CN114805596B - 一种以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

一种以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体及其应用。所述嵌合抗原受体包括RUNX3转录因子、抗原结合区、跨膜区和胞内信号激活区，所述抗原结合区为磷脂酰肌醇聚糖3结合区，所述RUNX3转录因子连接在所述抗原结合区的氨基端。本发明的嵌合抗原受体中，所述磷脂酰肌醇聚糖3结合区和胞内信号激活区能够使得嵌合抗原受体免疫细胞靶向结合肿瘤细胞，并激活其进行杀伤肿瘤细胞；所述RUNX3转录因子能够增强嵌合抗原受体免疫细胞的杀伤能力，并抑制嵌合抗原受体免疫细胞的耗竭；因此，使得嵌合抗原受体免疫细胞实现靶向高效杀伤肿瘤细胞的效果。

Description

一种以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)是一种是通过回输病人自体经过修饰的T细胞，特异性杀伤肿瘤的疗法。在人体临床试验中，科学家们通过一种类似透析的过程提取出病人体内的T细胞，并将编码嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)的基因导入T细胞，CAR能够识别靶细胞，使得T细胞具备识别靶细胞的能力，T细胞利用它们表达的CAR结合靶细胞表面上的分子，进而发挥杀伤效果。近年来，CAR-T除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外，经改进后，也被用来治疗实体瘤、自身免疫疾病、HIV感染和移植排斥等疾病，具有更广阔的应用空间。
磷脂酰肌醇聚糖3(Glypican-3，GPC3)是一种硫酸肝素蛋白聚糖，主要在原发性肝癌细胞(Hepatocellular Carcinoma，HCC)和肝母细胞癌细胞(hepatoblastoma)中表达，在正常肝组织中不表达或表达量很低，被认为是一种肝癌标志物。在针对肝癌的CAR-T疗法中，GPC3可作为靶点，如Gao et al.等首次开发了靶向GPC3的第一代和第三代CAR-T细胞，证实靶向GPC3的CAR-T细胞能够有效的裂解四种GPC3阳性的HCC细胞系(HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5和Huh7)，并进一步验证第三代靶向GPC3的CAR-T细胞能够有效清除小鼠体内GPC3高表达的HCC异种移植物，同时能有效抑制GPC3低表达的HCC异种移植物(参见Gao,H.,K.Li,H.Tu,X.Pan,H.Jiang,B.Shi,J.Kong,H.Wang,S.Yang,J.Gu,and Z.Li.2014.Developmentof T cells redirected to glypican-3for the treatment of hepatocellularcarcinoma.Clinical cancer research:an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research 20:6418-6428.)。
然而，现有技术中以GPC3为靶点的CAR-T细胞仍存在稳定性差、杀伤效果差以及脱靶效应等问题，因此提供一种有效的以GPC3为靶点的CAR，使得含有其的重组T细胞能够在血液中长效稳定存在，同时抵抗肿瘤微环境的影响，实现高效特异性杀伤肿瘤细胞的效果，对于肿瘤治疗领域具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体及其应用，所述以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体能够提高嵌合抗原受体免疫细胞的体外杀伤效果、增强嵌合抗原受体免疫细胞的活化、抑制嵌合抗原受体免疫细胞耗竭以及增强嵌合抗原受体免疫细胞的持续杀伤能力，从而增强嵌合抗原受体免疫细胞的体内抗肿瘤效果。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括共表达的RUNX3转录因子、抗原结合区、跨膜区和胞内信号激活区，所述抗原结合区为磷脂酰肌醇聚糖3结合区，所述RUNX3转录因子连接在所述抗原结合区的氨基端。
本发明的嵌合抗原受体中，所述磷脂酰肌醇聚糖3结合区能够靶向性结合肿瘤细胞膜上的磷脂酰肌醇聚糖3，并通过胞内信号激活区激活嵌合抗原受体免疫细胞进行杀伤肿瘤细胞；所述共表达的RUNX3转录因子既可以发挥转录激活作用，也可以发挥转录抑制作用，在免疫细胞发育、激活、分化和耗竭抑制中均发挥重要作用，增强嵌合抗原受体免疫细胞的杀伤能力，并降低PD1和LAG3的表达，从而抑制嵌合抗原受体免疫细胞的耗竭；因此，使得嵌合抗原受体免疫细胞实现靶向高效杀伤肿瘤细胞的效果。
优选地，所述RUNX3转录因子包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:1：
MASNSIFDSFPTYSPTFIRDPSTSRRFTPPSPAFPCGGGGGKMGENSGALSAQAAVGPGGRARPEVRSMVDVLADHAGELVRTDSPNFLCSVLPSHWRCNKTLPVAFKVVALGDVPDGTVVTVMAGNDENYSAELRNASAVMKNQVARFNDLRFVGRSGRGKSFTLTITVFTNPTQVATYHRAIKVTVDGPREPRRHRQKLEDQTKPFPDRFGDLERLRMRVTPSTPSPRGSLSTTSHFSSQPQTPIQGTSELNPFSDPRQFDRSFPTLPTLTESRFPDPRMHYPGAMSAAFPYSATPSGTSISSLSVAGMPATSRFHHTYLPPPYPGAPQNQSGPFQANPSPYHLYYGTSSGSYQFSMVAGSSSGGDRSPTRMLASCTSSAASVAAGNLMNPSLGGQSDGVEADGSHSNSPTALSTPGRMDEAVWRPY。
优选地，所述磷脂酰肌醇聚糖3结合区包括抗GPC3单链抗体。
优选地，所述抗GPC3单链抗体包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2：
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNANTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSS。
优选地，所述跨膜区包括CD8α跨膜区。
优选地，所述CD8α跨膜区包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。
优选地，所述胞内信号激活区包括4-1BB和CD3ζ。
优选地，所述4-1BB包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
优选地，所述CD3ζ包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5：
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
优选地，所述嵌合抗原受体由共表达的RUNX3转录因子、CD8α信号肽、GPC3单链抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB和CD3ζ串联组成。
优选地，所述嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6：
MASNSIFDSFPTYSPTFIRDPSTSRRFTPPSPAFPCGGGGGKMGENSGALSAQAAVGPGGRARPEVRSMVDVLADHAGELVRTDSPNFLCSVLPSHWRCNKTLPVAFKVVALGDVPDGTVVTVMAGNDENYSAELRNASAVMKNQVARFNDLRFVGRSGRGKSFTLTITVFTNPTQVATYHRAIKVTVDGPREPRRHRQKLEDQTKPFPDRFGDLERLRMRVTPSTPSPRGSLSTTSHFSSQPQTPIQGTSELNPFSDPRQFDRSFPTLPTLTESRFPDPRMHYPGAMSAAFPYSATPSGTSISSLSVAGMPATSRFHHTYLPPPYPGAPQNQSGPFQANPSPYHLYYGTSSGSYQFSMVAGSSSGGDRSPTRMLASCTSSAASVAAGNLMNPSLGGQSDGVEADGSHSNSPTALSTPGRMDEAVWRPYTSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPRRAMALPVTALLLPLALLLHAARPDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNANTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子包括第一方面所述的以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体的编码基因。
优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO:7所示的核酸序列。
SEQ ID NO:7：
atggcatcgaacagcatcttcgactccttcccgacctactcgccgaccttcatccgcgacccaagcaccagccgccgcttcacacctccctccccggccttcccctgcggcggcggcggcggcaagatgggcgagaacagcggcgcgctgagcgcgcaggcggccgtggggcccggagggcgcgcccggcccgaggtgcgctcgatggtggacgtgctggcggaccacgcaggcgagctcgtgcgcaccgacagccccaacttcctctgctccgtgctgccctcgcactggcgctgcaacaagacgctgcccgtcgccttcaaggtggtggcattgggggacgtgccggatggtacggtggtgactgtgatggcaggcaatgacgagaactactccgctgagctgcgcaatgcctcggccgtcatgaagaaccaggtggccaggttcaacgaccttcgcttcgtgggccgcagtgggcgagggaagagtttcaccctgaccatcactgtgttcaccaaccccacccaagtggcgacctaccaccgagccatcaaggtgaccgtggacggaccccgggagcccagacggcaccggcagaagctggaggaccagaccaagccgttccctgaccgctttggggacctggaacggctgcgcatgcgggtgacaccgagcacacccagcccccgaggctcactcagcaccacaagccacttcagcagccagccccagaccccaatccaaggcacctcggaactgaacccattctccgacccccgccagtttgaccgctccttccccacgctgccaaccctcacggagagccgcttcccagaccccaggatgcattatcccggggccatgtcagctgccttcccctacagcgccacgccctcgggcacgagcatcagcagcctcagcgtggcgggcatgccggccaccagccgcttccaccatacctacctcccgccaccctacccgggggccccgcagaaccagagcgggcccttccaggccaacccgtccccctaccacctctactacgggacatcctctggctcctaccagttctccatggtggccggcagcagcagtgggggcgaccgctcacctacccgcatgctggcctcttgcaccagcagcgctgcctctgtcgccgccggcaacctcatgaaccccagcctgggcggccagagtgatggcgtggaggccgacggcagccacagcaactcacccacggccctgagcacgccaggccgcatggatgaggccgtgtggcggccctacactagtggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctaggcgcgccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatgccaacacctatttacattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctataaagtttccaaccgattttctggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgctctcaaaatacacatgttcctcctacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaacgtggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgcaggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccgactatgaaatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagctcttgatcctaaaactggtgatactgcctacagtcagaagttcaagggcagagtcacgctgaccgcggacgaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtacaagattctactcctatacttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa。
第三方面，本发明提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包括第二方面所述的核酸分子。
优选地，所述重组表达载体为含有第二方面所述的核酸分子的病毒载体或质粒载体。
第四方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒含有第二方面所述的核酸分子。
第五方面，本发明提供一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达第一方面所述的以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体。
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞的基因组中整合有第二方面所述的核酸分子。
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞含有第三方面所述的重组表达载体。
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括嵌合抗原受体T细胞。
第六方面，本发明提供一种第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞的制备方法，所述制备方法包括将第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的重组表达载体导入宿主细胞中，获得嵌合抗原受体免疫细胞。
优选地，所述宿主细胞包括T细胞。
优选地，所述导入的方法包括电转导、病毒载体系统、非病毒载体系统或基因枪注射中的任意一种。
第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组表达载体、第四方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第八方面，本发明提供如第一方面所述的以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重组表达载体、第四方面所述的重组慢病毒、第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞或第七方面所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述抗肿瘤药物有效降低PD1和/或LAG3的表达。
优选地，所述抗肿瘤药物有效抑制嵌合抗原受体T细胞的耗竭。
优选地，所述肿瘤为肝癌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的嵌合抗原受体中，所述磷脂酰肌醇聚糖3结合区和胞内信号激活区能够使得嵌合抗原受体免疫细胞靶向结合肿瘤细胞并激活其进行杀伤肿瘤细胞；所述共表达的RUNX3转录因子增强嵌合抗原受体免疫细胞的杀伤能力，并抑制嵌合抗原受体免疫细胞的耗竭；因此，使得嵌合抗原受体免疫细胞实现靶向高效杀伤肿瘤细胞的效果；
(2)本发明在T细胞中共表达嵌合抗原受体和RUNX3转录因子，能够提高嵌合抗原受体T细胞的体外杀伤能力、增强CD8+嵌合抗原受体T细胞的活化、抑制嵌合抗原受体T细胞的耗竭、增强嵌合抗原受体T细胞的持续杀伤能力以及提高嵌合抗原受体T细胞的体内抗肿瘤效果。
附图说明
图1为实施例1嵌合抗原受体结构模式图；
图2为流式分析实施例1嵌合抗原受体T细胞表达嵌合抗原受体结果；
图3为对比例1嵌合抗原受体结构模式图；
图4为流式分析对比例1嵌合抗原受体T细胞表达嵌合抗原受体结果；
图5为嵌合抗原受体T细胞体外杀伤靶细胞结果；
图6A为流式分析嵌合抗原受体T细胞的CD69表达结果；
图6B为流式分析嵌合抗原受体T细胞的CD25表达结果；
图7A为流式分析嵌合抗原受体T细胞的PD1表达结果；
图7B为流式分析嵌合抗原受体T细胞的LGA3表达结果；
图8为嵌合抗原受体T细胞持续杀伤靶细胞结果；
图9A为小鼠肿瘤体积变化图；
图9B为小鼠体重变化图；
图9C为小鼠生存率变化图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达的以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体(RUNX3-GPC3-BBZ)的基因序列如SEQ ID NO:7所示，结构如图1所示。
所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法包括以下步骤：
(1)病毒制备：首先构建RUNX3-GPC3-BBZ慢病毒载体CJ-RUNX3-GPC3-BBZ，然后在293T细胞中用psPAX2(Addgene)和pMD2.G(Addgene)三质粒系统包装慢病毒，并对慢病毒进行浓缩纯化，随后感染293T细胞测试病毒滴度(Titer)，病毒滴度计算公式：Titer(TU/mL)＝(铺板时细胞数目×阳性细胞数目百分数×1000)/(加入病毒液体积(μL))，病毒制备好后，置于-80℃保存备用；
(2)T细胞分选和活化：首先使用淋巴细胞分离液(LTS10770015，天津TBD)离心分离外周血单个核细胞(PBMC)，然后使用CD4(130-045-101，美天旎)和CD8磁珠(130-045-201，美天旎)(1:1)分选CD4+和CD8+T细胞，将分选后的T细胞加入X-VIVO完全培养基中，调整细胞密度为1×106个细胞/mL，加入T75培养瓶中，并按体积比为1:100(1mL完全培养基加入10μL分子复合物)加入CD3和CD28分子复合物(T Cell TransAct，human，130-111-160，美天旎)，摇匀细胞，将细胞放入培养箱中培养，每日定期观察细胞状态，48h后进行补液；
(3)慢病毒感染T细胞：将病毒与细胞按感染复数MOI＝15混合进行感染T细胞，感染48h后，收集细胞，通过流式细胞仪检测嵌合抗原受体T细胞表面嵌合抗原受体的表达，结果如图2所示，嵌合抗原受体T细胞能够在细胞表面有效表达嵌合抗原受体，表达率为17.3％。
对比例1
本实施例提供一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达的以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体(GPC3-BBZ)的基因序列如SEQ ID NO:8所示，结构如图3所示。
SEQ ID NO:8：
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatgccaacacctatttacattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctataaagtttccaaccgattttctggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgctctcaaaatacacatgttcctcctacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaacgtggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgcaggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccgactatgaaatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagctcttgatcctaaaactggtgatactgcctacagtcagaagttcaagggcagagtcacgctgaccgcggacgaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtacaagattctactcctatacttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。
所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法包括以下步骤：
(1)病毒制备：首先构建GPC3-BBZ慢病毒载体CJ-GPC3-BBZ，然后在293T细胞中用psPAX2(Addgene)和pMD2.G(Addgene)三质粒系统包装慢病毒，并对慢病毒进行浓缩纯化，随后感染293T细胞测试病毒滴度，病毒滴度计算公式：Titer(TU/mL)＝(铺板时细胞数目×阳性细胞数目百分数×1000)/(加入病毒液体积(μL))，病毒制备好后，置于-80℃保存备用；
(2)T细胞分选和活化：首先使用淋巴细胞分离液(LTS10770015，天津TBD)离心分离外周血单个核细胞(PBMC)，然后使用CD4(130-045-101，美天旎)和CD8磁珠(130-045-201，美天旎)(1:1)分选CD4+和CD8+T细胞，将分选后的T细胞加入X-VIVO完全培养基中，调整细胞密度为1×106个细胞/mL，加入T75培养瓶中，并按体积比为1:100(1mL完全培养基加入10μL分子复合物)加入CD3和CD28分子复合物(T Cell TransAct，human，130-111-160，美天旎)，摇匀细胞，将细胞放入培养箱中培养，每日定期观察细胞状态，48h后进行补液；
(3)慢病毒感染T细胞：将病毒与细胞按感染复数MOI＝15混合进行感染T细胞，感染48h后，收集细胞，通过流式细胞仪检测嵌合抗原受体T细胞表面嵌合抗原受体的表达，结果如图4所示，嵌合抗原受体T细胞能够在细胞表面有效表达嵌合抗原受体，表达率为61.5％。
试验例1嵌合抗原受体T细胞体外杀伤能力分析
对实施例1和对比例1制备的嵌合抗原受体T细胞的体外杀伤能力进行分析。
按3.5:1的效靶比将实施例1和对比例1制备的嵌合抗原受体T细胞分别与靶细胞Huh7共孵育18h，以普通T细胞与靶细胞Huh7共孵育作为对照组(CTRL)，检测细胞培养上清的乳酸脱氢酶(LDH)含量并计算杀伤效果，杀伤率＝(实验组-对照组A-对照组B+培养基)/(对照组C-对照组B)×100％，其中，实验组为共孵育培养上清的LDH含量，对照组A为仅培养与实验组相同数量的嵌合抗原受体T细胞的培养上清的LDH含量，对照组B为仅培养与实验组相同数量的靶细胞的培养上清的LDH含量(目的是为了检测靶细胞正常死亡释放的LDH，一次实验设计一组即可)，对照组C为仅培养与实验组相同数量的靶细胞并使用lysisbuffer将细胞全部裂解后的培养上清的LDH含量，(目的是为了检测靶细胞全部死亡释放的LDH，一次实验设计一组即可)，培养基为X-VIVO完全培养基中LDH含量(目的是为了检测培养基会释放的LDH，一次实验设计一组即可)。
结果如图5所示，实施例1制备的嵌合抗原受体T细胞共表达嵌合抗原受体和RUNX3转录因子，靶细胞Huh7裂解率为62.2％，能够高效杀伤靶细胞，而对比例1制备的嵌合抗原受体T细胞仅表达嵌合抗原受体，靶细胞Huh7裂解率为41.1％，杀伤效果较差，表明本发明将嵌合抗原受体和RUNX3转录因子共表达，能够有效提高嵌合抗原受体T细胞的体外杀伤能力。
试验例2嵌合抗原受体T细胞活化水平分析
嵌合抗原受体T细胞受到肿瘤抗原刺激后，会迅速活化，细胞表面CD25和CD69分子的表达量迅速上调，因此CD25和CD69分子是评价嵌合抗原受体T细胞早期活化水平的重要标志。
将实施例1和对比例1制备的嵌合抗原受体T细胞分别与靶细胞Huh7共孵育(效靶比＝1:1)24h，以普通T细胞与靶细胞Huh7共孵育作为对照组(CTRL)，收集细胞，根据表达的白细胞分化抗原不同，可将嵌合抗原受体T细胞分为CD4+嵌合抗原受体T细胞和CD8+嵌合抗原受体T细胞，采用相应的流式抗体分别分析CD4+嵌合抗原受体T细胞和CD8+嵌合抗原受体T细胞的CD25和CD69分子的表达水平。
结果如图6A和图6B所示，共表达RUNX3转录因子能够显著提高CD8+嵌合抗原受体T细胞表面CD25的表达，即能够显著增强CD8+嵌合抗原受体T细胞的活化。
试验例3嵌合抗原受体T细胞耗竭水平分析
嵌合抗原受体T细胞受到肿瘤抗原刺激后，会分化成效应T细胞并杀伤肿瘤细胞，随着与抗原接触长时间的延长，T细胞会逐渐耗竭，表面会高表达一些抑制性受体分子，如PD-1、LAG3和TIM3等，抑制T细胞发挥抗肿瘤功能。
将实施例1和对比例1制备的嵌合抗原受体T细胞分别与靶细胞Huh7按效靶比1:1共孵育24h，以普通T细胞与靶细胞Huh7共孵育作为对照组(CTRL)，然后分别将嵌合抗原受体T细胞取出并继续培养7天，收集细胞，通过流式细胞仪分析PD-1和LAG3分子的表达。
结果如7A和图7B所示，实施例1制备的嵌合抗原受体T细胞中的PD-1和LAG3表达均低于对比例1制备的嵌合抗原受体T细胞，表明共表达RUNX3转录因子能够降低PD1和LAG3的表达，从而抑制嵌合抗原受体T细胞的耗竭。
试验例4嵌合抗原受体T细胞持续杀伤能力分析
将实施例1和对比例1制备的嵌合抗原受体T细胞分别与靶细胞Huh7按效靶比3.5:1同时铺三块96孔板(一块为超低吸附96孔板，另外两块为正常贴壁96孔板，分别编号为板1，板2和板3)；共孵育24h，以普通T细胞与靶细胞Huh7共孵育作为对照组(CTRL)，将板1取出，计算嵌合抗原受体T细胞对靶细胞的一轮杀伤效果，杀伤率的计算方法同试验例1所述的杀伤率计算方法，得到一轮杀伤率；将板2中悬浮细胞转移至另外一块新的超低吸附96孔板中(编号为板4)，再根据3.5:1的效靶比在相应孔中加入Huh7细胞，将板3中的悬浮细胞按照同样的方式转移至一块正常贴壁的96孔板中(编号为板5)，并加入相应的Huh7细胞，共孵育24h，将板4取出，按前述方法计算杀伤率，即为二轮杀伤率；将板5中相应孔中悬浮细胞全部转移至另外一块新的超低吸附96孔板中(编号为板6)，并加入Huh7细胞，共孵育24h，将板6取出，按前述方法计算杀伤率，即为三轮杀伤率。
结果如图8所示，实施例1制备的嵌合抗原受体T细胞在第三轮共孵育时靶细胞裂解率为71.3％，表明仍具有高效杀伤能力，而对比例1制备的嵌合抗原受体T细胞在第三轮共孵育时靶细胞裂解率仅为51.6％，表明其杀伤能力显著降低，综合上述，本发明共表达RUNX3转录因子能够增强嵌合抗原受体T细胞的持续杀伤能力。
试验例5RUNX3嵌合抗原受体T细胞体内抗肿瘤效果分析
将NSG小鼠(5周)置于动物房静息一周，用人肝癌细胞系Huh7(3×106细胞/小鼠)在NSG小鼠的右后侧部位(提前将毛发剔除)进行皮下荷瘤，构建小鼠肝癌皮下荷瘤模型，每3天测量肿瘤体积，在荷瘤14天后，根据测量肿瘤体积大小(100±50mm3左右)剔除肿瘤过大或过小的小鼠，将剩余小鼠随机分成三组(每组4只)，分别使用实施例1和对比例1制备的嵌合抗原受体T细胞对荷瘤小鼠进行治疗，每只注射3×106个嵌合抗原受体T细胞，以注射磷酸盐缓冲液(PBS)小鼠为对照，每3天测量肿瘤体积和小鼠体重以及记录生存情况。
结果如图9A小鼠肿瘤体积变化图、图9B小鼠体重变化图和图9C小鼠生存率变化图所示，相比于PBS对照组，实施例1和对比例1制备的嵌合抗原受体T细胞均能抑制肿瘤的生长；且注射实施例1制备的嵌合抗原受体T细胞的小鼠的肿瘤体积更小、生存率更高，因此，本发明共表达RUNX3转录因子能够显著提高嵌合抗原受体T细胞的体内抗肿瘤效果。
综上所述，本发明在T细胞中共表达嵌合抗原受体和RUNX3转录因子，获得嵌合抗原受体T细胞，能够提高嵌合抗原受体T细胞的体外杀伤能力、增强CD8+嵌合抗原受体T细胞的活化、抑制嵌合抗原受体T细胞的耗竭、增强嵌合抗原受体T细胞的持续杀伤能力以及提高嵌合抗原受体T细胞的体内抗肿瘤效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学，上海邦耀生物科技有限公司
<120> 一种以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体及其应用
<130> 20210114
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 429
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
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Ser Leu Ser Val Ala Gly Met Pro Ala Thr Ser Arg Phe His His Thr
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325 330 335
Phe Gln Ala Asn Pro Ser Pro Tyr His Leu Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser
340 345 350
Gly Ser Tyr Gln Phe Ser Met Val Ala Gly Ser Ser Ser Gly Gly Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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<213> 人工序列
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<211> 943
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
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Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His
625 630 635 640
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Leu
645 650 655
Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg
660 665 670
Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu
675 680 685
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe
690 695 700
Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
705 710 715 720
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
725 730 735
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
740 745 750
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
755 760 765
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
770 775 780
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
785 790 795 800
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
805 810 815
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
820 825 830
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln
835 840 845
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
850 855 860
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
865 870 875 880
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
885 890 895
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
900 905 910
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
915 920 925
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
930 935 940
<210> 7
<211> 2832
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggcatcga acagcatctt cgactccttc ccgacctact cgccgacctt catccgcgac 60
ccaagcacca gccgccgctt cacacctccc tccccggcct tcccctgcgg cggcggcggc 120
ggcaagatgg gcgagaacag cggcgcgctg agcgcgcagg cggccgtggg gcccggaggg 180
cgcgcccggc ccgaggtgcg ctcgatggtg gacgtgctgg cggaccacgc aggcgagctc 240
gtgcgcaccg acagccccaa cttcctctgc tccgtgctgc cctcgcactg gcgctgcaac 300
aagacgctgc ccgtcgcctt caaggtggtg gcattggggg acgtgccgga tggtacggtg 360
gtgactgtga tggcaggcaa tgacgagaac tactccgctg agctgcgcaa tgcctcggcc 420
gtcatgaaga accaggtggc caggttcaac gaccttcgct tcgtgggccg cagtgggcga 480
gggaagagtt tcaccctgac catcactgtg ttcaccaacc ccacccaagt ggcgacctac 540
caccgagcca tcaaggtgac cgtggacgga ccccgggagc ccagacggca ccggcagaag 600
ctggaggacc agaccaagcc gttccctgac cgctttgggg acctggaacg gctgcgcatg 660
cgggtgacac cgagcacacc cagcccccga ggctcactca gcaccacaag ccacttcagc 720
agccagcccc agaccccaat ccaaggcacc tcggaactga acccattctc cgacccccgc 780
cagtttgacc gctccttccc cacgctgcca accctcacgg agagccgctt cccagacccc 840
aggatgcatt atcccggggc catgtcagct gccttcccct acagcgccac gccctcgggc 900
acgagcatca gcagcctcag cgtggcgggc atgccggcca ccagccgctt ccaccatacc 960
tacctcccgc caccctaccc gggggccccg cagaaccaga gcgggccctt ccaggccaac 1020
ccgtccccct accacctcta ctacgggaca tcctctggct cctaccagtt ctccatggtg 1080
gccggcagca gcagtggggg cgaccgctca cctacccgca tgctggcctc ttgcaccagc 1140
agcgctgcct ctgtcgccgc cggcaacctc atgaacccca gcctgggcgg ccagagtgat 1200
ggcgtggagg ccgacggcag ccacagcaac tcacccacgg ccctgagcac gccaggccgc 1260
atggatgagg ccgtgtggcg gccctacact agtggaagcg gagctactaa cttcagcctg 1320
ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta ggcgcgccat ggccttacca 1380
gtgaccgcct tgctcctgcc gctggccttg ctgctccacg ccgccaggcc ggatgttgtg 1440
atgactcagt ctccactctc cctgcccgtc acccctggag agccggcctc catctcctgc 1500
agatctagtc agagccttgt acacagtaat gccaacacct atttacattg gtacctgcag 1560
aagccagggc agtctccaca gctcctgatc tataaagttt ccaaccgatt ttctggggtc 1620
cctgacaggt tcagtggcag tggatcaggc acagatttta cactgaaaat cagcagagtg 1680
gaggctgagg atgttggggt ttattactgc tctcaaaata cacatgttcc tcctacgttt 1740
ggccagggga ccaagctgga gatcaaacgt ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct 1800
ggcggtggcg gatcgcaggt gcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg 1860
gcctcagtga aggtctcctg caaggcttct ggatacacct tcaccgacta tgaaatgcac 1920
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gagctcttga tcctaaaact 1980
ggtgatactg cctacagtca gaagttcaag ggcagagtca cgctgaccgc ggacgaatcc 2040
acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac 2100
tgtacaagat tctactccta tacttactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 2160
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 2220
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 2280
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 2340
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 2400
aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 2460
tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 2520
gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 2580
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 2640
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 2700
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 2760
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 2820
ccccctcgct aa 2832
<210> 8
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggatgttg tgatgactca gtctccactc tccctgcccg tcacccctgg agagccggcc 120
tccatctcct gcagatctag tcagagcctt gtacacagta atgccaacac ctatttacat 180
tggtacctgc agaagccagg gcagtctcca cagctcctga tctataaagt ttccaaccga 240
ttttctgggg tccctgacag gttcagtggc agtggatcag gcacagattt tacactgaaa 300
atcagcagag tggaggctga ggatgttggg gtttattact gctctcaaaa tacacatgtt 360
cctcctacgt ttggccaggg gaccaagctg gagatcaaac gtggtggagg cggttcaggc 420
ggaggtggct ctggcggtgg cggatcgcag gtgcagctgg tgcagtctgg agctgaggtg 480
aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc tgcaaggctt ctggatacac cttcaccgac 540
tatgaaatgc actgggtgcg acaggcccct ggacaagggc ttgagtggat gggagctctt 600
gatcctaaaa ctggtgatac tgcctacagt cagaagttca agggcagagt cacgctgacc 660
gcggacgaat ccacgagcac agcctacatg gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg 720
gccgtgtatt actgtacaag attctactcc tatacttact ggggccaggg aaccctggtc 780
accgtctcct caaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840
tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900
acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 960
ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 1020
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1080
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1140
aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1200
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1260
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1320
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1380
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1440
atgcaggccc tgccccctcg c 1461

Claims (18)

1.一种以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括RUNX3转录因子、抗原结合区、跨膜区和胞内信号激活区；
所述抗原结合区为磷脂酰肌醇聚糖3结合区；
所述RUNX3转录因子连接在所述抗原结合区的氨基端；
所述RUNX3转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述磷脂酰肌醇聚糖3结合区为抗GPC3单链抗体；
所述抗GPC3单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区包括CD8α跨膜区。
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8α跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号激活区包括4-1BB和CD3ζ。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQID NO:4所示。
6.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示。
7.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由RUNX3转录因子、CD8α信号肽、GPC3单链抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB和CD3ζ串联组成；
所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
8.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括权利要求1-7任一项所述的以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体的编码基因。
9.根据权利要求8所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括SEQ ID NO:7所示的核酸序列。
10.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括权利要求8所述的核酸分子；
所述重组表达载体为含有权利要求8所述的核酸分子的病毒载体或质粒载体。
11.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒含有权利要求8所述的核酸分子。
12.一种嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达权利要求1-7任一项所述以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体。
13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞的基因组中整合有权利要求8所述的核酸分子。
14.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞含有权利要求10所述的重组表达载体。
15.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括嵌合抗原受体T细胞。
16.一种权利要求12所述的嵌合抗原受体免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将权利要求8所述的核酸分子或权利要求10所述的重组表达载体导入宿主细胞中，获得嵌合抗原受体免疫细胞；
所述宿主细胞包括T细胞；
所述导入的方法包括电转导、病毒载体系统、非病毒载体系统或基因枪注射中的任意一种。
17.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-7任一项所述的以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体、权利要求8所述的核酸分子、权利要求10所述的重组表达载体、权利要求11所述的重组慢病毒或权利要求12所述的嵌合抗原受体免疫细胞中的任意一种或至少两种的组合；
所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
18.权利要求1-7任一项所述的以磷脂酰肌醇聚糖3为靶点的嵌合抗原受体、权利要求8所述的核酸分子、权利要求10所述的重组表达载体、权利要求11所述的重组慢病毒、权利要求12所述的嵌合抗原受体免疫细胞或权利要求17所述的药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。
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