CN114409805B

CN114409805B - 一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114409805B
Application number: CN202210044776.8A
Authority: CN
Inventors: 王方圆; 戴卫国; 朱滨
Original assignee: Beijing Menlo Biotech Co ltd
Current assignee: Beijing Menlo Biotech Co ltd
Priority date: 2021-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2042-01-14
Also published as: CN114409805A

Abstract

本发明公开了一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用。本发明基于CAR泛素化修饰原理，将CD3ζ的第64位和第66位的赖氨酸突变为精氨酸，使其缺失了被泛素化的能力，进而减少CAR内化的速率，延长了CAR在细胞膜上的半衰期，进而提高了CAR在细胞膜上的停留时间，增加了CAR‑T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，可有效降低患者治疗后肿瘤的复发率，延长其生命周期，在临床上具有很好的应用价值。

Description

一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用，具体为一种能够延长嵌合抗原受体在细胞膜上的半衰期的突变的CD3ζ胞内区及其在构建嵌合抗原受体骨架中的应用。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)是一种人工合成的模拟TCR功能的T细胞受体，由胞外靶向连接区，以及T细胞的激活信号结构域组成。胞外靶向连接区由单链抗体或配体构成，具有特异性结合靶抗原的功能。T细胞的激活信号结构域包括铰链区、跨膜区、胞内信号转导区，铰链区常采用CD8、CD4或IgG4分子的铰链区。跨膜区由亲脂性的氨基酸序列组成，常采用CD8、CD28的跨膜区段。胞内信号转导区由CD3ζ链或FcεRIγ链以及共刺激信号分子CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27、ICOS、CD244等构成。第一代CAR仅含有CD3ζ链或FcεRIγ链，第二代CAR包含1个共刺激信号分子，第三代CAR含有2个及以上共刺激信号分子。CAR修饰的T细胞通过胞外靶向连接区识别肿瘤表面抗原，在患者体内靶向性地杀伤表达相关抗原的肿瘤细胞，进而达到清除肿瘤细胞的效果。

近年来，嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)作为一种新兴的肿瘤免疫治疗手段，在复发/难治性恶性B细胞肿瘤的治疗中展现出了显著的治疗效果，目前，全球已有多所医疗机构注册开展了针对急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)的临床试验，通过向患者体内输注经修饰的T细胞而特异性杀伤表达相应抗原的肿瘤细胞，并取得了相对较好的治愈率。然而，CAR-T治疗仍存在诸多的局限，例如，有研究表明治疗后完全缓解中位时间一般均在8个月左右，但仍有大量患者复发，这可能与CAR-T细胞的CAR中的CD3ζ的赖氨酸被泛素化修饰，引发CAR全结构内化，进入细胞内被溶酶体消化降解，导致其在患者体内存留时间短有关，因此，提高CAR-T细胞体内存留时间对于提高CAR-T治疗的疗效具有重大意义。

目前，现有技术存在的缺陷是细胞膜上的CAR半衰期过短，导致CAR-T细胞在体内的存留时间短，杀伤能力和持久力均不强，因此，针对现有技术存在的缺陷，本发明基于CAR泛素化修饰原理，将CD3ζ的第64位和第66位的赖氨酸突变为精氨酸，使其缺失了被泛素化的能力，进而减少CAR内化的速率，延长了CAR在细胞膜上的半衰期，提高了CAR在细胞膜上停留时间，增加了CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

发明内容

针对目前现有技术存在的细胞膜上的CAR半衰期过短，导致CAR-T细胞在体内的存留时间短，杀伤能力和持久力均不强等问题，本发明的目的在于提供一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用。本发明基于CAR泛素化修饰原理，将CD3ζ的第64位和第66位的赖氨酸突变为精氨酸，使其缺失了被泛素化的能力，进而减少CAR内化的速率，延长了CAR在细胞膜上的半衰期，提高了CAR在细胞膜上停留时间，增加了CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种嵌合抗原受体。

进一步，所述嵌合抗原受体包括依次串联的胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域；

优选地，所述胞内结构域包括依次串联的共刺激信号传导区和CD3ζ胞内区；

更优选地，所述CD3ζ胞内区为延长嵌合抗原受体在细胞膜上的半衰期的突变的CD3ζ胞内区；

最优选地，所述突变的CD3ζ胞内区为野生型CD3ζ胞内区的第64位和第66位的赖氨酸突变成精氨酸得到的；

最优选地，所述突变的CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

更优选地，所述共刺激信号传导区包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、B7-H3和/或其任何组合的胞内区；

最优选地，所述共刺激信号传导区为4-1BB胞内区；

最优选地，所述4-1BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；

优选地，所述胞外结构域包括抗原识别区；

更优选地，所述抗原识别区识别的肿瘤相关抗原包括CD3、CD19、CD123、CD138、CD38、CD33、CD30、CD28、CD27、CD22、CD20、IL13Rα2、CTLA4、CEA、CS1、NY-ESO-1、MAGE A3、ROR1、Her2、PD1、BCMA、GD2；

最优选地，所述抗原识别区识别的肿瘤相关抗原为CD3；

最优选地，所述抗原识别区包括与CD3特异性结合的scFv；

最优选地，所述scFv由重链可变区-Linker-轻链可变区构成；

最优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

最优选地，所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

最优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

更优选地，所述胞外结构域还包括信号肽和/或铰链区，形成依次串联的信号肽-抗原识别区-铰链区；

最优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

最优选地，所述铰链区包括CD8α、CD28、IgG1、IgG4、4-1BB、PD-1、CD34、OX40、CD3ε的铰链区；

最优选地，所述铰链区为CD8α铰链区；

最优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

优选地，所述跨膜结构域包括CD4、CD8、CD8α、CD28、H2-Kb、OX40、4-1BB的跨膜区；

更优选地，所述跨膜结构域为CD8跨膜区；

最优选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

进一步，形成本发明的嵌合抗原受体的上述各个部分，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3-25个氨基酸残基，例如3-15、5-15、10-20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2-20个，例如2-15、2-10、2-8个。除甘氨酸和丝氨酸外，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。

本发明的第二方面提供了一种核酸分子。

进一步，所述核酸分子包括本发明第一方面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。

进一步，本发明所述的核酸分子的核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。

进一步，所述的核酸分子的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的氨基酸序列，将其转化为核苷酸序列，根据该核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明的第三方面提供了一种表达载体。

进一步，所述表达载体包括本发明第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述表达载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体、或病毒载体；

更优选地，所述病毒载体包含慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体。

进一步，所述载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记；

优选地，所述启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

本发明的第四方面提供了一种表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体的细胞。

进一步，所述细胞包括本发明第二方面所述的核酸分子，或本发明第三方面所述的表达载体。

优选地，所述细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、或哺乳动物细胞。

更优选地，所述细胞包括免疫细胞；

最优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞培养分化的免疫细胞；

最优选地，所述免疫细胞为T淋巴细胞培养分化的免疫细胞。

本发明的第五方面提供了一种制备本发明第四方面所述的细胞的方法。

进一步，所述方法包括分离和激活待修饰的细胞，然后将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的表达载体引入到该细胞中；

优选地，所述细胞包括免疫细胞；

更优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

进一步，所述引入到细胞的方法包括物理方法、生物方法和化学方法；

优选地，所述物理方法包括但不限于磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔；

优选地，所述生物方法包括但不限于使用DNA和RNA载体；

优选地，所述化学手段包括但不限于胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，例如水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。

本发明的第六方面提供了一种表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体的细胞群体。

进一步，所述细胞群体包括本发明第四方面所述的细胞；

优选地，所述细胞群体包括包含本发明第二方面所述的核酸分子，或本发明第三方面所述的表达载体的细胞；

更优选地，所述细胞包括免疫细胞；

最优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

本发明的第七方面提供了一种组合物。

进一步，所述组合物包括本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的细胞、和/或本发明第六方面所述的细胞群体。

本发明的第八方面提供了一种试剂盒。

进一步，所述试剂盒包括本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的细胞、和/或本发明第六方面所述的细胞群体。

本发明的第九方面提供了一种药物组合物。

进一步，所述药物组合物包括有效量的本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的细胞、或本发明第六方面所述的细胞群体。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明的第十方面提供了如下任一方面的应用：

(1)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体在制备本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体中的应用；

(2)本发明第二方面所述的核酸分子在制备本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的细胞、本发明第六方面所述的细胞群体、本发明第七方面所述的组合物、本发明第八方面所述的试剂盒、或本发明第九方面所述的药物组合物中的应用；

(3)本发明第三方面所述的表达载体在制备本发明第四方面所述的细胞、本发明第六方面所述的细胞群体、本发明第七方面所述的组合物、本发明第八方面所述的试剂盒、或本发明第九方面所述的药物组合物中的应用；

(4)本发明第四方面所述的细胞在制备本发明第六方面所述的细胞群体、本发明第七方面所述的组合物、本发明第八方面所述的试剂盒、或本发明第九方面所述的药物组合物中的应用；

(5)本发明第六方面所述的细胞群体在制备本发明第七方面所述的组合物、本发明第八方面所述的试剂盒、或本发明第九方面所述的药物组合物中的应用；

(6)本发明第四方面所述的细胞、本发明第六方面所述的细胞群体在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；

(7)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的突变的CD3ζ在制备嵌合抗原受体、核酸分子、表达载体、细胞、细胞群体、组合物、试剂盒、药物组合物中的应用；

(8)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的细胞、本发明第六方面所述的细胞群体、或本发明第七方面所述的组合物在制备肿瘤治疗药物、提高对肿瘤的杀伤效率、和/或抑制肿瘤发展中的应用。

此外，本发明还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法。

进一步，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的表达载体、本发明第四方面所述的细胞、本发明第六方面所述的细胞群体、本发明第七方面所述的组合物、或本发明第九方面所述的药物组合物。

进一步，所述肿瘤包括非实体瘤、实体瘤。

进一步，所述的非实体瘤包括急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、急性髓性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤。

本发明的优点和有益效果如下：

相对于现有技术，本发明基于CAR泛素化修饰原理，仅将CD3ζ的第64位和第66位的赖氨酸突变为精氨酸，使其缺失了被泛素化得能力，进而减少CAR内化的速率，延长了CAR在细胞膜上的半衰期，提高了CAR在细胞膜上停留时间，增加了CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，可有效降低患者治疗后肿瘤的复发率，延长其生命周期，在临床上具有很好的应用价值。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为流式细胞术检测不同感染天数后T细胞表面CAR表达阳性率的结果图，其中，A图：感染3天后的CD3-CAR-T，B图：感染3天后的CD3-CAR-T-2KR，C图：感染5天后的CD3-CAR-T，D图：感染5天后的CD3-CAR-T-2KR；

图2为阴性对照组、阳性对照组和实验组各组的小鼠的生物荧光强度的结果图，其中，A图：阴性对照组，B图：阳性对照组，C图：实验组。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例

1、T细胞的纯化

人外周血经密度梯度离心后，分离外周血单个核细胞。利用德国美天旎公司的T细胞分离试剂盒获得纯化的CD3⁺T细胞，再按照2个细胞加入1个磁珠的比例，加入适量的CD3/CD28磁珠活化2天，加入病毒上清与polybrene(8μg/mL)孵育。10小时后，离心清洗T细胞1次后，加入含10ng/mL IL-7和10ng/mL IL-15的Gibco CTS^TM OpTmizer T细胞扩增无血清培养基扩增T细胞。

2、CAR表达载体的构建

(1)构建的嵌合抗原受体慢病毒表达载体中嵌合抗原受体各个元件的组合顺序(从N端到C端)如下：

信号肽-scFv-人CD8α分子柔性片段-人CD8分子跨膜区-4-1BB胞内段-突变的CD3ζ；

所述突变的CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述scFv由重链可变区(VH)-Linker-轻链可变区(VL)构成，其中重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述人CD8α分子柔性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述人CD8分子跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述4-1BB胞内段的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

(2)构建CAR表达载体(LV-CD3 CAR表达质粒)：将上述构建得到的针对CD3抗原的CAR按照酶切连接的方式插入表达载体pLVX-Puro中，构建LV-CD3 CAR表达质粒，酶切位点为XbaI，EcoRI；转化，涂板，小提测序，确认质粒构建成功。质粒大提获得无内毒素的表达质粒，以备包装慢病毒。

3、慢病毒包装

PEI转染法(针对T75培养瓶)步骤如下：

(1)Day1：复苏293T/17细胞至1*T75内，培养基体积15mL；

(2)Day3：将293T/17细胞传代至1*T225内，培养基体积45mL；

(3)Day5：将293T/17细胞传代至3*T225内，接种密度大概为6*10⁷个细胞/T225瓶；

(4)Day6：下午进行病毒包装。转染前观察细胞状态，汇聚度约90％时进行转染。弃去瓶内培养基，更换为15mL新鲜的DMEM培养基(无抗生素)，培养30min；

溶液A配制：取LV-CD3 CAR表达质粒17.7μg、辅助质粒pRSV-REV 8.8μg、辅助质粒pMDLg/pRRE 8.8μg及辅助质粒pMD2.G 4.4μg，转染比例为4:2:2:1，总量为40μg，混匀后用无血清DMEM稀释定容至0.75mL，混匀后室温静置5min；

溶液B配制：取630μL DMEM，再加入120μL PEI工作液(1mg/mL、4℃保存)，充分混匀，室温静置5min；

将B液逐滴加入到A液中，并轻柔混匀，室温孵育20min。将混合液逐滴加入到细胞中，轻柔混匀，置于5％二氧化碳培养17h；

(5)Day7：上午弃去原培养基，加入15mL的不含血清及抗生素的DMEM培养基，培养31h后收获病毒，之后再加入培养基培养24h，再收获一次病毒。收取细胞上清液，2000rpm离心5min。之后将上清液转移至高速离心管内，配平，然后30000g、4℃离心4h，吸净上清，加入500μL无菌PBS缓冲液重悬病毒颗粒，混匀200μL/支分装并于-80℃冰箱保存。

4、慢病毒转导

采用本实施例中扩增得到的T细胞进行LV-CD3 CAR慢病毒转导，病毒MOI：3-20，聚凝胺1.5μL 5-10μg/mL)。6-12小时后去除含有慢病毒的培养基，更换新鲜培养基，进行CAR-T细胞扩增。

5、CAR-T细胞扩增

更换新鲜培养基后，在IL-7/15持续存在下，以1M/mL为起始细胞密度，进行细胞传代，每2天检测细胞密度及活率，补充新鲜培养基及细胞因子。保持细胞密度在1M/mL，即得CD3ζ胞内区的第64位和第66位的赖氨酸突变成精氨酸的突变型CD3-CAR-T细胞(CD3-CAR-T-2KR细胞)。

采用上述相同的方法构建得到CD3ζ胞内区的第52位和第77位的赖氨酸突变成精氨酸的突变型CD3-CAR-T细胞(CD3-CAR-T-M细胞)。

6、T细胞CAR表达效率

T细胞感染3天后，利用流式细胞术对T细胞表面CAR的表达情况进行检测。检测CAR表达阳性率。T细胞感染5天后，再次利用流式细胞术对T细胞表面CAR的表达情况进行检测。

实验结果显示T细胞感染3天后，CD3-CAR-T和CD3-CAR-T-2KR的CAR表达阳性率分别为52.7％、76％，T细胞感染5天后，CD3-CAR-T和CD3-CAR-T-2KR的CAR表达阳性率分别为37.4％、63.8％(见图1和表1)。

表1 CD3-CAR-T和泛素化修饰的CD3-CAR-T细胞的CAR表达阳性率的统计结果

其中，CD3-CAR-T-2KR为本发明构建的CD3ζ胞内区的第64位和第66位的赖氨酸突变成精氨酸的突变型CD3-CAR-T，即泛素化修饰的CD3-CAR-T；CD3-CAR-T为常规的靶向CD3的野生型CD3-CAR-T细胞。

7、CAR-T细胞杀伤效果评价

T细胞感染5天后，分别计数T细胞与表达GFP的靶细胞Jurkat，然后按照效靶比(阳性效应细胞：靶细胞，E:T)2：1，1：1的比例，将T细胞(阳性效应细胞)与Jurkat-GFP靶细胞分别共孵育24小时、48小时。共孵育结束后，收集细胞，流式细胞术分析靶细胞占比。

实验结果显示，泛素化修饰的CD3-CAR-T-2KR细胞(CD3ζ胞内区的第64位和第66位的赖氨酸突变成精氨酸的突变型细胞)对靶向的肿瘤细胞有更好的杀伤能力(见表2和表3)，显著优于常规的靶向CD3的野生型CD3-CAR-T细胞以及CD3ζ胞内区的第52位和第77位的赖氨酸突变成精氨酸的突变型细胞CD3-CAR-T-M。

表2 E:T＝1:1的CD3-CAR-T、CD3-CAR-T-M和CD3-CAR-T-2KR细胞的杀伤效率的统计结果

表3 E:T＝2:1的CD3-CAR-T、CD3-CAR-T-M和CD3-CAR-T-2KR细胞的杀伤效率的统计结果

8、CAR-T细胞体内杀伤功能检测

实验方法：

(1)Jurkat-Fluc细胞系构建NPG鼠肿瘤模型

NPG小鼠5-8周龄，均为雌性，尾静脉注射1×10⁶个Jurkat-Fluc细胞。一周后生物荧光检测，确认NPG鼠肿瘤模型构建成功。

(2)一周后将NPG小鼠分为肿瘤模型组(阴性对照组)，CD3-CAR-T组(阳性对照组)，泛素化修饰的CD3-CAR-T组(实验组)，共三组，其中，CD3-CAR-T组是指常规的靶向CD3的野生型CD3-CAR-T细胞，泛素化修饰的CD3-CAR-T组是指CD3ζ胞内区的第64位和第66位的赖氨酸突变成精氨酸的突变型CD3-CAR-T细胞，每组3只小鼠。

(3)分别经NPG小鼠尾静脉回输CD3-CAR-T细胞、泛素化修饰的CD3-CAR-T细胞1×10⁷个。观察期限8周。

(4)每周观察各组NPG小鼠的生物荧光强度、体重、状态、以及生存时间。

实验结果显示，CD3-CAR-T组和泛素化修饰的CD3-CAR-T组(CD3ζ胞内区的第64位和第66位的赖氨酸突变成精氨酸的突变型CD3-CAR-T细胞)能够明显抑制肿瘤生长，生物荧光强度均显著低于肿瘤组，其中，泛素化修饰的CD3-CAR-T组小鼠生存时间显著延长，在观察期限内实验组小鼠仍存活。与阳性对照组相比，泛素化修饰的CAR-T组具有更好的肿瘤抑制效果(见图2)，即CD3ζ胞内区的第64位和第66位的赖氨酸突变成精氨酸的突变型CD3-CAR-T细胞具有更好的杀伤肿瘤细胞的能力。

体内实验证明了本发明构建的泛素化修饰的CAR-T(CD3ζ胞内区的第64位和第66位的赖氨酸突变成精氨酸的突变型CD3-CAR-T细胞)可有效地增加CAR-T细胞的杀伤能力。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。经阅读前述描述，那些优选实施方案的改变对于本领域普通技术人员而言可以变得显而易见。发明人期望本领域技术人员视情况应用此类改变，并且发明人意图以与本文具体所述的不同的方式实践本发明。因此，如适用的法律所允许的，本发明包括在此所附的权利要求中所述的主题的所有修饰和等同物。此外，本发明涵盖以上所述元素的所有可能的改变的任何组合，除非本文另外指明或者在其它方面与上下文明显矛盾。

序列表

<110> 北京门罗生物科技有限公司

<120> 一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用

<150> PCT/CN2021/071895

<151> 2021-01-14

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Arg

50 55 60

Asp Arg Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg

20 25 30

Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys

50 55 60

Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala

65 70 75 80

Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile

100 105

<210> 6

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 7

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 8

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次串联的胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域；

所述胞内结构域包括依次串联的共刺激信号传导区和CD3ζ胞内区；

所述CD3ζ胞内区为延长嵌合抗原受体在细胞膜上的半衰期的突变的CD3ζ胞内区；

所述突变的CD3ζ胞内区为野生型CD3ζ胞内区的第64位和第66位的赖氨酸突变成精氨酸得到的；

所述突变的CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述共刺激信号传导区为4-1BB胞内区；

所述胞外结构域包括抗原识别区；

所述抗原识别区识别的肿瘤相关抗原为CD3；

所述抗原识别区包括与CD3特异性结合的scFv；

所述scFv由重链可变区-Linker-轻链可变区构成；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述胞外结构域还包括信号肽和/或铰链区，形成依次串联的信号肽-抗原识别区-铰链区；

所述铰链区为CD8α铰链区；

所述跨膜结构域为CD8跨膜区。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述4-1BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。

7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求6所述的核酸分子。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体、或病毒载体。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体。

10.一种表达权利要求1所述的嵌合抗原受体的细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求6所述的核酸分子，或权利要求7所述的表达载体。

11.根据权利要求10所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、或哺乳动物细胞。

12.根据权利要求11所述的细胞，其特征在于，所述细胞为免疫细胞。

13.根据权利要求12所述的细胞，其特征在于，所述免疫细胞选自T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

14.根据权利要求13所述的细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T淋巴细胞培养分化的免疫细胞。

15.一种制备权利要求10所述的细胞的方法，其特征在于，所述方法包括分离和激活待修饰的细胞，然后将权利要求6所述的核酸分子或权利要求7所述的表达载体引入到该细胞中。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞为免疫细胞。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞选自T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

18.一种表达权利要求1所述的嵌合抗原受体的细胞群体，其特征在于，所述细胞群体包括权利要求10所述的细胞。

19.根据权利要求18所述的细胞群体，其特征在于，所述细胞群体包括包含权利要求6所述的核酸分子、或权利要求7所述的表达载体的细胞。

20.根据权利要求19所述的细胞群体，其特征在于，所述细胞为免疫细胞。

21.根据权利要求20所述的细胞群体，其特征在于，所述免疫细胞选自T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

22.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体、权利要求10所述的细胞、和/或权利要求18所述的细胞群体。

23.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体、权利要求10所述的细胞、和/或权利要求18所述的细胞群体。

24.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括有效量的权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体、权利要求10所述的细胞、和/或权利要求18所述的细胞群体。

25.根据权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

26.权利要求1所述的嵌合抗原受体在制备权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体中的应用。

27.权利要求6所述的核酸分子在制备权利要求7所述的表达载体、权利要求10所述的细胞、权利要求18所述的细胞群体、权利要求22所述的组合物、权利要求23所述的试剂盒、或权利要求24所述的药物组合物中的应用。

28.权利要求7所述的表达载体在制备权利要求10所述的细胞、权利要求18所述的细胞群体、权利要求22所述的组合物、权利要求23所述的试剂盒、或权利要求24所述的药物组合物中的应用。

29.权利要求10所述的细胞在制备权利要求18所述的细胞群体、权利要求22所述的组合物、权利要求23所述的试剂盒、或权利要求24所述的药物组合物中的应用。

30.权利要求18所述的细胞群体在制备权利要求22所述的组合物、权利要求23所述的试剂盒、或权利要求24所述的药物组合物中的应用。

31.权利要求10所述的细胞、权利要求18所述的细胞群体在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

32.氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的突变的CD3ζ在制备嵌合抗原受体、核酸分子、表达载体、细胞、细胞群体、组合物、试剂盒中的应用。

33.权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的表达载体、权利要求10所述的细胞、权利要求18所述的细胞群体、或权利要求22所述的组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。