KR20210018838A - 유전자 조작된 세포 및 응용 - Google Patents

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KR20210018838A
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exogenous
cell
seq
acid sequence
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KR1020207036137A
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종하이 리
홍 루오
후아 지앙
후아마오 왕
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카르스젠 테라퓨틱스 컴퍼니, 리미티드
상하이 캔서 인스티튜트
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Abstract

본 발명은 표적 항원에 특이적으로 결합되는 외인성 수용체 및 외인성 CCL21을 발현하고 또한 세포 증식을 촉진하는 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성IL-7을 더 발현할 수 있는 유전자 조작된 세포를 공개한다. 본 발명은 외인성 CCL21 발현 카세트의 발현 구성물과 이를 포함하는 전달체, 바이러스 및 상기 세포를 포함하는 약학 조성물을 더 공개한다. 본 발명은 종양을 억제하거나 병원체를 억제하는 약물의 제조에서 세포, 발현 구성물, 전달체 및 바이러스의 응용을 더 공개한다.

Description

유전자 조작된 세포 및 응용
본원 발명은 출원일이 2018년 5월 15일인 중국 특허 출원 CN201810463564.7, 출원일이 2018년 9월 18인 중국 특허 출원 CN201811088090.9, 출원일이 2018년 12월 19일인 중국 특허 출원 CN201811552806.6, 출원일이 2019년 2월 28일인 CN201910151930.X의 우선권을 주장한다. 본원 발명은 상기 중국 특허 출원의 모든 내용을 인용한다.
본 발명은 세포 치료 분야에 속하는 것으로, 유전자 조작된 세포 및 응용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 표적 항원에 특이적으로 결합되는 외인성 수용체 및 외인성 CCL21의 세포에 관한 것이다.
CAR-T 세포는 MHC 비제한적 방식으로 종양을 특이적으로 살해할 수 있고, 종양 면역 치료에서 비교적 바람직한 응용 전망을 보이고 있지만, 예컨대 고형 종양에 대한 치료 효과가 바람직하지 않고, 체외에서 우수한 효과를 나타내는 후보 약물이 체내에서 때때로 대응되는 효과를 나타낼 수 없는 등 여전히 비교적 많은 제한성이 있다.
Adachi 등은 IL7 및 CCL19를 발현하는 CAR-T 세포(IL-7 and CCL19 expression in CAR-T cells improves immune cell infiltration and CAR-T cell survival in the tumor. Nature Biotechnology, 2018, 36(4), 346-351)를 이용하여 CAR-T 세포의 항종양 능력을 향상시키고자 시도하고 있다.
본 발명의 목적은 유전자 조작된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 표적 항원에 특이적으로 결합되는 외인성 수용체 및 외인성 CCL21을 포함하는 유전자 조작된 세포를 제공한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 세포는 표적 항원에 특이적으로 결합되는 외인성 수용체, 외인성 CCL21 및 상기 세포 증식을 촉진하는 단백을 발현한다. 바람직하게, 상기 세포 증식을 촉진하는 상기 단백질은 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 IL-7R 결합 단백질은 외인성 IL-7R 결합 단백질인 바, 즉 상기 세포는 표적 항원에 특이적으로 결합되는 외인성 수용체, 외인성 CCL21 및 외인성 IL-7R 결합 단백질을 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 외인성 IL-7R 결합 단백질은 IL-7R에 특이적으로 결합할 수 있으며 IL-7R 활성을 증강시킨다.
구체적인 실시형태에서, 상기 외인성 IL-7R 결합 단백질은 IL-7R의 항체로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 외인성 IL-7R의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 19로 표시된다.
구체적인 실시형태에서, 상기 외인성 CCL21은 천연 CCL21, 또는 천연 CCL21과 동일한 기능을 가지는 천연 CCL21의 절단 단편 또는 천연 CCL21의 돌연변이체이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 천연 CCL21은 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 %의 서열 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열의 절단 단편이거나; 또는 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 %의 서열 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열의 절단 단편이다. 바람직한 예에서, 상기 천연 CCL21은 인간의 CCL21이고, 이의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 21로 표시되거나; 또는 이의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
구체적인 실시형태에서, 상기 외인성 CCL21은 구성적 발현(constitutive expression)된다.
구체적인 실시형태에서, 상기 외인성 CCL21은 유도적 발현(inducible expression)된다. 바람직한 예에서, 상기 유도적 발현은 면역 세포 유도성 프로모터를 통해 개시된다. 비교적 바람직한 예에서, 상기 면역 세포 유도성 프로모터는 NFAT 프로모터이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 외인성 IL-7은 천연 IL-7, 또는 천연 IL-7과 동일한 기능을 가지는 천연 IL-7의 절단 단편 또는 천연 IL-7의 돌연변이체이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 천연 IL-7의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열의 절단 단편이거나; 또는 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열의 절단 단편이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 외인성 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7은 구성적 발현된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 외인성 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7은 유도적 발현된다.
바람직한 실시예에서, 상기 유도적 발현은 면역 세포 유도성 프로모터를 통해 개시된다. 비교적 바람직한 예에서, 상기 면역 세포 유도성 프로모터는 NFAT 프로모터이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 세포는 면역작용 세포다. 구체적인 실시예에서, 상기 면역작용 세포는 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT)세포, 비만 세포 또는 골수 유래 식세포 또는 이들의 조합으로부터 선택되고; 바람직하게, 상기 면역작용 세포는 T 세포, NK 세포로부터 선택되며; 더 바람직하게, 상기 면역작용 세포는 T 세포이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 세포는 자가 세포로부터 유래되고; 바람직하게, 자가 T 세포, 자가 NK 세포이며; 더 바람직하게, 자가 T 세포이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 세포는 동종이계 세포로부터 유래되고; 바람직하게, 동종이계 T 세포 또는 동종이계 NK 세포(NK92 세포와 같은 NK 세포의 세포주도 포함)이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 표적 항원은 종양 항원 또는 병원체 항원이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 표적 항원은 종양 항원이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 종양 항원은 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); CD171; CS-1; C형 렉틴 유사 분자-1; 갱글리어시드 GD3; Tn 항원; CD19; CD20; CD 22; CD 30; CD 70; CD 123; CD 138; CD33; CD44; CD44v7/8; CD38; CD44v6; B7H3(CD276), B7H6; KIT(CD117); 인터류킨 13 수용체 서브 유닛 α(IL-13Rα); 인터류킨 11 수용체α(IL-11Rα); 전립선 줄기세포 항원(PSCA); 전립선 특이적 막 항원(PSMA); 암배아 항원(CEA); NY-ESO-1; HIV-1 Gag; MART-1; gp100; 티로시나아제; 메소텔린; EpCAM; 프로테아제 세린 21(PRSS21); 혈관내피성장인자 수용체; 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장인자 수용체 β(PDGFR-β); 발생단계 특이적 태아성 항원-4(SSEA-4); 세포 표면 관련 뮤신 1(MUC1), MUC6; 표피성장인자 수용체 패밀리 및 이의 돌연변이체(EGFR, EGFR2, ERBB3, ERBB4, EGFRvIII); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 탄산무수화효소 IX(CAIX); LMP2; A형 에프린 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴루이스 부착 분자(sLe); 갱글리어시드 GM3; TGS5; 고분자량 흑색종 관련 항원(HMWMAA); O-아세틸 GD2 갱글리어시드(OAcGD2); 엽산 수용체; 종양 혈관 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 혈관 내피 마커 7 관련 (TEM7R); 클라우딘 6(Claudin 6), 클라우딘 18.2(Claudin18.2, CLD18A2), 클라우딘 18.1(Claudin18.1); ASGPR1; CDH16; 5T4; 8H9; ανβ6 인테그린; B세포 성숙화 항원(BCMA); CA9; κ 경쇄(kappa light chain); CSPG4; EGP2, EGP40; FAP; FAR; FBP; 배아형 AchR; HLA-A1, HLA-A2; MAGEA1, MAGE3; KDR; MCSP; NKG2D 리간드; PSC1; ROR1; Sp17; SURVIVIN; TAG72; TEM1; 피브로넥틴; 테나신; 종양 괴사 부위의 암배아 변이체; G 단백질 결합 수용체 클래스 C 그룹 5 멤버 D(GPRC5D); X 염색체 오픈 리딩 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나아제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이 유전자 1(PLAC1) ; globoH 글리코세라미드(glycoceramide)의 육탄당 부분(GloboH); 유방 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(uroplakin 2, UPK2); A 형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린 수용체 β3(ADRB3); 파넥신 3(pannexin 3, PANX3); G 단백질 결합 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합 유전자좌 K9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); T 세포 수용체 감마 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); ETS 전위 변이 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리 멤버 1A(XAGE1); 안지오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2(Tie2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; p53 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사 효소(hTERT); 육종 전위 중단 점; 세포 사멸의 흑색종 억제제(ML-IAP); ERG(막관통 프로테아제 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 V(NA17); 페어 박스 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; V-myc 조류 골수증 바이러스 종양 유전자 신경 모세포종 유래 동족체(MYCN); Ras 동족체 패밀리 멤버 C(RhoC); 시토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC 결합 인자(아연 핑거 단백질) 유사 (BORIS); T 세포에 의해 식별되는 편평 세포 암종 항원 3(SART3); 페어 박스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신(proacrosin) 결합 단백질 sp32(OYTES1); 림프구 특이 단백질 티로신 키나아제(LCK); A 키나제 고정 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종 X 중단 점 2(SSX2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR); 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브 패밀리 멤버 2(LILRA2); CD300 분자 유사 패밀리 멤버 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 멤버 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF 유사 모듈 함유 뮤신 유사 호르몬 수용체 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 포스파티딜 근육 글리칸-3(GPC3); Fc 수용체 유사 5(FCRL5); 면역글로불린 람다 유사 펩타이드 1(IGLL1)로부터 선택된다.
바람직한 예에서, 상기 종양 항원은 GPC3, EGFR, EGFRvIII 또는 클라우딘 18.2이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 표적 항원은 병원체 항원이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 병원체 항원은 바이러스, 세균, 진균, 원생 동물, 또는 기생충의 항원으로부터 선택된다. 구체적인 실시예에서, 상기 바이러스 항원은 거대세포 바이러스 항원, EB 바이러스 항원, 인간 면역 결핍 바이러스 항원 또는 인플루엔자 바이러스 항원으로부터 선택된다.
구체적인 실시형태에서, 상기 외인성 수용체는 키메라 수용체이고, 상기 키메라 수용체는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 외인성 수용체는 키메라 수용체이고, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR), 변형된 T 세포(항원) 수용체(TCR), T 세포 융합 단백질(TFP), T 세포 항원 커플러(TAC) 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
바람직한 실시형태에서, 상기 외인성 수용체는 키메라 항원 수용체이고, 상기 키메라 항원 수용체의 항원 결합 도메인은 항체, 항체 단편, scFv, Fv, Fab,(Fab')2, 단일 도메인 항체(SDAB), VH 또는 VL 도메인, 또는 낙타과 VHH 도메인, 또는 대응되는 항원의 천연 리간드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 외인성 수용체는 키메라 항원 수용체이고, 상기 키메라 항원 수용체의 막관통 도메인은 T 세포 수용체의 α 사슬, β 사슬 또는 ζ 사슬, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CD11a, CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD160, CD19, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및 NKG2C로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 외인성 수용체는 키메라 항원 수용체이고, 상기 키메라 항원 수용체의 세포내 도메인은 1급 신호 전달 도메인 및/또는 공동자극 신호 전달 도메인을 포함하며, 여기서, (1) 상기 1급 신호 전달 도메인은 CD3ζ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, 흔히 보는 FcRγ(FCER1G), FcRβ(FcεR1b), CD79a, CD79b, FcγRIIa, DAP10, 및 DAP12로부터 선택되는 단백질의 신호 전달 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하거나; 및/또는 (2) 상기 공동자극 신호 전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합되는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, 및 NKG2D로부터 선택되는 단백질의 신호 전달 도메인, 또는 이들의 조합을 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 키메라 항원 수용체는 (i) 표적 항원에 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, CD28의 공동자극 신호 도메인 및 CD3ζ; 또는 (ii) 표적 항원에 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, 4-1BB의 공동자극 신호 도메인 및 CD3ζ; 또는 (iii) 표적 항원에 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, CD28의 공동자극 신호 도메인, 4-1BB의 공동자극 신호 도메인 및 CD3ζ를 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 외인성 수용체의 항원 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2로 표시되는 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가진다.
구체적인 실시형태에서, 상기 외인성 수용체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 또는 SEQ ID NO: 35로 표시되는 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가진다.
구체적인 실시형태에서, 상기 외인성 수용체, 및/또는 외인성 IL-7R 결합 단백질, 및/또는 외인성 CCL21은 바이러스 전달체를 이용하여 발현된다. 바람직하게, 상기 바이러스 전달체는 렌티바이러스(lentivirus) 전달체, 레트로바이러스(retrovirus) 전달체 또는 아데노바이러스(adenovirus) 전달체를 포함한다.
본 발명의 제2 양태에 따르면, 발현 구성물을 제공하되, 상기 발현 구성물은 순차적으로 연결된 표적 항원에 특이적으로 결합되는 외인성 수용체의 발현 카세트 1, 외인성 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7의 발현 카세트 2, 외인성 CCL21의 발현 카세트 3을 포함하고; 바람직하게, 상기 발현 카세트 사이는 F2A, PA2, T2A, 및/또는 E2A로부터 선택된 직렬 단편에 의해 연결된다. 여기서, 상기 F2A 및 P2A의 핵산 서열은 각각 SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 16으로 표시된다.
본 발명의 제3 양태에 따르면, 본 발명의 제2 양태에 따른 발현 구성물을 포함하는 발현 전달체를 제공한다.
본 발명의 제4 양태에 따르면, 본 발명의 제3 양태에 따른 발현 전달체를 포함하는 바이러스를 제공한다.
본 발명의 제5 양태에 따르면, 면역작용 세포에서 본 발명의 제1 양태에 따른 표적 항원에 특이적으로 결합되는 키메라 항원 수용체, 외인성 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7, 외인성 CCL21을 공동발현하는 단계를 포함하는 면역작용 세포의 활성을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제6 양태에 따르면, 종양을 억제하고 병원체를 억제하거나 피험자 면역 관용(immune tolerance) 능력을 강화시키는 약물의 제조에서 본 발명의 제1 양태에 따른 세포, 본 발명의 제2 양태에 따른 발현 구성물, 또는 본 발명의 제3 양태에 따른 발현 전달체, 또는 본 발명의 제4 양태에 따른 바이러스의 용도를 제공한다. 구체적인 실시형태에서, 종양을 억제하는 약물의 제조에서의 용도를 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 제조된 종양을 억제하는 약물과 화학 치료 약물을 병용한다.
구체적인 실시형태에서, 상기 종양은 혈액 종양이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 종양은 고형 종양이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 종양은 결장암, 직장암, 신장 세포 암종, 간암, 비소세포폐암, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위암, 고환암, 자궁암, 수란관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 아동 고형 종양, 방광암, 신장 또는 요관암, 신우암, 중추신경계(CNS)암, 원발성 중추신경계 림프종, 종양 혈관 신생, 척추 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체선종, 카포시 육종, 표피모양암종, 편평세포암종, T 세포 림프종, 환경적으로 유발된 암, 상기 암의 조합 및 상기 암의 전이성 병소로부터 선택된다.
바람직한 예에서, 상기 고형 종양은 결장암, 직장암, 신장 세포 암종, 간암, 비소세포폐암, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위암, 고환암, 자궁암, 수란관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 음문암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 방광암, 신장 또는 요관암, 신우암, 중추신경계(CNS)암, 원발성 중추신경계 림프종, 종양 혈관 신생, 척추 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체선종, 카포시 육종, 표피모양암종, 편평세포암종으로부터 선택된다.
더 바람직하게, 상기 고형 종양은 결장암, 직장암, 간암, 비소세포폐암, 소장암, 식도암, 췌장암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위암으로부터 선택된다. 더 바람직하게, 상기 고형 종양은 위암, 췌장암, 또는 식도암이다.
본 발명의 제7 양태에 따르면, 본 발명의 제1 양태에 따른 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 제8 양태에 따르면, 키트 A 및 키트 B를 포함하는 키트를 제공하되, 상기 키트 A는 유전자 조작된 세포를 포함하고, 상기 세포는 본 발명의 제1 양태에 따른 표적 항원에 특이적으로 결합되는 외인성 수용체를 발현하며; 상기 키트 B는 CCL21, 및/또는, 상기 세포 증식을 촉진하는 단백질을 포함한다. 바람직하게, 상기 세포 증식을 촉진하는 단백질은 본 발명의 제1 양태에 따른 IL-7R 결합 단백질 또는 IL-7을 포함한다. 더 바람직하게, 상기 키트 A 및 키트 B는 선후 순서와 상관없이 사용된다.
바람직한 예에서, 상기 키트 A는 키메라 수용체에 의해 변형된 면역작용 세포를 포함한다. 바람직하게, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체이다.
바람직한 예에서, 상기 면역작용 세포는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포이다.
본 발명의 제9 양태에 따르면, 본 발명의 제1 양태에 따른 세포, 또는 본 발명의 제7 양태에 따른 약학 조성물, 또는 본 발명의 제8 양태에 따른 키트를 사용하는 단계를 포함하는 종양을 억제하거나 병원체를 억제하거나 피험자 면역 관용 능력을 강화시키는 방법을 제공한다. 바람직하게, 화학 치료 약물을 사용하는 단계를 더 포함한다.
발명의 유리한 효과는 하기와 같다.
1. 본 발명에서 제공되는 세포는 표적 항원에 특이적으로 결합되는 외인성 수용체, 외인성 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7, 및 외인성 CCL21을 공동발현하므로, 세포의 생존 능력, 축적 능력을 향상시킬 수 있다.
2. 본 발명의 기술적 해결수단으로 제조된 면역작용 세포는 우수한 종양 세포 살해 능력을 가진다.
3. 본 발명의 기술적 해결수단으로 제조된 세포는 암의 치료에서 항암 미세환경에서의 면역을 억제할 수 있음으로써, 고형 종양의 작용을 현저히 증강시킨다. 난치성 및 진행성 암에 대해서도 비교적 우수한 효과를 가진다.
도 1a는 MSCV-hu8E5(2I)-m28Z의 플라스미드 프로파일이다.
도 1b는 MSCV-hu8E5(2I)-m28Z-F2A-mIL-7-P2A-mCCL21a의 플라스미드 프로파일이다.
도 1c는 MSCV-hu8E5(2I)-m28Z-F2A-mIL7-P2A-mCCL21b의 플라스미드 프로파일이다.
도 1d는 MSCV-hu8E5(2I)-mBBZ의 플라스미드 프로파일이다.
도 1e는 MSCV-hu8E5(2I)-mBBZ-F2A-mIL-7-P2A-mCCL21a의 플라스미드 프로파일이다.
도 1f는 MSCV-hu8E5(2I)-m28Z-F2A-mIL7-P2A-mCCL21b의 플라스미드 프로파일이다.
도 2는 체외 시토카인 IL7, CCL21 검출 결과를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 상이한 그룹의 세포가 PD-1을 분비하는 상황을 나타내고; 도 3c 및 도 3d는 상이한 그룹의 세포가 LAG-3을 분비하는 상황을 나타내며; 도 3E 및 도 3f는 상이한 그룹의 세포가 TIM-3을 분비하는 상황을 나타낸다.
도 4a는 28Z의 체외 살해 결과를 나타내고; 도 4b는 BBZ의 체외 살해 결과를 나타낸다.
도 5는 체외 증식 검출 결과를 나타낸다.
도 6은 마우스 체내 종양 치료 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 mBBZ-7*19의 플라스미드 프로파일이다.
도 8a는 IL7 및 CCL21을 발현하는 CAR-T 세포와 IL7 및 CCL19를 발현하는 CAR-T 세포의 체내 살해 비교 결과를 나타내고; 도 8b는 마우스 체중 변화를 나타내며; 도 8c는 종양 중량 비교 결과를 나타내고; 도 8d는 마우스의 췌장암 PANC02-A2 치료 후의 CAR-T 세포 복제 수를 나타내며; 도 8e는 마우스 췌장암 CD8+ 세포의 면역 조직 화학 검출 결과를 나타낸다.
도 9a는 마우스 유방암 E0771-A2 정위 이식 종양이 CAR-T 세포 치료를 거친 후의 종양 부피 변화 상황을 나타낸다.
도 9b는 마우스 유방암 E0771-A2 정위 이식 종양 치료 후의 종양 중량을 나타낸다.
도 9c는 마우스의 유방암 치료 후의 CAR-T 세포 복제 수를 나타낸다.
도 9d는 마우스 유방암 CD8+ 세포의 면역 조직 화학 검출 결과를 나타낸다.
도 10a는 마우스 간암 Hepal-6-A2 이식 종양 치료 후의 종양 부피 변화 상황을 나타낸다.
도 10b는 마우스 간암 Hepa1-6-A2 이식 종양 치료 후의 종양 중량을 나타낸다.
도 10c는 마우스의 간암 치료 후의 CAR-T 세포 복제 수를 나타낸다.
도 10d는 마우스 간암 CD8+ 세포의 면역 조직 화학 검출 결과를 나타낸다.
도 11은 체외 IFN-γ의 검출 결과를 나타낸다.
도 12a는 마우스 췌장암 피하 종양 QingLin(淸淋) 모델이 CAR-T 세포 치료를 거친 후의 종양 부피 변화 상황을 나타내고; 도 12b는 마우스 췌장암 피하 종양 QingLin 모델 치료 후의 종양 중량을 나타내며; 도 12c는 마우스 췌장암 피하 종양 QingLin 모델 치료 후의 CAR-T 세포 복제 수를 나타내고; 도 12d는 마우스 췌장암 피하 종양 QingLin 모델 CD8+ 세포의 면역 조직 화학 검출 결과를 나타낸다.
도 13a는 마우스 췌장암 PANC02-A2 피하 종양 모델이 CAR-T 치료를 거친 d10일 째에 비장 중 Tcm의 검출 상황을 나타내고; 도 13b는 d20일 째에 비장 중 Tcm의 검출 상황을 나타낸다.
도 14a는 마우스 췌장암 PANC02-A2 피하 종양 모델이 CAR-T 치료를 거친 0d10일 째에 골수 중 Tcm의 함량 상황을 나타내고; 도 14b는 d20일 째에 비장 중 Tcm의 검출 상황을 나타낸다.
도 15A는 마우스 췌장암 PANC02-A2 피하 종양 모델이 CAR-T 치료를 거친 0d10일 째에 마우스 종양 조직에서의 더 많은 DC 세포 침윤 상황을 나타낸다.
도 16은 마우스 췌장암 PANC02-A2 피하 종양 모델이 CAR-T 치료를 거친 0d10일 째에 마우스의 종양 조직 중 MDSC의 함량 상황을 나타낸다.
본 발명은 종양 항원을 표적화하는 외인성 수용체 및 CCL21의 면역작용 세포가 종양에 대해 보다 우수한 살해 효과를 가질 뿐만 아니라 종양 조직에서의 면역작용 세포의 생존을 향상시킬 수 있고, 난치성 고형 종양이더라도 이에 대해 보다 우수한 항종양 능력을 나타낼 수 있음을 발견하였다.
공개된 내용에 따르면, 본 기술분야의 통상의 기술자는 본문에 따른 사상 및 범위를 벗어나지 않는 전제 하에 공개된 구체적인 실시형태에 대해 다양한 변경 또는 변형을 진행하여도 여전히 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 범위는 본문에서 설명된 구체적인 실시형태(이는 단지 본문에 따른 각 양태에서 예를 든 설명에 대한 예측으로 사용됨)에 한정되지 않고, 또한 기능 측면에서 등가적 방법 및 조성성분은 여전히 본문에 따른 범위 내에 속함을 이해해야 한다.
달리 명확하게 정의되지 않은 한, 본문에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 유전자 치료, 생물 화학, 유전학 및 분자 생물학 분야 내의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미를 구비한다. 본문에서 설명된 모든 방법 및 재료와 유사하거나 등가적인 것은 본문에 따른 실천 또는 시험에 사용될 수 있다. 이러한 기술은 방법 및 재료가 문헌에 충분히 기재된 바와 같이 참조할 수 있는데, 예를 들어, 달리 설명되지 않은 한, 본 발명의 실천은 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전하 변형 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 기존 기술을 적용하되, 이들은 모두 본 기술분야의 기술 범위 Current Protocols in Molecμlar Biology(FrederickM.AUSUBEL, 2000, Wileyand sonInc, Library of Congress, USA); Molecμlar Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition,(Sambrooketal, 2001, Cold Spring Harbor, NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited., 1984); Mμllis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization(B. D. Harries & S. J. Higginseds. 1984); Transcription And Translation(B. D. Hames & S. J. Higginseds. 1984); Cμlture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecμlar Cloning(1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY(J. Abelson 및 M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), 특히 Vols.154 및 155(Wuetal. eds.) 및 Vol.185, "Gene Expression Technology"(D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J. H. Miller 및 M. P. Caloseds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecμlar Biology(Mayer 및 Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Hand book Of Experimental Immunology, 권 I-IV(D. M. Weir 및 C. C. Blackwell, eds., 1986); 및 Manipμlating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)에 속한다.
본문에서 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허 및 다른 참조 문헌의 모든 내용은 모두 본문에 참조로서 결합된다. 충돌될 경우, 본 명세서를 기준으로 한다. 이 밖에, 달리 규정되지 않은 한, 본 명세서에서 열거된 재료, 방법 및 실시예는 단지 설명하기 위한 것일 뿐 한정하려는 것이 아니다.
본문에서 사용된 용어 "조작된" 및 이의 어법에서의 다른 형태는 예컨대생물체 게놈 내의 핵산과 같은 핵산의 하나 또는 다수의 변형을 의미한다. 용어 "조작된"은 유전자의 개변, 추가 및/또는 결실을 의미할 수 있다. 조작된 세포는 추가, 결실 및/또는 개변된 유전자의 세포를 의미할 수도 있다.
본문에서 사용된 용어 "유전자 조작된 세포"는 유전자 조작의 수단을 통해 개변된 세포를 의미한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 면역작용 세포다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 본문에 따른 유전자 조작된 세포는 표적 항원에 특이적으로 결합되는 외인성 수용체를 발현하는 세포를 의미한다. 일부 실시형태에서, 본문에 따른 유전자 조작된 세포는 표적 항원에 특이적으로 결합되는 외인성 수용체를 발현하고 외인성 CLL21을 발현하는 세포를 의미한다. 일부 실시형태에서, 본문에 따른 유전자 조작된 세포는 종양 항원에 특이적으로 결합되는 키메라 항원 수용체, CLL21, 및 T 세포 증식을 촉진하는 단백질을 공동발현하는 T 세포일 수도 있다. 일부 실시형태에서, 본문에 따른 유전자 조작된 세포는 종양 항원에 특이적으로 결합되는 키메라 항원 수용체, CLL21, 및 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7을 공동발현하는 T 세포일 수도 있다.
용어 "면역작용 세포"는 면역 반응에 참여하여 면역 효과를 일으키는 세포를 의미하는데, 예를 들어, T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 비만 세포 및 골수 유래 식세포를 의미한다. 일부 실시형태에서, 상기 면역작용 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 T 세포는 자가 T 세포, 이종 T 세포, 동종이계 T 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 NK 세포는 동종이계 NK 세포일 수 있다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 호환하여 사용할 수 있고, 펩티드 결합으로 공유 결합된 아미노산 잔기로 이루어진 화합물을 의미한다. 단백질 또는 펩티드는 반드시 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 개수를 제한하지 않는다. 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 서로 결합되는 2개 또는 이상의 아미노산을 함유하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본문에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 짧은 사슬(이는 본 기술분야에서 통상적으로 예컨대 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머 등으로 지칭되기도 함) 및 비교적 긴 사슬(이는 본 기술분야에서 통상적으로 단백질로 지칭되기도 하고, 다양한 유형이 존재함)을 의미한다. "폴리펩티드"는 예컨대 생물학 활성 단편, 기본적으로 상동한 폴리펩티드, 올리고펩티드, 호모다이머, 헤테로다이머, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등을 포함한다. 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 용어 "IL-7(Interleukin7, 인터류킨 7 또는 IL7)"는, IL-7R(바람직하게 마우스 또는 인간과 같은 포유동물 유래의 IL-7R)과 서로 작용(예를 들어, 결합)할 수 있고, 또한 (i) 천연적으로 존재하는 포유동물 IL-7의 아미노산 서열 또는 이의 단편, 예를 들어, SEQIDNO: 18(인간)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편; (ii) SEQIDNO: 18(인간)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편과 거의 예컨대 적어도 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 상동성을 가지는 아미노산 서열; (iii) 천연적으로 존재하는 포유동물 IL-7 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편(예를 들어, SEQ ID NO: 17(인간) 또는 이의 단편)에 의해 코딩된 아미노산 서열; (iv) SEQ ID NO: 17(인간)로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편과 예컨대 적어도 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열; (v) 천연적으로 존재하는 IL-7 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편과 중첩되는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, SEQIDNO: 17(인간) 또는 이의 단편)에 의해 코딩된 아미노산 서열; 또는 (vi) 엄격한 조건에서 전술한 뉴클레오티드 서열 중 하나와 교잡하는 뉴클레오티드 서열 중 하나를 구비하는 단백질(바람직하게 마우스 또는 인간과 같은 포유동물 유래)을 의미한다.
“외인성 IL-7R 결합 단백질"은 IL-7R에 특이적으로 결합될 수 있고 IL-7R 활성을 증강시키는 모든 단백질을 의미한다. "IL-7R 활성에 대한 증강"은 NK 세포의 증식, 세포 독성 또는 성숙에 대한 억제; B 세포 및 T 세포의 증식 또는 분화에 대한 자극; B 세포 중의 항체 생성 및 친화력 성숙에 대한 자극; CD8+T 세포의 세포 독성에 대한 자극; T 세포 및 NK 세포 중 인터페론 γ 생성에 대한 자극; 수지상 세포(DC) 활성화 및 성숙에 대한 억제; 비만 세포로부터의 염증성 매체의 방출에 대한 억제; 대식세포의 대식 작용에 대한 증강; TReg 세포의 생성 또는 생존에 대한 억제; 및 골수 전구 세포의 증식에 대한 자극을 포함하지만 이에 한정되지 않는, IL-7R 결합 단백질이 천연적으로 존재하는 IL-7R의 임의의 하나 또는 다양한 활성을 증강시킬 수 있음을 의미하는 것으로 이해해야 한다.
"CCL21(Chemokine(C-C motif) ligand 21)"은 주요한 면역 케모카인 중 하나로서, 비장 및 림프선의 2급 림프 조직의 T 세포 영역에서 발현되고, 항원의 활성화(성숙)를 담당하는 수지상 세포(DC), 비성숙된 DC 및 미숙 T 세포의 집합이다. 본 발명에서 CCL21은 (i) 천연적으로 존재하는 포유동물 CCL21의 아미노산 서열 또는 이의 단편, 예를 들어, SEQ ID NO: 21(인간)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편; (ii) SEQ ID NO: 21(인간)로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 단편과 예컨대 적어도 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 상동성을 가지는 아미노산 서열; (iii) 천연적으로 존재하는 포유동물 CCL21 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편(예를 들어, SEQ ID NO: 20(인간) 또는 이의 단편)에 의해 코딩된 아미노산 서열; (iv) SEQ ID NO: 20(인간)으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편과 예컨대 적어도 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열; (v) 천연적으로 존재하는 CCL21 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편과 중첩되는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 20(인간) 또는 이의 단편)에 의해 코딩된 아미노산 서열; 또는 (vi) 엄격한 조건에서 전술한 뉴클레오티드 서열 중 하나와 교잡하는 뉴클레오티드 서열 중 하나를 가진다.
용어 "아미노산 변형"은 아미노산 치환, 추가 및/또는 결실을 포함하고, "아미노산 치환"은 다른 하나의 아미노산으로 모체 폴리펩티드 서열 중 특정 위치에서의 아미노산을 대체하는 것을 의미한다. 본문에서 사용된 "아미노산 삽입"은 모체 폴리펩티드 서열에서의 특정 위치에서 아미노산을 추가하는 것을 의미한다. 본문에서 사용된 "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모체 폴리펩티드 서열 중 특정 위치에서의 아미노산을 제거하는 것을 의미한다. 본문에서 사용된 "보존적 변형"은 상기 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 현저히 영향주거나 개변시키지 않는 아미노산 변형을 의미한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 삽입 및 결실을 포함한다. 본 기술분야에서 공지된 표준 기술을 통해 변형을 본 발명의 항체에 도입할 수 있는데, 예를 들어, 부위 특이적 변이 유도 및 PCR 매개 변이 유도를 진행할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 구비하는 아미노산 잔기로 아미노산 잔기를 치환하는 치환이다. 본 기술분야에서 유사한 측쇄를 구비하는 아미노산 잔기 패밀리를 이미 정의하였다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄를 함유하는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루타민산), 대전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β 분지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다.
본문에서 사용된 용어 "야생형", "모체 " ,"천연"은 단백질 및 DNA와 관련될 경우 동일한 의미를 나타낸다. 용어 "돌연변이", "변이체" 또는 "돌연변이체"는 천연 단백질 또는 천연 DNA와 동일하거나 더 우수한 생물 활성을 가지고, 이는 천연 단백질의 아미노산 서열에서 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 추가 또는 결실이 발생되거나; 또는 천연 DNA의 핵산 서열에서 하나 또는 다수의 뉴클레오티드의 치환, 추가 또는 결실이 발생된다. 구체적인 실시형태에서, 본문에서의 돌연변이체의 서열은 천연 단백질의 아미노산 서열 또는 천연 DNA의 핵산 서열과 적어도 약 80 %, 바람직하게 적어도 약 90 %, 더 바람직하게 적어도 약 95 %, 보다 바람직하게 적어도 약 97 %, 보다 더 바람직하게 적어도 약 98 %, 가장 바람직하게 적어도 약 99 %의 상동을 가진다. 예를 들어, "IL-7의 변이체"는 일반적으로 야생형의 IL-7에 대해 아미노산 변형을 진행한 후 얻은, IL-7과 유사한 생물 활성 또는 더 우수한 생물 활성을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "절단 단편"은 천연 단백질 또는 천연 DNA의 비전장 형태를 의미하고, 이는 천연 아미노산 서열 또는 핵산 서열에서 연속 또는 불연속적인 다수의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 결실이 발생되며, 상기 결실은 서열의 임의의 위치, 예를 들어헤드부, 중부, 미부 또는 이들의 결합에서 발생된다. 본 발명에서, 단백질의 절단 단편은 여전히 이로부터 유래되는 천연 단백질과 동일한 기능을 보존한다.
"구성적 발현(constitutive expression)"을 지속적 발현이라고도 하는데, 거의 모든 생리적 조건에서, 유전자가 모두 세포에서 지속적으로 발현될 수 있는 것을 의미한다. "유도적 발현(inducible expression)"은 일정한 조건에서의 발현을 의미하되, 상기 조건은 예를 들어 T 세포와 항원이 결합될 때이다.
용어 "유효량"은 특정 생물학 결과를 효과적으로 구현하는 화합물, 제제, 물질 또는 조성물의 양을 의미하는데, 예를 들어, T 세포 반응을 충분히 촉진하는 양 또는 사용량을 의미하지만 한정되지 않는다. "면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양 억제 유효량" 또는 "치료 유효량"을 나타낼 경우, 본 발명의 면역작용 세포, 또는 치료제의 정확한 투여량은 의사가 개체의 연령, 체중, 종양 크기, 또는 전이 정도 및 환자(피험자)의 상황을 고려한 경우 결정할 수 있다. 유효량의 면역작용 세포는 면역작용 세포가 항종양 활성을 증가, 증강 또는 연장시키도록 하는 것; 항종양 면역작용 세포 또는 활성화 면역작용 세포의 개수를 증가시키는 것; IFN-γ 분비를 촉진시키는 것; 종양 퇴화, 종양 축소, 종양 괴사의 면역작용 세포의 개수를 의미하지만 이에 한정되지 않는다.
본문에서 사용된 용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시하는데 필요한 세포의 합성 메커니즘 또는 도입된 합성 메커니즘에 의해 식별된 DNA 서열이다.
전형적인 진핵 생물 프로모터는 최소 프로모터 및 다른 시스 요소로 구성된다. 최소 프로모터는 실질적으로 하나의 TATA 골격 영역, RNA 폴리메라아제 II(polII), TATA 결합 단백질(TBP) 및 TBP 관련 인자(TAF)가 이와 결합되어 전사를 개시할 수 있다. 이미 발견된 이러한 서열 요소(예를 들어, 증폭자)는 근접한 유전사의 전체 발현 수준을 향상시키는데, 흔히 위치 및/또는 방향에 비의존적인 방식으로 향상시킨다.
"NFAT(Nuclear factor of activated T cells)"는 활성화 T 세포핵인자이다. 일부 구체적인 실시형태에서, NFAT는 T 세포 활성화 과정에서 시토카인의 전사 발현에 대해 중요한 작용을 일으킨다. 일부 실시형태에서, RUNX3은 유도성 프로모터를 사용하여 유도적 발현된다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 프로모터는 NFAT 프로모터이다. 일부 실시형태에서, RUNX3의 코딩 서열을 NFAT 결합 모티프를 포함하는 최소 프로모터와 함께 조절한다. 일부 구체적인 실시형태에서, 6개의 NFAT 결합 모티프를 포함하는 IL2 최소 프로모터는 6개의 NFAT의 결합 위치를 이용하여 IL2의 최소 프로모터(minimal promoter)와 직렬되어 구성된 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 본문에 따른 항원에 결합되는 수용체는 키메라 수용체를 의미한다. 본문에서 사용된 "키메라 수용체"는 유전자 재조합 기술을 사용하여 상이한 유래의 DNA 단편 또는 단백질에 대응되는 cDNA를 연결하여 형성된 융합 분자를 의미한다. 키메라 수용체는 일반적으로 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR), 변형된 T 세포(항원) 수용체(TCR), T 세포 융합 단백질(TFP), T 세포 항원 커플러(TAC)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "개방형 해독틀(Open Reading Frame, ORF)"은 구조 유전자의 정상적인 뉴클레오티드 서열로서, 시작 코돈으로부터 종료 코돈까지의 해독틀은 완전한 폴리펩티드 사슬을 코딩할 수 있고, 그 사이에는 번역을 중단시키는 종료 코돈이 존재하지 않는다.
본문에서 사용된 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 한 그룹의 폴리펩티드인 바, 이가 면역작용 세포에 존재할 경우, 상기 세포에 표적 세포(일반적으로 암 세포임)에 대한 특이성을 제공하고, 세포내 신호 생성 기능을 구비한다. CAR은 일반적으로 적어도 하나의 세포외 항원 결합 도메인(세포외 영역으로 지칭되기도 함), 막관통 도메인(막관통 영역으로 지칭되기도 함) 및 세포질 신호 전달 도메인(본문에서 "세포내 신호 전달 도메인" 또는 "세포내 영역"으로 지칭되기도 함)을 포함하고, 이는 하기와 같이 정의된 자극성 분자 및/또는 공동자극성 분자로부터 유래되는 기능성 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩티드 그룹은 서로 인접한다. 폴리펩티드 그룹은 이합체화 분자가 존재할 경우 폴리펩티드를 서로 커플링시킬 수 있는 이합체화 스위치를 포함하는데, 예를 들어, 항원 결합 도메인을 세포내 신호 전달 도메인에 커플링시킬 수 있는 이합체화 스위치를 포함한다. 하나의 양태에서, 자극성 분자는 T 세포 수용체 복합체에 결합되는 ζ 사슬이다. 하나의 양태에서, 세포질 신호 전달 도메인은 적어도 하나의 하기와 같이 정의된 공동자극성 분자로부터 유래되는 하나 또는 다수의 기능성 신호 전달 도메인을 더 포함한다. 하나의 양태에서, 공동자극성 분자는 예컨대 4-1BB(즉, CD137), CD27 및/또는 CD28 등 본문에 따른 공동자극성 분자로부터 유래된다. 하나의 양태에서, CAR은 키메라 융합 단백질을 포함하고, 상기 융합 단백질은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 자극성 분자로부터 유래되는 기능성 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, CAR은 키메라 융합 단백질을 포함하고, 상기 융합 단백질은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 공동자극성 분자로부터 유래되는 기능성 신호 전달 도메인 및 자극성 분자로부터 유래되는 기능성 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 하나의 양태에서, CAR은 키메라 융합 단백질을 포함하고, 상기 융합 단백질은 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 또는 다수의 공동자극성 분자로부터 유래되는 2개의 기능성 신호 전달 도메인을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명에서 기능 균등 분자의 시작 항체 또는 단편(예를 들어, scFv) 아미노산 서열의 변형을 발생하는 것으로 가상하면, 예를 들어, 본문에 따른 암 관련 항원의 항원 결합 도메인의 VH 또는 VL, 예를 들어 CAR에 포함된 scFv는 변형되어 본문에 따른 암 관련 항원의 항원 결합 도메인의 시작 VH 또는 VL 골격 영역(예를 들어, scFv)의 적어도 약 70 %, 71 %, 72 % .73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 상동성을 보존할 수 있다. 본 발명에서 전체 CAR 구성물의 변형, 예를 들어, CAR 구성물의 다수의 도메인의 하나 또는 다수의 아미노산 서열의 변형을 발생하여 기능 균등 분자를 생성하는 것으로 가상하면, CAR 구성물은 변형되어 시작 CAR 구성물의 적어도 약 70 %, 71 %, 72 % .73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 % ,81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %의 상동성을 보존할 수 있다.
본문에서 사용된 "막관통 도메인"(막관통 영역으로 지칭되기도 함)은 막관통 영역과 인접한 하나 또는 다수의 다른 아미노산을 포함할 수 있는데, 예를 들어, 상기 막관통 단백질이 유래되는 단백질의 세포외 영역과 관련된 하나 또는 다수의 아미노산(예를 들어, 세포외 영역의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 내지 15개의 아미노산) 및/또는 상기 막관통 단백질이 유래되는 단백질의 세포외 영역과 관련된 하나 또는 다수의 다른 아미노산(예를 들어, 세포내 영역의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 내지 15개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 막관통 도메인은 다른 도메인 중 하나와 관련된 도메인인 바, 예를 들어, 하나의 실시형태에서, 상기 막관통 도메인은 신호 전달 도메인, 공동자극 도메인 또는 경첩 도메인이 유래되는 동일한 단백질로부터 유래될 수 있다. 일부 경우, 막관통 도메인은 선택되거나 또는 아미노산을 통해 치환되어 이러한 도메인과, 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인의 결합을 방지할 수 있는데, 예를 들어, 수용체 복합체의 다른 멤버와의 상호작용을 최소화시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 막관통 도메인은 키메라 수용체를 발현하는 세포의 세포 표면에서의 다른 하나의 키메라 수용체와 동형 이합체화될 수 있다. 하나의 상이한 양태에서, 막관통 도메인의 아미노산 서열은 변형 또는 치환될 수 있으므로, 동일한 키메라 수용체를 발현하는 세포에 존재하는 천연 결합 배우체의 결합 도메인과의 상호작용을 최소화시킨다. 막관통 도메인은 천연적이거나 또는 재조합될 수 있다. 천연적일 경우, 상기 도메인은 임의의 막 결합된 단백질 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 키메라 수용체와 상기 표적 항원이 결합되기만 하면, 막관통 도메인은 세포내 도메인으로 신호를 전달할 수 있다. 본 발명에서 특별히 사용되는 막관통 도메인은 예를 들어 T-세포 수용체의 α 사슬, β 사슬 또는 ζ 사슬, CD28, CD27, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 등 막관통 도메인을 적어도 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 예를 들어 KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1(CD11a, CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C 등 막관통 영역을 적어도 포함할 수 있다.
일부 경우, 막관통 도메인은 경첩(예를 들어, 인간 단백질로부터 유래되는 경첩)을 통해 CAR의 항원 결합 도메인과 같은 CAR의 세포외 영역에 연결될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시형태에서, 경첩는 인간 Ig(면역글로불린) 경첩(예를 들어, IgG4 경첩, IgD 경첩), GS 링커(예를 들어, 본문에 따른 GS 링커), KIR2DS2 경첩 또는 CD8a 경첩일 수 있다. 하나의 양태에서, 막관통 도메인은 재조합될 수 있는데, 이러한 경우, 이는 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 하나의 양태에서, 재조합 막관통 도메인의 각각의 말단에서 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛(triplet)을 발견할 수 있다. 선택적으로, 길이가 2개 내지 10개의 아미노산 사이에 있는 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커는 CAR의 막관통 도메인과 세포질 영역 사이에서 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블릿(doublet)은 특별히 적합한 링커를 제공한다.
본문에서 사용된 "세포내 도메인"(세포내 영역으로 지칭되기도 함)은 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 세포내 신호 전달 도메인은 일반적으로 그 중 이미 키메라 수용체를 도입한 면역 세포의 정상적인 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "효과기 기능"은 세포의 특화 기능을 의미한다. T 세포의 효과기 기능은 예컨대 세포 용해 활성 또는 보조 활성일 수 있는데, 시토카인의 분비를 포함한다. 따라서, 용어 "세포내 신호 전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 전달하고 세포가 특정 기능을 수행하는 단백질의 부분을 의미한다. 비록 일반적으로 모든 세포내 신호 전달 도메인을 응용할 수 있지만, 대다수 경우 전체 사슬을 사용할 필요없다. 세포내 신호 전달 도메인의 절단 부분을 사용할 경우, 이러한 절단 부분으로 완전한 사슬을 대체할 수 있는데, 이가 효과기 기능 신호를 전달하기만 하면 된다. 따라서, 용어 "세포내 신호 전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 충분히 전달하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는 절단 부분을 의미한다.
주지된 바와 같이, 단독의 TCR을 통해 생성된 신호는 T 세포를 충분히 완전하게 활성화시킬 수 없고, 2급 및/또는 공동자극 신호도 필요하다. 따라서, T 세포 활성화는 2개의 상이한 종류의 세포질 신호 전달 서열에 의해 매개된, TCR 개시 항원 의존적 1급 활성화를 통한 것들(1급 세포내 신호 전달 도메인), 및 항원 독립 방식으로 작용을 일으켜 2급 또는 공동자극 신호를 제공하는 것들(2급 세포질 도메인, 예를 들어, 공동자극 도메인)로 지칭될 수도 있다.
용어 "자극"은 자극성 분자(예를 들어, TCR/CD3 복합체 또는 CAR)와 이의 동종 리간드(또는 CAR의 경우 종양 항원임)의 결합됨으로써, 신호 전달 사건(예를 들어, TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달 또는 적합한 NK 수용체 또는 CAR의 신호 전달 도메인을 통한 신호 전달이지만 이에 한정되지 않음)을 매개하여 유도된 최초 반응을 의미한다. 자극은 일부 분자의 개변을 매개할 수 있는 발현을 자극한다.
용어 "자극성 분자"는 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, B 세포)에 의해 발현된, 세포질 신호 전달 서열을 제공하는 분자를 의미하고, 상기 신호 전달 서열은 자극적 방식으로 면역 세포 신호 전달 경로에 사용되는 적어도 일부 측면의 면역 세포의 활성화를 조절한다. 하나의 양태에서, 신호는 예를 들어 TCR/CD3 복합체를 통해 펩티드가 로딩된 MHC 분자와 결합되어 개시되는 초급 신호이고, 이는 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 T 세포 반응을 매개한다. 자극 방식으로 작용을 일으키는 1급 세포질 신호 전달 서열("1급 신호 전달 도메인"으로 지칭되기도 함)은 면역 수용체 타이로신 기반의 활성화 모티프(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)로 불리우는 신호 전달 모티프를 함유할 수 있다. 특히 본 발명의 ITAM을 함유한 세포질 신호 전달 서열에 사용되는 구현예로 CD3ζ, 흔히 보는 FcRγ(FCER1G), FcγRIIa, FcRβ(FcEpsilon R1b), CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD79a, CD79b, DAP10 및 DAP12로부터 유래되는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 특이적 CAR에서, 본 발명의 어느 하나 또는 다수의 CAR 중의 세포내 신호 전달 도메인은 CD3-ζ의 초급 신호 전달 서열과 같은 세포내 신호 전달 서열을 포함한다. 본 발명의 특이적 CAR에서, CD3-ζ의 초급 신호 전달 서열은 인간 또는 예컨대 마우스, 설치류 동물, 원숭이, 유인원 등 비인간으로부터 유래된 균등 잔기이다.
용어 "공동자극성 분자"는 T 세포에서의 동종 결합 배우체를 의미하되, 이는 공동자극 리간드에 특이적으로 결함됨으로써, 예컨대 증식이지만 이에 포함하지 않는 T 세포의 공동자극 반응을 매개한다. 공동자극성 분자는 항원 수용체 또는 이의 리간드를 제외한 세포 표면 분자로서, 이는 효과적인 면역 반응을 촉진한다. 공동자극성 분자는 MHC I류 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체, 및 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 공동자극성 분자의 추가적인 구현예로 CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83에 특이적으로 결합되는 리간드를 포함한다.
공동자극성 세포내 신호 전달 도메인은 공동자극성 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공동자극성 분자는 TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호 전달 림프구 활성화 분자(SLAM 단백질), 및 NK 세포 수용체 등 단백질 패밀리가 대표적일 수 있다. 이러한 분자의 구현예로 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합되는 리간드 등을 포함한다.
세포내 신호 전달 도메인은 분자의 모든 세포내 부분 또는 모든 천연 세포내 신호 전달 도메인, 또는 이의 기능 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다.
용어 "4-1BB"는 GenBank Accession No.AAA62478.2에서 제공된 아미노산 서열을 구비하는 TNFR 슈퍼패밀리의 멤버, 또는 예컨대 마우스, 설치류 동물, 원숭이, 유인원 등으로부터 유래된 비인간의 균등 잔기를 의미하고; 또한, "4-1BB 공동자극 도메인"은 GenBank Accession No.AAA62478.2의 아미노산 잔기 214 ~ 255, 또는 예컨대 마우스, 설치류 동물, 원숭이, 유인원 등으로부터 유래된 비인간의 균등 잔기로 정의된다. 하나의 양태에서, "4-1BB 공동자극 도메인"은 인간 또는 예컨대 마우스, 설치류 동물, 원숭이, 유인원 등 비인간으로부터 유래된 균등 잔기이다.
용어 "T 세포(항원) 수용체(T cell receptor, TCR)"는 모든 T 세포 표면의 특징적 표지로서, 비공유 결합으로 CD3와 결합아여 TCR-CD3 복합체를 형성한다. TCR은 주요 조직 상용성 복합체 분자와 결합되는 항원을 식별한다. TCR은 2가닥의 상이한 펩티드 사슬로 구성된 헤테로다이머이고, α, β인 2가닥의 펩티드 사슬로 구성되며, 각각의 펩티드 사슬은 또한 가변 영역(V 영역), 불변 영역(C 영역), 막관통 영역 및 세포질 영역 등 몇 개의 부분으로 나뉠 수 있고; 이의 특징은 세포질 영역이 아주 짧은 것이다. TCR 분자는 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하고, 이의 항원은 V 영역에 특이적으로 존재하며, 각 V 영역(Vα, Vβ)은 또한 CDR1, CDR2, CDR3인 3개의 초가변 영역을 포함하되, 여기서, CDR3에 의한 변이가 가장 크므로, TCR의 항원 결합 특이성을 직접 결정한다. TCR이 MHC-항원 펩티드 복합체를 식별할 경우, CDR1, CDR2는 MHC 분자 항원 결합홈의 측벽을 식별하고 이에 결합되며, CDR3은 항원 펩티드와 직접 결합한다. TCR은 TCR1 및 TCR2인 2가지로 나뉘고; TCR1은 γ 및 δ인 2가닥의 사슬로 구성되며, TCR2는 α 및 β인 2가닥의 사슬로 구성된다.
용어 "T 세포 융합 단백질(T cell fusion protein, TFP)"은 TCR을 구성하는 다양한 폴리펩티드로부터 유래된 재조합 폴리펩티드를 포함하고, 이는 표적 세포에서의 표면 항원에 결합될 수 있으며, 완전한 TCR 복합체의 다른 폴리펩티드와 상호작용될 수 있고, 일반적으로 T 세포 표면에 위치한다. TFP는 하나의 TCR 서브그룹과 인간 또는 인간화 항체로 구성된 하나의 항원 결합 도메인에 의해 구성되고, 여기서, TCR 서브그룹은 적어도 일부의 TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, TCR 세포내 도메인의 세포내 신호 도메인의 자극 도메인을 포함하며; 상기 TCR 서브그룹 및 상기 항체 도메인은 효과적으로 연결되고, 여기서, TCR 서브그룹의 세포외, 막관통, 세포내 신호 도메인은 CD3 ε 또는 CD3γ로부터 유래되며, 또한, 상기 TFP는 T 세포에서 발현되는 TCR에 통합된다.
용어 "T 세포 항원 커플러(T cell antigen coupler, TAC)"는 3개의 기능 도메인을 포함하는 바, 즉, 1. 단일 사슬 항체, 설계된 안키린 반복 단백질(designed ankyrin repeat protein, DARPin) 또는 다른 표적화 그룹을 포함하는 종양 표적화 도메인; 2. CD3와 결합하는 단일 사슬 항체를 통해 TAC 수용체와 TCR 수용체를 접근시키는 세포외 영역 도메인; 3, 막관통 영역 및 CD4 공동 수용체의 세포내 영역을 포함하되, 여기서, 세포내 영역은 단백질 키나아제 LCK에 연결되고, TCR 복합체의 면역 수용체 타이로신 활성화 모티프(ITAMs) 인산화에 대해 촉매 작용하는 단계를 T 세포 활성화의 초기 단계로 한다.
용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합되는 면역글로불린 분자로부터 유래되는 단백질 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 항체는 다클론 또는 단클론, 다중 사슬 또는 단일 사슬, 또는 완전한 면역글로불린일 수 있고, 천연적이거나 재조합될 수 있다. 항체는 면역글로불린 분자의 4합체일 수 있다.
용어 "항체 단편"은 항원의 에피토프와의 특이적 상호작용(예를 들어, 결합, 공간 입체 장애, 안정화/탈안정화, 공간 분포)의 능력을 보존하는 항체의 적어도 일부분을 의미한다. 항체 단편의 구현예로 Fab, Fab ', F(ab')2, Fv 단편, scFv, 이황화 결합-연결된 Fvs(sdFv), VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체(예를 들어, sdAb), 항체 단편(예를 들어, 경첩 영역에서 이황화 결합을 통해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편)으로 형성된 다특이적 항체 및 항체의 분리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "scFv"는 경쇄를 포함하는 적어도 하나의 가변 영역의 항체 단편 및 중쇄를 포함하는 적어도 하나의 가변 영역의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 의미하되, 여기서, 상기 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 인접되고(예를 들어, 짧은 유연성 폴리펩티드 링커와 같은 합성 링커를 통해 인접함), 단일 사슬 폴리펩티드 형태로 발현될 수 있으며, 여기서, 상기 scFv는 이가 유래되는 완전한 항체의 특이성을 보존한다. 달리 지정되지 않은 한, 본문에서 사용된 바와 같이, scFv는 임의의 순서로(예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단 및 C 말단에 대해) 상기 VL 및 VH 가변 영역을 구비할 수 있고, scFv는 VL-링커-VH 또는 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
용어 "항체 중쇄"는 이의 천연적으로 존재하는 배열로 항체 분자에 존재하고 일반적으로 항체가 속하는 종류를 결정하는 2가지 폴리펩티드 사슬 중 비교적 큰 사슬을 의미한다.
용어 "항체 경쇄"는 이의 천연적으로 존재하는 배열로 항체 분자에 존재하는 2가지 폴리펩티드 사슬 중 비교적 작은 사슬을 의미한다. κ(k) 및 λ(l) 경쇄는 2가지 주요한 항체 경쇄의 동종형을 의미한다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 DNA 기술로 생성한 항체를 의미하는데, 예를 들어, 박테리오파지 또는 효모균 발현 시스템에 의해 발현된 항체를 의미한다. 상기 용어는 이미 합성 코딩 항체의 DNA 분자(또한 그 중 DNA 분자 발현 항체 단백질) 또는 지정된 항체의 아미노산 서열을 통해 생성된 항체도 의미하는 것으로 해석되어야 하고, 여기서, 상기 DNA 또는 아미노산 서열은 이미 재조합 DNA 또는 본 기술분야에서 획득 가능하고 숙지된 아미노산 서열 기술을 통해 획득된 것이다.
용어 "항원"은 면역 반응을 일으키는 분자를 의미한다. 상기 면역 반응은 항체 생상 또는 특이적 면역 능력을 가지는 세포의 활성화 또는 이들 모두와 관련될 수 있다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 실제적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 대분자는 모두 항원으로 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 이 밖에, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 본문에서 상기 용어를 사용할 경우, 본 기술분야의 통상의 기술자는 면역 반응을 일으킨 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 일부 뉴클레오티드 서열의 임의의 DNA, 코딩된 단백질 또는 펩티드를 포함함을 이해해야 한다. 이 밖에, 본 기술분야의 통상의 기술자는 항원은 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요가 없음을 이해해야 한다. 자명한 것은, 본 발명은 하나의 유전자를 초과하는 일부 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 이러한 뉴클레오티드 서열은 상이한 조합으로 배열되어 희망하는 면역 반응을 일으키는 폴리펩티드를 코딩한다. 또한, 본 기술분야의 통상의 기술자는 항원은 전혀 "유전자"에 의해 코딩될 필요가 없음을 이해해야 한다. 자명한 것은, 항원은 합성되어 생성될 수 있거나, 또는 생물 샘플로부터 유래될 수 있거나, 또는 폴리펩티드를 제외한 대분자일 수 있다. 이러한 생물 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 다른 생물 조성성분을 가지는 세포 또는 액체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
"종양 항원"은 과도 증식성 질환의 발생, 진행 과정에서 새로 나타나거나 과도하게 발현된 항원을 의미한다. 일부 양태에서, 본 발명의 과도 증식성 병증은 암을 의미한다.
본 발명에 따른 종양 항원은 고형 종양 항원일 수 있고, 혈액 종양 항원일 수도 있다.
본 발명의 종양 항원은 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); CD171; CS-1; C형 렉틴 유사 분자-1; 갱글리어시드 GD3; Tn 항원; CD19; CD20; CD 22; CD 30; CD 70; CD 123; CD 138; CD33; CD44; CD44v7/8; CD38; CD44v6; B7H3(CD276), B7H6; KIT(CD117); 인터류킨 13 수용체 서브 유닛 α(IL-13Rα); 인터류킨 11 수용체α(IL-11Rα); 전립선 줄기세포 항원(PSCA); 전립선 특이적 막 항원(PSMA); 암배아 항원(CEA); NY-ESO-1; HIV-1 Gag; MART-1; gp100; 티로시나아제; 메소텔린; EpCAM; 프로테아제 세린 21(PRSS21); 혈관내피성장인자 수용체, 혈관내피성장인자 수용체2(VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래 성장인자 수용체 β(PDGFR-β); 발생단계 특이적 태아성 항원-4(SSEA-4); 세포 표면 관련 뮤신 1(MUC1), MUC6; 표피성장인자 수용체 패밀리 및 이의 돌연변이체(EGFR, EGFR2, ERBB3, ERBB4, EGFRvIII); 신경 세포 부착 분자(NCAM); 탄산무수화효소 IX(CAIX); LMP2; A형 에프린 수용체 2(EphA2); 푸코실 GM1; 시알릴루이스 부착 분자(sLe); 갱글리어시드 GM3; TGS5; 고분자량 흑색종 관련 항원(HMWMAA); O-아세틸 GD2 갱글리어시드(OAcGD2); 엽산 수용체; 종양 혈관 내피 마커 1(TEM1/CD248); 종양 혈관 내피 마커 7 관련 (TEM7R); 클라우딘 6(Claudin 6), 클라우딘 18.2、Claudin18.1; ASGPR1; CDH16; 5T4; 8H9; ανβ6 인테그린; B세포 성숙화 항원(BCMA); CA9; κ 경쇄(kappa light chain); CSPG4; EGP2, EGP40; FAP; FAR; FBP; 배아형 AchR; HLA-A1, HLA-A2; MAGEA1, MAGE3; KDR; MCSP; NKG2D 리간드; PSC1; ROR1; Sp17; SURVIVIN; TAG72; TEM1; 피브로넥틴; 테나신; 종양 괴사 부위의 암배아 변이체; G 단백질 결합 수용체 클래스 C 그룹 5 멤버 D(GPRC5D); X 염색체 오픈 리딩 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나아제(ALK); 폴리시알산; 태반 특이 유전자 1(PLAC1); globoH 글리코세라미드(glycoceramide)의 육탄당 부분(GloboH); 유방 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(uroplakin 2, UPK2); A 형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린 수용체 β3(ADRB3); 파넥신 3(pannexin 3, PANX3); G 단백질 결합 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합 유전자좌 K9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); T 세포 수용체 감마 대체 판독 프레임 단백질(TARP); 윌름스 종양 단백질(WT1); ETS 전위 변이 유전자 6(ETV6-AML); 정자 단백질 17(SPA17); X 항원 패밀리 멤버 1A(XAGE1); 안지오포이에틴 결합 세포 표면 수용체 2(Tie2); 흑색종 암 고환 항원-1(MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos 관련 항원 1; p53 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역전사 효소(hTERT); 육종 전위 중단 점; 세포 사멸의 흑색종 억제제(ML-IAP); ERG(막관통 프로테아제 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제 V(NA17); 페어 박스 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; V-myc 조류 골수증 바이러스 종양 유전자 신경 모세포종 유래 동족체(MYCN); Ras 동족체 패밀리 멤버 C(RhoC); 시토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC 결합 인자(아연 핑거 단백질) 유사 (BORIS); T 세포에 의해 식별되는 편평 세포 암종 항원 3(SART3); 페어 박스 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신(proacrosin) 결합 단백질 sp32(OYTES1); 림프구 특이 단백질 티로신 키나아제(LCK); A 키나제 고정 단백질 4(AKAP-4); 활막 육종 X 중단 점 2(SSX2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR); 백혈구 면역글로불린 유사 수용체 서브 패밀리 멤버 2(LILRA2); CD300 분자 유사 패밀리 멤버 f(CD300LF); C형 렉틴 도메인 패밀리 12 멤버 A(CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2(BST2); EGF 유사 모듈 함유 뮤신 유사 호르몬 수용체 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 포스파티딜 근육 글리칸-3(GPC3); Fc 수용체 유사 5(FCRL5); 면역글로불린 람다 유사 펩타이드 1(IGLL1)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
병원체 항원은 바이러스, 세균, 진균, 원생 동물, 또는 기생충의 항원으로부터 선택되고; 바이러스 항원은 거대세포 바이러스 항원, EB 바이러스 항원, 인간 면역 결핍 바이러스 항원, 또는 인플루엔자 바이러스 항원으로부터 선택된다.
용어 "종양"은 체외(예를 들어, 형질전환된 세포) 또는 체내에서의 과도 증식성 세포 성장의 광범위한 병증 유형을 의미한다. 본 발명의 방법을 통해 예방 또는 치료할 수 있는 병세는 예를 들어 양성 또는 악성 종양을 포함하는 다양한 신생물, 다양한 증식 등을 포함한다. 암의 구체적인 예로 유방암, 전립선암, 백혈병, 림프종, 비인두암, 노교종, 결장암, 직장암, 신장 세포 암종, 간암, 비소세포폐암, 소장암, 식도암, 흑색종, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 자궁암, 난소암, 위암, 고환암, 수란관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 방광암, 수뇨관암, 신우암, 중추신경계(CNS)암, 혈관종 척추 종양, 신경교종, 성상세포종, 뇌하수체선종, 상기 암의 조합 및 상기 암의 전이성 병소를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 이를 통해 숙주 세포에 전이 또는 도입되는 과정을 의미한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 이미 외인성 핵산을 이용하여 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 상기 세포는 원발성 피험자 세포 및 그 후대를 포함한다.
용어 "특이적 결합"은 항체 또는 리간드가 결합적으로 샘플 중의 결합 배우체(예를 들어, 종양 항원)에 존재하지만, 샘플 중의 다른 분자를 거의 식별하지 않거나 이에 결합되지 않는 것을 의미한다.
여기서 사용되는 "난치"는 예컨대 치료에 반응하지 않는 종양과 같은 한 가지 질환을 의미한다. 실시형태에서, 난치성 종양은 치료 시작 전 또는 시작 시의 치료에 대해 저항성을 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 난치성 종양은 치료 동안에 저항성을 가질 수 있다. 본 발명에서, 난치성 종양은 방사선 치료에 대한 둔감, 방사선 치료 후 재발, 화학 치료에 대한 둔감, 화학 치료 후 재발, CAR-T 치료에 대한 둔감 또는 치료 후 재발하는 종양을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 난치성 또는 재발성 악성 종양은 본문에서 설명된 치료 방안을 적용할 수 있다.
본무에서 사용된 "재발"은 일정한 개선 기간에 예컨대 먼저 효과적인 종양 치료 후 환자에게 상기 효과적인 치료 전의 병증 및 증상이 다시 나타나는 것을 의미한다.
용어 "개체" 및 "피험자"는 본문에서 균등한 의미를 가지고, 인간, 및 다른 종속의 동물일 수 있다.
용어 "증강"은 피험자 또는 종양 세포 개선이 본문에서 공개된 치료를 허용하는 능력을 의미한다. 예를 들어, 증강된 반응은 반응성 중 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 또는 98 % 또는 이상의 증가를 포함할 수 있다. 본문에서 사용된 바와 같이, "증강"은 예컨대 면역작용 세포 치료법과 같은 치료에 반응하는 피험자 수량을 증가시키는 것을 의미할 수도 있다. 예를 들어, 증강된 반응은 치료에 반응하는 피험자의 전체 백분비를 의미할 수 있는데, 여기서 백분비는 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 또는 98 % 이상이다.
하나의 양태에서, 치료는 임상 결과; T 세포를 통한 항종양 활성 증가, 증강 또는 연장; 종양T 세포 또는 활성화 T 세포 수량이 치료 전의 수량에 비해 증가; IFN-γ 분비에 대한 촉진; 또는 이들의 조합에 의해 결정된다. 다른 양태에서, 임상 결과는 종양 퇴화; 종양 축소; 종양 괴사; 면역 시스템을 통한 항종양 반응; 종양 확대, 재발 또는 확산 또는 이들의 조합이다. 또 다른 양태에서, 치료 효과는 T 세포의 존재, T 세포 염증을 지시하는 유전자 표기의 존재, IFN-γ 분비에 대한 촉진, 또는 이들의 조합을 통해 예측한다.
본문에서 공개된 면역작용 세포는 다양한 경로를 통해 개체에 사용될 수 있는데, 예를 들어, 경구 투여, 또는 예컨대 정맥내, 근육내, 피하, 안와내, 낭내, 복막내, 직장내, 낭내영역(intracisternal), 종양내, 비강내(intravasally), 피내 또는 예컨대 피부 패치 또는 피부 투과 이온 전기 삼투 치료법을 각각 사용한 피부를 통한 수동적 또는 촉진적 흡수와 같은 비경구 투여 방식을 포함한다.
본 발명을 실천하는 방법에서 사용할 시약의 전체 사용량은 단일 사용량으로서 주사 또는 상대적으로 짧은 시간대의 주입을 통해 피험자에게 사용되거나, 또는 단계를 나누는 치료 방안으로 사용할 수 있는데, 여기서 연장 시간대에 다수의 사용량을 사용한다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 피험자의 치료 과정에서의 병리 상황을 치료하는 조성물의 양은 피험자의 연령 및 일반 건강, 및 사용 경로 및 사용될 치료 횟수를 포함한 다양한 요소에 의해 결정됨을 알 수 있다. 기술자는 이러한 요소를 고려하여 수요에 따라 구체적인 사용량을 조절한다. 일반적으로, 최초에는 I기 및 II기 임상 실험을 통해 조성물의 조제 및 사용 경로 및 빈도를 측정한다.
범위에 있어서, 전체 공개 내용에서, 본 발명의 각 양태는 모두 범위 형태로 존재할 수 있다. 범위 형태에 대한 설명은 단지 편의 및 간결함을 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위에 대한 불변적인 제한으로 간주되어서는 아니됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위에 대한 설명은 모든 가능한 서브 범위 및 상기 범위 내의 단독 수치를 특별히 공개한 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 범위에 대한 설명이 예를 들어 1 내지 6이면 구체적으로 서브 범위인 예컨대1 내지 3, 1내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3내지 6 등, 및 상기 범위내의 단독 수치 예컨대1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6을 공개하였음을 이해해야 한다. 다른 구현예로서, 예를 들어 범위 95 ~ 99 %의 상동성은 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 %의 상동성을 가지는 범위를 포함하고, 예를 들어 서브 범위인 96 ~ 99 %, 96 ~ 98 %, 96 ~ 97 %, 97 ~ 99 %, 97 ~ 98 % 및 98~99 %의 상동성을 포함하되, 이들은 모두 적용 가능하다.
공개된 내용에 따르면, 본 기술분야의 통상의 기술자는 본문에 따른 사상 및 범위를 벗어나지 않는 전제 하에 공개된 구체적인 실시형태에 대해 다양한 변경 또는 변형을 진행하여도 여전히 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 범위는 본문에서 설명된 구체적인 실시형태(이는 단지 본문에 따른 각 양태에서 예를 든 설명에 대한 예측으로 사용됨)에 한정되지 않고, 또한 기능 등가적 방법 및 조성성분은 여전히 본문에 따른 범위 내에 속함을 이해해야 한다. 실제적으로, 본 발명의 다양한 수정과 본문에서 설명된 것들은 전술한 설명에 따라 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 더욱 명확해질 것이다.
적용된 IL7 및 CCL21을 공동발현하는 CAR-T 세포가 피험자에 사용될 경우, 대응되는 종속을 선택할 수 있는데, 예를 들어, 마우스에 사용될 경우, 마우스 유래의 IL7 및 CCL21을 사용하고, 예컨대 막관통 도메인, 세포내 도메인 등 CAR을 구축하는 요소도 마우스 유래인 것을 선택할 수 있다. 피험자가 인간일 경우, 바람직하게 인간 유래의 IL7 및 CCL21 및 인간 유래의 CAR의 요소를 선택한다. 일부 실시형태에서, 사용된 CAR의 서열은 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, 또는 SEQ ID NO: 34로 표시될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 세포는 종양 치료에 사용될 경우 화학 치료 약물과 병용하여 응용될 수 있다.
용어 "CLD18(claudin 18)"은 클라우딘-18을 의미하고, 세포에 의해 천연적으로 발현되거나 CLD18 유전자를 형질감염시킨 세포에 의해 발현된 임의의 CLD18의 변이체(CLD18A1(claudin 18.1) 및 CLD18A2(claudin 18.2)를 포함), 배열, 이소폼(isoform) 및 종간 동종물(specieshomologs)을 포함한다. 바람직하게, "CLD18"은 인간 CLD18, 특히 CLD18A2(SEQ ID NO:22) 및/또는 CLD18A1(SEQ ID NO: 23)을 의미하고, 더 바람직하게 CLD18A2를 의미한다.
용어 "CLD18A1"은 세포에 의해 천연적으로 발현되거나 CLD18A1 유전자를 형질감염시킨 세포에 의해 발현된 임의의 인간 CLD18A1의 번역 후 변형된 변이체, 이소폼, 종간 동종물을 포함한다.
용어 "CLD18A2"는 세포에 의해 천연적으로 발현되거나 CLD18A2 유전자를 형질감염시킨 세포에 의해 발현된 임의의 인간 CLD18A2의 번역 후 변형된 변이체, 이소폼, 종간 동종물을 포함한다.
용어 "CLD18 변이체"는 (i) CLD18 접합 변이체,(ii) CLD18 번역 후 변형된 변이체, 특히 N 글리코실화 상태가 상이한 변이체, (iii) CLD18 배열 변이체, 특히 CLD18-배열-1, CLD18-배열-2 및 CLD18-배열-3, (iv) 세포간 긴밀 연결 측에 위치한 유리 CLD18 및 동형/이형 관련 변이체,(v) CLD18 암 관련 변이체 및 CLD18 비-암 관련 변이체를 포함해야 한다.
본 발명의 키메라 항원 수용체 폴리펩티드는,
세포외 항원 결합 영역-CD8 막관통 영역-4-1BB-CD3ζ,
세포외 항원 결합 영역-CD8 막관통 영역-CD28b-CD3ζ,
세포외 항원 결합 영역-CD28a-CD28b-CD3ζ,
세포외 항원 결합 영역-CD28a-CD28b-4-1BB-CD3ζ,
및 이들의 조합인 순서로 연결된 것으로부터 선택될 수 있되, 여기서, 관련 키메라 항원 수용체 단백질 중 CD28a는 CD28 분자의 막관통 영역을 의미하고, CD28b는 CD28 분자의 세포내 신호 영역을 의미한다. 본 발명은 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산도 포함한다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것으로, 이는 본 발명과 동일한 아미노산 서열을 구비하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 코딩한다.
본 발명은 상기 키메라 항원 수용체의 핵산을 포함하는 전달체를 더 제공한다. 본 발명은 상기 전달체를 포함하는 바이러스를 더 포함한다. 본 발명의 바이러스는 포장 후 감염력을 가지는 바이러스를 포함하고, 감염력을 가지는 바이러스에 필요한 성분으로 포장되는 포장될 바이러스도 포함한다. 본 기술분야 내에서 공지된 외인성 유전자를 면역작용 세포에 형질도입하는데 사용될 수 있는 다른 바이러스 및 이에 대응되는 플라스미드 전달체도 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명은 키메라 항원에 의해 변형된 면역작용 세포를 더 제공하되, 이는 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산이 형질도입되어 있거나 또는 상기 핵산을 함유하는 상기 재조합 플라스미드를 포함하거나 또는 상기 플라스미드를 포함하는 바이러스가 형질도입되어 있다. 본 기술분야에서 통상적인 핵산 형질도입 방법은 비-바이러스 및 바이러스의 형질도입 방법을 포함하되, 이들은 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 비-바이러스 기반의 형질도입 방법은 전기천공법 및 전이인자법을 포함한다. 최근에 Amaxa 회사에서 연구개발한 Nucleofector 핵 형질감염 기기는 외인성 유전자를 세포핵에 직접 도입시켜 목적 유전자를 얻을 수 있는 고효과적 형질도입을 구현한다. 이 밖에, 슬리핑 뷰티 시스템(Sleeping Beauty system) 또는 PiggyBac 전이인자 등 전이인자 시스템 기반의 형질도입 효율은 일반 전기천공에 비해 더욱 향상되었으며, nucleofector 형질감염 기기와 슬리핑 뷰티 전이인자 시스템의 병용은 이미 [Davies JK., et al. Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies. Cancer Res, 2010, 70(10): OF1-10.]에서 보도되었는 바, 상기 방법은 고효과적인 형질도입 효율을 가질 뿐만 아니라 목적 유전자의 사이트 지향 통합(site-directed integration)을 구현할 수도 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 키메라 항원 수용체 유전자에 의해 변형된 T-림프구의 형질도입 방법은 예컨대 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 등 바이러스의 형질도입 방법에 기반된 것이다. 상기 방법은 형질도입 효율이 높고 외인성 유전자가 안정적으로 발현될 수 있으며 체외에서 T-림프구 배양 시 임상 레벨 수량에 도달하는 시간을 단축시키는 등 장점을 구비한다. 상기 유전자 변형 T-림프구 표면에서 형질도입된 핵산은 전사, 번역을 통해 그 표면에 발현된다. 상이하게 배양한 다양한 종양 세포에 대해 치외 세포 독성 실험을 진행하여, 본 발명의 키메라 항원에 의해 변형된 면역작용 세포가 고도의 특이적 종양 세포 살해 효과(세포 독성이라고도 함)를 가지고, 종양 조직에서 효과적으로 생존할 수 있음을 증명하였다. 따라서, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산은 상기 핵산을 포함하는 플라스미드를 포함하고, 상기 플라스미드를 포함하는 바이러스 및 상기 핵산이 형질도입되어 있는 플라스미드 또는 바이러스의 유전자 변형 면역작용 세포는 종양의 면역 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 키메라 항원에 의해 변형된 면역작용 세포는 상기 키메라 수용체를 제외한 다른 키메라 수용체를 더 발현할 수 있고, 상기 수용체는 CD3ζ를 함유하지 않지만 CD28의 세포내 신호 도메인, CD137의 세포내 신호 도메인 또는 이들 양자의 조합을 함유한다.
본 발명의 키메라 항원 수용체에 의해 변형된 면역작용 세포는 약학 조성물 또는 진단 시약의 제조에 응용될 수 있다. 상기 조성물은 유효량의 상기 면역 세포를 포함하는 이외에, 약학적으로 허용 가능한 담체도 포함할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 분자 자체 및 조성물을 동물 또는 인간에 적절히 투여할 경우, 이들이 불리, 과민 또는 다른 부작용을 발생하지 않음을 의미한다.
약학적으로 허용 가능한 담체 또는 이의 조성성분일 수 있는 일부 물질의 구체적인 예는, 유당, 포도당 및 자당 등 당류; 옥수수 전분 및 감자 전분 등 전분; 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스 및 메틸셀룰로오스 등 셀룰로오스 및 이의 유도체; 트라가칸트 분말; 맥아; 젤라틴; 탈크; 스테아르산 및 스테아르산 마그네슘 등 고체 윤활제; 황산 칼슘; 땅콩기름, 면실유, 참기름, 올리브유, 옥수수기름 및 코코아유 등 식물유; 프로필렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 등 폴리올; 알긴산; Tween 등 유화제; 라우릴 황산나트륨 등 습윤제; 착색제; 조미제; 타정제; 안정화제; 항산화제; 방부제; 무열원수; 등장염 용액 및 인산염 완충액 등이다.
본 발명의 조성물은 수요에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 의사에 의해 환자 타입, 연령, 체중 및 대체적인 질환 상황, 투여 방식 등 요소에 따라 환자에 대해 유리한 사용량으로 사용하도록 결정될 수 있다. 투여 방식은 주사 또는 다른 치료 방식을 적용할 수 있다.
본 발명의 장점:
1. 본문에서 제공된 면역작용 세포는 종양 내에서의 상기 면역작용 세포의 증식, 생존 및 기능을 효과적으로 증가시킬 수 있고; 억제성 면역 검사 포인트의 발현을 감소시킴으로써, T 세포의 소모를 완화시킨다.
2. 본문에서 제공된 면역작용 세포는 고형 종양 세포에 대해 더 우수한 살해 효과 및 체외 증폭 기능을 가진다.
아래, 구체적인 실시예와 결부시켜 본 발명을 더 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하지 않음을 이해해야 한다. 하기 실시예에서 구체저인 조건을 주명하지 않은 실험 방법은 일반적으로 Sambrook.J. 등의 편저, 분자 클론 실험 지침서. 제3 판, 과학출판사, 2002에 기재된 통상적인 조건, 또는 제조업체에서 권장하는 조건을 따를 수 있다.
본 발명의 CAR을 포함하는 예시적 항원 수용체, 및 공학 개선 및 수용체를 세포에 도입하는 방법은 예컨대 중국 특허 출원 공개 번호 CN107058354A, CN107460201A, CN105194661A, CN105315375A, CN105713881A, CN106146666A, CN106519037A, CN106554414A, CN105331585A, CN106397593A, CN106467573A, CN104140974A, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2017186121A1 , WO2018006882A1, WO2015172339A8, WO2018/018958A1에서 공개된 내용을 참조할 수 있다.
실시예 1. 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포의 구축
본 실시예에서 claudin 18.2를 CAR-T 세포의 타겟으로 사용하되, 마우스 체내에서의 항종양 효과를 더 정확하게 검증하기 위해, 마우스 유래의 신호 펩티드, 막관통 영역, 세포내 영역 등을 선택한다. 제조 방법은 본 기술분야의 통상적인 CAR-T 세포의 제조 방법에 따라 수행된다.
1. 플라스미드 구축
본 기술분야의 통상적인 분자 생물학 방법을 사용하되, 본 실시예에서 사용된 scFv는 인간 claudin 18.2를 표적화하는 항체이고, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시되며, 사용된 키메라 항원 수용체는 2세대 키메라 항원 수용체이고, mCD8의 막관통 도메인, mCD28의 세포내 도메인 및/또는 m4-1BB 세포내 도메인, 및 mCD3ζ를 구비한다.
1. MSCV.pBABE 5(addgene 회사에서 구매)를 전달체로 사용하여, 2세대 키메라 항원 수용체를 발현하는 레트로바이러스 플라스미드 MSCV-hu8E5(2I)-28Z를 구축한다. hu8E5(2I)-28Z의 핵산 서열은 CD8α신호 펩티드(SEQ ID NO: 3), scFv(SEQ ID NO: 1), mCD8 경첩 영역 및 막관통 영역(SEQ ID NO: 5) 및 mCD28 세포내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 7) 및 mCD3의 세포내 세그먼트 mCD3ζ(SEQ ID NO: 9)를 포함하여 구성한다. hu8E5(2I)-28Z의 플라스미드 구축도는 도 1a에 도시된 바와 같다.
MSCV-hu8E5(2I)-m28Z 플라스미드의 기초상에서 F2A-mIL7-P2A-mCCL21a 또는 F2A-mIL7-P2A-mCCL21b의 유전자를 삽입하여, CAR, IL7 및 CCL21을 발현하는 레트로바이러스 플라스미드 MSCV-hu8E5(2I)-m28Z-F2A-mIL7-P2A-mCCL21a(플라스미드도는 도 1b에 도시된 바와 같음) 및 MSCV-hu8E5(2I)-m28Z-F2A-mIL7-P2A-mCCL21b(플라스미드도는 도 1c에 도시된 바와 같음)를 구축한다.
F2A-mIL7-P2A-mCCL21a는 F2A(SEQ ID NO: 11), mouse IL7(SEQ ID NO: 13)로 구성되고, P2A(SEQ ID NO: 16), mouse CCL21a(SEQ ID NO: 14)로 구성되며; F2A-mIL7-P2A-mCCL21b는 F2A(SEQ ID NO: 11), mouse IL7(SEQ ID NO: 13)로 구성되고, P2A(SEQ ID NO: 16), mouse CCL21b(SEQ ID NO: 15)로 구성된다.
MSCV.pBABE 5를 전달체로 사용하여, 2세대 키메라 항원 수용체를 발현하는 레트로바이러스 플라스미드 MSCV-hu8E5(2I)- mBBZ를 구축한다. hu8E5(2I)-mBBZ 서열은 CD8α 신호 펩티드(SEQ ID NO: 3), scFv(SEQ ID NO: 1), mCD8 hinge 및 막관통 영역(SEQ ID NO: 5) 및 m4-1BB 세포내 신호 전달 도메인(SEQ ID NO: 24) 및 mCD3의 세포내 세그먼트 CD3ζ(SEQ ID NO: 9)로 구성된다. 플라스미드도는 도 1d에 도시된 바와 같다.
MSCV-hu8E5(2I)-mBBZ 플라스미드의 기초상에서 F2A-mIL-7-P2A-mCCL21a, F2A-mIL7-P2A-mCCL21b를 각각 삽입하여, CAR, IL7 및 CCL21을 발현하는 레트로바이러스 플라스미드 MSCV-hu8E5(2I)-mBBZ-F2A-mIL-7-P2A-mCCL21a(플라스미드도는 도 1e에 도시된 바와 같음), MSCV-hu8E5(2I)-mBBZ-F2A-mIL7-P2A-mCCL21b(플라스미드도는 도 1f에 도시된 바와 같음)를 구축한다.
2. MSCV-hu8E5(2I)-m28Z, MSCV-hu8E5(2I)-m28Z-F2A-mIL-7-P2A-mCCL21a, MSCV-hu8E5(2I)-m28Z-F2A-mIL7-P2A-mCCL21b, MSCV-hu8E5(2I)-mBBZ, MSCV-hu8E5(2I)-mBBZ-F2A-mIL-7-P2A-mCCL21a, MSCV-hu8E5(2I)-mBBZ-F2A-mIL7-P2A-mCCL21b를 293T 세포에 각각 형질감염시켜, 레트로바이러스 hu8E5(2I)-28Z, IL7-CCL21a-28Z, IL7-CCL21b-28Z, hu8E5(2I)-BBZ, IL7-CCL21a-BBZ, IL7-CCL21b-BBZ를 얻는다.
3. 마우스 T 세포 추출 및 활성화: C57BL/6 마우스 비장을 박리하여 마우스 T 세포를 추출하고, 배양 및 활성화를 거친 후, 얻은 레트로바이러스 hu8E5(2I)-28Z, IL7-CCL21a-28Z, IL7-CCL21b-28Z, hu8E5(2I)-BBZ, IL7-CCL21a-BBZ, IL7-CCL21b-BBZ를 T 세포에 각각 감염시켜, m28Z CAR-T 세포, m28Z-7*21A CAR-T 세포, m28Z-7*21B CAR-T 세포, mBBZ CAR-T 세포, mBBZ-7*21A CAR-T 세포, 및 mBBZ-7*21B CAR-T 세포를 얻는다.
실시예 2. 체외 시토카인 검출
먼저 마이토마이신 C를 이용하여 마우스 췌장암세포 PANC02(claudin 18.2 발현 음성, ATCC에서 구매) 및 PANC02-A2(claudin 18.2 발현 양성)를 전처리한다(40μg/ml, 37 ℃, 2 ~ 3 h).
2×105 세포/400 μl에 따라 24웰판에 접종하고, 1:1의 감염다중도(multiplicity of infection, MOI)에 따라 Untransduced T 세포(UTD), mBBZ CAR-T 세포, mBBZ- 7*21A CAR-T 세포, mBBZ-7*21B CAR-T 세포를 각각 24웰판에 접종한다. 여기에 표적 세포를 넣지 않은 대조군을 설정하고, 3일 후 세포 상청액을 수집하며, ELISA 키트를 이용하여 각 시토카인 IL7 및 CCL21의 분비 상황을 검출하되, 결과는 도 2에 도시된 바와 같다.
여기서, PANC02-A2 세포인 경우, pwpt-mclaudin 18.2 렌티바이러스를 이용하여 PANC02 세포에 감염시켜 구축한다. pWPT-mclaudin 18.2 플라스미드 구축 과정은, 체외에서 마우스 claudin 18.2 유전자(GeneBank 참조 서열 번호: NM_001194921)를 합성하고, 효소 절단, 연결 방법을 통해 이를 렌티바이러스 발현 전달체 pWPT에 로딩하여 pwpt-mclaudin 18.2 플라스미드를 구축하는 것이다.
실시예 3. 체외 CAR-T 세포 표현형 검출
UTD, mBBZ CAR-T 세포, mBBZ-7*21A CAR-T 세포, mBBZ- 7*21B CAR-T 세포를 취하여 세포 표면 면역 검사 포인트인 PD-1, LAG-3, TIM-3을 검출한다. 먼저, 상이한 CAR-T 세포를 EP 튜브에 각각 수집하고, 각 세포를 각각 3개의 튜브로 나누며, 사전 아이스배스의 유동식 세척액(1 %의 NCS에 PBS를 넣어 조제함)으로 2번 세척하고, 상이한 검출 튜브를 각각 1:50의 비율에 따라 희석하며 BV421 표기된 anti-PD-1 항체, APC 표기된 anti-LAG-3 항체, APC 표기된 anti-TIM-3 항체를 넣고, 얼음에서 45 min 동안 배양하며, 3번 세척한 후 유동식 튜브에 넣고 검출한다. 결과는 도 3a ~ 도 3f에 도시된 바와 같다.
도 3a는 상이한 군의 세포가 PD-1을 발현하는 상황을 나타내되, 결과로부터 알 수 있는 바, mBBZ군의 PD-1의 분비는 30.2 %에 도달하고, mBBZ-7*21A군의 PD-1의 분비는 단지 11.7 %이며, mBBZ-7*21B군의 PD-1의 분비는 단지 9.4 %이고, 도 3b는 PD-1의 발현 강도를 나타내되, 도 3b에 도시된 바와 같이, mBBZ군의 PD-1의 발현은 mBBZ-7*21A군 및 mBBZ-7*21B군보다 높다.
도 3c는 상이한 군의 세포가 LAG-3을 발현하는 상황을 나타내되, 결과로부터 알 수 있는 바, mBBZ군의 LAG-3의 분비는 80.7 %에 도달하고, mBBZ-7*21A군의 LAG-3의 분비는 53.4 %이며, mBBZ-7*21B군의 LAG-3의 분비는 13.7 %이다. 도 3d는 LAG-3의 발현 강도를 나타내되, 도 3d에 도시된 바와 같이, mBBZ군의 LAG-3의 발현은 mBBZ-7*21A군 및 mBBZ-7*21B군보다 높다.
도 3E는 상이한 군의 세포가 TIM-3을 발현하는 상황을 나타내되, 결과로부터 알 수 있는 바, mBBZ군의 TIM-3의 분비는 41.3 %에 도달하고, mBBZ-7*21A군의 TIM-3의 분비는 16.2 %이며, mBBZ-7*21B군의 TIM-3의 분비는 13.2 %이다. 도 3f는 TIM-3의 발현 강도를 나타내되, 도 3f에 도시된 바와 같이, mBBZ군의 TIM-3의 발현은 mBBZ-7*21A군 및 mBBZ-7*21B보다 높다.
상술한 바를 종합하면, mBBZ-7*21A CAR-T 세포 및 mBBZ- 7*21B CAR-T 세포의 PD-1, LAG-3 및 TIM-3의 발현은 모두 mBBZ-CAR-T 세포보다 낮는데, 이는 시토카인 IL7 및 CCL21을 과발현 후 이들의 억제성 면역 검사 포인트의 발현을 감소시킴으로써 T 세포의 소모를 완화시킬 수 있음을 설명한다.
실시예 4. 체외 살해 독성 검출
CytoTox 96 비방사성 세포 독성 검출 키트(Promega 회사)를 사용한다. 구체적인 방법은 CytoTox 96 비방사성 세포 독성 검출 키트 설명서를 참조할 수 있다.
효과기 세포: 3:1, 1:1 또는 1:3의 감염다중도에 따라 UTD 세포, m28Z CAR-T 세포, 28Z-7*21A CAR-T 세포, m28Z-7*21B CAR-T 세포, mBBZ CAR-T 세포, mBBZ- 7*21A CAR-T 세포, mBBZ-7*21B CAR-T 세포를 각각 96웰판에 접종한다.
표적 세포: 50 μL의 2×105/mL의 마우스 췌장암 세포주 PANC02-A2 및 PANC02 세포를 각각 대응되는 96웰판에 접종한다.
각 군에 5개의 중복 웰을 설정한다. 배양 플레이트를 세포 배양기에 놓고 18 h 동안 배양한다.
여기서 각 실험군 및 각 대조군은 하기와 같이 설정한다. 실험군: 각 표적 세포+상이한 CAR-T 세포; 대조군 1: 표적 세포 최대 방출 LDH; 대조군 2: 표적 세포 자발적 방출 LDH; 대조군 3: 효과기 세포 자발적 방출 LDH. 계산 공식: % 세포 독성=[(실험군-효과기 세포 자발군-표적 세포 자발군)/(표적 세포 최대-표적 세포 자발)]×100. 실험 결과는 도 4a 및 4b에 도시된 바와 같다.
도 4a로부터 알 수 있는 바, m28Z CAR-T 세포, m28Z-7*21A CAR-T 세포, 또는 m28Z-7*21B CAR-T 세포는 대조군 UTD에 비해, 3:1 및 1:1의 감염다중도에서 PANC02-A2에 대해 모두 현저한 독성 살해 작용을 일으키고, PANC02 세포에 대해 살해 작용을 일으키지 않는다.
도 4b로부터 알 수 있는 바, mBBZ CAR-T 세포, mBBZ- 7*21A CAR-T 세포, mBBZ-7*21B CAR-T 세포는 대조군 UTD에 비해, 3:1 및 1:1의 감염다중도에서 PANC02-A2에 대해 모두 현저한 독성 살해 작용을 일으키고, PANC02 세포에 대해 살해 작용을 일으키지 않는다.
실시예 5. 체외 증식 검출
마이토마이신 C로 표적 세포인 PANC02-A2 세포(40 μg/ml, 37 ℃, 2 ~3 h)를 처리하고, 효과기 세포인 UTD 세포, mBBZ CAR-T 세포, mBBZ-7*21A CAR-T 세포, mBBZ- 7*21B CAR-T 세포에 대해 각각 CFSE 염색을 진행한 다음, 1:1의 감염다중도(1×106 세포/ml)에 따라 2일 동안 공동배양한다.
유동식 검출로 CAR-T 세포의 증식 상황을 검출하되, 결과는 도 5에 도시된 바와 같이, mBBZ-7*21A CAR-T 세포 및 mBBZ- 7*21B CAR-T 세포는 mBBZ CAR-T 세포에 비해 모두 더욱 신속하게 증식할 수 있다.
실시예 6. PANC02-A2 췌장암 피하 이식 종양 모델 종양 치료
1) 실험 그룹화: 6 ~ 8 주령의 C57BL/6 마우스(상하이 씨푸얼-삐카이 실험동물 유한회사(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)에서 구매함)를 각 그룹에 5 ~ 6 마리씩 랜덤으로 그룹을 나누되, 각각 UTD 세포, mBBZ CAR-T 세포, mBBZ-7*21A CAR-T 세포, mBBZ- 7*21B CAR-T 세포 치료군이다.
2) 피하 이식 종양의 접종: 판크레아틴 소화법으로 대수생장기에 있고 생장 상태가 우수한 PANC02-A2 세포를 수집하고, PBS로 1번 세척한 후, 세포 밀도가 6×106/mL이 되도록 조절하며, C57BL/6 마우스 우측 복부 피하에 200 μL의 세포 현탁액을 주사하는데, 즉 각 마우스에 1.2×106의 종양 세포를 접종하되, 접종일을 0번째 일로 기록한다.
3) CAR-T 세포 재주입(reinfusion): 피하에 종양 세포를 접종한 후 D11일 째 종양 평균 부피는 약 60 mm3이다. 처리하지 않은 T 세포 또는 CAR-T 세포를 주사하되, 주사량은 2.5×106/마리이다.
결과는 도 6에 도시된 바와 같이, CAR-T를 주사한 후 20일 째의 종양 억제율은 각각 mBBZ CAR-T군: 35.5 %, mBBZ-7*21A CAR-T군: 63 %, mBBZ-7*21B CAR-T군: 62.4 %인데, 이는 mBBZ-7*21A CAR-T 세포 및 mBBZ-7*21B CAR-T 세포 치료군의 항종양 효과가 mBBZ CAR-T 세포(P<0.05)보다 우수함을 설명한다.
실시예 7. 상이한 케모카인을 발현하는 종양 살해 비교
본 실시예에서 IL7 및 CCL19를 발현하는 CAR-T 세포(mBBZ-7*19 CAR-T 세포)를 선택하여 대조군으로 사용한다. mBBZ-7*19 CAR-T 세포의 제조는 실시예 1을 참조하여 진행하고, MSCV-hu8E5(2I)-mBBZ 플라스미드의 기초상에서 F2A-mIL7-P2A-mCCL19를 삽입하여, CAR, IL7 및 CCL19를 발현하는 레트로바이러스 플라스미드를 구춥하며, 플라스미드도는 도 7에 도시된 바와 같고, mCCL19의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 34로 표시되며, 플라스미드를 마우스의 T 세포에 감염시켜 mBBZ-7*19 CAR-T 세포를 얻는다.
1). 실시예 6의 조작을 참조하여 마우스의 췌장암 피하 이식 종양 모델을 제작하고, 종양 평균 부피가 약 65 mm3일 경우, mBBZ CAR-T 세포, mBBZ-7*19 CAR-T 세포, mBBZ- 7*21B CAR-T 세포 치료군을 각각 주사하되, 주사량은 2.5×106 세포/마리이며, 종양 살해 효과는 도 8a에 도시된 바와 같고, 종양 억제율은 각각 mBBZ CAR-T군: 22.8 %, mBBZ-7*19 CAR-T군: 32.7 %, mBBZ-7*21B CAR-T군: 76.6 %이므로, mBBZ-7*21B CAR-T 세포 치료군의 항종양 효과는 mBBZ CAR-T 세포 및 mBBZ-7*19 CAR-T 세포군보다 우수하다.
동시에, 각 군의 마우스 체중 변화(도 8b에 도시된 바와 같음)를 검출한 결과, 각 군마우스 사이의 체중은 유의적 차이(ns)가 없으므로, 시토카인의 분비는 마우스에 대해 독성 작용이 없음을 설명한다.
2). 종양 접종 후 31일 째에 마우스를 안락사시키고, 마우스 종양을 박리하여 종량 중량을 칭량하되, 구체적인 통계 결과는 도 8c에 도시된 바와 같다. 결과는 mBBZ-7*21B CAR-T 치료군의 종양 중량이 mBBZ군(P<0.05)보다 현저히 작음을 나타내는데, 이는 키메라 항원 수용체에 의해 변형된 T 세포가 IL7, CCL21을 공동발현하여 체내 종양에 대한 T 세포의 억제를 현저히 증가시킬 수 있음을 설명한다.
3). CAR-T 세포를 재주입한 후, d31일에 실험을 종료할 시 종양 조직을 박리하고, 종양 조직 CAR-T 복제 수를 검출한다.
1 mg의 종양 조직 덩어리를 취하여 기계적으로 연마한 후, QIAamp® genomic DNA kits를 이용하여 종양 중의 DNA를 추출하고, 각 샘플의 농도를 각각 측정한다. 실시간 정량 PCR(qPCR)을 이용하여 CAR 복제 수를 검출한다. 주형 플라스미드에 따라 표준 곡선 제작을 진행하고, 마지막으로 각 샘플 중 CAR의 복제 수를 계산한다.
결과는 도 8d에 도시된 바와 같이, mBBZ-7*21B CAR-T의 CAR-T 복제 수는 비교적 높다.
4). CD8+ 세포의 종양 침윤에 대한 면역 조직 화학 검출
단계 2)에서 안락사시킨 마우스의 종양 조직을 취하여 파라핀 조직 절편을 제조하고, 통상적으로 파라핀을 제거한 후, 표본을 수화 처리하며; 수화 처리한 후 절편을 진탕기에 놓고 PBS으로 3번 세척하며, 구연산 완충액을 끓인 후 조직 절편을 구연산 완충액에 넣고, 항원 열복구를 진행하며; 복구를 완성한 후 1 %의 BSA로 블로킹한다.
블로킹된 절편을 대응되는 CD8a의 항체(anti-mouse CD8αantibody, Cell Signaling에서 구매함) 또는 블랭크 대조 시약에 넣고, 4 ℃에서 하룻밤 배양하며; 0.5 %의 PBST 완충액으로 세척하고; 다음 PBS 완충액으로 세척한다.
세척한 절편을 이차 항체 양-항-토끼(Goat Anti-Rabbit)-HRP에 넣고, 37 ℃에서 1 h 동안 배양한다. 0.5 %의 PBST 완충액으로 2번 세척한 후, PBS 완충액으로 1번 세척하고, DAB(Dako REALTM EnVisionTM Detection System, Peroxidase/DAB+, 1:50로 희석)로 발색한다.
헤마톡실린으로 세포핵에 진홍색이 될 때까지 재염색하고, 재염색한 후의 조직 절편을 1 %의 염산 에탄올 분화액에 넣고 3 ~ 5초 동안 분화하며; 흐르는 수돗물로 20 min 동안 세척한 후 투명해질 때까지 탈수하고; 90 %의 에탄올에 1 min 동안 담그며; 100 %의 에탄올 I에 1 min 동안 담그고; 100 %의 에탄올 II에 1 min 동안 담그며; 자일렌에 3 min 동안 담그고; 중성 나무 진 봉입하며, 바람에 말리운다.
현미경으로 관찰한 결과는 도 8e에 도시된 바와 같이, 비록 mBBZ-7*19군 및 mBBZ-7*21B군의 종양 조직에서 모두 현저한 CD8+ T 세포의 침윤이 발생했지만, 그 중 mBBZ-7*21B CAR-T군의 CD8+ T 세포 침윤이 비교적 많았다.
실시예 8. 마우스의 유방암 정위 이식 종양 모델
마우스의 유방암 피하 이식 종양 모델을 제작하고, 판크레아틴 소화법으로 대수생장기에 있고 생장 상태가 우수한 E0771-A2 세포(제조 방법: pwpt-mclaudin 18.2 플라스미드를 이용하여 렌티바이러스를 포장하여 E0771 세포에 감염시킴)를 수집하며, PBS로 1번 세척한 후, 세포 밀도를 2Х107/mL로 조절하고, C57BL/6 마우스 우측 복부의 네 번째 쌍의 유방 피하에 50 μL의 세포 현탁액을 주사하는데, 즉 각 마우스에 1Х106의 E0771-A2 세포를 접종하되, 접종일을 0번째 일로 기록한다.
CAR-T 세포 재주입: 피하에 종양 세포를 접종한 후 D12일 째 종양 평균 부피는 약 150 mm3이다. 처리하지 않은 T 세포 또는 CAR-T 세포를 주사하되, 주사량은 2.5Х106/마리이다.
3 ~ 4일 간격으로 E0771-A2 이식 종양 부피의 크기를 측정하고, 각 군의 마우스 종양 부피 변화를 기록하되, 결과는 도 9a에 도시된 바와 같이, mBBZ-7*19 CAR-T군에 비해, mBBZ-7*21B CAR-T 치료군의 종양 살해 능력이 현저히 증강되었다.
종양 접종 후 31일 째에 마우스를 안락사시키고, 마우스 종양을 박리하여 종량 중량을 칭량하되, 구체적인 통계 결과는 도 9b에 도시된 바와 같다. 결과는 mBBZ-7*21B CAR-T 치료군의 종양 중량이 mBBZ-7*19 CAR-T군(P<0.05) 및 mBBZ CAR-T군(P<0.001)보다 현저히 작음을 나타내는데, 이는 키메라 항원 수용체에 의해 변형된 T 세포가 IL7, CCL21을 공동발현하여 체내 종양에 대한 T 세포의 억제를 현저히 증가시킬 수 있음을 설명한다.
실시예 7의 단계 3)의 조작을 참조하여 유방암 피하 이식 종양 모델의 CAR-T의 세포 복제를 검출하되, 결과는 도 9c에 도시된 바와 같이, mBBZ-7*19 CAR-T 및 mBBZ-7*21B CAR-T군의 CAR-T 복제 수는 UTD 및 BBZ군보다 높다.
실시예 7의 단계 4)의 조작을 참조하여 CD8+ 세포의 종양 침윤 상황을 검출하되, 결과는 도 9d에 도시된 바와 같이, mBBZ-7*19 CAR-T군 및 mBBZ-7*21B CAR-T군의 종양 조직에서 현저한 CD8+ T 세포의 침윤이 발생하였고, 그 중 mBBZ-7*21B CAR-T군의 CD8+ T 세포 침윤이 비교적 많았다.
실시예 9. 마우스의 간암 피하 이식 종양 모델
마우스의 간암 이식 종양 모델을 제작하고, 판크레아틴 소화법으로 대수생장기에 있고 생장 상태가 우수한 Hepa1-6-A2 세포(pwpt-mclaudin 18.2 플라스미드를 이용하여 렌티바이러스를 포장하여 Hepa1-6 세포에 감염시킴)를 수집하며, PBS로 1번 세척한 후, 세포 밀도를 5Х107/mL로 조절하고, C57BL/6 마우스 우측 복부 피하에 200 μL의 세포 현탁액을 주사하는데, 즉 각 마우스에 1Х107의 Hepal1-6-A2 간암세포를 접종하되, 접종일을 0번째 일로 기록한다.
CAR-T 세포 재주입: 피하에 종양 세포를 접종한 후 D7일 째 종양 평균 부피는 약 300 mm3이다. 처리하지 않은 T 세포 또는 CAR-T 세포를 주사하되, 주사량은 1Х106/마리이다.
3 ~ 4일 간격으로 Hepal1-6-A2 이식 종양 부피의 크기를 측정하고, 각 군의 마우스 종양 부피 변화를 기록하되, 결과는 도 10a에 도시된 바와 같이, mBBZ-7*19 CAR-T군에 비해, mBBZ-7*21B CAR-T 치료군의 종양 살해 능력이 현저히 증강되었다.
종양 접종 후 31일 째에 마우스를 안락사시키고, 마우스 종양을 박리하여 종량 중량을 칭량하되, 구체적인 통계 결과는 도 10b에 도시된 바와 같다. 결과는 mBBZ-7*21B CAR-T 치료군의 종양 중량이 mBBZ-7*19 CAR-T군(p<0.01) 및 8E5-2I-mBBZ CAR-T군(p<0.05)보다 현저히 작음을 나타내는데, 이는 키메라 항원 수용체에 의해 변형된 T 세포가 IL7, CCL21을 공동발현하여 체내 종양에 대한 T 세포의 억제를 현저히 증가시킬 수 있음을 설명한다.
실시예 7의 단계 3)의 조작을 참조하여 CAR-T 세포 복제 수를 검출하되, 결과는 도 10c에 도시된 바와 같이, mBBZ-7*21B CAR-T군의 CAR-T 복제 수는 비교적 높다.
실시예 7의 단계 4)의 조작을 참조하여 CD8+ 세포의 종양 침윤 상황을 검출하되, 결과는 도 10d에 도시된 바와 같이, mBBZ-7*19 CAR-T군 및 mBBZ-7*21B CAR-T군의 종양 조직에서 현저한 CD8+ T 세포의 침윤이 발생하였고, 그 중 mBBZ-7*21B CAR-T의 CD8+ T 세포 침윤이 비교적 많았다.
실시예 10. 체외 IFN-γ 검출
UTD, 8E5-2I-mBBZ-CAR, mBBZ-7*21B CAR-T, 및 mBBZ-7*19 CAR-T를 각각 표적 세포 PANC02-A2와 1:1에 따라 24 h 동안 배양한 후 상청액을 수집한 후 ELISA로 상청액 중 IFN-γ의 분비 수준을 검출한다. 사용된 ELISA 키트는 Žq커(聯科) 생물 mouse IFN-γ 검출 키트이다.
결과는 도 11에 도시된 바와 같이, mBBZ-7*21B CAR-T 세포와 claudin 18.2 양성의 종양 세포를 공동배양한 후 IFN-γ분비가 비교적 많았다.
실시예 11. 마우스 PANC02-A2 췌장암 피하 종양 QingLin 모델의 치료
실시예 6의 조작을 참조하여 C57BL/6 마우스의 PANC02-A2 피하 이식 종양 모델을 제작하고, 접종일을 0번째 일로 기록하며, 종양 접종 후 14일 째 종양 평균 부피는 약 60 mm3이고, 100mg/kg의 시클로포스파미드를 미정맥 주사하며, 종양 접종 후 15일 째에처리하지 않은 T 세포 또는 CAR-T 세포를 주사하되, 주사량은 2.5Х106/마리이다.
3 ~ 4일 간격으로 PANC02-A2 이식 종양 부피의 크기를 측정하고, 각 군의 마우스 종양 부피 변화를 기록하되, 결과는 도 12a에 도시된 바와 같이, 종양 접종 후 38일 째에 마우스를 안락사시키고, 마우스 종양을 박리하여 종량 중량을 칭량하되, 구체적인 통계 결과는 도 12b에 도시된 바와 같다.
실시예 7의 단계 3)의 조작을 참조하여 CAR-T 세포 복제 수를 검출하되, 결과는 도 12c에 도시된 바와 같이, mBBZ-7*19 CAR-T 및 mBBZ-7*21B CAR-T군의 CAR-T 복제 수는 UTD 및 BBZ군보다 높다.
실시예 7의 단계 4)의 조작을 참조하여 CD8+ 세포의 종양 침윤 상황을 검출하되, 결과는 도 12d에 도시된 바와 같이, mBBZ-7*19 CAR-T군 및 mBBZ-7*21B CAR-T군의 종양 조직에서 현저한 CD8+ T 세포의 침윤이 발생하였고, 그 중 mBBZ-7*21B CAR-T군의 CD8+ T 세포 침윤이 비교적 많았다.
실시예 12. 마우스 PANC02-A2 췌장암 피하 종양 모델의 CAR-T 세포 검출 분석
실시예 6의 조작을 참조하여 마우스 췌장암피하 이식 종양 모델을 제작하고, C57BL/6 마우스 우측 복부 피하에 2Х106의 PANC02-A2 췌장암세포를 주사하며, 피하에 종양 세포를 접종한 후 D14일 째 종양 평균 부피는 약 60 mm3이고, 처리하지 않은 T 세포 또는 CAR-T 세포(mBBZ CAR-T 세포, mBBZ-7*21A CAR-T 세포, 및 mBBZ-7*19 CAR-T 세포)를 각각 주사하되, 주사량은 4Х106/마리이다.
1. CAR-T 세포 치료 후 10일 째(d10), 20일 째(d20)의 마우스의 비장, 골수를 각각 추출하여 Tcm(중심 기억성 T 세포)의 함량(각 치료군은 2마리의 마우스를 선택함)을 검출한다. 실험 방법은 하기와 같다.
1) 비장세포 추출: 경추 탈구 방법으로 마우스를 치사시킨 후, 비장을 취하여 깨끗한 2 mL의 튜브 내에 넣고, PBS로 피얼룩을 세척한다. 40 μm의 여과막을 이용하여 연마하여 비장 세포를 얻는다. 400 g의 비장 세포 혼합액을 5 min 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하며, 400 μL의 마우스 적혈구 분해액(1Х)을 넣고, 5 min 동안 정치시키고, 1.5 mL의 PBS에 넣어 반응시키며, 원심분리하고, PBS를 넣어 재현탁시키며, 튜브를 나누어 항체를 배양하고, 항체를 CD8(PerCP), CD44(BV510), CD62L(APC)로 표기한다.
2) 골수 세포 추출: 경추 탈구 방법으로 마우스를 치사시킨 후, 마우스 대퇴골 및 경골을 취하여 근육을 제거하여 깨끗한 2 mL의 튜브 내에 넣고, PBS로 피얼룩을 세척한다. 2 mL의 주사기로 2 mL의 PBS를 뽑아 주사침을 대퇴골 또는 경골 일단을 따라 천자하고, 핀셋으로 고정시키며, 피스톤을 압착하고, 세척하여 골수 세포를 얻는다. 400 g의 세포 혼합액을 5 min 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하며, 400 μL의 마우스 적혈구 분해액(1Х)을 넣고, 5 min 동안 정치시키고, 1.5 mL의 PBS에 넣어 반응시키며, 원심분리하고, PBS를 넣어 재현탁시키며, 튜브를 나누어 항체를 배양하고, 항체를 CD8(PerCP), CD44(BV510), CD62L(APC)로 표기한다.
d10일 째에 비장 중 Tcm의 검출 상황은 도 13a에 도시된 바와 같고, d20일 째에 비장 중 Tcm의 검출 상황은 도 13b에 도시된 바와 같으며, 통상적인 CAR-T에 비해, IL7 및 CCL21을 발현하는 mBBZ-CAR-T 세포군 Tcm의 함량은 현저히 증가되었다.
d10일 째에 골수 중 Tcm의 함량 상황은 도 14a에 도시된 바와 같고, d20일 째에 비장 중 Tcm의 검출 상황은 도 14b에 도시된 바와 같으며, 통상적인 CAR-T에 비해, mBBZ-7*21BCAR-T 치료 후, 골수 중 Tcm의 함량은 현저히 증가되었다.
2. DC 침윤 검출
CAR-T 세포 치료 후 10일 째(d10)에 마우스의 종양 조직을 냉동하여 제조된 절편으로 DC의 침윤을 검출하되, 결과는 도 15에 도시된 바와 같이, mBBZ 세포군에 비해, mBBZ-7*21B 세포군의 마우스 종양 조직에서 더욱 많은 DC세포 침윤이 발생하였다.
3. MDSC(골수 유래의 억제성 세포)의 함량 검출
CAR-T 세포 치료 후 10일 째(d10)의 UTD군, mBBZ군, mBBZ-7*21B군, 및 mBBZ-7*19 CAR-T군의 마우스의 종양 조직을 각각 추출하고, 종양 표면 지방, 혈관, 포막 및 내부 괴사 조직을 제거하며, PBS로 세척하고, 5 mL의 원심분리관에 옮겨 2 mL의 배양액을 넣으며, 종양을 1Х1 mm 정도로 자르고, 배양액을 4.7 mL까지 보충하며 비율에 따라 소화 효소(조직 분리에 사용되는 소화 효소: collagenase type I(0.05 mg/ml), collagenase type IV(0.05mg/ml, hyaluronidase(0.025 mg/ml), DNase I(0.01 mg/ml)를 넣고, 37 ℃에서 30 min 정도(중간에 꺼내서 소화 상황을 관찰함) 진탕하며; 소화 후 현탁하고 70 μm 세포 스크리닝을 통해 50 mL의 튜브(얼음에서 조작함)에 넣으며, 주사기 푸셔로 완전히 소화되지 않은 조직을 가볍게 밀어, 대량(내지 20 mL)의 배양액으로 스크린 메쉬를 세척하고 수집하며, 동시에 소화를 종료하고, 400 g을 8 min 동안 원심분리하며, 4 ℃에서, 상청액을 제거하고, PBS로 세척한 후 튜브를 나누어 항체를 배양하며, CD45+, CD11b+(FITC) 및 Gr-1+(PE)의 세포의 함량, 즉 MDSC의 함량을 검출한다. 실험 결과는 도 16에 도시된 바와 같이, mBBZ군에 비해, mBBZ-7*21B CAR-T 치료 후, 종양 조직 중 MDSC의 함량이 비교적 적다.
예시적으로, 상기 실시예에서 CLD18A2를 표적화하는 CAR-T 세포를 선택하되, 예컨대 GPC3, EGFR, EGFRvIII, CD19, BCMA 등 다른 타겟에 사용되는 CAR-T 세포를 사용하여도 동일한 효과를 가짐을 이해해야 한다. 사용된 항체는 마우스-항인 것일 수 있고, 인간화인 것일 수도 있으며, 사용된 막관통 도메인, 세포내 도메인도 목적에 따라 인간과 같은 상이한 종속의 것을 사용할 수 있다.
예시적으로, 상기 실시예에서 비록 CAR-T 세포를 사용하였지만, 상기 T 세포에는 CAR-T 세포 기능을 증강시키는 다른 시토카인이 발현되어 있을 수도 있는데, 예를 들어, CAR 및 I형 인터페론이 공동발현된 CAR-T 세포, CAR 및 PD-1이 공동발현된 CAR-T 세포 등이다. 예시적으로, 상기 실시예에서 비록 CAR-T 세포를 사용하였지만, NK 세포, NK-T 세포와 같은 다른 면역 세포를 선택할 수도 있고, 구체적으로 γ/δT 세포와 같은 면역 세포의 특정 아형(subtype)을 선택할 수도 있다.
본 발명에서 사용된 서열은 하기 표와 같이 총괄된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
본 발명에서 언급한 모든 문헌은 각 문헌이 단독으로 참조로서 본원 발명에 인용되는 것과 같이 모두 참조로서 본원 발명에 인용된다. 이 밖에, 본 발명의 상기 내용을 열독한 후, 본 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 대해 다양한 변형 또는 수정을 진행할 수 있고, 이러한 등가 형태는 마찬가지로 본원 발명에 첨부된 특허청구범위에 한정된 범위에 속함을 이해해야 한다.
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SHANGHAI CANCER INSTITUTE <120> GENETICALLY ENGINEERED CELL AND APPLICATION THEREOF <130> PIPB204396CN <150> CN201810463564.7 <151> 2018-05-15 <150> CN201811088090.9 <151> 2018-09-18 <150> CN201811552806.6 <151> 2018-12-19 <150> CN201910151930.X <151> 2019-02-28 <160> 35 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu8E5-2I scFV Nucleic acid sequence <400> 1 caggtgcagc tgcaggagag cggccccggc ctgatcaagc ccagccagac cctgagcctg 60 acctgcaccg tgagcggcgg cagcatcagc agcggctaca actggcactg gatccggcag 120 ccccccggca agggcctgga gtggatcggc tacatccact acaccggcag caccaactac 180 aaccccgccc tgcggagccg ggtgaccatc agcgtggaca ccagcaagaa ccagttcagc 240 ctgaagctga gcagcgtgac cgccgccgac accgccatct actactgcgc ccggatctac 300 aacggcaaca gcttccccta ctggggccag ggcaccaccg tgaccgtgag cagcggtgga 360 ggcggttcag gcggaggtgg ttctggcggt ggcggatcgg acatcgtgat gacccagagc 420 cccgacagcc tggccgtgag cctgggcgag cgggccacca tcaactgcaa gagcagccag 480 agcctgttca acagcggcaa ccagaagaac 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Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val 50 55 60 Asn Ile Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val 65 70 75 80 Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr 85 90 95 Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly 100 105 110 Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys 115 120 125 Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Val Tyr Arg Glu Gly Ala Asn 130 135 140 Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val 145 150 155 160 Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn 165 170 175 Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln 180 185 190 Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile 195 200 205 Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr 210 215 220 Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro 225 230 235 240 Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu 245 250 255 Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val 260 265 270 Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys 275 280 285 Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu 290 295 300 Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val 305 310 315 320 Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu 325 330 335 Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu 340 345 350 Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser 370 375 380 Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val 385 390 395 400 Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro 405 410 415 Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala 420 425 430 Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala 435 440 445 Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln 450 455 <210> 20 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human CCL21 nucleic acid sequence <400> 20 atggctcagt cactggctct gagcctcctt atcctggttc tggcctttgg catccccagg 60 acccaaggca gtgatggagg ggctcaggac tgttgcctca agtacagcca aaggaagatt 120 cccgccaagg ttgtccgcag ctaccggaag caggaaccaa gcttaggctg ctccatccca 180 gctatcctgt tcttgccccg caagcgctct caggcagagc tatgtgcaga cccaaaggag 240 ctctgggtgc agcagctgat gcagcatctg gacaagacac catccccaca gaaaccagcc 300 cagggctgca ggaaggacag gggggcctcc aagactggca agaaaggaaa gggctccaaa 360 ggctgcaaga ggactgagcg gtcacagacc cctaaagggc catag 405 <210> 21 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CCL21 amino acid sequence <400> 21 Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe 1 5 10 15 Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys 20 25 30 Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr 35 40 45 Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe 50 55 60 Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu 65 70 75 80 Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro 85 90 95 Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr 100 105 110 Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser 115 120 125 Gln Thr Pro Lys Gly Pro 130 <210> 22 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Claudin18.2 amino acid sequence <400> 22 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 23 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Claudin18.1 amino acid sequence <400> 23 Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 24 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse4-1BB intracellular domain nucleic acid sequence <400> 24 aaatggatca ggaaaaaatt cccccacata ttcaagcaac catttaagaa gaccactgga 60 gcagctcaag aggaagatgc ttgtagctgc cgatgtccac aggaagaaga aggaggagga 120 ggaggctatg agctg 135 <210> 25 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse4-1BB intracellular domain amino acid sequence <400> 25 Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln Pro Phe Lys 1 5 10 15 Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser Cys Arg Cys 20 25 30 Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu 35 40 45 <210> 26 <211> 473 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu8E5-28ZCAR amino acid sequence (human) <400> 26 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ile Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Asn Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile His Tyr Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu 50 55 60 Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Tyr Asn Gly Asn Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 130 135 140 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 180 185 190 Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 245 250 255 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 260 265 270 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 275 280 285 Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala 290 295 300 Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg 305 310 315 320 Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 325 330 335 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 340 345 350 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 355 360 365 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 370 375 380 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 385 390 395 400 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln 405 410 415 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 420 425 430 Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 435 440 445 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 450 455 460 Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 465 470 <210> 27 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hu8E5-BBZCAR amino acid sequence (human) <400> 27 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ile Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Asn Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile His Tyr Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu 50 55 60 Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Tyr Asn Gly Asn Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 130 135 140 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 180 185 190 Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 245 250 255 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 260 265 270 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 275 280 285 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 290 295 300 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 305 310 315 320 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 325 330 335 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 340 345 350 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 355 360 365 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 370 375 380 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 385 390 395 400 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 405 410 415 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 420 425 430 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 435 440 445 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 450 455 460 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 465 470 <210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD8 alpha signal peptide amino acid sequence <400> 28 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 29 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanCD8 hinge region amino acid sequence <400> 29 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 30 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD28 Transmembrane amino acid sequence <400> 30 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 31 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD28 intracellular domain amino acid sequence <400> 31 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 32 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BB intracellular domain amino acid sequence <400> 32 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 33 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> intracellular segment CD3 xi amino acid sequence of human CD3 <400> 33 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 100 105 110 Arg <210> 34 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse CCL19 nucleic acid sequence <400> 34 atggcccccc gtgtgacccc actcctggcc ttcagcctgc tggttctctg gaccttccca 60 gccccaactc tggggggtgc taatgatgcg gaagactgct gcctgtctgt gacccagcgc 120 cccatccctg ggaacatcgt gaaagccttc cgctaccttc ttaatgaaga tggctgcagg 180 gtgcctgctg ttgtgttcac cacactaagg ggctatcagc tctgtgcacc tccagaccag 240 ccctgggtgg atcgcatcat ccgaagactg aagaagtctt ctgccaagaa caaaggcaac 300 agcaccagaa ggagccctgt gtct 324 <210> 35 <211> 515 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 28BBZ amino acid sequence <400> 35 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ile Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Asn Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile His Tyr Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ala Leu 50 55 60 Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Tyr Asn Gly Asn Ser Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu 130 135 140 Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Phe Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr 180 185 190 Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 195 200 205 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 245 250 255 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 260 265 270 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 275 280 285 Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala 290 295 300 Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg 305 310 315 320 Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 325 330 335 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 340 345 350 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 355 360 365 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu 370 375 380 Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys 385 390 395 400 Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 405 410 415 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 420 425 430 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 435 440 445 Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 450 455 460 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 465 470 475 480 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 485 490 495 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 500 505 510 Pro Pro Arg 515

Claims (40)

  1. 유전자 조작된 세포로서,
    상기 세포는 표적 항원에 특이적으로 결합되는 외인성 수용체 및 외인성 CCL21을 발현하고; 바람직하게, 상기 세포 증식을 촉진하는 단백질을 더 발현하며; 더 바람직하게, 상기 세포 증식을 촉진하는 단백질은 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7인 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 IL-7R 결합 단백질은 외인성 IL-7R 결합 단백질이고, 상기 외인성 IL-7R 결합 단백질은 IL-7R에 특이적으로 결합할 수 있으며 IL-7R 활성을 증강시키고;
    바람직하게, 상기 외인성 IL-7R의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 것을 특징으로 하는 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 외인성 CCL21은 천연 CCL21, 또는 천연 CCL21과 동일한 기능을 가지는 천연 CCL21의 절단 단편 또는 천연 CCL21의 돌연변이체이고;
    바람직하게, 상기 천연 CCL21은 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열의 절단 단편이거나; 또는 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열의 절단 단편인 것을 특징으로 하는 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 CCL21은 구성적 발현(constitutive expression)되는 것을 특징으로 하는 세포.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 CCL21은 유도적 발현되고; 바람직하게, 상기 유도적 발현(inducible expression)은 면역 세포 유도성 프로모터를 통해 개시되며, 더 바람직하게, 상기 면역 세포 유도성 프로모터는 NFAT 프로모터인 것을 특징으로 하는 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 IL-7은 천연 IL-7, 또는 천연 IL-7과 동일한 기능을 가지는 천연 IL-7의 절단 단편 또는 천연 IL-7의 돌연변이체이고;
    바람직하게, 상기 천연 IL-7은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열의 절단 단편이거나; 또는 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열의 절단 단편인 것을 특징으로 하는 세포.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7은 구성적 발현되는 것을 특징으로 하는 세포.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7은 유도적 발현되고; 바람직하게, 상기 유도적 발현은 면역 세포 유도성 프로모터를 통해 개시되며; 더 바람직하게, 상기 면역 세포 유도성 프로모터는 NFAT 프로모터인 것을 특징으로 하는 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 면역작용 세포고;
    바람직하게, 상기 면역작용 세포는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포이며;
    더 바람직하게, 상기 면역작용 세포는 T 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 표적 항원은 종양 항원 및/또는 병원체 항원을 포함하고; 바람직하게, 종양 항원인 것을 특징으로 하는 세포.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 표적 항원은 고형 종양 항원이고;
    바람직하게, 상기 고형 종양 항원은 GPC3, EGFR 또는 클라우딘 18.2(Claudin18.2)이며, 더 바람직하게, 상기 고형 종양 항원은 Claudin18.2인 것을 특징으로 하는 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 수용체는 키메라 수용체이고, 표적 항원에 특이적으로 결합되는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 외인성 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR), 변형된 T 세포(항원) 수용체(TCR), T 세포 융합 단백질(TFP), T 세포 항원 커플러(TAC) 또는 이들의 조합으로부터 선택되고;
    바람직하게, 상기 외인성 수용체는 키메라 항원 수용체인 것을 특징으로 하는 세포.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는,
    (i) 표적 항원에 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, CD28의 공동자극 신호 도메인 및 CD3ζ; 또는
    (ii) 표적 항원에 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, 4-1BB의 공동자극 신호 도메인 및 CD3ζ; 또는
    (iii) 표적 항원에 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 단편, CD28 또는 CD8의 막관통 도메인, CD28의 공동자극 신호 도메인, 4-1BB의 공동자극 신호 도메인 및 CD3ζ를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 외인성 수용체의 항원 결합 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 세포.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 외인성 수용체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 또는 SEQ ID NO: 35로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 세포.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 수용체, 및/또는 외인성 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7, 및/또는 외인성 CCL21은 바이러스 전달체를 이용하여 발현되고;
    바람직하게, 상기 바이러스 전달체는 렌티바이러스(lentivirus) 전달체, 레트로바이러스(retrovirus) 전달체 또는 아데노바이러스(adenovirus) 전달체를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  18. 발현 구성물로서,
    상기 발현 구성물은 순차적으로 연결된 표적 항원에 특이적으로 결합되는 외인성 수용체의 발현 카세트 1, 외인성 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7의 발현 카세트 2, 및 외인성 CCL21의 발현 카세트 3을 포함하고; 바람직하게, 상기 발현 카세트 사이는 F2A, P2A, T2A, 및/또는 E2A로부터 선택된 직렬 단편에 의해 선택적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 발현 구성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 발현 카세트 2는 SEQ ID NO: 17로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 구성물.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 발현 카세트 3은 SEQ ID NO: 20으로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 구성물.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 발현 구성물을 포함하는 발현 전달체.
  22. 제21항에 따른 발현 전달체를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스.
  23. 개체에서의 키메라 수용체를 발현하는 면역작용 세포의 활성을 향상시키는 방법으로서,
    상기 면역작용 세포에서 외인성 CCL21, 외인성 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7을 공동발현하고; 바람직하게, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 외인성 IL-7R 결합 단백질은 IL-7R에 특이적으로 결합할 수 있으며 IL-7R 활성을 증강시키고;
    바람직하게, 상기 외인성 IL-7R의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    상기 외인성 CCL21은 천연 CCL21, 또는 천연 CCL21과 동일한 기능을 가지는 천연 CCL21의 절단 단편 또는 천연 CCL21의 돌연변이체이고;
    바람직하게, 상기 천연 CCL21은 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열의 절단 단편이거나; 또는 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열의 절단 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 CCL21은 구성적 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 CCL21은 유도적 발현되고; 바람직하게, 상기 유도적 발현은 면역 세포 유도성 프로모터를 통해 개시되며; 더 바람직하게, 상기 면역 세포 유도성 프로모터는 NFAT 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 IL-7은 천연 IL-7, 또는 천연 IL-7과 동일한 기능을 가지는 천연 IL-7의 절단 단편 또는 천연 IL-7의 돌연변이체이고;
    바람직하게, 상기 IL-7은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열의 절단 단편이거나; 또는 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열의 절단 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7은 구성적 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 IL-7R 결합 단백질 또는 외인성 IL-7은 유도적 발현되고; 바람직하게, 상기 유도적 발현은 면역 세포 유도성 프로모터를 통해 개시되며; 더 바람직하게, 상기 면역 세포 유도성 프로모터는 NFAT 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역작용 세포는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 종양을 억제하거나 병원체를 억제하는 약물의 제조에서, 바람직하게, 종양을 억제하는 약물의 제조에서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 세포, 또는 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 발현 구성물, 또는 제21항에 따른 발현 전달체, 또는 제22항에 따른 바이러스의 용도.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 제조된 종양을 억제하는 약물과 화학 치료 약물을 병용하는 것을 특징으로 하는 용도.
  34. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  35. 키트로서,
    키트 A 및 키트 B를 포함하되, 상기 키트 A는 유전자 조작된 세포를 포함하고, 상기 세포는 표적 항원에 특이적으로 결합되는 외인성 수용체를 발현하며; 상기 키트 B는 CCL21, 및/또는, 상기 세포 증식을 촉진하는 단백질을 포함하고; 바람직하게, 상기 세포 증식을 촉진하는 단백질은 IL-7R 결합 단백질 또는 IL-7이며; 더 바람직하게, 상기 키트 A 및 키트 B는 선후 순서와 상관없이 사용되는 키트.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 IL-7R 결합 단백질은 IL-7R에 특이적으로 결합될 수 있고 IL-7R 활성을 증강시키며; 바람직하게, 상기 외인성 IL-7R의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 것을 특징으로 하는 키트.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서,
    상기 CCL21은 천연 CCL21, 또는 천연 CCL21과 동일한 기능을 가지는 천연 CCL21의 절단 단편 또는 천연 CCL21의 돌연변이체이고;
    바람직하게, 상기 천연 CCL21은 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 21로 표시되는 아미노산 서열의 절단 단편이거나; 또는 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열의 절단 단편인 것을 특징으로 하는 키트.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL-7은 천연 IL-7, 또는 천연 IL-7과 동일한 기능을 가지는 천연 IL-7의 절단 단편 또는 천연 IL-7의 돌연변이체이고;
    바람직하게, 상기 천연 IL-7은 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 18로 표시되는 아미노산 서열의 절단 단편이거나; 또는 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열과 적어도 90 %의 상동성을 가지거나, 또는 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열의 절단 단편인 것을 특징으로 하는 키트.
  39. 제35항에 있어서,
    상기 키트 A는 키메라 수용체에 의해 변형된 면역작용 세포를 포함하고;
    바람직하게, 상기 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체인 것을 특징으로 하는 키트.
  40. 제35항에 있어서,
    상기 면역작용 세포는 T 세포, NK 세포 또는 NKT 세포인 것을 특징으로 하는 키트.
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