CN110592140A - Pd-1基因缺陷型pd-1-cart细胞制剂的制法 - Google Patents

Pd-1基因缺陷型pd-1-cart细胞制剂的制法 Download PDF

Info

Publication number
CN110592140A
CN110592140A CN201910938616.6A CN201910938616A CN110592140A CN 110592140 A CN110592140 A CN 110592140A CN 201910938616 A CN201910938616 A CN 201910938616A CN 110592140 A CN110592140 A CN 110592140A
Authority
CN
China
Prior art keywords
car
gene
psin
pur
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910938616.6A
Other languages
English (en)
Inventor
王清路
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201910938616.6A priority Critical patent/CN110592140A/zh
Publication of CN110592140A publication Critical patent/CN110592140A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PD‑1基因缺陷型PD‑1‑CART细胞制剂的制法。PD‑1‑CAR嵌合序列构建，PD‑1‑CAR慢病毒构建，PD‑1基因缺陷型PD‑1‑CART细胞的构建。本发明首先通过突变PD‑1蛋白的ITSM基序而后获得具有PD‑L1靶向识别功能的T细胞胞外蛋白部分及跨膜信号引导区，而后通过构建慢病毒质粒获得带有新型CAR结构的慢病毒，转染PD‑1基因缺陷型的T淋巴细胞，即得。本发明提升了T淋巴细胞靶向杀灭肿瘤细胞的能力且降低了副作用，并能增强长期肿瘤免疫，并为类似新型CAR基因结构的开发提供了参考。

Description

PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法。
背景技术
PD-1(Programmed Death 1，程序性死亡受体-1)是一种重要的免疫抑制分子。由PD-1及其配体PD-L1、PD-L2组成的通路，在维持外周免疫耐受中起着至关重要的作用。肿瘤和引起慢性感染的病原体能利用该途径从T细胞介导的肿瘤特异性和病原体特异性免疫中逃逸，主要是通过它的表面产生PD-L1，当PD-L1联接到一类免疫细胞T细胞的PD-1蛋白上即引起T细胞失活，T细胞就不能发现肿瘤向免疫系统发出攻击肿瘤的信号。
PD-1由单个N-末端免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域、将IgV结构域与质膜分开并包含大约20个氨基酸的茎区、跨膜区和包含基于酪氨酸信号基序的胞质尾区构成。当免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)酪氨酸改变为苯丙氨酸(Y223F)时，PD-1抑制作用得以保留；但当免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)改变时(Y248F)，这些抑制作用则会丧失。
目前，治疗肿瘤细胞的制剂靶向性不强、副反应大。
发明内容
本发明的目的是提供一种PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，制得的细胞制剂增强了对肿瘤细胞的靶向性，解除了免疫抑制，降低了相对于传统CART细胞来说的副反应。
本发明所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，包括以下步骤：
(1)PD-1-CAR嵌合序列构建
人工合成PD-1-CAR嵌合序列，并在全序列5’端ATG前添加EcoRI位点，3’端TGA终止密码子后添加Spel位点，然后克隆进pMD18-T载体，得到pMD18-T-CAR载体；
PD-1-CAR嵌合序列为SEQ ID NO.1；
(2)PD-1-CAR慢病毒构建
基于pMD18-T-CAR载体构建pSin-EF2-Pur-CAR载体，然后将pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G质粒混匀后转染293T细胞，制备PD-1-CAR慢病毒；
(3)PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞的构建
将PD-1-CAR慢病毒转染PD-1基因缺陷型T淋巴细胞，转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行测序分析、鉴定，继续扩大培养，即得PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂。
步骤(2)中所述的pSin-EF2-Pur-CAR载体的制备方法是采用EcoRI和Spel双酶切pMD18-T-CAR和pSin-EF2-Sox2-Pur两个质粒，回收PD-1-CAR序列和线性化的pSin-EF2-Sox2-Pur，连接构建pSin-EF2-Pur-CAR载体。
步骤(2)中所述的pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G的质量比为15-25：12-18：5-8。
步骤(2)中所述的pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G的质量比优选为20：15：6。
步骤(2)中所述的转染时间为45-50h。
步骤(2)中所述的转染时间优选为48h。
本发明所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，具体包括以下步骤：
(1)PD-1基因缺陷型T淋巴细胞的获得
按照专利ZL201710649967.6制备。
(2)ITSM基序突变的PD-1+4-1BB+CD3ζ序列(CAR序列)合成
将设计好的序列送上海生工生物工程公司合成，并在全序列5’端ATG前添加EcoRI位点，3’端TGA终止密码子后添加Spel位点，然后克隆进pMD18-T载体，命名为pMD18-T-CAR。
(3)pSin-EF2-Pur-CAR载体构建
采用EcoRI和Spel双酶切pMD18-T-CAR和pSin-EF2-Sox2-Pur两个质粒，回收CAR序列部分和线性化的pSin-EF2-Sox2-Pur，链接构建pSin-EF2-Pur-CAR载体。
(4)慢病毒的包装
将pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G质粒共转染293T细胞，然后回收带有ITSM基序突变PD-1的CAR基因的慢病毒。
(5)转染T细胞
将步骤(1)中的T细胞接种到6孔板中，然后将沉淀收集的慢病毒加入6孔板的PD-1基因缺陷型T细胞中；转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行PCR(引物：F 5’-GATGGTTCTTAGACTCCCCAGAC-3’；R5’-GTCTCTTGTCCAAAACATCGTACTC-3’)然后测序分析、鉴定，符合需求的细胞继续扩大培养，即得PD-1基因缺陷型的PD-1-CART淋巴细胞制剂。
本发明构建特异的、高效的PD-1免疫检查缺陷且具有靶向PD-L1蛋白的PD-1-CART淋巴细胞可用于肿瘤治疗与预防的免疫细胞制剂生产。
携带PD-1+4-1BB+CD3ζ结构CAR基因的慢病毒转染PD-1基因缺陷型T淋巴细胞后，利用流式细胞仪筛选GFP或PD-1阳性细胞的T淋巴细胞可用于人体回输预防或治疗肿瘤。
本发明利用生物信息学技术分析PD-1蛋白的结构与特点，从而设计出PD-1-CAR的慢病毒构建载体，获得的慢病毒可用于T细胞、造血干细胞生产具有PD-L1靶向的细胞。
本发明使T细胞具有更强攻击、杀灭肿瘤细胞的能力。
本发明的T细胞实现了免疫检查点的抑制，同时利用天然的PD-1和PD-L1相互识别结合机制从而实现该类T细胞对肿瘤细胞的靶向性，此天然识别机制其结合力度最佳，不过强也不太弱，从而可以有效降低传统CART细胞带来的副作用，PD-1引导结合信号跨膜后，会激活4-1BB与CD3ζ元件，实现激活T细胞。
本发明根据人PD-1的ITSM基序基因序列密码子特点，将原酪氨酸密码子TAT用密码子TTT代替，设计ITSM基序中酪氨酸突变为苯丙氨酸的PD-1编码序列；细胞的靶向识别及信号传导由ITSM基序突变的PD-1蛋白完成。
本发明采用ITSM基序(Y248F)突变的PD-1作为CAR的胞外部分和膜内传导区，该设计保留了PD-1对PD-L1或PD-L2的识别作用，而又使其PD-1/PD-L1/2等的信号通路的免疫检查点抑制缺失。
本发明的新型T细胞采用PD-1基因敲除解除了T细胞对肿瘤细胞的免疫检查点抑制，采用ITSM中酪氨酸突变的PD-1实现了对表达PD-L1或PD-L2肿瘤细胞的靶向攻击，PD-1与PD-L1/2的结合力在机体内适度，可以有效降低传统CART治疗中产生的副反应(细胞因子风暴)，保留全部PD-1序列(仅突变ITSM基序)也就保留了PD-1蛋白在T细胞内的大部分功能。PD-1肽段后嵌合的4-1BB(214-255aa)和CD3ζ(52-163aa)肽段在T细胞起到正性调节。
本发明的有益效果如下：
本发明首先通过突变PD-1蛋白的ITSM基序而后获得具有PD-L1靶向识别功能的T细胞胞外蛋白部分及跨膜信号引导区，确定了新型CAR结构(图1)，而后通过构建慢病毒质粒获得带有新型CAR结构的慢病毒，转染PD-1基因缺陷型的T淋巴细胞，利用流式细胞仪筛选GFP/PD-1阳性细胞群，获得本发明的T淋巴细胞制剂。本发明的T淋巴细胞制剂的生产，提升了T淋巴细胞靶向杀灭肿瘤细胞的能力且降低了副作用，并能增强长期肿瘤免疫，并为类似新型CAR基因结构的开发提供了参考。
附图说明
图1是新型CAR结构示意图。
图2是PD-1基因缺陷型的PD-1-CART细胞攻击肺癌A549细胞图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。
实施例1
(1)PD-1基因缺陷型T淋巴细胞
根据专利ZL201710649967.6描述的方法制备PD-1基因缺陷型T淋巴细胞。
(2)ITSM基序酪氨酸突变的设计
将ITSM基序中原酪氨酸密码子TAT用密码子TTT代替，使酪氨酸突变成苯丙氨酸。
(3)PD-1+4-1BB+CD3ζ嵌合CAR设计
PD-1肽段后嵌合的4-1BB(214-255aa)和CD3ζ(52-163aa)肽段，将设计好的序列送上海生工生物工程公司合成，并在全序列5’端ATG前添加EcoRI位点，3’端TGA终止密码子后添加Spel位点，然后克隆进pMD18-T载体，命名为pMD18-T-CAR。
(4)pSin-EF2-Pur-CAR载体构建
a、用EcoR I和Spe l双酶切pMD18-T-CAR及pSin-EF2-Sox2-Pur两个质粒，酶切反应体系为：
37℃反应半小时，而后进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。
b、CAR与表达载体pSin-EF2-Sox2-Pur片段的获得
A)1.0％琼脂糖凝胶分离双酶切产物；
B)将割下的胶块放入1.5ml EP管中；按1：3的比例加入Extraction Buffer；
C)置50℃水浴10min，使琼脂糖完全熔化，每2min颠倒混匀一次；
将熔化的琼脂糖液移入Spin column，于6000g离心1min，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管；
D)在Spin column中加入500μl Extraction Buffer，于12000g离心30-60sec，倒掉收集管中的液体，将Spin column放入同一个收集管；
E)在Spin column中加入750μl Wash Buffer，于12000g离心30-60sec，倒掉收集管中的液体，将Spin column放入同一个收集管；
F)再次于12000g离心1min，然后将Spin column放入一个1.5mL离心管中；
G)在Spin column中央加入50μl Elution Buffer、水或TE溶液，于室温静置1min后，12000g离心1min，将得到的DNA储存备用。
c、回收CAR片段和pSin-EF2-Sox2-Pur载体片段，将二者用DNA T4连接酶连接，产物命名为pSin-EF2-Pur-CAR，连接反应体系：
连接反应条件为16℃过夜连接。而后转化大肠杆菌DH5α。
d、从转化质粒pSin-EF2-Pur-CAR的大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中提取质粒，将重组表达质粒pSin-EF2-Pur-CAR用Spe l和EcoR I双酶切鉴定，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
酶切反应体系为：
从而筛选到连接正确的重组表达载体pSin-EF2-Pur-CAR。
(5)慢病毒包装
用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以2.5×106密度重新接种于10cm培养皿，于37℃、5％CO2培养箱培养至细胞汇合度达60％～70％时开始转染。制备慢病毒包装系统中3种质粒DNA溶液(pSin-EF2-Pur-CAR 20μg、psPAX2 15μg、pMD2.G 6μg)，另用1.5mlOpti-MEM稀释68μl Lipofectamine 2000脂质体，轻柔混匀，室温孵育20min，以形成转染复合物；然后将上述复合物加到细胞培养皿中，轻轻混匀，培养6～7h后更换完全培养基，转染48h后于倒置荧光显微镜下可见GFP表达；收集病毒上清液，并于4℃、3000r/min离心5min，去除细胞沉淀和碎片；再以直径为0.45μm滤器过滤后，将过滤后上清于4℃、25000r/min离心2h，以500μl PBS重悬病毒沉淀并于4℃溶解过夜。命名为PD-1-CAR慢病毒。
取对数期293T细胞100μl，按1×103/μl接种于96孔板，培育24h后加入100μl不同浓度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10)的慢病毒。孵育24h后，每孔加100μl高糖DMEM培养基继续培养。4d后观察细胞生长状况，并收取细胞进行流式细胞仪检测。根据流式细胞仪检测结果计算滴度，公式如下：Titer(293T-transducing units/ml)＝100000(target cells)×(％of GFP-positivecells/100)/volume of supernatant(in ml)。
(6)PD-1-CART细胞的制备
PD-1基因缺陷型T淋巴细胞以2.0×105cells/孔的密度接种24孔板，12h后开始实验。加入300μl PD-1-CAR慢病毒进行感染，同时加入工作液浓度为5μg/ml的聚凝胺以增加感染效率。次日去除含病毒的培养基，更换为无血清完全培养基，感染后72h利用流式细胞仪分选PD-1(+)细胞为目的细胞。
(7)PD-1-CART细胞与A549细胞共培养实验
接种A549细胞于6孔板中，过夜培养至60％融合度，然后加入105个PD-1-CART细胞，置于37℃二氧化碳培养箱继续培养1h，然后镜下观察PD-1-CART细胞在A549细胞周围的聚集情况，结果发现(图2)约80％以上的细胞聚集在A549细胞周围，说明本发明的细胞对表达PD-L1的肿瘤细胞具有靶向性。
综上所述，本发明所构建的PD-1基因缺陷型的PD-1-CART细胞，不仅解除了免疫抑制且实现了对肿瘤细胞靶向，天然PD-1与PD-L1/2蛋白的结合机制极大的降低副反应，因此本细胞为一新型免疫细胞制剂，可用于肿瘤患者的防治。
序列表
<110> 王清路，许晓松
<120> PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1329
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg gttggtgtcg tgggcggcct gctgggcagc 540
ctggtgctgc tagtctgggt cctggccgtc atctgctccc gggccgcacg agggacaata 600
ggagccaggc gcaccggcca gcccctgaag gaggacccct cagccgtgcc tgtgttctct 660
gtggactatg gggagctgga tttccagtgg cgagagaaga ccccggagcc ccccgtgccc 720
tgtgtccctg agcagacgga gtttgccacc attgtctttc ctagcggaat gggcacctca 780
tcccccgccc gcaggggctc agctgacggc cctcggagtg cccagccact gaggcctgag 840
gatggacact gctcttggcc cctcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 900
caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 960
ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1020
cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1080
gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 1140
aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1200
tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1260
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1320
cctcgctga 1329
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
gatggttctt agactcccca gac 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
gtctcttgtc caaaacatcg tactc 25

Claims (6)

1.一种PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于包括以下步骤：
(1)PD-1-CAR嵌合序列构建
人工合成PD-1-CAR嵌合序列，并在全序列5’端ATG前添加EcoRI位点，3’端TGA终止密码子后添加Spel位点，然后克隆进pMD18-T载体，得到pMD18-T-CAR载体；
PD-1-CAR嵌合序列为SEQ ID NO.1；
(2)PD-1-CAR慢病毒构建
基于pMD18-T-CAR载体构建pSin-EF2-Pur-CAR载体，然后将pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G质粒混匀后转染293T细胞，制备PD-1-CAR慢病毒；
(3)PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞的构建
将PD-1-CAR慢病毒转染PD-1基因缺陷型T淋巴细胞，转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得单克隆细胞扩大培养，提取基因组进行测序分析、鉴定，继续扩大培养，即得PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于步骤(2)中所述的pSin-EF2-Pur-CAR载体的制备方法是采用EcoRI和Spel双酶切pMD18-T-CAR和pSin-EF2-Sox2-Pur两个质粒，回收PD-1-CAR序列和线性化的pSin-EF2-Sox2-Pur，连接构建pSin-EF2-Pur-CAR载体。
3.根据权利要求1所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于步骤(2)中所述的pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G的质量比为15-25：12-18：5-8。
4.根据权利要求3所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于步骤(2)中所述的pSin-EF2-Pur-CAR、psPAX2和pMD2.G的质量比为20：15：6。
5.根据权利要求1所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于步骤(2)中所述的转染时间为45-50h。
6.根据权利要求5所述的PD-1基因缺陷型PD-1-CART细胞制剂的制法，其特征在于步骤(2)中所述的转染时间为48h。
CN201910938616.6A 2019-09-30 2019-09-30 Pd-1基因缺陷型pd-1-cart细胞制剂的制法 Pending CN110592140A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910938616.6A CN110592140A (zh) 2019-09-30 2019-09-30 Pd-1基因缺陷型pd-1-cart细胞制剂的制法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910938616.6A CN110592140A (zh) 2019-09-30 2019-09-30 Pd-1基因缺陷型pd-1-cart细胞制剂的制法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110592140A true CN110592140A (zh) 2019-12-20

Family

ID=68864998

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910938616.6A Pending CN110592140A (zh) 2019-09-30 2019-09-30 Pd-1基因缺陷型pd-1-cart细胞制剂的制法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110592140A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018023025A1 (en) * 2016-07-28 2018-02-01 Novartis Ag Combination therapies of chimeric antigen receptors adn pd-1 inhibitors
CN107868791A (zh) * 2016-09-26 2018-04-03 李华顺 一种加强型Slit2 CAR‑T和CAR‑NK细胞制备方法和应用
CN108410892A (zh) * 2015-03-02 2018-08-17 上海斯丹赛生物技术有限公司 降低由pd-l1诱导的免疫耐受性
CN109563146A (zh) * 2016-05-13 2019-04-02 豪夫迈·罗氏有限公司 包含tnf家族配体三聚体和pd1结合模块的抗原结合分子
CN110029091A (zh) * 2019-04-28 2019-07-19 王清路 Pd-1免疫检查点解除抑制的t淋巴细胞制剂的制法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108410892A (zh) * 2015-03-02 2018-08-17 上海斯丹赛生物技术有限公司 降低由pd-l1诱导的免疫耐受性
CN109563146A (zh) * 2016-05-13 2019-04-02 豪夫迈·罗氏有限公司 包含tnf家族配体三聚体和pd1结合模块的抗原结合分子
WO2018023025A1 (en) * 2016-07-28 2018-02-01 Novartis Ag Combination therapies of chimeric antigen receptors adn pd-1 inhibitors
CN107868791A (zh) * 2016-09-26 2018-04-03 李华顺 一种加强型Slit2 CAR‑T和CAR‑NK细胞制备方法和应用
CN110029091A (zh) * 2019-04-28 2019-07-19 王清路 Pd-1免疫检查点解除抑制的t淋巴细胞制剂的制法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIANGTAO REN等: "Multiplex genome editing to generate universal CART cells resistant to PD1 inhibition.", 《CLIN CANCER RES》 *
NAGASE T等: "Synthetic construct DNA,clone:pFN21AE1780,Homo sapiens PDCD1 gene for programmed cell death 1,without stop codon,in Flexi system", 《GENBANK DATABASE》 *
刘君等: "PD-1/PD-L1信号通路在多系统疾病中的研究进展 ", 《西部医学》 *
张慧展: "《基因工程 第4版》", 31 January 2017, 华东理工大学出版社 *
支黎明等: "嵌合抗原受体T细胞功能设计与运用的研究进展", 《东南国防医药》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106279434B (zh) 工程化cd20靶向性的nkt细胞及其制备方法和应用
CN109678965B (zh) 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、cd22-cd19双靶向性的t细胞及其应用
KR20170023181A (ko) Cld18a2를 표적으로 하는 면역 효과 세포 및 그 제조방법과 용도
CN108350462B (zh) 嵌合抗原受体及其用途
CN109608549B (zh) 基于人源间皮素抗体的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用
CN111925451B (zh) 一种靶向bcma的嵌合抗原受体(car)及其应用
CN111423517B (zh) 一种肿瘤细胞干性限制型car及其应用
CN112062864A (zh) 靶向bcma肿瘤抗原受体修饰t细胞的制备方法和应用
CN111454372A (zh) 分泌超级il15的nkg2d-ace2 car-nk细胞的构建及其应用
CN110734498A (zh) 一种用于解除免疫抑制的融合蛋白及其应用
CN111217903B (zh) 一种重组人纤连蛋白ⅲ1-c及其制备方法和应用
CN111848819A (zh) 一种靶向msln的嵌合抗原受体及其应用
CN103131676A (zh) 表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基因的家蚕重组杆状病毒及其制备方法和应用
CN111704674B (zh) 一种靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv的嵌合抗原受体及其应用
US8609373B2 (en) Fusion protein mixture for inducing human pluripotent stem cell and preparation method there of
CN110592140A (zh) Pd-1基因缺陷型pd-1-cart细胞制剂的制法
CN109705225B (zh) 一种抗人caix抗原的嵌合抗原受体及其应用
CN109608547B (zh) 表达Her2的嵌合抗原受体、慢病毒表达载体及其应用
CN114249834B (zh) 能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体、其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN110129370B (zh) 一种car-t毒性指示细胞的快速构建方法
CN110615842B (zh) 一种包含共刺激受体的嵌合抗原受体及应用
CN111197060A (zh) 靶向治疗血液病恶性肿瘤的研究方法
CN110669144A (zh) 一种靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其应用
US20240058445A1 (en) Inducible chimeric antigen receptor and application thereof
CN108586586B (zh) 与庚型肝炎病毒e2蛋白相互作用的hiv p10蛋白

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191220

RJ01 Rejection of invention patent application after publication