CN110214150A - 嵌合抗原受体和pd-1抑制剂的组合疗法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于治疗疾病例如癌症，例如与抗原例如CD19的表达相关的疾病的组合物和方法，这些方法包括与PD‑1抑制剂组合给予表达特异于抗原例如CD19的嵌合抗原受体(CAR)的细胞。

Description

嵌合抗原受体和PD-1抑制剂的组合疗法
本申请要求2016年7月28日提交的美国序列号62/368100、2017年2月6日提交的美国序列号62/455,547、2017年4月7日提交的美国序列号62/482846、和2017年6月2日提交的美国序列号62/514542的优先权，将所有文献的内容通过引用以其全文并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表并且该序列表特此通过引用以其全文并入。所述ASCII拷贝创建于2017年7月27日，名称为N2067-7109WO_SL.txt并且大小为907,582字节。
技术领域
本发明总体上涉及被工程化以表达靶向抗原(例如CD19)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如免疫效应细胞)与PD-1抑制剂组合以治疗疾病的用途。
背景技术
许多患有B细胞恶性肿瘤的患者无法通过标准疗法治愈。此外，传统的治疗选择经常具有严重的副作用。已经在癌症免疫疗法中进行了尝试，然而，若干障碍使得这成为实现临床有效性的非常困难的目标。虽然已经鉴定了数百种所谓的肿瘤抗原，但这些通常源自自身并且因此免疫原性差。此外，肿瘤使用几种机制以使其自身与免疫攻击的起始和传播敌对。
使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的自体T细胞(CART)疗法(其依赖于将T细胞重定向至癌细胞(如B细胞恶性肿瘤)上的适合细胞表面分子)的最新发展显示出利用免疫系统的力量来治疗B细胞恶性肿瘤和其他癌症的有希望的结果(参见例如，Sadelain等人,CancerDiscovery[癌症发现]3:388-398(2013))。鼠来源的CART19(即“CTL019”)的临床结果显示了在患有CLL以及儿童ALL的患者中建立完全缓解的希望(参见例如，Kalos等人,SciTransl Med[科学转化医学]3:95ra73(2011)，Porter等人,NEJM[新英格兰医学杂志]365:725-733(2011)，Grupp等人,NEJM[新英格兰医学杂志]368:1509-1518(2013))。除遗传修饰的T细胞上的嵌合抗原受体识别和破坏靶细胞的能力之外，成功的治疗性T细胞疗法需要具有随时间增殖和持续的能力，以便调查白血病复发。由无反应性、抑制、或衰竭引起的T细胞的可变质量将对CAR转化的T细胞性能具有影响，此时熟练的从业者对其进行有限的控制。为了有效，CAR转化的患者T细胞需要持续并保持响应于同源抗原的增殖能力。已经证明，ALL患者T细胞表达可以用包含鼠scFv的CART19进行(参见例如，Grupp等人,NEJM[新英格兰医学杂志]368:1509-1518(2013))。
发明内容
本披露内容的特点至少部分地在于用于通过使用组合疗法在受试者中治疗疾病(例如癌症)，例如与抗原相关的疾病，例如与表达CD19的相关的疾病，例如癌症的方法和组合物，该组合疗法包括表达特异性结合抗原(例如本文所述的抗原，例如CD19)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如免疫效应细胞)(本文还称为“表达CD19 CAR的细胞”)(本文还称为“CAR疗法”)和程序性死亡抑制剂-1(本文还称为“PD-1抑制剂”)。在一些实施例中，特异性结合抗原(例如CD19)的CAR包括抗原结合结构域(例如，CD19结合结构域)、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域，例如如本文所述。在一些实施例中，PD-1抑制剂是抗体分子、多肽、小分子、或多核苷酸，例如抑制性核酸。在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗体分子，例如本文所述的抗体分子。不希望受理论的约束，据信例如与仅用表达CAR的细胞(例如表达CD19CAR的细胞)或PD-1抑制剂治疗患有疾病(例如癌症)，例如与表达CD19的相关的疾病，例如本文所述的癌症的受试者相比，用包括表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂的组合疗法治疗患有该疾病的受试者导致受试者中肿瘤进展的改善抑制或减少。例如，与CAR疗法组合，PD-1/PD-L1相互作用的抑制可以导致以下中的一种或多种：(i)表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)的活化(或再活化)；(ii)表达CAR的细胞群的扩增；(iii)对CAR疗法持续治疗响应的持续时间；(iv)CAR疗法的增加持久性，(v)衰竭的效应T细胞功能的减少，(vi)T细胞衰竭的逆转或缓解，(vii)细胞因子(例如IL-6、或IL-2)水平增加；或(viii)检查点抑制剂(例如PD-1、TIM-3或LAG-3中的一种或多种)对免疫效应细胞(例如CD4+和/或CD8+细胞，例如表达CAR的免疫效应细胞)的表达降低，因此例如与仅接受CAR疗法或PD-1抑制剂的受试者相比，在用组合疗法治疗的受试者中导致改善的治疗结果。
因此，在一个方面，本披露内容的特点在于一种治疗患有疾病(例如癌症)，例如与抗原相关的疾病，例如与CD19表达相关的疾病，例如如本文所述的癌症的受试者的方法。该方法包括向受试者给予包含例如表达特异性结合抗原(例如CD19)的CAR的细胞(例如细胞群)(本文还称为CAR疗法)、和PD-1抑制剂。在一个实施例中，顺序地给予表达CAR的细胞和PD-1抑制剂。在一个实施例中，在给予表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)之前给予PD-1抑制剂。在一个实施例中，在给予表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)后，给予PD-1抑制剂。在一个实施例中，同时或并行地给予PD-1抑制剂和表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)。
在实施例中，顺序地(例如以任何顺序)给予本文所述的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)、和PD-1抑制剂。在一个实施例中，在治疗间隔中给予该组合。在一个实施例中，治疗间隔包括PD-1抑制剂的单剂量和表达CAR的细胞的单剂量(例如以任何顺序)。在另一个实施例中，治疗间隔包括PD-1抑制剂的多剂量(例如第一和第二剂量)和表达CAR的细胞的剂量(例如以任何顺序)。
在相关方面，本披露内容提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法。该方法包括向受试者给予：
(i)CAR疗法，其包括包含例如表达CAR的免疫效应细胞群，其中CAR包含抗原(例如CD19)结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域；和
(ii)PD-1抑制剂。
在一些实施例中，PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体分子)的剂量是例如每2周、3周、4周、或5周给予约200mg至约450mg，例如约300mg至约400mg。
在另一个方面，本披露内容提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法。该方法包括向受试者给予：
(i)CAR疗法，其包括包含例如表达CAR的免疫效应细胞群，其中CAR包含抗原(例如CD19)结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域；和
(ii)PD-1抑制剂。
在一些实施例中，在给予CAR疗法后20天或更短开始给予PD-1抑制剂。例如，在给予CAR疗法后16天或更短、15天或更短、14天或更短、13天或更短、12天或更短、11天或更短、10天或更短、9天或更短、8天或更短、7天或更短、6天或更短、5天或更短、4天或更短、3天或更短、2天或更短开始给予PD-1抑制剂。
在另一个方面，本披露内容提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法。该方法包括向受试者给予：
(i)CAR疗法，其包括包含例如表达CAR的免疫效应细胞群，其中CAR包含抗原(例如CD19)结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域；和
(ii)PD-1抑制剂。
在一些实施例中，在受试者具有或被鉴定为具有以下中的一种或多种后开始给予PD-1抑制剂：
(a)对该CAR疗法的部分或无可检测的响应，
(b)该CAR疗法后复发的癌症，
(c)该CAR疗法难治性癌症；
(d)该CAR疗法后癌症的进行性形式；或
(e)该CAR疗法后(例如少于3个月)B细胞恢复。
在又另一个方面，本披露内容提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法。该方法包括向受试者给予：
(i)CAR疗法，其包括包含例如表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群，其中CAR包含抗原(例如CD19)结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域；和
(ii)PD-1抑制剂。
在一些实施例中，在给予CAR疗法后开始给予PD-1抑制剂，并且受试者不具有或未被鉴定为具有以下中的一种或多种：
(a)对该CAR疗法的部分或无可检测的响应，
(b)该CAR疗法后复发的癌症，
(c)该CAR疗法难治性癌症；
(d)癌症的进行性形式；或
(e)该CAR疗法后(例如少于3个月)B细胞恢复。
在另一个方面，本披露内容提供了用于在本文披露的任何方法中与PD-1抑制剂组合使用的CAR疗法。在其他实施例中，本文披露了与PD-1抑制剂组合的CAR疗法在制备用于治疗病症(例如增殖性病症，例如癌症)的药物方面的用途。
本文披露的任何方法、用途、组合物或组合的另外特征或实施例包括以下中的一种或多种：
在一些实施例中，可以给予PD-1抑制剂的一个或多个，例如1、2、3、4、或5或更多个后续剂量。在一个实施例中，给予PD-1抑制剂的多达6个剂量。
在一些实施例中，该方法或用途进一步包括评估受试者中CRS的存在或不存在。在一个实施例中，在CAR疗法后受试者不具有或未被鉴定为患有CRS，例如严重CRS(例如CRS 3级或4级)。
在其他实施例中，在CAR疗法后受试者被鉴定为不患有CRS，例如严重CRS(例如CRS3级或4级)后开始给予PD-1抑制剂。
在其他实施例中，在CAR疗法后治疗CRS(例如CRS消退)后开始给予PD-1抑制剂。在一个实施例中，CRS消退至1级。在一个实施例中，CRS消退至不可检测的水平。
当治疗间隔包括PD-1抑制剂的单剂量和表达CAR的细胞的单剂量时，在某些实施例中，同时或并行地给予PD-1抑制剂的剂量和表达CAR的细胞的剂量。例如，在彼此的20天、18天、16天、15天、12天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、1天、24小时、12小时、6小时、4小时、2小时、或更短)内给予PD-1抑制剂的剂量和表达CAR的细胞的剂量。在实施例中，治疗间隔在给予第一次给予的剂量时开始并在给予后期给予的剂量后完成。
当治疗间隔包括PD-1抑制剂的单剂量和表达CAR的细胞的单剂量时，在某些实施例中，顺序地给予PD-1抑制剂的剂量和表达CAR的细胞的剂量。在实施例中，在PD-1抑制剂的剂量之前给予表达CAR的细胞的剂量，并且治疗间隔在给予表达CAR的细胞的剂量时开始并在给予PD-1抑制剂的剂量后完成。在其他实施例中，在表达CAR的细胞的剂量之前给予PD-1抑制剂的剂量，并且治疗间隔在给予PD-1抑制剂的剂量时开始并在给予表达CAR的细胞的剂量后完成。在一个实施例中，治疗间隔进一步包括PD-1抑制剂的一个或多个，例如1、2、3、4、或5或更多个后续剂量。在此类实施例中，治疗间隔包括PD-1抑制剂的二、三、四、五、六、或更多个剂量和表达CAR的细胞的一个剂量。在一个实施例中，在给予PD-1抑制剂的剂量之前或之后，给予表达CAR的细胞的剂量至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、或至少2周。在其中给予PD-1抑制剂的多于一个剂量的实施例中，在给予PD-1抑制剂的第一剂量之前或之后或在治疗间隔开始后，给予表达CAR的细胞的剂量至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、或至少2周。在一个实施例中，在给予表达CAR的细胞的剂量后，给予PD-1抑制剂的剂量约25-40天(例如约25-30、30-35、或35-40天，例如约35天)或约2-7周(例如2、3、4、5、6、或7周)。在其中给予PD-1抑制剂的多于一个剂量的实施例中，在给予PD-1抑制剂的第一剂量后，给予第二PD-1抑制剂剂量约15-30天(例如约15-20、20-25、或25-30天，例如约20天)或约2-5周(例如2、3、4、或5周)。
当治疗间隔包括PD-1抑制剂的多剂量(例如，第一和第二，以及任选地一个或多个后续剂量)和表达CAR的细胞的剂量时，在某些实施例中，例如在彼此的2天内(例如2天、1天、24小时、12小时、6小时、4小时、2小时、或更短内)同时或并行地给予表达CAR的细胞的剂量和PD-1抑制剂的第一剂量。在实施例中，在(i)表达CAR的细胞的剂量或(ii)PD-1抑制剂的第一剂量(无论哪个较后)后，给予PD-1抑制剂的第二剂量。在实施例中，在(i)或(ii)后，给予PD-1抑制剂的第二剂量至少2天(例如至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、或更久)。在实施例中，在给予PD-1抑制剂的第二剂量后，给予PD-1抑制剂的后续剂量(例如第三、第四、或第五剂量等)。在实施例中，在PD-1抑制剂的第二剂量后，给予PD-1抑制剂的后续剂量至少2天(例如至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、或更久)。在此类实施例中，治疗间隔在给予第一次给予的剂量时开始并在给予PD-1抑制剂的第二剂量(或后续剂量)后完成。
在其中治疗间隔包括PD-1抑制剂的多剂量(例如，第一和第二，以及任选地后续剂量)和表达CAR的细胞的剂量的其他实施例中，顺序地给予表达CAR的细胞的剂量和PD-1抑制剂的第一剂量。在实施例中，在给予PD-1抑制剂的第一剂量后但在给予PD-1抑制剂的第二剂量前，给予表达CAR的细胞的剂量。在实施例中，在给予PD-1抑制剂的第二剂量后，给予PD-1抑制剂的后续剂量(例如第三、第四、或第五剂量等)。在此类实施例中，治疗间隔在给予PD-1抑制剂的第一剂量时开始并在给予PD-1抑制剂的第二剂量(或后续剂量)后完成。在一个实施例中，在给予PD-1抑制剂的第一剂量后，给予PD-1抑制剂的第二剂量至少2天(例如至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、或更久)。在一个实施例中，当PD-1抑制剂是抑制性RNA(例如siRNA)时，每2天至每2周给予第二剂量。在一个实施例中，当PD-1抑制剂是抗体分子时，每2-3周给予第二剂量。在一个实施例中，在PD-1抑制剂的第二剂量后，给予PD-1抑制剂的后续剂量(例如第三、第四、或第五剂量等)至少2天(例如至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、或更久)。在一个实施例中，在给予PD-1抑制剂的第一剂量后，给予表达CAR的细胞的剂量至少2天(例如至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、或更久)。在一个实施例中，在给予表达CAR的细胞的剂量后，给予PD-1抑制剂的第二剂量至少2天(例如至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、或更久)。在实施例中，在治疗间隔期间，每2-3周(例如每2周或每3周)给予PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体分子)。
在其他实施例中，在给予PD-1抑制剂的第一剂量前，给予表达CAR的细胞的剂量。在此类实施例中，治疗间隔在给予表达CAR的细胞时开始并在给予PD-1抑制剂的第一剂量(或后续剂量)后完成。在实施例中，在给予表达CAR的细胞后，给予PD-1抑制剂的第一剂量至少2天(例如，至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少2周、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少3周、至少4周、至少5周、或更久)。在一些实施例中，给予PD-1抑制剂的第一剂量在给予表达CAR的细胞后约5至约10天(例如约8天)发生。在其他实施例中，给予PD-1抑制剂的第一剂量在给予表达CAR的细胞后约10至约20天(例如约15或16天)发生。在实施例中，在给予PD-1抑制剂的第一剂量后，给予PD-1抑制剂的第二剂量至少2天(例如，至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、2周、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、3周、4周、5周、或更久)。在实施例中，在PD-1抑制剂的第一剂量后约2-4周，例如3周时给予PD-1抑制剂的第二剂量。在实施例中，在PD-1抑制剂的第二剂量后，给予PD-1抑制剂的后续剂量(例如第三、第四、或第五剂量等)至少2天(例如至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、或更久)。在实施例中，在PD-1抑制剂的前一次剂量后约2-4周，例如3周时给予PD-1抑制剂的后续剂量(例如第三、第四、或第五剂量等)。在实施例中，在给予表达CAR的细胞后，给予PD1抑制剂的第一剂量至少2天(例如至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、5周、或更久)。
在一些实施例中，治疗间隔包括PD-1抑制剂的一个、两个或三个剂量(例如，第一和第二、以及第三剂量)和表达CAR的细胞的剂量。在一个实施例中，顺序地给予表达CAR的细胞的剂量和PD-1抑制剂的第一剂量。例如，受试者(例如患者)在给予表达CAR的细胞后(例如，在给予表达CAR的细胞的剂量后约一周至4个月(例如约14天至2个月))开始接受PD-1抑制剂的一个、两个或三个剂量。
在一个实施例中，任何本文所述的治疗间隔可以重复一次或多次，例如1、2、3、4、或5更多次。在一个实施例中，治疗间隔重复一次，产生包括两个治疗间隔的治疗方案。在一个实施例中，在完成第一或前一次治疗间隔后，给予重复的治疗间隔至少1天，例如至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少2周、至少1个月、至少3个月、至少6个月、至少1年或更久。在一个实施例中，在完成第一或前一次治疗间隔后，给予重复的治疗间隔至少3天。
在一个实施例中，任何本文所述的治疗间隔之后可以是一个或多个，例如1、2、3、4、或5个后续治疗间隔。该一个或多个后续治疗间隔不同于第一或前一次治疗间隔。通过举例，由PD-1抑制剂的单剂量和表达CAR的细胞的单剂量组成的第一治疗间隔之后是由PD-1抑制剂的多剂量(例如二、三、四、或更多个剂量)和表达CAR的细胞的单剂量组成的第二治疗间隔。在一个实施例中，在完成第一或前一次治疗间隔后，给予该一个或多个后续治疗间隔至少1天，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、或2周。
在任何本文所述的方法中，在完成一个或多个治疗间隔后，给予PD-1抑制剂的一个或多个后续剂量，例如1、2、3、4、或5或更多个剂量。在其中重复治疗间隔或给予两个或更多个治疗间隔的实施例中，在完成一个治疗间隔后并在开始另一个治疗间隔前，给予PD-1抑制剂的一个或多个后续剂量，例如1、2、3、4、或5或更多个剂量。在一个实施例中，在完成一个或多个，或每个治疗间隔后，每5天、7天、2周、3周、或4周给予PD-1抑制剂的剂量。
在任何本文所述的方法中，在完成一个或多个治疗间隔后，给予表达CAR的细胞的一个或多个，例如1、2、3、4、或5或更多个后续剂量。在其中重复治疗间隔或给予两个或更多个治疗间隔的实施例中，在完成一个治疗间隔后并在开始另一个治疗间隔前，给予表达CAR的细胞的一个或多个后续剂量，例如1、2、3、4、或5、或更多个剂量。在一个实施例中，在完成一个或多个，或每个治疗间隔后，每2天、3天、4天、5天、7天、2周、3周、或4周给予表达CAR的细胞的剂量。
在一个实施例中，治疗间隔包括在PD-1抑制剂的第一剂量之前给予的表达CAR的细胞的单剂量。在该实施例中，在给予表达CAR的细胞后，给予PD-1抑制剂的第一剂量约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约25、约30、或约35天。在实施例中，在给予PD-1抑制剂的第一剂量后，给予PD-1抑制剂的第二剂量。在实施例中，在给予PD-1抑制剂的第一剂量后(例如在PD-1抑制剂的第一剂量后约2-4周，例如3周)，给予PD-1抑制剂的第二剂量约20天。在实施例中，在PD-1抑制剂的第二剂量后(例如，在PD-1抑制剂的前一次剂量后每1周、2周、3周、4周、5周、5天、7天、10天、14天、20天、25天、30天、或35天，例如约2-4周，例如3周)，给予PD-1抑制剂的后续剂量。
在一个实施例中，该方法包括例如在给予表达CAR的细胞之前，向受试者给予淋巴清除化疗。在实施例中，淋巴清除化疗包括环磷酰胺(例如超分割的环磷酰胺)，例如，剂量为约200-400mg/m2，例如约300mg/m2，例如1-10个剂量(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个剂量)。在实施例中，该方法包括给予治疗间隔，该治疗间隔包括表达CAR的细胞的剂量和PD-1抑制剂的多剂量。在实施例中，治疗间隔包括在PD-1抑制剂的第一剂量之前(例如在PD-1抑制剂的第一剂量之前至少2周(例如2、3、4、5、6周或更久)(例如，在PD-1抑制剂的第一剂量之前约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、或更多天)给予的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)的单剂量。在实施例中，在PD-1抑制剂的第一剂量前，给予表达CAR的细胞的剂量约3-4周。在实施例中，在治疗间隔期间，每2-4周(例如每2-3周或3-4周，例如每3周)给予PD-1抑制剂。在实施例中，将PD-1抑制剂以约1-3mg/kg，例如约2mg/kg的剂量给予。在实施例中，将表达CAR的细胞以约1-10x 106个细胞/kg，例如约5x 106个细胞/kg，例如约5.3x 106个细胞/kg的剂量给予。在实施例中，将表达CAR的细胞以约1-10x108个细胞/输注，例如约5x 108个细胞/输注的剂量给予。
在任何本文所述的方法中，给予受试者表达CAR的细胞的单剂量和PD-1抑制剂的单剂量。在一个实施例中，在给予PD-1抑制剂的单剂量前，给予表达CAR的细胞的单剂量至少2天，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、14、15、16、17、18、20、25、30、35、40天、或2周、3周、4周、或更久。在实施例中，在给予PD-1抑制剂前，给予表达CAR的细胞的单剂量约35天。
在一个实施例中，在表达CAR的细胞的初始剂量后，向受试者给予表达CAR的细胞的一个或多个，例如1、2、3、4、或5个后续剂量。在一个实施例中，在表达CAR的细胞的前一次剂量后，给予表达CAR的细胞的一个或多个后续剂量至少2天，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、14、20、25、30、35、40天、或2周、3周、4周、或更久。在一个实施例中，在表达CAR的细胞的前一次剂量后，给予表达CAR的细胞的一个或多个后续剂量至少1个月，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个月。在一个实施例中，在表达CAR的细胞的前一次剂量后，给予表达CAR的细胞的一个或多个后续剂量至少5天。在一个实施例中，给予受试者表达CAR的细胞的三个剂量/周或每2天一个剂量。
在一个实施例中，在给予PD-1抑制剂的单剂量后，给予PD-1抑制剂的一个或多个，例如1、2、3、4、或5个后续剂量。在一个实施例中，在PD-1抑制剂的前一次剂量后，给予PD-1抑制剂的一个或多个后续剂量至少5天、7天、10天、14天、20天、25天、30天、2周、3周、4周、或5周，例如3周。
在一个实施例中，在表达CAR的细胞的剂量(例如，表达CAR的细胞的初始剂量)后，给予PD-1抑制剂的一个或多个后续剂量至少1、2、3、4、5、6、或7天。
在一个实施例中，在表达CAR的细胞的第一剂量之前给予PD-1抑制剂的一个或多个，例如1、2、3、4、或5个剂量。
在一个实施例中，在表达CAR的细胞的第一剂量后(例如，在表达CAR的细胞的第一剂量后2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、或8周)，给予PD-1抑制剂的一个或多个，例如1、2、3、4、5、或6个剂量。在一个实施例中，在表达CAR的细胞的第一剂量后(例如，在表达CAR的细胞的第一剂量后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个月)，给予PD-1抑制剂的一个或多个，例如1、2、3、4、或5个剂量。
在一个实施例中，每2-3周(例如每2、3、4、或5周)给予在表达CAR的细胞的第一剂量后给予的PD-1抑制剂的一个或多个，例如1、2、3、4、5、或6个剂量持续至少1个月，例如持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个月或更久。在一个实施例中，例如在PD-1抑制剂的前一次剂量后约2-4周(例如3周)给予PD-1抑制剂的一个或多个剂量(例如，多达6个剂量)。
在一个实施例中，重复(例如1、2、3、4、或5更多次)给予表达CAR的细胞的一个或多个剂量和PD-1抑制剂的一个或多个剂量。
在任何本文所述的方法中，在实施例中，进一步给予受试者化疗(例如本文所述的化疗)。在实施例中，在给予表达CAR的细胞前，给予化疗。在实施例中，在给予表达CAR的细胞前，给予化疗约1-10天(例如约1-4、1-5、4-8、4-10、或5-10天)。
本文披露的治疗剂的剂量和治疗方案可以由技术人员确定。
在任何本文所述的给予方案或治疗间隔中，在一些实施例中，表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)的剂量包含约104至约109个细胞/kg，例如约104至约105个细胞/kg、约105至约106个细胞/kg、约106至约107个细胞/kg、约107至约108个细胞/kg、或约108至约109个细胞/kg；或以下中的至少约一个：1x 107、1.5x 107、2x 107、2.5x 107、3x 107、3.5x107、4x 107、5x 107、1x 108、1.5x 108、2x 108、2.5x 108、3x 108、3.5x 108、4x 108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x 109个细胞。在一些实施例中，表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)的剂量包括至少约1-5x 107至1-5x 108个表达CAR的细胞。在一些实施例中，给予受试者约1-5x 107个表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)。在其他实施例中，给予受试者约1-5x 108个表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)。
在实施例中，根据给药方案向受试者给予表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)，该给药方案包括通过剂量分割(例如，部分剂量的一次、二次、三次或更多次单独给予)向受试者给予的细胞的总剂量。在实施例中，在治疗的第一天给予总剂量的第一百分比，在治疗的后续(例如，第二、第三、第四、第五、第六、或第七或更晚)天给予总剂量的第二百分比，并且任选地，在治疗的又后续(例如，第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、或更晚)天给予总剂量的第三百分比(例如，剩余的百分比)。例如，在治疗的第一天递送细胞总剂量的10％，在治疗的第二天递送细胞总剂量的30％，并且在治疗的第三天递送细胞总剂量的剩余60％。例如，总细胞剂量包括1至5x 107或1至5x 108个表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)。
在任何本文所述的给予方案中，本文所述PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体分子(例如，派姆单抗、纳武单抗、PDR001、或表6中提供的抗PD-1抗体分子)的剂量包括约1至30mg/kg，例如约1至20mg/kg、约2至15mg/kg、约5至25mg/kg、约10至20mg/kg、约1至5mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、或约10mg/kg。在一个实施例中，该剂量是约10至20mg/kg。在一个实施例中，该剂量是约1至5mg/kg。在一个实施例中，该剂量小于5mg/kg、小于4mg/kg、小于3mg/kg、小于2mg/kg、或小于1mg/kg。在一个实施例中，该剂量是约2mg/kg。
在实施例中，在任何本文所述的给予方案中，每1-4周，例如每周、每2周、每3周、或每4周给予PD-1抑制剂的剂量。
在某些实施例中，将抗PD-1抗体分子(例如，派姆单抗、纳武单抗、PDR001、或表6中提供的抗PD-1抗体分子)通过注射(例如，皮下或静脉内)以约1至30mg/kg，例如约1至20mg/kg、约2至15mg/kg、约5至25mg/kg、约10至20mg/kg、约1至5mg/kg、约3mg/kg、或约2mg/kg的剂量给予。该给药计划表可以从例如每周一次至每2、3、或4周一次变化。在一个实施例中，将该抗PD-1抗体分子以从约10mg/kg至20mg/kg的剂量给予，每两周一次。在一个实施例中，该剂量是每2周、每3周、或每4周约1至5mg/kg。在一个实施例中，该剂量每2周、每3周、或每4周小于5mg/kg、小于4mg/kg、小于3mg/kg、小于2mg/kg、或小于1mg/kg。在一个实施例中，该剂量是每2周、每3周、或每4周约2mg/kg。
在一些实施例中，PD-1抑制剂，例如抗PD-1抗体分子(例如，派姆单抗、纳武单抗、PDR001或表6中提供的抗PD-1抗体分子)的剂量是平坦剂量。在一些实施例中，将抗PD-1抗体分子通过注射(例如，皮下或静脉内)以约200mg至500mg，例如约250mg至450mg、约300mg至400mg、约250mg至350mg、约350mg至450mg、或约200mg、约300mg或约400mg的剂量(例如平坦剂量)给予。该给药计划表(例如平坦给药计划表)可以从例如每周一次至每2、3、4、5、或6周一次变化。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子以从约200mg的剂量给予，每三周一次或每四周一次。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子以从约300mg至400mg的剂量给予，每三周一次或每四周一次。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子例如通过静脉内输注以从约300mg的剂量给予，每三周一次。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子例如通过静脉内输注以从约200mg的剂量给予，每三周一次。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子例如通过静脉内输注以从约400mg的剂量给予，每四周一次。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子例如通过静脉内输注以从约300mg的剂量给予，每四周一次。在一个实施例中，将抗PD-1抗体分子例如通过静脉内输注以从约400mg的剂量给予，每三周一次。
在一个实施例中，PD-1抑制剂是每三周以200mg给予多达六个剂量的派姆单抗。在一些实施例中，PD-1抑制剂是每三周以300mg给予多达六个剂量的派姆单抗。
在一个实施例中，PD-1抑制剂选自下组，该组由以下组成：纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗(Pidilizumab)、PDR001、AMP 514、AMP-224、以及任何表6中提供的抗PD-1抗体分子。
在一些实施例中，本披露内容提供了一种治疗患有与CD19表达相关的疾病(例如血液癌症(例如DLBCL(例如原发性DLBCL)或B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)))的受试者的方法。该方法包括与如本文所述的PD1抑制剂(例如抗PD1抗体)组合，向受试者给予有效数量的如本文所述表达结合CD19的CAR分子(例如CD19 CAR)的细胞群(“CD19 CAR疗法”)。在一些实施例中，在PD-1抑制剂之前、与其同时或之后给予CD19 CAR疗法。在一个实施例中，在PD-1抑制剂之前给予CD19 CAR疗法。例如，可以在CD19 CAR疗法后(例如，CD19 CAR疗法后开始5天至4个月，例如10天至3个月，例如14天至2个月)给予PD-1抑制剂的一个或多个剂量。在一些实施例中，重复CD19 CAR疗法和PD-1抑制剂疗法的组合。
在包括表达CD19 CAR的细胞和PD1抑制剂的疗法的一个实施例中，CD19 CAR疗法包括用如本文所述表达CD19 CAR的细胞进行的一个或多个治疗。在实施例中，CD19 CAR分子包括特异性结合CD19的抗原结合结构域，例如，如本文所述。在实施例中，将CD19 CAR和PD-1抑制剂疗法以本文所述的剂量给予。
在一些实施例中，CD19 CAR(或编码其的核酸)包含在表2或表3中的任一个中列出的序列。
在包括表达CD19 CAR的细胞和PD1抑制剂的疗法的实施例中，CD19 CAR疗法包括用本文所述表达鼠CAR分子(例如，表3的或具有如表4和表5中列出的CDR的鼠CD19 CAR分子)的细胞进行的一个或多个治疗。在实施例中，CD19 CAR是CTL019，例如，如本文所述。
在包括表达CD19 CAR的细胞和PD1抑制剂的疗法的另一个实施例中，CD19 CAR疗法包括用表达人源化CD19 CAR(例如，根据表2的或具有如表4和表5中列出的CDR的人源化CD19 CAR(例如根据表2的CAR2)，例如CTL119)的细胞进行的一个或多个治疗。
在一些实施例中，CAR分子包括来自表4和表5的鼠或人源化CD19 CAR的重链可变区的一个、两个、和/或三个CDR和/或来自其轻链可变区的一个、两个、和/或三个CDR。
在包括表达CD19 CAR的细胞和PD1抑制剂的疗法的另一个实施例中，PD-1抑制剂是针对PD-1的抗体。在一些实施例中，PD-1抑制剂选自派姆单抗、纳武单抗、PDR001(例如表6的抗体分子)、MEDI-0680(AMP-514)、AMP-224、REGN-2810、或BGB-A317。
在包括表达CD19 CAR的细胞和PD1抑制剂的疗法的一个实施例中，PD-1抑制剂是派姆单抗。在一个实施例中，该抗体分子包括：
(i)重链可变(VH)区，该重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:503的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:504的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:505的VHCDR3氨基酸序列；以及
(ii)轻链可变(VL)区，该轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:500的VLCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:501的VLCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:502的rge VLCDR3氨基酸序列，
或至少85％、90％、95％相同或更高的氨基酸序列。
在包括表达CD19 CAR的细胞和PD1抑制剂的疗法的另一个实施例中，PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体分子)包括来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区来自选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如US 2015/0210769的表1、或本文表6所述；或者由表1中的核苷酸序列编码，或者由本文表6中的核苷酸序列编码，或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列；或者密切相关的CDR，例如相同或具有至少一个氨基酸改变，但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的CDR。
在包括表达CD19 CAR的细胞和PD1抑制剂的疗法的又另一个实施例中，PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体分子)包含至少一个、两个、三个或四个可变区，这些可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如US 2015/0210769的表1、或本文表6所述；或者由表1中的核苷酸序列编码；或者由本文表6中的核苷酸序列编码，或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在实施例中，PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体分子)是PDR-001，其含有如表6所述的BAP049-克隆-E的可变轻链和可变重链氨基酸序列。
在包括表达CD19 CAR的细胞和PD1抑制剂的疗法的一个实施例中，在CD19 CAR疗法后(例如，在CTL019或CTL119疗法、或CTL019和CTL119疗法的组合后开始5天至4个月，例如10天3个月，例如14天至2个月)，给予PD-1抑制剂(例如派姆单抗)。在实施例中，向患有B-ALL(例如复发或难治性B-ALL)的受试者给予该疗法。
在包括表达CD19 CAR的细胞和PD1抑制剂的疗法的又另一个实施例中，该血液癌症是B-ALL或DLBCL(例如复发或难治性B-ALL或DLBCL)。在一个实施例中，受试者患有血液恶性肿瘤(例如B-ALL或DLBCL)，并且可能不响应于CAR T疗法或可能例如由于差的CAR T细胞持久性而复发。在CD19 CAR疗法-PD1抑制剂疗法的一个实施例中，响应于CD19 CAR疗法-PD1抑制剂疗法(例如，CD19 CAR疗法-PD1抑制剂疗法的一个或多个循环)，受试者显示出改善的治疗结果，例如，受试者实现以下中的一个或多个：部分缓解、完全缓解、或延长的CART细胞持久性。
在包括表达CD19 CAR的细胞和PD1抑制剂的疗法的一个实施例中，在给予PD-1抑制剂之前，受试者患有复发或难治性B-ALL或DLBCL至用CD19 CAR疗法进行的先前治疗(例如，用CTL019和CTL119中的一个或两个进行的先前治疗)。在一些实施例中，受试者显示出降低或差的CAR T细胞持久性。在一些实施例中，受试者用或已经用CTL019随后用CTL119进行治疗。
在一些实施例中，受试者显示出CD19+复发。在一些实施例中，受试者患有复发或难治性CD19+ B-ALL。在一些实施例中，受试者患有复发或难治性CD19+ DLBCL。在一个实施例中，受试者患有具有淋巴结受累的复发或难治性B-ALL，例如患有淋巴瘤疾病。
在一些实施例中，响应于CD19 CAR疗法-PD1抑制剂疗法(例如，响应于CD19 CAR疗法-PD1抑制剂疗法的一个或多个循环)，患有具有淋巴结受累的复发或难治性B-ALL，例如患有淋巴瘤疾病至用CD19 CAR疗法进行的先前治疗的受试者显示出减少的PET-狂热病变，例如显示出降低的病变数量或强度。
在一些实施例中，与PD-1抑制剂(例如派姆单抗)组合，给予受试者(例如在CD19CAR疗法后显示出CD19+复发的受试者)进一步的CD19 CAR疗法。在实施例中，进一步给予组合疗法导致改善的治疗结果，例如受试者实现以下中的一个或多个：部分缓解、完全缓解、或延长的CAR T细胞持久性。在一个实施例中，给予组合疗法导致CAR T细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)的延长持久性。在一个实施例中，例如与仅用CD19 CAR疗法治疗的受试者相比，给予组合疗法导致B细胞恢复的较长时间，例如B细胞发育不全之前的较长时间。在一些实施例中，例如与仅用CD19 CAR疗法治疗的受试者相比，在用本文披露的组合治疗后，受试者具有以下中的一个或多个：(i)降低的复发风险，(ii)延迟的复发开始时间，或(iii)降低的复发严重程度。在一个实施例中，给予组合疗法导致客观的临床响应。
在一个实施例中，受试者(例如在CD19 CAR疗法后显示出复发的受试者)有资格接受重复给予CD19 CAR疗法(例如第二、第三或第四剂量)。在一个实施例中，受试者有资格接受重复给予CD19 CAR疗法(例如第二、第三或第四剂量)，连同PD-1抑制剂。在一个实施例中，在第一次给予CD19 CAR疗法后显示出低CD19 CAR疗法持久性的受试者有资格接受重复给予CD19 CAR疗法(例如第二、第三或第四剂量)，连同PD-1抑制剂。
任选地，受试者具有或被鉴定为具有至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％为CD3+/PD1+的癌细胞(例如DLBCL细胞)。
在另一个方面，本披露内容的特点在于一种包含本文所述表达CAR(例如CD19CAR)的细胞和本文所述PD-1抑制剂的组合物(例如，一种或多种剂量配制品、组合、或一种或多种药物组合物)。在一个实施例中，CAR(例如CD19 CAR)包括抗原结合结构域(例如CD19抗原结合结构域)、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域，如本文所述。在一个实施例中，CD19 CAR包含表2或表3中列出的CD19抗原结合结构域。在一个实施例中，PD-1抑制剂包括抗体分子、小分子、多肽(例如融合蛋白)、或抑制性核酸(例如siRNA或shRNA)。在一个实施例中，PD-1抑制剂包括抗体分子，例如派姆单抗、纳武单抗、PDR001或表6中列出的抗体分子。表达CAR的细胞和PD-1抑制剂可以在相同或不同的配制品或药物组合物中。
在另一个方面，本披露内容的特点在于一种包含本文所述表达CAR(例如CD19CAR)的细胞和本文所述PD-1抑制剂的组合物(例如，一种或多种剂量配制品、组合、或一种或多种药物组合物)，用于在治疗疾病(例如癌症)，例如与CD19表达相关的疾病，例如本文所述的癌症的方法中使用。在一个实施例中，CAR(例如CD19 CAR)包括抗原结合结构域(例如CD19抗原结合结构域)、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域，如本文所述。在一个实施例中，CD19 CAR包含表2或表3中列出的CD19抗原结合结构域。在一个实施例中，PD-1抑制剂包括抗体分子、小分子、多肽(例如融合蛋白)、或抑制性核酸(例如siRNA或shRNA)。在一个实施例中，PD-1抑制剂包括抗体分子，例如派姆单抗、纳武单抗、PDR001、或表6中列出的抗体分子。表达CAR的细胞和PD-1抑制剂可以在相同或不同的配制品或药物组合物中。
PD-1抑制剂
本文提供了PD-1抑制剂，用于在任何本文所述的方法或组合物中使用。在任何本文所述的方法或组合物中，PD-1抑制剂包括抗体分子、小分子、多肽(例如融合蛋白)、或抑制性核酸(例如siRNA或shRNA)。
在一个实施例中，PD-1抑制剂的特征在于以下中的一种或多种：
抑制或减少PD-1表达，例如PD-1的转录或翻译；抑制或降低PD-1活性，例如抑制或降低PD-1与其配体(例如PD-L1)的结合；或结合PD-1或其配体(例如PD-L1)。
在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗体分子。
在一个实施例中，PD-1抑制剂包括抗PD-1抗体分子，该抗PD-1抗体分子包含表6中列出的任何PD-1抗体分子氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)、和重链互补决定区3(HC CDR3)；和/或表6中列出的任何PD-1抗体分子氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)、和轻链互补决定区3(LC CDR3)。
在一个实施例中，抗PD1抗体分子包含选自SEQ ID NO:137或140的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:138或141的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:139的HC CDR3氨基酸序列；和/或SEQ ID NO:146或149的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147或150的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:148、151、166、或167的LC CDR3氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体包含选自SEQ ID NO:137或140的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:138或141的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:139的HC CDR3氨基酸序列；和/或SEQ ID NO:146或149的LCCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147或150的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:166或167的LCCDR3氨基酸序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链可变区，该重链可变区包含表6中列出的任何重链可变区(例如SEQ ID NO:142、144、154、158、154、158、172、184、216、或220)的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链可变区，该重链可变区包含对表6中提供的任何重链可变区(例如SEQ ID NO:142、144、154、158、154、158、172、184、216、或220)的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链可变区，该重链可变区包含与表6中提供的任何重链可变区(例如SEQ ID NO:142、144、154、158、154、158、172、184、216、或220)的氨基酸序列至少95％相同(例如，具有95％-99％同一性)的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链，该重链包含表6中列出的任何重链(例如SEQ ID NO:156、160、174、186、218、222、225、或236)的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链，该重链包含对表6中列出的任何重链(例如SEQ ID NO:156、160、174、186、218、222、225、或236)具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链，该重链包含与表6中列出的任何重链(例如SEQ ID NO:156、160、174、186、218、222、225、或236)的氨基酸序列具有95％-99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含轻链可变区，该轻链可变区包含表6中列出的任何轻链可变区(例如SEQ ID NO:152、162、168、176、180、188、192、196、200、204、208、或212)的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含轻链可变区，该轻链可变区包含对表6中提供的任何轻链可变区(例如SEQ ID NO:152、162、168、176、180、188、192、196、200、204、208、或212)的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含轻链可变区，该轻链可变区包含与表6中提供的任何轻链可变区(例如SEQ ID NO:152、162、168、176、180、188、192、196、200、204、208、或212)的氨基酸序列至少95％相同(例如，具有95％-99％同一性)的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含轻链，该轻链包含表6中列出的任何轻链(例如SEQ ID NO:164、170、178、182、190、194、198、202、206、210、或214)的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含轻链，该轻链包含对表6中列出的任何轻链(例如SEQID NO:164、170、178、182、190、194、198、202、206、210、或214)具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含轻链，该轻链包含与表6中列出的任何轻链(例如SEQ ID NO:164、170、178、182、190、194、198、202、206、210、或214)的氨基酸序列至少95％相同(例如，具有95％-99％同一性)的氨基酸序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：
i)包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的轻链；
ii)包含SEQ ID NO:156或160的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的轻链；
iii)包含SEQ ID NO:156或160的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的轻链；
iv)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的轻链；
v)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的轻链；
vi)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的轻链；
vii)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的轻链；
viii)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的轻链；
ix)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链；
x)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的轻链；
xi)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链；
xii)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链；
xiii)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链；
xiv)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链；
xv)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的轻链；
xvi)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的轻链；
xvii)包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链；
xviii)包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链；
xix)包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链；
xx)包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的轻链；
xxi)包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的轻链；
xxii)包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链；
xxiii)包含SEQ ID NO:236的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链；或
xxiv)包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：
i)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域；
ii)包含SEQ ID NO:142或144的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的轻链可变结构域；
iii)包含SEQ ID NO:154或158的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ IDNO:162的氨基酸序列的轻链可变结构域；
iv)包含SEQ ID NO:154或158的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的轻链可变结构域；
v)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的轻链可变结构域；
vi)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的轻链可变结构域；
vii)包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的轻链可变结构域；
viii)包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的轻链可变结构域；
ix)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的轻链可变结构域；
x)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xi)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xii)包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xiii)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xiv)包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xv)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xvi)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xvii)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xviii)包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xix)包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xx)包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xxi)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xxii)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xxiii)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
xxiv)包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，其包含BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E的氨基酸序列；或者如US 2015/0210769的表1、或本文表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码，或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。抗PD-1抗体分子任选地包含前导序列，该前导序列来自如US2015/0210769的表4中所示的重链、轻链或两者；或与其基本上相同的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个、或三个互补决定区(CDR)，该重链可变区和/或轻链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自重链可变区的至少一个、两个、或三个CDR(或总体上全部CDR)，该重链可变区包含US 2015/0210769的表1或本文表6中所示的氨基酸序列，或由表6中所示的核苷酸序列编码。在一个实施例中，相对于表6中所示的氨基酸序列，或由表6中所示的核苷酸序列编码，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自轻链可变区的至少一个、两个、或三个CDR(或总体上全部CDR)，该轻链可变区包含US 2015/0210769的表1或本文表6中所示的氨基酸序列，或由表6中所示的核苷酸序列编码。在一个实施例中，相对于表6中所示的氨基酸序列，或由表6中所示的核苷酸序列编码，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施例中，抗PD-1抗体分子包括轻链CDR中的取代，例如轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。在一个实施例中，根据表6(例如鼠或嵌合、未修饰序列的SEQ ID NO:152或162；或修饰序列的SEQ ID NO:168、176、180、188、192、196、200、204、208、或212中的任一个)，抗PD-1抗体分子在轻可变区的位置102处包括轻链CDR3中的取代(例如，将半胱氨酸取代为酪氨酸)，或在轻可变区的位置102处将半胱氨酸取代为丝氨酸残基。
在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区包含US 2015/0210769的表1、或本文表6中所示的氨基酸序列，或由表6中所示的核苷酸序列编码。在一个实施例中，相对于表6中所示的氨基酸序列，或由表6中所示的核苷酸序列编码，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括：
(a)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:140的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:141的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:149的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:150的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:167的VLCDR3氨基酸序列，各自在US 2015/0210769的表1、或本文表6中披露；
(b)VH，该VH包含选自SEQ ID NO:137的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:138的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:146的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:166的VLCDR3氨基酸序列，各自在US 2015/0210769的表1、或本文表6中披露；
(c)VH，该VH包含SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:141的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:149的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:150的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:167的VLCDR3氨基酸序列，各自在US 2015/0210769的表1、或本文表6中披露；或
(d)VH，该VH包含SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:138的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:146的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:166的VLCDR3氨基酸序列，各自在US 2015/0210769的表1、或本文表6中披露。
在下文的组合中，在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含(i)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含选自SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:140、或SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:141的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及(ii)轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:149的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:150的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:166或SEQ ID NO:167的VLCDR3氨基酸序列，各自在US 2015/0210769的表1、或本文表6中披露。
在实施例中，PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体分子)是PDR-001，其含有如表6所述的BAP049-克隆-E的可变轻链和可变重链氨基酸序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含含有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一些实施例中，PD-1抑制剂选自纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、AMP 514、AMP-224、或描述于US 8,609,089、US 2010028330、和/或US 20120114649中的抗PD1抗体，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。
在一个实施例中，PD-1抑制剂是派姆单抗。在一个实施例中，该抗体分子包括：
(i)重链可变(VH)区，该重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:503的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:504的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:505的VHCDR3氨基酸序列；以及
(ii)轻链可变(VL)区，该轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:500的VLCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:501的VLCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:502的rge VLCDR3氨基酸序列，
或至少85％、90％、95％相同或更高的氨基酸序列。
表达CAR的细胞
本文提供了表达靶向(例如特异性结合)抗原(例如CD19)的嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如免疫效应细胞)，用于在任何本文所述的方法或组合物中使用。特异性结合抗原X的CAR本文还称为“X CAR”。例如，特异性结合CD19的CAR本文还称为“CD19 CAR”。由本文所述的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)表达的CAR(例如CD19 CAR)包括抗原结合结构域(例如CD19结合结构域)、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域和/或初级信号传导结构域。
在实施例中，CAR分子包括抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域(例如，包括共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域)。
在一个实施例中，CAR分子包括抗原结合结构域，该抗原结合结构域能够结合例如选自以下中的一种或多种的本文所述抗原(例如肿瘤抗原)：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(还称为CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319、和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；Ca癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；延伸因子2突变(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸化Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记7相关(TEM7R)；claudin 6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物、基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)、由T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰基葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc鸟髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P4501B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点的调节物的兄弟)，由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖化终产物受体(RAGE-1)；肾普遍存在1(RU1)；肾普遍存在2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPVE7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一个实施例中，CAR的抗原结合结构域结合B细胞抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、和/或CD79a。
在实施例中，CAR的抗原结合结构域结合CD123。
在实施例中，CAR的抗原结合结构域结合CD19。
在其他实施例中，CAR的抗原结合结构域结合BCMA。
在实施例中，CAR的抗原结合结构域结合CLL。
CD19抗原结合结构域
在一个实施例中，CD19结合结构域包含表2或表3中列出的任何CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)、和重链互补决定区3(HC CDR3)；以及表2或表3中列出的任何CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)、和轻链互补决定区3(LC CDR3)。在一个实施例中，CD19结合结构域包含根据表4中的HC CDR氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HCCDR3，以及根据表5中的LC CDR氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2、和LC CDR3。
在一个实施例中，CD19结合结构域包含(例如，由其组成)选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、或SEQ ID NO:115。在一个实施例中，CD19结合结构域包含(例如，由其组成)对以下中的任一个具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列：SEQID NO:109、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、或SEQ ID NO:115。在一个实施例中，CD19结合结构域包含(例如，由其组成)与以下中的任一个的氨基酸序列具有95％-99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、或SEQ ID NO:115。
CAR分子的另外结构域
在一个实施例中，CAR(例如CD19 CAR)包括包含蛋白质(例如本文所述的蛋白质)的跨膜结构域的跨膜结构域，该蛋白质例如选自下组，该组由以下组成：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一个实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的序列。在一个实施例中，跨膜结构域包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，编码跨膜结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。
在一个实施例中，抗原结合结构域(例如CD19结合结构域)通过铰链区(例如本文所述的铰链区)连接至跨膜结构域。在一个实施例中，编码的铰链区包含SEQ ID NO:2、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。在一个实施例中，编码铰链区的核酸序列包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。
在一个实施例中，分离的核酸分子进一步包含编码共刺激结构域(例如本文所述的共刺激结构域)的序列。在实施例中，细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域。在实施例中，细胞内信号传导结构域包括初级信号传导结构域。在实施例中，细胞内信号传导结构域包括共刺激结构域和初级信号传导结构域。
在一个实施例中，共刺激结构域是来自蛋白质的功能性信号传导结构域，该蛋白质例如本文所述，例如选自下组，该组由以下组成：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、以及与CD83特异性结合的配体。
在一个实施例中，4-1BB的共刺激结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一个实施例中，编码的共刺激结构域包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。在一个实施例中，编码共刺激结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。在另一个实施例中，CD28的共刺激结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一个实施例中，共刺激结构域包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，编码CD28的共刺激结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。在另一个实施例中，CD27的共刺激结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一个实施例中，共刺激结构域包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。在一个实施例中，编码CD27的共刺激结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。在另一个实施例中，ICOS的共刺激结构域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一个实施例中，ICOS的共刺激结构域包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，编码ICOS的共刺激结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。在实施例中，共刺激结构域包含含有SEQ IDNO:43的氨基酸序列的ICOS共刺激结构域突变体(例如Y至F突变体)。
在一些实施例中，初级信号传导结构域包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。在实施例中，CD3ζ的功能性信号传导结构域包含SEQ ID NO:9(突变体CD3ζ)或SEQ ID NO:10(野生型人CD3ζ)的氨基酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。
在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施例中，4-1BB的细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的CD3ζ氨基酸序列。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQID NO:10的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的序列和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列，其中包含细胞内信号传导结构域的序列在同一框架中表达并且表达为单一多肽链。在一个实施例中，编码细胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列，和/或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的CD3ζ核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。
在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含CD27的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施例中，CD27的编码的细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的CD3ζ氨基酸序列。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列和/或SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:8的序列和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列，其中包含细胞内信号传导结构域的序列在同一框架中表达并且表达为单一多肽链。在一个实施例中，编码CD27的细胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列，和/或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的CD3ζ核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。
在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含CD28的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施例中，CD28的细胞内信号传导结构域包含SEQID NO:36的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的CD3ζ氨基酸序列。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:36的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:36的序列和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列，其中包含细胞内信号传导结构域的序列在同一框架中表达并且表达为单一多肽链。在一个实施例中，编码CD28的细胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列，和/或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的CD3ζ核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。
在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含ICOS的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施例中，ICOS的细胞内信号传导结构域包含SEQID NO:38的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的CD3ζ氨基酸序列。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:38的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:38的序列和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列，其中包含细胞内信号传导结构域的序列在同一框架中表达并且表达为单一多肽链。在一个实施例中，编码ICOS的细胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列，和/或SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的CD3ζ核苷酸序列、或其至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的序列。
在一个实施例中，CAR(例如CD19 CAR)进一步包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的前导序列。
示例性CAR分子
在一个实施例中，CD19 CAR包含以下中的任一个的氨基酸序列：SEQ ID NO:108；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQID NO:104、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116。在一个实施例中，CD19 CAR包含对以下中的任一个具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列：SEQ ID NO:108；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116。在一个实施例中，CD19 CAR包含与以下中的任一个至少95％相同(例如具有95％-99％同一性)的氨基酸序列：SEQ ID NO:108；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116。
在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的CD123 CAR，例如描述于US 2014/0322212 A1或US 2016/0068601 A1中的CD123 CAR，两者均通过引用并入本文。在实施例中，CD123 CAR包含氨基酸，或具有US 2014/0322212 A1或US 2016/0068601 A1中所示的核苷酸序列，两者均通过引用并入本文。
在实施例中，CAR分子包含本文所述的CD19 CAR分子，例如描述于US-2015-0283178-A1中的CD19 CAR分子，例如CTL019。在实施例中，CD19 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US-2015-0283178-A1中所示的核苷酸序列。
在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的BCMA CAR分子，例如描述于US-2016-0046724-A1中的BCMA CAR。在实施例中，BCMA CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US-2016-0046724-A1中所示的核苷酸序列。
在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的CLL1 CAR，例如描述于通过引用并入本文的US 2016/0051651 A1中的CLL1 CAR。在实施例中，CLL1 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2016/0051651 A1中所示的核苷酸序列。
在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的CD33 CAR，例如描述于通过引用并入本文的US 2016/0096892 A1中的CD33 CAR。在实施例中，CD33 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2016/0096892 A1中所示的核苷酸序列。
在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的EGFRvIII CAR分子，例如描述于通过引用并入本文的US 2014/0322275 A1中的EGFRvIII CAR。在实施例中，EGFRvIII CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2014/0322275 A1中所示的核苷酸序列。
在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的间皮素CAR，例如描述于通过引用并入本文的WO 2015/090230中的间皮素CAR。在实施例中，间皮素CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的WO 2015/090230中所示的核苷酸序列。
在本文所述的任何方法和组合物的实施例中，包含CAR的细胞包含编码该CAR的核酸。
在一个实施例中，编码CAR的核酸是慢病毒载体。在一个实施例中，编码CAR的核酸通过慢病毒转导引入细胞中。在一个实施例中，编码CAR的核酸是RNA，例如体外转录的RNA。在一个实施例中，编码CAR的核酸通过电穿孔引入细胞中。
在本文所述的任何方法和组合物的实施例中，该细胞是T细胞或NK细胞。在一个实施例中，T细胞是自体或同种异体T细胞。
在一个实施例中，该方法进一步包括给予另外的治疗剂(例如抗癌治疗剂)用于治疗本文所述的疾病。在实施例中，该方法进一步包括例如在给予本文所述的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和/或PD-1抑制剂之前、与其并行、或之后，给予例如本文所述的淋巴清除剂。在实施例中，淋巴清除剂包括一种或多种化疗剂、化疗剂的组合、放射疗法、或化疗-放射疗法的组合，包括但不限于美法仑、环磷酰胺、氟达拉滨、苯达莫司汀、和环磷酰胺-放射疗法。
在本文所述的任何方法和组合物的实施例中，该疾病(例如癌症)，例如与CD19表达相关的疾病是癌症。在一个实施例中，该癌症是血液癌症。在实施例中，该血液癌症选自以下中的一种或多种：B细胞急性淋巴细胞性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病、MALT淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。在实施例中，该血液癌症是白血病，例如急性白血病或慢性白血病。在其他实施例中，该血液癌症是淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤。在实施例中，该非霍奇金淋巴瘤是伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、和套细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、或前体T淋巴母细胞淋巴瘤。
在一个实施例中，该癌症表达CD19，例如表达CD19。在其他实施例中，该癌症是复发或难治性B-ALL。在一个实施例中，该癌症是具有淋巴结受累的复发或难治性B-ALL，例如具有淋巴瘤疾病。在其他实施例中，该癌症是DLBCL，例如复发或难治性DLBCL。
在一些实施例中，将CAR疗法(例如CD19 CAR疗法)与PD-1抑制剂(例如，如本文所述的PD-1抑制剂)组合给予至患有霍奇金淋巴瘤(HL)(例如复发或难治性HL)的受试者。在一个实施例中，在PD-1抑制剂后向患有复发和/或难治性HL的受试者给予CAR疗法。在另一个实施例中，在CAR疗法后向患有复发和/或难治性HL的受试者给予PD-1抑制剂，例如，如本文所述。在另一个实施例中，在给予CAR疗法后20天或更短开始给予PD-1抑制剂，例如，如本文所述。在一些实施例中，表达CD19 CAR的细胞是例如通过电穿孔将编码CD19CAR的RNA引入其中的细胞。在实施例中，受试者包含CD19阴性和CD19阳性癌细胞。在实施例中，例如在2周的过程中，用6个剂量的表达CAR的细胞治疗受试者。在实施例中，该剂量例如对于<80kg的受试者包含1x 105-5x 106或8x 105-1.5x 106个表达CD19 CAR的细胞/剂量，或者例如对于≥80kg的受试者包含1x 108(±50％)或1x 108(±20％)个表达CD19 CAR的细胞/剂量。在实施例中，该剂量包含约1x 105-1.5x 106个表达CD19 CAR的细胞/剂量。在实施例中，受试者未经历CRS或未经历严重CRS。在实施例中，受试者经历完全响应、部分响应、或稳定疾病。
受试者
在一个实施例中，受试者(例如，从其获取免疫细胞的受试者和/或有待治疗的受试者)是人，例如癌症患者。在某些实施例中，受试者的年龄是18岁或更年轻(例如18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1岁或更年轻(例如12个月、6个月、3个月或更小))。在一个实施例中，受试者是儿科癌症患者。
在其他实施例中，受试者是成人，例如受试者的年龄大于18岁(例如大于18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、或更大)。在一个实施例中，受试者是成人癌症患者。
在某些实施例中，受试者患有与肿瘤或癌症相关抗原的表达相关的疾病(例如，如本文所述的疾病)。在一个实施例中，受试者患有癌症(例如，如本文所述的癌症)。
在一个实施例中，受试者患有选自血液癌症、实体瘤、或其转移性病变的癌症。示例性癌症包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞早幼粒细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、以及瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。在一个实施例中，该癌症是ALL。在另一个实施例中，该癌症是CLL。在一个实施例中，该癌症是DLBCL，例如复发或难治性DLBCL。
在实施例中，受试者患有白血病，例如ALL(例如B-ALL)。在实施例中，受试者患有白血病(例如ALL)并且是儿科患者，例如年龄是18岁或更年轻(例如18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1岁或更年轻(例如12个月、6个月、3个月或更小))。
在实施例中，受试者患有淋巴瘤，例如DLBCL。在实施例中，受试者患有淋巴瘤，例如DLBCL(例如复发或难治性DLBCL)并且是成人患者，例如年龄大于18岁(例如大于18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、或更大)。
在实施例中，受试者患有(例如被诊断患有)本文所述的疾病(例如癌症)，例如与CD19表达相关的疾病，例如本文所述与CD19表达相关的癌症。在实施例中，受试者患有复发和/或难治性癌症，例如复发或难治性淋巴瘤，例如CD19+淋巴瘤。在实施例中，受试者患有DLBCL，例如CD19+ DLBCL。在实施例中，受试者患有从滤泡性淋巴瘤转化的DLBCL。在实施例中，受试者患有DLBCL和进行性淋巴瘤。在实施例中，受试者患有具有原发纵隔起源的DLBCL。在实施例中，受试者先前已治疗了淋巴瘤(例如DLBCL)并且患有难治性淋巴瘤(例如难治性DLBCL)。
在实施例中，例如在给予第一剂量前，受试者患有(例如被诊断患有)高肿瘤负荷癌症。在一个实施例中，该癌症是ALL或CLL。在实施例中，受试者具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％，例如至少5％的骨髓幼稚细胞水平。在实施例中，受试者患有I、II、III、或IV期癌症。在实施例中，受试者例如在单个肿瘤或多个肿瘤中具有至少1、2、5、10、20、50、100、200、500、或1000g的肿瘤质量。
在实施例中，在给予本文所述的表达CAR的细胞和/或PD-1抑制剂之前，已经给予受试者化疗，例如本文所述的化疗(例如淋巴清除化疗，例如卡铂和/或吉西他滨)。在实施例中，在给予本文所述的表达CAR的细胞和/或PD-1抑制剂之前，已经给予受试者免疫疗法，例如同种异体骨髓移植。
在本文所述的任何方法和组合物的实施例中，受试者是哺乳动物，例如人。在一个实施例中，受试者表达PD-1。在一个实施例中，受试者中的癌细胞或紧密接近癌细胞(例如癌症相关细胞)的细胞表达PD-1或PL-L1。在一个实施例中，癌症相关细胞是抗肿瘤免疫细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
在一个实施例中，表达CAR的细胞(例如，本文所述的表达CD19CAR的细胞)表达PD-1。
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管在实施或测试本发明时可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述适合的方法和材料。本文所提到的所有出版物、专利申请、专利、和其他参考文献均通过引用以其全文并入。此外，材料、方法、和实例仅仅是示例性的并且不旨在是限制性的。标题、小标题或编号或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素以字母顺序执行，或者步骤或元素必须彼此离散。根据说明书和附图并且根据权利要求书，本发明的其他特征、目标、和优点将是显而易见的。
附图说明
图1A是患者的弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞中PD-L1(CD274)表达的图像。在CART19细胞输注之前获得活组织检查。用来自细胞信号传导公司(Cell Signaling)(克隆E1J2J，目录号15165BF)的抗PD-L1抗体进行免疫组织化学染色。主图像放大40倍，右上角插入100倍。
图1B是一组CT扫描，示出三周后对派姆单抗的临床响应。左侧图像是在派姆单抗输注当天(第26天)，并且右侧图像是在派姆单抗输注后3周(第45天)。
图2A-2L是示出相关研究的图，这些相关研究检查与CART19输注和派姆单抗输注相关的T细胞子集的变化。(图2A)外周血中CART19+CD3+细胞的百分比。CART19输注之前(前)、CART19输注后三天(第3天)、CART19后7天(第7天)、CART19后十天(第10天)、CART19后十四天(第14天)、CART19后二十六天和派姆单抗输注后一小时(第26天)、CART19后二十七天和派姆单抗后一天(第27天)、CART19后二十八天和派姆单抗后2天(第28天)、以及CART19后四十五天和派姆单抗后14天(第45天)的CD3+细胞的CART19+百分比。(图2B)IL-6血清水平从基线的倍数变化。(图2C)外周血中PD1+CD4+细胞和PD1+CART19+CD4+细胞的百分比。(图2D)外周血中PD1+CD8+细胞和PD1+CART19+CD8+细胞的百分比。(图2E)外周血中PD1+Eomes+CD4+细胞和PD1+Eomes+CART19+CD4+细胞的百分比。(图2F)外周血中PD1+Eomes+CD8+细胞和PD1+Eomes+CART19+CD8+细胞的百分比。(图2G)外周血中粒酶B+CD4+细胞和粒酶B+CART19+CD4+细胞的百分比。(图2H)外周血中粒酶B+CD8+细胞和粒酶B+CART19+CD8+细胞的百分比。(图2I)外周血中PD1+CD4+细胞和PD1+Eomes+CD4+细胞的百分比。(图2J)外周血中PD1+CD4+CART19+细胞和PD1+Eomes+CD4+CART19+细胞的百分比。(图2K)外周血中PD1+CD8+细胞和PD1+Eomes+C8+细胞的百分比。(图2L)外周血中PD1+CD8+CART19+细胞和PD1+Eomes+CD8+CART19+细胞的百分比。
图3示出了来自五名CR患者、一名未分类患者、和六名PD患者的淋巴结(LN)和骨髓(BM)样品中PD-L1、PD1、LAG3、和TIM3(每组四个条中从左到右)的表达。
图4A、4B、4C、和4D示出了T细胞上PD1和CAR19表达的流式细胞术分析。图4A和图4B是代表性的流式细胞术图谱，其证明PD-1和CAR19表达在来自为CART疗法的完全响应者(CR)或无响应者(NR)的受试者的CD4+ T细胞上的分布。图4C是示出来自对CART疗法具有不同响应的受试者组的CD4+ T细胞群中PD1细胞百分比的图。图4D是示出来自对CART疗法具有不同响应的受试者组的CD8+ T细胞群中PD1细胞百分比的图。
图5A和图5B示出了来自对CART疗法具有不同响应的受试者组的CD4和表达CAR19的细胞(图5A)或CD8和表达CAR19的细胞(图5B)中PD1表达的分布。
图6示出了来自为CART疗法的完全响应者(CR)或无响应者(NR)的受试者的T细胞上PD1、CAR 19、LAG3、和TIM3表达的流式细胞术分析。
图7A和图7B示出了来自对CART疗法具有不同响应的受试者组的PD1和LAG3表达(图7A)或PD1和TIM3表达(图7B)的分布。
图8示出了多重FIHC AQUA分析，该分析显示初级和次级人DLBCL患者样品中CD3+/PD-1+细胞群之间的显著差异。
图9示出了AQUA分析，该分析显示DLBCL样品的初级和次级位点中的各种水平的CD19(下图)和PD-L1(上图)。使总共40个人DLBCL患者样品(25个初级和15个次级位点)经受多重FIHC并且随后是AQUA分析以鉴定CD19和PD-L1蛋白的表达水平。
图10示出了仅输注CART19细胞后或输注CART19细胞与派姆单抗的剂量后，来自病例3的患者中CART19细胞的百分比。
图11示出了仅接受huCART19或huCART19和派姆单抗的患者的B细胞恢复相比huCART19输注后数月的概率的图。
图12示出了来自仅输注有CART19(圆圈)以及在用派姆单抗(方块)处理后的病例6的患者中CART19的百分比。
图13示出了来自在用派姆单抗治疗之前和之后使用CART19的病例6的患者中CART19的百分比，其与用派姆单抗治疗之前和之后的PET扫描数据整合。
图14是描绘了接受RNA CART19疗法的四名患者的外周血中CART19RNA表达水平的图。在每次输注之前和之后(第0、2、4、9、11和14天)收集的细胞上进行定量RT-PCR。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
术语“一个/种(a和an)”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
当指可测量的值如量、时距等时，术语“约”意在涵盖与规定值±20％或在一些情况下±10％、或在一些情况下±5％、或在一些情况下±1％、或在一些情况下±0.1％的变化，因为此类变化适于执行所披露的方法。
如本文所用，“组合”给予意指在受试者患病期间将两种(或更多种)不同的治疗递送至受试者，例如在受试者被诊断患有病症后并且在该病症被治愈或清除前或者在由于其他原因终止治疗前递送两种或多种治疗。在一些实施例中，当第二治疗的递送开始时，第一治疗的递送仍在进行，所以就给予而言存在重叠。这在本文中有时被称为“同时递送”或“并行递送”。在其他实施例中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始前结束。在每一种情况的一些实施例中，由于是组合给予，该治疗更有效。例如，与不存在第一治疗的条件下给予第二治疗所观察到的结果相比，第二治疗更有效，例如使用更少的第二治疗观察到等效的作用，或者第二治疗将症状减少更大的程度，或者观察到对第一治疗而言类似的情况。在一些实施例中，与不存在另一种治疗的条件下递送一种治疗所观察到的结果相比，递送使得症状或与该病症相关的其他参数减少更多。两种治疗的作用可以部分累加、完全累加、或大于累加。该递送可以使得当递送第二治疗时，递送的第一治疗的作用仍然是可检测的。
术语“嵌合抗原受体”或可替代的“CAR”是指重组多肽构建体，该重组多肽构建体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自如下定义的刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞质信号传导结构域(本文还称为“细胞内信号传导结构域”)。在一些实施例中，CAR多肽构建体中的结构域在同一多肽链中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些实施例中，例如，如在如本文所述的RCAR中所提供，CAR多肽构建体中的结构域彼此不连续，例如在不同的多肽链中。
在一个方面，刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如CD3-ζ的初级信号传导结构域)。在一个方面，细胞质信号传导结构域进一步包含源自如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激分子选自4-1BB(即CD137)、CD27、ICOS、和/或CD28。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域以及包含源自共刺激分子的功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域以及包含源自一个或多个共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域以及包含源自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域。在一个方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基末端(N-ter)处的任选前导序列。在一个方面，CAR进一步包含细胞外抗原结合结构域的N末端处的前导序列，其中该前导序列任选地在细胞加工和CAR定位到细胞膜期间从抗原识别结构域(例如scFv)切割。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，其通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过响应于此类信使而用作效应子，经由定义的信号传导途径调节细胞活动起作用。在一些方面，本文所述CAR的信号传导结构域源自本文所述的刺激分子或共刺激分子，或者是合成或工程化的信号传导结构域。
如本文所用，术语“CD19”是指分化簇19蛋白，该分化簇19蛋白是白血病前体细胞上可检测的抗原决定簇。人和鼠氨基酸和核酸序列可以在公共数据库如GenBank、UniProt和Swiss-Prot中找到。例如，人CD19的氨基酸序列可以作为UniProt/Swiss-Prot登录号P15391找到，并且编码人CD19的核苷酸序列可以在登录号NM_001178098处找到。如本文所用，“CD19”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD19的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。CD19在大多数B谱系癌症(包括例如急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤)上表达。具有表达CD19的其他细胞在下文“与CD19表达相关的疾病”的定义中提供。它也是B细胞祖细胞的早期标记。参见例如，Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)。在一个方面，CART的抗原结合部分识别并结合CD19蛋白的细胞外结构域内的抗原。在一个方面，CD19蛋白在癌细胞上表达。
如本文所用的术语“抗体”或“抗体分子”是指源自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质、或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链、或完整免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。在一个实施例中，抗体或抗体分子包含抗体片段，例如由抗体片段组成。
术语“抗体片段”是指完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且是指足以赋予抗体片段识别和特异性结合靶标(如抗原)的抗原结合结构域(例如完整抗体的抗原决定可变区)。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科动物VHH结构域、和由抗体片段(如包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体、和分离的CDR或抗体的其他表位结合片段。抗原结合片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、纳米抗体、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和bis-scFv中(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology[自然生物技术]23:1126-1136,2005)。抗原结合片段还可以基于多肽(如III型纤连蛋白(Fn3))接枝到支架中(参见美国专利号：6,703,199，该文献描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。
术语“scFv”是指融合蛋白，该融合蛋白包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中该轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中该scFv保留了衍生其的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文所用，scFv可以例如相对于多肽的N末端和C末端以任何顺序具有VL和VH可变区，该scFv可以包含VL-接头-VH或者可以包含VH-接头-VL。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸序列。例如，一般来说，每个重链可变区中存在三个CDR(例如HCDR1、HCDR2、和HCDR3)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),"Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest"[具有免疫学重要性的蛋白序列]，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)、或其组合。根据Kabat编号方案，在一些实施例中，将重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)、和95-102(HCDR3)；并将轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)、和89-97(LCDR3)。根据Chothia编号方案，在一些实施例中，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)、和95-102(HCDR3)；并将VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)、和91-96(LCDR3)。在组合的Kabat和Chothia编号方案中，在一些实施例中，CDR对应于为Kabat CDR、Chothia CDR或两者的一部分的氨基酸残基。例如，在一些实施例中，CDR对应于VH(例如哺乳动物VH，例如人VH)中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)、和95-102(HCDR3)；和VL(例如哺乳动物VL，例如人VL)中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)、和89-97(LCDR3)。
包含抗体或其抗体片段的本发明CAR的部分可以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，包括例如scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科动物VHH结构域、人源化抗体、双特异性抗体、抗体缀合物(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold SpringHarbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一个方面，本发明CAR的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一个方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。
如本文所用，术语“抗体分子”是指包含至少一种免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语抗体分子涵盖抗体和抗体片段。在一个实施例中，抗体分子涵盖“结合结构域”(本文还称为“抗靶(例如CD19)结合结构域”或“靶(例如CD19)结合结构域”)。在一个实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中该多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且该多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
术语“抗体重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，并且通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。Kappa(κ)和lambda(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如像由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子和表达抗体蛋白的DNA分子或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中该DNA或氨基酸序列已经使用本领域可得和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫响应的分子。免疫响应可以涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的活化或两者。技术人员将理解实际上包括所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。技术人员将理解包含编码引发免疫响应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都因此编码“抗原”(当该术语在本文中使用时)。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所需免疫响应的多肽。另外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或可以源自生物样品，或者可以是除多肽外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的流体。
术语“抗癌效应”是指可以通过各种手段显现的生物学效应，包括但不限于例如肿瘤体积减少、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命延长、癌细胞增殖减少、癌细胞存活率降低、或改善与癌症相关的各种生理症状。“抗癌效应”还可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防癌症发生的能力来显现。术语“抗肿瘤效应”是指可以通过各种手段显现的生物学效应，包括但不限于例如肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少、或肿瘤细胞存活率降低。
术语“自体的”是指源自与后来将其重新引入个体中的同一个体的任何材料。
术语“同种异体的”是指源自与引入材料的个体相同的物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时，称两个或更多个个体彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体材料可以在遗传上充分不同以抗原性地相互作用。
术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
术语“癌症”是指特征在于异常细胞不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的实例，并且包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语包括实体和液体，例如弥散或循环肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前以及恶性癌症和肿瘤。
术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”或“增殖性病症抗原”或“与增殖性病症相关的抗原”可互换地是指与正常细胞相比，优先在癌细胞表面上完全或作为片段(例如MHC/肽)表达，并且可用于优先将药理学药剂靶向癌细胞的分子(典型地是蛋白质、碳水化合物或脂质)。在一些实施例中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标记，例如谱系标记，例如B细胞上的CD19。在某些方面，本发明的肿瘤抗原源自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌(如乳腺癌、前列腺癌症)、卵巢癌、胰腺癌等。在一些实施例中，肿瘤抗原是特定增殖性病症常见的抗原。在一些实施例中，癌症相关抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达(例如与正常细胞相比1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多)的细胞表面分子。在一些实施例中，癌症相关抗原是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施例中，癌症相关抗原将仅在癌细胞的细胞表面上完全或作为片段(例如MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施例中，本发明的CAR包括包含结合MHC呈递的肽的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR。通常，源自内源性蛋白质的肽填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并且被CD8+ T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表用于免疫疗法的独特类别的细胞表面靶标。已经描述了在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的情况下靶向源自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见例如，Sastry等人,J Virol.[病毒学杂志]201185(5):1935-1942；Sergeeva等人,Bood[血液],2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol[免疫学杂志]2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,GeneTher[基因疗法]2001 8(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med[科学转化医学]2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther[癌基因疗法]2012 19(2):84-100)。例如，可以从筛选文库(如人scFv噬菌体展示文库)鉴定TCR样抗体。
短语“与CD19表达相关的疾病”包括但不限于与CD19表达相关的疾病(例如野生型或突变型CD19)或与表达或在任何时间表达CD19(例如野生型或突变型CD19)的细胞相关的病状，包括例如增殖性疾病，如癌症或恶性肿瘤或癌前病状，如脊髓发育不良、脊髓发育不良综合征或白血病前期；或与表达CD19的细胞相关的非癌症相关适应症。为避免疑义，与CD19表达相关的疾病可以包括与目前不表达CD19但曾经有一段时间表达CD19的细胞相关的病状，例如因为例如由于用靶向CD19的分子(例如CD19 CAR)处理已下调CD19表达。在一个方面，与CD19表达相关的癌症是血液癌症。在一个方面，该血液癌症是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与CD19表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于例如一种或多种急性白血病，包括但不限于例如B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。与CD19表达相关的另外的癌症或血液病状包括但不限于，例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、和为由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)联合在一起的各种血液病状集合的“白血病前期”等。与CD19表达相关的其他疾病包括但不限于，例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病状或与CD19表达相关的增殖性疾病。与CD19表达相关的非癌相关适应症包括但不限于例如自身免疫疾病(例如狼疮)、炎性病症(变态反应和哮喘)和移植。在一些实施例中，表达CD19的细胞表达或在任何时间表达CD19 mRNA。在一个实施例中，表达CD19的细胞产生CD19蛋白(例如野生型或突变体)，并且该CD19蛋白可以正常水平或降低水平存在。在一个实施例中，表达CD19的细胞在一个点处产生可检测水平的CD19蛋白，并且随后基本上不产生可检测的CD19蛋白。
如本文所用，术语“程序性死亡1”或“PD-1”包括同种型，哺乳动物例如人PD-1、人PD-1的物种同源物、和包含至少一个与PD-1的共同表位的类似物。PD-1(例如人PD-1)的氨基酸序列是本领域已知的，例如Shinohara T等人(1994)Genomics[基因组学]23(3):704-6；Finger LR等人Gene[基因](1997)197(1-2):177-87。
术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的CAR内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的CAR例如结合CD19的能力。
术语“刺激”是指通过刺激分子(例如TCR/CD3复合物或CAR)与其同源配体(或在CAR情况下的肿瘤抗原)的结合诱导的初级响应，从而介导信号转导事件，如但不限于，通过TCR/CD3复合物的信号转导或通过适当的NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，如TGF-β的下调、和/或细胞骨架结构的重构等。
术语“刺激分子”是指由免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，该免疫效应细胞提供以刺激方式调节免疫效应细胞的活化以用于免疫效应细胞信号传导途径(例如T细胞信号传导途径)的至少一些方面的一种或多种细胞质信号传导序列。在一个方面，该信号是初级信号，该初级信号通过例如TCR/CD3复合物与负载有肽的MHC分子的结合而起始，并且导致T细胞响应(包括但不限于增殖、活化、分化等)的介导。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有在本发明中特别使用的初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于源自以下的那些：CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12、和CD66d。在本发明的特定CAR中，本发明的任何一种或多种CAR中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是作为SEQ ID NO:9，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基提供的氨基酸序列。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是如SEQ ID NO:10中提供的氨基酸序列，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫系统细胞如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)，该免疫系统细胞在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外来抗原。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将它们呈递给T细胞。
如本文所用的术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生促进表达CAR的细胞(例如CART细胞或表达CAR的NK细胞)的免疫效应子功能的信号。例如CART细胞或表达CAR的NK细胞中的免疫效应功能的实例包括细胞溶解活性和辅助活性(包括细胞因子的分泌)。虽然可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度上，可以使用这种截短的部分代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。因此，术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在一个实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包括源自负责初级刺激、或抗原依赖性模拟的分子的那些。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包括源自负责共刺激信号、或抗原非依赖性刺激的分子的那些。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域是合成或工程化的。例如，在表达CAR的免疫效应细胞(例如CART细胞或表达CAR的NK细胞)的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的细胞质序列，初级细胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包含来自共受体或共刺激分子的细胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于源自以下的那些：CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(“ICOS”)、FcεRI CD66d、DAP10和DAP12。
术语“ζ”或可替代的“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”定义为作为GenBan登录号BAG36664.1、或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基提供的蛋白质，并且“ζ刺激结构域”或可替代的“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”定义为来自ζ链足以在功能上传输T细胞活化所必需的初始信号的细胞质结构域的氨基酸残基。在一个方面，ζ的细胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164或是其功能性直向同源物的来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是作为SEQ ID NO:10提供的序列。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是作为SEQ ID NO:9提供的序列。本文还包括包含对本文所述氨基酸序列(例如SEQ ID NO:9)的一个或多个突变的CD3ζ结构域。
术语“共刺激分子”是指T细胞上与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激响应(如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子是有效免疫响应所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、以及与CD83特异性结合的配体。
共刺激细胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可以包含其源自的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。
术语“4-1BB”是指具有作为GenBank登录号AAA62478.2，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员；并且“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQ IDNO:7或来自非人物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基提供的序列。
当该术语在本文中使用时，“免疫效应细胞”是指参与免疫响应(例如促进免疫效应子响应)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和骨髓衍生的吞噬细胞。
当该术语在本文中使用时，“免疫效应子功能或免疫效应子响应”是指例如免疫效应细胞增强或促进靶细胞免疫攻击的功能或响应。例如，免疫效应子功能或响应是指T细胞或NK细胞促进靶细胞的杀伤或抑制生长或增殖的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或响应的实例。
术语“效应子功能”是指细胞的特定功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。
术语“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA、或mRNA)中特定核苷酸序列用作在生物过程中用于合成具有确定核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码蛋白质或者该基因或cDNA的其他产物。
除非另外说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包含内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可以在某些形式中含有一个或多个内含子。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文所述的化合物、配制品、材料、或组合物的有效实现特定生物学结果的量。
术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何材料。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生的任何材料。
术语“表达”是指具体核苷酸序列由其启动子驱动的转录和/或翻译。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可以用于向细胞内部递送该分离的核酸的物质组合物。许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒、以及病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应当解释为进一步包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列有效地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法中的一种。HIV、SIV、和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)中提供的自失活性慢病毒载体。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自牛津生物医药公司(Oxford BioMedica)的基因递送技术、来自Lentigen公司的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可得的并且是本领域技术人员已知的。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子(如两个DNA分子或两个RNA分子)之间或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当这两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
术语“人源化”是指非人(例如鼠)抗体为含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)的那些形式。在大多数情况下，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)(如具有所希望的特异性、亲和力、和能力的小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应非人残基置换。此外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。一般来说，人源化抗体或其抗体片段将包含至少一个且典型地两个可变结构域的显著部分，其中全部或基本全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区并且全部或基本全部的FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体或抗体片段还可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。有关进一步的细节，参见Jones等人,Nature[自然],321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature[自然],332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.[结构生物学新见],2:593-596,1992。
“完全人”是指免疫球蛋白(如抗体或抗体片段)，其中整个分子是人源的或由与人形式的抗体或免疫球蛋白相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指从天然状态改变的或去除的。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质能以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如像，宿主细胞)中。
在本发明的上下文中，使用以下对常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。
术语“有效地连接”或“转录控制”是指调节序列和异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列被放置成与第二核酸序列有功能关系时，该第一核酸序列与该第二核酸序列有效地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列有效地连接。有效地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一阅读框中。
术语“肠胃外”施用免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)、或胸骨内注射、瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，这些核酸具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子和细胞探针]8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含由肽键共价连接地氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含由肽键彼此相连的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链，例如其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体，并且还是指较长的链，其在本领域中通常称为蛋白质，存在有很多类型的蛋白质。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、重组肽、或其组合。
术语“启动子”是指启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器所识别的DNA序列。
术语“启动子/调节序列”是指表达与启动子/调节序列有效地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调节元件。启动子/调节序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调节序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸有效地连接时，在细胞的大多数或全部生理条件下致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸有效地连接时，基本上仅在对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子是指当与编码或由基因指定的多核苷酸有效地连接时，基本上仅在细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时才致使基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
如在scFv的情况下中使用的术语“柔性多肽接头”或“接头”是指由单独或组合使用的氨基酸(如甘氨酸和/或丝氨酸)残基组成的肽接头，以将可变重链和可变轻链区连接在一起。在一个实施例中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:40)。例如n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5和n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10(SEQ ID NO:41)。在一个实施例中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO:28)。在另一个实施例中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:29)的多个重复。描述于WO2012/138475中的接头也包括在本发明的范围内，该文献通过引用并入本文。
如本文所用，5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是已经在转录开始后不久添加到真核信使RNA的“前”端或5'端的经修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽由与第一转录核苷酸连接的末端基团组成。它的存在对于被核糖体识别和被保护免于RNA酶至关重要。帽添加与转录偶联，并且共转录地发生，使得每个都影响另一个。在转录开始后不久，合成的mRNA的5'端被与RNA聚合酶相关的帽合成复合物结合。该酶促复合物催化mRNA加帽所需的化学反应。合成作为多步生物化学反应进行。可以修饰加帽部分以调制mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。
如本文所用，“体外转录的RNA”是指已在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用，“聚(A)”是通过聚腺苷酸化与mRNA连接的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施例中，聚A为50个至5000个之间(SEQ ID NO:30)，优选大于64个，更优选大于100个，最优选大于300个或400个。聚(A)序列可以被化学修饰或酶促修饰以调制mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所用，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其经修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端被聚腺苷酸化。3'聚(A)尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加到前mRNA上的腺嘌呤核苷酸(通常数百个)的长序列。在高等真核生物中，将聚(A)尾添加到含有特定序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。聚(A)尾和与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、从细胞核输出mRNA以及翻译也是重要的。聚腺苷酸化在DNA转录成RNA后立即在细胞核中发生，但另外也可稍后在细胞质中发生。转录终止后，通过与RNA聚合酶相关的内切核酸酶复合物的作用切割mRNA链。切割位点通常被表征为切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA被切割后，腺苷残基被添加到切割位点处的游离3'端上。
如本文所用，“瞬时”是指非整合转基因的持续数小时、数天或数周的表达，其中表达的时间段小于如果整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内的基因的表达的时间段。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善增殖性病症的进展、严重程度和/或持续时间，或者改善增殖性病症的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)，这由给予一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂，如本发明的CAR)引起。在具体的实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指改善增殖性病症的至少一种可测量的物理参数，如肿瘤的生长，这不一定是患者可辨别的。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指通过例如稳定可辨别的症状来物理地，或通过例如稳定物理参数来生理地，或通过两者，抑制增殖性病症的进展。在其他实施例中，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或稳定肿瘤大小或癌细胞计数。
剂量方案，例如治疗剂量方案，可以包括一个或多个治疗间隔。该剂量方案可以产生至少一种有益或希望的临床结果，包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进程的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和，无论是可检测或是不可检测。
如本文所用，“治疗间隔”是指可以例如以常规方案重复的治疗周期，例如治疗剂的给予过程。在实施例中，剂量方案可以在治疗间隔之间具有一个或多个不给予治疗剂的时期。例如，治疗间隔可以包括与给予第二治疗剂(例如抑制剂(例如，如本文所述的激酶抑制剂))组合(之前、并行或之后)给予的CAR分子的一个剂量。
术语“信号转导途径”是指在多种信号转导分子之间的生物化学关系，这些信号转导分子在信号从细胞的部分传递至细胞的另一部分中发挥作用。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并且传递信号跨过细胞膜的分子以及分子复合物。
术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫响应的活生物体(例如，哺乳动物、人)。在一个实施例中，受试者是哺乳动物。在一个实施例中，受试者是人。在一个实施例中，受试者是患者。在一个实施例中，受试者是儿科受试者。在其他实施例中，受试者是成人。
术语“基本上纯化的”细胞是指基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下正常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经与其天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些方面，在体外培养细胞。在其他方面，不在体外培养细胞。
如本文所用的术语“治疗剂”意指治疗。通过减少、抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。
如本文所用的术语“预防”意指对疾病或疾病状态的预防或保护性治疗。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主题细胞及其子代。
术语“特异性结合”是指识别样品中存在的结合配偶体(例如肿瘤抗原)蛋白并与其结合的抗体或配体，但该抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
如本文所用，“可调节的嵌合抗原受体(RCAR)”是指一组多肽(在最简单的实施例中典型地为两个)，当在免疫效应细胞中时这些多肽为细胞提供对靶细胞(典型地是癌细胞)的特异性，并具有可调节的细胞内信号产生。在一些实施例中，RCAR至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜和包含在CAR分子情况下源自如本文所定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞质信号传导结构域(本文还称为“细胞内信号传导结构域”)。在一些实施例中，RCAR中的多肽组并不是相互连续的，例如在不同的多肽链中。在一些实施例中，RCAR包括二聚化开关，该二聚化开关在存在二聚化分子时可以将多肽彼此偶联，例如可以将抗原结合结构域偶联至细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，RCAR在如本文所述的细胞(例如免疫效应细胞)，例如R表达CAR的细胞(本文还称为“RCARX细胞”)中表达。在一个实施例中，RCARX细胞是T细胞，并且被称为RCART细胞。在一个实施例中，RCARX细胞是NK细胞，并且被称为RCARN细胞。RCAR可以为R表达CAR的细胞提供对靶细胞(典型地是癌细胞)的特异性，并且具有可调节的细胞内信号产生或增殖，这可以优化R表达CAR的细胞的免疫效应特性。在实施例中，RCAR细胞至少部分地依赖于抗原结合结构域，以提供对包含由该抗原结合结构域结合的抗原的靶细胞的特异性。
当该术语在本文中使用时，“膜锚”或“膜栓系结构域”是指足以将细胞外或细胞内结构域锚定到质膜的多肽或部分(例如肉豆蔻酰基)。
当该术语在本文中使用时(例如当提及RCAR时)，“开关结构域”是指实体(典型地是基于多肽的实体)，该实体在二聚化分子存在下与另一个开关结构域缔合。该缔合导致连接到(例如融合到)第一开关结构域的第一实体和连接到(例如融合到)第二开关结构域的第二实体的功能偶联。第一和第二开关结构域统称为二聚化开关。在实施例中，第一和第二开关结构域彼此相同，例如它们是具有相同伯氨基酸序列的多肽，并且统称为同源二聚化开关。在实施例中，第一和第二开关结构域彼此不同，例如它们是具有不同伯氨基酸序列的多肽，并且统称为异源二聚化开关。在实施例中，该开关是细胞内的。在实施例中，该开关是细胞外的。在实施例中，开关结构域是基于多肽(例如基于FKBP或FRB)的实体，并且二聚化分子是小分子(例如rapalogue)。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体(例如结合myc肽的scFv)，并且二聚化分子是多肽、其片段、或多肽的多聚体，例如结合一个或多个mycscFv的myc配体或myc配体的多聚体。在实施例中，开关结构域是基于多肽的实体(例如myc受体)，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如myc抗体。
当该术语在本文中使用时(例如当提及RCAR时)，“二聚化分子”是指促进第一开关结构域与第二开关结构域缔合的分子。在实施例中，二聚化分子不在受试者中天然发生，或者不以导致显著二聚化的浓度发生。在实施例中，二聚化分子是小分子，例如雷帕霉素或rapalogue，例如RAD001。
术语“生物当量”是指产生与参考剂量或参考量的参考化合物(例如RAD001)产生的效果相当的效果所需的除参考化合物(例如RAD001)之外的试剂的量。在一个实施例中，该效果是mTOR抑制水平，例如，如通过P70S6激酶抑制测量的，例如，如在体内或体外测定中评估的，例如，如通过本文所述的测定法(例如Boulay测定法)测量的、或通过蛋白质印迹测量磷酸化的S6水平。在一个实施例中，该效果是改变PD-1阳性/PD-1阴性T细胞的比率，如通过细胞分选测量的。在一个实施例中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是达到与参考化合物的参考剂量或参考量相同的P70S6激酶抑制水平的量或剂量。在一个实施例中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是在PD-1阳性/PD-1阴性T细胞比率中达到与参考化合物的参考剂量或参考量相同的改变水平的量或剂量。
当与mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂(例如RAD001或雷帕霉素)，或催化mTOR抑制剂)结合使用时，术语“低免疫增强剂量”是指部分但不完全抑制mTOR活性的mTOR抑制剂的剂量，例如，如通过P70S6激酶活性的抑制测量的。本文讨论了用于例如通过P70S6激酶的抑制评估mTOR活性的方法。该剂量不足以导致完全免疫抑制，但足以增强免疫响应。在一个实施例中，mTOR抑制剂的低免疫增强剂量导致PD-1阳性T细胞数量减少和/或PD-1阴性T细胞数量增加、或PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞的比率增加。在一个实施例中，mTOR抑制剂的低免疫增强剂量导致幼稚T细胞数量的增加。在一个实施例中，mTOR抑制剂的低免疫增强剂量导致以下中的一种或多种：
增加以下标记中的一个或多个的表达：例如记忆T细胞(例如记忆T细胞前体)上的CD62L高、CD127高、CD27+、和BCL2；
例如记忆T细胞(例如记忆T细胞前体)上KLRG1的表达降低；和
记忆T细胞前体的数量增加，例如具有以下特征中的任一种或组合的细胞：增加的CD62L高、增加的CD127高、增加的CD27+、减少的KLRG1、和增加的BCL2；
其中例如与未治疗的受试者相比，上述任何变化都例如至少瞬时地发生。
如本文所用的“进行性”是指正在进行或恶化的疾病(例如癌症)。对于实体肿瘤(例如肺癌)，自治疗开始，进行性疾病典型地显示出至少20％的肿瘤大小生长或肿瘤扩散。
如本文所用的“难治性”是指对治疗无响应的疾病，例如癌症。在实施例中，难治性癌症可以在治疗开始之前或治疗开始时对治疗具有抗性。在其他实施例中，难治性癌症可能在治疗期间变得有抗性。难治性癌症也称为抗性癌症。
如本文所用的“复发的”或“复发”是指疾病(例如癌症)或疾病的体征和症状(如改善或响应期之后，例如在疗法(例如癌症疗法)的先前治疗后的癌症)的回返或再现。初始响应期可能涉及癌细胞水平降至低于某一阈值，例如低于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。该再现可能涉及癌细胞水平升高高于某一阈值，例如高于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％、或1％。例如，例如在B-ALL的情况下，该再现可能涉及，例如在完全响应后血液、骨髓(>5％)、或任何髓外部位中幼稚细胞的再现。在这种情况下，完全响应可能涉及<5％BM幼稚细胞。更通常地，在一个实施例中，响应(例如完全响应或部分响应)可能涉及不存在可检测的MRD(最小残留疾病)。在一个实施例中，初始响应期持续至少1、2、3、4、5、或6天；至少1、2、3、或4周；至少1、2、3、4、6、8、10、或12个月；或至少1、2、3、4、或5年。
“完全响应”或“CR”是指缺乏可检测的疾病(例如癌症)证据，例如治疗的完全缓解。如本文所述，可以例如使用NCCN或Cheson等人,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]17:1244(1999)和Cheson等人,“Revised Response Criteria for MalignantLymphoma[修订版恶性淋巴瘤治疗响应标准]”,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]25:579-586(2007)(两者均通过引用以其全文并入本文)鉴定完全响应。例如，在B-ALL的情况下，完全响应可能涉及<5％BM幼稚细胞。
如本文所用的“完全响应者”是指患有疾病(例如癌症)的受试者，其对治疗表现出完全的响应(例如完全缓解)。
“部分响应”或“PR”是指疾病(例如癌症)的减少，尽管例如仍存在可检测的疾病。
如本文所用的“部分响应者”是指患有疾病(例如癌症)的受试者，其对治疗表现出部分的响应(例如部分缓解)。例如可以使用如本文所述的NCCN或Cheson标准来鉴定部分响应。
如本文所用的“无响应者”是指患有疾病(例如癌症)的受试者，其对治疗(例如本文所述的治疗)未表现出响应，例如患者在给予治疗后患有稳定的疾病或进行性疾病。例如可以使用如本文所述的NCCN或Cheson标准来鉴定无响应者。
可以使用几种方法来确定患者是否响应于治疗，包括例如由NCCN肿瘤学临床实践指南(NCCN)提供的标准。例如，在B-ALL的情况下，完全响应或完全响应者可能涉及以下中的一个或多个：<5％BM幼稚细胞，>1000个中性粒细胞/ANC(/μL)。>100,000个血小板(/μL)其中无循环幼稚细胞或髓外疾病(无淋巴结肿大、脾肿大、皮肤/牙龈浸润/睾丸团块/CNS受累)，三谱系造血，并且4周无复发。部分响应者可能涉及以下中的一个或多个：BM幼稚细胞减少≥50％，>1000个中性粒细胞/ANC(/μL)。>100,000个血小板(/μL)。无响应者可能显示出疾病进展，例如BM幼稚细胞>25％。
范围：贯穿本披露内容，本发明的各个方面可以范围形式呈现。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便以及简洁，不应该被理解为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为是具有确切披露的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围如从1至6的描述应当被认为是具有确切披露的子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围如95％-99％同一性包括具有95％、96％、97％、98％、或99％同一性，并且包括如96％-99％、96％-98％、96％-97％、97％-99％、97％-98％、和98％-99％同一性的子范围。无论范围的宽度如何，这都适用。
说明书
本文提供了用于通过与PD-1抑制剂组合给予包含靶向抗原(例如本文所述的抗原，例如CD19)的嵌合抗原受体(例如CD19 CAR)的细胞来治疗疾病(如癌症)的组合物和方法。产生CAR分子(例如CD19 CAR和表达CAR的细胞)(例如表达CD19 CAR的细胞)的示例性组分在本文中披露。本文还描述了示例性PD-1抑制剂。
在实施例中，本文所述表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和本文所述PD-1抑制剂的组合疗法产生以下中的一种或多种：表达CAR的细胞的抗肿瘤活性改善或增加；表达CAR的细胞的增殖或持久性增加；表达CAR的细胞的浸润改善或增加；肿瘤进展的抑制改善；肿瘤进展的延迟；癌细胞增殖的抑制或减少；和/或肿瘤负荷(例如肿瘤体积或大小)的减少。在一个实施例中，本文所述的表达CD19 CAR的细胞(例如多个表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂的组合疗法导致表达CD19 CAR的细胞的持久性增加或改善，例如多个表达CD19 CAR的细胞的持久性增加或改善。
在一些实施例中，在给予表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)之前或后续给予PD-1抑制剂导致增加的治疗功效，例如与仅给予PD-1抑制剂或表达CAR的细胞相比，例如在一些癌症中，肿瘤进展和/或肿瘤生长的抑制增加。
已知PD-1下调免疫响应，例如抗肿瘤免疫响应。PD-1和/或PD-L1还可以由癌细胞或癌症相关细胞(例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))表达。不希望受理论的约束，在一些实施例中，如果受试者具有以下中的一种或多种：表达(例如高度表达)PD-1和/或PD-L1的癌症；由抗肿瘤免疫细胞(例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))浸润的癌症；和/或表达(例如高度表达)PD-1和/或PD-L1的癌症相关细胞，则与未给予该组合疗法、或仅给予表达CAR的细胞或PD-1抑制剂的受试者相比，给予本文所述的组合疗法(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)的受试者更可能具有增加的抗肿瘤活性。例如，不希望受理论的约束，用PD-1抑制剂的治疗预防或减少抗肿瘤免疫响应的下调(例如抗肿瘤免疫细胞(例如TIL)的衰竭)，从而增加表达CAR的细胞的抗肿瘤功效。不希望受理论的约束，给予组合疗法(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和免疫检查点抑制剂(例如PD-1抑制剂)可以减少T细胞的衰竭，从而导致表达CAR的细胞的持久性的改善(例如更长)。在一个实施例中，给予表达CD19 CAR的细胞和PD-1抑制剂的组合可以导致表达CD19 CAR的细胞的持久性的改善(例如更长)。
嵌合抗原受体(CAR)
本披露内容涵盖包含靶向(例如特异性结合)抗原(例如本文所述的抗原(例如CD19))的CAR分子(CAR，例如CD19 CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)。在一个实施例中，将免疫效应细胞工程化以表达CAR(例如CD19 CAR)。在一个实施例中，免疫效应细胞包含含有编码CAR(例如CD19 CAR)的核酸序列的重组核酸构建体。
在实施例中，CAR(例如CD19 CAR)包含特异性结合抗原(例如CD19)的抗原结合结构域，例如抗原结合结构域(例如CD19结合结构域)、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，抗原结合结构域的序列与编码细胞内信号传导结构域的核酸序列邻接并在同一阅读框中。细胞内信号传导结构域可以包含共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域(例如ζ链)。共刺激信号传导结构域是指CAR包含共刺激分子的细胞内结构域的至少一部分的部分。
可以是本文所述CAR分子(例如CD19 CAR分子)的一部分的各种组分的非限制性实例的序列在表1中列出，其中“aa”代表氨基酸，并且“na”代表编码相应肽的核酸。
根据本文所述的任何方法或组合物，在实施例中，CAR分子包含本文所述的CD123CAR，例如描述于US 2014/0322212 A1或US 2016/0068601 A1中的CD123 CAR，两者均通过引用并入本文。在实施例中，CD123 CAR包含氨基酸，或具有US 2014/0322212 A1或US2016/0068601 A1中所示的核苷酸序列，两者均通过引用并入本文。在其他实施例中，CAR分子包含本文所述的CD19 CAR分子，例如描述于US-2015-0283178-A1中的CD19 CAR分子，例如CTL019。在实施例中，CD19 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US-2015-0283178-A1中所示的核苷酸序列。在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的BCMA CAR分子，例如描述于US-2016-0046724-A1中的BCMA CAR。在实施例中，BCMA CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US-2016-0046724-A1中所示的核苷酸序列。在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的CLL1 CAR，例如描述于通过引用并入本文的US 2016/0051651 A1中的CLL1 CAR。在实施例中，CLL1 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2016/0051651 A1中所示的核苷酸序列。在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的CD33 CAR，例如描述于通过引用并入本文的US 2016/0096892 A1中的CD33 CAR。在实施例中，CD33 CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2016/0096892 A1中所示的核苷酸序列。在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的EGFRvIII CAR分子，例如描述于通过引用并入本文的US 2014/0322275 A1中的EGFRvIII CAR。在实施例中，EGFRvIII CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的US 2014/0322275 A1中所示的核苷酸序列。在一个实施例中，CAR分子包含本文所述的间皮素CAR，例如描述于通过引用并入本文的WO 2015/090230中的间皮素CAR。在实施例中，间皮素CAR包含氨基酸，或具有通过引用并入本文的WO 2015/090230中所示的核苷酸序列。
表1.CAR的各种组分的序列(aa-氨基酸序列，na-核酸序列)
在一个方面，示例性CAR构建体包含任选前导序列(例如本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域(例如本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)、和细胞内刺激结构域(例如本文所述的细胞内刺激结构域)。在一个方面，示例性CAR构建体包含任选前导序列(例如本文所述的前导序列)、细胞外抗原结合结构域(例如本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)、细胞内共刺激信号传导结构域(例如本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或细胞内初级信号传导结构域(例如本文所述的初级信号传导结构域)。
在一个方面，本发明的CAR(例如CD19 CAR)包含至少一个选自下组的细胞内信号传导结构域：CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD27信号传导结构域、ICOS信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域、及其任何组合。在一个方面，本发明的CAR包含来自选自以下的一种或多种共刺激分子的至少一个细胞内信号传导结构域：CD137(4-1BB)、CD28、CD27、或ICOS。
示例性CD19 CAR包括本文(例如本文所述的一个或多个表中)所述的CD19 CAR、或描述于以下中的抗CD19 CAR：Xu等人Blood[血液]123.24(2014):3750-9；Kochenderfer等人Blood[血液],122.25(2013):4129-39、Cruz等人Blood[血液]122.17(2013):2965-73、NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961、或NCT02456207，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。
抗原结合结构域
在一个方面，本披露内容的CAR包含靶特异性结合元件，在其他方面称为抗原结合结构域。在一个实施例中，CAR包含抗原结合结构域的部分包含靶向(例如特异性结合)抗原(例如本文所述的抗原(例如CD19))的抗原结合结构域。在一个实施例中，抗原结合结构域靶向(例如特异性结合)人CD19。
抗原结合结构域可以是结合抗原的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、及其功能性片段，包括但不限于单结构域抗体(如骆驼科动物衍生纳米抗体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH))，以及本领域已知的用作抗原结合结构域(如重组纤连蛋白结构域)的可替代支架等。在一些情况下，有益的是抗原结合结构域源自CAR最终将在其中使用的相同物种。例如，对于在人类中使用，可能有益的是CAR的抗原结合结构域包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基。因此，在一个方面，抗原结合结构域包含人抗体或抗体片段。
在一个实施例中，抗原结合结构域包含一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，这些重链CDR来自本文所述的抗体(例如描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275A1、或WO 2015/090230中的抗体)，和/或一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3，这些轻链CDR来自本文所述的抗体(例如描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗体)。在一个实施例中，抗原结合结构域包含上文列出抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在实施例中，抗原结合结构域是描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗原结合结构域。
在实施例中，抗原结合结构域靶向BCMA并且描述于US-2016-0046724-A1中。
在实施例中，抗原结合结构域靶向CD19并且描述于US-2015-0283178-A1中。
在实施例中，抗原结合结构域靶向CD123并且描述于US 2014/0322212 A1、US2016/0068601 A1中。
在实施例中，抗原结合结构域靶向CLL并且描述于US 2016/0051651 A1中。
在实施例中，抗原结合结构域靶向CD33并且描述于US 2016/0096892 A1中。
可以使用表达CAR的细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4等，如例如WO 2014/153270、WO 2014/130635、WO2016/028896、WO 2014/130657、WO 2016/014576、WO 2015/090230、WO 2016/014565、WO2016/014535、和WO 2016/025880中所述，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合人源化CD19，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/153270的表3的CAR分子或抗原结合结构域(例如人源化抗原结合结构域)。编码CD19 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸和核苷酸序列(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2014/153270中指定。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/130635的表1-2的CAR分子(例如CAR1至CAR8中的任一个)或抗原结合结构域。编码CD123CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸和核苷酸序列(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2014/130635中指定。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/028896的表2、表6、和表9的CAR分子(例如CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32中的任一个)或抗原结合结构域。编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸和核苷酸序列(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VHCDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/028896中指定。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合EGFRvIII，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2014/130657的表2或SEQ ID NO:11的CAR分子或抗原结合结构域。编码EGFRvIII CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸和核苷酸序列(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2014/130657中指定。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD33，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/014576的表2或表9的CAR分子(例如CAR33-1至CAR-33-9中的任一个)或抗原结合结构域。编码CD33 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸和核苷酸序列(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO2016/014576中指定。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合间皮素，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2015/090230的表2-3的CAR分子或抗原结合结构域。编码间皮素CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸和核苷酸序列(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2015/090230中指定。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合BCMA，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/014565的表1或表16、SEQ ID NO:271或SEQ ID NO:273的CAR分子或抗原结合结构域。编码BCMA CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸和核苷酸序列(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/014565中指定。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合CLL-1，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/014535的表2的CAR分子或抗原结合结构域。编码CLL-1 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸和核苷酸序列(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/014535中指定。
在其他实施例中，表达CAR的细胞可以特异性结合GFR ALPHA-4，例如可以包括根据通过引用并入本文的WO 2016/025880的表2的CAR分子或抗原结合结构域。编码GFRALPHA-4CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸和核苷酸序列(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/025880中指定。
在一个实施例中，本文所述的任何CAR分子(例如CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4中的任一个)的抗原结合结构域包含来自上文列出抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或来自上文列出抗原结合结构域的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一个实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一个实施例中，CD19结合结构域包含选自SEQ ID NO:45-56、69-80、106、109、110、112、或115的CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)、和轻链互补决定区3(LC CDR3)以及选自SEQ ID NO:45-56、69-80、106、109、110、112、或115的CD19结合结构域的一个或多个(例如全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)、和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施例中，CD19结合结构域包含本文所述(例如，表2或表3中)的轻链可变区和/或本文所述(例如，表2或表3中)的重链可变区。在一个实施例中，CD19结合结构域是包含表2或表3的氨基酸序列的轻链可变区和重链可变区的scFv。在一个实施例中，CD19结合结构域(例如scFV)包含：轻链可变区，该轻链可变区包含具有表2或表3中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代)但不多于30、20或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列、或与表2或表3的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列；和/或重链可变区，该重链可变区包含具有表2或表3中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代)但不多于30、20或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列、或与表2或表3的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。
在一个实施例中，CD19结合结构域包含含有本文所述(例如，表2或表3中)的氨基酸序列的轻链可变区，该轻链可变区通过接头(例如本文所述的接头)附接到含有本文所述(例如，表2或表3中)的氨基酸序列的重链可变区。在一个实施例中，人源化抗CD19结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头(SEQ ID NO:26)，其中n是1、2、3、4、5、或6，优选3或4。scFv的轻链可变区和重链可变区可以是例如以任何以下取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在另一个实施例中，CD19结合结构域包含本领域已知的结合CD19的任何抗体或其抗体片段。
在一个方面，本发明的抗体可以以多种其他形式存在，包括例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼科动物VHH结构域、由抗体片段(如包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体、和分离的CDR或抗体的其他表位结合片段。在一个方面，本文提供的抗体片段是scFv。在一些情况下，人scFv还可以源自酵母展示文库。
可以使用本领域已知的多种技术产生人源化抗体，包括但不限于CDR接枝(参见例如，欧洲专利号EP 239,400；国际公布号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101、和5,585,089，这些文献各自通过引用以其全文并入本文)、贴面或表面重建(参见例如，欧洲专利号EP592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology[分子免疫学],28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering[蛋白质工程],7(6):805-814；和Roguska等人,1994,PNAS[美国国家科学院院刊],91:969-973，这些文献各自通过引用以其全文并入本文)、链改组(参见例如，美国专利号5,565,332，该文献通过引用以其全文并入本文)、和例如以下中披露的技术：美国专利申请公布号US 2005/0042664、美国专利申请公布号US 2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公布号WO 9317105、Tan等人,J.Immunol.[免疫学杂志],169:1119-25(2002)、Caldas等人,Protein Eng.[蛋白质工程],13(5):353-60(2000)、Morea等人,Methods[方法],20(3):267-79(2000)、Baca等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],272(16):10678-84(1997)、Roguska等人,Protein Eng.[蛋白质工程],9(10):895-904(1996)、Couto等人,CancerRes.[癌症研究],55(23Supp):5973s-5977s(1995)、Couto等人,Cancer Res.[癌症研究],55(8):1717-22(1995)、Sandhu J S,Gene[基因],150(2):409-10(1994)、和Pedersen等人,J.Mol.Biol.[分子生物学期刊],235(3):959-73(1994)，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。关于框架区和人源化抗体的另外信息描述于2016年4月8日提交的国际申请WO2016/164731的第169-170页，该文献通过引用以其全文并入。
用于制备人源化抗体的人可变结构域轻链与重链的选择对降低抗原性来说是。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后接受与啮齿动物的序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.[免疫学杂志],151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学期刊],196:901(1987)，这些文献的内容通过引用以其全文并入本文)。另一种方法使用源自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(参见例如，Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.[免疫学杂志],151:2623(1993)，这些文献的内容通过引用以其全文并入本文)。在一些实施例中，重链可变区的框架区(例如全部四个框架区)源自VH4_4-59种系序列。在一个实施例中，框架区可以包含例如来自相应鼠序列(例如SEQID NO:109)处的氨基酸的一个、两个、三个、四个或五个修饰(例如取代)。在一个实施例中，轻链可变区的框架区(例如全部四个框架区)源自VK3_1.25种系序列。在一个实施例中，框架区可以包含例如来自相应鼠序列(例如SEQ ID NO:109)处的氨基酸的一个、两个、三个、四个或五个修饰(例如取代)。基于三维构象结构的人源化抗体或抗体片段的设计详细描述于2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731的第171页，该文献通过引用以其全文并入。
人源化抗体或抗体片段可以保留与原始抗体相似的抗原特异性，例如在本披露内容中，结合人CD19的能力。在一些实施例中，人源化抗体或抗体片段可以具有改善的结合人CD19的亲和力和/或特异性。
在一个方面，结合结构域(例如结合CD19的抗原结合结构域)是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一个方面，结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2、或双功能性(例如双特异性)杂合抗体(例如Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[免疫学杂志]17,105(1987))。在一个方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合CD19蛋白。
在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果采用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人1993ProcNatl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448、美国专利申请公布号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794、和PCT公布号WO 2006/020258以及WO 2007/024715，通过引用并入本文。
scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施例中，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复序列，如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:25)。在一个实施例中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28)。接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。
在一些实施例中，可以例如通过保守取代修饰抗原结合结构域(例如结合CD19的抗原结合结构域)或其他部分或整个CAR的氨基酸序列，例如可以修饰本文所述的氨基酸序列。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中进行了定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
百分比同一性在两种或更多种核酸或多肽序列的情形中是指两个或更多个序列是相同的。当在比较窗口或指定区域上如使用以下序列比较算法中的一种或通过手动比对和目视检查测量的进行比较和比对以进行最大对应时，如果两个序列具有相同的指定百分比的氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域上，或者如果未指定，则在整个序列上的60％同一性，任选70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％,81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)，则这两个序列“基本上相同”。任选地，该同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或者在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
对于序列比较，典型地一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数、或可以指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算出测试序列相对于参比序列的序列相同百分比。比对用于比较的序列的方法是本领域熟知的。例如通过Smith和Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学期刊]48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444的相似性方法研究，通过这些算法(威斯康星州麦迪逊的科学大道575号遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA)的计算机实现，或通过手动比对和目测检查(参见例如，Brent等人,(2003)Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学实验指南])，可以进行用于比较的序列的最佳比对。
适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，这些算法分别描述于Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402；和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学期刊]215:403-410中。用于执行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心公共可利用的。
两个氨基酸序列之间的百分比同一性还可以使用已并入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller,(1988)Comput.Appl.Biosci.[生物科学中的计算机应用]4:11-17的算法，使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分为12和缺口罚分为4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用已并入GCG软件包(在www.gcg.com上可得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学期刊]48:444-453算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵以及缺口权重为16、14、12、10、8、6、或4和长度权重为1、2、3、4、5、或6来确定。
在一个方面，本披露内容考虑了产生功能等效分子的起始抗体或片段(例如scFv)氨基酸序列的修饰。例如，可以修饰包含在CAR中的结合结构域(例如结合CD19的抗原结合结构域)(例如scFv)的VH或VL，以保留抗CD19结合结构域(例如scFv)的起始VH或VL框架区的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％,81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。本发明考虑了整个CAR构建体的修饰，例如对CAR构建体的各种结构域的一个或多个氨基酸序列的修饰，以便产生功能等效分子。可以修饰CAR构建体以保留起始CAR构建体的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过例如使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子可以包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果采用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448、美国专利申请公布号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794、和PCT公布号WO 2006/020258以及WO 2007/024715，通过引用并入本文。
示例性CD19抗原结合结构域和CAR构建体
本文披露的示例性CD19 CAR构建体包含如本文表2或表3中披露的scFv(例如人scFv)，任选地在其之前具有任选前导序列(例如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:12分别为示例性前导氨基酸和核苷酸序列)。scFv片段的序列(SEQ ID NO:45-56、69-80、106、109、110、112、或115的氨基酸序列)在本文表2或表3中提供。CD19 CAR构建体可以进一步包括任选铰链结构域，例如CD8铰链结构域(例如，包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13的核酸序列编码的氨基酸序列)；跨膜结构域，例如CD8跨膜结构域(例如，包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由SEQ ID NO:17的核苷酸序列编码)；细胞内结构域，例如4-1BB细胞内结构域(例如，包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由SEQ ID NO:18的核苷酸序列编码；和功能性信号传导结构域，例如CD3ζ结构域(例如，包括SEQ ID NO:9或10的氨基酸序列，或由SEQ IDNO:20或21的核苷酸序列编码)。在某些实施例中，这些结构域邻接并在同一阅读框中以形成单个融合蛋白。在其他实施例中，结构域在分开的多肽中，例如，在如本文所述的RCAR分子中。
在某些实施例中，全长CD19 CAR分子包括表2或表3中提供的CAR1-CAR12、CTL019、mCAR1-mCAR3、或SSJ25-C1的氨基酸序列或与前述序列中任一项基本上相同(例如与其95％-99％相同，或最多20、15、10、8、6、5、4、3、2、或1个氨基酸变化)的序列，或者由这些序列的核苷酸序列编码。
在某些实施例中，CD19 CAR分子或CD19抗原结合结构域包括表2或表3中提供的CAR1-CAR12、CTL019、mCAR1-mCAR3、或SSJ25-C1的scFv氨基酸序列或与前述序列中任一项基本上相同(例如与其95％-99％相同，或最多20、15、10、8、6、5、4、3、2、或1个氨基酸变化)的序列，或者由这些序列的核苷酸序列编码。
在某些实施例中，CD19 CAR分子或CD19抗原结合结构域包括表2或表3中提供的CAR1-CAR12、CTL019、mCAR1-mCAR3、或SSJ25-C1的重链可变区和/或轻链可变区，或与前述序列中任一项基本上相同(例如95％-99％相同，或最多20、15、10、8、6、5、4、3、2、或1个氨基酸变化)的序列。
在某些实施例中，CD19 CAR分子或CD19抗原结合结构域包括来自表2或表3中提供的CAR1-CAR12、CTL019、mCAR1-mCAR3、或SSJ25-C1的重链可变区(例如HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)的一个、两个或三个CDR；和/或来自表2或表3中提供的CAR1-CAR12、CTL019、mCAR1-mCAR3、或SSJ25-C1的轻链可变区(例如LCDR1、LCDR2和/或LCDR3)的一个、两个或三个CDR；或与前述序列中任一项基本上相同(例如95％-99％相同，或最多5、4、3、2、或1个氨基酸变化)的序列。
scFv结构域的CDR序列的序列对于重链可变结构域在表4中示出，并且对于轻链可变结构域在表5中示出。
CD19 scFv结构域和CD19 CAR分子的氨基酸和核酸序列在表2和表3中提供。在一个实施例中，CD19 CAR分子包括本文所述的前导序列，例如如在表2和表3中提供的序列中加下划线。在一个实施例中，CD19 CAR分子不包括前导序列。
在实施例中，CAR分子包含特异性结合CD19的抗原结合结构域(CD19 CAR)。在一个实施例中，抗原结合结构域靶向人CD19。在一个实施例中，CAR的抗原结合结构域具有与描述于Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中的FMC63scFv片段相同或相似的结合特异性。在一个实施例中，CAR的抗原结合结构域包括描述于Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中的scFv片段。CD19抗体分子可以是例如描述于通过引用以其全文并入本文的WO 2014/153270中的抗体分子(例如人源化抗CD19抗体分子)。WO 2014/153270还描述了测定各种CAR构建体的结合和功效的方法。
在一个方面，亲本鼠scFv序列是PCT公布WO 2012/079000(通过引用并入本文)中提供的CAR19构建体，并且在本文中作为SEQ ID NO:108提供。在一个实施例中，抗CD19结合结构域是描述于WO 2012/079000中的scFv，并且在本文中以SEQ ID NO:109提供。
在一个实施例中，CAR分子包含在PCT公布WO 2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供，以及在本文中作为SEQ ID NO:108提供的多肽序列，其中scFv结构域被选自SEQ ID NO:93-104的一个或多个序列取代。在一个实施例中，SEQ ID NO:93-104的scFv结构域是SEQID NO:109的scFv结构域的人源化变体，其是特异性结合人CD19的鼠来源的scFv片段。该小鼠scFv的人源化可能是临床环境所希望的，其中小鼠特异性残基可以在接受CART19治疗(例如用由CAR19构建体转导的T细胞进行的治疗)的患者中诱导人-抗小鼠抗原(HAMA)响应。
在一个实施例中，CD19 CAR包含在PCT公布WO2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的氨基酸序列。在实施例中，该氨基酸序列是
MALPVTALLLPLALLLHAARPdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:108)、或与其基本上同源的序列。
在一个实施例中，该氨基酸序列是：
diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:289)、或与其基本上同源的序列。
在一个实施例中，CD19 CAR具有USAN名称TISAGENLECLEUCEL-T。在实施例中，CTL019通过T细胞的基因修饰来制备，这些T细胞通过经由用在EF-1α启动子控制下含有CTL019转基因的自失活、复制缺陷型慢病毒(LV)载体转导进行稳定插入来介导。CTL019可以是转基因阳性和阴性T细胞的混合物，其基于转基因阳性T细胞百分比递送至受试者。
在其他实施例中，CD19 CAR包含根据通过引用并入本文的WO2014/153270的表3的抗原结合结构域(例如人源化抗原结合结构域)。
在实施例中，CAR分子是本文所述的CD19 CAR分子，例如本文所述的人源化CAR分子，例如表2或具有如表4和表5中列出的CDR的人源化CD19 CAR分子。
在实施例中，CAR分子是本文所述的CD19 CAR分子，例如本文所述的鼠CAR分子，例如表3或具有如表4和表5中列出的CDR的鼠CD19 CAR分子。
在一些实施例中，CAR分子包括来自表4和表5的鼠或人源化CD19 CAR的重链可变区的一个、两个、和/或三个CDR和/或来自其轻链可变区的一个、两个、和/或三个CDR。
在一个实施例中，抗原结合结构域包含来自本文列出抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或来自本文列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一个实施例中，抗原结合结构域包含本文列出抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
鼠抗CD19抗体的人源化
鼠CD19抗体的人源化是临床环境所希望的，其中小鼠特异性残基可以在接受CART19治疗(即用由CAR19构建体转导的T细胞进行的治疗)的患者中诱导人-抗小鼠抗原(HAMA)响应。人源化CD19 CAR序列的产生、表征、和功效描述于通过引用以其全文并入本文的国际申请WO2014/153270中，包括实例1-5(第115-159页)，例如表3、4、和5(第125-147页)。
CAR构建体，例如CD19 CAR构建体
将描述于国际申请WO2014/153270中的CD19 CAR构建体中的某些序列在本文中复制。
人源化scFv片段的序列(SEQ ID NO:45-56)在下表2中提供。使用SEQ ID NO:45-56以及例如来自下表1所示的另外序列产生完全CAR构建体，以产生具有SEQ ID NO:93-104的完全CAR构建体。
这些克隆均含有源自4-1BB的共刺激结构域的信号结构域中的Q/K残基变化。
表2：人源化CD19 CAR构建体
对于所有可溶性scFv氨基酸序列，任选信号序列以粗体和下划线显示；并且组氨酸标签加下划线。
对于所有CAR氨基酸序列，CDR的相对位置用下划线和粗体表示。
表3：鼠CD19 CAR构建体
对于所有可溶性scFv氨基酸序列，任选信号序列以粗体和下划线显示；并且组氨酸标签加下划线。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表2或表3中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域进一步包含LCCDR1、LC CDR2、和LC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域包含表2或表3中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2、和LC CDR3。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表2或表3中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2、和LC CDR3中的一个、两个或全部，以及表2或表3中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3中的一个、两个或全部。
在一些实施例中，根据Kabat编号方案、Chothia编号方案、或其组合定义CDR。
scFv结构域的人源化CDR序列的序列对于重链可变结构域在表4中示出，并且对于轻链可变结构域在表5中示出。“ID”代表每个CDR的相应SEQ ID NO。
表4.重链可变结构域CDR(Kabat)
表5.轻链可变结构域CDR(Kabat)
然后将CAR scFv片段克隆到慢病毒载体中，以在单个编码框中产生全长CAR构建体，并使用EF1α启动子用于表达(SEQ ID NO:11)。
在一些实施例中，CD19 CAR包含源自(例如包含其氨基酸序列)抗CD19抗体(例如抗CD19单或双特异性抗体)或其片段或缀合物的抗原结合结构域。在一个实施例中，the抗CD19抗体是如描述于通过引用并入本文的WO2014/153270(例如WO2014/153270的表3)中的人源化抗原结合结构域、或其缀合物。其他示例性抗CD19抗体或其片段或缀合物包括但不限于靶向CD19的双特异性T细胞结合物(例如blinatumomab)、SAR3419(赛诺菲公司(Sanofi))、MEDI-551(医学免疫公司(MedImmune LLC))、Combotox、DT2219ARL(共济会癌症中心(Masonic Cancer Center))、MOR-208(也称为XmAb-5574；MorphoSys公司)、XmAb-5871(Xencor公司)、MDX-1342(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))、SGN-CD19A(西雅图遗传学公司(Seattle Genetics))、和AFM11(Affimed Therapeutics公司)。参见例如，Hammer.MAbs.4.5(2012):571-77。Blinatomomab是包含两个scFv—一个结合CD19并且一个结合CD3的双特异性抗体。Blinatomomab指导T细胞攻击癌细胞。参见例如，Hammer等人；临床试验标识号NCT00274742和NCT01209286。MEDI-551是人源化抗CD19抗体，其中Fc被工程化以具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。参见例如，Hammer等人；和临床试验标识号NCT01957579。Combotox是结合CD19和CD22的免疫毒素的混合物。这些免疫毒素由与去糖基化的蓖麻毒素A链融合的scFv抗体片段组成。参见例如，Hammer等人；和Herrera等人J.Pediatr.Hematol.Oncol.[儿科血液学与肿瘤学杂志]31.12(2009):936-41；Schindler等人Br.J.Haematol.[英国血液学杂志]154.4(2011):471-6。DT2219ARL是靶向CD19and Cd22的双特异性免疫毒素，包含两个scFvs和截短的白喉毒素。参见例如，Hammer等人；和临床试验标识号NCT00889408。SGN-CD19A是抗体-药物缀合物(ADC)，其包含与合成细胞毒素细胞杀伤剂单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)连接的抗CD19人源化单克隆抗体。参见例如，Hammer等人；和临床试验标识号NCT01786096和NCT01786135。SAR3419是抗CD19抗体-药物缀合物(ADC)，其包含通过可切割接头与美登素衍生物缀合的抗CD19人源化单克隆抗体。参见例如，Younes等人J.Clin.Oncol.[临床肿瘤学杂志]30.2(2012):2776-82；Hammer等人；临床试验标识号NCT00549185；和Blanc等人Clin Cancer Res.[临床癌症研究]2011；17:6448-58。XmAb-5871是Fc-工程化的人源化抗CD19抗体。参见例如，Hammer等人。MDX-1342是具有增强的ADCC的人Fc-工程化的抗CD19抗体。参见例如，Hammer等人。在实施例中，抗体分子是双特异性抗CD19和抗CD3分子。例如，AFM11是靶向CD19和CD3的双特异性抗体。参见例如，Hammer等人；和临床试验标识号NCT02106091。在一些实施例中，本文所述的抗CD19抗体与例如以下的治疗剂缀合或以其他方式结合：化学治疗剂、肽疫苗(如描述于Izumoto等人2008J Neurosurg[神经外科杂志]108:963-971中)、免疫抑制剂、或免疫清除剂(例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、FK506、CAMPATH、抗CD3抗体、细胞毒素、氟达拉滨、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、或细胞因子)。
在一个实施例中，针对CD19的抗原结合结构域是描述于本文表中的抗原结合结构域的抗原结合部分，例如CDR。在一个实施例中，CD19抗原结合结构域可以来自任何CD19CAR，例如LG-740；美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,Leuk Lymphoma.[白血病和淋巴瘤]2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood[血液]122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood[血液]118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood[血液]116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood[血液]122(25):4129-39(2013)；和16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther[第16届年会美国基因与细胞治疗学会](ASGCT)(5月15-18日,盐湖城)2013,摘要10，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。
示例性BCMA抗原结合结构域和CAR构建体
在实施例中，BCMA CAR包含抗BCMA结合结构域(例如人或人源化抗BCMA结合结构域)、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域，并且其中所述抗BCMA结合结构域包含表7或表8中列出的任何抗BMCA重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)、和重链互补决定区3(HC CDR3)。
在一个实施例中，抗BCMA结合结构域包含本文所述(例如，表7或表8中)的轻链可变区和/或本文所述(例如，表7或表8中)的重链可变区。
在一个实施例中，编码的抗BCMA结合结构域是包含表7或表8的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。
在一个实施例中，人或人源化抗BCMA结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，该轻链可变区包含具有表7或表8中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不多于30、20或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列、或其具有至少95％(例如95％-99％)同一性的序列；和/或重链可变区，该重链可变区包含具有表7或表8中提供的重链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)但不多于30、20或10个修饰(例如取代，例如保守取代)的氨基酸序列、或其具有至少95％(例如95％-99％)同一性的序列。
表7.示例性抗BCMA scFv结构域和BCMA CAR分子的氨基酸和核酸序列
表8.另外的示例性BCMA CAR序列
双特异性CAR
在实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施例中，第一和第二表位在相同的抗原(例如相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基))上。在一个实施例中，第一和第二表位重叠。在一个实施例中，第一和第二表位不重叠。在一个实施例中，第一和第二表位在不同的抗原(例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基))上。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在某些实施例中，抗体分子是多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体分子。用于产生双特异性或异二聚体抗体分子的方案是本领域已知的；包括但不限于，例如，描述于例如US 5731168中的“孔中旋钮”方法；如描述于例如WO 09/089004、WO 06/106905和WO2010/129304中的静电转向Fc配对；如描述于例如WO 07/110205中的链交换工程化结构域(SEED)异二聚体形成；如描述于例如WO 08/119353、WO 2011/131746、和WO 2013/060867中的Fab臂交换；如描述于例如US 4433059中的例如使用具有胺反应性基团和巯基反应性基团的异双功能性试剂通过抗体交联产生双特异性结构的双抗体缀合物；如描述于例如US4444878中，通过两条重链之间的二硫键的还原和氧化循环通过重组来自不同抗体的半抗体(重链-轻链对或Fab)产生的双特异性抗体决定簇；如描述于例如US 5273743中的三功能抗体，例如通过巯基反应基团交联的三个Fab'片段；如描述于例如US 5534254中的生物合成结合蛋白，例如通过C末端尾交联(优选通过二硫键或胺反应性化学交联)的scFv对；如描述于例如US 5582996中的双功能抗体，例如通过已置换恒定结构域的亮氨酸拉链(例如，c-fos和c-jun)二聚化的具有不同结合特异性的Fab片段；如描述于例如US 5591828中的双特异性和寡特异性单价和低价受体，例如通过一个抗体的CH1区与典型地具有相关轻链的另一个抗体的VH区之间的多肽间隔区连接的两个抗体(两个Fab片段)的VH-CH1区；如描述于例如US 5635602中的双特异性DNA-抗体缀合物，例如抗体或Fab片段通过双链DNA段交联；如描述于例如US 5637481中的双特异性融合蛋白，例如含有具有在其之间的亲水性螺旋肽接头和完全恒定区的两个scFv的表达构建体；如描述于例如US 5837242中的多价和多特异性结合蛋白，例如具有含Ig重链可变区的结合区的第一结构域和含Ig轻链可变区的结合区的第二结构域的多肽的二聚体，通常称为双抗体(更高级结构还包括产生双特异性、三特异性、或四特异性分子；如描述于例如US 5837821中的具有用肽间隔区进一步连接至抗体铰链区和CH3区的连接的VL和VH链的微抗体构建体，其可以二聚化以形成双特异性/多价分子；与短肽接头(例如，5或10个氨基酸)连接或在任一取向上完全没有接头的VH和VL结构域，其可以形成二聚体以形成双特异性双抗体；如描述于例如US 5844094中的三聚体和四聚体；如描述于例如US 5864019中，通过肽键与C-末端处的可交联基团连接的VH结构域(或家族成员中的VL结构域)的串进一步与VL结构域相关联以形成一系列FV(或scFv)；以及如描述于例如US 5869620中，通过非共价或化学交联将具有通过肽接头连接的VH和VL结构域两者的单链结合多肽组合成多价结构，以使用scFV或双抗体两种类型格式形成例如同二价、异二价、三价、和四价结构。另外的示例性多特异性和双特异性分子及其制备方法见于例如US 5910573、US 5932448、US 5959083、US 5989830、US 6005079、US 6239259、US6294353、US 6333396、US 6476198、US 6511663、US 6670453、US 6743896、US 6809185、US6833441、US 7129330、US 7183076、US 7521056、US 7527787、US 7534866、US 7612181、US2002004587 A1、US 2002076406 A1、US 2002103345 A1、US 2003207346 A1、US2003211078 A1、US 2004219643 A1、US 2004220388 A1、US 2004242847 A1、US2005003403 A1、US 2005004352 A1、US 2005069552 A1、US 2005079170 A1、US2005100543 A1、US 2005136049 A1、US 2005136051 A1、US 2005163782 A1、US2005266425 A1、US 2006083747 A1、US 2006120960 A1、US 2006204493 A1、US2006263367 A1、US 2007004909 A1、US 2007087381 A1、US 2007128150 A1、US2007141049 A1、US 2007154901 A1、US 2007274985 A1、US 2008050370 A1、US2008069820 A1、US 2008152645 A1、US 2008171855 A1、US 2008241884 A1、US2008254512 A1、US 2008260738 A1、US 2009130106 A1、US 2009148905 A1、US2009155275 A1、US 2009162359 A1、US 2009162360 A1、US 2009175851 A1、US2009175867 A1、US 2009232811 A1、US 2009234105 A1、US 2009263392 A1、US2009274649 A1、EP 346087 A2、WO 0006605 A2、WO 02072635 A2、WO 04081051 A1、WO06020258 A2、WO 2007044887 A2、WO 2007095338 A2、WO 2007137760 A2、WO 2008119353A1、WO 2009021754 A2、WO 2009068630 A1、WO 9103493 A1、WO 9323537 A1、WO 9409131A1、WO 9412625 A2、WO 9509917 A1、WO 9637621 A2、WO 9964460 A1中。上述申请的内容通过引用以其全文并入本文。
在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段(例如scFv)内，VH可以在VL的上游或下游。在一些实施例中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VL(VL1)上游布置有其VH(VH1)，并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VH(VH2)上游布置有其VL(VL2)，使得整个双特异性抗体分子具有布置VH1-VL1-VL2-VH2。在其他实施例中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VH(VH1)上游布置有其VL(VL1)，并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)在其VL(VL2)上游布置有其VH(VH2)，使得整个双特异性抗体分子具有布置VL1-VH1-VH2-VL2。任选地，如果构建体被布置为VH1-VL1-VL2-VH2则接头设置在两个抗体或抗体片段(例如scFv)之间，例如VL1与VL2之间，如果构建体被布置为VL1-VH1-VH2-VL2则接头设置在VH1与VH2之间。接头可以是如本文所述的接头，例如(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5、或6，优选4(SEQID NO:26)。一般来说，两个scFv之间的接头应足够长以避免两个scFv的结构域之间的错配。任选地，接头设置在第一scFv的VL与VH之间。任选地，接头设置在第二scFv的VL与VH之间。在具有多个接头的构建体中，接头中的任何两个或更多个可以相同或不同。因此，在一些实施例中，双特异性CAR在如本文所述的布置中包含VL、VH、和任选一个或多个接头。
在某些实施例中，抗体分子是具有对第一B细胞表位的第一结合特异性和对另一个B细胞抗原的第二结合特异性的双特异性抗体分子。例如，在一些实施例中，双特异性抗体分子具有对CD19的第一结合特异性和对CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、或CD79a中的一个或多个的第二结合特异性。在一些实施例中，双特异性抗体分子具有对CD19的第一结合特异性和对CD22的第二结合特异性。
嵌合TCR
在一个方面，本发明的CD19抗体和抗体片段(例如表2或表3中披露的那些)可以接枝到T细胞受体(“TCR”)链(例如TCRα或TCRβ链)的一个或多个恒定结构域，以产生特异性结合CD19的嵌合TCR。不受理论的约束，据信嵌合TCR在抗原结合时将通过TCR复合物发出信号。例如，如本文披露的CD19 scFv可以接枝到TCR链(例如TCRα链和/或TCRβ链)的恒定结构域，例如细胞外恒定结构域、跨膜结构域和细胞质结构域的至少一部分。作为另一个实例，CD19抗体片段(例如如本文所述的VL结构域)可以接枝到TCRα链的恒定结构域，并且CD19抗体片段(例如如本文所述的VH结构域)可以接枝到TCRβ链的恒定结构域(或可替代地，VL结构域可以接枝到TCRβ链的恒定结构域并且VH结构域可以接枝到TCRα链)。作为另一个实例，CD19抗体或抗体片段的CDR(例如如描述于表4或表5中的CD19抗体或抗体片段的CDR)可以接枝到TCRα和/或β链中，以产生特异性结合CD19的嵌合TCR。例如，本文披露的LCDR可以接枝到TCRα链的可变结构域中，并且本文披露的HCDR可以接枝到TCRβ链的可变结构域，或反之亦然。此类嵌合TCR可以通过本领域已知的方法产生(例如，Willemsen RA等人，GeneTherapy[基因疗法]2000；7:1369-1377；Zhang T等人，Cancer Gene Ther[癌基因疗法]2004；11:487-496；Aggen等人，Gene Ther.[基因疗法]2012年4月；19(4):365-74)。
跨膜结构域
关于跨膜结构域，在各种实施例中，CAR可以被设计成包含附接到CAR的细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如与跨膜源自的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如该细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白源自的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如该细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域与所使用CAR的其他结构域中的一个相关，例如在一个实施例中，跨膜结构域可以来自信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域源自的相同蛋白质。在另一个方面，跨膜结构域不源自CAR的任何其他结构域源自的相同蛋白质。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸取代修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一个方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一种CAR同源二聚化。在不同的方面，可以修饰或取代跨膜结构域的氨基酸序列，以便最小化与存在于相同表达CAR的细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然来源或来自重组来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白。在一个方面，每当CAR结合靶标时，跨膜结构域能够向一个或多个细胞内结构域发出信号。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以至少包括以下的一个或多个跨膜结构域：例如T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些实施例中，跨膜结构域可以至少包括以下的一个或多个跨膜区：例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、以及NKG2C。
在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白质的铰链)附接到CAR的细胞外区域(例如CAR的抗原结合结构域)。例如，在一个实施例中，该铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如IgG4铰链、IgD铰链)、GS接头(例如本文所述的GS接头)、KIR2DS2铰链或CD8a铰链。在一个实施例中，铰链或间隔区包含(例如由其组成)SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一个方面，跨膜结构域包含(例如由其组成)SEQ ID NO:6的跨膜结构域。
在一个方面，铰链或间隔区包含IgG4铰链。例如，在一个实施例中，铰链或间隔区包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的铰链。
在一些实施例中，铰链或间隔区包含由核苷酸序列SEQ ID NO:14编码的铰链。
在一个方面，铰链或间隔区包含IgD铰链。例如，在一个实施例中，铰链或间隔区包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的铰链。
在一些实施例中，铰链或间隔区包含由SEQ ID NO:15的核苷酸序列编码的铰链。
在一个方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，可以在重组跨膜结构域的每个末端处发现苯基丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，长度为2至10个氨基酸的短寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与细胞质信号传导区之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别适合的接头。例如，在一个方面，该接头包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列。在一些实施例中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:16)的核苷酸序列编码。
在一个方面，铰链或间隔区包含KIR2DS2铰链及其部分。
细胞质结构域
CAR的细胞质结构域或区域包括细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常负责活化其中已引入CAR的免疫细胞的正常效应子功能中的至少一种。术语“效应子功能”是指细胞的特定功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能。虽然通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度上，可以使用这种截短的部分代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。因此，术语细胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明CAR的细胞内信号传导结构域的实例包括协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何重组序列。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要次级和/或共刺激信号。因此，可以说T细胞活化由以下两种不同类的细胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些(初级细胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质结构域，例如共刺激结构域)。
初级细胞质信号传导结构域以刺激方式或以抑制性方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。
含有在本发明中特别使用的初级细胞内信号传导结构域的ITAM的实例包括以下的那些：CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、CD66d、DAP10、和DAP12。在一个实施例中，本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ(例如本文所述的CD3-ζ序列)的初级信号传导结构域。
在一个实施例中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如与天然ITAM结构域相比具有改变(例如增加或减少)活性的突变ITAM结构域。在一个实施例中，初级信号传导结构域包含含修饰的ITAM的初级细胞内信号传导结构域，例如含优化的和/或截短的ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
含有在本发明中特别使用的初级细胞内信号传导结构域的分子的其他实例包括DAP10、DAP12、和CD32的那些。
CAR的细胞内结构域本身可以包含CD3-ζ信号传导结构域，或者它可以与在本发明CAR的情况下有用的任何其他所希望的一个或多个细胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的细胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指CAR包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效响应所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1(也称为PD1)、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与CD83特异性结合的配体等。例如，已证明CD27共刺激增强体外人CART细胞的扩增、效应子功能、和存活，并增加体内人T细胞持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.[血液]2012；119(3):696-706)。此类共刺激分子的其他实例包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、以及与CD83特异性结合的配体。例如，已证明CD27共刺激增强体外人CART细胞的扩增、效应子功能、和存活，并增加体内人T细胞持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.[血液]2012；119(3):696-706)。
本发明CAR的细胞质部分内的细胞内信号传导结构域可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，例如长度在2和10个氨基酸之间(例如2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸)的短的寡肽或多肽接头可以在细胞内信号传导结构域之间形成连接。在一个实施例中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作适合的接头。在一个实施例中，单个氨基酸(例如丙氨酸、甘氨酸)可以用作适合的接头。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域。在一个实施例中，两个或更多个(例如2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域通过接头分子(例如本文所述的接头分子)分开。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施例中，接头是丙氨酸残基。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:7的信号传导结构域。在一个方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:9(突变体CD3-ζ)或SEQ ID NO:10(野生型人CD3-ζ)的信号传导结构域。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域由SEQ ID NO:18的核酸序列编码。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一个方面，CD27的信号传导结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一个方面，CD27的信号传导结构域由SEQ ID NO:19的核酸序列编码。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，CD28的信号传导结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一个方面，CD28的信号传导结构域由SEQ ID NO:37的核酸序列编码。
在一个方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。在一个方面，ICOS的信号传导结构域包含SEQ ID NO:38或43的氨基酸序列。在一个方面，ICOS的信号传导结构域由SEQ ID NO:44的核酸序列编码。
天然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在一个实施例中，本文所述的CAR分子包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，从而形成NKR-CAR。NKR组分可以是来自任何以下天然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域、或细胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME、和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A、LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可以与衔接分子或细胞内信号传导结构域(例如DAP12)相互作用。包含NKR组分的CAR分子的示例性构型和序列描述于国际公布号WO2014/145252中，该文献的内容特此通过引用并入。
拆分的CAR
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞使用拆分的CAR。拆分的CAR方法更详细地描述于通过引用并入本文的出版物WO 2014/055442和WO 2014/055657中。简而言之，拆分的CAR系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如4-1BB)的第一CAR的细胞，并且该细胞还表达具有第二抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)的第二CAR。当该细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被活化，并且细胞增殖。当该细胞遇到第二抗原时，细胞内信号传导结构域被活化并开始细胞杀伤活性。因此，该表达CAR的细胞仅在两种抗原都存在下完全活化。在实施例中，第一抗原结合结构域识别本文所述的肿瘤抗原或B细胞抗原(例如包含本文所述的抗原结合结构域)，并且第二抗原结合结构域识别第二抗原(例如本文所述的第二肿瘤抗原或第二B细胞抗原)。
CAR与其他分子或药剂的共表达
第二CAR的共表达
在一个方面，本文所述的表达CAR的细胞可以进一步包含第二CAR，例如包括例如针对相同靶标(CD19)或不同靶标(例如除CD19之外的靶标，例如除CD19之外的B细胞抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、或CD79a)的不同抗原结合结构域的第二CAR。在一个实施例中，表达CAR的细胞包含靶向第一抗原并且包括具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原并且包括具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。将共刺激信号传导结构域(例如4-1BB、CD28、CD27、OX-40或ICOS)置于第一CAR上，并且将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上可以限制CAR对表达两个靶标的细胞的活性。在一个实施例中，表达CAR的细胞包含包括CD19结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域的第一CD19 CAR，以及靶向除CD19之外的抗原(例如除CD19之外的靶标，例如除CD19之外的B细胞抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、或CD79a)并且包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域的第二CAR。在另一个实施例中，表达CAR的细胞包含包括CD19结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域的第一CD19 CAR，以及靶向除CD19之外的抗原(例如除CD19之外的靶标，例如除CD19之外的B细胞抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、或CD79a)并且包括针对该抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域的第二CAR。
在一个实施例中，表达CAR的细胞包含本文所述的CD19 CAR和抑制性CAR。在一个实施例中，抑制性CAR包含结合在正常细胞(例如也表达CD19的正常细胞)而非癌细胞上发现的抗原的抗原结合结构域。在一个实施例中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是以下的细胞内结构域：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ。
在一个实施例中，当表达CAR的细胞包含两个或更多个不同CAR时，不同CAR的抗原结合结构域可以使得这些抗原结合结构域不相互作用。例如，表达第一和第二CAR的细胞可以具有不与第二CAR的抗原结合结构域形成关联的例如为片段(例如scFv)的第一CAR的抗原结合结构域，例如第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(SDAB)分子，包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的分子。实例包括但不限于除抗体源自的那些之外的重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、源自常规4-链抗体的单结构域、工程化结构域和单结构域支架。SDAB分子可以是任何现有技术，或任何未来的单结构域分子。SDAB分子可以源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔、和牛。该术语还包括来自除骆驼科和鲨鱼之外的物种的天然存在的单结构域抗体分子。
在一个方面，SDAB分子可以源自在鱼中发现的免疫球蛋白的可变区，例如像源自在鲨鱼血清中发现的称为新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型的那些。产生源自NAR("IgNARs")的可变区的单结构域分子的方法描述于WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.[蛋白质科学]14:2901-2909中。
根据另一个方面，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，称为缺乏轻链的重链。此类单结构域分子在例如WO 9404678和Hamers-Casterman,C.等人(1993)Nature[自然]363:446-448中披露。出于清楚的原因，这种源自天然缺乏轻链的重链分子的可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这种VHH分子可以源自骆驼科物种，例如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和驼马。除骆驼科之外的其他物种可能产生天然缺乏轻链的重链分子；此类VHH属于本发明的范围内。
SDAB分子可以重组、CDR接枝、人源化、骆驼源化、去免疫化和/或体外产生(例如通过噬菌体展示选择)。
还已发现，具有多个包含在受体的抗原结合结构域之间相互作用的抗原结合结构域的嵌合膜嵌入受体的细胞可能是不希望的，例如因为它抑制抗原结合结构域中的一个或多个结合其同源抗原的能力。因此，本文披露了具有包含最小化这种相互作用的抗原结合结构域的第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的细胞。本文还披露了编码包含最小化这种相互作用的抗原结合结构域的第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体的核酸，以及制备和使用此类细胞和核酸的方法。在一个实施例中，第一和第二非天然存在的嵌合膜嵌入受体中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含单VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼、或七鳃鳗单VH结构域、或源自人或小鼠序列的单VH结构域。
在一些实施例中，要求保护的发明包含第一和第二CAR，其中第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域不包含可变轻结构域和可变重结构域。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域是scFv，并且另一个不是scFv。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含单VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼、或七鳃鳗单VH结构域、或源自人或小鼠序列的单VH结构域。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含骆驼科动物VHH结构域。
在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含单VH结构域，例如骆驼科动物、鲨鱼、或七鳃鳗单VH结构域、或源自人或小鼠序列的单VH结构域。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含纳米抗体。在一些实施例中，第一和第二CAR中的一个的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含骆驼科动物VHH结构域。
在一些实施例中，当存在于细胞表面上时，第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合基本上不因第二CAR的存在而降低。在一些实施例中，存在第二CAR情况下的第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合是不存在CAR情况下的第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施例中，当存在于细胞表面上时，第一和第二CAR的抗原结合结构域彼此的相关联小于两者都是scFv抗原结合结构域的情况。在一些实施例中，第一和第二CAR的抗原结合结构域彼此的相关联小于两者都是scFv抗原结合结构域的情况的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
增强CAR活性的药剂的共表达
在另一个方面，本文所述的表达CAR的细胞可以进一步表达另一种药剂，例如增强表达CAR的细胞的活性或适合性的药剂。
例如，在一个实施例中，该药剂可以是抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的药剂。在一些实施例中，调制或调节T细胞功能的分子是抑制性分子。在一些实施例中，抑制性分子(例如PD-1)可以降低表达CAR的细胞产生免疫效应子响应的能力。抑制性分子的实例包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ。
在实施例中，例如如本文所述的药剂(例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)；或例如，抑制性蛋白质或系统(例如聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN))可以用于在表达CAR的细胞中抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的表达。在一个实施例中，该药剂是shRNA，例如本文所述的shRNA。在一个实施例中，调制或调节(例如抑制)T细胞功能的药剂在表达CAR的细胞内被抑制。例如，将抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子与编码CAR组分(例如所有组分)的核酸连接。
在一个实施例中，抑制抑制性分子的药剂包含第一多肽(例如抑制性分子)，该第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文所述的细胞内信号传导结构域)相关联。在一个实施例中，该药剂包含例如抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ、或这些中的任一个的片段(例如这些中的任一个的细胞外结构域的至少一部分))的第一多肽，和为本文所述的细胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域(例如4-1BB、CD27或CD28，例如如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一个实施例中，该药剂包含PD-1或其片段(例如PD-1的细胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，和本文所述的细胞内信号传导结构域(例如本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。PD-1是还包括CD28、CTLA-4、ICOS、和BTLA的CD28受体家族的抑制性成员。PD-1在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(Agata等人1996Int.Immunol[国际免疫学]8:765-75)。PD-1的两个配体，PD-L1和PD-L2已证明在与PD-1结合后下调T细胞活化(Freeman等人2000J Exp Med[实验医学杂志]192:1027-34；Latchman等人2001Nat Immunol[自然免疫学]2:261-8；Carter等人2002Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]32:634-43)。PD-L1在人癌症中很丰富(Dong等人2003J MolMed[分子医学杂志]81:281-7；Blank等人2005Cancer Immunol.Immunother[癌症免疫学免疫疗法]54:307-314；Konishi等人2004Clin Cancer Res[临床癌症研究]10:5094)。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。
在一个实施例中，包含抑制性分子(例如程序性死亡1(PD-1))的细胞外结构域(ECD)的药剂可以融合到跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(如4-1BB和CD3ζ)(本文还称为PD1 CAR)。在一个实施例中，PD1 CAR在与本文所述的CD19 CAR组合使用时改善T细胞的持久性。在一个实施例中，CAR是包含如在SEQ ID NO:24中加下划线标出的PD-1的细胞外结构域和SEQ ID NO:24的氨基酸1-21处的信号序列的PD1 CAR。在一个实施例中，PD1 CAR包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在一个实施例中，不含N末端信号序列的PD1 CAR包含SEQ ID NO:22提供的氨基酸序列。
在一个实施例中，该药剂包含编码具有N末端信号序列的PD1 CAR(例如本文所述的PD1 CAR)的核酸序列。在一个实施例中，PD1 CAR的核酸序列在表1中示出，其中PD1ECD在SEQ ID NO:23中加下划线。
在另一个实例中，在一个实施例中，增强表达CAR的细胞活性的药剂可以是共刺激分子或共刺激分子配体。共刺激分子的实例包括MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、以及与CD83特异性结合的配体，例如，如本文所述。共刺激分子配体的实例包括CD80、CD86、CD40L、ICOSL、CD70、OX40L、4-1BBL、GITRL、和LIGHT。在实施例中，共刺激分子配体是不同于CAR的共刺激分子结构域的共刺激分子的配体。在实施例中，共刺激分子配体是与CAR的共刺激分子结构域相同的共刺激分子的配体。在一个实施例中，共刺激分子配体是4-1BBL。在一个实施例中，共刺激配体是CD80或CD86。在一个实施例中，共刺激分子配体是CD70。在实施例中，可以进一步工程化本文所述的表达CAR的免疫效应细胞以表达一种或多种另外的共刺激分子或共刺激分子配体。
CAR与趋化因子受体的共表达
在实施例中，本文所述的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)进一步包含趋化因子受体分子。趋化因子受体CCR2b或CXCR2在T细胞中的转基因表达增强了至分泌CCL2或CXCL1的实体瘤(包括黑素瘤和神经母细胞瘤)的运输(Craddock等人,JImmunother.[免疫疗法杂志]2010年10月；33(8):780-8和Kershaw等人,Hum Gene Ther.[人类基因疗法]2002年11月1日；13(16):1971-80)。因此，不希望受理论的约束，据信在识别由肿瘤(例如实体瘤)分泌的趋化因子的表达CAR的细胞中表达的趋化因子受体可以改善表达CAR的细胞向肿瘤的归巢，促进表达CAR的细胞向肿瘤的浸润，并增强表达CAR的细胞的抗肿瘤功效。趋化因子受体分子可以包含天然存在或重组趋化因子受体或其趋化因子结合片段。适于在本文所述的表达CAR的细胞(例如CAR-Tx)中表达的趋化因子受体分子包括CXC趋化因子受体(例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、或CXCR7)、CC趋化因子受体(例如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、或CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如CX3CR1)、XC趋化因子受体(例如XCR1)、或其趋化因子结合片段。在一个实施例中，基于由肿瘤分泌的一种或多种趋化因子选择有待用本文所述CAR表达的趋化因子受体分子。在一个实施例中，本文所述的表达CAR的细胞进一步包含(例如表达)CCR2b受体或CXCR2受体。在一个实施例中，本文所述的CAR和趋化因子受体分子在同一载体或在两个不同载体上。在其中本文所述CAR和趋化因子受体分子在同一载体上的实施例中，CAR和趋化因子受体分子各自处于两个不同启动子的控制下或处于同一启动子的控制下。
编码CAR的核酸构建体
本发明提供了包含编码本发明的一种或多种CAR构建体的核酸序列的CAR转基因。在一个方面，CAR转基因作为信使RNA转录物提供。在一个方面，CAR转基因作为DNA构建体提供。
因此，在一个方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中CAR包含抗CD19结合结构域(例如鼠抗CD19结合结构域或人源化抗CD19结合结构域)、跨膜结构域、和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，抗CD19结合结构域是本文所述的抗CD19结合结构域，例如包含选自下组的序列的抗CD19结合结构域，该组由以下组成：SEQ ID NO:45-56、69-80、106、109、110、112、或115、或其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，分离的核酸分子进一步包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施例中，跨膜结构域是选自下组的蛋白质的跨膜结构域，该组由以下组成：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一个实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的序列、或其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，抗CD19结合结构域通过铰链区(例如本文所述的铰链)连接至跨膜结构域。在一个实施例中，铰链区包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:39、或其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，分离的核酸分子进一步包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施例中，共刺激结构域是选自下组的蛋白质的功能性信号传导结构域，该组由以下组成：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、以及PAG/Cbp。在一个实施例中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:7的序列、或其具有95％-99％同一性的序列。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8的序列、或其具有95％-99％同一性的序列，和SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10的序列、或其具有95％-99％同一性的序列，其中包含细胞内信号传导结构域的序列在同一框架中表达并且表达为单一多肽链。在另一个方面，本发明涉及编码CAR构建体的分离的核酸分子，该CAR构建体包含SEQ ID NO:1的前导序列，具有选自下组的序列的scFv结构域，该组由以下组成：SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、和SEQ ID NO:115(或其具有95％-99％同一性的序列)，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:39(或其具有95％-99％同一性的序列)的铰链区，具有SEQ ID NO:6的序列(或其具有95％-99％同一性的序列)的跨膜结构域，具有SEQ ID NO:7的序列(或其具有95％-99％同一性的序列)的4-1BB共刺激结构域或具有SEQ ID NO:8的序列(或其具有95％-99％同一性的序列)的CD27共刺激结构域，以及具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列(或其具有95％-99％同一性的序列)的CD3ζ刺激结构域。
在另一个方面，本发明涉及由该核酸分子编码的分离的多肽分子。在一个实施例中，该分离的多肽分子包含选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、和SEQ ID NO:116、或其具有95％-99％同一性的序列。
在另一个方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)分子的分离的核酸分子，该嵌合抗原受体(CAR)分子包含抗CD19结合结构域、跨膜结构域、和包含刺激结构域的细胞内信号传导结构域，并且其中编码抗CD19结合结构域的核酸包含选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:68、和SEQ ID NO:105、或其具有95％-99％同一性的序列。
在一个实施例中，编码的CAR分子进一步包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施例中，共刺激结构域是选自下组的蛋白质的功能性信号传导结构域，该组由以下组成：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。在一个实施例中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:7的序列。在一个实施例中，跨膜结构域是选自下组的蛋白质的跨膜结构域，该组由以下组成：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一个实施例中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的序列。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施例中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的序列和SEQ ID NO:9的序列，其中包含细胞内信号传导结构域的序列在同一框架中表达并且表达为单一多肽链。在一个实施例中，抗CD19结合结构域通过铰链区连接至跨膜结构域。在一个实施例中，铰链区包含SEQ ID NO:2。在一个实施例中，铰链区包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:39。
在另一个方面，本发明涉及分离的CAR分子，该分离的CAR分子包含SEQ ID NO:1的前导序列，具有选自下组的序列的scFv结构域，该组由以下组成：SEQ ID NO:45-56、109、110、112、和115、或其具有95％-99％同一性的序列，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:39的铰链区，具有SEQ ID NO:6的序列的跨膜结构域，具有SEQ ID NO:7的序列的4-1BB共刺激结构域或具有SEQ ID NO:8的序列的CD27共刺激结构域，和具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列的CD3ζ刺激结构域。在一个实施例中，编码的CAR分子包含选自下组的序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:93-104、108、111、114、116、或其具有95％-99％同一性的序列。
本发明进一步提供了包含CAR转基因的载体。在一个方面，CAR载体可以直接转导到细胞(例如T细胞或NK细胞)中。在一个方面，该载体是克隆或表达载体，例如包括但不限于以下的载体：一种或多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、小环、小载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一个方面，该载体能够在哺乳动物T细胞或NK细胞中表达CAR构建体。在一个方面，哺乳动物T细胞是人T细胞或人NK细胞。
本发明还包括可以直接转染到细胞(例如T细胞或NK细胞)中的CAR编码RNA构建体。产生用于转染的mRNA的方法包括用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)，随后加入polyA，以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、有待表达的基因、和polyA尾的构建体，典型地长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO:35)。如此产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个方面，该模板包括CAR的序列。
在一个方面，CAR(例如CD19 CAR)转基因由信使RNA(mRNA)编码。在一个方面，将编码CAR转基因的mRNA引入T细胞中以产生CART细胞或NK细胞。
载体
本发明还提供了其中插入本发明DNA的载体。源自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的适合工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于源自致癌性逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖细胞(如肝细胞)。它们还具有低免疫原性的附加优点。
在一个实施例中，包含编码本发明所希望的CAR的核酸的载体是DNA、RNA、质粒、腺病毒载体、慢病毒载体、或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体还可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如两个)长末端重复序列(LTR)、和感兴趣的转基因(例如编码CAR的基因)。γ逆转录病毒载体可能缺少病毒结构基因(如gag、pol、和env)。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、形成脾脏病灶病毒(SFFV)、和骨髓增殖性肉瘤病毒(MPSV)，以及由其衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体描述于例如Tobias Maetzig等人,“GammaretroviralVectors:Biology,Technology and Application[γ逆转录病毒载体：生物学、技术和应用]”Viruses.[病毒]2011年6月；3(6):677-713中。
在另一个实施例中，包含编码本发明所希望的CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施例中，可以使用转座子(如sleeping beauty)、CRISPR、CAS9、和锌指核酸酶来完成编码CAR的核酸的表达。参见例如，June等人2009Nature ReviewsImmunology[自然评论：免疫学]9.10:704-716，该文献通过引用以其全文并入本文。
简单概括来说，典型地通过将编码CAR多肽的核酸或其部分与启动子可操作地连接，并将构建体掺入表达载体中来实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。这些载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有可用于调节所希望的核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列、和启动子。
使用标准基因递送方案，本发明的表达构建体还可用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，通过引用以其全文并入本文。在另一个实施例中，本发明提供了基因疗法载体。
可以将该核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可以将该核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒、和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体、和测序载体。
此外，表达载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的并且描述于例如Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL[分子克隆：实验室手册],第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY[纽约冷泉港出版社])，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、和慢病毒。一般来说，适合的载体含有在至少一种生物体中发挥功能的复制起点、启动子序列、便利的限制核酸内切酶位点、和一个或多个可选择标记(例如WO01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用了腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施例中，使用了慢病毒载体。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。典型地，这些启动子位于起始位点上游30-110bp区域中，不过许多启动子最近已被证明也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔常常是灵活的，以便当元件相对于彼此反转或移动时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加到相隔50bp。取决于启动子，似乎个别元件可以协同或者独立地发挥功能以激活转录。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C、或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的实例是EF1α启动子(EF1a或EFlα)。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基的表达，这负责将氨酰基tRNA酶促递送至核糖体。EF1a启动子已广泛用于哺乳动物表达质粒，并且已被证实有效地驱动来自克隆到慢病毒载体中的转基因的CAR表达。参见例如，Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。在一个方面，EF1a启动子包含提供为SEQ ID NO:11的序列。
启动子的另一个实例是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这种启动子序列是强大的组成型启动子序列，能够驱动任何与其可操作地连接的多核苷酸序列的高水平表达。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即刻早期启动子、Rous肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子、和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应被限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。使用诱导型启动子提供了分子开关，该分子开关能够在希望这种表达时开启与它可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不希望表达时关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、黄体酮启动子、和四环素启动子。
启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施例中，截短的PGK启动子(例如当与野生型PGK启动子序列相比时，具有一个或多个(例如1、2、5、10、100、200、300、或400个)核苷酸缺失的PGK启动子)可能是希望的。示例性PGK启动子的核苷酸序列作为SEQ ID NO:126中的野生型PGK启动子或PGK启动子的截短形式提供，例如，如SEQ ID NO:127中提供的PGK100、如SEQ ID NO:128中提供的PGK200、如SEQ ID NO:129中提供的PGK300、和如SEQ ID NO:130中提供的PGK400。
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起源和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如氨苄青霉素抗性基因和/或zeocin标记)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，有待引入细胞中的表达载体也可以含有选择性标记基因或报告基因或这两者，以便有助于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，选择性标记可以在一段单独的DNA上携带，并在共转染程序中使用。选择性标记和报告基因两者均可以侧接适当的调节序列以使得在宿主细胞中能够表达。有用的选择性标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因可用于鉴定潜在被转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。一般来说，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由该受体生物体或组织表达的基因，并且它编码通过一些易于检测的特性(例如酶活性)显现表达的多肽。在DNA已被引入受体细胞中后适合的时间，测定报告基因的表达。适合的报告基因可以包括编码荧光素酶、β半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因、或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]479:79-82)。适合的表达系统是熟知的，并且可以使用已知的技术来制备或者商购获得。一般来说，具有显示报告基因的最高水平表达的最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以连接到报告基因，并用于评估药剂调制启动子驱动的转录的能力。
在一个实施例中，该载体可以进一步包含编码第二CAR的核酸。在一个实施例中，第二CAR包括针对例如除CD19之外的靶标(例如除CD19之外的B细胞抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、或CD79a)的抗原结合结构域。在一个实施例中，该载体包含编码靶向第一抗原并且包括具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR的核酸，以及编码靶向第二不同的抗原并且包括具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR的核酸。在一个实施例中，该载体包含编码包括CD19结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域的第一CD19 CAR的核酸，以及编码靶向除CD19之外的抗原(例如除CD19之外的B细胞抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、或CD79a)并且包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域的第二CAR的核酸。在另一个实施例中，该载体包含编码包括CD19结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域的第一CD19 CAR的核酸，以及编码靶向除CD19之外的抗原(例如除CD19之外的B细胞抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、或CD79a)并且包括针对该抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域的第二CAR的核酸。
在一个实施例中，该载体包含编码本文所述CAR(例如CD19 CAR)的核酸和编码抑制性CAR的核酸。在一个实施例中，抑制性CAR包含结合在正常细胞(例如也表达CD19的正常细胞)而非癌细胞上发现的抗原的抗原结合结构域。在一个实施例中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和/或TGFβ的细胞内结构域。
在实施例中，该载体可以包含两种或更多种核酸序列，其中这些核酸序列中的一种编码本文所述的CAR(例如本文所述的CD19 CAR)。在一个实施例中，另一种核酸可以编码第二CAR，例如抑制性CAR或特异性结合除CD19之外的抗原(例如除CD19之外的B细胞抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、或CD79a)、或可以调节本文所述CAR(例如CD19 CAR)活性的多肽。在此类实施例中，例如编码本文所述CAR(例如CD19CAR)和第二CAR或其他多肽的两种或更多种核酸序列由同一框架中并且为单个多肽链的单个核酸分子编码。在一个实施例中，两个或更多个多肽可以通过一个或多个肽切割位点(例如自身切割位点或细胞内蛋白酶的底物)分开。肽切割位点的实例包括以下，其中GSG残基是任选的：如SEQ ID NO:131中提供的T2A、如SEQ ID NO:132中提供的P2A、如SEQ ID NO:133中提供的E2A、和如SEQ ID NO:134中提供的F2A。
将基因引入细胞中并表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法将该载体容易地引入宿主细胞(例如哺乳动物、细菌、酵母、或昆虫细胞)中并且描述于2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731的第208-210页，该文献通过引用以其全文并入。
本发明进一步提供包含CAR编码核酸分子的载体。在一个方面，CAR载体可以直接转导到细胞(例如T细胞或NK细胞)中。在一个方面，该载体是克隆或表达载体，例如包括但不限于以下的载体：一种或多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、小环、小载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一个方面，该载体能够在哺乳动物T细胞中表达CAR构建体。在一个方面，哺乳动物T细胞是人T细胞。在一个方面，哺乳动物细胞是人NK细胞。
RNA转染
本文披露了用于产生体外转录RNA CAR的方法。本发明还包括可以直接转染到细胞中的CAR编码RNA构建体。产生用于转染的mRNA的方法可以包括用特别设计的引物对模板进行体外转录(IVT)，随后加入polyA，以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、有待表达的核酸、和polyA尾的构建体，典型地长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO:35)。如此产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个方面，该模板包括CAR的序列。
在一个方面，CAR(例如CD19 CAR)由信使RNA(mRNA)编码。在一个方面，将编码CAR的mRNA引入免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)中以产生表达CAR的细胞(例如CART细胞或CAR NK细胞)。
RNA转染的另外方法描述于2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731的第192-196页，该文献通过引用以其全文并入。
非病毒递送方法
在一些方面，非病毒方法可以用于将编码本文所述CAR的核酸递送到细胞或组织或受试者中。在一些实施例中，非病毒方法包括使用转座子(也称为转座因子)。在一些实施例中，转座子是可以将自身插入基因组中的位置处的DNA片段，例如能够自我复制并将其拷贝插入基因组中的DNA片段，或可以从较长核酸中剪接并插入基因组中的另一个位置中的DNA片段。另外和示例性转座子以及非病毒递送方法描述于2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731的第196-198页，该文献通过引用以其全文并入。
细胞的来源
在扩增和遗传修饰例如以表达本文所述的CAR之前，可以从受试者获得细胞(例如T细胞或NK细胞)的来源。术语“受试者”旨在包括可以在其中引发免疫响应的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、及其转基因物种。
在实施例中，免疫效应细胞(例如免疫效应细胞群)(例如T细胞)源自(例如分化自)干细胞，例如胚胎干细胞或多能干细胞(例如诱导多能干细胞(iPSC))。在实施例中，这些细胞是自体或同种异体的。在其中细胞是同种异体的实施例中，修饰例如源自干细胞(例如iPSC)的细胞以降低它们的同种异体反应性。例如，可以修饰细胞以降低同种异体反应性，例如通过修饰(例如破坏)它们的T细胞受体。在实施例中，例如在T细胞分化后，位点特异性核酸酶可以用于破坏T细胞受体。在其他实例中，细胞(例如源自iPSC的T细胞)可以由病毒特异性T细胞产生，其由于识别病原体衍生的抗原而不太可能引起移植物抗宿主病。在又其他实例中，通过从常见HLA单倍型产生iPSC使得它们与匹配的非相关的受体受试者组织相容，可以降低(例如最小化)同种异体反应性。在又其他实例中，通过遗传修饰抑制HLA表达，可以降低(例如最小化)同种异体反应性。例如，可以如例如通过引用并入本文的Themeli等人Nat.Biotechnol.[自然生物技术]31.10(2013):928-35中所述地处理源自iPSC的T细胞。在一些实例中，可以使用描述于WO 2014/165707中的方法处理/产生源自干细胞的免疫效应细胞(例如T细胞)，该文献通过引用并入本文。本文例如在本文的“同种异体CAR免疫效应细胞”部分中描述了涉及同种异体细胞的另外实施例。
T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织、和肿瘤。在本披露内容的某些方面，可以使用任何数量本领域可得的T细胞系。在本披露内容的某些方面，可以使用任何数量本领域技术人员已知的技术(如FicollTM分离)从自受试者收集的血液单位获得T细胞。在一个优选的方面，通过单采血液成分术获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分术产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞、和血小板。在一个方面，可以洗涤由单采血液成分术收集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在可替代方面，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。在不存在钙的情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如通过根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、BaxterCytoMate、或Haemonetics Cell Saver 5)。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如像无Ca、无Mg的PBS、PlasmaLyte A、或者含有或不含缓冲液的其他盐溶液。可替代地，可以除去单采血液成分术样品中不希望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
应认识到，本申请的方法可以利用包含5％或更少(例如2％)人AB血清的培养基条件，并采用已知的培养基条件和组合物，例如描述于Smith等人,“Ex vivo expansion ofhuman T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS ImmuneCell Serum Replacement[使用新型无Xeno CTS免疫细胞血清替代物进行过继性免疫疗法的人T细胞的离体扩增]”Clinical&Translational Immunology[临床和转化免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中的那些。
在一个方面，通过例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘洗来裂解红细胞和耗尽单核细胞，从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、和CD45RO+T细胞。例如，在一个方面，通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)缀合珠(如M-450CD3/CD28T)孵育足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一个方面，该时间段是约30分钟。在另一个方面，该时间段的范围为从30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在另一个方面，该时间段是至少1、2、3、4、5、或6小时。在又另一个优选的方面，该时间段是10至24小时。在一个方面，该孵育时间段是24小时。与其他细胞类型相比，在存在较少T细胞的任何情况下，如从肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+ T细胞捕获的效率。因此，通过简单地缩短或延长使T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养起始时或在该过程期间的其他时间点优先地选择或针对T细胞亚群。另外，通过增加或减少抗CD3和/或抗CD28抗体在珠或其他表面上的比率，可以在培养起始时或在其他希望的时间点优先地选择或针对T细胞亚群。本领域技术人员将认识到，在本发明的上下文中还可以使用多轮选择。在某些方面，可能希望执行选择程序并在活化和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以经受进一步轮次的选择。
可以用针对阴性选择的细胞特有的表面标记的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物典型地包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。在某些方面，可能希望富集或阳性选择典型地表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、和FoxP3+的调节T细胞。可替代地，在某些方面，T调节细胞被抗C25缀合的珠或其他类似的选择方法耗尽。
本文所述的方法可以包括，例如使用例如(例如本文所述的)阴性选择技术选择免疫效应细胞(例如T细胞)的特定亚群，该亚群是T调节细胞耗尽的群，CD25+耗尽的细胞。优选地，T调节耗尽的细胞群含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在一个实施例中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体IL-2从该群除去T调节细胞(例如CD25+ T细胞)。在一个实施例中，将抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体与底物(例如珠)缀合，或以其他方式包被在底物(例如珠)上。在一个实施例中，将抗CD25抗体或其片段与如本文所述的底物缀合。
在一个实施例中，使用来自MiltenyiTM的CD25耗尽试剂从该群除去T调节细胞(例如CD25+ T细胞)。在一个实施例中，细胞与CD25耗尽试剂的比率是1e7个细胞至20uL、或1e7个细胞至15uL、或1e7个细胞至10uL、或1e7个细胞至5uL、或1e7个细胞至2.5uL、或1e7个细胞至1.25uL。在一个实施例中，例如对于T调节细胞(例如CD25+)耗尽，使用大于5亿个细胞/ml。在另一个方面，使用600、700、800、或900百万个细胞/ml的细胞浓度。
在一个实施例中，有待耗尽的免疫效应细胞群包括约6x 109个CD25+ T细胞。在其他方面，有待耗尽的免疫效应细胞群包括约1x 109至1x 1010个CD25+ T细胞，以及其间的任何整数值。在一个实施例中，所得T调节耗尽的细胞群具有2x 109个T调节细胞(例如CD25+细胞)或更少(例如1x 109、5x 108、1x 108、5x 107、1x 107、或更少个CD25+细胞)。
在一个实施例中，使用具有耗尽管组(例如像管162-01)的CliniMAC系统从该群除去T调节细胞(例如CD25+细胞)。在一个实施例中，将CliniMAC系统在耗尽设置(例如像DEPLETION2.1)上运行。
不希望受特定理论的约束，在单采血液成分术之前或在制造表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如TREG细胞)的数量)可以降低受试者复发的风险。例如，耗尽TREG细胞的方法是本领域已知的。减少TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25耗尽、及其组合。
在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前减少TREG细胞的数量(例如，耗尽TREG细胞)。例如，制造方法包括使样品(例如单采血液成分术样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如以在制造表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)产物之前耗尽TREG细胞。
在一个实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用一种或多种减少TREG细胞的疗法预处理受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一个实施例中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者给予环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗尽、或其组合中的一种或多种。给予环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗尽、或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间或之后发生。
在一个实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用环磷酰胺预处理受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一个实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用抗GITR抗体预处理受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。
在一个实施例中，有待除去的细胞群既不是调节T细胞或肿瘤细胞，也不是以其他方式对CART细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞(例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潜在免疫抑制细胞表达的其他标记的细胞)。在一个实施例中，设想将此类细胞与调节T细胞和/或肿瘤细胞并行除去，或者在所述耗尽之后，或以另一种顺序除去。
本文所述的方法可以包括多于一个的选择步骤，例如多于一个的耗尽步骤。可以例如用针对阴性选择的细胞特有的表面标记的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。
本文所述的方法可以进一步包括从表达肿瘤抗原(例如不包含CD25的肿瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群除去细胞，从而提供T调节耗尽的(例如CD25+耗尽的)和肿瘤抗原耗尽的细胞群，该细胞群适于表达CAR(例如本文所述的CAR)。在一个实施例中，将肿瘤抗原表达细胞与T调节例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞或抗CD25抗体或其片段、或抗肿瘤抗原抗体或其片段的同一底物(例如珠)，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节细胞(例如CD25+细胞)的除去和肿瘤抗原表达细胞的除去是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。
还提供了包括以下的方法：从表达检查点抑制剂(例如本文所述的检查点抑制剂)的群除去细胞(例如PD1+细胞、LAG3+细胞、和TIM3+细胞中的一种或多种)，从而提供T调节耗尽的(例如CD25+耗尽的)细胞和检查点抑制剂耗尽的细胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗尽的细胞)群。示例性检查点抑制剂包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。在一个实施例中，将检查点抑制剂表达细胞与T调节例如CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞或抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段的同一珠，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节细胞(例如CD25+细胞)的除去和检查点抑制剂表达细胞的除去是连续的，并且可以例如以任何顺序发生。
在一个实施例中，可以选择表达IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B、和穿孔素中的一种或多种、或其他适当分子(例如其他细胞因子)的T细胞群。用于筛选细胞表达的方法可以例如通过描述于PCT公布号：WO 2013/126712中的方法确定。
为了通过阳性或阴性选择分离希望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如颗粒(如珠))的浓度。在某些方面，可能希望显著减小其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个方面，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个方面，使用10、15、20、25、30、35、40、45、或50百万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方面，使用75、80、85、90、95、或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用125或150百万个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞活化、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如白血病的血、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可能具有治疗价值，并且是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关方面，可能希望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒(如珠))的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量有待结合颗粒的所希望抗原的细胞。例如，CD4+ T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地捕获。在一个方面，使用的细胞浓度是5X 10e6/ml。在其他方面，使用的浓度可以是从约1X 105/ml至1X 106/ml，以及其间的任何整数值。
在其他方面，可以将细胞在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论的约束，冷冻和后续解冻步骤通过除去细胞群中的粒细胞和一定程度的单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他适合的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷冻。
在某些方面，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并在使用本披露内容的方法活化之前将其在室温下静置1小时。
在本发明的上下文中还考虑了在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采血液成分术产物。因此，可以在任何必要的时间点收集有待扩增的细胞来源，并且分离和冷冻所希望的细胞(如T细胞)以便以后在T细胞疗法中用于任何数量将受益于T细胞疗法(如本文所述的那些)的疾病或病状。在一个方面，血液样品或单采血液成分术取自基本健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采血液成分术取自基本健康的受试者，该受试者处于发展疾病的风险中，但尚未患发展疾病，并且将感兴趣的细胞分离并冷冻供以后使用。在某些方面，T细胞可以扩增、冷冻，并在以后使用。在某些方面，在诊断如本文所述的特定疾病之后但在任何治疗之前不久从患者收集样品。在另一方面，在任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采血液成分术分离细胞，这些相关治疗方式包括但不限于用以下进行治疗：药剂(如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂)、化疗、放射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)、和照射。
在本披露内容的另一个方面，在使受试者离开功能性T细胞的治疗之后直接从患者获得T细胞。在这点上，已观察到在某些癌症治疗(特别是使用破坏免疫系统的药物的治疗)之后，在患者通常将从治疗恢复期间治疗后不久，所获得的T细胞的质量因其离体扩增的能力可能是最佳或改善的。同样地，在使用本文所述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选的状态以增强植入和体内扩增。因此，在本披露内容的上下文中考虑了在该恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞、或造血谱系的其他细胞。此外，在某些方面，动员(例如，用GM-CSF动员)和调整方案可以用于在受试者中产生病状，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的，尤其是在治疗后确定的时间窗口。例证性细胞类型包括免疫系统的T细胞、B细胞、树突细胞、和其他细胞。
在一个实施例中，T细胞群是二酰基甘油激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质，或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。DGK缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如给予RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以减少或预防DGK表达。可替代地，可以通过用本文所述的DGK抑制剂处理产生DGK缺陷型细胞。
在一个实施例中，T细胞群是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达IkarosRNA或蛋白质，或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，Ikaros缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如给予RNA干扰剂(例如siRNA、shRNA、miRNA)以减少或预防Ikaros表达。可替代地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如来那度胺)处理产生Ikaros缺陷型细胞。
在实施例中，T细胞群是DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的，例如不表达DGK和Ikaros，或者具有降低或抑制的DGK和Ikaros活性。可以通过本文所述的任何方法产生此类DGK和Ikaros缺陷型细胞。
在一个实施例中，从受试者获得NK细胞。在另一个实施例中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92细胞系(Conkwest公司)。
同种异体CAR免疫效应细胞
在本文所述的实施例中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如，该细胞可以是同种异体T细胞，例如缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。
缺少功能性TCR的T细胞可以例如被工程化使得它在其表面上不表达任何功能性TCR，被工程化使得它不表达包含功能性TCR的一个或多个亚基或被工程化使得它在其表面上产生非常少的功能性TCR。可替代地，T细胞可以例如通过表达TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式表达严重受损的TCR。术语“严重受损的TCR”意指该TCR将不在宿主中引发不利的免疫反应。
本文所述的T细胞可以例如被工程化，使得它在其表面上不表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以被工程化，使得细胞表面表达HLA(例如HLA I类和/或HLA II类)下调。
在一些实施例中，T细胞可以缺少功能性TCR和功能性HLA(例如HLA I类和/或HLAII类)。
缺少功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任何适合的方式获得，包括敲除或敲低TCR或HLA的一个或多个亚基。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。
在一些实施例中，同种异体细胞可以是例如通过本文所述的任何方法不表达或以低水平表达抵制性分子的细胞。例如，该细胞可以是不表达或以低水平表达抵制性分子的细胞，该抵制性分子例如可以降低表达CAR的细胞产生免疫效应子响应的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ。抑制性分子的抑制(例如通过在DNA、RNA、或蛋白质水平上的抑制)可以优化表达CAR的细胞的性能。在实施例中，可以使用例如如本文所述的抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA、聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN)。
抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA
在一些实施例中，在细胞(例如T细胞)中，可以使用靶向编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA，和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)来抑制TCR表达和/或HLA表达。
siRNA和shRNA的表达系统以及示例性shRNA描述于例如2015年3月13日提交的国际公布WO2015/142675的第649和650段中，该文献通过引用以其全文并入。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文所用的“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指一组聚集的规则间隔短回文重复序列，或包含这种重复序列组的系统。如本文所用，“Cas”是指CRISPR相关蛋白。
“CRISPR/Cas”系统是指源自CRISPR和Cas的系统，其可以用于在细胞(例如T细胞)中沉默或突变TCR和/或HLA基因，和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)。
CRISPR/Cas系统及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际公布WO2015/142675的第651-658段中，该文献通过引用以其全文并入。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
TALEN”或“针对HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录激活因子样效应核酸酶，一种可以用于在细胞(例如T细胞)中编辑HLA和/或TCR基因和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)的人工核酸酶。
TALEN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际公布WO 2015/142675的第659-665段中，该文献通过引用以其全文并入。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶，一种可以用于在细胞(例如T细胞)中编辑HLA和/或TCR基因和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)的人工核酸酶。
ZFN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际公布WO 2015/142675的第666-671段中，该文献通过引用以其全文并入。
端粒酶表达
尽管不希望受任何特定理论的约束，但在一些实施例中，由于T细胞中的端粒缩短，治疗性T细胞在患者中具有短期持久性；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善患者体内T细胞的持久性。参见Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancerin the clinic[临床上用于癌症的过继性T细胞疗法]”,Journal of ClinicalInvestigation[临床研究杂志],117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施例中，免疫效应细胞(例如T细胞)异位表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT。在一些方面，本披露内容提供了产生表达CAR的细胞的方法，该方法包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT)的核酸接触。可以使细胞在与编码CAR的构建体接触之前、同时或之后与该核酸接触。
在一个方面，本披露内容的特点在于制备免疫效应细胞(例如T细胞、NK细胞)群的方法。在一个实施例中，该方法包括：提供免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)群，在允许CAR和端粒酶表达的条件下，使免疫效应细胞群与编码CAR的核酸接触；并且使免疫效应细胞群与编码端粒酶亚基(例如hTERT)的核酸接触。
在一个实施例中，编码端粒酶亚基的核酸是DNA。在一个实施例中，编码端粒酶亚基的核酸包含能够驱动端粒酶亚基表达的启动子。
在一个实施例中，hTERT具有如SEQ ID NO:135中提供的GenBank蛋白IDAAC51724.1的氨基酸序列(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human TelomeraseCatalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and duringImmortalization[hEST2，推定的人端粒酶催化亚基基因，在肿瘤细胞和永生化过程中上调]”Cell[细胞]第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795页)。
在一个实施例中，hTERT具有与SEQ ID NO:135的序列至少80％、85％、90％、95％、96^、97％、98％、或99％相同的序列。在一个实施例中，hTERT具有SEQ ID NO:135的序列。在一个实施例中，hTERT在N末端、C末端或两者处包含缺失(例如不多于5、10、15、20、或30个氨基酸)。在一个实施例中，hTERT在N末端、C末端或两者处包含转基因氨基酸序列(例如不多于5、10、15、20、或30个氨基酸)。
在一个实施例中，hTERT由如SEQ ID NO:136中提供的GenBank登录号AF018167的核酸序列编码(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase CatalyticSubunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization[hEST2，推定的人端粒酶催化亚基基因，在肿瘤细胞和永生化过程中上调]”Cell[细胞]第90卷,第4期,1997年8月22日,第785-795页)
在一个实施例中，hTERT由具有与SEQ ID NO:136的序列至少80％、85％、90％、95％、96、97％、98％、或99％相同的序列的核酸编码。在一个实施例中，hTERT由SEQ ID NO:136的核酸编码。
免疫效应细胞(例如T细胞)的活化和扩增
免疫效应细胞(如T细胞)通常可以使用如描述于例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公布号20060121005中的方法活化和扩增。
通常，免疫效应细胞(例如T细胞)群可以通过与已附着有药剂和配体的表面接触而扩增，该药剂刺激CD3/TCR复合物相关信号并且该配体刺激免疫效应细胞(例如T细胞)表面上的共刺激分子。具体地，可以如本文所述刺激T细胞群，如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗CD2抗体接触，或通过与结合有钙离子载体的蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，在适于刺激T细胞增殖的条件下，可以使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。可以使用抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(法国贝桑松Diaclone公司(Diaclone,France))，还可以使用本领域公知的其他方法(Berg等人,Transplant Proc.[移植学会会报]30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.[实验医学杂志]190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.[免疫学杂志]227(1-2):53-63,1999)。
在某些方面，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到同一表面(即，为“顺式”形成)或偶联到分离表面(即，为“反式”形成)。可替代地，可以将一种药剂偶联到表面并且使另一种药剂在溶液中。在一个方面，将提供共刺激信号的药剂与细胞表面结合，并且使提供初级活化信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在某些方面，两种药剂都可以在溶液中。在一个方面，这些试剂可以为可溶形式，并且然后交联到表面，如表达Fc受体的细胞或将与这些药剂结合的抗体或其他结合剂。在这点上，参见例如，美国专利申请公布号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，考虑将其用于活化和扩增本披露内容中的T细胞。
在一个方面，将两种药剂固定在珠上，或者在同一珠上，即“顺式”，或者在分离的珠上，即“反式”。通过举例，提供初级活化信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且将两种药剂以等效分子量共固定到同一珠。在一个方面，使用与珠结合的每种抗体的1:1比率用于CD4+ T细胞扩增和T细胞生长。在本披露内容的某些方面，使用与珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，使得与使用1:1比率观察到的扩增相比观察到T细胞扩增的增加。在一个特定方面，与使用1:1比率观察到的扩增相比，观察到从约1倍至约3倍的增加。在一个方面，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率范围为从100:1至1:100以及其间的所有整数值。在本披露内容的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于1。在本发明的某些方面，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特定方面，使用与珠结合的抗体的1:100CD3:CD28比率。在一个方面，使用与珠结合的抗体的1:75CD3:CD28比率。在另一个方面，使用与珠结合的抗体的1:50CD3:CD28比率。在一个方面，使用与珠结合的抗体的1:30CD3:CD28比率。在一个优选的方面，使用与珠结合的抗体的1:10CD3:CD28比率。在一个方面，使用与珠结合的抗体的1:3CD3:CD28比率。在又一个方面，使用与珠结合的抗体的3:1CD3:CD28比率。
颗粒与细胞的比率为从1:500至500:1以及其间的任何整数值可以用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的颗粒尺寸。例如，小尺寸的珠仅可以结合少量细胞，而较大的珠可以结合许多细胞。在某些方面范围从1:100至100:1以及其间的任何整数值的细胞与颗粒的比率和在另外的方面包括1:9至9:1的比率以及其间的任何整数值也可以用于刺激T细胞。如以上所指出，导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比率可以变化，然而某些优选值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、和15:1，其中一个优选的比率是每个T细胞至少1:1个颗粒。在一个方面，使用1:1或更小的颗粒与细胞比率。在一个特定方面，优选的颗粒:细胞比率是1:5。在另外的方面，颗粒与细胞的比率可以根据刺激日而变化。例如，在一个方面，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，并且将另外颗粒在之后每天或每隔一天加入到细胞中持续最长10天，最终比率为从1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一个特定方面，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为1:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:5。在一个方面，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:5，每天或每隔一天添加颗粒。在一个方面，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比率为2:1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1:10。在一个方面，基于在第一天的最终比率为1:1并且在刺激的第三天和第五天为1:10，每天或每隔一天添加颗粒。本领域技术人员将理解，多种其他比率可以适用于本披露内容。具体地，比率将根据粒度和细胞大小和类型而变化。在一个方面，在第一天用于使用的最典型比率是1:1、2:1和3:1附近。
在本披露内容的另外的方面，将细胞(如T细胞)与药剂包被的珠组合，随后分离珠和细胞，并且然后培养细胞。在可替代方面，在培养之前，不将药剂包被的珠和细胞分开而是一起培养。在另一个方面，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标记的连接增加，从而诱导细胞刺激。
通过举例，可以通过使抗CD3和抗CD28附着的顺磁珠(3x28珠)接触T细胞来连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠(例如，比率为1:1的M-450 CD3/CD28 T顺磁珠)在缓冲液(例如PBS(不含二价阳离子(如钙和镁))中组合。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常罕见，并且仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可以包含感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量均在本披露内容的上下文中。在某些方面，可能希望显著减小其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个方面，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个方面，使用10、15、20、25、30、35、40、45、或50百万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方面，使用75、80、85、90、95、或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用125或150百万个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞活化、和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。此类细胞群可能具有治疗价值，并且在某些方面是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个实施例中，例如通过本文所述的方法扩增用编码CAR(例如本文所述的CAR)的核酸转导的细胞。在一个实施例中，使细胞在培养物中扩增数小时(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的一段时间。在一个实施例中，使细胞扩增4至9天的一段时间。在一个实施例中，使细胞扩增8天或更少(例如7、6或5天)的一段时间。在一个实施例中，使细胞(例如本文所述的表达CAR的细胞)在培养物中扩增5天，并且所得细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。效力可以例如通过各种T细胞功能来定义，例如增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、活化、迁移、或其组合。在一个实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如本文所述的表达CAR的细胞)在抗原刺激后显示细胞倍增至少增加一倍、两倍、三倍或四倍。在一个实施例中，使细胞(例如本文所述的表达CAR的细胞)在培养物中扩增5天，并且与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，所得细胞表现出更高的促炎细胞因子产生(例如IFN-γ和/或GM-CSF水平)。在一个实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞(例如本文所述的表达CAR的细胞)显示促炎细胞因子产生(例如IFN-γ和/或GM-CSF水平)以pg/ml增加至少一、二、三、四、五、十倍或更多。
在本披露内容的一个方面，可以将混合物培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在一个方面，可以将混合物培养21天。在本发明的一个方面，将珠和T细胞一起培养约八天。在一个方面，将珠和T细胞一起培养2-3天。还可能希望进行几个刺激循环，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，Minimal Essential Media或RPMI Media 1640或X-vivo 15，(龙沙公司(Lonza)))，该培养基可以含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、和TNF-α或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白制品、和还原剂(如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。培养基可以包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、和X-Vivo 20、优化剂，其中添加氨基酸、丙酮酸钠、和维生素，无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或一组确定的激素、和/或足以使T细胞生长和扩增的一定量细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)仅包含在实验培养物中，而不包含在有待注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和大气(例如空气加5％CO2)。
在一个实施例中，使细胞在包括一种或多种白细胞介素的适当介质(例如本文所述的介质)中扩增，该白细胞介素导致在14天的扩增期间细胞增加至少200倍(例如200倍、250倍、300倍、350倍)，例如如通过本文所述的方法(如流式细胞术)测量。在一个实施例中，使细胞在IL-15和/或IL-7(例如IL-15和IL-7)存在下扩增。
在一个实施例中，扩增本文所述细胞(例如表达CAR的细胞，例如表达CD19 CAR的细胞，例如本文所述的表达CD19 CAR的细胞，例如CTL-019)的方法(例如离体扩增)包括使细胞与PD-1抑制剂(例如本文所述的PD-1抑制剂，例如本文所述的抗PD-1抗体分子，例如PDR-001)接触。
在实施例中，本文所述的方法(例如表达CAR的细胞制造方法)包括例如使用抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体IL-2从细胞群除去T调节细胞(例如CD25+ T细胞)。本文描述了从细胞群除去T调节细胞(例如CD25+ T细胞)的方法。在实施例中，这些方法(例如制造方法)进一步包括使细胞群(例如其中T调节细胞(如CD25+ T细胞)已耗尽的细胞群；或先前已接触抗CD25抗体、其片段，或CD25-结合配体的细胞群)与IL-15和/或IL-7接触。例如，使细胞群(例如先前已接触抗CD25抗体、其片段，或CD25-结合配体)在IL-15和/或IL-7存在下扩增。
在一个实施例中，本文所述的方法(例如表达CAR的细胞制造方法)包括使细胞(例如表达CAR的细胞，例如表达CD19 CAR的细胞，例如本文所述的表达CD19 CAR的细胞，例如CTL-019)与PD-1抑制剂(例如本文所述的PD-1抑制剂，例如本文所述的抗PD-1抗体分子，例如PDR-001)接触。
在一些实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含白细胞介素-15(IL-15)多肽、白细胞介素-15受体α(IL-15Ra)多肽，或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如hetIL-15)两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合的组合物接触。在实施例中，在例如离体制造表达CAR的细胞过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。
在一个实施例中，在离体扩增过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物接触。在一个实施例中，在离体扩增过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物接触。在一个实施例中，在离体扩增过程中，使本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合物接触。在一个实施例中，该接触导致淋巴细胞亚群(例如CD8+ T细胞)的存活和增殖。
在一个实施例中，在包含血清的介质中培养(例如扩增、模拟和/或转导)细胞。该血清可以是例如人AB血清(hAB)。在一些实施例中，hAB血清以约2％、约5％、约2％-3％、约3％-4％、约4％-5％、或约2％-5％存在。2％和5％血清各自是允许T细胞多倍扩增的适合水平。此外，如Smith等人,“Ex vivo expansion of human T cells for adoptiveimmunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型无Xeno CTS免疫细胞血清替代物进行过继性免疫疗法的人T细胞的离体扩增]”Clinical&Translational Immunology[临床和转化免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中所示，含有2％人AB血清的介质适于T细胞的离体扩增。
已暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群(TH，CD4+)，其大于细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生T细胞群，该T细胞群在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，该T细胞群包含越来越多的TC细胞群。因此，取决于治疗目的，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群可能是有利的。类似地，如果已分离了TC细胞的抗原特异性子集，则将该子集扩增到更大程度可能是有益的。
此外，在细胞扩增过程中，除CD4和CD8标记之外，其他表型标记显著地，但在很大程度上，可重复地变化。因此，这种可重复性使得能够针对特定目的定制活化的T细胞产物。
在一些实施例中，可以基于例如CCL20、GM-CSF、IFNγ、IL-10、IL-13、IL-17a、IL-2、IL-21、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、TNFα和/或其组合中的一种或多种的蛋白质表达水平选择用编码CAR(例如本文所述的CAR)的核酸转导的细胞以用于给予。在一些实施例中，可以基于例如CCL20、IL-17a、IL-6及其组合的蛋白质表达水平选择用编码CAR(例如本文所述的CAR)的核酸转导的细胞以用于给予。
此外，在细胞扩增过程中，除CD4和CD8标记之外，其他表型标记显著地，但在很大程度上，可重复地变化。因此，这种可重复性使得能够针对特定目的定制活化的T细胞产物。
一旦构成CAR(例如CD19 CAR)，则可以使用各种测定来评估分子的活性，如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞的能力、在不存在再刺激的情况下维持T细胞扩增的能力，以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。用于评估CAR(例如CD19 CAR)的作用的测定描述于例如2014年12月19日提交的国际公布WO2015/090230的第[0417]-[00423]段中，该文献通过引用以其全文并入。
CAR细胞群
在另一个方面，本发明提供了表达CAR的细胞群，例如表达CD19 CAR的细胞群。在一些实施例中，表达CAR的细胞群包含表达不同CAR的细胞的混合物。
例如，在一个实施例中，表达CAR的细胞群可以包括表达具有本文所述抗CD19结合结构域的CAR的第一细胞，和表达具有不同抗CD19结合结构域(例如，不同于由第一细胞表达的CAR中的抗CD19结合结构域的本文所述抗CD19结合结构域)的CAR的第二细胞。
作为另一个实例，表达CAR的细胞群可以包括表达包括抗CD19结合结构域(例如如本文所述)的CAR的第一细胞，和表达包括针对除CD19之外的靶标(例如除CD19之外的B细胞抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、或CD79a)的抗原结合结构域的CAR的第二细胞。在一个实施例中，表达CAR的细胞群包括例如表达包括初级细胞内信号传导结构域的CAR的第一细胞，和表达包括次级信号传导结构域的CAR的第二细胞。
在一个实施例中，表达CAR的细胞群可以包括表达包括抗CD19结合结构域的CAR的第一细胞，和表达包括靶向(例如特异性结合)在细胞上表达的抗原或B细胞抗原的抗原结合结构域的CAR的第二细胞。在一个实施例中，B细胞抗原是CD19，例如，其中第一细胞和第二细胞表达不同的CD19 CAR。在另一个实施例中，B细胞抗原是除CD19之外的抗原，例如CD10、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、或CD79a。
在另一个方面，本发明提供了细胞群，其中该群中的至少一种细胞表达具有本文所述抗CD19结合结构域的CAR，且第二细胞表达另一种药剂(例如增强表达CAR的细胞活性或功能的药剂)。例如，在一个实施例中，该药剂可以是调制或调节(例如抑制)T细胞功能的药剂。在一些实施例中，调制或调节T细胞功能的分子是抑制性分子，例如本文所述的药剂。在一些实施例中，抑制性分子例如可以降低表达CAR的细胞产生免疫效应子响应的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ。在一个实施例中，抑制抑制性分子的药剂包含第一多肽(例如抑制性分子)，该第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文所述的细胞内信号传导结构域)相关联。在一个实施例中，该药剂包含例如抑制性分子(如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ、或这些中的任一个的片段(例如这些中的任一个的细胞外结构域的至少一部分))的第一多肽，和为本文所述的细胞内信号传导结构域(例如包含共刺激结构域(例如4-1BB、CD27、CD28、或ICOS，例如如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一个实施例中，该药剂包含PD1或其片段(例如PD1的细胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，和本文所述的细胞内信号传导结构域(例如本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
在一个方面，本发明提供了包括以下的方法：与另一种药剂(例如PD-1抑制剂，如本文所述的PD-1抑制剂)组合，给予表达CAR的细胞(例如CART细胞)群例如表达不同CAR的细胞的混合物。在另一个方面，本发明提供了包括以下的方法：与另一种药剂(例如PD-1抑制剂，如本文所述的PD-1抑制剂)组合给予细胞群，其中该群中的至少一种细胞表达具有如本文所述抗CD19结合结构域的CAR，且第二细胞表达另一种药剂(例如增强表达CAR的细胞活性或适合性的药剂)。
PD-1抑制剂
免疫系统具有识别和消除肿瘤细胞的能力；然而，肿瘤可以使用多种策略来逃避免疫力。阻断免疫检查点是用于活化或重新活化治疗性抗肿瘤免疫的方法。PD-1是示例性免疫检查点分子。
PD-1是CD28/CTLA-4家族成员，其在例如活化的CD4+和CD8+ T细胞、Tregs、和B细胞上表达。参见例如，Agata等人1996Int.Immunol[国际免疫学]8:765-75。PD-1是还包括CD28、CTLA-4、ICOS、和BTLA的CD28受体家族的抑制性成员。PD-1负调节效应T细胞信号传导和功能。PD-1在肿瘤浸润性T细胞上被诱导，并且可以导致功能性衰竭或功能障碍(Keir等人(2008)Annu.Rev.Immunol.[免疫学年评]26:677-704；Pardoll等人(2012)Nat RevCancer[癌症自然评论]12(4):252-64)。PD-1在与其两种配体(程序性死亡-配体1(PD-L1)或程序性死亡-配体2(PD-L2))之一结合时递送共抑制信号。PD-L1和PD-L2已证明在与PD-1结合后下调T细胞活化(Freeman等人2000J Exp Med[实验医学杂志]192:1027-34；Latchman等人2001Nat Immunol[自然免疫学]2:261-8；Carter等人2002Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]32:634-43)。PD-L1在许多细胞类型(包括T细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、B细胞、上皮细胞、血管内皮细胞)以及许多类型的肿瘤上表达。PD-L1在人癌症中很丰富(Dong等人2003J Mol Med[分子医学杂志]81:281-7；Blank等人2005Cancer Immunol.Immunother[癌症免疫学免疫疗法]54:307-314；Konishi等人2004Clin Cancer Res[临床癌症研究]10:5094)，并且PD-L1在鼠和人肿瘤中的高表达与多种癌症的不良临床结果有关(Keir等人(2008)Annu.Rev.Immunol.[免疫学年评]26:677-704；Pardoll等人(2012)Nat Rev Cancer[癌症自然评论]12(4):252-64)。PD-L2在树突细胞、巨噬细胞和一些肿瘤上表达。已经针对癌症免疫疗法在临床前和临床上验证了阻断PD-1途径。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。临床前和临床研究都证明，抗PD-1阻断可以恢复效应T细胞的活性，并产生强大的抗肿瘤反应。例如，阻断PD-1途径可以恢复衰竭/功能失调的效应T细胞功能(例如，增殖、IFN-γ分泌或细胞溶解功能)和/或抑制Treg细胞功能(Keir等人(2008)Annu.Rev.Immunol.[免疫学年评]26:677-704；Pardoll等人(2012)Nat Rev Cancer[癌症自然评论]12(4):252-64)。PD-1途径的阻断可以用抗体，其抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，或PD-1、PD-L1和/或PD-L2的寡肽实现。
针对PD-1的抗体分子
在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体分子，如题为“PD-1的抗体分子及其用途”的2015年7月30日公布的US 2015/0210769中所述，该文献通过引用以其全文并入。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子(例如，分离的或重组的抗体分子)具有以下特性中的一种或多种：
(i)以高亲和力，例如以至少约107M-1、典型地约108M-1、并且更典型地约109M-1至1010M-1或更强的亲和力常数结合PD-1(例如人PD-1)；
(ii)基本上不结合CD28、CTLA-4、ICOS或BTLA；
(iii)抑制或降低PD-1与PD-1配体(例如PD-L1或PD-L2或两者)的结合；
(iv)特异性结合PD-1上的表位，例如与由鼠单克隆抗体BAP049或嵌合抗体BAP049(例如BAP049-chi或BAP049-chi-Y)识别的表位相同或相似的表位；
(v)显示与以下中的任一个相同或相似的结合亲和力或特异性或两者：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；
(vi)显示与描述于表6中的抗体分子(例如重链可变区和轻链可变区)相同或相似的结合亲和力或特异性或两者；
(vii)显示与具有表6中所示氨基酸序列的抗体分子(例如重链可变区和轻链可变区)相同或相似的结合亲和力或特异性或两者；
(viii)显示与由具有表6中所示核苷酸序列编码的抗体分子(例如重链可变区和轻链可变区)相同或相似的结合亲和力或特异性或两者；
(ix)抑制(例如竞争性抑制)第二抗体分子与PD-1的结合，其中第二抗体分子是本文所述的抗体分子，例如选自例如以下中的任一个的抗体分子：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；
(x)与第二抗体分子结合PD-1的相同或重叠表位，其中第二抗体分子是本文所述的抗体分子，例如选自例如以下中的任一个的抗体分子：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；
(xi)与第二抗体分子竞争结合和/或结合PD-1的相同表位，其中第二抗体分子是本文所述的抗体分子，例如选自例如以下中的任一个的抗体分子：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；
(xii)具有本文所述抗体分子的一种或多种生物学特性，例如选自例如以下中的任一个的抗体分子：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；
(xiii)具有本文所述抗体分子的一种或多种药代动力学特性，例如选自例如以下中的任一个的抗体分子：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；
(xiv)抑制PD-1的一种或多种活性，例如导致以下中的一种或多种：增加肿瘤浸润淋巴细胞、增加T细胞受体介导的增殖、或减少癌细胞免疫逃避；
(xv)结合人PD-1并与食蟹猴PD-1交叉反应；
(xvi)结合PD-1的C链、CC'环、C'链、或FG环内的一个或多个残基，或者PD-1的C链、CC'环、C'链、或FG环中的两个、三个或全部的组合，例如其中该结合使用ELISA或Biacore测定；或
(xvii)具有与VH区相比，对PD-1的结合贡献更多的VL区。
在一些实施例中，该抗体分子以高亲和力结合PD-1，例如具有与鼠或嵌合抗PD-1抗体分子(例如本文所述的鼠或嵌合抗PD-1抗体分子)的KD相比大约相同，或至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％更高或更低的KD。在一些实施例中，鼠或嵌合抗PD-1抗体分子的KD小于约0.4、0.3、0.2、0.1、或0.05nM，例如通过Biacore方法测量。在一些实施例中，鼠或嵌合抗PD-1抗体分子的KD小于约0.2nM，例如约0.135nM。在其他实施例中，鼠或嵌合抗PD-1抗体分子的KD小于约10、5、3、2、或1nM，例如通过表达PD-1的细胞(例如300.19细胞)上的结合测量。在一些实施例中，鼠或嵌合抗PD-1抗体分子的KD小于约5nM，例如约4.60nM(或约0.69μg/mL)。
在一些实施例中，该抗PD-1抗体分子以慢于1×10-4、5×10-5、或1×10-5s-1(例如约1.65×10-5s-1)的Koff结合PD-1。在一些实施例中，该抗PD-1抗体分子以快于1×104、5×104、1×105、或5×105M-1s-1(例如约1.23×105M-1s-1)的Kon结合PD-1。
在一些实施例中，该抗体分子的表达水平高于，例如至少约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍高于鼠或嵌合抗体分子(例如本文所述的鼠或嵌合抗PD-1抗体分子)的表达水平。在一些实施例中，该抗体分子在CHO细胞中表达。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子以与鼠或嵌合抗PD-1抗体分子(例如本文所述的鼠或嵌合抗PD-1抗体分子)的IC50相比大约相同或更低，例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％更低的IC50(50％抑制时的浓度)降低一种或多种PD-1相关活性。在一些实施例中，鼠或嵌合抗PD-1抗体分子的IC50小于约6、5、4、3、2、或1nM，例如通过表达PD-1的细胞(例如300.19细胞)上的结合测量。在一些实施例中，鼠或嵌合抗PD-1抗体分子的IC50小于约4nM，例如约3.40nM(或约0.51μg/mL)。在一些实施例中，降低的PD-1相关活性是PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合。在一些实施例中，抗PD-1抗体分子结合由葡萄球菌肠毒素B(SEB)活化的外周血单核细胞(PBMC)。在其他实施例中，抗PD-1抗体分子增加由SEB活化的全血上IL-2的表达。例如，与使用同种型对照(例如IgG4)时的IL-2的表达相比，抗PD-1抗体使IL-2的表达增加至少约2、3、4、或5倍。
在一些实施例中，与鼠或嵌合抗PD-1抗体分子(例如本文所述的鼠或嵌合抗PD-1抗体分子)相比，抗PD-1抗体分子在体内或体外具有改善的稳定性，例如至少约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍更稳定。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是人源化抗体分子，并且具有基于T细胞表位分析为300至700、400至650、450至600的风险评分，或如本文所述的风险评分。
在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含至少一个抗原结合区(例如可变区或其抗原结合片段)，该抗原结合区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含至少一个、两个、三个或四个可变区，这些可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含至少一个或两个重链可变区，这些重链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含至少一个或两个轻链可变区，这些轻链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括IgG4(例如人IgG4)的重链恒定区。在一个实施例中，人IgG4包括根据EU编号的位置228处的取代(例如Ser至Pro取代)。在仍另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括IgG1(例如人IgG1)的重链恒定区。在一个实施例中，人IgG1包括根据EU编号的位置297处的取代(例如Asn至Ala取代)。在一个实施例中，人IgG1包括根据EU编号的位置265处的取代、根据EU编号的位置329处的取代或两者(例如，位置265处的Asp至Ala取代和/或位置329处的Pro至Ala取代)。在一个实施例中，人IgG1包括根据EU编号的位置234处的取代、根据EU编号的位置235处的取代或两者(例如，位置234处的Leu至Ala取代和/或位置235处的Leu至Ala取代)。在一个实施例中，重链恒定区包含表3中列出的氨基序列，或与其基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括κ轻链恒定区，例如人κ轻链恒定区。在一个实施例中，轻链恒定区包含US 2015/0210769 A1的表3中列出的氨基序列，或与其基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括IgG4(例如人IgG4)的重链恒定区，和κ轻链恒定区(例如人κ轻链恒定区)，例如包含US 2015/0210769 A1的表3中列出的氨基序列，或与其基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列的重链和轻链恒定区。在一个实施例中，人IgG4包括根据EU编号的位置228处的取代(例如Ser至Pro取代)。在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括IgG1(例如人IgG1)的重链恒定区，和κ轻链恒定区(例如人κ轻链恒定区)，例如包含US 2015/0210769 A1的表3中列出的氨基序列，或与其基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列的重链和轻链恒定区。在一个实施例中，人IgG1包括根据EU编号的位置297处的取代(例如Asn至Ala取代)。在一个实施例中，人IgG1包括根据EU编号的位置265处的取代、根据EU编号的位置329处的取代或两者(例如，位置265处的Asp至Ala取代和/或位置329处的Pro至Ala取代)。在一个实施例中，人IgG1包括根据EU编号的位置234处的取代、根据EU编号的位置235处的取代或两者(例如，位置234处的Leu至Ala取代和/或位置235处的Leu至Ala取代)。
在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括重链可变结构域和恒定区、轻链可变结构域和恒定区或两者，其包含BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E的氨基酸序列；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。抗PD-1抗体分子任选地包含前导序列，该前导序列来自如US2015/0210769 A1的表4中所示的重链、轻链或两者；或与其基本上相同的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自重链可变区的至少一个、两个、或三个互补决定区(CDR)，该重链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自重链可变区的至少一个、两个、或三个CDR(或总体上全部CDR)，该重链可变区包含表6中所示的氨基酸序列，或由表6中所示的核苷酸序列编码。在一个实施例中，相对于表6中所示的氨基酸序列，或由表6中所示的核苷酸序列编码，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自轻链可变区的至少一个、两个、或三个CDR，该轻链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自轻链可变区的至少一个、两个、或三个CDR(或总体上全部CDR)，该轻链可变区包含表6中所示的氨基酸序列，或由表6中所示的核苷酸序列编码。在一个实施例中，相对于表6中所示的氨基酸序列，或由表6中所示的核苷酸序列编码，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施例中，抗PD-1抗体分子包括轻链CDR中的取代，例如轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。在一个实施例中，根据表6(例如鼠或嵌合、未修饰序列的SEQ ID NO:152或162；或修饰序列的SEQ ID NO:168、176、180、188、192、196、200、204、208、或212中的任一个)，抗PD-1抗体分子在轻可变区的位置102处包括轻链CDR3中的取代(例如，将半胱氨酸取代为酪氨酸)，或在轻可变区的位置102处将半胱氨酸取代为丝氨酸残基。
在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区包含表6中所示的氨基酸序列，或由表6中所示的核苷酸序列编码。在一个实施例中，相对于表6中所示的氨基酸序列，或由表6中所示的核苷酸序列编码，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代或缺失。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括全部六个CDR，这些CDR来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者密切相关的CDR，例如相同或具有至少一个氨基酸改变，但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的CDR。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子可以包括本文所述的任何CDR。在某些实施例中，抗PD-1抗体分子包括轻链CDR中的取代，例如轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。在一个实施例中，根据表6(例如鼠或嵌合、未修饰序列的SEQ ID NO:152或162；或修饰序列的SEQ ID NO:168、176、180、188、192、196、200、204、208、或212中的任一个)，抗PD-1抗体分子在轻可变区的位置102处包括轻链CDR3中的取代(例如，将半胱氨酸取代为酪氨酸)，或在轻可变区的位置102处将半胱氨酸取代为丝氨酸残基。
在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自重链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个、或三个CDR(例如如表6中列出的根据Kabat定义的至少一个、两个、或三个CDR)，该重链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列；或者相对于表6中所示根据Kabat等人的一个、两个、或三个CDR具有至少一个氨基酸改变但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的序列。
在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自轻链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个、或三个CDR(例如如表6中列出的根据Kabat定义的至少一个、两个、或三个CDR)，该轻链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列；或者相对于表6中所示根据Kabat等人的一个、两个、或三个CDR具有至少一个氨基酸改变但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自重链和轻链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个、三个、四个、五个、或六个CDR(例如如表6中列出的根据Kabat定义的至少一个、两个、三个、四个、五个、或六个CDR)，该重链和轻链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列；或者相对于表6中所示根据Kabat等人的一个、两个、三个、四个、五个、或六个CDR具有至少一个氨基酸改变但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自重链和轻链可变区的根据Kabat等人的全部六个CDR(例如如表6中列出的根据Kabat定义的全部六个CDR)，该重链和轻链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列；或者相对于表6中所示根据Kabat等人的全部六个CDR具有至少一个氨基酸改变但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的序列。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子可以包括本文所述的任何CDR。
在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自重链可变区的至少一个、两个、或三个Chothia高变环(例如如表6中列出的根据Chothia定义的至少一个、两个、或三个高变环)，该重链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或至少来自接触PD-1的那些高变环的氨基酸；或者相对于表6中所示根据Chothia等人的一个、两个、或三个高变环具有至少一个氨基酸改变但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的序列。
在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自轻链可变区的至少一个、两个、或三个Chothia高变环(例如如表6中列出的根据Chothia定义的至少一个、两个、或三个高变环)，该轻链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或至少来自接触PD-1的那些高变环的氨基酸；或者相对于表6中所示根据Chothia等人的一个、两个、或三个高变环具有至少一个氨基酸改变但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的序列。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个、或六个高变环(例如如表6中列出的根据Chothia定义的至少一个、两个、三个、四个、五个、或六个高变环)，该重链和轻链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或至少来自接触PD-1的那些高变环的氨基酸；或者相对于表6中所示根据Chothia等人的一个、两个、三个、四个、五个或六个高变环具有至少一个氨基酸改变但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括全部六个高变环(例如如表6中列出的根据Chothia定义的全部六个高变环)，这些高变环来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E，或密切相关的高变环，例如相同或具有至少一个氨基酸改变但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的高变环；或者相对于表6中所示根据Chothia等人的全部六个高变环具有至少一个氨基酸改变但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的高变环。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子可以包括本文所述的任何高变环。
在仍另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括至少一个、两个、或三个高变环，这些高变环具有与本文所述抗体(例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E)的相应高变环相同的规范结构，例如与本文所述抗体的重链和/或轻链可变结构域的至少环1和/或环2相同的规范结构。关于高变环规范结构的描述参见例如，Chothia等人,(1992)J.Mol.Biol.[分子生物学期刊]227:799-817；Tomlinson等人,(1992)J.Mol.Biol.[分子生物学期刊]227:776-798。这些结构可以通过检查描述于这些参考文献中的表来确定。
在某些实施例中，抗PD-1抗体分子包括根据Kabat等人和Chothia等人定义的CDR或高变环的组合。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自重链可变区的根据Kabat和Chothia定义的至少一个、两个或三个CDR或高变环(例如如表6中列出的根据Kabat和Chothia定义的至少一个、两个、或三个CDR或高变环)，该重链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列；或者相对于表6中所示根据Kabat和/或Chothia的一个、两个、或三个CDR或高变环具有至少一个氨基酸改变但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的序列。
例如，该抗PD-1抗体分子可以包括根据Kabat等人的VH CDR1、或根据Chothia等人的VH高变环1、或其组合，例如如表6中所示。在一个实施例中，VH CDR1的Kabat和ChothiaCDR的组合包含氨基酸序列GYTFTTYWMH(SEQ ID NO:286)，或与其基本相同的氨基酸序列(例如，具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，取代、缺失或插入，例如保守取代))。该抗PD-1抗体分子可以进一步包括例如根据Kabat等人的VH CDR 2-3和根据Kabat等人的VL CDR 1-3，例如如表6中所示。因此，在一些实施例中，框架区基于根据Kabat等人定义的CDR和根据Chothia等人定义的高变环的组合来定义。例如，该抗PD-1抗体分子可以包括基于根据Chothia等人的VH高变环1定义的VH FR1和基于根据Kabat等人的VH CDR 1-2定义的VH FR2，例如如表6中所示。该抗PD-1抗体分子可以进一步包括例如基于根据Kabat等人的VH CDR 2-3定义的VH FR 3-4和基于根据Kabat等人的VL CDR 1-3定义的VL FR 1-4。
抗PD-1抗体分子可以含有根据Kabat和Chothia定义的CDR或高变环的任何组合。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自轻链可变区的根据Kabat和Chothia定义的至少一个、两个或三个CDR(例如如表6中列出的根据Kabat和Chothia定义的至少一个、两个、或三个CDR)，该轻链可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E。
在一个实施例(例如包含可变区、CDR(例如Chothia CDR或Kabat CDR)、或本文例如在表6中提及的其他序列的实施例)中，该抗体分子是单特异性抗体分子、双特异性抗体分子、或包含抗体的抗原结合片段(例如半抗体或半抗体的抗原结合片段)的抗体分子。在某些实施例中，该抗体分子是对PD-1具有第一结合特异性，并且对TIM-3、LAG-3、CEACAM(例如CEACAM-1和/或CEACAM-5)、PD-L1或PD-L2具有第二结合特异性的双特异性抗体分子。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括：
(a)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:140的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:141的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:149的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:150的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:167的VLCDR3氨基酸序列；
(b)VH，该VH包含选自SEQ ID NO:137的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:138的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:146的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:166的VLCDR3氨基酸序列；
(c)VH，该VH包含SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:141的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:149的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:150的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:167的VLCDR3氨基酸序列；或
(d)VH，该VH包含SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:138的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:146的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:166的VLCDR3氨基酸序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含VH，该VH包含SEQ ID NO:140的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:141的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:149的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:150的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:167的VLCDR3氨基酸序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含VH，该VH包含SEQ ID NO:137的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:138的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:146的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:166的VLCDR3氨基酸序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含VH，该VH包含SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:141的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:149的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:150的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:167的VLCDR3氨基酸序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含VH，该VH包含SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:138的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:146的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:166的VLCDR3氨基酸序列。
在一个实施例中，抗体分子是人源化抗体分子。在另一个实施例中，抗体分子是单特异性抗体分子。在又另一个实施例中，抗体分子是双特异性抗体分子。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括：
(i)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包括选自SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:140或SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:138的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ IDNO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及
(ii)轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:146的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:166的VLCDR3氨基酸序列。
在另一个实施例中，该抗PD-1抗体分子包括：
(i)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包括选自SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:140或SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:141的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ IDNO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及
(ii)轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:149的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:150的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:167的VLCDR3氨基酸序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含SEQ ID NO:137的VHCDR1氨基酸序列。在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含SEQ ID NO:140的VHCDR1氨基酸序列。在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子的轻链或重链可变框架(例如至少包含FR1、FR2、FR3和任选FR4的区域)可以选自：(a)包括来自人轻链或重链可变框架的氨基酸残基(例如来自人成熟抗体、人种系序列、或人共有序列的轻链或重链可变框架残基)的至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％、或优选100％的轻链或重链可变框架；(b)包括来自人轻链或重链可变框架的氨基酸残基(例如来自人成熟抗体、人种系序列、或人共有序列的轻链或重链可变框架残基)的从20％至80％、40％至60％、60％至90％、或70％至95％的轻链或重链可变框架；(c)非人框架(例如啮齿动物框架)；或(d)已修饰例如以除去抗原性或细胞毒性决定簇(例如去免疫化或部分人源化)的非人框架。在一个实施例中，轻链或重链可变框架区(特别是FR1、FR2和/或FR3)包括与人种系基因的VL或VH区段的框架至少70％、75％、80％、85％、87％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同或相同的轻链或重链可变框架序列。
在某些实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链可变结构域，该重链可变结构域从BAP049-chi-HC的氨基酸序列(例如，例如US 2015/0210769A1的图9A-9B或SEQ ID NO:154、156、158或160中所示的整个可变区中FR区的氨基酸序列)具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、十五个、二十个或更多个变化(例如氨基酸取代或缺失)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链可变结构域，该重链可变结构域具有以下中的一个或多个：BAP049-chi-HC的氨基酸序列(例如，例如US 2015/0210769 A1的图9A-9B或SEQ ID NO:154、156、158或160中所示的整个可变区中FR的氨基酸序列)的位置1处的E、位置5处的V、位置9处的A、位置11处的V、位置12处的K、位置13处的K、位置16处的E、位置18处的L、位置19处的R、位置20处的I或V、位置24处的G、位置37处的I、位置40处的A或S、位置41处的T、位置42处的S、位置43处的R、位置48处的M或L、位置68处的V或F、位置69处的T、位置70处的I、位置71处的S、位置72处的A或R、位置74处的K或N、位置76处的T或K、位置77处的S或N、位置79处的L、位置81处的L、位置82处的E或Q、位置83处的M、位置84处的S或N、位置87处的R、位置88处的A、或位置91处的T。
可替代地，或与本文所述的BAP049-chi-HC的重链取代组合，抗PD-1抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域从BAP049-chi-LC的氨基酸序列(例如，US 2015/0210769 A1的图10A-10B或SEQ ID NO:162或164中所示的氨基酸序列)具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、十五个、二十个或更多个氨基酸变化(例如氨基酸取代或缺失)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链可变结构域，该重链可变结构域具有以下中的一个或多个：BAP049-chi-LC的氨基酸序列(例如，US 2015/0210769 A1的图10A-10B或SEQ ID NO:162或164中所示的氨基酸序列)的位置1处的E、位置2处的V、位置3处的Q、位置4处的L、位置7处的T、位置9处的D或L或A、位置10处的F或T、位置11处的Q、位置12处的S或P、位置13处的L或A、位置14处的S、位置15处的P或L或V、位置16处的K、位置17处的Q或D、位置18处的R、位置19处的A、位置20处的S、位置21处的I或L、位置22处的T、位置43处的L、位置48处的K、位置49处的A或S、位置51处的R或Q、位置55处的Y、位置64处的I、位置66处的S或P、位置69处的S、位置73处的Y、位置74处的G、位置76处的E、位置79处的F、位置82处的N、位置83处的N、位置84处的L或I、位置85处的E、位置86处的S或P、位置87处的D、位置89处的A或F或I、位置91处的T或Y、位置93处的F、或位置102处的Y。
在其他实施例中，抗PD-1抗体分子包括一个、两个、三个、或四个重链框架区(例如US 2015/0210769 A1的表2中所示，或由US 2015/0210769 A1的表2中所示的核苷酸序列编码的VHFW氨基酸序列)、或与其基本上相同的序列。
在又其他实施例中，抗PD-1抗体分子包括一个、两个、三个、或四个轻链框架区(例如US 2015/0210769 A1的表2中所示，或由US 2015/0210769 A1的表2中所示的核苷酸序列编码的VLFW氨基酸序列)、或与其基本上相同的序列。
在其他实施例中，抗PD-1抗体分子包括一个、两个、三个、或四个重链框架区(例如US 2015/0210769 A1的表2中所示，或由US 2015/0210769 A1的表2中所示的核苷酸序列编码的VHFW氨基酸序列)、或与其基本上相同的序列；和一个、两个、三个、或四个轻链框架区(例如US 2015/0210769 A1的表2中所示，或由US 2015/0210769 A1的表2中所示的核苷酸序列编码的VLFW氨基酸序列)、或与其基本上相同的序列。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E的重链框架区1(VHFW1)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147)。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum14或BAP049-hum15的重链框架区1(VHFW1)(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:151)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum09、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、或BAP049-克隆-E的重链框架区2(VHFW2)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:153)。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum08、BAP049-hum10、BAP049-hum14、BAP049-hum15、或BAP049-克隆-D的重链框架区2(VHFW2)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:157)。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum16的重链框架区2(VHFW2)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:160)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum09、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、或BAP049-克隆-E的重链框架区3(VHFW3)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:162)。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum08、BAP049-hum10、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、或BAP049-克隆-D的重链框架区3(VHFW3)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:166)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E的重链框架区4(VHFW4)(例如US 2015/0210769 A1的SEQID NO:169)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum15、BAP049-hum16、或BAP049-克隆-C的轻链框架区1(VLFW1)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:174)。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum01、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum07、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum14、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E的轻链框架区1(VLFW1)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:177)。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum06的轻链框架区1(VLFW1)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:181)。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum13的轻链框架区1(VLFW1)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:183)。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum02、BAP049-hum03、或BAP049-hum12的轻链框架区1(VLFW1)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:185)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum06、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-D、or BAP049-克隆-E的轻链框架区2(VLFW2)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:187)。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum07、BAP049-hum13、或BAP049-克隆-C的轻链框架区2(VLFW2)(例如US 2015/0210769 A1的SEQID NO:191)。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum12的轻链框架区2(VLFW2)(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:194)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E的轻链框架区3(VLFW3)(例如US 2015/0210769A1的SEQ ID NO:196)。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum02或BAP049-hum03的轻链框架区3(VLFW3)(例如US 2015/0210769A1的SEQ ID NO:200)。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum01或BAP049-克隆-A的轻链框架区3(VLFW3)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:202)。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum04、BAP049-hum05、或BAP049-克隆-B的轻链框架区3(VLFW3)(例如US 2015/0210769A1的SEQ ID NO:205)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E的轻链框架区4(VLFW4)(例如US 2015/0210769 A1的SEQID NO:208)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP-hum07、BAP049-hum09、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、或BAP049-克隆-E的重链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:153(VHFW2)、和SEQ IDNO:162(VHFW3))。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum08、BAP049-hum10、或BAP049-克隆-D的重链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:157(VHFW2)、和SEQ ID NO:166(VHFW3))。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum14或BAP049-hum15的重链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:151(VHFW1)、SEQ ID NO:157(VHFW2)、和SEQ ID NO:166(VHFW3))。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum16的重链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ IDNO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:160(VHFW2)、和SEQ ID NO:166(VHFW3))。在一些实施例中，抗体分子进一步包含BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E的重链框架区4(VHFW4)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:169)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum01或BAP049-克隆-A的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:177(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:202(VLFW3))。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum02或BAP049-hum03的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:185(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:200(VLFW3))。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum04、BAP049-hum05、或BAP049-克隆-B的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ IDNO:177(VLFW1)、SEQ ID NO:191(VLFW2)、和SEQ ID NO:205(VLFW3))。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum06的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:181(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum07的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:177(VLFW1)、SEQ ID NO:191(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum15、BAP049-hum16、或BAP049-克隆-C的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:174(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQID NO:196(VLFW3))。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum14、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769A1的SEQ ID NO:177(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum12的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769A1的SEQID NO:185(VLFW1)、SEQ ID NO:194(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。在一些实施例中，抗体分子包含BAP049-hum13的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:183(VLFW1)、SEQ ID NO:191(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。在一些实施例中，抗体分子进一步包含BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E的轻链框架区4(VLFW4)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:208)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum01或BAP049-克隆-A的重链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:153(VHFW2)、和SEQ ID NO:162(VHFW3))和BAP049-hum01或BAP049-克隆-A的轻链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:177(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:202(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum02的重链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:153(VHFW2)、和SEQ ID NO:162(VHFW3))和BAP049-hum02的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:185(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:200(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum03的重链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:157(VHFW2)、和SEQ ID NO:166(VHFW3))和BAP049-hum03的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:185(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:200(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum04的重链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:157(VHFW2)、和SEQ ID NO:166(VHFW3))和BAP049-hum04的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:177(VLFW1)、SEQ ID NO:191(VLFW2)、和SEQ ID NO:205(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum05或BAP049-克隆-B的重链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:153(VHFW2)、和SEQ ID NO:162(VHFW3))和BAP049-hum05或BAP049-克隆-B的轻链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:177(VLFW1)、SEQ ID NO:191(VLFW2)、和SEQ ID NO:205(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum06的重链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:153(VHFW2)、和SEQ ID NO:162(VHFW3))和BAP049-hum06的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:181(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum07的重链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:153(VHFW2)、和SEQ ID NO:162(VHFW3))和BAP049-hum07的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:177(VLFW1)、SEQ ID NO:191(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum08的重链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:157(VHFW2)、和SEQ ID NO:166(VHFW3))和BAP049-hum08的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:174(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum09或BAP049-克隆-C的重链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:153(VHFW2)、和SEQ ID NO:162(VHFW3))和BAP049-hum09或BAP049-克隆-C的轻链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:174(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum10或BAP049-克隆-D的重链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:157(VHFW2)、和SEQ ID NO:166(VHFW3))和BAP049-hum10或BAP049-克隆-D的轻链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:177(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum11或BAP049-克隆-E的重链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:153(VHFW2)、和SEQ ID NO:162(VHFW3))和BAP049-hum11或BAP049-克隆-E的轻链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:177(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum12的重链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:153(VHFW2)、和SEQ ID NO:162(VHFW3))和BAP049-hum12的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:185(VLFW1)、SEQ ID NO:194(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum13的重链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:153(VHFW2)、和SEQ ID NO:162(VHFW3))和BAP049-hum13的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:183(VLFW1)、SEQ ID NO:191(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum14的重链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:151(VHFW1)、SEQ ID NO:157(VHFW2)、和SEQ ID NO:166(VHFW3))和BAP049-hum14的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:177(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum15的重链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:151(VHFW1)、SEQ ID NO:157(VHFW2)、和SEQ ID NO:166(VHFW3))和BAP049-hum15的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:174(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含BAP049-hum16的重链框架区1-3(例如US2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147(VHFW1)、SEQ ID NO:160(VHFW2)、和SEQ ID NO:166(VHFW3))和BAP049-hum16的轻链框架区1-3(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:174(VLFW1)、SEQ ID NO:187(VLFW2)、和SEQ ID NO:196(VLFW3))。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子进一步包含BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E的重链框架区4(VHFW4)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:169)和BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E的轻链框架区4(VLFW4)(例如US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:208)。
在一些实施例中，抗PD-1抗体分子包含重链框架区，该重链框架区具有如US2015/0210769 A1的图5或图7中所示的框架区FW1、FW2和FW3的组合。在其他实施例中，该抗体分子包含轻链框架区，该轻链框架区具有如US 2015/0210769 A1的图5或图7中所示的框架区FW1、FW2和FW3的组合。在又其他实施例中，该抗体分子包含重链框架区和轻链框架区，该重链框架区具有如US 2015/0210769 A1的图5或图7中所示的框架区FW1、FW2和FW3的组合，并且该轻链框架区具有如US 2015/0210769 A1的图5或图7中所示的框架区FW1、FW2和FW3的组合。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子的重链或轻链可变结构域或两者包括氨基酸序列，该氨基酸序列与本文披露的氨基酸基本上相同，例如与本文所述抗体(例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E)的可变区至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同；或者如表6所述，或者由表6中的核苷酸序列编码；或者与本文所述抗体的可变区相差至少1或5个残基，但少于40、30、20、或10个残基。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子的重链或轻链可变区或两者包括由本文所述的核酸序列或例如在低严格性、中等严格性、或高严格性、或本文所述的其他杂交条件下与本文所述核酸序列(例如，如US 2015/0210769 A1的表1和表2、或本文表6中所示的核酸序列)或其补体杂交的核酸编码的氨基酸序列。
在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含至少一个、两个、三个、或四个抗原结合区，例如具有如表6中列出的氨基酸序列、或与其基本上相同的序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更高相同，或与表6中所示序列相差不多于1、2、5、10、或15个氨基酸残基的序列)的可变区。在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括VH和/或VL结构域，该VH和/或VL结构域由具有如表6中列出的核苷酸序列、或与其基本上相同的序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更高相同，或与表6中所示序列相差不多于3、6、15、30、或45个核苷酸的序列)的核酸编码。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个、或三个CDR，该重链可变区具有如表6中列出的氨基酸序列、或与其基本上同源的序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更高相同，和/或具有一个、两个、三个或更多个取代、插入或缺失(例如保守取代)的序列)。在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个、或三个CDR，该轻链可变区具有如表6中列出的氨基酸序列、或与其基本上同源的序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更高相同，和/或具有一个、两个、三个或更多个取代、插入或缺失(例如保守取代)的序列)。在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR，这些重链和轻链可变区具有如表6中列出的氨基酸序列、或与其基本上同源的序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更高相同，和/或具有一个、两个、三个或更多个取代、插入或缺失(例如保守取代)的序列)。
在一个实施例中，如表6所概述，抗PD-1抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个、或三个CDR和/或高变环，该重链可变区具有本文所述抗体(例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E)的氨基酸序列，或与其基本上相同的序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更高相同的序列，和/或具有一个、两个、三个或更多个取代、插入或缺失(例如保守取代)的序列)。在另一个实施例中，如表6所概述，抗PD-1抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个、或三个CDR和/或高变环，该轻链可变区具有本文所述抗体(例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E)的氨基酸序列，或与其基本上相同的序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更高相同的序列，和/或具有一个、两个、三个或更多个取代、插入或缺失(例如保守取代)的序列)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含本文所述(例如表6中所述)的全部六个CDR和/或高变环。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子具有可变区，该可变区与本文所述的可变区(例如本文披露的FR区)在序列上相同，或相差1、2、3、或4个氨基酸。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是完全抗体或其片段(例如Fab、F(ab')2、Fv、或单链Fv片段(scFv))。在某些实施例中，抗PD-1抗体分子是单克隆抗体或具有单一特异性的抗体。抗PD-1抗体分子还可以是人源化、嵌合、骆驼科动物、鲨鱼、或体外产生的抗体分子。在一个实施例中，其抗PD-1抗体分子是人源化抗体分子。抗PD-1抗体分子的重链和轻链可以是全长的(例如，抗体可以包括至少一个且优选两个完整重链，和至少一个且优选两个完整轻链)，或者可以包括抗原结合片段(例如Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv片段、单结构域抗体、双抗体(dAb)、二价抗体、或双特异性抗体或其片段、其单结构域变体、或骆驼科动物抗体)。
在又其他实施例中，抗PD-1抗体分子具有重链恒定区(Fc)，该重链恒定区(Fc)选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、和IgE的重链恒定区；具体地，选自例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4的重链恒定区，更具体地，选自IgG1或IgG2(例如人IgG1、IgG2或IgG4)的重链恒定区。在一个实施例中，重链恒定区是人IgG1。在另一个实施例中，抗PD-1抗体分子具有轻链恒定区，该轻链恒定区选自例如κ或λ，优选κ(例如人κ)的轻链恒定区。在一个实施例中，改变(例如突变)恒定区以修饰抗PD-1抗体分子的特性(例如，以增加或减少以下中的一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能、或补体功能)。例如，在位置296(M至Y)、298(S至T)、300(T至E)、477(H至K)和478(N至F)处突变恒定区以改变Fc受体结合(例如，突变位置对应于SEQ ID NO:212或214的位置132(M至Y)、134(S至T)、136(T至E)、313(H至K)和314(N至F)；或SEQ ID NO:215、216、217或218的位置135(M至Y)、137(S至T)、139(T至E)、316(H至K)和317(N至F)。在另一个实施例中，在例如如US 2015/0210769 A1的表3中所示根据EU编号的位置228处突变IgG4(例如人IgG4)的重链恒定区(例如S至P)。在某些实施例中，抗PD-1抗体分子包含在例如如US 2015/0210769 A1的表3中所示根据EU编号的位置228处突变的人IgG4(例如S至P)；和例如如US 2015/0210769 A1的表3中所示的κ轻链恒定区。在仍另一个实施例中，在例如如US 2015/0210769 A1的表3中所示根据EU编号的位置297(例如N至A)、根据EU编号的位置265(例如D至A)、根据EU编号的位置329(例如P至A)、根据EU编号的位置234(例如L至A)、或根据EU编号的位置235(例如L至A)中的一个或多个处突变IgG1(例如人IgG1)的重链恒定区。在某些实施例中，抗PD-1抗体分子包含在例如如US 2015/0210769 A1的表3中所示前述位置中的一个或多个处突变的人IgG1；和例如如US 2015/0210769 A1的表3中所示的κ轻链恒定区。
在一个实施例中，分离或重组抗PD-1抗体分子。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是人源化抗体分子。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子具有基于T细胞表位分析为小于700、600、500、400或更少的风险评分。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是人源化抗体分子，并且具有基于T细胞表位分析为300至700、400至650、450至600的风险评分，或如本文所述的风险评分。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括：
(a)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含SEQ ID NO:140的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:141的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:149的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:150的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:167的VLCDR3氨基酸序列；
(b)VH，该VH包含选自SEQ ID NO:137的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:138的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:146的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:166的VLCDR3氨基酸序列；
(c)VH，该VH包含SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:141的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:149的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:150的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:167的VLCDR3氨基酸序列；或
(d)VH，该VH包含SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:138的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及VL，该VL包含SEQ ID NO:146的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:166的VLCDR3氨基酸序列。
在某些实施例中，该抗PD-1抗体分子包含：
(i)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含选自SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:140或SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:138的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ IDNO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及
(ii)轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:146的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:166的VLCDR3氨基酸序列。
在其他实施例中，该抗PD-1抗体分子包含：
(i)重链可变区(VH)，该重链可变区(VH)包含选自SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:140或SEQ ID NO:286的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:141的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ IDNO:139的VHCDR3氨基酸序列；以及
(ii)轻链可变区(VL)，该轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:149的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:150的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:167的VLCDR3氨基酸序列。
在前述抗体分子的实施例中，该VHCDR1包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列。在其他实施例中，该VHCDR1包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列。在又其他实施例中，该VHCDR1包含SEQ ID NO:286的氨基酸序列。
在实施例中，前述抗体分子具有包含至少一个框架(FW)区的重链可变区，该框架区包含US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147、151、153、157、160、162、166、或169中任一项的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列，或者与US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147、151、153、157、160、162、166、或169中任一项的氨基酸序列相比具有不超过两个氨基酸取代、插入或缺失。
在其他实施例中，前述抗体分子具有包含至少一个框架区的重链可变区，该框架区包含US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147、151、153、157、160、162、166、或169中任一项的氨基酸序列。
在又其他实施例中，前述抗体分子具有包含至少两个、三个、或四个框架区的重链可变区，这些框架区包含US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147、151、153、157、160、162、166、或169中任一项的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:147或151的VHFW1氨基酸序列，US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:153、157、或160的VHFW2氨基酸序列，和US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:162或166的VHFW3氨基酸序列，并且任选地，进一步包含US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:169的VHFW4氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子具有包含至少一个框架区的轻链可变区，该框架区包含US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:174、177、181、183、185、187、191、194、196、200、202、205、或208中任一项的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的氨基酸序列，或者与US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:174、177、181、183、185、187、191、194、196、200、202、205、或208中任一项的氨基酸序列相比具有不超过两个氨基酸取代、插入或缺失。
在其他实施例中，前述抗体分子具有包含至少一个框架区的轻链可变区，该框架区包含US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:174、177、181、183、185、187、191、194、196、200、202、205、或208中任一项的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子具有包含至少两个、三个、或四个框架区的轻链可变区，这些框架区包含US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:174、177、181、183、185、187、191、194、196、200、202、205、或208中任一项的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:174、177、181、183、或185的VLFW1氨基酸序列，US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:187、191、或194的VLFW2氨基酸序列，和US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:196、200、202、或205的VLFW3氨基酸序列，并且任选地，进一步包含US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:208的VLFW4氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含与SEQID NO:172、184、216、或220中任一项至少85％同一的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQID NO:172、184、216、或220的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:176、180、188、192、196、200、204、208、或212中任一项至少85％同一的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQID NO:176、180、188、192、196、200、204、208、或212的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQID NO:172的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:225的氨基酸序列的重链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQID NO:184的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:186或SEQ ID NO:236的氨基酸序列的重链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQID NO:216的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:218的氨基酸序列的重链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQID NO:220的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:222的氨基酸序列的重链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQID NO:176的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:178的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQID NO:180的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:182的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQID NO:188的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:190的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQID NO:192的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQID NO:196的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体包含含有SEQ ID NO:198的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQID NO:200的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQID NO:204的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQID NO:208的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:210的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQID NO:212的氨基酸序列。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:214的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:176的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:180的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:180的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:188的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:188的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:192的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:196的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:208的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:212的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:216的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:216的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:220的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:225的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:178的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:225的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:190的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:225的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:225的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:236的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:178的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:182的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:182的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:190的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:190的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体包含含有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:198的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:210的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:214的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:218的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体包含含有SEQ ID NO:218的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子包含含有SEQ ID NO:222的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链。
在其他实施例中，前述抗体分子选自Fab、F(ab')2、Fv、或单链Fv片段(scFv)。
在其他实施例中，前述抗体分子包含选自IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4的重链恒定区。
在其他实施例中，前述抗体分子包含选自κ或λ轻链恒定区的轻链恒定区。
在其他实施例中，前述抗体分子包含人IgG4重链恒定区(其在US 2015/0210769A1的SEQ ID NO:212或214的位置228(根据EU编号)或位置108处具有突变)和κ轻链恒定区。
在其他实施例中，前述抗体分子包含人IgG4重链恒定区(其在US 2015/0210769A1的SEQ ID NO:212或214的位置228(根据EU编号)或位置108处具有丝氨酸至脯氨酸突变)和κ轻链恒定区。
在其他实施例中，前述抗体分子包含人IgG1重链恒定区(其在US 2015/0210769A1的SEQ ID NO:216的位置297(根据EU编号)或位置180处具有天冬酰胺至丙氨酸突变)和κ轻链恒定区。
在其他实施例中，前述抗体分子包含人IgG1重链恒定区(其在US 2015/0210769A1的SEQ ID NO:217的位置265(根据EU编号)或位置148处具有天冬氨酸盐至丙氨酸突变，以及在US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:217的位置329(根据EU编号)或位置212处具有脯氨酸至丙氨酸突变)和κ轻链恒定区。
在其他实施例中，前述抗体分子包含人IgG1重链恒定区(其在US 2015/0210769A1的SEQ ID NO:218的位置234(根据EU编号)或位置117处具有亮氨酸至丙氨酸突变，以及在US 2015/0210769 A1的SEQ ID NO:218的位置235(根据EU编号)或位置118处具有亮氨酸至丙氨酸突变)和κ轻链恒定区。
在其他实施例中，前述抗体分子能够结合人PD-1，其中解离常数(KD)小于约0.2nM。
在一些实施例中，前述抗体分子结合人PD-1，其中KD小于约0.2nM、0.15nM、0.1nM、0.05nM、或0.02nM，例如约0.13nM至0.03nM，例如约0.077nM至0.088nM，例如约0.083nM，例如如通过Biacore方法测量的。
在其他实施例中，前述抗体分子结合食蟹猴PD-1，其中KD小于约0.2nM、0.15nM、0.1nM、0.05nM、或0.02nM，例如约0.11nM至0.08nM，例如约0.093nM，例如如通过Biacore方法测量的。
在某些实施例中，前述抗体分子结合人PD-1和食蟹猴PD-1两者，其中KD是相似的，例如在nM范围内，例如如通过Biacore方法测量的。在一些实施例中，前述抗体分子结合人PD-1-Ig融合蛋白，其中KD小于约0.1nM、0.075nM、0.05nM、0.025nM、或0.01nM，例如约0.04nM，例如如通过ELISA测量的。
在一些实施例中，前述抗体分子结合表达人PD-1的Jurkat细胞(例如人PD-1转染的Jurkat细胞)，其中KD小于约0.1nM、0.075nM、0.05nM、0.025nM、或0.01nM，例如约0.06nM，例如如通过FACS分析测量的。
在一些实施例中，前述抗体分子结合食蟹猴T细胞，其中KD小于约1nM、0.75nM、0.5nM、0.25nM、或0.1nM，例如约0.4nM，例如如通过FACS分析测量的。
在一些实施例中，前述抗体分子结合表达食蟹猴PD-1的细胞(例如用食蟹猴PD-1转染的细胞)，其中KD小于约1nM、0.75nM、0.5nM、0.25nM、或0.01nM，例如约0.6nM，例如如通过FACS分析测量的。
在某些实施例中，前述抗体分子不具有与小鼠或大鼠PD-1的交叉反应性。在其他实施例中，前述抗体具有与恒河猴PD-1的交叉反应性。例如，可以使用表达PD-1的细胞(例如表达人PD-1的300.19细胞)通过Biacore方法或结合测定来测量交叉反应性。在其他实施例中，前述抗体分子结合PD-1的细胞外Ig样结构域。
在其他实施例中，前述抗体分子能够减少PD-1与PD-L1、PD-L2或两者，或者与表达PD-L1、PD-L2或两者的细胞的结合。在一些实施例中，前述抗体分子减少(例如阻断)PD-L1与表达PD-1的细胞(例如表达人PD-1的300.19细胞)的结合，其中IC50小于约1.5nM、1nM、0.8nM、0.6nM、0.4nM、0.2nM、或0.1nM，例如在约0.79nM和约1.09nM之间，例如约0.94nM，或约0.78nM或更小，例如约0.3nM。在一些实施例中，前述抗体减少(例如阻断)PD-L2与表达PD-1的细胞(例如表达人PD-1的300.19细胞)的结合，其中IC50小于约2nM、1.5nM、1nM、0.5nM、或0.2nM，例如在约1.05nM和约1.55nM之间，或约1.3nM或更小，例如约0.9nM。
在其他实施例中，前述抗体分子能够增强抗原特异性T细胞响应。
在实施例中，该抗体分子是单特异性抗体分子或双特异性抗体分子。在实施例中，该抗体分子对PD-1具有第一结合特异性，并且对TIM-3、LAG-3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、PD-L1或PD-L2具有第二结合特异性。在实施例中，该抗体分子包含抗体的抗原结合片段，例如半抗体或半抗体的抗原结合片段。
在一些实施例中，与使用同种型对照(例如IgG4)时IL-2的表达相比，前述抗体分子将来自葡萄球菌肠毒素B(SEB)(例如，以25μg/mL)活化的细胞的IL-2表达增加至少约2、3、4、5倍，例如约2至3倍，例如约2至2.6倍，例如约2.3倍，例如，如在SEB T细胞活化测定或人全血离体测定中所测量的。
在一些实施例中，与使用同种型对照(例如IgG4)时IFN-γ的表达相比，前述抗体分子将来自抗CD3(例如以0.1μg/mL)刺激的T细胞的IFN-γ表达增加至少约2、3、4、5倍，例如约1.2至3.4倍，例如约2.3倍，例如，如在IFN-γ活性测定中所测量的。
在一些实施例中，与使用同种型对照(例如IgG4)时IFN-γ的表达相比，前述抗体分子将来自SEB(例如以3pg/mL)活化的T细胞的IFN-γ表达增加至少约2、3、4、5倍，例如约0.5至4.5倍，例如约2.5倍，例如，如在IFN-γ活性测定中所测量的。
在一些实施例中，与使用同种型对照(例如IgG4)时IFN-γ的表达相比，前述抗体分子将来自用CMV肽活化的T细胞的IFN-γ表达增加至少约2、3、4、5倍，例如约2至3.6倍，例如约2.8倍，例如，如在IFN-γ活性测定中所测量的。
在一些实施例中，与使用同种型对照(例如IgG4)时CD8+ T细胞的增殖相比，前述抗体分子使用CMV肽活化的CD8+ T细胞的增殖增加至少约1、2、3、4、5倍，例如约1.5倍，例如如由通过至少n(例如n＝2或4)个细胞分裂的CD8+ T细胞的百分比来测量的。
在某些实施例中，前述抗体分子的Cmax在约100μg/mL和约500μg/mL之间、在约150μg/mL和约450μg/mL之间、在约250μg/mL和约350μg/mL之间、或在约200μg/mL和约400μg/mL之间，例如约292.5μg/mL，例如如在猴中所测量的。
在某些实施例中，前述抗体分子的T1/2在约250小时和约650小时之间、在约300小时和约600小时之间、在约350小时和约550小时之间、或在约400小时和约500小时之间，例如约465.5小时，例如如在猴中所测量的。
在一些实施例中，前述抗体分子结合PD-1，其中Kd低于5×10-4、1×10-4、5×10-5、或1×10-5s-1，例如约2.13×10-4s-1，例如如通过Biacore方法测量的。在一些实施例中，前述抗体分子结合PD-1，其中Ka快于1×104、5×104、1×105、或5×105M-1s-1，例如约2.78×105M- 1s-1，例如如通过Biacore方法测量的。
在一些实施例中，前述抗PD-1抗体分子结合PD-1的C链、CC'环、C'链和FG环内的一个或多个残基。PD-1的结构域结构描述于例如以下文献中：Cheng等人,"Structure andInteractions of the Human Programmed Cell Death 1Receptor[人类程序性细胞死亡1受体的结构和相互作用]"J.Biol.Chem.[生物化学杂志]2013,288:11771-11785。如Cheng等人中所述，C链包含残基F43-M50，CC'环包含S51-N54，C'链包含残基Q55-F62，并且FG环包含残基L108-I114(根据Chang等人(同上)所述的氨基酸编号)。因此，在一些实施例中，如本文所述的抗PD-1抗体结合PD-1的F43-M50、S51-N54、Q55-F62、和L108-I114的一个或多个范围中的至少一个残基。在一些实施例中，如本文所述的抗PD-1抗体结合PD-1的F43-M50、S51-N54、Q55-F62、和L108-I114的两个、三个、或所有四个范围中的至少一个残基。在一些实施例中，该抗PD-1抗体结合PD-1中的残基，该残基也是PD-L1和PD-L2之一或二者的结合位点的一部分。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码上述抗体分子、其载体和宿主细胞中的任一项。
还提供了编码任何前述抗体分子的抗体重链可变区或轻链可变区或两者的分离的核酸。
在一个实施例中，分离的核酸编码重链CDR 1-3，其中所述核酸包含SEQ ID NO:242-246、255、256-260、267-271、或278-280的核苷酸序列。
在另一个实施例中，分离的核酸编码轻链CDR 1-3，其中所述核酸包含SEQ ID NO:247-254、261-266、或272-277的核苷酸序列。
在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码重链可变结构域的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:173、185、217、221、224、229、或235中的任一项至少85％同一。
在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码重链可变结构域的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:173、185、217、221、224、229、或235中的任一项。
在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码重链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:175、187、219、223、226、230、或237中的任一项至少85％同一。
在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码重链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:175、187、219、223、226、230、或237中的任一项。
在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码轻链可变结构域的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:177、181、189、193、197、201、205、209、213、227、231、233、238、或240中的任一项至少85％同一。
在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码轻链可变结构域的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:177、181、189、193、197、201、205、209、213、227、231、233、238、或240中的任一项。
在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码轻链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与SEQ ID NO:179、183、191、195、199、203、207、211、215、228、232、234、239或241中的任一项至少85％同一。
在其他实施例中，前述核酸进一步包含编码轻链的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:179、183、191、195、199、203、207、211、215、228、232、234、239或241中的任一项。
在某些实施例中，提供了包含前述核酸的一种或多种表达载体和宿主细胞。
还提供了产生抗体分子或其片段的方法，该方法包括在适于基因表达的条件下培养如本文所述的宿主细胞。
在一个方面，本披露内容的特点在于一种提供本文所述抗体分子的方法。该方法包括：提供PD-1抗原(例如包含至少一部分PD-1表位的抗原)；获得特异性结合PD-1多肽的抗体分子；并评估该抗体分子是否特异性结合PD-1多肽，或评估该抗体分子调制(例如抑制)PD-1活性的功效。该方法可以进一步包括将该抗体分子向受试者(例如人或非人动物)给予。
在另一个方面，本披露内容提供了组合物，例如药物组合物，其包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂、和至少一种治疗剂(例如本文所述的抗PD-1抗体分子)。在一个实施例中，该组合物(例如药物组合物)包括抗体分子和一种或多种试剂(例如，如本文所述的治疗剂或其他抗体分子)的组合。在一个实施例中，将该抗体分子与标记物或治疗剂缀合。
表6.鼠、嵌合和人源化抗PD-1抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。抗体分子包括鼠mAb BAP049、嵌合mAb BAP049-chi和BAP049-chi-Y，以及人源化mAb BAP049-hum01至BAP049-hum16和BAP049-克隆-A至BAP049-克隆-E。示出了重链和轻链CDR、重链和轻链可变区、以及重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。
在实施例中，PD-1的抑制剂是除抗体或其片段之外的分子。在实施例中，PD-1的抑制剂包含RNA分子，例如dsRNA分子，例如如例如2014年12月19日提交的国际公布WO 2015/090230的第[00489]段和表16和表17所述，靶向并且调制或调节(例如抑制)PD-1的dsRNA分子(例如，RNAi药剂，如shRNA、siRNA、miRNA、聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN)，该文献通过引用以其全文并入。
PD-1、PD-L1和PD-L2的抗体、抗体片段、和其他抑制剂是本领域可得的并且可以与本文所述本披露内容的表达CAR的细胞组合使用。在一些实施例中，PD-1抑制剂选自PDR001(诺华公司(Novartis))、纳武单抗(百时美施贵宝公司)、派姆单抗(默克公司(Merck&Co))、匹地利珠单抗(CureTech公司)、MEDI0680(医学免疫公司)、REGN2810(再生元公司(Regeneron))、TSR-042(Tesaro公司)、PF-06801591(辉瑞公司(Pfizer))、BGB-A317(百济神州公司(Beigene))、BGB-108(百济神州公司)、INCSHR1210(因赛特公司(Incyte))、或AMP-224(Amplimmune公司)。
纳武单抗(也称为BMS-936558或MDX1106；百时美施贵宝公司)是特异性阻断PD-1的完全人IgG4单克隆抗体。纳武单抗(克隆5C4)和特异性结合PD-1的其他人单克隆抗体在US 8,008,449和WO 2006/121168中披露。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗。纳武单抗的可替代名称包括MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538、或BMS-936558。在一些实施例中，抗PD-1抗体是纳武单抗(CAS登记号：946414-94-4)。纳武单抗是特异性阻断PD1的完全人IgG4单克隆抗体。纳武单抗(克隆5C4)和特异性结合PD1的其他人单克隆抗体在US 8,008,449和WO 2006/121168中披露。在一个实施例中，PD-1的抑制剂是纳武单抗，并且具有本文披露的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：纳武单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
纳武单抗的重链和轻链氨基酸序列如下：
重链
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO:281)
轻链
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:282)
派姆单抗(以前称为lambrolizumab，并且也称为MK03475；默克公司)是结合PD-1的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗和其他人源化抗PD-1抗体在US 8,354,509和WO2009/114335中披露。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如在WO2010/027827和WO2011/066342中披露)是阻断PD-1与B7-H1之间相互作用的PD-L2Fc融合可溶性受体。其他抗PD-1抗体包括AMP 514(Amplimmune)，尤其例如US 8,609,089、US 2010028330、和/或US 20120114649中披露的抗PD-1抗体。
在一些实施例中，抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗(也称为Lambrolizumab、MK-3475、MK03475、SCH-900475或默克公司(Merck))是结合PD-1的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗和其他人源化抗PD-1抗体在Hamid,O.等人(2013)New EnglandJournal of Medicine[新英格兰医学期刊]369(2):134-44、US 8,354,509和WO 2009/114335中披露。
派姆单抗
在一个实施例中，PD-1的抑制剂是在例如US 8,354,509和WO 2009/114335中披露的派姆单抗，并且具有本文披露的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：派姆单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一些实施例中，抗PD1抗体分子包含：
(i)包含SEQ ID NO:530的VHCDR1氨基酸序列的重链可变(VH)区；SEQ ID NO:531的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:532的VHCDR3氨基酸序列；以及
(ii)包含SEQ ID NO:527的VLCDR1氨基酸序列的轻链可变(VL)区；SEQ ID NO:528的VLCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:529的VLCDR3氨基酸序列，
或与其相似的序列，例如至少85％、90％、95％相同或更高的序列。
在其他实施例中，抗PD1抗体分子包含重链和轻链，该重链包含SEQ ID NO:283的氨基酸，并且该轻链包含SEQ ID NO:284的氨基酸，或与其相同或相似的序列(例如至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
派姆单抗的重链、轻链、重链CDR、和轻链CDR的氨基酸序列如下所披露：
重链
(SEQ ID NO:283)
轻链
(SEQ ID NO:284)
轻链CDR1：RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:527)
轻链CDR2：LASYLES(SEQ ID NO:528)
轻链CDR3：QHSRDLPLT(SEQ ID NO:529)
重链CDR1：NYYMY(SEQ ID NO:530)
重链CDR2：GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:531)
重链CDR3：RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:532)
在一些实施例中，抗PD-1抗体是匹地利珠单抗。匹地利珠单抗(CT-011；Cure Tech公司)是结合PD1的人源化IgG1k单克隆抗体。匹地利珠单抗和其他人源化抗PD-1单克隆抗体在WO2009/101611、Rosenblatt,J.等人(2011)J Immunotherapy[免疫学杂志]34(5):409-18、US 7,695,715、US 7,332,582、和US 8,686,119中披露，这些文献通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：匹地利珠单抗的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是MEDI0680(医学免疫公司)，也称为AMP-514。MEDI0680和其他抗PD-1抗体在US 9,205,148和WO 2012/145493中披露，这些文献通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：MEDI0680的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是REGN2810(再生元公司)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：REGN2810的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是PF-06801591(辉瑞公司)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：PF-06801591的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是BGB-A317或BGB-108(百济神州公司)。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：BGB-A317或BGB-108的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是INCSHR1210(Incyte公司)，也称为INCSHR01210或SHR-1210。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：INCSHR1210的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
在一个实施例中，抗PD-1抗体分子是TSR-042(Tesaro公司)，也称为ANB011。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含以下中的一个或多个：TSR-042的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。
其他抗PD1抗体包括AMP 514(Amplimmune)，尤其例如US 8,609,089、US2010028330、和/或US 20120114649中披露的抗PD1抗体。其他已知的抗PD-1抗体包括描述于例如以下中的那些：WO 2015/112800、WO 2016/092419、WO 2015/085847、WO 2014/179664、WO 2014/194302、WO 2014/209804、WO 2015/200119、US 8,735,553、US 7,488,802、US 8,927,697、US 8,993,731、和US 9,102,727，这些文献通过引用以其全文并入。
在一个实施例中，抗PD-1抗体是与本文所述的抗PD-1抗体之一竞争与PD-1上的相同表位结合和/或结合PD-1上的相同表位的抗体。
在一个实施例中，PD-1抑制剂是例如如8,907,053中所述抑制PD-1信号传导途径的肽，该文献通过引用以其全文并入。在一些实施例中，PD-1抑制剂是免疫粘附素(例如包含融合到恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施例中，PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如在WO2010/027827和WO 2011/066342中披露)是阻断PD-1与B7-H1之间相互作用的PD-L2Fc融合可溶性受体。
在一个实施例中，抗PD-1抗体或其片段是如题为“PD-1的抗体分子及其用途”的US2015/0210769中所述的抗PD-1抗体分子，该文献通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包括来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区来自选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如US 2015/0210769的表1所述，或者由表1中的核苷酸序列编码，或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列；或者密切相关的CDR，例如相同或具有至少一个氨基酸改变，但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的CDR。
在又另一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含至少一个、两个、三个或四个可变区，这些可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-克隆-A、BAP049-克隆-B、BAP049-克隆-C、BAP049-克隆-D、或BAP049-克隆-E；或者如US 2015/0210769的表1所述，或者由表1中的核苷酸序列编码，或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
用于疾病和病症的治疗应用
抗原(例如CD19)相关疾病和/或病症
本披露内容提供了用于治疗例如与抗原(例如CD19)的表达相关的疾病和病症(例如癌症)的组合物和方法。在一个方面，本发明提供了用于治疗疾病的方法，其中该癌症的一部分对抗原(例如CD19)是阴性的，并且该癌症的一部分对抗原(例如CD19)是阳性的。
例如，本发明的方法和组合物可用于治疗患有复发或患有难治性疾病(例如癌症，例如CD19+癌症)的受试者。
在某些实施例中，在给予本文所述的表达CAR的细胞和/或PD-1抑制剂之前，先前已给予受试者化疗，例如本文所述的化疗(例如淋巴清除化疗、卡铂、和/或吉西他滨)。在实施例中，在给予本文所述的表达CAR的细胞和/或PD-1抑制剂之前，先前已给予受试者免疫疗法，例如同种异体骨髓移植。在实施例中，在给予本文所述的表达CAR的细胞和/或PD-1抑制剂之前，受试者先前已经历了放射疗法。
可以用本文所述的组合疗法(例如表达CAR的细胞和PD-1抑制剂)治疗的示例性癌症包括血液癌症。示例性血液癌症在下文更详细地描述。
本披露内容包括(除了其他情况)一种细胞疗法，其中T细胞经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，并且CAR T细胞被输注给有需要的受体。输注的细胞能够杀伤受体中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR修饰的T细胞能够在体内复制，从而产生可以导致持续肿瘤控制的长期持久性。在各个方面，在向患者给予T细胞后，给予患者的T细胞或其后代在患者中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年、或五年。
本发明还包括一种细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如NK细胞或T细胞)例如通过体外转录的RNA被修饰，以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)，并且表达CAR的(例如CART)细胞被输注给有需要的受体。输注的细胞能够杀伤受体中的癌细胞。因此，在各个方面，在向患者给予表达CAR的细胞(例如T细胞)后，给予患者的表达CAR的细胞(例如T细胞)存在少于一个月，例如三周、两周、一周。
不希望受任何特定理论的约束，由CAR修饰的T细胞引发的抗癌免疫响应可以是主动或被动免疫响应，或者可替代地可以归因于直接和间接免疫响应。在一个方面，CAR(例如CD19-CAR)转导的T细胞表现出响应于表达靶抗原(例如CD19)的人癌细胞的特异性促炎细胞因子分泌和有效细胞溶解活性，抵抗可溶性靶抗原抑制，介导旁观者杀伤并介导已建立的人癌症的消退。例如，表达靶抗原的癌症的异质区域内的无抗原癌细胞可能易于被先前已与相邻抗原阳性癌细胞反应的靶抗原重定向T细胞间接破坏。
在一个方面，本披露内容的特点在于一种在受试者中治疗癌症的方法。该方法包括向受试者给予组合疗法，该组合疗法包括给予表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂，使得在受试者中治疗癌症。可通过本文所述的组合疗法治疗的癌症的实例是与抗原(例如CD19)表达相关的癌症。在一个方面，与抗原(例如CD19)表达相关的癌症选自本文所述的任何血液癌症，例如淋巴瘤，例如滤泡性淋巴瘤或DLBCL。
在一个实施例中，本文所述表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂的组合疗法产生以下中的一种或多种：表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)的抗肿瘤活性改善或增加；表达CAR的细胞的增殖或持久性增加；表达CAR的细胞的浸润改善或增加；肿瘤进展的抑制改善；肿瘤进展的延迟；癌细胞增殖的抑制或减少；和/或肿瘤负荷(例如肿瘤体积或大小)的减少，例如与单独的表达CAR的细胞或PD-1抑制剂的单一疗法相比。在一个实施例中，组合疗法导致表达CAR的细胞的持久性增加和B细胞恢复延长，例如表现为B细胞发育不全。在一个实施例中，组合疗法导致表达CAR的细胞的持久性增加和复发风险降低(例如减小)。
本发明提供了用于抑制抗原表达(例如表达CD19的)细胞群的增殖或减少其的方法。在一个实施例中，这些方法包括给予组合疗法，例如包含表达CAR的细胞(例如表达CD19CAR的细胞)或表达CAR的细胞群和PD-1抑制剂的组合。在某些实施例中，相对于仅用表达CAR的(例如表达CD19 CAR的)细胞或PD-1抑制剂治疗的受试者中细胞和/或癌细胞的总量、数量、量、或百分比，本文所述的组合疗法使具有抗原(例如CD19)或另一种与抗原表达(例如表达CD19的)细胞相关的癌症的受试者或动物模型中细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分比减少至少5％、10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％。在一个实施例中，受试者是人。在一个实施例中，受试者是猴，例如食蟹猴。
本发明还提供了用于预防、治疗和/或控制病症(例如与抗原表达细胞(例如表达CD19的细胞)相关的病症(例如本文所述的癌症))的方法，这些方法包括向有需要的受试者给予表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)或表达CAR的细胞群和PD-1抑制剂。在一个方面，受试者是人。
在一个方面，本发明涉及一种抑制癌细胞(例如抗原表达(例如表达CD19的)癌细胞)生长的方法，该方法包含使癌细胞与表达CAR的(例如表达CD19 CAR的)细胞(例如本文所述的CD19 CART细胞)，以及例如如本文所述的一种或多种其他表达CAR的细胞接触，使得CART响应于抗原而活化并且靶向癌细胞，其中癌症的生长被抑制。与PD-1(例如本文所述的PD-1)组合给予表达CAR的细胞(例如T细胞)。
本披露内容还提供了用于预防、治疗和/或控制疾病(例如与抗原表达(例如表达CD19的)细胞(例如表达抗原(例如CD19)的血液癌症或非典型癌症)相关的疾病)的方法，这些方法包括向有需要的受试者给予结合抗原表达细胞的表达CAR的(例如表达CD19 CAR的)细胞并且给予本文所述的PD-1抑制剂。在一个方面，受试者是人。与表达抗原(例如CD19)的细胞相关的病症的非限制性实例包括自身免疫病症(如狼疮)、炎性病症(如过敏和哮喘)和癌症(如表达抗原(例如CD19)的血液癌症或非典型癌症)。
本披露内容还提供了用于预防、治疗和/或控制与抗原表达(例如表达CD19的)细胞相关的疾病的方法，这些方法包括向有需要的受试者给予结合抗原表达(例如表达CD19的)细胞的本发明CART细胞(例如抗CD19 CART细胞)。在一个方面，受试者是人。
本披露内容还提供了用于预防例如与抗原表达(例如表达CD19的)细胞相关的癌症复发的方法，这些方法包括向有需要的受试者给予结合抗原表达(例如表达CD19的)细胞的本发明CART细胞(例如抗CD19 CART细胞)。在一个方面，这些方法包括与有效量的另一种疗法(例如PD-1抑制剂)组合向有需要的受试者给予有效量的结合抗原表达(例如表达CD19的)细胞的本文所述CART细胞(例如抗CD19 CART细胞)。
例如与抗原(例如CD19)表达相关的非癌相关适应症包括但不限于例如自身免疫疾病(例如狼疮)、炎性病症(变态反应和哮喘)和移植。
本文所述的表达CAR的细胞可以单独给予，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分(如IL-2)或其他细胞因子或细胞群组合给予。
在一些实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)用于耗尽B细胞(例如B细胞(例如调节B细胞)群)。不希望受理论的约束，据信B细胞(例如调节B细胞)的耗尽可以改善肿瘤微环境，使得组合疗法(例如本文所述的组合疗法)可以(例如，比没有耗尽B细胞)更有效。因此，本文提供了一种用于减少(例如耗尽)调节细胞(例如调节B细胞)的方法。该方法包括以足以减少调节细胞的量给予本文所述的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)。在一些实施例中，这些方法可以用于调节肿瘤微环境，例如以增强本文所述疗法的有效性。
血液癌症
血液癌症病状是癌症的类型，如白血病、淋巴瘤和影响血液、骨髓和淋巴系统的恶性淋巴组织增生病状。
在一个实施例中，该血液癌症是白血病。在一个实施例中，该癌症选自下组，该组由以下组成：一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴细胞性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；另外的血液癌症或血液病状包括但不限于套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病、MALT淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、和为由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)联合在一起的各种血液病状集合的“白血病前期”。与抗原(例如CD19表达)相关的疾病包括但不限于非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病状或表达抗原(例如CD19)的增殖性疾病；及其任何组合。
白血病可以分类为急性白血病和慢性白血病。急性白血病可以进一步分类为急性粒细胞性白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性粒细胞性白血病(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。其他相关病状包括骨髓增生异常综合征(MDS，以前称为“白血病前期”)，其是由骨髓血细胞的无效产生(或发育异常)和转化为AML的风险联合的血液病状的多样化集合。
淋巴瘤是一组从淋巴细胞发展的血细胞肿瘤。示例性淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
在一个方面，本发明涉及一种治疗患有霍奇金淋巴瘤的哺乳动物的方法，该方法包括向哺乳动物给予有效量的表达CAR分子(例如CD19 CAR分子，例如本文所述的CD19 CAR分子)的细胞和B细胞抑制剂。
在一个方面，本发明的组合物和CART细胞或表达CAR的NK细胞特别可用于治疗B细胞恶性肿瘤，如非霍奇金淋巴瘤，例如DLBCL、滤泡性淋巴瘤、或CLL。
非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一组由B或T细胞形成的淋巴细胞癌。NHL发生在任何年龄，并且经常以比正常更大的淋巴结、体重减轻、和发烧为特征。不同类型的NHL分类为侵袭性(快速生长)和惰性(缓慢生长)类型。B细胞非霍奇金淋巴瘤包括伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、和套细胞淋巴瘤。T细胞非霍奇金淋巴瘤的实例包括蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、和前体T淋巴母细胞淋巴瘤。在骨髓或干细胞移植后发生的淋巴瘤典型地是B细胞非霍奇金淋巴瘤。参见例如，Maloney.NEJM.[新英格兰医学杂志]366.21(2012):2008-16。在一些实施例中，非霍奇金淋巴瘤(例如DLBCL、滤泡性淋巴瘤、或CLL)可能具有高表达的PD-L1，这可能与差的临床结果有关。
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是从B细胞发展的NHL形式。DLBCL是一种侵袭性淋巴瘤，其可以出现在淋巴结中或淋巴系统外部，例如在胃肠道、睾丸、甲状腺、皮肤、乳房、骨骼、或大脑中。在DLBCL中通常观察到细胞形态的三个变体：中心母细胞、免疫母细胞、和间变性细胞。中心母细胞形态是最常见的，并且具有含最小细胞质的中等至大尺寸的淋巴细胞外观。存在几种DLBCL的亚型。例如，原发性中枢神经系统淋巴瘤是一种仅影响大脑的DLBCL类型，其不同于影响大脑外区域的DLBCL被称呼和治疗。另一种类型的DLBCL是原发性纵隔B细胞淋巴瘤，其经常发生在较年轻的患者中并且在胸部快速生长。DLBCL的症状包括颈部、腋窝、或腹股沟中无痛性快速肿胀，这是由淋巴结肿大引起的。对于一些受试者，肿胀可能是痛苦的。DLBCL的其他症状包括盗汗、不明原因的发烧、和体重减轻。尽管大多数患有DLBCL的患者是成年人，但该疾病有时发生在儿童身上。
在一些实施例中，DLBCL患者的子集显示PD-L1和/或PD-L2基因座改变。例如，在19％患者中观察到PD-L1和PD-L2基因座的改变，其中12％患者显示拷贝数增加，3％呈现扩增并且4％显示易位。在一些实施例中，PD-L1表达可以通过免疫组织化学(IHC)在来自患者的样品(包括具有PD-L1和PD-L2基因座的易位或扩增的那些)中检测。
遗传改变还可以存在于DLBCL的非GCB(生发中心B细胞)亚型中。在一些实施例中，可以在非GCB DLBCL患者中观察到PD-L1表达。在一些实施例中，非GCB DLBCL患者在PD-L1/PD-L2表达或遗传改变方面类似于经典的霍奇金淋巴瘤(cHL)。
DLBCL的治疗包括化疗(例如环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松、依托泊苷)、抗肿瘤药物(例如Pixantrone)、抗体(例如利妥昔单抗)、含蒽环霉素的方案、放射、或干细胞移植(例如自体干细胞移植(ASCT)或同种异体造血干细胞移植(HSCT))。在一些实施例中，DLBCL的治疗可以包括组合疗法，这些组合疗法包括但不限于：R-CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松/泼尼松龙、和利妥昔单抗)；R-ICE(利妥昔单抗、异环磷酰胺、卡铂和依托泊苷)；R-DHAP(利妥昔单抗、地塞米松、阿糖胞苷和顺铂)；R-GDP(利妥昔单抗、地塞米松、吉西他滨和顺铂)；GemOX(吉西他滨和奥沙利铂)；或HDCT(高剂量化疗)和ASCT。
DLBCL的这些治疗(例如疗法线)可以作为第一线疗法、第二线疗法、第三线疗法或第四线疗法给予。在一些实施例中，DLBCL的治疗可以包括疗法的一个或多个线，例如疗法的一个、两个、三个、或四个线。在一些实施例中，DLBCL的治疗可以包括本文披露的治疗中的任何一种或多种，或其组合。
在一些实施例中，第一线疗法包含R-CHOP、R-ICE、R-DHAP、R-GDP、GemOx、利妥昔单抗、HDCT和ASCT、Pixantrone、同种异体HSCT、CART疗法(例如CTL019、CTL119或BCMA CAR)或研究药剂。在一些实施例中，第一线疗法是R-CHOP。
在一些实施例中，第二线疗法包含R-CHOP、R-ICE、R-DHAP、R-GDP、GemOx、利妥昔单抗、HDCT和ASCT、Pixantrone、同种异体HSCT、CART疗法(例如CTL019、CTL119或BCMA CAR)或研究药剂。在一些实施例中，第二线疗法包含R-ICE、R-DHAP、R-GDP、GemOx、利妥昔单抗、HDCT和ASCT、或研究药剂。在一些实施例中，第二线疗法是R-ICE、R-DHAP或R-GDP。在一些实施例中，第二线疗法是与ASCT组合的HDCT。在一些实施例中，第二线疗法是利妥昔单抗。在一些实施例中，第二线疗法是GemOx。在一些实施例中，第二线疗法是研究药剂。
在一些实施例中，第三线疗法包含R-CHOP、R-ICE、R-DHAP、R-GDP、GemOx、利妥昔单抗、HDCT和ASCT、Pixantrone、同种异体HSCT、CART疗法(例如CTL019、CTL119或BCMA CAR)或研究药剂。在一些实施例中，第三线疗法是Pixantrone。在一些实施例中，第三线疗法是研究药剂。在一些实施例中，第三线疗法是CART疗法(例如CTL019、CTL119或BCMA CAR)。在其他实施例中，第三线疗法是同种异体HSCT。
在一些实施例中，第四线疗法包含R-CHOP、R-ICE、R-DHAP、R-GDP、GemOx、利妥昔单抗、HDCT和ASCT、Pixantrone、同种异体HSCT、CART疗法(例如CTL019、CTL119或BCMA CAR)或研究药剂。在一些实施例中，第四线疗法包含研究药剂。
约60％患者响应于含有疗法的第一线的利妥昔单抗。在一些实施例中，接受疗法的多于两个线(例如疗法的两个、三个、或四个线)的患者预后不良。接受R-DHAP和O-DHAP作为第二线疗法的患者具有分别为2.1和1.8个月的中位无进展生存期(PFS)，并且具有分别为13.2和13.7个月的中位总生存期(OS)。在自体HSCT后挽救疗法失败或复发的患者具有为4.4个月的中位OS。这些患者的1年OS是23％并且这些患者的2年OS是15.7％。另外，对于第三线化疗，或对于自体移植失败或没有资格进行自体移植的患者，不存在护理标准。因此，存在r/r DLBCL中未满足的需求。
CART疗法可能潜在地是治疗性的，但不适用于所有r/r DLBCL患者。尽管CART疗法提供了比现有疗法更好的结果，但约三分之二的r/rDLBCL患者将不具有对CART疗法的持久响应。CART疗法和检查点抑制剂(例如抗PD-1抗体(例如派姆单抗))的组合可以改善r/rDLBCL患者的响应。
在一些实施例中，可以将CART疗法(例如CTL019、CTL119或BCMA CAR)与检查点抑制剂(例如抗PD-1抗体(例如派姆单抗))的组合用作第三线疗法。在一些实施例中，组合疗法可以在例如患有r/rDLBCL的患者中产生持久的响应率。在一些实施例中，组合疗法可以延长CART疗法(例如CTL019、CTL119或BCMA CAR)在肿瘤部位(例如血液、骨髓、或脾脏)处的持久性。在其他实施例中，组合疗法可以好于CART单一疗法(例如CTL019、CTL119或BCMACAR的单一疗法)。在一些实施例中，组合疗法可以增强受试者中恢复正常T细胞群时(例如在淋巴细胞消除后)的响应持续时间。在其他实施例中，抗PD-1抗体(例如派姆单抗)可以阻断PD-1介导的自发免疫响应的抑制。在一些实施例中，接受组合疗法的受试者患有DLBCL(例如GCB或非GCB DLBCL)。在一些实施例中，可以基于PD-L1表达或遗传改变选择患有DLBCL(例如GCB或非GCB DLBCL)的受试者用于组合疗法。
滤泡性淋巴瘤是一种非霍奇金淋巴瘤类型，并且是滤泡中心B细胞(中心细胞和中心母细胞)的淋巴瘤，其至少具有部分滤泡模式。滤泡性淋巴瘤细胞表达B细胞标记CD10、CD19、CD20、和CD22。滤泡性淋巴瘤细胞通常对CD5是阴性的。在形态学上，滤泡性淋巴瘤肿瘤由含有中心细胞(也称为切割的滤泡中心细胞或小细胞)和中心母细胞(也称为大的未切割的滤泡中心细胞或大细胞)的混合物的滤泡组成。滤泡被非恶性细胞(大多数是T细胞)包围。滤泡主要含有中心细胞和少数中心母细胞。世界卫生组织(WHO)如下对疾病进行形态学分级：1级(<5个中心母细胞/高倍视野(hpf)；2级(6-15个中心母细胞/hpf)；3级(>15个中心母细胞/hpf)。3级进一步细分为以下等级：3A级(仍存在中心细胞)；3B级(滤泡几乎完全由中心母细胞组成)。
滤泡性淋巴瘤的治疗包括化疗，例如烷化剂、核苷类似物、含蒽环霉素的方案，例如称为CHOP-环磷酰胺的组合疗法、多柔比星、长春新碱、泼尼松/泼尼松龙、抗体(例如利妥昔单抗)、放射免疫疗法、和造血干细胞移植。
CLL是B细胞恶性肿瘤，其特征在于肿瘤细胞在骨髓、血液、淋巴结、和脾脏中的增殖和积累。CLL诊断时的中位年龄是约65岁。目前的治疗包括化疗、放射疗法、生物疗法、或骨髓移植。有时症状通过外科手术(例如肿大脾脏的脾脏切除)或通过放射疗法(例如肿胀淋巴结的去膨胀)治疗。用于治疗CLL的化学治疗剂包括例如氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨)、苯丁酸氮芥、长春新碱、喷司他丁、环磷酰胺、阿仑单抗(Campath-1H)、多柔比星、和泼尼松。CLL的生物疗法包括抗体，例如阿仑单抗、利妥昔单抗、和奥法木单抗；以及酪氨酸激酶抑制剂疗法。许多标准可以用于对CLL的阶段进行分类，例如Rai或Binet系统。Rai系统描述了CLL具有五个阶段：阶段0，其中仅存在淋巴细胞增多；阶段I，其中存在淋巴结肿大；阶段II，其中存在脾肿大、淋巴结肿大或两者；阶段III，其中存在贫血、器官肿大或两者(进展的定义是体重减轻、疲劳、发烧、大量器官肿大、和淋巴细胞计数快速增加)；和阶段IV，其中存在贫血、血小板减少、器官肿大、或其组合。在Binet分阶段系统下，存在三个类别：阶段A，其中存在淋巴细胞增多和少于三个淋巴结肿大(该阶段包括所有Rai阶段0患者、Rai阶段I患者的一半、和Rai阶段II患者的三分之一)；阶段B，其中涉及三个或更多个淋巴结；和阶段C，其中存在贫血或血小板减少或两者。这些分类系统可以与免疫球蛋白基因突变的测量组合，以提供更准确的疾病状态表征。突变免疫球蛋白基因的存在与改善的预后相关。
在另一个实施例中，将本发明的表达CAR的细胞用于例如用白血病干细胞治疗癌症或白血病。例如，这些白血病干细胞是CD34+/CD38-白血病细胞。
组合疗法
本文所述的任何方法可以与其他已知药剂和疗法组合使用。
本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)和至少一种另外的治疗剂可以同时(在同一或分开的组合物中)或顺序给予。对于顺序给予，本文所述的表达CAR的细胞和/或PD-1抑制剂可以在另外的治疗剂之后给予，或者可以逆转给予顺序，其中该另外的治疗剂可以在本文所述的表达CAR的细胞和/或PD-1抑制剂之后给予。可替代地，另外的治疗剂可以在给予表达CAR的细胞与PD-1抑制剂之间给予。
在另外的方面，本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)可以与以下组合用于治疗方案：手术、化疗、放射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体、或其他免疫吸附剂(如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法)、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子、和照射，如描述于Izumoto等人2008J Neurosurg[神经外科杂志]108:963-971中的肽疫苗。
在一个实施例中，本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)可以与化学治疗剂组合使用。示例性化学治疗剂包括蒽环霉素(例如多柔比星(例如脂质体多柔比星))、长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷化剂(例如环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如阿仑单抗、吉妥单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗)、抗代谢物(包括例如，叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调制剂如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如来那度胺)。
一般化学治疗剂在2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731的第268-269页披露，该文献通过引用以其全文并入。
示例性烷化剂在2016年4月8日提交的国际申请WO 2016/164731的第270-271页披露，该文献通过引用以其全文并入。
示例性mTOR抑制剂包括例如坦罗莫司；地磷莫司(ridaforolimus)(正式地称为deferolimus，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，并且描述于PCT公布号WO 03/064383中)；依维莫司(或RAD001)；雷帕霉素(AY22989，)；simapimod(CAS 164301-51-3)；emsirolimus，(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉正离子-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-，内盐(SEQ IDNO:526)(SF1126，CAS 936487-67-1)、和XL765。
示例性免疫调节剂包括例如阿托珠单抗(可购自)；聚乙二醇非格司亭来那度胺(CC-5013，)；沙利度胺actimid(CC4047)；和IRX-2(包括白细胞介素1、白细胞介素2、和干扰素γ的人细胞因子的混合物，CAS 951209-71-5，可购自IRX Therapeutics公司)。
示例性蒽环霉素包括例如，多柔比星(和)；博莱霉素柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素、和盐酸红比霉素，)；柔红霉素脂质体(柔红霉素柠檬酸盐脂质体，)；米托蒽醌(DHAD，)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星(Idamycin)；丝裂霉素C格尔德霉素；除莠霉素；近灰霉素(ravidomycin)；和去乙酰近灰霉素(desacetylravidomycin)。
示例性长春花生物碱包括例如，酒石酸长春瑞滨长春新碱和长春地辛)；长春碱(也称为硫酸长春碱、长春花碱和VLB，和)；和长春瑞滨
示例性蛋白体抑制剂包括硼替佐米卡非佐米(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；艾沙佐米柠檬酸盐(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
在实施例中，与brentuximab组合向受试者给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。Brentuximab是抗CD30抗体和单甲基奥瑞斯他汀E的抗体-药物缀合物。在实施例中，受试者患有霍奇金淋巴瘤(HL)，例如复发或难治性HL。在实施例中，受试者包含CD30+HL。在实施例中，受试者已经历了自体干细胞移植(ASCT)。在实施例中，受试者未经历ASCT。在实施例中，例如每3周，例如静脉内地将brentuximab以约1-3mg/kg(例如约1-1.5、1.5-2、2-2.5、或2.5-3mg/kg)的剂量给予。
在实施例中，与brentuximab和达卡巴嗪组合或与brentuximab和苯达莫司汀组合向受试者给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。达卡巴嗪是化学名称为5-(3,3-二甲基-1-三苄基)咪唑-4-甲酰胺的烷化剂。苯达莫司汀是化学名称为4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸的烷化剂。在实施例中，受试者患有霍奇金淋巴瘤(HL)。在实施例中，受试者先前未用癌症疗法治疗。在实施例中，受试者的年龄是至少60岁，例如60、65、70、75、80、85、或更大。在实施例中，例如静脉内地将达卡巴嗪以约300-450mg/m2(例如约300-325、325-350、350-375、375-400、400-425、或425-450mg/m2)的剂量给予。在实施例中，例如静脉内地将苯达莫司汀以约75-125mg/m2(例如75-100或100-125mg/m2，例如约90mg/m2)的剂量给予。在实施例中，例如每3周，例如静脉内地将brentuximab以约1-3mg/kg(例如约1-1.5、1.5-2、2-2.5、或2.5-3mg/kg)的剂量给予。
在一些实施例中，与CD20抑制剂，例如抗CD20抗体(例如抗CD20单或双特异性抗体)或其片段组合向受试者给予本文所述的表达CAR的细胞。示例性抗CD20抗体包括但不限于利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、veltuzumab、obinutuzumab、TRU-015(Trubion制药公司)、ocaratuzumab、和Pro131921(基因泰克公司(Genentech))。参见例如，Lim等人Haematologica.[血液学]95.1(2010):135-43。
在一些实施例中，抗CD20抗体包括利妥昔单抗。利妥昔单抗是结合CD20并引起CD20表达细胞的细胞溶解的嵌合小鼠/人单克隆抗体IgG1κ，例如如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf中所述。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与利妥昔单抗组合给予受试者。在实施例中，受试者患有CLL或SLL。
在一些实施例中，静脉内(例如，如静脉内输注)给予利妥昔单抗。例如，每次输注提供约500-2000mg(例如约500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、或1900-2000mg)的利妥昔单抗。在一些实施例中，将利妥昔单抗以150mg/m2至750mg/m2，例如约150-175mg/m2、175-200mg/m2、200-225mg/m2、225-250mg/m2、250-300mg/m2、300-325mg/m2、325-350mg/m2、350-375mg/m2、375-400mg/m2、400-425mg/m2、425-450mg/m2、450-475mg/m2、475-500mg/m2、500-525mg/m2、525-550mg/m2、550-575mg/m2、575-600mg/m2、600-625mg/m2、625-650mg/m2、650-675mg/m2、或675-700mg/m2的剂量给予，其中m2表示受试者的体表面积。在一些实施例中，将利妥昔单抗以至少4天，例如4、7、14、21、28、35天、或更久的给药间隔给予。例如，将利妥昔单抗以至少0.5周，例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8周、或更久的给药间隔给予。在一些实施例中，将利妥昔单抗以本文所述的剂量和给药间隔给予一段时间，例如至少2周，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20周、或更久。例如，将利妥昔单抗以本文所述的剂量和给药间隔给予每治疗周期总共至少4个剂量(例如每治疗周期至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、或更多个剂量)。
在一些实施例中，抗CD20抗体包括奥法木单抗。奥法木单抗是分子量为大约149kDa的抗CD20IgG1κ人单克隆抗体。例如，使用转基因小鼠和杂交瘤技术产生奥法木单抗，并从重组鼠细胞系(NS0)表达和纯化。参见例如，www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；和临床试验标识号NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352、和NCT01397591。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与奥法木单抗组合给予受试者。在实施例中，受试者患有CLL或SLL。
在一些实施例中，如静脉内输注给予奥法木单抗。例如，每次输注提供约150-3000mg(例如约150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1200、1200-1400、1400-1600、1600-1800、1800-2000、2000-2200、2200-2400、2400-2600、2600-2800、或2800-3000mg)的奥法木单抗。在实施例中，将奥法木单抗以约300mg的起始剂量随后是2000mg的剂量给予例如持续约11个剂量，例如持续24周。在一些实施例中，将奥法木单抗以至少4天，例如4、7、14、21、28、35天、或更久的给药间隔给予。例如，将奥法木单抗以至少1周，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30周、或更久的给药间隔给予。在一些实施例中，将奥法木单抗以本文所述的剂量和给药间隔给予一段时间，例如至少1周，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60周或更久，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久，或1、2、3、4、5年或更久。例如，将奥法木单抗以本文所述的剂量和给药间隔给予每治疗周期总共至少2个剂量(例如每治疗周期至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、或更多个剂量)。
在一些情况下，抗CD20抗体包括奥瑞珠单抗。奥瑞珠单抗是人源化抗CD20单克隆抗体，例如，如临床试验标识号NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570，和Kappos等人Lancet.[柳叶刀]19.378(2011):1779-87中所述。
在一些情况下，抗CD20抗体包括veltuzumab。Veltuzumab是针对CD20的人源化单克隆抗体。参见例如，临床试验标识号NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581，和Goldenberg等人Leuk Lymphoma.[白血病和淋巴瘤]51(5)(2010):747-55。
在一些情况下，抗CD20抗体包括GA101。GA101(也称为obinutuzumab或RO5072759)是人源化和糖工程化的抗CD20单克隆抗体。参见例如，Robak.Curr.Opin.Investig.Drugs.[研究药物中的最新观点]10.6(2009):588-96；临床试验标识号：NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422、和NCT01414205；和www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。
在一些情况下，抗CD20抗体包括AME-133v。AME-133v(也称为LY2469298或ocaratuzumab)是针对CD20的人源化IgG1单克隆抗体，与利妥昔单抗相比，对FcγRIIIa受体具有增加的亲和力和增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。参见例如，Robak等人BioDrugs[生物制药]25.1(2011):13-25；和Forero-Torres等人Clin Cancer Res.[临床癌症研究]18.5(2012):1395-403。
在一些情况下，抗CD20抗体包括PRO131921。PRO131921是人源化抗CD20单克隆抗体，其被工程化以与利妥昔单抗相比具有与FcγRIIIa的更好结合和增强的ADCC。参见例如，Robak等人BioDrugs[生物制药]25.1(2011):13-25；和Casulo等人Clin Immunol.[临床免疫学]154.1(2014):37-46；和临床试验标识号NCT00452127。
在一些情况下，抗CD20抗体包括TRU-015。TRU-015是源自针对CD20的抗体的结构域的抗CD20融合蛋白。TRU-015小于单克隆抗体，但保留Fc介导的效应子功能。参见例如，Robak等人BioDrugs[生物制药]25.1(2011):13-25。TRU-015含有与人IgG1铰链、CH2、和CH3结构域连接但缺少CH1和CL结构域的抗CD20单链可变片段(scFv)。
在一些实施例中，本文所述的抗CD20抗体与本文所述的治疗剂(例如化学治疗剂(例如环磷酰胺、氟达拉滨、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、去甲基化剂、肽疫苗、抗肿瘤抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、烷化剂、抗微管或抗有丝分裂剂)、抗过敏剂、抗恶心剂(或止吐剂)、止痛剂、或细胞保护剂)缀合或以其他方式结合。
在实施例中，与B细胞淋巴瘤2(BCL-2)抑制剂(例如维奈妥拉(venetoclax)，也称为ABT-199或GDC-0199)和/或利妥昔单抗组合向受试者给予本文所述的表达CAR的细胞。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与维奈妥拉和利妥昔单抗组合给予受试者。维奈妥拉是抑制抗凋亡蛋白BCL-2的小分子。维奈妥拉具有化学名称：(4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺)。
在实施例中，受试者患有CLL。在实施例中，受试者患有复发CLL，例如受试者先前给予了癌症疗法。在实施例中，例如每天将维奈妥拉以约15-600mg(例如15-20、20-50、50-75、75-100、100-200、200-300、300-400、400-500、或500-600mg)的剂量给予。在实施例中，例如每月，例如静脉内地将利妥昔单抗以约350-550mg/m2(例如350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、或475-500mg/m2)的剂量给予。
在一些实施例中，与溶瘤病毒组合给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。在实施例中，溶瘤病毒能够在癌细胞中选择性地复制并引发癌细胞的死亡或减缓其生长。在一些情况下，溶瘤病毒对非癌细胞没有影响或影响很小。溶瘤病毒包括但不限于溶瘤腺病毒、溶瘤单纯疱疹病毒、溶瘤逆转录病毒、溶瘤细小病毒、溶瘤牛痘病毒、溶瘤Sinbis病毒、溶瘤流感病毒、或溶瘤RNA病毒(例如溶瘤呼肠孤病毒、溶瘤新城疫病毒(NDV)、溶瘤麻疹病毒、或溶瘤水疱性口炎病毒(VSV))。
在一些实施例中，溶瘤病毒是描述于US2010/0178684 A1中的病毒(例如重组溶瘤病毒)，该文献通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，例如如US2010/0178684 A1中所述，重组溶瘤病毒包含编码免疫或炎症响应抑制剂的核酸序列(例如异源核酸序列)，该文献通过引用以其全文并入本文。在实施例中，重组溶瘤病毒(例如溶瘤NDV)包含促凋亡蛋白(例如凋亡蛋白)、细胞因子(例如GM-CSF、干扰素-γ、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α)、免疫球蛋白(例如针对ED-B firbonectin的抗体)、肿瘤相关抗原、双特异性衔接蛋白(例如针对NDV HN蛋白的双特异性抗体或抗体片段以及T细胞共刺激受体，如CD3或CD28；或人IL-2与针对NDV HN蛋白的单链抗体之间的融合蛋白)。参见例如，Zamarin等人FutureMicrobiol.[未来微生物学]7.3(2012):347-67，该文献通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，溶瘤病毒是描述于US 8591881 B2、US 2012/0122185 A1、或US 2014/0271677A1中的嵌合溶瘤NDV，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，溶瘤病毒包含条件复制型腺病毒(CRAd)，其被设计成仅在癌细胞中复制。参见例如，Alemany等人Nature Biotechnol.[自然生物技术杂志]18(2000):723-27。在一些实施例中，溶瘤腺病毒包含描述于Alemany等人的第725页的表1中的一种，该文献通过引用以其全文并入本文。
示例性溶瘤病毒包括但不限于以下：
B组溶瘤腺病毒(ColoAd1)(PsiOxus Therapeutics公司)(参见例如，临床试验标识：NCT02053220)；ONCOS-102(先前称为CGTG-102)，其是包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的腺病毒(Oncos Therapeutics公司)(参见例如，临床试验标识：NCT01598129)；VCN-01，其是编码人PH20透明质酸酶的遗传修饰的溶瘤人腺病毒(VCNBiosciences,S.L.公司)(参见例如，临床试验标识：NCT02045602和NCT02045589)；
条件复制型腺病毒ICOVIR-5，其是经修饰以在癌细胞中用失调的视网膜母细胞瘤/E2F途径选择性复制的源自野生型人腺病毒血清型5(Had5)的病毒，(Institut Catalàd'Oncologia公司)(参见例如，临床试验标识：NCT01864759)；Celyvir，其包含用ICOVIR5感染的骨髓来源的自体间充质干细胞(MSC)，该ICOVIR5是溶瘤腺病毒(西班牙马德里的小耶稣大学儿童医院(Hospital Infantil UniversitarioJesús,Madrid,Spain)/RamonAlemany)(参见例如，临床试验标识：NCT01844661)；CG0070，其是条件性复制的溶瘤血清型5腺病毒(Ad5)，其中人E2F-1启动子驱动必需E1a病毒基因的表达，从而限制病毒复制和对Rb途径缺陷型肿瘤细胞的细胞毒性(Cold Genesys公司)(参见例如，临床试验标识：NCT02143804)；或DNX-2401(以前命名为δ-24-RGD)，其是已被工程化以在视网膜母细胞瘤(Rb)-途径缺陷型细胞中选择性复制，并更有效感染表达某些RGD结合整联蛋白的细胞的腺病毒(纳瓦拉临床大学，纳瓦拉大学/DNAtrix公司(Clinica Universidad de Navarra,Universidad de Navarra/DNAtrix,Inc.))(参见例如，临床试验标识：NCT01956734)。
在一些实施例中，通过注射(例如皮下、动脉内、静脉内、肌肉内、鞘内、或腹膜内注射)给予本文所述的溶瘤病毒。在实施例中，肿瘤内、经皮、经粘膜、口服、鼻内、或通过肺部给予来给予本文所述的溶瘤病毒。
在一个实施例中，与降低Treg细胞群的分子组合向受试者给予表达本文所述CAR的细胞。减少(例如耗尽)Treg细胞数量的方法是本领域已知的，并且包括例如CD25耗尽、环磷酰胺给予、调制GITR功能。不希望受理论的约束，据信在单采血液成分术之前或给予本文所述的表达CAR的细胞之前减少受试者中的Treg细胞数量减少了肿瘤微环境中不需要的免疫细胞(例如Tregs)的数量，并降低受试者的复发风险。
在一个实施例中，与靶向GITR和/或调制GITR功能的分子(如耗尽调节T细胞(Tregs)的GITR激动剂和/或GITR抗体)组合向受试者给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。在一个实施例中，在表达CAR的细胞之前给予GITR结合分子和/或调制GITR功能的分子(例如GITR激动剂和/或Treg耗尽GITR抗体)。例如，在一个实施例中，可以在细胞的单采血液成分术之前给予GITR激动剂。在一个实施例中，受试者患有CLL。示例性GITR激动剂包括例如，GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如二价抗GITR抗体)例如像描述于以下中的GITR融合蛋白：美国专利号：6,111,090、欧洲专利号：090505B1、美国专利号：8,586,023、PCT公布号：WO 2010/003118和2011/090754，或描述于例如以下中的抗GITR抗体：美国专利号：7,025,962、欧洲专利号：1947183B1、美国专利号：7,812,135、美国专利号：8,388,967、美国专利号：8,591,886、欧洲专利号：EP 1866339、PCT公布号：WO 2011/028683、PCT公布号：WO 2013/039954、PCT公布号：WO 2005/007190、PCT公布号：WO 2007/133822、PCT公布号：WO 2005/055808、PCT公布号：WO 99/40196、PCT公布号：WO 2001/03720、PCT公布号：WO 99/20758、PCT公布号：WO 2006/083289、PCT公布号：WO2005/115451、美国专利号：7,618,632、和PCT公布号：WO 2011/051726。
在一个实施例中，与mTOR抑制剂(例如本文所述的mTOR抑制剂，例如雷帕霉素类似物(如依维莫司))组合向受试者给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。在一个实施例中，在表达CAR的细胞之前给予mTOR抑制剂。例如，在一个实施例中，可以在细胞的单采血液成分术之前给予mTOR抑制剂。在一个实施例中，受试者患有CLL。
在一个实施例中，与GITR激动剂(例如本文所述的GITR激动剂)组合向受试者给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。在一个实施例中，在表达CAR的细胞之前给予GITR激动剂。例如，在一个实施例中，可以在细胞的单采血液成分术之前给予GITR激动剂。在一个实施例中，受试者患有CLL。
在一个实施例中，与蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如本文所述的蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂)组合向受试者给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。在一个实施例中，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂，例如本文所述的SHP-1抑制剂，例如像葡萄糖酸锑钠。在一个实施例中，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-2抑制剂。
在一个实施例中，本文所述的表达CAR的细胞可以与激酶抑制剂组合使用。在一个实施例中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如本文所述的CDK4抑制剂，例如CDK4/6抑制剂，例如像6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮，盐酸盐(也称为帕柏西利(palbociclib)或PD0332991)。在一个实施例中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如本文所述的BTK抑制剂，例如像依鲁替尼。在一个实施例中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如本文所述的mTOR抑制剂，例如像雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。该mTOR抑制剂可以是例如mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如本文所述的mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一个实施例中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，例如本文所述的MNK抑制剂，例如像4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。该MNK抑制剂可以是例如MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。在一个实施例中，激酶抑制剂是本文所述的双PI3K/mTOR抑制剂，例如像PF-04695102。
在一个实施例中，激酶抑制剂是选自以下的CDK4抑制剂：aloisine A；flavopiridol或HMR-1275，2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]-4-苯并吡喃酮；克唑替尼(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮，盐酸(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；英迪舒兰(indisulam)(E7070)；roscovitine(CYC202)；帕柏西利(PD0332991)；地那西利(dinaciclib)(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基噁唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮杂-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰基氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；和XL281(BMS908662)。
在一个实施例中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如帕柏西利(PD0332991)，并且将帕柏西利以每天约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如75mg、100mg或125mg)的剂量给予一段时间，例如给予28天周期的14-21天、或给予21天周期的7-12天。在一个实施例中，给予帕柏西利的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。
在实施例中，与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4或6抑制剂(例如本文所述的CDK4抑制剂或CDK6抑制剂)组合向受试者给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。在实施例中，与CDK4/6抑制剂(例如靶向CDK4和CDK6两者的抑制剂)，例如本文所述的CDK4/6抑制剂组合向受试者给予本文所述的表达CAR的细胞。在一个实施例中，受试者患有MCL。MCL是一种侵袭性癌症，其对目前可用的疗法响应差，即基本上无法治愈。在许多MCL的病例中，细胞周期蛋白D1(CDK4/6的调节剂)在MCL细胞中表达(例如由于涉及免疫球蛋白和细胞周期蛋白D1基因的染色体易位)。因此，不受理论的约束，认为MCL细胞对CDK4/6抑制高度敏感，具有高特异性(即对正常免疫细胞的影响最小)。单独的CDK4/6抑制剂在治疗MCL方面具有一些功效，但仅实现了具有高复发率的部分缓解。示例性CDK4/6抑制剂是LEE011(也称为利波西利(ribociclib))，其结构如下所示。
不受理论的约束，据信例如与单独的CDK4/6抑制剂相比，给予本文所述的表达CAR的细胞与CDK4/6抑制剂(例如LEE011或本文所述的其他CDK4/6抑制剂)可以实现更高的响应性，例如具有更高的缓解率和/或更低的复发率。
在一个实施例中，激酶抑制剂是选自以下的BTK抑制剂：依鲁替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在优选的实施例中，BTK抑制剂不降低或抑制白细胞介素-2-诱导型激酶(ITK)的激酶活性，并且选自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在一个实施例中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如依鲁替尼(PCI-32765)。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与BTK抑制剂(例如依鲁替尼)组合给予受试者。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与依鲁替尼(也称为PCI-32765)组合给予受试者。依鲁替尼具有化学名称：(1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮)。
在实施例中，受试者患有CLL、套细胞淋巴瘤(MCL)、或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。例如，受试者在染色体17的短臂中具有缺失(例如白血病细胞中的del(17p))。在其他实例中，受试者不具有del(17p)。在实施例中，受试者患有复发CLL或SLL，例如受试者先前已给予了癌症疗法(例如先前已给予了一次、两次、三次、或四次以前癌症疗法)。在实施例中，受试者患有难治性CLL或SLL。在其他实施例中，受试者患有滤泡性淋巴瘤，例如复发或难治性滤泡性淋巴瘤。在一些实施例中，将依鲁替尼以约300-600mg/天(例如约300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、或550-600mg/天，例如约420mg/天或约560mg/天)的剂量例如口服给予。在实施例中，将依鲁替尼以每天约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如250mg、420mg或560mg)的剂量给予一段时间，例如给予21天周期、或给予28天周期。在一个实施例中，给予依鲁替尼的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。
在一些实施例中，将依鲁替尼与利妥昔单抗组合给予。参见例如，Burger等人(2013)Ibrutinib In Combination With Rituximab(iR)Is Well Tolerated andInduces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk ChronicLymphocytic Leukemia(CLL):New,Updated Results Of a Phase II Trial In40Patients[依鲁替尼与利妥昔单抗(iR)组合是耐受良好的并且在患有高风险慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者中诱导高比率的持久缓解：40名患者中的II期试验的新的、更新结果]，第55届ASH年会和博览会上发表的摘要675,洛杉矶新奥尔良,12月7-10日。不受理论的约束，认为添加依鲁替尼增强T细胞增殖性响应并且可以将T细胞从T辅助细胞2(Th2)变为T辅助细胞1(Th1)表型。Th1和Th2是辅助性T细胞的表型，其中Th1相比Th2指导不同的免疫响应途径。Th1表型与促炎响应相关，例如用于杀伤细胞(如细胞内病原体/病毒或癌细胞)，或使自身免疫响应永久化。Th2表型与嗜酸性粒细胞积累和抗炎症响应相关。
在本文的方法、用途、和组合物的一些实施例中，BTK抑制剂是描述于国际申请WO/2015/079417中的BTK抑制剂，该文献通过引用以其全文并入本文。例如，在一些实施例中，BTK抑制剂是具有式(I)的化合物或其药学上可接受的盐；
其中，
R1是氢、任选被羟基取代的C1-C6烷基；
R2是氢或卤素；
R3是氢或卤素；
R4是氢；
R5是氢或卤素；
或者R4和R5彼此附接并且代表键-CH2-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-、-CH＝CH-CH2-；-CH2-CH＝CH-；或-CH2-CH2-CH2-；
R6和R7彼此独立地代表H，任选被羟基取代的C1-C6烷基，任选被卤素或羟基取代的C3-C6环烷基、或卤素；
R8、R9、R、R’、R10和R11彼此独立地代表H、或任选被C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基；或者R8、R9、R、R'、R10和R11中的任何两个与它们所键合的碳原子一起可形成3-6元饱和碳环；
R12是氢或任选被卤素或C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基；
或者R12和R8、R9、R、R'、R10或R11中的任一个与它们所键合的原子一起形成4、5、6或7元氮杂环，该环可以任选被卤素、氰基、羟基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代；
n是0或1；并且
R13是任选被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或N,N-二-C1-C6烷基氨基取代的C2-C6烯基；任选被C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代的C2-C6炔基；或任选被C1-C6烷基取代的C2-C6亚烷基氧化物。
在一些实施例中，具有式I的BTK抑制剂选自：N-(3-(5-((1-丙烯酰氮杂环丁-3-基)氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-烯酰)氮杂环丁-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-((1-丙炔酰氮杂环丁-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-炔酰基)氮杂环丁-3-基)氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-((1-丙烯酰哌啶-4-基)氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(4-甲氧基-N-甲基丁-2-烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(2-((4-氨基-6-(3-(4-环丙基-2-氟苯甲酰胺基)-5-氟-2-甲基苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基环氧乙烷-2-甲酰胺；N-(2-((4-氨基-6-(3-(6-环丙基-8-氟-1-氧代异喹啉-2(1H)-基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基丙烯酰胺；N-(3-(5-(2-丙烯酰胺基乙氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-乙基丙烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-(2-氟乙基)丙烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-((1-丙烯酰胺基环丙基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-(2-丙烯酰胺基丙氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(丁-2-烯酰胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙烯酰胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-烯酰胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(3-(N-甲基丙烯酰胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-((1-丙烯酰吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-炔酰基)吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-2-(3-(5-((1-丙烯酰吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮；N-(2-((4-氨基-6-(3-(6-环丙基-1-氧代-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧基)乙基)-N-甲基丙烯酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；2-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮；N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯酰-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4S)-1-(丁-2-炔酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-氟吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-((1-丙烯酰氮杂环丁-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-((1-丙炔酰氮杂环丁-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-2-(3-(5-((1-丙烯酰氮杂环丁-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮；(R)-N-(3-(5-((1-丙烯酰氮杂环丁-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(R)-N-(3-(5-((1-丙烯酰哌啶-3-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2R,3S)-1-丙烯酰-3-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-氰基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；或N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯酰-4-氰基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺。
除非另有规定，否则上文在描述具有式I的BTK抑制剂时使用的化学术语根据其在国际申请WO/2015/079417中列出的含义使用，该文献通过引用以其全文并入本文。
在一个实施例中，激酶抑制剂是选自以下的mTOR抑制剂：坦罗莫司；地磷莫司(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧杂-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；simapimod；(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉正离子-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-，内盐(SEQ ID NO:526)(SF1126)；和XL765。
在一个实施例中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如雷帕霉素，并且将雷帕霉素以每天约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如6mg)的剂量给予一段时间，例如21天周期、或28天周期。在一个实施例中，给予雷帕霉素的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。在一个实施例中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如依维莫司，并且将依维莫司以每天约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如10mg)的剂量给予一段时间，例如28天周期。在一个实施例中，给予依维莫司的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期。
在一个实施例中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，选自CGP052088；4-氨基-3-(对氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；cercosporamide；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在一个实施例中，激酶抑制剂是双磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR抑制剂，选自2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384，PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；apitolisib(GDC-0980，RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(XL765)。
在一个实施例中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，选自CGP052088；4-氨基-3-(对氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；cercosporamide；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在实施例中，与磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂(例如本文所述的PI3K抑制剂，例如idelalisib或duvelisib)和/或利妥昔单抗组合向受试者给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与idelalisib和利妥昔单抗组合给予受试者。在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与duvelisib和利妥昔单抗组合给予受试者。Idelalisib(也称为GS-1101或CAL-101；吉利德公司(Gilead))是阻断PI3K的δ同种型的小分子。Idelalisib具有化学名称：(5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(7H-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3H)-喹唑啉酮)。
Duvelisib(也称为IPI-145；无限制药公司(Infinity Pharmaceuticals)和艾伯维公司(Abbvie))是阻断PI3K-δ,γ的小分子。Duvelisib具有化学名称(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-1(2H)-异喹啉酮)。
在实施例中，受试者患有CLL。在实施例中，受试者患有复发CLL，例如受试者先前已给予了癌症疗法(例如先前已给予了抗CD20抗体或先前已给予了依鲁替尼)。例如，受试者在染色体17的短臂中具有缺失(例如白血病细胞中的del(17p))。在其他实例中，受试者不具有del(17p)。在实施例中，受试者包含含有免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中的突变的白血病细胞。在其他实施例中，受试者不包含含有免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中的突变的白血病细胞。在实施例中，受试者在染色体11的长臂中具有缺失(del(11q))。在其他实施例中，受试者不具有del(11q)。在实施例中，例如BID将idelalisib以约100-400mg(例如100-125、125-150、150-175、175-200、200-225、225-250、250-275、275-300、325-350、350-375、或375-400mg)的剂量给予。在实施例中，例如每天两次将duvelisib以约15-100mg(例如约15-25、25-50、50-75、或75-100mg)的剂量给予。在实施例中，例如静脉内地将利妥昔单抗以约350-550mg/m2(例如350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、或475-500mg/m2)的剂量给予。
在一个实施例中，激酶抑制剂是双磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR抑制剂，选自2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384，PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；apitolisib(GDC-0980，RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(XL765)。
在实施例中，将本文所述的表达CAR的细胞与间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂组合给予受试者。示例性ALK激酶包括但不限于克唑替尼(辉瑞公司)、ceritinib(诺华公司)、艾乐替尼(Chugai公司)、brigatinib(也称为AP26113；阿瑞雅德公司(Ariad))、entrectinib(Ignyta公司)、PF-06463922(辉瑞公司)、TSR-011(Tesaro公司)(参见例如，临床试验标识号NCT02048488)、CEP-37440(梯瓦公司(Teva))、和X-396(Xcovery公司)。在一些实施例中，受试者患有实体癌，例如本文所述的实体癌，例如肺癌。
克唑替尼的化学名称是3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺。ceritinib的化学名称是5-氯-N2-[2-异丙氧基-5-甲基-4-(4-哌啶基)苯基]-N4-[2-(异丙基磺酰基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。艾乐替尼的化学名称是9-乙基-6,6-二甲基-8-(4-吗啉代哌啶-1-基)-11-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[b]咔唑-3-甲腈。brigatinib的化学名称是5-氯-N2-{4-[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]-2-甲氧基苯基}-N4-[2-(二甲基磷酰基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。entrectinib的化学名称是N-(5-(3,5-二氟苄基)-1H-吲唑-3-基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)苯甲酰胺。PF-06463922的化学名称是(10R)-7-氨基-12-氟-2,10,16-三甲基-15-氧代-10,15,16,17-四氢-2H-8,4-(次甲基)吡唑并[4,3-h][2,5,11]-苯并二氮杂环十四因-3-甲腈。CEP-37440的化学结构是(S)-2-((5-氯-2-((6-(4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基)-1-甲氧基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]轮烯-2-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-N-甲基苯甲酰胺。X-396的化学名称是(R)-6-氨基-5-(1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)哒嗪-3-甲酰胺。
还可以使用抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶的药物(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶的药物(雷帕霉素)(Liu等人,Cell[细胞]66:807-815,1991；Henderson等人,Immun.[免疫学]73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.[免疫学当前观点]5:763-773,1993)。在另一个方面，本披露内容的细胞组合物可以与骨髓移植、使用化疗剂(如氟达拉滨)进行的T细胞消融疗法、外束放射疗法(XRT)、环磷酰胺、和/或抗体(如OKT3或CAMPATH)一起(例如之前、同时或之后)给予患者。在一个方面，在B细胞消融疗法(如与CD20反应的药剂，例如Rituxan)后给予本披露内容的细胞组合物。例如，在一个实施例中，受试者可以经受使用高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些实施例中，在该移植后，受试者接受输注本披露内容的扩增的免疫细胞。在另外的实施例中，在手术之前或之后给予扩增的细胞。
在实施例中，与吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)抑制剂组合向受试者给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。IDO是催化氨基酸L-色氨酸降解为犬尿氨酸的酶。许多癌症过表达IDO，例如前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌、和肺癌。pDC、巨噬细胞、和树突细胞(DC)可以表达IDO。不受理论的约束，认为L-色氨酸的减少(例如，由IDO催化)通过诱导T细胞无反应性和细胞凋亡而导致免疫抑制环境。因此，不受理论的约束，认为IDO抑制剂可以例如通过降低表达CAR的免疫细胞的抑制或死亡来增强本文所述表达CAR的细胞的功效。在实施例中，受试者患有实体瘤，例如本文所述的实体瘤，例如前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌、或肺癌。IDO的示例性抑制剂包括但不限于1-甲基-色氨酸、英多莫德(indoximod)(纽琳基因公司(NewLink Genetics))(参见例如，临床试验标识号NCT01191216；NCT01792050)、和INCB024360(因赛特公司(Incyte Corp.))(参见例如，临床试验标识号NCT01604889；NCT01685255)
在实施例中，与骨髓来源的抑制细胞(MDSC)的调制剂组合向受试者给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。MDSC在许多实体瘤的外周和肿瘤部位积累。这些细胞抑制T细胞响应，从而阻碍表达CAR的细胞疗法的功效。不受理论的约束，认为给予MDSC调制剂增强本文所述表达CAR的细胞的功效。在一个实施例中，受试者患有实体瘤，例如本文所述的实体瘤，例如成胶质细胞瘤。MDSC的示例性调制剂包括但不限于MCS110和BLZ945。MCS110是针对巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的单克隆抗体(mAb)。参见例如，临床试验标识号NCT00757757。BLZ945是集落刺激因子1受体(CSF1R)的小分子抑制剂。参见例如，Pyonteck等人Nat.Med.[自然医学]19(2013):1264-72。BLZ945的结构在以下示出。
在实施例中，与抑制或降低免疫抑制性浆细胞活性的药剂组合向受试者给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和本文的PD-1抑制剂)。免疫抑制性浆细胞已被证实阻碍T细胞依赖性免疫原性化疗，如奥沙利铂(Shalapour等人,Nature[自然]2015,521:94-101)。在一个实施例中，免疫抑制性浆细胞可以表达IgA、白细胞介素(IL)-10、和PD-L1中的一种或多种。在一个实施例中，该药剂是BCMA表达CAR的细胞。
在一些实施例中，与白细胞介素-15(IL-15)多肽、白细胞介素-15受体α(IL-15Ra)多肽、或IL-15多肽和IL-15Ra多肽两者的组合(例如hetIL-15(Admune Therapeutics公司))组合向受试者给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。hetIL-15是IL-15和IL-15Ra的异二聚体非共价复合物。hetIL-15描述于例如U.S.8,124,084、U.S.2012/0177598、U.S.2009/0082299、U.S.2012/0141413、和U.S.2011/0081311中，这些文献通过引用并入本文。在实施例中，皮下给予het-IL-15。在实施例中，受试者患有癌症，例如实体癌，例如黑素瘤或结肠癌。在实施例中，受试者患有转移癌。
在实施例中，与药剂(例如细胞毒性剂或化疗剂)、生物疗法(例如抗体(例如单克隆抗体)或细胞疗法)、或抑制剂(例如激酶抑制剂)组合，给予患有本文所述疾病的受试者本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。在实施例中，与细胞毒性剂，例如CPX-351(Celator制药公司)、阿糖胞苷、柔红霉素、沃沙洛星(vosaroxin)(Sunesis制药公司)、沙西他滨(sapacitabine)(Cyclacel制药公司)、伊达比星、或米托蒽醌组合给予受试者本文所述的表达CAR的细胞。CPX-351是一种脂质体配制品，其包含5:1摩尔比的阿糖胞苷和柔红霉素。在实施例中，与低甲基化剂(例如DNA甲基转移酶抑制剂，例如阿扎胞苷或地西他滨)组合给予受试者本文所述的表达CAR的细胞。在实施例中，与生物疗法(例如抗体或细胞疗法，例如225Ac-林妥珠单抗(lintuzumab)(Actimab-A；Actinium制药公司)、IPH2102(Innate制药公司/百时美施贵宝公司)、SGN-CD33A(西雅图遗传学公司)、或吉妥单抗(Mylotarg；辉瑞公司))组合给予受试者本文所述的表达CAR的细胞。SGN-CD33A是抗体-药物缀合物(ADC)，其包含附接到抗CD33抗体的吡咯并苯并二氮杂二聚体。Actimab-A是用锕标记的抗CD33抗体(林妥珠单抗)。IPH2102是靶向杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)的单克隆抗体。在实施例中，与FLT3抑制剂(例如索拉非尼(拜耳公司(Bayer))、米哚妥林(诺华公司)、奎扎替尼(quizartinib)(Daiichi Sankyo公司)、克瑞拉尼(crenolanib)(Arog制药公司)、PLX3397(Daiichi Sankyo公司)、AKN-028(Akinion制药公司)、或ASP2215(安斯泰来公司(Astellas))组合给予受试者本文所述的表达CAR的细胞。在实施例中，与异柠檬酸脱氢酶(IDH)抑制剂(例如AG-221(Celgene公司/Agios公司)或AG-120(Agios公司/Celgene公司))组合给予受试者本文所述的表达CAR的细胞。在实施例中，与细胞周期调节剂(例如polo样激酶1(Plk1)的抑制剂，例如沃拉舍替(volasertib)(勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelheim))；或细胞周期蛋白依赖性激酶9(Cdk9)的抑制剂，例如阿沃西地(alvocidib)(Tolero制药公司/赛诺菲-安万特公司(Sanofi Aventis))组合给予受试者本文所述的表达CAR的细胞。在实施例中，与B细胞受体信号传导网络抑制剂(例如B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)的抑制剂，例如维奈妥拉(艾伯维公司/罗氏公司(Roche)))；或布鲁顿酪氨酸激酶(Btk)的抑制剂(例如依鲁替尼(Pharmacyclics公司/强生詹森制药公司(Johnson&Johnson Janssen Pharmaceutical)))组合给予受试者本文所述的表达CAR的细胞。在实施例中，与M1氨基肽酶的抑制剂(例如托多司他(tosedostat)(CTI生物制药公司(CTI BioPharma)/Vernalis公司))；组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的抑制剂(例如普诺司他(pracinostat)(MEI制药公司))；多激酶抑制剂(例如利戈舍替(rigosertib)(Onconova制药公司(Onconova Therapeutics)/百特公司(Baxter)/信必优公司(SymBio)))；或肽CXCR4反向激动剂(例如BL-8040(BioLineRx公司))组合给予受试者本文所述的表达CAR的细胞。
在另一个实施例中，在移植(例如同种异体干细胞移植)细胞之前，受试者接受输注表达CAR的细胞(例如本披露内容的组合物)。在优选的实施例中，表达CAR的细胞例如通过电穿孔编码CAR的mRNA瞬时表达CAR，由此在输注供体干细胞之前终止CAR的表达以避免植入失败。
一些患者在给予期间或之后可能经历对本披露内容化合物和/或一种或多种其他抗癌剂的过敏反应；因此，经常给予抗过敏剂以最小化过敏反应的风险。适合的抗过敏剂包括皮质类固醇，如地塞米松(例如)、倍氯米松(例如)、氢化可的松(也称为可的松、氢化可的松琥珀酸纳、氢化可的松磷酸钠，并且以商品名磷酸氢化可的松、Hydrocort和销售)、泼尼松龙(以商品名和销售)、泼尼松(以商品名Liquid和销售)、甲泼尼龙(也称为6-甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥珀酸纳，以商品名 和销售)；抗组胺剂，如苯海拉明(例如)、安泰乐、和赛庚啶；和支气管扩张剂，如β-肾上腺素能受体激动剂、沙丁胺醇(例如)、和特布他林
一些患者在给予本披露内容化合物和/或一种或多种其他抗癌剂期间或之后可能经历恶心；因此，将止吐剂用于预防恶心(上部胃)和呕吐。适合的止吐剂包括阿瑞匹坦昂丹司琼盐酸格拉司琼劳拉西泮地塞米松丙氯拉嗪卡索匹坦(和)、及其组合。
经常开出用于缓解治疗期间经历的疼痛的药物以使患者更舒适。经常使用常见的非处方镇痛药，如然而，阿片类镇痛药如氢可酮/对乙酰氨基酚或氢可酮/醋氨酚(例如)、吗啡(例如或)、羟考酮(例如或)、盐酸羟吗啡酮和芬太尼(例如)也可用于中度或重度疼痛。
为了保护正常细胞免受治疗毒性并且限制器官毒性，可以将细胞保护剂(如神经保护剂、自由基清除剂、心脏保护剂、蒽环霉素外渗中和剂、营养素等)用作辅助疗法。适合的细胞保护剂包括氨磷汀谷氨酰胺、二美司钠美司钠右雷佐生(或)、xaliproden和甲酰四氢叶酸(也称为甲酰四氢叶酸钙、嗜橙菌因子和亚叶酸)。
由代号、通用名或商品名鉴定的活性化合物的结构可以取自标准纲要“默克索引(The Merck Index)”的实际版本或来自数据库，例如专利国际(例如IMS世界出版物)。
可以与本披露内容的化合物组合使用的上述化合物可以如本领域所述地制备和给予，如在上文引用的文献中那样。
在一个实施例中，本披露内容提供了单独或与其他抗癌剂一起的药物组合物，这些药物组合物包含至少一种本披露内容的化合物(例如本披露内容的化合物)或其药学上可接受的盐以及适于给予人或动物受试者的药学上可接受的载体。
在一个实施例中，本披露内容提供了治疗患有细胞增殖性疾病(如癌症)的人或动物受试者的方法。本披露内容提供了治疗需要这种治疗的人或动物受试者的方法，这些方法包括单独或与其他抗癌剂组合，向受试者给予治疗有效量的本披露内容化合物(例如本披露内容的化合物)或其药学上可接受的盐。
具体地，组合物将作为组合治疗剂一起配制或分别给予。
在组合疗法中，本披露内容的化合物和一种或多种其他抗癌剂可以同时、并行或顺序给予而没有特定的时间限制，其中这样的给予在患者体内提供治疗有效水平的两种化合物。
在优选的实施例中，本披露内容的化合物和一种或多种其他抗癌剂通常通过输注或口服以任何顺序顺序地给予。给药方案可以根据疾病的阶段、患者的身体状况、各药物的安全性能、各药物的耐受性以及主治医师和一名或多名医生所熟知的给予该组合的其他标准而有所不同。本披露内容的化合物和一种或多种其他抗癌剂可以在彼此分开的数分钟、数小时、数天或、甚至数周内给予，这取决于用于治疗的特定周期。此外，该周期可以包括在治疗周期期间比一种药物更频繁地给予另一种药物，并且每次给予药物时的剂量不同。
在本披露内容的另一个方面，提供了包含一种或多种本披露内容的化合物和如本文所披露的组合搭档的试剂盒。代表性试剂盒包括(a)本披露内容的化合物或其药学上可接受的盐，(b)至少一种例如如以上所指出的组合搭档，其中这种试剂盒可以包括包装说明书或其他标记(包括用于给予的指示)。
本披露内容的化合物还可以有利地与已知的治疗方法(例如激素或尤其是放射的给予)组合使用。本披露内容的化合物可以特别地用作放射增敏剂，尤其用于治疗对放射疗法表现出差敏感性的肿瘤。
在一个实施例中，可以给予受试者减少或改善与给予表达CAR的细胞相关的副作用的药剂。与给予表达CAR的细胞相关的副作用包括但不限于CRS和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)，也称为巨噬细胞活化综合征(MAS)。
因此，本文所述的方法可以包括向受试者给予本文所述的表达CAR的细胞，并且进一步给予一种或多种药剂以控制由用表达CAR的细胞进行治疗产生的可溶性因子的升高水平。在一个实施例中，受试者中升高的可溶性因子是IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-6中的一种或多种。在一个实施例中，受试者中升高的因子是IL-1、GM-CSF、IL-10、IL-8、IL-5和fraktalkine中的一种或多种。因此，用于治疗该副作用的药剂可以是中和这些可溶性因子中的一种或多种的药剂。在一个实施例中，中和这些可溶形式中的一种或多种的药剂是抗体或其抗原结合片段。此类药剂的实例包括但不限于类固醇(例如皮质类固醇)、TNFα的抑制剂、和IL-6的抑制剂。TNFα抑制剂的实例是抗TNFα抗体分子如英夫利昔单抗、阿达木单抗、塞妥珠单抗、和戈利木单抗。TNFα抑制剂的另一个实例是融合蛋白(如依那西普)。TNFα的小分子抑制剂包括但不限于黄嘌呤衍生物(例如己酮可可碱)和安非他酮。IL-6抑制剂的实例是抗IL-6抗体分子如托珠单抗(toc)、sarilumab、伊斯利莫、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301、和FM101。在一个实施例中，抗IL-6抗体分子是托珠单抗。基于IL-1R的抑制剂的实例是阿那白滞素。
在一些实施例中，给予受试者皮质类固醇，例如像甲泼尼龙、氢化可的松等。
在一些实施例中，给予受试者血管加压剂，例如像去甲肾上腺素、多巴胺、去氧肾上腺素、肾上腺素、加压素、或其组合。
在一个实施例中，可以给予受试者解热剂。在一个实施例中，可以给予受试者镇痛剂。
在一个实施例中，可以进一步给予受试者增强表达CAR的细胞活性或适合性的药剂。例如，在一个实施例中，该药剂可以是抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子的药剂。在一些实施例中，调制或调节T细胞功能的分子是抑制性分子。在一些实施例中，抑制性分子(例如程序性死亡1(PD-1)或PD-1配体(PD-L1))可以降低表达CAR的细胞产生免疫效应子响应的能力。抑制性分子的实例包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ。抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子(例如通过在DNA、RNA、或蛋白质水平上的抑制)可以优化表达CAR的细胞的性能。在实施例中，可以将例如如本文所述的药剂，例如抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA、聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、或锌指核酸内切酶(ZFN)用于抑制抑制性分子在表达CAR的细胞中的表达。在一个实施例中，该抑制剂是shRNA。
在一个实施例中，调制或调节(例如抑制)T细胞功能的药剂在表达CAR的细胞内被抑制。在这些实施例中，将抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子与编码CAR组分(例如所有组分)的核酸连接。在一个实施例中，将编码抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子与启动子(例如H1-或U6-衍生的启动子)可操作地连接，使得抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子表达，例如在表达CAR的细胞内表达。参见例如，Tiscornia G.,“Development ofLentiviral Vectors Expressing siRNA[表达siRNA的慢病毒载体的开发]，”Gene Transfer:Delivery and Expression of DNA and RNA[基因转移：DNA和RNA的递送和表 达]中的第3章(Friedmann和Rossi编辑)。Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],美国纽约冷泉港,2007；Brummelkamp TR等人(2002)Science[科学]296:550-553；Miyagishi M等人(2002)Nat.Biotechnol.[自然生物技术]19:497-500。在一个实施例中，编码抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子存在于包含编码CAR组分(例如所有组分)的核酸分子的同一载体(例如慢病毒载体)上。这样的实施例中，编码抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子位于编码CAR组分(例如所有组分)的核酸5’-或3’-的载体(例如慢病毒载体)上。编码抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子可以在与编码CAR组分(例如所有组分)的核酸相同或不同的方向上转录。在一个实施例中，编码抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子存在于除包含编码CAR组分(例如所有组分)的核酸分子的载体之外的载体上。在一个实施例中，编码抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子在表达CAR的细胞内瞬时表达。在一个实施例中，编码抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子稳定地整合到表达CAR的细胞的基因组中。用于表达CAR组分(例如所有组分)以及抑制调制或调节(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的示例性载体的构型在例如2014年12月19日提交的国际公布WO 2015/090230的图47中提供，该文献通过引用以其全文并入本文。
使用检查点分子抑制剂的组合疗法
在一个实施例中，调制或调节(例如抑制)T细胞功能的药剂可以是例如结合抑制性分子的抗体或抗体片段。例如，该药剂可以是结合PD-1、PD-L1、PD-L2或CTLA4的抗体或抗体片段(例如ipilimumab(也称为MDX-010和MDX-101，并且作为销售；百时美施贵宝公司；Tremelimumab(可购自辉瑞公司的IgG2单克隆抗体，以前称为ticilimumab，CP-675,206))。在一个实施例中，该药剂是结合TIM3的抗体或抗体片段。在一个实施例中，该药剂是结合LAG3的抗体或抗体片段。在一个实施例中，该药剂是结合PD-L1的抗体或抗体片段。
上文更详细地描述了PD-1。PD1的两个配体，PD-L1和PD-L2已证明在与PD1结合后下调T细胞活化(Freeman等人2000J Exp Med[实验医学杂志]192:1027-34；Latchman等人2001Nat Immunol[自然免疫学]2:261-8；Carter等人2002Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]32:634-43)。PD-L1在人癌症中很丰富(Dong等人2003J Mol Med[分子医学杂志]81:281-7；Blank等人2005Cancer Immunol.Immunother[癌症免疫学免疫疗法]54:307-314；Konishi等人2004Clin Cancer Res[临床癌症研究]10:5094)。通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制。术语“程序性死亡配体1”或“PD-L1”包括同种型，哺乳动物例如人PD-L1、人PD-1的物种同源物、和包含至少一个与PD-L1的共同表位的类似物。PD-L1(例如人PD-1)的氨基酸序列是本领域已知的，例如Dong等人(1999)Nat Med.[自然医学]5(12):1365-9；Freeman等人(2000)J Exp Med.[实验医学杂志]192(7):1027-34)。
例如PD-L1和PD-L2的抗体、抗体片段、和其他抑制剂(例如小分子；多肽，例如融合蛋白；或抑制性核酸；例如siRNA或shRNA抑制剂)是本领域可得的，并且可以与本文所述的CAR(例如CD19 CAR)(例如和PD-1抑制剂)组合使用。MEDI4736(医学免疫公司(Medimmune))是人单克隆抗体，其结合PDL1并且抑制配体与PD1的相互作用。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体是抗PD-L1抗体分子，如题为“PD-L1的抗体分子及其用途”的2016年4月21日公布的US 2016/0108123中所披露，该文献通过引用以其全文并入。
在一些实施例中，抗PD-L1抗体是MSB0010718C。MSB0010718C(也称为A09-246-2；默克雪兰诺公司(Merck Serono)或avelumab公司)是结合PD-L1的单克隆抗体。示例性人源化抗PD-L1抗体在WO2013/079174(通过引用并入本文)中披露，并且具有本文披露的序列(或与其基本上相同或相似的序列，例如与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。
MDPL3280A(基因泰克公司/罗氏公司)是结合PD-L1的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。MDPL3280A(也称为Atezolizumab)和针对PD-L1的其他人单克隆抗体在美国专利号：7,943,743和U.S公布号：20120039906中披露，这些文献通过引用并入本文。
在一个实施例中，抗PD-L1抗体分子包含以下中的一个或多个：Atezolizumab的CDR序列(或总体上全部CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。在实施例中，将Atezolizumab与CAR组合给予。
在一个实施例中，CAR疗法(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19CAR的细胞))可以与抗PDL1抗体(例如Atezolizumab)组合用于治疗患有淋巴瘤(例如DLBCL)的受试者。在一些实施例中，受试者患有DLBCL(例如r/r DLBCL)并且之前已具有抗CD20和蒽环霉素疗法。在一些实施例中，可以与给予CAR疗法(例如表达CD19 CAR的细胞)并行、在其之前或之后给予Atezolizumab。在一些实施例中，与CAR疗法(例如表达CD19 CAR的细胞)并行地给予Atezolizumab。在一些实施例中，将Atezolizumab以1200mg(例如1000、1200、1500或2000mg)的剂量每3周给予至少一次(例如一次、两次、三次、四次、五次、六次或更多次)。在一些实施例中，将Atezolizumab以1200mg的剂量每3周给予四次。
其他抗PD-L1结合剂包括YW243.55.S70(WO2010/077634中的SEQ ID NO:20和21中示出的重链和轻链可变区)和MDX-1105(也称为BMS-936559，以及例如WO2007/005874中披露的抗PD-L1结合剂)。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如在WO2010/027827和WO2011/066342中披露)是阻断PD1与B7-H1之间相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体。RNAi剂的实例包括长dsRNA、siRNA、shRNA、和微RNA。本文所述的抑制性核酸包括但不限于适体、吗啉代、核酶、和核酸序列，例如包含或编码长dsRNA、siRNA、shRNA、或微RNA的质粒或载体。
TIM3(T细胞免疫球蛋白-3)还负调节T细胞功能，特别是在分泌IFN-g的CD4+ T辅助细胞1和CD8+ T细胞毒性1细胞中，并且在T细胞衰竭中起关键作用。抑制TIM3与其配体(例如半乳凝素-9(Gal9)、磷脂酰丝氨酸(PS)和HMGB1)之间的相互作用可以增强免疫响应。TIM3及其配体的抗体、抗体片段、和其他抑制剂是本领域可得的，并且可以与本文所述的CAR(例如CD19 CAR)组合使用。例如，靶向TIM3的抗体、抗体片段、小分子、或肽抑制剂结合TIM3的IgV结构域以抑制与其配体的相互作用。抑制TIM3的抗体和肽在WO2013/006490和US20100247521中披露。其他抗TIM3抗体包括RMT3-23的人源化版本(在Ngiow等人,2011,Cancer Res[癌症研究],71:3540-3551中披露)，和克隆8B.2C12(在Monney等人,2002,Nature[自然],415:536-541中披露)。抑制TIM3和PD-1的双特异性抗体在US20130156774中披露。
在一个实施例中，抗TIM3抗体或其片段是如题为“TIM3的抗体分子及其用途”的US2015/0218274中所述的抗TIM3抗体分子，该文献通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗TIM3抗体分子包括来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区来自选自以下中的任一个的抗体：ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23；或者如US 2015/0218274的表1-4中所述；或者由表1-4中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列，或者密切相关的CDR，例如相同或具有至少一个氨基酸改变，但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的CDR。
在又另一个实施例中，抗TIM3抗体分子包含至少一个、两个、三个或四个可变区，这些可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23；或者如US 2015/0218274的表1-4中所述；或者由表1-4中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在其他实施例中，增强表达CAR的细胞活性的药剂是CEACAM抑制剂(例如CEACAM-1、CEACAM-3、和/或CEACAM-5抑制剂)。在一个实施例中，CEACAM的抑制剂是抗CEACAM抗体分子。示例性抗CEACAM-1抗体描述于WO 2010/125571、WO 2013/082366WO 2014/059251和WO2014/022332中，例如单克隆抗体34B1、26H7、和5F4；或其重组形式，如例如US 2004/0047858、US 7,132,255和WO 99/052552中所述。在其他实施例中，抗CEACAM抗体如例如Zheng等人PLoS One.[科学公共图书馆综合卷]2010年9月2日；5(9).pii:e12529(DOI:10:1371/journal.pone.0021146)中所述结合CEACAM-5，或如例如WO 2013/054331和US 2014/0271618中所述与CEACAM-1和CEACAM-5交叉反应。
不希望受理论的约束，据信癌胚抗原细胞粘附分子(CEACAM)(如CEACAM-1和CEACAM-5)至少部分地介导抗肿瘤免疫响应的抑制(参见例如，Markel等人J Immunol.[免疫学杂志]2002年3月15日；168(6):2803-10；Markel等人J Immunol.[免疫学杂志]2006年11月1日；177(9):6062-71；Markel等人Immunology.[免疫学]2009年2月；126(2):186-200；Markel等人Cancer Immunol Immunother.[癌症免疫学免疫疗法]2010年2月；59(2):215-30；Ortenberg等人Mol Cancer Ther.[分子癌症治疗学]2012年6月；11(6):1300-10；Stern等人J Immunol.[免疫学杂志]2005年6月1日；174(11):6692-701；Zheng等人PLoS One.[科学公共图书馆综合卷]2010年9月2日；5(9).pii:e12529)。例如，CEACAM-1已被描述为TIM-3的异嗜性配体，并在TIM-3介导的T细胞耐受和衰竭中起作用(参见例如，WO 2014/022332；Huang,等人(2014)Nature[自然]doi:10.1038/nature13848)。在实施例中，共阻断CEACAM-1和TIM-3已被证实增强异种移植结肠直肠癌模型中的抗肿瘤免疫响应(参见例如，WO2014/022332；Huang,等人(2014),同上)。在其他实施例中，如例如WO 2014/059251中所述，共阻断CEACAM-1和PD-1降低了T细胞耐受性。因此，CEACAM抑制剂可以与本文所述的其他免疫调制剂(例如抗PD-1和/或抗TIM-3抑制剂)一起使用，以增强针对癌症(例如黑素瘤、肺癌(例如NSCLC)、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、和如本文所述的其他癌症)的免疫响应。
LAG3(淋巴细胞活化基因-3或CD223)是在已被证实在CD8+T细胞衰竭中起作用的活化T细胞和B细胞上表达的细胞表面分子。LAG3及其配体的抗体、抗体片段、和其他抑制剂是本领域可得的，并且可以与本文所述的CAR(例如CD19 CAR)组合使用。例如，BMS-986016(百时美施贵宝公司)是靶向LAG3的单克隆抗体。IMP701(Immutep公司)是拮抗性LAG3抗体，并且IMP731(Immutep公司和葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline))是耗尽的LAG3抗体。其他LAG3抑制剂包括IMP321(Immutep公司)，其是结合MHC II类分子并活化抗原呈递细胞(APC)的LAG3和Ig的可溶性部分的重组融合蛋白。其他抗体在例如WO 2010/019570中披露。
在一个实施例中，抗LAG3抗体或其片段是如题为“LAG3的抗体分子及其用途”的US2015/0259420中所述的抗LAG3抗体分子，该文献通过引用以其全文并入。在一个实施例中，抗LAG3抗体分子包括来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区来自选自以下中的任一个的抗体：BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser、或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-克隆-F、BAP050-克隆-G、BAP050-克隆-H、BAP050-克隆-I、或BAP050-克隆-J；或者如US 2015/0259420的表1中所述；或者由表1中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列，或者密切相关的CDR，例如相同或具有至少一个氨基酸改变，但不多于两个、三个或四个改变(例如取代、缺失、或插入，例如保守取代)的CDR。
在又另一个实施例中，抗LAG3抗体分子包含至少一个、两个、三个或四个可变区，这些可变区来自本文所述的抗体，例如选自以下中的任一个的抗体：BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser、或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-克隆-F、BAP050-克隆-G、BAP050-克隆-H、BAP050-克隆-I、或BAP050-克隆-J；或者如US 2015/0259420的表1中所述；或者由表1中的核苷酸序列编码；或者与前述序列中任一项基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。
在一些实施例中，增强表达CAR的细胞活性的药剂可以是例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中该第一结构域是抑制性分子或其片段，并且该第二结构域是与阳性信号相关的多肽，例如包含如本文所述的细胞内信号传导结构域的多肽。在一些实施例中，与阳性信号相关的多肽可以包括CD28、CD27、ICOS的共刺激结构域(例如CD28、CD27和/或ICOS的细胞内信号传导结构域)，和/或例如，例如本文所述的CD3ζ的初级信号传导结构域。在一个实施例中，融合蛋白由表达CAR的相同细胞表达。在另一个实施例中，融合蛋白由细胞(例如不表达本披露内容的CAR的T细胞)表达。
在实施例中，给予受试者另外的药剂(进一步与本文所述的表达CAR的细胞和PD-1抑制剂组合)，其中该另外的药剂是抑制性分子，例如检查点分子，例如PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ的抑制剂。在实施例中，该另外的药剂是PD-L1的抑制剂，例如FAZ053(hIgG4人源化抗PD-L1单克隆抗体)、MPDL3280A、durvalumab(DEMI-4736)、avelumab(MSB-0010718C)、或BMS-936559。在实施例中，该另外的药剂是PD-1的另外的抑制剂，例如派姆单抗、纳武单抗、PDR001、MEDI-0680(AMP-514)、AMP-224、REGN-2810、或BGB-A317。在实施例中，该另外的药剂是CTLA-4的抑制剂，例如ipilimumab。在实施例中，该另外的药剂是LAG-3的抑制剂，例如LAG525(hIgG4人源化抗LAG-3单克隆抗体)。在实施例中，该另外的药剂是TIM-3的抑制剂，例如MBG453(hIgG4人源化抗TIM-3单克隆抗体)。在实施例中，该另外的药剂是酶B-Raf的抑制剂，例如达拉菲尼(GSK2118436；N-{3-[5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-叔丁基-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺)。在实施例中，该另外的药剂是MEK1和/或MEK2的抑制剂，例如曲美替尼(N-(3-{3-环丙基-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢吡啶并[4,3-d]嘧啶-1(2H)-基}苯基)乙酰胺)。在实施例中，该另外的药剂包含达拉菲尼和曲美替尼。在实施例中，该另外的药剂是GITR的抑制剂，例如GWN323。在实施例中，该另外的药剂是STING(干扰素基因的刺激剂)的激动剂，例如MIW815。在实施例中，该另外的药剂是IL-15激动剂，例如NIZ985。在实施例中，该另外的药剂是腺苷受体的抑制剂，例如NIR178。在实施例中，该另外的药剂是巨噬细胞集落刺激因子(CSF-1)的抑制剂，例如MCS110。在实施例中，该另外的药剂是cMet的抑制剂，例如INC280。在实施例中，该另外的药剂是porcupine(PORCN)的抑制剂，例如WNT974。在实施例中，该另外的药剂是组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如panobinost。在实施例中，该另外的药剂是mTOR抑制剂，例如依维莫司。在实施例中，该另外的药剂是第二线粒体来源的半胱天冬酶模拟活化剂(SMAC)和/或IAP(细胞凋亡蛋白抑制剂)蛋白质家族的抑制剂，例如LCL161。在实施例中，该另外的药剂是抑制剂表皮生长因子受体(EGFR)，例如EGF816。在实施例中，该另外的药剂是IL-17的抑制剂，例如CJM112。在实施例中，该另外的药剂是IL-1β的抑制剂，例如ILARIS。
在一个实施例中，增强本文所述表达CAR的细胞的活性的药剂是miR-17-92。
在一个实施例中，增强本文所述CAR的活性的药剂是细胞因子。细胞因子具有与T细胞扩增、分化、存活、和稳态相关的重要功能。可以向接受本文所述表达CAR的细胞的受试者给予的细胞因子包括：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18、和IL-21、或其组合。在优选的实施例中，给予的细胞因子是IL-7、IL-15、或IL-21、或其组合。可以一天一次或一天多于一次(例如一天两次、一天三次、或一天四次)给予该细胞因子。可以给予细胞因子持续多于一天，例如给予细胞因子持续2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、或4周。例如，一天一次给予细胞因子持续7天。
在实施例中，与本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂组合给予细胞因子。可以与表达CAR的细胞同时或并行地给予细胞因子，例如在同一天给予。细胞因子可以在与表达CAR的细胞相同的药物组合物中制备，或可以在单独的药物组合物中制备。可替代地，可以在给予表达CAR的细胞后不久(例如在给予表达CAR的T细胞后1天、2天、3天、4天、5天、6天、或7天)给予细胞因子。在其中以多于一天发生的给药方案给予细胞因子的实施例中，细胞因子给药方案的第一天可以是与给予表达CAR的细胞的同一天，或者细胞因子给药方案的第一天可以是给予表达CAR的细胞后的1天、2天、3天、4天、5天、6天、或7天。在一个实施例中，在第一天，向受试者给予表达CAR的细胞，并且在第二天，一天一次给予细胞因子持续接下来的7天。在优选的实施例中，有待与表达CAR的细胞组合给予的细胞因子是IL-7、IL-15、或IL-21。
在其他实施例中，在给予表达CAR的细胞后给予细胞因子一段时间，例如在给予表达CAR的细胞后至少2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、或1年或更久。在一个实施例中，在评估受试者对表达CAR的细胞的响应后给予细胞因子。例如，根据本文所述的剂量和方案给予受试者表达CAR的细胞。使用本文所述的任何方法，在给予表达CAR的细胞后2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、或1年或更久评估受试者对CART疗法的响应，包括抑制肿瘤生长、减少循环肿瘤细胞、或肿瘤消退。对表达CAR的细胞疗法未表现出足够响应的受试者可以给予细胞因子。向针对表达CAR的细胞疗法具有次佳响应的受试者给予细胞因子改善了表达CAR的细胞功效或抗肿瘤活性。在优选的实施例中，在给予表达CAR的细胞后给予的细胞因子是IL-7。
与低剂量的mTOR抑制剂组合
在一个实施例中，与低免疫增强剂量的mTOR抑制剂组合给予本文所述的组合(例如表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-1抑制剂)。
在另一个实施例中，例如与未处理的表达CAR的细胞或未治疗的受试者相比，给予低免疫增强剂量的mTOR抑制剂例如在培养物或受试者中导致表达CAR的细胞的增殖增加或延长。在实施例中，增加的增殖与表达CAR的细胞数量的增加有关。用于测量增加或延长的增殖的方法描述于本文实例中。在另一个实施例中，例如与未处理的表达CAR的细胞或未治疗的受试者相比，给予低免疫增强剂量的mTOR抑制剂例如在培养物或受试者中导致表达CAR的细胞对癌细胞的杀伤增加。在实施例中，增加的癌细胞杀伤与肿瘤体积的减少相关。
在一个实施例中，与低免疫增强剂量的mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂，例如RAD001)或催化mTOR抑制剂组合给予表达CAR分子(例如本文所述的CAR分子)的细胞。例如，给予低免疫增强剂量的mTOR抑制剂可以在给予本文所述的表达CAR的细胞之前开始；在给予本文所述的表达CAR的细胞之前完成；在给予本文所述的表达CAR的细胞的同时开始；与给予本文所述的表达CAR的细胞重叠；或在给予本文所述的表达CAR的细胞后继续。
可替代地或此外，给予低免疫增强剂量的mTOR抑制剂可以优化有待工程化以表达本文所述CAR分子的免疫效应细胞。在此类实施例中，给予低免疫增强剂量的mTOR抑制剂(例如变构抑制剂，例如RAD001)或催化抑制剂在从受试者收获有待工程化以表达本文所述CAR分子的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)之前开始或完成。
在另一个实施例中，可以使有待工程化以表达本文所述CAR分子的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)例如在从受试者收获后，或表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)例如在向受试者给予之前在低免疫增强剂量的mTOR抑制剂存在下培养。
如本文所用，术语“mTOR抑制剂”是指抑制细胞中mTOR激酶的化合物或配体、或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，mTOR抑制剂是变构抑制剂。在一个实施例中，mTOR抑制剂是催化抑制剂。
变构mTOR抑制剂包括中性三环化合物雷帕霉素(西罗莫司)、雷帕霉素相关化合物，即与雷帕霉素具有结构和功能相似性的化合物，包括例如雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物(也称为rapalogs)和抑制mTOR活性的其他大环内酯化合物。
雷帕霉素是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的已知大环内酯抗生素。
其他适合的雷帕霉素类似物包括但不限于具有以下化学名称的RAD001，或者称为依维莫司(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂-三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-戊酮、西罗莫司(雷帕霉素，AY-22989)、40-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸甲酯]-雷帕霉素(也称为坦罗莫司或CCI-779)和地磷莫司(AP-23573/MK-8669)。如US2005/0101624中所述，变构mTor抑制剂的其他实例包括佐他莫司(ABT578)和乌罗莫司(umirolimus)，该文献的内容通过引用并入。其他适合的mTOR抑制剂描述于2015年3月13日提交的国际公布WO 2015/142675的第946至964段中，该文献通过引用以其全文并入。低免疫增强剂量的mTOR抑制剂、与低剂量的mTOR抑制剂相关的适合水平的mTOR抑制、用于检测mTOR抑制水平的方法、以及其适合的药物组合物进一步描述于2015年3月13日提交的国际公布WO 2015/142675的第936至945和965至1003段中，该文献通过引用以其全文并入。
细胞因子释放综合征(CRS)
细胞因子释放综合征(CRS)是可能由于癌症免疫疗法(例如癌症抗体疗法或T细胞免疫疗法(例如，CAR T细胞))发生的潜在地危及生命的细胞因子相关毒性。当大量淋巴细胞和/或骨髓细胞在活化后释放炎性细胞因子时，CRS由高水平免疫活化产生。CRS的严重程度和症状发作的时间可以根据免疫细胞活化的程度、给予的疗法类型、和/或受试者中的肿瘤负荷程度而变化。在用于癌症的T细胞疗法的情况下，症状发作典型地在给予T细胞疗法后数天至数周，例如当存在体内T细胞扩增峰值时。参见例如，Lee等人Blood.[血液]124.2(2014):188-95。
CRS的症状可以包括神经毒性、弥散性血管内凝血、心功能不全、成人呼吸窘迫综合征、肾衰竭、和/或肝衰竭。例如，CRS的症状包括高烧、恶心、短暂性低血压、缺氧等。CRS可能包括临床体构体征和症状，如发烧、疲劳、厌食、肌痛、关节痛、恶心、呕吐、和头痛。CRS可能包括临床皮肤体征和症状，如皮疹。CRS可能包括临床胃肠道体征和症状，如恶心、呕吐和腹泻。CRS可能包括临床呼吸道体征和症状，如呼吸急促和低氧血症。CRS可能包括临床心血管体征和症状，如心动过速、加宽的脉压、低血压、增加的心输出量(早期)和可能减少的心输出量(晚期)。CRS可能包括临床凝血体征和症状，如升高的d-二聚体、伴有或没有出血的低纤维蛋白原血症。CRS可能包括临床肾脏体征和症状，如氮血症。CRS可能包括临床肝脏体征和症状，如转氨酶升高和高胆红素血症。CRS可能包括临床神经系统体征和症状，如头痛、精神状态改变、意识错乱、谵妄、找字困难或frank失语、幻觉、震颤、辨距障碍、步态改变、和癫痫发作。
IL-6被认为是CRS毒性的介质。参见例如，同上。高IL-6水平可以引发促炎性IL-6信号传导级联，从而导致CRS症状中的一种或多种。在一些情况下，C-反应蛋白(CRP)(例如响应于IL-6由肝脏产生的生物分子)的水平可以是IL-6活性的量度。在一些情况下，CRS期间的CRP水平可能增加几倍(例如，几个数量级)。可以使用本文所述的方法和/或本领域可得的标准方法测量CRP水平。
CRS分级
在一些实施例中，可以如下从1-5对CRS的严重程度进行分级。1-3级是不太严重的CRS。4-5级是严重的CRS。对于1级CRS，仅需要对症治疗(例如恶心、发烧、疲劳、肌痛、不适、头痛)并且症状不危及生命。对于2级CRS，症状需要适度干预，并且通常响应于对中度干预。患有2级CRS的受试者发展响应于流体或一种低剂量血管加压剂的低血压；或者它们发展响应于低流量氧气(<40％氧气)的2级器官毒性或轻度呼吸道症状。在3级CRS受试者中，低血压通常不能通过流体疗法或一种低剂量血管加压剂逆转。这些受试者通常需要超过低流量的氧气，并且具有3级器官毒性(例如，肾或心脏功能障碍或凝血病)和/或4级转氨酶升高。3级CRS受试者需要更积极的干预，例如40％或更高的氧气、高剂量的一种或多种血管加压剂、和/或多种血管加压剂。4级CRS受试者患有立即危及生命的症状，包括4级器官毒性或需要机械通气。4级CRS受试者通常没有转氨酶升高。在5级CRS受试者中，毒性导致死亡。例如，用于分级CRS的标准在本文中作为表A提供。除非另外说明，否则如本文所用的CRS是指根据表A的标准的CRS。
表A：CRS分级
CRS疗法
CRS的疗法包括IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗或siltuximab)、sgp130阻断剂、血管活性药物、皮质类固醇、免疫抑制剂、和机械通气。CRS的示例性疗法描述于国际申请WO 2014011984中，该文献特此通过引用并入。
托珠单抗是人源化免疫球蛋白G1κ抗人IL-6R单克隆抗体。参见例如，同上。托珠单抗阻断IL-6与可溶性和膜结合IL-6受体(IL-6R)的结合，并且由此抑制经典和反式-IL-6信号传导。在实施例中，对于成人将托珠单抗以约4-12mg/kg(例如约4-8mg/kg)的剂量给予，并且对于儿科受试者以约8-12mg/kg的剂量给予，例如在1小时内给予。
在一些实施例中，CRS治疗剂是IL-6信号传导的抑制剂，例如IL-6或IL-6受体的抑制剂。在一个实施例中，抑制剂是抗IL-6抗体，例如抗IL-6嵌合单克隆抗体(如siltuximab)。在其他实施例中，抑制剂包含能够阻断IL-6信号传导的可溶性gp130或其片段。在一些实施例中，sgp130或其片段融合到异源结构域，例如Fc结构域，例如为gp130-Fc融合蛋白(如FE301)。在实施例中，IL-6信号传导的抑制剂包含抗体，例如针对IL-6受体的抗体，如sarilumab、olokizumab(CDP6038)、elsilimomab、sirukumab(CNTO 136)、ALD518/BMS-945429、ARGX-109、或FM101。在一些实施例中，IL-6信号传导的抑制剂包含小分子(如CPSI-2364)。
示例性血管活性药物包括但不限于血管紧张素-11、内皮素-1、α肾上腺素能激动剂、rostanoid、磷酸二酯酶抑制剂、内皮素拮抗剂，inotrope(例如肾上腺素、多巴酚丁胺、异丙肾上腺素、麻黄碱)、血管加压剂(例如去甲肾上腺素、加压素、间羟胺、加压素、亚甲蓝)、纤维扩张剂(例如米力农、左西孟旦)、和多巴胺。
示例性血管加压剂包括但不限于去甲肾上腺素、多巴胺、去氧肾上腺素、肾上腺素、和加压素。在一些实施例中，高剂量血管加压剂包括以下中的一种或多种：≥20ug/min的去甲肾上腺素单一疗法、≥10ug/kg/min的多巴胺单一疗法、≥200ug/min的去氧肾上腺素单一疗法、和/或≥10ug/min的肾上腺素单一疗法。在一些实施例中，如果受试者在加压素上，则高剂量血管加压剂包括当量为≥10ug/min的加压素+去甲肾上腺素，其中去甲肾上腺素当量剂量＝[去甲肾上腺素(ug/min)]+[多巴胺(ug/kg/min)/2]+[肾上腺素(ug/min)]+[去氧肾上腺素(ug/min)/10]。在一些实施例中，如果受试者在组合血管加压剂(非加压素)上，则高剂量血管加压剂包括当量为≥20ug/min的去甲肾上腺素，其中去甲肾上腺素当量剂量＝[去甲肾上腺素(ug/min)]+[多巴胺(ug/kg/min)/2]+[肾上腺素(ug/min)]+[去氧肾上腺素(ug/min)/10]。参见例如，同上。
在一些实施例中，低剂量血管加压剂是以小于上文针对高剂量血管加压剂列出剂量中的一个或多个的剂量给予的血管加压剂。
示例性皮质类固醇包括但不限于地塞米松、氢化可的松、和甲泼尼龙。在实施例中，使用0.5mg/kg的地塞米松剂量。在实施例中，使用10mg/剂量的地塞米松最大剂量。在实施例中，使用2mg/kg/天的甲泼尼龙剂量。
示例性免疫抑制剂包括但不限于TNFα的抑制剂或IL-1的抑制剂。在实施例中，TNFα的抑制剂包含抗TNFα抗体，例如单克隆抗体，例如英夫利昔单抗。在实施例中，TNFα的抑制剂包含可溶性TNFα受体(例如依那西普)。在实施例中，IL-1或IL-1R抑制剂包含阿那白滞素。
在一些实施例中，给予处于发展严重CRS风险中的受试者抗IFN-γ或抗sIL2Ra疗法，例如针对IFN-γ或sIL2Ra的抗体分子。
在实施例中，对于已接受治疗性抗体分子(如blinatumomab)和患有CRS或处于发展CRS风险中的受试者，以较低剂量和/或较低频率给予治疗性抗体分子，或停止给予治疗剂抗体分子。
在实施例中，用降低发烧的药物(如对乙酰氨基酚)治疗患有CRS或处于发展CRS风险中的受试者。
在实施例中，以任何组合，例如与本文所述的表达CAR的细胞组合给予或提供本文受试者本文所述的一种或多种CRS疗法，例如以下中的一种或多种：IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)、血管活性药物、皮质类固醇、免疫抑制剂、或机械通气。
在实施例中，以任何组合，例如与本文所述的表达CAR的细胞组合给予处于发展CRS(例如严重CRS)风险中的受试者(例如被鉴定为具有发展严重CRS的高风险状态)本文所述的一种或多种CRS疗法，例如以下中的一种或多种：IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)、血管活性药物、皮质类固醇、免疫抑制剂、或机械通气。
在实施例中，本文受试者(例如处于发展严重CRS风险中的受试者或被鉴定为处于发展严重CRS风险中的受试者)被转移至重症监护病房。在一些实施例中，监测本文受试者(例如处于发展严重CRS风险中的受试者或被鉴定为处于发展严重CRS风险中的受试者)与CRS相关的一种或多种症状或病状，如发烧、心率升高、凝血病、MODS(多器官功能障碍综合征)、心血管功能障碍、分布性休克、心肌病、肝功能障碍、肾功能障碍、脑病、临床癫痫发作、呼吸衰竭、或心动过速。在一些实施例中，本文方法包括给予针对与CRS相关的症状或病状之一的疗法。例如，在实施例中，例如，如果受试者发展凝血病，则该方法包括给予冷沉淀物。在一些实施例中，例如，如果受试者发展心血管功能障碍，则该方法包括给予血管活性输注支持物。在一些实施例中，例如，如果受试者发展分布性休克，则该方法包括给予α-激动剂疗法。在一些实施例中，例如，如果受试者发展心肌病，则该方法包括给予米力农疗法。在一些实施例中，例如，如果受试者发展呼吸衰竭，则该方法包括进行机械通气(例如有创机械通气或无创机械通气)。在一些实施例中，例如，如果受试者发展休克，则该方法包括给予晶体和/或胶体流体。
在实施例中，在给予本文所述的一种或多种CRS疗法(例如以下中的一种或多种：IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)、血管活性药物、皮质类固醇、免疫抑制剂、或机械通气)之前、与其并行、或之后给予表达CAR的细胞。在实施例中，在给予本文所述的一种或多种CRS疗法(例如以下中的一种或多种：IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)、血管活性药物、皮质类固醇、免疫抑制剂、或机械通气)2周内(例如2或1周内、或14天内，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1天或更短时间内)给予表达CAR的细胞。在实施例中，在给予本文所述的一种或多种CRS疗法(例如以下中的一种或多种：IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)、血管活性药物、皮质类固醇、免疫抑制剂、或机械通气)之前或之后至少一天(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、3个月、或更长时间)给予表达CAR的细胞。
在实施例中，给予本文受试者(例如处于发展严重CRS风险中的受试者或被鉴定为处于发展严重CRS风险中的受试者)单剂量的IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)。在实施例中，给予受试者多个剂量(例如2、3、4、5、6、或更多个剂量)的IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)。
在实施例中，未给予处于低或无发展CRS(例如严重CRS)风险中的受试者(例如被鉴定为具有发展严重CRS的低风险状态)本文所述的CRS疗法，例如以下中的一种或多种：IL-6抑制剂或IL-6受体(IL-6R)抑制剂(例如托珠单抗)、血管活性药物、皮质类固醇、免疫抑制剂、或机械通气。
在一些实施例中，通过本文披露方法治疗的受试者具有低严重程度的CRS，例如1级、2级或3级。
药物组合物
本发明的药物组合物可以包含表达CAR的细胞(例如如本文所述的多种表达CAR的细胞)，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一方面，本发明的组合物被配制用于静脉内给予。
本发明的药物组合物能以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式给予。给予的总量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重程度等因素来确定，然而适当的剂量可以通过临床试验来确定。
在一个实施例中，药物组合物基本上不含，例如不存在可检测水平的例如选自下组的污染物，该组由以下组成：内毒素、支原体、复制型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、合并的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施例中，细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、以及酿脓链球菌A组。
治疗的方法
当指出“免疫有效量”、“有效剂量”、“抗癌有效量”、“癌症抑制有效量”或“治疗量”时，有待给予的本发明组合物的精确量可以由医生在考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)病状方面的个体差异的情况下确定。
有待向受试者给予的以上治疗的剂量将随着所治疗病状的确切性质和该治疗的受者而变化。可以根据本领域接受的做法来缩放人类施用剂量。例如，对于成年患者，CAMPATH的剂量通常将在1至约100mg的范围内，通常每天给予持续1至30天的时间。优选的每天剂量是每天1至10mg，但在一些情况下，可以使用每天最多40mg的较大剂量(描述于美国专利号6,120,766中)。
可以以任何常规方式进行本文所述组合物的给予，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。可以向患者经动脉、皮下、真皮内、瘤内、结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或者腹膜内施用本文所述的组合物。在一个实施例中，通过皮内或皮下注射向患者给予例如包含表达CAR的细胞和/或PD-1抑制剂的本文所述组合物。在一个实施例中，通过i.v.注射给予例如包含表达CAR的细胞和/或PD-1抑制剂的本文所述组合物。可以将例如包含表达CAR的细胞和/或PD-1抑制剂的本文所述组合物直接注射到肿瘤、淋巴结、或感染部位中。
通常可以说，可以将包含本文所述免疫效应细胞的药物组合物以104至109个细胞/kg体重，在一些情况下105至106个细胞/kg体重(包括这些范围内的所有整数值)的剂量给予。还可以以这些剂量多次给予免疫效应细胞组合物。可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来给予细胞(参见例如，Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.[新英格兰医学杂志]319:1676,1988)。
在某些方面，可能希望向受试者给予活化的免疫效应细胞，并且然后随后重抽血液(或进行单采血液成分术)，根据本发明从其活化细胞，并用这些活化和扩增的细胞回输患者。该过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，细胞可以由从10cc至400cc的抽血活化。在某些方面，细胞由20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc的抽血活化。
在特定的示例性方面，受试者可以经历白细胞单采法，其中离体收集、富集、或耗尽白细胞以选择和/或分离感兴趣的细胞(例如T细胞)。这些T细胞分离物可以通过本领域已知的方法扩增并处理，使得可以引入本发明的一个或多个CAR构建体，从而产生本发明的CAR T细胞。有需要的受试者可以随后经历使用高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或并行，受试者接受输注本发明的扩增的表达CAR的细胞。在另外的方面，在手术之前或之后给予扩增的细胞。
在一个实施例中，例如使用体外转录将CAR引入免疫效应细胞中，并且受试者(例如人)接受本发明的表达CAR的细胞的初始给予，以及本发明的表达CAR的细胞的一个或多个后续给予，其中该一个或多个后续给予在前一次给予后少于15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、或2天给予。在一个实施例中，每周向受试者(例如人)给予多于一次本发明的表达CAR的细胞的给予，例如每周给予2、3、或4次本发明的表达CAR的细胞的给予。在一个实施例中，受试者(例如人受试者)每周接受多于一次表达CAR的细胞的给予(例如每周2、3或4次给予)(在本文中也称为周期)，随后一周不进行表达CAR的细胞的给予，并且然后向受试者给予一个或多个另外的表达CAR的细胞的给予(例如每周多于一次表达CAR的细胞的给予)。在另一个实施例中，受试者(例如人受试者)接受多于一个周期的表达CAR的细胞，并且每个周期之间的时间少于10、9、8、7、6、5、4、或3天。在一个实施例中，每隔一天给予表达CAR的细胞，每周给予3次。在一个实施例中，给予本发明的表达CAR的细胞持续至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。
在一些实施例中，表达CAR的细胞(例如本文所述的表达CAR的细胞，例如本文所述的表达CD19 CAR的细胞)的剂量包含约104至约109个细胞/kg，例如约104至约105个细胞/kg、约105至约106个细胞/kg、约106至约107个细胞/kg、约107至约108个细胞/kg、或约108至约109个细胞/kg。在实施例中，表达CAR的细胞的剂量包含约0.6x 106个细胞/kg至约2x 107个细胞/kg。在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)的剂量包含约2x 105、1x 106、1.1x 106、2x 106、3x 106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x107、5x 107、1x 108、2x 108、3x 108、或5x 108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)的剂量包含至少约1x 106、1.1x 106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、3x 108、或5x 108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)的剂量包含高达约1x 106、1.1x 106、2x 106、3.6x106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、3x 108、或5x 108个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)的剂量包含约1.1x 106-1.8x 107个细胞/kg。在一些实施例中，CAR细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)的剂量包含约1x 107、2x107、5x 107、1x 108、2x 108、3x 108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x 109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞(例如，例如表达CD19 CAR的细胞)的剂量包含至少约1x 107、2x 107、5x 107、1x108、2x 108、3x 108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x 109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞(例如，例如表达CD19 CAR的细胞)的剂量包含高达约1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、3x108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x 109个细胞。
在一些实施例中，CAR细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)的剂量包含高达约1x 107,1.5x 107、2x 107、2.5x 107、3x 107、3.5x 107、4x 107、5x 107、1x 108、1.5x 108、2x 108、2.5x 108、3x 108、3.5x 108、4x 108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x 109个细胞。在一些实施例中，CAR细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)的剂量包含高达约1-3x 107至1-3x 108个。在一些实施例中，给予受试者约1-3x 107个表达CD19 CAR的细胞。在其他实施例中，给予受试者约1-3x 108个表达CD19 CAR的细胞。
在一些实施例中，表达CAR的细胞(例如本文所述的表达CAR的细胞，例如本文所述的表达CD19 CAR的细胞)的剂量包含约1x 106个细胞/m2至约1x 109个细胞/m2，例如约1x107个细胞/m2至约5x 108个细胞/m2，例如约1.5x 107个细胞/m2、约2x 107个细胞/m2、约4.5x107个细胞/m2、约108个细胞/m2、约1.2x 108个细胞/m2、或约2x 108个细胞/m2。
在实施例中，将表达CD19 CAR的细胞以多个剂量(例如第一剂量、第二剂量、和任选第三剂量)给予。在实施例中，该方法包括治疗患有癌症(例如急性淋巴细胞白血病(ALL))的受试者(例如成人受试者)，包括向受试者给予第一剂量、第二剂量、和任选一个或多个另外剂量，每个剂量包含表达CAR分子(例如CD19 CAR分子，例如根据SEQ ID NO:108的CAR分子)的免疫效应细胞。
在实施例中，该方法包括给予剂量为2-5x106个的活表达CAR的细胞/kg，其中受试者具有小于50kg的体重；或
给予剂量为1.0-2.5x108个的活表达CAR的细胞，其中受试者具有至少50kg的体重。
在实施例中，向受试者(例如儿科受试者)给予单剂量。
在实施例中，在顺序的天数给予这些剂量，例如在第1天给予第一剂量，在第2天给予第二剂量，并且在第3天给予任选的第三剂量(如果给予)。
在实施例中，给予第四、第五、或第六剂量、或更多剂量。
在实施例中，第一剂量占总剂量的约10％，第二剂量占总剂量的约30％，并且第三剂量占总剂量的约60％，其中上述百分比的总和为100％。在实施例中，第一剂量占总剂量的约9％-11％、8％-12％、7％-13％、或5％-15％。在实施例中，第二剂量占总剂量的约29％-31％、28％-32％、27％-33％、26％-34％、25％-35％、24％-36％、23％-37％、22％-38％、21％-39％、或20％-40％。在实施例中，第三剂量占总剂量的约55％-65％、50％-70％、45％-75％、或40％-80％。在实施例中，总剂量是指在1周、2周、3周、或4周的过程中给予的活表达CAR的细胞的总数量。在其中给予两个剂量的一些实施例中，总剂量是指在第一和第二剂量中向受试者给予的活表达CAR的细胞的数量总和。在其中给予三个剂量的一些实施例中，总剂量是指在第一、第二、和第三剂量中向受试者给予的活表达CAR的细胞的数量总和。
在实施例中，根据其中活表达CAR的细胞的数量测量剂量。可以例如通过使用结合CAR分子的抗体分子和可检测标记的流式细胞术测量CAR表达。可以例如通过Cellometer测量活力。
在实施例中，以递增剂量给予活表达CAR的细胞。在实施例中，第二剂量大于第一剂量，例如大于10％、20％、30％、或50％。在实施例中，第二剂量是第一剂量大小的两倍、三倍、四倍、或五倍。在实施例中，第三剂量大于第二剂量，例如大于10％、20％、30％、或50％。在实施例中，第三剂量是第二剂量大小的两倍、三倍、四倍、或五倍。
在某些实施例中，该方法包括以下a)-h)中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部：
a)以第一剂量给予的表达CAR的活细胞的数量不多于以第二剂量给予的表达CAR的活细胞数量的1/3；
b)以第一剂量给予的表达CAR的活细胞的数量不多于给予的表达CAR的活细胞总数量的1/X，其中X是2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50；
c)以第一剂量给予的表达CAR的活细胞的数量不多于1x 107、2x 107、3x 107、4x107,5x 107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107、1x 108、2x 108、3x 108、4x 108、或5x 108个表达CAR的活细胞，并且第二剂量大于第一剂量；
d)以第二剂量给予的表达CAR的活细胞的数量不多于以第三剂量给予的表达CAR的活细胞数量的1/2；
e)以第二剂量给予的表达CAR的活细胞的数量不多于给予的表达CAR的活细胞总数量的1/Y，其中Y是2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50；
f)以第二剂量给予的表达CAR的活细胞的数量不多于1x 107、2x 107、3x 107、4x107,5x 107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107、1x 108、2x 108、3x 108、4x 108、或5x 108个表达CAR的活细胞，并且第三剂量大于第二剂量；
h)选择第一、第二、和任选第三剂量的给予剂量和时间段，使得受试者经历的CRS水平不大于4、3、2、或1。
在实施例中，总剂量是约5x 108个表达CAR的活细胞。在实施例中，总剂量是约5x107-5x 108个表达CAR的活细胞。在实施例中，第一剂量是约5x 107个(例如±10％、20％、或30％)表达CAR的活细胞，第二剂量是约1.5x 108个(例如±10％、20％、或30％)表达CAR的活细胞，并且第三剂量是约3x 108个(例如±10％、20％、或30％)表达CAR的活细胞。
在实施例中，在接受一定剂量后，例如在接受第一剂量、第二剂量、和/或第三剂量后，评估受试者的CRS。
在实施例中，受试者接受CRS治疗，例如托珠单抗、皮质类固醇、依那西普、或siltuximab。在实施例中，在包含CAR分子的细胞的第一剂量之前或之后给予CRS治疗。在实施例中，在包含CAR分子的细胞的第二剂量之前或之后给予CRS治疗。在实施例中，在包含CAR分子的细胞的第三剂量之前或之后给予CRS治疗。在实施例中，在包含CAR分子的细胞的第一与第二剂量之间，和/或在包含CAR分子的细胞的第二与第三剂量之间给予CRS治疗。
在实施例中，在第一剂量后患有CRS(例如1、2、3、或4级CRS)的受试者中，在第一剂量后至少2、3、4、或5天给予第二剂量。在实施例中，在第二剂量后患有CRS(例如1、2、3、或4级CRS)的受试者中，在第二剂量后至少2、3、4、或5天给予第三剂量。在实施例中，在第一剂量后患有CRS的受试者中，相对于当受试者没有CRS给予第二剂量时，延迟表达CAR的细胞的第二剂量。在实施例中，在第二剂量后患有CRS的受试者中，相对于当受试者没有CRS给予第三剂量时，延迟表达CAR的细胞的第三剂量。
在实施例中，受试者在给予第一剂量之前患有具有高疾病负荷的癌症。在实施例中，受试者具有至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％，例如至少5％的骨髓幼稚细胞水平。在实施例中，受试者患有I、II、III、或IV期癌症。在实施例中，受试者例如在单个肿瘤或多个肿瘤中具有至少1、2、5、10、20、50、100、200、500、或1000g的肿瘤质量。
在一些实施例中，受试者患有癌症(例如，如本文所述的实体癌症或血液癌症)。在一个实施例中，受试者患有CLL。在实施例中，受试者患有ALL。在其他实施例中，受试者患有多发性骨髓瘤。
在一个实施例中，该癌症是与CD19表达相关的疾病，例如，如本文所述。在其他实施例中，该癌症是与肿瘤抗原相关的疾病，例如，本文所述。在实施例中，CAR分子是如本文所述的CAR分子。
在一个方面，使用慢病毒病毒载体(如慢病毒)产生表达CAR的细胞(例如表达CD19CAR的细胞)。以该方式产生的表达CAR的细胞将具有稳定的表达CAR的。
在一个方面，表达CAR的细胞在转导后瞬时表达CAR载体4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。CAR的瞬时表达可能受RNACAR载体递送的影响。在一个方面，通过电穿孔将CARRNA转导到T细胞中。
使用瞬时表达表达CAR的细胞(特别是携带表达CAR的细胞的鼠scFv)治疗的患者可能出现的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。
不受该理论的约束，据信这种过敏反应可能是由患者发展体液抗CAR响应，即具有抗IgE同种型的抗CAR抗体引起的。认为当存在暴露于抗原的10至14天中断时，患者的抗体产生细胞经历从IgG同种型(不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。
如果患者在瞬时CAR疗法(如通过RNA转导产生的那些)过程中处于产生抗CAR抗体响应的高风险中，则表达CAR的细胞输注中断不应持续超过10至14天。
使用具有人(而不是鼠)scFv的CAR可以降低具有抗CAR响应的患者的可能性和强度。
PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体分子)的剂量和治疗方案可以由技术人员确定。使用的分子的适合剂量将取决于受试者的年龄和体重以及使用的特定药物。
给予抗体分子的方法是本领域已知的，并在下文描述。使用的分子的适合剂量将取决于受试者的年龄和体重以及使用的特定药物。抗PD-1抗体的剂量和治疗方案可由技术人员确定。
在某些实施例中，将抗PD-1抗体分子通过注射(例如皮下或静脉内)以约1至30mg/kg，例如约5至25mg/kg、约10至20mg/kg、约1至5mg/kg、或约3mg/kg的剂量给予。在一些实施例中，将抗PD-1抗体分子以约1mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、或约40mg/kg的剂量给予。在一些实施例中，将抗PD-1抗体分子以约1-3mg/kg、或约3-10mg/kg的剂量给予。在一些实施例中，将抗PD-1抗体分子以约0.5-2、2-4、2-5、5-15、或5-20mg/kg的剂量给予。该给药计划表可以从例如每周一次至每2、3、或4周一次变化。在一个实施例中，将该抗PD-1抗体分子以从约10mg/kg至20mg/kg的剂量给予，每两周一次。在另一个实施例中，将抗PD-1抗体分子以每两周一次约1mg/kg、每两周一次约3mg/kg、每两周一次10mg/kg、每四周一次3mg/kg、或每四周一次5mg/kg的剂量给予。
在其他实施例中，将抗PD-1抗体分子通过注射(例如，皮下或静脉内)以约200mg至500mg，例如约250mg至450mg、约300mg至400mg、约250mg至350mg、约350mg至450mg、或约300mg或约400mg的剂量(例如平坦剂量)给予。在一些实施例中，将抗PD-1抗体分子以约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、或约500mg的剂量给予。在一些实施例中，将抗PD1抗体以约200或300mg的剂量给予。在一些实施例中，将抗PD-1抗体分子以约250-450mg、或约300-400mg的剂量给予。在一些实施例中，将抗PD-1抗体分子以约200-300mg、250-350mg、300-400mg、350-450mg、或400-500mg的剂量给予。该给药计划表可以从例如每周一次至每2、3、4、5、或6周一次变化。在一个实施例中，将该抗PD-1抗体分子以从约300mg至400mg的剂量给予，每三周一次或每四周一次。在一个实施例中，将该抗PD-1抗体分子以从约300mg的剂量给予，每三周一次。在一个实施例中，将该抗PD-1抗体分子以从约400mg的剂量给予，每四周一次。在一个实施例中，将该抗PD-1抗体分子以从约300mg的剂量给予，每四周一次。在一个实施例中，将该抗PD-1抗体分子以从约400mg的剂量给予，每三周一次。可以给予抗PD-1抗体一次或多次，例如一次、二次、三次、四次、五次、六次、七次或更多次。在一个实施例中，给予抗PD-1抗体六次。在给予表达CAR的细胞，例如CD19(例如CLT019或CTL119)或BCMA表达CAR的细胞后，可以给予抗PD-1抗体至少5天，例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、20、25、30、35、或40天。在一些实施例中，在给予表达CAR的细胞，例如表达CD19的细胞(例如CLT019或CTL119)或BCMA表达CAR的细胞后，可以给予抗PD-1抗体约8天或约15天。
抗体分子可以通过本领域已知的多种方法给予，但是对于许多治疗应用，优选的给予途径/方式是静脉内注射或输注。例如，抗体分子可以通过静脉内输注以超过20mg/min，例如20-40mg/min，并且典型地大于或等于40mg/min的速率给予，以达到约35至440mg/m2，典型地约70至310mg/m2，并且更典型地约110至130mg/m2的剂量。在实施例中，抗体分子可以通过静脉内输注以小于10mg/min的速率给予；优选小于或等于5mg/min，以达到约1至100mg/m2，优选约5至50mg/m2、约7至25mg/m2并且更优选约10mg/m2的剂量。如本领域技术人员将理解的，给予途经和/或方式将随所希望的结果而变化。在某些实施例中，活性化合物可与将保护该化合物避免快速释放的载体一起制备，如控释配制品，包括植入物、经皮贴片和微胶囊化递送系统。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类、以及聚乳酸。许多用于制备此类配制品的方法是获得专利权的或是本领域的技术人员通常已知的。参见例如Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems[缓控释药物递送系统],J.R.Robinson编辑,Marcel Dekker,Inc.[马塞尔德克尔公司],纽约,1978。
该抗体分子可以通过静脉内输注以超过20mg/min，例如20-40mg/min，并且典型地大于或等于40mg/min的速率给予，以达到约35至440mg/m2，典型地约70至310mg/m2，并且更典型地约110至130mg/m2的剂量。在实施例中，约110至130mg/m2的输注速率达到约3mg/kg的水平。在其他实施例中，该抗体分子可以通过静脉内输注以小于10mg/min，例如小于或等于5mg/min的速率给予，以达到约1至100mg/m2，例如约5至50mg/m2、约7至25mg/m2、或约10mg/m2的剂量。在一些实施例中，该抗体在约30min的时间内输注。
应注意，剂量值可以随待减轻的病状的类型和严重程度而变化。应进一步理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和给予或监督组合物给予的人的专业判断随时间调整特定剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的，并不旨在限制所要求保护的组合物的范围或实践。
实例
参考以下实验实例对本发明进一步详述。提供这些实施仅出于说明的目的，并且不旨在进行限制，除非另外说明。因此，本发明不应以任何方式被解释为限于以下实例，而是应被解释为涵盖因本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。
实例1：表达CD19 CAR的细胞和PD-1抑制剂降低了人受试者中的肿瘤负荷
与PD-1拮抗剂组合用CD19 CART细胞输注治疗患有滤泡性淋巴瘤转变为“双击”DLBCL的34岁女性。该女性先前经历了11次化疗和免疫疗法，包括同种异体骨髓移植，但对先前疗法无响应。在给予CD19 CART细胞(CTL019)之前，使该女性经历淋巴清除化疗(例如卡铂和吉西他滨)。向该女性给予CTL019，随后是放射疗法，并且然后是PD-1拮抗剂，派姆单抗(人源化IgG4抗PD-1单克隆抗体)。在给予CTL019与放射疗法之间进行活组织检查-通过流式细胞术、免疫组织化学(IHC)、和荧光原位杂交(FISH)分析活组织检查。通过流式细胞术，样品对于κ轻链、CD10、和CD19呈阳性。通过IHC，样品具有大的PAX5+ B细胞并且是PDL1+。通过FISH，样品具有重排列的c-MYC和BCL-2。在派姆单抗治疗后进行第二活组织检查。在第二活组织检查中，观察到广泛的坏死，并且未检测到肿瘤。因此，数据表明CD19 CART细胞与PD-1拮抗剂的组合在减少人体肿瘤负荷方面是有效的。
实例2：PD-1拮抗剂PDR-001的表征
PDR-001是针对人PD-1的人源化单克隆抗体。PDR-001具有稳定铰链突变以防止分子解离和半抗体的形成。PDR-001属于IgG4/κ同种型亚类。
在体外表征PDR-001对人PD-1的亲和力和活性。PDR-001在CHO细胞系中表达。PDR-001以高亲和力结合人PD-1。在Biacore测定中，PDR-001对人PD-1的Kd是0.83nM。在使用人血液的离体淋巴细胞刺激测定中，响应于用葡萄球菌肠毒素B(SEB)的超抗原刺激，PDR-001使白细胞介素-2(IL-2)产生增强大约2倍。PDR-001不与啮齿动物PD-1交叉反应但与食蟹猴PD-1交叉反应并具有功能活性，从而使食蟹猴成为毒理学研究的相关物种。PDR-001对食蟹猴PD-1的亲和力是0.93nM，这与对人PD-1的Kd相似。
此外，在具有安全药理学终点和八周恢复的食蟹猴的五周良好实验室实践(GLP)毒理学研究中评估了PDR-001的非临床毒理学。评估了高达100mg/kg/周的剂量，没有与药物相关的生命、死亡率、器官重量变化、或肉眼可见的发现。在测试的最高剂量下，注意到巨噬细胞浸润在脾脏中，以及血管和血管周围空间中有限的单核细胞浸润。
实例3：PDR-001的临床结果
在患有晚期恶性肿瘤的患者中对PDR-001进行了临床研究。以1、3、和10mg/kg Q2W以及3和5mg/kg Q4W的剂量水平治疗患者。没有患者经历剂量限制毒性，并且毒性特征似乎与市售的PD-1抑制剂相似。从剂量递增和暴露数据建模获得的药代动力学数据支持使用每4周给予400mg的PDR-001的平坦剂量。谷浓度(C谷)与观察到的派姆单抗的稳态平均谷浓度一致，派姆单抗被认可在几种癌症类型中具有显著功效。该数据还支持例如在组合治疗方案中，使用300mg Q3W作为替代剂量方案。
实例4：使用CTL019和PDR-001的组合的临床研究
该研究中的受试者患有已被鉴定为CD19+的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。受试者具有以下特征中的一个或多个：(i)初级疗法后残留的疾病，并且因此没有资格进行自体干细胞移植；(ii)先前自体干细胞移植后复发或持续性疾病；(iii)超过首次完全响应(CR)伴有复发或持续性疾病并且没有资格或不适合常规同种异体或自体干细胞移植；和/或(iv)滤泡性淋巴瘤或CLL/SLL的先前历史。
受试者接受输注CART-19(例如CTL019细胞，例如本文详细描述的)。将CART-19细胞在不溶性冷介质中冷冻保存，并作为单次输注给予。每袋细胞含有包含以下不溶性等级试剂(％v/v)的冷介质：31.25％勃脈力-A(plasmalyte-A)、31.25％葡萄糖(5％)、0.45％NaCl、高达7.5％ DMSO、1％葡聚糖40、和5％人血清白蛋白。通过含有1-5x 108个用CD19TCRζ/4-1BB载体转导的细胞的输注，静脉内给予CART-19细胞的单剂量。该输注在化疗后大约1-4天发生。该CART-19是鼠CART-19(例如CTL019)。
受试者还接受PDR-001。PDR-001在CHO细胞中表达。PDR-001配制品是小瓶中的冻干粉末，每瓶100mg/冻干物。在用1.0mL注射用水重构冻干粉末后，所得溶液含有100mg/mLPDR-001、组氨酸/组氨酸-HCl、蔗糖、聚山梨醇酯-20，pH为5.5。如果未发展细胞因子释放综合征(CRS)，则在CART-19输注后给予PDR-001。如果在CART-19输注后发展了CRS，则在CRS消退后给予PDR-001。
实例5：低剂量RAD001在细胞培养模型中刺激CART增殖
低剂量RAD001对体外CAR T细胞增殖的影响描述于例如US 2016/0096892 A1的实例8中，并且该申请的内容通过引用并入本文。
实例6：低剂量RAD001在体内刺激CART扩增
低剂量RAD001对体内CART扩增的影响描述于例如US 2016/0096892 A1的实例9中，并且该申请的内容通过引用并入本文。
实例7：PD-1阻断调制的嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞和诱导的肿瘤消退
阻断T细胞上程序性死亡1受体(PD-1)的抗体通过破坏PD-L1/PD-1免疫抑制轴而在多种癌症中产生肿瘤消退。参见例如，Topalian等人N.Engl J Med[新英格兰医学杂志]2012；366:2443-54；Brahmer等人N Engl J Med[新英格兰医学杂志]2012；366:2455-65；Hamid等人N Engl J Med[新英格兰医学杂志]2013；369:134-44；Wolchok等人N Engl JMed[新英格兰医学杂志]2013；369:122-33；和Topalian等人J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]2014；32:1020-30。这种癌症免疫疗法的方法可能是嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞疗法的良好搭档，但该组合尚未经过测试。该实例描述了其中在使用针对CD19(CART19)的CAR修饰的T细胞疗法后向患有难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和进行性淋巴瘤的患者给予PD-1阻断抗体的实验。在PD-1阻断后，患者具有强大的抗肿瘤响应、CART19细胞扩增，以及CART19细胞对PD-1和Eomes的共表达降低。这些结果表明抗PD-1可以高效地对抗不能响应于CAR修饰的T细胞疗法的癌症。它还表明PD-1途径在确定响应于CAR修饰的T细胞免疫疗法方面可能是重要的。
在宾夕法尼亚大学的一项临床试验中，用表达鼠抗CD19 scFv和4-1BB-CD3ζ共刺激-活化结构域的自体CART19细胞治疗一名患有原发性纵隔起源的多次预处理的难治性DLBCL的35岁男性，其中在诊断时出现小肠的结外受累、以及纵隔、肺、心肌、和心包进展(NCT02030834)。参见Schuster等人Blood[血液]2015；126(23):183(摘要)。如先前所述制造CART19细胞。参见例如，Porter Sci Transl Med[科学转化医学]2015；7(303):303ra139；和Milone等人Mol Ther[分子疗法]2009；17(8):1453-64。该患者接受了使用超分割环磷酰胺(300mg/m2x 6剂量)的淋巴清除化疗，随后于2015年10月16日进行了自体CART19细胞输注(5x 108个CART19细胞或5.34x 106个细胞/kg)。于2015年11月11日进行随访胸部CT扫描，以评估恶化的呼吸困难，显示出进行性淋巴瘤伴纵隔和心包肿瘤扩大，以及新的和扩大的肺结节(图1A)。心脏MRI记录心肌和心包侵袭。鉴于患者的快速进展性缺氧和呼吸窘迫的临床状况，未进行纵隔镜检查或胸部肺活组织检查。因此，不可能将CTL019后的假性进展排除为纵隔淋巴结和肺实质病变扩大的原因。他于2015年11月11日接受了2mg/kg的派姆单抗。选择派姆单抗用于治疗，因为临床前数据表明抗PD-1疗法有效地增强基因修饰的T细胞根除已建立的肿瘤(参见例如，John等人Clin Cancer Res[临床癌症研究]2013；19(20):5636-46)，以及患者的肿瘤细胞强烈表达PD-L1(图1B)。除发烧之外，疗法是耐受良好的。到2015年11月30日，注意到显著的临床改善；在那时胸部CT显示多发性肺结节、胸腔积液、纵隔淋巴结肿大、和心包结节的间隔改善(图1A)。因此，在CART19后的假性进展被认为是不可能的，因为在给予派姆单抗后存在病灶大小的减少，而不是进一步进展。在治疗3周后，他能够重返工作岗位。每3周继续2mg/kg的派姆单抗；2015年12月22日和2016年4月20日的PET/CT扫描显示纵隔腺病持续解剖改善，其中残余FDG摄取(部分代谢响应)；淋巴瘤引起的肺部受累已消退。在派姆单抗开始后的12个月，患者继续在临床上表现良好。
通过qPCR分析外周血的CART19 DNA变化(数据未示出)，通过流式细胞术分析CART19细胞百分比，以及血清细胞因子的变化(图2A-2B)。参见Porter等人Sci Transl Med[科学转化医学]2015；7(303):303ra139。在CART19细胞输注后，CART19 DNA拷贝数增加至最大2,350个拷贝/mcg DNA，并且从在派姆单抗之前第14天的497个拷贝/mcg再次增加至在派姆单抗之后第26天的1,530个拷贝/mcg，其中在开始使用派姆单抗后明显持续增加。在第10-14天左右CART19输注稳定后，表达CAR19的T细胞百分比增加；然而，在派姆单抗后48小时，观察到最高百分比的CAR19+ T细胞(图2A)。这反映了在派姆单抗后，CAR19+CD8+和CD4+T细胞两者，特别是CART19+CD8+细胞的增加(数据未示出)。在CART19输注后3-7天和派姆单抗后24小时期间观察到最高的血清IL-6水平(图2B)。在派姆单抗输注后，共表达PD1/Eomes的CART19细胞在CD4+CART19+细胞(图2E、图2I和图2J)和CD8+CART19+细胞(图2F、图2K和图2L)中减少。在共表达PD-1和CTLA4、TIM3、或LAG3的细胞中未观察到变化(数据未示出)。在派姆单抗后，粒酶B+表达在两种T细胞子集中，特别是在CART19+CD8+细胞中增加(图2G-2H)。
在第14天(派姆单抗之前)、第26天(派姆单抗后1小时)、和第45天(派姆单抗后19天)对单采血液成分术产物、CART19转导的细胞产物、和外周血进行TCRβ深度测序。观察到派姆单抗后富度(生产性重排)和生产性克隆性的增加(数据未示出)。在派姆单抗后观察到8个显性克隆(频率≥1％，范围1.2％-13.1％)。这些克隆中的两个在CART19输注后最初扩增(第14天，克隆1：6.1％，克隆2：2.4％)并在派姆单抗后继续进一步扩增(第26和第45天，克隆1：6.1％至13.11％和克隆2：2.9％至6.45％)。四个克隆在CART19后以低水平存在，并在派姆单抗后扩增(第14天至第26天至第45天，克隆4：0.4％至0.4％至2.1％，克隆5：0.1％至0.3％至1.5％，克隆7：0.6％至0.9％至1.3％，克隆8：0.1％至0.3％至1.2％)；并且两个显性克隆仅在派姆单抗后出现(第14至第26天至第45天，克隆3：0％至0.27％至3.57％，克隆6：0％至0.04％至1.46％)。临床观察结果与相关实验室发现相结合表明，除可能诱导其他肿瘤定向克隆的增殖之外，派姆单抗还可以增强CART19细胞功效。这通常还表明PD-1/PD-L1途径在CAR修饰的T细胞免疫疗法中的潜在重要作用。基于本文所述的结果，正在进行不能响应于CART19疗法的患有CD19+淋巴瘤的患者中的派姆单抗的I/II期临床试验(NCT02650999)。
实例8：低水平的免疫检查点分子与改善的结果相关
通过免疫组织化学检测来自淋巴瘤患者的样品中的免疫检查点分子(PD-L1、PD1、LAG3、和TIM3)。还进行阳性和阴性对照组织和细胞系。使用定量图像分析对感兴趣的区域进行免疫检查点表达分析，该感兴趣的区域可以包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞(如免疫细胞)。从组织、淋巴结、或骨髓采取样品。
在用CD19靶向CAR疗法治疗后，在完全响应者(CR)和患有进行性疾病(PD)的患者中比较免疫检查点蛋白质表达。如图3所示，CR患者在治疗之前和之后倾向于具有低水平的PD-L1、PD1、LAG3、和TIM3，而PD患者在治疗之前和之后倾向于具有高水平的这些分子。该实例支持与表达CAR的细胞和免疫检查点抑制剂的组合疗法，并支持测试以确定接受CAR疗法的患者中的免疫检查点分子水平。
实例9：CLL患者的无响应者子集表现出免疫检查点抑制剂分子的表达增加
在该研究中，评估来自34名CLL患者的临床制造的CART19细胞的免疫检查点抑制剂分子(如PD-1、LAG3、和TIM3)的表达。该队列对CART19的响应是已知的，并且因此可以评估响应与生物标记表达模式之间的相关性。
通过流式细胞术分析来自对CART疗法具有不同响应的CLL患者的制造的CART19细胞，以确定CAR和免疫检查点抑制剂分子PD-1、LAG3、和TIM3的表达。CART19细胞来自：健康供体(HD)(n＝2)；响应于CART疗法的CLL患者(CR)(n＝5)；部分响应于CART疗法的CLL患者(PR)(n＝8)；不响应于CART疗法的CLL患者(NR)(n＝21)。根据本领域已知的流式细胞术分析的标准方法，用荧光标记的抗体染色细胞，这些荧光标记的抗体特异性识别CD3、CD4、CD8、CD27、CD45RO、CAR19分子，以及免疫检查点分子PD-1、LAG3、和TIM3。通过流式细胞术分析软件确定每种标记(例如CD4+、CD8+等)的表达，并进一步分析亚群(例如，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、或表达CAR19的T细胞)的免疫检查点分子PD-1、LAG3、和TIM3的表达。
用于确定表面标记表达的流式细胞术谱分析的实例在图4A和4B中示出。使用流式细胞术测定表达CD4的T细胞，并进一步分析CAR19和PD-1表达，使得谱的x轴表示表达CAR19的(左上(Q5)和左下(Q8)象限示出CAR19阴性CD4+细胞，而右上(Q6)和右下(Q7)象限示出表达CAR19的CD4+细胞)并且y轴示出PD-1表达(左下(Q8)和右(Q7)象限示出PD-1阴性CD4+细胞并且左上(Q5)和右(Q6)象限示出PD-1表达CD4+细胞)。在来自CART响应者的CD4+群中，44.7％的CD4+细胞总体上表达PD-1，并且约22.3％的表达CAR19的细胞是PD-1阳性的，而27.2％的表达CAR19的细胞是PD-1阴性的(图4A)。相比之下，在来自非响应者的CD4+群中，总体上表达CAR19的细胞显著减少(与CR中的49.5％相比约为15.3％)，其中14.7％的表达CAR19的细胞是PD-1阳性的，而仅0.64％是PD-1阴性的(图4B)。图4A与图4B中的谱之间的比较显示，与CART响应者(约44.7％)相比，来自非响应者的表达PD-1的CD4+细胞的百分比高得多(约92.9％)。
使用上述方法和分析，确定每个响应组中每个患者的CD4+群和CD8+群的PD-1表达(PD-1+)细胞的百分比。与响应于CAR疗法(CR)的那些相比，无响应者被证实在CD4+(图4C)和CD8+(图4D)两个群中具有更大的PD-1+细胞的百分比；CD4+和CD8+两个群的平均PD-1百分比的增加是统计学显著的。部分响应者(PR)在CD4+(图4C)和CD8+(图4D)两个群中表现出比响应者(CR)更高百分比的PD-1+细胞。
接下来，确定每个响应组中每个患者的表达CAR19的CD4+群和表达CAR19的CD8+群的PD-1表达(PD-1+)细胞的百分比。如上所述进行类似的分析，其中另外的步骤是分析CD4+和CD8+细胞的表达CAR19的，并且在鉴定表达CAR19的细胞后，确定来自表达CAR19的细胞群的具有PD-1表达的细胞的百分比。对于表达CAR19的CD4+和CD8+群，观察到与在CD4+和CD8+总体群中观察到的类似趋势：与响应于CAR疗法(CR)的那些相比，无响应者被证实在CD4+(图5A)和CD8+(图5B)两个群中具有更大的PD-1+细胞的百分比；CD4+和CD8+两个群的平均PD-1百分比的增加是统计学显著的。部分响应者(PR)在CD4+(图5A)和CD8+(图5B)两个群中表现出比响应者(CR)更高百分比的PD-1+细胞。
进行进一步分析以确定表达PD-1、LAG3、和TIM3的细胞在对CAR疗法具有不同响应的患者中的分布。CD4+群中PD-1、LAG3、和TIM3表达的代表性细胞概况分析在图6中示出。首先分析细胞群的CD4+和CD8+表达。然后分析CD4+群(或CD8+群，未示出)的PD-1和CAR19表达(图6，左侧图谱)。如先前所述，与CART响应者(CR)相比，无响应者(NR)具有显著增加百分比的为PD-1+总体的细胞(对于NR为约92.9％ PD-1阳性相比于对于CR为44.7％PD-1阳性)。此外，在非响应者中，表达CAR19的细胞大多数是PD-1阳性的(14.7％ PD-1阳性和CAR+相比于0.64％PD-1阴性和CAR+)。然后分析这些群的PD-1和LAG3共表达(图6，中间图谱)。表达PD-1和LAG3两者的细胞在右上象限(Q2)中示出。与CART响应者相比，无响应者具有显著增加百分比的表达免疫检查点抑制剂PD-1和LAG3两者的细胞(67.3％相比于7.31％)。还用TIM3表达分析PD-1表达。在图6右侧图谱中，该框表示表达PD-1和TIM3两者的细胞。与用PD-1和LAG3获得的结果类似，与CART响应者相比，无响应者具有显著更高百分比的表达免疫检查点抑制剂PD-1和TIM3两者的细胞(83.3％相比于28.5％)。使用如上所述的流式细胞术分析，确定每个响应组中每个患者的表达PD-1的细胞(PD1+)、表达PD-1和LAG3的细胞(PD1+LAG3+)、以及表达PD-1和TIM3的细胞(PD1+TIM3+)的百分比。与CART响应者相比，非响应者被证实具有对于两个细胞群均是统计学显著的增加百分比的PD1+LAG3+细胞(图7A)和PD1+TIM3+细胞(图7B)。与CART响应者相比，部分响应者也显示增加百分比的两种细胞群，其中平均值与无响应者相比有所降低。
这些结果表明，与响应于或部分响应于CAR疗法的患者相比，不响应于CAR疗法的患者表现出免疫检查点抑制剂(例如PD-1、LAG3、和TIM3)的表达增加。因此，这些结果显示，抑制或降低免疫检查点抑制剂(例如PD-1、LAG3、或TIM3)表达的药剂可以用于向接受CAR疗法的患者给予以预防通过(例如由PD-1、LAG3、或TIM3介导的)免疫检查点途径的免疫抑制，从而增加表达CAR的细胞的功效。
实例10：某些患有原发性DLBCL患者显示CD3+/PD1+双阳性癌细胞
尽管最近以嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞和检查点抑制剂的形式在癌症免疫疗法领域取得了令人瞩目的进展，但尚未广泛获得探索其组合的治疗机制的先进工具。为了满足这种日益增长的需求，开发了一种使用多重AQUA(自动定量分析)技术的稳健的定量荧光免疫组织化学平台，以评估检查点抑制剂表达、计数CAR T细胞并通过新型共定位算法确定肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用。在临床前和临床模型两个系统中表征了该方法的实用性。在B细胞淋巴瘤的免疫缺陷小鼠模型中，评估CAR T细胞至原发性淋巴器官中的恶性B细胞的归巢。通过CD4、CD8、PD1和FOXP3表达的多重分析确定CAR T细胞的表型和功能状态。另外，为了在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)环境中实现组合免疫疗法，通过由在来自DLBCL患者(n＝63)的初级和次级活组织检查中进行细胞质和核染色产生的界标检测了免疫和肿瘤细胞区室中为PD1和PD-L1表达形式的适应性免疫抗性机制的存在。为了支持CART试验的患者选择，量化通过传统方法可以重复评分的相关肿瘤抗原的表达和存在以产生客观切割点。用于最佳患者选择的这些定量多重IHC方法可以用于即将进行的新型组合免疫疗法试验中。
对原发性DLBCL(n＝49)和继发性DLBCL(15)人患者进行DLBCL组织样品的样品制备、成像、和成像分析。
样品制备。将福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品脱蜡。然后通过一系列二甲苯至醇洗涤将载玻片再水化，接着在蒸馏水中孵育。然后使用升高的压力和温度条件进行热诱导的抗原恢复，使其冷却，并转移至Tris缓冲盐水中。然后进行染色，其中进行以下步骤。首先，将内源性过氧化物酶阻断，随后与蛋白质-阻断溶液一起孵育以减少非特异性抗体染色。接下来，用小鼠抗PD1初级抗体染色载玻片。然后洗涤载玻片，接着用抗小鼠HRP第二抗体孵育。洗涤载玻片并且然后使用 5(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))检测PD-1染色。然后通过微波除去初级和第二抗体试剂。再次洗涤载玻片，接着用兔抗CD3初级抗体染色。洗涤载玻片并且然后与抗兔HRP第二抗体加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的混合物一起孵育。洗涤载玻片并且然后使用3(珀金埃尔默公司)检测CD3染色。最后一次洗涤载玻片，接着将其用封固的介质覆盖滑动，并使其在室温下干燥过夜。
样品成像和分析。然后使用采用Vectra软件版本2.0.8的Vectra 2智能载玻片分析系统(珀金埃尔默公司)获取荧光图像。首先，使用DAPI以4倍放大率对载玻片进行单色成像。使用自动算法(使用inForm开发)来鉴定含有组织的载玻片区域。
对于与DAPI(蓝色)、3(绿色)、和5(红色)相关的通道，将鉴定为含有组织的载玻片区域以4倍放大率成像，以产生RGB图像。使用自动富集算法(使用inForm开发)在视场选择器中处理这些4倍放大图像，以根据最高的3表达来鉴定和排列可能的20倍放大视场。
将前40个视场在DAPI、3、和5波长上以20倍放大率成像。检查原始图像的可接受性，并且在分析之前拒绝未聚焦、缺少任何肿瘤细胞、高度坏死、或含有高水平的与预期抗体定位无关的荧光信号(即背景染色)的图像。使用AQUAduct(珀金埃尔默公司)处理接受的图像，其中通过光谱解混器将每个荧光团在光谱上解混成单独的通道并保存为单独的文件。
使用AQUAnalysisTM或通过使用AQUAserveTM的全自动过程进一步分析处理过的文件。通过细胞掩蔽器处理每个DAPI图像以鉴定该图像内的所有细胞核，并且然后扩大2个像素以表示整个细胞的近似大小。该所得掩模代表该图像内的所有细胞。通过生物标记掩蔽器处理每个5图像以产生为PD-1阳性的所有细胞的二元掩模。通过生物标记掩蔽器处理每个3图像以产生为CD3阳性的所有细胞的二元掩模。将所有细胞PD-1阳性和CD3阳性的二元掩模组合以产生对于PD-1和CD3为双重阳性的所有细胞的二元掩模。使用阳性计算器，通过将所有PD-1阳性肿瘤细胞的掩模的总面积(以像素为单位测量并由面积评估器确定)除以所有CD3阳性细胞的掩模的总面积(以像素为单位测量并由面积评估器确定)推出表达PD-1的所有CD3细胞的生物标记阳性率％(PBP)。原发性和继发性DLBCL人样品中表达PD-1的所有CD3阳性细胞的PBP的代表性值在图8中示出。CD3和PD-1状态显示原发性中CD3+/PD-1+细胞的患病率高于继发性DLBCL环境，从而为选择单一或组合治疗的患者提供了机会。
进行类似的实验，其中使用兔抗PDL1初级抗体和TSA+Cy5(珀金埃尔默公司)在来自原发性DLBCL人患者的DLBCL组织样品上检测PD-L1。还在同一样品上检测PD1和CD3。实验显示肿瘤微环境包含表达PD1、CD3、和PDL1的细胞。该实验还鉴定了为CD3+PD1+的细胞亚群(数据未示出)。这些结果支持肿瘤微环境促进免疫抑制细胞的模型，这些免疫抑制细胞可以用特异于PD1+或PD-L1+细胞的药剂靶向。
实例11：包含DLBCL细胞的样品中CD19和PD-L1的互斥表达
样品制备。将福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品脱蜡。然后通过一系列二甲苯至醇洗涤将载玻片再水化，接着在蒸馏水中孵育。然后使用升高的压力和温度条件进行热诱导的抗原恢复，使其冷却，并转移至Tris缓冲盐水中。然后进行染色，其中进行以下步骤。首先，将内源性过氧化物酶阻断，随后与蛋白质-阻断溶液一起孵育以减少非特异性抗体染色。接下来，用兔抗PDL1初级抗体染色载玻片。然后洗涤载玻片，接着用抗兔HRP第二抗体孵育。洗涤载玻片并且然后使用3(珀金埃尔默公司)检测PDL1染色。然后通过微波除去初级和第二抗体试剂。再次洗涤载玻片，接着用小鼠抗CD19初级抗体染色。洗涤载玻片并且然后与抗小鼠HRP第二抗体加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的混合物一起孵育。洗涤载玻片并且然后使用5(珀金埃尔默公司)检测CD19染色。最后一次洗涤载玻片，接着将其用封固的介质覆盖滑动，并使其在室温下干燥过夜。
样品成像和分析。然后使用采用Vectra软件版本2.0.8的Vectra 2智能载玻片分析系统(珀金埃尔默公司)获取荧光图像。首先，使用DAPI以4倍放大率对载玻片进行单色成像。使用自动算法(使用inForm开发)来鉴定含有组织的载玻片区域。
对于与DAPI(蓝色)、3(绿色)、和5(红色)相关的通道，将鉴定为含有组织的载玻片区域以4倍放大率成像，以产生RGB图像。使用自动富集算法(使用inForm开发)在视场选择器中处理这些4倍放大图像，以根据最高的3表达来鉴定和排列可能的20倍放大视场。
将前40个视场在DAPI、3、和5波长上以20倍放大率成像。检查原始图像的可接受性，并且在分析之前拒绝未聚焦、缺少任何肿瘤细胞、高度坏死、或含有高水平的与预期抗体定位无关的荧光信号(即背景染色)的图像。使用AQUAduct(珀金埃尔默公司)处理接受的图像，其中通过光谱解混器将每个荧光团在光谱上解混成单独的通道并保存为单独的文件。
如先前实例中所述，使用AQUAnalysisTM或通过使用AQUAserveTM的全自动过程进一步分析处理过的文件。
原发性和继发性DLBCL人样品中所有CD19阳性和PD-L1阳性细胞的PBP的代表性值在图9中示出。CD19和PDL1表达在DLBCL样品中不同。CD19和PDL1表达倾向于互斥，即一般来说，给定的细胞表达CD19或PD-L1但不是两者。虽然不希望受理论的约束，但这可能是因为CD19在DLBCL肿瘤细胞中表达，而PD-L1在非肿瘤细胞(例如支持肿瘤微环境的细胞)中表达。该观察结果表明，CD19抑制剂(例如表达CD19 CAR的细胞)和PD-L1信号传导的抑制剂的组合疗法可以用于靶向这两个细胞群。
进行类似的实验以例如证明AQUA分析监测CART19功效的能力。该研究监测了包含具有CART19+Jurkat细胞和CD19+REH细胞的混合细胞系的样品中的CD19、CD3、和CART19核酸。通过抗体检测CD19和CD3蛋白，并使用针对CAR核酸的3'UTR的RNA探针检测CART19。该实验显示，细胞系样品包含表达CD19、CD3、和CART19的细胞(数据未示出)。该实验还显示，细胞系样品包含为CD3+/CART19+的细胞亚群(数据未示出)。进行接近分析，其显示CART19细胞在物理上接近CD19+细胞(数据未示出)。这些实验支持CD3+CART19细胞浸润包含CD19+细胞的肿瘤微环境，并且CD19和CART19细胞的物理位置转化为CART19疗法的功效的模型。
实例12：派姆单抗与靶向CD19的CAR T细胞组合以增加响应
注意：除非另外说明，否则本实例中使用的派姆单抗的剂量是基于患者体重的2mg/kg，直至达到200mg的剂量，此时给予200mg的平坦剂量。
靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞在B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中显示超过90％的完全响应(CR)率。患者的子集可能不响应于CAR T疗法，或者由于CAR T细胞持久性差而可能复发。本实例中描述的研究检查了抑制PD-1检查点途径是否可以改善CAR T细胞功能和持久性。
在CAR T细胞输注后14天-2个月开始，使用鼠(CTL019)或人源化(CTL119)抗CD19CAR T细胞治疗的患者接受PD-1抑制剂派姆单抗的1-3个剂量。在CTL019(n＝1)或CTL119(n＝3)输注后，使四名患有复发/难治性B-ALL的儿童接受派姆单抗以治疗部分/无响应(n＝3)或CAR T细胞持久性差的既往史(n＝1)。派姆单抗耐受性良好，其中2名患者发烧并且无自身免疫毒性。在派姆单抗后，在所有4名儿童中观察到可检测的循环CAR+ T细胞增加(通过流式细胞术的CD3+细胞的％)和/或延长的检测(与先前的输注相比)。
患者1和2在先前的小鼠CD19 CAR T细胞后接受CTL119以治疗CD19+复发，并用派姆单抗治疗以治疗对CTL119的部分或无响应。两者在派姆单抗后都患有进行性疾病，1名保留并且1名具有减少的CD19表达。
两名患者对添加派姆单抗具有客观响应。在患者3中，先前用CTL019和CTL119两者治疗导致具有差CAR T细胞持久性的CR，随后是CD19+复发。在重复CTL119输注与派姆单抗组合后，患者3实现了具有延长的CAR T细胞持久性的CR(在初始CTL119输注后在第50天可检测到相比于在第36天损失)。尽管在骨髓中具有形态学缓解，没有CAR T细胞治疗既往史的患者4在CTL019输注后第28天接受派姆单抗以治疗广泛的淋巴结受累。在CTL019后3个月，派姆单抗后的CAR T细胞增殖与PET-狂热疾病的显著减少相关。
结果显示，派姆单抗与CAR T细胞治疗安全地组合并且增加或延长CAR+ T细胞检测，其中观察到客观响应。因此，免疫检查点途径可以影响对CAR T细胞治疗的响应。
实例13：派姆单抗在复发性急性淋巴细胞白血病(ALL)中增加对CD19 CAR T细胞的响应
注意：除非另外说明，否则本实例中使用的派姆单抗的剂量是基于患者体重的2mg/kg，直至达到200mg的剂量，此时给予200mg的平坦剂量。
研究设计
显示CAR T细胞持久性差的先前用表达CD19 CAR的T细胞治疗的复发的难治性ALL患者有资格接受含有或不含派姆单抗的重复输注CAR T细胞。R/R ALL患者参加临床试验(NCT02374333)。在首次输注CAR-T细胞之前，患者进行了化疗和淋巴细胞清除。在第1天进行基线评估，随后首次输注人源化CD19 CAR T细胞(CTL119)。在第28天评估患者的响应，并在第3、6、9和12个月进行随访评估。监测患者的微小残留疾病(MRD)、B细胞发育不全和CTL119持久性。基于CTL119持久性的状况，用CTL119再次输注患者。一些患者在再次输注后至少2周或从CRS恢复后也用派姆单抗治疗。图10示出研究设计。
结果
病例1：派姆单抗用于治疗部分响应
病例1描述了患有R/R ALL且对先前CD19 CAR疗法无响应(NR)的患者。在该患者中观察到huCART19的增殖，并且在第28天患者表现为具有1.2％CD19+MRD的完全响应(CR)。在输注后7周，患者复发CD19+疾病和低水平的huCART19。然后在第52天给予患者派姆单抗。观察到huCART19适度增加，其中暂时清除外周胚细胞，随后疾病进展。
病例2：派姆单抗用于治疗无响应
病例2描述了在先前CD19 CAR疗法后12个月患有具有CD19+复发的R/R/ALL的患者。在该患者中观察到huCART19的良好增殖。在第28天，患者表现为具有CD19+复发的NR。在6周后将HuCART19再次输注到该患者中，随后在再次输注后14天用派姆单抗治疗。观察到huCART19的良好增殖以及细胞的延长持久性。在再次输注后第28天的评估中，患者显示出具有可变CD19表达的持续性疾病。
病例3-5：派姆单抗用于治疗持久性差
病例3、4和5描述了先前输注huCART19但显示CAR T细胞持久性差的R/R ALL患者。这些患者具有良好的初始huCART19增殖。所有3名患者再次输注huCART19，随后在再次输注后14天给予派姆单抗的剂量。
病例3描述了在先前输注huCART19后9个月患有具有CD19+复发的R/R ALL的患者。首次输注huCART19后的第28天评估显示其中未检测到MRD的CR。即使CAR T细胞增殖，CAR T细胞仅持续短时间，其中B细胞在2个月时恢复。在输注后15个月时，患者复发，并在17个月时再次输注huCART19，随后在14天后再给予派姆单抗的剂量。该患者显示出延长的持久性并且继续B细胞发育不全，同时每3周一次给予派姆单抗。图11示出了在派姆单抗处理存在或不存在下huCART19输注后数天huCART19细胞的百分比。派姆单抗增加了huCART19细胞的持久性。
病例4描述了在先前输注huCART19后9个月表现为具有CD19+复发的R/R ALL的患者。首次输注huCART19后的第28天评估显示其中未检测到MRD的CR。即使观察到良好的CART细胞增殖，CAR T细胞仅持续短时间，其中在2个月时观察到B细胞恢复。在输注后12个月时，患者复发，并在14个月时再次输注huCART19，随后在14天后再给予派姆单抗的剂量。未观察到huCART19的增殖，并且第二次输注后的第28天评估显示其中检测到CD19+MRD的无响应(NR)。
病例5描述了在先前输注huCART19后12个月表现为具有CD19+复发的R/R ALL的患者。首次输注huCART19后的第28天评估显示其中未检测到MRD的CR。即使观察到良好的CART细胞增殖，CAR T细胞仅持续短时间。在首次输注后6个月，患者接受第二次输注短持久性的CAR T细胞。在首次输注后8个月时，患者再次接受输注huCART19，随后在14天后接受派姆单抗的剂量。该患者显示出延长的持久性并且继续B细胞发育不全，同时每3周一次给予派姆单抗。图12示出了比较仅接受huCART19(n＝4)的患者和接受huCART19和派姆单抗(n＝7)的患者中B细胞恢复概率的图。
病例6：派姆单抗用于治疗淋巴瘤疾病
病例6描述了患有R/R ALL的患者，其在骨髓中具有M3阶段并且具有广泛的淋巴瘤疾病(LAD)。该患者接受了CART19的输注并且细胞增殖良好。第28天评估显示骨髓中的CR，然而PET分析显示一个或多个淋巴结中的广泛摄取。然后在输注后第32天给该患者派姆单抗，并且每2-3周给予一次。如图13所示，派姆单抗治疗增加了CART19细胞的百分比。在用派姆单抗治疗后还观察到PET狂热病变的减少(图14)。
实例14：复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤患者(r/r DLBCL)中与派姆单抗组合的靶向CD19的CAR T细胞
研究基本原理
靶向CD19的CART疗法(CTL019)在36％-45％的患者中对r/rDLBCL具有潜在的治愈作用。然而，PD-L1在DLBCL细胞上高度表达，从而导致转导的T细胞上(例如CTL019细胞上)的PD-1活化。CTL019细胞上PD-1的活化导致CTL019疗法的功能受损。用抗PD-1治疗阻断PD-1/PD-L1相互作用，这可以重新活化来自患有DLBCL的患者的CTL019细胞并提高响应率。
对r/r DLBCL中CTL019的C2201(JULIET)研究的初步分析显示，与响应者相比，在对CTL019疗法无响应的患者中观察到CTL019成品中检查点抑制剂(例如PD-1和TIM-3)的较高表达相关。在该研究中57％的患者(99人中有57.6人)观察到细胞因子释放综合征，其中11％患有1级CRS，23％患有2级CRS，15％患有3级CRS，并且8％患有4级CRS。在患有CRS的患者中，CRS发作的平均时间(以天计)为4.1天，其中中位数为3.0天。最早的患者在CTL019给予后1天发展CRS，并且在CTL019给予后51天观察到CRS的最新时间点。这些患者的CRS平均持续时间为8.3天，其中中位数为7.0天，并且所有患者的CRS持续时间范围为2-30天。平均而言，3级或4级CRS需要4.2天进行发展。观察到3级或4级CRS的最早时间点为2天，并且观察到3级或4级CRS的最新时间点为8天。
在r/r DLBCL中的CTL019的A2101J(DLBCL)研究中，与从响应者获得的样品相比，在从非响应者获得的活组织检查样品中和体内CTL019细胞中观察到更高的检查点抑制剂(例如TIM3、LAG-3、PD1、PD-L1)表达。淋巴结和骨髓样品的免疫组织化学分析显示，在患有进行性疾病(PD)的患者中，TIM3、LAG-3、PD1、和PD-L1的表达更高。另外，调查了r/r DLBCL中的派姆单抗的该研究显示接受CTL019后有进展的9名患者中有5名响应于派姆单抗治疗。在响应于派姆单抗的患者中未观察到CRS事件，并且响应持续时间(DoR)超过1年。
总之，来自这些试验的数据表明抗PD1疗法与CLT019配对可能是一种有效的治疗方案，为没有资格进行移植的患有r/r DLBCL的患者提供治愈的可能性，如通过更高的总体和完整的响应率所证明。与单独的CTL019和替代治疗选择相比，抗PD1和CTL019的组合也显示出持续的响应持续时间。组合疗法具有类似于CTL019单一疗法的副作用特征，没有另外的长期不希望作用。因此，派姆单抗和CTL019的组合改善了患者的治疗效果，使其成为一种更好、更具成本效益的治疗方案。另外，组合疗法可以在彼此的短时间内给予，例如，例如在不发展CRS的患者中，抗PD-1抗体可以在CTL019给予后(例如5-15天后)不久给予。对于在CTL019疗法后患有CRS的患者，可以例如在解决CRS后给予抗PD-1抗体。
研究设计
将进行在r/r(JULIET)DLBCL患者群中并行给予CTL019和派姆单抗的I/II期研究。单臂研究将招募20-25名患者，并将包括剂量计时结果的磨合。没有资格进行移植的患有r/r DLBDL的患者将参加该研究。在疗法开始之前五周(第5周)，将产生自体CTL019细胞并冷冻保存。在此期间将开始挽救疗法，并且将在CTL019输注之前一周(第1周)进行疾病分期。然后将CTL019输注到患者体内。在CTL019输注后至少5天将给予派姆单抗疗法。将每3周一次给予六次派姆单抗，剂量为300mg。将在输注后的前6个月每月评估患者，从7-24个月每3个月进行评估，并且之后每6个月进行评估。根据FDA关于基因转移方案的规定，患者将被随访15年。
该研究的结果将指导开展一项具有90名患者的双臂随机II期注册研究。没有资格进行移植的患有r/r DLBCL的患者将参加该研究。在该II期研究中，一组60名患者将并行接受给予与CTL019组合的派姆单抗，并且另一组30名患者将单独接受给予CTL019。该研究的主要目的将是评估CTL019与派姆单抗组合的功效。该研究的主要终点将是治疗后3个月时患者的响应率(RR)。该研究的第二个目的将是评估接受组合疗法的患者相比于单独接受CTL019的患者在3个月时RR的差异。
实例15：派姆单抗疗法用于治疗先前用靶向CD19的CAR T细胞治疗的复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤患者(r/r DLBCL)
在患有r/r DLBCL的患者中开始使用派姆单抗的临床试验，该患者在CTL019输注后具有记录的进展。一旦观察到进展并记录，立即给予派姆单抗的第一剂量。每3周一次给予派姆单抗持续2年。患者在CTL019输注后约28天接受了派姆单抗。
先前接受CTL019并随后用派姆单抗治疗的患有进行性DLBCL的9名患者中有5名表现出对该疗法的响应。最长的响应持续时间超过1年。在这些患者中未观察到CRS。
实例16：患有难治性/复发性霍奇金淋巴瘤(HL)的患者中的非病毒、RNA重定向的自体抗CD19T细胞
背景
使用抗CD19自体嵌合抗原受体T(CART19)细胞的细胞疗法在B细胞来源的几种血液恶性肿瘤中显示出有希望的结果，但该疗法尚未在霍奇金淋巴瘤(HL)患者中进行研究。虽然肿瘤性HL里德-斯泰伯格氏(HL Reed-Sternberg，HRS)细胞被认为是CD19阴性的，但循环CD19阳性克隆HRS细胞前体和HRS肿瘤微环境内的CD19阳性反应细胞代表HL中CART19的潜在治疗靶标。
方法
设计了一项开放标记试点研究以评估RNA CART19细胞输注在患有复发/难治性HL的患者中的可行性、安全性、和有效性，这些患者对没有治愈性治疗选项的多于一系列标准挽救疗法无响应或不耐受。在这些患者中使用了用嵌合抗CD19免疫受体scFv(RNA CART19细胞)电穿孔的自体T细胞代替通过慢病毒转导工程化的更持久的细胞，以允许瞬时CD19靶向并限制急性和长期毒性的窗口。在提取和制造RNACART19细胞后，对于体重小于80kg的患者，使患者经历多达六次静脉内(IV)输注8x 105至1.5x 106个RNA CART19细胞/kg/剂量，并且对于体重多于80kg的患者为1x 108个RNA CART19细胞/剂量(±20％)。在第一和第四RNACART19细胞剂量之前给予静脉内环磷酰胺(30mg/kg)以增强植入。在整个研究中的确定时间点测量使用Cheson 2007标准的安全性和响应评估。主要目的是描述复发HL中RNACART19细胞的制造可行性、安全性、和生物学植入。第二个目的是通过总响应率(ORR)和RNACART19细胞对全身可溶性免疫因子的影响来估计功效。
结果
招募了5名患者并制造了RNA CART19，其中输注了4名患者并评估了响应和/或毒性。参与研究的5名患者的特征包括：i)中位年龄为24岁，其中范围为21-42岁；ii)四名患者患有IV期/结外疾病，iii)先前疗法的中位数为5，其中范围为0-8次先前疗法；iv)4名患者进行了干细胞移植(3名患者进行了自体干细胞移植，并且1名患者进行了自体和同种异体干细胞移植)。在用RNA CART19细胞治疗的患者中，三名患者(60％)先前已在PD-1抑制剂上进展。提取的绝对淋巴细胞计数中值为1,030mmol/μL(范围：830-2,650)。所有患者均成功制造RNA CART19。两名患者需要桥接化疗，其中一名患者接受brentuximab，并且另一名患者接受苯达莫司汀和派姆单抗。所有4名治疗的患者均按照方案用环磷酰胺进行淋巴清除治疗。CART19细胞/kg/剂量的中位数为1.5x 106(范围：7.3x 105至1.52x 106)。每位患者在2周的时间内接受6次分开剂量或输注RNA CART19细胞。使用qRT-PCR。在80％的输注后在给药后立即在外周血样品中瞬时检测到RNA CART19(图14)。不存在研究相关的死亡或3-4级非血液学毒性。最常见的1-2级毒性包括在3名患者中观察到短暂性头痛并且在2名患者中观察到失眠。不存在细胞因子释放综合征的证据。输注后1个月时的总响应率(ORR)为50％：观察到一个完全响应(CR)和一个部分响应(PR)。另外一名患者具有稳定疾病(SD)。CR患者在3个月时进展，并且将PR患者从该研究取出以进行其他疗法。具有SD的患者在3个月时进展。目前，两名患者对于PD-1抑制剂处于CR状态。一名患者对于来那度胺处于PR状态，并且一名患者死于进行性疾病。不存在任何明显的长期毒性。
结论
这些数据表明使用非病毒、RNA重定向的CART19细胞的细胞疗法对于患有复发/难治性HL的患者是可行的和安全的。
等效形式
本文所引用的每个专利、专利申请、和出版物的披露内容特此通过引用以其全文并入本文。虽然已经参照具体方面披露了本发明，但是本领域其他技术人员可以在不偏离本发明的真实精神以及范围的情况下设想本发明的其他方面以及变化。所附权利要求旨在理解为包括所有这类方面以及等效变化。

Claims (108)

1.一种CAR疗法，该CAR疗法包含表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群，该CAR疗法用于与PD-1抑制剂组合使用，其中该CAR包含抗原(例如CD19)结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，并且其中该PD-1抑制剂，例如抗PD-1抗体分子的剂量是例如每2周、3周、4周、或5周给予约200mg至约450mg，例如约300mg至约400mg。
2.一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予：
(i)CAR疗法，其包括表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群，其中该CAR包含抗原(例如CD19)结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域；和
(ii)PD-1抑制剂，
其中该PD-1抑制剂，例如抗PD-1抗体分子的剂量是例如每2周、3周、4周、或5周给予约200mg至约450mg，例如约300mg至约400mg。
3.一种CAR疗法，该CAR疗法包含表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群，该CAR疗法用于与PD-1抑制剂组合使用，其中该CAR包含抗原(例如CD19)结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，并且其中该PD-1抑制剂的给予在给予该CAR疗法后20天或更短开始。
4.一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予：
(i)CAR疗法，其包括表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群，其中该CAR包含抗原(例如CD19)结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域；和
(ii)PD-1抑制剂，
其中在给予该CAR疗法后20天或更短开始给予该PD-1抑制剂。
5.如权利要求3或4所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在给予该CAR疗法后16天或更短、15天或更短、14天或更短、13天或更短、12天或更短、11天或更短、10天或更短、9天或更短、8天或更短、7天或更短、6天或更短、5天或更短、4天或更短、3天或更短、2天或更短开始给予该PD-1抑制剂。
6.一种CAR疗法，该CAR疗法包含表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群，该CAR疗法用于与PD-1抑制剂组合使用，其中该CAR包含抗原(例如CD19)结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，并且其中该PD-1抑制剂的给予在该受试者具有或被鉴定为具有以下中的一种或多种后开始：
(a)对该CAR疗法的部分或无可检测的响应，
(b)该CAR疗法后复发的癌症，
(c)该CAR疗法难治性癌症；
(d)该CAR疗法后癌症的进行性形式；或
(e)该CAR疗法后(例如少于3个月)B细胞恢复。
7.一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予：
(i)CAR疗法，其包括表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群，其中该CAR包含抗原(例如CD19)结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域；和
(ii)PD-1抑制剂，
其中在该受试者具有或被鉴定为具有以下中的一种或多种后开始给予该PD-1抑制剂：
(a)对该CAR疗法的部分或无可检测的响应，
(b)该CAR疗法后复发的癌症，
(c)该CAR疗法难治性癌症；或
(d)该CAR疗法后癌症的进行性形式，或
(e)该CAR疗法后(例如少于3个月)B细胞恢复。
8.一种CAR疗法，该CAR疗法包含表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群，该CAR疗法用于与PD-1抑制剂组合使用，其中该CAR包含抗原(例如CD19)结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，并且其中该PD-1抑制剂的给予在给予该CAR疗法后开始，并且该受试者不具有或未被鉴定为具有以下中的一种或多种：
(a)对该CAR疗法的部分或无可检测的响应，
(b)该CAR疗法后复发的癌症，
(c)该CAR疗法难治性癌症，
(d)癌症的进行性形式，或
(e)该CAR疗法后(例如少于3个月)B细胞恢复。
9.一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予：
(i)CAR疗法，其包括表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群，其中该CAR包含抗原(例如CD19)结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域；和
(ii)PD-1抑制剂，
其中在给予该CAR疗法后开始给予该PD-1抑制剂，并且该受试者不具有或未被鉴定为具有以下中的一种或多种：
(a)对该CAR疗法的部分或无可检测的响应，
(b)该CAR疗法后复发的癌症，
(c)该CAR疗法难治性癌症，
(d)癌症的进行性形式，或
(e)该CAR疗法后(例如少于3个月)B细胞恢复。
10.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，该方法进一步包括给予该PD-1抑制剂的一个或多个，例如1、2、3、4、或5或更多个后续剂量。
11.如权利要求10所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中给予该PD-1抑制剂的多达6个剂量。
12.如权利要求1-11中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该方法进一步包括评估该受试者中CRS的存在或不存在。
13.如权利要求1-12中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在该CAR疗法后该受试者不具有或未被鉴定为患有CRS，例如严重CRS(例如CRS3级或4级)。
14.如权利要求12-13中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂的给予在该CAR疗法后，该受试者被鉴定为不患有CRS，例如严重CRS(例如3级或4级CRS)后开始。
15.如权利要求12-14中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂的给予在CRS治疗后，例如在CRS消退后、在CAR疗法后开始。
16.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中给予该CAR疗法和该PD-1抑制剂持续一个治疗间隔，并且其中该治疗间隔包含该PD-1抑制剂的单剂量和该表达CAR的细胞的单剂量。
17.如权利要求16所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该治疗间隔在给予该CAR疗法的剂量后开始，并且在给予该PD-1抑制剂的剂量后完成。
18.如权利要求16或17所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该治疗间隔进一步包括给予该PD-1抑制剂的一个或多个，例如1、2、3、4、或5个或更多个后续剂量。
19.如权利要求18所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在该治疗间隔期间给予该PD-1抑制剂的多达6个剂量。
20.如权利要求1-2或6-19中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在给予PD-1抑制剂的剂量之前至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11,天、至少12、至少13、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、或至少20天给予该CAR疗法的剂量。
21.如权利要求20所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在给予该PD-1抑制剂的剂量之前25-40天(例如约25-30、30-35、或35-40天，例如约35天)给予该CAR疗法的剂量。
22.如权利要求1-2或12-15中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中给予该CAR疗法和该PD-1抑制剂持续一个治疗间隔，其中该治疗间隔包含该PD-1抑制剂的第一和第二剂量以及该CAR疗法的剂量，并且其中在给予该PD-1抑制剂的第一剂量之后但在给予该PD-1抑制剂的第二剂量之前给予该CAR疗法的剂量。
23.如权利要求22所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该治疗间隔在给予该PD-1抑制剂的第一剂量后开始，并且在给予该PD-1抑制剂的第二剂量后完成。
24.如权利要求22或23所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在给予该PD-1抑制剂的第一剂量后至少5天、7天、1周、2周、或3周给予该PD-1抑制剂的第二剂量。
25.如权利要求22-24中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在给予该PD-1抑制剂的第一剂量后至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、或2周给予该CAR疗法的剂量。
26.如权利要求22-25中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在给予该CAR疗法的剂量后至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、或2周给予该PD-1抑制剂的第二剂量。
27.如权利要求16-26中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中将该治疗间隔重复，例如一次或多次，例如1、2、3、4、5更多次。
28.如权利要求16-27中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该治疗间隔随后是一个或多个，例如1、2、3、4、或5个后续治疗间隔。
29.如权利要求28所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该一个或多个后续治疗间隔不同于第一或前一次治疗间隔。
30.如权利要求28或29所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在完成该第一或前一次治疗间隔后至少1天，例如至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少2周、至少1个月、至少3个月、至少6个月、或至少1年给予该一个或多个后续治疗间隔。
31.如权利要求16-30中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在完成一个或多个治疗间隔后，给予该PD-1抑制剂的一个或多个后续剂量，例如1、2、3、4、或5或更多个剂量。
32.如权利要求16-31中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在完成一个或多个治疗间隔后每5天、6天、7天、10天、2周、3周、或4周给予该PD-1抑制剂的剂量。
33.如权利要求16-32中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该治疗间隔包含在给予该PD-1抑制剂的剂量之前2-20天、5-17天、7-16天、8-16天、10-15天、14-21天或2-3周给予的CAR疗法的剂量，并且其中将该治疗间隔重复0-52次，并且其中这些治疗间隔在完成前一次治疗间隔后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少2周、至少1个月、至少3个月、至少6个月、或至少1年开始。
34.如权利要求33所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在第二治疗间隔后每5天、7天、2周、3周、或4周给予该PD-1抑制剂的一个或多个后续剂量。
35.如权利要求1-15中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中给予该受试者表达CAR的细胞的单剂量和PD-1抑制剂的单剂量。
36.如权利要求35所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在给予该PD-1抑制剂的单剂量前，给予该表达CAR的细胞的单剂量至少2天，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。
37.如权利要求35或36所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR疗法包含RNA CAR分子，例如体外转录(IVT)RNA，并且其中在CAR疗法的初始剂量后向该受试者给予该CAR疗法的一个或多个，例如1、2、3、4、或5个后续剂量。
38.如权利要求37所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在该表达CAR的细胞的前一次剂量后至少2天，例如2、3、4、5、6、7天、2周、或3周给予该表达CAR的细胞的一个或多个后续剂量。
39.如权利要求27-38中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在给予该PD-1抑制剂的单剂量后给予PD-1抑制剂的一个或多个，例如1、2、3、4、或5个、或更多个后续剂量。
40.如权利要求39所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在PD-1抑制剂的前一次剂量后至少5天、7天、2周、3周或4周给予该PD-1抑制剂的一个或多个后续剂量。
41.如权利要求39或40所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中在该CAR疗法的剂量，例如该CAR疗法的初始剂量后至少1、2、3、4、5、6、或7天、或2周或3周给予该PD-1抑制剂的一个或多个后续剂量。
42.如权利要求27-41中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中重复给予该表达CAR的细胞的一个或多个剂量和PD-1抑制剂的一个或多个剂量。
43.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR疗法包含表达CAR的细胞的剂量，该剂量包含约104至约109个细胞/kg，例如约104至约105个细胞/kg、约105至约106个细胞/kg、约106至约107个细胞/kg、约107至约108个细胞/kg、约108至约109个细胞/kg、或约1-5x107个细胞/kg至约1-5x108个细胞/kg。
44.如权利要求43所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中表达CAR的细胞的剂量是约1-5x107个细胞/kg。
45.如权利要求43所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中表达CAR的细胞的剂量是约1-5x108个细胞/kg。
46.如权利要求3-45中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂的剂量在1与30mg/kg之间，例如约1至25mg/kg、约2至20mg/kg、约2至5mg/kg、或约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、或约5mg/kg。
47.如权利要求46所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂的剂量是例如每2周、3周、4周、或5周给予约1至20mg/kg或约2-5mg/kg。
48.如权利要求1-45中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂，例如抗PD-1抗体分子的剂量是例如每2周、3周、4周、或5周给予约200mg至约450mg，例如约200mg至约400mg。
49.如权利要求1-48中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂的剂量是例如通过静脉内输注例如每3周给予约200mg或约300mg。
50.如权利要求1-48中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂的剂量是例如通过静脉内输注例如每4周给予约400mg。
51.如权利要求1-48中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂是PD-1抗体分子，并且每2周、3周、或4周以约300mg的剂量给予，并且该CAR疗法以1-5x108个细胞的剂量给予。
52.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂包括抗体分子、小分子、多肽，例如融合蛋白、或抑制性核酸，例如siRNA或shRNA。
53.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂的特征在于以下中的一个或多个：
a.抑制或减少PD-1表达，例如PD-1的转录或翻译；
b.抑制或降低PD-1活性，例如抑制或降低PD-1与其同源配体，例如PD-L1或PD-L2的结合；或
c.结合PD-1或其一个或多个配体，例如PD-L1或PD-L2。
54.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂是抗体分子。
55.如前一项权利要求所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂选自下组，该组由以下组成：纳武单抗、派姆单抗、PDR001、匹地利珠单抗、AMP514、AMP-224、以及任何表6中提供的抗PD-1抗体分子。
56.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂包含抗PD-1抗体分子，该抗PD-1抗体分子包含
a.表6中列出的任何PD-1抗体分子氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)、和重链互补决定区3(HC CDR3)；和
b.表6中列出的任何PD-1抗体分子氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)、和轻链互补决定区3(LC CDR3)。
57.如权利要求56所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该其抗PD-1抗体分子包含
a)选自SEQ ID NO:137或140的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:138或141的HC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:139的HC CDR3氨基酸序列；和
b)SEQ ID NO:146或149的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147或150的LC CDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:148、151、166、或167的LC CDR3氨基酸序列(例如SEQ ID NO:166或167的LC CDR3氨基酸序列)。
58.如权利要求56或57所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该抗PD-1抗体分子包含重链可变区，该重链可变区包含：
i)表6中列出的任何重链可变区，例如SEQ ID NO:142、144、154、158、172、184、216、或220的氨基酸序列；
ii)对表6中提供的任何重链可变区，例如SEQ ID NO:142、144、154、158、172、184、216、或220的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
iii)与表6中提供的任何重链可变区，例如SEQ ID NO:142、144、154、158、172、184、216、或220的氨基酸序列具有95％-99％同一性的氨基酸序列。
59.如权利要求56-58中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该抗PD-1抗体分子包含重链，该重链包含：
i)表6中列出的任何重链，例如SEQ ID NO:156、160、174、186、218、222、225、或236的氨基酸序列；
ii)对表6中列出的任何重链，例如SEQ ID NO:156、160、174、186、218、222、225、或236具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
iii)与表6中列出的任何重链，例如SEQ ID NO:156、160、174、186、218、222、225、或236的氨基酸序列具有95％-99％同一性的氨基酸序列。
60.如权利要求56-59中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该抗PD-1抗体分子包含轻链可变区，该轻链可变区包含：
i)表6中列出的任何轻链可变区，例如SEQ ID NO:152、162、168、176、180、188、192、196、200、204、208、或212的氨基酸序列；
ii)对表6中提供的任何轻链可变区，例如SEQ ID NO:152、162、168、176、180、188、192、196、200、204、208、或212的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
iii)与表6中提供的任何轻链可变区，例如SEQ ID NO:152、162、168、176、180、188、192、196、200、204、208、或212的氨基酸序列具有95％-99％同一性的氨基酸序列。
61.如权利要求56-60中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该抗PD-1抗体分子包含轻链，该轻链包含：
i)表6中列出的任何轻链，例如SEQ ID NO:164、170、178、182、190、194、198、202、206、210、或214的氨基酸序列；
ii)对表6中列出的任何轻链，例如SEQ ID NO:164、170、178、182、190、194、198、202、206、210、或214具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
iii)与表6中列出的任何轻链，例如SEQ ID NO:164、170、178、182、190、194、198、202、206、210、或214的氨基酸序列具有95％-99％同一性的氨基酸序列。
62.如权利要求56-61中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该抗PD-1抗体分子包含：
i)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域
ii)包含SEQ ID NO:142或144的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的轻链可变结构域；
iii)包含SEQ ID NO:154或158的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的轻链可变结构域；
iv)包含SEQ ID NO:154或158的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的轻链可变结构域；
v)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的轻链可变结构域；
vi)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的轻链可变结构域；
vii)包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的轻链可变结构域；
viii)包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的轻链可变结构域；
ix)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的轻链可变结构域；
x)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xi)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xii)包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xiii)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xiv)包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xv)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xvi)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xvii)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:212的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xviii)包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xix)包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xx)包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xxi)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xxii)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的轻链可变结构域；
xxiii)包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
xxiv)包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的重链可变结构域和包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域。
63.如权利要求56-62中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该抗PD-1抗体分子包含：
i)包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链；
ii)包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的轻链；
iii)包含SEQ ID NO:156或160的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的轻链；
iv)包含SEQ ID NO:156或160的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的轻链；
v)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的轻链；
vi)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的轻链；
vii)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的轻链；
viii)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的轻链；
ix)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的轻链；
x)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的轻链；
xi)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的轻链；
xii)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链；
xiii)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链；
xiv)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链；
xv)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链；
xvi)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的轻链；
xvii)包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的轻链；
xviii)包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链；
xix)包含SEQ ID NO:218的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链；
xx)包含SEQ ID NO:222的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链；
xxi)包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的轻链；
xxii)包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的轻链；
xxiii)包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链；或
xxiv)包含SEQ ID NO:236的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链。
64.如权利要求56-63中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该PD-1抑制剂包括抗PD-1抗体分子，该抗PD-1抗体分子包含含有SEQ ID NO:172的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:204的氨基酸序列的轻链可变结构域。
65.如权利要求64所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该抗PD1抗体分子包含：
(i)重链可变(VH)区，该重链可变(VH)区包含SEQ ID NO:503的VHCDR1氨基酸序列；SEQID NO:504的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:505的VHCDR3氨基酸序列；以及
(ii)轻链可变(VL)区，该轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO:500的VLCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:501的VLCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:502的rge VLCDR3氨基酸序列，
或至少85％、90％、95％相同或更高的氨基酸序列。
66.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CD19结合结构域包含表2或表3中列出的任何CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)、和重链互补决定区3(HC CDR3)；以及表2或表3中列出的任何CD19轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)、和轻链互补决定区3(LC CDR3)。
67.如权利要求66所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CD19结合结构域包含根据表4中的HC CDR氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2、和HC CDR3，以及根据表5中的LC CDR氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2、和LC CDR3。
68.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CD19结合结构域包含：
a.表2或表3中列出的CD19结合结构域的任何重链可变区的氨基酸序列；
b.对表2或表3中提供的CD19结合结构域的任何重链可变区的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
c.与表2或表3中提供的CD19结合结构域的任何重链可变区的氨基酸序列至少95％相同，例如具有95％-99％同一性的氨基酸序列。
69.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CD19结合结构域包含：
a.表2或表3中提供的CD19结合结构域的任何重链的氨基酸序列；
b.对表2或表3中提供的CD19结合结构域的任何重链具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
c.与表2或表3中提供的CD19结合结构域的任何重链的氨基酸序列至少95％相同，例如具有95％-99％同一性的氨基酸序列。
70.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CD19结合结构域包含：
a.表2或表3中提供的CD19结合结构域的任何轻链可变区的氨基酸序列；
b.对表2或表3中提供的CD19结合结构域的任何轻链可变区的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
c.与表2或表3中提供的CD19结合结构域的任何轻链可变区的氨基酸序列至少95％相同，例如具有95％-99％同一性的氨基酸序列。
71.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CD19结合结构域包含：
a.表2或表3中提供的CD19结合结构域的任何轻链的氨基酸序列；
b.对表2或表3中提供的CD19结合结构域的任何轻链具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
c.与表2或表3中提供的CD19结合结构域的任何轻链的氨基酸序列至少95％相同，例如具有95％-99％同一性的氨基酸序列。
72.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CD19结合结构域包含表2或表3中列出的任何重链可变区的氨基酸序列，和表2或表3中列出的任何轻链可变区的氨基酸序列。
73.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CD19结合结构域包含：
a.选自下组的氨基酸序列，该组由以下组成：SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:110、SEQID NO:112、或SEQ ID NO:115；
b.对以下中的任一个具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列：SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、或SEQ ID NO:115；或
c.与以下中的任一个的氨基酸序列至少95％相同，例如具有95％-99％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、或SEQ ID NO:115。
74.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该跨膜结构域包含来自选自下组的蛋白质的跨膜结构域，该组由以下组成：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
75.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该跨膜结构域包含
(i)SEQ ID NO:6的氨基酸序列，
(ii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列，或
(iii)与SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少95％相同，例如具有95％-99％同一性的序列。
76.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CD19结合结构域通过铰链区连接至该跨膜结构域。
77.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该铰链区包含SEQ ID NO:2、或其至少95％相同，例如具有95％-99％同一性的序列。
78.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域，该共刺激信号传导结构域包含从选自下组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域，该组由以下组成：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、以及与CD83特异性结合的配体。
79.如权利要求59所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该共刺激结构域包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
80.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该细胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。
81.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；或具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
82.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列和SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列，其中包含该细胞内信号传导结构域的氨基酸序列在同一框架中表达并且表达为单一多肽链。
83.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR进一步包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的前导序列。
84.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该CAR包含：
(i)以下中的任一个的氨基酸序列：SEQ ID NO:108；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:94、SEQID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:114、或SEQ ID NO:116；
(ii)对以下中的任一个具有至少一个、两个或三个修饰但不多于30、20或10个修饰的氨基酸序列：SEQ ID NO:108；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116；或
(iii)与以下中的任一个至少95相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:108；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQID NO:111、SEQ ID NO:114、或SEQ ID NO:116。
85.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中包含CAR的细胞包含编码该CAR的核酸。
86.如权利要求85所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中编码该CAR的该核酸是慢病毒载体。
87.如权利要求85或86所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中通过慢病毒转导将编码该CAR的核酸引入细胞中。
88.如权利要求85-87中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中编码该CAR的该核酸是RNA，例如体外转录RNA。
89.如权利要求88所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中编码该CAR的该核酸通过电穿孔引入细胞中。
90.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该细胞是T细胞或NK细胞。
91.如权利要求90所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该T细胞是自体或同种异体T细胞。
92.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，该方法进一步包括给予另外的抗癌剂。
93.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该癌症是血液癌症。
94.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该癌症是淋巴瘤或白血病。
95.如权利要求93所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该癌症选自以下中的一种或多种：B细胞急性淋巴细胞性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞性白血病(TALL)、小淋巴细胞白血病(SLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病、MALT淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤、或瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
96.如权利要求93所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该癌症是急性淋巴细胞白血病(ALL)，例如儿科B-ALL、或B细胞淋巴瘤，例如儿科B细胞淋巴瘤。
97.如权利要求93所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，例如复发或难治性DLBCL。
98.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该受试者是哺乳动物，例如人。
99.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该受试者表达PD-1、PD-L1和/或PD-L2。
100.如权利要求99所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该受试者中的癌细胞或癌细胞附近的细胞表达PD-1、PD-L1、和/或PD-L2。
101.如权利要求99或100所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该癌细胞来自DLBCL样品，例如来自复发或难治性DLBCL样品。
102.如前述权利要求中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中表达CAR的细胞表达PD-1、PD-L1、和/或PD-L2。
103.如权利要求1-102中任一项所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中与参考值，例如对CAR疗法的完全响应者相比，该受试者具有或被鉴定为具有更高数量或百分比的表达PD-1、LAG-3或TIM-3中的一种、两种、三种、或全部的免疫效应细胞，例如CD4+和/或CD8+T细胞。
104.如103所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中该受试者具有或被鉴定为具有更高数量的：PD-1表达免疫效应细胞，例如CD4+和/或CD8+T细胞；表达PD-1和LAG-3的免疫效应细胞，例如CD4+和/或CD8+T细胞；PD-1和TIM-3表达免疫效应细胞，例如CD4+和/或CD8+T细胞；或PD-1、TIM-3和LAG-3表达免疫效应细胞，例如CD4+和/或CD8+T细胞。
105.如权利要求103或104所述使用的CAR疗法或所述的方法，其中这些免疫效应细胞，例如CD4+和/或CD8+T细胞共表达CAR，例如CD19 CAR。
106.一种组合，该组合包含：
包含CAR的细胞，例如免疫效应细胞群，其中该CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域；和
例如包含SEQ ID NO:204和SEQ ID NO:172的可变轻链和可变重链氨基酸序列的PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂选自派姆单抗、纳武单抗、或任何来自表6的抗体分子，
用于治疗受试者的癌症。
107.一种组合物(例如一种或多种组合物或剂型)，该组合物包含：
包含CAR的细胞，例如免疫效应细胞群，其中该CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域，和
例如包含SEQ ID NO:204和SEQ ID NO:172的可变轻链和可变重链氨基酸序列的选自表6的PD-1抑制剂。
108.如前述权利要求中任一项所述的方法、组合、或组合物，其中该CD19结合结构域是SEQ ID NO:109的氨基酸序列；或其中该CAR包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列。
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