 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 면역 이펙터 세포는 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제를 제공받은 대상체로부터 수득된다. 한 실시양태에서, CAR을 발현하도록 조작될 면역 이펙터 세포의 집단, 예를 들어 T 세포는 대상체 내의 또는 대상체로부터 수거된 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수준, 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포/ PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 비가 적어도 일시적으로 증가되도록 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 충분한 시간 후에 또는 충분한 투여 후에 수거된다.
다른 실시양태에서, CAR을 발현하도록 조작되었거나 또는 조작될 면역 이펙터 세포의 집단, 예를 들어 T 세포는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 수를 증가시키거나 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포/ PD1 양성 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포의 비를 증가시키는 mTOR 억제제의 양과의 접촉에 의해 생체외에서 처리될 수 있다.
한 실시양태에서, T 세포 집단은 디아글리세롤 키나제 (DGK)-결핍이다. DGK-결핍 세포는 DGK RNA 또는 단백질을 발현하지 않거나 또는 감소 또는 억제된 DGK 활성을 갖는 세포를 포함한다. DGK-결핍 세포는 유전적 접근법에 의해, 예를 들어 RNA-간섭제, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 DGK 발현을 감소 또는 방지하는 것에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, DGK-결핍 세포는 본원에 기재된 DGK 억제제를 사용한 처리에 의해 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, T 세포 집단은 이카로스(Ikaros)-결핍이다. 이카로스-결핍 세포는 이카로스 RNA 또는 단백질을 발현하지 않거나 또는 감소 또는 억제된 이카로스 활성을 갖는 세포를 포함하고, 이카로스-결핍 세포는 유전적 접근법에 의해, 예를 들어 RNA-간섭제, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA를 투여하여 이카로스 발현을 감소 또는 방지하는 것에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 이카로스-결핍 세포는 이카로스 억제제, 예를 들어 레날리도미드를 사용한 처리에 의해 생성될 수 있다.
실시양태에서, T 세포 집단은 DGK-결핍 및 이카로스-결핍이고, 예를 들어 DGK 및 이카로스를 발현하지 않거나 또는 감소 또는 억제된 DGK 및 이카로스 활성을 갖는다. 이러한 DGK 및 이카로스-결핍 세포는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, NK 세포는 대상체로부터 수득된다. 또 다른 실시양태에서, NK 세포는 NK 세포주, 예를 들어 NK-92 세포주 (콘퀘스트(Conkwest))이다.
동종 CAR
본원에 기재된 실시양태에서, 면역 이펙터 세포는 동종 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 동종 T 세포, 예를 들어 기능적 T 세포 수용체 (TCR) 및/또는 인간 백혈구 항원 (HLA), 예를 들어, HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II의 발현이 결여된 동종 T 세포일 수 있다.
기능적 TCR이 결여된 T 세포는 예를 들어 그의 표면 상에 임의의 기능적 TCR을 발현하지 않도록 조작되거나, 기능적 TCR을 포함하는 1개 이상의 서브유닛을 발현하지 않도록 조작되거나 (예를 들어, TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마, TCR 델타, TCR 엡실론, 및/또는 TCR 제타를 발현하지 않도록 (또는 감소된 발현을 나타내도록) 조작되거나), 또는 그의 표면 상에 매우 적은 기능적 TCR을 생산하도록 조작될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 예를 들어 TCR의 서브유닛 중 1개 이상의 돌연변이된 또는 말단절단된 형태의 발현에 의해 실질적으로 손상된 TCR을 발현할 수 있다. 용어 "실질적으로 손상된 TCR"은 이러한 TCR이 숙주에서 유해한 면역 반응을 도출하지 않을 것임을 의미한다.
본원에 기재된 T 세포는 예를 들어 그의 표면 상에 기능적 HLA를 발현하지 않도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 T 세포는 세포 표면 발현 HLA, 예를 들어, HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II가 하향조절되도록 조작될 수 있다. 일부 측면에서, HLA의 하향조절은 베타-2 마이크로글로불린 (B2M)의 발현을 감소시키거나 제거하는 것에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, T 세포는 기능적 TCR 및 기능적 HLA, 예를 들어 HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II가 결여될 수 있다.
기능적 TCR 및/또는 HLA의 발현이 결여된 변형된 T 세포는 TCR 또는 HLA의 1개 이상의 서브유닛의 녹아웃 또는 녹다운을 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 siRNA, shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN)를 사용한 TCR 및/또는 HLA의 녹다운을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 동종 세포는 억제 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 조작된 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 예를 들어 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있는 억제 분자를 발현하지 않거나 낮은 수준으로 발현하는 세포일 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타를 포함한다. 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서의 억제에 의한 억제 분자의 억제는 CAR-발현 세포 성능을 최적화할 수 있다. 실시양태에서, 억제 핵산, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 예를 들어 억제 핵산, 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR), 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN)가 사용될 수 있다.
TCR 또는 HLA를 억제하는 siRNA 및 shRNA
일부 실시양태에서, TCR 발현 및/또는 HLA 발현은 세포, 예를 들어 T 세포에서 TCR 및/또는 HLA, 및/또는 본원에 기재된 억제 분자 (예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타)를 코딩하는 핵산을 표적화하는 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 억제될 수 있다.
T 세포에서 siRNA 및 shRNA의 발현은 임의의 통상적인 발현 시스템, 예를 들어 렌티바이러스 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있다.
TCR의 성분의 발현을 하항조절하는 예시적인 shRNA는 예를 들어 미국 공개 번호 2012/0321667에 기재되어 있다. HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II 유전자의 발현을 하항조절하는 예시적인 siRNA 및 shRNA는 예를 들어 미국 공개 번호 US 2007/0036773에 기재되어 있다.
TCR 또는 HLA를 억제하는 CRISPR
본원에 사용된 "CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하는 CRISPR"은 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부의 세트, 또는 이러한 반복부의 세트를 포함하는 시스템을 지칭한다. 본원에 사용된 "Cas"는 CRISPR-연관 단백질을 지칭한다. "CRISPR/Cas" 시스템은 TCR 및/또는 HLA 유전자, 및/또는 본원에 기재된 억제 분자 (예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타)를 침묵 또는 돌연변이시키기 위해 사용될 수 있는, CRISPR 및 Cas로부터 유래된 시스템을 지칭한다.
자연-발생 CRISPR/Cas 시스템은 서열분석된 유박테리움 게놈의 대략 40% 및 서열분석된 고세균의 90%에서 발견된다. 문헌 [Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172]. 이러한 시스템은 외래 유전 요소, 예컨대 플라스미드 및 파지에 저항성을 부여하는 원핵 면역계의 유형이고, 후천성 면역 형태를 제공한다. 문헌 [Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. ( 2008) Science 322: 1843-1845].
CRISPR/Cas 시스템은 진핵생물, 예컨대 마우스 또는 영장류에서의 유전자 편집 (특정 유전자를 침묵, 증진 또는 변화시키는 것)에 사용하기 위해 변형된 바 있다. 문헌 [Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8]. 이는 특이적으로 설계된 CRISPR 및 1개 이상의 적절한 Cas를 함유하는 플라스미드를 진핵 세포 내로 도입함으로써 달성된다.
때때로 CRISPR 유전자좌로 불리는 CRISPR 서열은 교대 반복부 및 스페이서를 포함한다. 자연-발생 CRISPR에서, 스페이서는 통상적으로 박테리아에 외래인 서열, 예컨대 플라스미드 또는 파지 서열을 포함하고; TCR 및/또는 HLA CRISPR/Cas 시스템에서 스페이서는 TCR 또는 HLA 유전자 서열로부터 유래된다.
CRISPR 유전자좌로부터의 RNA는 구성적으로 발현되고, Cas 단백질에 의해 작은 RNA로 프로세싱된다. 이들은 반복부 서열과 플랭킹된 스페이서를 포함한다. RNA는 RNA 또는 DNA 수준에서 외인성 유전 요소를 침묵시키기 위해 다른 Cas 단백질을 안내한다. 문헌 [Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7]. 스페이서는 따라서 siRNA와 유사하게 RNA 분자에 대한 주형으로서 역할을 한다. 문헌 [Pennisi (2013) Science 341: 833-836].
이들은 많은 상이한 유형의 박테리아에서 자연 발생하기 때문에, CRISPR의 정확한 배열 및 Cas 유전자의 구조, 기능, 및 수, 및 그의 산물은 종별로 다소 상이하다. 문헌 [Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663; 및 Stern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340]. 예를 들어, Cse (Cas 하위유형, 이. 콜라이) 단백질 (예를 들어, CasA)은 CRISPR RNA 전사체를 기능적 복합체인 캐스케이드를 보유하는 스페이서-반복부 단위로 프로세싱하는 캐스케이드를 형성한다. 문헌 [Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964]. 다른 원핵생물에서, Cas6은 CRISPR 전사체를 프로세싱한다. 이. 콜라이에서의 CRISPR-기반 파지 불활성화는 캐스케이드 및 Cas3을 필요로 하지만, Cas1 또는 Cas2는 필요로 하지 않는다. 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 및 다른 원핵생물에서 Cmr (Cas RAMP 모듈) 단백질은 상보성 표적 RNA를 인식하고 절단하는 작은 CRISPR RNA와 기능적 복합체를 형성한다. 보다 단순한 CRISPR 시스템은 이중 나선의 각각의 나선에 대해 1개씩, 2개의 활성 절단 부위를 갖는 뉴클레아제인 단백질 Cas9에 의존한다. Cas9 및 변형된 CRISPR 유전자좌 RNA의 조합이 유전자 편집을 위해 시스템에서 사용될 수 있다. 문헌 [Pennisi (2013) Science 341: 833-836].
CRISPR/Cas 시스템은 따라서 TCR 및/또는 HLA 유전자의 편집 (염기쌍의 부가 또는 결실), 또는 TCR 및/또는 HLA의 발현을 감소시키는 조기 정지의 도입을 위해 사용될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 대안적으로 RNA 간섭처럼 사용되고, TCR 및/또는 HLA 유전자를 가역적인 방식으로 종료시킬 수 있다. 포유동물 세포에서, 예를 들어 RNA는 Cas 단백질을 TCR 및/또는 HLA 프로모터로 안내하여, RNA 폴리머라제를 입체적으로 차단할 수 있다.
관련 기술분야에 공지된, 예를 들어 미국 공개 번호 20140068797, 및 문헌 [Cong (2013) Science 339: 819-823]에 기재된 기술을 사용하여 TCR 및/또는 HLA를 억제하는 인공 CRISPR/Cas 시스템이 생성될 수 있다. 또한 TCR 및/또는 HLA를 억제하는 관련 기술분야에 공지된, 예를 들어 문헌 [Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576], 미국 특허 번호 8,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; 및 8,697,359에 기재된 다른 인공 CRISPR/Cas 시스템이 또한 생성될 수 있다.
TCR 및/또는 HLA를 억제하는 TALEN
"TALEN" 또는 "HLA 및/또는 TCR에 대한 TALEN" 또는 "HLA 및/또는 TCR을 억제하는 TALEN"은 HLA 및/또는 TCR 유전자, 및/또는 본원에 기재된 억제 분자 (예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타)를 편집하기 위해 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제를 지칭한다.
TALEN은 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 인공적으로 생산된다. 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE)는 HLA 또는 TCR 유전자의 부분을 포함하는 임의의 목적하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 TALE를 DNA 절단 도메인과 조합함으로써, HLA 또는 TCR 서열을 포함하는 임의의 목적하는 DNA 서열에 특이적인 제한 효소가 생산될 수 있다. 이어서, 이들은 세포 내로 도입될 수 있고, 여기서 이들은 게놈 편집을 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6; 및 Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501].
TALE는 크산토모나스(Xanthomonas) 박테리아에 의해 분비되는 단백질이다. DNA 결합 도메인은 제12 및 제13 아미노산을 제외하고, 반복된, 고도로 보존된 33-34개 아미노산 서열을 함유한다. 이들 2개의 위치는 매우 가변적이고, 이것은 특정 뉴클레오티드 인식과의 강한 상관관계를 보여준다. 따라서, 이들은 목적하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다.
TALEN을 생산하기 위해, TALE 단백질은 야생형 또는 돌연변이된 FokI 엔도뉴클레아제인 뉴클레아제 (N)에 융합된다. TALEN에서의 사용을 위해 FokI에 대한 여러 돌연변이가 이루어진 바 있고; 이들은 예를 들어 절단 특이성 또는 활성을 개선시킨다. 문헌 [Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; 및 Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96].
FokI 도메인은 이량체로서 기능하고, 적절한 배향 및 간격으로 표적 게놈 내의 부위에 대해 특유한 DNA 결합 도메인을 갖는 2개의 구축물을 필요로 한다. TALE DNA 결합 도메인과 FokI 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수 및 2개의 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 수 둘 다는 높은 활성 수준의 달성을 위해 중요한 파라미터인 것으로 보인다. 문헌 [Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8].
HLA 또는 TCR TALEN은 이중-가닥 파괴 (DSB)를 생성하기 위해 세포 내에서 사용될 수 있다. 돌연변이는 복구 메카니즘이 비-상동 말단 연결을 통해 파괴를 부적절하게 복구하는 경우에 파괴 부위에 도입될 수 있다. 예를 들어, 부적절한 복구는 프레임 시프트 돌연변이를 도입할 수 있다. 대안적으로, 외래 DNA가 TALEN과 함께 세포 내로 도입될 수 있고; 외래 DNA의 서열 및 염색체 서열에 따라, 이러한 과정은 HLA 또는 TCR 유전자 내의 결함을 교정하거나 또는 이러한 결함을 wt HLA 또는 TCR 유전자 내에 도입하여 HLA 또는 TCR의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
HLA 또는 TCR 내의 서열에 특이적인 TALEN은 모듈 성분을 사용하는 다양한 방식을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 구축될 수 있다. 문헌 [Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509].
HLA 및/또는 TCR을 억제하는 아연 핑거 뉴클레아제
"ZFN" 또는 "아연 핑거 뉴클레아제" 또는 "HLA 및/또는 TCR에 대한 ZFN" 또는 "HLA 및/또는 TCR을 억제하는 ZFN"은 HLA 및/또는 TCR 유전자, 및/또는 본원에 기재된 억제 분자 (예를 들어, PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타)를 편집하기 위해 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인 아연 핑거 뉴클레아제를 지칭한다.
TALEN처럼, ZFN은 DNA-결합 도메인에 융합된 FokI 뉴클레아제 도메인 (또는 그의 유도체)을 포함한다. ZFN의 경우에, DNA-결합 도메인은 1개 이상의 아연 핑거를 포함한다. 문헌 [Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782; 및 Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160].
아연 핑거는 1개 이상의 아연 이온에 의해 안정화된 작은 단백질 구조 모티프이다. 아연 핑거는 예를 들어 Cys2His2를 포함할 수 있고, 대략 3-bp 서열을 인식할 수 있다. 공지된 특이성의 다양한 아연 핑거를 조합하여 약 6, 9, 12, 15 또는 18-bp 서열을 인식하는 다중-핑거 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 파지 디스플레이, 효모 1-하이브리드 시스템, 박테리아 1-하이브리드 및 2-하이브리드 시스템, 및 포유동물 세포를 비롯하여, 특정 서열을 인식하는 아연 핑거 (및 그의 조합)를 생성하기 위한 다양한 선택 및 모듈 어셈블리 기술이 이용가능하다.
TALEN처럼, ZFN은 DNA를 절단하기 위해 이량체화되어야 한다. 따라서, 한 쌍의 ZFN이 비-회문식 DNA 부위를 표적화하기 위해 필요하다. 2개의 개별 ZFN은 DNA의 대향하는 가닥에 결합해야 하고, 그의 뉴클레아제는 적절하게 이격된다. 문헌 [Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5].
또한, TALEN처럼, ZFN은 DNA에 이중-가닥 파단부를 생성할 수 있고, 이것은 부적절하게 복구되는 경우에 프레임-시프트 돌연변이를 생성할 수 있고, 이는 세포 내 HLA 및/또는 TCR의 발현 및 양의 감소로 이어질 수 있다. ZFN은 또한 HLA 또는 TCR 유전자를 돌연변이시키기 위해 상동 재조합과 함께 사용될 수 있다.
HLA 및/또는 TCR 내의 서열에 특이적인 ZFN은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96]; 미국 특허 공개 2011/0158957; 및 미국 특허 공개 2012/0060230을 참조한다.
텔로머라제 발현
어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 일부 실시양태에서, 치료 T 세포는 T 세포의 단축된 텔로미어로 인해 환자에서 단기 지속성을 갖고; 따라서, 텔로머라제 유전자에 의한 형질감염은 T 세포의 텔로미어를 늘이고 환자에서의 T 세포의 지속성을 개선시킬 수 있다. 문헌 [Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)]을 참조한다. 따라서, 한 실시양태에서, 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포는 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어 텔로머라제의 촉매 서브유닛, 예를 들어 TERT, 예를 들어 hTERT를 이소적으로 발현한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 세포를 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어 텔로머라제의 촉매 서브유닛, 예를 들어 TERT, 예를 들어 hTERT를 코딩하는 핵산과 접촉시키는 것을 포함하는, CAR-발현 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 세포는 CAR을 코딩하는 구축물과의 접촉 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 핵산과 접촉될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 집단을 제조하는 방법을 특색으로 한다. 한 실시양태에서, 방법은 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포)의 집단을 제공하는 단계, 면역 이펙터 세포의 집단을 CAR을 코딩하는 핵산과 접촉시키는 단계; 및 CAR 및 텔로머라제 발현을 가능하게 하는 조건 하에, 면역 이펙터 세포의 집단을 텔로머라제 서브유닛, 예를 들어 hTERT를 코딩하는 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 텔로머라제 서브유닛을 코딩하는 핵산은 DNA이다. 한 실시양태에서, 텔로머라제 서브유닛을 코딩하는 핵산은 텔로머라제 서브유닛의 발현을 구동시킬 수 있는 프로모터를 포함한다.
한 실시양태에서, hTERT는 하기와 같은, 진뱅크 단백질 ID AAC51724.1의 아미노산 서열을 갖는다 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795):
Figure pct00112
한 실시양태에서, hTERT는 서열식별번호: 284의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, hTERT는 서열식별번호: 284의 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, hTERT는 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에서 결실 (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 또는 30개 이하의 아미노산)을 포함한다. 한 실시양태에서, hTERT는 N-말단, C-말단, 또는 둘 다에서 트랜스제닉 아미노산 서열 (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 또는 30개 이하의 아미노산)을 포함한다.
한 실시양태에서, hTERT는 진뱅크 수탁 번호 AF018167의 핵산 서열에 의해 코딩된다 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization" Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795):
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
한 실시양태에서, hTERT는 서열식별번호: 285의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서, hTERT는 서열식별번호: 285의 핵산에 의해 코딩된다.
T 세포의 활성화 및 확장
T 세포는 일반적으로 예를 들어 미국 특허 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개 번호 20060121005에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상의 공동자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 본원에 기재된 바와 같이, 예컨대 표면에 고정된 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성화제 (예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공동-자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체가 사용될 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28 (디아클론(Diaclone), 프랑스 브장송)을 포함하고, 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 다른 방법이 사용될 수 있다 (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
특정 측면에서, T 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공동자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 존재하거나 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링되는 경우에, 작용제는 동일한 표면 (즉, "시스" 형태) 또는 개별 표면 (즉, "트랜스" 형태)에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 한 작용제는 표면에 커플링되고 다른 작용제는 용액 중에 존재할 수 있다. 한 측면에서, 공동자극 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면에 결합되고, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 존재하거나 표면에 커플링된다. 특정 측면에서, 둘 다의 작용제는 용액 중에 존재할 수 있다. 한 측면에서, 작용제는 가용성 형태로 존재한 후, 표면, 예컨대 Fc 수용체 또는 항체 또는 다른 결합제를 발현하는 세포에 가교될 수 있고, 이것이 작용제에 결합할 것이다. 이와 관련하여, 본 발명에서 T 세포를 활성화 및 확장하는데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 대한, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 20040101519 및 20060034810을 참조한다.
한 측면에서, 2종의 작용제는 동일한 비드, 즉 "시스" 또는 개별 비드, 즉 "트랜스"의 비드 상에 고정된다. 예로서, 1차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 공동자극 신호를 제공하는 작용제는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며; 둘 다의 작용제는 동일한 비드에 동등한 분자량으로 공동-고정된다. 한 측면에서, CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 1:1 비의 비드에 결합된 각각의 항체가 사용된다. 본 발명의 특정 측면에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비는 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 T 세포 확장의 증가가 관찰되도록 사용된다. 하나의 특정한 측면에서, 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비는 100:1 내지 1:100 및 그 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 본 발명의 한 측면에서, 항-CD3 항체보다 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되고, 즉 CD3:CD28의 비는 1 미만이다. 본 발명의 특정 측면에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비는 2:1보다 크다. 하나의 특정한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:100 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:75 CD3:CD28 비가 사용된다. 추가 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:50 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:30 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 바람직한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:10 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 1:3 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드에 결합된 항체의 3:1 CD3:CD28 비가 사용된다.
1:500 내지 500:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 입자 대 세포의 비가 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하기 위해 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 인식할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비는 표적 세포에 대한 입자 크기에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 소수의 세포에만 결합할 수 있지만, 보다 큰 비드는 많은 세포에 결합할 수 있다. 특정 측면에서, 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 범위이고, 추가의 측면에서 비는 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함하고, 이는 또한 T 세포를 자극하기 위해 사용될 수 있다. T 세포 자극을 발생시키는 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 입자 대 T 세포의 비는 상기 언급된 바와 같이 달라질 수 있지만, 특정의 바람직한 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하고, 하나의 바람직한 비는 T 세포 당 적어도 1:1 입자이다. 한 측면에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비가 사용된다. 하나의 특정한 측면에서, 바람직한 입자: 세포 비는 1:5이다. 추가의 측면에서, 입자 대 세포의 비는 자극 일에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 입자 대 세포의 비는 제1일에 1:1 내지 10:1이고, 추가의 입자는 이후에 10일까지 매일 또는 격일로, 1:1 내지 1:10의 최종 비 (첨가 일의 세포 수 기준)로 세포에 첨가된다. 하나의 특정한 측면에서, 입자 대 세포의 비는 자극 제1일에 1:1이고, 자극 제3일 및 제5일에 1:5로 조정된다. 한 측면에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극의 제1일에 1:1, 제3일 및 제5일에 1:5의 최종 비로 첨가된다. 한 측면에서, 입자 대 세포의 비는 자극 제1일에 2:1이고, 자극 제3일 및 제5일에 1:10으로 조정된다. 한 측면에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극의 제1일에 1:1, 제3일 및 제5일에 1:10의 최종 비로 첨가된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 다른 비가 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 비는 입자 크기 및 세포 크기 및 종류에 따라 달라질 것이다. 한 측면에서, 사용하기에 가장 일반적인 비는 제1일에 대략 1:1, 2:1 및 3:1이다.
본 발명의 추가 측면에서, 세포, 예컨대 T 세포는 작용제-코팅된 비드와 조합되고, 비드 및 세포를 후속적으로 분리한 후, 세포를 배양한다. 다른 측면에서, 배양 전에, 작용제-코팅된 비드 및 세포를 분리하지 않고, 함께 배양한다. 추가의 측면에서, 비드 및 세포는 먼저 힘, 예컨대 자력을 인가하여 농축함으로써, 세포 표면 마커의 라이게이션을 증가시켜 세포 자극을 유도한다.
예를 들어, 세포 표면 단백질은 항-CD3 및 항-CD28이 부착되는 상자성 비드 (3x28 비드)가 T 세포에 결합하도록 함으로써 라이게이션될 수 있다. 한 측면에서, 세포 (예를 들어, 104 내지 109개 T 세포) 및 비드 (예를 들어, 1:1 비의 디나비즈? M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)를 완충제, 예를 들어 PBS (2가 양이온, 예컨대, 칼슘 및 마그네슘 미함유) 내에 조합한다. 다시, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플에 매우 드물 수 있고, 단지 샘플의 0.01%만을 이루거나 또는 전체 샘플 (즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수가 본 발명의 측면에 포함된다. 특정 측면에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는 (즉, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 약 100억개 세포/ml, 90억개/ml, 80억개/ml, 70억개/ml, 60억개/ml, 50억개/ml, 또는 20억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 한 측면에서, 1억개 세포/ml 초과의 농도가 사용된다. 추가의 측면에서, 1천만, 1천5백만, 2천만, 2천5백만, 3천만, 3천5백만, 4천만, 4천5백만, 또는 5천만개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 한 측면에서 7천5백만, 8천만, 8천5백만, 9천만, 9천5백만, 또는 1억개 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 측면에서, 1억2천5백만 또는 1억5천만개 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 발생시킬 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T 세포의 보다 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포의 집단은 치료 가치를 가질 수 있고, 특정 측면에서 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 높은 농도의 세포를 사용하면, 정상적으로는 보다 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포를 보다 효율적으로 선택하는 것이 가능하다.
한 실시양태에서, CAR, 예를 들어, 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산으로 형질도입된 세포는, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 확장된다. 한 실시양태에서, 세포는 배양 중 수시간 (예를 들어, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21시간) 내지 약 14일 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14일)의 기간 동안 확장된다. 한 실시양태에서, 세포는 4 내지 9일의 기간 동안 확장된다. 한 실시양태에서, 세포는 8일 이하, 예를 들어 7, 6 또는 5일의 기간 동안 확장된다. 한 실시양태에서, 세포, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA CAR 세포는 배양 중 5일 동안 확장되고, 생성된 세포는 동일한 배양 조건 하에 배양 중 9일 동안 확장된 동일한 세포보다 더 강력하다. 효력은, 예를 들어 다양한 T 세포 기능, 예를 들어 증식, 표적 세포 사멸, 시토카인 생산, 활성화, 이동, 또는 그의 조합에 의해 규정될 수 있다. 한 실시양태에서, 5일 동안 확장된 세포, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA CAR 세포는 동일한 배양 조건 하에 배양 중 9일 동안 확장된 동일한 세포와 비교하여 항원 자극 시 세포 배가에서 적어도 1, 2, 3 또는 4배 증가를 보인다. 한 실시양태에서, 세포, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA CAR을 발현하는 세포는 배양 중 5일 동안 확장되고, 생성된 세포는 동일한 배양 조건 하에 배양 중 9일 동안 확장된 동일한 세포와 비교하여 보다 높은 염증유발 시토카인 생산, 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준을 나타낸다. 한 실시양태에서, 5일 동안 확장된 세포, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA CAR 세포는 동일한 배양 조건 하에 배양 중 9일 동안 확장된 동일한 세포와 비교하여 pg/ml 단위의 염증유발 시토카인 생산, 예를 들어 IFN-γ 및/또는 GM-CSF 수준에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10배 또는 그 초과의 증가를 보인다.
본 발명의 한 측면에서, 혼합물은 수시간 (약 3시간) 내지 약 14일 또는 그 사이의 임의의 시간상 정수 값 동안 배양될 수 있다. 한 측면에서, 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 비드 및 T 세포는 함께 약 8일 동안 배양된다. 한 측면에서, 비드 및 T 세포는 함께 2-3일 동안 배양된다. 또한, T 세포의 배양 시간이 60일 이상이 될 수 있도록 여러 사이클의 자극이 바람직할 수 있다. T 세포 배양을 위해 적절한 조건은 혈청 (예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α 또는 통상의 기술자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는 증식 및 생존에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 배지 (예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, 엑스-비보(X-vivo) 15 (론자(Lonza)))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-메르캅토에탄올을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 배지는 혈청-비함유 또는 적절한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 규정된 세트의 호르몬으로 보충된 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장을 위해 충분한 양의 시토카인(들)과 함께 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, 최적화제를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험적 배양에만 포함되고, 대상체 내에 주입되어야 하는 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하기 위해 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도 (예를 들어, 37℃) 및 분위기 (예를 들어, 공기 플러스 5% CO2) 하에 유지된다.
한 실시양태에서, 세포는, 예를 들어 본원에 기재된 방법, 예컨대 유동 세포측정법에 의해 측정 시 14일 확장 기간에 걸쳐 세포의 적어도 200-배 (예를 들어, 200-배, 250-배, 300-배, 350-배) 증가를 발생시키는, 1종 이상의 인터류킨을 포함하는 적절한 배지 (예를 들어, 본원에 기재된 배지 중에서 확장된다. 한 실시양태에서, 세포는 IL-15 및/또는 IL-7 (예를 들어, IL-15 및 IL-7)의 존재 하에 확장된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 방법, 예를 들어 CAR-발현 세포 제조 방법은, 예를 들어 항-CD25 항체 또는 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드, IL-2를 사용하여 세포 집단으로부터 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포를 제거하는 것을 포함한다. 세포 집단으로부터 T 조절 세포, 예를 들어 CD25+ T 세포를 제거하는 방법은 본원에 기재되어 있다. 실시양태에서, 방법, 예를 들어 제조 방법은 세포 집단 (예를 들어, T 조절 세포, 예컨대 CD25+ T 세포가 고갈된 세포 집단; 또는 항-CD25 항체, 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드와 이전에 접촉시킨 세포 집단)을 IL-15 및/또는 IL-7과 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 세포 집단 (예를 들어, 항-CD25 항체, 그의 단편, 또는 CD25-결합 리간드와 이전에 접촉시킨 것)은 IL-15 및/또는 IL-7의 존재 하에 확장된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 인터류킨-15 (IL-15) 폴리펩티드, 인터류킨-15 수용체 알파 (IL-15Ra) 폴리펩티드, 또는 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드, 예를 들어 hetIL-15 둘 다의 조합을 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체외에서 접촉된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체외에서 접촉된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15 Ra 폴리펩티드 둘 다의 조합을 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체외에서 접촉된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CAR-발현 세포의 제조 동안 hetIL-15를 포함하는 조성물과, 예를 들어 생체외에서 접촉된다.
한 실시양태에서 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 생체외 확장 동안 hetIL-15를 포함하는 조성물과 접촉된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 생체외 확장 동안 IL-15 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 접촉된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 생체외 확장 동안 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드 둘 다를 포함하는 조성물과 접촉된다. 한 실시양태에서, 접촉은 림프구 하위집단, 예를 들어 CD8+ T 세포의 생존 및 증식을 발생시킨다.
상이한 자극 횟수에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 분리반출술을 거친 말초 혈액 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 억제자 T 세포 집단 (TC, CD8+)보다 큰 헬퍼 T 세포 집단 (TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극하는 것에 의한 T 세포의 생체외 확장은 T 세포의 집단을 생산하고, 이는 약 8-9일 전에는 주로 TH 세포로 이루어지는 반면에, 약 8-9일 후 T 세포의 집단은 점점 더 큰 TC 세포의 집단을 포함한다. 따라서, 치료의 목적에 따라, 대상체에게 주로 TH 세포를 포함하는 T 세포 집단을 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 하위세트가 단리되면, 이 하위세트를 더 큰 정도로 확장시키는 것이 유익할 수 있다.
추가로, CD4 및 CD8 마커에 더하여, 다른 표현형 마커는 세포 확장 과정 동안 유의하게, 그러나 대부분 재현가능하게 상이하다. 따라서, 그러한 재현가능성 때문에, 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 생성물을 적합하게 조정할 수 있다.
BCMA CAR이 구축되면, 다양한 검정을 사용하여 분자의 활성, 예컨대 비제한적으로 항원 자극 후에 T 세포를 확장시키는 능력, 재자극의 부재 하에 T 세포 확장을 지속시키는 능력, 및 적절한 시험관내 및 동물 모델에서의 항암 활성을 평가할 수 있다. BCMA CAR의 효과를 평가하기 위한 검정이 하기에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
1차 T 세포에서 CAR 발현의 웨스턴 블롯 분석은 단량체 및 이량체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 아주 간략하게, CAR을 발현하는 T 세포 (CD4+ 및 CD8+ T 세포의 1:1 혼합물)를 10일 초과 동안 시험관내에서 확장시킨 후, 용해 및 환원 조건 하의 SDS-PAGE를 수행한다. 전장 TCR-ζ 세포질 도메인 및 내인성 TCR-ζ 쇄를 포함하는 CAR은 TCR-ζ 쇄에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된다. 동일한 T 세포 하위세트는 공유 이량체 형성의 평가를 허용하는 비-환원 조건 하의 SDS-PAGE 분석을 위해 사용된다.
항원 자극 후에 CAR+ T 세포의 시험관내 확장은 유동 세포측정법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물을 αCD3/αCD28 aAPC로 자극한 후, 분석할 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한다. 예시적인 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1α, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나제 (PGK) 프로모터를 포함한다. GFP 형광은 유동 세포측정법에 의해 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 하위세트에서 배양 제6일에 평가된다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 대안적으로, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합물을 제0일에 αCD3/αCD28 코팅된 자기 비드로 자극하고, 2A 리보솜 스키핑 서열을 사용하여 eGFP와 함께 CAR을 발현하는 비시스트론 렌티바이러스 벡터를 사용하여 제1일에 CAR로 형질도입한다. 배양물을 세척 후에 BCMA-발현 세포, 예컨대 다발성 골수종 세포주 또는 K562-BCMA로 재자극한다. 외인성 IL-2를 배양물에 격일로 100 IU/ml로 첨가한다. GFP+ T 세포를 비드-기반 카운팅을 사용하여 유동 세포측정법에 의해 카운팅한다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다.
재자극의 부재 하에 지속되는 CAR+ T 세포 확장을 또한 측정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 간략하게, 평균 T 세포 부피 (fl)는 제0일에 αCD3/αCD28 코팅된 자기 비드를 사용한 자극, 및 제1일에 나타낸 CAR을 사용한 형질도입 후에 쿨터 멀티사이저 III(Coulter Multisizer III) 입자 계수기, 넥셀롬 셀로미터 비전(Nexcelom Cellometer Vision) 또는 밀리포어 셉터(Millipore Scepter)를 사용하여 배양 제8일에 측정한다.
CART 활성을 측정하기 위해 동물 모델을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 면역결핍 마우스에서 원발성 인간 다발성 골수종을 치료하기 위해 인간 BCMA-특이적 CAR+ T 세포를 사용하는 이종이식편 모델을 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 매우 간략하게, MM의 확립 후에, 마우스를 처리군으로 무작위화하였다. 상이한 수의 BCMA CART 세포를 MM을 함유하는 면역결핍 마우스 내로 주사할 수 있다. 동물은 매주 간격으로 질환 진행 및 종양 부담에 대해 평가된다. 군에 대한 생존 곡선은 로그 순위 검정을 사용하여 비교된다. 또한, 면역결핍 마우스에서 T 세포 주사 4주 후에 절대 말초 혈액 CD4+ 및 CD8+ T 세포 카운트를 또한 분석할 수 있다. 마우스에게 다발성 골수종 세포를 주사하고, 3주 후에 예를 들어 eGFP에 연결된 CAR을 코딩하는 비시스트론 렌티바이러스 벡터에 의해 BCMA CAR을 발현하도록 조작된 T 세포를 주사한다. T 세포를 주사 전에 모의-형질도입된 세포와 혼합함으로써 45-50% 투입 GFP+ T 세포로 정규화하고, 유동 세포측정법에 의해 확인한다. 1-주 간격으로 백혈병에 대해 동물을 평가한다. CAR+ T 세포군에 대한 생존 곡선을 로그 순위 검정을 사용하여 비교한다.
세포 증식 및 시토카인 생산의 평가는 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]에 이전에 기재된 바 있다. 간략하게, CAR-매개 증식의 평가는 세척된 T 세포를 사용 전 감마-방사선으로 방사선조사된 BCMA를 발현하는 K562 세포 또는 다른 BCMA-발현 골수종 세포와 혼합함으로써 마이크로타이터 플레이트에서 수행된다. 항-CD3 (클론 OKT3) 및 항-CD28 (클론 9.3) 모노클로날 항체를 배양물에 첨가하고, KT32-BBL 세포는 T-세포 증식을 자극하기 위한 양성 대조군으로 기능하고, 이것은 이들 신호가 생체외에서 장기간 CD8+ T 세포 확장을 지지하기 때문이다. T 세포는 제조업체에 의해 기재된 바와 같이 카운트브라이트(CountBright)™ 형광 비드 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스바드) 및 유동 세포측정법을 사용하여 배양물에서 열거된다. CAR+ T 세포는 eGFP-2A 연결된 CAR-발현 렌티바이러스 벡터로 조작된 T 세포를 사용한 GFP 발현에 의해 확인된다. GFP를 발현하지 않는 CAR+ T 세포에 대해, CAR+ T 세포는 비오티닐화 재조합 BCMA 단백질 및 2차 아비딘-PE 접합체로 검출된다. T 세포 상의 CD4+ 및 CD8+ 발현은 또한 특이적 모노클로날 항체 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))로 동시에 검출된다. 시토카인 측정은 제조업체의 지침에 따라 인간 TH1/TH2 시토카인 세포측정 비드 어레이 키트 (비디 바이오사이언시스, 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하여 재자극 24시간 후에 수집된 상청액에 대해 수행된다. 형광을 FACS칼리버(FACScalibur) 유동 세포측정기를 사용하여 평가하고, 데이터를 제조업체의 지침에 따라 분석한다.
세포독성은 표준 51Cr-방출 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]을 참조한다. 간략하게, 표적 세포 (예를 들어, BCMA를 발현하는 K562 세포주 및 원발성 다발성 골수종 세포)를 37℃에서 2시간 동안 빈번하게 교반하면서 51Cr (NaCrO4로서, 뉴 잉글랜드 뉴클리어(New England Nuclear), 매사추세츠주 보스턴)을 로딩하고, 완전 RPMI 내에 2회 세척하고, 마이크로타이터 플레이트 내로 플레이팅한다. 이펙터 T 세포를 웰 내에서 완전 RPMI 내에서 표적 세포와, 이펙터 세포:표적 세포 (E:T)의 다양한 비로 혼합한다. 배지만 함유하는 (자연 방출, SR) 또는 트리톤-X 100 세제의 1% 용액 (총 방출, TR)을 함유하는 추가의 웰을 또한 제조한다. 37℃에서 4시간 인큐베이션한 후, 각각의 웰로부터 상청액을 수거한다. 이어서, 방출된 51Cr을 감마 입자 계수기 (패카드 인스트루먼트 코포레이션(Packard Instrument Co.), 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 측정한다. 각각의 조건은 적어도 삼중으로 수행되고, 용해 백분율은 다음 식을 사용하여 계산된다: % 용해 = (ER - SR)/(TR - SR) (여기서, ER은 각각의 실험 조건에서 방출된 평균 51Cr을 나타낸다).
영상화 기술이 종양-보유 동물 모델에서 CAR의 특이적 수송 및 증식을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어 문헌 [Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)]에 기재되어 있다. 간략하게, NOD/SCID/γc-/- (NSG) 마우스 또는 다른 면역결핍 마우스에게 다발성 골수종 세포를 IV 주사하고, 7일 후에 CAR 구축물을 사용한 전기천공 4시간 후에 BCMA CART 세포를 주사한다. T 세포를 반딧불이 루시페라제를 발현하도록 렌티바이러스 구축물로 안정하게 형질감염시키고, 마우스를 생체발광에 대해 영상화한다. 대안적으로, 다발성 골수종 이종이식편 모델에서 CAR+ T 세포의 단일 주사의 치료 효능 및 특이성은 다음과 같이 측정할 수 있다: NSG 마우스에게 반딧불이 루시페라제를 안정하게 발현하도록 형질도입된 다발성 골수종 세포를 주사한 후, 수일 후에 BCMA CAR 구축물로 전기천공된 T 세포를 단일 꼬리-정맥 주사한다. 동물을 주사 후 다양한 시점에서 영상화한다. 예를 들어, 제5일 (치료 2일 전) 및 제8일 (CAR+ PBL 24시간 후)에 대표적인 마우스에서 반딧불이 루시페라제 양성 종양의 광자-밀도 열 지도를 생성할 수 있다.
대안적으로, 또는 본원에 개시된 방법과 조합하여, CAR-발현 세포의 검출 및/또는 정량화 (예를 들어, 시험관내 또는 생체내 (예를 들어, 임상 모니터링)); 면역 세포 확장 및/또는 활성화; 및/또는 CAR 리간드의 사용을 수반하는 CAR-특이적 선택 중 하나 이상을 위한 방법 및 조성물이 개시된다. 하나의 예시적 실시양태에서, CAR 리간드는 CAR 분자에 결합하는, 예를 들어 CAR의 세포외 항원 결합 도메인에 결합하는 항체 (예를 들어, 항원 결합 도메인에 결합하는 항체, 예를 들어 항-이디오타입 항체; 또는 세포외 결합 도메인의 불변 영역에 결합하는 항체)이다. 다른 실시양태에서, CAR 리간드는 CAR 항원 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 CAR 항원 분자)이다.
한 측면에서, CAR-발현 세포를 검출 및/또는 정량화하는 방법이 개시된다. 예를 들어, CAR 리간드는 시험관내 또는 생체내에서 CAR-발현 세포를 검출 및/또는 정량화하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 환자에서 CAR-발현 세포의 임상 모니터링, 또는 환자에의 투여). 방법은 하기를 포함한다:
CAR 리간드 (임의로, 표지화 CAR 리간드, 예를 들어 태그, 비드, 방사성 또는 형광 표지를 포함하는 CAR 리간드)를 제공하는 단계;
CAR-발현 세포를 획득하는 단계 (예를 들어, CAR-발현 세포를 함유하는 샘플, 예컨대 제조 샘플 또는 임상 샘플을 획득하는 단계);
CAR-발현 세포를 CAR 리간드와 결합이 일어나는 조건 하에 접촉시켜, 존재하는 CAR-발현 세포의 수준 (예를 들어, 양)을 검출하는 단계. CAR-발현 세포와 CAR 리간드의 결합은 FACS, ELISA 등과 같은 표준 기술을 사용하여 검출될 수 있다.
또 다른 측면에서, 세포 (예를 들어, 면역 이펙터 세포)를 확장 및/또는 활성화하는 방법이 개시된다. 방법은 하기를 포함한다:
CAR-발현 세포 (예를 들어, 제1 CAR-발현 세포 또는 일시적 발현 CAR 세포)를 제공하는 단계;
상기 CAR-발현 세포를 CAR 리간드, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 CAR 리간드와 면역 세포 확장 및/또는 증식이 일어나는 조건 하에 접촉시켜, 활성화 및/또는 확장된 세포 집단을 생산하는 단계.
특정 실시양태에서, CAR 리간드가 존재한다 (예를 들어, 기질, 예를 들어 비-자연 발생 기질에 고정되거나 부착됨). 일부 실시양태에서, 기질은 비-세포 기질이다. 비-세포 기질은 플레이트 (예를 들어, 마이크로타이터 플레이트), 막 (예를 들어, 니트로셀룰로스 막), 매트릭스, 칩 또는 비드로부터 선택된 고체 지지체일 수 있다. 실시양태에서, CAR 리간드는 기질에 (예를 들어, 기질 표면 상에) 존재한다. CAR 리간드는 기질에 공유 또는 비-공유 고정되거나, 부착되거나, 회합된다 (예를 들어 가교된다). 한 실시양태에서, CAR 리간드는 비드에 부착된다 (예를 들어, 공유 부착된다). 상기 실시양태에서, 면역 세포 집단은 시험관내 또는 생체외 확장될 수 있다. 방법은 CAR 분자의 리간드의 존재 하에, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 면역 세포의 집단을 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 세포를 확장 및/또는 활성화하는 방법은 추가로 제2 자극 분자, 예를 들어 CD28의 첨가를 포함한다. 예를 들어, CAR 리간드 및 제2 자극 분자는 기질, 예를 들어 1개 이상의 비드에 고정되어, 증가된 세포 확장 및/또는 활성화를 제공할 수 있다.
또 다른 측면에서, CAR 발현 세포를 선택 또는 풍부화하는 방법이 제공된다. 방법은 CAR 발현 세포를 본원에 기재된 바와 같은 CAR 리간드와 접촉시키는 단계; 및 CAR 리간드의 결합에 기초하여 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, CAR 발현 세포를 고갈, 감소 및/또는 사멸시키는 방법이 제공된다. 방법은 CAR 발현 세포를 본원에 기재된 바와 같은 CAR 리간드와 접촉시키는 단계; 및 CAR 리간드의 결합에 기초하여 세포를 표적화하여, CAR-발현 세포의 수를 감소시키고/거나 그를 사멸시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, CAR 리간드는 독성제 (예를 들어, 독소 또는 세포 제거 약물)에 커플링된다. 또 다른 실시양태에서, 항-이디오타입 항체는 이펙터 세포 활성, 예를 들어 ADCC 또는 ADC 활성을 유발할 수 있다.
본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 예시적인 항-CAR 항체가 예를 들어 WO 2014/190273 및 문헌 [Jena et al., "Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials", PLOS March 2013 8:3 e57838]에 기재되어 있고, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, 항-이디오타입 항체 분자는 항-CD19 항체 분자, 예를 들어 항-CD19 scFv를 인식한다. 예를 들어, 항-이디오타입 항체 분자는 문헌 [Jena et al., PLOS March 2013 8:3 e57838]에 기재된 CD19-특이적 CAR mAb 클론 번호 136.20.1과 결합에 대해 경쟁할 수 있거나; CD19-특이적 CAR mAb 클론 번호 136.20.1과 동일한 CDR (예를 들어, 카바트 정의, 코티아 정의, 또는 카바트와 코티아 정의의 조합을 사용하여 VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 중 1개 이상, 예를 들어 모두)을 가질 수 있거나; CD19-특이적 CAR mAb 클론 번호 136.20.1로서 1개 이상 (예를 들어, 2개)의 가변 영역을 가질 수 있거나, 또는 CD19-특이적 CAR mAb 클론 번호 136.20.1을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-이디오타입 항체는 문헌 [Jena et al.]에 기재된 방법에 따라 제조되었다. 또 다른 실시양태에서, 항-이디오타입 항체 분자는 WO 2014/190273에 기재된 항-이디오타입 항체 분자이다. 일부 실시양태에서, 항-이디오타입 항체 분자는 WO 2014/190273의 항체 분자, 예컨대 136.20.1과 동일한 CDR (예를 들어 VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 중 1개 이상, 예를 들어 모두)을 갖거나; WO 2014/190273의 항체 분자의 1개 이상 (예를 들어, 2개)의 가변 영역을 가질 수 있거나, 또는 WO 2014/190273의 항체 분자, 예컨대 136.20.1을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항-CAR 항체는 예를 들어 WO 2014/190273에 기재된 바와 같은 CAR 분자의 세포외 결합 도메인의 불변 영역에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-CAR 항체는 CAR 분자의 세포외 결합 도메인의 불변 영역, 예를 들어 중쇄 불변 영역 (예를 들어, CH2-CH3 힌지 영역) 또는 경쇄 불변 영역에 결합한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 항-CAR 항체는 WO 2014/190273에 기재된 2D3 모노클로날 항체와 결합에 대해 경쟁하거나, 2D3과 동일한 CDR (예를 들어 VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 중 1개 이상, 예를 들어 모두)을 갖거나, 또는 2D3의 1개 이상 (예를 들어, 2개)의 가변 영역을 갖거나, 또는 WO 2014/190273에 기재된 바와 같은 2D3을 포함한다.
일부 측면 및 실시양태에서, 본원의 조성물 및 방법은, 예를 들어 2014년 7월 31일에 출원된 미국 일련 번호 62/031,699에 기재된 바와 같이 T 세포의 특정 하위세트에 대해 최적화되고, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, T 세포의 최적화된 하위세트는 대조군 T 세포, 예를 들어 동일한 구축물을 발현하는 상이한 유형 (예를 들어, CD8+ 또는 CD4+)의 T 세포와 비교하여 증진된 지속성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, CD4+ T 세포는 본원에 기재된 CAR을 포함하며, 상기 CAR은 CD4+ T 세포에 적합한 (예를 들어 그에 최적화된, 예를 들어 증진된 지속성으로 이어지는) 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 ICOS 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8+ T 세포는 본원에 기재된 CAR을 포함하며, 상기 CAR은 CD8+ T 세포에 적합한 (예를 들어 그에 최적화된, 예를 들어 증진된 지속성으로 이어지는) 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB 도메인, CD28 도메인, 또는 ICOS 도메인 이외의 또 다른 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR은 본원에 기재된 항원 결합 도메인을 포함한다 (예를 들어 BCMA를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR, 예를 들어 표 1 또는 16의 CAR).
한 측면에서, 대상체, 예를 들어 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 방법은 상기 대상체에게 유효량의
1) 항원 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 항원 결합 도메인, 예를 들어 BCMA를 표적화하는 항원 결합 도메인, 예를 들어 표 1 또는 16의 항원 결합 도메인;
막횡단 도메인; 및
세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 제1 공동자극 도메인, 예를 들어 ICOS 도메인
을 포함하는 CAR을 포함하는 CD4+ T 세포 (CARCD4 +); 및
2) 항원 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 항원 결합 도메인, 예를 들어 BCMA를 표적화하는 항원 결합 도메인, 예를 들어 표 1 또는 16의 항원 결합 도메인;
막횡단 도메인; 및
세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 제2 공동자극 도메인, 예를 들어 4-1BB 도메인, CD28 도메인, 또는 ICOS 도메인 이외의 또 다른 공동자극 도메인
을 포함하는 CAR을 포함하는 CD8+ T 세포 (CARCD8 +)
를 투여하는 것을 포함하며;
여기서 CARCD4 + 및 CARCD8 +는 서로 상이하다.
임의로, 방법은
3) 항원 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 항원 결합 도메인, 예를 들어 BCMA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인, 예를 들어 표 1 또는 16의 항원 결합 도메인;
막횡단 도메인; 및
세포내 신호전달 도메인
을 포함하는 CAR을 포함하는 제2 CD8+ T 세포 (제2 CARCD8 +)
를 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 제2 CARCD8 +은 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 CARCD8 + 상에 존재하지 않는 공동자극 신호전달 도메인을 포함하고, 임의로 ICOS 신호전달 도메인은 포함하지 않는다.
본원의 실시예 섹션에 기재된 것 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 것을 비롯한 다른 검정이 또한 본 발명의 BCMA CAR 구축물을 평가하는데 사용될 수 있다.
치료 용도
BCMA 연관 질환 및/또는 장애
한 측면에서, 본 발명은 BCMA 발현과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 종양의 일부는 BCMA에 대해 음성이고 종양의 일부는 BCMA에 대해 양성인 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 CAR은 상승된 BCMA의 발현과 연관된 질환의 치료를 거친 대상체를 치료하는데 유용하고, 여기서 상승된 수준의 BCMA에 대한 치료를 거친 대상체는 상승된 수준의 BCMA와 연관된 질환을 나타낸다. 실싱양태에서, 본 발명의 CAR은 BCMA의 발현과 연관된 질환의 치료를 거친 대상체를 치료하는데 유용하고, 여기서 BCMA의 발현과 관련된 치료를 거친 대상체는 BCMA의 발현과 연관된 질환을 나타낸다.
한 실시양태에서, 본 발명은 BCMA가 정상 세포 및 암 세포 둘 다에서 발현되지만 정상 세포에서 보다 낮은 수준으로 발현되는 것인 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 예를 들어 본원에 기재된 검정에 의해 결정된 바와 같이, BCMA CAR이 BCMA를 발현하는 암 세포에 결합하여 그를 사멸시키도록 하는 친화도로 결합하지만 BCMA를 발현하는 정상 세포는 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 그 미만을 사멸시키는 본 발명의 CAR을 선택하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 사멸 검정, 예컨대 Cr51 CTL에 기초한 유동 세포측정법이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, BCMA CAR은 표적 항원에 대해 10-4 M 내지 10-8 M, 예를 들어 10-5 M 내지 10-7 M, 예를 들어 10-6 M 또는 10-7 M의 결합 친화도 KD를 갖는 항원 결합 도메인을 갖는다. 한 실시양태에서, BCMA 항원 결합 도메인은 참조 항체, 예를 들어 본원에 기재된 항체보다 적어도 5-배, 10-배, 20-배, 30-배, 50-배, 100-배 또는 1,000-배 미만인 결합 친화도를 갖는다.
한 측면에서, 본 발명은 포유동물 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포에서의 발현을 위해 프로모터에 작동가능하게 연결된 BCMA CAR을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 BCMA-발현 종양을 치료하는데 사용하기 위한 BCMA CAR을 발현하는 재조합 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포를 제공하고, 여기서 BCMA CAR을 발현하는 재조합 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)로 불린다. 한 측면에서, 본 발명의 BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)는 BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)가 종양 세포를 표적화하고 종양의 성장이 억제되도록 종양 세포를 그의 표면 상에 발현된 적어도 1개의 본 발명의 BCMA CAR과 접촉시킬 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)가 항원에 반응하여 활성화되고 암 세포를 표적화하도록 종양 세포를 본 발명의 BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)와 접촉시키는 것을 포함하는 BCMA-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이며, 여기서 종양의 성장은 억제된다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 암이 대상체에서 치료되도록 대상체에게 본 발명의 BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 BCMA의 발현과 연관된 암이다.
본 발명은 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)를 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형시키고, BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)를 그를 필요로 하는 수용자에게 주입하는 세포 요법의 유형을 포함한다. 주입된 세포는 수용자 내에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과는 달리, CAR-변형된 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포는 생체내에서 복제할 수 있어서 장기간 존속하고, 이는 지속된 종양 제어로 이어질 수 있다. 다양한 측면에서, 환자에 투여된 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포), 또는 그의 자손은 환자에게 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)를 투여한 후 환자 내에서 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 또는 5년 동안 지속된다.
본 발명은 또한 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)를 키메라 항원 수용체 (CAR)를 일시적으로 발현하도록 예를 들어 시험관내 전사된 RNA에 의해 변형시키고, 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)를 그를 필요로 하는 수용자에게 주입하는 세포 요법의 유형을 포함한다. 주입된 세포는 수용자 내에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양한 측면에서, 환자에 투여된 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 환자에게 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)를 투여한 후 1개월 미만, 예를 들어 3주, 2주, 1주 동안 존재한다.
임의의 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, CAR-변형된 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)에 의해 도출된 항종양 면역 반응은 능동 또는 수동 면역 반응일 수 있거나, 또는 대안적으로 직접 대 간접 면역 반응으로 인한 것일 수 있다. 한 측면에서, CAR 형질도입된 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 BCMA를 발현하는 인간 암 세포에 반응하여 특이적 염증유발 시토카인 분비 및 강력한 세포용해 활성을 나타내고, 가용성 BCMA 억제에 저항하고, 방관자 사멸을 매개하고, 확립된 인간 종양의 퇴행을 매개한다. 예를 들어, BCMA-발현 종양의 불균질 영역 내의 항원이-없는 종양 세포는 인접한 항원-양성 암 세포에 대해 이전에 반응한 BCMA-재지시된 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)에 의한 간접적인 파괴에 감수성일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 완전-인간 CAR-변형된 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 포유동물에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 요법을 위한 백신의 유형일 수 있다. 한 측면에서, 포유동물은 인간이다.
생체외 면역화와 관련하여, 하기 중 적어도 하나가 세포를 포유동물 내로 투여하기 전 시험관내에서 일어난다: i) 세포의 확장, ii) CAR을 코딩하는 핵산의 세포로의 도입 또는 iii) 세포의 동결보존.
생체외 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 하기에 보다 상세하게 논의된다. 간략하게, 세포는 포유동물 (예를 들어, 인간)으로부터 단리되고, 본원에 개시된 CAR을 발현하는 벡터에 의해 유전자 변형된다 (즉, 시험관내에서 형질도입 또는 형질감염된다). CAR-변형된 세포는 포유동물 수용자에게 투여되어 치료 이익을 제공할 수 있다. 포유동물 수용자는 인간일 수 있고, CAR-변형된 세포는 수용자에 관하여 자가일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수용자에 관하여 동종, 동계 또는 이종일 수 있다.
조혈 줄기 및 전구 세포의 생체외 확장 절차는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,199,942에 기재되어 있고, 이는 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 따라서 본 발명은 세포의 생체외 확장의 임의의 특정한 방법으로 제한되지 않는다. 간략하게, T 세포의 생체외 배양 및 확장은: (1) 포유동물로부터 말초 혈액 수거 또는 골수 이식편으로부터 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포를 수집하는 것; 및 (2) 이러한 세포를 생체외 확장시키는 것을 포함한다. 미국 특허 번호 5,199,942에 기재된 세포 성장 인자에 더하여, 다른 인자, 예컨대 flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드가 세포의 배양 및 확장을 위해 사용될 수 있다.
생체외 면역화와 관련하여 세포-기반 백신을 사용하는 것에 더하여, 본 발명은 또한 환자에서 항원에 대해 지시된 면역 반응을 도출하는 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포는 면역손상된 개체에서 발생하는 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 CAR-변형된 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 BCMA의 발현과 연관된 질환, 장애 및 상태의 치료에 사용된다. 특정 측면에서, 본 발명의 세포는 BCMA의 발현과 연관된 질환, 장애 및 상태의 발생 위험이 있는 환자의 치료에 사용된다. 따라서, 본 발명은 BCMA의 발현과 연관된 질환, 장애 및 상태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 CAR-변형된 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)를 투여하는 것을 포함하는, BCMA의 발현과 연관된 질환, 장애 및 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
한 측면에서 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)는 증식성 질환, 예컨대 암 또는 악성종양, 또는 전암성 상태, 예컨대 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병을 치료하는데 사용될 수 있다. 한 측면에서, 암은 혈액암이다. 혈액암 상태는 혈액, 골수 및 림프계에 영향을 미치는 백혈병 및 악성 림프증식성 상태와 같은 암의 유형이다. 한 측면에서, 혈액암은 백혈병 또는 혈액학적이다. BCMA와 연관된 질환 또는 장애의 예는 다발성 골수종 (MM으로도 공지됨)이다 (문헌 [Claudio et al., Blood. 2002, 100(6):2175-86; 및 Novak et al., Blood. 2004, 103(2):689-94] 참조). 형질 세포 골수종 또는 칼러병으로도 공지된 다발성 골수종은 골수 내 비정상 또는 악성 형질 B-세포의 축적을 특징으로 하는 암이다. 빈번하게, 암 세포는 인접한 골에 침습하여, 골격 구조를 파괴시키고 골통 및 골절을 야기한다. 대부분의 경우의 골수종은 또한 악성 형질 세포의 클론 증식에 의해 과량으로 생산되는 비정상적 이뮤노글로불린인 파라단백질 (M 단백질 또는 골수종 단백질로도 공지됨)의 생산을 특색으로 한다. 30g/L 초과의 혈청 파라단백질 수준은 국제 골수종 연구 그룹(International Myeloma Working Group) (IMWG)의 진단 기준에 따라 다발성 골수종으로 진단된다 (문헌 [Kyle et al. (2009), Leukemia. 23:3-9] 참조). 다발성 골수종의 다른 증상 또는 징후는 감소된 신장 기능 또는 신부전, 골 병변, 빈혈, 고칼슘혈증 및 신경계 증상을 포함한다.
다발성 골수종을 다른 형질 세포 증식성 장애와 구별하기 위한 기준은 국제 골수종 연구 그룹에 의해 확립되어 있다 (문헌 [Kyle et al. (2009), Leukemia. 23:3-9] 참조). 모든 3가지의 하기 기준을 충족시켜야 한다:
- 클론 골수 형질 세포 ≥10%
- 혈청 및/또는 요 모노클로날 단백질의 존재 (진성 비-분비 다발성 골수종을 갖는 환자에서는 제외)
- 기저 형질 세포 증식성 장애에서 기인한 종말-기관 손상의 증거, 특히:
o 고칼슘혈증: 혈청 칼슘 ≥11.5 mg/100 ml
o 신장 기능부전: 혈청 크레아티닌 > 1.73 mmol/l
o 빈혈: 정상의 하한 미만인 >2g/100 ml의 헤모글로빈 값, 또는 헤모글로빈 값 <10g/100ml을 갖는 정상혈색소성, 정상혈구성
o 골 병변: 용해 병변, 중증 골감소증 또는 병리학적 골절.
본원에 기재된 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 다른 형질 세포 증식성 장애는 무증상 골수종 (증상이 없는 다발성 골수종 또는 무통성 골수종), 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질세포종 (예를 들어, 형질 세포 이혼화증, 고립 골수종, 고립 형질세포종, 수질외 형질세포종, 및 다발성 형질세포종), 전신 아밀로이드 경쇄 아밀로이드증, 및 POEMS 증후군 (크로우-푸카세 증후군, 다카츠키병 및 PEP 증후군으로도 공지됨)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
다발성 골수종의 병기결정에 2종의 병기결정 시스템이 사용된다: 국제 병기결정 시스템 (ISS) (문헌 [Greipp et al. (2005), J. Clin. Oncol. 23 (15):3412-3420] 참조) 및 듀리-살몬(Durie-Salmon) 병기결정 시스템 (DSS) (문헌 [Durie et al. (1975), Cancer 36 (3): 842-854] 참조). 2종의 병기결정 시스템이 하기 표에 요약된다:
<표 18>
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*듀리-살몬 병기결정 시스템은 또한 신기능의 상태를 나타내는 하위분류를 포함한다. "A" 또는 "B"의 명칭이 병기 숫자 다음에 부가되고, 여기서 "A"는 상대적으로 정상인 신기능 (혈청 크레아티닌 값 <2.0 mg/dL)을 나타내고, B는 비정상인 신기능 (혈청 크레아티닌 값 >2.0 mg/dL)을 나타낸다.
다발성 골수종 및 연관 질환에 대한 표준 치료는 화학요법, 줄기 세포 이식 (자가 또는 동종), 방사선 요법 및 다른 약물 요법을 포함한다. 빈번하게 사용되는 항골수종 약물은 알킬화제 (예를 들어, 벤다무스틴, 시클로포스파미드 및 멜팔란), 프로테아솜 억제제 (예를 들어, 보르테조밉), 코르티코스테로이드 (예를 들어, 덱사메타손 및 프레드니손) 및 면역조정제 (예를 들어, 탈리도미드 및 레날리도미드 또는 레블리미드?) 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 비포스포네이트 약물은 또한 빈번하게, 골 손실을 방지하기 위해 표준 항-MM 치료와 조합되어 투여된다. 65-70세 초과의 환자는 줄기 세포 이식을 위한 후보가 아닐 수 있다. 일부 경우에, 이중-자가 줄기 세포 이식은 제1 이식에 대해 준최적 반응을 갖는 60세 미만의 환자에 대한 옵션이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 다발성 골수종에 대해 현재 처방된 임의의 치료와 조합되어 투여될 수 있다.
BCMA와 연련된 질환 또는 장애의 또 다른 예는 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종이다 (문헌 [Chiu et al., Blood. 2007, 109(2):729-39; He et al., J Immunol. 2004, 172(5):3268-79] 참조).
호지킨병으로도 공지된 호지킨 림프종 (HL)은 백혈구 또는 림프구에서 기원한 림프계의 암이다. 림프종을 포함하는 비정상 세포는 리드-스턴버그 세포로 불린다. 호지킨 림프종에서, 암은 하나의 림프절 군에서 또 다른 군으로 확산된다. 호지킨 림프종은 리드-스턴버그 세포 형태 및 리드-스턴버그 세포 주위의 세포 조성에 기초하여 4종의 병리학적 하위유형으로 하위분류될 수 있다 (림프절 생검을 통해 결정되는 바와 같음): 결절성 경화성 HL, 혼합-세포충실성 하위유형, 림프구-풍부 또는 림프구성 우세형, 림프구 고갈. 일부 호지킨 림프종은 또한 결절성 림프구 우세형 호지킨 림프종일 수 있거나, 명시되지 않을 수 있다. 호지킨 림프종의 증상 및 징후는 목, 겨드랑이, 또는 사타구니 내 림프절에서의 무통 종창, 열, 야간 발한, 체중 감소, 피로, 가려움증 또는 복통을 포함한다.
비-호지킨 림프종 (NHL)은 호지킨 림프종 이외의 임의의 유형의 림프종을 포함하는 혈액암의 다양한 군을 포함한다. 비-호지킨 림프종의 하위유형은 주로 세포 형태, 염색체 이상 및 표면 마커에 의해 분류된다. NHL 하위유형 (또는 NHL-연관 암)은 B 세포 림프종, 예컨대 비제한적으로, 버킷 림프종, B-세포 만성 림프구성 백혈병 (B-CLL), B-세포 전림프구성 백혈병 (B-PLL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL) (예를 들어, 혈관내 대 B-세포 림프종 및 원발성 종격 B-세포 림프종), 여포성 림프종 (예를 들어, 여포 중심세포 림프종, 여포성 소분할 세포), 모발 세포 백혈병, 고등급 B-세포 림프종 (버킷 유사), 림프형질세포성 림프종 (발덴스트롬 마크로글로불린혈증), 외투 세포 림프종, 변연부 B-세포 림프종 (예를 들어, 림프절외 변연부 B-세포 림프종 또는 점막-연관 림프성 조직 (MALT) 림프종, 결절성 변연부 B-세포 림프종, 및 비장 변연부 B-세포 림프종), 형질세포종/골수종, 전구체 B-림프모구성 백혈병/림프종 (PB-LBL/L), 원발성 중추 신경계 (CNS) 림프종, 원발성 안내 림프종, 소림프구성 림프종 (SLL); 및 T 세포 림프종, 예컨대 비제한적으로, 역형성 대세포 림프종 (ALCL), 성인 T-세포 림프종/백혈병 (예를 들어, 증상이 없는, 만성, 급성 및 림프종), 혈관중심성 림프종, 혈관면역모세포성 T-세포 림프종, 피부 T-세포 림프종 (예를 들어, 균상 식육종, 세자리 증후군 등), 림프절외 자연 킬러/T-세포 림프종 (비강-유형), 장병증 유형 장 T-세포 림프종, 거대 과립 림프구 백혈병, 전구체 T-림프모구성 림프종/백혈병 (T-LBL/L), T-세포 만성 림프구성 백혈병/전림프구성 백혈병 (T-CLL/PLL), 및 명시되지 않은 말초 T-세포 림프종을 포함한다. 호지킨 림프종의 증상 및 징후는 목, 겨드랑이, 또는 사타구니 내 림프절에서의 무통 종창, 열, 야간 발한, 체중 감소, 피로, 가려움증, 복통, 기침, 또는 흉통을 포함한다.
병기결정은 호지킨 및 비-호지킨 림프종 둘 다에 대해 동일하고, 신체 내 암 세포의 확산의 정도를 지칭한다. 병기 I에서, 림프종 세포는 1개의 림프절 군 내에 존재한다. 병기 II에서, 림프종 세포는 적어도 2개의 림프절 군 내에 존재하지만, 둘 다의 군은 횡경막의 동일한 쪽에 있거나, 조직 또는 기관의 한 부분 및 횡경막의 동일한 쪽의 그러한 기관과 가까운 림프절에 있다. 병기 III에서, 림프종 세포는 횡경막 양쪽의 림프절에 존재하거나, 이들 림프절 군과 가까운 조직 또는 기관의 한 부분에 존재하거나, 비장에 존재한다. 병기 IV에서, 림프종 세포는 적어도 1종의 기관 또는 조직의 여러 부분에서 발견되거나, 림프종 세포는 횡경막의 다른 쪽의 기관 및 림프절에 있다. 로마 숫자 병기결정 명칭에 더하여, 병기는 또한 문자 A, B, E, 및 S에 의해 기재될 수 있고, 여기서 A는 증상이 없는 환자를 지칭하고, B는 증상이 있는 환자를 지칭하고, E는 림프종이 림프계 외부의 조직에서 발견되는 환자를 지칭하고, S는 림프종이 비장에서 발견되는 환자를 지칭한다.
호지킨 림프종은 통상적으로 방사선 요법, 화학요법 또는 조혈 줄기 세포 이식에 의해 치료된다. 비-호지킨 림프종을 위한 가장 통상적인 요법은 R-CHOP로, 이는 4종의 상이한 화학요법 (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레니솔론) 및 리툭시맙 (리툭산?)으로 이루어진다. NHL를 치료하는데 통상적으로 사용되는 다른 요법은 다른 화학요법제, 방사선 요법, 줄기 세포 이식 (자가 또는 동종 골수 이식) 또는 생물학적 요법, 예컨대 면역요법을 포함한다. 생물학적 치료제의 다른 예는 리툭시맙 (리툭산?), 토시투모맙 (벡사르(Bexxar)?), 에프라투주맙 (림포사이드(LymphoCide)?) 및 알렘투주맙 (맙캄파트(MabCampath)?)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법은 호지킨 림프종 또는 비-호지킨 림프종에 대한 임의의 현재 처방된 치료와 조합되어 투여될 수 있다.
BCMA 발현은 또한 림프형질세포성 림프종 (LPL)으로도 공지된 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 (WM)과 연관되어 왔다. (문헌 [Elsawa et al., Blood. 2006, 107(7):2882-8] 참조). 발덴스트롬 마크로글로불린혈증은 이전에 다발성 골수종과 관련이 있는 것으로 간주되었지만, 보다 최근에는 비-호지킨 림프종의 하위유형으로서 분류된 바 있다. WM은 비제어 B-세포 림프구 증식을 특징으로 하고, 이는 빈혈, 및 혈액을 증점시켜 고점도 증후군을 발생시키는 과량의 파라단백질, 또는 이뮤노글로불린 M (IgM)의 생산을 발생시킨다. WM의 다른 증상 또는 징후는 열, 야간 발한, 피로, 빈혈, 체중 감소, 림프절병증 또는 비장비대, 흐린 시각, 어지럼증, 코피, 잇몸 출혈, 비통상적 타박상, 신장애 또는 신부전, 아밀로이드증 또는 말초 신경병증을 포함한다.
WM을 위한 표준 치료는 특히 리툭시맙 (리툭산?)에 의한 화학요법으로 이루어진다. 다른 화학요법 약물, 예컨대 클로람부실 (류케란(Leukeran)?), 시클로포스파미드 (네오사르(Neosar)?), 플루다라빈 (플루다라(Fludara)?), 클라드리빈 (류스타틴(Leustatin)?), 빈크리스틴 및/또는 탈리도미드와 조합되어 사용될 수 있다. 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니손이 또한 화학요법과 조합되어 투여될 수 있다. 혈장분리반출술 또는 혈장 교환은 파라단백질을 혈액으로부터 제거함으로써 일부 증상을 완화시키기 위해 환자의 치료 전반에 걸쳐 통상적으로 사용된다. 일부 경우에, 줄기 세포 이식은 일부 환자를 위한 옵션이다.
BCMA와 연관된 질환 또는 장애의 또 다른 예는 뇌암이다. 특히, BCMA의 발현은 성상세포종 또는 교모세포종과 연관되어 왔다 (문헌 [Deshayes et al., Oncogene. 2004, 23(17):3005-12, Pelekanou et al., PLoS One. 2013, 8(12):e83250] 참조). 성상세포종은 뇌 내 일종의 신경교 세포인 성상세포에서 비롯된 종양이다. 교모세포종 (다형성 교모세포종 또는 GBM으로도 공지됨)은 성상세포종의 가장 악성 형태이고, 뇌암의 가장 진행된 병기 (병기 IV)로 간주된다. 교모세포종의 2종의 변이체: 거대 세포 교모세포종 및 신경교육종이 존재한다. 다른 성상세포종은 소아 모양세포성 성상세포종 (JPA), 원섬유성 성상세포종, 다형성 황색성상세포종 (PXA), 배아이형성 신경상피 종양 (DNET) 및 역형성 성상세포종 (AA)을 포함한다.
교모세포종 또는 성상세포종과 연관된 증상 또는 징후는 뇌내 증가된 압력, 두통, 발작, 기억 상실, 행동에서의 변화, 신체의 한쪽에서의 운동 또는 감각 상실, 언어 기능장애, 인지 장애, 시각 장애, 오심, 구토, 및 팔 또는 하지 약화를 포함한다.
종양의 외과적 제거 (또는 절제)는 손상없이 또는 정상의 뇌 주위에의 최소한의 손상으로 가능한 한 많은 신경교종의 제거를 위한 표준 치료이다. 방사선 요법 및/또는 화학요법은 종종 임의의 남아있는 암 세포 또는 위성 병변으로부터의 재발성 질환을 억제 또는 늦추기 위해 수술 후에 사용된다. 방사선 요법은 전체 뇌 방사선요법 (통상적인 외부 빔 방사선), 표적화된 3차원 입체조형 방사선요법 및 표적화된 방사성핵종을 포함한다. 교모세포종을 치료하기 위해 통상적으로 사용되는 화학요법제는 테모졸로미드, 게피티닙 또는 에를로티닙 및 시스플라틴을 포함한다. 혈관신생 억제제, 예컨대 베바시주맙 (아바스틴(Avastin)?)은 또한 통상적으로 화학요법 및/또는 방사선요법과 조합되어 사용된다.
신경계 증상을 경감시키고 신경계 기능을 개선시키기 위해 지지적 치료가 또한 빈번하게 사용되고, 이는 본원에 기재된 임의의 암 요법과 조합되어 투여된다. 1차 지지적 작용제는 항경련제 및 코르티코스테로이드를 포함한다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 교모세포종 또는 성상세포종을 치료하기 위해 임의의 표준 또는 지지적 치료와 조합되어 사용될 수 있다.
BCMA 발현과 연관된 비-암 관련 질환 및 장애는 또한 본원에 개시된 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있다. BCMA 발현과 연관된 비-암 관련 질환 및 장애의 예는 바이러스 감염; 예를 들어, HIV, 진균 감염, 예를 들어, 씨. 네오포르만스; 과민성 장 질환; 궤양성 결장염 및 점막 면역과 관련된 장애를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 CAR-변형된 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 단독으로, 또는 희석제 및/또는 다른 성분, 예컨대 IL-2 또는 다른 시토카인 또는 세포 집단과 조합되어 제약 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명은 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, 암은 백혈병 또는 림프종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 혈액암이다. 한 측면에서, 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CART 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)는 암 및 악성종양, 예컨대 비제한적으로 예를 들어, B-세포 급성 림프성 백혈병 ("BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 급성 백혈병; 예를 들어, 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 만성 백혈병; 예를 들어, B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 상태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 형질모구성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 및 골수 혈액 세포의 비유효 생산 (또는 이형성증)과 연관된 혈액 상태의 다양한 집단인 "전백혈병"을 포함하나 이에 제한되지는 않는 추가의 혈액암 또는 혈액 상태 등을 치료하는데 사용될 수 있다. BCMA 발현과 연관된 추가의 질환은, 예를 들어 BCMA를 발현하는 비정형 및/또는 비-전형적 암, 악성종양, 전암성 상태 또는 증식성 질환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 형질 세포 증식성 장애, 예를 들어 무증상 골수종 (증상이 없는 다발성 골수종 또는 무통성 골수종), 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질세포종 (예를 들어, 형질 세포 이혼화증, 고립 골수종, 고립 형질세포종, 수질외 형질세포종, 및 다발성 형질세포종), 전신 아밀로이드 경쇄 아밀로이드증, 및 POEMS 증후군 (크로우-푸카세 증후군, 다카츠키병 및 PEP 증후군으로도 공지됨)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 암, 예를 들어 본원에 기재된 암, 예를 들어 전립선암 (예를 들어, 거세-저항성 또는 요법-저항성 전립선암 또는 전이성 전립선암), 췌장암 또는 폐암을 포함하나 이에 제한되지는 않는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 BCMA-발현 세포를 포함하는 세포의 집단을 BCMA-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 세포 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)와 접촉시키는 것을 포함하는, BCMA-발현 세포 집단의 증식을 억제 또는 그를 감소시키는 방법을 제공한다. 구체적 측면에서, 본 발명은 BCMA-발현 암 세포 집단을 BCMA-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 세포 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)와 접촉시키는 것을 포함하는, BCMA를 발현하는 암 세포의 증식을 억제 또는 그의 집단을 감소시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 BCMA-발현 암 세포 집단을 BCMA-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 세포 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)와 접촉시키는 것을 포함하는, BCMA를 발현하는 암 세포의 증식을 억제 또는 그의 집단을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 본 발명의 항-BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 세포 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)는 골수성 백혈병 또는 BCMA-발현 세포와 연관된 또 다른 암을 갖는 대상체 또는 그에 대한 동물 모델에서 세포 및/또는 암 세포의 수량, 수, 양 또는 백분율을 음성 대조군에 비해 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 감소시킨다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한 BCMA-발현 세포와 연관된 질환 (예를 들어, 혈액암 또는 BCMA를 발현하는 비정형 암)의 예방, 치료 및/또는 관리를 필요로 하는 대상체에게 BCMA-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 세포 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)를 투여하는 것을 포함하는, BCMA-발현 세포와 연관된 질환 (예를 들어, 혈액암 또는 BCMA를 발현하는 비정형 암)을 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다. BCMA-발현 세포와 연관된 장애의 비제한적 예는 바이러스 또는 진균 감염 및 점막 면역과 관련된 장애를 포함한다.
본 발명은 또한 BCMA-발현 세포와 연관된 질환의 예방, 치료 및/또는 관리를 필요로 하는 대상체에게 BCMA-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 세포 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)를 투여하는 것을 포함하는, BCMA-발현 세포와 연관된 질환을 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 BCMA-발현 세포와 연관된 암의 재발의 예방을 필요로 하는 대상체에게 BCMA-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 세포 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)를 투여하는 것을 포함하는, BCMA-발현 세포와 연관된 암의 재발을 예방하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 방법은 BCMA-발현 세포에 결합하는 본원에 기재된 항-BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 세포 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)의 유효량을 또 다른 요법의 유효량과 조합하여 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
조합 요법
본원에 기재된 CAR-발현 세포는 다른 공지된 작용제 및 요법과 조합되어 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "조합되어" 투여된은, 2종 (또는 그 초과)의 상이한 치료가 대상체가 장애를 앓는 동안 대상체에게 전달됨을 의미하고, 예를 들어 대상체가 장애로 진단된 후 및 장애가 치유 또는 제거되기 전 또는 치료가 다른 이유로 중지되기 전에 2종 이상의 치료가 전달된다. 일부 실시양태에서, 1종의 치료의 전달은 제2 전달이 개시될 때 여전히 발생하여, 투여 관점에서 중첩된다. 이것은 때때로 본원에서 "동시" 또는 "공동 전달"로 지칭된다. 다른 실시양태에서, 1종의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 개시되기 전에 종료된다. 어느 하나의 경우의 일부 실시양태에서, 조합 투여로 인해 치료가 보다 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료가 보다 효과적이고, 예를 들어 더 적은 제2 치료에 의해 동등한 효과가 관찰되거나, 또는 제1 치료의 부재 하에 제2 치료가 투여된 경우에 관찰될 것보다 더 큰 정도로 제2 치료가 증상을 감소시키거나, 또는 제1 치료에 의해 유사한 상황이 관찰된다. 일부 실시양태에서, 증상 또는 장애와 관련된 다른 파라미터의 감소가 다른 것의 부재 하에 전달된 1종의 치료에 의해 관찰될 것보다 더 크도록 전달된다. 2종의 치료의 효과는 부분적으로 부가적이거나, 전체적으로 부가적이거나, 또는 부가적인 것보다 클 수 있다. 전달된 제1 치료의 효과가 제2 치료가 전달될 때 여전히 검출가능하도록 전달이 이루어질 수 있다.
본원에 기재된 CAR-발현 세포 및 적어도 1종의 추가의 치료제는 동시에, 동일한 조성물 내에 또는 개별 조성물 내에, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적인 투여를 위해, 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 먼저 투여될 수 있고 추가의 작용제는 두 번째로 투여될 수 있거나, 투여 순서가 역전될 수 있다.
CAR 요법 및/또는 다른 치료제, 절차 또는 양식은 장애의 활성 기간 동안, 또는 질환의 완화 또는 보다 낮은 활성 기간 동안 투여될 수 있다. CAR 요법은 장애의 다른 치료 전, 치료와 공동으로, 치료-후, 또는 완화 동안 투여될 수 있다.
조합되어 사용되는 경우에, CAR 요법 및 추가의 작용제 (예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 또는 모두는 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 높거나, 낮거나, 또는 동일한 양 또는 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, CAR 요법, 추가의 작용제 (예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 또는 모두의 투여되는 양 또는 투여량은 개별적으로, 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 낮다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%). 다른 실시양태에서, 목적하는 효과 (예를 들어, 암의 치료)를 발생시키는 CAR 요법, 추가의 작용제 (예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 또는 모두의 양 또는 투여량은 동일한 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 개별적으로 예를 들어 단독요법으로서 사용되는 각각의 작용제의 양 또는 투여량보다 낮다 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 낮다).
추가 측면에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 수술, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역절제제, 예컨대 캄파트, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 치료제, 시톡신, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 시토카인, 및 방사선조사, 펩티드 백신, 예컨대 문헌 [Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971]에 기재된 것과 조합되어 치료 요법에서 사용될 수 있다.
특정 경우에, 본 발명의 화합물은 다른 치료제, 예컨대 다른 항암제, 항알레르기제, 항오심제 (또는 항구토제), 통증 완화제, 세포보호제 및 그의 조합과 조합된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 제1 CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA CAR-발현 세포는 제2 CAR-발현 세포와 조합되어 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 제2 CAR-발현 세포는 제1 CAR-발현 세포에 의해 발현된 CAR 내의 항-BCMA 결합 도메인과 상이한, 상이한 항-BCMA 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 항-BCMA 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현한다. 한 실시양태에서, 제2 CAR-발현 세포는 BCMA 이외의 항원 (예를 들어, CD19, CD20, CS-1, 카파 경쇄, CD139, 루이스 Y 항원, 또는 CD38)을 표적화하는 항원-결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 제1 CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA CAR-발현 세포는 CD19 CAR을 포함하는 제2 CAR-발현 세포와 조합되어 사용된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 BCMA CAR-발현 세포는 본원에 기재된 BCMA-연관 암, 예를 들어 다발성 골수종을 치료하기 위해 CD19 CAR-발현 세포와 조합되어 사용된다. 일부 실시양태에서, 다발성 골수종은 예를 들어 유동 세포측정법, RT-PCR, 또는 유동 세포측정법 및 RT-PCR 둘 다에 의해 검출된 바와 같이, 예를 들어 대부분 (예를 들어, 적어도 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.95%)의 신생물성 형질 세포가 CD19-음성 표현형을 갖는, CD19-음성이다. 본원의 실시예 17에 제시된 바와 같이, CD19 CAR은 CD19-음성 다발성 골수종에 대해서도 유효할 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, CD19 CAR은 본원에 기재된 검정의 검출 역치 미만에 속하는 CD19의 수준을 발현하는 세포를 표적화함으로써, 또는 신생물성 세포를 지지하는 비-신생물성 세포를 표적화함으로써 신생물성 세포의 작지만 중요한 CD19-양성 집단에 대해 작용할 수 있다. 실시양태에서, CD19 CAR은 B 세포, 예를 들어 B 조절 B 세포를 제거할 수 있다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 본원에 기재된 제1 CAR-발현 세포, 예를 들어 BCMA CAR-발현 세포, 및 본원에 기재된 제2 CAR-발현 세포, 예를 들어 CD19 CAR-발현 세포는 동일한 조성물로 제조되고, 동시에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 제1 CAR-발현 세포, 예를 들어 BCMA CAR-발현 세포, 및 본원에 기재된 제2 CAR-발현 세포, 예를 들어 CD19 CAR-발현 세포는 개별 조성물로 제조되고, 개별 조성물은 동시에 또는 순차적으로 투여된다. BCMA CAR-발현 세포 및 제2 CAR-발현 세포가 개별 조성물로 제조되는 경우에, BCMA CAR-발현 세포가 첫번째로 투여될 수 있고 제2 CAR-발현 세포가 두번째로 투여될 수 있거나, 투여의 순서가 역전될 수 있다.
한 실시양태에서, CD19 CAR은 2014년 3월 15일에 출원된 WO2014/153270에 기재된 (그의 전문은 본원에 참조로 포함됨) CD19 CAR, 예를 들어 인간화 CD19 CAR 또는 그에 대해 적어도 95%, 예를 들어 95-99% 동일한 서열이다. 일부 실시양태에서, CD19 CAR 구축물은 PCT 공개 WO2012/079000에 제공된 (그의 전문은 본원에 참조로 포함됨) CAR19 구축물 또는 그에 대해 적어도 95%, 예를 들어 95-99% 동일한 서열이다. 한 실시양태에서, 항-CD19 결합 도메인은 WO2012/079000에 기재된 scFv 또는 그에 대해 적어도 95%, 예를 들어 95-99% 동일한 서열이다.
실시양태에서, 제1 CAR-발현 세포가 대상체에게 투여되고, 제2 CAR-발현 세포가 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 제1 CAR-발현 세포는 CD27 공동자극 도메인 및 CD3제타 (돌연변이체 또는 야생형) 1차 신호전달 도메인을 포함하는 CAR (예를 들어, BCMA 또는 CD19 CAR)을 포함한다. 실시양태에서, 제2 CAR-발현 세포는 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3제타 (돌연변이체 또는 야생형) 1차 신호전달 도메인을 포함하는 CAR (예를 들어, BCMA CAR)을 포함한다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 실시양태에서, 제1 CAR-발현 세포가 제2 CAR-발현 세포보다 덜 독성일 수 있고 종양을 용적축소하는데 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 화학요법제와 조합되어 사용될 수 있다. 예시적인 화학요법제는 안트라시클린 (예를 들어, 독소루비신 (예를 들어, 리포솜 독소루비신)), 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈), 알킬화제 (예를 들어, 시클로포스파미드, 데카르바진, 멜팔란, 이포스파미드, 테모졸로미드), 면역 세포 항체 (예를 들어, 알렘투주맙, 겜투주맙, 리툭시맙, 토시투모맙), 항대사물 (예를 들어, 폴산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 데아미나제 억제제 (예를 들어, 플루다라빈) 포함), mTOR 억제제, TNFR 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질 (GITR) 효능제, 프로테아솜 억제제 (예를 들어, 아클라시노마이신 A, 글리오톡신 또는 보르테조밉); 면역조정제, 예컨대 탈리도미드 또는 탈리도미드 유도체 (예를 들어, 레날리도미드)를 포함한다.
조합 요법에 사용하기 위해 고려되는 일반적 화학요법제는 아나스트로졸 (아리미덱스(Arimidex)?), 비칼루타미드 (카소덱스(Casodex)?), 블레오마이신 술페이트 (블레녹산(Blenoxane)?), 부술판 (밀레란?), 부술판 주사 (부술펙스?), 카페시타빈 (젤로다(Xeloda)?), N4-펜톡시카르보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카르보플라틴 (파라플라틴(Paraplatin)?), 카르무스틴 (BiCNU?), 클로람부실 (류케란(Leukeran)?), 시스플라틴 (플라티놀(Platinol)?), 클라드리빈 (류스타틴(Leustatin)?), 시클로포스파미드 (시톡산? 또는 네오사르?), 시타라빈, 시토신 아라비노시드 (시토사르-U?), 시타라빈 리포솜 주사 (데포사이트?), 다카르바진 (DTIC-돔)?), 닥티노마이신 (악티노마이신 D(Actinomycin D), 코스메간(Cosmegan)), 다우노루비신 히드로클로라이드 (세루비딘(Cerubidine)?), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사 (다우녹솜?), 덱사메타손, 도세탁셀 (탁소테레(Taxotere)?), 독소루비신 히드로클로라이드 (아드리아마이신(Adriamycin)?, 루벡스(Rubex)?), 에토포시드 (베페시드(Vepesid)?), 플루다라빈 포스페이트 (플루다라(Fludara)?), 5-플루오로우라실 (아드루실(Adrucil)?, 에푸덱스(Efudex)?), 플루타미드 (유렉신(Eulexin)?), 테자시티빈, 겜시타빈 (디플루오로데옥시시티딘), 히드록시우레아 (히드레아(Hydrea)?), 이다루비신 (이다마이신(Idamycin)?), 이포스파미드 (이펙스(IFEX)?), 이리노테칸 (캄프토사르(Camptosar)?), L-아스파라기나제 (엘스파르(ELSPAR)?), 류코보린 칼슘, 멜팔란 (알케란(Alkeran)?), 6-메르캅토퓨린 (퓨린톨(Purinethol)?), 메토트렉세이트 (폴렉스(Folex)?), 미톡산트론 (노반트론(Novantrone)?), 밀로타르그, 파클리탁셀 (탁솔(Taxol)?), 포에닉스(phoenix) (이트륨90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카르무스틴 이식물을 갖는 폴리페프로산 20 (글리아델(Gliadel)?), 타목시펜 시트레이트 (놀바덱스(Nolvadex)?), 테니포시드 (부몬(Vumon)?), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민 (티라존(Tirazone)?), 주사용 토포테칸 히드로클로라이드 (하이캄틴(Hycamptin)?), 빈블라스틴 (벨반(Velban)?), 빈크리스틴 (온코빈(Oncovin)?), 및 비노렐빈 (나벨빈(Navelbine)?)을 포함한다.
본 발명의 화합물과의 조합을 위한 특정한 관심 항암제는 안트라시클린; 알킬화제; 항대사물; 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린 또는 p70S6 키나제 FK506를 억제하거나, p70S6 키나제를 억제하는 약물; mTOR 억제제; 면역조정제; 안트라시클린; 빈카 알칼로이드; 프로테오솜 억제제; GITR 효능제; 단백질 티로신 포스파타제 억제제; CDK4 키나제 억제제; BTK 억제제; MKN 키나제 억제제; DGK 키나제 억제제; 또는 종양용해 바이러스를 포함한다.
예시적인 알킬화제는 비제한적으로 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠): 우라실 머스타드 (아미노우라실 머스타드(Aminouracil Mustard)?, 클로레타미나실(Chlorethaminacil)?, 데메틸도판(Demethyldopan)?, 데스메틸도판(Desmethyldopan)?, 해만타민(Haemanthamine)?, 노르도판(Nordopan)?, 우라실 질소 머스타드(Uracil nitrogen mustard)?, 우라실로스트(Uracillost)?, 우라실모스타자(Uracilmostaza)?, 우라무스틴(Uramustin)?, 우라무스틴(Uramustine)?), 클로르메틴 (머스타르겐(Mustargen)?), 시클로포스파미드 (시톡산?, 네오사르(Neosar)?, 클라펜(Clafen)?, 엔독산(Endoxan)?, 프로시톡스(Procytox)?, 레비뮨(Revimmune)™), 이포스파미드 (미톡사나(Mitoxana)?), 멜팔란 (알케란?), 클로람부실 (류케란?), 피포브로만 (아메델(Amedel)?, 베르사이트(Vercyte)?), 트리에틸렌멜라민 (헤멜(Hemel)?, 헥살렌(Hexalen)?, 헥사스타트(Hexastat)?), 트리에틸렌티오포스포르아민, 테모졸로미드 (테모다르(Temodar)?), 티오테파 (티오플렉스(Thioplex)?), 부술판 (부실벡스(Busilvex)?, 밀레란?), 카르무스틴 (BiCNU?), 로무스틴 (세뉴(CeeNU)?), 스트렙토조신 (자노사르(Zanosar)?), 및 다카르바진 (DTIC-돔?)을 포함한다. 추가의 예시적인 알킬화제는 비제한적으로 옥살리플라틴 (엘록사틴(Eloxatin)?); 테모졸로미드 (테모다르? 및 테모달?); 닥티노마이신 (악티노마이신-D, 코스메겐(Cosmegen)?으로도 공지됨); 멜팔란 (L-PAM, L-사르코리신, 및 페닐알라닌 머스타드, 알케란?으로도 공지됨); 알트레타민 (헥사메틸멜라민 (HMM), 헥살렌?으로도 공지됨); 카르무스틴 (BiCNU?); 벤다무스틴 (트레안다(Treanda)?); 부술판 (부술펙스? 및 밀레란?); 카르보플라틴 (파라플라틴?); 로무스틴 (CCNU, 세뉴?로도 공지됨); 시스플라틴 (CDDP, 플라티놀? 및 플라티놀?-AQ로도 공지됨); 클로람부실 (류케란?); 시클로포스파미드 (시톡산? 및 네오사르?); 다카르바진 (DTIC, DIC 및 이미다졸 카르복스아미드, DTIC-돔?으로도 공지됨); 알트레타민 (헥사메틸멜라민 (HMM), 헥살렌?으로도 공지됨); 이포스파미드 (이펙스?); 프레드누무스틴; 프로카르바진 (마툴란(Matulane)?); 메클로레타민 (질소 머스타드, 무스틴 및 메클로로에타민 히드로클로라이드, 머스타르겐?으로도 공지됨); 스트렙토조신 (자노사르?); 티오테파 (티오포스포아미드, TESPA 및 TSPA, 티오플렉스?로도 공지됨); 시클로포스파미드 (엔독산?, 시톡산?, 네오사르?, 프로시톡스?, 레비뮨?); 및 벤다무스틴 HCl (트레안다?)을 포함한다.
예시적인 mTOR 억제제는, 예를 들어 템시롤리무스; 리다포롤리무스 (공식적으로 데포롤리무스로서 공지됨, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시시클로헥실 디메틸포스피네이트, 또한 AP23573 및 MK8669로도 공지되고 PCT 공개 번호 WO 03/064383에 기재됨); 에베롤리무스 (아피니토르(Afinitor)? 또는 RAD001); 라파마이신 (AY22989, 시롤리무스(Sirolimus)?); 시마피모드 (CAS 164301-51-3); 엠시롤리무스, (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올 (AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF04691502, CAS 1013101-36-4); 및 N2-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파르틸L-세린- (서열식별번호: 383), 내부 염 (SF1126, CAS 936487-67-1) 및 XL765를 포함한다.
예시적인 면역조정제는 예를 들어 아푸투주맙 (로슈(Roche)?로부터 이용가능함); 페그필그라스팀 (뉴라스타(Neulasta)?); 레날리도미드 (CC-5013, 레블리미드(Revlimid)?); 탈리도미드 (탈로미드(Thalomid)?), 악티미드 (CC4047); 및 IRX-2 (인터류킨 1, 인터류킨 2, 및 인터페론 γ를 비롯한 인간 시토카인의 혼합물, CAS 951209-71-5, IRX 테라퓨틱스(IRX Therapeutics)로부터 이용가능함)을 포함한다.
예시적인 안트라시클린은 예를 들어 독소루비신 (아드리아마이신? 및 루벡스?); 블레오마이신 (블레녹산?); 다우노루비신 (다우노루비신 히드로클로라이드, 다우노마이신, 및 루비도마이신 히드로클로라이드, 세루비딘?); 다우노루비신 리포솜 (다우노루비신 시트레이트 리포솜, 다우녹솜?); 미톡산트론 (DHAD, 노반트론?); 에피루비신 (엘렌스(Ellence)™); 이다루비신 (이다마이신?, 이다마이신 PFS?); 미토마이신 C (뮤타마이신(Mutamycin)?); 겔다나마이신; 헤르비마이신; 라비도마이신; 및 데스아세틸라비도마이신을 포함한다.
예시적인 빈카 알칼로이드는 예를 들어 비노렐빈 타르트레이트 (나벨빈?), 빈크리스틴 (온코빈?), 및 빈데신 (엘디신(Eldisine)?)); 빈블라스틴 (빈블라스틴 술페이트, 빈카류코블라스틴 및 VLB, 알카반(Alkaban)-AQ? 및 벨반?으로도 공지됨); 및 비노렐빈 (나벨빈?)을 포함한다.
예시적인 프로테오솜 억제제는 보르테조밉 (벨케이드(Velcade)?); 카르필조밉 (PX-171-007, (S)-4-메틸-N-((S)-1-(((S)-4-메틸-1-((R)-2-메틸옥시란-2-일)-1-옥소펜탄-2-일)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)-2-((S)-2-(2-모르폴리노아세트아미도)-4-페닐부탄아미도)-펜탄아미드); 마리조밉 (NPI-0052); 익사조밉 시트레이트 (MLN-9708); 델란조밉 (CEP-18770); 및 O-메틸-N-[(2-메틸-5-티아졸릴)카르보닐]-L-세릴-O-메틸-N-[(1S)-2-[(2R)-2-메틸-2-옥시라닐]-2-옥소-1-(페닐메틸)에틸]-L-세린아미드 (ONX-0912)를 포함한다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 플루다라빈, 시클로포스파미드 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 플루다라빈, 시클로포스파미드, 및 리툭시맙 (FCR)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 예를 들어, 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실 (del(17p), 예를 들어 백혈병성 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함하지 않는다. 실시양태에서, 플루다라빈은 약 10-50 mg/m2 (예를 들어, 약 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 또는 45-50 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 시클로포스파미드는 약 200-300 mg/m2 (예를 들어, 약 200-225, 225-250, 250-275, 또는 275-300 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 400-600 mg/m2 (예를 들어, 400-450, 450-500, 500-550, 또는 550-600 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 벤다무스틴 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 예를 들어, 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실 (del(17p), 예를 들어 백혈병성 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함하지 않는다. 실시양태에서, 벤다무스틴은 약 70-110 mg/m2 (예를 들어, 70-80, 80-90, 90-100, 또는 100-110 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 400-600 mg/m2 (예를 들어, 400-450, 450-500, 500-550, 또는 550-600 mg/m2) 의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및/또는 코르티코스테로이드 (예를 들어, 프레드니손)와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손 (R-CHOP)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL)을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 비벌키 제한-병기 DLBCL을 갖는다 (예를 들어, 7 cm 미만의 크기/직경을 갖는 종양을 포함함). 실시양태에서, 대상체는 방사선으로 R-CHOP과 조합되어 치료된다. 예를 들어, 대상체에게 R-CHOP (예를 들어 1-6사이클, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6사이클의 R-CHOP)이 투여된 다음, 방사선이 투여된다. 일부 경우에, 대상체에게 방사선 후에 R-CHOP (예를 들어 1-6사이클, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6사이클의 R-CHOP)이 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 시클로포스파미드, 독소루비신 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 에토포시드, 프레드니손, 빈크리스틴, 시클로포스파미드, 독소루비신 및 리툭시맙 (EPOCH-R)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 용량-조정된 EPOCH-R (DA-EPOCH-R)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 B 세포 림프종, 예를 들어 Myc-재배열 공격성 B 세포 림프종을 갖는다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙 및/또는 레날리도미드와 조합되어 대상체에게 투여된다. 레날리도미드 ((RS)-3-(4-아미노-1-옥소 1,3-디히드로-2H-이소인돌-2-일)피페리딘-2,6-디온)는 면역조정제이다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙 및 레날리도미드와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 여포성 림프종 (FL) 또는 외투 세포 림프종 (MCL)을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 FL을 갖고, 이전에 암 요법으로 치료받은 바 없다. 실시양태에서, 레날리도미드는 약 10-20 mg (예를 들어, 10-15 또는 15-20 mg)의 투여량으로, 예를 들어 매일 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 350-550 mg/m2 (예를 들어, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, 또는 475-500 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 브렌툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 브렌툭시맙은 항-CD30 항체 및 모노메틸 아우리스타틴 E의 항체-약물 접합체이다. 실시양태에서, 대상체는 호지킨 림프종 (HL), 예를 들어 재발성 또는 불응성 HL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 CD30+ HL을 포함한다. 실시양태에서, 대상체는 자가 줄기 세포 이식 (ASCT)을 겪은 바 있다. 실시양태에서, 대상체는 ASCT를 겪은 바 없다. 실시양태에서, 브렌툭시맙은 약 1-3 mg/kg (예를 들어, 약 1-1.5, 1.5-2, 2-2.5, 또는 2.5-3 mg/kg)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로, 예를 들어 3주마다 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 브렌툭시맙 및 다카르바진과 조합되어 또는 브렌툭시맙 및 벤다무스틴과 조합되어 대상체에게 투여된다. 다카르바진은 5-(3,3-디메틸-1-트리아제닐)이미다졸-4-카르복스아미드의 화학 명칭을 갖는 알킬화제이다. 벤다무스틴은 4-[5-[비스(2-클로로에틸)아미노]-1-메틸벤즈이미다졸-2-일]부탄산의 화학 명칭을 갖는 알킬화제이다. 실시양태에서, 대상체는 호지킨 림프종 (HL)을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 이전에 암 요법으로 치료받은 바 없다. 실시양태에서, 대상체는 적어도 60세, 예를 들어 60, 65, 70, 75, 80, 85세 또는 그 초과이다. 실시양태에서, 다카르바진은 약 300-450 mg/m2 (예를 들어, 약 300-325, 325-350, 350-375, 375-400, 400-425, 또는 425-450 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 벤다무스틴은 약 75-125 mg/m2 (예를 들어 75-100 또는 100-125 mg/m2, 예를 들어 약 90 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다. 실시양태에서, 브렌툭시맙은 약 1-3 mg/kg (예를 들어, 약 1-1.5, 1.5-2, 2-2.5, 또는 2.5-3 mg/kg)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로, 예를 들어 3주마다 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CD20 억제제, 예를 들어 항-CD20 항체 (예를 들어, 항-CD20 단일- 또는 이중특이적 항체) 또는 그의 단편과 조합되어 대상체에게 투여된다. 예시적인 항-CD20 항체는 리툭시맙, 오파투무맙, 오크렐리주맙, 벨투주맙, 오비누투주맙, TRU-015 (트루비온 파마슈티칼스(Trubion Pharmaceuticals)), 오카라투주맙, 및 프로131921 (제넨테크(Genentech))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 항-CD20 항체는 리툭시맙을 포함한다. 리툭시맙은 예를 들어 www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf에 기재된 바와 같은, CD20에 결합하고 CD20 과다발현 세포의 세포용해를 유발하는 키메라 마우스/인간 모노클로날 항체 IgG1 카파이다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 CLL 또는 SLL을 갖는다.
일부 실시양태에서, 리툭시맙은 정맥내로, 예를 들어 정맥내 주입으로서 투여된다. 예를 들어, 각각의 주입은 약 500-2000 mg (예를 들어, 약 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900, 또는 1900-2000 mg)의 리툭시맙을 제공한다. 일부 실시양태에서, 리툭시맙은 150 mg/m2 내지 750 mg/m2, 예를 들어 약 150-175 mg/m2, 175-200 mg/m2, 200-225 mg/m2, 225-250 mg/m2, 250-300 mg/m2, 300-325 mg/m2, 325-350 mg/m2, 350-375 mg/m2, 375-400 mg/m2, 400-425 mg/m2, 425-450 mg/m2, 450-475 mg/m2, 475-500 mg/m2, 500-525 mg/m2, 525-550 mg/m2, 550-575 mg/m2, 575-600 mg/m2, 600-625 mg/m2, 625-650 mg/m2, 650-675 mg/m2, 또는 675-700 mg/m2의 용량으로 투여되며, 여기서 m2는 대상체의 체표면적을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 리툭시맙은 적어도 4일, 예를 들어 4, 7, 14, 21, 28, 35일, 또는 그 초과의 투여 간격으로 투여된다. 예를 들어, 리툭시맙은 적어도 0.5주, 예를 들어 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 초과의 투여 간격으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 리툭시맙은, 예를 들어 적어도 2주, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20주 또는 그 초과의 일정 기간 동안 본원에 기재된 용량 및 투여 간격으로 투여된다. 예를 들어, 리툭시맙은 치료 사이클당 총 적어도 4용량 (예를 들어, 치료 사이클당 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 그 초과의 용량) 동안 본원에 기재된 용량 및 투여 간격으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 항-CD20 항체는 오파투무맙을 포함한다. 오파투무맙은 대략 149 kDa의 분자량을 갖는 항-CD20 IgG1κ 인간 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 오파투무맙은 트랜스제닉 마우스 및 하이브리도마 기술을 사용하여 생성되고, 재조합 뮤린 세포주 (NS0)로부터 발현 및 정제된다. 예를 들어, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf; 및 임상 시험 식별자 번호 NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352, 및 NCT01397591을 참조한다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 오파투무맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 CLL 또는 SLL을 갖는다.
일부 실시양태에서, 오파투무맙은 정맥내 주입으로 투여된다. 예를 들어, 각각의 주입은 약 150-3000 mg (예를 들어, 약 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1200, 1200-1400, 1400-1600, 1600-1800, 1800-2000, 2000-2200, 2200-2400, 2400-2600, 2600-2800, 또는 2800-3000 mg)의 오파투무맙을 제공한다. 실시양태에서, 오파투무맙은, 예를 들어 약 11 용량 동안, 예를 들어 24주 동안 약 300 mg의 출발 투여량에 이어서 2000 mg으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 오파투무맙은 적어도 4일, 예를 들어 4, 7, 14, 21, 28, 35일 또는 그 초과의 투여 간격으로 투여된다. 예를 들어, 오파투무맙은 적어도 1주, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 26, 28, 20, 22, 24, 26, 28, 30주 또는 그 초과의 투여 간격으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 오파투무맙은 일정 기간, 예를 들어 적어도 1주, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60주 또는 그 초과, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 또는 그 초과, 또는 1, 2, 3, 4, 5년 또는 그 초과 동안 본원에 기재된 용량 및 투여 간격으로 투여된다. 예를 들어, 오파투무맙은 치료 사이클당 총 적어도 2 용량 (예를 들어, 치료 사이클당 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20 또는 그 초과의 용량) 동안 본원에 기재된 용량 및 투여 간격으로 투여된다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 오크렐리주맙을 포함한다. 오크렐리주맙은, 예를 들어 임상 시험 식별자 번호 NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570, 및 문헌 [Kappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87]에 기재된 바와 같은 인간화 항-CD20 모노클로날 항체이다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 벨투주맙을 포함한다. 벨투주맙은 CD20에 대한 인간화 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 임상 시험 식별자 번호 NCT00547066, NCT00546793, NCT01101581, 및 문헌 [Goldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55]을 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 GA101을 포함한다. GA101 (오비누투주맙 또는 RO5072759로도 불림)은 인간화 및 글리코-조작된 항-CD20 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 문헌 [Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96]; 임상 시험 식별자 번호: NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422, 및 NCT01414205; 및 www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf를 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 AME-133v를 포함한다. AME-133v (LY2469298 또는 오카라투주맙으로도 불림)는 리툭시맙과 비교하여 FcγRIIIa 수용체에 대해 증가된 친화도 및 증진된 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는 CD20에 대한 인간화 IgG1 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 문헌 [Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; 및 Forero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403]을 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 PRO131921을 포함한다. PRO131921은 리툭시맙과 비교하여 FcγRIIIa에 대한 보다 나은 결합 및 증진된 ADCC를 갖도록 조작된 인간화 항-CD20 모노클로날 항체이다. 예를 들어, 문헌 [Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; 및 Casulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46]; 및 임상 시험 식별자 번호 NCT00452127을 참조한다.
일부 경우에, 항-CD20 항체는 TRU-015를 포함한다. TRU-015는 CD20에 대한 항체의 도메인으로부터 유래된 항-CD20 융합 단백질이다. TRU-015는 모노클로날 항체보다 작지만, Fc-매개 이펙터 기능을 보유한다. 예를 들어, 문헌 [Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25]을 참조한다. TRU-015는 인간 IgG1 힌지, CH2, 및 CH3 도메인에 연결된 항-CD20 단일-쇄 가변 단편 (scFv)을 함유하지만, CH1 및 CL 도메인은 결여되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CD20 항체는 치료제, 예를 들어 본원에 기재된 화학요법제 (예를 들어, 시톡산, 플루다라빈, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 탈메틸화제, 펩티드 백신, 항종양 항생제, 티로신 키나제 억제제, 알킬화제, 항미세관제 또는 항유사분열제), 항알레르기제, 항오심제 (또는 항구토제), 통증 완화제 또는 세포보호제에 접합되거나 달리 결합된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 B-세포 림프종 2 (BCL-2) 억제제 (예를 들어, 베네토클락스, ABT-199 또는 GDC-0199로도 불림) 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 베네토클락스 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 베네토클락스는 항아폽토시스 단백질, BCL-2를 억제하는 소분자이다. 베네토클락스 (4-(4-{[2-(4-클로로페닐)-4,4-디메틸시클로헥스-1-엔-1-일]메틸}피페라진-1-일)-N-({3-니트로-4-[(테트라히드로-2H-피란-4-일메틸)아미노]페닐}술포닐)-2-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-일옥시)벤즈아미드)의 구조가 하기 제시된다.
Figure pct00117
실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 재발성 CLL을 갖고, 예를 들어 대상체는 이전에 암 요법을 투여받은 바 있다. 실시양태에서, 베네토클락스는 약 15-600 mg (예를 들어, 15-20, 20-50, 50-75, 75-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 또는 500-600 mg)의 투여량으로, 예를 들어 매일 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 350-550 mg/m2 (예를 들어, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, 또는 475-500 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로, 예를 들어 매월 투여된다.
이론에 얽매이지는 않지만, 일부 암에서, B 세포 (예를 들어, B 조절 세포)는 T 세포를 억제할 수 있는 것으로 여겨진다. 추가로, 옥살리플라틴 및 B 세포 고갈제의 조합은 대상체에서 종양 크기를 감소시키고/거나 종양을 제거할 수 있는 것으로 여겨진다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CAR)는 B 세포 고갈제 (예를 들어, CD19 CAR-발현 세포, CD20 CAR-발현 세포, 리툭시맙, 오크렐리주맙, 에프라투주맙, 또는 벨리무맙) 및 옥살리플라틴과 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 암 세포는 CD19 음성 또는 CD19 양성; 또는 BCMA 음성 또는 BCMA 양성일 수 있다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CAR)는 암, 예를 들어 본원에 기재된 암, 예를 들어 고형 암, 예를 들어 전립선암, 췌장암 또는 폐암을 치료하기 위해 B 세포 고갈제 및 옥살리플라틴과 조합되어 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CAR)는 대상체에서 B 세포 (예를 들어, 예를 들어 BCMA, CD19, 및/또는 CD20을 발현하는 형질 세포-유사 표현형을 갖는 B 세포)를 고갈시킬 수 있다. 실시양태에서, B 세포는 CD19 음성 또는 CD19 양성; 또는 BCMA 음성 또는 BCMA 양성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CAR)는 옥살리플라틴과 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 암, 예를 들어 고형 암, 예를 들어 전립선암, 췌장암 또는 폐암을 치료하기 위해 사용되는 옥살리플라틴과 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 종양용해 바이러스와 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 암 세포 내에서 선택적으로 복제될 수 있고, 그의 사멸을 촉발하거나 성장을 늦출 수 있다. 일부 경우에, 종양용해 바이러스는 비-암 세포에 대해서는 전혀 효과를 갖지 않거나 최소 효과를 갖는다. 종양용해 바이러스는 종양용해 아데노바이러스, 종양용해 단순 포진 바이러스, 종양용해 레트로바이러스, 종양용해 파르보바이러스, 종양용해 백시니아 바이러스, 종양용해 신드비스 바이러스, 종양용해 인플루엔자 바이러스 또는 종양용해 RNA 바이러스 (예를 들어, 종양용해 레오바이러스, 종양용해 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 종양용해 홍역 바이러스 또는 종양용해 수포성 구내염 바이러스 (VSV))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 US2010/0178684 A1에 기재된 바이러스, 예를 들어 재조합 종양용해 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 재조합 종양용해 바이러스는, 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 US2010/0178684 A1에 기재된 바와 같은, 면역 또는 염증 반응의 억제제를 코딩하는 핵산 서열 (예를 들어, 이종 핵산 서열)을 포함한다. 실시양태에서, 재조합 종양용해 바이러스, 예를 들어 종양용해 NDV는 아폽토시스촉진 단백질 (예를 들어, 아폽틴), 시토카인 (예를 들어, GM-CSF, 인터페론-감마, 인터류킨-2 (IL-2), 종양 괴사 인자-알파), 이뮤노글로불린 (예를 들어, ED-B 피브로넥틴에 대한 항체), 종양 연관 항원, 이중특이적 어댑터 단백질 (예를 들어, NDV HN 단백질 및 T 세포 공동-자극 수용체, 예컨대 CD3 또는 CD28에 대해 지시된 이중특이적 항체 또는 항체 단편; 또는 NDV HN 단백질에 대해 지시된 인간 IL-2와 단일 쇄 항체 사이의 융합 단백질)을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Zamarin et al. Future Microbiol. 7.3(2012):347-67]을 참조하고, 그의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 US 8591881 B2, US 2012/0122185 A1, 또는 US 2014/0271677 A1에 기재된 키메라 종양용해 NDV이고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 종양용해 바이러스는 암 세포에서만 독점적으로 복제하도록 설계된 조건부 복제 아데노바이러스 (CRAd)를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Alemany et al. Nature Biotechnol. 18(2000):723-27]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 종양용해 아데노바이러스는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Alemany et al.]의 페이지 725의 표 1에 기재된 것을 포함한다.
예시적인 종양용해 바이러스는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
군 B 종양용해 아데노바이러스 (ColoAd1) (사이옥수스 테라퓨틱스 리미티드(PsiOxus Therapeutics Ltd.)) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT02053220 참조);
ONCOS-102 (이전에 CGTG-102로 불림), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 포함하는 아데노바이러스임 (온코스 테라퓨틱스(Oncos Therapeutics)) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT01598129 참조);
VCN-01, 인간 PH20 히알루로니다제를 코딩하는 유전자 변형된 종양용해 인간 아데노바이러스 (브이씨엔 바이오사이언시스, 에스.엘.(VCN Biosciences, S.L.)) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT02045602 및 NCT02045589 참조);
조건부 복제 아데노바이러스 ICOVIR-5, 탈조절된 망막모세포종/E2F 경로를 갖는 암 세포에서 선택적으로 복제하도록 변형된 야생형 인간 아데노바이러스 혈청형 5 (Had5)로부터 유래된 바이러스임 (인스티튜트 카탈라 드옹콜로지아(Institut Catala d'Oncologia)) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT01864759 참조);
셀리비르(Celyvir), ICOVIR5, 종양용해 아데노바이러스로 감염된 골수-유래 자가 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 포함함 (호스피탈 인판틸 유니베르시타리오 니노 예수스(Hospital Infantil Universitario Nino Jesus), 스페인 마드리드/ 라몬 알레마니(Ramon Alemany) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT01844661 참조);
CG0070, 인간 E2F-1 프로모터가 본질적 E1a 바이러스 유전자의 발현을 구동하여 바이러스 복제 및 세포독성을 Rb 경로-결손 종양 세포로 제한한 조건부 복제 종양용해 혈청형 5 아데노바이러스 (Ad5)임 (콜드 제네시스, 인크.(Cold Genesys, Inc.)) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT02143804 참조); 또는
DNX-2401 (이전에 델타-24-RGD로 명명됨), 망막모세포종 (Rb)-경로 결손 세포에서 선택적으로 복제되고 특정 RGD-결합 인테그린을 보다 효율적으로 발현하는 세포를 감염시키도록 조작된 아데노바이러스임 (클리니카 유니베르시다드 드 나바라(Clinica Universidad de Navarra), 나바라 대학교/ 디엔에이트릭스, 인크.(DNAtrix, Inc.)) (예를 들어, 임상 시험 식별자: NCT01956734 참조).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 종양용해 바이러스는 주사, 예를 들어 피하, 동맥내, 정맥내, 근육내, 척수강내, 또는 복강내 주사에 의해 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 종양용해 바이러스는 종양내로, 경피로, 경점막으로, 경구로, 비강내로, 또는 폐 투여를 통해 투여된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR을 발현하는 세포는 Treg 세포 집단을 감소시키는 분자와 조합되어 대상체에게 투여된다. Treg 세포의 수를 감소시키는 (예를 들어, 고갈시키는) 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 CD25 고갈, 시클로포스파미드 투여, GITR 기능 조정을 포함한다. 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 분리반출술 전 또는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여 전에 대상체에서 Treg 세포의 수를 감소시키는 것은 종양 미세환경에서 원치않는 면역 세포 (예를 들어, Treg)의 수를 감소시키고 대상체의 재발 위험을 감소시키는 것으로 여겨진다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 GITR 표적화하고/거나 GITR 기능을 조정하는 분자, 예컨대 조절 T 세포 (Treg)를 고갈시키는 GITR 효능제 및/또는 GITR 항체와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR을 발현하는 세포는 시클로포스파미드와 조합되어 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, GITR 결합 분자 및/또는 GITR 기능을 조절하는 분자 (예를 들어, GITR 효능제 및/또는 Treg 고갈 GITR 항체)는 CAR-발현 세포의 투여 전에 투여된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, GITR 효능제는 세포의 분리반출술 전에 투여될 수 있다. 실시양태에서, 시클로포스파미드는 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입 또는 재-주입) 전 또는 세포의 분리반출술 전에 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 시클로포스파미드 및 항-GITR 항체는 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입 또는 재-주입) 전 또는 세포의 분리반출술 전에 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, 대상체는 암 (예를 들어, 고형 암 또는 혈액암, 예컨대 다발성 골수종, ALL 또는 CLL)을 갖는다. 한 실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 다발성 골수종을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 고형 암, 예를 들어 본원에 기재된 고형 암을 갖는다. 예시적인 GITR 효능제는, 예를 들어 GITR 융합 단백질 및 항-GITR 항체 (예를 들어, 2가 항-GITR 항체), 예컨대 예를 들어, 미국 특허 번호 6,111,090, 유럽 특허 번호 090505B1, 미국 특허 번호 8,586,023, PCT 공개 번호 WO 2010/003118 및 2011/090754에 기재된 GITR 융합 단백질, 또는 예를 들어 미국 특허 번호 7,025,962, 유럽 특허 번호 1947183B1, 미국 특허 번호 7,812,135, 미국 특허 번호 8,388,967, 미국 특허 번호 8,591,886, 유럽 특허 번호 EP 1866339, PCT 공개 번호 WO 2011/028683, PCT 공개 번호 WO 2013/039954, PCT 공개 번호 WO2005/007190, PCT 공개 번호 WO 2007/133822, PCT 공개 번호 WO2005/055808, PCT 공개 번호 WO 99/40196, PCT 공개 번호 WO 2001/03720, PCT 공개 번호 WO99/20758, PCT 공개 번호 WO2006/083289, PCT 공개 번호 WO 2005/115451, 미국 특허 번호 7,618,632, 및 PCT 공개 번호 WO 2011/051726에 기재된 항-GITR 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 mTOR 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTOR 억제제, 예를 들어 라파로그, 예컨대 에베롤리무스와 조합되어 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제는 CAR-발현 세포 전에 투여된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, mTOR 억제제는 세포의 분리반출술 전에 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 GITR 효능제, 예를 들어 본원에 기재된 GITR 효능제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, GITR 효능제는 CAR-발현 세포 전에 투여된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, GITR 효능제는 세포의 분리반출술 전에 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 단백질 티로신 포스파타제 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 단백질 티로신 포스파타제 억제제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, 단백질 티로신 포스파타제 억제제는 SHP-1 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 SHP-1 억제제, 예컨대 예를 들어 소듐 스티보글루코네이트이다. 한 실시양태에서, 단백질 티로신 포스파타제 억제제는 SHP-2 억제제이다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 키나제 억제제와 조합되어 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 CDK4 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 CDK4 억제제, 예를 들어 CDK4/6 억제제, 예컨대 예를 들어, 6-아세틸-8-시클로펜틸-5-메틸-2-(5-피페라진-1-일-피리딘-2-일아미노)-8H-피리도[2,3-d]피리미딘-7-온, 히드로클로라이드 (팔보시클립 또는 PD0332991로도 지칭됨)이다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 BTK 억제제, 예컨대 예를 들어, 이브루티닙이다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTOR 억제제, 예컨대 예를 들어, 라파마이신, 라파마이신 유사체, OSI-027이다. mTOR 억제제는, 예를 들어 mTORC1 억제제 및/또는 mTORC2 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 mTORC1 억제제 및/또는 mTORC2 억제제일 수 있다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 MNK 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 MNK 억제제, 예컨대 예를 들어, 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘이다. MNK 억제제는, 예를 들어 MNK1a, MNK1b, MNK2a 및/또는 MNK2b 억제제일 수 있다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 본원에 기재된 이중 PI3K/mTOR 억제제, 예컨대 예를 들어 PF-04695102이다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 DGK 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 DGK 억제제, 예컨대 예를 들어, DGKinh1 (D5919) 또는 DGKinh2 (D5794)이다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 알로이신 A; 플라보피리돌 또는 HMR-1275, 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-[(3S,4R)-3-히드록시-1-메틸-4-피페리디닐]-4-크로메논; 크리조티닙 (PF-02341066); 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-[(2R,3S)-2-(히드록시메틸)-1-메틸-3-피롤리디닐]-4H-1-벤조피란-4-온, 히드로클로라이드 (P276-00); 1-메틸-5-[[2-[5-(트리플루오로메틸)-1H-이미다졸-2-일]-4-피리디닐]옥시]-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-1H-벤즈이미다졸-2-아민 (RAF265); 인디술람 (E7070); 로스코비틴 (CYC202); 팔보시클립 (PD0332991); 디나시클립 (SCH727965); N-[5-[[(5-tert-부틸옥사졸-2-일)메틸]티오]티아졸-2-일]피페리딘-4-카르복스아미드 (BMS 387032); 4-[[9-클로로-7-(2,6-디플루오로페닐)-5H-피리미도[5,4-d][2]벤즈아제핀-2-일]아미노]-벤조산 (MLN8054); 5-[3-(4,6-디플루오로-1H-벤즈이미다졸-2-일)-1H-인다졸-5-일]-N-에틸-4-메틸-3-피리딘메탄아민 (AG-024322); 4-(2,6-디클로로벤조일아미노)-1H-피라졸-3-카르복실산 N-(피페리딘-4-일)아미드 (AT7519); 4-[2-메틸-1-(1-메틸에틸)-1H-이미다졸-5-일]-N-[4-(메틸술포닐)페닐]-2-피리미딘아민 (AZD5438); 및 XL281 (BMS908662)로부터 선택된 CDK4 억제제이다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 CDK4 억제제, 예를 들어 팔보시클립 (PD0332991)이고, 팔보시클립은 일정 기간 동안 매일, 예를 들어 28일 사이클의 14-21일 동안 매일 또는 21일 사이클의 7-12일 동안 매일 약 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (예를 들어, 75 mg, 100 mg 또는 125 mg)의 용량으로 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 또는 그 초과의 사이클의 팔보시클립이 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 시클린-의존성 키나제 (CDK) 4 또는 6 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 CDK4 억제제 또는 CDK6 억제제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CDK4/6 억제제 (예를 들어, CDK4 및 CDK6 둘 다를 표적화하는 억제제), 예를 들어 본원에 기재된 CDK4/6 억제제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, 대상체는 MCL을 갖는다. MCL은 현행 이용가능한 요법에 대해 불량한 반응성의, 즉 본질적으로 치유불가능한 공격성 암이다. MCL의 많은 경우에, 시클린 D1 (CDK4/6의 조절제)이 MCL 세포에서 발현된다 (예를 들어, 이뮤노글로불린 및 시클린 D1 유전자를 수반하는 염색체 전위로 인함). 따라서, 이론에 얽매이지는 않지만, MCL 세포는 CDK4/6 억제에 대해 높은 특이성으로 고도로 감수성인 것으로 생각된다 (즉, 정상 면역 세포에 대해서는 최소 효과). CDK4/6 억제제 단독은 MCL을 치료하는데 있어서 일부 효능을 갖지만, 높은 재발률을 갖는 부분적 완화만이 달성된다. 예시적인 CDK4/6 억제제는 LEE011 (리보시클립으로도 불림)로, 그의 구조가 하기 제시된다.
Figure pct00118
이론에 얽매이지는 않지만, CDK4/6 억제제 (예를 들어, LEE011 또는 본원에 기재된 다른 CDK4/6 억제제)와 함께 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여는, 예를 들어 CDK4/6 억제제 단독과 비교하여, 예를 들어 더 높은 완화율 및/또는 더 낮은 재발률을 갖는 더 높은 반응성을 달성할 수 있는 것으로 여겨진다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 이브루티닙 (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된 BTK 억제제이다. 바람직한 실시양태에서, BTK 억제제는 인터류킨-2-유도성 키나제 (ITK)의 키나제 활성을 감소시키거나 억제하지 않고, GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; 및 LFM-A13으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 BTK 억제제, 예를 들어 이브루티닙 (PCI-32765)이다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 BTK 억제제 (예를 들어, 이브루티닙)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 이브루티닙 (PCI-32765로도 불림)과 조합되어 대상체에게 투여된다. 이브루티닙 (1-[(3R)-3-[4-아미노-3-(4-페녹시페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-1-일]피페리딘-1-일]프로프-2-엔-1-온)의 구조가 하기 제시된다.
Figure pct00119
실시양태에서, 대상체는 CLL, 외투 세포 림프종 (MCL), 또는 소림프구성 림프종 (SLL)을 갖는다. 예를 들어, 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실 (del(17p), 예를 들어 백혈병성 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 재발성 CLL 또는 SLL을 갖고, 예를 들어 대상체는 이전에 암 요법을 투여받은 바 있다 (예를 들어, 이전에 1, 2, 3, 또는 4종의 선행 암 요법을 투여받은 바 있음). 실시양태에서, 대상체는 불응성 CLL 또는 SLL을 갖는다. 다른 실시양태에서, 대상체는 여포성 림프종, 예를 들어 재발 또는 불응성 여포성 림프종을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이브루티닙은 약 300-600 mg/일 (예를 들어, 약 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 또는 550-600 mg/일, 예를 들어, 약 420 mg/일 또는 약 560 mg/일)의 투여량으로, 예를 들어 경구로 투여된다. 실시양태에서, 이브루티닙은 약 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (예를 들어, 250 mg, 420 mg 또는 560 mg)의 용량으로 소정 기간 동안 매일, 예를 들어 21일 사이클 동안 매일, 또는 28일 사이클 동안 매일 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12사이클 또는 그 초과의 사이클의 이브루티닙이 투여된다. 일부 실시양태에서, 이브루티닙은 리툭시맙과 조합되어 투여된다. 예를 들어, 문헌 [Burger et al. (2013) Ibrutinib In Combination With Rituximab (iR) Is Well Tolerated and Induces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL): New, Updated Results Of a Phase II Trial In 40 Patients, Abstract 675 presented at 55th ASH Annual Meeting and Exposition, New Orleans, LA 7-10 Dec]을 참조한다. 이론에 얽매이지는 않지만, 이브루티닙의 첨가는 T 세포 증식 반응을 증진시키고, T 세포를 T-헬퍼-2 (Th2)에서 T-헬퍼-1 (Th1) 표현형으로 이동시킬 수 있는 것으로 생각된다. Th1 및 Th2는 헬퍼 T 세포의 표현형으로, Th1 대 Th2는 상이한 면역 반응 경로를 지시한다. Th1 표현형은 예를 들어 세포, 예컨대 세포내 병원체/바이러스 또는 암성 세포를 사멸시키거나 자가면역 반응을 영속시키는 염증유발 반응과 연관된다. Th2 표현형은 호산구 축적 및 항-염증 반응과 연관된다.
본원의 방법, 용도 및 조성물의 일부 실시양태에서, BTK 억제제는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 출원 WO/2015/079417에 기재된 BTK 억제제이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, BTK 억제제는 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 I>
Figure pct00120
여기서,
R1은 수소, 또는 히드록시에 의해 임의로 치환된 C1-C6 알킬이고;
R2는 수소 또는 할로겐이고;
R3은 수소 또는 할로겐이고;
R4는 수소이고;
R5는 수소 또는 할로겐이거나;
또는 R4 및 R5는 서로 부착되고, 결합, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH=CH-, -CH=CH-CH2-; -CH2-CH=CH-; 또는 -CH2-CH2-CH2-를 나타내고;
R6 및 R7은 서로 독립적으로 H, 히드록실에 의해 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 할로겐 또는 히드록시에 의해 임의로 치환된 C3-C6 시클로알킬, 또는 할로겐을 나타내고;
R8, R9, R, R', R10 및 R11은 서로 독립적으로 H, 또는 C1-C6 알콕시에 의해 임의로 치환된 C1-C6 알킬을 나타내거나; 또는 R8, R9, R, R', R10 및 R11 중 임의의 2개는 이들이 결합되어 있는 탄소 원자와 함께 3 - 6원 포화 카르보시클릭 고리를 형성할 수 있고;
R12는 수소, 또는 할로겐 또는 C1-C6 알콕시에 의해 임의로 치환된 C1-C6 알킬이거나;
또는 R12 및 R8, R9, R, R', R10 또는 R11 중 어느 하나는 이들이 결합되어 있는 원자와 함께, 할로겐, 시아노, 히드록실, C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알콕시에 의해 임의로 치환될 수 있는 4, 5, 6 또는 7원 아자시클릭 고리를 형성할 수 있고;
n은 0 또는 1이고;
R13은 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시 또는 N,N-디-C1-C6 알킬 아미노에 의해 임의로 치환된 C2-C6 알케닐; C1-C6 알킬 또는 C1-C6 알콕시에 의해 임의로 치환된 C2-C6 알키닐; 또는 C1-C6 알킬에 의해 임의로 치환된 C2-C6 알킬레닐 옥시드이다.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 BTK 억제제는 하기로부터 선택된다: N-(3-(5-((1-아크릴로일아제티딘-3-일)옥시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (E)-N-(3-(6-아미노-5-((1-(부트-2-에노일)아제티딘-3-일)옥시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-((1-프로피올로일아제티딘-3-일)옥시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-((1-(부트-2-이노일)아제티딘-3-일)옥시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(5-((1-아크릴로일피페리딘-4-일)옥시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-메틸아크릴아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (E)-N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-메틸부트-2-엔아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-메틸프로피올아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (E)-N-(3-(6-아미노-5-(2-(4-메톡시-N-메틸부트-2-엔아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-메틸부트-2-인아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(2-((4-아미노-6-(3-(4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미도)-5-플루오로-2-메틸페닐)피리미딘-5-일)옥시)에틸)-N-메틸옥시란-2-카르복스아미드; N-(2-((4-아미노-6-(3-(6-시클로프로필-8-플루오로-1-옥소이소퀴놀린-2(1H)-일)페닐)피리미딘-5-일)옥시)에틸)-N-메틸아크릴아미드; N-(3-(5-(2-아크릴아미도에톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-에틸아크릴아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-(2-플루오로에틸)아크릴아미도)에톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(5-((1-아크릴아미도시클로프로필)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(5-(2-아크릴아미도프로폭시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(6-아미노-5-(2-(부트-2-인아미도)프로폭시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-메틸아크릴아미도)프로폭시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(6-아미노-5-(2-(N-메틸부트-2-인아미도)프로폭시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(3-(N-메틸아크릴아미도)프로폭시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(5-((1-아크릴로일피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(6-아미노-5-((1-(부트-2-이노일)피롤리딘-2-일)메톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-2-(3-(5-((1-아크릴로일피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-(히드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-3,4-디히드로이소퀴놀린-1(2H)-온; N-(2-((4-아미노-6-(3-(6-시클로프로필-1-옥소-3,4-디히드로이소퀴놀린-2(1H)-일)-5-플루오로-2-(히드록시메틸)페닐)피리미딘-5-일)옥시)에틸)-N-메틸아크릴아미드; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-아크릴로일-4-메톡시피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(((2S,4R)-1-(부트-2-이노일)-4-메톡시피롤리딘-2-일)메톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; 2-(3-(5-(((2S,4R)-1-아크릴로일-4-메톡시피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-(히드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-3,4-디히드로이소퀴놀린-1(2H)-온; N-(3-(5-(((2S,4S)-1-아크릴로일-4-메톡시피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(((2S,4S)-1-(부트-2-이노일)-4-메톡시피롤리딘-2-일)메톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-아크릴로일-4-플루오로피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(6-아미노-5-(((2S,4R)-1-(부트-2-이노일)-4-플루오로피롤리딘-2-일)메톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(5-((1-아크릴로일아제티딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-N-(3-(6-아미노-5-((1-프로피올로일아제티딘-2-일)메톡시)피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (S)-2-(3-(5-((1-아크릴로일아제티딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-(히드록시메틸)페닐)-6-시클로프로필-3,4-디히드로이소퀴놀린-1(2H)-온; (R)-N-(3-(5-((1-아크릴로일아제티딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; (R)-N-(3-(5-((1-아크릴로일피페리딘-3-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(5-(((2R,3S)-1-아크릴로일-3-메톡시피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; N-(3-(5-(((2S,4R)-1-아크릴로일-4-시아노피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드; 또는 N-(3-(5-(((2S,4S)-1-아크릴로일-4-시아노피롤리딘-2-일)메톡시)-6-아미노피리미딘-4-일)-5-플루오로-2-메틸페닐)-4-시클로프로필-2-플루오로벤즈아미드.
달리 제공되지 않는 한, 화학식 I의 BTK 억제제를 기재하는데 상기 사용된 화학 용어는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 출원 WO/2015/079417에 제시된 바와 같은 그의 의미에 따라 사용된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 하기로부터 선택된 mTOR 억제제이다: 템시롤리무스; 리다포롤리무스 (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시시클로헥실 디메틸포스피네이트, AP23573 및 MK8669로도 공지됨; 에베롤리무스 (RAD001); 라파마이신 (AY22989); 세마피모드; (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올 (AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF04691502); 및 N2-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파르틸L-세린- (서열식별번호: 383), 내부 염 (SF1126); 및 XL765.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 라파마이신이고, 라파마이신은 약 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (예를 들어, 6 mg)의 용량으로 소정 기간 동안 매일, 예를 들어 21일 사이클 동안 매일, 또는 28일 사이클 동안 매일 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12사이클 또는 그 초과의 사이클의 라파마이신이 투여된다. 한 실시양태에서, 키나제 억제제는 mTOR 억제제, 예를 들어 에베롤리무스이고, 에베롤리무스는 약 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (예를 들어, 10 mg)의 용량으로 소정 기간 동안 매일, 예를 들어 28일 사이클 동안 매일 투여된다. 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12사이클 또는 그 초과의 사이클의 에베롤리무스가 투여된다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 CGP052088; 4-아미노-3-(p-플루오로페닐아미노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘 (CGP57380); 세르코스포라미드; ETC-1780445-2; 및 4-아미노-5-(4-플루오로아닐리노)-피라졸로[3,4-d] 피리미딘으로부터 선택된 MNK 억제제이다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제 (예를 들어, 본원에 기재된 PI3K 억제제, 예를 들어 이델라리십 또는 두벨리십) 및/또는 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 이델라리십 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 두벨리십 및 리툭시맙과 조합되어 대상체에게 투여된다. 이델라리십 (GS-1101 또는 CAL-101로도 불림; 길리아드(Gilead))은 PI3K의 델타 이소형을 차단하는 소분자이다. 이델라리십 (5-플루오로-3-페닐-2-[(1S)-1-(7H-퓨린-6-일아미노)프로필]-4(3H)-퀴나졸리논)의 구조가 하기 제시된다.
Figure pct00121
두벨리십 (IPI-145로도 불림; 인피니티 파마슈티칼스(Infinity Pharmaceuticals) 및 아브비(Abbvie))은 PI3K-δ,γ를 차단하는 소분자이다. 두벨리십 (8-클로로-2-페닐-3-[(1S)-1-(9H-퓨린-6-일아미노)에틸]-1(2H)-이소퀴놀리논)의 구조가 하기 제시된다.
Figure pct00122
실시양태에서, 대상체는 CLL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 재발성 CLL을 갖고, 예를 들어 대상체는 이전에 암 요법을 투여받은 바 있다 (예를 들어, 이전에 항-CD20 항체를 투여받은 바 있거나, 또는 이전에 이브루티닙을 투여받은 바 있음). 예를 들어, 대상체는 짧은 아암의 염색체 17에서 결실 (del(17p), 예를 들어 백혈병성 세포에서)을 갖는다. 다른 예에서, 대상체는 del(17p)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 대상체는 이뮤노글로불린 중쇄 가변-영역 (IgVH) 유전자에서 돌연변이를 포함하는 백혈병성 세포를 포함하지 않는다. 실시양태에서, 대상체는 긴 아암의 염색체 11에서 결실 (del(11q))을 갖는다. 다른 실시양태에서, 대상체는 del(11q)을 갖지 않는다. 실시양태에서, 이델라리십은 약 100-400 mg (예를 들어, 100-125, 125-150, 150-175, 175-200, 200-225, 225-250, 250-275, 275-300, 325-350, 350-375, 또는 375-400 mg)의 투여량으로, 예를 들어 BID 투여된다. 실시양태에서, 두벨리십은 약 15-100 mg (예를 들어, 약 15-25, 25-50, 50-75, 또는 75-100 mg)의 투여량으로, 예를 들어 1일 2회 투여된다. 실시양태에서, 리툭시맙은 약 350-550 mg/m2 (예를 들어, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, 또는 475-500 mg/m2)의 투여량으로, 예를 들어 정맥내로 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 역형성 림프종 키나제 (ALK) 억제제와 조합되어 대상체에게 투여된다. 예시적인 ALK 키나제는 크리조티닙 (화이자(Pfizer)), 세리티닙 (노파르티스(Novartis)), 알렉티닙 (츄가이(Chugai)), 브리가티닙 (AP26113으로도 불림; 아리아드(Ariad)), 엔트렉티닙 (이그니타(Ignyta)), PF-06463922 (화이자), TSR-011 (테사로(Tesaro)) (예를 들어, 임상 시험 식별자 번호 NCT02048488 참조), CEP-37440 (테바(Teva)), 및 X-396 (엑스커버리(Xcovery))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 고형 암, 예를 들어 본원에 기재된 고형 암, 예를 들어 폐암을 갖는다.
크리조티닙의 화학 명칭은 3-[(1R)-1-(2,6-디클로로-3-플루오로페닐)에톡시]-5-(1-피페리딘-4-일피라졸-4-일)피리딘-2-아민이다. 세리티닙의 화학 명칭은 5-클로로-N2-[2-이소프로폭시-5-메틸-4-(4-피페리디닐)페닐]-N4-[2-(이소프로필술포닐)페닐]-2,4-피리미딘디아민이다. 알렉티닙의 화학 명칭은 9-에틸-6,6-디메틸-8-(4-모르폴리노피페리딘-1-일)-11-옥소-6,11-디히드로-5H-벤조[b]카르바졸-3-카르보니트릴이다. 브리가티닙의 화학 명칭은 5-클로로-N2-{4-[4-(디메틸아미노)-1-피페리디닐]-2-메톡시페닐}-N4-[2-(디메틸포스포릴)페닐]-2,4-피리미딘디아민이다. 엔트렉티닙의 화학 명칭은 N-(5-(3,5-디플루오로벤질)-1H-인다졸-3-일)-4-(4-메틸피페라진-1-일)-2-((테트라히드로-2H-피란-4-일)아미노)벤즈아미드이다. PF-06463922의 화학 명칭은 (10R)-7-아미노-12-플루오로-2,10,16-트리메틸-15-옥소-10,15,16,17-테트라히드로-2H-8,4-(메테노)피라졸로[4,3-h][2,5,11]-벤족사디아자시클로테트라데신-3-카르보니트릴이다. CEP-37440의 화학 구조는 (S)-2-((5-클로로-2-((6-(4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일)-1-메톡시-6,7,8,9-테트라히드로-5H-벤조[7]아눌렌-2-일)아미노)피리미딘-4-일)아미노)-N-메틸벤즈아미드이다. X-396의 화학 명칭은 (R)-6-아미노-5-(1-(2,6-디클로로-3-플루오로페닐)에톡시)-N-(4-(4-메틸피페라진-1-카르보닐)페닐)피리다진-3-카르복스아미드이다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF-04691502); N-[4-[[4-(디메틸아미노)-1-피페리디닐]카르보닐]페닐]-N'-[4-(4,6-디-4-모르폴리닐-1,3,5-트리아진-2-일)페닐]우레아 (PF-05212384, PKI-587); 2-메틸-2-{4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디히드로-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐}프로판니트릴 (BEZ-235); 아피톨리십 (GDC-0980, RG7422); 2,4-디플루오로-N-{2-(메틸옥시)-5-[4-(4-피리다지닐)-6-퀴놀리닐]-3-피리디닐}벤젠술폰아미드 (GSK2126458); 8-(6-메톡시피리딘-3-일)-3-메틸-1-(4-(피페라진-1-일)-3-(트리플루오로메틸)페닐)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2(3H)-온 말레산 (NVP-BGT226); 3-[4-(4-모르폴리닐피리도[3',2':4,5]푸로[3,2-d]피리미딘-2-일]페놀 (PI-103); 5-(9-이소프로필-8-메틸-2-모르폴리노-9H-퓨린-6-일)피리미딘-2-아민 (VS-5584, SB2343); 및 N-[2-[(3,5-디메톡시페닐)아미노]퀴녹살린-3-일]-4-[(4-메틸-3-메톡시페닐)카르보닐]아미노페닐술폰아미드 (XL765)로부터 선택된 이중 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K) 및 mTOR 억제제이다.
칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린 (시클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장 인자 유도 신호전달에 중요한 p70S6 키나제를 억제하는 약물 (라파마이신) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)이 또한 사용될 수 있다. 추가 측면에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 플루다라빈과 같은 화학요법제를 사용하는 T 세포 절제 요법, 외부-빔 방사선 요법 (XRT), 시클로포스파미드, 및/또는 항체, 예컨대 OKT3 또는 캄파트와 공동으로 (예를 들어, 그 전에, 동시에 또는 그 후에) 환자에게 투여될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 세포 조성물은 B-세포 절제 요법, 예컨대 CD20과 반응하는 작용제, 예를 들어 리툭산(Rituxan) 후에 투여된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 대상체는 고용량 화학요법에 이어 말초 혈액 줄기 세포 이식을 사용하는 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 실시양태에서, 이식 후에, 대상체는 본 발명의 확장된 면역 세포의 주입을 받는다. 추가의 실시양태에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 비포스포네이트, 예를 들어 파미드로네이트 (아레디아(Aredia)?); 졸레드론산 또는 졸레드로네이트 (조메타(Zometa)?, 조메라(Zomera)?, 아클라스타(Aclasta)? 또는 레클라스트(Reclast)?); 알렌드로네이트 (포사맥스(Fosamax)?); 리세드로네이트 (악토넬(Actonel)?); 이반드로네이트 (보니바(Boniva)?); 클론드로네이트 (보네포스(Bonefos)?); 에티드로네이트 (디드로넬(Didronel)?); 틸루드로네이트 (스켈리드(Skelid)?); 파미드로네이트 (아레디아(Aredia)?); 네리드로네이트 (네릭시아(Nerixia)?); 스트론튬 라넬레이트 (프로텔로스(Protelos)? 또는 프로토스(Protos)?); 및 테리파라티드 (포르테오(Forteo)?)와 조합되어 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 코르티코스테로이드, 예를 들어 덱사메타손 (예를 들어, 데카드론(Decadron)?), 베클로메타손 (예를 들어, 베클로벤트(Beclovent)?), 히드로코르티손 (코르티손, 히드로코르티손 소듐 숙시네이트, 히드로코르티손 인산나트륨으로도 공지됨, 상표명 알라-코르트(Ala-Cort)?, 히드로코르티손 포스페이트, 솔루-코르테프(Solu-Cortef)?, 히드로코르트 아세테이트(Hydrocort Acetate)? 및 라나코르트(Lanacort)? 하에 판매됨), 프레드니솔론 (상표명 델타-코르텔(Delta-Cortel)?, 오라프레드(Orapred)?, 페디아프레드(Pediapred)? 및 프렐론(Prelone)? 하에 판매됨), 프레드니손 (상표명 델타손(Deltasone)?, 리퀴드 레드(Liquid Red)?, 메티코르텐(Meticorten)? 및 오라손(Orasone)? 하에 판매됨), 메틸프레드니솔론 (6-메틸프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 메틸프레드니솔론 소듐 숙시네이트로도 공지됨, 상표명 듀랄론(Duralone)?, 메드랄론(Medralone)?, 메드롤(Medrol)?, M-프레드니솔(M-Prednisol)? 및 솔루-메드롤(Solu-Medrol)? 하에 판매됨); 항히스타민제, 예컨대 디펜히드라민 (예를 들어, 베나드릴(Benadryl)?), 히드록시진 및 시프로헵타딘; 및 기관지확장제, 예컨대 베타-아드레날린성 수용체 효능제, 알부테롤 (예를 들어, 프로벤틸(Proventil)?) 및 테르부탈린 (브레틴(Brethine)?)과 조합되어 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 면역조정제, 예를 들어 아푸투주맙 (로슈(Roche)?로부터 이용가능함); 페그필그라스팀 (뉴라스타(Neulasta)?); 레날리도미드 (CC-5013, 레블리미드(Revlimid)?); 탈리도미드 (탈로미드(Thalomid)?), 악티미드 (CC4047); 및 IRX-2 (인터류킨 1, 인터류킨 2, 및 인터페론 γ를 비롯한 인간 시토카인의 혼합물, CAS 951209-71-5, IRX 테라퓨틱스(IRX Therapeutics)로부터 이용가능함)와 조합되어 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 프로테아솜 억제제, 예를 들어 보르테조밉 (벨케이드?); 익사조밉 시트레이트 (MLN9708, CAS 1201902-80-8); 다노프레비르 (RG7227, CAS 850876-88-9); 익사조밉 (MLN2238, CAS 1072833-77-2); 및 (S)-N-[(페닐메톡시)카르보닐]-L-류실-N-(1-포르밀-3-메틸부틸)- L-류신아미드 (MG-132, CAS 133407-82-6)와 조합되어 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체, 예를 들어 베바시주맙 (아바스틴(Avastin)?), 악시티닙 (인리타(Inlyta)?); 브리바닙 알라니네이트 (BMS-582664, (S)-((R)-1-(4-(4-플루오로-2-메틸-1H-인돌-5-일옥시)-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일옥시)프로판-2-일)2-아미노프로파노에이트); 소라페닙 (넥사바르(Nexavar)?); 파조파닙 (보트리엔트(Votrient)?); 수니티닙 말레이트 (수텐트(Sutent)?); 세디라닙 (AZD2171, CAS 288383-20-1); 바르가테프 (BIBF1120, CAS 928326-83-4); 포레티닙 (GSK1363089); 텔라티닙 (BAY57-9352, CAS 332012-40-5); 아파티닙 (YN968D1, CAS 811803-05-1); 이마티닙 (글리벡(Gleevec)?); 포나티닙 (AP24534, CAS 943319-70-8); 티보자닙 (AV951, CAS 475108-18-0); 레고라페닙 (BAY73-4506, CAS 755037-03-7); 바탈라닙 디히드로클로라이드 (PTK787, CAS 212141-51-0); 브리바닙 (BMS-540215, CAS 649735-46-6); 반데타닙 (카프렐사(Caprelsa)? 또는 AZD6474); 모테사닙 디포스페이트 (AMG706, CAS 857876-30-3, PCT 공개 번호 WO 02/066470에 기재된 N-(2,3-디히드로-3,3-디메틸-1H-인돌-6-일)-2-[(4-피리디닐메틸)아미노]-3-피리딘카르복스아미드; 도비티닙 디락트산 (TKI258, CAS 852433-84-2); 린파닙 (ABT869, CAS 796967-16-3); 카보잔티닙 (XL184, CAS 849217-68-1); 레스타우르티닙 (CAS 111358-88-4); N-[5-[[[5-(1,1-디메틸에틸)-2-옥사졸릴]메틸]티오]-2-티아졸릴]-4-피페리딘카르복스아미드 (BMS38703, CAS 345627-80-7); (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올 (BMS690514); N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타히드로-2-메틸시클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민 (XL647, CAS 781613-23-8); 4-메틸-3-[[1-메틸-6-(3-피리디닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일]아미노]-N-[3-(트리플루오로메틸)페닐]-벤즈아미드 (BHG712, CAS 940310-85-0); 및 아플리베르셉트 (아일리아(Eylea)?)와 조합되어 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 CD20 항체 또는 그의 접합체, 예를 들어: 리툭시맙 (리툭산? 및 맙테라(MabThera)?); 및 토시투모맙 (벡사르(Bexxar)?); 및 오파투무맙 (아르제라(Arzerra)?), 이브리투모맙 티욱세탄 (제발린(Zevalin)?); 및 토시투모맙과 조합되어 대상체에게 투여된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 발현 세포는 항경련제, 예를 들어 항경련제 (항간질제 또는 항발작 약물): 알데히드, 예를 들어 파라알데히드; 방향족 알릴 알콜, 예를 들어 스티리펜톨 (디아코미드(Diacomit)?); 바르비투레이트, 예를 들어 페노바르비탈 (루미날(Luminal)?), 메틸페노바르비탈 (메바랄(Mebaral)?), 바르벡사클론 (마리아신(Maliasin)?), 벤조디아제핀, 예를 들어 클로바잠 (온피(Onfi)?), 클로나제팜 (클로노핀(Klonopin)?), 클로라제페이트 (트랑센(Tranxene)? 및 노보-클로파테(Novo-Clopate)?), 디아제팜 (발리움(Valium)?, 렘브롤(Lembrol)?, 디아스타트(Diastat)?), 미다졸람 (베르세드(Versed)?), 로라제팜 (아티반(Ativan)? 및 오르피달(Orfidal)?), 니트라제팜 (알로도름(Alodorm)?, 아렘(Arem)?, 인소마(Insoma)?), 테마제팜 (레스토릴(restoril)?, 노르미손(Normison)?), 미메트제팜 (에리민(Erimin)?), 브로마이드, 예를 들어 브로민화칼륨; 카르바메이트, 예를 들어 펠바메이트 (펠바톨(Felbatol)?); 카르복스아미드, 예를 들어 카르바마제핀 (테그레톨(Tegretol)?, 에퀘트로(Equetro)?), 옥스카르바제핀 (트리렙탈(Trileptal)?, 옥스카르브(Oxcarb)?), 에슬리카르바제핀 아세테이트 (압티옴(Aptiom)?); 지방산, 예를 들어 발프로에이트 (발프로산, 소듐 발프로에이트, 디발프로엑스 나트륨), 비가바트린 (사브릴(Sabril)?), 프로가비드 (가브렌(Gabren)?), 티아가빈 (가비트릴(Gabitril)?); 프룩토스 유도체, 예를 들어 토피라메이트 (토파맥스(Topamax)?); GABA 유사체, 예를 들어 가바펜틴 (뉴론틴(Neurontin)?), 프레가발린 (리리카(Lyrica)?); 히단토인, 예를 들어 에토토인 (페가논(Peganone)?), 페니토인 (딜란틴(Dilantin)?), 메페니토인 (메산토인(Mesantoin)?), 포스페니토인 (세레빅스(Cerebyx)?, 프로딜란틴(Prodilantin)?); 옥사졸리딘디온, 예를 들어 파라메타디온 (파라디온(Paradione)?), 트리메타디온 (트리디온(Tridione)?); 프로피오네이트, 예를 들어 베클라미드 (코라콘(Choracon)?, 히비콘(Hibicon)?, 포세드린(Posedrine)?); 피리미딘디온, 예를 들어 프리미돈 (미솔린(Mysoline)?); 피롤리딘, 예를 들어 브리바라세탐, 레베티라세탐, 셀레트라세탐 (케프라(Keppra)?); 숙신이미드, 예를 들어 에토숙시미드 (자론틴(Zarontin)?), 펜숙시미드 (밀론틴(Milontin)?), 메숙시미드 (셀론틴(Celontin)?, 페티누틴(Petinutin)?); 술폰아미드, 예를 들어 아세타졸아미드 (디아목스(Diamox)?), 술티암 (오스폴로트(Ospolot)?), 메타졸아미드 (넵타잔(Neptazane)?), 조니사미드 (조네그란(Zonegran)?); 트리아진, 예를 들어 라모트리진 (라믹탈(Lamictal)?); 우레아, 예를 들어 페네투리드, 페나세미드 (페누론(Phenurone)?); 발프로일아미드 (발프로에이트의 아미드 유도체), 예를 들어 발프로미드 (데파미드(Depamide)?), 발녹타미드; AMPA 수용체 길항제, 예를 들어 페람파넬 (피콤파(Fycompa)?)와 조합되어 대상체에게 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO) 억제제와 조합되어 대상체에게 투여된다. IDO는 아미노산, L-트립토판의 키누레닌으로의 분해를 촉매하는 효소이다. 많은 암, 예를 들어 전립선, 결장직장, 췌장, 자궁경부, 위, 난소, 두부 및 폐암이 IDO를 과다발현한다. pDC, 대식세포 및 수지상 세포 (DC)는 IDO를 발현할 수 있다. 이론에 얽매이지는 않지만, L-트립토판의 감소 (예를 들어, IDO에 의해 촉매됨)는 T-세포 무반응 및 아폽토시스를 유도함으로써 면역억제 환경을 발생시키는 것으로 생각된다. 따라서, 이론에 얽매이지는 않지만, IDO 억제제는 예를 들어 CAR-발현 면역 세포의 억제 또는 사멸을 감소시킴으로써 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 효능을 증진시킬 수 있는 것으로 생각된다. 실시양태에서, 대상체는 고형 종양, 예를 들어 본원에 기재된 고형 종양, 예를 들어 전립선, 결장직장, 췌장, 자궁경부, 위, 난소, 두부 또는 폐암을 갖는다. IDO의 예시적인 억제제는 1-메틸-트립토판, 인독시모드 (뉴링크 제네틱스(NewLink Genetics)) (예를 들어, 임상 시험 식별자 번호 NCT01191216; NCT01792050 참조), 및 INCB024360 (인사이트 코포레이션(Incyte Corp.)) (예를 들어, 임상 시험 식별자 번호 NCT01604889; NCT01685255 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 골수-유래 억제자 세포 (MDSC)의 조정제와 조합되어 대상체에게 투여된다. MDSC는 많은 고형 종양의 주변 및 종양 부위에 축적된다. 이들 세포는 T 세포 반응을 억제함으로써 CAR-발현 세포 요법의 효능을 방해한다. 이론에 얽매이지는 않지만, MDSC 조정제의 투여는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 효능을 증진시키는 것으로 생각된다. 한 실시양태에서, 대상체는 고형 종양, 예를 들어 본원에 기재된 고형 종양, 예를 들어 교모세포종을 갖는다. MDSC의 예시적인 조정제는 MCS110 및 BLZ945를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. MCS110은 대식세포 콜로니-자극 인자 (M-CSF)에 대한 모노클로날 항체 (mAb)이다. 예를 들어, 임상 시험 식별자 번호 NCT00757757을 참조한다. BLZ945는 콜로니 자극 인자 1 수용체 (CSF1R)의 소분자 억제제이다. 예를 들어 문헌 [Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72]을 참조한다. BLZ945의 구조가 하기 제시된다.
Figure pct00123
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 CD19 CART 세포 (예를 들어 CTL019, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO2012/079000에 기재된 바와 같음)와 조합되어 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 급성 골수성 백혈병 (AML), 예를 들어 CD19 양성 AML 또는 CD19 음성 AML을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 CD19+ 림프종, 예를 들어 CD19+ 비-호지킨 림프종 (NHL), CD19+ FL, 또는 CD19+ DLBCL을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 재발성 또는 불응성 CD19+ 림프종을 갖는다. 실시양태에서, 림프구고갈 화학요법은 CD19 CART 세포의 투여 (예를 들어, 주입) 전, 그와 공동으로, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다. 한 예에서, 림프구고갈 화학요법은 CD19 CART 세포의 투여 전에 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 림프구고갈 화학요법은 CD19 CART 세포 주입 1-4일 (예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4일) 전에 종료된다. 실시양태에서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 다중 용량의 CD19 CART 세포가 투여된다. 예를 들어, 단일 용량은 약 5 x 108개의 CD19 CART 세포를 포함한다. 실시양태에서, 림프구고갈 화학요법은 본원에 기재된 CAR-발현 세포, 예를 들어 비-CD19 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입) 전, 그와 공동으로, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다. 실시양태에서, CD19 CART는 비-CD19 CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 기재된 비-CD19 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입) 전, 그와 공동으로, 또는 그 후에 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 BCMA의 발현과 연관된 질환, 예를 들어 본원에 기재된 암의 치료를 위해 CD19 CAR-발현 세포, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 WO2012/079000에 기재된 바와 같은, 예를 들어 CTL019와 조합되어 대상체에게 투여된다. 이론에 얽매이지는 않지만, CAR-발현 세포와 조합된 CD19 CAR-발현 세포의 투여는 초기 계열 암 세포, 예를 들어 암 줄기 세포의 표적화, 면역 반응의 조정, 조절 B 세포의 고갈, 및/또는 종양 미세환경의 개선에 의해 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 효능을 개선시키는 것으로 여겨진다. 예를 들어, CD19 CAR-발현 세포는 초기 계열 마커를 발현하는 암 세포, 예를 들어 암 줄기 세포 및 CD19-발현 세포를 표적화하고, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 보다 후기 계열 마커, 예를 들어 BCMA를 발현하는 암 세포를 표적화한다. 이러한 사전조건화 접근법은 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 효능을 개선시킬 수 있다. 이러한 실시양태에서, CD19 CAR-발현 세포는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여 (예를 들어, 주입) 전, 그와 공동으로, 또는 그 후에 투여된다.
실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 또한 CD19를 표적화하는 CAR, 예를 들어 CD19 CAR을 발현한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 및 CD19 CAR을 발현하는 세포는 본원에 기재된 암, 예를 들어 AML의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 한 실시양태에서, CAR 분자의 하나 또는 둘 다의 구성은 1차 세포내 신호전달 도메인 및 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CAR 분자의 하나 또는 둘 다의 구성은 1차 세포내 신호전달 도메인 및 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 또는 5개 또는 그 초과의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR 분자 및 CD19 CAR은 동일하거나 상이한 1차 세포내 신호전달 도메인, 동일하거나 상이한 공동자극 신호전달 도메인, 또는 동일한 수 또는 상이한 수의 공동자극 신호전달 도메인을 가질 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 CAR 및 CD19 CAR은 스플릿 CAR로서 구성되고, 여기서 CAR 분자 중 1개는 항원 결합 도메인 및 공동자극 도메인 (예를 들어, 4-1BB)을 포함하고, 다른 CAR 분자는 항원 결합 도메인 및 1차 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, CD3 제타)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 인터류킨-15 (IL-15) 폴리펩티드, 인터류킨-15 수용체 알파 (IL-15Ra) 폴리펩티드, 또는 IL-15 폴리펩티드 및 IL-15Ra 폴리펩티드 둘 다의 조합, 예를 들어 hetIL-15 (애드뮨 테라퓨틱스, 엘엘씨(Admune Therapeutics, LLC))와 조합되어 대상체에게 투여된다. hetIL-15는 IL-15 및 IL-15Ra의 이종이량체 비-공유 복합체이다. hetIL-15는, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 U.S. 8,124,084, U.S. 2012/0177598, U.S. 2009/0082299, U.S. 2012/0141413, 및 U.S. 2011/0081311에 기재되어 있다. 실시양태에서, het-IL-15는 피하로 투여된다. 실시양태에서, 대상체는 암, 예를 들어 고형 암, 예를 들어 흑색종 또는 결장암을 갖는다. 실시양태에서, 대상체는 전이성 암을 갖는다.
한 실시양태에서, 대상체에게 CAR-발현 세포의 투여와 연관된 부작용을 감소 또는 호전시키는 작용제를 투여할 수 있다. CAR-발현 세포의 투여와 연관된 부작용은 CRS, 및 식세포 활성화 증후군 (MAS)으로도 불리는 혈구포식성 림프조직구증식증 (HLH)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. CRS의 증상은 고열, 오심, 일시적 저혈압, 저산소증 등을 포함한다. CRS는 임상적 체질 징후 및 증상, 예컨대 열, 피로, 식욕부진, 근육통, 관절통, 오심, 구토 및 두통을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 피부 징후 및 증상, 예컨대 발진을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 위장 징후 및 증상, 예컨대 오심, 구토 및 설사를 포함할 수 있다. CRS는 임상적 호흡 징후 및 증상, 예컨대 빈호흡 및 저산소혈증을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 심혈관 징후 및 증상, 예컨대 빈맥, 확대된 맥압, 저혈압, 증가된 심장 박출량 (초기) 및 잠재적으로 감소된 심장 박출량 (후기)을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 응고 징후 및 증상, 예컨대 상승된 d-이량체, 저섬유소원혈증 (출혈의 존재 또는 부재 하)을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 신장 징후 및 증상, 예컨대 질소혈증을 포함할 수 있다. CRS는 임상적 간 징후 및 증상, 예컨대 트랜스아미니티스 및 고빌리루빈혈증을 포함할 수 있다. CRS는 임상 신경계 징후 및 증상, 예컨대 두통, 정신상태 변화, 혼동, 섬망, 단어 찾기 곤란 또는 명백한 실어증, 환각, 진전, 겨냥이상, 변경된 보행, 및 발작을 포함할 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 CAR-발현 세포를 대상체에게 투여하고, CAR-발현 세포를 사용한 치료로부터 생성되는 상승된 수준의 가용성 인자를 관리하기 위해 1종 이상의 작용제를 추가로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체에서 상승되는 가용성 인자는 IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-6 중 1종 이상이다. 한 실시양태에서, 대상체에서 상승되는 인자는 IL-1, GM-CSF, IL-10, IL-8, IL-5 및 프랙탈카인 중 1종 이상이다. 따라서, 이러한 부작용을 치료하기 위해 투여되는 작용제는 이들 가용성 인자 중 1종 이상을 중화시키는 작용제일 수 있다. 한 실시양태에서, 이들 가용성 형태 중 1종 이상을 중화시키는 작용제는 항체 또는 항체 단편이다. 이러한 작용제의 예는 스테로이드 (예를 들어, 코르티코스테로이드), TNFα의 억제제, 및 IL-6의 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. TNFα 억제제의 예는 항-TNFα 항체 분자, 예컨대 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골 및 골리무맙이다. TNFα 억제제의 또 다른 예는 융합 단백질, 예컨대 에타네르셉트이다. TNFα의 소분자 억제제는 크산틴 유도체 (예를 들어 펜톡시필린) 및 부프로피온을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. IL-6 억제제의 예는 항-IL-6 항체 분자, 예컨대 토실리주맙 (toc), 사릴루맙, 엘실리모맙, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301, 및 FM101이다. 한 실시양태에서, 항-IL-6 항체 분자는 토실리주맙이다. IL-1R 기반 억제제의 예는 아나킨라이다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 코르티코스테로이드, 예컨대 예를 들어, 특히 메틸프레드니솔론, 히드로코티손이 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 혈관수축제, 예컨대 예를 들어, 노르에피네프린, 도파민, 페닐에프린, 에피네프린, 바소프레신, 또는 그의 조합이 투여된다.
한 실시양태에서, 대상체에게 해열제가 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체에게 진통제가 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 대상체에게 BCMA CAR-발현 세포가 뇌로 트래픽킹하는 것을 방지하는 작용제, 예를 들어, 나탈리주맙 (티사브리(TYSABRI)?)을 투여할 수 있다. BCMA 발현, 예를 들어 그의 스플라이스 변이체는 뇌의 일부 부분, 예를 들어 소뇌 또는 연수에서 검출된 바 있다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, BCMA CAR-발현 세포가 뇌로 트래픽킹하는 것을 방지하는 것은 임의의 BCMA CAR-발현 세포가 BCMA-발현 뇌 조직과 상호작용하거나 그에 대해 작용하는 것을 방지하기 위해 바람직하다.
한 실시양태에서, 대상체에게 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제가 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 작용제는 억제 분자를 억제하는 작용제일 수 있고, 예를 들어 작용제는 체크포인트 억제제이다. 억제 분자, 예를 들어 프로그램화된 사멸 1 (PD1)은 일부 실시양태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제 분자의 예는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3 및/또는 CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 부류 I, MHC 부류 II, GAL9, 아데노신, 및 TGFR 베타를 포함한다. 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서 억제에 의한 억제 분자의 억제는 CAR-발현 세포 성능을 최적화할 수 있다. 실시양태에서, 억제 핵산, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR), 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 또는 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN)와 같은 억제 핵산이 CAR-발현 세포에서 억제 분자의 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 억제제는 shRNA이다. 한 실시양태에서, 억제 분자는 CAR-발현 세포 내에서 억제된다. 이들 실시양태에서, 억제 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자는 CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 코딩하는 핵산에 연결된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 억제 분자의 억제제와 조합되어, 예를 들어 체크포인트 억제제와 조합되어, 예를 들어 PD1 및/또는 PD-L1의 억제제와 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 PD1의 억제제와 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 PD-L1의 억제제와 조합되어 투여된다.
한 실시양태에서, T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자가 발현되도록, 예를 들어 CAR-발현 세포 내에서 발현되도록 프로모터, 예를 들어 H1- 또는 U6-유래 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 문헌 [Tiscornia G., "Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA," Chapter 3, in Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann and Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007; Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553; Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500]을 참조한다. 한 실시양태에서, T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 동일한 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 존재한다. 이러한 실시양태에서, T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 코딩하는 핵산에 5'- 또는 3'-로 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터 상에 위치한다. T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 코딩하는 핵산과 동일하거나 상이한 방향으로 전사될 수 있다. 한 실시양태에서, T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 이외의 벡터 상에 존재한다. 한 실시양태에서, T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR-발현 세포 내에서 일시적으로 발현된다. 한 실시양태에서, T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 코딩하는 핵산 분자는 CAR-발현 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 도 41a-41e는 T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자를 갖는, CAR의 성분, 예를 들어 모든 성분을 발현시키기 위한 벡터의 예를 도시한다.
T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자의 발현을 억제하는데 유용한 dsRNA 분자의 예가 하기 제공되고, 여기서 T-세포 기능을 조정 또는 조절, 예를 들어 억제하는 분자는 PD-1이다.
PDCD1 (PD1) RNAi 작용제의 명칭 (마우스 PDCD1 유전자 서열 NM_008798.2 내 그의 위치로부터 유래됨)이, DNA 서열을 나타내는 서열식별번호: 286-333과 함께 하기 표 18에 제공된다. 센스 (S) 및 안티센스 (AS) 서열 둘 다는 이러한 표에서 19mer 및 21mer 서열로서 표시된다. 또한, 위치 (PoS, 예를 들어, 176)는 마우스 PDCD1 유전자 서열 NM_008798.2 내 위치 번호로부터 유래된 것임을 주목한다. "sense 19" 서열식별번호: 286-297; "sense 21" 서열식별번호: 298-309; "asense 21" 서열식별번호: 310-321; "asense 19" 서열식별번호: 322-333에 상응하는 12개의 군에 서열식별번호가 표시된다.
<표 18> 마우스 PDCD1 (PD1) shRNA 서열
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126
PDCD1 (PD1) RNAi 작용제의 명칭 (인간 PDCD1 유전자 서열 내 그의 위치로부터 유래됨)이, DNA 서열을 나타내는 서열식별번호: 334-381과 함께 하기 표 19에 제공된다. 센스 (S) 및 안티센스 (AS) 서열 둘 다는 19mer 및 21mer 서열로서 표시된다. "sense 19" 서열식별번호: 334-345; "sense 21" 서열식별번호: 346-357; "asense 21" 서열식별번호: 358-369; "asense 19" 서열식별번호: 370-381에 상응하는 12개의 군에 서열식별번호가 표시된다.
<표 19> 인간 PDCD1 (PD1) shRNA 서열
Figure pct00127
Figure pct00128
Figure pct00129
한 실시양태에서, 억제 신호의 억제제는, 예를 들어 억제 분자에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 예를 들어, 작용제는 PD1, PD-L1, PD-L2 또는 CTLA4 (예를 들어, 이필리무맙 (MDX-010 및 MDX-101로도 지칭되고, 예르보이(Yervoy)?로서 시판됨; 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)); 트레멜리무맙 (화이자(Pfizer)로부터 이용가능한 IgG2 모노클로날 항체, 이전에 티실리무맙, CP-675,206으로서 공지됨))에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 한 실시양태에서, 작용제는 TIM3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 작용제는 LAG3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 실시양태에서, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제, 예를 들어 억제 분자의 억제제는 동종 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 동종 CAR (예를 들어, 본원의 동종 CAR 섹션에 기재된)과 조합되어 투여된다.
PD-1은 CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA를 또한 포함하는 CD28 패밀리의 수용체의 억제 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수성 세포 상에서 발현된다 (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). PD-1에 대한 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2는 PD-1에 결합할 때 T 세포 활성화를 하향조절하는 것으로 나타났다 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1은 인간 암에 풍부하다 (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). 면역 억제는 PD-1과 PD-L1의 국소 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있다. PD-1, PD-L1 및 PD-L2의 항체, 항체 단편 및 다른 억제제는 관련 기술분야에서 입수가능하고, 본원에 기재된 본 발명의 CAR과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 니볼루맙 (BMS-936558 또는 MDX1106으로도 지칭됨; 브리스톨-마이어스 스큅)은 PD-1을 특이적으로 차단하는 완전 인간 IgG4 모노클로날 항체이다. 니볼루맙 (클론 5C4) 및 PD-1에 특이적으로 결합하는 다른 인간 모노클로날 항체는 US 8,008,449 및 WO2006/121168에 기재되어 있다. 피딜리주맙 (CT-011; 큐어 테크(Cure Tech))은 PD-1에 결합하는 인간화 IgG1k 모노클로날 항체이다. 피딜리주맙 및 다른 인간화 항-PD-1 모노클로날 항체는 WO2009/101611에 기재되어 있다. 펨브롤리주맙 (이전에 람브롤리주맙으로 공지됨, MK03475로도 지칭됨; 머크(Merck))은 PD-1에 결합하는 인간화 IgG4 모노클로날 항체이다. 펨브롤리주맙 및 다른 인간화 항-PD-1 항체는 US 8,354,509 및 WO2009/114335에 개시되어 있다. MEDI4736 (메드이뮨(Medimmune))은 PDL1에 결합하는 인간 모노클로날 항체이고, 리간드가 PD1과 상호작용하는 것을 억제한다. MDPL3280A (제넨테크(Genentech)/로슈)는 PD-L1에 결합하는 인간 Fc 최적화된 IgG1 모노클로날 항체이다. MDPL3280A 및 PD-L1에 대한 다른 인간 모노클로날 항체는 미국 특허 7,943,743 및 미국 특허 출원 공개 20120039906에 개시되어 있다. 다른 항-PD-L1 결합제는 YW243.55.S70 (중쇄 및 경쇄 가변 영역이 WO2010/077634의 서열식별번호: 20 및 21에 제시되어 있음) 및 MDX-1 105 (BMS-936559로도 지칭됨, 예를 들어 WO2007/005874에 개시된 항-PD-L1 결합제)를 포함한다. AMP-224 (B7-DCIg; 암플리뮨 (Amplimmune); 예를 들어 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 개시됨)는 PD-1 및 B7-H1 사이의 상호작용을 차단하는 PD-L2 Fc 융합 가용성 수용체이다. 다른 항-PD-1 항체는 AMP 514 (암플리뮨), 특히 예를 들어 US 8,609,089, US 2010028330 및/또는 US 20120114649에 개시된 항-PD-1 항체를 포함한다.
TIM3 (T 세포 이뮤노글로불린-3)은 또한, 특히 IFN-g-분비 CD4+ T 헬퍼 1 및 CD8+ T 세포독성 1 세포에서 T 세포 기능을 음성적으로 조절하고, T 세포 소진에서 중요한 역할을 한다. TIM3 및 그의 리간드, 예를 들어 갈렉틴-9 (Gal9), 포스포티딜세린 (PS), 및 HMGB1 사이의 상호작용의 억제는 면역 반응을 증가시킬 수 있다. TIM3 및 그의 리간드의 항체, 항체 단편, 및 다른 억제제는 관련 기술분야에서 이용가능하고, 본원에 기재된 CD19 또는 BCMA CAR과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, TIM3을 표적화하는 항체, 항체 단편, 소분자, 또는 펩티드 억제제는 TIM3의 IgV 도메인에 결합하여, 그의 리간드와의 상호작용을 억제한다. TIM3을 억제하는 항체 및 펩티드는 WO2013/006490 및 US20100247521에 개시되어 있다. 다른 항-TIM3 항체는 인간화 버전의 RMT3-23 (문헌 [Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551]에 개시됨), 및 클론 8B.2C12 (문헌 [Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541]에 개시됨)를 포함한다. TIM3 및 PD-1을 억제하는 이중-특이적 항체는 US20130156774에 개시되어 있다.
다른 실시양태에서, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제는 CEACAM 억제제 (예를 들어, CEACAM-1, CEACAM-3, 및/또는 CEACAM-5 억제제)이다. 한 실시양태에서, CEACAM의 억제제는 항-CEACAM 항체 분자이다. 예시적인 항-CEACAM-1 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 34B1, 26H7, 및 5F4가 WO 2010/125571, WO 2013/082366 WO 2014/059251 및 WO 2014/022332에 기재되어 있거나; 또는 그의 제조합 형태는 예를 들어 US 2004/0047858, US 7,132,255 및 WO 99/052552에 기재된 바와 같다. 다른 실시양태에서, 항-CEACAM 항체는 예를 들어 문헌 [Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)]에 기재된 바와 같이 CEACAM-5에 결합하거나, 또는 예를 들어 WO 2013/054331 및 US 2014/0271618에 기재된 바와 같이 CEACAM-1 및 CEACAM-5와 교차반응한다.
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 암배아성 항원 세포 부착 분자 (CEACAM), 예컨대 CEACAM-1 및 CEACAM-5는, 적어도 부분적으로, 항종양 면역 반응의 억제를 매개하는 것으로 여겨진다 (예를 들어, 문헌 [Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529] 참조). 예를 들어, CEACAM-1은 TIM-3에 대한 이종친화성 리간드로서 및 TIM-3-매개 T 세포 관용 및 소진에서 소정의 역할을 하는 것으로서 기재되어 있다 (예를 들어, WO 2014/022332; 문헌 [Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848] 참조). 실시양태에서, CEACAM-1 및 TIM-3의 공동-차단은 이종이식편 결장직장암 모델에서 항종양 면역 반응을 증진시키는 것으로 밝혀진 바 있다 (예를 들어, WO 2014/022332; 상기 문헌 [Huang, et al. (2014)] 참조). 다른 실시양태에서, CEACAM-1 및 PD-1의 공동-차단은 예를 들어 WO 2014/059251에 기재된 바와 같이 T 세포 관용을 감소시킨다. 따라서, CEACAM 억제제는 본원에 기재된 다른 면역조정제 (예를 들어, 항-PD-1 및/또는 항-TIM-3 억제제)와 함께 사용되어 암, 예를 들어 흑색종, 폐암 (예를 들어, NSCLC), 방광암, 결장암, 난소암 및 본원에 기재된 바와 같은 다른 암에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다.
LAG3 (림프구 활성화 유전자-3 또는 CD223)은 CD8+ T 세포 소진에서 소정의 역할을 하는 것으로 밝혀진 바 있는, 활성화된 T 세포 및 B 세포 상에서 발현되는 세포 표면 분자이다. LAG3 및 그의 리간드의 항체, 항체 단편, 및 다른 억제제는 관련 기술분야에서 이용가능하고, 본원에 기재된 CD19 또는 BCMA CAR과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, BMS-986016 (브리스톨-마이어스 스큅)은 LAG3을 표적화하는 모노클로날 항체이다. IMP701 (이뮤텝(Immutep))은 길항제 LAG3 항체이고, IMP731 (이뮤텝 및 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline))은 고갈 LAG3 항체이다. 다른 LAG3 억제제는, MHC 부류 II 분자에 결합하고 항원 제시 세포 (APC)를 활성화시키는 LAG3의 가용성 부분 및 Ig의 재조합 융합 단백질인 IMP321 (이뮤텝)을 포함한다. 다른 항체는 예를 들어 WO2010/019570에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제는 예를 들어, 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 여기서 제1 도메인은 억제 분자 또는 그의 단편이고, 제2 도메인은 양성 신호와 연관된 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 양성 신호와 연관된 폴리펩티드는 CD28, CD27, ICOS의 공동자극 도메인, 예를 들어 CD28, CD27 및/또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인, 및/또는 예를 들어 본원에 기재된, 예를 들어 CD3 제타의 1차 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 융합 단백질은 CAR을 발현하는 동일한 세포에 의해 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 항-BCMA CAR을 발현하지 않는 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포에 의해 발현된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 작용제는 miR-17-92이다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR의 활성을 증진시키는 작용제는 시토카인이다. 시토카인은 T 세포 확장, 분화, 생존, 및 항상성과 관련하여 중요한 기능을 갖는다. 본원에 기재된 CAR-발현 세포를 제공받은 대상체에게 투여될 수 있는 시토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18, 및 IL-21, 또는 그의 조합을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 투여되는 시토카인은 IL-7, IL-15, 또는 IL-21, 또는 그의 조합이다. 시토카인은 1일에 1회, 또는 1일에 1회 초과, 예를 들어 1일에 2회, 1일에 3회, 또는 1일에 4회 투여될 수 있다. 시토카인은 1일 초과 동안 투여될 수 있고, 예를 들어 시토카인은 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주 또는 4주 동안 투여된다. 예를 들어, 시토카인은 7일 동안 1일에 1회 투여된다.
실시양태에서, 시토카인은 CAR-발현 T 세포와 조합되어 투여된다. 시토카인은 CAR-발현 T 세포와 동시에 또는 공동으로 투여, 예를 들어 동일한 날에 투여될 수 있다. 시토카인은 CAR-발현 T 세포와 동일한 제약 조성물 내에 제조될 수 있거나, 또는 개별 제약 조성물로 제조될 수 있다. 대안적으로, 시토카인은 CAR-발현 T 세포의 투여 직후, 예를 들어 CAR-발현 T 세포의 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후에 투여될 수 있다. 시토카인이 1일 초과에 걸쳐 이루어지는 투여 요법으로 투여되는 실시양태에서, 시토카인 투여 요법의 제1일은 CAR-발현 T 세포에 의한 투여와 동일한 날일 수 있거나, 또는 시토카인 투여 요법의 제1일은 CAR-발현 T 세포의 투여 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후일 수 있다. 한 실시양태에서, 제1일에 CAR-발현 T 세포가 대상체에게 투여되고, 제2일에 시토카인이 다음 7일 동안 1일에 1회 투여된다. 바람직한 실시양태에서, CAR-발현 T 세포와 조합되어 투여되는 시토카인은 IL-7, IL-15, 또는 IL-21이다.
다른 실시양태에서, 시토카인은 CAR-발현 세포의 투여의 소정의 기간 후, 예를 들어 CAR-발현 세포의 투여의 적어도 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 1년 또는 그 초과 후에 투여된다. 한 실시양태에서, 시토카인은 CAR-발현 세포에 대한 대상체의 반응의 평가 후에 투여된다. 예를 들어, 본원에 기재된 투여량 및 요법에 따라 대상체에게 CAR-발현 세포가 투여된다. CAR-발현 세포 요법에 대한 대상체의 반응은 종양 성장의 억제, 순환 종양 세포의 감소, 또는 종양 퇴행을 비롯한 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여, CAR-발현 세포의 투여의 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 1년 또는 그 초과 후에 평가된다. CAR-발현 세포 요법에 대해 충분한 반응을 나타내지 않는 대상체에게 시토카인이 투여될 수 있다. CAR-발현 세포 요법에 대해 준-최적 반응을 갖는 대상체에게의 시토카인의 투여는 CAR-발현 세포 효능 또는 항암 활성을 개선시킨다. 바람직한 실시양태에서, CAR-발현 세포의 투여 후에 투여되는 시토카인은 IL-7이다.
낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제와의 조합
본원에 기재된 방법은 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제, 예를 들어 라파로그, 예컨대 RAD001을 비롯한 알로스테릭 mTOR 억제제를 사용한다. 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제 (예를 들어, 면역계를 완전히 억제하기에 불충분하지만 면역 기능을 개선시키기에는 충분한 용량)의 투여는 대상체에서 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 CAR-발현 세포의 성능을 최적화할 수 있다. mTOR 억제를 측정하는 방법, 투여량, 치료 요법, 및 적합한 제약 조성물은 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 번호 2015/01240036에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 투여는 하기:
i) PD-1 양성 면역 이펙터 세포의 수에서의 감소;
ii) PD-1 음성 면역 이펙터 세포의 수에서의 증가;
iii) PD-1 음성 면역 이펙터 세포 / PD-1 양성 면역 이펙터 세포의 비에서의 증가;
iv) 나이브 T 세포의 수에서의 증가;
v) 예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 하기 마커 중 1종 이상의 발현에서의 증가: CD62L고, CD127고, CD27+, 및 BCL2;
vi) 예를 들어 기억 T 세포, 예를 들어 기억 T 세포 전구체 상에서의 KLRG1의 발현에서의 감소; 또는
vii) 기억 T 세포 전구체, 예를 들어 하기 특징 중 어느 하나 또는 그의 조합을 갖는 세포의 수에서의 증가: 증가된 CD62L고, 증가된 CD127고, 증가된 CD27+, 감소된 KLRG1, 및 증가된 BCL2
중 1종 이상을 발생시키고; 여기서 상기 중 임의의 것, 예를 들어 i), ii), iii), iv), v), vi), 또는 vii)은 예를 들어 비-처리 대상체와 비교하여 예를 들어 적어도 일시적으로 발생한다.
또 다른 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 투여는, 예를 들어 배양물 또는 대상체에서, 예를 들어 비-처리 CAR-발현 세포 또는 비-처리 대상체와 비교하여 CAR-발현 세포의 증가 또는 연장된 증식 또는 지속성을 발생시킨다. 실시양태에서, 증가된 증식 또는 지속성은 CAR-발현 세포의 수에서의 증가와 연관된다. 증가 또는 연장된 증식을 측정하는 방법은 실시예 15 및 16에 기재되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 투여는, 예를 들어 배양물 또는 대상체에서, 예를 들어 비-처리 CAR-발현 세포 또는 비-처리 대상체와 비교하여 CAR-발현 세포에 의한 암 세포의 증가된 사멸을 발생시킨다. 실시양태에서, 암 세포의 증가된 사멸은 종양 부피에서의 감소와 연관된다. 암 세포의 증가된 사멸을 측정하는 방법이 본원, 예를 들어 실시예 2, 5-6, 8 및 13에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 mTOR 억제제, 예를 들어 RAD001, 또는 촉매 mTOR 억제제와 조합되어 투여된다. 예를 들어, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 투여는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여 전에 개시되거나; 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여 전에 완결되거나; 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여와 동시에 개시되거나; 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여와 중첩되거나; 또는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 투여 후에 계속될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 투여는 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하도록 조작하기 위해 면역 이펙터 세포를 최적화할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제, 예를 들어 알로스테릭 억제제, 예를 들어 RAD001, 또는 촉매 억제제의 투여는 대상체로부터 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하도록 조작하기 위해 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포의 수거 전에 개시 또는 완결된다.
또 다른 실시양태에서, 예를 들어 대상체로부터의 수거 후의 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하도록 조작하기 위한 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포, 또는 예를 들어 대상체에의 투여 전의 CAR-발현 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포는 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제의 존재 하에 배양될 수 있다.
한 실시양태에서, 대상체에게 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제를 투여하는 것은, 예를 들어 1주에 1회, 예를 들어 즉시 방출 투여 형태로, 0.1 내지 20, 0.5 내지 10, 2.5 내지 7.5, 3 내지 6, 또는 약 5 mg의 RAD001 또는 그의 생물학적 등가 양을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상체에게 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제를 투여하는 것은, 예를 들어 1주에 1회, 예를 들어 지속 방출 투여 형태로, 0.3 내지 60, 1.5 내지 30, 7.5 내지 22.5, 9 내지 18, 또는 약 15 mg의 RAD001, 또는 그의 생물학적 등가 양을 투여하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, mTOR 억제제의 용량은 적어도 5 내지 90% 이하, 적어도 10 내지 90% 이하, 적어도 15 내지 90% 이하, 적어도 20 내지 90% 이하, 적어도 30 내지 90% 이하, 적어도 40 내지 90% 이하, 적어도 50 내지 90% 이하, 적어도 60 내지 90% 이하, 적어도 70 내지 90% 이하, 적어도 5 내지 80% 이하, 적어도 10 내지 80% 이하, 적어도 15 내지 80% 이하, 적어도 20 내지 80% 이하, 적어도 30 내지 80% 이하, 적어도 40 내지 80% 이하, 적어도 50 내지 80% 이하, 적어도 60 내지 80% 이하, 적어도 5 내지 70% 이하, 적어도 10 내지 70% 이하, 적어도 15 내지 70% 이하, 적어도 20 내지 70% 이하, 적어도 30 내지 70% 이하, 적어도 40 내지 70% 이하, 적어도 50 내지 70% 이하, 적어도 5 내지 60% 이하, 적어도 10 내지 60% 이하, 적어도 15 내지 60% 이하, 적어도 20 내지 60% 이하, 적어도 30 내지 60% 이하, 적어도 40 내지 60% 이하, 적어도 5 내지 50% 이하, 적어도 10 내지 50% 이하, 적어도 15 내지 50% 이하, 적어도 20 내지 50% 이하, 적어도 30 내지 50% 이하, 적어도 40 내지 50% 이하, 적어도 5 내지 40% 이하, 적어도 10 내지 40% 이하, 적어도 15 내지 40% 이하, 적어도 20 내지 40% 이하, 적어도 30 내지 40% 이하, 적어도 35 내지 40% 이하, 적어도 5 내지 30% 이하, 적어도 10 내지 30% 이하, 적어도 15 내지 30% 이하, 적어도 20 내지 30% 이하, 또는 적어도 25 내지 30% 이하의 mTOR 억제와 연관되거나 또는 mTOR 억제를 제공한다.
한 실시양태에서, 대상체에게 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제를 투여하는 것은, 예를 들어 1주에 1회, 예를 들어 즉시 방출 투여 형태로, 0.1 내지 20, 0.5 내지 10, 2.5 내지 7.5, 3 내지 6, 또는 약 5 mg의 RAD001, 또는 그의 생물학적 등가 용량을 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 대상체에게 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제를 투여하는 것은, 예를 들어 1주에 1회, 예를 들어 지속 방출 투여 형태로, 0.3 내지 60, 1.5 내지 30, 7.5 내지 22.5, 9 내지 18, 또는 약 15 mg의 RAD001, 또는 그의 생물학적 등가 용량을 투여하는 것을 포함한다.
mTOR 억제의 정도는 P70 S6 키나제 억제의 정도로서 나타내어질 수 있거나 그에 상응하고, 예를 들어 mTOR 억제의 정도는 P70 S6 키나제 활성에서의 감소 수준에 의해, 예를 들어 P70 S6 키나제 기질의 인산화에서의 감소에 의해 결정될 수 있다. mTOR 억제의 수준은 다양한 방법, 예컨대 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 번호 2015/01240036에 기재된 바와 같은, 또는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,727,950에 기재된 바와 같은 불레이 검정에 의해 P70 S6 키나제 활성을 측정하는 것; 웨스턴 블롯에 의해 인산화 S6의 수준을 측정하는 것; 또는 PD1 음성 면역 이펙터 세포 대 PD1 양성 면역 이펙터 세포의 비에서의 변화를 평가하는 것에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "mTOR 억제제"는 세포에서 mTOR 키나제를 억제하는 화합물 또는 리간드, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 지칭한다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제는 알로스테릭 억제제이다. 알로스테릭 mTOR 억제제는 중성 트리시클릭 화합물 라파마이신 (시롤리무스), 예를 들어 라파마이신 유도체, 라파마이신 유사체 (라파로그로도 지칭됨) 및 mTOR 활성을 억제하는 다른 마크롤리드 화합물을 비롯한 라파마이신과 구조적 및 기능적 유사성을 갖는 화합물인 라파마이신-관련 화합물을 포함한다. 한 실시양태에서, mTOR 억제제는 촉매 억제제이다.
라파마이신은 하기 화학식 A에 제시된 구조를 갖는 스트렙토미세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에 의해 생산된 공지된 마크롤리드 항생제이다.
<화학식 A>
Figure pct00130
예를 들어, 문헌 [McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433]; 미국 특허 번호 3,929,992를 참조한다. 라파마이신에 대해 제안되는 다양한 넘버링 스킴이 존재한다. 혼동을 피하기 위해, 특정 라파마이신 유사체가 본원에서 명명되는 경우에, 명칭은 화학식 A의 넘버링 스킴을 사용하는 라파마이신과 관련하여 주어진다.
본 발명에서 유용한 라파마이신 유사체는, 예를 들어 라파마이신의 시클로헥실 고리 상의 히드록실 기가 OR1 (여기서 R1은 히드록시알킬, 히드록시알콕시알킬, 아실아미노알킬 또는 아미노알킬임)에 의해 대체된 O-치환된 유사체; 예를 들어 각각의 내용이 참조로 포함되는 US 5,665,772 및 WO94/09010에 기재된 바와 같은 에베롤리무스로도 공지된 RAD001이다.
다른 적합한 라파마이신 유사체는 26- 또는 28-위치에서 치환된 것을 포함한다. 라파마이신 유사체는 상기 언급된 유사체의 에피머, 특히 위치 40, 28 또는 26에서 치환된 유사체의 에피머일 수 있고, 예를 들어 그 내용이 참조로 포함되는 US 6,015,815, WO95/14023 및 WO99/15530에 기재된 바와 같이 임의로 추가로 수소화될 수 있다 (예를 들어 그 내용이 참조로 포함되는 US 7,091,213, WO98/02441 및 WO01/14387에 기재된 조타롤리무스로도 공지된 ABT578 또는 라파마이신 유사체, 예를 들어 리다포롤리무스로도 공지된 AP23573).
US 5,665,772로부터의 본 발명에서 사용하기에 적합한 라파마이신 유사체의 예는 40-O-벤질-라파마이신, 40-O-(4'-히드록시메틸)벤질-라파마이신, 40-O-[4'-(1,2-디히드록시에틸)]벤질-라파마이신, 40-O-알릴-라파마이신, 40-O-[3'-(2,2-디메틸-1,3-디옥솔란-4(S)-일)-프로프-2'-엔-1'-일]-라파마이신, (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-디히드록시펜트-2'-엔-1'-일)-라파마이신, 40-O-(2-히드록시)에톡시카르보닐메틸-라파마이신, 40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신, 40-O-(3-히드록시)프로필-라파마이신, 40-O-(6-히드록시)헥실-라파마이신, 40-O-[2-(2-히드록시)에톡시]에틸-라파마이신, 40-O-[(3S)-2,2-디메틸디옥솔란-3-일]메틸-라파마이신, 40-O-[(2S)-2,3-디히드록시프로프-1-일]-라파마이신, 40-O-(2-아세톡시)에틸-라파마이신, 40-O-(2-니코티노일옥시)에틸-라파마이신, 40-O-[2-(N-모르폴리노)아세톡시]에틸-라파마이신, 40-O-(2-N-이미다졸릴아세톡시)에틸-라파마이신, 40-O-[2-(N-메틸-N'-피페라지닐)아세톡시]에틸-라파마이신, 39-O-데스메틸-39,40-O,O-에틸렌-라파마이신, (26R)-26-디히드로-40-O-(2-히드록시)에틸-라파마이신, 40-O-(2-아미노에틸)-라파마이신, 40-O-(2-아세트아미노에틸)-라파마이신, 40-O-(2-니코틴아미도에틸)-라파마이신, 40-O-(2-(N-메틸-이미다조-2'-일카르브에톡사미도)에틸)-라파마이신, 40-O-(2-에톡시카르보닐아미노에틸)-라파마이신, 40-O-(2-톨릴술폰아미도에틸)-라파마이신 및 40-O-[2-(4',5'-디카르보에톡시-1',2',3'-트리아졸-1'-일)-에틸]-라파마이신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 다른 라파마이신 유사체는 라파마이신의 시클로헥실 고리 상의 히드록실 기 및/또는 28 위치의 히드록실 기가 히드록시에스테르 기로 대체된 유사체이고, 예를 들어 US RE44,768에서 확인되는 라파마이신 유사체, 예를 들어 템시롤리무스가 공지되어 있다.
본 발명에 유용한 다른 라파마이신 유사체는 16 위치의 메톡시 기가 또 다른 치환기, 바람직하게는 (임의로 히드록시-치환된) 알키닐옥시, 벤질, 오르토메톡시벤질 또는 클로로벤질에 의해 대체되고/거나 39 위치의 메톡시 기가 39 탄소와 함께 결실되어 라파마이신의 시클로헥실 고리가 39 위치 메톡시 기가 결여된 시클로펜틸 고리로 된 것; 예를 들어 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 WO95/16691 및 WO96/41807에 기재된 바와 같은 것을 포함한다. 유사체는 라파마이신의 40-위치의 히드록시가 알킬화되고/거나 32-카르보닐이 환원되도록 추가로 변형될 수 있다.
WO95/16691로부터의 라파마이신 유사체는 16-데메톡시-16-(펜트-2-이닐)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-(부트-2-이닐)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-(프로파르길)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-(4-히드록시-부트-2-이닐)옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-벤질옥시-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 16-데메톡시-16-벤질옥시-라파마이신, 16-데메톡시-16-오르토-메톡시벤질-라파마이신, 16-데메톡시-40-O-(2-메톡시에틸)-16-펜트-2-이닐)옥시-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-포르밀-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-히드록시메틸-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-카르복시-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-(4-메틸-피페라진-1-일)카르보닐-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-(모르폴린-4-일)카르보닐-42-노르-라파마이신, 39-데메톡시-40-데스옥시-39-[N-메틸, N-(2-피리딘-2-일-에틸)]카르바모일-42-노르-라파마이신 및 39-데메톡시-40-데스옥시-39-(p-톨루엔술포닐히드라조노메틸)-42-노르-라파마이신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
WO96/41807로부터의 라파마이신 유사체는 32-데옥소-라파마이신, 16-O-펜트-2-이닐-32-데옥소-라파마이신, 16-O-펜트-2-이닐-32-데옥소-40-O-(2-히드록시-에틸)-라파마이신, 16-O-펜트-2-이닐-32-(S)-디히드로-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 32(S)-디히드로-40-O-(2-메톡시)에틸-라파마이신 및 32(S)-디히드로-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 적합한 라파마이신 유사체는 그 내용이 참조로 포함되는 US2005/0101624에 기재된 바와 같은 우미롤리무스이다.
달리 에베롤리무스 (아피니토르(Afinitor)?)로도 공지된 RAD001은 각각의 내용이 본원에 참조로 포함되는 US 5,665,772 및 WO94/09010에 기재된 바와 같은 화학 명칭 (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-히드록시에톡시)-3-메톡시시클로헥실]-1-메틸에틸}-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-11,36-디옥사-4-아자-트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-2,3,10,14,20-펜타온을 갖는다.
알로스테릭 mTOR 억제제의 추가의 예는 시롤리무스 (라파마이신, AY-22989), 40-[3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]-라파마이신 (템시롤리무스 또는 CCI-779로도 불림) 및 리다포롤리무스 (AP-23573/MK-8669)를 포함한다. 알로스테릭 mTOR 억제제의 다른 예는 조타롤리무스 (ABT578) 및 우미롤리무스를 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 촉매 ATP-경쟁적 mTOR 억제제는 mTOR 키나제 도메인을 직접적으로 표적화하고, mTORC1 및 mTORC2 둘 다를 표적화하는 것으로 발견되었다. 이들은 라파마이신-저항성 mTORC1 결과물, 예컨대 4EBP1-T37/46 인산화 및 캡-의존성 번역을 조정하기 때문에, 또한 라파마이신으로서 이러한 알로스테릭 mTOR 억제제보다 mTORC1의 보다 유효한 억제제이다.
촉매 억제제는 BEZ235 또는 2-메틸-2-[4-(3-메틸-2-옥소-8-퀴놀린-3-일-2,3-디히드로-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)-페닐]-프로피오니트릴 또는 모노토실레이트 염 형태 (BEZ235의 합성은 WO2006/122806에 기재되어 있음); 화학 명칭 {5-[2,4-비스-((S)-3-메틸-모르폴린-4-일)-피리도[2,3d]피리미딘-7-일]-2-메톡시-페닐}-메탄올을 갖는 CCG168 (달리 AZD-8055로 공지됨, 문헌 [Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298]); 3-[2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일]-N-메틸벤즈아미드 (WO09104019); 3-(2-아미노벤조[d]옥사졸-5-일)-1-이소프로필-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-아민 (WO10051043 및 WO2013023184); N-(3-(N-(3-((3,5-디메톡시페닐)아미노)퀴녹살린-2-일)술파모일)페닐)-3-메톡시-4-메틸벤즈아미드 (WO07044729 및 WO12006552); 화학 명칭 1-[4-[4-(디메틸아미노)피페리딘-1-카르보닐]페닐]-3-[4-(4,6-디모르폴리노-1,3,5-트리아진-2-일)페닐]우레아를 갖는 PKI-587 (Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645); 화학 명칭 2,4-디플루오로-N-{2-메톡시-5-[4-(4-피리다지닐)-6-퀴놀리닐]-3-피리디닐}벤젠술폰아미드를 갖는 GSK-2126458 (ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43); 5-(9-이소프로필-8-메틸-2-모르폴리노-9H-퓨린-6-일)피리미딘-2-아민 (WO10114484); 및 (E)-N-(8-(6-아미노-5-(트리플루오로메틸)피리딘-3-일)-1-(6-(2-시아노프로판-2-일)피리딘-3-일)-3-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2(3H)-일리덴)시안아미드 (WO12007926)를 포함한다.
촉매 mTOR 억제제의 추가의 예는 8-(6-메톡시-피리딘-3-일)-3-메틸-1-(4-피페라진-1-일-3-트리플루오로메틸-페닐)-1,3-디히드로-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-온 (WO2006/122806) 및 Ku-0063794 (Garcia-Martinez JM, et al.,Biochem J., 2009, 421(1), 29-42)를 포함한다. Ku-0063794는 라파마이신 (mTOR)의 포유동물 표적의 특이적 억제제이다. WYE-354는 촉매 mTOR 억제제의 또 다른 예이다 (Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240).
본 발명에 따라 유용한 mTOR 억제제는 상기 중 임의의 것의 전구약물, 유도체, 제약상 허용되는 염, 또는 그의 유사체를 또한 포함한다.
mTOR 억제제, 예컨대 RAD001은 본원에 기재된 특정한 투여량을 기초로 하여 관련 기술분야에 널리-확립되어 있는 방법을 기초로 전달을 위해 제제화될 수 있다. 특히, 미국 특허 번호 6,004,973 (본원에 참조로 포함됨)은 본원에 기재된 mTOR 억제제와 함께 사용가능한 제제의 예를 제공한다.
CAR-유효성 또는 샘플 적합성을 평가하기 위한 방법 및 바이오마커
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체 (예를 들어, 암, 예를 들어 혈액암을 갖는 대상체)에서 CAR-발현 세포 요법 (예를 들어, BCMACAR 요법)의 유효성, 또는 CAR 요법 (예를 들어, BCMACAR 요법)을 위한 샘플 (예를 들어, 분리반출술 샘플)의 적합성을 평가 또는 모니터링하는 방법을 특색으로 한다. 방법은 CAR 요법에 대한 유효성 또는 샘플 적합성의 값을 획득하는 것을 포함하며, 여기서 상기 값은 CAR-발현 세포 요법의 유효성 또는 적합성을 나타낸다.
실시양태에서, CAR 요법에 대한 유효성 또는 샘플 적합성의 값은 하기 중 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과 (모두)의 측정치를 포함한다:
(i) 샘플 (예를 들어, 분리반출술 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플) 내 휴지기 TEFF 세포, 휴지기 TREG 세포, 더 어린 T 세포 (예를 들어, 더 어린 CD4 또는 CD8 세포, 또는 감마/델타 T 세포), 또는 초기 기억 T 세포 또는 그의 조합 중 1, 2, 3종 또는 그 초과 (예를 들어, 모두)의 수준 또는 활성;
(ii) 샘플 (예를 들어, 분리반출술 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플) 내 활성화 TEFF 세포, 활성화 TREG 세포, 더 노화된 T 세포 (예를 들어, 더 노화된 CD4 또는 CD8 세포), 또는 후기 기억 T 세포 또는 그의 조합 중 1, 2, 3종 또는 그 초과 (예를 들어, 모두)의 수준 또는 활성;
(iii) 샘플 (예를 들어, 분리반출술 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플) 내 면역 세포 소진 마커, 예를 들어 1, 2종 또는 그 초과의 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어, PD-1, PD-L1, TIM-3 및/또는 LAG-3)의 수준 또는 활성. 한 실시양태에서, 면역 세포는 소진 표현형을 갖고, 예를 들어 적어도 2종의 소진 마커를 공동-발현하며, 예를 들어 PD-1 및 TIM-3을 공동-발현한다. 다른 실시양태에서, 면역 세포는 소진 표현형을 갖고, 예를 들어 적어도 2종의 소진 마커를 공동-발현하며, 예를 들어 PD-1 및 LAG-3을 공동-발현한다;
(iv) 샘플 (예를 들어, 분리반출술 샘플 또는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플) 내 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 집단에서의 CD27 및/또는 CD45RO- (예를 들어, CD27+ CD45RO-) 면역 이펙터 세포의 수준 또는 활성;
(v) CCL20, IL-17a 및/또는 IL-6, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CD57, CD27, CD122, CD62L, KLRG1로부터 선택된 바이오마커 중 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20종 또는 그 초과의 수준 또는 활성;
(vi) CAR-발현 세포 생성물 샘플, 예를 들어 BCMA-발현 세포 생성물 샘플 내 시토카인 수준 또는 활성 (예를 들어, 시토카인 레퍼토리의 품질); 또는
(vii) 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플 내 CAR-발현 세포의 형질도입 효율.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, CAR-발현 세포 요법은 복수 (예를 들어, 집단)의 CAR-발현 면역 이펙터 세포, 예를 들어 복수 (예를 들어, 집단)의 T 세포 또는 NK 세포, 또는 그의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR-발현 세포 요법은 BCMACAR 요법이다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, (i)-(vii) 중 1개 이상의 측정치는 대상체로부터 획득된 분리반출술 샘플로부터 수득된다. 분리반출술 샘플은 주입 또는 재-주입 전에 평가될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, (i)-(vii) 중 1개 이상의 측정치는 제조된 CAR-발현 세포 생성물 샘플, 예를 들어 BCMACAR-발현 세포 생성물 샘플로부터 수득된다. 제조된 CAR-발현 세포 생성물은 주입 또는 재-주입 전에 평가될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 CAR-발현 세포 요법을 제공받기 전, 그 동안, 또는 제공받은 후에 평가된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, (i)-(vii) 중 1개 이상의 측정치는 유전자 발현, 유동 세포측정법 또는 단백질 발현 중 1종 이상에 대한 프로파일을 평가한다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 (i)-(vii) 중 1개 이상의 측정치에 기초하여 대상체를 반응자, 비-반응자, 재발자 또는 비-재발자로서 확인하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 반응자 (예를 들어, 완전 반응자)는 비-반응자와 비교하여 GZMK, PPF1BP2, 또는 나이브 T 세포 중 1, 2종 또는 그 초과 (모두)의 보다 큰 수준 또는 활성을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 비-반응자는 반응자와 비교하여 IL22, IL-2RA, IL-21, IRF8, IL8, CCL17, CCL22, 이펙터 T 세포, 또는 조절 T 세포 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7종 또는 그 초과 (예를 들어, 모두)의 보다 큰 수준 또는 활성을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
한 실시양태에서, 재발자는 비-재발자와 비교하여 하기 유전자: MIR199A1, MIR1203, uc021ovp, ITM2C, 및 HLA-DQB1 중 1종 이상 (예를 들어, 2, 3, 4종 또는 모두)의 증가된 발현 수준 및/또는 비-재발자와 비교하여 하기 유전자: PPIAL4D, TTTY10, TXLNG2P, MIR4650-1, KDM5D, USP9Y, PRKY, RPS4Y2, RPS4Y1, NCRNA00185, SULT1E1, 및 EIF1AY 중 1종 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11종 또는 모두)의 감소된 발현 수준을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된 환자이다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 완전 반응자는 참고 값, 예를 들어 CD8+ T 세포의 비-반응자 백분율과 비교하여 CD8+ T 세포의 보다 큰, 예를 들어 통계적으로 유의하게 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 완전 반응자는, 예를 들어 CD8+ 집단에서 참고 값, 예를 들어 CD27+ CD45RO- 면역 이펙터 세포의 비-반응자 수와 비교하여 CD27+ CD45RO- 면역 이펙터 세포의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 완전 반응자 또는 부분 반응자는 참고 값, 예를 들어 CD4+ T 세포의 비-반응자 백분율과 비교하여 CD4+ T 세포의 보다 큰, 예를 들어 통계적으로 유의하게 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 완전 반응자는 참고 값, 예를 들어 휴지기 TEFF 세포, 휴지기 TREG 세포, 더 어린 T 세포 (예를 들어, 더 어린 CD4 또는 CD8 세포), 또는 초기 기억 T 세포의 비-반응자 수와 비교하여 휴지기 TEFF 세포, 휴지기 TREG 세포, 더 어린 T 세포 (예를 들어, 더 어린 CD4 또는 CD8 세포, 또는 감마/델타 T 세포), 또는 초기 기억 T 세포 또는 그의 조합 중 1, 2, 3종 또는 그 초과 (예를 들어, 모두)의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 비-반응자는 참고 값, 예를 들어 활성화 TEFF 세포, 활성화 TREG 세포, 더 노화된 T 세포 (예를 들어, 더 노화된 CD4 또는 CD8 세포), 또는 후기 기억 T 세포의 반응자 수와 비교하여 활성화 TEFF 세포, 활성화 TREG 세포, 더 노화된 T 세포 (예를 들어, 더 노화된 CD4 또는 CD8 세포), 또는 후기 기억 T 세포 또는 그의 조합 중 1, 2, 3종 또는 그 초과 (예를 들어, 모두)의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 비-반응자는 면역 세포 소진 마커, 예를 들어 1, 2종 또는 그 초과의 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어, PD-1, PD-L1, TIM-3 및/또는 LAG-3)의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다. 한 실시양태에서, 비-반응자는 반응자로부터의 PD-1 또는 LAG-3 발현 면역 이펙터 세포의 백분율과 비교하여 PD-1, PD-L1, 또는 LAG-3 발현 면역 이펙터 세포 (예를 들어, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포) (예를 들어, CAR-발현 CD4+ 세포 및/또는 CD8+ T 세포)의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
한 실시양태에서, 비-반응자는 소진 표현형을 갖는 면역 세포, 예를 들어 적어도 2종의 소진 마커를 공동-발현하는, 예를 들어 PD-1, PD-L1 및/또는 TIM-3을 공동-발현하는 면역 세포의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다. 다른 실시양태에서, 비-반응자는 소진 표현형을 갖는 면역 세포, 예를 들어 적어도 2종의 소진 마커를 공동-발현하는, 예를 들어 PD-1 및 LAG-3을 공동-발현하는 면역 세포의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 비-반응자는 CAR-발현 세포 요법에 대해 반응자 (예를 들어, 완전 반응자)와 비교하여 CAR-발현 세포 집단 (예를 들어, BCMACAR+ 세포 집단)에서 PD-1/ PD-L1+/LAG-3+ 세포의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 부분 반응자는 CAR-발현 세포 집단 (예를 들어, BCMACAR+ 세포 집단)에서 반응자보다 PD-1/ PD-L1+/LAG-3+ 세포의 보다 높은 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 비-반응자는 CAR-발현 세포 집단 (예를 들어, BCMACAR + 세포 집단)에서 PD1/ PD-L1+ CAR+의 소진 표현형 및 LAG3의 공동-발현을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 비-반응자는 반응자 (예를 들어, 완전 반응자)와 비교하여 CAR-발현 세포 집단 (예를 들어, BCMACAR + 세포 집단)에서 PD-1/ PD-L1+/TIM-3+ 세포의 보다 큰 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 부분 반응자는 CAR-발현 세포 집단 (예를 들어, BCMACAR + 세포 집단)에서 반응자보다 PD-1/ PD-L1+/TIM-3+ 세포의 보다 높은 백분율을 갖거나, 또는 갖는 것으로 확인된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 분리반출술 샘플에서 CD8+ CD27+ CD45RO- T 세포의 존재는 CAR-발현 세포 요법 (예를 들어, BCMACAR 요법)에 대한 대상체 반응의 양성 예측인자이다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 분리반출술 샘플에서 높은 백분율의 PD1+ CAR+ 및 LAG3+ 또는 TIM3+ T 세포는 CAR-발현 세포 요법 (예를 들어, BCMACAR 요법)에 대한 대상체 반응의 불량한 예후 예측인자이다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 반응자 (예를 들어, 완전 또는 부분 반응자)는 하기 프로파일 중 1, 2, 3종 또는 그 초과 (또는 모두)를 갖는다:
(i) 참고 값, 예를 들어 CD27+ 면역 이펙터 세포의 비-반응자 수와 비교하여 보다 큰 수의 CD27+ 면역 이펙터 세포를 가짐;
(ii) 참고 값, 예를 들어 CD8+ T 세포의 비-반응자 수와 비교하여 보다 큰 수의 CD8+ T 세포를 가짐;
(iii) 참고 값, 예를 들어 1종 이상의 체크포인트 억제제를 발현하는 세포의 비-반응자 수와 비교하여 1종 이상의 체크포인트 억제제, 예를 들어 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, 또는 KLRG-1, 또는 조합으로부터 선택된 체크포인트 억제제를 발현하는 보다 적은 수의 면역 세포를 가짐; 또는
(iv) 참고 값, 예를 들어 휴지기 TEFF 세포, 휴지기 TREG 세포, 나이브 CD4 세포, 비자극 기억 세포 또는 초기 기억 T 세포의 비-반응자 수와 비교하여 휴지기 TEFF 세포, 휴지기 TREG 세포, 나이브 CD4 세포, 비자극 기억 세포 또는 초기 기억 T 세포 또는 그의 조합 중 1, 2, 3, 4종 또는 그 초과 (모두)의 보다 큰 수를 가짐.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, (vi)의 시토카인 수준 또는 활성은 시토카인 CCL20/MIP3a, IL17A, IL6, GM-CSF, IFNγ, IL10, IL13, IL2, IL21, IL4, IL5, IL9 또는 TNFα, 또는 그의 조합 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8종 또는 그 초과 (또는 모두)로부터 선택된다. 시토카인은 IL-17a, CCL20, IL2, IL6, 또는 TNFa 중 1, 2, 3, 4종 또는 그 초과 (모두)로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 시토카인의 증가된 수준 또는 활성은 IL-17a 및 CCL20 중 1종 또는 둘 다로부터 선택되고, 이는 증가된 반응성 또는 감소된 재발을 나타낸다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, (vii)에서 15% 이상의 형질도입 효율은 증가된 반응성 또는 감소된 재발을 나타낸다.
본원에 개시된 임의의 방법의 일부 실시양태에서, (vii)에서 15% 미만의 형질도입 효율은 감소된 반응성 또는 증가된 재발을 나타낸다.
실시양태에서, 본원의 방법에 의해 확인된 반응자, 비-반응자, 재발자 또는 비-재발자는 임상 기준에 따라 추가로 평가될 수 있다. 예를 들어, 완전 반응자는 치료에 대해 완전 반응, 예를 들어 완전 완화를 나타낸 질환, 예를 들어 암을 갖거나, 또는 그를 갖는 대상체로 확인된다. 완전 반응은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 NCCN 가이드라인?, 또는 문헌 [Cheson et al., J Clin Oncol 17:1244 (1999) 및 Cheson et al., "Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma", J Clin Oncol 25:579-586 (2007)] (이들 둘 다는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 사용하여 확인될 수 있다. 부분 반응자는 치료에 대해 부분 반응, 예를 들어 부분 완화를 나타낸 질환, 예를 들어 암을 갖거나, 또는 그를 갖는 대상체로 확인된다. 부분 반응은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 NCCN 가이드라인? 또는 체손(Cheson) 기준을 사용하여 확인될 수 있다. 비-반응자는 치료에 대해 반응을 나타내지 않는 질환, 예를 들어 암을 갖거나, 또는 그를 갖는 대상체로 확인되며, 예를 들어 환자는 안정 질환 또는 진행성 질환을 갖는다. 비-반응자는, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 NCCN 가이드라인? 또는 체손 기준을 사용하여 확인될 수 있다.
대안적으로 또는 본원에 개시된 방법과 조합하여, 상기 값에 대해 반응성인 것에 하기 중 1, 2, 3, 4종 또는 그 초과를 수행한다:
예를 들어 반응자 또는 비-재발자에게 CAR-발현 세포 요법의 투여;
CAR-발현 세포 요법의 변경된 용량의 투여;
CAR-발현 세포 요법의 스케줄 또는 시간 경과의 변경;
예를 들어 비-반응자 또는 부분 반응자에게 CAR-발현 세포 요법과 조합하여 추가의 작용제, 예를 들어 체크포인트 억제제, 예를 들어 본원에 기재된 체크포인트 억제제의 투여;
비-반응자 또는 부분 반응자에게 CAR-발현 세포 요법을 사용한 처리 전 대상체에서 더 어린 T 세포의 수를 증가시키는 요법의 투여;
예를 들어 비-반응자 또는 부분 반응자로서 확인된 대상체에 대해 CAR-발현 세포 요법의 제조 방법의 변형, 예를 들어 CAR을 코딩하는 핵산을 도입하기 전 더 어린 T 세포의 풍부화, 또는 형질도입 효율의 증가;
예를 들어 비-반응자 또는 부분 반응자 또는 재발자에 대해 대체 요법의 투여; 또는
대상체가 비-반응자 또는 재발자이거나 또는 그러한 것으로 확인된 경우에, 예를 들어 CD25 고갈, 시클로포스파미드, 항-GITR 항체 또는 그의 조합의 투여 중 1종 이상에 의해 TREG 세포 집단 및/또는 TREG 유전자 서명의 감소.
특정 실시양태에서, 대상체는 항-GITR 항체에 의해 사전-처리된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 주입 또는 재-주입 전 항-GITR 항체에 의해 처리된다.
생체중합체 전달 방법
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 1종 이상의 CAR-발현 세포는 생체중합체 스캐폴드, 예를 들어 생체중합체 이식물을 통해 대상체에게 투여 또는 전달될 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 본원에 기재된 CAR-발현 세포의 전달, 확장, 및/또는 분산을 지지 또는 증진시킬 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 자연 발생적 또는 합성적일 수 있는 생체적합성 (예를 들어, 염증 또는 면역 반응을 실질적으로 유도하지 않음) 및/또는 생분해성 중합체를 포함한다.
적합한 생체중합체의 예는 단독의, 또는 임의의 다른 중합체 조성물과 임의의 농도 및 임의의 비로 조합된 한천, 아가로스, 알기네이트, 알기네이트/칼슘 포스페이트 시멘트 (CPC), 베타-갈락토시다제 (β-GAL), (1,2,3,4,6-펜타아세틸 a-D-갈락토스), 셀룰로스, 키틴, 키토산, 콜라겐, 엘라스틴, 젤라틴, 히알루론산 콜라겐, 히드록시아파타이트, 폴리(3-히드록시부티레이트-코-3-히드록시-헥사노에이트) (PHBHHx), 폴리(락티드), 폴리(카프로락톤) (PCL), 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG), 폴리에틸렌 옥시드 (PEO), 폴리(락트산-코-글리콜산) (PLGA), 폴리프로필렌 옥시드 (PPO), 폴리비닐 알콜 (PVA), 실크, 대두 단백질, 및 대두 단백질 단리물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 생체중합체는 부착- 또는 이동-촉진 분자, 예를 들어 림프구의 콜라겐 수용체에 결합하는 콜라겐-모방체 펩티드, 및/또는 자극 분자에 의해 증대 또는 변형되어, 전달되는 세포의 전달, 확장, 또는 기능, 예를 들어 항암 활성을 증진시킬 수 있다. 생체중합체 스캐폴드는 주사가능한, 예를 들어 겔 또는 반-고체, 또는 고체 조성물일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현 세포는 대상체에게의 전달 전에 생체중합체 스캐폴드 상에 시딩될 수 있다. 실시양태에서, 생체중합체 스캐폴드는, 예를 들어 스캐폴드의 생체중합체에 혼입되거나 접합된, CAR-발현 세포의 활성을 증진시키는 본원에 기재된 1종 이상의 추가의 치료제 (예를 들어, 또 다른 CAR-발현 세포, 항체, 또는 소분자) 또는 작용제를 추가로 포함한다. 실시양태에서, 생체중합체 스캐폴드는 예를 들어 종양내로 주사되거나, 또는 종양에 또는 항종양 효과를 매개하기에 충분히 종양에 근접하여 외과적으로 이식된다. 생체중합체 조성물 및 그의 전달 방법의 추가의 예가 문헌 [Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101]; 및 WO2014/110591에 기재되어 있다.
제약 조성물 및 치료
본 발명의 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 CAR-발현 세포, 예를 들어 복수의 CAR-발현 세포를 1종 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 상기 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아주반트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 한 측면에서 정맥내 투여를 위해 제제화된다.
본 발명의 제약 조성물은 치료할 (또는 예방할) 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양 및 빈도는 환자의 상태, 환자의 질환의 종류 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 것이다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 예를 들어 내독소, 미코플라스마, 복제 적격 렌티바이러스 (RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드, 마우스 항체, 풀링된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 박테리아 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택된 오염물이 실질적으로 없고, 예를 들어 검출가능한 수준의 오염물이 없다. 한 실시양태에서, 박테리아는 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 및 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 군 A로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이다.
"면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양-억제 유효량", 또는 "치료량"이 제시되는 경우에, 투여할 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자 (대상체)의 상태에서의 개별 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 본원에 기재된 T 세포를 포함하는 제약 조성물은 104 내지 109개 세포/kg 체중, 일부 경우에 105 내지 106개 세포/kg 체중 (상기 범위 내의 모든 정수 값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있는 것으로 일반적으로 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 투여량으로 다중 횟수로 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에서 통상적으로 공지되어 있는 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다 (예를 들어 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조).
특정 측면에서, 활성화된 T 세포를 대상체에게 투여한 후, 후속적으로 혈액을 재채취하고 (또는 분리반출술을 수행하고), 본 발명에 따라 그로부터 T 세포를 활성화하고, 환자에게 이들 활성화되고 확장된 T 세포를 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 과정은 수주마다 다중 횟수로 수행될 수 있다. 특정 측면에서, T 세포는 10cc 내지 400cc의 혈액 채취물로부터 활성화될 수 있다. 특정 측면에서, T 세포는 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc 또는 100cc의 혈액 채취물로부터 활성화된다.
대상 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식(implantation) 또는 이식(transplantation)에 의한 것을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 경동맥으로, 피하로, 피내로, 종양내로, 결절내로, 수질내로, 근육내로, 정맥내 (i.v.) 주사에 의해, 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 피부내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 한 측면에서, 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다. CAR-발현 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위 내로 직접 주사될 수 있다.
특정한 예시적인 측면에서, 대상체는 백혈구분리반출술을 거칠 수 있고, 여기서 백혈구는 수집, 풍부화, 또는 생체외 고갈되어 관심 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 선택하고/거나 단리한다. 이들 면역 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 단리물은 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 확장되고, 본 발명의 1종 이상의 CAR 구축물이 도입되어, 본 발명의 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR T 세포 또는 CAR-발현 NK 세포)를 생성할 수 있도록 처리될 수 있다. 그를 필요로 하는 대상체는 후속적으로 고용량 화학요법에 이어 말초 혈액 줄기 세포 이식에 의하는 표준 치료를 거칠 수 있다. 특정 측면에서, 이식 이후에 또는 이식과 공동으로, 대상체는 본 발명의 확장된 CAR-발현 세포 (예를 들어, CAR T 세포 또는 NK 세포)의 주입을 받는다. 추가의 측면에서, 확장된 세포는 수술 전에 또는 수술 이후에 투여된다.
실시양태에서, 림프구고갈은 대상체에 대해, 예를 들어 본원에 기재된 CAR, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA-결합 CAR을 발현하는 1종 이상의 세포를 투여하기 전에 수행된다. 실시양태에서, 림프구고갈은 멜팔란, 시톡산, 시클로포스파미드 및 플루다라빈 중 1종 이상을 투여하는 것을 포함한다.
환자에게 투여할 상기 치료의 투여량은 치료되는 상태의 정확한 속성 및 치료의 수용자에 따라 달라질 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 스케일링은 관련 기술분야에서 허용되는 실시에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 캄파트에 대한 용량은 통상적으로 1 내지 30일의 기간 동안 매일 투여되는, 성인 환자의 경우에 1 내지 약 100 mg 범위 내일 것이다. 바람직한 1일 용량은 1일에 1 내지 10 mg이지만, 일부 경우에 1일에 40 mg까지의 보다 많은 용량이 사용될 수 있다 (미국 특허 번호 6,120,766에 기재됨).
한 실시양태에서, CAR은 예를 들어 시험관내 전사를 사용하여 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포) 내로 도입되고, 대상체 (예를 들어, 인간)는 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)의 초기 투여 및 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)의 1회 이상의 후속 투여를 제공받고, 여기서 1회 이상의 후속 투여는 이전 투여 후 15일 미만에, 예를 들어 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2일에 투여된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)의 1회 초과의 투여는 1주에 대상체 (예를 들어, 인간)에게 투여되고, 예를 들어 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)의 2, 3 또는 4회 투여가 1주에 투여된다. 한 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)는 1주에 1회 초과의 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)의 투여 (예를 들어, 1주에 2, 3 또는 4회 투여) (본원에서 사이클로도 지칭됨)를 제공받고, 이어서 어떠한 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포) 투여도 없는 1주에 이어서, CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)의 1회 이상의 추가 투여 (예를 들어, 1주에 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)의 1회 초과의 투여)가 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)는 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)의 1회 초과의 사이클을 제공받고, 각각의 사이클 사이의 시간은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3일 미만이다. 한 실시양태에서, CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 1주에 3회 투여 동안 격일로 투여된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CAR 면역 이펙터 세포 (예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 초과 동안 투여된다.
한 측면에서, BCMA CAR-발현 세포 (예를 들어, BCMA CART 또는 BCMA CAR-발현 NK 세포)는 렌티바이러스 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스를 사용하여 생성된다. 그러한 방식으로 생성된 CAR-발현 세포 (예를 들어 CART 또는 CAR-발현 NK 세포)는 안정한 CAR 발현을 가질 것이다.
한 측면에서, CAR-발현 세포, 예를 들어 CART는 바이러스 벡터, 예컨대 감마레트로바이러스 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 감마레트로바이러스 벡터를 사용하여 생성된다. 이들 벡터를 사용하여 생성된 CART는 안정한 CAR 발현을 갖는다.
한 측면에서, CAR-발현 세포 (예를 들어 CART 또는 CAR-발현 NK 세포)는 형질도입 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15일 동안 CAR 벡터를 일시적으로 발현한다. CAR의 일시적 발현은 RNA CAR 벡터 전달에 의해 실행될 수 있다. 한 측면에서, CAR RNA는 전기천공에 의해 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포 내로 형질도입된다.
일시적으로 발현하는 CAR-발현 세포 (예를 들어, CART 또는 CAR-발현 NK 세포)를 사용하여 (특히, 뮤린 scFv 보유 CAR-발현 세포 (예를 들어, CART 또는 CAR-발현 NK 세포)에 의해) 치료받는 환자에서 일어날 수 있는 잠재적인 이슈는 다중 치료 후 아나필락시스이다.
이러한 이론에 얽매이지는 않지만, 이러한 아나필락시스 반응은 체액성 항-CAR 반응, 즉, 항-IgE 이소형을 갖는 항-CAR 항체를 발생시키는 환자에 의해 유발될 수 있는 것으로 여겨진다. 환자의 항체 생산 세포는 항원에의 노출에서 10 내지 14일 중단이 있을 때 IgG 이소형 (아나필락시스를 유발하지 않음)으로부터 IgE 이소형으로 부류 전환을 거치는 것으로 생각된다.
환자가 일시적 CAR 요법 (예컨대, RNA 형질도입에 의해 생성된 것)의 과정 동안 항-CAR 항체 반응을 생성할 위험이 크면, CAR-발현 세포 (예를 들어, CART 또는 CAR-발현 NK 세포) 주입 중단은 10 내지 14일 초과로 지속되어서는 안된다.
실시예
본 발명은 하기 실험 실시예를 참조하여 추가로 상세히 기재된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되고, 달리 명시되지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 어떠한 방식으로도 하기 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되고, 대신에 본원에 제공된 교시의 결과로서 분명해지는 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 설명 없이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 선행하는 상세한 설명 및 하기 예시적인 실시예를 사용하여, 본 발명의 화합물을 제조 및 이용하고 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 여겨진다. 하기 작업 실시예는 본 발명의 다양한 측면을 구체적으로 나타내고, 나머지 개시내용을 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: BCMA는 골수종 세포주 및 원발성 샘플에서 발현된다
정량적 PCR에 의한 골수종 세포주에서의 BCMA 발현의 분석
인간 암의 16종의 세포주를 정량적 RT-PCR에 의해 BCMA RNA 발현에 대해 스크리닝하였다. RNA를 RNA퀘오스(RNAqueos)-4PCR 키트 (암비온(Ambion), AM-1914)로 추출하고, RT-qPCR (바이오라드(BioRad), 170-8841) 동안 iScript 역전사 슈퍼믹스를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 상대 BCMA cDNA 카피를 상대 qPCR (qPCR)에 의해 정규화를 위한 ABI 택맨 BCMA-특이적 프라이머 및 프로브 세트 (ABI, Hs03045080, 로트:1139777); 택맨 GUSB (ABI, Hs99999908_M1, 로트: 1093869) 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 정량화하였다.
qPCR의 분석은 시험된 모든 MM 세포주 (U266, NCI H929 및 RPMI 8226)가 BCMA를 발현한다는 것을 제시하였다. BCMA는 또한 BJAB 및 LCL 세포 (B-세포 림프모구성 세포주) 및 CEM 세포 (T-림프모구성 세포주)에서 검출되었다. 어떠한 다른 비-MM 세포주도 BCMA의 검출가능한 발현을 나타내지 않았다. 이러한 RNA 분석은 평가에 사용되는 양성 BCMA 발현 세포주의 선택을 위한 유동 세포측정법에 의한 단백질 검출과 상보적이다. 상세한 결과를 도 1a에 제공한다.
환자로부터의 형질 세포 및 상이한 다발성 골수종 샘플에서의 BCMA 발현의 RNA 분석에 의한 비교를 도 1b에 제공한다.
유동 세포측정법에 의한 다발성 골수종 세포주 및 원발성 샘플에서의 BCMA 발현의 분석
다발성 골수종 (MM) 세포주 U266, NCI H929 또는 RPMI 8226 또는 MM 환자로부터의 원발성 샘플 (PB 또는 BM)을 인간 BCMA/TNFRSF17 피코에리트린 친화도 정제된 PAb, 염소 IgG (R&D, FAB193P)로 염색하였다. 다발성 골수종 환자로부터의 원발성 샘플을 또한 라이브/데드 염료 (라이프테크놀로지스(LifeTechnologies), L34960), CD45-BV421 (바이오레전드(Biolegend), 304032), CD38-APCeF780 (이바이오사이언스(eBioscience) 47-0389-42), CD138-APC (이바이오사이언스 17-1389-42), CD19-PECY7 (이바이오사이언스, E10328-1632), 람다 쇄-PerCP-eF710 (이바이오사이언스 46-9990-42) 및 카파 경쇄 (이바이오사이언스, 11-9970-42)로 염색하였다. 염색된 샘플로부터의 데이터를 BD 포르테사(BD Fortessa) 세포측정기를 사용하여 수집하였다. 유동 세포측정 분석을 플루우조 v10 (트리 스타 인크(Tree Star Inc))을 사용하여 수행하였다.
BCMA는 도 2a, 2b, 및 2c에 제시된 바와 같이 모든 3종의 MM 세포주의 표면 상에서 검출되었다. 또한, BCMA는 분석된 대부분의 MM 환자의 (10명 중 9명) 대부분의 클론 (카파 또는 람다 국한) 형질 세포 상에서 균질하게 발현되었다 (도 2d 및 2e). 이들 결과는 MM에서 표적으로서 BCMA의 관련성에 대한 강력한 지지를 제공한다.
정상 말초 혈액 세포, CD3/CD28 확장된 T 세포 및 골수 줄기 세포에서의 BCMA 발현의 유동 세포측정 분석
정상 조직 내 및 T 세포 상에서의 BCMA의 가능한 오프-타겟 발현을 배제하기 위해, 자원한 건강한 공여자로부터의 2종의 골수 (BM) 및 말초 혈액 (PB) 시편에서의 BCMA 발현을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 피콜-파크(Ficoll-Paque) (지이 헬스케어(GE healthcare)) 구배 분리를 통해 단핵 세포를 수득하였다. BM 세포를 라이브/데드 염료 (라이프테크놀로지스, L34960)로 표시한 다음, CD34-APC (이바이오사이언스, 17-0349-42), CD38-PECY7(이바이오사이언스, 25-0389-42), 인간 조혈 계열 마커 믹스-FITC (이바이오사이언스, 22-7778-72), CD45RA-APC-eF780 (이바이오사이언스, 47-0458-42, CD90-PerCPCy5.5 (이바이오사이언스, 45-0909-41), CD10-BV421 (바이오레전드, 312218) 및 BCMA-PE (R&D, FAB193P)에 대한 모노클로날 항체로 염색하였다. 신선한 PB 세포를 기준선 및 CD3/CD28 비드에 의한 자극 및 확장 후에 염색하였다. PB를 CD14-V500 (BD, 561391), CD45-BV421 (바이오레전드, 304032), CD3-AF700 (56-0038-42), CD19-PECY7 (이바이오사이언스, E10328-1632), 및 BCMA-PE (R&D, FAB193P)에 대한 모노클로날 항체로 염색하였다. 세포를 2회 세척하고, BD 포르테사 세포측정기에서 염색 데이터를 획득하였다. 유동 세포측정 분석을 플루우조 v10 (트리 스타 인크)을 사용하여 수행하였다.
PBMC 상에서 BCMA 발현의 어떠한 증거도 관찰되지 않았다. 중요한 것으로, T 세포는 확장 동안 BCMA에 대해 음성으로 남아있었다 (도 3a). BM 내 상이한 줄기 세포 하위세트의 분석은 미성숙, 계열 음성 CD34 양성 줄기 세포 상에서는 BCMA의 발현이 전혀 없음을 밝혀내었다. 특히, 공통 림프구 전구세포 및 조혈 줄기 세포는 음성이었다 (도 3b).
면역조직화학에 의한 정상 조직에서의 BCMA 발현의 분석
면역조직화학을 위한 3종의 상업적으로 입수가능한 항체 (노부스(Novus), 시그마(Sigma))를 선택하고, 파라핀-고정된 정상 비장 조직에서 적정하였다. 27종의 건강한 인간 조직을 포함하는 조직 마이크로 어레이 (TMA)를 면역조직화학에 의해 염색하였다.
모든 3종의 항체는 림프절, 비장 및 편도 내 정상 형질 세포에 대해 양성 염색을 제시한 반면에, 시험된 정상 폐, 췌장 및 갑상선은 음성을 제시하였다. 입수가능한 항체의 폴리클로날 속성으로 인해 비-특이적일 가능성이 있는 염색이 하기 기관에서 관찰되었다: 위, 타액선, 신장, 부신, 소뇌, 심장 및 충수. 선택된 결과를 도 4a-4e에 제시하고, 표 11에 요약한다.
<표 11> 정상 조직 내 면역조직화학 염색에 의한 BCMA 발현
이들 결과는 이들 조직에서의 BCMA 발현의 결여를 확인하기 위한, 특히 RNA스콥(RNAscope) 계내 혼성화를 사용한 발현의 추가의 분석으로 이어졌다. 선택된 결과를 도 4f에 제시한다.
실시예 2: 인간화 항-BCMA scFv를 함유하는 CAR의 시험관내 평가
인간화 마우스 항-BCMA 항체로부터 생성된 BCMA CAR 구축물
PCT 공개 WO 2012/163805 (그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 VL 및 VH 서열을 사용하여 4종의 구분되는 항-BCMA CAR 구축물을 설계하였다. 항-BCMA CAR을 생성하기 위해, VH 및 VL 서열을 합성하고, [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser] x 4 링커 (서열식별번호: 27)로 연결하여 VH가 VL을 선행하는 (H2L, 서열식별번호: 255) 또는 VL이 VH를 선행하는 (L2H, 서열식별번호: 257) 2개의 단일-쇄 가변 단편 (scFv)을 생성하였다. 또한 CD8 리더를 합성하고, XbaI에 대한 BamHI 부위 제한 부위와 함께 각각의 scFv의 5' 말단에 융합시켰고, BspE1을 합성 시점에 각각 5' 및 3' 말단에 포함시켜 힌지 및 4-1BB 및 CD3z 세포질 도메인을 갖는 CD8TM 영역을 함유하는 pTRPE 렌티바이러스 벡터 내로의 CD8 리더-scFv의 클로닝을 용이하게 하였다. 하나는 인간 CD8 힌지를 함유하고 다른 것은 인간 IgG4 힌지를 함유하는 2개의 개별 CAR 백본 구축물을 클로닝에 사용하여 도 5에 개략적으로 제시한, pBCMA 1, pBCMA 2, pBCMA 3, 및 pBCMA 4로 지정된 4종의 항-BCMA CAR 구축물을 생성하였다. 감염성 렌티바이러스 벡터 상청액을 생산하기 위해, 리포펙타민 2000 (인비트로젠(Invitrogen))을 사용하여 293-T 세포를 4종의 BCMA CAR 구축물 중 어느 하나를 갖는 하기 플라스미드로 형질감염시켰다: pTRP-VSV-G (수포성 구내염 바이러스 (VSV-G) 외피를 코딩함), pTRP gag/pol (gag 및 pol을 코딩함) 및 pTRP-Rev.
VH가 VL을 선행하는 인간화 항-BCMA scFv (H2L, 예를 들어 pBCMA 2 및 pBCMA 4)의 핵산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00132
Vh가 VL을 선행하는 인간화 항-BCMA scFv (H2L, 예를 들어 pBCMA 2 및 pBCMA 4)에 대해 상응하는 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00133
VL이 VH를 선행하는 인간화 항-BCMA scFv (L2H, 예를 들어 pBCMA1 및 pBCMA3)의 핵산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00134
VL이 VH를 선행하는 인간화 항-BCMA scFv (L2H, 예를 들어 pBCMA1 및 pBCMA3)의 상응하는 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure pct00135
인간화 항-BCMA scFv를 함유하는 이들 pBCMA-CAR을 하기 상세한 실험 및 실시예 3에 사용하였다.
T 세포 상에서의 BCMA-CAR의 효율적 발현
건강한 공여자로부터의 신선한 단리된 인간 T 세포를 pBCMA 1 내지 4 CAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터 상청액으로 형질도입하고, 항-BCMA CAR 발현을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 간략하게, T 세포를 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 배양하고, 항-CD3/항-CD28 디나비즈 (인비트로젠)로 자극하였다. 자극 24시간 후, T 세포를 4종의 상이한 pBCMA CAR 렌티바이러스 벡터 상청액으로 형질도입하였다. 항-메소텔린 CAR (SS1) 벡터로 형질도입된 T 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다. 모의-형질도입된 T 세포 (NTD)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 렌티바이러스 형질도입 4-6일 후, T 세포를 비오티닐화 단백질 L 항체로 염색한 다음 스트렙타비딘 FITC (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)) 또는 비오틴 염소-항 마우스로 염색하고, CAR 발현을 유동 세포측정법 (FACS 칼리버, BD)에 의해 평가하였다. 유동 세포측정 분석을 플루우조 (트리 스타 인크)를 사용하여 수행하였다.
형질도입 후 pBCMA CAR이 도 6에 제시된 바와 같이 형질도입된 T 세포의 세포 표면 상에서 효율적으로 발현된다는 것이 관찰되었다.
항-BCMA CAR-발현 T 세포 (BCMA CART)로부터의 시토카인 생산
인간 BCMA (K562-BCMA)를 이소 발현하는 K562 세포를, 진코포에이아(GeneCopoeia)에 의해 공급된 벡터를 사용한 렌티바이러스 형질도입에 이은 퓨로마이신 선택에 의해 생성하였다. K562-BCMA 특이적 표적 세포를 시험관내 이용하여 pBCMA 1-4 CAR-형질도입된 T 세포로부터의 세포독성 및 시토카인 생산을 평가하였다. 항-pBCMA CAR T 세포 또는 대조군 T 세포를 대수기 성장 말미까지 확장시키고, 후속해서 K562-BCMA 특이적 표적 세포, 양성 대조군으로서 K562-메소텔린 표적 세포 또는 음성 대조군으로서 표적 세포 없이, 이펙터 세포 대 표적 세포 3 대 1 비로 16시간 동안 공동-배양하였다. 배양물 상청액을 수거하고, 제조업체의 지침 (R&D)에 따라 특이적 ELISA에 의해 IFN-감마 및 IL-2 농도를 측정하였다.
모든 4종의 항-pBCMA CAR을 발현하는 T 세포는, 도 7a 및 7b에 제시된 바와 같이, BCMA-발현 표적 세포와 공동-배양한 경우에 유사한 수준의 IFN-감마 및 IL-2를 생산하였지만, BCMA-음성 표적 세포와 공동-배양한 경우에는 그렇지 않았다.
골수종 세포주에 대한 BCMA CART의 세포독성 활성
pBCMA CAR T 세포가 BCMA-발현 표적 세포를 사멸시키는 능력을 51Cr 방출-검정을 사용하여 평가하였다. 간략하게, 표적 MM 세포를 51Cr (중크로뮴산나트륨 염)로 표지하고, 세척하고, 이펙터 pBCMA CAR T 세포와 상이한 이펙터/표적 비로 공동-배양하였다. 4-시간째에 상청액을 수집하고, 96 웰 루마플레이트 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer))에 넣었다. 표지된 표적 세포로부터 방출된 51Cr의 양을 액체 섬광 카운터 (마이크로베타 트리룩스, 퍼킨 엘머) 상에서 측정하였다. 배지 단독 중에서 또는 1% SDS와 함께 인큐베이션된 표적 세포를 사용하여 자발적 (S) 또는 최대 (M) 51Cr 방출을 결정하였다. 특이적 용해의 백분율을 하기와 같이 계산하였다: 100x (cpm 실험 방출- cpm S 방출)/ (cpm M 방출- cpm S 방출).
모든 4종의 pBCMA-CAR-형질도입된 T 세포는 도 8a, 8b, 8c, 및 8d에 제시된 바와 같이 K562-BCMA 세포 및 BCMA-발현 다발성 골수종 세포주의 용해를 유도할 수 있었고, BCMA 음성 세포주에 대해서는 거의 활성을 갖지 않았다. CD8 힌지를 갖는 pBCMA-CAR (pBCMA 3 및 4)은 IgG4 힌지를 함유하는 pBCMA CAR과 비교하여 더 큰 세포독성을 나타내었고, 이는 그러한 힌지가 최적 기능을 위해 CAR 설계에서 중요한 인자라는 것을 시사한다.
실시예 3: 다발성 골수종에 대한 pBCMA-CART의 생체내 평가
pBCMA 3 및 pBCMA 4 CAR-변형된 T 세포의 증진된 기능을 지지하는 시험관내 데이터에 기초하여, 이들 CART의 항종양 활성을 RPMI 8226 세포주를 사용하여 다발성 골수종의 전임상 동물 모델에서 평가하였다. 생물발광 생체내 영상화 (IVIS) 및 리빙 이미지 소프트웨어 (퍼킨 엘머)에 의해 종양 진행을 추적하기 위해 RPMI 8226 세포를 방아벌레 녹색 루시페라제 (CB-G Luc+)를 발현하도록 조작하였다. CB-G Luc+의 주사 4주 후, RPMI 8226 세포를 NSG 수용자 내로 IV 주사하고, pBCMA 3 CAR, pBCMA 4 CAR, CD19 CAR (인간 CD8 힌지, 4-1BB 및 CD3z 세포질 도메인을 갖는 FMC63 항-CD19 scFv) 또는 SS1 CAR (인간 CD8 힌지, 4-1BB 및 CD3z 세포질 도메인을 갖는 SS1 항-메소텔린 scFv)을 발현하는 T 세포를 IV 주사하고, 광학 영상화 뿐만 아니라 질환의 임상 징후의 출현에 의해 (하기 표 12) 종양 부담을 평가하였다. 점수화는 다음과 같이 수행하였다: 1- 임상 징후가 전혀 없음; 2- 약간의 보행 변화/약간의 종양 덩이; 3- 감소된 이동성/종양 덩이/여전히 활동함; 4- 뒷다리 마비/큰 종양 덩이/종점; 및 5- 완전한 사지 마비.
<표 12> 처리 군 및 임상 점수화
Figure pct00136
pBCMA-3 및 pBCMA 4 CAR 중 어느 하나를 발현하는 T 세포는 도 9a 및 9b에 제시된 바와 같이 메소텔린 (SS1로 지정됨) 또는 CD19를 표적화하는 대조군 T 세포와 비교하여 RPMI 8226을 보유하는 마우스의 종양 부담에서의 유의한 감소 뿐만 아니라 개선된 임상 질환 활성을 유도하였다.
실시예 2 및 3에 기재된 실험은 추가의 CAR 구축물을 위한 인간 scFv 결합 도메인을 확인하기 위한 근거를 제공하였고, 이는 실시예 4-7에서 기재되고 평가된다.
실시예 4: 인간 항-BCMA CAR 구축물의 생성
CAR 구축물을 위한 인간 BCMA-특이적 scFv를 3라운드의 비드-기반 바이오-BCMA 패닝에 의해 확인하였다. 부문 1에서, SBAL-1Sk 파지 라이브러리 (8.4E13)를 사용하였다. 부문 2에서, SBAL-3Sk(G1+G2+G4+G5) 파지 라이브러리 (1E13)를 사용하였다. 파지 용해물을 BCMA 반응성에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 319개의 양성 히트가 확인되었고, 이는 135개의 고유한 서열을 나타낸다. 파지 서열을 이. 콜라이(E. coli)에서 발현될 수 있는 가용성 scFv로 전환시켰다. 다음으로 이. 콜라이 용해물을 ELISA에 의해 스크리닝하고, 주변세포질을 FACs에 의해 스크니링하였다. 15개의 히트가 FACs 분석에 의해 확인되었다. 다음으로, scFv를 이. 콜라이로부터 정제하고, 정제된 scFv를 FACs에 의해 시험하였다. 15종의 scFv가 확인되었고, BCMA-1, BCMA-2, BCMA-3, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-11, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, 및 BCMA-15로 지정하였다. 인간 항-BCMA scFv 단편의 서열 (서열식별번호: 39-52)을 표 1에 제공한다 (명칭 지정이 표 2에 제공됨). 전장 BCMA CAR 구축물 (서열식별번호: 99-113)은 인간 scFv 단편 (서열식별번호: 39-52)을 상세한 설명에 제시된 추가의 서열, 예를 들어 리더, CD8 힌지, CD8 막횡단, 4-1BB 세포내 도메인, CD27 세포내 도메인, CD28 세포내 도메인, ICOS 도메인, CD3제타 도메인 (돌연변이체), 인간 CD3제타 도메인, IgG4 힌지, Gly/Ser 서열 및/또는 폴리(A) 서열과 조합하여 사용하여 생성하였다.
이어서, CAR scFv 단편을 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝하여, 발현을 위해 EF1 알파 프로모터 (서열식별번호: 11)를 사용하여 단일 코딩 프레임 내에 전장 CAR 구축물을 생성하였다.
BCMA scFv 도메인 및 BCMA CAR 분자의 아미노산 및 핵산 서열이 상세한 설명에서 표 1에 제공되어 있다. 상세한 설명에서의 표 2는 또한 표 1에 열거된 DNA ID 번호와 관련하여 BCMA CAR 구축물에 대한 별칭을 지정한다.
추가의 도구 BCMA CAR 구축물을 또한 PCT 공개 WO2012/0163805 (그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)로부터의 VH 및 VL 서열을 사용하여 생성하였고, 이는 실시예 2 및 3에 기재된 pBCMA3 및 pBCMA4 CAR로부터의 결과에 기초하였다. 도구 BCMA 구축물 (BCMA-3NP 및 BCMA-4NP)의 개략도를 도 10a에 제시한다. 2종의 구축물은 VH 및 VL 쇄의 배향에서 상이하다 (도 10b). 도구 BCMA CAR 구축물 및 그의 상응하는 DNA ID를 하기 제시한다.
<표 3> 도구 CAR 구축물 ID
Figure pct00137
추가의 BCMA CAR 구축물을 또한 상세한 설명에서의 표 16에서 확인되는 VH 및 VL 서열을 사용하여 생성할 수 있다. VH 및 VL 도메인 및 링커 서열을 포함하는 예시적인 scFv 도메인, 및 전장 CAR의 아미노산 서열이 또한 표 16에서 확인된다.
BCMA CAR 구축물의 생산 및 그에 대한 바이러스 역가의 계산
렌티바이러스 상청액을 scFv 파지 스크리닝으로부터 수득한 15종의 BCMA-특이적 CAR 구축물로부터 생성하였다 (표 2). 2종의 BCMA 도구 CAR 구축물, BCMA-3NP 및 BCMA-4NP에 대한 렌티바이러스 상청액을 또한 생성하였다. 본 실시예에 기재된 도구 구축물은 실시예 2 및 3에서 이전에 기재된 pBCMA3 및 pBCMA4 구축물을 기초로 하였다.
렌티바이러스 상청액을 생성하기 위해, 렌티X-293T 세포를 제0일에 시딩하고, 제1일에 리포펙타민 2000 형질감염 시약 (라이프 테크놀로지스)으로 형질감염시켰다. 각각의 구축물에 대해, 사용된 플라스미드 DNA는 하기와 같다: pRSV.REV (Rev 발현 플라스미드), pMDLg/p.RRE (Gag/Pol 발현 플라스미드), pVSV-G (VSV 당단백질 발현 플라스미드), 및 CAR 전달 벡터. 형질감염 혼합물을 제2일에 신선한 배지로 대체하고, 제3일 및 제4일에 바이러스 상청액을 수집하였다.
렌티-X 농축 시약 (클론테크(Clontech))을 사용하여 바이러스 상청액을 농축시키고, 생성된 펠릿을 성장 배지 중에 원래 부피의 1/10 내지 1/100로 재현탁시켰다. 농축된 바이러스 상청액을 분취하고, -80℃에서 저장하였다.
바이러스 역가의 계산은 SupT1 세포를 형질도입하고 CAR 발현을 평가하는 것에 의해 결정되었다. SupT1 세포를 제1일에 1:300의 농도에서 출발하여 바이러스 상청액의 3-배 연속 희석 시리즈로 형질도입하였다. CAR 발현을 제5일에 BCMA-Fc 항원 (알앤디 시스템즈(R&D Systems)) 및 비오틴-단백질 L 시약 (진스크립트(GenScript))을 사용하여 평가하였다. 바이러스 역가를 하기 식에 따라 계산하였다:
(% CAR+) x (# SupT1 세포) / (바이러스의 양 (ml)) x (희석)
평균 바이러스 역가를 희석 점으로부터 1 및 20% CAR-양성 사이에서 선형 범위로 계산하였다. BCMA CAR 클론에 대한 역가 계산은 표 4에 제시된다.
<표 4> BCMA-Fc 또는 단백질 L에 의해 측정된 바와 같은 BCMA-표적화 CAR로 형질도입된 렌티X-293T 세포로부터의 렌티바이러스 상청액의 역가
Figure pct00138
모든 BCMA CAR 클론이 BCMA-Fc 항원에 의해 검출되었지만, 비오틴-단백질 L에 의하면 수많은 클론 (BCMA-1, BCMA-6, BCMA-11)에 대해 검출이 더 약했다. BCMA-Fc 검출에 기초한 역가를 사용하여 1차 T 세포에서의 형질도입에 대한 MOI를 계산하였다. 본 실시예에 기재된 인간 항-BCMA scFv를 함유하는 BCMA CAR 구축물을 실시예 4 및 5에서의 실험 내내 사용하였다. 본 실시예에 기재된 도구 BCMA CAR 구축물을 또한 실시예 5, 6, 및 7에 기재된 실험에서 사용하였다.
실시예 5: 도구 BCMA CAR 구축물의 시험관내 특징화
도구 BCMA CAR 구축물에 대한 JNL 리포터 검정
도구 BCMA CAR 구축물로 형질도입된 Jurkat-NFAT-루시페라제 (JNL) 세포를 BCMA-발현 표적 세포주에 대한 반응으로 활성화에 대해 평가하였다. 제0일에, JNL 세포를 BCMA-3NP 및 BCMA-4NP로 형질도입하였다. 바이러스 농도를 MOI 3으로 조정하고, 밤새 인큐베이션하였다. 형질도입 후 제6일에, BCMA CAR-형질도입된 JNL 세포를 표적 세포와 0 내지 27의 범위의 이펙터-대-표적 (E:T) 비로 인큐베이션하였다. 표적 세포주는 하기와 같다: K562 (BCMA 음성 대조군), 및 BCMA 양성 다발성 골수종 세포주, NCI-H929, KMS26, 및 RPMI 8226. JNL 활성화를 제7일에 브라이트-글로 기질 (프로메가(Promega))을 사용하여 측정하였다. 형질도입된 JNL 상에서의 CAR 발현을 BCMA-Fc 항원을 사용하여 제6일에 평가하였다 (표 5). 이러한 리포터 검정은 도구 BCMA-표적화 CAR 클론이 표적-특이적 방식으로 활성화된다는 것을 입증하였다 (도 11).
<표 5> JNL 세포 상에서의 퍼센트 CAR 발현
Figure pct00139
1차 T 세포의 단리, BCMA-표적화 도구 CAR에 의한 형질도입 및 활성화에 대한 스케줄을 표 6에 제시한다. 제0일에, 건강한 인간 공여자 PBMC (노파르티스 직원 혈액 공여자 프로그램)를 피콜 추출에 의해 전혈로부터 단리하고, 범 T 세포 단리 키트 II (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 사용한 음성 선택에 의해 PBMC로부터 T 세포를 단리하였다. 단리된 T 세포를 디나비즈 인간 T-확장 CD3/CD28 비드 (라이프 테크놀로지스)에 의해 비드-대-세포의 3:1 비로 밤새 자극하였다. 또한 T 세포를 염색하여 CD4+ 및 CD8+ 세포의 상대량을 평가하였다 (도 12).
<표 6> BCMA CAR 형질도입된 클론의 T 세포 확장을 위한 스케줄
Figure pct00140
제1일에, T 세포를 BCMA-3NP 및 BCMA-4NP로 형질도입하였다. 바이러스 농도를 MOI 5로 조정하고, 밤새 인큐베이션하였다. 제11일에, 형질도입된 CART 세포를 탈-비드하고, 90% FBS, 10% DMSO 중의 분취물로 동결시켰다. 형질도입 및 확장 후, T 세포를 다시 염색하여 CD4+ 및 CD8+ 세포의 상대량을 평가하였다. 또한, CAR 발현을 BCMA-Fc 항원을 사용하여 평가하였다 (도 13).
BCMA 증식 검정
BCMA-발현 표적 세포에 대한 반응으로 BCMA CART 세포 증식을 평가하였다. CART 세포를 제0일에 해동하고, 밤새 인큐베이션하여 회복시켰다. 제1일에, CART 세포를 셀트레이스(CellTrace) CFSE (라이프 테크놀로지스)로 표지하고, 방사선조사된 표적 세포와 1:1의 E:T 비로 인큐베이션하였다. 비드-대-세포 비 3:1의 디나비즈 인간 T-확장 CD3/CD28 비드를 양성 대조군으로서 포함시켰다. 제5일에, CART 세포에서 CFSE 수준을 측정하였다 (도 14). 또한, CART 세포를 CD3, CD4, CD8, 및 BCMA-Fc 항원으로 염색하고, 카운트브라이트 앱솔루트 카운팅 비즈 (라이프 테크놀로지스) 대비 유동 세포측정법에 의해 측정하여 상대 세포 카운트를 결정하였다 (도 15). BCMA에 대한 반응으로 특이적 증식이 BCMA-3NP 및 BCMA-4NP 둘 다에 대해 관찰되었다.
BCMA CART 루시페라제 세포 사멸 검정
BCMA-발현 표적 세포에 대한 반응으로 BCMA CART 세포 사멸을 평가하였다. CART 세포를 제0일에 해동하고, 밤새 인큐베이션하여 회복시켰다. 제1일에, CART 세포를 BCMA 발현 KMS11-루시페라제 또는 MM1-S-루시페라제 표적 세포와 0 내지 20의 범위의 E:T 비로 인큐베이션하였다. 세포 사멸로부터 발생한 루시페라제 신호의 상실을 제2일에 브라이트-글로 기질을 사용하여 측정하고, 특이적 용해를 하기 식에 따라 계산하였다:
특이적 용해 (%) = 100 - (샘플 발광 / 평균 최대 발광) * 100
세포 사멸의 결과를 도 16에 제시하였고, 이는 도구 CART 클론이 특이적 사멸 반응을 갖는다는 것을 입증하였다.
BCMA CART CFSE 세포 사멸 검정
BCMA-발현 표적 세포에 대한 반응으로 BCMA CART 세포 사멸을 평가하였다. CART 세포를 제0일에 해동하고, 밤새 인큐베이션하여 회복시켰다. 제1일에, 표적 세포를 셀트레이스 CFSE (라이프 테크놀로지스)로 표지하고, BCMA CAR T 세포와 0 내지 10의 범위의 E:T 비로 인큐베이션하였다. 표적 세포주는 하기와 같다: K562-BCMA (BCMA를 안정하게 발현하도록 조작됨), K562 (모 세포주), 및 BCMA 양성 다발성 골수종 세포주, NCI-H929, KMS26, 및 RPMI 8226. 세포 사멸로부터 발생한 CFSE-양성 세포의 상실을 제2일에 카운트브라이트 앱솔루트 카운팅 비즈 (라이프 테크놀로지스) 대비 유동 세포측정법에 의해 측정하여 상대 세포 카운트를 결정하였다 (도 17). 특이적 세포 사멸이 BCMA-3NP 및 BCMA-4NP 둘 다에 대해 관찰되었다.
BCMA 도구 CAR 클론의 시험관내 특징화에 기초하여, BCMA-3NP 및 BCMA-4NP를 KMS11-루시페라제 파종성 종양 모델에서의 생체내 평가를 위해 선택하였다. UTD (비형질도입된) T 세포를 음성 대조군으로서 선택하였다. 생체내 특징화로부터의 결과가 실시예 5에 추가로 기재되어 있다.
실시예 6: BCMA CART의 시험관내 특징화
본 실시예에 기재된 실험은 표 1로부터의 인간 항-BCMA scFv를 함유하는 CAR 구축물, 및 도구 BCMA CAR 구축물을 이용하였다.
BCMA CAR 구축물에 대한 JNL 리포터 검정
BCMA CAR 구축물로 형질도입된 Jurkat-NFAT-루시페라제 (JNL) 세포를 BCMA-발현 표적 세포주에 대한 반응으로 활성화에 대해 평가하였다. 소규모 바이러스 상청액 샘플을 JNL 세포의 형질도입을 위해 HEK293T 세포에서 생성하였다. 형질도입 후 제3일에, BCMA CAR-형질도입된 JNL 세포를 표적 세포와 6:1의 이펙터-대-표적 (E:T) 비로 인큐베이션하였다. 표적 세포주는 하기와 같다: K562-BCMA (BCMA를 안정하게 발현하도록 조작됨), K562 (모 세포주), 및 BCMA 양성 다발성 골수종 세포주, NCI-H929 및 RPMI 8226. JNL 활성화를 제4일에 브라이트-글로 기질 (프로메가)을 사용하여 측정하였다. 형질도입된 JNL 상에서의 CAR 발현을 제7일에 BCMA-Fc 항원 및 비오틴-단백질 L 시약을 사용하여 평가하였다 (표 7). 이러한 리포터 검정은 여러 BCMA-표적화 CAR 클론이 표적-특이적 방식으로 활성화된다는 것을 입증하였다 (도 18).
<표 7> JNL 세포 상에서의 퍼센트 CAR 발현
Figure pct00141
JNL 활성은 % CAR 발현과 상관되지 않았다. BCMA-특이적 활성화에 기초하여, 하기 BCMA CAR 클론을 1차 T 세포에서의 특징화를 위해 선택하였다: BCMA-1, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-10, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, 및 BCMA-15. 관찰된 비-특이적 활성화에 기초하여, BCMA-6을 음성 대조군으로서 선택하였다. 관찰된 활성의 부재에 기초하여, BCMA-9를 또한 음성 대조군으로서 선택하였다.
1차 인간 T 세포의 BCMA CAR 형질도입
1차 T 세포의 단리, BCMA-표적화 CAR에 의한 형질도입 및 활성화에 대한 스케줄을 표 8에 제시한다. 제0일에, 건강한 인간 공여자 PBMC (노파르티스 직원 혈액 공여자 프로그램)를 피콜 추출에 의해 전혈로부터 단리하고, 범 T 세포 단리 키트 II (밀테니 바이오텍)를 사용한 음성 선택에 의해 PBMC로부터 T 세포를 단리하였다. 단리된 T 세포를 디나비즈 인간 T-확장 CD3/CD28 비드 (라이프 테크놀로지스)에 의해 비드-대-세포의 3:1 비로 밤새 자극하였다. 또한 T 세포를 염색하여 CD4+ 및 CD8+ 세포의 상대량을 평가하였다 (도 19).
<표 8> BCMA CAR 형질도입된 클론의 T 세포 확장을 위한 스케줄
Figure pct00142
제1일에, T 세포를 하기 BCMA CAR 클론: BCMA-1, BCMA-4, BCMA-5, BCMA-6, BCMA-7, BCMA-8, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, BCMA-15, BCMA-3NP, 및 BCMA-4NP로 형질도입하였다. 바이러스 농도를 MOI 5로 조정하고 (표 9), 밤새 인큐베이션하였다.
<표 9> MOI 5를 수득하기 위해 각각의 클론의 경우에 웰당 첨가되는 T 세포의 계산.
Figure pct00143
제11일에, 형질도입된 CART 세포를 탈-비드하고, 90% FBS, 10% DMSO 중의 분취물로 동결시켰다. 형질도입 및 확장 후, T 세포를 다시 염색하여 CD4+ 및 CD8+ 세포의 상대량을 평가하였다. 또한, CAR 발현을 BCMA-Fc 항원을 사용하여 평가하였다 (도 20).
BCMA CART 증식 검정
BCMA-발현 표적 세포에 대한 반응으로 BCMA CART 세포 증식을 평가하였다. CART 세포를 제0일에 해동하고, 밤새 인큐베이션하여 회복시켰다. 제1일에, CART 세포를 셀트레이스 CFSE (라이프 테크놀로지스)로 표지하고, 방사선조사된 표적 세포와 1:1의 E:T 비로 인큐베이션하였다. 제6일에, CART 세포에서 CFSE 수준을 측정하였다 (도 21).
또한, CART 세포를 CD3, CD4, 및 CD8로 염색하고, 카운트브라이트 앱솔루트 카운팅 비즈 (라이프 테크놀로지스) 대비 유동 세포측정법에 의해 측정하여 상대 세포 카운트를 결정하였다 (도 22a, 22b, 및 22c). BCMA에 대한 반응으로 특이적 증식이 하기 CART 클론: BCMA-4, BCMA-10, BCMA-12, BCMA-13, BCMA-14, 및 BCMA-15에 대해 관찰되었다.
BCMA CART 사멸 검정
BCMA-발현 표적 세포에 대한 반응으로 BCMA CART 세포 사멸을 평가하였다. CART 세포를 제0일에 해동하고, 밤새 인큐베이션하여 회복시켰다. 제1일에, CART 세포를 BCMA 발현 KMS11-루시페라제 표적 세포와 0 내지 10의 범위의 E:T 비로 인큐베이션하였다. 세포 사멸로부터 발생한 루시페라제 신호의 상실을 제2일에 브라이트-글로 기질을 사용하여 측정하고, 특이적 용해를 하기 식에 따라 계산하였다:
특이적 용해 (%) = 100 - (샘플 발광 / 평균 최대 발광) * 100
세포 사멸 검정의 결과를 각각의 BCMA CAR 구축물을 BCMA-3NP 및 BCMA-4NP와 비교하여 도 23a에 제시하였다. 이들 결과는 그러한 여러 CART 클론 (인간 항-BCMA scFv를 발현함)이 대조군 BCMA-3NP 및 BCMA-4NP 구축물보다 더 큰 사멸 반응을 갖는다는 것을 입증하였다. 선택 후보 BCMA CAR (BCMA-4, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15)로부터의 결과를 도 23b에 그래프로 나타내어 후보 CAR 사이의 사멸 능력을 비교하였다. 비형질도입된 T 세포 및 BCMA-4NP 구축물로 형질도입된 T 세포를 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다. 선택 BCMA CART 클론 (BCMA-4, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15)의 세포 사멸의 백분율을 각각의 CART에 대해 CAR 발현의 퍼센트로 정규화하고, 도 23c에 나타내었다. 결과는 BCMA-4, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15 CART 클론 모두가 BCMA-4NP의 그것과 유사한 세포 사멸 능력을 갖는다는 것을 제시한다.
상기 기재된 BCMA CART 클론의 시험관내 검정의 요약을 표 10에 제시한다. BCMA CART 클론의 시험관내 특징화에 기초하여, BCMA-4, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15를 실시예 7에 기재된 바와 같은 KMS11-루시페라제 파종성 종양 모델에서의 생체내 평가를 위해 선택하였다. BCMA-4NP를 양성 대조군으로서 선택하였다. BCMA-9 및 UTD (비형질도입됨)를 음성 대조군으로서 선택하였다.
<표 10> BCMA CART 클론의 시험관내 특징화의 요약
Figure pct00144
실시예 7: BCMA CART의 생체내 특징화
KMS-11은 IgGκ 흉막 삼출로부터 유래된 인간 다발성 골수종 세포주이고, 면역 손상된 마우스에서 이종이식편으로서 성장될 수 있다. 이러한 이종이식편은 인간에서 관찰되는 바와 같은 골수에서의 질환을 모방하여, 골 내 다발성 골수종에 대한 요법의 효능을 시험하기 위한 모델을 확립할 것이다. 이들 마우스를 사용하여 형질 세포 및 다발성 골수종 세포 상에서 발견되는 세포 마커, 예컨대 B 세포 성숙 항원 (BCMA)에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포의 효능을 시험할 수 있다. KMS-11 세포를 반딧불이 루시페라제 리포터 유전자로 태그부착하고, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스에서 다발성 골수종의 동소 모델에 사용하여 BCMA에 특이적인 CAR T 세포의 효능을 시험하였다.
BCMA 발현을 KMS-11 세포에 대해 시험하고, 이들 세포를 시험관내 검정에 사용하여 BCMA-특이적 CAR T 세포가 표적을 인식하고 그에 반응하는 능력을 조사하였다. 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 이식된 경우에 생체내 KMS-11 세포가 성장하였고, 성장은 주로 골수로 제한되었다. 종양 세포 이식 1주 후, 질환은 완전히 골로 이동하였고, 지수 속도로 성장하기 시작하였다. 비처리로 남긴 마우스는 종양 이식 5-6주 후에 임상 증상 및 뒷다리 마비를 나타내기 시작할 것이다. 도구 BCMA CAR T 세포를 본 모델에서 효능 연구에서 먼저 시험하여 모델이 BCMA CAR T 세포의 효능 및 항종양 활성을 시험하기 위한 적절한 생체내 모델인지 여부를 결정하였다. 그 후, 시험관내 스크린으로부터의 리드 BCMA scFv를 본 생체내 모델에서 시험하였고, 현재 반복 효능 연구에서 확인되고 있다.
물질 및 방법:
KMS-11 세포주: KMS-11 인간 다발성 골수종 세포주는 다발성 골수종을 갖는 환자의 흉막 삼출로부터 발생하였다. 이어서 세포를 반딧불이 루시페라제로 태그부착하였다. 이들 현탁 세포를 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI에서 성장시켰다.
마우스: 더 잭슨 래보러토리(the Jackson Laboratory)로부터 6주령 NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) 마우스를 제공받았다 (스톡 번호 005557). 동물을 실험에 앞서 노파르티스 NIBRI 동물 시설에서 적어도 3일 동안 순응되도록 하였다. 동물은 노파르티스 ACUC 규정 및 가이드라인에 따라 취급하였다.
종양 이식: KMS-11-luc 세포를 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI에서 시험관내 성장 및 확장시켰다. 이어서 세포를 15 ml 원추형 튜브로 옮기고, 차가운 멸균 PBS로 2회 세척하였다. 이어서 KMS-11-luc 세포를 카운팅하고, PBS의 밀리리터당 10x106개 세포의 농도로 재현탁시켰다. 세포를 빙상에 두고, 즉시 (1시간 내) 마우스에 이식하였다. 마우스당 총 1x106개 세포를 위해 KMS-11 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 100 μl 부피로 주사하였다.
CAR T 세포 투여: 마우스에게 종양 이식 7-8일 후 5x106 T 세포를 투여하였다. 세포를 37℃ 수조 내에서 부분적으로 해동한 다음, 세포를 함유하는 튜브에 1 ml의 차가운 멸균 PBS를 첨가하여 완전히 해동하였다. 해동된 세포를 15 ml 팔콘 튜브로 옮기고, PBS를 사용하여 10 ml의 최종 부피로 조정하였다. 세포를 1000rpm에서 각각 10분 동안 2회 세척한 다음, 혈구계 상에서 카운팅하였다. 각각의 군이 동일한 백분율의 CAR+ T 세포를 갖도록 CAR T 세포를 CAR 형질도입에 대해 정규화하였다. 이어서, 총 5x106개 세포를 차가운 PBS ml당 50x106개 세포의 농도로 재현탁하고, 마우스에게 투여할 때까지 빙상에 유지시켰다. 마우스당 5x106개 T 세포의 용량을 위해 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 100 μl의 CAR T 세포를 주사하였다.
군당 5 내지 7마리의 마우스를 100 μl의 PBS 단독 (PBS), 비형질도입된 T 세포 (모의), 도구 BCMA CAR T 세포 (BCMA-3NP 또는 BCMA-4NP), 또는 신규 BCMA CAR T 세포 (BCMA-4, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-13, BCMA-15)로 처리하였다. T 세포는 모두 동일한 인간 공여자로부터 병행 제조되었다.
동물 모니터링: 마우스의 건강 상태를, 매주 2회의 체중 측정을 포함하여 매일 모니터링하였다. 체중에서의 퍼센트 변화를 (BW현재 - BW개시)/(BW개시) x 100%로 계산하였다. 종양 부담은 생물발광 영상화에 의해 매주 2회 모니터링하였다. 마우스에게 마취 10분 전 D-루시페린을 복강내로 주사하고, 제노겐을 사용하여 마우스를 영상화하였다. 질환 부담은 종양 세포의 생물발광을 계산하는 것에 의해 계산하였다 (광자/초).
생물발광 분석: 퍼센트 처리/대조군 (T/C) 값을 하기 식을 사용하여 계산하였다:
% T/C = 100 x ΔT/ΔC, ΔT ≥ 0인 경우;
% 퇴행 = 100 x ΔT/T초기, ΔT < 0인 경우;
여기서 T = 연구 최종일에 약물-처리 군의 평균 생물발광; T초기 = 투여 초기일에 약물-처리 군의 평균 생물발광; ΔT = 연구 최종일에 약물-처리 군의 평균 생물발광 - 투여 초기일에 약물-처리 군의 평균 생물발광; C = 연구 최종일에 대조군의 평균 생물발광; 및 ΔC = 연구 최종일에 대조군의 평균 생물발광 - 투여 초기일에 대조군의 평균 생물발광.
100% 내지 42% 범위 내의 T/C 값은 항종양 활성을 전혀 갖지 않거나 최소 항종양 활성을 갖는 것으로 해석되고; ≤ 42% 및 > 10%인 T/C 값은 항종양 활성 또는 종양 성장 억제를 갖는 것으로 해석되고. T/C 값 ≤ 10% 또는 퇴행 값 ≥ -10%는 종양 정체인 것으로 해석된다. 퇴행 값 < -10%는 퇴행으로서 보고된다.
말초 혈액 FACS 분석: 마우스의 말초 혈액 내 T 세포를 또한 모니터링하였다. 마우스에서 매주 꼬리 정맥을 통해, 빙상에 유지된 EDTA 코팅된 튜브 내로 채혈하였다. 튜브로부터 10-20μl의 혈액을 빙상의 96 웰 플레이트 내로 플레이팅하였다. 적혈구를 ACK 적혈구 용해 완충제 (라이프 테크놀로지스, 카탈로그 번호 A10492-01)로 용해시킨 다음, 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 인간 및 마우스 Fc 차단의 Fc 차단 믹스 (밀테니 바이오텍, 카탈로그 번호 130-059-901 및 130-092-575)와 함께 30분 동안 인큐베이션한 다음, 항-마우스 CD11b 항체 (비디 바이오사이언시스, 카탈로그 번호 557960), 항-인간 CD4 항체 (비디 바이오사이언시스 카탈로그 번호 563550), 항-인간 CD8 항체 (비디 바이오사이언시스 카탈로그 번호 560347), 및 BCMA-Fc 항체 (알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 193-BC-050)에 이어서 Ig 2차 (잭슨 이뮤노리서치)와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 2% 파라포름알데히드 용액으로 20분 동안 고정시키고, 세척하고, PBS + 2% FBS 중에서 밤새 저장한 후, BD 포르테사 상에서 분석하고, 이어서 플루우조 FACS 분석 소프트웨어를 사용하여 추가 분석하였다. 세포를 분석하여 KMS-11-luc 종양-보유 NSG 마우스에서 혈액 밀리리터당 CAR+ CD4+ 및 CD8+ T 세포의 수를 결정하였다. 혈액 중 T 세포 수를 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로서 보고하였다.
결과:
인간 다발성 골수종의 KMS-11 모델에서 도구 BCMA CAR T 세포 (BCMA-3NP 및 BCMA 4-NP)의 항종양 활성을 평가하고 직접 비교하였다. 제0일에 종양 이식 후, 마우스를 처리 군으로 무작위화하고, 제7일에 5x106개 T 세포로 정맥내로 처리하였다. 동물이 종점에 도달할 때까지 다발성 골수종 질환 부담 및 동물 건강을 모니터링하였다. 영상화를 통해 대조군에서의 질환 부담이 최대 발광에 근접할 때인 CAR T 세포 투여후 제14일 (종양 이식후 제21일)에 모든 군의 마우스를 안락사시켰다.
CAR T 세포 투여후 제14일에 P<0.01로, 대조군 및 어느 하나의 도구 CAR T 세포로 처리된 군 사이의 질환 부담에서 분명한 차이를 관찰할 수 있었다. 도구 BCMA CAR T 세포 둘 다는 NSG 마우스에서 인간 다발성 골수종 성장을 제어하는 유사한 능력을 입증하였다. 모의 형질도입된 T 세포 군에 대한 % T/C 값은 212.13%였고, 이는 모의 형질도입된 T 세포가 어떠한 항종양 활성도 갖지 않는다는 것을 입증하였다.
BCMA-3NP 및 BCMA-4P 군에 대한 퍼센트 델타 T/C 값은 각각 1.10% 및 2.17%였고, 이는 도구 BCMA CAR T 세포를 사용한 처리 후 종양 정체를 입증하였다. 생물발광 영상화 결과를 도 24에 제시한다. 어떠한 T 세포도 제공받지 않은 PBS 처리 군은 정맥내로 이식된 NSG 마우스에서 기준선 KMS-11 종양 성장 동역학을 입증하였다. 모의 처리 군은 CAR T 세포와 동일한 시험관내 확장 과정을 거친 비형질도입된 T 세포를 제공받았다. 이들 세포는 본 종양 모델에서 T 세포의 비-특이적 반응을 제시하기 위한 T 세포 대조군으로서의 역할을 하였다. PBS 및 모의 형질도입된 T 세포 처리 군 둘 다는 실험 내내 계속적인 종양 진행을 입증하였다. 도구 BCMA CAR T 세포 둘 다는 5x106개 T 세포 주사 후 질환의 진행을 제어하였다.
KMS-11-luc 모델이 BCMA CAR T 세포를 통한 표적화에 반응한다는 것을 확인한 후, 신규 scFv 리드를 평가하기 위한 연구를 개시하였다. 종양 이식 후, 마우스를 다시 처리 군으로 무작위화하고, 제7일에 5x106개 T 세포로 정맥내로 처리하였다. 동물이 종점에 도달할 때까지 다발성 골수종 질환 부담 및 동물 건강을 모니터링하였다. 영상화를 통해 군에서의 질환 부담이 최대 발광에 근접했을 때 각각의 군의 마우스를 안락사시켰다.
대조군 및 BCMA CAR T 세포로 처리된 일부 군 사이에 질환 부담에서 분명한 차이를 관찰할 수 있었다. 도구 BCMA CAR T 세포 (BCMA-4NP)는 그것이 이전에 KMS-11 종양 성장을 제어하지 못하는 것으로 제시된 바와 같이 그를 제어하지 못했다. 그러나, 일부 신규 BCMA CAR T 세포는 이러한 다발성 골수종 모델에서 다양한 수준의 효능을 제시하였다. 각각의 군에 대해 종점에서 계산된 % T/C 값은 BCMA-10 및 BCMA-13 군의 경우에 종양 성장에서의 정체를 제시하였다. 모의 형질도입된 T 세포 군은 61.56%의 %T/C 값을 가졌고, 모의 형질도입된 T 세포가 최소의 항종양 활성을 갖거나 내지는 항종양 활성을 전혀 갖지 않는다는 것을 입증하였다. BCMA-4P 군에 대한 퍼센트 델타 T/C 값은 32.03%였고, 도구 BCMA CAR T 세포를 사용한 처리 후 일부 최소의 항종양 효능을 입증하였다. BCMA-10 및 BCMA-13 군 둘 다는 종양 성장에서의 정체를 제시하였고, 각각 0.07% 및 6.04%의 T/C 값을 가졌다. BCMA-4는 종양 성장에서 초기 제어를 제시하였지만, 단지 1회의 T 세포 용량이 각각의 군에게 주어지면, 이러한 군에서 종양은 성장하기 시작하였다. 제1 실험으로부터의 생물발광 영상화 결과를 도 25a에 제시한다. 어떠한 T 세포도 제공받지 않은 PBS 처리 군은 정맥내로 이식된 NSG 마우스에서 기준선 KMS-11 종양 성장 동역학을 입증하였다. 모의 처리 군은 CAR T 세포와 동일한 시험관내 확장 과정을 거친 비형질도입된 T 세포를 제공받았다. 이들 세포는 본 종양 모델에서 T 세포의 비-특이적 반응을 제시하기 위한 T 세포 대조군으로서의 역할을 하였다. PBS 및 모의 형질도입된 T 세포 처리 군 둘 다는 실험 내내 계속적인 종양 진행을 입증하였다. BCMA CAR T 세포 군 중에서, BCMA-4, BCMA-10, 및 BCMA-13은 항종양 활성을 제시한 한편, 도구 BCMA CAR T 세포 (BCMA-4NP) 및 BCMA-9 및 BCMA-15는 어떠한 항종양 효능도 제시하지 않았다. 제2 실험을 수행하였고, 생물발광 영상화 결과를 도 25b에 제공하였다. 비형질도입된 T 세포를 제공받은 마우스는 기준선 KMS-11 종양 성장 동역학을 제시하였다. BCMA-4NP*은 제1 실험에서의 BCMA-4NP CART 클론으로부터의 결과를 나타낸다. 제2 실험에서, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15는 강건한 항종양 활성을 제시하였다.
생물발광을 통해 질환 부담을 모니터링하는 것에 더하여, 각각의 군에서의 CAR+ T 세포 수를 말초 혈액 FACS 분석을 통해 또한 모니터링하였다. 본 연구의 FACS 결과를 도 26에 제시한다. KMS-11 종양에 대해 항종양 효과를 제시하는 군은 또한 말초 혈액에서 CD4+CAR+ 및 CD8+CAR+ T 세포 확장을 제시하였다. BCMA-4, BCMA-10, 및 BCMA-13 군은 T 세포 처리 후 10일 내지 20일에 최고의 CD4+CAR+ 증식을 제시하였다. 이들 동일한 군은 또한 지속된 CD8+CAR+ T 세포 확장을 제시하였다.
신규 BCMA CAR 형질도입된 T 세포의 항종양 활성을 인간 다발성 골수종의 이종이식편 모델을 보유하는 NSG 마우스에서의 효능 연구에서 평가하였다. 이들 연구는 KMS-11-luc 모델이 NSG 마우스에서 인간 다발성 골수종을 재현하고, BCMA CAR T 세포에 의해 표적화될 수 있다는 것을 제시한다 (도 24). 이 모델이 BCMA CAR T 세포를 시험하는데 적합하다는 것을 확인한 후, 신규 인간 BCMA CAR을 효능 연구에서 시험하였다. 이 연구는 여러 신규 BCMA CAR (BCMA-4, BCMA-10, 및 BCMA-13)이 다발성 골수종의 이종이식편 모델에서 항종양 반응을 일으킨다는 것을 입증하였다 (도 25a). 종양 실험을 반복하여, BCMA-4, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15를 시험하였다. BCMA-4, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15는 이식 후 적어도 4주 (28일) 동안 종양 성장을 억제 또는 감소시킴으로써 항종양 효능을 입증하였다 (도 25b).
또한, 항종양 반응은 이들 마우스의 말초 혈액에서의 CD4+CAR+ 및 CD8+CAR+ T 세포의 확장과 상관되었다 (도 26a, b, c, 및 d). 이러한 T 세포 확장이 관찰되지 않은 경우에 임의의 BCMA CAR에 대해 어떠한 항종양 효능도 관찰되지 않았다. 본 모델에서 가장 큰 항종양 효능을 제시한 BCMA-10은 또한 가장 지속적인 CD8+CAR+ T 세포 확장을 제시하였다. BCMA-4, BCMA-10 및 BCMA-13 군은 모두 대조군과 비교하여 종양 성장에서 유의한 변화를 제시하였다. 제1 종양 실험에서 도구 BCMA CAR (BCMA-4NP) 및 BCMA-9 및 BCMA-15에 의해 관찰되는 효능의 결여 (도 25a)는 이들 군 내 마우스의 말초 혈액에서의 T 세포 확장의 결여와 상관되었다. 유사하게, 제2 종양 실험에서 BCMA-4NP에 의해 관찰되는 효능의 결여 (도 25b)는 마우스의 말초 혈액에서의 T 세포 확장의 결여와 상관되었다.
생체내 종양 실험의 말미에 말단 골수 및 비장 샘플을 또한 분석하여 항종양 효능을 입증한 CART 클론이 항종양 효능을 제시하지 않은 군과 비교하여 골수 집단을 확립할 수 있는데 차이를 제시하는지 여부를 결정하였다. CAR-발현 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 수를 제1 실험으로부터 마우스의 골수 (도 27a 및 27c) 및 비장 (도 27b 및 27d)에서 결정하였다. 결과는 BCMA-9 CART의 투여가 골수 및 비장에서 최고의 수의 CAR+ T 세포 (CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다)를 생성한다는 것을 제시하였고, 이는 BCMA-9 CART 세포가 생체내에서 효율적인 확장을 거치지만, 사멸 능력 또는 항종양 활성은 갖지 않는다는 것을 나타낸다. BCMA-10 CART 세포는 골수 및 비장에서 T 세포의 다음으로 가장 일관된 확립을 제시하였다. BCMA-4 및 BCMA-15 CART 세포가 또한 비장에서 발견되었다.
실시예 8: 요법을 위한 리드 BCMA CAR 구축물의 확인
리드 BCMA CAR 구축물을 확인하기 위해, 여러 시험관내 및 생체내 결과를 검정하였다. 실험 검정, 검정의 세부사항이 기재된 실시예, 및 검정의 분석 후 생성된 리드 BCMA CAR의 수를 하기 표 (표 13)에 요약하였다. 검정의 결과를 표 13에 열거된 바와 같은 순서로 분석하여 특이성, 면역 이펙터 세포에서의 발현, 및 시험관내 및/또는 생체내 활성을 나타내는 후보 BCMA CAR을 선택하였다.
<표 13> BCMA CAR을 선택하기 위한 검정
Figure pct00145
시험관내 검정, 예를 들어 렌티바이러스 형질도입된 CAR 발현, JNL NFAT 활성화, T 세포 확장, T 세포 증식, 및 표적 세포 사멸 (실시예 5, 6 및 7에 기재된 바와 같음)에 기초하여, 7종의 BCMA CAR을 생체내 치료 효능에 대해 시험할 리드 CAR로서 확인하였고, 5종의 BCMA CAR (BCMA-4, BCMA-9, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15)을 실시예 8에서 시험하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, BCMA-4, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15는 모두 항종양 효능을 입증하였고, BCMA-10 및 BCMA-13은 2회의 개별 생체내 실험에서 항종양 효능을 재현가능하게 입증하였다.
자동화 바이러스 생산 및 SupT1 세포의 자동화 형질도입 후 후보 BCMA CAR 사이의 렌티바이러스 역가를 비교하였다. 2회의 독립적 렌티바이러스 역가 검정을 실행하였다. 제1 역가 시험 실행은 BCMA-4, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15 CAR의 2종의 독립적인 DNA 표본 (A 및 B)을 분석하였다. 제2 역가 시험 실행은 BCMA-4, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15 CAR의 3종의 독립적인 DNA 표본 (A, B 및 C)을 분석하였다. 바이러스 생산은 자동화 96-웰 포맷으로 생산하였다. SupT1 세포 형질도입을 또한 자동화 96-웰 포맷을 통해 수행하였다. CAR 발현은 FACs에 의해 수동 분석하고, 결과를 도 28a 및 28b에 제시하였다. 모든 시험된 BCMA CAR은 바이러스 역가의 대등한 수준 및 일관성을 제시하였다.
따라서, 표 13에 개략된 바와 같은 시험관내 및 생체내 실험으로부터의 결과를 종합하면, BCMA-4, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15는 각각의 검정에 대한 기준을 충족시키는 것으로서 확인되었고, 치료 용도를 위한 추가의 시험을 위한 우수한 후보이다. 둘 다의 실험에서 항종양 효능을 재현가능하게 입증한 CAR 구축물 만을 추가로 분석한 종양 퇴행 분석에서 보다 엄격한 기준을 사용한 경우에, BCMA-10 및 BCMA-13이 추가의 치료 시험을 위해 확인되었다.
실시예 9: 리드 BCMA CAR 구축물의 특징화
실시예 5-8에 기재된 다양한 검정에서 시험관내 및 생체내 효능을 입증한 바 있는 리드 BCMA CAR 구축물 BCMA-4, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15 CAR의 특성을 특징화하기 위해, 추가의 검정을 수행하였다. BCMA-10 및 BCMA-13의 서열 정렬은 2개의 CAR이 동일한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 내 높은 상동성을 갖는다는 것을 제시하였다. 4종의 리드 후보 BCMA-4, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15 CAR 및 대조군으로서 BCMA-4NP (도구 CAR) 사이에 경쟁 검정을 수행하였다. 도 29에 제시된 바와 같이 BCMA-4NP를 BCMA 기질과 인큐베이션하고, 인큐베이션 후 50 내지 300초 결합시켰다. 4종의 BCMA CAR 구축물을 첨가하고, 기질에 대한 결합을 모니터링하였다. 도 29에 제시된 바와 같이, 모든 4종의 BCMA CAR 구축물은 BCMA-4NP 대조군과 경쟁하였고, 이는 모든 4종의 후보 BCMA CAR이 BCMA-4NP 도구 CAR과 동일한 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 주어진 농도에서, 후보 CAR이 상이한 에피토프에 결합하는 경우에, 예상 RU 변화는 약 70 RU일 것이다. 후보 BCMA CAR의 결합 동안 관찰된 작은 RU 변화는 BCMA-4NP 대조군 샘플의 BCMA로부터의 경미한 해리로 인한 것이다.
4종의 후보 BCMA CAR: BCMA-4, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15에 대해 항체 친화도를 또한 평가하였다. 결과를 도 30에 제시하고, 하기 표에 요약하였다.
<표 14> BCMA CAR 결합 친화도
Figure pct00146
BCMA-10 및 BCMA-13은 유사한 친화도를 가졌고, 시험된 후보의 최저 친화도였다.
후보 BCMA CAR의 선택적 결합을 또한 시험하였다. BCMA는 TNF 수용체 패밀리 내의 1종의 수용체이고, 밀접하게 관련된 패밀리 구성원 BaffR 및 TACI를 포함한다. BCMA는 BaffR에 대해 약 41% 상동성 및 TACI에 대해 약 22% 상동성을 갖는다. 후보 BCMA CAR BCMA-4, BCMA-10, BCMA-13, 및 BCMA-15을 발현하는 T 세포를 Fc 영역에 융합된 재조합 BCMA, BaffR, 또는 TACI와 인큐베이션하였다. CAR+ 세포를 염색하여 결합을 평가하였다 (도 31). 결과는 특이적 결합이 모든 BCMA-발현 T 세포와 재조합 BCMA-Fc 사이에서만 관찰된다는 것을 나타내었고, 이는 BCMA CAR 구축물이 BCMA에 선택적으로 결합한다는 것을 입증하였다.
실시예 10: 뇌에서의 BCMA 발현
표 11에 제시된 조직 마이크로어레이 결과는 면역조직화학적 분석에 의한 결과를 나타내고, BCMA 발현이 소뇌에서 검출되었다. 인간 및 비-인간 영장류 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 뇌 조직을 항-BCMA 항체, 예를 들어 BCMA 세포내 에피토프에 대해 생성된 USBio 토끼 폴리클로날 항체 (0807-50G), 및 BCMA 세포외 에피토프를 인식하는 J6MO 토끼 키메라 항체로 염색하였다. 비-영장류 인간 (시노몰구스 마카크) 뇌 조직에서의 UsBio 토끼 폴리클로날 항체에 의한 염색은 소뇌 오름 섬유 (도 32a) 및 소뇌의 하올리브 핵 내 세포체 (도 32b)의 양성 염색을 발생시켰다. J6MO에 의한 비-인간 영장류 뇌 조직의 염색은 하올리브 핵에서만 BCMA 양성 염색을 발생시켰다 (도 32c; 도 32e에서 Ig 대조군 염색). 유사하게, J6MO에 의한 인간 뇌 조직의 염색은 또한 하올리브 핵에서만 BCMA 양성 염색을 발생시켰다 (도 32d; 도 32f에서 Ig 대조군 염색).
면역조직화학 결과를 RNA 분석에 의해 확인하였다. 비-인간 영장류 및 인간 뇌 조직의 계내 혼성화를 수행하였다. 소뇌 및 연수 둘 다는 계내 혼성화에 의한 mRNA 검출에 의하면 BCMA 음성이었다 (도 33a 및 33b). 정량적 PCR을 또한 비-인간 영장류 (시노몰구스 마카크) 및 인간으로부터의 소뇌, 연수, 위, 및 신장 조직에 대해 수행하였다. qPCR 결과는 BCMA mRNA가 인간 (도 33c) 또는 비-인간 영장류 (도 33d)의 소뇌 및 연수에서 검출되지 않는다는 것을 나타내었다. 면역조직화학 및 RNA 분석 사이의 잠재적인 불일치는 관련 기술분야에 공지된 상이한 BCMA 스플라이스 변이체로 인한 것일 수 있다 (Smirnova et al., Mol Immunol, 2008, 45:1179-83).
모든 BCMA 이소형 및 스플라이스 변이체를 검출할 RNAseq 분석을 정상 조직에 대해 수행하였다. 결과는 정상 조직에서의 RNAseq에 의해 BCMA의 발현이 거의 또는 전혀 검출되지 않는다는 것을 제시하였다 (도 33e).
BCMA 검출 단백질이 BCMA CART 세포에 접근가능한지, 및 BCMA CART 요법에 연루되는지 여부를 결정하기 위해 추가의 분석을 수행하였다. PCR 프로브를 재설계하고, BCMA 스플라이스 변이체 발현을 재평가하였다. 소뇌 샘플에서 단세포 RNAseq를 수행하였다. 공초점 현미경 분석을 수행하여 세포내 염색을 가시화하였다. 효과적인 CART, 예를 들어 BCMA-10 및 BCMA-13에서의 뇌에 대한 효과에 대해 마우스를 또한 평가하였다. BCMA CART 세포가 뇌로 잠재적으로 트래픽킹하는 것을 방지하기 위해, 나탈리주맙을 대상체에게 투여할 수 있다.
실시예 11: 재발성/불응성 골수종에서의 BCMA CART 요법
본 실시예는 재발성 및/또는 불응성 다발성 골수종에서의 BCMA-특이적 CAR을 발현하는 자가 T 세포의 주입의 안전성 및 실현가능성을 평가하기 위한 단일 코호트, 개방-표지 파일럿 연구를 제공한다. BCMA-CAR은 탠덤 TCRζ 및 4-1BB (TCRζ /4-1BB) 공동자극 도메인을 포함하고, BCMA-CAR을 발현하는 T 세포를 BCMA CAR T 세포로 지칭하였다.
연구 목적
연구의 1차 목적은 MM 환자에서 BCMA CAR T 세포의 안전성 및 내약성을 결정하는 것이다. 2차 목적은 하기를 포함한다: 반응률, 최소 잔류 질환 (MRD) 비, 무진행 및 전체 생존을 비롯한 결과의 기재; 및 BCMA CAR T 세포 제조의 실현가능성의 평가. 탐색적 목적은 하기를 포함한다: 그의 확장, 지속성, 귀소, 표현형 및 기능과 관련하여 BCMA CAR T 세포의 특징화; BCMA CAR T 세포에 대한 세포성 및/또는 체액성 면역의 발생에 대한 평가; 이뮤노글로불린 수준을 비롯하여 B 세포 및 형질 세포 구획에 대한 BCMA CAR T 세포의 효과의 평가; 환자에서의 전신 가용성 면역 인자에 대한 BCMA CAR T 세포의 영향 결정; MM 세포 처리 전 및 처리 후 BCMA 발현의 평가; 및 선행 임상 이익 후 진행된 환자에서 BCMA CAR T 세포를 사용한 재-처리의 안전성 및 효능의 평가.
연구 지속시간
적극적 개입 및 모니터링의 지속기간은 대략 2년이었다. 2년 후, 지연된 유해 사건에 대한 모니터링은 FDA 가이드라인에 따라 개별 장기간 추적 프로토콜로 이행될 것이다. 프로토콜은 등록 완료를 위해 대략 12-18개월을 필요로 할 것이다.
진단 및 주요 포함 기준
최대 12명의 평가가능한 대상체를 등록시킬 것이다.
포함 기준은 선행 알킬화제, 프로테아솜 억제제 (PI) 및 면역조정 약물 (IMiD) (또는 IMiD (면역조정 약물, 탈리도미드 및 레날리도미드), 및 프로테아솜 억제제에 대해 이중-불응성인 경우에 2종의 선행)을 반드시 포함하는 적어도 3종의 선행 요법 라인 후 재발성 및/또는 불응성 다발성 골수종을 갖는 >18세의 성인 환자를 포함하였다. 환자는 PD에 대한 IMWG (국제 골수종 연구 그룹) 기준을 충족시키는 것으로서 정의되는 재발성이거나, 가장 최근의 요법 후 <PR을 달성하는 것으로서 정의되는 불응성이었다. 환자는 현행 이용가능한 요법에 의해 제한된 예후 (≤2년 예상 생존)를 갖는다.
생성물, 용량, 경로, 요법 연구
BCMA CAR T 세포의 단일 주입을 정맥내 주입에 의해 투여하였다. 코호트 1은 총 세포 중 2-50% 형질도입된 세포의 범위로 계산되는 1-5x108개 BCMA CAR T 세포 단독을 제공받을 것이다 (코호트 1의 세포 용량은 예상외의 중증 독성이 존재하는 경우에 1-5x107개 BCMA CAR T 세포로 감소될 수 있다 (코호트 -1)). 코호트 2는 1-5x107개 BCMA CAR T 세포의 주입 1-3일 전 i.v. 주입에 의해 투여되는, 시클로포스파미드 (시톡산) 1.5 g/m2를 제공받을 것이다. 코호트 3은 1-5x108개 BCMA CAR T 세포의 주입 1-3일 전 i.v. 주입에 의해 투여되는, 시클로포스파미드 1.5 g/m2를 제공받을 것이다.
주입된 총 부피 및 분당 10-20mL의 권장된 주입 속도에 기초하여, 각각의 코호트에 대한 투여량 및 요법을 하기 표에 요약하고, 개략적 다이어그램을 도 34에 제시한다.
<표 15> 코호트 및 투여량의 요약
Figure pct00147
T-세포가 뇌로 잠재적으로 트래픽킹하는 것을 방지하기 위해, 환자에게 나탈리주맙 (티사브리?)을 투여할 수 있다.
환자 모니터링
종양 반응은 혈청 및 소변 단백질 전기영동 및 면역고정; 골수 생검; 및 처리 전 골격 병변이 존재하는 경우 영상화에 의해 측정될 것이다. 또한, 어떠한 신경 변화도 없음을 확실하게 하기 위해 요법 전 및 후에 신경 시험을 수행할 것이다.
통계적 방법론
통계적 분석은 주로 연구의 탐색적 속성과 일치되게 기재될 것이다. 기술 통계학은 상대적 생착, 지속성 및 연구 약물 성분의 혈액 및 골수로의 트래픽킹을 결정하기 위해 적용될 것이다. 모든 유해 사건이 기재될 것이고, 전체 및 주요 카테고리 내 둘 다의 유해 사건 비에 대한 정확한 95% 신뢰 구간이 생성될 것이다. 다른 2차 종점, 예컨대 항종양 활성의 분석이 또한 주로 기재될 것이고, 요약 통계, 예컨대 평균 및 표준 편차 또는 생존 정보에 대한 카플란-마이어 곡선을 포함할 수 있다.
실시예 12: CART 세포로부터의 시토카인 분비
CART 세포가 표적에 대한 반응으로 시토카인을 분비하는 능력을 결정하였다. BCMA-10 CAR을 함유하는 CART 세포 또는 비형질도입된 T-세포를 BCMA-양성 (KMS11-luc) 또는 BCMA 음성 (U87-luc) 표적 세포와 공동-배양하고, 배지 내로의 IL-2, IFNγ, 및 TNFα의 분비를 측정하였다. 구체적으로, 해동한 BCMA-10 CAR을 함유하는 CAR T 세포 또는 비형질도입된 것을 표적 세포와 20시간 동안 2.5:1의 이펙터:표적 비로 공동-배양하였다. 표적 세포는 BCMA 양성 루시페라제화 KMS-11 (KMS11-luc) 또는 BCMA 음성 루시페라제화 U87 세포 (U87-luc)를 포함하였다. 이펙터 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에서 3x104개 표적 세포와 함께 완전 T 세포 배지 중 200 μL/웰의 총 부피로 배양하였다. 20시간 후, 배양물로부터 상청액을 제거하고, IFNγ, IL-2, 및 TNFα 분비를 FACS 상에서 세포측정 비드 어레이 (비디 바이오사이언스(BD Bioscience))에 의해 제조업체의 지침에 따라 정량화하였다. 이중으로 측정하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다 (도 35a-35b). 결과는 BCMA-10 CART가 BCMA-발현에 의해 시토카인 생산을 자극하였지만 비형질도입된 T-세포는 자극하지 못했고, 이는 BCMA-음성 표적 세포에서는 일어나지 않는다는 것을 제시하였다 (도 35a-35b).
실시예 13: 다발성 골수종에서의 BCMA-CART의 기능
다발성 골수종 (MM)는 가장 통상적인 것으로서 빈혈, 피부 병변, 골 압통 또는 통증, 피로, 골용해성 병변, 고칼슘혈증, 신부전 및 반복적 박테리아 감염을 포함하는 임상 양상을 갖는 골수 내 형질 세포의 악성종양이다. 약물, 예컨대 레날리도미드에 의한 현행 치료가 재발성 MM의 생존에서 유의한 증가를 생성하고 있다는 사실에도 불구하고, 질환은 거의 항상 치유불능이다. 중앙 5-년 생존율은 약 35%이다. 불량한 예후로 인해, 유효 표적화 요법이 필요하다.
키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된 T-세포를 사용한 치료는 혈액 악성종양, 예컨대 ALL에 대한 유망한 면역요법을 생성할 수 있다. CAR은 종양 세포 상에서 발현된 세포-표면 표적 단백질을 인식하는 융합 단백질을 함유한다. 차등 유전자 발현 연구는 악성 형질 세포 및 정상 형질 세포에 대한 고도로 특이적인 표적 항원으로서 B-세포 성숙 항원 (BCMA, CD269)을 확인한 바 있고; 따라서, BCMA는 CAR T 세포 요법을 위한 잠재적으로 유용한 표적 항원이다. 예를 들어, 문헌 [Carpenter et al. Clin Cancer Res. 19.8(2013):2048-60]을 참조한다.
BCMA는 TNF-수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. 단백질은 TNFRSF17 유전자에 의해 코딩된다. BCMA는 성숙 B 림프구 내에서 발현된다. 이는 종양 괴사 인자 (리간드) 슈퍼패밀리, 구성원 13b (TNFSF13B/TALL-1/BAFF), APRIL 및 다양한 TRAF 패밀리 구성원에 결합한다. 그의 리간드와의 상호작용은 B 세포 발생, 장기간 혈장 생존, 및 세포 증식과 관련된 NF-카파B 및 MAPK8/JNK 신호를 발생시킨다.
본 실시예는 BCMA10 scFv가 혼입된 huBCMA-BBz CAR-형질도입된 T 세포 (CART-BCMA 또는 BCMA-CART)의 시험관내 및 생체내 기능을 평가하기 위한 전임상 연구를 기재한다.
물질
T 세포. 건강한 공여자로부터의 T 세포를 펜실베니아 대학교 CFAR 인간 면역학 코어 (펜실베니아주 필라델피아)로부터 입수하였다. 세포는 건강한 지원자 공여자의 백혈구분리반출술로부터 제조하였다.
배지. 10% 태아 소 혈청 및 여과된 (밸리 바이오메디칼(Valley Biomedical)), 2mM 글루타맥스, (인비트로젠), 10mM HEPES (인비트로젠), 100U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신 (깁코)이 보충된 RPMI 배지 (깁코(Gibco))를 사용하였다.
CD3/28 비드. CD3/28 비드 (GMP-등급)는 펜실베니아 대학교의 임상 세포 및 백신 생산 시설에 의해 제조되었다.
플라스미드. pELPS 렌티바이러스 벡터 NVP- MCM998 내에 클로닝된 huBCMA-BBz CAR 구축물은 노파르티스에 의해 생성되었다.
항체. 다발성 골수종 세포주 상에서의 BCMA 발현을 검출하기 위해 염소 항-인간 BCMA PE 표지된 항체 (바이오레전드 cat# 357504), 및 스트렙타비딘 (비디 바이오사이언시스)을 사용하였다. CAR T 세포 발현에 대해서는, BCMA fc 융합 단백질 (알앤디 시스템즈, cat#193-BC-050)에 이어서 항-인간 IgG fc-PE 항체 (바이오레전드, cat# 409304)를 사용하였다.
PBS. PBS는 깁코로부터의 것이다.
렌티바이러스 패키지. 293T 세포를 리포펙타민 2000 (인비트로젠 Cat# 11668027)을 사용하여 형질감염시킴으로써 huBCMA-BBz 렌티바이러스 제조를 위해 PCL USUG, PRSV Rev, PGAG pol 플라스미드 (네이쳐 테크놀로지 코포레이션 cat# NTC RP20)를 사용하였다.
세포주. 인간 배아 신장 293T 세포 (ATCC cat# CRL-3216)를 렌티바이러스 제조에 사용하였다. CART-BCMA 세포에 대한 기능 실험을 위해 다발성 골수종 세포주 RPMI 8226 (ATCC cat# CCL-155), MM1S (ATCC cat# CRL-2974), U266 (ATCC cat# CRL-3216), NCI H929 (ATCC cat# CRL-9068) 및 OPM2 (DSMZ cat# ACC-50); 및 K562 (ATCC cat# CCL-256), 또는 K562- BCMA 세포 (진코포에이아로부터의 BCMA 렌티바이러스 벡터 cat# Lv105)를 사용하였다.
방법
렌티바이러스 생산 프로토콜 및 역가 결정. 293T 세포를 10% FBS (ATCC cat # 30-2020) 및 strep/페니실린 (인비트로젠 cat # 10378-016)으로 보충된 RPMI1640 배지 (깁코 Cat. #11875-080)가 들은 T150 플라스크 (코닝 코스타(Corning Costar) Cat. #430825) 내에 8.106개 세포/플라스크로 시딩하고, 패킹 플라스미드 믹스 (네이쳐 테크놀로지 코포레이션) 플러스 huBCMA-BBz 코딩 pELPS 렌티바이러스 벡터로 24시간 동안 형질감염시켰다. 생성된 바이러스 제제를 -80℃에서 저장하였다. 재조합 렌티바이러스를 CD4 T에 대해 적정하였다.
형질도입 프로토콜. 휴먼 이뮤놀로지 코어(Human Immunology Core)로부터 입수한 T 세포를 배지 중에서 1회 세척하고, 106개 세포/ml로 재현탁시키고, CD3/28 비드로 1:3의 세포:비드 비로 자극하였다. 제2일에 렌티바이러스 벡터를 세포 배양물 내로 MOI 3으로 혼합하여 렌티바이러스 형질도입을 수행하였다.
T 세포 확장. 자극된 T 세포를 7-9일 동안, 또는 세포 분열의 감소된 속도 및 < ~300fl로의 평균 세포 부피에서의 감소에 의해 결정되는 바와 같이 세포가 휴지기일 때까지, 2-3일마다 0.8x106개 세포/ml로 공급 및 분할하였다.
세포 배양. 다발성 골수종 세포주 및 K562, K562 BCMA 세포주를 10% FBS 및 항생제를 함유하는 RPMI 중에서 배양하였다.
세포 카운팅. 배양물을 온화하게 혼합하고 배양 부피로부터 40ul의 세포를 수집함으로써 확장 동안 3일마다 세포를 카운팅하고, 쿨터 멀티사이저 3(Coulter Multisizer 3) (베크만 쿨터(Beckman Coulter))을 사용한 카운팅을 위해 20ml 이소톤(Isoton) II 희석 완충제가 들은 아큐벳 (베크만 쿨터) 내로 넣었다. 본 시험의 결과 (절대 세포 카운트 및 세포 부피)를 사용하여 세포 농도, 총 세포 수, 성장 속도, 및 희석 부피를 결정하였다.
51Cr 방출-검정. CART-BCMA 세포가 BCMA-발현 표적 세포를 사멸시키는 능력을 51Cr 방출-검정을 사용하여 평가하였다. 간략하게, 표적 K562-BCMA 세포 (또는 대조군 K562 세포) 및 다발성 골수종 세포주를 51Cr (중크로뮴산나트륨 염)로 표지하고, 세척하고, 이펙터 CART-BCMA 또는 대조군 비-형질도입된 T 세포 (NTD)와 상이한 이펙터/표적 비로 공동-배양하였다. 4-시간째에 상청액을 수집하고, 96 웰 루마플레이트 (퍼킨 엘머)에 넣었다. 표지된 표적 세포로부터 방출된 51Cr의 양을 액체 섬광 카운터 (마이크로베타 트리룩스, 퍼킨 엘머) 상에서 측정하였다. 배지 단독 중에서 또는 1% SDS와 함께 인큐베이션된 표적 세포를 사용하여 자발적 (S) 또는 최대 (M) 51Cr 방출을 결정하였다. 특이적 용해의 백분율을 하기와 같이 계산하였다: 100x (cpm 실험 방출- cpm S 방출)/ (cpm M 방출- cpm S 방출).
형질도입된 T 세포 상에서의 CAR 검출. CART-BCMA의 형질도입을 평가하기 위해, T 세포를 BCMA-Fc 융합 단백질 (알앤디 시스템즈)에 이어 항-인간 IgG Fc-PE 항체 (바이오레전드)로 염색하였다.
유동 세포측정법. 항-BCMA 염색을 위해, 인간 골수종 세포주를 염소 항-인간-PE BCMA 항체 (바이오레전드)에 이어서 스트렙타비딘 (비디 바이오사이언시스)으로 염색하였다. 모든 실험에 대한 유동 세포측정 분석은 플루우조 (트리 스타, 인크.)를 사용하여 수행하였다.
ELISA. 표적 K562-BCMA 세포 (또는 대조군 K562 세포) 또는 다발성 골수종 세포주를 CAR-형질도입된 T 세포와 1:3의 표적:이펙터 비로 96 웰 편평 바닥 플레이트의 이중 웰 내에서 합하였다. 인간 IFNγ 또는 IL2 듀오세트 ELISA 키트 (R&D)를 제조업체가 권장하는 바와 같이 사용하여 인큐베이션 16시간 후에 수집된 상청액의 1:10 희석 중에서 ELISA 검정을 수행하였다.
결과
huBCMA-BBz는 형질도입된 T 세포 상에서 고도로 발현된다.
새로이 정제된 음성 선택된 정상 인간 T 세포를 CD3/28 비드 (세포:비드 비 1:3)를 사용하여 시험관내 활성화시키고, 확장되도록 하였다. 활성화 후 제1일에, 세포를 huBCMA-BBz를 발현하는 전임상 렌티바이러스 벡터로 형질도입하거나 모의 형질도입하였다 (NTD 대조군). 도 36a는 배양 동안 총 T 세포의 증가를 제시한다. BCMA-CART 세포를 3일마다 카운팅하고, 분할 세포의 비를 조정하였다. T 세포를 쿨터 카운터 멀티사이저 III을 사용하여 열거하고, 확장 사이클 말까지 (제7일-제9일) 2일마다 공급하였다. 생체외 확장 제6일에, 200ul의 CART- BCMA 또는 대조군 NTD T 세포를 상기 방법 섹션에 기재된 바와 같이 염색하였다. 살아있는 세포 집단을 FCS vs. SSC를 사용하여 게이팅하였다. 유동 획득을 BC FACS 칸토 기기 상에서 수행하고, 유동 분석은 플루우조 소프트웨어 (트리스타, 인크)를 사용하여 수행하였다.
비 형질도입된 (NTD) 및 CART-BCMA 세포의 증식 속도에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았고, 이는 렌티바이러스 발현이 T 세포의 증식 잠재력에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다 (도 36a). 형질도입 효율을 형질도입 후 제6일에 상기 방법 섹션에 기재된 바와 같이 평가하였다. 도 36b는 huBCMA-BBz 형질도입 효율이 49%임을 제시한다. 이들 결과는 huBCMA-BBz CAR이 인간 T 세포의 표면 상에서 효율적으로 발현된다는 것을 입증하였다.
BCMA는 다발성 골수종 세포주 상에서 다양한 수준으로 발현되었다.
다발성 골수종 세포주 상에서의 BCMA 표면 발현을 유동 세포측정 염색을 사용하여 결정하였다. 살아있는 세포 집단을 FCS/SCC 파라미터에 의해 게이팅하였다. 유동 획득을 칸토 기기 상에서 행하고, 유동 분석은 플루우조 소프트웨어를 사용하여 행하였다. 시험된 대부분의 다발성 골수종 세포주는 강력한 BCMA 발현을 제시한 반면에, RPMI 8226 및 대조군 K562-BCMA 세포는 보다 낮은 수준의 표면 BCMA를 발현하였다 (도 37). 모든 플롯의 경우에, 오렌지색으로 채워진 피크는 이소형 대조군을 나타내고, 청색으로 채워진 피크는 BCMA 항체에 의한 염색을 나타낸다 (도 37). 유동 세포측정 염색은 다발성 골수종 세포주 NCI H929, U266, RPMI 8226, OPM2 및 MM1S의 표면 상에서, 뿐만 아니라 K562- BCMA 세포에 의한 BCMA 발현을 밝혀내었다. BCMA는 K562 세포주의 표면 상에서는 검출되지 않았다 (도 37). 이들 결과는 BCMA가 여러 다발성 골수종 세포주에 의해 약 1 로그만큼 다양한 발현 수준으로 발현된다는 것을 입증하였다.
CART-BCMA 세포는 시토카인을 생산하였고, 특히 상이한 BCMA-발현, 다발성 골수종 세포주에 대한 반응으로 세포독성 특성을 제시하였다.
CART-BCMA 세포가 시토카인을 생산하고 BCMA+ 표적 세포를 사멸시키는 능력을 결정하였다. CART-BCMA 세포 (huBCMA-BBz 형질도입된 T 세포) 또는 대조군 비 형질도입된 T 세포 (NTD)를 K562, K562-BCMA 또는 다발성 골수종 세포주 (MM1S, OPM2, 또는 U266)와 함께 16시간 동안 이중으로 공동-배양하였다. 세포를 3:1 비의 T 세포 대 표적 세포로 공동-배양하였다. 세포 무함유 상청액을 수거하고, IL2 또는 IFNγ의 생산을 상기 방법 섹션에 기재된 바와 같이 평가하였다.
CART-BCMA 세포는 특히 비-항원-발현, 야생형 K562 세포와 비교하여 BCMA를 발현하도록 조작된 K562 (K562-BCMA)의 존재 하에 IL2 또는 IFNγ를 생산하였다. CART-BCMA 세포는 또한 U266, OPM2 및 MM1S 다발성 골수종 세포주의 존재 하에 시토카인을 생산할 수 있었다 (도 38a-38b). 이들 결과는, BCMA+ 표적 세포주의 존재 하에, CART-BCMA 세포가 염증유발 시토카인을 생산한다는 것을 입증하였다.
CART-BCMA 세포의 항종양 유효성에 대한 또 다른 시험관내 측정은 BCMA+ 표적 세포를 사멸시키는 그의 능력이다. 예를 들어 도 36a-36b와 관련하여 상기 기재된 바와 같이, T 세포를 활성화시키고 형질도입하였다. BCMA10 CAR T 세포를 51Cr-표지된 K562-BCMA, RPMI 8226 또는 MM1S 세포주와 4시간 동안 도 39a-39c에 표시된 바와 같은 이펙터 대 표적 비 (E:T 비) (E:T 0, 10, 20, 또는 30)로 공동-배양하고, 용해의 백분율을 상기 방법 섹션에 기재된 바와 같이 계산하였다. 도 39a는 CART-BCMA 세포가 특히 K562-BCMA 세포를 사멸시킨다는 것을 제시한다. CART-BCMA 세포는 또한 4-시간 세포독성 검정에서 BCMA고 다발성 골수종 세포주 MM1S 및 BCMA저 RPMI 8226 세포주를 효율적으로 사멸시켰다 (도 39b, 39c). 이들 결과는 CART-BCMA가 다발성 골수종 세포주에 대해 증진된 세포독성 활성 (51Cr 검정)을 나타낸다는 것을 입증하였다.
CART-BCMA 세포의 생체내 항종양 활성
많은 다른 골수종 세포주와 비교하여 보다 낮은 수준의 BCMA 발현을 제시하는 RPMI 8226 세포를 사용하여, CART-BCMA가, 생물발광 영상화 (BLI)를 위해 방아벌레 녹색 루시페라제 (CBG)를 발현하도록 조작한 BCMA저 RPMI 8226 세포주에 의해 생산된 종양을 인식하고 제거하는 능력을 평가하기 위한 마우스 모델을 확립하였다. 확립된 정맥내 RPMI 8226 종양을 갖는 NOD/SCID/γ- 쇄-/- (NSG) 마우스에게 종양 세포 접종 후 제30일에 CART-BCMA 세포 (N=10) 또는 비 형질도입된 대조군 T 세포 (NTD) (N=10)의 정맥내 주사를 제공하였다. RPMI-8226 세포가 생착된 NSG 마우스를 종양 세포 주사 후 제30일에 5x106개 CART-BCMA T 세포로 처리하였다. 골수종 종양 진행을 T 세포 주입의 최대 9주 후 (종양 주사 14주 후)까지 생체내 BLI (1주에 1회 복측 및 배측 마우스 영역의 BLI)에 의해 추적하였다.
비-형질도입된 T 세포는 종양을 제어하는데 실패하였고, 모든 마우스는 종양 주사 10-11주 후에 질환 진행으로 인해 안락사되어야 했다 (도 40a 및 40c). 대조적으로, CART-BCMA 세포를 제공받은 마우스는 대부분의 마우스에서 종양 성장의 제어를 제시하였고, NTD 대조군-처리된 마우스의 0% 생존과 비교하여 종양 세포 접종 10주 후에 CART-BCMA-처리된 마우스의 80% 생존을 발생시켰다 (도 40b 및 40c). 이들 결과는 수질내 RPMI 8226 종양이 CART-BCMA 처리에 의해 억제된다는 것을 입증하였다.
실시예 14: BCMA-CART 투여 계획
BCMA CART 세포 요법, 예를 들어 본원에 기재된 BCMA CART 세포 요법을 본원에 기재된 투여 요법, 예를 들어 하기와 같이 기재된 투여 요법에 따라 환자, 예를 들어 다발성 골수종 환자에게 투여할 수 있다.
BCMA CART 요법을 제공하기 전 환자에 대해 백혈구분리반출술을 수행하여 자가 T 세포를 수득하였다. BCMA 렌티CAR T 세포의 제조 및/또는 동결보존을 수행하였다. 질환 제어를 유지하기 위해 제조 동안 환자에게 요법을 제공할 수 있다. 일부 환자는 CART 세포 투여 전 림프구고갈 요법 (예를 들어, 시톡산)을 제공받을 수 있다. 예를 들어, 림프구고갈 화학요법, 예를 들어 시톡산 (예를 들어 1.5 g/m2으로)을 환자에게 투여하였다. 다른 투여 요법에서, 림프구고갈 화학요법을 환자에게 투여하지 않았다. 이어서 환자를 본원에 기재된 투여 요법에 따라 BCMA CART 세포로 처리하였다.
투여 요법은 용량 분할을 수반하며, 예를 들어 여기서 세포의 총 용량의 특정 백분율이 처리 제1일에 전달되고, 세포의 총 용량의 상이한 백분율이 처리의 후속 일에 전달되고, 세포의 총 용량의 상이한 백분율이 처리의 더 후속 일에 전달된다. 예를 들어, 세포의 총 용량의 10%가 제1일에 전달되고, 세포의 총 용량의 30%가 제2일에 전달되고, 세포의 총 용량의 나머지 60%가 처리의 제3일에 전달된다. 예를 들어, 총 세포 용량은 1 내지 5 x 107개 또는 1 내지 5 x 108개 BCMA-CART 세포를 포함한다.
하나의 투여 요법에서, 어떠한 림프구고갈 화학요법도 투여되지 않고, 1 내지 5 x 107개의 총 BCMA-CART 세포 용량이 처리 제1일에 10%의 세포 용량, 처리 제2일에 30%, 및 처리 제3일에 60%로 투여된다 (예를 들어, 주입에 의함). 또 다른 투여 요법에서, 어떠한 림프구고갈 화학요법도 투여되지 않고, 1 내지 5 x 108개의 총 BCMA-CART 세포 용량이 처리 제1일에 10%의 세포 용량, 처리 제2일에 30%, 및 처리 제3일에 60%로 투여된다 (예를 들어, 주입에 의함). 또 다른 투여 요법에서, 림프구고갈 화학요법 (1.5 g/m2으로의 시톡산)이 BCMA-CART 세포 투여 3일 전에 투여되고, 이어서 1 내지 5 x 107개의 총 BCMA-CART 세포 용량이 처리 제1일에 10%의 세포 용량, 처리 제2일에 30%, 및 처리 제3일에 60%로 투여된다 (예를 들어, 주입에 의함). 또 다른 투여 요법에서, 림프구고갈 화학요법 (1.5 g/m2으로의 시톡산)이 BCMA-CART 세포 투여 3일 전에 투여되고, 이어서 1 내지 5 x 108개의 총 BCMA-CART 세포 용량이 처리 제1일에 10%의 세포 용량, 처리 제2일에 30%, 및 처리 제3일에 60%로 투여된다 (예를 들어, 주입에 의함).
CART 세포 투여 1일, 2일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일 후, 4주마다 (제0일은 CART 투여의 제1일임) 임상 실험실 평가를 수행하였다. 다발성 골수종 평가를 CART 투여 전, CART 투여 제1일 (제0일), 및 14일, 28일, 및 4주마다 수행하였다. 골수 흡인/생검 (bx)을 CART 투여 전, 및 CART 투여 28일 및 90일 후에 수행하였다. CART 처리의 최초 28일 후, 6개월까지 4주마다, 이어서 2년까지 3개월마다 추적을 수행하였다.
실시예 15: 낮은 용량의 RAD001은 세포 배양 모델에서 CART 증식을 자극한다
CART-발현 세포를 표적 세포와 상이한 농도의 RAD001의 존재 하에 공동-배양함으로써 시험관내 CAR T 세포 증식에 대한 낮은 용량의 RAD001의 효과를 평가하였다.
물질 및 방법
CAR-형질도입된 T 세포의 생성
인간화, 항-인간 CD19 CAR (huCART19) 렌티바이러스 전달 벡터를 사용하여 VSVg 유사형화 렌티바이러스 입자 내에 패키징된 게놈 물질을 생산하였다. 인간화 항-인간 CD19 CAR (huCART19)의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 2014년 3월 15일에 출원된 PCT 공개 WO2014/153270에 기재된 CAR 1, ID 104875이고, 거기서 서열식별번호: 85 및 31로 지정되어 있다.
렌티바이러스 전달 벡터 DNA를 3종의 패키징 성분 VSVg env, gag/pol 및 rev와, 리포펙타민 시약과 조합하여 혼합하여 렌티-X 293T 세포를 형질감염시켰다. 이후 배지를 24h 및 30h 후에 바꾸고, 바이러스-함유 배지를 수집하고, 여과하고, -80℃에서 저정하였다. 건강한 공여자 혈액 또는 류코팩(leukopak)의 음성 자기 선택에 의해 수득된 신선한 또는 동결된 나이브 T 세포의 형질도입에 의해 CART를 생성하였다. 항-CD3/항-CD28 비드와 24h 동안 인큐베이션하여 T 세포를 활성화시키고, 그 후 바이러스 상청액 또는 농축된 바이러스 (각각 MOI=2 또는 10)를 배양물에 첨가하였다. 변형된 T 세포가 약 10일 동안 확장되게 하였다. 형질도입된 세포 (세포 표면 상에서 CAR을 발현함)의 백분율 및 CAR 발현의 수준 (상대 형광 강도, 기하 평균)을 제7일 내지 제9일에 유동 세포측정 분석에 의해 결정하였다. 성장 속도의 감속 및 ~350 fL에 근접한 T 세포 크기의 조합은 추후 분석을 위해 동결보존될 T 세포에 대한 상태를 결정한다.
CART의 증식의 평가
CART의 기능성을 평가하기 위해, T 세포를 해동하고, 카운팅하고, 셀로미터에 의해 생존율을 평가하였다. 각각의 배양물 중 CAR-양성 세포의 수를 비-형질도입된 T 세포 (UTD)를 사용하여 정규화하였다. CART에 대한 RAD001의 영향을 50nM에서 출발하는 RAD001을 사용한 적정에서 시험하였다. 모든 공동-배양 실험에 사용된 표적 세포주는 CD19를 발현하고 루시페라제를 발현하도록 형질도입된 인간 전-B 세포 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 세포주인 Nalm-6이다.
CART의 증식을 측정하기 위해, T 세포를 표적 세포와 1:1의 비로 배양하였다. 세포가 CD3, CD4, CD8 및 CAR 발현에 대해 염색된 경우에 검정을 4일 동안 실행하였다. T 세포의 수는 참조로서 비드를 카운팅하는 것을 사용하여 유동 세포측정법에 의해 평가하였다.
결과
CART 세포의 증식 능력을 4일 공동-배양 검정에서 시험하였다. CAR-양성 CD3-양성 T 세포 (어두운 막대) 및 총 CD3-양성 T 세포 (연한 막대)의 수는 CAR-형질도입된 및 비-형질도입된 T 세포를 Nalm-6과 배양한 후에 평가하였다 (도 43). huCART19 세포는 0.016 nM 미만의 RAD001의 존재 하에 배양한 경우에 확장되었고, 보다 높은 화합물의 농도에서 더 낮은 정도로 확장되었다. 중요한 것은, 0.0032 및 0.016 nM RAD001 둘 다에서의 증식이 RAD001의 첨가의 부재 하에 관찰된 것보다 더 높았다. 비-형질도입된 T 세포 (UTD)는 검출가능한 확장을 제시하지 않았다.
실시예 16: 낮은 용량의 RAD001은 생체내 CART 확장을 자극한다
본 실시예는 huCAR19 세포가 상이한 농도의 RAD001에 의해 생체내 증식하는 능력을 평가한다.
물질 및 방법:
NALM6-luc 세포: NALM6 인간 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 세포주는 재발성 ALL을 갖는 환자의 말초 혈액으로부터 발생하였다. 이어서 세포를 반딧불이 루시페라제로 태그부착하였다. 이들 현탁 세포를 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI에서 성장시켰다.
마우스: 더 잭슨 래보러토리로부터 6주령 NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) 마우스를 제공받았다 (스톡 번호 005557).
종양 이식: NALM6-luc 세포를 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI에서 시험관내 성장 및 확장시켰다. 이어서 세포를 15 ml 원추형 튜브로 옮기고, 차가운 멸균 PBS로 2회 세척하였다. 이어서 NALM6-luc 세포를 카운팅하고, PBS의 밀리리터당 10x106개 세포의 농도로 재현탁시켰다. 세포를 빙상에 두고, 즉시 (1시간 내) 마우스에 이식하였다. 마우스당 총 1x106개 세포를 위해 NALM6-luc 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 100 μl 부피로 주사하였다.
CAR T 세포 투여: 마우스에게 종양 이식 7일 후 5x106개 CAR T 세포를 투여하였다. 세포를 37℃ 수조 내에서 부분적으로 해동한 다음, 세포를 함유하는 튜브에 1 ml의 차가운 멸균 PBS를 첨가하여 완전히 해동하였다. 해동된 세포를 15 ml 팔콘 튜브로 옮기고, PBS를 사용하여 10 ml의 최종 부피로 조정하였다. 세포를 1000rpm에서 각각 10분 동안 2회 세척한 다음, 혈구계 상에서 카운팅하였다. 이어서, T 세포를 차가운 PBS ml당 50x106개 CAR T 세포의 농도로 재현탁하고, 마우스에게 투여할 때까지 빙상에 유지시켰다. 마우스당 5x106개 CAR T 세포의 용량을 위해 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 100 μl의 CAR T 세포를 주사하였다. 군당 8마리의 마우스를 100 μl의 PBS 단독 (PBS) 또는 인간화 CD19 CAR T 세포로 처리하였다.
RAD001 투여: 1mg RAD001과 동등한 50mg의 농축된 마이크로-에멀전을 제제화한 다음, 투여 시점에 D5W (물 중 덱스트로스 5%) 중에 재현탁시켰다. 마우스에게 200 μl의 목적하는 용량의 RAD001을 경구로 매일 (경구 위관영양을 통해) 투여하였다.
PK 분석: 마우스에게 RAD001을 종양 이식 7일 후에 시작하여 매일 투여하였다. 투여 군은 하기와 같다: 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 및 10 mg/kg. RAD001의 최초 및 최종 용량 후 제0일 및 제14일에 마우스에서 채혈하고, 하기 시점에 PK 분석하였다: 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 및 24시간.
결과:
확장 및 RAD001의 약동학을 NALM6-luc 종양을 갖는 NSG 마우스에서 시험하였다. RAD001 단독을 매일 경구 투여하는 것은 NALM6-luc 종양의 성장에 대해 영향을 갖지 않았다 (도 44). RAD001의 약동학적 분석은 그것이 종양 보유 마우스의 혈액 중에서 상당히 안정하다는 것을 제시하였다 (도 45a 및 45b). 제0일 및 제14일 둘 다의 PK 분석은 혈액 중 RAD001 농도가 시험된 최저 용량 (0.3 mg/kg)에서 투여 24시간 후에도 10nm을 초과한다는 것을 제시하였다.
이들 용량에 기초하여, huCAR19 CAR T 세포를 RAD001의 존재 및 부재 하에 투여하여 이들 세포의 증식 능력을 결정하였다. 투여 24시간 후 혈액 중 RAD001의 수준에 기초하여 사용된 최고 용량은 3 mg/kg이었다. RAD001의 농도가 RAD001의 최종 용량 24시간 후에 10nM을 초과하였기 때문에, CAR T 세포를 사용한 생체내 연구에 여러 더 낮은 용량의 RAD001을 사용하였다. CAR T 세포를 매일 경구 RAD001 투여를 시작하기 1일 전에 IV 투여하였다. FACS를 통해 T 세포 확장에 대해 마우스를 모니터링하였다.
RAD001의 최저 용량은 CAR T 세포의 증진된 증식을 제시하였다 (도 46). 이러한 증진된 증식은 CD8+ CAR T 세포보다 CD4+ CAR T 세포를 사용한 경우에 보다 명백했고, 연장되었다. 그러나, CD8+ CAR T 세포에 의하면, CAR T 세포 투여 후 초기 시점에 증진된 증식을 관찰할 수 있었다.
실시예 17: 다발성 골수종을 치료하는데 사용하기 위한 CD19 CAR T 세포
화학요법, 표적화 요법 및 자가 줄기 세포 이식의 현행 요법을 사용하더라도, 골수종은 치유불가능한 질환으로 간주된다. 본 실시예는 키메라 항원 수용체를 갖는 CD19에 대해 지시된 자가 T 세포 (렌티바이러스/CD19:4-1BB:CD3제타; "CART19" 또는 CTL019로도 공지됨)를 사용한 다발성 골수종 (MM)의 치료를 기재한다. 본 실시예는 CD19-지시된 CAR 요법이 매우 낮은 (대부분의 방법에 의해 검출불가능한) 수준의 CD19를 발현하는 골수종 줄기 세포 및/또는 종양 세포를 표적화하는 것에 기초하여 깊은 장기간의 지속적인 완화를 확립하는 잠재력을 갖는다는 것을 입증하였다.
공격성 속발성 형질 세포 백혈병을 갖는 환자를 치료하는데 있어서, 본 발명자들은 구제 자가 줄기 세포 이식 2일 후에 투여된 CART19가 다중 라인의 화학요법을 통해 진행된 환자에서 형질 세포 백혈병의 신속한 클리어런스 및 매우 우수한 부분 반응을 발생시킨다는 것을 발견하였다. 이 환자는 치료 전 수개월 동안 수혈-의존성이었고; 치료 2개월 후에, 혈액 카운트를 회복하였고 (정상-범위 혈소판 카운트 및 백혈구 카운트를 가짐), 치료로부터 병원에서 퇴원한 이래로 수혈을 필요로 하지 않았다.
골수종 세포는 CD19를 자연 발현하지 않기 때문에, CART19 처리가 이러한 종양에서 신속하고 유의한 종양 반응을 유도하였다는 발견은 놀라웠다. 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 하기 이유 때문에 CART19가 골수종을 치료하는데 사용될 수 있는 것으로 추론되었다: (1) 골수종 세포는 전통적으로 유동 세포측정법에 의해 CD19 발현에 대해 음성인 것으로 생각되었지만, 발현이 RNA에 의해 검출가능하지만 유동 세포측정법 또는 면역조직화학에 의해서는 검출가능하지 않은 정도로, 골수종 세포가 매우 낮은 수준의 CD19를 발현할 수 있다는 것을 나타내는 데이터가 존재함; (2) 다발성 골수종을 발생시키고 특히 화학요법에 저항성인 암성 줄기 세포인 것으로 생각되는 클론형 B 세포를 표적화하는 개념. B 세포와 골수종 종양 세포 사이에 클론 관계가 존재하지만, 전통적인 골수종 요법은 B 세포보다 악성 형질 세포를 목표로 한다. 따라서, 골수종을 치료하기 위한 CART19는 대부분의 골수종 요법과는 상이한 세포 집단을 표적화한다.
본 발명자들의 단일 환자 경험에서, 환자는 순환 형질 세포를 갖고, 본 발명자들은 종양 세포를 CD19의 발현에 대해 시험할 수 있었다. 대략 1-2%의 종양 세포가 CD19 항원을 발현하였다. (도 47). 따라서, CART19는 종양 세포의 매우 작은 집단에 대해 직접적인 효과를 가질 수 있는 것으로 추론되었고; 이것은 단지 CD19+ 종양 세포의 매우 작은 집단을 표적화하는 것에 기초하여 예측되지 않았지만 매우 우수한 부분 반응이었다.
본 사례에서, 고-용량 멜팔란 후 자가 줄기 세포 이식 구출 후에 CART19를 투여하였다. 이는 골수종에서 표준 요법이지만, 치유적이지 않다. 게다가, 이 환자는 이전에 탠덤 자가 줄기 세포 이식을 거쳤고, 이식 후 초기에 (<6개월) 재발된 바 있다. 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 실시예에 기재된 바와 같은 CART19 세포의 사용은 구제 자가 줄기 세포 이식과 조합되는 경우에 골수종의 치료에서 비-중첩 메카니즘을 가질 수 있다.
불응성 다발성 골수종을 갖는 환자를 골수절제 화학요법 및 ASCT 후 CTL019로 처리하였다. 검출가능한 CTL019의 상실 및 정상 CD19-양성 B 세포의 재구성에도 불구하고 완화가 유지되었고, 이는 이러한 반응이 지속적인 CTL019 활성을 필요로 하지 않는다는 것을 나타내었다. 또한, 이러한 환자의 반응은 대부분 (99.95%)의 신생물성 형질 세포가 유동 세포측정법 및 RT-PCR 둘 다에 의해 CD19-음성인 경우에도 실현되었다.
환자의 우성 신생물성 형질 세포 집단에서의 검출가능한 CD19 발현의 부재는 CTL019의 임상적으로 관련된 표적이 이러한 우성 CD19-음성 집단 외부에 존재한다는 것을 시사한다. 다발성 골수종 환자의 신생물성 형질 세포는 유전적, 면역표현형적, 및 기능적 이질성을 나타낸다. 특정한 하위집단은 항골수종 요법을 통해 클론의 생존을 필요로 할 수 있다. 본원에 보고된 환자에서, 예를 들어 형질 세포의 작은 CD19-발현 하위세트는 상대적으로 멜팔란-저항성이지만 CTL019에 감수성일 수 있다. 이러한 발견은 클론의 작은 하위세트의 치료 표적화가 통상적인 항골수종 요법과 커플링된 경우에 지속적인 임상 이익으로 이어질 수 있음을 시사한다.
대안적으로, 이러한 환자에서 CTL019의 임상적으로 관련된 표적은 신생물성 형질 세포 집단 외부에 존재할 수 있다. 예를 들어, CTL019는 상대적으로 작지만 신생물성 형질 세포를 발생시키는 줄기 세포 집단을 표적화할 수 있다. 따라서 다발성 골수종은 직전에 말단 분화된 형질 세포가 아닌 다중 후기 B-계열 세포 유형의 질환일 수 있고, 이는 B 림프구를 표적화하는 CTL019와 같은 요법이 형질 세포를 직접 표적화하는 요법에 대한 유용한 보조 요법일 수 있도록 한다.
추가의 10명의 다발성 골수종 환자가 I상 시험에서 CART19로 처리될 것이고, 적어도 3명의 환자는 현재까지 처리된 바 있다.
용량 근거
처음 3명의 환자에서, 본 발명자들은 1.4 x 107 내지 1.1 x 109개 CART-19 세포 범위의 용량에서 임상 활성을 관찰하였다. 상기 관찰은 적어도 치료된 처음 3명의 환자에서, 명백한 용량 반응 관계가 존재하지 않음을 보여준다. 완전 반응은 용량에서 2 로그 배수 차이로 투여된 환자에서 관찰되었다. 따라서, 대사되는 표준 약물과는 달리, CAR T 세포는 넓은 용량 반응 범위를 가질 수 있다. 이것은 아마도 CAR T 세포가 환자 내에서 광범하게 증식할 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명자들은 주입을 위해 1-5 x 108개 CART-19 세포의 용량 범위를 설정하였다. 동정적 사용에 기초하여 제공된 상기 단일-환자 연구에서, 환자는 더 낮은 용량 하한없이 최대 5 x 108개의 CART19 세포를 제공받았다. 10명의 환자 시험에 대해, 환자는 1-5 x 107개 CART-19 세포를 제공받을 것이다.
일반적인 설계
이것은 동정적 사용에 기초하여 제공된 단일 환자-연구이고; CART-19를 발현하도록 형질도입된 자가 T 세포의 주입이 안전한지 결정하기 위해 I상 연구 후 모델을 제시하였다. 연구의 1차 목표는 처음 ASCT 이후 조기 재발한 후 구제 ASCT를 받은 환자에서 CART-19 T 세포의 안전성, 내약성 및 이식 능력을 결정하는 것이었다. 프로토콜은 공개 파일럿 연구로 이루어진다.
진입 시, 대상체는 골수 생검 및 그들의 MM의 일상적 실험실 시험 및 영상화 평가를 받을 것이다. 적격 대상체는 CART-19 제조를 위한 많은 수의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수득하기 위해 정상 상태 분리반출술을 받을 것이다. T 세포를 PBMC로부터 정제하고, TCRζ/4-1BB 렌티바이러스 벡터로 형질도입하고, 시험관내에서 확장시킨 후, 미래의 투여를 위해 동결시킬 것이다. 성공적으로 제조된 T 세포를 갖는 환자의 수에 비해 부적합한 T 세포 수집물, 확장 또는 제조를 갖는 환자의 수가 기록될 것이고; 생성물 제조의 실현가능성은 상기 환자 집단에서 문제가 되는 것으로 예상되지 않는다.
대상체는 일반적으로 2회의 추가 ASCT를 수행하기 위해, 그들의 처음 ASCT에 대한 준비에서 수행된 동원/수집으로부터 저장되어 남아있는 적당한 말초 혈액 줄기 세포를 가질 것이다. 치료 의사의 선호도에 따른 요법으로 그들의 정상 상태 분리반출술 전 또는 후에 제2 동원/수집 절차를 받지 않을 것이다. 초기 백혈구분리반출술의 대략 2주 후에, 대상체는 병원에 입원하고 고-용량 멜팔란 (제 -2일)에 이어서, 2일 후 (제0일)에 자가 줄기 세포의 주입을 받을 것이고, 모든 대상체는 12 내지 14일 후 (제+12-14일)에 CART-19 세포의 주입을 받을 것이다. 최대 10명의 환자가 등록될 것이다.
모든 대상체는 연구의 제4주까지 규칙적인 간격으로 CART-19 세포의 안전성, 및 이식 및 존속을 평가하기 위해 혈액 시험을 받을 것이다. 제+42일 및 제+100일에, 대상체는 골수 형질 세포 부담 및 골수로의 CART-19 세포의 트래픽킹을 평가하기 위해 골수 흡인물/생검을 받을 것이다. 공식적인 반응 평가는 제100일에 국제 골수종 연구 그룹 (IMWG) 기준 136에 따라 이루어질 것이고, TTP는 다발성 골수종의 환자에 대한 일상적 임상 실무에 따라 모니터링될 것이다. 상기 연구에서 측정된 주요 효능 성과는 상기 연구에서 ASCT 이후 TTP에 대한 환자의 초기 ASCT 이후 TTP의 비교일 것이다.
치료 요법
재발성/진행성 다발성 골수종에 대한 요법
환자는 등록에 앞서 그들의 치료 의사의 선호도에 따라 재발/진행성 다발성 골수종에 대한 요법을 받을 수 있다. 치료는 등록 시에 지속할 수 있다.
환자는 분리반출술에 앞서 2주 동안 및 고-용량 멜팔란에 앞서 2주 동안 모든 요법을 중단해야 한다. 분리반출술 및 고-용량 멜팔란 사이에 2주 초과로 경과할 것이 예상되면, 환자는 그들의 치료 의사의 재량으로 분리반출술 후에 요법을 재개할 수 있다.
고-용량 멜팔란 (제 -2일)
환자는 제 -3일 또는 제 -2일에 병원에 입원할 것이고, 담당의, 및 치료 프로토콜의 개시에 앞서 종양 용해 증후군에 대한 파라미터를 모니터링하는 것을 포함하는 일상적 실험실 시험에 의해 검사를 받을 것이다. MM 모니터링 실험실 시험 (SPEP, 정량적 이뮤노글로불린, 및 혈청 비함유 경쇄 분석)을 위한 혈액은 그러한 시험이 입원 7일 이내에 채취되지 않았다면 요법의 개시에 앞서 채취될 것이다.
고-용량 요법은 제 -2일에 대략 20분에 걸쳐 정맥내 투여되는 200 mg/m2의 용량의 멜팔란으로 이루어질 것이다. 환자 >70세, 또는 치료 의사의 재량에서 200 mg/m2의 용량을 허용할 수 없는 임의의 연령의 환자에 대해 멜팔란의 용량은 140 mg/m2으로 감소될 것이다. 모든 환자는 덱사메타손을 포함할 수 있는 표준 항구토제 예방, 및 표준 항생제 예방을 투여받을 것이다.
줄기-세포 재-주입 (제0일)
줄기 세포 주입은 제0일에, 고-용량 멜팔란의 투여의 적어도 적어도 18시간 후에 일어날 것이다. 줄기 세포는 표준 기관 실무에 따라 예비투여 후 대략 20-60분에 걸쳐 정맥내 주입될 것이다. 체중 1 kg당 적어도 2 x 106개 CD34+ 전구체를 주입할 것이다. 추가로, 체중 1 kg당 적어도 1 x 106개 CD34+ 전구체가 지연된 생착 또는 후기 그라프트 실패의 경우에 주입할 예비 줄기 세포 제품으로서 이용가능해야 한다. G-CSF는 표준 기관 실무에 따른 용량으로 제+5일에 시작하여 SQ 투여되어야 한다. 수혈 지지와 같은 다른 지지적 관리 수단은 표준 기관 가이드라인에 따라 이루어질 것이다.
CART19 세포 주입 (제+12-14일)
5 x 107개 이하의 CART-19 세포로 이루어지는 단일 용량의 CART-19 형질도입된 T 세포가 제공될 것이다. CD19 TCRζ4-1BB로 벡터로 형질도입된 세포의 주입에 대한 최소 허용 용량은 1 x 107개이다. CART-19 세포는 줄기 세포 주입 후 제+12-14일에 신속 i.v. 주입에 의한 단일 용량으로서 제공될 것이다. 환자가 제12일-제14일 윈도우 내에 본원에 기재된 임의의 포함 기준을 충족시키는데 실패한 경우에, CART-19 주입은 기준이 만족될 때까지 제+12-14일을 넘어 지연될 수 있다.
유지 레날리도마이드
제1 ASCT 후 유지 레날리도마이드를 투여받고 이를 허용하는 대상체는 치료 의사의 판단 하에 금기가 없는 것으로 여겨지면 대략 제+100일에 레날리도마이드 유지 요법을 재개할 것이다. 출발 용량은 선행 실험이 특정한 환자에 대한 대안적 출발 용량을 좌우하지 않는 한 매일 10 mg일 것이다. 유지 요법은 질환 진행 또는 불관용까지 계속될 것이다.
연구 약물의 투여
주입은 면역억제된 환자에 대한 예방책을 사용하여 로즈(Rhoads) 내의 격리실에서 일어날 것이다. 형질도입된 T 세포는 3-방향 스톱콕을 갖는 18-게이지 라텍스 무함유 Y-형 혈액 세트를 통해 대략 1분에 10 mL 내지 20 ml의 유량으로 신속한 정맥내 주입에 의해 투여될 것이다. 주입 지속시간은 주입될 총 부피 및 권고되는 주입 속도에 기초할 것이다. 각각의 주입 백에는 하기 내용을 포함한 라벨을 부착할 것이다: "절대 자가 용도". 또한, 라벨은 적어도 2개의 특유한 식별자, 예컨대 대상체의 이니셜, 출생일자 및 연구 번호를 포함할 것이다. 주입에 앞서, 2명의 개인이 대상체의 존재 하에 상기 모든 정보를 독립적으로 확인하여, 정보가 참여자에게 정확하게 일치하는지 확인할 것이다.
패키징
주입은 1-5 x 107개 CA T19-형질도입된 세포의 단일 용량으로 이루어질 것이고, 여기서 최소 허용 용량은 주입에 대해 1 x 107개 CART-19 세포이다. 각각의 백은 하기 주입 등급 시약 (% v/v)을 함유하는 냉동매질의 분취물 (용량에 의존한 부피)을 담을 것이다: 31.25% 플라스마라이트-A, 31.25% 덱스트로스 (5%), 0.45% NaCl, 최대 7.5% DMSO, 1% 덱스트란 40, 5% 인간 혈청 알부민.
분리반출술
대량 부피 (12-15 리터 또는 4-6 혈액 부피) 분리반출술 절차를 분리반출술 센터에서 수행하였다. 상기 절차 동안 CART-19를 위한 PBMC를 수득하였다. 단일 백혈구분리반출술로부터, 목적은 CART-19 T 세포를 제조하기 위해 적어도 5 x 109개 백혈구를 수거하는 것이다. FDA 역추적조사 요건 및 연구를 위한 기준선 혈액 백혈구를 또한 수득하고 동결보존하였다. 세포 생성물은 대략 2-4주 후 배포를 위해 준비되는 것으로 예상된다. CD19 및 CD20 B 세포 결정을 비롯한 유동 세포측정 림프구 하위세트 정량. 기준선 평가는 인간 항-VSV-G 및 항-뮤린 항체 (HAMA)에 대해 이루어졌다. 대상체가 이전에 임상 세포 및 백신 생산 시설에서 현재 우수 제조 관리기준에 따라 축적된 적합한 분리반출술 수집을 받은 경우에, 이들 세포는 CART-19 제조를 위한 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다. 축적된 분리반출술 생성물을 사용하는 것은 추가의 분리반출술 수집을 받는 대상체에 대한 비용, 시간 및 위험을 방지할 것이다.
세포감소 화학요법
림프구 고갈 화학요법은 본원에 기재된 바와 같은 고용량 멜팔란일 것이다.
CART-19 주입
주입은 줄기 세포 재주입 후 제+12-14일에 시작할 것이다.
제1 주입 전 제+12-14일에, 화학요법이 부분적으로 림프구감소증을 유도하기 위해 제공되기 때문에 환자는 CD3, CD4 및 CD8 카운트의 차이 및 평가를 갖는 CBC를 받을 것이다.
제1 용량은 단일 용량을 사용하여 투여될 것이다. 세포를 환자 병상에서 해동한다. 해동된 세포는 주입 지속시간이 대략 10-15분이 되도록, 허용되는 한 신속한 주입 속도로 제공될 것이다. 혼합을 용이하게 하기 위해, 세포를 Y-어댑터를 사용하여 동시에 투여할 것이다. 대상체에게 본원에 기재된 바와 같이 주입하고 사전약물첨가할 것이다. 대상체의 생명 징후를 평가할 것이고, 펄스 산소측정은 투여 전에, 주입의 말미에, 및 그 후 15분마다 1시간 동안 및 이들이 안정하고 만족스러울 때까지 이루어진다. 기준선 CART-19 수준의 결정을 위한 혈액 샘플은 제1 주입에 앞서 및 각각의 주입의 20분 내지 4시간 후 임의의 시간에 수득한다 (그리고 TCSL에 보냄).
결과
3명의 치료-불응성, 진행성 다발성 골수종 환자를 현재 진행 중인 시험에서 CTL019로 처리하였다. 이들 환자 중 2명에 대한 결과는 둘 다 3-개월 시점에서의 1차 효능 평가에 기초하여 CTL019 요법으로부터 실질적인 항종양 효과를 갖는 것으로 나타났다. 제3 환자는 아직 3-개월 시점에 도달하지 않았다. 2명의 환자에 대한 결과를 이하에서 보다 상세하게 기재한다.
제1 골수종 환자는 그의 제+100일 반응 평가를 완료하였고, CART19 요법에 대해 매우 양호한 반응을 가졌다. 하기 시험을 수행하여 하기 결과가 나왔다:
-SPEP/면역고정: 음성
-소변 면역고정: 면역고정에 대한 희미한 측정불가능한 카파 경쇄 밴드 (또한 제38일에 존재함, 따라서 신규한 것이 아님)
달리, 환자는 하기를 비롯한 엄격한 완전 완화에 대한 기준을 충족시켰다:
-무혈청 경쇄 비: 정상
-골수 생검: 음성
-IgA 면역표현형결정: IgA는 검출 한계 미만임
소변 면역고정으로부터 발생한 희미한 측정불가능한 카파 경쇄 외에는, 환자는 "엄격한 완전 완화"에 대한 모든 기준을 충족시켰다. 3회 시점 (제-2일, 제+38일, 제+103일)에서의 형질 세포 면역표현형결정의 요약을 도 39에 제시하고, 이는 환자의 IgA가 검출 한계 미만임을 입증하였다. 요약은 제-2일에 무거운 골수종 부담, 및 제+38일 및 제+103일에 검출가능하지 않음을 보여주고, 이는 유동 분석에 의하면 환자를 "MRD 음성"으로 분류한다. 제+103일에, 요약은 정상, 폴리클로날, CD19+ 형질 세포 및 B 세포의 회복을 보여준다. 환자는 질환 또는 요법의 어떠한 증상도 갖지 않았고, 정상 인간과 마찬가지로 기능적이다.
처리된 제2 환자는 아직 제+100일 시점에 도달하지 않았다. 그러나, 이 시점에, 잘 활동하고 있지만, CTL019 주입의 효과를 결정하기에는 너무 이르다.
등가물
본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원 및 공개의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 발명은 구체적 측면을 참조로 하여 개시되지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명의 진정한 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 본 발명의 다른 측면 및 변형을 고안할 수 있을 것임이 명백하다. 첨부된 청구항은 그러한 모든 측면 및 균등한 변형을 포함하는 것으로 해석되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> BROGDON, JENNIFER CHOI, EUGENE EBERSBACH, HILMAR ERHARD GLASS, DAVID HUET, HEATHER JUNE, CARL H. MANNICK, JOAN MILONE, MICHAEL C. MURPHY, LEON PLESA, GABRIELA RICHARDSON, CELESTE RUELLA, MARCO SINGH, RESHMA WANG, YONGQIANG WU, QILONG <120> TREATMENT OF CANCER USING HUMANIZED ANTI-BCMA CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR <130> N2067-704510 <140> 14/805,193 <141> 2015-07-21 <150> PCT/CN2014/090501 <151> 2014-11-06 <150> PCT/CN2014/082586 <151> 2014-07-21 <160> 1117 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 2 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 3 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of 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Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 305 310 315 320 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 325 330 335 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 340 345 350 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 355 360 365 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 370 375 380 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 385 390 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 26 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> This sequence may encompass 1-6 'Gly Gly Gly Gly Ser' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 26 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 30 <211> 5000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> This sequence may encompass 50-5,000 nucleotides, wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 30 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000 <210> 31 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 31 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 100 <210> 32 <211> 5000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> This sequence may encompass 50-5,000 nucleotides, wherein some positions may be absent <400> 32 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 180 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 240 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 300 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 360 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 420 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 480 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 540 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 600 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 660 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 720 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 780 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 840 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 900 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 960 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1020 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1080 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1140 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1200 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1260 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1320 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1380 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1440 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1500 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1560 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1620 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1680 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1740 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1800 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1860 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1920 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1980 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2040 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2100 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2160 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2220 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2280 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2340 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2400 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2460 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2520 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2580 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2640 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2700 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2760 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2820 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2880 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2940 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3000 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3060 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3120 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3180 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3240 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3300 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3360 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3420 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3480 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3540 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3600 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3660 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3720 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3780 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3840 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3900 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3960 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4020 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4080 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4140 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4200 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4260 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4320 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4380 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4440 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4500 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4560 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4620 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4680 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4740 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4800 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4860 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4920 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4980 tttttttttt tttttttttt 5000 <210> 33 <211> 5000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> This sequence may encompass 100-5,000 nucleotides, wherein some positions may be absent <400> 33 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000 <210> 34 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(400) <223> This sequence may encompass 100-400 nucleotides, wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 34 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 400 <210> 35 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2000) <223> This sequence may encompass 50-2,000 nucleotides, wherein some positions may be absent <400> 35 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2000 <210> 36 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys Met 225 230 <210> 37 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 37 gagagcaagt acggccctcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc 60 agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120 gtgacctgtg tggtggtgga cgtgtcccag gaggaccccg aggtccagtt caactggtac 180 gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagcccc gggaggagca gttcaatagc 240 acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggaa 300 tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360 gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420 accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540 gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600 gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660 aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690 <210> 38 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(40) <223> This sequence may encompass 1-10 'Gly Gly Gly Ser' repeating units, wherein some positions may be absent <220> <223> See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments <400> 38 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 39 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gly Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Arg Ser Gly Glu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Ala His Tyr Tyr Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg 180 185 190 Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Ser Pro Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys 245 <210> 40 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 40 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Val His Ser Phe Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro 130 135 140 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 145 150 155 160 Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala 180 185 190 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 195 200 205 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 210 215 220 Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys <210> 41 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ala Leu Ser Asn His 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Val Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 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Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Asp Asn Phe 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Lys Asn Asn Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gln Ser Tyr Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr 130 135 140 Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys 145 150 155 160 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asn 165 170 175 Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu 180 185 190 Gly Ser Lys Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu His Ile Thr Arg Val Gly Ala Glu Asp 210 215 220 Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 245 <210> 43 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 43 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asp 20 25 30 Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Ala Arg Gly Pro Arg Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu 130 135 140 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 145 150 155 160 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr 165 170 175 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser 180 185 190 Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp Ser Ala 210 215 220 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Lys Arg Ala Ser Phe Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Lys Val Glu Ile Lys 245 <210> 44 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg 115 120 125 Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu 130 135 140 Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser 145 150 155 160 Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Val Asp Trp Tyr 165 170 175 Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser 180 185 190 Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Thr Asp Phe Lys Leu Gln Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly 210 215 220 Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Arg Gln Phe Pro Tyr Ser Phe Gly Gln 225 230 235 240 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 245 <210> 45 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Glu Val Gln Leu Leu Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ala Leu Ser Asn His 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Val Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95 Ala His Gly Gly Glu Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 130 135 140 Val Ser Pro Gly Glu Ser Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 145 150 155 160 Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 165 170 175 Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp 180 185 190 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 195 200 205 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly 210 215 220 Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 <210> 46 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 46 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ala Leu Ser Asn His 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Val Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95 Ala His Gly Gly Glu Ser Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 130 135 140 Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 145 150 155 160 Val Ser Ser Lys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 165 170 175 Arg Leu Leu Met Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp 180 185 190 Arg Phe Ser Gly Ser Gly 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<211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 50 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Val Arg Glu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Arg Ala 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser 130 135 140 Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser 145 150 155 160 Glu Ser Leu Val His Asn Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe His 165 170 175 Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr 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acgtgggagt gtactactgt atgcaggcgc tgcagactcc gtacacattc 720 ggacagggca ccaagctgga gatcaag 747 <210> 58 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 58 caagtgcaac ttcaagaatc aggcggagga ctcgtgcagc ccggaggatc attgcggctc 60 tcgtgcgccg cctcgggctt caccttctcg agcgacgcca tgacctgggt ccgccaggcc 120 ccggggaagg ggctggaatg ggtgtctgtg atttccggct ccgggggaac tacgtactac 180 gccgattccg tgaaaggtcg cttcactatc tcccgggaca acagcaagaa caccctttat 240 ctgcaaatga attccctccg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagctggac 300 tcctcgggct actactatgc ccggggtccg agatactggg gacagggaac cctcgtgacc 360 gtgtcctccg cgtccggcgg aggagggtcg ggagggcggg cctccggcgg cggcggttcg 420 gacatccagc tgacccagtc cccatcctca ctgagcgcaa gcgtgggcga cagagtcacc 480 attacatgca gggcgtccca gagcatcagc tcctacctga actggtacca acagaagcct 540 ggaaaggctc ctaagctgtt gatctacggg gcttcgaccc tggcatccgg ggtgcccgcg 600 aggtttagcg gaagcggtag cggcactcac ttcactctga ccattaacag cctccagtcc 660 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gaggacgtgg gaatctacta ctgtatgcag ggccgccagt ttccgtactc gttcggacag 720 ggcaccaaag tggaaatcaa g 741 <210> 60 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 60 gaagtgcaat tgctcgaaac tggaggaggt ctggtgcaac ctggaggatc acttcgcctg 60 tcctgcgccg tgtcgggctt tgccctgtcc aaccatggaa tgagctgggt ccgccgcgcg 120 ccggggaagg gcctcgaatg ggtgtccggc atcgtctact ccggctccac ctactacgcc 180 gcgtccgtga agggccggtt cacgatttca cgggacaact cgcggaacac cctgtacctc 240 caaatgaatt cccttcggcc ggaggatact gccatctact actgctccgc ccacggtggc 300 gaatccgacg tctggggcca gggaaccacc gtgaccgtgt ccagcgcgtc cgggggagga 360 ggaagcgggg gtagagcatc gggtggaggc ggatcagaga tcgtgctgac ccagtccccc 420 gccaccttga gcgtgtcacc aggagagtcc gccaccctgt catgccgcgc cagccagtcc 480 gtgtcctcca acctggcttg gtaccagcag aagccggggc aggcccctag actcctgatc 540 tatggggcgt cgacccgggc atctggaatt cccgataggt tcagcggatc gggctcgggc 600 actgacttca ctctgaccat ctcctcgctg caagccgagg acgtggctgt gtactactgt 660 cagcagtacg gaagctccct gactttcggt ggcgggacca aagtcgagat taag 714 <210> 61 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 61 gaagtgcaat tggtggaaac tggaggagga cttgtgcaac ctggaggatc attgagactg 60 agctgcgcag tgtcgggatt cgccctgagc aaccatggaa tgtcctgggt cagaagggcc 120 cctggaaaag gcctcgaatg ggtgtcaggg atcgtgtact ccggttccac ttactacgcc 180 gcctccgtga aggggcgctt cactatctca cgggataact cccgcaatac cctgtacctc 240 caaatgaaca gcctgcggcc ggaggatacc gccatctact actgttccgc ccacggtgga 300 gagtctgacg tctggggcca gggaactacc gtgaccgtgt cctccgcgtc cggcggtgga 360 gggagcggcg gccgcgccag cggcggcgga ggctccgaga tcgtgatgac ccagagcccc 420 gctactctgt cggtgtcgcc cggagaaagg gcgaccctgt cctgccgggc gtcgcagtcc 480 gtgagcagca agctggcttg gtaccagcag aagccgggcc aggcaccacg cctgcttatg 540 tacggtgcct ccattcgggc caccggaatc ccggaccggt tctcggggtc ggggtccggt 600 accgagttca cactgaccat ttcctcgctc gagcccgagg actttgccgt ctattactgc 660 cagcagtacg gctcctcctc atggacgttc ggccagggga ccaaggtcga aatcaag 717 <210> 62 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 62 gaagtgcaat tggtggagac tggaggagga gtggtgcaac ctggaggaag cctgagactg 60 tcatgcgcgg tgtcgggctt cgccctctcc aaccacggaa tgtcctgggt ccgccgggcc 120 cctgggaaag gacttgaatg ggtgtccggc atcgtgtact cgggttccac ctactacgcg 180 gcctcagtga agggccggtt tactattagc cgcgacaact ccagaaacac actgtacctc 240 caaatgaact cgctgcggcc ggaagatacc gctatctact actgctccgc ccatggggga 300 gagtcggacg tctggggaca gggcaccact gtcactgtgt ccagcgcttc cggcggtggt 360 ggaagcgggg gacgggcctc aggaggcggt ggcagcgaga ttgtgctgac ccagtccccc 420 gggaccctga gcctgtcccc gggagaaagg gccaccctct cctgtcgggc atcccagtcc 480 gtggggtcta ctaaccttgc atggtaccag cagaagcccg gccaggcccc tcgcctgctg 540 atctacgacg cgtccaatag agccaccggc atcccggatc gcttcagcgg aggcggatcg 600 ggcaccgact tcaccctcac catttcaagg ctggaaccgg aggacttcgc cgtgtactac 660 tgccagcagt atggttcgtc cccaccctgg acgttcggcc aggggactaa ggtcgagatc 720 aag 723 <210> 63 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 63 caagtgcaac tcgtggaatc tggtggagga ctcgtgaaac ctggaggatc attgagactg 60 tcatgcgcgg cctcgggatt cacgttctcc gattactaca tgagctggat tcgccaggct 120 ccggggaagg gactggaatg ggtgtcctac atttcctcat ccggctccac catctactac 180 gcggactccg tgaaggggag attcaccatt agccgcgata acgccaagaa cagcctgtac 240 cttcagatga actccctgcg ggctgaagat actgccgtct actactgcgc aagggagagc 300 ggagatggga tggacgtctg gggacagggt accactgtga ccgtgtcgtc ggcctccggc 360 ggagggggtt cgggtggaag ggccagcggc ggcggaggca gcgacatcca gatgacccag 420 tccccctcat cgctgtccgc ctccgtgggc gaccgcgtca ccatcacatg ccgggcctca 480 cagtcgatct cctcctacct caattggtat cagcagaagc ccggaaaggc ccctaagctt 540 ctgatctacg cagcgtcctc cctgcaatcc ggggtcccat ctcggttctc cggctcgggc 600 agcggtaccg acttcactct gaccatctcg agcctgcagc cggaggactt cgccacttac 660 tactgtcagc aaagctacac cctcgcgttt ggccagggca ccaaagtgga 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738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 65 caagtgcaac tggtgcaaag cggaggagga ttggtcaaac ccggaggaag cctgagactg 60 tcatgcgcgg cctctggatt caccttctcc gattactaca tgtcatggat cagacaggcc 120 ccggggaagg gcctcgaatg ggtgtcctac atctcgtcct ccgggaacac catctactac 180 gccgacagcg tgaagggccg ctttaccatt tcccgcgaca acgcaaagaa ctcgctgtac 240 cttcagatga attccctgcg ggctgaagat accgcggtgt actattgcgc ccggtccact 300 atggtccggg aggactactg gggacagggc acactcgtga ccgtgtccag cgcgagcggg 360 ggtggaggca gcggtggacg cgcctccggc ggcggcggtt cagacatcgt gctgactcag 420 tcgcccctgt cgctgccggt caccctgggc caaccggcct caattagctg caagtcctcg 480 gagagcctgg tgcacaactc aggaaagact tacctgaact ggttccatca gcggcctgga 540 cagtccccac ggaggctcat ctatgaagtg tccaacaggg attcgggggt gcccgaccgc 600 ttcactggct ccgggtccgg caccgacttc accttgaaaa tctccagagt ggaagccgag 660 gacgtgggcg tgtactactg tatgcagggt acccactggc ctggaacctt tggacaagga 720 actaagctcg agattaag 738 <210> 66 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 66 caagtgcaac tcgtggaatc tggtggagga ctcgtgcaac ccggtggaag ccttaggctg 60 tcgtgcgccg tcagcgggtt tgctctgagc aaccatggaa tgtcctgggt ccgccgggca 120 ccgggaaaag ggctggaatg ggtgtccggc atcgtgtaca gcgggtcaac ctattacgcc 180 gcgtccgtga agggcagatt cactatctca agagacaaca gccggaacac cctgtacttg 240 caaatgaatt ccctgcgccc cgaggacacc gccatctact actgctccgc ccacggagga 300 gagtcggacg tgtggggcca gggaacgact gtgactgtgt ccagcgcatc aggagggggt 360 ggttcgggcg gccgggcctc ggggggagga ggttccgaca ttcggctgac ccagtccccg 420 tccccactgt cggcctccgt cggcgaccgc gtgaccatca cttgtcaggc gtccgaggac 480 attaacaagt tcctgaactg gtaccaccag acccctggaa aggcccccaa gctgctgatc 540 tacgatgcct cgacccttca aactggagtg cctagccggt tctccgggtc cggctccggc 600 actgatttca ctctgaccat caactcattg cagccggaag atatcgggac ctactattgc 660 cagcagtacg aatccctccc gctcacattc ggcgggggaa ccaaggtcga gattaag 717 <210> 67 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 67 gaagtgcaat tggtggaaac tggaggagga cttgtgcaac ctggaggatc attgcggctc 60 tcatgcgctg tctccggctt cgccctgtca aatcacggga tgtcgtgggt cagacgggcc 120 ccgggaaagg gtctggaatg ggtgtcgggg attgtgtaca gcggctccac ctactacgcc 180 gcttcggtca agggccgctt cactatttca cgggacaaca gccgcaacac cctctatctg 240 caaatgaact ctctccgccc ggaggatacc gccatctact actgctccgc acacggcggc 300 gaatccgacg tgtggggaca gggaaccact gtcaccgtgt cgtccgcatc cggtggcgga 360 ggatcgggtg gccgggcctc cgggggcggc ggcagcgaga ctaccctgac ccagtcccct 420 gccactctgt ccgtgagccc gggagagaga gccaccctta gctgccgggc cagccagagc 480 gtgggctcca acctggcctg gtaccagcag aagccaggac agggtcccag gctgctgatc 540 tacggagcct ccactcgcgc gaccggcatc cccgcgaggt tctccgggtc gggttccggg 600 accgagttca ccctgaccat ctcctccctc caaccggagg acttcgcggt gtactactgt 660 cagcagtaca acgattggct gcccgtgaca tttggacagg ggacgaaggt ggaaatcaaa 720 <210> 68 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 68 gaagtgcaat tggtggaatc tggtggagga cttgtgcaac ctggaggatc actgagactg 60 tcatgcgcgg tgtccggttt tgccctgagc aatcatggga tgtcgtgggt ccggcgcgcc 120 cccggaaagg gtctggaatg ggtgtcgggt atcgtctact ccgggagcac ttactacgcc 180 gcgagcgtga agggccgctt caccatttcc cgcgataact cccgcaacac cctgtacttg 240 caaatgaact cgctccggcc tgaggacact gccatctact actgctccgc acacggagga 300 gaatccgacg tgtggggcca gggaactacc gtgaccgtca gcagcgcctc cggcggcggg 360 ggctcaggcg gacgggctag cggcggcggt ggctccgaga tcgtgctgac ccagtcgcct 420 ggcactctct cgctgagccc cggggaaagg gcaaccctgt cctgtcgggc cagccagtcc 480 attggatcat cctccctcgc ctggtatcag cagaaaccgg gacaggctcc gcggctgctt 540 atgtatgggg ccagctcaag agcctccggc attcccgacc ggttctccgg gtccggttcc 600 ggcaccgatt tcaccctgac tatctcgagg ctggagccag aggacttcgc cgtgtactac 660 tgccagcagt acgcggggtc cccgccgttc acgttcggac agggaaccaa ggtcgagatc 720 aag 723 <210> 69 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 69 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gly Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Arg Ser Gly Glu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Ala His Tyr Tyr Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 72 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Thr Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Asp Asn Phe 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Lys Asn Asn Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gln Ser Tyr Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 73 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 73 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asp 20 25 30 Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 90 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 91 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 91 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Lys 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Met 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly 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tgaggcctgt gcagactact caagaggagg acggctgttc atgccggttc 1080 ccagaggagg aggaaggcgg ctgcgaactg cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct 1140 ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag 1200 gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc 1260 agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc 1320 tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc agaagaggca aaggccacga cggactgtac 1380 cagggactca gcaccgccac caaggacacc tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg 1440 cctcgg 1446 <210> 121 <211> 1449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 121 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtgc aattggtgga aactggagga ggacttgtgc aacctggagg atcattgaga 120 ctgagctgcg cagtgtcggg attcgccctg agcaaccatg gaatgtcctg ggtcagaagg 180 gcccctggaa aaggcctcga atgggtgtca gggatcgtgt actccggttc cacttactac 240 gccgcctccg tgaaggggcg cttcactatc tcacgggata actcccgcaa taccctgtac 300 ctccaaatga acagcctgcg gccggaggat accgccatct actactgttc cgcccacggt 360 ggagagtctg acgtctgggg ccagggaact accgtgaccg tgtcctccgc gtccggcggt 420 ggagggagcg gcggccgcgc cagcggcggc ggaggctccg agatcgtgat gacccagagc 480 cccgctactc tgtcggtgtc gcccggagaa agggcgaccc tgtcctgccg ggcgtcgcag 540 tccgtgagca gcaagctggc ttggtaccag cagaagccgg gccaggcacc acgcctgctt 600 atgtacggtg cctccattcg ggccaccgga atcccggacc ggttctcggg gtcggggtcc 660 ggtaccgagt tcacactgac catttcctcg ctcgagcccg aggactttgc cgtctattac 720 tgccagcagt acggctcctc ctcatggacg ttcggccagg ggaccaaggt cgaaatcaag 780 accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 840 tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 900 gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg 960 ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt 1020 aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg 1080 ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat 1140 gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga 1200 gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg 1260 cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa 1320 gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg 1380 taccagggac tcagcaccgc caccaaggac acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg 1440 ccgcctcgg 1449 <210> 122 <211> 1455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 122 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtgc aattggtgga gactggagga ggagtggtgc aacctggagg aagcctgaga 120 ctgtcatgcg cggtgtcggg cttcgccctc tccaaccacg gaatgtcctg ggtccgccgg 180 gcccctggga aaggacttga atgggtgtcc ggcatcgtgt actcgggttc cacctactac 240 gcggcctcag tgaagggccg gtttactatt agccgcgaca actccagaaa cacactgtac 300 ctccaaatga actcgctgcg gccggaagat accgctatct actactgctc cgcccatggg 360 ggagagtcgg acgtctgggg acagggcacc actgtcactg tgtccagcgc ttccggcggt 420 ggtggaagcg ggggacgggc ctcaggaggc ggtggcagcg agattgtgct gacccagtcc 480 cccgggaccc tgagcctgtc cccgggagaa agggccaccc tctcctgtcg ggcatcccag 540 tccgtggggt ctactaacct tgcatggtac cagcagaagc ccggccaggc ccctcgcctg 600 ctgatctacg acgcgtccaa tagagccacc ggcatcccgg atcgcttcag cggaggcgga 660 tcgggcaccg acttcaccct caccatttca aggctggaac cggaggactt cgccgtgtac 720 tactgccagc agtatggttc gtccccaccc tggacgttcg gccaggggac taaggtcgag 780 atcaagacca ctaccccagc accgaggcca cccaccccgg ctcctaccat cgcctcccag 840 cctctgtccc tgcgtccgga ggcatgtaga cccgcagctg gtggggccgt gcatacccgg 900 ggtcttgact tcgcctgcga tatctacatt tgggcccctc tggctggtac ttgcggggtc 960 ctgctgcttt cactcgtgat cactctttac tgtaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac 1020 atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg cagactactc aagaggagga cggctgttca 1080 tgccggttcc cagaggagga ggaaggcggc tgcgaactgc gcgtgaaatt cagccgcagc 1140 gcagatgctc cagcctacaa gcaggggcag aaccagctct acaacgaact caatcttggt 1200 cggagagagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggac gggacccaga aatgggcggg 1260 aagccgcgca gaaagaatcc ccaagagggc ctgtacaacg agctccaaaa ggataagatg 1320 gcagaagcct atagcgagat tggtatgaaa ggggaacgca gaagaggcaa aggccacgac 1380 ggactgtacc agggactcag caccgccacc aaggacacct atgacgctct tcacatgcag 1440 gccctgccgc ctcgg 1455 <210> 123 <211> 1449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 123 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc aactcgtgga atctggtgga ggactcgtga aacctggagg atcattgaga 120 ctgtcatgcg cggcctcggg attcacgttc tccgattact acatgagctg gattcgccag 180 gctccgggga agggactgga atgggtgtcc tacatttcct catccggctc caccatctac 240 tacgcggact ccgtgaaggg gagattcacc attagccgcg ataacgccaa gaacagcctg 300 taccttcaga tgaactccct gcgggctgaa gatactgccg tctactactg cgcaagggag 360 agcggagatg ggatggacgt ctggggacag ggtaccactg tgaccgtgtc gtcggcctcc 420 ggcggagggg gttcgggtgg aagggccagc ggcggcggag gcagcgacat ccagatgacc 480 cagtccccct catcgctgtc cgcctccgtg ggcgaccgcg tcaccatcac atgccgggcc 540 tcacagtcga tctcctccta cctcaattgg tatcagcaga agcccggaaa ggcccctaag 600 cttctgatct acgcagcgtc ctccctgcaa tccggggtcc catctcggtt ctccggctcg 660 ggcagcggta ccgacttcac tctgaccatc tcgagcctgc agccggagga cttcgccact 720 tactactgtc agcaaagcta caccctcgcg tttggccagg gcaccaaagt ggacatcaag 780 accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 840 tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 900 gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg 960 ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt 1020 aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg 1080 ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat 1140 gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga 1200 gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg 1260 cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa 1320 gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg 1380 taccagggac tcagcaccgc caccaaggac acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg 1440 ccgcctcgg 1449 <210> 124 <211> 1449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 124 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtgc aattggtgga atcaggggga ggacttgtgc agcctggagg atcgctgaga 120 ctgtcatgtg ccgtgtccgg ctttgccctg tccaaccacg ggatgtcctg ggtccgccgc 180 gcgcctggaa agggcctcga atgggtgtcg ggtattgtgt acagcggtag cacctactat 240 gccgcatccg tgaaggggag attcaccatc agccgggaca actccaggaa cactctgtac 300 ctccaaatga attcgctgag gccagaggac actgccatct actactgctc cgcgcatggc 360 ggagagtccg acgtctgggg acaggggacc accgtgaccg tgtctagcgc gtccggcgga 420 ggcggcagcg ggggtcgggc atcagggggc ggcggatcgg acatccagct cacccagtcc 480 ccgagctcgc tgtccgcctc cgtgggagat cgggtcacca tcacgtgccg cgccagccag 540 tcgatttcct cctacctgaa ctggtaccaa cagaagcccg gaaaagcccc gaagcttctc 600 atctacgccg cctcgagcct gcagtcagga gtgccctcac ggttctccgg ctccggttcc 660 ggtactgatt tcaccctgac catttcctcc ctgcaaccgg aggacttcgc tacttactac 720 tgccagcagt cgtactccac cccctacact ttcggacaag gcaccaaggt cgaaatcaag 780 accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 840 tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 900 gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg 960 ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt 1020 aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg 1080 ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat 1140 gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga 1200 gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg 1260 cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa 1320 gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg 1380 taccagggac tcagcaccgc caccaaggac acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg 1440 ccgcctcgg 1449 <210> 125 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 125 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc aactggtgca aagcggagga ggattggtca aacccggagg aagcctgaga 120 ctgtcatgcg cggcctctgg attcaccttc tccgattact acatgtcatg gatcagacag 180 gccccgggga agggcctcga atgggtgtcc tacatctcgt cctccgggaa caccatctac 240 tacgccgaca gcgtgaaggg ccgctttacc atttcccgcg acaacgcaaa gaactcgctg 300 taccttcaga tgaattccct gcgggctgaa gataccgcgg tgtactattg cgcccggtcc 360 actatggtcc gggaggacta ctggggacag ggcacactcg tgaccgtgtc cagcgcgagc 420 gggggtggag gcagcggtgg acgcgcctcc ggcggcggcg gttcagacat cgtgctgact 480 cagtcgcccc tgtcgctgcc ggtcaccctg ggccaaccgg cctcaattag ctgcaagtcc 540 tcggagagcc tggtgcacaa ctcaggaaag acttacctga actggttcca tcagcggcct 600 ggacagtccc cacggaggct catctatgaa gtgtccaaca gggattcggg ggtgcccgac 660 cgcttcactg gctccgggtc cggcaccgac ttcaccttga aaatctccag agtggaagcc 720 gaggacgtgg gcgtgtacta ctgtatgcag ggtacccact ggcctggaac ctttggacaa 780 ggaactaagc tcgagattaa gaccactacc ccagcaccga ggccacccac cccggctcct 840 accatcgcct cccagcctct gtccctgcgt ccggaggcat gtagacccgc agctggtggg 900 gccgtgcata cccggggtct tgacttcgcc tgcgatatct acatttgggc ccctctggct 960 ggtacttgcg gggtcctgct gctttcactc gtgatcactc tttactgtaa gcgcggtcgg 1020 aagaagctgc tgtacatctt taagcaaccc ttcatgaggc ctgtgcagac tactcaagag 1080 gaggacggct gttcatgccg gttcccagag gaggaggaag gcggctgcga actgcgcgtg 1140 aaattcagcc gcagcgcaga tgctccagcc tacaagcagg ggcagaacca gctctacaac 1200 gaactcaatc ttggtcggag agaggagtac gacgtgctgg acaagcggag aggacgggac 1260 ccagaaatgg gcgggaagcc gcgcagaaag aatccccaag agggcctgta caacgagctc 1320 caaaaggata agatggcaga agcctatagc gagattggta tgaaagggga acgcagaaga 1380 ggcaaaggcc acgacggact gtaccaggga ctcagcaccg ccaccaagga cacctatgac 1440 gctcttcaca tgcaggccct gccgcctcgg 1470 <210> 126 <211> 1449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 126 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc aactcgtgga atctggtgga ggactcgtgc aacccggtgg aagccttagg 120 ctgtcgtgcg ccgtcagcgg gtttgctctg agcaaccatg gaatgtcctg ggtccgccgg 180 gcaccgggaa aagggctgga atgggtgtcc ggcatcgtgt acagcgggtc aacctattac 240 gccgcgtccg tgaagggcag attcactatc tcaagagaca acagccggaa caccctgtac 300 ttgcaaatga attccctgcg ccccgaggac accgccatct actactgctc cgcccacgga 360 ggagagtcgg acgtgtgggg ccagggaacg actgtgactg tgtccagcgc atcaggaggg 420 ggtggttcgg gcggccgggc ctcgggggga ggaggttccg acattcggct gacccagtcc 480 ccgtccccac tgtcggcctc cgtcggcgac cgcgtgacca tcacttgtca ggcgtccgag 540 gacattaaca agttcctgaa ctggtaccac cagacccctg gaaaggcccc caagctgctg 600 atctacgatg cctcgaccct tcaaactgga gtgcctagcc ggttctccgg gtccggctcc 660 ggcactgatt tcactctgac catcaactca ttgcagccgg aagatatcgg gacctactat 720 tgccagcagt acgaatccct cccgctcaca ttcggcgggg gaaccaaggt cgagattaag 780 accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 840 tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 900 gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg 960 ctttcactcg tgatcactct ttactgtaag cgcggtcgga agaagctgct gtacatcttt 1020 aagcaaccct tcatgaggcc tgtgcagact actcaagagg aggacggctg ttcatgccgg 1080 ttcccagagg aggaggaagg cggctgcgaa ctgcgcgtga aattcagccg cagcgcagat 1140 gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag ctctacaacg aactcaatct tggtcggaga 1200 gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga ggacgggacc cagaaatggg cgggaagccg 1260 cgcagaaaga atccccaaga gggcctgtac aacgagctcc aaaaggataa gatggcagaa 1320 gcctatagcg agattggtat gaaaggggaa cgcagaagag gcaaaggcca cgacggactg 1380 taccagggac tcagcaccgc caccaaggac acctatgacg ctcttcacat gcaggccctg 1440 ccgcctcgg 1449 <210> 127 <211> 1452 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 127 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtgc aattggtgga aactggagga ggacttgtgc aacctggagg atcattgcgg 120 ctctcatgcg ctgtctccgg cttcgccctg tcaaatcacg ggatgtcgtg ggtcagacgg 180 gccccgggaa 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actcgctccg gcctgaggac actgccatct actactgctc cgcacacgga 360 ggagaatccg acgtgtgggg ccagggaact accgtgaccg tcagcagcgc ctccggcggc 420 gggggctcag gcggacgggc tagcggcggc ggtggctccg agatcgtgct gacccagtcg 480 cctggcactc tctcgctgag ccccggggaa agggcaaccc tgtcctgtcg ggccagccag 540 tccattggat catcctccct cgcctggtat cagcagaaac cgggacaggc tccgcggctg 600 cttatgtatg gggccagctc aagagcctcc ggcattcccg accggttctc cgggtccggt 660 tccggcaccg atttcaccct gactatctcg aggctggagc cagaggactt cgccgtgtac 720 tactgccagc agtacgcggg gtccccgccg ttcacgttcg gacagggaac caaggtcgag 780 atcaagacca ctaccccagc accgaggcca cccaccccgg ctcctaccat cgcctcccag 840 cctctgtccc tgcgtccgga ggcatgtaga cccgcagctg gtggggccgt gcatacccgg 900 ggtcttgact tcgcctgcga tatctacatt tgggcccctc tggctggtac ttgcggggtc 960 ctgctgcttt cactcgtgat cactctttac tgtaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac 1020 atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg cagactactc aagaggagga cggctgttca 1080 tgccggttcc cagaggagga ggaaggcggc tgcgaactgc gcgtgaaatt cagccgcagc 1140 gcagatgctc cagcctacaa 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 131 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Ile Ala Ala Val Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser 130 135 140 Leu Pro Val Thr Pro Glu Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 145 150 155 160 Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn 180 185 190 Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 141 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gly Lys Ala Val Pro Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser 130 135 140 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 145 150 155 160 Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 165 170 175 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 180 185 190 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 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Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Leu Trp Phe Gly Glu Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 130 135 140 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 145 150 155 160 Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala 180 185 190 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 195 200 205 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 210 215 220 Cys Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Val Asp Ile Lys <210> 148 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 148 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Gly Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Arg Asp Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val 130 135 140 Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala 145 150 155 160 Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly 180 185 190 Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Ser Asp Arg Phe Ser Gly 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Ile Val Leu Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ala Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Gly Arg 180 185 190 Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln His Tyr Gly Gly Ser Pro Arg Leu Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Val Asp Ile Lys 245 <210> 150 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 150 caagtgcagc ttcaggaaag cggaccgggc ctggtcaagc catccgaaac tctctccctg 60 acttgcactg tgtctggcgg ttccatctca tcgtcgtact actactgggg ctggattagg 120 cagccgcccg gaaagggact ggagtggatc ggaagcatct actattccgg ctcggcgtac 180 tacaacccta gcctcaagtc gagagtgacc atctccgtgg atacctccaa gaaccagttt 240 tccctgcgcc tgagctccgt gaccgccgct gacaccgccg tgtactactg tgctcggcat 300 tggcaggaat ggcccgatgc cttcgacatt tggggccagg gcactatggt cactgtgtca 360 tccgggggtg gaggcagcgg gggaggaggg tccggggggg gaggttcaga gacaaccttg 420 acccagtcac ccgcattcat gtccgccact ccgggagaca aggtcatcat ctcgtgcaaa 480 gcgtcccagg atatcgacga tgccatgaat tggtaccagc agaagcctgg cgaagcgccg 540 ctgttcatta tccaatccgc aacctcgccc gtgcctggaa tcccaccgcg gttcagcggc 600 agcggtttcg gaaccgactt ttccctgacc attaacaaca ttgagtccga ggacgccgcc 660 tactacttct gcctgcaaca cgacaacttc cctctcacgt tcggccaggg aaccaagctg 720 gaaatcaag 729 <210> 151 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 151 caagtcaatc tgcgcgaatc cggccccgcc ttggtcaagc ctacccagac cctcactctg 60 acctgtactt tctccggctt ctccctgcgg acttccggga tgtgcgtgtc ctggatcaga 120 cagcctccgg gaaaggccct ggagtggctc gctcgcattg actgggatga ggacaagttc 180 tactccacct cactcaagac caggctgacc atcagcaaag atacctctga caaccaagtg 240 gtgctccgca tgaccaacat ggacccagcc gacactgcca cttactactg cgcgaggagc 300 ggagcgggcg gaacctccgc caccgccttc gatatttggg gcccgggtac catggtcacc 360 gtgtcaagcg gaggaggggg gtccgggggc ggcggttccg ggggaggcgg atcggacatt 420 cagatgactc agtcaccatc gtccctgagc gctagcgtgg gcgacagagt gacaatcact 480 tgccgggcat cccaggacat ctataacaac cttgcgtggt tccagctgaa gcctggttcc 540 gcaccgcggt cacttatgta cgccgccaac aagagccagt cgggagtgcc gtcccggttt 600 tccggttcgg cctcgggaac tgacttcacc ctgacgatct ccagcctgca acccgaggat 660 ttcgccacct actactgcca gcactactac cgctttccct actcgttcgg acagggaacc 720 aagctggaaa tcaag 735 <210> 152 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 152 gaagtgcagc ttgtcgaatc cgggggggga ctggtcaagc cgggcggatc actgagactg 60 tcctgcgccg cgagcggctt cacgttctcc tcctactcca tgaactgggt ccgccaagcc 120 cccgggaagg gactggaatg ggtgtcctct atctcctcgt cgtcgtccta catctactac 180 gccgactccg tgaagggaag attcaccatt tcccgcgaca acgcaaagaa ctcactgtac 240 ttgcaaatga actcactccg ggccgaagat actgctgtgt actattgcgc caagactatt 300 gccgccgtct acgctttcga catctggggc cagggaacca ccgtgactgt gtcgtccggt 360 ggtggtggct cgggcggagg aggaagcggc ggcggggggt ccgagattgt gctgacccag 420 tcgccactga gcctccctgt gacccccgag gaacccgcca gcatcagctg ccggtccagc 480 cagtccctgc tccactccaa cggatacaat tacctcgatt ggtaccttca gaagcctgga 540 caaagcccgc agctgctcat ctacttggga tcaaaccgcg cgtcaggagt gcctgaccgg 600 ttctccggct cgggcagcgg taccgatttc accctgaaaa tctccagggt ggaggcagag 660 gacgtgggag tgtattactg tatgcaggcg ctgcagactc cgtacacatt tgggcagggc 720 accaagctgg agatcaag 738 <210> 153 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 153 gaagtccagc tcgtggagtc cggcggaggc cttgtgaagc ctggaggttc gctgagactg 60 tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc gactactaca tgtcctggat cagacaggcc 120 ccgggaaagg gcctggaatg ggtgtcctac atctcgtcat cgggcagcac tatctactac 180 gcggactcag tgaaggggcg gttcaccatt tcccgggata acgcgaagaa ctcgctgtat 240 ctgcaaatga actcactgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccgcgatctc 300 cgcggggcat ttgacatctg gggacaggga accatggtca cagtgtccag cggaggggga 360 ggatcgggtg gcggaggttc cgggggtgga ggctcctcct acgtgctgac tcagagccca 420 agcgtcagcg ctgcgcccgg ttacacggca accatctcct gtggcggaaa caacattggg 480 accaagtctg tgcactggta tcagcagaag ccgggccaag ctcccctgtt ggtgatccgc 540 gatgactccg tgcggcctag caaaattccg ggacggttct ccggctccaa cagcggcaat 600 atggccactc tcaccatctc gggagtgcag gccggagatg aagccgactt ctactgccaa 660 gtctgggact cagactccga gcatgtggtg ttcgggggcg gaaccaagct gactgtgctc 720 <210> 154 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 154 caagtgcagc tggtgcagag cggggccgaa gtcaagaagc cgggagcctc cgtgaaagtg 60 tcctgcaagc cttcgggata caccgtgacc tcccactaca ttcattgggt ccgccgcgcc 120 cccggccaag gactcgagtg gatgggcatg atcaacccta gcggcggagt gaccgcgtac 180 agccagacgc tgcagggacg cgtgactatg acctcggata cctcctcctc caccgtctat 240 atggaactgt ccagcctgcg gtccgaggat accgccatgt actactgcgc ccgggaagga 300 tcaggctccg ggtggtattt cgacttctgg ggaagaggca ccctcgtgac tgtgtcatct 360 gggggagggg gttccggtgg tggcggatcg ggaggaggcg gttcatccta cgtgctgacc 420 cagccaccct ccgtgtccgt gagccccggc cagactgcat cgattacatg tagcggcgac 480 ggcctctcca agaaatacgt gtcgtggtac cagcagaagg ccggacagag cccggtggtg 540 ctgatctcaa gagataagga gcggcctagc ggaatcccgg acaggttctc gggttccaac 600 tccgcggaca ctgctactct gaccatctcg gggacccagg ctatggacga agccgattac 660 tactgccaag cctgggacga cactactgtc gtgtttggag ggggcaccaa gttgaccgtc 720 ctt 723 <210> 155 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 155 caagtgcagc ttcaggagag cggcccggga ctcgtgaagc cgtcccagac cctgtccctg 60 acttgcaccg tgtcgggagg aagcatctcg agcggaggct actattggtc gtggattcgg 120 cagcaccctg gaaagggcct ggaatggatc ggctacatct actactccgg ctcgacctac 180 tacaacccat cgctgaagtc cagagtgaca atctcagtgg acacgtccaa gaatcagttc 240 agcctgaagc tctcttccgt gactgcggcc gacaccgccg tgtactactg cgcacgcgct 300 ggaattgccg cccggctgag gggtgccttc gacatttggg gacagggcac catggtcacc 360 gtgtcctccg gcggcggagg ttccgggggt ggaggctcag gaggaggggg gtccgacatc 420 gtcatgactc agtcgccctc aagcgtcagc gcgtccgtcg gggacagagt gatcatcacc 480 tgtcgggcgt cccagggaat tcgcaactgg ctggcctggt atcagcagaa gcccggaaag 540 gcccccaacc tgttgatcta cgccgcctca aacctccaat ccggggtgcc gagccgcttc 600 agcggctccg gttcgggtgc cgatttcact ctgaccatct cctccctgca acctgaagat 660 gtggctacct actactgcca aaagtacaac tccgcacctt ttactttcgg accggggacc 720 aaagtggaca ttaag 735 <210> 156 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 156 caagtgcagc tggtccagtc gggcgccgag gtcaagaagc ccgggagctc tgtgaaagtg 60 tcctgcaagg cctccggggg cacctttagc tcctacgcca tctcctgggt ccgccaagca 120 ccgggtcaag gcctggagtg gatgggggga attatcccta tcttcggcac tgccaactac 180 gcccagaagt tccagggacg cgtgaccatt accgcggacg aatccacctc caccgcttat 240 atggagctgt ccagcttgcg ctcggaagat accgccgtgt actactgcgc ccggaggggt 300 ggataccagc tgctgagatg ggacgtgggc ctcctgcggt cggcgttcga catctggggc 360 cagggcacta tggtcactgt gtccagcgga ggaggcggat cgggaggcgg cggatcaggg 420 ggaggcggtt ccagctacgt gcttactcaa cccccttcgg tgtccgtggc cccgggacag 480 accgccagaa tcacttgcgg aggaaacaac attgggtcca agagcgtgca ttggtaccag 540 cagaagccag gacaggcccc tgtgctggtg ctctacggga agaacaatcg gcccagcgga 600 gtgccggaca ggttctcggg ttcacgctcc ggtacaaccg cttcactgac tatcaccggg 660 gcccaggcag aggatgaagc ggactactac tgttcctccc gggattcatc cggcgaccac 720 ctccgggtgt tcggaaccgg aacgaaggtc accgtgctg 759 <210> 157 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 157 gaagtgcagc tccaacagtc aggaccgggg ctcgtgaagc catcccagac cctgtccctg 60 acttgtgcca tctcgggaga tagcgtgtca tcgaactccg ccgcctggaa ctggattcgg 120 cagagcccgt cccgcggact ggagtggctt ggaaggacct actaccggtc caagtggtac 180 tctttctacg cgatctcgct gaagtcccgc attatcatta accctgatac ctccaagaat 240 cagttctccc tccaactgaa atccgtcacc cccgaggaca cagcagtgta ttactgcgca 300 cggagcagcc ccgaaggact gttcctgtat tggtttgacc cctggggcca ggggactctt 360 gtgaccgtgt cgagcggcgg agatgggtcc ggtggcggtg gttcgggggg cggcggatca 420 tcatccgaac tgacccagga cccggctgtg tccgtggcgc tgggacaaac catccgcatt 480 acgtgccagg gagactccct gggcaactac tacgccactt ggtaccagca gaagccgggc 540 caagcccctg tgttggtcat ctacgggacc aacaacagac cttccggcat ccccgaccgg 600 ttcagcgctt cgtcctccgg caacactgcc agcctgacca tcactggagc gcaggccgaa 660 gatgaggccg actactactg caacagcaga gactcctcgg gtcatcacct cttgttcgga 720 actggaacca aggtcaccgt gctg 744 <210> 158 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 158 gaagtgcagc tcgtggagtc aggaggcggc ctggtccagc cgggagggtc ccttagactg 60 tcatgcgccg caagcggatt cactttctcc tcctatgcca tgagctgggt ccgccaagcc 120 cccggaaagg gactggaatg ggtgtccgcc atctcggggt ctggaggctc aacttactac 180 gctgactccg tgaagggacg gttcaccatt agccgcgaca actccaagaa caccctctac 240 ctccaaatga actccctgcg ggccgaggat accgccgtct actactgcgc caaagtggaa 300 ggttcaggat cgctggacta ctggggacag ggtactctcg tgaccgtgtc atcgggcgga 360 ggaggttccg gcggtggcgg ctccggcggc ggagggtcgg agatcgtgat gacccagagc 420 cctggtactc tgagcctttc gccgggagaa agggccaccc tgtcctgccg cgcttcccaa 480 tccgtgtcct ccgcgtactt ggcgtggtac cagcagaagc cgggacagcc ccctcggctg 540 ctgatcagcg gggccagcac ccgggcaacc ggaatcccag acagattcgg gggttccggc 600 agcggcacag atttcaccct gactatttcg aggttggagc ccgaggactt tgcggtgtat 660 tactgtcagc actacgggtc gtcctttaat ggctccagcc tgttcacgtt cggacagggg 720 acccgcctgg aaatcaag 738 <210> 159 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 159 gaagtgcaac tggtggaaac cggtggcggc ctggtgcagc ctggaggatc attgaggctg 60 tcatgcgcgg ccagcggtat taccttctcc cggtacccca tgtcctgggt cagacaggcc 120 ccggggaaag ggcttgaatg ggtgtccggg atctcggact ccggtgtcag cacttactac 180 gccgactccg ccaagggacg cttcaccatt tcccgggaca actcgaagaa caccctgttc 240 ctccaaatga gctccctccg ggacgaggat actgcagtgt actactgcgt gacccgcgcc 300 gggtccgagg cgtctgacat ttggggacag ggcactatgg tcaccgtgtc gtccggcgga 360 gggggctcgg gaggcggtgg cagcggagga ggagggtccg agatcgtgct gacccaatcc 420 ccggccaccc tctcgctgag ccctggagaa agggcaacct tgtcctgtcg cgcgagccag 480 tccgtgagca actccctggc ctggtaccag cagaagcccg gacaggctcc gagacttctg 540 atctacgacg cttcgagccg ggccactgga atccccgacc gcttttcggg gtccggctca 600 ggaaccgatt tcaccctgac aatctcacgg ctggagccag aggatttcgc catctattac 660 tgccagcagt tcggtacttc ctccggcctg actttcggag gcggcacgaa gctcgaaatc 720 aag 723 <210> 160 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 160 caagtgcagc tcgtggaatc gggtggcgga ctggtgcagc cggggggctc acttagactg 60 tcctgcgcgg ccagcggatt cactttctcc tcctacgcca tgtcctgggt cagacaggcc 120 cctggaaagg gcctggaatg ggtgtccgca atcagcggca gcggcggctc gacctattac 180 gcggattcag tgaagggcag attcaccatt tcccgggaca acgccaagaa ctccttgtac 240 cttcaaatga actccctccg cgcggaagat accgcaatct actactgcgc tcgggccact 300 tacaagaggg aactgcgcta ctactacggg atggacgtct ggggccaggg aaccatggtc 360 accgtgtcca gcggaggagg aggatcggga ggaggcggta gcgggggtgg agggtcggag 420 atcgtgatga cccagtcccc cggcactgtg tcgctgtccc ccggcgaacg ggccaccctg 480 tcatgtcggg ccagccagtc agtgtcgtca agcttcctcg cctggtacca gcagaaaccg 540 ggacaagctc cccgcctgct gatctacgga gccagcagcc gggccaccgg tattcctgac 600 cggttctccg gttcggggtc cgggaccgac tttactctga ctatctctcg cctcgagcca 660 gaggactccg ccgtgtatta ctgccagcag taccactcct ccccgtcctg gacgttcgga 720 cagggcacaa ggctggagat taag 744 <210> 161 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 161 gaggtgcagc ttgtggaaac cggtggcgga ctggtgcagc ccggaggaag cctcaggctg 60 tcctgcgccg cgtccggctt caccttctcc tcgtacgcca tgtcctgggt ccgccaggcc 120 cccggaaagg gcctggaatg ggtgtccgcc atctctggaa gcggaggttc cacgtactac 180 gcggacagcg tcaagggaag gttcacaatc tcccgcgata attcgaagaa cactctgtac 240 cttcaaatga acaccctgaa ggccgaggac actgctgtgt actactgcgc acgggccacc 300 tacaagagag agctccggta ctactacgga atggacgtct ggggccaggg aactactgtg 360 accgtgtcct cgggaggggg tggctccggg gggggcggct ccggcggagg cggttccgag 420 attgtgctga cccagtcacc ttcaactctg tcgctgtccc cgggagagag cgctactctg 480 agctgccggg ccagccagtc cgtgtccacc accttcctcg cctggtatca gcagaagccg 540 gggcaggcac cacggctctt gatctacggg tcaagcaaca gagcgaccgg aattcctgac 600 cgcttctcgg ggagcggttc aggcaccgac ttcaccctga ctatccggcg cctggaaccc 660 gaagatttcg ccgtgtatta ctgtcaacag taccactcct cgccgtcctg gacctttggc 720 caaggaacca aagtggaaat caag 744 <210> 162 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 162 gaagtgcagc tcgtggaaac tggaggtgga ctcgtgcagc ctggacggtc gctgcggctg 60 agctgcgctg catccggctt caccttcgac gattatgcca tgcactgggt cagacaggcg 120 ccagggaagg gacttgagtg ggtgtccggt atcagctgga atagcggctc aatcggatac 180 gcggactccg tgaagggaag gttcaccatt tcccgcgaca acgccaagaa ctccctgtac 240 ttgcaaatga acagcctccg ggatgaggac actgccgtgt actactgcgc ccgcgtcgga 300 aaagctgtgc ccgacgtctg gggccaggga accactgtga ccgtgtccag cggcgggggt 360 ggatcgggcg gtggagggtc cggtggaggg ggctcagata ttgtgatgac ccagaccccc 420 tcgtccctgt ccgcctcggt cggcgaccgc gtgactatca catgtagagc ctcgcagagc 480 atctccagct acctgaactg gtatcagcag aagccgggga aggccccgaa gctcctgatc 540 tacgcggcat catcactgca atcgggagtg ccgagccggt tttccgggtc cggctccggc 600 accgacttca cgctgaccat ttcttccctg caacccgagg acttcgccac ttactactgc 660 cagcagtcct actccacccc ttactccttc ggccaaggaa ccaggctgga aatcaag 717 <210> 163 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 163 gaagtgcagc tcgtggagag cgggggagga ttggtgcagc ccggaaggtc cctgcggctc 60 tcctgcactg cgtctggctt caccttcgac gactacgcga tgcactgggt cagacagcgc 120 ccgggaaagg gcctggaatg ggtcgcctca atcaactgga agggaaactc cctggcctat 180 ggcgacagcg tgaagggccg cttcgccatt tcgcgcgaca acgccaagaa caccgtgttt 240 ctgcaaatga attccctgcg gaccgaggat accgctgtgt actactgcgc cagccaccag 300 ggcgtggcat actataacta cgccatggac gtgtggggaa gagggacgct cgtcaccgtg 360 tcctccgggg gcggtggatc gggtggagga ggaagcggtg gcgggggcag cgaaatcgtg 420 ctgactcaga gcccgggaac tctttcactg tccccgggag aacgggccac tctctcgtgc 480 cgggccaccc agtccatcgg ctcctccttc cttgcctggt accagcagag gccaggacag 540 gcgccccgcc tgctgatcta cggtgcttcc caacgcgcca ctggcattcc tgaccggttc 600 agcggcagag ggtcgggaac cgatttcaca ctgaccattt cccgggtgga gcccgaagat 660 tcggcagtct actactgtca gcattacgag tcctcccctt catggacctt cggtcaaggg 720 accaaagtgg agatcaag 738 <210> 164 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 164 gaggtgcagt tggtcgaaag cgggggcggg cttgtgcagc ctggcggatc actgcggctg 60 tcctgcgcgg catcaggctt cacgttttct tcctacgcca tgtcctgggt gcgccaggcc 120 cctggaaagg gactggaatg ggtgtccgcg atttcggggt ccggcgggag cacctactac 180 gccgattccg tgaagggccg cttcactatc tcgcgggaca actccaagaa caccctctac 240 ctccaaatga atagcctgcg ggccgaggat accgccgtct actattgcgc taaggtcgtg 300 cgcgacggaa tggacgtgtg gggacagggt accaccgtga cagtgtcctc ggggggaggc 360 ggtagcggcg gaggaggaag cggtggtgga ggttccgaga ttgtgctgac tcaatcaccc 420 gcgaccctga gcctgtcccc cggcgaaagg gccactctgt cctgtcgggc cagccaatca 480 gtctcctcct cgtacctggc ctggtaccag cagaagccag gacaggctcc gagactcctt 540 atctatggcg catcctcccg cgccaccgga atcccggata ggttctcggg aaacggatcg 600 gggaccgact tcactctcac catctcccgg ctggaaccgg aggacttcgc cgtgtactac 660 tgccagcagt acggcagccc gcctagattc actttcggcc ccggcaccaa agtggacatc 720 aag 723 <210> 165 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 165 gaagtgcagc tgctggagtc cggcggtgga ttggtgcaac cggggggatc gctcagactg 60 tcctgtgcgg cgtcaggctt caccttctcg agctacgcca tgtcatgggt cagacaggcc 120 cctggaaagg gtctggaatg ggtgtccgcc atttccggga gcgggggatc tacatactac 180 gccgatagcg tgaagggccg cttcaccatt tcccgggaca actccaagaa cactctctat 240 ctgcaaatga actccctccg cgctgaggac actgccgtgt actactgcgc caaaatccct 300 cagaccggca ccttcgacta ctggggacag gggactctgg tcaccgtcag cagcggtggc 360 ggaggttcgg ggggaggagg aagcggcggc ggagggtccg agattgtgct gacccagtca 420 cccggcactt tgtccctgtc gcctggagaa agggccaccc tttcctgccg ggcatcccaa 480 tccgtgtcct cctcgtacct ggcctggtac cagcagaggc ccggacaggc cccacggctt 540 ctgatctacg gagcaagcag ccgcgcgacc ggtatcccgg accggttttc gggctcgggc 600 tcaggaactg acttcaccct caccatctcc cgcctggaac ccgaagattt cgctgtgtat 660 tactgccagc actacggcag ctccccgtcc tggacgttcg gccagggaac tcggctggag 720 atcaag 726 <210> 166 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 166 gaagtgcaac tggtggaaac cggtggagga ctcgtgcagc ctggcggcag cctccggctg 60 agctgcgccg cttcgggatt caccttttcc tcctacgcga tgtcttgggt cagacaggcc 120 cccggaaagg ggctggaatg ggtgtcagcc atctccggct ccggcggatc aacgtactac 180 gccgactccg tgaaaggccg gttcaccatg tcgcgcgaga atgacaagaa ctccgtgttc 240 ctgcaaatga actccctgag ggtggaggac accggagtgt actattgtgc gcgcgccaac 300 tacaagagag agctgcggta ctactacgga atggacgtct ggggacaggg aactatggtg 360 accgtgtcat ccggtggagg gggaagcggc ggtggaggca gcgggggcgg gggttcagaa 420 attgtcatga cccagtcccc gggaactctt tccctctccc ccggggaatc cgcgactttg 480 tcctgccggg ccagccagcg cgtggcctcg aactacctcg catggtacca gcataagcca 540 ggccaagccc cttccctgct gatttccggg gctagcagcc gcgccactgg cgtgccggat 600 aggttctcgg gaagcggctc gggtaccgat ttcaccctgg caatctcgcg gctggaaccg 660 gaggattcgg ccgtgtacta ctgccagcac tatgactcat ccccctcctg gacattcgga 720 cagggcacca aggtcgagat caag 744 <210> 167 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 167 gaagtgcagc tgctcgaaac cggtggaggg ctggtgcagc cagggggctc cctgaggctt 60 tcatgcgccg ctagcggatt ctccttctcc tcttacgcca tgtcgtgggt ccgccaagcc 120 cctggaaaag gcctggaatg ggtgtccgcg atttccggga gcggaggttc gacctattac 180 gccgactccg tgaagggccg ctttaccatc tcccgggata actccaagaa cactctgtac 240 ctccaaatga actcgctgag agccgaggac accgccgtgt attactgcgc gaaggcgctg 300 gtcggcgcga ctggggcatt cgacatctgg ggacagggaa ctcttgtgac cgtgtcgagc 360 ggaggcggcg gctccggcgg aggagggagc gggggcggtg gttccgaaat cgtgttgact 420 cagtccccgg gaaccctgag cttgtcaccc ggggagcggg ccactctctc ctgtcgcgcc 480 tcccaatcgc tctcatccaa tttcctggcc tggtaccagc agaagcccgg acaggccccg 540 ggcctgctca tctacggcgc ttcaaactgg gcaacgggaa cccctgatcg gttcagcgga 600 agcggatcgg gtactgactt taccctgacc atcaccagac tggaaccgga ggacttcgcc 660 gtgtactact gccagtacta cggcacctcc cccatgtaca cattcggaca gggtaccaag 720 gtcgagatta ag 732 <210> 168 <211> 733 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 168 gaagtgcagc tgcttgagag cggtggaggt ctggtgcagc ccgggggatc actgcgcctg 60 tcctgtgccg cgtccggttt cactttctcc tcgtacgcca tgtcgtgggt cagacaggca 120 ccgggaaagg gactggaatg ggtgtcagcc atttcgggtt cggggggcag cacctactac 180 gctgactccg tgaagggccg gttcaccatt tcccgcgaca actccaagaa caccttgtac 240 ctccaaatga actccctgcg ggccgaagat accgccgtgt attactgcgt gctgtggttc 300 ggagagggat tcgacccgtg gggacaagga acactcgtga ctgtgtcatc cggcggaggc 360 ggcagcggtg gcggcggttc cggcggcggc ggatctgaca tcgtgttgac ccagtcccct 420 ctgagcctgc cggtcactcc tggcgaacca gccagcatct cctgccggtc gagccagtcc 480 ctcctgcact ccaatgggta caactacctc gattggtatc tgcaaaagcc gggccagagc 540 ccccagctgc tgatctacct tgggtcaaac cgcgcttccg gggtgcctga tagattctcc 600 gggtccggga gcggaaccga ctttaccctg aaaatctcga gggtggaggc cgaggacgtc 660 ggagtgtact actgcatgca ggcgctccag actcccctga ccttcggagg aggaacgaag 720 gtcgacatca aga 733 <210> 169 <211> 753 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 169 caagtgcagc tcgtggagtc aggcggagga ctggtgcagc ccgggggctc cctgagactt 60 tcctgcgcgg catcgggttt taccttctcc tcctatgcta tgtcctgggt gcgccaggcc 120 ccgggaaagg gactggaatg ggtgtccgca atcagcggta gcgggggctc aacatactac 180 gccgactccg tcaagggtcg cttcactatt tcccgggaca actccaagaa taccctgtac 240 ctccaaatga acagcctcag ggccgaggat actgccgtgt actactgcgc caaagtcgga 300 tacgatagct ccggttacta ccgggactac tacggaatgg acgtgtgggg acagggcacc 360 accgtgaccg tgtcaagcgg cggaggcggt tcaggagggg gaggctccgg cggtggaggg 420 tccgaaatcg tcctgactca gtcgcctggc actctgtcgt tgtccccggg ggagcgcgct 480 accctgtcgt gtcgggcgtc gcagtccgtg tcgagctcct acctcgcgtg gtaccagcag 540 aagcccggac aggcccctag acttctgatc tacggcactt cttcacgcgc caccgggatc 600 agcgacaggt tcagcggctc cggctccggg accgacttca ccctgaccat tagccggctg 660 gagcctgaag atttcgccgt gtattactgc caacactacg gaaactcgcc gccaaagttc 720 acgttcggac ccggaaccaa gctggaaatc aag 753 <210> 170 <211> 739 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 170 gaagtccaac tggtggagtc cgggggaggg ctcgtgcagc ccggaggcag ccttcggctg 60 tcgtgcgccg cctccgggtt cacgttctca tcctacgcga tgtcgtgggt cagacaggca 120 ccaggaaagg gactggaatg ggtgtccgcc attagcggct ccggcggtag cacctactat 180 gccgactcag tgaagggaag gttcactatc tcccgcgaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctccaaatga actctctgcg 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 201 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Thr Ser Ser Gly 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 202 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 202 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Val Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 233 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Met Gly Trp Ser Ser Gly Tyr Leu Gly 115 120 125 Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile 145 150 155 160 Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg 165 170 175 Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ala Ser Ser Phe Leu 180 185 190 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 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atttggggcc agggcactat ggtcactgtg 420 tcatccgggg gtggaggcag cgggggagga gggtccgggg ggggaggttc agagacaacc 480 ttgacccagt cacccgcatt catgtccgcc actccgggag acaaggtcat catctcgtgc 540 aaagcgtccc aggatatcga cgatgccatg aattggtacc agcagaagcc tggcgaagcg 600 ccgctgttca ttatccaatc cgcaacctcg cccgtgcctg gaatcccacc gcggttcagc 660 ggcagcggtt tcggaaccga cttttccctg accattaaca acattgagtc cgaggacgcc 720 gcctactact tctgcctgca acacgacaac ttccctctca cgttcggcca gggaaccaag 780 ctggaaatca agaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 840 tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 900 acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 960 ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg 1020 ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc 1080 tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 1140 cgcagcgcag atgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 1200 cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg 1260 ggcgggaagc cgcgcagaaa gaatccccaa gagggcctgt acaacgagct ccaaaaggat 1320 aagatggcag aagcctatag cgagattggt atgaaagggg aacgcagaag aggcaaaggc 1380 cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc gccaccaagg acacctatga cgctcttcac 1440 atgcaggccc tgccgcctcg g 1461 <210> 235 <211> 1467 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 235 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtca atctgcgcga atccggcccc gccttggtca agcctaccca gaccctcact 120 ctgacctgta ctttctccgg cttctccctg cggacttccg ggatgtgcgt gtcctggatc 180 agacagcctc cgggaaaggc cctggagtgg ctcgctcgca ttgactggga tgaggacaag 240 ttctactcca cctcactcaa gaccaggctg accatcagca aagatacctc tgacaaccaa 300 gtggtgctcc gcatgaccaa catggaccca gccgacactg ccacttacta ctgcgcgagg 360 agcggagcgg gcggaacctc cgccaccgcc ttcgatattt ggggcccggg taccatggtc 420 accgtgtcaa gcggaggagg ggggtccggg ggcggcggtt ccgggggagg cggatcggac 480 attcagatga ctcagtcacc atcgtccctg agcgctagcg tgggcgacag agtgacaatc 540 acttgccggg catcccagga catctataac aaccttgcgt ggttccagct gaagcctggt 600 tccgcaccgc ggtcacttat gtacgccgcc aacaagagcc agtcgggagt gccgtcccgg 660 ttttccggtt cggcctcggg aactgacttc accctgacga tctccagcct gcaacccgag 720 gatttcgcca cctactactg ccagcactac taccgctttc cctactcgtt cggacaggga 780 accaagctgg aaatcaagac cactacccca gcaccgaggc cacccacccc ggctcctacc 840 atcgcctccc agcctctgtc cctgcgtccg gaggcatgta gacccgcagc tggtggggcc 900 gtgcataccc ggggtcttga cttcgcctgc gatatctaca tttgggcccc tctggctggt 960 acttgcgggg tcctgctgct ttcactcgtg atcactcttt actgtaagcg cggtcggaag 1020 aagctgctgt acatctttaa gcaacccttc atgaggcctg tgcagactac tcaagaggag 1080 gacggctgtt catgccggtt cccagaggag gaggaaggcg gctgcgaact gcgcgtgaaa 1140 ttcagccgca gcgcagatgc tccagcctac aagcaggggc agaaccagct ctacaacgaa 1200 ctcaatcttg gtcggagaga ggagtacgac gtgctggaca agcggagagg acgggaccca 1260 gaaatgggcg ggaagccgcg cagaaagaat ccccaagagg gcctgtacaa cgagctccaa 1320 aaggataaga tggcagaagc ctatagcgag attggtatga aaggggaacg cagaagaggc 1380 aaaggccacg acggactgta ccagggactc agcaccgcca ccaaggacac ctatgacgct 1440 cttcacatgc aggccctgcc gcctcgg 1467 <210> 236 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 236 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtgc agcttgtcga atccgggggg ggactggtca agccgggcgg atcactgaga 120 ctgtcctgcg ccgcgagcgg cttcacgttc tcctcctact ccatgaactg ggtccgccaa 180 gcccccggga agggactgga atgggtgtcc tctatctcct cgtcgtcgtc ctacatctac 240 tacgccgact ccgtgaaggg aagattcacc atttcccgcg acaacgcaaa gaactcactg 300 tacttgcaaa tgaactcact ccgggccgaa gatactgctg tgtactattg cgccaagact 360 attgccgccg tctacgcttt cgacatctgg ggccagggaa ccaccgtgac tgtgtcgtcc 420 ggtggtggtg gctcgggcgg aggaggaagc ggcggcgggg ggtccgagat tgtgctgacc 480 cagtcgccac tgagcctccc tgtgaccccc gaggaacccg ccagcatcag ctgccggtcc 540 agccagtccc tgctccactc caacggatac aattacctcg attggtacct tcagaagcct 600 ggacaaagcc cgcagctgct catctacttg ggatcaaacc gcgcgtcagg agtgcctgac 660 cggttctccg gctcgggcag cggtaccgat ttcaccctga aaatctccag ggtggaggca 720 gaggacgtgg gagtgtatta ctgtatgcag gcgctgcaga ctccgtacac atttgggcag 780 ggcaccaagc tggagatcaa gaccactacc ccagcaccga ggccacccac cccggctcct 840 accatcgcct cccagcctct gtccctgcgt ccggaggcat gtagacccgc agctggtggg 900 gccgtgcata cccggggtct tgacttcgcc tgcgatatct acatttgggc ccctctggct 960 ggtacttgcg gggtcctgct gctttcactc gtgatcactc tttactgtaa gcgcggtcgg 1020 aagaagctgc tgtacatctt taagcaaccc ttcatgaggc ctgtgcagac tactcaagag 1080 gaggacggct gttcatgccg gttcccagag gaggaggaag gcggctgcga actgcgcgtg 1140 aaattcagcc gcagcgcaga tgctccagcc tacaagcagg ggcagaacca gctctacaac 1200 gaactcaatc ttggtcggag agaggagtac gacgtgctgg acaagcggag aggacgggac 1260 ccagaaatgg gcgggaagcc gcgcagaaag aatccccaag agggcctgta caacgagctc 1320 caaaaggata agatggcaga agcctatagc gagattggta tgaaagggga acgcagaaga 1380 ggcaaaggcc acgacggact gtaccaggga ctcagcaccg ccaccaagga cacctatgac 1440 gctcttcaca tgcaggccct gccgcctcgg 1470 <210> 237 <211> 1452 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 237 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtcc agctcgtgga gtccggcgga ggccttgtga agcctggagg ttcgctgaga 120 ctgtcctgcg ccgcctccgg cttcaccttc tccgactact acatgtcctg gatcagacag 180 gccccgggaa agggcctgga atgggtgtcc tacatctcgt catcgggcag cactatctac 240 tacgcggact cagtgaaggg gcggttcacc atttcccggg ataacgcgaa gaactcgctg 300 tatctgcaaa tgaactcact gagggccgag gacaccgccg tgtactactg cgcccgcgat 360 ctccgcgggg catttgacat ctggggacag ggaaccatgg tcacagtgtc cagcggaggg 420 ggaggatcgg gtggcggagg ttccgggggt ggaggctcct cctacgtgct gactcagagc 480 ccaagcgtca gcgctgcgcc cggttacacg gcaaccatct cctgtggcgg aaacaacatt 540 gggaccaagt ctgtgcactg gtatcagcag aagccgggcc aagctcccct gttggtgatc 600 cgcgatgact ccgtgcggcc tagcaaaatt ccgggacggt tctccggctc caacagcggc 660 aatatggcca ctctcaccat ctcgggagtg caggccggag atgaagccga cttctactgc 720 caagtctggg 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atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc agctggtgca gagcggggcc gaagtcaaga agccgggagc ctccgtgaaa 120 gtgtcctgca agccttcggg atacaccgtg acctcccact acattcattg ggtccgccgc 180 gcccccggcc aaggactcga gtggatgggc atgatcaacc ctagcggcgg agtgaccgcg 240 tacagccaga cgctgcaggg acgcgtgact atgacctcgg atacctcctc ctccaccgtc 300 tatatggaac tgtccagcct gcggtccgag gataccgcca tgtactactg cgcccgggaa 360 ggatcaggct ccgggtggta tttcgacttc tggggaagag gcaccctcgt gactgtgtca 420 tctgggggag ggggttccgg tggtggcgga tcgggaggag gcggttcatc ctacgtgctg 480 acccagccac cctccgtgtc cgtgagcccc ggccagactg catcgattac atgtagcggc 540 gacggcctct ccaagaaata cgtgtcgtgg taccagcaga aggccggaca gagcccggtg 600 gtgctgatct caagagataa ggagcggcct agcggaatcc cggacaggtt ctcgggttcc 660 aactccgcgg acactgctac tctgaccatc tcggggaccc aggctatgga cgaagccgat 720 tactactgcc aagcctggga cgacactact gtcgtgtttg gagggggcac caagttgacc 780 gtccttacca ctaccccagc accgaggcca cccaccccgg ctcctaccat cgcctcccag 840 cctctgtccc tgcgtccgga 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 245 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaggtgc agcttgtgga aaccggtggc ggactggtgc agcccggagg aagcctcagg 120 ctgtcctgcg ccgcgtccgg cttcaccttc tcctcgtacg ccatgtcctg ggtccgccag 180 gcccccggaa agggcctgga atgggtgtcc gccatctctg gaagcggagg ttccacgtac 240 tacgcggaca gcgtcaaggg aaggttcaca atctcccgcg ataattcgaa gaacactctg 300 taccttcaaa tgaacaccct gaaggccgag gacactgctg tgtactactg cgcacgggcc 360 acctacaaga gagagctccg gtactactac ggaatggacg tctggggcca gggaactact 420 gtgaccgtgt cctcgggagg gggtggctcc ggggggggcg gctccggcgg aggcggttcc 480 gagattgtgc tgacccagtc accttcaact ctgtcgctgt ccccgggaga gagcgctact 540 ctgagctgcc gggccagcca gtccgtgtcc accaccttcc tcgcctggta tcagcagaag 600 ccggggcagg caccacggct cttgatctac gggtcaagca acagagcgac cggaattcct 660 gaccgcttct cggggagcgg ttcaggcacc gacttcaccc tgactatccg gcgcctggaa 720 cccgaagatt tcgccgtgta ttactgtcaa cagtaccact cctcgccgtc 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tttactgtaa gcgcggtcgg 1020 aagaagctgc tgtacatctt taagcaaccc ttcatgaggc ctgtgcagac tactcaagag 1080 gaggacggct gttcatgccg gttcccagag gaggaggaag gcggctgcga actgcgcgtg 1140 aaattcagcc gcagcgcaga tgctccagcc tacaagcagg ggcagaacca gctctacaac 1200 gaactcaatc ttggtcggag agaggagtac gacgtgctgg acaagcggag aggacgggac 1260 ccagaaatgg gcgggaagcc gcgcagaaag aatccccaag agggcctgta caacgagctc 1320 caaaaggata agatggcaga agcctatagc gagattggta tgaaagggga acgcagaaga 1380 ggcaaaggcc acgacggact gtaccaggga ctcagcaccg ccaccaagga cacctatgac 1440 gctcttcaca tgcaggccct gccgcctcgg 1470 <210> 248 <211> 1455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 248 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaggtgc agttggtcga aagcgggggc gggcttgtgc agcctggcgg atcactgcgg 120 ctgtcctgcg cggcatcagg cttcacgttt tcttcctacg ccatgtcctg ggtgcgccag 180 gcccctggaa agggactgga atgggtgtcc gcgatttcgg ggtccggcgg gagcacctac 240 tacgccgatt 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600 ccgggcctgc tcatctacgg cgcttcaaac tgggcaacgg gaacccctga tcggttcagc 660 ggaagcggat cgggtactga ctttaccctg accatcacca gactggaacc ggaggacttc 720 gccgtgtact actgccagta ctacggcacc tcccccatgt acacattcgg acagggtacc 780 aaggtcgaga ttaagaccac taccccagca ccgaggccac ccaccccggc tcctaccatc 840 gcctcccagc ctctgtccct gcgtccggag gcatgtagac ccgcagctgg tggggccgtg 900 catacccggg gtcttgactt cgcctgcgat atctacattt gggcccctct ggctggtact 960 tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc actctttact gtaagcgcgg tcggaagaag 1020 ctgctgtaca tctttaagca acccttcatg aggcctgtgc agactactca agaggaggac 1080 ggctgttcat gccggttccc agaggaggag gaaggcggct gcgaactgcg cgtgaaattc 1140 agccgcagcg cagatgctcc agcctacaag caggggcaga accagctcta caacgaactc 1200 aatcttggtc ggagagagga gtacgacgtg ctggacaagc ggagaggacg ggacccagaa 1260 atgggcggga agccgcgcag aaagaatccc caagagggcc tgtacaacga gctccaaaag 1320 gataagatgg cagaagccta tagcgagatt ggtatgaaag gggaacgcag aagaggcaaa 1380 ggccacgacg gactgtacca gggactcagc accgccacca aggacaccta tgacgctctt 1440 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ggccgaggac 720 gtcggagtgt actactgcat gcaggcgctc cagactcccc tgaccttcgg aggaggaacg 780 aaggtcgaca tcaagaccac taccccagca ccgaggccac ccaccccggc tcctaccatc 840 gcctcccagc ctctgtccct gcgtccggag gcatgtagac ccgcagctgg tggggccgtg 900 catacccggg gtcttgactt cgcctgcgat atctacattt gggcccctct ggctggtact 960 tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc actctttact gtaagcgcgg tcggaagaag 1020 ctgctgtaca tctttaagca acccttcatg aggcctgtgc agactactca agaggaggac 1080 ggctgttcat gccggttccc agaggaggag gaaggcggct gcgaactgcg cgtgaaattc 1140 agccgcagcg cagatgctcc agcctacaag caggggcaga accagctcta caacgaactc 1200 aatcttggtc ggagagagga gtacgacgtg ctggacaagc ggagaggacg ggacccagaa 1260 atgggcggga agccgcgcag aaagaatccc caagagggcc tgtacaacga gctccaaaag 1320 gataagatgg cagaagccta tagcgagatt ggtatgaaag gggaacgcag aagaggcaaa 1380 ggccacgacg gactgtacca gggactcagc accgccacca aggacaccta tgacgctctt 1440 cacatgcagg ccctgccgcc tcgg 1464 <210> 253 <211> 1485 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 253 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 ccccaagtgc agctcgtgga gtcaggcgga ggactggtgc agcccggggg ctccctgaga 120 ctttcctgcg cggcatcggg ttttaccttc tcctcctatg ctatgtcctg ggtgcgccag 180 gccccgggaa agggactgga atgggtgtcc gcaatcagcg gtagcggggg ctcaacatac 240 tacgccgact ccgtcaaggg tcgcttcact atttcccggg acaactccaa gaataccctg 300 tacctccaaa tgaacagcct cagggccgag gatactgccg tgtactactg cgccaaagtc 360 ggatacgata gctccggtta ctaccgggac tactacggaa tggacgtgtg gggacagggc 420 accaccgtga ccgtgtcaag cggcggaggc ggttcaggag ggggaggctc cggcggtgga 480 gggtccgaaa tcgtcctgac tcagtcgcct ggcactctgt cgttgtcccc gggggagcgc 540 gctaccctgt cgtgtcgggc gtcgcagtcc gtgtcgagct cctacctcgc gtggtaccag 600 cagaagcccg gacaggcccc tagacttctg atctacggca cttcttcacg cgccaccggg 660 atcagcgaca ggttcagcgg ctccggctcc gggaccgact tcaccctgac cattagccgg 720 ctggagcctg aagatttcgc cgtgtattac tgccaacact acggaaactc gccgccaaag 780 ttcacgttcg gacccggaac caagctggaa atcaagacca ctaccccagc accgaggcca 840 cccaccccgg ctcctaccat cgcctcccag cctctgtccc tgcgtccgga ggcatgtaga 900 cccgcagctg gtggggccgt gcatacccgg ggtcttgact tcgcctgcga tatctacatt 960 tgggcccctc tggctggtac ttgcggggtc ctgctgcttt cactcgtgat cactctttac 1020 tgtaagcgcg gtcggaagaa gctgctgtac atctttaagc aacccttcat gaggcctgtg 1080 cagactactc aagaggagga cggctgttca tgccggttcc cagaggagga ggaaggcggc 1140 tgcgaactgc gcgtgaaatt cagccgcagc gcagatgctc cagcctacaa gcaggggcag 1200 aaccagctct acaacgaact caatcttggt cggagagagg agtacgacgt gctggacaag 1260 cggagaggac gggacccaga aatgggcggg aagccgcgca gaaagaatcc ccaagagggc 1320 ctgtacaacg agctccaaaa ggataagatg gcagaagcct atagcgagat tggtatgaaa 1380 ggggaacgca gaagaggcaa aggccacgac ggactgtacc agggactcag caccgccacc 1440 aaggacacct atgacgctct tcacatgcag gccctgccgc ctcgg 1485 <210> 254 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 254 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgaagtcc aactggtgga gtccggggga gggctcgtgc agcccggagg cagccttcgg 120 ctgtcgtgcg ccgcctccgg gttcacgttc tcatcctacg cgatgtcgtg ggtcagacag 180 gcaccaggaa agggactgga atgggtgtcc gccattagcg gctccggcgg tagcacctac 240 tatgccgact cagtgaaggg aaggttcact atctcccgcg acaacagcaa gaacaccctg 300 tacctccaaa tgaactctct gcgggccgag gataccgcgg tgtactattg cgccaagatg 360 ggttggtcca gcggatactt gggagccttc gacatttggg gacagggcac tactgtgacc 420 gtgtcctccg ggggtggcgg atcgggaggc ggcggctcgg gtggaggggg ttccgaaatc 480 gtgttgaccc agtcaccggg aaccctctcg ctgtccccgg gagaacgggc tacactgtca 540 tgtagagcgt cccagtccgt ggcttcctcg ttcctggcct ggtaccagca gaagccggga 600 caggcacccc gcctgctcat ctacggagcc agcggccggg cgaccggcat ccctgaccgc 660 ttctccggtt ccggctcggg caccgacttt actctgacca ttagcaggct tgagcccgag 720 gattttgccg tgtactactg ccaacactac ggggggagcc ctcgcctgac cttcggaggc 780 ggaactaagg tcgatatcaa aaccactacc ccagcaccga ggccacccac cccggctcct 840 accatcgcct cccagcctct gtccctgcgt ccggaggcat gtagacccgc agctggtggg 900 gccgtgcata cccggggtct tgacttcgcc tgcgatatct acatttgggc ccctctggct 960 ggtacttgcg gggtcctgct gctttcactc gtgatcactc tttactgtaa gcgcggtcgg 1020 aagaagctgc tgtacatctt taagcaaccc ttcatgaggc ctgtgcagac tactcaagag 1080 gaggacggct gttcatgccg gttcccagag gaggaggaag gcggctgcga actgcgcgtg 1140 aaattcagcc gcagcgcaga tgctccagcc tacaagcagg ggcagaacca gctctacaac 1200 gaactcaatc ttggtcggag agaggagtac gacgtgctgg acaagcggag aggacgggac 1260 ccagaaatgg gcgggaagcc gcgcagaaag aatccccaag agggcctgta caacgagctc 1320 caaaaggata agatggcaga agcctatagc gagattggta tgaaagggga acgcagaaga 1380 ggcaaaggcc acgacggact gtaccaggga ctcagcaccg ccaccaagga cacctatgac 1440 gctcttcaca tgcaggccct gccgcctcgg 1470 <210> 255 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 255 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Phe Lys Trp Met 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269 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg His Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Thr Glu Ser Gly Val Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Val Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Val Ile Asn Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Asn Asp Tyr Leu Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ala 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala 130 135 140 Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 145 150 155 160 Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr 180 185 190 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Asp 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Synthetic polynucleotide <400> 272 caggtgcagc tggtccagag cggcgccgaa gtgaagaagc ccggcagctc cgtgaaagtg 60 agctgcaagg ccagcggcgg caccttcagc aactactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120 cccggacagg gcctggagtg gatgggcgcc acctacaggg gccacagcga cacctactac 180 aaccagaagt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctcag gagcgaggac accgctgtgt attactgcgc caggggcgcc 300 atctacaacg gctacgacgt gctggacaac tggggccagg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agcggtggag gaggtagcgg aggaggcggg agcggtggag gtggctctgg aggtggcgga 420 agcgacatcc agatgaccca gagccctagc tcactgagcg ccagcgtggg cgacagggtg 480 accattacct gctccgccag ccaggacatc agcaactacc tgaactggta ccagcagaag 540 cccggcaagg cccccaagct gctgatctac tacacctcca acctgcactc cggcgtgccc 600 agcaggttca gcggaagcgg cagcggcacc gatttcaccc tgaccatctc cagcctgcag 660 cccgaggact tcgccaccta ctactgccag cagtacagga agctcccctg gactttcggc 720 cagggcacca aactggagat caagcgt 747 <210> 273 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 273 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 130 135 140 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 145 150 155 160 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 180 185 190 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(78) <223> Any amino acid <400> 281 Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Xaa Glu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu 20 25 30 Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp 50 55 60 Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Xaa Gln Ala 65 70 75 80 Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys Thr Ser 85 90 95 <210> 282 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 282 Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Ile Glu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu 20 25 30 Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 357 ttagcatgct ctcatattt 19 <210> 358 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 358 gcggccagga tggttcttag a 21 <210> 359 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 359 gagcttcgtg ctaaactggt a 21 <210> 360 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 360 acgggcgtga cttccacatg a 21 <210> 361 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 361 tgcaggccta gagaagtttc a 21 <210> 362 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 362 tccttggaac ccattcctga a 21 <210> 363 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 363 ttggaaccca ttcctgaaat t 21 <210> 364 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 364 tggaacccat tcctgaaatt a 21 <210> 365 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 365 ggaacccatt cctgaaatta t 21 <210> 366 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 366 gaacccattc ctgaaattat t 21 <210> 367 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 367 aacccattcc tgaaattatt t 21 <210> 368 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 368 ccctgtggtt ctattatatt a 21 <210> 369 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 369 ttaaatatga gagcatgcta a 21 <210> 370 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 370 tctaagaacc atcctggccg c 21 <210> 371 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 371 taccagttta gcacgaagct c 21 <210> 372 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 372 tcatgtggaa gtcacgcccg t 21 <210> 373 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 373 tgaaacttct ctaggcctgc a 21 <210> 374 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 374 ttcaggaatg ggttccaagg a 21 <210> 375 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 375 aatttcagga atgggttcca a 21 <210> 376 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 376 taatttcagg aatgggttcc a 21 <210> 377 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 377 ataatttcag gaatgggttc c 21 <210> 378 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 378 aataatttca ggaatgggtt c 21 <210> 379 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 379 aaataatttc aggaatgggt t 21 <210> 380 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 380 taatataata gaaccacagg g 21 <210> 381 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 381 ttagcatgct ctcatattta a 21 <210> 382 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 382 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 150 <210> 383 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 383 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 384 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 384 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 385 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 385 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 386 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 386 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 444 Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 445 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 445 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 446 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 446 Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Ser Phe Tyr Ala Ile Ser Leu 1 5 10 15 Lys Ser <210> 447 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 447 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 448 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 448 Gly Ile Ser Asp Ser Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 449 <211> 17 <212> PRT <213> 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Synthetic peptide <400> 463 Arg Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Leu Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 464 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 464 Ser Pro Ala His Tyr Tyr Gly Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 465 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 465 His Ser Phe Leu Ala Tyr 1 5 <210> 466 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 466 His Gly Gly Glu Ser Asp Val 1 5 <210> 467 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 467 Gly Pro Tyr Tyr Tyr Gln Ser Tyr Met Asp Val 1 5 10 <210> 468 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 468 Leu Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Ala Arg Gly Pro Arg Tyr 1 5 10 <210> 469 <211> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1064 Gln Gln Tyr His Ser Ser Pro Ser Trp Thr 1 5 10 <210> 1065 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1065 Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 1066 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1066 Met Gln Asn Ile Gln Phe Pro Ser 1 5 <210> 1067 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1067 Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 1068 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1068 Gln Gln Ser Tyr Lys Arg Ala Ser 1 5 <210> 1069 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1069 Met Gln Gly Arg Gln Phe Pro Tyr Ser 1 5 <210> 1070 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1070 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu Thr 1 5 <210> 1071 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1071 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Ser Trp Thr 1 5 <210> 1072 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1072 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Trp Thr 1 5 10 <210> 1073 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1073 Gln Gln Ser Tyr Thr Leu Ala 1 5 <210> 1074 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1074 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 1075 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1075 Met Gln Gly Thr His Trp Pro Gly Thr 1 5 <210> 1076 <211> 9 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1087 Gln His Tyr Gly Ser Ser Phe Asn Gly Ser Ser Leu Phe Thr 1 5 10 <210> 1088 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1088 Gln Gln Phe Gly Thr Ser Ser Gly Leu Thr 1 5 10 <210> 1089 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1089 Gln Gln Tyr His Ser Ser Pro Ser Trp Thr 1 5 10 <210> 1090 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1090 Gln Gln Tyr His Ser Ser Pro Ser Trp Thr 1 5 10 <210> 1091 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1091 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Ser 1 5 <210> 1092 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1092 Gln His Tyr Glu Ser Ser Pro 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1098 Gln His Tyr Gly Asn Ser Pro Pro Lys Phe Thr 1 5 10 <210> 1099 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1099 Gln His Tyr Gly Gly Ser Pro Arg Leu Thr 1 5 10 <210> 1100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1100 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 1101 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1101 Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 1102 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1102 Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr 1 5 <210> 1103 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1103 Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr 1 5 <210> 1104 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1104 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 1105 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1105 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 1106 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1106 Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr 1 5 10 15 Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp 20 25 30 Val Thr Leu 35 <210> 1107 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1107 acaaaaaaga agtattcatc cagtgtgcac gaccctaacg gtgaatacat gttcatgaga 60 gcagtgaaca cagccaaaaa atccagactc acagatgtga cccta 105 <210> 1108 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1108 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 1109 <211> 521 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Wild-type PGK promoter polynucleotide <400> 1109 acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60 ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120 gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180 gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga 240 cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg 300 ttccttggaa gggctgaatc cccgcctcgt ccttcgcagc ggccccccgg gtgttcccat 360 cgccgcttct aggcccactg cgacgcttgc ctgcacttct tacacgctct gggtcccagc 420 cgcggcgacg caaagggcct tggtgcgggt ctcgtcggcg cagggacgcg tttgggtccc 480 gacggaacct tttccgcgtt ggggttgggg caccataagc t 521 <210> 1110 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1110 acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60 ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtg 118 <210> 1111 <211> 221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1111 acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60 ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120 gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180 gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac g 221 <210> 1112 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1112 acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60 ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120 gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180 gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga 240 cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg 300 ttccttggaa gggctgaatc cccg 324 <210> 1113 <211> 422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1113 acccctctct ccagccacta agccagttgc tccctcggct gacggctgca cgcgaggcct 60 ccgaacgtct tacgccttgt ggcgcgcccg tccttgtccc gggtgtgatg gcggggtgtg 120 gggcggaggg cgtggcgggg aagggccggc gacgagagcc gcgcgggacg actcgtcggc 180 gataaccggt gtcgggtagc gccagccgcg cgacggtaac gagggaccgc gacaggcaga 240 cgctcccatg atcactctgc acgccgaagg caaatagtgc aggccgtgcg gcgcttggcg 300 ttccttggaa gggctgaatc cccgcctcgt ccttcgcagc ggccccccgg gtgttcccat 360 cgccgcttct aggcccactg cgacgcttgc ctgcacttct tacacgctct gggtcccagc 420 cg 422 <210> 1114 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> May or may not be present <400> 1114 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 1115 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> May or may not be present <400> 1115 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 1116 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> May or may not be present <400> 1116 Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 1117 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> May or may not be present <400> 1117 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25

Claims (66)

  1. 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산 분자이며, 여기서 CAR은 항-BCMA 결합 도메인 (예를 들어, 인간 또는 인간화 항-BCMA 결합 도메인), 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서 상기 항-BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 항-BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-BCMA 결합 도메인이 표 1 또는 16에 열거된 임의의 항-BCMA 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3)을 추가로 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 LC CDR1, LC CDR2, 및 LC CDR3이 표 21, 23 또는 25에 열거된 LC CDR 서열인 단리된 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HC CDR1, HC CDR2, 및 HC CDR3이 표 20, 22, 또는 24에 열거된 HC CDR 서열인 단리된 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 표 1에 열거된 임의의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열;
    (ii) 표 1에 제공된 경쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 표 1에 제공된 경쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 표 1에 열거된 임의의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열;
    (ii) 표 1에 제공된 중쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 표 1에 제공된 중쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1에 열거된 임의의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 표 1에 열거된 임의의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인이
    (i) 서열식별번호: 49, 39-53, 69-83, 84-98, 129-149, 171-191, 192-212, 255-258, 259-262, 263-266, 271, 또는 273으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열;
    (ii) 서열식별번호: 49, 39-53, 69-83, 84-98, 129-149, 171-191, 192-212, 255-258, 259-262, 263-266, 271, 또는 273 중 임의의 것에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 서열식별번호: 49, 39-53, 69-83, 84-98, 129-149, 171-191, 192-212, 255-258, 259-262, 263-266, 271, 또는 273 중 임의의 것에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항-BCMA 결합 도메인이 서열식별번호: 64, 54-68, 150-170, 272, 또는 274로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 코딩된 CAR이 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함하는 막횡단 도메인을 포함하거나;
    (ii) 코딩된 막횡단 도메인이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 포함하지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 6의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나;
    (iii) 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이 서열식별번호: 17의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인
    단리된 핵산 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인이
    (i) 서열식별번호: 49의 아미노산 서열;
    (ii) 서열식별번호: 49에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 서열식별번호: 49에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 항-BCMA 결합 도메인이 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된 것인 단리된 핵산 분자.
  13. 제12항에 있어서,
    (i) 코딩된 힌지 영역이 서열식별번호: 2의 아미노산 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나; 또는 (ii) 힌지 영역을 코딩하는 핵산 서열이 서열식별번호: 13의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인
    단리된 핵산 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 공동자극 도메인이 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인인 단리된 핵산 분자.
  15. 제14항에 있어서, 코딩된 공동자극 도메인이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  16. 제14항에 있어서, 공동자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열이 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인이 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열; 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인이 서열식별번호: 7의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열이 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현되는 것인 단리된 핵산 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열이 서열식별번호: 18의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열 및/또는 서열식별번호: 20 또는 서열식별번호: 21의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 코딩하는 리더 서열을 추가로 포함하는 단리된 핵산 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열식별번호: 109, 99-113, 213-233, 또는 267-270 중 임의의 것의 아미노산 서열;
    (ii) 서열식별번호: 109, 99-113, 213-233, 또는 267-270 중 임의의 것에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 서열식별번호: 109, 99-113, 213-233, 또는 267-270 중 임의의 것에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 124, 114-128 또는 234-254 중 임의의 것의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 124, 114-128 또는 234-254 중 임의의 것에 대해 95-99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드 분자.
  25. 단리된 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드이며, 여기서 CAR은 인간 항-BCMA 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편, 막횡단 도메인, 및 공동자극 도메인 및/또는 1차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서 상기 항-BCMA 결합 도메인은 표 1 또는 16에 열거된 임의의 항-BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3)을 포함하는 것인 단리된 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 인간 항-BCMA 결합 도메인이 표 1 또는 16에 열거된 임의의 항-BCMA 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3)을 추가로 포함하는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  27. 제24항에 있어서, 상기 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3이 표 21, 23, 또는 25에 열거된 LC CDR 서열인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3이 표 21, 23, 또는 25에 열거된 HC CDR 서열인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 표 1에 열거된 임의의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열;
    (ii) 표 1에 제공된 경쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 표 1에 제공된 경쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 단리된 CAR 폴리펩티드.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 표 1에 열거된 임의의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열;
    (ii) 표 1에 제공된 중쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 표 1에 제공된 중쇄 가변 영역 중 임의의 것의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 단리된 CAR 폴리펩티드.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1에 열거된 임의의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 표 1에 제공된 임의의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 CAR 폴리펩티드.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열식별번호: 49, 39-53, 69-83, 84-98, 129-149, 171-191, 192-212, 255-258, 259-262, 263-266, 271, 및 273으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 아미노산 서열;
    (ii) 서열식별번호: 49, 39-53, 69-83, 84-98, 129-149, 171-191, 192-212, 255-258, 259-262, 263-266, 271, 및 273 중 임의의 것에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 서열식별번호: 49, 39-53, 69-83, 84-98, 129-149, 171-191, 192-212, 255-258, 259-262, 263-266, 271, 및 273 중 임의의 것에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 단리된 CAR 폴리펩티드.
  33. 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 도메인이 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터의 막횡단 도메인을 포함하는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 막횡단 도메인이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (ii) 아미노산 서열이 서열식별번호: 6의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 포함하지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 포함하거나; 또는
    (iii) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열인
    단리된 CAR 폴리펩티드.
  35. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항-BCMA 결합 도메인이 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  36. 제35항에 있어서, 힌지 영역이 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 36, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  37. 제25항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 공동자극 도메인이 MHC 부류 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, 톨 리간드 수용체, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  38. 제25항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 공동자극 도메인이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  39. 제25항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  40. 제25항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 및/또는 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  41. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 서열식별번호: 7의 서열 및 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 서열을 포함하며, 여기서 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열이 동일한 프레임 내에서 및 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현되는 것인 단리된 CAR 폴리펩티드.
  42. 제25항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 리더 서열을 추가로 포함하는 단리된 CAR 폴리펩티드.
  43. 제25항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열식별번호: 109, 99-113, 213-233, 또는 267-270 중 임의의 것의 아미노산 서열;
    (ii) 서열식별번호: 109, 99-113, 213-233, 또는 267-270 중 임의의 것에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖지만 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (iii) 서열식별번호: 109, 99-113, 213-233, 또는 267-270 중 임의의 것에 대해 95-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열
    을 포함하는 단리된 CAR 폴리펩티드.
  44. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터이며, DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 벡터.
  45. 제44항에 있어서, 서열식별번호: 11의 서열을 포함하는 EF-1 프로모터를 추가로 포함하는 벡터.
  46. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산, 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드, 또는 제44항 또는 제45항의 벡터를 포함하는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포.
  47. 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포를 제44항 또는 제45항의 벡터로 형질도입하는 것을 포함하는, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포를 제조하는 방법.
  48. 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 RNA-조작된 세포 집단을 생성하는 방법이며, 여기서 RNA는 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 것인 방법.
  49. 포유동물에게 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 CAR 핵산 또는 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 포함하는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 항종양 면역을 제공하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 세포가 자가 T 세포 또는 동종 T 세포인 방법.
  51. BCMA의 발현과 연관된 질환을 갖는 포유동물에게 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 CAR 핵산 또는 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 포함하는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물을 치료하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, BCMA 발현과 연관된 질환이
    (i) 골수이형성증, 골수이형성 증후군 또는 전백혈병 중 1종 이상으로부터 선택된 암 또는 악성종양 또는 전암성 상태, 또는
    (ii) BCMA의 발현과 연관된 비-암 관련 적응증
    인 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 질환이 혈액암인 방법.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 B-세포 급성 림프성 백혈병 ("BALL"), T-세포 급성 림프성 백혈병 ("TALL"), 급성 림프성 백혈병 (ALL) 중 1종 이상으로부터 선택된 급성 백혈병; 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL); B 세포 전림프구성 백혈병, 모구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 소세포- 또는 대세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 상태, MALT 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 형질모구성 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 전립선암 (예를 들어, 거세-저항성 또는 요법-저항성 전립선암 또는 전이성 전립선암), 췌장암 또는 폐암; 또는 형질 세포 증식성 장애 (예를 들어 무증상 골수종 (증상이 없는 다발성 골수종 또는 무통성 골수종), 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 형질세포종 (예를 들어, 형질 세포 이혼화증, 고립 골수종, 고립 형질세포종, 수질외 형질세포종, 및 다발성 형질세포종), 전신 아밀로이드 경쇄 아밀로이드증, 및 POEMS 증후군 (크로우-푸카세 증후군, 다카츠키병 및 PEP 증후군으로도 공지됨)), 또는 그의 조합인 방법.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이
    (i) CAR 핵산 또는 CAR 폴리펩티드를 포함하는 세포의 효능을 증가시키는 작용제;
    (ii) CAR 핵산 또는 CAR 폴리펩티드를 포함하는 세포의 투여와 연관된 1종 이상의 부작용을 호전시키는 작용제;
    (iii) BCMA와 연관된 질환을 치료하는 작용제
    중 1종 이상과 조합되어 투여되는 것인 방법.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단이 PD-L1 억제제, 예를 들어 항-PD-L1 항체와 조합되어 투여되는 것인 방법.
  57. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 단리된 핵산 분자, 단리된 CAR 폴리펩티드 분자, 벡터 또는 세포.
  58. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, BCMA의 발현과 연관된 질환의 치료에 사용하기 위한 단리된 핵산 분자, 단리된 CAR 폴리펩티드 분자, 벡터 또는 세포.
  59. 제46항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인으로부터의 양성 신호를 포함하는 제2 폴리펩티드와 회합된, 억제 분자의 적어도 일부를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하는 억제 분자를 추가로 발현하는 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포의 집단.
  60. 제59항에 있어서, 억제 분자가 PD1의 적어도 일부를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 공동자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 것인 세포.
  61. 제55항에 있어서, 작용제가 mTOR 억제제이고, 대상체에게 낮은, 면역 증진 용량의 mTOR 억제제, 예를 들어 RAD001 또는 라파마이신을 투여하는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, mTOR 억제제가 대상체의 말초 혈액 또는 대상체로부터 단리된 T 세포의 표본에서 PD-1 양성 T 세포의 비율을 감소시키거나, PD-1 음성 T 세포의 비율을 증가시키거나, PD-1 음성 T 세포/ PD-1 양성 T 세포의 비를 증가시키는데 충분한 시간 동안 투여되는 것인 방법.
  63. 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 분자를 발현하는 세포가 CD19 CAR 분자를 포함하는 세포와 조합되어 투여되는 것인 방법.
  64. 제63항에 있어서, BCMA와 연관된 질환이 다발성 골수종인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 다발성 골수종이 CD19-음성 다발성 골수종인 방법.
  66. 제51항 내지 제56항 및 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 분자를 발현하는 세포가 용량 분할, 예를 들어 부분 용량의 1, 2, 3회 또는 그 초과의 개별 투여에 의해 대상체에게 투여되고,
    임의로 여기서 총 용량의 제1 백분율은 처리 제1일에 투여되고, 총 용량의 제2 백분율은 처리의 후속 (예를 들어, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 또는 제7 또는 그 초과)일에 투여되고, 임의로 총 용량의 제3 백분율 (예를 들어, 나머지 백분율)은 처리의 더 후속 (예를 들어, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 또는 그 초과)일에 투여되고,
    임의로 여기서 세포의 총 용량의 10%는 제1일에 투여되고, 세포의 총 용량의 30%는 제2일에 투여되고, 세포의 총 용량의 나머지 60%는 처리의 제3일에 투여되고,
    임의로 여기서 총 세포 용량은 1 내지 5 x 107개 또는 1 내지 5 x 108개 세포를 포함하는 것인
    방법.
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