JPH021556A

JPH021556A - ハイブリッド抗体及びその作製方法

Info

Publication number: JPH021556A
Application number: JP63141959A
Authority: JP
Inventors: Yoji Niimoto; 洋士新本; Isahiro Kawasaki; 功博川崎; Shunichi Dosemari; 俊一堂迫; Hironori Murakami; 浩紀村上
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1988-06-09
Filing date: 1988-06-09
Publication date: 1990-01-05
Also published as: EP0346087A2; EP0346087A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】倉呈上傅■■公ユ本発明は、二つの抗原認識能を有する、いわゆる二抗原
認識抗体（ｂｉｆｕｎｃＬｉｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ　％以下ｂ「抗体と略記する）及びその作製方法に関
する。

ｂｒ抗体は、癌、感染症などの治療薬あるいは疾病の診
断及び微量物質の定量に利用することが可能である。

狐米技■ 生体内で起る最も典型的な免疫反応である抗原抗体反応
は、その抗体の特異性が高いことなどから、種々の疾患
、例えば癌、感染症、中毒などの治療、血液生化学検査
並びに免疫診断又は微量物質の定量等に広（利用されて
きた。特に、Ｍｉｌｓｔｅｉｎｓらにより発表されたハ
イブリドーマ法〔ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ）２５６．
４９５〜４９７　（１９７５））によるモノクローナル
抗体の生産方法は、単一の抗体を比較的簡単にかつ大量
に供給する手法を提供しており、抗体の利用が非常に注
目されるようになった。

また、抗体の特異性が高いことを利用し、抗体分子中に
二つの抗原認識性を持たせ、抗体の利用範囲を拡大する
方法がいくつか検討されており、その過程で２種類の抗
原認識を持った抗体を相互に結合させて１分子の抗体と
する方法が提案されている。

２種類の抗体を結合させる方法としては、■化学的に結
合させ葛、■黄色ブドウ球菌の産生ずるプロティンＡを
介して結合させる、０２種類の抗体産生細胞を融合させ
た細胞融合株を培養し、培養液より結合抗体を得るなど
の手法が提案されている。

これらの手法のうち、化学的に結合させる技術としては
、Ｎ１５ｏｎｏｆｆらの方法〔八、Ｎ１５ｏｎｏｆｆ他
「アーカイブオブバイオケミストリイ　エンドバイオフ
イジンクスＪ　（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、）　９０．４６０〜４６２　（１９６１）
）による抗体をペプシン液化した後、抗体のＨ１Ｕ間の
ジスルフィド結合をメルカプトエチルアミンで還元し、
次いで再酸化することによりｂｆ抗体を得る方法、或い
は、ゲルタールアルデヒドやＮ−スクシンイシジル３−
（２ピリジルチオ）プロピオネートを使用する架橋反応
による方法（Ｙ、Ｇｅｒｍａｎｉ他［ジャーナルオブイ
ムノロジカルメソソヅＪ　（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅ
ｔｂｏｄｓ）　９８．８３〜８９（１９７Ｂ）　）など
の方法が開示されている。又モノクローナル抗体のＦａ
ｂ−断片をチオニトロ安息香酸誘導体となし、もう一方
のＦａｂ−断片還元物と反応させｂ「抗体とする方法（
Ｍ、Ｂｅｒｍａｎｉ他［サイエンスＪ　（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）　２２９．８１〜８３（１９８５））が開示されて
いる。

しかし、これらの抗体分子のジスルフィド基を介して結
合させる方法によって作製された抗体では、それぞれの
抗体の抗原結合部位が近接しており、一方の抗原結合部
位に抗原が結合した場合、立体障害によりもう一方の抗
原結合部位が抗原と結合できなくなる例が指摘されてい
る。

また、上述のグルタルアルデヒドやＮ−スクシンイシジ
ル３−（２ピリジルチオ）プロピオネートを用いた架橋
法では、抗体のアミノ基を介して結合するため、抗体分
子のように抗原結合部位がアミノ基末端である場合、こ
のアミノ基末端を介して結合する場合があり、このため
抗体活性を失う欠点があることが指摘されてきた。

なお、プロティンＡを介して抗体を結合させる方法は、
ＩｇＡやＩｇＭのような抗体がプロティン八に結合性を
有しないことから、目的とするｂｆ抗体を調製できない
という欠点がある。

また、最近、細胞融合株の培養によりｂｆ抗体を得る方
法がＭｉｌｓｔｅｉｎらにより開示されている。

（Ｃ，ＭｉｌｓｔｅＬｎ　ｅｔ　ａｌ、　ｒネイチャＪ
　（Ｎａｔｕｒｅ）狙匝、５３７〜５４０　（１９８７
））。

しかし、この方法は、目的とするす、ｆ抗体を生産する
細胞株を得るための操作が煩雑であり、また、得られた
細胞株の生産安定性にも問題があった。特に、生産株が
ｂｒ抗体を生産しなくなったり、生産量が減少する例が
あり、常に細胞株のｂｒ抗体の生産、維持には注意が必
要であるという問題がある。

軟土の状況に鑑み、広範囲な抗体のクラスについて適用
可能なりｆ抗体の作製方法並びに新しいｂｆ抗体の提供
が要望されていた。

が　°　しようとする課題本発明は、２種の抗体分子をその各々のカルボキシル基
末端基で架橋結合させた重合構造を有する新しいタイプ
のハイブリッド抗体及びその作製方法を提供することを
課題とする。

以下本発明の詳細な説明する。

課　を”ン１するための本発明に係るハイブリッド抗体（ｂｒ抗体）は、２種の
異なった抗体分子を、それぞれの分子中のカルボキシル
基のＣ末端をジアミンなどを介して架橋的に結合させた
重合構造を有するものであつて、２種の抗原に対して結
合性を有し、しかも−分子の抗体としての物理化学的な
挙動を示す特性を存する新しいタイプのｂｆ抗体である
。

本発明に係るｂ「抗体は下記の手順に従って作製するこ
とができる。

本発明で用いる抗体は、モノマー型抗体であれば広範囲
の種類のものが使用可能であるが、ＩｇＧクラスの抗体
が最も一般的で使用され、また、ＩｇＡ、ＩｇＭなどの
クラスの抗体も使用される。

また、抗体の動物種は問わず、ポリクローン抗体でもモ
ノクローン抗体でもよい。

これらの抗体としては、ヒト、チンパンシイ、ヤギ、ヒ
ツジ、ブタ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット及びマ
ウス等のポリクローン抗体、並びにヒト、ラット；マウ
ス等のモノクローン抗体を例示し得る。

これらのうち２種の抗体を、リン酸緩衝液のような適当
な緩衝液（ｐＨ４〜１０）に溶解し、この溶液に、水冷
下で、２種の抗体のモル数の１０倍〜１０００倍程度の
縮合剤を加える。次いで、これに直ちにジアミンを縮合
剤のモル数の２〜４倍量加え、室温で１〜２４時間架橋
反応を行う。反応後、反応液をゲル濾過カラムに通すか
あるいは限外濾過を行うことにより低分子のジアミン及
び縮合剤を除去して、架橋重合により生成したｂｆ抗体
を取得する。

ここで用いる縮合剤としては、ｌ−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、
１−シクロへキシル−３−（３−モルホリノエチル）カ
ルボジイミドメトパラトルエンスルホン酸塩（ＣＭＣ）
　、１−ベンジル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミドＣＢＤＣ）、１−シクロへキシル−３
（モルホリノエチル）カルボジイミド等の水溶性のカル
ボジイミドを例示し得る。囚に、他のカルボジイミドは
有機溶媒中でしか使用できない。

また、ジアミンは水溶性のものであれば広範囲の種類が
使用可能であるが、アミン間の炭素鎖がある程度長く、
しかも水溶性である１、５−ジアミノペンクン、１．６
−ジアミツヘキサン等の使用が好ましい。

本発明では、上記のようなジアミンを架橋剤として用い
２種の抗体分子のカルボキシル基の各々と縮合反応させ
ることにより、目的のｂｆ抗体を作製する。したがって
、このようにして得られたｂｒ抗体は、ジアミンをスペ
ーサーとして共有結合したポリマー型ｂｒ抗体である。

本発明によるｂｒ抗体の作製法は、従来の化学的手法に
よるモノマータイプのｂｆ抗体の作製法に比べて操作が
前車であり、どのようなりラスの抗体からもｂｒ抗体を
作製できる利点があり、また、細胞融合法にみられるよ
うな複雑な工程も必要としない。

本発明によって得られるｂｒ抗体の生成は、それに用い
た各抗体のサブクラス並びに抗原特異性によって確認し
得る。

すなわち、寒天ゲル内２重拡散法、赤血球凝反応、ラテ
ンラス凝集反応、酵素免疫測定法、放射免疫測定法もし
くはプロッティング法等によって生成した抗体が同一分
子中に２種類のサブクラス或は２種類の抗原特異性を有
することを検出することにより、ｂｒ抗体の生成が確認
できる。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１マウス抗ウシラクトフェリンモノクローン抗体（ＩｇＧ
クラス）　（Ｋａｗａｋａｍｉ　ａｔ　ａｔ、　ｒジャ
ーナルオブデイリイサイエンスＪ　（Ｊ、Ｄａｉｒｙ　
Ｓｃｉ、）、互、７５２（１９Ｂ？）　）及びヒト抗イ
ンフルエンザＡ型ウィルスモノクローン抗体（ＩｇＧク
ラス）（特開昭６２−５１７００）のそれぞれ１．５＋
ｎｇ（１０ナノモル）をｐＨ７の０．７ＭＩＪン酸緩衝
液Ｉｎ＋りに溶解し、ガラス小試験管に入れて氷冷した
。

これに縮合剤としてのＥＤＳ塩酸塩１．９２ｍｇ（１０
μＭ）を加え、ついで直ちに１．６−ジアミツヘキサン
塩酸塩４．７３ｍｇ（２５μＭ）を加えて良く混和した
後、室温に６時間放置して反応を行った。

反応後、反応液をｐＨ７，２のリンＭＷ街食塩水（Ｐ　
Ｂ　Ｓ）で平衡化したセファデックスＧ−５０カラムｌ
　Ｘ２０ｃｍ（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過し
てボイド画分を集め、生成抗体２．８ｍｇを得た。

なお、上記により得た生成抗体は、下記に示す酵素免疫
測定法（ＥＬＩＳＡ）によってｂｒ抗体と確認された。

ＥＬＩＳＡによるｂｒ抗体の確認：０．０５Ｍ重炭酸ナトリウムで１０００倍希釈した抗マ
ウスＩｇＧ或は抗ヒトＩｇＧ（タボ社製）をＥＬＩＳＡ
プレート（ヌンクイミノプレート■）に５０μｌづつ分
注して一夜放置した０次いで、このプレートを４倍希釈
した生成抗体（ゲル濾過画分）５０μｌを加えて１時間
室温に放置した。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含
む１０倍希釈ブロックエース（大日本製薬社）で３回プ
レートを洗浄後、１０００倍希釈した西洋ワサビペルオ
キシダーゼ標識した抗マウスＩｇＧもしくは抗ヒトＩｇ
Ｇ（タボ社製）を５０μｌ加えて更に１時間室温に放置
した。プレートを６回洗浄後、２．２’−アジノージ−
（３−エチルベンズチアゾリンスルホネート）（ＡＢＴ
Ｓ）を基質として１００μｌづつ加えてプレートに結合
した酵素活性を測定した。

その結果は表１に示すとおりであって、生成抗体は抗マ
ウスＩｇＧと抗ヒトＩｇＧを固定化したプレトに吸着し
、この吸着した抗体は、いずれもペルオキシダーゼ標識
した抗マウスＩｇＧ及び抗ヒトＩｇＧと反応した。

このことから、生成抗体は、マウスＩｇＧとヒトＩｇＧ
から成るｂｒ抗体であることが確認された。

表１実施例２ウサギポリクローン　　からのｂｒ　　　の市販ウサギ
抗マウスＩｇＧ抗体（１５０画分、ＭＢＬ社製）及びウ
サギ抗西洋ワサビペルオキシダゼ抗体（１５０画分、Ｍ
ＢＬ社製）を混合し、実施例１に記載したと同様の手順
に従って架橋反応を行った。ただし、架橋剤として１，
５−ジアミノペンクン塩酸塩を用いた。

上記抗体１．ｓｍｇから生成抗体２．５ｍｇを得た。下
記に示したように抗原特異性を調べることにより、生成
抗体がｂｒ抗体であることが確認された。

抗原特異性による確認：マウス血清１ｇＧ　（生化学工業社製）を０．０５ＭＮ
ａＨＣＯ，に５　ｐ　ｇ／ｍ　Ｉｔの濃度に溶解し、Ｅ
ＬＩＳＡプレートに５０μｌづつ加え抗原としてコート
した。

これをブロッキング後、１１００ｎ／ｍ　Ｉｔに希釈し
た生成抗体５０μｌと、１μｇ７ｍ　ｊ！のペルオキシ
ダーゼ（シグマ社製）２０μｌを加え、１時間静置した
。

次いで、プレートを洗浄後、ＡＢＴＳを加えて発色させ
た結果は表２に示すとおりである。

表２表２にみられるとおり、マウスＩｇＧをコートしたプレ
ートに生成抗体を反応させた場合にのみ、ペルオキシダ
ーゼをプレートに結合させることができた。したがって
、生成抗体はｂｆ抗体であることが確認された。

実施例３ｂｆ　　　を　いたウェスタンブロッティング実施例２
で作製した抗マウスＩｇＧ抗ペルオキシダーゼ抗体を用
いて下記手順によりヒ）ＩｇＡα鎖のウェスタンブロッ
ティング解析を行った。

ウェスタンブロッティング解析：ヒト血清５０μｌに２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、５％２−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ６，８）５０μβを加えて３７℃
に１６時間保温して前処理を行った。

上記処理を行った血清５μｌを、１０％アクリルアミド
ゲル中でＬａｅｍｍｌｉの方法（ネイチャ（Ｎａ　Ｌｕ
ｒｅ）、２７７．６８０　（１９７０））に従って泳動
させた。

泳動後、アクリルアミドゲル中で分離されたタンパクｆ
をｐｖｏＦトランスファーメンブレンフィルター（第一
化学社製）に電気ブロッティング装置（テフコ社製）を
用いてブロッティングした。

フィルターはブロックエースを用いて１時間ブロッキン
グを行った後、１０．０００倍希釈したマウスモノクロ
ーン抗ヒトＩｇＡ（ＡＭＤ、日本化薬社製）５１ＩＩＩ
ｌと１時間反応させた。

フィルターをＴｗｅｅｎ−Ｐ　Ｂ　Ｓで洗浄後、１　ｐ
　ｇ／ｍ　ｌに希釈したｂｒ抗体５ｍｆｆと３０分間反
応させた。更に、フィルターを洗浄後、ペルオキシダー
ゼ溶液（ｌμｇ／ｍｊり　５ｍｊ！と３０分間反応させ
た。次いで、最終的にフィルターに結合したペルオキシ
ダーゼの位置を３．３′−ジアミノベンジジン（Ｄ　Ａ
　Ｂ）を基質として発色させて検出したところ、α鎖に
相当する分子量約５万の位置にバンドが現れた。

光皿■塾果以上述べたとおり、本発明によると従来のｂｒ抗体と異
なり、カルボキシル基を介した重合構造を有する新しい
タイプのｂ「抗体が提供される。

また、本発明によると、従来、作製することが困難であ
ったＩｇＭなどのクラスの抗体も容易にｂｒ抗体とする
ことが可能であり、したがって、抗体の利用性を高める
こともできる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）相互に異なる抗原特異性を有する２種の抗体分子
を、各抗体分子のカルボキシル基を介した架橋構造によ
り重合して成る二つの抗原認識能を有するハイブリッド
抗体。
（２）架橋構造は、ジアミンのアミノ基と各抗体分子の
カルボキシル基の間の重合構造である請求項（１）に記
載のハイブリッド抗体。
（３）相互に異なる抗原特異性を有する２種の抗体分子
に、縮合剤とジアミンを作用させて架橋反応を行つた後
、低分子のジアミン及び縮合剤を除去することを特徴と
するハイブリッド抗体の作製方法。
（４）低分子のジアミン及び縮合剤の除去は、ゲル濾過
又は限外濾過で行う請求項（３）に記載のハイブリッド
抗体の作製方法。
（５）縮合剤は、水溶性カルボジイミドである請求項（
３）又は（４）に記載のハイブリッド抗体の作製方法。