KR20170023181A

KR20170023181A - Cld18a2를 표적으로 하는 면역 효과 세포 및 그 제조방법과 용도

Info

Publication number: KR20170023181A
Application number: KR1020177003178A
Authority: KR
Inventors: 후아마오 왕; 보 송; 시우메이 카이
Original assignee: 카르스젠 테라퓨틱스 리미티드
Priority date: 2014-07-17
Filing date: 2015-07-15
Publication date: 2017-03-02
Also published as: PL3170842T3; EP3170842A4; US20220363751A1; EP3170842A1; ES2746555T3; CN105315375A; KR101950747B1; US10377822B2; US20170204177A1; DK3170842T3; CN105315375B; WO2016008405A1; EP3170842B1; JP6664528B2; PT3170842T; JP2019122380A; US11198729B2; CN112979828A; US20200172613A1; JP2017522024A

Abstract

본 발명은 CLD18A2를 표적으로 하는 면역 효과 세포 및 그 제조방법과 용도에 관한 것이다. 본 발명자는 최초로 수많은 종양 관련 유전자에서 CAR 조작된 면역 효과 세포를 연구하는데 적절한 표적 유전자 CLD18A2를 성공적으로 찾아냈고 CLD18A2를 표적으로 하는 CAR 조작된 면역 효과 세포를 성공적으로 제조하여 췌장암, 위암 등 종양에 대해 새로운 치료 수단을 제공한다.

Description

CLD18A2를 표적으로 하는 면역 효과 세포 및 그 제조방법과 용도{IMMUNOLOGIC EFFECTOR CELL OF TARGETED CLD18A2, AND PREPARATION METHOD AND USE THEREOF}

본 발명은 종양 세포 치료 영역에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 본 발명은 CLD18A2를 표적으로 하는 면역 효과 세포 및 그 제조방법과 용도에 관한 것이다.

종양 면역 반응에서 T 림프 세포의 역할이 날로 중시받고 있다. T 림프 세포를 기반으로 하는 입양 면역 치료는 일부 종양에서 일정한 효과를 거두었고, 이러한 면역 치료방법은 항체 치료의 상술한 결함을 극복할 수 있으나 대부분 종양에 대한 치료 효과는 여전히 이상적이지 못한다[Grupp SA, et al. Adoptive cellular therapy. Curr Top Microbiol Immunol., 2011; 344:149-72.]. 최근, 표적 세포에 대한 CTL의 인식 특이성이 T 림프 세포 수용체(T Cell Receptor, TCR)에 의존하는 것이 발견됨에 따라 종양 세포 관련 항원에 대한 항체의 scFv와 T 림프 세포 수용체의 CD3ζ 또는 FcεRIγ 등의 세포내 신호 활성화 모티프를 키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)로 융합하고, 이를 렌티 바이러스(慢病毒) 감염 등과 같은 방식으로 T 림프 세포 표면에 유전자 조작한다. 이러한 CAR T 림프 세포는 주조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex, MHC)에 의해 비제한적 방식으로 T 림프 세포를 종양 세포에 선택적으로 지향하고 종양을 특이적으로 살상할 수 있다. CAR T 림프 세포는 종양 면역 치료 분야에서의 하나의 새로운 면역 치료 수단이다[Schmitz M, et al. Chimeric antigen receptor-engineered T cells for immunotherapy of Cancer. J Biomed Biotechnol, 2010, doi:10.1155/2010/956304.].

키메릭 항원 수용체는 세포외 결합영역, 막관통영역과 세포내 신호영역을 포함한다. 일반적으로 세포외 영역은 종양 관련 항원을 인식할 수 있는 scFv를 포함하고, 막관통영역은 CD8, CD28 등 분자의 막관통영역을 채용하며, 세포내 신호영역은 타이로신 기반 면역 수용체 활성화 모티프(ITAM) CD3ζ 또는 FcεRIγ 및 보조 자극 신호분자 CD28, CD27, CD137, CD134 등의 세포내 신호영역을 채용한다.

세포내 신호영역이 ITAM만을 포함하는 것은 1세대 CAR T 림프 세포이고, 그 중 키메릭 항원 수용체의 각 부분은 scFv-TM-ITAM 형식으로 연결된다. 이러한 CAR T는 종양을 억제하는 세포 독성 효과를 촉발할 수 있으나 사이토카인의 분비가 적고, 체내에서 지속적인 항종양 효과를 촉발하지 못한다[Zhang T. et al. Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways, Can Res 2007, 67(22):11029-11036.].

그 후 발전한 2세대 CAR T 림프 세포는 CD28 또는 CD137(4-1BB라고도 함)의 세포내 신호영역을 추가하였고, 그 중 키메릭 항원 수용체의 각 부분은 scFv-TM-CD28-ITAM 또는 scFv-TM-/CD137-ITAM 형식으로 연결된다. 세포내 신호영역에서 발생한 B7/CD28 또는 4-1BBL/CD137의 보조자극 작용에 의해 T 림프 세포가 지속적으로 증식되고, T 림프 세포가 IL-2와 IFN-γ 등의 사이토카인을 분비하는 수준을 향상시키는 동시에 CAR T의 체내에서의 생존 주기와 항종양 효과를 향상시킬 수 있다[Dotti G. et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients. J Clin Invest, 2011, 121(5): 1822-1826.].

최근에 발전한 3세대 CAR T 림프 세포는 키메릭 항원 수용체의 각 부분이 scFv-TM-CD28-CD137-ITAM 또는 scFv-TM-CD28-CD134-ITAM 형식으로 연결되어 CAR T의 체내에서의 생존 주기와 항종양 효과를 더욱 향상시켰다[Carpenito C., et al. Control of large established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains. PNAS, 2009, 106(9): 3360-3365.].

CAR T 림프 세포는 종양 면역 치료에서 아주 좋은 전망을 가지고 있으나, 그의 높은 리스크도 함께 고려하여야 한다. 예를 들어, 어떤 정상적인 조직은 CAR이 인식할 수 있는 특이성 항원을 저발현하므로 CAR T 림프 세포가 해당 항원을 발현하는 정상적인 조직을 손상시킬 수 있다. 예를 들어, 신세포암 환자의 종양 세포에 발현되는 항원인 탄산탈수효소 IX(CAIX)는 처음으로 임상에 사용한 CAR T 림프 세포 입양 치료의 사례로서, 처음으로 CAR 세포를 포함하는 표적 이탈 효과를 보도한 사례이기도 한다. CAR T 림프 세포를 수회 주입한 후, 환자는 2-4급 간독성을 나타냈다. 분석에 따르면, 간관 상피 세포가 CAIX를 저발현하기 때문이었고, 원 임상시험이 부득이로 중단되었으며 동시에 환자 치료효과에 대한 모든 평가를 배제하였다[Stoter G. et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX: first clinical experience. J clin oncol, 2006, 24(13): e20-e22.; Ngo MC., et al. Ex vivo gene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer. Human Molecular Genetics, 2011, R1-R7]. 그리고, CAR 중의 지나친 보조 자극신호는 효과 세포를 활성화하는데 필요한 역치를 낮출 수 있어 유전자 조작된 T 림프 세포가 저수준 항원 또는 항원 촉발이 없는 조건에서도 활성화될 수 있고, 이로 인해 대량의 사이토카인이 방사하게 되어 ‘사이토카인 폭풍’을 일으킬 수 있다. 이러한 신호 누설(singnal leakage)은 표적이 세포 독성으로부터 이탈되도록 할 수 있어 비특이적인 조직 손상이 발생하게 된다. 예를 들어, Her2에 대한 3세대 CAR을 채용하여 간장과 폐 전이가 발생한 말기 결장암 환자를 임상 치료하는 과정에서, 정상적인 폐조직에서 Her2를 저발현하기 때문에 “사이토카인 폭풍”이 일어나 환자가 급사하게 된다[Morgan RA., et al. Report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing Erbb2. Molecular Therapy, 2010, 18 (4): 843-851.].

CAR T를 설계할 때, 타깃으로 하는 항원 유전자를 선택하는 것이 아주 중요하고, 체내에서의 유전자 발현의 복잡성 및 각종 통제 불가능한 요인으로 인해 CAR T를 위한 적절한 하나의 유전자를 선택하는 것은 매우 어렵다. 또한, 많은 종양 특이 항원은 그에 적합하고 CAR 조작된 면역 효과 세포를 구축하는데 적절한 특이성 분자를 찾아내기가 어렵고, CAR T를 수립한 후 활성이 있는 세포외 결합영역을 획득할 수 없는 것이 보편적이며 이 또한 CAR T 기술 발전의 난관이다.

본 발명은 CLD18A2를 표적으로 하는 면역 효과 세포 및 그 제조방법과 용도를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 제1 측면에서는 면역 효과 세포의 표면에 발현되는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 제공하는데, 상기 키메릭 항원 수용체는 차례로 연결되는 세포외 결합영역, 막관통영역과 세포내 신호영역을 포함하고, 그 중 상기 세포외 결합영역은 CLD18A2(claudin 18.2)를 특이적으로 인식하는 단백질을 포함한다.

하나의 바람직한 예에서, 상기 CLD18A2를 특이적으로 인식하는 단백질은 항체 또는 리간드이고, 상기 항체는 외가닥 항체 또는 도메인 항체인 것이 바람직하다.

다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 막관통영역은 CD8 또는 CD28의 막관통영역과 경첩 영역의 서열을 포함한다.

다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 세포내 신호영역은 CD3ζ, FcεRIγ, CD27, CD28, CD137, CD134의 세포내 신호영역 서열 또는 그 조합으로부터 선택된다.

다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메릭 항원 수용체는,

CLD18A2를 특이적으로 인식하는 외가닥 항체, CD8 및 CD3ζ;

CLD18A2를 특이적으로 인식하는 외가닥 항체, CD8, CD137 및 CD3ζ;

CLD18A2를 특이적으로 인식하는 외가닥 항체, CD28 분자의 막관통영역(CD28a), CD28 분자의 세포내 신호영역(CD28b) 및 CD3ζ; 또는

CLD18A2를 특이적으로 인식하는 외가닥 항체, CD28분자의 막관통영역, CD28 분자의 세포내 신호영역, CD137 및 CD3ζ;의 순서로 연결되는 세포외 결합영역, 막관통영역과 세포내 신호영역을 포함한다.

다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 키메릭 항원 수용체는 SEQ ID NO: 19~22 중의 임의의 아미노산 서열을 가지고 있다.

다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 면역 효과 세포는 T 림프 세포, NK세포 또는 NKT세포를 포함한다.

본 발명의 다른 하나의 측면에서는 상기 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 제공한다.

하나의 바람직한 예에서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 15~18 중의 임의의 뉴클레오티드 서열을 가지고 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면에서는 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

하나의 바람직한 예에서, 상기 발현 벡터는 렌티 바이러스 플라스미드 pWPT(또는 pWPT-eGFP)에서 유래된다.

본 발명의 다른 하나의 측면에서는 상기 벡터를 포함하는 바이러스(예를 들어, 렌티 바이러스)를 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 측면에서는 CLD18A2를 표적으로 하는 유전자 조작된 면역 효과 세포를 제조하는 상기 키메릭 항원 수용체, 상기 핵산, 상기 발현 벡터 또는 상기 바이러스의 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 측면에서는 상기 핵산, 상기 발현 벡터 또는 상기 바이러스가 도입된 유전자 조작된 면역 효과 세포를 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 측면에서는 표면이 SEQ ID NO: 19~22 중의 임의의 아미노산 서열을 구비하는 상기 키메릭 항원 수용체를 발현하는 유전자 조작된 면역 효과 세포를 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 측면에서는 CLD18A2가 양성(陽性)(고발현)인 종양을 억제하는 약물을 제조하는 유전자 조작된 면역 효과 세포의 용도를 제공한다.

다른 하나의 바람직한 예에서, 상기 CLD18A2가 양성인 종양은 췌장암, 위암을 포함한다.

본 발명의 다른 측면에 대해서는 본 기술분야의 당업자라면 본 명세서에서 공개한 내용에 의해 자명할 것이다.

도 1은 본 발명의 CAR 서열을 코딩하는 렌티 바이러스 벡터 pWPT-eGFP-F2A-CAR의 예시적인 구조 모식도이다.
도 2는 키메릭 항원 수용체의 각 부분의 연결 순서 모식도이다.
도 3은 실시예 1에 따른 CLD18A2를 억제하는 외가닥 항체의 정제 전기영동도이다.
도 4는 CLD18A1, CLD18A2를 안정 발현하는 세포계의 Western Blot 검출 결과이다.
도 5는 유세포 분석기에 의해 CLD18A2 외가닥 항체와 CLD18A1, CLD18A2의 결합 특이성을 검출한 결과이다.
도 6은 조립된 키메릭 항원 수용체의 전기 영동에 의한 동정이다.

본 발명자는 예의 연구를 거듭한 결과, 최초로 CLD18A2 유전자를 기반으로 하는 CAR 조작된 면역 효과 세포 및 그 제조방법을 개시하였다.

CLD18A2 유전자

본 발명자는 초반에 수많은 종양 특이성 유전자를 조사하였고, 그 결과 이러한 유전자의 대부분은 일부 조직의 정상적인 세포에도 발현되어 키메릭 항원 수용체 T세포 기술에 적용할 수 없으며, 어떤 종양 특이성 유전자는 양호한 종양 특이성 발현 특성을 가지고 있으나 이를 기반으로 설계한 CAR 조작된 면역 효과 세포는 종양 세포 살상 활성이 없거나 살상 활성이 매우 낮은데, 이것은 해당 유전자가 발현하는 단백질의 항원성이 낮거나 발현 위치가 불합리적이거나 또는 발현량이 충분하지 않는 등 원인에 의해 발생될 수 있고, 재조합한 후 획득한 T 림프 세포가 영향을 받아 종양 살상능력이 떨어지거나 상실되는 원인에 의해 발생될 수도 있다는 것을 발견하였다.

거듭된 조사와 선별을 거쳐, 본 발명자는 CLD18A2 유전자를 발견하여 CAR 조작된 면역 효과 세포(예, T 림프 세포)를 설계하기 위한 표적 유전자로 하였다.

Claudin 18(CLD18) 분자(Genbank accession number: splice variant 1 (CLD18A1): NP.sub.-057453, NM.sub.-016369, and splice variant 2 (CLD18A2): NM.sub.-001002026, NP.sub.-001002026)는 분자량이 대략 27.9/27.72인 막관통 단백질이다. Claudins는 상피와 내피에 위치하는 밀착 연접된 막단백질이다.

연구에 따르면, CLD18A1은 정상적인 폐와 위의 상피에 선택적으로 발현되며, CLD18A2의 발현은 위의 상피에서 분화된 단명 세포에만 제한되고 위의 줄기세포에 발현되지 않으며, 또한 연구에 따르면, CLD18A2는 많은 종양 세포에서 발현된다. CLD18A2의 상술한 특성에 따라 본 발명자는 CLD18A2는 이러한 종양들의 중요한 치료 타깃으로 추정하였고 후속의 대량 작업을 거쳐 이 추정을 획인하였다.

키메릭 항원 수용체 및 그 코딩 핵산

본 발명은 T 림프 세포 표면에 발현되는 키메릭 항원 수용체를 제공하는데, 상기 키메릭 항원 수용체는 차례로 연결되는 세포외 결합영역, 막관통영역과 세포내 신호영역을 포함하고, 그 중 상기 세포외 결합영역은 CLD18A2(claudin 18.2)를 특이적으로 인식하는 단백질을 포함한다. 상기 키메릭 항원 수용체를 T 림프 세포 표면에 발현함으로써 T 림프 세포가 CLD18A2를 고발현하는 종양 세포에 대해 높은 특이성을 보이는 세포 독성작용을 가지도록 한다.

본 발명의 바람직한 실시형태로서, 상기 세포외 결합영역은 CLD18A2를 특이적으로 인식하는 외가닥 항체 scFv를 포함한다(CLD18A2). 상기 키메릭 항원 수용체 단백질의 세포외 결합영역은 CD8의 경첩 영역을 통해 CD8 또는 CD28의 막관통영역과 상호 연결되고, 막관통영역 뒤에는 세포내 신호영역이 붙는다.

본 발명은 또한 상기 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 핵산을 포함한다. 본 발명의 핵산 서열은 DNA 형식 또는 RNA 형식일 수 있다. DNA 형식은 cDNA, 게놈 DNA 또는 인공 합성된 DNA를 포함한다. DNA는 외가닥 또는 2중 가닥일 수 있다. DNA는 암호가닥 또는 비암호가닥일 수 있다. 본 발명의 키메릭 항원 수용체 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 코돈은 퇴화된 것일 수 있는데, 즉 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 퇴화 핵산 서열은 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 해당 아미노산을 코딩하는 퇴화 핵산 코돈은 본 기술분야에서 공지된 것이다. 본 발명은 또한 본 발명과 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 단편, 유사체와 유도체를 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 천연적인 대립 변이체 또는 비천연적인 변이체일 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 변이체들은 치환 변이체, 결손 변이체와 삽입 변이체를 포함한다. 본 기술분야에서 알려져 있는 바와 같이, 대립 변이체는 폴리뉴클레오티드의 한 대체 형식으로서, 하나 또는 복수의 뉴클레오티드가 치환, 결손, 또는 삽입될 수 있으나 그에 의해 코딩된 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변화시키지 않는다.

사람 CLD18A2를 특이적으로 인식하는 단일 클론 항체는 종래 기술에서 공개된 항체를 선택할 수 있다. CLD18A2를 인식하는 C 말단 항원 결정기의 다양한 단일 클론 항체는 재조합을 거친 후 최종 살상 활성을 가진 CAR 조작된 면역 효과 세포를 획득할 수 있다면 적절한 방식으로 본 발명에 적용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 방식은 외가닥 항체를 적용하는 것인데, 상기 외가닥 항체는 CLD18A2를 특이적으로 인식할 수 있으나 CLD18A1을 인식하지 않는 163과 175 항체인 것이 바람직하다. 이들은 Fc와 연결하는 것이 더욱 바람직하다(ScFv-163과 scFv-175).

본 발명에서 사용하는 용어 ‘외가닥 항체(scFv) 단편’은 연결자(linker)에 의해 연결된 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)의 재조합 단백질을 포함하는 항체 단편을 의미하는데, 연결자는 최종 항원 결합 부위가 형성되도록 상기 2개의 도메인을 상호 관련시킨다. scFv의 크기는 일반적으로 하나의 완전 항체의 1/6이다. 외가닥 항체는 하나의 뉴클레오티드쇄로 코딩된 하나의 아미노산쇄 서열인 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 외가닥 항체는 아미노산 결손, 삽입, 치환, 부가 및/또는 재조합 및/또는 기타 조작방법과 같은 본 기술분야의 통상의 기술을 단독 또는 결합하여 더욱 조작될 수 있다. 하나의 항체의 아미노산 서열에 따라 그 DNA 서열에 이러한 조작 방법을 도입하는 것은 본 기술분야의 당업자로서 자명한 것이고, 예를 들어 Sambrook, 분자 클론: 시험 설명서, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.를 참조한다. 상기 조작은 핵산 수준에서 진행하는 것이 바람직하다. 상기 외가닥 항체는 그 유도체를 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 ‘항체의 유도체’는 예를 들어 파지전시법을 통해 상기 항체의 유도체를 획득할 경우, BIAcore 시스템에서 사용되는 표면 플라즈몬 공명기술을 이용하여 CLD18A2 항원 결정기와 결합하는 파지 항체의 효율을 증가시킬 수 있다(Schier, 사람 항체 혼성세포 7(1996), 97-105;Malmborg, 면역학 방법 저널 183(1995), 7-13). 예를 들어 WO 89/09622에서 기술한 키메릭 항체의 생성 방법, EP-A10239400과 WO90/07861에서 기술한 인간화 항체의 생성 방법, WO91/10741, WO94/02602와 WO96/33735에서 기술한 마우스의 사람 항체와 같은 이종 항체의 생성 방법을 통해 생성한 항체의 유도체를 더 포함한다.

본 발명의 용어 ‘특이적 인식’은 본 발명의 2중 특이성 항체가 목표 항원을 제외한 임의의 폴리펩티드와 교차 반응하지 않거나 또는 기본적으로 교차 반응하지 않는 것을 의미한다. 그의 특이성 정도는 면역학 기술로 판단할 수 있고, 웨스턴 블로팅, 친화성 크로마토그래피, 유세포 분석 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 특이적 인식은 유세포 기술을 통해 결정하는 것이 바람직하고, 구체적인 경우에 따라 특이적 인식의 표준은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 기술분야의 상식을 통해 판단될 수 있다.

키메릭 항원 수용체의 막관통영역은 CD8 또는 CD28 등의 단백질의 막관통영역으로부터 선택될 수 있다. CD8 또는 CD28는 T 림프 세포 표면의 천연 마커이다. 사람 CD8 단백질은 헤테로다이머로서, αβ 또는 γδ 등 2개의 사슬로 구성된다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 막관통영역은 CD8α 또는 CD28의 막관통영역으로부터 선택된다. 그리고, CD8α 경첩 영역(hinge)은 연성 영역이기 때문에 CD8 또는 CD28과 막관통영역은 경첩 영역과 함께 키메릭 항원 수용체 CAR의 타깃 인식 도메인 scFv와 세포내 신호영역을 연결하는데 사용된다.

세포내 신호영역은 CD3ζ, FcεRIγ, CD28, CD137, CD134 단백질의 세포내 신호영역 및 그 조합으로부터 선택될 수 있다. CD3 분자는 5개의 서브 유닛으로 구성되는데, 그 중 CD3ζ 서브 유닛(CD3 zeta라고도 하고 Z로 약칭)은 3개의 ITAM 모티브를 가지고 있고, 상기 모티브는 TCR-CD3 복합체 중의 중요한 신호 전달 영역이다. CD3δZ는 ITAM 모티브가 없는 절단된 CD3ζ 서열이고, 본 발명의 실천에서 일반적으로 음성 대조로서 구축된다. FcεRIγ는 주로 비만 세포와 호염기성 세포 표면에 분포되고, 하나의 ITAM 모티브를 가지고 있으며, 구조, 분포 및 기능 상에서 CD3ζ와 유사한다. 그리고, 상술한 바와 같이 CD28, CD137, CD134는 보조 자극신호 분자이며, 각각의 리간드와 결합한 후 그 세포내 신호영역에 발생한 보조자극 작용에 의해 T 림프 세포가 지속적으로 증식되고, T 림프 세포가 IL-2와 IFN-γ 등의 사이토카인을 분비하는 수준을 향상시키는 동시에 CAR 조작된 면역 효과 세포의 체내에서의 생존 주기와 항종양 효과를 향상시킬 수 있다.

본 발명의 핵산이 코딩한 항CLD18A2 키메릭 항원 수용체 단백질은

scFv(CLD18A2)-CD8-CD3ζ,

scFv(CLD18A2)-CD8-CD137-CD3ζ,

scFv(CLD18A2)-CD28a-CD28b-CD3ζ,

scFv(CLD18A2)-CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ와 같은 연결 순서 및

그 조합으로부터 선택될 수 있는데, 그 중 관련 키메릭 항원 수용체 단백질에서 CD28a는 CD28 분자의 막관통영역을 나타내고, CD28b는 CD28 분자의 세포내 신호영역을 나타낸다. 상기 각종 항CLD18A2 키메릭 항원 수용체는 scFv(CLD18A2)-CAR로 총칭한다.

본 발명의 하나의 실시형태에서, 핵산은 SEQ ID NO: 15~18과 같은 서열을 가지고 있다. 본 발명의 다른 하나의 실시형태에서, 핵산은 SEQ ID NO: 19~22 중의 하나를 가진 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산이다.

발현 벡터 및 세포

본 발명은 또한 T 림프 세포 표면에 발현되는 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 하나의 구체적인 실시형태에서, 본 발명에 사용되는 벡터는 렌티 바이러스 플라스미드 벡터 pWPT-eGFP이다. 상기 플라스미드는 3세대 자기 불활성화 렌티 바이러스 벡터 시스템에 속하고, 상기 시스템은 단백질 Gag/Pol을 코딩하고 Rev 단백질을 코딩하는 패키징 플라스미드 psPAX2; VSV-G 단백질을 코딩하는 외피 플라스미드 PMD2.G 및 목표 핵산 서열을 재조합하고 도입, 즉 CAR의 핵산 서열을 코딩할 수 있는 빈 벡터 pWPT-eGFP 등 총 3개의 플라스미드를 포함한다. 빈 벡터 pWPT-eGFP(그 자체는 후속 시험의 mock임)에서 연장인자-1α(elongation factor-1α, EF-1α) 프로모터로 증강형 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, eGFP)의 발현을 제어한다. CAR의 목표 핵산 서열을 코딩하는 재조합 발현 벡터 pWPT-eGFP-F2A-CAR은 구제역 바이러스(food-and-mouth disease virus, FMDV)에서 유래한 리보솜 스키핑 서열(ribosomal skipping sequence 2A)(F2A로 약칭)을 통해 eGFP와 CAR의 공통 발현을 구현한다.

본 발명은 상기 벡터를 포함하는 바이러스를 더 포함한다. 본 발명의 바이러스는 패키징 후의 감염력이 있는 바이러스를 포함하고, 감염력이 있는 바이러스로 패키징하기 위한 필요성분을 포함하는 패키징 대기 바이러스도 포함한다. 본 기술분야에서 공지된 외래 유전자를 T 림프 세포에 도입할 수 있는 기타 바이러스 및 그에 대응하는 플라스미드 벡터도 본 발명에 적용될 수 있다.

본 발명의 하나의 실시형태에서, 상기 바이러스는 상기 pWPT-eGFP-F2A-CAR 재조합 벡터(즉, scFv(CLD18A2)-CAR을 포함)를 포함하는 렌티 바이러스이다.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산이 도입되어 있거나 본 발명의 상기 핵산을 포함하는 상기 재조합 플라스미드 또는 상기 플라스미드를 포함하는 바이러스가 도입되어 있는 유전자 조작된 T 림프 세포를 제공한다. 본 기술분야의 통상의 핵산 도입방법은 비바이러스와 바이러스 도입방법을 포함하는데 모두 본 발명에 적용될 수 있다. 비바이러스를 기반으로 하는 도입방법은 전기천공법과 전이인자법을 포함한다. 최근, Amaxa사에서 개발한 뉴클레오펙터(Nucleofector)는 외래 유전자를 직접 세포 핵에 도입함으로써 목표 유전자를 효율적으로 도입할 수 있다. 그리고, 슬리핑 뷰티 전이인자(Sleeping Beauty system) 또는 PiggyBac 전이인자 등의 전이인자 시스템을 기반으로 하는 도입효율은 일반적인 전기천공보다 대폭 향상되었고, 뉴클레오펙터와 슬리핑 뷰티 전이인자 시스템을 결합하여 적용하는 것에 대해 보고된 바 있는데[Davies JK., et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res, 2010, 70(10): OF1-10.], 이 방법은 높은 도입효율을 가지면서도 목표 유전자를 표적화 통합할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 키메릭 항원 수용체 유전자 조작된 T 림프 세포를 구현하는 도입방법은 역전사 바이러스 또는 렌티 바이러스와 같은 바이러스를 기반으로 하는 도입방법이다. 이 방법은 도입효율이 높고, 외래 유전자가 안정적으로 발현될 수 있으며 T 림프 세포를 체외 배양하여 임상 수준에 도달하게 하는 시간을 단축할 수 있는 등 장점이 있다. 도입된 핵산은 전사, 번역을 통해 상기 유전자 변형 T 림프 세포 표면에 발현된다. 배양된 각종 종양세포에 대한 체외 세포 독성 실험에 따르면, 본 발명의 항CLD18A2 키메릭 항원 수용체 유전자 조작된 T 림프 세포는 높은 특이성의 종양세포 살상효과가 있다(세포 독성이라고도 함). 따라서, 본 발명의 키메릭 항원 수용체 단백질을 코딩하는 핵산은 이 핵산의 플라스미드를 포함하고, 이 플라스미드를 포함하는 바이러스와 상기 핵산, 플라스미드 또는 바이러스가 도입된 유전자 변형 T 림프 세포는 종양 면역치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

하나의 실시형태에서, 본 발명의 유전자 조작된 T 림프 세포의 표면은 키메릭 항원 수용체를 발현하고, 상기 키메릭 항원 수용체는 SEQ ID NO: 15~18 중의 하나의 핵산으로 코딩되어 발현된다. 다른 하나의 실시형태에서, 본 발명의 유전자 변형 T 림프 세포 표면은 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 19~22으로부터 선택된 하나인 키메릭 항원 수용체를 발현한다.

현재 CLD18A2를 표적으로 하는 CAR T에 대한 보도가 없는 것을 고려하여 본 발명자는 최초로 수많은 종양 관련 유전자에서 CAR 조작된 면역 효과 세포(예를 들어 T 림프 세포)에 적용되는 표적 유전자 CLD18A2를 성공적으로 찾아냈고, CLD18A2를 표적으로 하는 CAR 조작된 면역 효과 세포를 성공적으로 제조하여 췌장암, 위암 등 종양에 대해 새로운 치료수단을 제공하였다.

이하, 구체적인 실시예를 결부하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이러한 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것에 불과하고 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해해서는 안된다. 하기 실시예에서, 구체적인 조건이 표시되지 않는 실험방법은 일반적으로 ‘J. Sambrook 등 편집, 분자 클론 실험안내, 제3판, 과학 출판사, 2002’에 기재된 조건과 같은 통상의 조건 또는 제조사측에서 제기한 조건을 따른다.

실시예 1. CLD18A2 를 억제하는 외가닥 항체의 발현

본 발명자는 예의 연구를 거급한 결과, CLD18A2를 인식하는 몇 개의 scfv 항체를 발견하였고, 125, 163과 175로 약칭한다.

중첩 연장 PCR을 기반으로 하는 유전자 합성기술을 통해 125(SEQ ID NO: 1(뉴클레오티드), 2(아미노산)), 163(SEQ ID NO: 3(뉴클레오티드), 4(아미노산)), 175(SEQ ID NO: 5(뉴클레오티드), 6(아미노산)) 외가닥 항체 서열를 합성하고, Nhe1/BamH1(NEB에서 구입) 2중 효소절단을 통해 T4 DNA 연결 효소(NEB에서 구입)로 마찬가지로 Nhe1/BamH1 2중 효소절단에 의한 벡터 플라스미드 pCMV-V5-Fc(이 벡터는 다클론 부위의 하류에서 사람 항체 Fc 단편을 융합 발현함, 이하 V5-Fc로 약칭, 상해 Rui Jin 생물에서 구입)와 연결하여 숙주균 TOP10에 전환하며, 클론을 추출하여 PCR을 통해 양성 클론을 동정하고 서열 분석으로 확인한 후 각각 V5-scFv-125-Fc, V5-scFv-163-Fc, V5-scFv-175-Fc 진핵 발현 플라스미드를 획득한다.

상기 발현 플라스미드를 각각 성장이 양호한 HEK-293F 세포에 전이하고, 37℃, 5% CO₂, 125 rpm에서 쉐이커로 7일 동안 연속 배양한 후 4000rpm으로 10min 동안 원심 처리하여 침전물을 제거하고 상층액을 수집하며, 0.45μm의 여과막으로 여과하고, 처리된 샘플을 protein A(GE에서 구입) 친화 컬럼으로 친화 정제하여 최종 정제된 외가닥 항체-Fc 융합 단백질 scFv-125-Fc(scFv-125로 약칭), scFv-163-Fc(scFv-163으로 약칭), scFv-175-Fc(scFv-175로 약칭)를 획득하는데, 동정 결과는 도 3과 같다.

실시예 2. CLD18A1 또는 CLD18A2 를 안정발현하는 세포계의 구축

1. CLD18A1과 CLD18A2의 발현 벡터의 구축 및 렌티 바이러스의 제조

중첩 연장 PCR을 기반으로 하는 유전자 합성기술을 통해 CLD18A1의 완전한 코딩 서열(GenBank: NM_016369)과 CLD18A1의 완전한 코딩 서열(GenBank: NM_001002026)을 전체적으로 합성하며, 코딩되는 c단에 Flag 태그(DYKDDDK)를 삽입하고, 유전자 단편을 합성하는 양단에 각각 MluI/SalI(NEB에서 구입) 효소절단 부위를 결합하며, MluI/SalI 2중 효소절단을 통해 T4 DNA로 마찬가지로 MluI/SalI 2중 효소절단된 벡터 플라스미드 pWPT(addgene사에서 구입)를 연결하여 숙주균 TOP10에 전환하고, 클론을 추출한 후 PCR 동정을 진행하고 서열 분석함으로써 정확한 렌티 바이러스 벡터 플라스미드 PWPT-CLD18A1, PWPT-CLD18A2를 획득한다. 상기 플라스미드를 패키징 보조 플라스미드 pGag-pol, pREV, pVsv-g(모두 addgene사에서 구입)와 각각 일정한 비율로 293T 세포에 동시 전이시키고, 각각 48h 및 72h 전이된 후 CLD18A1, CLD18A2 바이러스 액체를 수집하고 나누어 포장하여 -80℃에서 보존한다.

2. CLD18A1, CLD18A2의 외래 발현 안정계의 수립 및 Western blot 검출

상기 수집한 CLD18A1 또는 CLD18A2 바이러스 액체를 각각 6cm의 평판에 펼쳐 놓은 293T 세포에 첨가하고, 72h 후 세포를 수집하여 세포 용해 버퍼로 용해한다. 그리고, CLD18A2 바이러스 액체로 사람 위암 BGC-823(중국 과학원 상해 세포 은행에서 구입, TCHu 11)과 NCI-N87(ATCC에서 구입, CRL-5822) 세포계를 각각 감염시키고, 세포가 가득 찬 후 세포를 수집하여 세포 용해 버퍼로 용해한다. 용해하여 수집한 세포 단백질 40μg으로 SDS-PAGE 겔 전기영동을 수행한 후 겔을 웨스턴 블로팅하고, 마우스 항Flag 항체(Sigma Aldrich에서 구입)로 염색한다. PBS로 세척한 후 겨자무과산화효소 라벨링된 산양 항 마우스 항체(Santa Cluz에서 구입)와 인큐베이션한 다음 ECL 시약를 사용하여 현색하고 마지막으로 현상한다.

Western blot 결과에 따르면, CLD18A1 또는 CLD18A2가 전이된 293T 세포(즉, 293T-CLD18A1, 293T-CLD18A2) 및 CLD18A2가 전이된 BGC-823과 NCI-N87 세포(즉, BGC-823-CLD18A2, NCI-N87-CLD18A2)에서 분자량 크기가 약 28KD인 스트립이 검출될 수 있고, 전이하지 않은 빈 세포에서는 해당 스트립이 검출되지 않는데(도 4), 이것은 CLD18A1, CLD18A2를 외래 발현하는 세포계가 성공적으로 구축되었다는 것을 의미한다.

3. 각 세포계와 항CLD18A2 항체의 결합 상황을 유세포 분석하는 실험 절차

형광 표지 세포분류기(FACS)(BD사, FACSCalibur)를 통해 외가닥 항체 scFv-125, scFv-163 및 scFv-175 각각의 아래의 각 세포계와의 결합능력을 분석한다.

구체적인 방법은 다음과 같다.

1). 대수 생장기의 293T, 293T-CLD18A1, 293T-CLD18A2, BGC-823, BGC-823-CLD18A2, NCI-N87, NCI-N87-CLD18A2 종양세포를 6cm의 접시에 접종하는데, 세포 접종 밀도는 약 90%이고, 37℃의 인큐베이터에서 하룻밤 배양한다.

2). 10mM의 EDTA를 사용하여 세포를 소화하고, 200g×5min로 원심 처리하여 세포를 수집한다. 1×10⁶~1×10⁷/mL의 농도로 1% 송아지 혈청을 함유하는 인산염완충액(NBS PBS)에 재부유시키고, 100ul/관으로 유세포 전용관에 넣는다.

3). 200g×5min으로 원심 처리하고 상층액을 버린다.

4). 각각 측정 대기 항체 scFv-125, scFv-163과 scFv-175를 첨가하고, 동시에 항체 관계없이 음성 대조로 하는데, 항체 최종 농도는 20μg/ml이고, 각 관마다 100ul를 넣는다. 아이스 배쓰에 45분간 넣는다.

5). 각 관마다 2ml의 1% NBS PBS를 첨가하고, 200g×5min으로 총 2회의 원심 처리를 한다.

6). 상층액을 버리고 1:50로 희석한 FITC 형광 라벨링된 산양 항 인간 항체(상해 Kang Cheng 생물공정 주식회사)를 첨가하는데, 각 관마다 100ul를 넣는다. 아이스 배쓰에 45분간 넣는다.

7). 각 관마다 2ml의 1% NBS PBS를 첨가하고, 200g×5min으로 총 3회의 원심 처리를 한다.

8). 상층액을 버리고, 300ul의 1% NBS PBS에 재부유시켜 유세포 분석기를 통해 검출한다.

9). 유세포 분석기의 데이터 분석 소프트웨어 WinMDI 2.9를 이용하여 데이터를 분석한다.

유세포 분석 결과에 따르면, 외가닥 항체 scFv-125는 CLD18A1뿐만 아니라 CLD18A2가 안정 발현되는 293T 세포와도 결합할 수 있는데(도 5), 이것은 상기 외가닥 항체가 CLD18A2에 대한 결합 특이성이 낮다는 것을 의미한다. 다행히도, 외가닥 항체 ScFv-163과 scFv-175는 CLD8A2가 안정 발현되는 293T를 특이적으로 인식할 수 있고, CLD18A1을 안정 발현하는 293T 세포와 결합하지 않는데, 이것은 상기 2개의 외가닥 항체가 CLD18A2를 특이적으로 인식할 수 있다는 것을 의미한다. 그리고, 상기 2개의 외가닥 항체는 CLD18A2가 안정 전이된 BGC-823 또는 NCI-N87 세포계도 특이적으로 인식할 수 있으나, CLD18A2가 전이되지 않는 BGC-823 또는 NCI-N87 세포와 결합하지 않는다.

실시예 3. 본 발명의 핵산이 코딩한 키메릭 항원 수용체 단백질을 발현하는 렌티 바이러스 플라스미드의 구축 및 바이러스 패키징

표 1은 본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체의 각 부분의 연결 순서를 나타내고, 이 연결은 도 2를 참조할 수도 있다.

1. 핵산 단편의 증폭

(1) scFv ( CLD18A2 -163, CLD18A2 -175) 서열의 증폭

V5-scFv-163-Fc 플라스미드를 템플릿으로 하며, 채용한 프라이머 쌍은 전방향 프라이머(SEQ ID NO: 7)가 일부 2A의 서열을 포함하고 역방향 프라이머(SEQ ID NO: 8)는 일부 CD8 hinge 서열을 포함하며, PCR 증폭에 의해 scFv(CLD18A2-163)를 획득하고, 마찬가지로 V5-scFv-175-Fc 플라스미드를 템플릿으로 하며, 채용한 프라이머 쌍은 전방향 프라이머가 일부 2A의 서열을 포함하고, 역방향 프라이머(SEQ ID NO: 9)는 일부 CD8 hinge 서열(SEQ ID NO:10)를 포함하며, PCR 증폭에 의해 scFv(CLD18A2-175)를 획득한다.

(2) 키메릭 항원 수용체의 기타 부분의 핵산 서열

항CLD18A2 키메릭 항원 수용체 단백질의 scFv(CLD18A2-163, CLD18A2-175)를 제외한 나머지 부분의 핵산 서열은 각각 특허출원번호 201310164725.X에서 공개한 서열 SEQ ID NO: 18, 21을 템플릿으로 하고 PCR 방식으로 획득한다.

그 중, eGFP-F2A 서열은 특허출원번호 201310164725.X에서 기재한 SEQ ID NO: 18 플라스미드를 템플릿으로 하고, 프라이머 쌍(SEQ ID NO: 11, 12)으로 PCR 증폭하여 획득한다.

CD8-CD3ζ(Z)와 CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(28BBZ)를 획득할 경우, 각각 scFv(GPC3)-CD8-CD3ζ(특허출원 201310164725.X의 SEQ ID NO: 18)와 scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(특허출원 201310164725.X의 SEQ ID NO:21)를 템플릿으로 하며, 프라이머 쌍(SEQ ID NO: 13, 14)을 채용하고 PCR 증폭에 의해 각각 CD8-CD3ζ(Z)와 CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(28BBZ) 단편을 획득한다.

201310164725.X의 SEQ ID NO: 18은 본 발명의 SEQ ID NO: 23 서열과 대응한다.

201310164725.X의 SEQ ID NO: 21은 본 발명의 SEQ ID NO: 24 서열과 대응한다.

2. 핵산 단편의 조립

상술한 바와 같이 획득한 eGFP-F2A 핵산 단편을 각각 등몰의 scFv(CLD18A2-163) 또는 scFv(CLD18A2-175) 핵산 단편 및 등몰의 CD8-CD3ζ(Z) 또는 CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(BBZ) 핵산 단편과 도 2에 도시된 바와 같이 3개의 단편을 조립하고 PCR를 수행하는데, 조립조건은 초기 변성 94℃, 4min; 변성 94℃, 40s; 어닐링 60℃, 40s; 연장 68℃, 140s로 하여 5회 순환한 후 68℃에서 10min 동안 전연장하고, DNA 중합효소 및 전방향 프라이머(SEQ ID NO: 11)와 역방향 프라이머(SEQ ID NO:14)를 보충한 후 PCR 증폭을 30회 순환하는데, 증폭조건은 초기 변성 94℃, 4min; 변성 94℃, 40s; 어닐링 60℃, 40s; 연장 68℃, 140s로 하여 30회 순환한 다음 68℃에서 10min 동안 전연장한다. 증폭하여 획득한 단편은 각각 다음과 같다(표 2).

eGFP-scFv(CLD18A2)-163-Z(SEQ ID NO: 15, 19),

eGFP-scFv(CLD18A2)-163-BBZ(SEQ ID NO: 16, 20),

eGFP-scFv(CLD18A2)-175-Z(SEQ ID NO: 17, 21),

eGFP-scFv(CLD18A2)-175-BBZ(SEQ ID NO: 18, 22).

검정 결과는 도 6과 같다.

3. 렌티 바이러스 플라스미드 벡터의 구축

본 발명의 렌티 바이러스 플라스미드 벡터를 구축하는데 사용되는 예시적인 벡터 시스템은 3세대 자기 불활성화 렌티 바이러스 벡터 시스템에 속하고, 이 시스템은 단백질 Gag/Pol을 코딩하고 Rev 단백질을 코딩하는 패키징 플라스미드 psPAX2(addgene에서 구입), VSV-G 단백질을 코딩하는 외피 플라스미드 PMD2.G(addgene에서 구입) 및 빈 벡터 pWPT-eGFP(addgene에서 구입)를 기반으로 하는 목표 유전자 CAR을 코딩하는 재조합 발현 벡터 등 총 3개의 플라스미드를 가지고 있다.

빈 벡터 pWPT-eGFP에서, 연장인자-1α(elongation factor-1α, EF-1α)의 프로모터는 증강형 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, eGFP)의 발현을 제어하고, 목표 유전자 CAR을 코딩하는 재조합 발현 벡터에서는 구제역 바이러스에서 유래한 리보솜 스키핑 서열(food and mouth disease virus, FMDV, ribosomal skipping sequence, F2A)을 통해 eGFP와 목표 유전자 CAR의 공통 발현을 구현한다. F2A는 구제역 바이러스의 2A(또는 ‘자기 절단 폴리펩티드 2A’)에서 유래한 한 토막의 핵심 서열이고, 2A의 ‘자기 절단’ 기능을 구비하며, 상류와 하류 유전자의 공통 발현을 구현할 수 있다. 2A는 전단 효율이 높고, 상하류 유전자 발현의 평형성이 높으며 서열이 짧은 장점을 가지고 있어 유전자 치료 폴리시스트론 벡터를 구축하는데 효과적인 실행 가능 수단을 제공하였다. 특히, 키메릭 항원 수용체 유전자 조작된 T 림프 세포를 기반으로 하는 면역치료에서 상기 서열을 사용하여 목표 유전자와 GFP 또는 eGFP의 공통 발현을 구현하는 경우가 많고, GFP 또는 eGFP를 검출함으로써 CAR의 발현을 간접적으로 검출할 수 있다.

본 실시예에서는 F2A로 상호 연결된 eGFP와 특이성 CAR이 공통 발현하는 렌티 바이러스 발현 벡터를 구축하였는데 pWPT-eGFP-F2A-CAR로 총칭한다(도 1). 상기 절차 2에서 획득한 목표 유전자 eGFP-F2A-CAR(실시예 3의 1(2)를 참조, F2A 뒤의 소자를 CAR로 약칭)은 MluI와 SalI 제한 효소를 2중 효소절단함으로써 마찬가지로 2중 효소절단된 pWPT 벡터에 연결하여 각 키메릭 항원 수용체를 발현하는 렌티 바이러스벡터를 구현한다. 성공적으로 구축된 벡터는 MluI와 SalI를 효소 절단하여 동정하고 서열 측정이 정확한 후 렌티 바이러스 패키징에 사용될 수 있다. 상술한 바와 같이, eGFP-F2A-CAR은 하나의 mRNA로 전사되지만 최종 eGFP와 항CLD18A2 키메릭 항원 수용체 등 2개의 펩티드 사슬로 번역되고, 그 중 CD8α 신호 펩티드의 가이드에 의해 항CLD18A2 키메릭 항원 수용체는 세포막에 위치결정된다.

각 목표 CAR을 함유하는 획득된 벡터는 다음과 같다.

pWPT-eGFP-F2A-scFv(CLD18A2)-163-Z;

pWPT-eGFP-F2A-scFv(CLD18A2)-163-BBZ;

pWPT-eGFP-F2A-scFv(CLD18A2)-175-Z;

pWPT-eGFP-F2A-scFv(CLD18A2)-175-BBZ.

4. 플라스미드 전이 293T를 통한 렌티 바이러스 패키징

6×10⁶의 밀도로 6~10세대의 HEK-293T 세포(ATCC: CRL-11268)에 접종하여 10cm 배양 접시에서 배양하는데, 37℃, 5% CO₂에서 하룻밤 배양하여 전이에 사용한다. 배지는 10% 소태아혈청(PAA사에서 구입)을 함유하는 DMEM(PAA사에서 구입)이고, 다음날 약 전이 2시간 전에 배양액을 무혈청 DMEM로 교체한다.

전이 절차는 다음과 같다.

4.1 20μg의 빈 플라스미드 pWPT-eGFP(mock 대조) 또는 20μg의 각 목표 유전자 플라스미드 pWPT-eGFP-F2A-CAR을 각각 15μg의 패키징 플라스미드 PAX2 및 6μg의 외피 플라스미드 pMD2.G와 500μL의 MillQ 물에 용해시켜 균일하게 혼합한다.

4.2 62μL의 2.5M CaCl2(Sigma사에서 구입)를 천천히 적하하여 1200rpm/min vortex로 균일하게 혼합한다.

4.3 마지막에 500μL의 2 ×HeBS(280mM의 NaCl, 10mM의 KCl, 1.5mM의 Na2HPO4?2H2O, 12mM의 글루코스, 50mM의 Hepes(Sigma사에서 구입), pH 7.05, 0.22μM 여과 제균)를 천천히 적하하여 1200rpm/min vortex로 10s 동안 균일하게 혼합한다.

4.4 배양 접시에 바로 천천히 적하하여 가볍게 흔들고, 37℃, 5% CO₂에서 4~6h 동안 배양한 후 10% 소태아혈청를 함유하는 DMEM로 교체한다.

전이한 다음날에 전이효율(즉, 녹색 형광을 띄는 세포 비율)을 관찰하는데, ~80%의 양성 전이효율이면 전이 실험이 성공한 것을 의미한다. 48h 또는 72h 전이한 후, 0.45μm 필터(Millipore사에서 구입)를 사용하여 바이러스를 여과 수집한 다음 Beckman Optima L-100XP 초원심기를 통해 28000rpm로 4℃에서 2시간 동안 원심 처리하여 원심 상층액을 버리고 원심 처리하여 얻은 침전물은 1/10~1/50 원액 부피의 Quantum 007 배양액(PAA사에서 구입)을 사용하여 재부유시키며, 100μL/관으로 나누어 포장하고 -80℃에서 냉동 보존하여 바이러스가 T 림프 세포에 적정되거나 또는 감염되는 것을 기다린다.

5. mock 또는 eGFP -F2A- CAR 이 패키징된 렌티 바이러스 적정 농도 측정

첫 날에, 293T 세포를 1×10⁵/mL로 96웰 플레이트에 접종하고 100μL/웰로 37℃, 5% CO₂에서 배양하는데, 배양액은 10% 소태아혈청을 함유하는 DMEM이다. 다음 날, 50μL/웰로 배양 상층액을 버려 50μL/웰로 신선한 상기 배양액을 보충하고, 최종 농도가 6μg/mL인 polybrene을 함유시키며, 37℃, 5% CO₂에서 30min 동안 부화시킨다. 10μL/웰로 바이러스 원액 또는 1μL/웰로 바이러스 농축액을 첨가하고, 5배 희석, 4개의 기울기, 2개의 복제 웰을 조건으로 37℃, 5% CO₂에서 배양한다. 48h 동안 감염한 후 유세포 분석기로 eGFP를 검출하고, 양성율이 5~20%인 세포수가 바람직하며, 적정 농도(U/mL)=양성율×희석 배수×100×10⁴를 계산한다. 인산칼슘 전이법으로 패키징된 mock 즉 빈 벡터 대조와 각 eGFP-F2A-CAR을 포함하는 상기 바이러스의 적정 농도는 모두 약 0.5~2×10⁶U/mL 수준이고, 농축된 후 측정한 바이러스의 적정 농도는 약 2×10⁷U/mL이다.

실시예 4. 렌티 바이러스가 감염된 CTL 세포의 재조합

건강한 사람의 말초혈액을 이용하여 밀도 기울기 원심법을 통해 인간 말초혈액 단핵세포(상해 혈액 센터에서 제공)를 획득하고, 말초혈액 단핵세포에 대해서는 CTL 세포 자성 비드(Stem Cell Technologies에서 구입) 음성 선택방법을 통해 CTL를 획득하며, 선택한 후의 CTL 세포는 유세포 검출을 통해 CTL 세포의 순도를 검출하고, CTL 세포의 양성율≥95%로 다음 절차를 수행하는 것이 바람직하다. 약 1×10⁶/mL의 밀도로 Quantum 007 림프 세포 배지액(PAA사에서 구입)을 첨가하여 배양하고, 세포:자성 비드의 비례를 1:1로 하여 항 CD3과 항 CD28 항체가 동시에 감싸여 있는 자성 비드(Invitrogen사)와 최종 농도가 100U/mL인 재조합 IL-2(상해 Xin Hua 하이테크 주식회사에서 구입)을 첨가하여 24h 동안 자극 배양한다. 이 후, 상기 재조합 렌티 바이러스를 이용하여 MOI

5로 CTL 세포를 감염시킨다. 감염된 후의 세포는 이틀마다 5×10⁵/mL의 밀도로 계대 배양하는 동시에 림프 세포 배양액에 최종 농도가 100U/mL인 재조합 IL-2를 보총한다.

감염된 CTL 세포는 배양 후 8일째에 유세포 검출을 통해 서로 다른 키메릭 항원 수용체의 발현을 검출하는데, eGFP와 CAR이 공통 발현되므로 eGFP의 양성세포의 검출이 바로 키메릭 항원 수용체를 발현하는 양성세포이다. 감염되지 않는 T 림프 세포를 음성 대조로 하고, 서로 다른 키메릭 항원 수용체를 발현하는 바이러스 감염 CTL 세포의 양성율은 표 3과 같다. 상기 양성율 결과에 따르면, 렌티 바이러스 감염 방법을 통해 일정한 양성율의 CAR⁺ CTL 세포를 획득할 수 있다.

CTL 세포는 각각 서로 다른 키메릭 항원 수용체가 패키징된 바이러스가 감염된 후 세포 밀도 5×10⁵/ml로 이틀마다 계대 배양하고 카운트하며, 계대 배양된 세포 배양액에 IL-2(최종 농도 100U/ml)를 보충하고, 11일째에는 약 20~40배 증폭되는데, 이것은 서로 다른 키메릭 항원 수용체를 발현하는 CTL 세포가 체외에서 일정량의 증폭이 구현될 수 있는 것을 의미하고, 후속 체외 독성 시험 및 체내 시험에 보장을 제공하였다.

실시예 5. 키메릭 항원 수용체를 발현하는 세포의 체외 독성효과 실험

체외 독성실험에 사용되는 재료는 다음과 같다.

표 4에 표시한 바와 같은 293T와 위암 세포계를 표적 세포로 하고, 효과 세포는 실시예 4에서 검증한 바와 같은 체외에서 12일 배양하고 FACS 검출에 의해 키메릭 항원 수용체를 발현하는 양성세포를 키메릭 항원 수용체 양성(CAR⁺) CTL로 하며, 효과 세포/표적 세포비는 경우에 따라 각각 3:1, 1:1 및 1:3으로 하고, 표적 세포수는 10000/웰이며, 서로 다른 효과 세포/표적 세포비에 따라 효과 세포에 대응한다. 각 조에 모두 5개의 복제 웰을 설치하고 5개의 복제 웰의 평균치를 사용한다. 검출 시간은 제18 시간이다.

그 중, 각 실험군와 각 대조군는 다음과 같다.

각 실험군: 각 표적 세포+서로 다른 키메릭 항원 수용체를 발현하는 CTL,

대조군 1: 표적 세포의 방사가 가장 큰 LDH,

대조군 2: 표적 세포를 자발 방사하는 LDH,

대조군 3: 효과 세포를 자발 방사하는 LDH.

검출 방법: CytoTox 96 비방사성 세포 독성 검출 키트(Promega사)를 채용하여 진행한다. 이 방법은 비색법을 기반으로 하고, 51Cr 방사법을 대체할 수 있다. CytoTox 96® 검출은 락트산 탈수소효소(LDH)를 정량적으로 계측한다. LDH는 안정적인 세포질 효소로서, 세포가 용해될 때 방사될 수 있는데, 그 방사밥법은 방사성 분석에서의 51Cr의 방사방식과 기본적으로 동일하다. 방사한 LDH 배지 상층액에서는 30분간 커플링한 효소 반응을 통해 검출할 수 있고, 효소 반응에서 LDH는 테트라졸륨염(INT)을 적색의 포르마잔(Formazan)으로 전환시킬 수 있다. 생성된 적색 생성물의 양은 용해된 세포수와 정비례한다. 구체적으로는 CytoTox 96 비방사성 세포 독성 검출 키트 설명서를 참조한다.

세포 독성 계산공식은 다음과 같다:

구체적으로, 표 4와 표 5에 표시한 바와 같이 본 발명의 키메릭 항원 수용체(외가닥 항체 163 또는 175를 융합 발현) CLD18A2-Z CAR⁺를 발현하는 CTL과 CLD18A2-28BBZ CAR⁺를 발현하는 CTL은 CLD18A2를 고발현하는 293T 세포에 대해 현저한 살상 작용이 있고, CLD18A1을 고발현하는 293T 세포에 대해서는 살상력이 없어 CLD18A2의 세포를 선택적으로 살상할 수 있다. 그리고, 본 발명의 키메릭 항원 수용체 CLD18A2-Z CAR⁺를 발현하는 CTL과 CLD18A2-28BBZ CAR⁺를 발현하는 CTL은 CLD18A2를 고발현하는 2개의 위암 세포계 BGC-823및 NCI-N87에 대해서도 현저한 살상력이 있으며(표 4와 표 5 참조), 효과 세포/표적 세포비 기울기 의존성을 나타내는데, 즉 효과 세포/표적 세포비가 높을수록 세포 독성 작용이 높아지고 CLD18A2을 발현하지 않는 BGC-823 및 NCI-N87에 대해서는 특이적 세포 독성 작용이 없다.

효과 세포/표적 세포비 의존성 데이터에 따르면, 본 발명의 항CLD18A2 키메릭 항원 수용체를 발현하는 CTL은 CLD18A2를 고발현하는 위암 세포에 대해 특이적 세포 독성 작용을 가지고 있다는 것을 더욱 이해할 수 있다.

상대적으로, mock 플라스미드(CLD18A2-CAR을 가지고 있지 않은 빈 플라스미드 벡터 pWPT-eGFP)를 포함하는 바이러스가 전이된 빈 대조로서의 CTL은 CLD18A2를 고발현하는 3개의 상기 세포계에 대해 세포 독성 작용이 모두 매우 낮다. 그의 CLD18A2를 고발현하는 세포계에 대한 세포 독성과 본 발명의 항CLD18A2 키메릭 항원 수용체를 발현하는 CTL의 세포 독성의 데이터는 매우 현저한 차이가 있다.

상기 결과에 따르면, CLD18A2의 외가닥 항체에 대해 구축한 키메릭 항원 수용체를 선택하고, CLD18A2를 고발현하는 표적 세포를 선택적으로 살상할 수 있다. 그리고, 세포 독성 데이터에 따르면 CLD18A2-28BBZ의 CAR T는 CLD18A2-Z의 CART에 비해 CLD18A2를 발현하는 세포에 대한 독성이 더 강하다.

토론

현재 CAR T 세포는 이미 잠재적 치료수단으로 되었다. 그러나, 많은 종양, 예를 들어 위암에 대해서는 아직 CAR T 세포 치료에 관한 보도가 없다. CLD18A2는 위조직의 특이적 표지자일 수 있고, 따라서 위암 등 종양의 치료 타깃이 될 수도 있다는 연구가 있다. 그러나, 현재 CLD18A2를 치료 타깃으로 하는 후보 약물은 다만 단일 클론 항체만 있고, 해당 종양 치료에 성공적으로 적용될 수 있는지는 아직 알려지지 않았다. 따라서, 새로운 치료 수단을 찾을 필요가 있다. CLD18A2의 조직 특이성을 고려하여 본 발명에서는 CAR T 세포를 이용하여 표적 치료를 하면 새로운 항암제제를 얻을 수 있다고 가상하였다. 그러나, 알려져 있는 CLD18A2 항원은 밀착 연접 단백질로서, CAR T 세포와 접촉하고 해당 표적 세포에 대한 살상력을 발생할 수 있는지는 알려지지 않았다. 그리고, 단백질은 작은 변동에도 전체에 큰 영향이 끼치게 되는 입체구조이고, 많은 단일 클론 항체는 외가닥 항체로 진화할 때 항상 항원결합 활성 또는 특이성을 잃게 된다. 다행히도, 본 발명자는 2개의 외가닥 항체(163과 175)가 단일 클론 항체의 항원결합 특이성을 유지하고 있는 것을 발결하였다. 진일보적인 연구에 따르면, 상기 2개의 외가닥 항체로 구성된 CAR T 세포는 CLD18A2 양성세포에 대한 선택적인 살상 작용을 유지하였다. 본 발명의 결과에 따르면, CLD18A2는 확실히 CAR T 세포치료의 타깃으로 될 수 있고, CLD18A2를 타깃으로 하는 CAR T 세포는 종양 치료의 새로운 후보 수단이다.

본 발명에서 언급한 모든 문헌은 본 출원에서 참고로 인용되는데, 이것은 각 문헌이 단독적으로 참고로 인용된 것과 마찬가지이다. 그리고, 본 기술분야의 당업자는 본 발명의 상술한 내용을 통해 본 발명을 다양하게 변동 또는 수정할 수 있고, 이러한 등가 형식들은 마찬가지로 본 출원의 특허청구범위가 한정하는 범위에 포함된다.

<110> CARSGEN THERAPEUTICS LTD. <120> IMMUNOLOGIC EFFECTOR CELL OF TARGETED CLD18A2, AND PREPARATION METHOD AND USE THEREOF <130> 145023 <150> CN 201410341504.X <151> 2014-07-17 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 727 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding CLD18A2 single strand antibody125 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(727) <400> 1 gctagcacag gttcagctgc agcagtctgg agctgagctg gcgaggcccg gggcttcagt 60 gaagctgtcc tgcaaggctt ctggctacac cttcactgac tactatataa actgggtgaa 120 gcagaggact ggacagggcc ttgagtggat tggagagatt tatcctggaa gtggtaatac 180 ttactacaat gagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac 240 agcctacatg cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag 300 atcgtatggt gcctttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcaggtgg 360 aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gacattgtga tgacccagtc 420 tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc atcacctgca aggccagtca 480 gaatgttcgt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 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tggggtccct gatcgcttca caggcagtgg 1500 atctggaaca gatttcactc tcaccatcag cagtgtgcag gctgaagacc tggcagttta 1560 ttactgtcag aatgattata gttatccgct cacgttcggt gctgggacca agctggagct 1620 gaaaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg cccaccatcg cgtcgcagcc 1680 cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg ggcgcagtgc acacgagggg 1740 gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg gccgggactt gtggggtcct 1800 tctcctgtca ctggttatca ccagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta 1860 ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga 1920 tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccgc agagaaggaa 1980 gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag 2040 tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg 2100 tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg 2160 ctaggtcgac ctcgagggaa ttc 2183 <210> 16 <211> 2450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding chimeric antigen receptor protein CLD18A2-163-28BBZ 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caaccctggg cccatggcct taccagtgac 840 cgccttgctc ctgccgctgg ccttgctgct ccacgccgcc aggccgcaga tccagttggt 900 gcagtctgga cctgagctga agaagcctgg agagacagtc aagatctcct gcaaggcttc 960 tgggtatacc ttcacaaact atggaatgaa ctgggtgaag caggctccag gaaagggttt 1020 aaagtggatg ggctggataa acaccaacac tggagagcca acctatgctg aagagttcaa 1080 gggacggttt gccttctctt tggaaacctc tgccagcact gcctatttgc agatcaacaa 1140 cctcaaaaat gaggacacgg ctacatattt ctgtgcaaga ctgggttttg gtaatgctat 1200 ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca ggtggaggcg gttcaggcgg 1260 aggtggctct ggcggtggcg gatcggacat tgtgatgaca cagtctccat cctccctgac 1320 tgtgacagca ggagagaagg tcactatgag ctgcaagtcc agtcagagtc tgttaaacag 1380 tggaaatcaa aagaactact tgacctggta ccagcagaaa ccagggcagc ctcctaaact 1440 gttgatctac tgggcatcca ctagggaatc tggggtccct gatcgcttca caggcagtgg 1500 atctggaaca gatttcactc tcaccatcag cagtgtgcag gctgaagacc tggcagttta 1560 ttactgtcag aatgattata gttatccgct cacgttcggt gctgggacca agctggagct 1620 gaaaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg cccaccatcg cgtcgcagcc 1680 cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg ggcgcagtgc acacgagggg 1740 gctggacttc gcctgtgatt tttgggtgct ggtggtggtt ggtggagtcc tggcttgcta 1800 tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg aggagtaaga ggagcaggct 1860 cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc gggccaaccc gcaagcatta 1920 ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc tccaaacggg gcagaaagaa 1980 actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga 2040 tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt 2100 cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct 2160 caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga 2220 gatgggggga aagccgcaga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca 2280 gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg 2340 caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc 2400 ccttcacatg caggccctgc cccctcgcta ggtcgacctc gagggaattc 2450 <210> 17 <211> 2183 <212> DNA <213> Artificial 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gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtccggagtg aaacagactt tgaattttga 780 ccttctgaag ttggcaggag acgttgagtc caaccctggg cccatggcct taccagtgac 840 cgccttgctc ctgccgctgg ccttgctgct ccacgccgcc aggccgcagg tccaactgca 900 gcagcctggg gctgagctgg tgaggcctgg ggcttcagtg aagctgtcct gcaaggcttc 960 tggctacacc ttcaccagct actggataaa ctgggtgaag cagaggcctg gacaaggcct 1020 tgagtggatc ggaaatattt atccttctga tagttatact aactacaatc aaaagttcaa 1080 ggacaaggcc acattgactg tagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc agctcagcag 1140 cccgacatct gaggactctg cggtctatta ctgtacaaga tcgtggaggg gtaactcctt 1200 tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca ggtggaggcg gttcaggcgg 1260 aggtggctct ggcggtggcg gatcggacat tgtgatgaca cagtctccat cctccctgac 1320 tgtgacagca ggagagaagg tcactatgag ctgcaagtcc agtcagagtc tgttaaacag 1380 tggaaatcaa aagaactact tgacctggta ccagcagaaa ccagggcagc ctcctaaact 1440 gttgatctac tgggcatcca ctagggaatc tggggtccct gatcgcttca caggcagtgg 1500 atctggaaca gatttcactc tcaccatcag cagtgtgcag gctgaagacc tggcagttta 1560 ttactgtcag aatgattata gttatccatt cacgttcggc tcggggacaa agttggaaat 1620 aaaaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg cccaccatcg cgtcgcagcc 1680 cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg ggcgcagtgc acacgagggg 1740 gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg gccgggactt gtggggtcct 1800 tctcctgtca ctggttatca ccagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta 1860 ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga 1920 tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccgc agagaaggaa 1980 gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag 2040 tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg 2100 tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg 2160 ctaggtcgac ctcgagggaa ttc 2183 <210> 18 <211> 2450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence encoding chimeric antigen receptor protein CLD18A2-175-28BBZ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2450) <400> 18 aagcttacgc gtcctagcgc taccggtcgc caccatggtg agcaagggcg aggagctgtt 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Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 705 710 715 720 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg 725 730 735 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 740 745 750 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 755 760 765 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 770 775 780 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 785 790 795 <210> 21 <211> 709 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of chimeric antigen receptor protein CLD18A2-175-Z <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(709) <223> MISC_FEATURE <400> 21 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 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285 Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu 290 295 300 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp 305 310 315 320 Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr 325 330 335 Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala 340 345 350 Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser 355 360 365 Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp 370 375 380 Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 385 390 395 400 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 405 410 415 Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala 420 425 430 Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn 435 440 445 Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 450 455 460 Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly 465 470 475 480 Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 485 490 495 Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 500 505 510 Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 515 520 525 Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 530 535 540 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 545 550 555 560 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 565 570 575 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 580 585 590 Leu Val Ile Thr Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 595 600 605 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 610 615 620 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 625 630 635 640 Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr 645 650 655 Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly 660 665 670 Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln 675 680 685 Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln 690 695 700 Ala Leu Pro Pro Arg 705 <210> 22 <211> 798 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of chimeric antigen receptor protein CLD18A2-175-28BBZ <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(798) <223> MISC_FEATURE <400> 22 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn 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Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp 370 375 380 Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 385 390 395 400 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 405 410 415 Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala 420 425 430 Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn 435 440 445 Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 450 455 460 Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly 465 470 475 480 Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 485 490 495 Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln 500 505 510 Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu 515 520 525 Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 530 535 540 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 545 550 555 560 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe 565 570 575 Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu 580 585 590 Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg 595 600 605 Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro 610 615 620 Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala 625 630 635 640 Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln 645 650 655 Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser 660 665 670 Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys 675 680 685 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln 690 695 700 Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 705 710 715 720 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg 725 730 735 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 740 745 750 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 755 760 765 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 770 775 780 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 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ctactcctat acttactggg gccagggaac cctggtcacc 720 gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780 cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840 agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 900 gtccttctcc tgtcactggt tatcaccaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 960 gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1020 tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga 1080 aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1140 tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1200 cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1260 cctcgc 1266 <210> 24 <211> 1533 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3zeta nucleotide sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1533) <400> 24 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg ccaacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaaatac acatgttcct 300 cctacgtttg gccaggggac caagctggag atcaaacgtg gtggaggcgg ttcaggcgga 360 ggtggctctg gcggtggcgg atcgcaggtg cagctggtgc agtctggagc tgaggtgaag 420 aagcctgggg cctcagtgaa ggtctcctgc aaggcttctg gatacacctt caccgactat 480 gaaatgcact gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg agtggatggg agctcttgat 540 cctaaaactg gtgatactgc ctacagtcag aagttcaagg gcagagtcac gctgaccgcg 600 gacgaatcca cgagcacagc ctacatggag ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc 660 gtgtattact gtacaagatt ctactcctat acttactggg gccagggaac cctggtcacc 720 gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780 cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840 agggggctgg acttcgcctg tgatttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 900 tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 960 aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc aacccgcaag 1020 cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccaa acggggcaga 1080 aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1140 gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1200 aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1260 gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1320 cctgagatgg ggggaaagcc gcagagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1380 ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1440 aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1500 gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1533

Claims

차례로 연결되는 세포외 결합영역, 막관통영역과 세포내 신호영역을 포함하고, 상기 세포외 결합영역은 CLD18A2를 특이적으로 인식하는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 효과 세포 표면에 발현되는 키메릭 항원 수용체.
제1항에 있어서,
CLD18A2를 특이적으로 인식하는 상기 단백질은 항체 또는 리간드이고, 바람직하게 상기 항체는 외가닥 항체 또는 도메인 항체인 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 막관통영역은 CD8 또는 CD28의 막관통영역과 경첩 영역의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 세포내 신호영역은 CD3ζ, FcεRIγ, CD27, CD28, CD137, CD134의 세포내 신호영역의 서열 또는 그 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
제1항에 있어서,
CLD18A2를 특이적으로 인식하는 외가닥 항체, CD8 및 CD3ζ;
CLD18A2를 특이적으로 인식하는 외가닥 항체, CD8, CD137 및 CD3ζ;
CLD18A2를 특이적으로 인식하는 외가닥 항체, CD28 분자의 막관통영역, CD28 분자의 세포내 신호영역 및 CD3ζ; 또는
CLD18A2를 특이적으로 인식하는 외가닥 항체, CD28 분자의 막관통영역, CD28 분자의 세포내 신호영역, CD137 및 CD3ζ와 같은 순서로 연결되는 세포외 결합영역, 막관통영역과 세포내 신호영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
제1항에 있어서,
SEQ ID NO: 19~22 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
제1항에 있어서,
상기 면역 효과 세포는 T 림프 세포, NK 세포 또는 NKT 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항의 키메릭 항원 수용체를 코딩하는 핵산.
제8항에 있어서,
SEQ ID NO: 15~18 중의 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 핵산.
제8항 또는 제9항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제10항에 있어서,
렌티 바이러스 플라스미드 pWPT에서 유래되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제10항 또는 제11항의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
CLD18A2를 표적으로 하는 유전자 조작된 면역 효과 세포를 제조하는데 사용되는, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항의 키메릭 항원 수용체, 제8항 또는 제9항의 핵산, 제10항 또는 제11항의 발현 벡터 또는 제12항의 바이러스의 용도.
제8항 또는 제9항의 핵산, 제10항 또는 제11항의 발현 벡터 또는 제12항의 바이러스가 도입된 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 면역 효과 세포.
표면이 SEQ ID NO: 19-22 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 가진 키메릭 항원 수용체를 발현하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 면역 효과 세포.
제14항 또는 제15항에 있어서,
T 림프 세포, NK 세포 또는 NKT 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 면역 효과 세포.
CLD18A2 양성 종양 억제 약물을 제조하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 제14항 내지 제16항 중의 어느 한 항의 유전자 조작된 면역 효과 세포의 용도.