CN116348496A - Bcma嵌合抗原受体 - Google Patents

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香农·格朗德·康特拉斯塔诺
艾米莉·G·柯伊伯
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2 Savinti Biology
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Abstract

本申请提供了用于B细胞相关病状的过继性T细胞疗法的改进的组合物。

Description

BCMA嵌合抗原受体
相关申请交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2020年8月25日提交的美国临时申请第63/069,784号的权益，所述美国临时申请通过引用以其整体并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关联的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且在此通过引用并入到本说明书中。含有序列表的文本文件名称是BLUE-131PC_ST25.txt。文本文件为96.4KB，于2021年8月22日创建并且通过EFS-Web以电子方式与本说明书同时提交。
背景
技术领域
本发明总体上涉及用于治疗B细胞相关病状的改进的组合物和方法。更具体地，本发明涉及包括人抗B细胞成熟抗原(抗BCMA)抗体或其抗原结合片段的改进的嵌合抗原受体(CAR)，经基因修饰以表达这些CAR的免疫效应细胞，以及这些组合物用于有效治疗B细胞相关病状的用途。
背景技术
若干种重要的疾病涉及B淋巴细胞，即，B细胞。B细胞的恶性转化导致癌症，包含但不限于淋巴瘤，例如，多发性骨髓瘤和非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkins′lymphoma)。异常的B细胞生理学也可能导致自身免疫性疾病的发展，包含但不限于全身性红斑狼疮(SLE)。
大多数患有B细胞恶性肿瘤，包含非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)和多发性骨髓瘤(MM)的患者是癌症死亡的重要因素。B细胞恶性肿瘤对各种形式治疗的应答是混合的。治疗B细胞恶性肿瘤的传统方法，包含化学疗法、放射疗法和治疗性抗体，已经取得有限的成功。
最近，通过使用靶向BCMA的治疗性抗体或嵌合抗原受体(CAR)来治疗B细胞恶性肿瘤的尝试已经取得有前途但有限的成功。事实上，并不是所有的患者在接受这些疗法时都能被治愈或完全缓解。开发此类治疗方法的一个困难是用于治疗性抗体或CAR的给定抗原结合结构域的治疗功效是不可预测的。例如，如果抗原结合结构域太强烈地结合，则CAR T细胞诱导大规模细胞因子释放，从而导致被视为“细胞因子风暴”的潜在致命免疫反应，并且如果抗原结合结构域太弱地结合，则CAR T细胞在清除癌细胞时不会展现出足够的治疗功效。此外，一些CAR表现出导致T细胞功能障碍(有时被称为T细胞衰竭)的抑制水平的抗原非依赖性信号传导，由此限制了疗效。
因此，仍然非常需要鉴定具有改进的功效同时限制抗原非依赖性信号传导和T细胞功能障碍的改进的抗BCMACAR。
发明内容
本申请总体上提供了用于产生T细胞疗法的改进的载体、抗体、抗体片段和嵌合抗原受体(CAR)和其使用方法。具体地，本申请提供了改进的抗BCMA抗体、抗体片段和嵌合抗原受体(CAR)。更具体地，本申请提供了改进的人抗BCMA抗体、抗体片段或CAR。
在本申请的一方面，本文提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包括：a)细胞外结构域，所述细胞外结构域包括抗BCMA(B细胞成熟抗原)抗体或其抗原结合片段，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段与人BCMA多肽的一个或多个表位结合，所述人BCMA多肽包括：如SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中所示的可变轻链氨基酸序列内的可变轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3区；以及如SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48中所示的可变重链氨基酸序列内的可变重链CDRH1、CDRH2和CDRH3区；b)跨膜结构域；c)一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域；以及d)初级信号传导结构域。
在另一方面，本文提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包括：a)细胞外结构域，所述细胞外结构域包括抗BCMA(B细胞成熟抗原)抗体或其抗原结合片段，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段与人BCMA多肽的一个或多个表位结合，所述人BCMA多肽包括：SEQ ID NO:1-3、9-11、17-19、25-27、33-35或41-43中所示的可变轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及SEQ ID NO:4-6、12-14、20-22、28-30、36-38或44-46中所示的可变重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列；b)跨膜结构域；c)一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域；以及d)初级信号传导结构域。
在各个实施例中，所述可变轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:7中示出，和/或所述可变重链氨基酸序列在SEQ ID NO:8中示出。在各个实施例中，所述可变轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:15中示出，和/或所述可变重链氨基酸序列在SEQ ID NO:16中示出。在各个实施例中，所述可变轻链氨基酸序列在SEQ ID NO：23中示出，和/或所述可变重链氨基酸序列在SEQ ID NO：24中示出。在各个实施例中，所述可变轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:31中示出，和/或所述可变重链氨基酸序列在SEQ ID NO：32中示出。在各个实施例中，所述可变轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:39中示出，和/或所述可变重链氨基酸序列在SEQ ID NO：40中示出。在各个实施例中，所述可变轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:47中示出，和/或所述可变重链氨基酸序列在SEQ ID NO:48中示出。
在各个实施例中，所述抗BCMA抗体或抗原结合片段选自由以下组成的组：骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或抗原结合片段是scFv。
在各个实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:1-3中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:4-6中的任一个所示的一个或多个重链CDR。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:9-11中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO：12-14中的任一个所示的一个或多个重链CDR。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO：17-19中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:20-22中的任一个所示的一个或多个重链CDR。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:25-27中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:28-30中的任一个所示的一个或多个重链CDR。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:33-35中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO：36-38中的任一个所示的一个或多个重链CDR。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:41-43中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:44-46中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
在各个实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中的任一个所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48中的任一个所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQID NO:7中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:8中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:15中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:16中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:23中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:24中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:31中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:32中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:39中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:40中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:31中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ IDNO:48中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的47an氨基酸序列。
在各个实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中的任一个所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48中的任一个所示的可变重链序列。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQID NO:7中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:8中所示的可变重链序列。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:15中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:16中所示的可变重链序列。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:23中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:24中所示的可变重链序列。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:31中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:32中所示的可变重链序列。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:39中所示的可变轻链序列和/或如SEQ IDNO:40中所示的可变重链序列。在一些实施例中，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:47中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:48中所示的可变重链序列。
在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是scFv，并且所述可变轻链位于所述可变重链的c末端。在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是scFv，并且所述可变重链位于所述可变轻链的c末端。
在各个实施例中，所述CAR跨膜结构域从多肽中分离，所述多肽选自由以下组成的组：T细胞受体的α链或β链、CDδ、CD3ε、CDγ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD152、CD154和PD1。在一些实施例中，所述跨膜结构域从多肽中分离，所述多肽选自由以下组成的组：CD8α；CD4、CD45、PD1和CD152。在一些实施例中，所述跨膜结构域从CD8α中分离。在一些实施例中，所述跨膜结构域从PD1中分离。在一些实施例中，所述跨膜结构域从CD152中分离。
在各个实施例中，所述一个或多个CAR共刺激信号传导结构域从共刺激分子中分离，所述共刺激分子选自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM和ZAP70。在一些实施例中，一个或多个共刺激信号传导结构域从共刺激分子中分离，所述共刺激分子选自由以下组成的组：CD28、CD134和CD137。在一些实施例中，所述一个或多个共刺激信号传导结构域从CD28中分离。在一些实施例中，所述一个或多个共刺激信号传导结构域从CD134中分离。在一些实施例中，所述一个或多个共刺激信号传导结构域从CD137中分离。
在各个实施例中，所述初级信号传导结构域从多肽中分离，所述多肽选自由以下组成的组：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在一些实施例中，所述初级信号传导结构域从CD3ζ中分离。
在各个实施例中，所述CAR进一步包括铰链区多肽。在一些实施例中，所述铰链区多肽包括CD8α的铰链区。在一些实施例中，所述铰链区多肽包括PD1的铰链区。在一些实施例中，所述铰链区多肽包括CD152的铰链区。
在各个实施例中，所述CAR进一步包括间隔子区。在一些实施例中，间隔子区多肽包括IgG1、IgG2、IgG4或IgD的CH2区和CH3区。
在各个实施例中，所述CAR进一步包括信号肽。
在各个实施例中，所述CAR包括如SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、66和68中的任一个所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR包括如SEQ ID NO:50中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR包括如SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR包括如SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR包括如SEQ ID NO：56中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR包括如SEQ ID NO：58中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR包括如SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR包括如SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR包括如SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR包括如SEQ IDNO:66中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述CAR包括如SEQ ID NO:68中所示的氨基酸序列。
在各个实施例中，所述CAR包括多肽，所述多肽包括本文所设想的CAR中的任何一种的氨基酸序列。
在本申请的另一方面，本文提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本文所设想的CAR或多肽中的任何一种。在一些实施例中，所述多核苷酸包括与如SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、65和67中的任一个所示的多核苷酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括如SEQ IDNO:49、51、53、55、57、59、61、63、65和67中的任一个所示的多核苷酸序列。
在本申请的另一方面，本文提供了一种载体，所述载体包括本文所设想的多核苷酸中的任何一种多核苷酸。在一些实施例中，所述载体是表达载体。在一些实施例中，所述载体是游离型载体。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述载体是逆转录病毒载体。在一些实施例中，所述载体是慢病毒载体。在一些实施例中，所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的组：人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)；人类免疫缺陷病毒2(HIV-2)；维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在特定实施例中，所述载体包括：左(5')逆转录病毒LTR、Psi(Ψ)包装信号、中心多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆转录病毒输出元件；与根据权利要求45所述的多核苷酸可操作地连接的启动子；以及右(3')逆转录病毒LTR。在一些实施例中，所述载体进一步包括异源聚腺苷酸化序列。在一些实施例中，所述载体进一步包括乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)或土拨鼠转录后调节元件(WPRE)。在一些实施例中，所述5'LTR的启动子用异源启动子替换。在一些实施例中，所述异源启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。在一些实施例中，所述5'LTR或所述3'LTR是慢病毒LTR。在一些实施例中，所述3'LTR包括一个或多个修饰。在一些实施例中，所述3'LTR包括一个或多个缺失。在一些实施例中，所述3'LTR是自失活(SIN)LTR。在一些实施例中，所述聚腺苷酸化序列是牛生长激素聚腺苷酸化或信号兔β-珠蛋白聚腺苷酸化序列。在一些实施例中，所述多核苷酸包括优化的Kozak序列。在一些实施例中，与所述多核苷酸可操作地连接的所述启动子选自由以下组成的组：巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)、延长因子1α启动子(EF1-α)、磷酸甘油酸激酶-1启动子(PGK)、泛素-C启动子(UBQ-C)、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)、多瘤增强子/单纯疱疹胸苷激酶启动子(MC1)、β肌动蛋白启动子(β-ACT)、猿猴病毒40启动子(SV40)和骨髓增殖性肉瘤病毒增强子、阴性对照区缺失的、dl587rev引物结合位点取代的(MND)U3启动子。
在本申请的另一方面，本文提供了一种细胞，所述细胞表达本文所设想的CAR或多肽中的任何一种CAR或多肽。在一些实施例中，所述细胞包括本文所设想的多核苷酸中的任何一种多核苷酸或本文所设想的载体中的任何一种载体。在一些实施例中，所述细胞是经基因工程化的宿主细胞。在一些实施例中，所述细胞是造血细胞。在一些实施例中，所述细胞是造血干细胞或祖细胞。在一些实施例中，所述细胞是CD34+造血干细胞或祖细胞。在一些实施例中，所述细胞是免疫效应细胞。在一些实施例中，所述细胞是T细胞。在一些实施例中，所述细胞是CD3+、CD4+和/或CD8+细胞。在一些实施例中，所述细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或辅助T细胞。在一些实施例中，所述T细胞是αβ-T细胞。在一些实施例中，所述T细胞是γδ-T细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施例中，所述自然杀伤细胞是自然杀伤T(NKT)细胞。在一些实施例中，所述细胞是巨噬细胞。
在各个实施例中，所述免疫效应细胞用本文所设想的载体中的任何一个载体转导，并且在存在PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激，由此与在不存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的经转导的免疫效应细胞的增殖相比，维持所述经转导的免疫效应细胞的增殖。在一些实施例中，与在不存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的免疫效应细胞相比，在存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的所述免疫效应细胞增加了以下的表达：i)一种或多种标志物，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：CD62L、CD127、CD197和CD38；或ii)所有标志物CD62L、CD127、CD197和CD38。在一些实施例中，与在不存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的免疫效应细胞相比，在存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的所述免疫效应细胞增加了以下的表达：i)一种或多种标志物，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：CD62L、CD127、CD27和CD8；或ii)所有标志物CD62L、CD127、CD27和CD8。在一些实施例中，所述PI3K抑制剂是ZSTK474。
在各个实施例中，所述细胞或所述其后代在与表达BCMA的细胞共培养时展现出高IFNγ释放。在一些实施例中，与相同细胞相比，所述细胞或所述其后代在与表达BCMA的细胞共培养时展现出类似或更高的IFNγ释放，除了所述CAR包括包含鼠类源性抗BCMA scFv的细胞外结构域之外。在一些实施例中，共培养的表达BCMA的细胞是Daudi细胞、HT1080.BCMA细胞和/或RPMI-8226细胞。在一些实施例中，所述细胞或所述其后代在与表达低BCMA的细胞共培养时展现出高IFNγ释放。在一些实施例中，所述表达低BCMA的细胞的表面BCMA表达是Daudi细胞、HT1080.BCMA细胞和/或RPMI-8226细胞的表面BCMA表达的至多1/5。在一些实施例中，所述表达低BCMA的细胞的表面BCMA表达是HT1080.BCMA细胞的表面BCMA表达的至多1/10。在一些实施例中，所述表达低BCMA的细胞的表面BCMA表达是RPMI-8226细胞的表面BCMA表达的至多1/10。在一些实施例中，所述表达低BCMA的细胞是RL细胞和/或Toledo细胞。在一些实施例中，与相同CAR T细胞相比，所述CAR T细胞在与低抗原密度细胞共培养时展现出更高的IFNγ释放，除了所述CAR包括包含鼠类源性抗BCMA scFv的细胞外结构域之外。在一些实施例中，所述细胞展现出低抗原非依赖性信号传导。在一些实施例中，与相同CAR T细胞相比，所述细胞展现出低抗原非依赖性信号传导，除了所述CAR包括包含鼠类源性抗BCMA scFv的细胞外结构域之外。
在本申请的另一方面，本文提供了一种组合物，所述组合物包括本文所设想的细胞中的任何一种细胞以及生理学上可接受的赋形剂。
在本申请的另一方面，本文提供了一种产生包括本文所设想的CAR或多肽的免疫效应细胞的方法，所述方法包括将本文所设想的载体中的任何一种载体引入到免疫效应细胞中。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过使所述免疫效应细胞与和CD3结合的抗体以及和CD28结合的抗体接触来刺激所述细胞并诱导所述细胞增殖；由此产生免疫效应细胞群体。在一些实施例中，在引入所述载体之前刺激所述免疫效应细胞并诱导所述免疫效应细胞增殖。在一些实施例中，所述免疫效应细胞包括T淋巴细胞。在一些实施例中，所述免疫效应细胞包括NK细胞。在一些实施例中，与在不存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的免疫效应细胞相比，在存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的所述免疫效应细胞增加了以下的表达：i)一种或多种标志物，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：CD62L、CD127、CD197和CD38；或ii)所有标志物CD62L、CD127、CD197和CD38。在一些实施例中，与在不存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的免疫效应细胞相比，在存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的所述免疫效应细胞增加了以下的表达：i)一种或多种标志物，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：CD62L、CD127、CD27和CD8；或ii)所有标志物CD62L、CD127、CD27和CD8。在一些实施例中，所述PI3K抑制剂是ZSTK474。
在本申请的另一方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的B细胞相关病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所提供的组合物中的任何一种组合物。在一些实施例中，所述B细胞相关病状是癌症。在一些实施例中，所述癌症是实体癌。在一些实施例中，所述癌症是液体癌。在一些实施例中，所述癌症是恶性血液肿瘤。在一些实施例中，所述B细胞相关病状是多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、恶性可能性不确定的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病、移植后淋巴增殖性障碍、免疫调节障碍、类风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征、恰加斯氏病(Chagas'disease)、格雷夫氏病(Grave′s disease)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′sgranulomatosis)、结节性多动脉炎、舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)、寻常性天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、抗磷脂综合征、ANCA相关血管炎、古德帕斯丘氏病(Goodpasture'sdisease)、川崎氏病(Kawasaki disease)、自身免疫性溶血性贫血和急进性肾小球肾炎、重链疾病、原发性或免疫细胞相关淀粉样变性或显著性未确定的单克隆性丙种球蛋白病。在一些实施例中，所述B细胞相关病状是B细胞恶性肿瘤。在一些实施例中，所述B细胞恶性肿瘤是多发性骨髓瘤(MM)或非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。在一些实施例中，所述MM选自由以下组成的组：明显多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤。在一些实施例中，所述NHL选自由以下组成的组：伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。在一些实施例中，所述B细胞相关病状是浆细胞恶性肿瘤。在一些实施例中，所述B细胞相关病状是自身免疫性疾病。在一些实施例中，所述自身免疫性疾病是全身性红斑狼疮。在一些实施例中，所述B细胞相关病状是类风湿性关节炎。在一些实施例中，所述B细胞相关病状是特发性血小板减少性紫癜、或重症肌无力或自身免疫性溶血性贫血。
在本申请的另一方面，本文提供了一种用于改善与受试者的表达BCMA的癌症相关的一种或多种症状的方法条件是，所述方法包括向所述受试者施用一定量的足以改善与表达BCMA的癌细胞相关的至少一种症状的本文所提供的组合物中的任何一种组合物。在一些实施例中，改善的所述一种或多种症状选自由以下组成的组：虚弱、疲劳、呼吸短促、容易挫伤和出血、频繁感染、淋巴结肿大、腹部肿胀或疼痛、骨骼或关节疼痛、骨折、计划外的体重减轻、食欲不振、盗汗、持续轻度发烧和排尿减少。
在本申请的另一方面，本文提供了一种用于减少受试者的表达BCMA的细胞的数量的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的足以与所述施用之前表达BCMA的细胞的数量相比减少表达BCMA的所述细胞的数量的根据权利要求116所述的组合物。
在本申请的另一方面，本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人BCMA多肽的一个或多个表位结合，所述人BCMA多肽包括：如SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中所示的可变轻链氨基酸序列内的可变轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3区；和/或如SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48中所示的可变重链氨基酸序列内的可变重链CDRH1、CDRH2和CDRH3区。在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括SEQ ID NO：1-3、9-11、17-19、25-27、33-35或41-43中的任一个所示的可变轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；和/或SEQ ID NO：4-6、12-14、20-22、28-30、36-38或44-46中所示的可变重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
在特定实施例中，所述抗体或抗原结合片段选自由以下组成的组：骆驼Ig、IgNAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)。在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段是scFv。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:1-3中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:4-6中的任一个所示的一个或多个重链CDR。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:9-11中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:12-14中的任一个所示的一个或多个重链CDR。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:17-19中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:20-22中的任一个所示的一个或多个重链CDR。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:25-27中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:28-30中的任一个所示的一个或多个重链CDR。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:33-35中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:36-38中的任一个所示的一个或多个重链CDR。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:41-43中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:44-46中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
在各个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中的任一个所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48中的任一个所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:7中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:8中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:15中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:16中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:23中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:24中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:31中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:32中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:39中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:40中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:47中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:48中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在各个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中的任一个所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48中的任一个所示的可变重链序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:7中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:8中所示的可变重链序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:15中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:16中所示的可变重链序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:23中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:24中所示的可变重链序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:31中所示的可变轻链序列和/或如SEQ IDNO:32中所示的可变重链序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ IDNO:39中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:40中所示的可变重链序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:47中所示的可变轻链序列和/或如SEQID NO:48中所示的可变重链序列。
在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是scFv，并且所述可变轻链位于所述可变重链的c末端。在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是scFv，并且所述可变重链位于所述可变轻链的c末端。
附图说明
图1示出了抗BCMA CAR构建体的示意图。
图2A-2D示出了每个细胞的载体拷贝数(图2A和2C)和通过FACS评估的T细胞上的CAR构建体的表达(图2B和2D)。
图3A-3I示出了与表达BCMA的Daudi细胞(图3C)或HT.1080.BCMA细胞(图3F和3I)相比，抗BCMA CAR T细胞单独(图3A、3D和3G)或与BCMA阴性横纹肌肉瘤(RD)细胞(图3B)或HT1080细胞(图3E和3H)共培养24小时释放的IFNγ的量。
图3J和3k示出了与BCMA-低Jeko1细胞(图3J)或BCMA-高RPMI8226细胞(图3K)共培养的抗BCMA CAR T细胞释放的IL2的量。
图4A-4C示出了表达比较物CAR、CAR1或CAR5的抗BCMA CAR T细胞单独(图4A)或与癌细胞共培养(图4B和4C)时释放的IFNγ的量。将细胞与抗原-低细胞系RL和Toledo(图4B)以及抗原-高细胞系Daudi和HT1080.BCMA(图4C)共培养24小时。
图5示出了表达对照物CAR、CAR1或CAR5的T细胞随时间对表达BCMA的HT.1080细胞的细胞毒性。
图6示出了HT.1080、RL、Toledo、Daudi、RPMI-8226和HT.1080.BCMA癌细胞上的BCMA抗原表达/密度。
图7A和7B示出了与不表达BCMA的HT1080-nucRed细胞(抗原非依赖性增殖；图7A)或表达BCMA的HT1080-nucRed.BCMA细胞(抗原依赖性增殖，图7B)共培养的CAR T细胞的增殖。
序列标识符简要说明
SEQ ID NO:1-48列出了本文所设想的抗BCMA CAR的示例性轻链CDR序列、重链CDR序列、可变轻链和可变重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49-68列出了本文所设想的示例性BCMA CAR构建体的多核苷酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:69列出了人BCMA的氨基酸序列。
SEQ ID NO:71-81列出了各种接头的氨基酸序列。
SEQ ID NO:82-106列出了蛋白酶切割位点和自切割多肽切割位点的氨基酸序列。
在前述序列中，X(如果存在的话)是指任何氨基酸或不存在氨基酸。
具体实施方式
A.概述
本发明总体上涉及用于治疗B细胞相关病状的改进的组合物和方法。具体地，本发明涉及用于治疗B细胞相关病状(例如，癌症)的改进的人抗BCMA抗体、CAR和CAR T细胞。
如本文所使用的，术语“B细胞相关病状”涉及与不适当的B细胞活性和B细胞恶性肿瘤相关的病状。在特定实施例中，本申请涉及使用经基因修饰的免疫效应细胞对B细胞相关病状进行改进的过继性细胞疗法。基因方法提供了增强免疫识别和消除癌细胞的潜在手段。
一种有前途的策略是对免疫效应细胞进行基因工程化以表达将细胞毒性朝癌细胞重新定向的嵌合抗原受体(CAR)。然而，任何CAR的潜在治疗功效涉及CAR的若干个组分之间的微妙平衡，包含但不限于选择正确的结构结构域(例如，铰链或跨膜结构域)，选择正确的信号传导或共刺激结构域(例如，4-1BB或CD3ζ)，以及选择正确的抗原结合结构域。例如，优选地，抗原结合结构域与在癌细胞上表达并且在非癌细胞上表达相对低(或不表达)的抗原结合。此外，抗原不能太强或太弱，以免没有收到信号传导或收到太多信号传导。
最近，通过使用靶向BCMA的治疗性抗体或嵌合抗原受体(CAR)，通过靶向B细胞成熟抗原(BCMA，也被称为CD269或肿瘤坏死因子受体超家族，成员17；TNFRSF17)来治疗B细胞恶性肿瘤的尝试已经取得有前途但有限的成功。事实上，尽管许多患者在这些患者群体中经历了先前从未见过的可测量的治疗益处，但并非所有接受这些治疗的患者都会经历完全缓解和许多复发。因此，这些患者群体对改进的治疗方法的需求仍然很大，包含改进抗BCMA抗体和/或CAR(包含CAR T疗法)。
BCMA是肿瘤坏死因子受体超家族的成员(参见例如Thompson等人,《实验医学杂志(J.Exp.Medicine)》,192(1):129-135,2000；以及Mackay等人,《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol)》,21:231-264,2003。BCMA结合B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)(参见例如Mackay等人,2003；以及Kalled等人,《免疫学评论(ImmunologicalReviews)》,204:43-54,2005)。在非恶性细胞中，据报道BCMA大部分表达在浆细胞和成熟B细胞亚群中(参见例如Laabi等人,《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J)》,77(1):3897-3904,1992；Laabi等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,22(7):1147-1154,1994；Kalled等人,2005；O'Connor等人,《实验医学杂志》,199(1):91-97,2004；以及Ng等人,《免疫学杂志(J.Immunol)》.,73(2):807-817,2004。缺乏BCMA的小鼠是健康的并且具有正常数量的B细胞，但长寿命浆细胞的存活受损(参见例如O'Connor等人,2004；Xu等人,《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol)》,21(12):4067-4074,2001；以及Schiemann等人,《科学(Science)》,293(5537):2 111-21 14,2001)。已经在多发性骨髓瘤细胞和其它淋巴瘤中普遍检测到BCMA RNA，并且已经由多名研究者在多发性骨髓瘤患者的浆细胞表面上检测到BCMA蛋白(参见例如Novak等人,《血液(Blood)》,103(2):689-694,2004；Neri等人,《临床癌症研究(Clinical Cancer Research)》,73(19):5903-5909,2007；Bellucci等人,《血液》,105(10):3945-3950,2005；以及Moreaux等人,《血液》,703(8):3148-3157,2004。
因此，本文所公开的过继性细胞疗法的改进的组合物和方法提供了经基因修饰的免疫效应细胞(例如，CAR T细胞)，所述经基因修饰的免疫效应细胞靶向表达BCMA的细胞并具有人源性抗原结合结构域，表现出改进的细胞因子释放和/或低抗原非依赖性信号传导。在特定实施例中，提供了包括人抗BCMA抗体或抗原结合片段、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域的CAR。在另外的实施例中，改进的CAR T细胞在与低抗原密度细胞共培养时展现出高IFNγ释放。
在一个实施例中，提供了被基因修饰成表达本文所设想的CAR的免疫效应细胞。表达CAR的T细胞在本文中被称为CART细胞或经CAR修饰的T细胞。
在各个实施例中，将本文所设想的经基因修饰的免疫效应细胞施用于患有B细胞相关病状，例如，与B细胞相关的自身免疫性疾病或B细胞恶性肿瘤的患者。
在其它实施例中，提供了改进的抗BCMA抗体或其片段。
除非特别相反地指示，否则本发明的实践将会采用本领域技术范围内常规的化学、生物化学、有机化学、分子生物学、微生物学、重组DNA技术、遗传学、免疫学和细胞生物学方法，所述方法中的许多出于说明的目的在下文进行描述。此类技术在文献中进行了充分解释。参见例如Sambrook等人,《分子克隆：实验手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》(第3版,2001)；Sambrook等人,《分子克隆：实验手册》(第2版,1989)；Maniatis等人,《分子克隆：实验手册》(1982)；Ausubel等人,《当代分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(约翰威立父子公司(Wiley and Sons),2008年7月更新)；《精编分子生物学实验指南：当代分子生物学实验指南的方法概要(Short Protocolsin Molecular Biology:ACompendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology)》,格林出版协会与威利国际科学(Greene Pub.Associates andWiley-Interscience)；Glover,《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A PracticalApproach)》,第I卷&第II卷(牛津的IRL出版社(IRL Press,Oxford),1985)；Anand,《复杂基因组分析技术(Techniques for the Analysis of Complex Genomes)》,(纽约的学术出版社公司(Academic Press,New York),1992)；《转录和转译(Transcription andTranslation)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1984)；Perbal,《分子克隆实用指南(APractical Guide to Molecular Cloning)》(1984)；Harlow和Lane,《抗体(Antibodies)》,(纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.),1998)；《当代免疫学指南(Current Protocols in Immunology)》,Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober编辑,1991)；《免疫学年度评论》；以及《免疫学进展(Advances in Immunology)》等期刊上的专著。
B.定义
在更加详细地阐述本申请之前，提供本文要使用的某些术语的定义可能有助于理解本申请。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。尽管可以使用与本文所描述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料来实践或测试特定实施例，但本文中描述组合物、方法和材料的优选实施例。出于本申请的目的，下文定义以下术语。
本文使用的冠词“一(a/an)”是指一个(种)或超过一个(种)(即，至少一个(种)或一个(种)或多个(种))该冠词的语法对象。举例来说，“一要素”意指一个要素或一个或多个要素。
替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一个、两个或其任何组合。
术语“和/或”应理解为意指替代方案中的一种或两种。
如本文所使用，术语“约”或“大约”是指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“约”是指关于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
在一个实施例中，范围，例如，1至5、约1至5或约1至约5指代所述范围所涵盖的每个数值。例如，在一个非限制性且仅说明性实施例中，范围“1至5”相当于表达1、2、3、4、5；或1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0；或1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。
如本文所使用，术语“基本上”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度是参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比。在一个实施例中，“基本上相同”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度产生的作用，例如，生理作用与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大致相同。
在本说明书通篇，除非上下文另外要求，否则“包含(comprise/comprises/comprising)”一词应理解为暗指包括所述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或任何其它组步骤或要素。“由…组成”意指包含且限于短语“由…组成”之后的事物。因此，短语“由…组成”指示所列要素是必不可少或必需的，并且不能存在其它要素。“基本上由…组成”意指包含短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响关于所列要素的公开内容中所说明的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由…组成”指示所列要素是必不可少的或必需的，而且不存在实质上影响所列要素的活性或作用的其它要素。
贯穿本说明书中对“一个实施例”、“实施例”、“特定实施例”、“相关实施例”、“某个实施例”、“另外的实施例”或“进一步的实施例”或其组合的引用意味着结合所述实施例所描述的特定特征、结构或特性包含在至少一个实施例中。因此，上述短语在贯穿本说明书的各个地方的出现不一定全部是指同一个实施例。此外，特定特征、结构或特性可以通过任何适合方式组合于一个或多个实施例中。还应理解的是，在一个实施例中对特征的肯定叙述充当在特定实施例中排除所述特征的基础。
在本申请通篇阐述了另外的定义。
C.人抗BCMA抗体
在特定实施例中，本文提供了与人BCMA结合的抗体或其抗原结合片段。
术语“抗体”是指属于包括至少轻链或重链免疫珠蛋白可变区或其片段的多肽的结合剂，所述轻链或重链免疫珠蛋白可变区或其片段特异性地识别抗原的一个或多个表位并与其结合，如肽、脂质、多糖或含有抗原决定簇的核酸，如通过免疫细胞识别的那些。
术语“抗体”涵盖任何天然存在的、重组的、经修饰的或经工程化的免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构或其抗原结合片段或部分，或其衍生物，如本文其它地方进一步描述的。因此，所述术语是指与靶抗原特异性结合的免疫球蛋白分子，并且包含例如嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体和双特异性抗体。完整抗体将通常包括至少两条全长重链和两条全长轻链，但在一些情况下可以包含更少的链，如骆驼科中天然存在的抗体，其可以仅包括重链。抗体可以仅源自单一来源，或者可以是“嵌合的”，即，抗体的不同部分可以源自两种不同的抗体。抗体或其抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割在杂交瘤中产生。
术语“抗原结合片段”或“抗体结合部分”是指保留与抗原(例如，BCMA)特异性结合的能力的一个或多个抗体片段。抗原结合片段包含但不限于与抗原特异性结合以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的多肽或糖蛋白。在一些实施例中，抗体的抗原结合部分可以例如使用任何合适的标准技术，如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变结构域和任选地抗体恒定结构域的DNA的操作和表达的重组基因工程技术源自完整抗体分子。在优选实施例中，所述抗原结合片段是单链可变片段(svFv)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH结构域和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中并且处于任何朝向(例如，VL-VH或VH-VL)。例如，在一些实施例中，所述scFv可变轻链位于所述可变重链的c末端。在一些实施例中，所述scFv可变重链位于所述可变轻链的c末端。通常，所述scFv多肽进一步包括使scFv能够形成用于抗原结合的期望结构的在VH结构域与VL结构域之间的多肽接头。关于scFv的综述，参见例如，Pluckthün,《单克隆抗体药理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,(纽约的施普林格出版社(Springer Verlag,New York),1994),第269-315页。
“分离的抗体或其抗原结合片段”是指已经从其天然环境的组分中鉴定、分离和/或回收的抗体或其抗原结合片段。
“抗原(Ag)”广泛地包含在抗体或片段特异性结合的结合区内包括抗原决定簇的任何分子。在特定实施例中，“抗原(Ag)”是指可以在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包含注射或吸收到动物内的组合物(如包含癌症特异性蛋白的组合物)。抗原与具有特定体液或细胞免疫的产物反应，包含由如公开的抗原等异源抗原诱导的产物。在特定实施例中，靶抗原是BCMA多肽(例如，人BCMA多肽)的表位。
抗原可以是单个单位分子(如蛋白质单体或片段)或由多个组分组成的复合物。抗原提供能够被选择性结合剂如抗原结合蛋白(包含，例如，抗体)结合的表位，例如，分子或分子的一部分，或分子或分子部分的复合物。因此，选择性结合剂可以与由复合物中的两种或更多种组分形成的抗原特异性结合。在一些实施例中，抗原能够用于动物以产生能够与该抗原结合的抗体。抗原可以具有能够与不同抗原结合蛋白，例如，抗体相互作用的一个或多个表位。
“表位”或“抗原决定簇”是指结合剂与其结合的抗原的区。表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸两者形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位在独特的空间构象中通常包含至少3个并且更常见地至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。
如本文所使用的，术语“特异性结合亲和力(specific binding affinity)”或“特异性结合(specifically binds)”或“特异性结合的(specifically bound)”或“特异性结合(specific binding)”或“特异性靶向(specifically targets)”描述了抗BCMA抗体或其抗原结合片段(或包括所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段的CAR)与BCMA(例如，人BCMA)以相比于背景结合更大的结合亲和力的结合。如果结合结构域(或包括结合结构域的CAR或含有结合结构域的融合蛋白)与BCMA以例如大于或等于约105M-1的亲和力或Ka(即，特定结合相互作用的平衡缔合常数，其中单位为1/M)结合或缔合，则其与BCMA“特异性结合”。在某些实施例中，结合结构域(或其融合蛋白)与靶标以大于或等于约106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1的Ka结合。“高亲和力”结合结构域(或其单链融合蛋白)是指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更大的那些结合结构域。
可替代地，亲和力可以被定义为以M为单位的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)(例如，10-5M至10-13M或更低)。根据本申请的结合结构域多肽以及CAR蛋白质的亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如，通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定)；或通过结合缔合；或使用所标记的配体的置换测定；或使用如可从新泽西州皮斯卡塔韦Biacore公司(Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)获得的Biacore T100等表面等离子体共振装置、或如分别可从康宁公司(Corning)和珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)获得的EPIC系统或EnSpire等光学生物传感器技术(还参见，例如，Scatchard等人(1949)《纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》51：660；以及美国专利第5,283,173号；第5,468,614号或等效物)。
在一个实施例中，特异性结合亲和力为背景结合的约2倍、为背景结合的约5倍、为背景结合的约10倍、为背景结合的约20倍、为背景结合的约50倍、为背景结合的约100倍或为背景结合的约1000倍或更多倍。
在特定实施例中，CAR的细胞外结合结构域包括抗体或其抗原结合片段。在CAR的上下文中，“抗体”是指包括至少轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽的结合剂，所述轻链或重链免疫球蛋白可变区特异性地识别并结合抗原的表位，如肽、脂质、多糖或含有抗原决定簇的核酸，如通过免疫细胞识别的那些。
如本领域的技术人员所理解的并且如本文中其它地方所描述的，完全抗体包括两条重链和两条轻链。每条重链由可变区以及第一、第二和第三恒定区组成，而每条轻链由可变区和恒定区组成。
轻链和重链可变区包含被三个高变区中断的“框架”区，也被称为“互补决定区”或“CDR”。CDR可以通过常规方法定义或鉴定，如通过根据Kabat等人(Wu,TT和Kabat,E.A.,《实验医学期刊(J Exp Med)》132(2):211-50,(1970)；Borden,P.和Kabat E.A.,《美国国家科学院院刊(PNAS)》,84:2440-2443(1987)；(参见Kabat等人,《免疫学关注的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，美国卫生与公共事业部(U.S.Department of Health and Human Services),1991，所述文献通过引用并入本文)的序列或通过根据Chothia等人(Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志(JMol.Biol)》,196(4):901-917(1987)；Chothia,C.等人,《自然(Nature)》,342:877-883(1989))的结构来定义或鉴定。
Padlan(1995)《美国实验生物学会联合会杂志(FASEB J.)》9:133-139和MacCallum(1996)《分子生物学杂志》262(5):732-45描述了定义与Kabat CDR重叠的CDR的其它边界。仍其它CDR边界定义可能不严格遵循本文系统之一，但尽管如此将与Kabat CDR重叠，但是鉴于特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原-结合的预测或实验发现，所述边界定义可以被缩短或加长。例如，可以根据AbM编号方案确定抗体的CDR，所述AbM编号方案是指AbM高变区，其代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且用于牛津分子AbM抗体建模软件(牛津分子科技集团(Oxford Molecular Group,Inc.))。
另外地，抗体的CDR可以根据Lefranc M-P,(1999)《免疫学家(TheImmunologist)》7:132-136和Lefranc M-P等人,(1999)《核酸研究》27:209-212中描述的IMGT编号系统来确定。
在MacCallum R M等人,(1996)《分子生物学杂志》262:732-745中公开了CDR确定的仍其它方法。还参见例如Martin A.“抗体可变结构域的蛋白序列和结构分析(ProteinSequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains)”,《抗体工程(Antibody Engineering)》,Kontermann和Dübel编辑,第31章,第422-439页,柏林的施普林格出版社(Springer-Verlag,Berlin)(2001)。本领域技术人员已知专有和公开可用的程序，其可以用于基于本文所描述的CDR定义中的任何CDR定义来确定CDR，例如，abYsis(abysis.org/abysis/)和IMGT/V-QUEST(imgt.org/IMGT_vquest)。
用于预测轻链CDR的规则的说明性实例包含：CDRL1开始于约残基24，之前是Cys，为约10-17个残基并且之后是Trp(通常是Trp-Tyr-Gln，但还是Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln、Trp-Tyr-Leu)；CDRL2开始于CDRL1结束后的约16个残基，通常之前是Ile-Tyr还有Val-Tyr、Ile-Lys、Ile-Phe并且为7个残基；并且CDRL3开始于CDRL2结束后的约33个残基，之前是Cys，为7-11个残基并且之后是Phe-Gly-XXX-Gly(SEQ ID NO:108)(XXX是任何氨基酸)。
用于预测重链CDR的规则的说明性实例包含：CDRH1开始于约残基26，之前是Cys-XXX-XXX-XXX(SEQ ID NO:109)，为10-12个残基并且之后是Trp(通常是Trp-Val，但还是Trp-Ile、Trp-Ala)；CDRH2开始于CDRH1结束后约15个残基，通常之前是Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(SEQ ID NO:110)或多个变异，为16-19个残基并且之后是Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala，AbM定义提前结束7个残基；并且CDRH3开始于CDRH2结束后的约33个残基，之前是Cys-XXX-XXX(通常是Cys-Ala-Arg)，为3到25个残基并且之后是Trp-Gly-XXX-Gly(SEQ ID NO:111)。
因此，在某些实施例中，本申请提供了分离的抗体、其抗原结合片段，所述分离的抗体、其抗原结合片段与人BCMA蛋白特异性结合并包括重链可变区，所述重链可变区包括可变轻链SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3区氨基酸序列和/或可变重链SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3区氨基酸序列，其中每个CDR是根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义的组合、IMGT定义、AbM定义或CDR的接触定义来定义的。在一些实施例中，所述CDR是根据Kabat定义来定义的。在一些实施例中，所述CDR是根据Chothia定义来定义的。在一些实施例中，所述CDR是根据AbM定义来定义的。在一些实施例中，所述CDR是根据IMGT定义来定义的。在一些实施例中，所述CDR是根据接触定义来定义的。在一些实施例中，所述CDR是通过上述CDR定义中的任何一个CDR定义的组合来定义的。
适用于本文所设想的抗体或其抗原结合片段的轻链CDR的说明性实例包含但不限于SEQ ID NO:1-3、9-11、17-19、25-27、33-35或41-43中所示的CDR序列。适用于本文所设想的抗体或其抗原结合片段的重链CDR的说明性实例包含但不限于SEQ ID NO:4-6、12-14、20-22、28-30、36-38或44-46中所示的CDR序列。
如本文所公开的，提及“VH”或“VH”是指免疫珠蛋白重链的可变区，包含抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或其它抗体片段的可变区。如本文所公开的，提及“VL”或“VL”是指免疫珠蛋白轻链的可变区，包含抗体、Fv、scFv、dsFv、Fab或其它抗体片段的可变区。
在特定实施例中，抗原特异性结合结构域是与人BCMA多肽结合的scFv。适用于本文所设想的抗体或其抗原结合片段的可变重链的说明性实例包含但不限于SEQ ID NO:8、16、24、32、40和48中所示的氨基酸序列。适用于本文所设想的抗体或其抗原结合片段的可变轻链的说明性实例包含但不限于SEQ ID NO:7、15、23、31、39和47中所示的氨基酸序列。
本文所提供的BCMA特异性结合结构域还包括一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。此类CDR可以是选自轻链的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重链的CDRH1、CDRH2和CDRH3的人或非人CDR或改变的非人CDR。在某些实施例中，BCMA特异性结合结构域包括：(a)轻链可变区，其包括轻链CDRL1、轻链CDRL2和轻链CDRL3；以及(b)重链可变区，其包括重链CDRH1、重链CDRH2和重链CDRH3。在优选实施例中，所述CDR是人CDR。
适用于本文所设想的抗体或其抗原结合片段的轻链CDR的说明性实例包含但不限于SEQ ID NO:1-3、9-11、17-19、25-27、33-35或41-43中所示的CDR序列。适用于本文所设想的抗体或其抗原结合片段的重链CDR的说明性实例包含但不限于SEQ ID NO:4-6、12-14、20-22、28-30、36-38或44-46中所示的CDR序列。
在各个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括一个或多个CDR序列，与对应的CDR区相比，所述一个或多个CDR序列与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3基本上类似。例如，所述抗体或其抗原结合片段可以包含一个或多个CDR序列(例如，SEQ ID NO:1-6、9-14、17-22、25-30、33-38或41-46)，与SEQ ID NO:1-6、9-14、17-22、25-30、33-38或41-46中的任一个中的对应的CDR区相比，每个CDR序列含有至多1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基变异。
如本文所使用的，短语“氨基酸变异”或“氨基酸变化”或“氨基酸残基的变化”是指与参考序列相比的一个或多个氨基酸差异并且包含氨基酸修饰、取代、插入和/或缺失。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括至少三个选自以下的CDR，任选地包括至多3个氨基酸变化，例如CDR中的每一个的1个、2个或3个氨基酸变化：CDRL1：SEQID NO:1；CDRL2：SEQ ID NO:2；CDRL3：SEQ ID NO:3；CDRH1：SEQ ID NO:4；CDRH2：SEQ IDNO:5；和CDRH3：SEQ ID NO:6。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括至少三个选自以下的CDR，任选地包括至多3个氨基酸变化，例如CDR中的每一个的1个、2个或3个氨基酸变化：CDRL1：SEQID NO:9；CDRL2：SEQ ID NO:10；CDRL3：SEQ ID NO:11；CDRH1：SEQ ID NO:12；CDRH2：SEQ IDNO:13；和CDRH3：SEQ ID NO:14。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括至少三个选自以下的CDR，任选地包括至多3个氨基酸变化，例如CDR中的每一个的1个、2个或3个氨基酸变化：CDRL1：SEQID NO:17；CDRL2：SEQ ID NO:18；CDRL3：SEQ ID NO:19；CDRH1：SEQ ID NO:20；CDRH2：SEQID NO:21；和CDRH3：SEQ ID NO:22。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括至少三个选自以下的CDR，任选地包括至多3个氨基酸变化，例如CDR中的每一个的1个、2个或3个氨基酸变化：CDRL1：SEQID NO:25；CDRL2：SEQ ID NO:26；CDRL3：SEQ ID NO:27；CDRH1：SEQ ID NO:28；CDRH2：SEQID NO:29；和CDRH3：SEQ ID NO:30。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括至少三个选自以下的CDR，任选地包括至多3个氨基酸变化，例如CDR中的每一个的1个、2个或3个氨基酸变化：CDRL1：SEQID NO:33；CDRL2：SEQ ID NO:34；CDRL3：SEQ ID NO:35；CDRH1：SEQ ID NO:36；CDRH2：SEQID NO:37；和CDRH3：SEQ ID NO:38。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括至少三个选自以下的CDR，任选地包括至多3个氨基酸变化，例如CDR中的每一个的1个、2个或3个氨基酸变化：CDRL1：SEQID NO:41；CDRL2：SEQ ID NO:42；CDRL3：SEQ ID NO:43；CDRH1：SEQ ID NO:44；CDRH2：SEQID NO:45；和CDRH3：SEQ ID NO:46。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:1、2和3中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:4、5和6中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:1、2和3中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及如SEQ ID NO:4、5和6中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:9、10和11中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO：12、13和14中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:9、10和11中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及如SEQ ID NO:12、13和14中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:17、18和19中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:20、21和22中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:17、18和19中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及如SEQ ID NO：20、21和22中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:25、26和27中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO：28、29和30中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO:25、26和27中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及如SEQ ID NO：28、29和30中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO：33、34和35中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO：36、37和38中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO：33、34和35中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及如SEQ ID NO：36、37和38中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:41、42和43中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO：44、45和46中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。在特定实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括：如SEQ ID NO：41、42和43中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及如SEQ ID NO:44、45和46中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
本发明的各方面涉及与人BCMA选择性结合的抗体或其抗原结合片段，所述人BCMA包括重链可变区序列和轻链可变区序列。
在各个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括具有与SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括具有与SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括具有与SEQ ID NO:7具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区和/或具有与SEQ ID NO:8具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括具有与SEQ ID NO:15具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区和/或具有与SEQ ID NO:16具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括具有与SEQ ID NO:23具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区和/或具有与SEQ ID NO:24具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括具有与SEQ ID NO:31具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区和/或具有与SEQ ID NO:32具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括具有与SEQ ID NO:39具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区和/或具有与SEQ ID NO:40具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括具有与SEQ ID NO:47具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区和/或具有与SEQ ID NO:48具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施例中，所述轻链可变区序列和/或所述重链可变区序列在本文所提供的CDR序列中的任何CDR序列内没有变化。例如，在一些实施例中，序列变异的程度(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)可以出现在除了本文所提供的CDR序列中的任何CDR序列之外的重链可变和/或轻链可变氨基酸序列内。
在一些实施例中，使用Karlin和Altschul《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》87：2264-68,1990的算法确定两个氨基酸序列的“同一性百分比”，所述算法如Karlin和Altschul《美国国家科学院院刊)》90：5873-77,1993所修改的。此类算法并入到Altschul等人,《分子生物学杂志》215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用XBLAST程序(分值＝50，字长＝3)来执行BLAST蛋白质检索以获得与所关注蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空位时，可以利用如Altschul等人,《核酸研究》25(l7):3389-3402,1997中描述的空位的BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在各个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。
在各个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。
在各个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列。
在各个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列。
在各个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列。
在各个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:47中所示的氨基酸序列，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:48中所示的氨基酸序列。
在本文所设想的抗体或其抗原结合片段中的任何抗体或其抗原结合片段中，可以在所述残基不可能参与抗体-抗原相互作用的位置处将一个或多个保守突变引入到所述CDR或框架序列中。在一些实施例中，可以在所述残基不可能参与与BCMA相互作用的位置处将此类保守突变引入到所述CDR或框架序列中，如基于晶体结构所确定的。在一些实施例中，可能的界面(例如，参与抗原-抗体相互作用的残基)可以从共享结构相似性的其它抗原的已知结构信息推断。
在各个实施例中，本申请提供了与本文所设想的抗体或其抗原结合片段竞争结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，本申请提供了与本文所设想的抗体或其抗原结合片段相同的表位结合的抗体或其抗原结合片段。
本申请的各方面涉及与如本文所提供的特异性抗体或其抗原结合片段中的任何特异性抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体，例如，具有一个或多个如上文所描述的CDR序列(1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR序列)的抗体。在一个实施例中，本申请提供了与具有如SEQ ID NO:1-3、9-11、17-19、25-27、33-35或41-43中所示的轻链CDR序列和/或如SEQ ID NO:4-6、12-14、20-22、28-30、36-38或44-46中所示的重链CDR序列的抗体竞争或交叉竞争的抗体和其抗原结合片段。在一个实施例中，本申请提供了与具有包括SEQ IDNO:7、15、23、31、39或47的轻链可变区序列和/或包括SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48的重链可变区序列的抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体。
在一个实施例中，本申请提供了与具有如SEQ ID NO:1-3中所示的轻链CDR序列和/或如SEQ ID NO:4-6中所示的重链CDR序列的抗体竞争或交叉竞争的抗体和其抗原结合片段。在一个实施例中，本申请提供了与具有包括SEQ ID NO:7的轻链可变区序列和/或包括SEQ ID NO:8的重链可变区序列的抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体。
在一个实施例中，本申请提供了与具有如SEQ ID NO:9-11中所示的轻链CDR序列和/或如SEQ ID NO:12-14中所示的重链CDR序列的抗体竞争或交叉竞争的抗体和其抗原结合片段。在一个实施例中，本申请提供了与具有包括SEQ ID NO:15的轻链可变区序列和/或包括SEQ ID NO:16的重链可变区序列的抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体。
在一个实施例中，本申请提供了与具有如SEQ ID NO:17-19中所示的轻链CDR序列和/或如SEQ ID NO:20-22中所示的重链CDR序列的抗体竞争或交叉竞争的抗体和其抗原结合片段。在一个实施例中，本申请提供了与具有包括SEQ ID NO:23的轻链可变区序列和/或包括SEQ ID NO:24的重链可变区序列的抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体。
在一个实施例中，本申请提供了与具有如SEQ ID NO:25-27中所示的轻链CDR序列和/或如SEQ ID NO:28-30中所示的重链CDR序列的抗体竞争或交叉竞争的抗体和其抗原结合片段。在一个实施例中，本申请提供了与具有包括SEQ ID NO:31的轻链可变区序列和/或包括SEQ ID NO:32的重链可变区序列的抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体。
在一个实施例中，本申请提供了与具有如SEQ ID NO:33-35中所示的轻链CDR序列和/或如SEQ ID NO:36-38中所示的重链CDR序列的抗体竞争或交叉竞争的抗体和其抗原结合片段。在一个实施例中，本申请提供了与具有包括SEQ ID NO:39的轻链可变区序列和/或包括SEQ ID NO:40的重链可变区序列的抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体。
在一个实施例中，本申请提供了与具有如SEQ ID NO:41-43中所示的轻链CDR序列和/或如SEQ ID NO:44-46中所示的重链CDR序列的抗体竞争或交叉竞争的抗体和其抗原结合片段。在一个实施例中，本申请提供了与具有包括SEQ ID NO:47的轻链可变区序列和/或包括SEQ ID NO:48的重链可变区序列的抗体或其抗原结合片段竞争或交叉竞争的抗体。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段在与本文所提供的抗体中的任何抗体相同的表位处或附近结合。在一些实施例中，如果抗体或其抗原结合片段在表位的15个或更少个氨基酸残基内结合，则其在表位附近结合。在一些实施例中，如本文所提供的抗体或其抗原结合片段中的任何抗体或其抗原结合片段与本文所提供的抗体中的任何抗体所结合的表位的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸残基内结合。
在另一实施例中，本文提供了以抗体与蛋白质之间的小于10-8M的平衡解离常数KD与本文所提供的抗原中的任何抗原(例如，人BCMA)竞争或交叉竞争结合的抗体或其抗原结合片段。在其它实施例中，抗体以范围为10-11M至10-8M的KD竞争或交叉竞争与BCMA结合。在一些实施例中，本文提供了竞争与本文所设想的抗体或其抗原结合片段结合的BCMA特异性抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，本申请提供了与本文所设想的抗体或其抗原结合片段相同的表位结合的BCMA特异性抗体或其抗原结合片段。
本文所提供的抗体可以使用任何合适的方法来表征。例如，一种方法是鉴别与抗原结合的表位或“表位映射”。存在多种合适的用于映射和表征蛋白质上的表位位置的方法，所述方法包含解决抗体-抗原络合物的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定和基于合成肽的测定，如例如在以下文献的第11章中所描述的：Harlow和Lane,《使用抗体，实验室手册(Using Antibodies,a Laboratory Manual)》,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社,1999。在另外一个实例中，表位映射可以用于确定与抗体结合的序列。表位可以是线性表位，即，含在单个氨基酸区段中或由不一定含在单个区段中的氨基酸的三维相互作用形成的构象表位(一级结构线性序列)。
可以对不同长度(例如，至少4-19个氨基酸长)的肽进行分离或合成(例如，重组)并且用于与抗体的结合测定。在另一个实例中，可以通过使用源自靶抗原序列的重叠肽并确定抗体的结合来在全身筛查中确定与抗体结合的表位。根据基因片段表达测定，随机地或通过特异性遗传构建体使编码靶抗原的开放阅读框片段化并且确定抗原的表达片段与待测试抗体的反应性。例如，基因片段可以通过PCR产生并且然后在存在放射性氨基酸的情况下在体外转录并翻译成蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳来确定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。也可以通过使用在噬菌体颗粒表面展示的随机肽序列的大型文库(噬菌体文库)来鉴别某些表位。可替代地，可以在简单的结合测定中测试重叠肽片段的限定文库与测试抗体的结合。在另外一个实例中，可以执行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变以鉴别表位结合所需的、足够的和/或必需的残基。例如，可以使用靶抗原的突变体执行结构域交换实验，其中BCMA的各种片段已经被来自密切相关但抗原性不同的蛋白质，如BCMA蛋白家族的另一个成员的序列替换(交换)。通过评估抗体与突变体BCMA的结合，可以评估特定抗原片段对抗体结合的重要性。
可替代地，可以使用已知的与相同抗原结合的其它抗体来执行竞争测定以确定抗体是否与其它抗体相同的表位结合。竞争测定是本领域技术人员所熟知的。
进一步地，本文所提供的抗体中的任何抗体与BCMA中一个或多个残基的相互作用可以通过常规技术来确定。例如，可以确定晶体结构，并且可以相应地确定BCMA中的残基与抗体(或抗原结合片段)中的一个或多个残基之间的距离。基于此类距离，可以确定BCMA中的特定残基是否与抗体中的一个或多个残基相互作用。进一步地，如竞争测定和靶诱变测定等合适的方法可以用于确定候选抗体的优先结合。
在一些实施例中，与BCMA选择性结合的本申请的抗体或其抗原结合片段包含如本文所设想的互补决定区(CDR)中的一个或多个。在一些实施例中，本申请提供了编码与BCMA选择性结合的抗体或其抗原结合片段的核酸分子，如本文所设想的。在一个实施例中，核酸分子编码如本文所设想的CDR序列中的一个或多个。
D.嵌合抗原受体
在各个实施例中，提供了将免疫效应细胞的细胞毒性重定向至表达BCMA的细胞(例如，B细胞)的改进的经基因工程化的受体。这些经基因工程化的受体在本文中被称为嵌合抗原受体(CAR)。CAR是将针对期望的抗原(例如，BCMA)的基于抗体的特异性与T细胞受体激活细胞内结构域组合以产生展现出特异性抗BCMA细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。如本文所使用的，术语“嵌合”描述由来自不同来源的不同蛋白质或DNA部分构成。
本文所设想的CAR包括与BCMA结合的细胞外结构域(也被称为结合结构域或抗原特异性结合结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。CAR的抗BCMA抗原结合结构域与靶细胞表面上的BCMA的接合导致CAR的聚集并向含CAR的细胞递送激活刺激。CAR的主要特性是其能够利用单克隆抗体、可溶性配体或细胞特异性共同受体的细胞特异性靶向能力来重新定向免疫效应细胞特异性，从而触发增殖、细胞因子产生、吞噬作用或可以以主要组织相容性(MHC)非依赖性方式介导靶抗原表达细胞的细胞死亡的分子的产生。
在各个实施例中，CAR包括：细胞外结合结构域，所述细胞外结合结构域包括抗BCMA特异性结合结构域；跨膜结构域；一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域；以及初级信号传导结构域。
在特定实施例中，CAR包括：细胞外结合结构域，所述细胞外结合结构域包括抗BCMA抗体或其抗原结合片段；一个或多个铰链结构域或间隔子结构域；跨膜结构域，所述跨膜结构域包含；一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域；以及初级信号传导结构域。
1.结合结构域
在特定实施例中，本文所考虑的CAR包括细胞外结合结构域，所述细胞外结合结构域包括与B细胞上表达的人BCMA多肽特异性结合的抗BCMA抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段与人BCMA多肽的一个或多个表位特异性结合。在特定实施例中：所述抗BCMA抗体或抗原结合片段是人抗体或抗原结合片段。在各个实施例中，所述CAR包括如本文所设想的抗BCMA抗体或抗原结合片段。
如本文所使用的，术语“结合结构域”、“细胞外结构域”、“细胞外结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”和“细胞外抗原特异性结合结构域”可互换使用并为CAR提供与所关注靶抗原，例如，BCMA特异性结合的能力。结合结构域可以源自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。
在特定实施例中，本文所设想的CAR包括作为scFv的抗原特异性结合结构域。在各个实施例中，所述scFv结构域存在于单个多肽链中并且处于任何朝向(例如，VL-VH或VH-VL)。例如，在一些实施例中，所述scFv可变轻链位于所述可变重链的c末端。在其它实施例中，所述scFv可变重链位于所述可变轻链的c末端。参见例如图1。通常，所述scFv多肽进一步包括使scFv能够形成用于抗原结合的期望结构的在VH结构域与VL结构域之间的多肽接头。
适用于构建本文所设想的BCMA CAR的可变重(VH)链的说明性实例包含但不限于SEQ ID NO:8、16、24、32、40和48中所示的氨基酸序列。适用于构建本文所设想的BCMA CAR的可变轻(VL)链的说明性实例包含但不限于SEQ ID NO:7、15、23、31、39和47中所示的氨基酸序列。
本文所提供的BCMA特异性结合结构域还包括一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。此类CDR可以是选自轻链的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及重链的CDRH1、CDRH2和CDRH3的非人CDR或改变的非人CDR。在某些实施例中，BCMA特异性结合结构域包括：(a)轻链可变区，其包括轻链CDRL1、轻链CDRL2和轻链CDRL3；以及(b)重链可变区，其包括重链CDRH1、重链CDRH2和重链CDRH3。
因此，在某些实施例中，本申请提供了CAR细胞外结合结构域，所述CAR细胞外结合结构域与人BCMA蛋白特异性结合并包括重链可变区，所述重链可变区包括可变轻链SEQ IDNO:7、15、23、31、39或47中所示的CDRL1、CDRL2和CDRL3区氨基酸序列和/或可变重链SEQ IDNO:8、16、24、32、40或48中所示的CDRH1、CDRH2和CDRH3区氨基酸序列。在特定实施例中，每个CDR是根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义的组合、IMGT定义、AbM定义或CDR的接触定义来定义的。在一些实施例中，所述CDR是根据Kabat定义来定义的。在一些实施例中，所述CDR是根据Chothia定义来定义的。在一些实施例中，所述CDR是根据AbM定义来定义的。在一些实施例中，所述CDR是根据IMGT定义来定义的。在一些实施例中，所述CDR是根据接触定义来定义的。在一些实施例中，所述CDR是通过上述CDR定义中的任何一个CDR定义的组合来定义的。
适用于构建本文所设想的人源化BCMACAR的轻链CDR的说明性实例包含但不限于SEQ ID NO:1-3、9-11、17-19、25-27、33-35或41-43中所示的CDR序列。适用于构建本文所设想的人源化BCMACAR的重链CDR的说明性实例包含但不限于SEQ ID NO:4-6、12-14、20-22、28-30、36-38或44-46中所示的CDR序列。
在各个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括一个或多个CDR序列，与对应的CDR区相比，所述一个或多个CDR序列与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和/或CDRL3基本上类似。例如，所述BCMA特异性结合结构域可以包含一个或多个CDR序列(例如，SEQ ID NO:1-6、9-14、17-22、25-30、33-38或41-46)，与SEQ ID NO:1-6、9-14、17-22、25-30、33-38或41-46中的任一个中的对应的CDR区相比，每个CDR序列含有至多1个、2个、3个、4个或5个氨基酸残基变异。
如本文所使用的，短语“氨基酸变异”或“氨基酸变化”或“氨基酸残基的变化”包含氨基酸取代和/或缺失。
在一个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括至少三个选自以下的CDR，任选地包括至多3个氨基酸变化，例如CDR中的每一个的1个、2个或3个氨基酸变化：CDRL1：SEQID NO:1；CDRL2：SEQ ID NO:2；CDRL3：SEQ ID NO:3；CDRH1：SEQ ID NO:4；CDRH2：SEQ IDNO:5；和CDRH3：SEQ ID NO:6。
在一个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括至少三个选自以下的CDR，任选地包括至多3个氨基酸变化，例如CDR中的每一个的1个、2个或3个氨基酸变化：CDRL1：SEQID NO:9；CDRL2：SEQ ID NO:10；CDRL3：SEQ ID NO:11；CDRH1：SEQ ID NO：12；CDRH2：SEQ IDNO:13；和CDRH3：SEQ ID NO:14。
在一个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括至少三个选自以下的CDR，任选地包括至多3个氨基酸变化，例如CDR中的每一个的1个、2个或3个氨基酸变化：CDRL1：SEQID NO:17；CDRL2：SEQ ID NO:18；CDRL3：SEQ ID NO:19；CDRH1：SEQ ID NO:20；CDRH2：SEQID NO:21；和CDRH3：SEQ ID NO:22。
在一个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括至少三个选自以下的CDR，任选地包括至多3个氨基酸变化，例如CDR中的每一个的1个、2个或3个氨基酸变化：CDRL1：SEQID NO:25；CDRL2：SEQ ID NO:26；CDRL3：SEQ ID NO：27；CDRH1：SEQ ID NO：28；CDRH2：SEQID NO：29；和CDRH3：SEQ ID NO：30。
在一个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括至少三个选自以下的CDR，任选地包括至多3个氨基酸变化，例如CDR中的每一个的1个、2个或3个氨基酸变化：CDRL1：SEQID NO：33；CDRL2：SEQ ID NO:34；CDRL3：SEQ ID NO：35；CDRH1：SEQ ID NO：36；CDRH2：SEQID NO：37；和CDRH3：SEQ ID NO:38。
在一个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括至少三个选自以下的CDR，任选地包括至多3个氨基酸变化，例如CDR中的每一个的1个、2个或3个氨基酸变化：CDRL1：SEQID NO:41；CDRL2：SEQ ID NO：42；CDRL3：SEQ ID NO：43；CDRH1：SEQ ID NO：44；CDRH2：SEQID NO：45；和CDRH3：SEQ ID NO：46。
在一些实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括如SEQ ID NO:1、2和3中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在一些实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括如SEQ ID NO：4、5和6中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。在特定实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括：如SEQ ID NO：1、2和3中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及如SEQ ID NO:4、5和6中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
在一些实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括如SEQ ID NO:9、10和11中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在一些实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括如SEQ ID NO:12、13和14中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。在特定实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括：如SEQ ID NO:9、10和11中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及如SEQ ID NO:12、13和14中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
在一些实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括如SEQ ID NO:17、18和19中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在一些实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括如SEQ ID NO:20、21和22中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。在特定实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括：如SEQ ID NO:17、18和19中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及如SEQ ID NO:20、21和22中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
在一些实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括如SEQ ID NO：25、26和27中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在一些实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括如SEQ ID NO:28、29和30中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。在特定实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括：如SEQ ID NO:25、26和27中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及如SEQ ID NO:28、29和30中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
在一些实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括如SEQ ID NO：33、34和35中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在一些实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括如SEQ ID NO:36、37和38中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。在特定实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括：如SEQ ID NO:33、34和35中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及如SEQ ID NO:36、37和38中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
在一些实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括如SEQ ID NO:41、42和43中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。在一些实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括如SEQ ID NO:44、45和46中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。在特定实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括：如SEQ ID NO:41、42和43中分别所示的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及如SEQ ID NO:44、45和46中分别所示的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
本申请的各方面涉及包括与人BCMA选择性结合的细胞外结合结构域(BCMA特异性结合结构域)的CAR，所述人BCMA包括重链可变区序列和轻链可变区序列。
在各个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括具有与SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括具有与SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括具有与SEQ ID NO:7具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区和/或具有与SEQ ID NO:8具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括具有与SEQ ID NO:15具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区和/或具有与SEQ ID NO:16具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括具有与SEQ ID NO:23具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区和/或具有与SEQ ID NO:24具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括具有与SEQ ID NO:31具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区和/或具有与SEQ ID NO:32具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括具有与SEQ ID NO:39具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区和/或具有与SEQ ID NO:40具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括具有与SEQ ID NO:47具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的轻链可变区和/或具有与SEQ ID NO:48具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施例中，所述轻链可变区序列和/或所述重链可变区序列在本文所提供的CDR序列中的任何CDR序列内没有变化。例如，在一些实施例中，序列变异的程度(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)可以出现在除了本文所提供的CDR序列中的任何CDR序列之外的重链可变和/或轻链可变氨基酸序列内。
在各个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列。
在各个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列。
在各个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列。
在各个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:32中所示的氨基酸序列。
在各个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:39中所示的氨基酸序列，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列。
在各个实施例中，所述BCMA特异性结合结构域包括轻链可变结构域和/或重链可变结构域，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:47中所示的氨基酸序列，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:48中所示的氨基酸序列。
在本文所设想的BCMA特异性结合结构域中的任何BCMA特异性结合结构域中，可以在所述残基不可能参与BCMA-具体地相互作用的位置处将一个或多个保守突变引入到所述CDR或框架序列中。在一些实施例中，可以在所述残基不可能参与与BCMA相互作用的位置处将此类保守突变引入到所述CDR或框架序列中，如基于晶体结构所确定的。在一些实施例中，可能的界面(例如，参与抗原-抗体相互作用的残基)可以从共享结构相似性的其它抗原的已知结构信息推断。
2.接头
在某些实施例中，本文所设想的CAR可以包括各个结构域之间的接头残基，例如，为了分子的适当间隔和构象而添加的残基。在特定实施例中，接头是可变区连接序列。“可变区连接序列”是氨基酸序列，所述氨基酸序列连接VH结构域和VL结构域并且提供与两个子结合结构域的相互作用兼容的间隔子功能，使得所得多肽保留对与包括相同轻链可变区和重链可变区的抗体相同的靶分子的特异性结合亲和力。本文所设想的CAR可以包括一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在特定实施例中，接头的长度为约1个至约25个氨基酸、约5个至约20个氨基酸、或约10个至约20个氨基酸或任何中间长度的氨基酸。在一些实施例中，接头为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个氨基酸长。
接头的说明性实例包含：甘氨酸聚合物(G)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n，其中n为至少为一、二、三、四或五的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对较非结构化，因此可以能够充当如本文所设想的CAR等融合蛋白的结构域之间的中性系链。甘氨酸比甚至丙氨酸获得显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基的限制要少得多(参见Scheraga,《计算化学综述(Rev.Computational Chem.)》11173-142(1992))。普通技术人员将认识到，特定实施例中的CAR的设计可以包含完全或部分柔性的接头，使得接头可以包含柔性接头以及赋予较少的柔性结构的一个或多个部分以提供期望的CAR结构。
其它示例性接头包含但不限于以下氨基酸序列：GGG；DGGGS(SEQ ID NO:71)；TGEKP(SEQ ID NO:72)(参见例如Liu等人,《美国国家科学院院刊》5525-5530(1997))；GGRR(SEQ ID NO:73)(Pomerantz等人1995，同上)；(GGGGS)n，其中＝1、2、3、4或5(SEQ ID NO:74)(Kim等人,《美国国家科学院院刊》93,1156-1160(1996))；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO:75)(Chaudhary等人,1990,《美国国家科学院院刊》87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:76)(Bird等人,1988,《科学》242:423-426)；GGRRGGGS(SEQ ID NO:77)；LRQRDGERP(SEQ ID NO:78)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO:79)；LRQKd(GGGS)2ERP(SEQ ID NO:80)。可替代地，柔性接头可以使用能够对DNA结合位点和肽两者自身进行建模的计算机程序(Desjarlais和Berg,《美国国家科学院院刊》90:2256-2260(1993)；《美国国家科学院院刊》91:11099-11103(1994))或通过噬菌体展示方法合理地设计。在一个实施例中，接头包括以下氨基酸序列：GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:81)(Cooper等人,《血液》,101(4):1637-1644(2003))。
3.间隔子结构域
在特定实施例中，CAR的结合结构域之后是一个或多个“间隔子结构域”，所述一个或多个间隔子结构域是指使抗原结合结构域移动远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活的区(Patel等人,《基因疗法(Gene Therapy)》，1999；6:412-419)。间隔子结构域可以源自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。在某些实施例中，间隔子结构域是免疫球蛋白的一部分，包含但不限于一个或多个重链恒定区，例如，CH2和CH3。间隔子结构域可以包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或更改的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
在一个实施例中，间隔子结构域包括IgG1、IgG2或IgG4或其合适的组合的CH2结构域和CH3结构域。
4.铰链结构域
CAR的结合结构域之后通常是一个或多个“铰链结构域”连接，所述一个或多个铰链结构域在将抗原结合结构域定位成远离效应细胞表面以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活中起作用。CAR通常包括结合结构域与跨膜结构域(TM)之间的一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以源自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。铰链结构域可以包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或经更改免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。
适于在本文所设想的CAR中使用的说明性铰链结构域包含源自1型膜蛋白的细胞外区的铰链区，包含但不限于CD8α、CD4、CD28和CD7，所述铰链区可以是来自这些分子的野生型铰链区或可以被改变。在一个实施例中，铰链是PD-1铰链或CD152铰链。在另一实施例中，铰链结构域包括天然存在的免疫球蛋白铰链区，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链或其合适的组合。在另一实施例中，铰链结构域包括IgG1铰链/CH2/CH3、IgG1铰链/CH3/铰链/M1、IgG4铰链/CH2/CH3或IgG4铰链/CH2。
在各个实施例中，本文所设想的CAR包括经修饰的铰链区。如本文所使用的，术语“改变的铰链区”、“经修饰的铰链区”和“经修饰的铰链结构域”可互换使用并且是指：(a)具有至多30％氨基酸变化(例如，至多25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)的天然存在的铰链区；(b)天然存在的铰链区的长度为至少10个氨基酸(例如，至少12个、13个、14个或15个氨基酸)的具有至多30％氨基酸变化(例如，至多25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)的一部分；或(c)天然存在的铰链区的包括核心铰链区(所述核心铰链区的长度可以为4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14或15个或至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸)的一部分。
在各个实施例中，经修饰的铰链区包括与如本文所设想的和/或本领域已知的合适的铰链结构域/区具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，包括如本文所设想的铰链序列的经修饰的铰链区具有4个或更少、3个或更少、或2个或更少氨基酸取代和/或缺失。
在某些实施例中，天然存在的铰链区/结构域中的一个或多个半胱氨酸残基可以被一个或多个其它氨基酸残基取代以产生经修饰的铰链结构域。在一些实施例中，经修饰的铰链结构域包括被丝氨酸或丙氨酸取代的一个或多个半胱氨酸残基。在另一实施例中，经修饰的铰链结构域包括被丝氨酸取代的一个或多个半胱氨酸残基。在另一实施例中，经修饰的铰链结构域包括被丙氨酸取代的一个或多个半胱氨酸残基。
在特定实施例中，改变的铰链区包括由另一种氨基酸残基(例如，丝氨酸残基)对脯氨酸残基进行的取代。
5.跨膜(TM)结构域
“跨膜结构域”是CAR的一部分，所述部分融合细胞外结合部分和细胞内信号传导结构域并且将CAR锚定到免疫效应细胞的质膜上。TM结构域可以源自天然的、合成的、半合成的或重组的来源。TM结构域可以源自(即，至少包括其跨膜区)T细胞受体的α链或β链、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD1。在一特定实施例中，TM结构域是合成的并且主要包括如亮氨酸和缬氨酸等疏水残基。
在一个实施例中，CAR包括源自PD1、CD152、CD28或CD8α的TM结构域。在另一实施例中，CAR包括源自PD1、CD152、CD28或CD8α的TM结构域和优选地长度在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸之间的视情况而定连接TM结构域和CAR的细胞内信号传导或共刺激结构域的短寡肽或多肽接头。基于甘氨酸-丝氨酸的接头提供了特别适合的接头。
6.细胞内信号传导结构域
在特定实施例中，本文所设想的CAR包括细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指CAR的参与将与人BCMA多肽的有效BCMA CAR结合的消息转导到免疫效应细胞的内部以引发效应细胞功能，例如，激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒活性，包含细胞毒性因子释放到CAR结合的靶细胞或用与细胞外CAR结构域的抗原结合引发的其它细胞应答的部分。
术语“效应子功能”是指免疫效应细胞的专门功能。T细胞的效应子功能例如可以是溶细胞活性或辅助或活性，包含细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”指代蛋白质的一部分，所述部分转导效应子功能信号并引导细胞执行专门功能。虽然通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个结构域。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分来说，可使用这类截短部分代替整个结构域，只要其转导效应子功能信号即可。术语细胞内信号传导结构域意图包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
已知的是，单独通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，可以说T细胞激活由两种不同类别的细胞内信号传导结构域介导：初级信号传导结构域，其通过TCR(例如，TCR/CD3复合物)启动抗原依赖性初级激活；以及共刺激信号传导结构域，其是以抗原非依赖性方式起作用以提供次级信号或共刺激信号。在优选实施例中，本文所设想的CAR包括细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包括一个或多个“共刺激信号传导结构域”和“初级信号传导结构域”。
初级信号传导结构域以刺激性方式或以抑制性方式调控TCR复合物的初级激活。以刺激性方式起作用的初级信号传导结构域可含有信号传导基元，所述信号传导基元称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
在本发明中特别有用的含有ITAM的初级信号传导结构域的说明性实例包含源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在特定优选实施例中，CAR包括CD3ζ初级信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。细胞内初级信号传导和共刺激信号传导结构域可以与跨膜结构域的羧基末端按任何顺序串联连接。
本文所设想的CAR包括用于增强表达CAR受体的T细胞的疗效和扩增的一个或多个共刺激信号传导结构域。如本文所使用的，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子，所述细胞表面分子提供在与抗原结合后使T淋巴细胞有效激活和起作用所需的第二信号。此类共刺激分子的说明性实例包含：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2CSLP76、TRIM和ZAP70。
在一个实施例中，CAR包括选自由CD28、CD137和CD134组成的组的一个或多个共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
在另一实施例中，CAR包括CD28和CD137共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
在又另一实施例中，CAR包括CD28和CD134共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
在一个实施例中，CAR包括CD137和CD134共刺激信号传导结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。
E.CAR的说明性实施例
在一个实施例中，CAR包括：抗体或其抗原特异性结合片段，所述抗体或其抗原特异性结合片段与抗原结合；铰链区；跨膜结构域；来自共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域；以及初级信号传导结构域。在特定实施例中，本文所考虑的CAR包括与B细胞上表达的BCMA多肽特异性结合的抗BCMA抗体或其抗原结合片段。
在一个实施例中，CAR包括：抗BCMA scFv，所述抗BCMAscFv与BCMA多肽结合；间隔子或铰链结构域；跨膜结构域，所述跨膜结构域源自多肽，所述多肽选自由以下组成的组：T细胞受体的α链、β链或ζ链、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD1；以及来自共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，所述共刺激分子选自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、TNFR2和ZAP70；以及来自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的初级信号传导结构域。
在一个实施例中，CAR包括：抗BCMAscFv，所述抗BCMAscFv与BCMA多肽结合；间隔子结构域或铰链结构域，所述间隔子结构域或铰链结构域选自由以下组成的组：CD8α铰链、CD4铰链、CD28铰链、CD7铰链、PD-1铰链、CD152铰链、IgG1铰链、IgG2铰链、IgG3铰链、IgG4铰链、IgG1铰链/CH2/CH3、IgG1铰链/CH3/铰链/M1、IgG4铰链/CH2/CH3或IgG4铰链/CH2；跨膜结构域，所述跨膜结构域源自多肽，所述多肽选自由以下组成的组：T细胞受体的α链、β链或ζ链、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD1；以及来自共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，所述共刺激分子选自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、TNFR2和ZAP70；以及来自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的初级信号传导结构域。
在一个实施例中，CAR包括：抗BCMA scFv，所述抗BCMA scFv与BCMA多肽结合；铰链结构域，所述铰链结构域选自由以下组成的组：CD8α铰链、CD4铰链、CD28铰链、CD7铰链、PD-1铰链、CD152铰链、IgG1铰链、IgG2铰链、IgG3铰链、IgG4铰链、IgG1铰链/CH2/CH3、IgG1铰链/CH3/铰链/M1、IgG4铰链/CH2/CH3或IgG4铰链/CH2；跨膜结构域，所述跨膜结构域源自多肽，所述多肽选自由以下组成的组：T细胞受体的α链、β链或ζ链、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD1；优选地长度在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸之间的将TM结构域与CAR的细胞内信号传导结构域连接的短寡肽或多肽接头；以及来自共刺激分子的一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域，所述共刺激分子选自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、TNFR2和ZAP70；以及来自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的初级信号传导结构域。
在特定实施例中，CAR包括：抗BCMA scFv，所述抗BCMA scFv与BCMA多肽结合；间隔子结构域，所述间隔子结构域包括IgG2和/或IgG4铰链/CH2/CH3多肽的一个或多个片段；CD28跨膜结构域；CD137细胞内共刺激信号传导结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。
在特定实施例中，CAR包括：抗BCMA scFv，所述抗BCMA scFv与BCMA多肽结合；铰链结构域，所述铰链结构域包括IgG1铰链/CH2/CH3多肽和CD8α多肽；CD8α跨膜结构域，所述CD8α跨膜结构域包括约3个至约10个氨基酸的多肽接头；CD137细胞内共刺激信号传导结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。
在特定实施例中，CAR包括：抗BCMA scFv，所述抗BCMAscFv与BCMA多肽结合；铰链结构域，所述铰链结构域包括CD8α多肽；CD8α跨膜结构域，所述CD8α跨膜结构域包括约3个至约10个氨基酸的多肽接头；CD134细胞内共刺激信号传导结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。
在特定实施例中，CAR包括：抗BCMA scFv，所述抗BCMA scFv与BCMA多肽结合；铰链结构域，所述铰链结构域包括CD8α多肽；CD8α跨膜结构域，所述CD8α跨膜结构域包括约3个至约10个氨基酸的多肽接头；CD28细胞内共刺激信号传导结构域；以及CD3ζ初级信号传导结构域。
此外，与未经修饰的T细胞或被修饰成表达其它CAR的T细胞相比，本文所设想的CAR的设计在表达CAR的T细胞中实现了改进的扩增、长期持续性和可耐受细胞毒性性质。
在各个实施例中，本文所公开的过继性细胞疗法的改进的组合物和方法提供了经基因修饰的免疫效应细胞(例如，CAR T细胞)，所述经基因修饰的免疫效应细胞靶向表达BCMA的细胞并具有人源性抗原结合结构域，表现出改进的细胞因子释放和低抗原非依赖性信号传导。
在特定实施例中，改进的CAR T细胞在与表达BCMA的细胞共培养时展现出高IFNγ释放。在一些实施例中，与相同CAR T细胞相比，改进的CAR T细胞在与表达BCMA的细胞共培养时展现出类似或更高的IFNγ释放，除了所述CAR包括包含鼠类源性抗BCMA scFv的细胞外结构域之外。在一些实施例中，共培养的表达BCMA的细胞是Daudi细胞和/或HT1080.BCMA细胞。
在特定实施例中，改进的CAR T细胞在与低抗原密度(表达低BCMA的)细胞共培养时展现出高IFNγ释放。如果细胞或细胞系的表面BCMA表达是Daudi、HT1080.BCMA和/或RPMI-8226细胞的表面BCMA表达的至多1/5(例如，至多1/5、至多1/10、至多1/15或至多1/20)，则其特征在于具有低BCMA表达。在一些实施例中，所述细胞在相同或类似的培养条件下培养。在一些实施例中，所述表达低BCMA的细胞的表面BCMA表达是Daudi细胞、HT1080.BCMA细胞和/或RPMI-8226细胞的表面BCMA表达的至多1/5。在一些实施例中，所述表达低BCMA的细胞的表面BCMA表达是HT1080.BCMA细胞的表面BCMA表达的至多1/10。在一些实施例中，所述表达低BCMA的细胞的表面BCMA表达是RPMI-8226细胞的表面BCMA表达的至多1/10。用于测量蛋白质表面表达的测定是本领域技术人员已知的(例如，FACS分析)。
在一些实施例中，与相同提高CAR T细胞相比，改进的CAR T细胞在与低抗原密度(表达低BCMA的)细胞共培养时展现出更高的IFNγ释放，除了所述CAR包括包含鼠类源性抗BCMA scFv的细胞外结构域之外。在一些实施例中，所述表达低BCMA的细胞是RL细胞和/或Toledo细胞。
在一些实施例中，与相同CAR T细胞相比，改进的CAR T细胞展现出更低的抗原非依赖性信号传导，除了所述CAR包括包含鼠类源性抗BCMA scFv的细胞外结构域之外。
在一些实施例中，与相同CAR T细胞相比，改进的CAR T细胞展现出更低的抗原非依赖性信号传导，除了所述CAR包括包含鼠类源性抗BCMA scFv的细胞外结构域之外。
F.多肽
本申请部分设想了CAR多肽和其片段、包括所述CAR多肽和其片段的细胞和组合物以及表达多肽的载体。在优选实施例中，提供了包括如SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、66和68所示的一种或多种CAR的多肽。
除非相反地规定，否则“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且根据常规含义使用，即，作为氨基酸序列。多肽不限于具体长度，例如，多肽可以包括全长蛋白序列或全长蛋白质的片段，并且可以包含多肽的转译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等以及本领域已知的天然存在的和非天然存在的其它修饰。在各个实施例中，本文所设想的CAR多肽包括蛋白质的N末端处的信号(或前导)序列，其共翻译或翻译后引导蛋白质的转移。可用于本文所公开的CAR的适合的信号序列的说明性实例包含但不限于IgG1重链信号序列和CD8α信号序列。多肽可以使用各种公知的重组和/或合成技术中的任何一种进行制备。本文所设想的多肽具体地包含本申请的CAR或与如本文所公开的CAR的一个或多个氨基酸有缺失、添加和/或取代的序列。
如本文所使用的，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从细胞环境中以及从与细胞的其它组分的缔合中体外分离和/或纯化的肽或多肽分子，即，所述肽或多肽分子未与体内物质显著缔合。类似地，“分离的细胞”是指从体内组织或器官获得并且基本上不含细胞外基质的细胞。
多肽包含“多肽变体”。多肽变体与天然存在的多肽的不同之处可以在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入。此类变体可以是天然存在的或可以通过合成生成，例如通过修饰上述多肽序列中的一个或多个。例如，在特定实施例中，可以期望通过将一个或多个取代、缺失、添加和/或插入引入到结合结构域、铰链、TM结构域、共刺激信号传导结构域或CAR多肽的初级信号传导结构域中来改进CAR的结合亲和力和/或其它生物学性质。优选地，本文所设想的多肽包含与其具有至少约65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸同一性的多肽。
多肽包含“多肽片段”。多肽片段是指可以是单体的或多体的具有天然存在的或重组产生的多肽的氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失或取代的多肽。在某些实施例中，多肽片段可以包括至少5个至约500个氨基酸长的氨基酸链。应当理解的是，在某些实施例中，片段长至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、150个、200个、250个、300个、350个、400个或450个氨基酸。特别有用的多肽片段包含功能性结构域，所述功能性结构域包含抗原结合结构域或抗体片段。在鼠抗BCMA抗体的情况下，有用的片段包含但不限于：重链或轻链的CDR区、CDR3区；重链或轻链的可变区；抗体链的一部分或包含两个CDR的可变区；等等。
多肽也可以使用相同读框融合或与接头或其它序列缀合，以便合成、纯化或鉴定多肽(例如，聚-His)或增强多肽与固相载体的结合。
如上文中指出的，可以以各种方式来改变多肽，包含氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此类操纵的方法在本领域中是熟知的。例如，参考多肽的氨基酸序列变体可以通过DNA中的突变来制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如，Kunkel(1985,《美国国家科学院院刊》82:488-492)；Kunkel等人,(1987,《酶学方法(Methods in Enzymol)》,154:367-382)；美国专利第4,873,192号；Watson,J.D.等人,(《基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》,第四版,加利福尼亚门洛帕克的本杰明/卡明斯公司(Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.),1987)以及本文引用的参考文献。关于不影响所关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人,(1978),《蛋白质序列和结构图集(Atlas of Protein Sequence and Structure)》(美国国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.),华盛顿特区(Washington,D.C.))的模型中找到。
在某些实施例中，变体将含有保守取代。“保守取代”是氨基酸取代具有相似性质的另一种氨基酸，使得肽化学领域的技术人员将预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不变的取代。修饰可以在本申请的多核苷酸和多肽的结构进行，并且仍然获得编码具有期望特性的变体或衍生多肽的功能分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以产生如本文所设想的等效的或甚至经改进的变体多肽时，本领域技术人员例如可以例如根据表1改变编码DNA序列的密码子中的一个或多个。
表1-氨基酸密码子
Figure BDA0004177911670000451
Figure BDA0004177911670000461
使用本领域中公知的计算机程序如DNASTARTM软件，可以发现在确定可以不消除生物活性的情况下取代、插入或缺失哪些氨基酸残基方面的指导。优选地，本文所公开的蛋白质变体的氨基酸改变是保守氨基酸改变，即，带类似电荷或不带电荷的氨基酸的取代。保守氨基酸改变涉及在侧链方面相关的氨基酸的家族中的一个氨基酸的取代。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和极性不带电氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。在肽或蛋白质中，适当的氨基酸保守取代对于本领域的技术人员来说是已知的，并且通常可以在不改变所得分子的生物活性的情况下进行。本领域的技术人员认识到，通常，多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物活性(参见，例如，Watson等人《基因的分子生物学》,第4版,1987,本杰明/卡明斯出版公司(The Benjamin/Cummings Pub.Co.)，第224页)。美国临时专利申请第61/241,647号中描述了示例性保守取代，所述美国临时专利申请的公开内容通过引用并入本文。
在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质交互性生物功能方面的重要性在本领域中普遍理解的(Kyte和Doolittle，1982，通过引用并入本文)。已经基于氨基酸的亲水性和电荷特性为每个氨基酸分配了亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)。这些值是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。
本领域中已知某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或评分的其它氨基酸取代并且仍产生具有类似生物活性的蛋白质，即，仍获得生物功能等同蛋白质。在进行此类改变时，优选亲水指数在±2内的氨基酸取代，特别优选在±1内的氨基酸取代，并且甚至更加特别优选在±0.5内的氨基酸取代。在本领域中还应理解，可以基于亲水性来有效地进行相似氨基酸的取代。
如美国专利第4,554,101号中所详述的，已经为氨基酸残基分配了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(–0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(–2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解的是，氨基酸可以取代具有相似亲水性质的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学上等同的，特别是免疫学上等同的蛋白质。在此类改变中，优选亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在±1以内的氨基酸的取代并且甚至更特别优选亲水性值在±0.5以内的氨基酸的取代。
如上文所概述的，氨基酸取代可以基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。
多肽变体进一步包含糖基化形式、与其它分子的聚集缀合物和与不相关化学部分(例如，聚乙二醇化分子)的共价缀合物。如本领域中已知的，可以通过将功能与在氨基酸链中或在N末端或C末端残基处发现的基团连接来制备共价变体。变体还包含等位基因变体、物种变体和突变蛋白。不影响蛋白质的功能活性的区截短或缺失也是变体。
在一个实施例中，在期望表达两个或更多个多肽的情况下，如本文其它地方所讨论的，对其进行编码的多核苷酸序列可以通过IRES序列分开。在另一个实施例中，可以将两个或更多个多肽表达为包括一个或多个自切割多肽序列的融合蛋白。
本申请的多肽包含融合多肽。在优选实施例中，提供了融合多肽和编码融合多肽的多核苷酸，例如，CAR。融合多肽和融合蛋白指代具有至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个多肽区段的多肽。融合多肽通常是C末端连接到N末端，但其也可以是C末端连接到C末端、N末端连接到N末端或N末端连接到C末端。融合蛋白的多肽可以采取任何顺序或指定的顺序。融合多肽或融合蛋白还可以包含保守修饰的变体、多态变体、等位基因、突变体、子序列和种间同系物，只要保持融合多肽的期望的转录活性即可。融合多肽可以通过化学合成法或通过两个部分之间的化学连接产生或者通常可以使用其它标准技术制备。包括融合多肽的连接的DNA序列可操作地连接到如本文其它地方所讨论的适合的转录或转译控制元件。
在一个实施例中，融合配偶体包括有助于以比天然重组蛋白更高的产率表达蛋白质(表达增强子)的序列。可以选择其它融合配偶体，以增加蛋白质的溶解度或使蛋白质能够靶向期望的细胞内隔区或促进融合蛋白通过细胞膜的转运。
融合多肽可以进一步包括本文所设想的多肽结构域中的每个多肽结构域之间的多肽切割信号。另外，可以将多肽位点置于任何接头肽序列中。示例性多肽切割信号包含多肽切割识别位点，如蛋白酶切割位点、核酸酶切割位点(例如，稀有限制酶识别位点、自切割核酶识别位点)和自切割病毒寡肽(参见deFelipe和Ryan,2004.《转运(Traffic)》,5(8),616-26)。
合适的蛋白酶切割位点和自切割肽是技术人员已知的(参见例如，Ryan等人,1997,《普通病毒学杂志(J.Gener.Virol.)》78,699-722；Scymczak等人(2004)《自然生物科技(Nature Biotech.)》5,589-594)。示例性蛋白酶切割位点包含但不限于以下的切割位点：马铃薯Y病毒NIa蛋白酶(例如，烟草蚀斑病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯Y病毒P1(P35)蛋白酶、byo病毒NIa蛋白酶、byo病毒RNA-2编码蛋白酶、口疮病毒属L蛋白酶、肠病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、小rna 3C蛋白酶、豇豆花叶病毒24K蛋白酶、线虫传多面体病毒24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球状病毒)3C样蛋白酶、PYVF(欧防风黄点病毒)3C样蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa和肠激酶。在一个实施例中，由于TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶切割位点的切割严格度高，所以优选TEV蛋白酶切割位点，例如，EXXYXQ(G/S)(SEQ ID NO:82)，例如ENLYFQG(SEQ ID NO:83)和ENLYFQS(SEQ ID NO:84)，其中X表示任何氨基酸(由TEV进行的切割发生在Q与G或Q与S之间)。
在特定实施例中，多肽切割信号是病毒自切割肽或核糖体跳跃序列。
核糖体跳跃序列的说明性实例包含但不限于：2A或2A样位点、序列或结构域(Donnelly等人,2001.《普通病毒学杂志》82:1027-1041)。在一特定实施例中，病毒2A肽是口疮病毒2A肽、马铃薯Y病毒2A肽或心脏病毒2A肽。
在一些实施例中，所述病毒2A肽选自由以下组成的组：口蹄疫病毒(FMDV)2A肽、马鼻炎A型病毒(ERAV)2A肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(TaV)2A肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)2A肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。
表2中提供了2A位点的说明性实例。
表2
SEQ ID NO:85 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO:86 ATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO:87 LLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO:88 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO：89 EGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:90 LLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:91 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:92 QCTNYALLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:93 LLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:94 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:95 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:96 LLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:97 LLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:98 TLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:99 LLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:100 NFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:101 QLLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:102 APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:103 VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQT
SEQ ID NO:104 LNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:105 LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO：106 EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
在优选的实施例中，本文所设想的多肽包括CAR多肽。
G.多核苷酸
在优选实施例中，提供了编码一种或多种CAR多肽的多核苷酸，例如，SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、65和67。在一些实施例中，所述多核苷酸编码如SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、66和68中的任一个所示的氨基酸序列。
在其它实施例中，提供了编码抗BMCACAR、抗体或其片段的多核苷酸。在一些实施例中，所述多核苷酸编码包括SEQ ID NO:1-3、9-11、17-19、25-27、33-35或41-43中所示的可变轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列和/或SEQ ID NO:4-6、12-14、20-22、28-30、36-38或44-46中所示的可变重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列的抗BMCACAR、抗体或其片段。
在一些实施例中，所述多核苷酸编码包括包含SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中的任一个所示的氨基酸序列的可变轻链的抗BMCACAR、抗体或其片段。在一些实施例中，所述多核苷酸编码包括包含SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48中的任一个所示的氨基酸序列的可变轻链的抗BMCA CAR、抗体或其片段。在一些实施例中，所述多核苷酸编码包括包含SEQID NO:7、15、23、31、39或47中的任一个所示的氨基酸序列的可变轻链和包含SEQ ID NO：8、16、24、32、40或48中的任一个所示的氨基酸序列的可变重链的抗BMCACAR、抗体或其片段。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和DNA/RNA杂交体。多核苷酸可以是单链的或双链的以及重组的、合成的或分离的。多核苷酸包含但不限于：前信使RNA(前mRNA)、信使RNA(mRNA)、RNA、基因组DNA(gDNA)、PCR扩增DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA或重组DNA。多核苷酸是指长度为至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少5000个、至少10000个或至少15000个或更多个核苷酸以及所有中间长度的核苷酸的聚合形式，或者是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者是任一类型核苷酸的修饰形式。容易理解的是，在此上下文中，“中间长度”意指所引用值之间的任何长度，如6、7、8、9等，101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。在特定实施例中，多核苷酸或变体与参考序列具有至少或约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
如本文所使用的，“分离的多核苷酸”是指已经从其两侧的处于天然存在状态的序列纯化的多核苷酸，例如，已经从通常与片段相邻的序列中移除的DNA片段。在特定实施例中，“分离的多核苷酸”是指互补DNA(cDNA)、重组DNA、或自然界中不存在但已经通过人手制成的其它多核苷酸。在特定实施例中，分离的多核苷酸是合成多核苷酸、半合成多核苷酸或获自或源自重组来源的多核苷酸。
在各个实施例中，多核苷酸包括编码本文所设想的多肽的mRNA。在某些实施例中，mRNA包括帽、一个或多个核苷酸和poly(A)尾部。
在特定实施例中，多核苷酸可以是密码子优化的。如本文所使用的，术语“密码子优化的”指代取代编码多肽的多核苷酸中的密码子以增加多肽的表达、稳定性和/或活性。影响密码子优化的因素包含但不限于以下中的一种或多种：(i)两个或更多个生物体或基因之间的密码子偏倚或者合成地构成的偏倚表格的变化；(ii)生物体、基因或基因组内的密码子偏倚度的变化；(iii)包含背景在内的密码子的系统变化；(iv)密码子根据其解码tRNA的变化；(v)密码子根据GC％在总体上或在三联体中的一个位置处的变化；(vi)与参考序列例如天然存在的序列的相似度的变化；(vii)密码子频率截止的变化；(viii)从DNA序列转录的mRNA的结构性质；(ix)关于设计密码子取代组所基于的DNA序列的功能的先验知识；(x)每个氨基酸的密码子组的系统变化；和/或(xi)假性转译起始位点的经过分离的移除。
如本文所使用的，术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指展现出与参考多核苷酸序列或在下文中定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸具有实质性序列同一性的多核苷酸。这些术语包含与参考多核苷酸相比其中已添加或缺失、或用不同核苷酸替代一个或多个核苷酸的多核苷酸。在此方面，本领域中充分理解的是，可以对参考多核苷酸作出包括突变、添加、缺失以及取代在内的某些改变，由此所改变的多核苷酸保留所述参考多核苷酸的生物功能或活性。
多核苷酸变体包含编码生物活性多肽片段或变体的多核苷酸片段。如本文所使用，术语“多核苷酸片段”是指长度为至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个、1600个、1700个或更多个核苷酸的多核苷酸片段，其编码保留至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％的天然存在的多肽活性的多肽变体。多核苷酸片段指代编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有天然存在的或重组产生的多肽的一个或多个氨基酸的氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失或取代。
如本文所使用，叙述“序列同一性”或例如包含“与…50％一致的序列”是指在核苷酸与核苷酸基础上或在氨基酸与氨基酸基础上，序列在比较窗内一致的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过以下方式计算：在比较窗内比较两个最佳地比对的序列，测定的一致核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或一致氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys以及Met)在两个序列中出现的位置的数目以得到相配位置的数目，用相配位置的数目除以比较窗中的位置总数(即，窗大小)并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。包含与本文所设想的参考序列中的任一个具有至少约50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、86％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体维持参考多肽的至少一种生物活性。
用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参考序列”的长度是至少12个，但常常是15个至18个且通常是至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基在内。因为两个多核苷酸可以各自包括(1)在两个多核苷酸之间类似的序列(即，仅完整多核苷酸序列的一部分)；和(2)在两个多核苷酸之间相异的序列，两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗”内比较两个多核苷酸的序列以鉴别并比较序列局部区域的相似性来进行。“比较窗”是指具有至少6个、通常约50个至约100个、更通常约100个至约150个连续位置的概念性区段，其中在最佳地比对一个序列与具有相同数目连续位置的参考序列之后，比较所述两个序列。为了对两条序列进行最佳比对，比较窗可以包含相较于参考序列(不包含添加或缺失的序列)，约20％或更低百分比的添加或缺失(即，空位)。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实施例(美国威斯康星州麦迪逊的科学大道575号的遗传学计算机集团(Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)的威斯康星遗传学软件包7.0版本(Wisconsin Genetics Software PackageRelease 7.0)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者通过检查和由所选择的各种方法中的任何一种方法生成的最佳比对(即，产生了比较窗口内的最高同源性百分比)来进行。还可以参考如例如通过Altschul等人，1997，《核酸研究》25:3389所公开的BLAST程序家族。序列分析的详细讨论可以见于Ausubel等人，《当代分子生物学实验手册》,约翰威立父子公司(John Wiley&Sons,Inc.),1994-1998,第15章,第19.3单元。
描述多核苷酸的朝向的术语包含：5'(通常是具有游离磷酸基的多核苷酸的端部)和3'(通常是具有游离羟基(OH)的多核苷酸的端部)。多核苷酸序列可以按5'-3'朝向或3'-5'朝向注释。对于DNA和mRNA，5'-3'链被指定为“有义”链、“正”链或“编码”链，因为其序列与前信使(前mRNA)的序列是一致的[RNA中的尿嘧啶(U)而非DNA中的胸腺嘧啶(T)除外]。对于DNA和mRNA，作为通过RNA聚合酶转录的链的3'-5'互补链被命名为“模板”、“反义”、“负”或“非编码”链。如本文所使用的，术语“相反朝向”是指以3'-5'朝向书写的5'-3'序列或以5'-3'朝向书写的3'-5'序列。
术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，DNA序列5'A G T C A T G 3'的互补链是3'T C A G TA C 5'。后一个序列常常写成左边为5'端且右边为3'端的反向补体5'C A T GA C T 3'。与其反向补体相等的序列被称为回文序列。互补性可以是“部分的”，其中核酸的碱基中仅一些碱基根据碱基配对规则是匹配的。或者，在核酸之间可以存在“完全”或“全部”的互补性。
此外，本领域普通技术人员应了解，由于遗传密码的简并性，存在许多核苷酸序列对多肽或其变体的片段进行编码，如本文所设想的。这些多核苷酸中的一些多核苷酸与任何天然基因的核苷酸序列具有最小的同源性。尽管如此，在特定实施例中具体地设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸，例如针对人和/或灵长类动物密码子选择而优化的多核苷酸。此外，还可以使用包括本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因。等位基因是由于如核苷酸的缺失、添加和/或取代等一个或多个突变而改变的内源基因。
如本文所使用的，术语“核酸盒”或“表达盒”是指载体内可以表达RNA和随后表达多肽的基因序列。在一个实施例中，核酸盒含有所关注基因，例如，所关注多核苷酸。在另一个实施例中，核酸盒含有一个或多个表达控制序列，例如，启动子、增强子、poly(A)序列和所关注基因，例如，所关注多核苷酸。载体可以包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核酸盒。核酸盒在载体内定位且顺序地朝向，使得可以将盒中的核酸转录成RNA并在必要时转译成蛋白质或多肽、经历在转化细胞中具有活性所需的适当的转译后修饰并且通过将适合的细胞内隔区靶向细胞外隔区或分泌到细胞外隔区而易位到适合的隔区以具有生物活性。优选地，盒使其3'端和5'端适于准备插入到载体中，例如，其在每一端均具有限制性核酸内切酶位点。在一优选实施例中，核酸盒编码CAR。盒可以作为单个单元移除并插入到质粒或病毒载体中。
多核苷酸包含所关注多核苷酸。如本文所术语，术语“所关注多核苷酸”是指编码多肽、多肽变体或融合多肽的多核苷酸。载体可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个所关注多核苷酸。在某些实施例中，所关注多核苷酸编码在治疗或预防疾病或病症中提供治疗效果的多肽。所关注多核苷酸和从其编码的多肽包括编码野生型多肽的多核苷酸以及其功能变体和片段。在特定实施例中，功能变体与对应的野生型参考多核苷酸或多肽序列具有至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性。在某些实施例中，功能变体或片段具有对应的野生型多肽的生物活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
如本文其它地方所公开的或如本领域已知的，无论编码序列本身的长度如何，本文所涵盖的多核苷酸可以与其它DNA序列组合，如启动子和/或增强子、非转译区(UTR)、信号序列、Kozak序列、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如，LoxP位点、FRT位点和Att位点)、终止密码子、转录终止信号以及对自切割多肽、表位标记进行编码的多核苷酸，使得所述多核苷酸的总长度可以显著变化。因此，在特定实施例中设想可以采用几乎任何长度的多核苷酸片段，其总长度优选地受制备的容易性和在预期的重组DNA方案中的使用的限制。
可以使用本领域中熟知且可获得的各种既定技术来制备、操纵和/或表达多核苷酸。为了表达所期望的多肽，可以将对多肽进行编码的核苷酸序列插入到适当的载体中。
载体的说明性实例包括但不限于质粒、自主复制序列和转座元件，例如，piggyBac、睡美人、Mos1、Tc1/mariner、Tol2、mini-Tol2、Tc3、MuA、Himar I、Frog Prince以及其衍生物。
载体的另外的说明性实例包含但不限于：质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1源性人工染色体(PAC)、如λ噬菌体或M13噬菌体等噬菌体以及动物病毒。
可用作载体的病毒的说明性实例包含但不限于逆转录病毒(包含慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯性疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。
表达载体的说明性实例包含但不限于：用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载体(普洛麦格公司(Promega))；用于在哺乳动物细胞中进行慢病毒介导的基因转移和表达的pLenti4/V5-DESTTM、pLenti6/V5-DESTTM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(英杰公司(Invitrogen))。在特定实施例中，本文所公开的多肽的编码序列可以连接到用于在哺乳动物细胞中表达多肽的此类表达载体中。
在一个实施例中，编码本文所设想的CAR的载体包括SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、65和67中所示的多核苷酸序列。
在特定实施例中，载体是游离型载体或在染色体外维持的载体。如本文所使用的，术语“附加型”是指能够复制而不整合到宿主的染色体DNA中且不会从分裂的宿主细胞中逐渐丧失的载体，这还意味着所述载体在染色体外或附加地复制。
表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是载体的非翻译区—复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)、内含子、聚腺苷酸化序列、5'和3'非翻译区—其与宿主细胞蛋白相互作用以实施转录和翻译。此类元件的强度和特异性可以有所不同。取决于所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的适合的转录和翻译元件，包含普遍存在的启动子和诱导型启动子。
在特定实施例中，载体包括但不限于表达载体和病毒载体，将包括外源、内源或异源控制序列，诸如启动子和/或增强子。“内源”控制序列是与基因组中的给定基因天然连接的序列。“外源”控制序列是通过基因操纵(即，分子生物技术)被放置成与基因并置，使得所述基因的转录由所连接的增强子/启动子引导的控制序列。“异源”控制序列是来自与被基因操纵的细胞不同的物种的外源序列。
如本文所使用的，术语“启动子”指代RNA聚合酶所结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶引发并转录可操作地连接到启动子的多核苷酸。在特定实施例中，哺乳动物细胞中可操作的启动子包括定位在引发转录的位点上游大约25个到30个碱基处的AT富含区和/或发现于距离转录起始点上游70个到80个碱基处的另一个序列，即CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。
术语“增强子”指代含有能够提供增强的转录并且在一些情况下可以不依赖于其相对于另一个控制序列的朝向而起作用的序列的DNA片段。增强子可以与启动子和/或另一个增强子元件协作地或加性地起作用。术语“启动子/增强子”指代含有能够提供启动子功能和增强子功能两者的序列的DNA片段。
术语“可操作地连接”指代并置，其中所描述的组分处于允许所述组分按其预期方式起作用的关系。在一个实施例中，所述术语是指核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)与第二多核苷酸序列，例如，所关注的多核苷酸之间的功能性连接，其中表达控制序列引导对应于第二序列的核酸的转录。
如本文所使用的，术语“组成型表达控制序列”是指连续地或连续不断地允许可操作地连接的序列的转录的启动子、增强子或启动子/增强子。组成型表达控制序列可以是允许在各种各样的细胞和组织类型中表达的“普遍存在的”启动子、增强子或启动子/增强子或分别允许在受限种类的细胞和组织类型中表达的“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子、增强子或启动子/增强子。
适合于在特定实施例中使用的示例性普遍存在的表达控制序列包含但不限于：巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、Rous肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、H5、来自牛痘病毒的P7.5启动子和P11启动子、延长因子1-α(EF1a)启动子、早期生长应答1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ、成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人ROSA26基因座(Irions等人,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》,25,1477-1482(2007))、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、β-肌动蛋白启动子和骨髓增殖性肉瘤病毒增强子、阴性对照区缺失的、dl587rev引物结合位点取代的(MND)U3启动子(Haas等人《病毒学杂志(Journal of Virology.)》2003；77(17):9439-9450)。
在一个实施例中，载体包括MNDU3启动子。
在一个实施例中，载体包括包含人EF1a基因的第一内含子的EF1a启动子。
在一个实施例中，载体包括缺少人EF1a基因的第一内含子的EF1a启动子。
在特定实施例中，可能需要表达包括来自T细胞特异性启动子的CAR的多核苷酸。
如本文所使用的，“条件表达”可以是指任何类型的条件表达，包含但不限于：诱导型表达；可阻遏型表达；在具有特定生理、生物或疾病状态等的细胞或组织中的表达。此定义不旨在排除细胞类型或组织特异性表达。某些实施例提供了所关注多核苷酸的条件表达，例如，通过使细胞、组织、生物体等经受导致多核苷酸表达或导致由所关注多核苷酸编码的多核苷酸的表达增加或减少的治疗或病状来控制表达。
诱导型启动子/系统的说明性实例包含但不限于类固醇诱导型启动子，如对糖皮质激素或雌性激素受体进行编码的基因的启动子(可通过用相应激素处理来诱导)、巯基金属结合蛋白启动子(可通过用各种重金属处理来诱导)、MX-1启动子(可通过干扰素来诱导)、“基因开关(GeneSwitch)”米非司酮可调系统(Sirin等人,2003,《基因(Gene)》,323:67)、cumate诱导型基因开关(WO 2002/088346)、四环素依赖性调控系统等。
还可以通过使用位点特异性DNA重组酶实现条件表达。根据某些实施例，载体包括由位点特异性重组酶介导的重组的至少一个(通常两个)位点。如本文所使用的，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包含切除或整合蛋白、酶、辅因子或参与涉及一个或多个重组位点(例如，两个、三个、四个、五个、七个、十个、十二个、十五个、二十个、三十个、五十个等)的重组反应的相关蛋白，所述蛋白可以是野生型蛋白质(参见Landy,《生物技术当前述评(Current Opinion in Biotechnology)》3:699-707(1993))或突变体、衍生物(例如，含有重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段和其变体。适于在特定实施例中使用的重组酶的说明性实例包含但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1和ParA。
载体可以包括各种各样的位点特异性重组酶中的任何位点特异性重组酶的一个或多个重组位点。应理解，位点特异性重组酶的靶位点是整合载体，例如，逆转录病毒载体或慢病毒载体，所需的任何一个或多个位点的补充。如本文所使用的，术语“重组序列”、“重组位点”或“位点特异性重组位点”指代重组酶识别和结合的特定核酸序列。
例如，Cre重组酶的一个重组位点是loxP，其是34碱基对序列，所述碱基对序列包括8碱基对核心序列两侧的两个13碱基对反向重复序列(用作重组酶结合位点)(参见图1中Sauer,B.,《生物技术当前述评》,5:521-527(1994))。其它示例性loxP位点包含但不限于：lox511(Hoess等人,1996；Bethke和Sauer,1997)；lox5171(Lee和Saito,1998)；lox2272(Lee和Saito,1998)；m2(Langer等人,2002)；lox71(Albert等人，1995)；以及lox66(Albert等人,1995)。
FLP重组酶的合适识别位点包含但不限于：FRT(McLeod等人,1996)；F1、F2、F3(Schlake和Bode，1994)；F4、F5(Schlake和Bode,1994)；FRT(LE)(Senecoff等人,1988)；FRT(RE)(Senecoff等人,1988)。
识别序列的其它实例为通过重组酶λ整合酶，例如，phi-c31，识别的attB、attP、attL和attR序列。
Figure BDA0004177911670000571
SSR仅介导异型位点attB(长度为34bp)与attP(长度为39bp)之间的重组(Groth等人,2000)。分别以细菌和噬菌体基因组上用于噬菌体整合酶的附接位点命名的attB和attP均含有可能由/>
Figure BDA0004177911670000573
同源二聚体结合的不完全的反向重复序列(Groth等人,2000)。产物位点attL和attR对另外的/>
Figure BDA0004177911670000572
介导的重组具有有效惰性(Belteki等人，2003)，从而使反应不可逆。对于催化插入，已经发现，相比于attP位点插入到基因组attB位点中，attB携带的DNA更容易插入到基因组attP位点中(Thyagarajan等人,2001；Belteki等人,2003)。因此，典型的策略通过同源重组将携带attP的“对接位点”定位到限定的基因座中，然后所述基因座与携带attB的进入序列配合以便插入。
如本文所使用的，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指促进内部核糖体直接进入顺反子(蛋白编码区)的如ATG等起始密码子由此导致基因的帽非依赖性翻译的元件。参见例如，Jackson等人,1990.《生物化学科学趋势(Trends Biochem Sci)》15(12):477-83)以及Jackson和Kaminski 1995.《RNA》1(10):985-1000。在特定实施例中，载体包含编码一个或多个多肽的一个或多个所关注多核苷酸。在特定实施例中，为了实现多个多肽中的每一个多肽的有效转译，可以通过一个或多个IRES序列或编码自切割多肽的多核苷酸序列来分离多核苷酸序列。在一个实施例中，本文设想的多核苷酸中使用的IRES是EMCV IRES。
如本文所使用的，术语“Kozak序列”是指大大促进mRNA与核糖体的小亚单元的初始结合并增加转译的短核苷酸序列。共有Kozak序列是(GCC)RCCATGG(SEQ ID NO:107)，其中R是嘌呤(A或G)(Kozak,1986.《细胞(Cell)》44(2):283-92以及Kozak,1987.《核酸研究》.15(20):8125-48)。在特定实施例中，载体包括具有共有Kozak序列并编码期望多肽(例如，CAR)的多核苷酸。
引导异源核酸转录物的高效终止和聚腺苷酸化的元件将增加异源基因表达。转录终止信号通常存在于多腺苷酸化信号的下游。在特定实施例中，载体包括对待表达的多肽进行编码的多核苷酸的3′处的多腺苷酸化序列。如本文所使用的，术语“polyA位点”或“polyA序列”表示通过RNA聚合酶II引导新生RNA转录物的终止和多腺苷酸化二者的DNA序列。多腺苷酸化序列可以通过向编码序列的3′端添加polyA尾来促进mRNA稳定性，并且因此有助于提高转译效率。切割和多腺苷酸化由RNA中的poly(A)序列引导。哺乳动物前mRNA的核心poly(A)序列具有位于切割-多腺苷酸化位点两侧的两个识别元件。通常，几乎不变的AAUAAA六聚体位于富含U或GU残基的更加可变元件的上游20-50个核苷酸处。新生转录物的切割发生在这两种元件之间，并且与向5′切割产物添加的多达250个腺苷偶联。在特定实施例中，核心poly(A)序列是理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)。在特定实施例中，poly(A)序列是SV40 polyA序列、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)、其变体或本领域已知的另一适合的异源或内源polyA序列。
在一些实施例中，多核苷酸或含有多核苷酸的细胞利用自杀基因，包含用于减小直接毒性和/或不受控制的增殖的风险的诱导型自杀基因。在具体方面，自杀基因对含有多核苷酸或细胞的宿主不产生免疫性。可以使用的自杀基因的某个实例是胱天蛋白酶-9或胱天蛋白酶-8或胞嘧啶脱氨酶。可以使用特定的二聚化学诱导剂(CID)来激活胱天蛋白酶-9。
H.载体
在特定实施例中，通过非病毒或病毒载体将编码CAR的一个或多个多核苷酸引入到细胞(例如，免疫效应细胞)中。在一些实施例中，通过非病毒或病毒载体将编码CAR的多顺反子多核苷酸引入到细胞中。
术语“载体”在本文中用于是指能够转移或转运另一个核酸分子的核酸分子。所转移的核酸通常连接到，(例如，插入)载体核酸分子。载体可以包含在细胞中引导自主复制的序列，或可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。在特定实施例中，非病毒载体用于将本文所设想的一个或多个多核苷酸递送到T细胞。
非病毒载体的说明性实例包含但不限于mRNA、质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒以及细菌人工染色体。
特定实施例中所设想的多核苷酸或载体的非病毒递送的说明性方法包含但不限于：电穿孔、声致穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪法、病毒体、脂质体、免疫脂质体、纳米颗粒、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体、DEAE-右旋糖酐介导的转移、基因枪和热休克。
在特定实施例中所设想的适合在特定实施例中使用的多核苷酸递送系统的说明性实例包含但不限于由阿马夏生物系统公司(Amaxa Biosystems)、马克赛特公司(Maxcyte,Inc.)、BTX分子递送系统公司(BTX Molecular Delivery Systems)和哥白尼治疗公司(Copernicus Therapeutics Inc.)提供的系统。脂质转染试剂是商业销售的(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。已经在文献中描述了适于多核苷酸的高效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质。参见，例如，Liu等人(2003),《基因疗法》10：180-187；以及Balazs等人(2011)《药物递送杂志(Journal of Drug Delivery.)》2011：1-12。在特定实施例中还设想了抗体靶向的、源自细菌的、基于无生命纳米细胞的递送。
在各个实施例中，多核苷酸是引入细胞中的mRNA，以便瞬时表达所期望的多肽。
如本文所使用，“瞬时”是指未整合的转基因在数小时、数天或数周的时间段内表达，其中表达的时间段小于多核苷酸(如果整合到基因组中或包含在细胞中的稳定质粒复制子内)的表达时间段。
在特定实施例中，编码多肽的mRNA是体外转录的mRNA。如本文所使用，“体外转录的RNA”是指已在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录RNA的模板。
在特定实施例中，mRNA还可以包含5′帽或修饰的5′帽和/或poly(A)序列。如本文所使用，5′帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是在转录开始后不久添加到真核信使RNA的“前”或5'端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽包含与第一转录核苷酸连接并且被核糖体识别并且保护免受RNA酶影响的末端基团。可修饰封端部分以调节mRNA的功能性，诸如其稳定性或翻译效率。在一特定实施例中，mRNA包括约50个与约5000个腺嘌呤的poly(A)序列。在一个实施例中，mRNA包括约100个至约1000个碱基、约200个至约500个碱基或约300个至约400个碱基之间的poly(A)序列。在一个实施例中，mRNA包括约65个碱基、约100个碱基、约200个碱基、约300个碱基、约400个碱基、约500个碱基、约600个碱基、约700个碱基、约800个碱基、约900个碱基或约1000个或更多个碱基的poly(A)序列。poly(A)序列可以被化学或酶促修饰为调节mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。
如下文所描述的，包括在特定实施例中所设想的多核苷酸的病毒载体可以通过向个体患者施用进行体内递送，通常通过全身施用(例如，静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或颅内输注)或局部应用。可替代地，载体可以离体递送到细胞，如从个体患者移植的细胞(例如，动员的外周血、淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检等)或通用供体造血干细胞，然后将细胞再植入患者体内。
在一个实施例中，将包括编码CAR的多核苷酸的病毒载体直接施用于生物体，用于在体内转导细胞。可替代地，可以施用裸DNA。通过通常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径施用，包含但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。施用这种核酸的合适的方法是本领域技术人员可获得的并且是公知的，并且尽管可以使用多于一种途径来施用特定组合物，但是特定途径通常可以提供比另一条途径更直接且更有效的反应。
适合于在本文所设想的特定实施例中使用的病毒载体系统的说明性实例包含但不限于腺病毒伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒以及痘苗病毒载体。
在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)转导细胞，将编码CAR的一个或多个多核苷酸引入到免疫效应细胞中，例如，T细胞。
AAV是一种小型(约26nm)复制缺陷型、主要是附加型无包膜病毒。AAV可以感染分裂和非分裂细胞，并且可以将其基因组并入到宿主细胞的基因组中。重组AAV(rAAV)通常至少由转基因和其调节序列以及5′和3′AAV反向末端重复序列(ITR)构成。ITR序列的长度约为145bp。在特定实施例中，rAAV包括从AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10分离的ITR和衣壳序列。
在一些实施例中，使用嵌合rAAV，从一种AAV血清型分离ITR序列，并从不同的AAV血清型分离衣壳序列。例如，具有源自AAV2的ITR序列和源自AAV6的衣壳序列的rAAV被称为AAV2/AAV6。在特定实施例中，rAAV载体可以包括来自AAV2的ITR以及来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10中任一种的衣壳蛋白。在一优选实施例中，rAAV包括源自AAV2的ITR序列和源自AAV6的衣壳序列。在一优选实施例中，rAAV包括源自AAV2的ITR序列和源自AAV2的衣壳序列。
在一些实施例中，工程化和选择方法可以应用于AAV衣壳，以使其更有可能转导所关注细胞。
rAAV载体的构建、产生和其纯化已经在以下公开：例如在美国专利第9,169,494号；第9,169,492号；第9,012,224号；第8,889,641号；第8,809,058号；和第8,784,799号，所述美国专利中的每一个通过引用以其整体并入本文中。
在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的逆转录病毒，例如，慢病毒转导细胞，将编码CAR的所述一个或多个多核苷酸引入到免疫效应细胞中。
如本文所使用的，术语“逆转录病毒”是指RNA病毒，所述RNA病毒将其基因组RNA逆转录为线性双链DNA拷贝并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。适于特定实施例使用的说明性逆转录病毒包含但不限于：莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗里德鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)以及慢病毒。
如本文所使用的，术语“慢病毒”是指复杂逆转录病毒的组(或属)。说明性慢病毒包含但不限于：HIV(人类免疫缺陷病毒；包含HIV 1型和HIV 2)；维斯纳-梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施例中，优选基于HIV的载体主链(即，HIV顺式作用序列元件)。
在各个实施例中，本文所设想的慢病毒载体包括一个或多个LTR以及以下附属元件中的一种或多种或全部：cPPT/FLAP、Psi(Ψ)包装信号、输出元件、poly(A)序列，并且可以任选地包括WPRE或HPRE、绝缘体元件、可选择标志物和细胞自杀基因，如本文其它地方所讨论的。
在特定实施例中，本文所设想的慢病毒载体可以是整合的或非整合的或整合缺陷型慢病毒。如本文所使用的，术语“整合缺陷型慢病毒”或“IDLV”是指具有缺乏将病毒基因组整合到宿主细胞的基因组的能力的整合酶的慢病毒。专利申请WO 2006/010834中已经描述了无整合能力的病毒载体，所述专利申请通过引用以其整体并入本文。
适于降低整合酶活性的HIV-1pol基因的说明性突变包含但不限于：H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199c、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A和K264H。
在一个实施例中，HIV-1整合酶缺陷型pol基因包括D64V、D116I、D116A、E152G或E152A突变；D64V、D116I和E152G突变；或D64V、D116A和E152A突变。
在一个实施例中，HIV-1整合酶缺陷型pol基因包括D64V突变。
术语“长末端重复序列(LTR)”是指位于逆转录病毒DNA末端的碱基对的结构域，其在其天然序列环境中是直接重复序列并含有U3、R和U5区。
如本文所使用的，术语“FLAP元件”或“cPPT/FLAP”指代序列包含逆转录病毒，例如，HIV-1或HIV-2，的中心多嘌呤段和中心终止序列(cPPT和CTS)的核酸。合适的FLAP元件描述于美国专利第6,682,907号和Zennou等人,2000,《细胞》,101:173。在另一实施例中，慢病毒载体含有在cPPT和/或CTS元件中具有一种或多种突变的FLAP元件。在又另一个实施例中，慢病毒载体包括cPPT或CTS元件。在又另一实施例中，慢病毒载体不包括cPPT或CTS元件。
如本文所使用的，术语“包装信号”或“包装序列”是指位于逆转录病毒基因组内的psi[Ψ]序列，所述序列是将病毒RNA插入病毒衣壳或颗粒中所需要的，参见例如Clever等人,1995.《病毒学杂志》,第69卷,第4期；第2101-2109页。
术语“输出元件”是指调节RNA转录物从细胞的细胞核向细胞质转运的顺式作用转录后调节元件。RNA输出元件的实例包含但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)(参见例如,Culle等人,1991.《病毒学杂志》.65:1053；以及Culle等人,1991.《细胞》58:423)以及乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)。
在特定实施例中，通过将转录后调节元件、高效的多腺苷酸化位点和任选地转录终止信号结合到载体中来增加异源序列在病毒载体中的表达。各种转录后调节元件可以增加异源核酸在蛋白质处的表达，例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE；Zufferey等人,1999,《病毒学杂志》,73:2886)；存在于乙型肝炎病毒中的转录后调节元件(HPRE)(Huang等人,《分子与细胞生物学》,5:3864)；等等(Liu等人,1995,《基因与发育(GenesDev)》,9:1766)。
由于对LTR进行修饰，所以慢病毒载体优选地含有几种安全性增强。“自失活”(SIN)载体是指复制缺陷型载体，例如，其中被称为U3区的右(3')LTR增强子-启动子区已经被修饰(例如，通过缺失或取代)成防止第一轮病毒复制之外的病毒转录。通过用异源启动子替换5'LTR的U3区来提供额外的安全性增强，以驱动病毒基因组在产生病毒颗粒期间的转录。可以使用的异源启动子的实例包含例如病毒猿猴病毒40(SV40)(例如，早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如，即刻早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)以及单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。
如本文所使用，术语“假型”或“假型包装”是指具有病毒包膜蛋白的病毒，所述病毒包膜蛋白已被具有优选特性的另一种病毒的包膜蛋白取代。例如，HIV可以用水疱性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白进行假型包装，这允许HIV感染更广泛的细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常将病毒靶向CD4+呈递细胞。
在某些实施例中，慢病毒载体根据已知方法产生。参见例如，Kutner等人,《BMC生物技术(BMC Biotechnol)》2009；9:10.Doi:10.1186/1472-6750-9-10；Kutner等人《自然实验手册(Nat.Protoc.)》2009；4(4):495-505。Doi:10.1038/nprot.2009.22。
根据本文所设想的某些具体实施例，大多数或所有病毒载体主链序列都源自慢病毒，例如，HIV-1。然而，应理解，可以使用多种不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，或某些慢病毒序列可以容纳大量取代和变化的组合而不损害转移载体执行本文所描述功能的能力。此外，各种慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人,(1996a、1996b和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998,美国专利第6,013,516号；以及第5,994,136号，所述文献中的许多文献可以适于产生本文所设想的病毒载体或转移质粒。
在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的腺病毒转导细胞，将编码CAR的所述一个或多个多核苷酸引入到免疫效应细胞中。
基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高转导效率并且并不需要细胞分裂。使用这种载体，已经获得了高滴度和高表达水平。此载体可以在相对简单的系统中大量制备。将大多数腺病毒载体工程化，使得转基因替代Ad E1a、E1b和/或E3基因；随后，使复制缺陷型载体在以反式提供缺失的基因功能的人293细胞中繁殖。Ad载体可以在体内转导多种类型的组织，包含如在肝、肾和肌肉中发现的非分裂的分化细胞。常规Ad载体具有很大的承载能力。
复制缺陷的当前腺病毒载体的产生和繁殖可以利用命名为293的独特辅助细胞系，所述辅助细胞系通过Ad5 DNA片段从人胚胎肾细胞转化并组成性地表达E1蛋白(Graham等人,1977)。由于E3区可从腺病毒基因组中分配出来(Jones和Shenk,1978)，所以目前的腺病毒载体在293细胞的帮助下在E1、D3区或两个区中携带外源DNA(Graham和Prevec,1991)。腺病毒载体已经用于真核基因表达(Levrero等人，1991；Gomez-Foix等人，1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。向不同的组织施用重组腺病毒方面的研究包含气管滴注(Rosenfeld等人,1991；Rosenfeld等人,1992)、肌肉注射(Ragot等人,1993)、外周静脉注射(Herz和Gerard,1993)以及立体定向脑内接种(Le Gal La Salle等人，1993)。在临床试验中使用Ad载体的实例涉及用于伴随肌内注射的抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法(Sterman等人,《人基因疗法(Hum.Gene Ther.)》7:1083-9(1998))。
在各个实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的单纯疱疹病毒，例如，HSV-1、HSV-2转导细胞，将编码CAR的所述一个或多个多核苷酸引入到免疫效应细胞中。在一些实施例中，通过用包括一个或多个多核苷酸的单纯疱疹病毒，例如，HSV-1、HSV-2转导细胞，将编码多顺反子信息的所述一个或多个多核苷酸引入到免疫效应细胞中，所述多顺反子信息编码CAR。
成熟HSV病毒粒子由包膜的二十面体衣壳组成，其中病毒基因组由152kb的线性双链DNA分子组成。在一个实施例中，基于HSV的病毒载体缺乏一个或多个必需或非必需的HSV基因。在一个实施例中，基于HSV的病毒载体为复制缺陷型。大多数复制缺陷型HSV载体含有缺失以去除一个或多个中早期、早期或晚期HSV基因从而防止复制。例如，HSV载体可能缺乏立即早期基因，所述立即早期基因选自由以下组成的组：ICP4、ICP22、ICP27、ICP47及其组合。HSV载体的优点是其进入可以导致长期DNA表达的潜伏期的能力，以及其可以容纳高达25kb的外源DNA插入物的大型病毒DNA基因组。基于HSV的载体在例如以下专利中有描述：美国专利第5,837,532号、第5,846,782号和第5,804,413号及国际专利申请WO 91/02788、WO96/04394、WO 98/15637和WO 99/06583，所述专利中的每一个通过引用以其整体并入本文。
I.经基因修饰的细胞
在各个实施例中，被基因修饰成表达本文所设想的CAR的细胞用于治疗B细胞相关病状。如本文所使用的，术语“经基因工程化的”或“经基因修饰的”是指将额外的遗传物质以DNA或RNA的形式添加到细胞中的总遗传物质中。术语“经基因修饰的细胞”、“经修饰细胞”和“重定向细胞”可互换使用。如本文所使用的，术语“基因治疗”指代将额外的遗传物质以DNA或RNA的形式引入到细胞中的总遗传物质中，所述额外的遗传物质恢复、校正或修饰基因的表达或实现表达治疗多肽，例如CAR，的目的。
在特定实施例中，将本文所设想的CAR引入到免疫效应细胞中并进行表达，从而将其特异性重定向至所关注靶抗原，例如，BCMA多肽。“免疫效应细胞”是免疫系统的任何细胞，其具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、细胞因子分泌、ADCC和/或CDC的诱导)。本文所设想的说明性免疫效应细胞为T淋巴细胞，包含但不限于细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、TIL和辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)。在一特定实施例中，所述细胞包括αβT细胞。在一特定实施例中，所述细胞包括γδT细胞。在一实施例中，免疫效应细胞包含自然杀伤(NK)细胞。在一个实施例中，免疫效应细胞包含自然杀伤T(NKT)细胞。
免疫效应细胞可以是自体的(autologous/autogeneic)(“自身的”)或非自体的(“非自身的”，例如，同种异体的、同基因的或异种的)。如本文所使用的，“自体”指代来自同一受试者的细胞。如本文所使用的，“同种异体”指代同一物种的与相比之下的细胞在基因上有所不同的细胞。如本文所使用的，“同基因”指代不同受试者的与相比之下的细胞在基因上相同的细胞。如本文所使用的，“异种”指代与相比之下的细胞属于不同物种的细胞。在优选实施例中，细胞是自体的。
与在特定实施例中所设想的CAR一起使用的说明性免疫效应细胞包含T淋巴细胞。术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域公认的并且旨在包含胸腺细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或激活T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助(Th)细胞，例如T辅助1(Th1)细胞或T辅助2(Th2)细胞。T细胞可以是辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)CD4+T细胞、细胞毒性T细胞(CTL，CD8+T细胞)、CD4+CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞或任何其它T细胞亚群。适于在特定实施例中使用的其它说明性T细胞群体包含原始T细胞(TN)、T记忆干细胞(TSCM)、中心记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)和效应T细胞(TEFF)。
如本领域的技术人员所理解的，其它细胞还可以用作具有本文的CAR的免疫效应细胞。具体地，免疫效应细胞还包含NK细胞、NKT细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。免疫效应细胞还包含效应细胞的祖细胞，其中可以在体内或体外诱导这种祖细胞分化成免疫效应细胞。因此，在特定实施例中，免疫效应细胞包含免疫效应细胞的祖细胞，如源自脐带血、骨髓或动员外周血的CD34+细胞群体内含有的造血干细胞(HSC)，所述HSC在施用于受试者时分化为成熟免疫效应细胞或者可以在体外诱导以分化为成熟免疫效应细胞。
如本文所使用的，术语“CD34+细胞”是指在其细胞表面上表达CD34蛋白的细胞。如本文所使用的，“CD34”是指通常充当细胞—细胞粘附因子并且参与T细胞进入淋巴结的细胞表面糖蛋白(例如，唾液黏蛋白)。CD34+细胞群含有造血干细胞(HSC)，其在施用给患者时分化并促成所有造血谱系，包含T细胞、NK细胞、NKT细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞。
在特定实施例中，提供了用于制备表达本文所设想的CAR的免疫效应细胞的方法。在一个实施例中，所述方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达如本文所设想的一种或多种CAR。在某些实施例中，免疫效应细胞从个体分离并经基因修饰而无需在体外进一步操纵。然后，可以将这种细胞直接再次施用到个体。在另外的实施例中，免疫效应细胞在基因修饰以表达CAR之前首先在体外被激活和刺激以增殖。在这方面，免疫效应细胞可以在被基因修饰(即，被转导或转染成表达本文所设想的CAR)之前和/或之后培养。
在特定实施例中，在本文所设想的免疫效应细胞的体外操纵或基因修饰之前，从受试者获得细胞来源。在特定实施例中，经修饰免疫效应细胞包括T细胞。
在特定实施例中，可以使用本文所设想的方法直接基因修饰PBMC以表达CAR。在某些实施例中，在PBMC分离之后，将T淋巴细胞进一步分离，并且在某些实施例中，可以在基因修饰和/或扩增之前或之后将细胞毒性和辅助T淋巴细胞分选到原始、记忆和效应T细胞亚群中。
如T细胞等免疫效应细胞可以在分离之后使用已知方法进行基因修饰，或者免疫效应细胞可以在进行基因修饰之前进行体外激活和扩增(或在祖细胞的情况下分化)。在一特定实施例中，如T细胞等免疫效应细胞用本文所设想的嵌合抗原受体进行基因修饰(例如，用包括编码CAR或多顺反子信使的核酸的病毒载体进行转导，所述多顺反子信使编码CAR)，并且然后在体外进行激活和扩增。在各个实施例中，可以在基因修饰之前或之后使用如例如以下所述的方法对T细胞进行激活和扩增以表达CAR：美国专利第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；以及美国专利申请公开第20060121005号。
在一个实施例中，CD34+细胞用本文所设想的核酸构建体转导。在某些实施例中，经转导的CD34+细胞在施用于受试者，通常是细胞最初从其分离的受试者之后在体内分化成成熟免疫效应细胞。在另一实施例中，CD34+细胞可以在暴露于以下细胞因子中的一种或多种细胞因子之前或在用如本文所设想的CAR进行基因修饰之后根据前述方法在体外进行刺激：Flt-3配体(FLT3)、干细胞因子(SCF)、巨核细胞生长和分化因子(TPO)、IL-3和IL-6(Asheuer等人,2004；Imren等人,2004)。
在特定实施例中，用于治疗癌症的修饰的免疫效应细胞群体包括本文所设想的CAR。例如，经修饰的免疫效应细胞群体由从被诊断患有本文所述的B细胞恶性肿瘤的患者(自体供体)获得的外周血单核细胞(PBMC)制备。PBMC形成可以是CD4+、CD8+或CD4+和CD8+的T淋巴细胞的异质群体。
PBMC还可包括其它细胞毒性淋巴细胞，如NK细胞或NKT细胞。将携带特定实施例中所设想的CAR的编码序列的表达载体引入到人供体T细胞、NK细胞或NKT细胞的群体中。在特定实施例中，携带表达载体的成功转导的T细胞可以使用流式细胞术分选，以分离CD3阳性T细胞，并且接着除了使用抗CD3抗体和/或抗CD28抗体和IL-2或如本文其它地方所述本领域已知的任何其它方法进行细胞激活之外，进一步增殖以增加这些表达CAR蛋白的T细胞的数目。标准程序可以用于表达CAR蛋白T细胞的T细胞的冷冻保存，所述冷冻保存用于储存和/或制备以用于人类受试者。在一个实施例中，在不存在非人动物衍生产物如胎牛血清(fetal calf serum/fetal bovine serum)的情况下进行T细胞的体外转导、培养和/或扩增。由于PBMC的异质群体是经基因修饰的，因此所得的经转导的细胞是包括BCMA靶向CAR的经修饰的细胞的异质群体，如本文所设想的。
在一另外的实施例中，例如，一种、两种、三种、四种、五种或更多种不同表达载体的混合物可用于基因修饰免疫效应细胞的供体群，其中每个载体编码如本文所涵盖的不同嵌合抗原受体蛋白。所得的经修饰免疫效应细胞形成经修饰细胞的混合群体。
可以使用本领域已知的各种方法制造经基因工程化的细胞，包含T细胞，参见例如WO 2016/094304，其通过引用整体并入本文。
J.组合物和调配物
在特定实施例中，对药学上可接受的载体溶液的调配对本领域的技术人员来说是熟知的，这和开发用于将本文所设想的特定组合物用于各种治疗方案中的适合的给药和治疗方案一样，包含例如，肠内和肠胃外，例如，血管内、静脉内、动脉内、骨内、心室内、脑内、颅内、脊柱内、鞘内和髓内施用和调配。本领域的技术人员应当理解，本文所设想的特定实施例可以包括如制药领域中熟知并且在例如以下各项中描述的调配物等其它调配物：《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第I卷和第II卷第22版编辑：Loyd V.Allen Jr,宾夕法尼亚州费城：医药出版社(Philadelphia,PA：Pharmaceutical Press)；2012，所述文献通过引用以其整体并入本文。
本文所设想的组合物可以包括一种或多种如本文所设想的抗BCMA多肽或其片段、CAR多肽、多核苷酸、包括其的载体或经基因修饰的免疫效应细胞等。组合物包含但不限于药物组合物。在优选实施例中，组合物包括被修饰成表达CAR的一种或多种细胞。
“药物组合物”是指单独地或与一种或多种其它治疗方式组合地施用于细胞或动物的在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中调配的组合物。还应理解，如果需要，组合物也可以与其它药剂组合施用，例如，细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前药、药物、抗体或其它各种药学活性剂。对组合物中还可以包含的其它组分实际上不存在限制，条件是另外的药剂不会不利地影响组合物递送预期疗法的能力。在优选实施例中，药物组合物包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以及被修饰成表达如本文所设想的CAR的一种或多种细胞。在一些实施例中，药物组合物包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以及如本文所设想的抗BCMA抗体或其片段。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏性应答或其它问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所使用的，“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包含但不限于任何已经被美国食品和药品管理局批准为可用于人类或家畜的佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。示例性药学上可接受的载体包含但不限于糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂、蜡、动植物油脂、石蜡、硅酮、膨润土、硅酸、氧化锌；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer'ssolution)；乙醇；磷酸盐缓冲液；以及药物调配物中采用的任何其它相容性物质。
在特定实施例中，组合物包括一定量的本文所设想的表达CAR的免疫效应细胞。在其它实施例中，组合物包括一定量的本文所设想的抗BCMA抗体或其片段。如本文所使用，术语“量”是指实现有益或期望的预防或治疗结果(包括临床结果)的基因修饰的治疗细胞，例如，T细胞的“有效的量”或“有效量”。
“预防有效量”是指有效实现所需预防结果的经基因修饰的治疗细胞的量。通常，但不一定，因为预防剂量是在疾病之前或疾病早期用于受试者的，所以预防有效量小于治疗有效量。
基因修饰的治疗细胞的“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及干细胞和祖细胞在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过病毒或转导的治疗细胞的任何毒性或有害作用的量。术语“治疗有效量”包含有效地“治疗”受试者(例如，患者)的量。当指示治疗量时，待施用的组合物的精确量可以由内科医生涵盖年龄、体重、肿瘤大小、感染程度或转移程度以及患者(受试者)的病状的个体差异来确定。
通常可以说，包括本文所设想的T细胞的药物组合物可以以102个至1010个细胞/kg体重，优选地105个至106个细胞/kg体重施用，包含那些范围内的所有整数值的剂量。细胞的数目将取决于组合物期望的最终用途，其中包含的细胞的类型也是如此。对于本文所提供的用途，细胞的体积通常为一升或更少，可以为500mL或更少，甚至250mL或100mL或更少。因此，所期望细胞的密度通常大于106个细胞/ml，并且通常大于107个细胞/ml，通常108个细胞/ml或更大。临床相关数目的免疫细胞可以分配到累积等于或超过105、106、107、108、109、1010、1011或1012个细胞的多次输注中。在一些方面，特别是由于所有输注的细胞将被重新定向至特定靶抗原，所以可以施用106/千克(106-1011/患者)范围内的较低数目的细胞。组合物可以以这些范围内的剂量多次施用。对于进行治疗的患者，细胞可以是同种异体的、同基因的、异种的或自体的。如果期望，治疗还可以包含施用如本文所设想的有丝分裂原(例如，PHA)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-18和TNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1α等)以增强对免疫应答的诱导。
通常，包括如本文所设想的激活和扩增的细胞的组合物可以用于治疗和预防免疫受损的个体出现的疾病。在特定实施例中，包括被修饰成表达本文所设想的CAR的免疫效应细胞的组合物用于治疗癌症(例如，B细胞恶性肿瘤)。经修饰的免疫效应细胞可以单独施用，或作为药物组合物与载体、稀释剂、赋形剂和/或与如IL-2等其它组分或其它细胞因子或细胞群组合施用。在特定实施例中，药物组合物包括与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的一定量的基因修饰的T细胞。
包括被修饰成表达CAR(例如，T细胞)或抗体或其片段的免疫效应细胞群体的药物组合物可以包括缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。组合物优选地被调配成用于肠胃外施用，例如，血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌肉内施用。
液体药物组合物，无论其是溶液、悬浮液还是其它类似形式，均可以包含以下中的一种或多种：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、如可以用作溶剂或悬浮培养基的合成甘油单酯或甘油二酯等固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的药剂，如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选地是无菌的。
在一个实施例中，本文所设想的免疫效应细胞(例如，T细胞)组合物在药学上可接受的细胞培养基中调配。此类组合物适合于向人类受试者施用。在特定实施例中，药学上可接受的细胞培养基是无血清培养基。
无血清培养基相比于含有血清的培养基具有若干优点，包含组合物得到简化且得到更好定义、污染物程度得到减小、可能的传染剂来源得到消除以及成本降低。在各个实施例中，无血清培养基是无动物的并且可以任选地是无蛋白质的。任选地，培养基可以含有生物药学上可接受的重组蛋白。“无动物”培养基是指组合物源自非动物来源的培养基。重组蛋白替代无动物培养基中的天然动物蛋白质，并且营养物从合成的、植物或微生物来源获得。相比之下，“无蛋白质”培养基被定义为基本上不含蛋白质。
特定实施例中使用的无血清培养基的说明性实例包含但不限于QBSF-60(质量生物有限公司(Quality Biological,Inc.))、StemPro-34(生命技术公司(LifeTechnologies))和X-VIVO 10。
在一个优选实施例中，包括本文所设想的免疫效应细胞的组合物在包括PlasmaLyte A的溶液中调配。
在另一优选实施例中，包括本文所设想的免疫效应细胞的组合物在包括低温保存培养基的溶液中调配。例如，可以使用具有低温保存药剂的低温保存培养基以在解冻后保持高细胞存活率结果。特定实施例中使用的低温保存培养基的说明性实例包括但不限于CryoStor CS10、CryoStor CS5和CryoStor CS2。
在一更优选实施例中，包括本文所设想的免疫效应细胞的组合物在包括50:50PlasmaLyte A:CryoStor CS10的溶液中调配。
在一特定实施例中，组合物包括有效量的免疫效应细胞，所述免疫效应细胞被修饰成单独或与一种或多种治疗剂组合表达CAR。因此，表达CAR的免疫效应细胞可以单独施用或与其它已知的癌症治疗组合施用，如放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等。组合物还可以与抗生素组合施用。本领域可接受此类治疗剂作为如本文所设想的如特定癌症等特定疾病状态的标准治疗。在具体实施例中设想的示例性治疗剂包含细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂、治疗性抗体或其它活性剂和辅助剂。
在某些实施例中，包括被修饰成表达CAR的免疫效应细胞的组合物可以与任何数目的化学治疗剂结合施用。
多种其它治疗剂可以与本文所设想的组合物结合使用。在一个实施例中，包括免疫效应细胞、CAR的组合物与抗炎剂一起施用。
在一个实施例中，包括免疫效应细胞、CAR的组合物与治疗性抗体一起施用。适于与特定实施例中设想的CAR修饰的T细胞组合的治疗性抗体的说明性实例包含但不限于阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、西米普利单抗(cemiplimab)、可那木单抗(conatumumab)、克唑替尼(crizotinib)、达雷木单抗(daratumumab)、杜利他单抗(duligotumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛珠单抗(dalotuzumab)、度伐单抗(durvalumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)(HuLuc63)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、因达单抗(indatuximab)、奥妥珠格图单抗(inotuzumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、罗沃单抗(lorvotuzumab)、卢卡珠单抗(lucatumumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、莫西姆单抗(moxetumomab)、纳武单抗(nivolumab)、奥卡鲁单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(siltuximab)、四丙珠单抗(teprotumumab)和乌布妥昔单抗(ublituximab)。
K.治疗方法
表达本文所设想的CAR的经基因修饰的免疫效应细胞提供了用于预防、治疗和改善B细胞相关病状的改进的过继性免疫疗法，所述B细胞相关病状包含但不限于免疫调节病状和血液恶性肿瘤。
在各个实施例中，本文所设想的经基因修饰的免疫效应细胞提供了用于在增加受试者的癌细胞中的细胞毒性中使用，或用于在减少受试者的癌细胞的数量中使用的过继性免疫疗法的经改进的方法。
在特定实施例中，通过用本文所设想的CAR对初级免疫效应细胞进行基因修饰，将初级免疫效应细胞的特异性重定向至表达特定抗原的细胞，例如，癌细胞。在各个实施例中，使用病毒载体以对具有编码CAR的特定多核苷酸的免疫效应细胞进行基因修饰。在特定实施例中，所述CAR包括：抗BCMA抗原结合结构域，所述抗BCMA抗原结合结构域与BCMA多肽结合；铰链结构域；跨膜(TM)结构域；短寡肽或多肽接头，所述短寡肽或多肽接头将TM结构域与CAR的细胞内信号传导结构域连接；以及一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域；以及初级信号传导结构域。
在一个实施例中，提供了一种类型的细胞疗法，其中T细胞被基因修饰成表达靶向表达癌细胞的BCMA的CAR，并且T细胞被输注至有需要的受体。输注的细胞能够杀死在受体中引起疾病的细胞。与抗体疗法不同，T细胞疗法能够在体内复制，导致可以导致持续癌症治疗的长期持久性。
在一个实施例中，表达CAR的T细胞可以经历强大的体内T细胞扩增，并且可以持续延长的时间量。在另一实施例中，表达CAR的T细胞演变成特异性记忆T细胞或干细胞记忆T细胞，所述细胞可以被再激活以抑制任何另外的肿瘤形成或生长。
在特定实施例中，包括表达本文所设想的CAR的免疫效应细胞的组合物用于治疗与表达癌细胞或癌症干细胞的特定抗原相关的病状。
可使用包括本文所设想的CAR的免疫效应细胞治疗、预防或改善病状的说明性实例包含但不限于：全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征、恰加斯氏病、格雷夫氏病、韦格纳氏肉芽肿病、结节性多动脉炎、舍格伦综合征、寻常性天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、抗磷脂综合征、ANCA相关血管炎、古德帕斯丘氏病、川崎氏病和急进性肾小球肾炎。
经修饰的免疫效应细胞还可以应用于浆细胞病症，如重链疾病、原发性或免疫细胞相关淀粉样变性和显著性未确定的单克隆性丙种球蛋白病(MGUS)。
如本文所使用的，“B细胞恶性肿瘤”是指在B细胞(一种免疫系统细胞)中形成的一种癌症，如下文所讨论的。
在一特定实施例中，包括表达本文所设想的CAR的T细胞的组合物用于治疗骨肉瘤或尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)。
在一特定实施例中，包括表达本文所设想的CAR的T细胞的组合物用于治疗液体癌或血液癌。
在某些实施例中，所述液体癌或所述血液癌选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
在某些实施例中，所述液体癌或所述血液癌选自由以下组成的组：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病、红白血病、毛细胞白血病(HCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性粒细胞白血病(CML)、慢性髓单核细胞白血病(CMML)和真性红细胞增多症、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、塞扎里氏综合征(Sézary syndrome)、前体T淋巴母细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、明显多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤。
在某些实施例中，液体癌或血液癌选自由以下组成的组：急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓性白血病(AML)或慢性粒细胞白血病(CML)。
在优选实施例中，液体或血液癌是多发性骨髓瘤(MM)。
在优选实施例中，液体癌或血液癌是复发性/难治性多发性骨髓瘤(MM)。
在特定实施例中，提供了包括以下的方法：向有需要的患者单独或与一种或多种治疗剂组合施用治疗有效量的表达本文所设想的CAR的免疫效应细胞或包括所述免疫效应细胞的组合物。在某些实施例中，所述细胞用于治疗有风险患上癌症或与癌细胞相关的病状的患者。因此，在特定实施例中，用于治疗或预防或改善与异常B细胞活性相关的癌症或病状(例如，B细胞恶性肿瘤)的至少一种症状的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的表达本文所设想的CAR的经修饰的T细胞。
如本文所使用的，术语“个体”和“受试者”通常可互换使用并且指代表现出可以用本文其它地方设想的基因治疗载体、基于细胞的疗法和方法治疗的疾病、病症或病状的症状的任何动物。在优选实施例中，受试者包括表现出与可以用基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和本文其它地方涵盖的方法治疗的癌症相关的疾病、病症或病状的症状的任何动物。适合的受试者(例如，患者)包含实验用动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家养动物或宠物(如猫或狗)。包含非人灵长类和优选地人类患者。典型的受试者包含患有癌症(例如，B细胞恶性肿瘤)、已被诊断患有癌症(例如，B细胞恶性肿瘤)、或有风险患上或患有癌症(例如，B细胞恶性肿瘤)的人类患者。
如本文所使用，术语“患者”是指已经诊断为患有可以用基因治疗载体、基于细胞的治疗剂和本文其它地方公开的方法治疗的特定疾病、病症或病状的受试者。
如本文所使用的，“治疗(treatment或treating)”包含对疾病或病理状况的症状或病理的任何有益的或期望的效果并且甚至可以包含正在治疗的疾病或病状的一个或多个可测量标志物的最低限度的减少。治疗可以涉及任选地减少疾病或病状或者延迟疾病或病状的进展。“治疗”不一定指示完全根除或治愈疾病或病状或其相关症状。
如本文所使用的，“预防(prevent)”和如“预防(prevented/preventing)”等类似词语指示用于预防、抑制或减少疾病或病状发生或复发的可能性。预防还是指延迟疾病或病状的发作或复发或者延迟疾病或病状的症状的发生或复发。如本文所使用的，“预防(prevention)”和类似词语还包含在疾病或病状发作或复发之前减少疾病或病状的强度、效果、症状和/或负担。
如本文所使用的，短语“减轻…的至少一种症状”是指减少正在治疗的受试者的疾病或病状的一种或多种症状。在特定实施例中，被治疗的疾病或病状是癌症，其中所减轻的所述一种或多种症状包含但不限于虚弱、疲劳、呼吸短促、容易挫伤和出血、频繁感染、淋巴结肿大、腹部肿胀或疼痛(由于腹部器官肿大)、骨骼或关节疼痛、骨折、意外体重减轻、食欲不振、盗汗、持续性轻度发烧以及排尿减少(由于肾功能受损)。
“增强”或“促进”或者“增加”或“扩增”通常是指相比于由媒剂或对照分子/组合物引起的响应，本文所设想的组合物，例如，表达CAR的经基因修饰的T细胞能够产生、引发或引起更大的生理响应(即，下游效应)。可测量的生理响应可以包括T细胞扩增、激活、持续性的增加和/或癌细胞杀伤能力的增加以及从本领域的理解和本文中的描述中显而易见的其它方面。“增加的”或“增强的”量通常是“统计上显著”的量并且可以包含是由媒剂或对照组合物产生的应答的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括其间且在1以上的所有整数和小数点，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。
“减小”或“减弱”或“变少”或“减少”或“减轻”通常是指与由媒剂或对照分子/组合物引起的响应相比，本文所设想的组合物能够产生、引发或引起更少的生理响应(即，下游效应)。“减小的”或“减少的”量通常是“统计上显著”的量并且可以包括是由媒剂、对照组合物或特定细胞谱系中的应答产生的应答(参考应答)的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括其间且在1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的减小。
“维持(maintain或maintenance)”或“保持”或“无变化”或“无实质变化”或“无实质减小”通常是指与由媒介物、对照分子/组合物引起的响应或特定细胞谱系中的响应相比，本文所涵盖的组合物能够在细胞中产生、引发或引起类似的生理响应(即，下游效应)。相当的应答是与参考应答没有显著差异或可测量的差异的应答。
在一个实施例中，治疗有需要的受试者的B细胞相关病状或癌症的方法包括施用有效量，例如，治疗有效量的包括本文所设想的经基因修饰的免疫效应细胞的组合物。施用的数量和频率将由如患者的病状以及患者疾病的类型和严重性等因素确定，尽管适当的剂量可以通过临床试验确定。
在一个实施例中，向受试者施用的组合物中免疫效应细胞，例如，表达CAR的T细胞，的量为至少0.1×105个细胞、至少0.5×105个细胞、至少1×105个细胞、至少5×105个细胞、至少1×106个细胞、至少0.5×107个细胞、至少1×107个细胞、至少0.5×108个细胞、至少1×108个细胞、至少0.5×109个细胞、至少1×109个细胞、至少2×109个细胞、至少3×109个细胞、至少4×109个细胞、至少5×109个细胞或至少1×1010个细胞。
在特定实施例中，向受试者施用约1×107个T细胞至约1×109个T细胞、约2×107个T细胞至约0.9×109个T细胞、约3×107个T细胞至约0.8×109个T细胞、约4×107个T细胞至约0.7×109个T细胞、约5×107个T细胞至约0.6×109个T细胞、或约5×107个T细胞至约0.5×109个T细胞。
在一个实施例中，向受试者施用的组合物中免疫效应细胞，例如表达CAR的T细胞，的量为至少0.1×104个细胞/kg体重、至少0.5×104个细胞/kg体重、至少1×104个细胞/kg体重、至少5×104个细胞/kg体重、至少1×105个细胞/kg体重、至少0.5×106个细胞/kg体重、至少1×106个细胞/kg体重、至少0.5×107个细胞/kg体重、至少1×107个细胞/kg体重、至少0.5×108个细胞/kg体重、至少1×108个细胞/kg体重、至少2×108个细胞/kg体重、至少3×108个细胞/kg体重、至少4×108个细胞/kg体重、至少5×108个细胞/kg体重或至少1×109个细胞/kg体重。
在特定实施例中，向受试者施用约1×106个T细胞/kg体重至约1×108个T细胞/kg体重、约2×106个T细胞/kg体重至约0.9×108个T细胞/kg体重、约3×106个T细胞/kg体重至约0.8×108个T细胞/kg体重、约4×106个T细胞/kg体重至约0.7×108个T细胞/kg体重、约5×106个T细胞/kg体重至约0.6×108个T细胞/kg体重、或约5×106个T细胞/kg体重至约0.5×108个T细胞/kg体重。
本领域的普通技术人员将认识到，可能需要多次施用本文所设想的组合物以实现期望疗法。例如，组合物可以在1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更长时间的跨度内施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次或更多次。
在某些实施例中，可能希望向受试者施用激活的免疫效应细胞，并且随后重新抽血(或进行单采血液成分术)、从中激活免疫效应细胞并且向患者重新输注这些激活的和扩增的免疫效应细胞。可以每隔几周进行多次此过程。在某些实施例中，可以抽取10cc到400cc的血来激活免疫效应细胞。在某些实施例中，抽取20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc或400cc或更多量的血来激活免疫效应细胞。不受理论束缚，使用该多次抽血/多次重新输注方案可以用于选出某些免疫效应细胞群体。
本文所设想的组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。在一优选实施例中，肠胃外施用组合物。本文所使用的短语“肠胃外施用(parenteral administration和administered parenterally)”意指除了肠内施用和局部施用以外的通常通过注射进行的施用方式，并且包含但不限于：血管内、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、瘤内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内以及胸骨内注射和输注。在一个实施例中，本文所设想的组合物通过直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位向受试者施用。
在一个实施例中，向有需要的受试者施用有效量的组合物以增加对受试者的B细胞相关病状的细胞免疫应答。免疫应答可以包含由能够杀死感染细胞、调节性T细胞和辅助T细胞应答的细胞毒性T细胞介导的细胞免疫应答。还可以诱导主要由能够激活B细胞从而导致抗体产生的辅助T细胞介导的体液免疫应答。多种技术可用于分析由组合物诱导的免疫应答的类型，所述技术在本领域中得到充分描述；例如，《当代免疫学指南》,由：JohnE.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober编辑(2001)纽约州纽约市约翰威立父子公司(John Wiley&Sons,NY，N.Y.)。
在一个实施例中，提供了一种治疗被诊断为患有B细胞相关病状或癌症的受试者的方法，所述方法包括从被诊断为患有癌症或表达BCMA的B细胞相关病状的所述受试者体内取出免疫效应细胞，用包括编码本文所设想的CAR的核酸的载体对所述免疫效应细胞进行基因修饰，由此产生经修饰的免疫效应细胞群体，以及将所述经修饰的免疫效应细胞群体施用于所述同一受试者。在一优选实施例中，免疫效应细胞包括T细胞。
在某些实施例中，提供了用于刺激对受试者的靶细胞群体的免疫效应细胞介导的免疫调节剂应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用表达编码CAR分子的核酸构建体的免疫效应细胞群体的步骤。
用于施用特定实施例中所设想的细胞组合物的方法包含有效引起在受试者体内重新引入直接表达本文所设想的CAR的离体经基因修饰的免疫效应细胞或对重新引入免疫效应细胞的经基因修饰的祖细胞有效的方法，所述免疫效应细胞在引入到受试者体内时分化为表达CAR的成熟免疫效应细胞。一种方法包括用本文所设想的核酸构建体离体转导外周血T细胞，并且将转导的细胞返回到受试者中。
L.序列表
Figure BDA0004177911670000771
/>
Figure BDA0004177911670000781
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Figure BDA0004177911670000791
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Figure BDA0004177911670000801
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Figure BDA0004177911670000811
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Figure BDA0004177911670000821
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Figure BDA0004177911670000831
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Figure BDA0004177911670000841
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Figure BDA0004177911670000851
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Figure BDA0004177911670000861
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Figure BDA0004177911670000871
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Figure BDA0004177911670000881
本说明书中引用的所有出版物、专利申请和经发布专利通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或经发布专利具体地且单独地指示通过引用并入一样。
尽管已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式稍为详细地描述了前述实施例，但是根据本文设想的教导，本领域的普通技术人员将容易清楚的是，可以在不脱离随附权利要求的精神或范围的情况下对其进行某些改变和修改。提供以下实例仅作为说明并且不具有限制性。本领域的技术人员将容易认识到可以被改变或修改以产生本质上类似的结果的各种非关键参数。
实例
实例1
人抗BCMA CAR的构建
设计、构建并验证包括包含人抗BCMA CAR的构建体的慢病毒载体。将包括与抗BCMA CAR可操作地连接的MNDU3启动子的构建体克隆到慢病毒载体中，所述抗BCMA CAR含有CD8α信号序列、人抗BCMA scFv、CD8α铰链和跨膜结构域、CD137共刺激结构域和CD3ζ初级信号传导结构域。使用聚甘氨酸-丝氨酸接头在VH/VL和VL/VH两个朝向上设计和评估抗BCMA scFv。示例性抗BCMA CAR多肽序列在SEQ ID NO：50、52、54、56、58、60、62、64、66和68中示出，并且示例性抗BCMA CAR多核苷酸序列在SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、65和67中示出。
实例2
人抗BCMA CAR T细胞的评价
与已知的具有鼠类源性scFv的抗BCMA CAR(“比较物”)相比，评估对BCMA具有特异性并具有人scFv(例如，SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、66和68)的嵌合抗原受体(CAR)的CAR表达和针对表达BCMA的细胞的生物活性。使用G-
Figure BDA0004177911670000891
烧瓶在7天的过程中产生抗BCMA CAR T细胞。简而言之，外周血单核细胞(PBMC)在含有IL-2(CellGenix股份有限公司(CellGenix,GmbH))和对CD3和CD28具有特异性的抗体(美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotec,Inc.))的培养基中培养。在培养开始之后一天添加编码抗BCMA CAR的慢病毒。在第4天，将CAR T细胞从24孔板转移到24孔G-REX烧瓶中，细胞在其中维持直到第7天收获为止。对CAR T细胞进行询问用于将慢病毒载体整合到基因组DNA中。经转导的细胞的每个细胞的载体拷贝数在1至4个转基因拷贝数之间。如图2A所示，所有经转导的细胞展现出的载体拷贝数类似于或大于比较物抗BMCA CAR T细胞的载体拷贝数。
还使用流式细胞术分析CAR T细胞的细胞表面CAR表达。使用重组藻红蛋白(PE)标记的BCMA细胞外结构域-FC融合蛋白(Creative BioMart公司(Creative BioMart,Inc))对CAR T细胞进行染色。除了CAR3无表达之外，在不同水平的所有转导条件下，通过阳性Fc-BCMA结合检测到表面CAR表达。这些试剂鉴定特异性表达抗BCMA CAR的T细胞。如图2B所示，与比较物抗BMCA CAR T细胞相比，用CAR1、CAR4或CAR5转导的T细胞具有类似或更高的CAR表达水平。
另外地，评估CAR T细胞单独或与肿瘤细胞系共培养时干扰素γ产生的生物活性。具体地，评估CAR T细胞单独或与不表达BCMA的RD细胞系或HT1080细胞共培养时产生的抗原非依赖性IFNγ。如图3A和3B所示，除了CAR4之外，所有CAR都不依赖于抗原产生最小IFNγ。在图3D和3E的CAR 7-10中可以看到类似的结果。此外，测量CAR T细胞在与伯基特淋巴瘤细胞(Daudi细胞)或表达BCMA的HT.1080.BCMA细胞共培养之后的干扰素γ产量。如图3C和3F所示，与比较物抗BCMA CAR相比，CAR1、CAR4、CAR5、CAR9和CAR10产生类似或更多的IFNγ。类似地，当CAR1或CAR5单独或与抗原阴性(HT1080)或抗原阳性(HT1080.BCMA)肿瘤细胞系共培养时，CAR1和CAR5表现出最小抗原非依赖性IFNγ(如图3G和3H所示)，同时也以抗原依赖性方式产生类似或更多量的IFNγ，如图3I所示。
另外地，当评估CAR1、CAR5、CAR9和CAR10在与抗原低(Jeko1)或抗原高(RPMI8336)肿瘤细胞系共培养时的IL2细胞因子产量时，与比较物CAR相比，CAR1和CAR5产生更多的IL2，如图3J和3K所示。
实例3
人抗BCMA CAR T细胞激活针对低和高抗原表达肿瘤细胞的评价
在另一项实验中，抗BCMA CAR T细胞是使用可直接扩展到大型临床制造工艺的系统产生的。简而言之，外周血单核细胞(PBMC)在含有IL-2(CellGenix股份有限公司)和对CD3和CD28具有特异性的抗体(美天旎生物技术有限公司)的培养基中培养。在培养开始之后一天，以特定的感染复数(MOI)添加编码抗BCMA CAR的慢病毒。通过添加含有IL-2的新鲜培养基将CAR T细胞维持在对数期，总共培养10天。通过流式细胞术分析结合的BCMA-Fc抗原来分析抗BCMA CAR T细胞的表面CAR表达并将标准化数量的CAR阳性CAR T细胞添加到单独培养物或具有不同抗原密度的肿瘤细胞的培养物中。与伯奇氏淋巴瘤(Burkett'sLymphoma)细胞系(Daudi)和经工程化的细胞系HT1080.BCMA相比，B细胞淋巴瘤细胞系RL和Toledo具有低BCMA抗原表达。
如图4A所示，CAR1和CAR5两者产生不依赖于抗原的最小IFNγ，并且少于比较物抗BCMA CAR T细胞。然而，与低BCMA密度细胞系共培养产生的IFNγ产量表明CAR1和CAR5的IFNγ产量高于比较物(图4B)。另外地，与高BCMA密度细胞系共培养产生的IFNγ产量表明CAR1和CAR5的IFNγ产量与比较物类似(图4C)。该数据表明，人CAR1和CAR5 T细胞1)潜在地比比较物CAR更有效地对抗低抗原密度细胞，2)与比较物CAR相比，至少对高抗原密度细胞有效，以及3)展现出低抗原非依赖性IFNγ释放。
实例4
人抗BCMA CAR T细胞细胞毒性针对表达抗原的肿瘤细胞的评价
为了评估抗BCMA CAR T细胞杀伤表达BCMA的癌细胞的能力，首先使用可直接扩展到大型临床制造工艺的系统产生抗BCMACAR T细胞，如以上实施例3中所描述的。在培养10天之后，用表达核红色荧光蛋白的HT.1080细胞系(HT1080-nucRed)或被工程化成以各种效应细胞与靶细胞比率(E:T)表达BCMA的衍生系(HT.1080-nucRed.BCMA)培养等量的表达抗BCMA的CAR T细胞。
如图5所示，在与CAR1、CAR5、CAR9和CAR10以及表达BCMA的HT.1080-nucRed.BCMA细胞系的共培养物中随时间观察到不同程度的抗原依赖性细胞毒性。
实例5
内源性和工程化细胞系上的BCMA抗原密度
在另一项实验中，在多种细胞系上评估BCMA受体密度，这些细胞系既内源性表达BCMA(例如，RL、Toledo、Daudi和RPMI-8226)，也有一些被工程化成表达BCMA(例如，HT.1080.BCMA)。使用抗BCMA抗体克隆19F2(百进生物公司(Biolegend))使用QuantumTMSimply
Figure BDA0004177911670000911
测定(Bangs实验室公司(Bangs Laboratories，Inc))评估BCMA密度。如图6所示，工程化细胞系HT.1080.BCMA和多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226表达最高量的BCMA，平均有20,000个受体。淋巴瘤系Daudi、Toledo和RL表达的BCMA抗原是HT.1080.BCMA或RPMI-8226的BCMA抗原的1/50-1/10。
实例6
人抗BCMA CAR T细胞抗原依赖性增殖的评价
为了评估抗BCMA CAR T细胞在存在表达BCMA的癌细胞的情况下增殖的能力，首先使用类似于实施例2中描述的系统的系统产生抗BCMA CAR T细胞。在培养10天之后，用表达核红色荧光蛋白的HT.1080细胞系(HT1080-nucRed)或被工程化成从每种条件下每种细胞类型的5E3处开始表达BCMA的衍生系(HT.1080-nucRed.BCMA)培养等量的表达抗BCMA的CART细胞。
如图7A所示，在CAR T细胞添加之后6天，观察到HT.1080-nucRed细胞系的增殖最小或没有。然而，在与表达BCMA的HT.1080-nucRed.BCMA细胞系共培养物中观察到增殖(图7B)。
通常，在以下权利要求书中，所使用的术语不应当被解释为将权利要求书限制于本说明书和权利要求书中所公开的特定实施例，而是应当被解释为包含所有可能的实施例连同此类权利要求有权获得的等效物的整个范围。因此，权利要求书并不受本申请的限制。
序列表
<110> 蓝鸟生物公司（bluebird bio, Inc.）
<120> BCMA嵌合抗原受体
<130> BLUE-131PC
<150> US 63/069,784
<151> 2020-08-25
<160> 111
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR1
<400> 1
Gly Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR2
<400> 2
Asp Ala Ser Gly Arg Ala Thr
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR3
<400> 3
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Thr
1 5
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR1
<400> 4
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Arg Tyr Tyr Trp Asp
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR2
<400> 5
Ser Leu Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR3
<400> 6
Gln Gly Ala Thr His Ala Leu Asp Leu
1 5
<210> 7
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 可变轻链序列
<400> 7
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Gly Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 可变重链序列
<400> 8
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Arg Tyr Tyr Trp Asp Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Leu Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Lys Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gln Gly Ala Thr His Ala Leu Asp Leu Trp Gly Pro Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR1
<400> 9
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR2
<400> 10
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR3
<400> 11
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR1
<400> 12
Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Asn Gly Phe Ser
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR2
<400> 13
Trp Ile Ser Gly Phe Asn Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR3
<400> 14
Gly Leu Leu Leu Ser Gly Glu Leu Trp Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 可变轻链序列
<400> 15
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Ile Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 可变重链序列
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Gly Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Gly Phe Asn Gly Lys Thr Tyr Tyr Thr Lys Thr Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Leu Leu Ser Gly Glu Leu Trp Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR1
<400> 17
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Gly
1 5 10
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR2
<400> 18
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR3
<400> 19
Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR1
<400> 20
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
1 5 10
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR2
<400> 21
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Asn
1 5 10
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR3
<400> 22
Glu Gly Glu Ala Thr Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 可变轻链序列
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Ala Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 可变重链序列
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Glu Ala Thr Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Pro Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR1
<400> 25
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR2
<400> 26
Val Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR3
<400> 27
Gln Gln Leu Tyr Ser Tyr Pro Arg Ala
1 5
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR1
<400> 28
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
1 5 10
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR2
<400> 29
Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Asn
1 5 10
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR3
<400> 30
Glu Gly Glu Ala Thr Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 可变轻链序列
<400> 31
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 32
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 可变重链序列
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Glu Ala Thr Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Pro Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR1
<400> 33
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Lys Thr Phe Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR2
<400> 34
Glu Gly Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR3
<400> 35
Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Asn Thr
1 5
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR1
<400> 36
Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Ile Gly
1 5 10
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR2
<400> 37
Trp Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Lys Thr Asn
1 5 10
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR3
<400> 38
Asp Asp Gly Ala Gly Thr Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 39
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 可变轻链序列
<400> 39
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Gly Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Phe Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Ile Gln Leu Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 40
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 可变重链序列
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Lys Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Gly Ala Gly Thr Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR1
<400> 41
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR2
<400> 42
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 轻链CDR3
<400> 43
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR1
<400> 44
Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Asn Gly Phe Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR2
<400> 45
Trp Ile Ser Gly Phe Asn Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 46
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 重链CDR3
<400> 46
Gly Leu Leu Leu Ser Gly Glu Leu Trp Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 可变轻链序列
<400> 47
Asp Ile Gln Leu Ala Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Ile Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 可变重链序列
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Gly Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Gly Phe Asn Gly Lys Thr Tyr Tyr Thr Lys Thr Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Leu Leu Ser Gly Glu Leu Trp Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 49
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR1构建体的多核苷酸
<400> 49
atggccctgc ctgtgaccgc ccttctcctg ccccttgctc tgctcctcca tgccgccagg 60
cctcaactgc agctgcagga gagtggcccc ggcttggtga agcctagtga aacactcagc 120
cttacgtgca ctgtttctgg gggcagtata tcctccagcc gctattactg ggattggatc 180
cggcagccgc ccgggaaggg acttgaatgg attggaagcc tctactactc cggaaatact 240
tactataaac catccctgaa gagtagagtt acaattagcg tagacaccag caagaatcaa 300
ttttctctta aactgacatc agtgactgcc gcagatactg ctgtgtacta ctgtgcacgg 360
cagggagcta ctcacgccct ggacctctgg ggacctggta ctatggtcac ggtctcttct 420
ggaggaggag ggtcaggcgg aggaggttcc gggggcggag ggtccgaaat tgttcttacg 480
cagtcacccg ccacactttc tctgtccccg ggggaacggg ctactctgtc ctgtggggct 540
tcccaatccg tgaccagctc ctaccttgcc tggtatcaac agaaacctgg tctcgcccca 600
cggctgctta tctacgatgc atctggcaga gctaccggta taccagacag gttttctggt 660
tccggtagcg gaaccgattt tagtctgact atctcacggc tggagcccga ggatttcgcg 720
gtgtattact gtcagcagta cgggagcagt ccatttacct ttggacctgg cacgaaggtg 780
gatataaaga ccacaacacc tgctccaagg ccccccacac ccgctccaac tatagccagc 840
caaccattga gcctcagacc tgaagcttgc aggcccgcag caggaggcgc cgtccatacg 900
cgaggcctgg acttcgcgtg tgatatttat atttgggccc ctttggccgg aacatgtggg 960
gtgttgcttc tctcccttgt gatcactctg tattgtaagc gcgggagaaa gaagctcctg 1020
tacatcttca agcagccttt tatgcgacct gtgcaaacca ctcaggaaga agatgggtgt 1080
tcatgccgct tccccgagga ggaagaagga gggtgtgaac tgagggtgaa attttctaga 1140
agcgccgatg ctcccgcata tcagcagggt cagaatcagc tctacaatga attgaatctc 1200
ggcaggcgag aagagtacga tgttctggac aagagacggg gcagggatcc cgagatgggg 1260
ggaaagcccc ggagaaaaaa tcctcaggag gggttgtaca atgagctgca gaaggacaag 1320
atggctgaag cctatagcga gatcggaatg aaaggcgaaa gacgcagagg caaggggcat 1380
gacggtctgt accagggtct ctctacagcc accaaggaca cttatgatgc gttgcatatg 1440
caagccttgc caccccgcta a 1461
<210> 50
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR1构建体的多肽
<400> 50
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Ser Arg Tyr Tyr Trp Asp Trp Ile Arg Gln Pro Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Leu Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr
65 70 75 80
Tyr Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr
85 90 95
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Ala Thr His Ala Leu Asp
115 120 125
Leu Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr
145 150 155 160
Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
165 170 175
Ser Cys Gly Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser
195 200 205
Gly Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Pro
245 250 255
Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 51
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR2构建体的多核苷酸
<400> 51
atggcgcttc ccgttaccgc tctcctcctg cccctggccc tgctgctgca cgcagcccgc 60
ccacaggtcc agctcgttca gtctggagcc gaagtaaaga agcccggggc atcagtaaag 120
gtctcttgta aggctagcgg gtacacattt agtaacaatg gcttctcttg ggtgaggcag 180
gctcccggac agggcctgga gtggatgggg tggatcagcg ggttcaacgg gaaaacatat 240
tacaccaaaa cactgcaggg acgggtcact atgacaatcg acacatccac cagcacagcc 300
tacatggacc ttagatcctt gagatcagat gataccgccg tgtactactg cgcaagagga 360
ctcctcttga gtggagaact ttggggattc gattattggg gacagggcac cctcgtgact 420
gtttcaagcg gtggaggcgg cagcggcggg ggcggatctg gaggaggagg aagtgacatt 480
cagctcacac agtcccctag cttcctctct gcatcagtgg gcgaccgcgt tactattacc 540
tgcagggcca gccaggatat ttctagcttc cttgcctggt atcaacagaa gccagggaaa 600
gcacctaaac ttctgatttt cgctgcatcc accctgcaat caggagtccc atctcgaata 660
agcggctccg gatcaggaac agagtttacg ctcacaataa gtagtctgca gcccgaggac 720
ttcgctacct attactgcca gcagttcaat agctatcccc gcaccttcgg gcagggtacg 780
aaggtcgaga ttaagaccac aacacctgct ccaaggcccc ccacacccgc tccaactata 840
gccagccaac cattgagcct cagacctgaa gcttgcaggc ccgcagcagg aggcgccgtc 900
catacgcgag gcctggactt cgcgtgtgat atttatattt gggccccttt ggccggaaca 960
tgtggggtgt tgcttctctc ccttgtgatc actctgtatt gtaagcgcgg gagaaagaag 1020
ctcctgtaca tcttcaagca gccttttatg cgacctgtgc aaaccactca ggaagaagat 1080
gggtgttcat gccgcttccc cgaggaggaa gaaggagggt gtgaactgag ggtgaaattt 1140
tctagaagcg ccgatgctcc cgcatatcag cagggtcaga atcagctcta caatgaattg 1200
aatctcggca ggcgagaaga gtacgatgtt ctggacaaga gacggggcag ggatcccgag 1260
atggggggaa agccccggag aaaaaatcct caggaggggt tgtacaatga gctgcagaag 1320
gacaagatgg ctgaagccta tagcgagatc ggaatgaaag gcgaaagacg cagaggcaag 1380
gggcatgacg gtctgtacca gggtctctct acagccacca aggacactta tgatgcgttg 1440
catatgcaag ccttgccacc ccgctaa 1467
<210> 52
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR2构建体的多肽
<400> 52
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Ser Asn Asn Gly Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Gly Phe Asn Gly Lys Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Thr Lys Thr Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Thr Ser
85 90 95
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Leu Ser Gly Glu Leu Trp
115 120 125
Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
145 150 155 160
Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
165 170 175
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Phe Leu Ala
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe Ala
195 200 205
Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Ile Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
225 230 235 240
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Arg Thr Phe
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
325 330 335
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
340 345 350
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
355 360 365
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
370 375 380
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
385 390 395 400
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
405 410 415
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
420 425 430
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
435 440 445
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
450 455 460
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
465 470 475 480
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 53
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR3构建体的多核苷酸
<400> 53
atggccctgc ccgttacagc cttgcttctg cccctcgcgc tgcttttgca cgctgcgagg 60
ccagacatcc agttgacaca atcaccatcc tttcttagtg cctctgtggg agatagagtc 120
accatcacgt gccgagcatc tcaggatatc agtagcttct tggcatggta tcagcagaaa 180
cctggcaagg cccctaaact gctcatcttc gctgcgtcca ctctgcagtc cggagtccca 240
agcagaatca gtggttccgg atcaggaact gagtttaccc tcacaattag cagtttgcag 300
cccgaagatt tcgccaccta ttactgtcag cagtttaact cataccctag gactttcgga 360
caggggacca aggtcgagat caagggcggt gggggctccg gcggaggcgg atcaggtggt 420
ggaggttctc aggtacagct tgtccagtca ggcgccgagg tgaaaaaacc tggggcctca 480
gtgaaggtct cctgcaaagc aagcggttat acgttctcca acaacgggtt ctcatgggta 540
aggcaagctc ctggacaggg gctcgaatgg atggggtgga tcagcggctt caatggcaag 600
acctattaca ccaagaccct tcaaggcaga gtaacgatga ctatcgatac tagtacaagc 660
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cgcggcctgc tgttgagcgg cgagctgtgg ggattcgatt actgggggca aggcaccctg 780
gtcactgtgt cctctaccac aacacctgct ccaaggcccc ccacacccgc tccaactata 840
gccagccaac cattgagcct cagacctgaa gcttgcaggc ccgcagcagg aggcgccgtc 900
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ctcctgtaca tcttcaagca gccttttatg cgacctgtgc aaaccactca ggaagaagat 1080
gggtgttcat gccgcttccc cgaggaggaa gaaggagggt gtgaactgag ggtgaaattt 1140
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<210> 54
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR3构建体的多肽
<400> 54
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe
100 105 110
Asn Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser
145 150 155 160
Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Asn Gly
165 170 175
Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
180 185 190
Trp Ile Ser Gly Phe Asn Gly Lys Thr Tyr Tyr Thr Lys Thr Leu Gln
195 200 205
Gly Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
210 215 220
Asp Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Arg Gly Leu Leu Leu Ser Gly Glu Leu Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
245 250 255
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
325 330 335
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
340 345 350
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
355 360 365
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
370 375 380
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
385 390 395 400
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
405 410 415
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
420 425 430
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
435 440 445
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
450 455 460
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
465 470 475 480
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 55
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR4构建体的多核苷酸
<400> 55
atggcgctgc cagtcacagc attgctgctg cctctggcac tcctgttgca tgcagcccgc 60
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cccgaggact tcgctaccta ttattgcctc caagattata tatatccttg gaccttcgca 780
caaggcacta aagttgagat caaaaccaca acacctgctc caaggccccc cacacccgct 840
ccaactatag ccagccaacc attgagcctc agacctgaag cttgcaggcc cgcagcagga 900
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gatgcgttgc atatgcaagc cttgccaccc cgctaa 1476
<210> 56
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR4构建体的多肽
<400> 56
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val
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Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
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Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Asn
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Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
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Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Glu Ala Thr Tyr Tyr Asp Ile
115 120 125
Leu Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
165 170 175
Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn
180 185 190
Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu
195 200 205
Ile Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Pro
245 250 255
Trp Thr Phe Ala Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
290 295 300
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
305 310 315 320
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
325 330 335
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340 345 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
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Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
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435 440 445
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485 490
<210> 57
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR5构建体的多核苷酸
<400> 57
atggcactcc ccgtgactgc cctgcttctt ccactggcac tgctgctcca tgcagccagg 60
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accatcacat gtcgggccag ccaagacatc cggaactatc ttggatggta tcagcaaaaa 180
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ccagaggact tcgcgactta ctattgtctg caggattaca tctacccgtg gaccttcgcc 360
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<210> 58
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR5构建体的多肽
<400> 58
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
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Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp
100 105 110
Tyr Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Ala Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
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Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
165 170 175
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275 280 285
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355 360 365
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<210> 59
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR6构建体的多核苷酸
<400> 59
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tctcggttca gcgggtctgg tagtggaact gagtttacac tgaccataag cagtctgcaa 720
cccgatgatt tcgccactta ttactgccaa cagctttact cttatccgcg cgcatttggc 780
caggggacta aagtagagat taaaaccaca acacctgctc caaggccccc cacacccgct 840
ccaactatag ccagccaacc attgagcctc agacctgaag cttgcaggcc cgcagcagga 900
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<212> PRT
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<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR6构建体的多肽
<400> 60
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
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115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
465 470 475 480
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 61
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR7构建体的多核苷酸
<400> 61
atggccctgc ccgtaaccgc ccttctgctg cctctggctc tgcttctcca cgcagcaagg 60
cctcaggtcc agctggtgca atctggagcc gaggtcaaga aacctggcgc aagcgtgaag 120
gtgtcttgta aagggagcgg ctatacgttt tccacgtacg gcattggctg ggttagacaa 180
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tacgcacaga aggtccaggg cagagtgacc ctcacaactg atactagcac caacaccgcg 300
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attgtgatga cccagacccc actgtcactg tctgtgaccc cgggtcagcc agcttctatt 540
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ggagttcctg acagattctc tggatctggc tcaggaactg atttcactct gaagatttca 720
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acattcgggc aggggacaaa gctcgagatt aaaaccacaa cacctgctcc aaggcccccc 840
acacccgctc caactatagc cagccaacca ttgagcctca gacctgaagc ttgcaggccc 900
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aagcgcggga gaaagaagct cctgtacatc ttcaagcagc cttttatgcg acctgtgcaa 1080
accactcagg aagaagatgg gtgttcatgc cgcttccccg aggaggaaga aggagggtgt 1140
gaactgaggg tgaaattttc tagaagcgcc gatgctcccg catatcagca gggtcagaat 1200
cagctctaca atgaattgaa tctcggcagg cgagaagagt acgatgttct ggacaagaga 1260
cggggcaggg atcccgagat ggggggaaag ccccggagaa aaaatcctca ggaggggttg 1320
tacaatgagc tgcagaagga caagatggct gaagcctata gcgagatcgg aatgaaaggc 1380
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gacacttatg atgcgttgca tatgcaagcc ttgccacccc gctaa 1485
<210> 62
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR7构建体的多肽
<400> 62
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Leu Ala Trp Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Lys Thr Asn
65 70 75 80
Tyr Ala Gln Lys Val Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser
85 90 95
Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly Ala Gly Thr Asp Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
145 150 155 160
Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln
165 170 175
Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asp
180 185 190
Gly Lys Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
195 200 205
Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Gly Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp
210 215 220
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
225 230 235 240
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Phe Tyr Cys Met Gln Ser Ile
245 250 255
Gln Leu Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr
260 265 270
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
275 280 285
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
290 295 300
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
305 310 315 320
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
325 330 335
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
340 345 350
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
355 360 365
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
370 375 380
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
385 390 395 400
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
405 410 415
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
420 425 430
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
435 440 445
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
450 455 460
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
465 470 475 480
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 63
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR8构建体的多核苷酸
<400> 63
atggctctcc ctgtcactgc tctgctcctt cctctggcgc ttctgctgca tgctgcccga 60
cccgatattg tgatgacgca gacccccctg tctctgtccg tcaccccagg gcagccggcg 120
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cagctctaca atgaattgaa tctcggcagg cgagaagagt acgatgttct ggacaagaga 1260
cggggcaggg atcccgagat ggggggaaag ccccggagaa aaaatcctca ggaggggttg 1320
tacaatgagc tgcagaagga caagatggct gaagcctata gcgagatcgg aatgaaaggc 1380
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gacacttatg atgcgttgca tatgcaagcc ttgccacccc gctaa 1485
<210> 64
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR8构建体的多肽
<400> 64
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Lys Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln
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Tyr Cys Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
145 150 155 160
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Phe Ser Thr Tyr Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Leu Ala Trp Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Lys Thr Asn Tyr
195 200 205
Ala Gln Lys Val Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr
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Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly Ala Gly Thr Asp Tyr Tyr Tyr
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275 280 285
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Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
325 330 335
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340 345 350
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
355 360 365
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385 390 395 400
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
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435 440 445
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<210> 65
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR9构建体的多核苷酸
<400> 65
atggctctgc ccgtgactgc cctgctgctg ccgttggcac tgcttttgca cgctgcacgg 60
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<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR9构建体的多肽
<400> 66
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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115 120 125
Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
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Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Arg Thr Phe
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
260 265 270
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
275 280 285
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<210> 67
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR10构建体的多核苷酸
<400> 67
atggcactcc cagtcaccgc cctgctgctc ccactggccc tcctgctgca tgcagcacgc 60
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<210> 68
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在实验室中制备 - 抗BCMA CAR10构建体的多肽
<400> 68
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
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65 70 75 80
Ser Arg Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
290 295 300
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
305 310 315 320
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
325 330 335
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
435 440 445
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450 455 460
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
465 470 475 480
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 69
<211> 184
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 69
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu
50 55 60
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile
65 70 75 80
Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys
115 120 125
Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe
130 135 140
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys
145 150 155 160
Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu
165 170 175
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
180
<210> 71
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头序列
<400> 71
Asp Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 72
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头序列
<400> 72
Thr Gly Glu Lys Pro
1 5
<210> 73
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头序列
<400> 73
Gly Gly Arg Arg
1
<210> 74
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头序列
<400> 74
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 75
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头序列
<400> 75
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp
1 5 10
<210> 76
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头序列
<400> 76
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头序列
<400> 77
Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头序列
<400> 78
Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro
1 5
<210> 79
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头序列
<400> 79
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10
<210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头序列
<400> 80
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 81
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的 - 接头序列
<400> 81
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TEV蛋白酶的切割序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Gly或Ser
<400> 82
Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa
1 5
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TEV蛋白酶的切割序列
<400> 83
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TEV蛋白酶的切割序列
<400> 84
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
1 5
<210> 85
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 85
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 86
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 86
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 87
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 87
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 88
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 88
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 89
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 89
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 90
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 90
Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 91
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 91
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 92
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 92
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 93
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 93
Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 94
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 94
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 95
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 95
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 96
Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 97
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 97
Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 98
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 98
Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 99
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 99
Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
1 5 10
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 100
Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly
1 5 10 15
Pro
<210> 101
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 101
Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 102
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 102
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
1 5 10 15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 103
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 103
Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro
1 5 10 15
Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys
20 25 30
Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr
35 40
<210> 104
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 104
Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 105
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 105
Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val
1 5 10 15
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
20 25 30
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
35 40
<210> 106
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包括2A位点的自切割多肽
<400> 106
Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu
1 5 10 15
Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly
20 25 30
Pro
<210> 107
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有Kozak序列
<400> 107
gccrccatgg 10
<210> 108
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于确定轻链CDR-L3基序的示例性规则
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 108
Phe Gly Xaa Gly
1
<210> 109
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于确定重链CDR-H1基序的示例性规则
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(4)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 109
Cys Xaa Xaa Xaa
1
<210> 110
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于确定重链CDR-H2基序的示例性规则
<400> 110
Leu Glu Trp Ile Gly
1 5
<210> 111
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于确定重链CDR-H3基序的示例性规则
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 111
Trp Gly Xaa Gly
1

Claims (168)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包括：
a)细胞外结构域，所述细胞外结构域包括抗BCMA(B细胞成熟抗原)抗体或其抗原结合片段，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段与人BCMA多肽的一个或多个表位结合，所述人BCMA多肽包括：如SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中所示的可变轻链氨基酸序列内的可变轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3区；以及如SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48中所示的可变重链氨基酸序列内的可变重链CDRH1、CDRH2和CDRH3区；
b)跨膜结构域；
c)一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域；以及
d)初级信号传导结构域。
2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述可变轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:7中示出，和/或所述可变重链氨基酸序列在SEQ ID NO:8中示出。
3.根据权利要求1所述的CAR，其中所述可变轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:15中示出，和/或所述可变重链氨基酸序列在SEQ ID NO:16中示出。
4.根据权利要求1所述的CAR，其中所述可变轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:23中示出，和/或所述可变重链氨基酸序列在SEQ ID NO:24中示出。
5.根据权利要求1所述的CAR，其中所述可变轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:31中示出，和/或所述可变重链氨基酸序列在SEQ ID NO：32中示出。
6.根据权利要求1所述的CAR，其中所述可变轻链氨基酸序列在SEQ ID NO：39中示出，和/或所述可变重链氨基酸序列在SEQ ID NO:40中示出。
7.根据权利要求1所述的CAR，其中所述可变轻链氨基酸序列在SEQ ID NO:47中示出，和/或所述可变重链氨基酸序列在SEQ ID NO:48中示出。
8.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包括：
a)细胞外结构域，所述细胞外结构域包括抗BCMA(B细胞成熟抗原)抗体或其抗原结合片段，所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段与人BCMA多肽的一个或多个表位结合，所述人BCMA多肽包括：SEQ ID NO:1-3、9-11、17-19、25-27、33-35或41-43中所示的可变轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及SEQ ID NO:4-6、12-14、20-22、28-30、36-38或44-46中所示的可变重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列；
b)跨膜结构域；
c)一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域；以及
d)初级信号传导结构域。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或抗原结合片段选自由以下组成的组：骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2片段、F(ab)′3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或抗原结合片段是scFv。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:1-3中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:4-6中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:9-11中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:12-14中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:17-19中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:20-22中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:25-27中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:28-30中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
15.根据权利要求1至10中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:33-35中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:36-38中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
16.根据权利要求1至10中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:41-43中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:44-46中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中的任一个所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48中的任一个所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:7中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:8中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:15中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:16中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
20.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:23中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO：24中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
21.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:31中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO：32中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
22.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:39中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:40中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
23.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:31中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:48中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的47an氨基酸序列。
24.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中的任一个所示的可变轻链序列和/或如SEQ IDNO:8、16、24、32、40或48中的任一个所示的可变重链序列。
25.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:7中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:8中所示的可变重链序列。
26.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:15中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:16中所示的可变重链序列。
27.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:23中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:24中所示的可变重链序列。
28.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:31中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:32中所示的可变重链序列。
29.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:39中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:40中所示的可变重链序列。
30.根据权利要求1至16中任一项所述的CAR，其中所述抗BCMA抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:47中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:48中所示的可变重链序列。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv并且所述可变轻链位于所述可变重链的c末端。
32.根据权利要求1至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv并且所述可变重链位于所述可变轻链的c末端。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域从多肽中分离，所述多肽选自由以下组成的组：T细胞受体的α链或β链、CDδ、CD3ε、CDγ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD152、CD154和PD1。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域从多肽中分离，所述多肽选自由以下组成的组：CD8α；CD4、CD45、PD1和CD152。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域从CD8α中分离。
36.根据权利要求1至34中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域从PD1中分离。
37.根据权利要求1至34中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域从CD152中分离。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的CAR，其中所述一个或多个共刺激信号传导结构域从共刺激分子中分离，所述共刺激分子选自由以下组成的组：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM和ZAP70。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的CAR，其中所述一个或多个共刺激信号传导结构域从共刺激分子中分离，所述共刺激分子选自由以下组成的组：CD28、CD134和CD137。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的CAR，其中所述一个或多个共刺激信号传导结构域从CD28中分离。
41.根据权利要求1至39中任一项所述的CAR，其中所述一个或多个共刺激信号传导结构域从CD134中分离。
42.根据权利要求1至39中任一项所述的CAR，其中所述一个或多个共刺激信号传导结构域从CD137中分离。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的CAR，其中所述初级信号传导结构域从多肽中分离，所述多肽选自由以下组成的组：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的CAR，其中所述初级信号传导结构域从CD3ζ中分离。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的CAR，其进一步包括铰链区多肽。
46.根据权利要求45所述的CAR，其中所述铰链区多肽包括CD8α的铰链区。
47.根据权利要求45所述的CAR，其中所述铰链区多肽包括PD1的铰链区。
48.根据权利要求45所述的CAR，其中所述铰链区多肽包括CD152的铰链区。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的CAR，其进一步包括信号肽。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的CAR，其进一步包括间隔子区。
51.根据权利要求50所述的CAR，其中间隔子区多肽包括IgG1、IgG2、IgG4或IgD的CH2区和CH3区。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的CAR，其包括如SEQ ID NO:50、52、54、56、58、60、62、64、66和68中的任一个所示的氨基酸序列。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的CAR，其包括如SEQ ID NO:50中所示的氨基酸序列。
54.根据权利要求1至52中任一项所述的CAR，其包括如SEQ ID NO:52中所示的氨基酸序列。
55.根据权利要求1至52中任一项所述的CAR，其包括如SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列。
56.根据权利要求1至52中任一项所述的CAR，其包括如SEQ ID NO:56中所示的氨基酸序列。
57.根据权利要求1至52中任一项所述的CAR，其包括如SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列。
58.根据权利要求1至52中任一项所述的CAR，其包括如SEQ ID NO:60中所示的氨基酸序列。
59.根据权利要求1至52中任一项所述的CAR，其包括如SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列。
60.根据权利要求1至52中任一项所述的CAR，其包括如SEQ ID NO:64中所示的氨基酸序列。
61.根据权利要求1至52中任一项所述的CAR，其包括如SEQ ID NO:66中所示的氨基酸序列。
62.根据权利要求1至52中任一项所述的CAR，其包括如SEQ ID NO:68中所示的氨基酸序列。
63.一种多肽，其包括根据权利要求1至62中任一项所述的CAR的氨基酸序列。
64.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至63中任一项所述的CAR或多肽。
65.根据权利要求64所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括与如SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、65和67中的任一个所示的多核苷酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。
66.根据权利要求64所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括如SEQ ID NO:49、51、53、55、57、59、61、63、65和67中的任一个所示的多核苷酸序列。
67.一种载体，其包括根据权利要求64至66中任一项所述的多核苷酸。
68.根据权利要求67所述的载体，其中所述载体是表达载体。
69.根据权利要求67或权利要求68所述的载体，其中所述载体是游离型载体。
70.根据权利要求67至69中任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
71.根据权利要求67至70中任一项所述的载体，其中所述载体是逆转录病毒载体。
72.根据权利要求67至71中任一项所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
73.根据权利要求72所述的载体，其中所述慢病毒载体选自基本上由以下组成的组：人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)；人类免疫缺陷病毒2(HIV-2)；维斯纳-梅迪病毒(visna-maedivirus，VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
74.根据权利要求70至73中任一项所述的载体，其包括：左(5')逆转录病毒LTR、Psi(Ψ)包装信号、中心多嘌呤段/DNA瓣(cPPT/FLAP)、逆转录病毒输出元件；与根据权利要求45所述的多核苷酸可操作地连接的启动子；以及右(3')逆转录病毒LTR。
75.根据权利要求70至74中任一项所述的载体，其进一步包括异源聚腺苷酸化序列。
76.根据权利要求70至75中任一项所述的载体，其进一步包括乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)或土拨鼠转录后调节元件(WPRE)。
77.根据权利要求70至76中任一项所述的载体，其中所述5′LTR的启动子用异源启动子替换。
78.根据权利要求77所述的载体，其中所述异源启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。
79.根据权利要求74至78中任一项所述的载体，其中所述5'LTR或所述3'LTR是慢病毒LTR。
80.根据权利要求74至79中任一项所述的载体，其中所述3'LTR包括一个或多个修饰。
81.根据权利要求74至80中任一项所述的载体，其中所述3'LTR包括一个或多个缺失。
82.根据权利要求74至81中任一项所述的载体，其中所述3′LTR是自失活(SIN)LTR。
83.根据权利要求75至82中任一项所述的载体，其中所述聚腺苷酸化序列是牛生长激素聚腺苷酸化或信号兔β-珠蛋白聚腺苷酸化序列。
84.根据权利要求67至83中任一项所述的载体，其中根据权利要求6466中任一项所述的多核苷酸包括优化的Kozak序列。
85.根据权利要求74至84中任一项所述的载体，其中所述与根据权利要求64所述的多核苷酸可操作地连接的启动子选自由以下组成的组：巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)、延长因子1α启动子(EF1-α)、磷酸甘油酸激酶-1启动子(PGK)、泛素-C启动子(UBQ-C)、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)、多瘤增强子/单纯疱疹胸苷激酶启动子(MC1)、β肌动蛋白启动子(β-ACT)、猿猴病毒40启动子(SV40)和骨髓增殖性肉瘤病毒增强子、阴性对照区缺失的、dl587rev引物结合位点取代的(MND)U3启动子。
86.一种细胞，其表达根据权利要求1至63中任一项所述的CAR或多肽。
87.一种细胞，其包括根据权利要求64至66中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求67至85中任一项所述的载体。
88.根据权利要求86或权利要求87所述的细胞，其中所述细胞是经基因工程化的宿主细胞。
89.根据权利要求86至88中任一项所述的细胞，其中所述细胞是造血细胞。
90.根据权利要求86至89中任一项所述的细胞，其中所述细胞是造血干细胞或祖细胞。
91.根据权利要求86至90中任一项所述的细胞，其中所述细胞是CD34+造血干细胞或祖细胞。
92.根据权利要求86至89中任一项所述的细胞，其中所述细胞是免疫效应细胞。
93.根据权利要求86至89和92中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞。
94.根据权利要求86至89、92和93中任一项所述的细胞，其中所述细胞是CD3+、CD4+和/或CD8+细胞。
95.根据权利要求86至89和92至94中任一项所述的细胞，其中所述细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或辅助T细胞。
96.根据权利要求93至95中任一项所述的T细胞，其中所述T细胞是αβ-T细胞。
97.根据权利要求93至95中任一项所述的T细胞，其中所述T细胞是γδ-T细胞。
98.根据权利要求86至89和92中任一项所述的细胞，其中所述细胞是自然杀伤(NK)细胞。
99.根据权利要求98所述的细胞，其中所述自然杀伤细胞是自然杀伤T(NKT)细胞。
100.根据权利要求86至89和92中任一项所述的细胞，其中所述细胞是巨噬细胞。
101.根据权利要求92至100中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述免疫效应细胞用根据权利要求67至85中任一项所述的载体转导，并且在存在PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激，由此与在不存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的经转导的免疫效应细胞的增殖相比，维持所述经转导的免疫效应细胞的增殖。
102.根据权利要求101所述的免疫效应细胞，其中与在不存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的免疫效应细胞相比，在存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的所述免疫效应细胞增加了以下的表达：i)一种或多种标志物，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：CD62L、CD127、CD197和CD38；或ii)所有标志物CD62L、CD127、CD197和CD38。
103.根据权利要求101所述的免疫效应细胞，其中与在不存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的免疫效应细胞相比，在存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的所述免疫效应细胞增加了以下的表达：i)一种或多种标志物，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：CD62L、CD127、CD27和CD8；或ii)所有标志物CD62L、CD127、CD27和CD8。
104.根据权利要求101至103中任一项所述的免疫效应细胞，其中所述PI3K抑制剂是ZSTK474。
105.根据权利要求86至104中任一项所述的细胞或其后代，其中所述细胞或所述后代在与表达BCMA的细胞共培养时展现出高IFNγ释放。
106.根据权利要求86至105中任一项所述的细胞或其后代，其中与相同细胞相比，所述细胞或所述后代在与表达BCMA的细胞共培养时展现出类似或更高的IFNγ释放，除了所述CAR包括包含鼠类源性抗BCMAscFv的细胞外结构域之外。
107.根据权利要求105或权利要求106所述的细胞或其后代，其中共培养的表达BCMA的细胞是Daudi细胞、HT1080.BCMA细胞和/或RPMI-8226细胞。
108.根据权利要求86至107中任一项所述的细胞，其中所述细胞或所述其后代在与表达低BCMA的细胞共培养时展现出高IFNγ释放。
109.根据权利要求108所述的细胞，其中所述表达低BCMA的细胞的表面BCMA表达是Daudi细胞、HT1080.BCMA细胞和/或RPMI-8226细胞的表面BCMA表达的至多1/5。
110.根据权利要求108或权利要求109所述的细胞，其中所述表达低BCMA的细胞的表面BCMA表达是HT1080.BCMA细胞的表面BCMA表达的至多1/10。
111.根据权利要求108至110中任一项所述的细胞，其中所述表达低BCMA的细胞的表面BCMA表达是RPMI-8226细胞的表面BCMA表达的至多1/10。
112.根据权利要求108至111中任一项所述的细胞，其中所述表达低BCMA的细胞是RL细胞和/或Toledo细胞。
113.根据权利要求108至112中任一项所述的细胞，其中与相同CAR T细胞相比，所述CAR T细胞在与低抗原密度细胞共培养时展现出更高的IFNγ释放，除了所述CAR包括包含鼠类源性抗BCMA scFv的细胞外结构域之外。
114.根据权利要求86至113中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现出低抗原非依赖性信号传导。
115.根据权利要求86至114中任一项所述的细胞，其中与相同CAR T细胞相比，所述细胞展现出低抗原非依赖性信号传导，除了所述CAR包括包含鼠类源性抗BCMAscFv的细胞外结构域之外。
116.一种组合物，其包括根据权利要求86至115中任一项所述的细胞以及生理学上可接受的赋形剂。
117.一种产生包括根据权利要求1至63中任一项所述的CAR或多肽的免疫效应细胞的方法，所述方法包括将根据权利要求67至85中任一项所述的载体引入到免疫效应细胞中。
118.根据权利要求117所述的方法，其进一步包括通过使所述免疫效应细胞与和CD3结合的抗体以及和CD28结合的抗体接触来刺激所述细胞并诱导所述细胞增殖；由此产生免疫效应细胞群体。
119.根据权利要求118所述的方法，其中在引入所述载体之前刺激所述免疫效应细胞并诱导所述免疫效应细胞增殖。
120.根据权利要求118或权利要求119所述的方法，其中所述免疫效应细胞包括T淋巴细胞。
121.根据权利要求118或权利要求119所述的方法，其中所述免疫效应细胞包括NK细胞。
122.根据权利要求117至121中任一项所述的方法，其中与在不存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的免疫效应细胞相比，在存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的所述免疫效应细胞增加了以下的表达：i)一种或多种标志物，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：CD62L、CD127、CD197和CD38；或ii)所有标志物CD62L、CD127、CD197和CD38。
123.根据权利要求117至121中任一项所述的方法，其中与在不存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的免疫效应细胞相比，在存在所述PI3K通路抑制剂的情况下被激活和刺激的所述免疫效应细胞增加了以下的表达：i)一种或多种标志物，所述一种或多种标志物选自由以下组成的组：CD62L、CD127、CD27和CD8；或ii)所有标志物CD62L、CD127、CD27和CD8。
124.根据权利要求122或权利要求123所述的方法，其中所述PI3K抑制剂是ZSTK474。
125.一种治疗有需要的受试者的B细胞相关病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求116所述的组合物。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述B细胞相关病状是癌症。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述癌症是实体癌。
128.根据权利要求126所述的方法，其中所述癌症是液体癌。
129.根据权利要求126所述的方法，其中所述癌症是恶性血液肿瘤。
130.根据权利要求125所述的方法，其中所述B细胞相关病状是多发性骨髓瘤(non-Hodgkins'lymphoma，MM)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、恶性可能性不确定的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病、移植后淋巴增殖性障碍、免疫调节障碍、类风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合征、恰加斯氏病(Chagas'disease)、格雷夫氏病(Grave'sdisease)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、结节性多动脉炎、舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)、寻常性天疱疮、硬皮病、多发性硬化症、抗磷脂综合征、ANCA相关血管炎、古德帕斯丘氏病(Goodpasture's disease)、川崎氏病(Kawasaki disease)、自身免疫性溶血性贫血和急进性肾小球肾炎、重链疾病、原发性或免疫细胞相关淀粉样变性或显著性未确定的单克隆性丙种球蛋白病。
131.根据权利要求125至130中任一项所述的方法，其中所述B细胞相关病状是B细胞恶性肿瘤。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是多发性骨髓瘤(MM)或非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述MM选自由以下组成的组：明显多发性骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌性骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤。
134.根据权利要求132所述的方法，其中所述NHL选自由以下组成的组：伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
135.根据权利要求125所述的方法，其中所述B细胞相关病状是浆细胞恶性肿瘤。
136.根据权利要求125所述的方法，其中所述B细胞相关病状是自身免疫性疾病。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是全身性红斑狼疮。
138.根据权利要求125所述的方法，其中所述B细胞相关病状是类风湿性关节炎。
139.根据权利要求125所述的方法，其中所述B细胞相关病状是特发性血小板减少性紫癜、或重症肌无力或自身免疫性溶血性贫血。
140.一种用于改善与受试者的表达BCMA的癌症相关的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的足以改善与表达BCMA的癌细胞相关的至少一种症状的根据权利要求116所述的组合物。
141.根据权利要求140所述的方法，其中改善的所述一种或多种症状选自由以下组成的组：虚弱、疲劳、呼吸短促、容易挫伤和出血、频繁感染、淋巴结肿大、腹部肿胀或疼痛、骨骼或关节疼痛、骨折、计划外的体重减轻、食欲不振、盗汗、持续轻度发烧和排尿减少。
142.一种用于减少受试者的表达BCMA的细胞的数量的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的足以与所述施用之前表达BCMA的细胞的数量相比减少表达BCMA的所述细胞的数量的根据权利要求116所述的组合物。
143.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人BCMA多肽的一个或多个表位结合，所述人BCMA多肽包括：如SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中所示的可变轻链氨基酸序列内的可变轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3区；以及如SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48中所示的可变重链氨基酸序列内的可变重链CDRH1、CDRH2和CDRH3区。
144.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与人BCMA多肽的一个或多个表位结合，所述人BCMA多肽包括：SEQ ID NO:1-3、9-11、17-19、25-27、33-35或41-43中的任一个所示的可变轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列；以及SEQ ID NO:4-6、12-14、20-22、28-30、36-38或44-46中所示的可变重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。
145.根据权利要求143或权利要求144所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段选自由以下组成的组：骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)。
146.根据权利要求145所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是scFv。
147.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:1-3中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQID NO:4-6中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
148.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:9-11中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQID NO:12-14中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
149.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:17-19中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:20-22中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
150.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:25-27中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:28-30中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
151.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:33-35中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:36-38中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
152.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:41-43中的任一个所示的一个或多个轻链CDR和/或如SEQ ID NO:44-46中的任一个所示的一个或多个重链CDR。
153.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中的任一个所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48中的任一个所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
154.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:7中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:8中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
155.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:15中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:16中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
156.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:23中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:24中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
157.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:31中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:32中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
158.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:39中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:40中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
159.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括可变轻链和/或可变重链，所述可变轻链包括与如SEQ ID NO:47中所示的可变轻链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，所述可变重链包括与如SEQ ID NO:48中所示的可变重链氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
160.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:7、15、23、31、39或47中的任一个所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:8、16、24、32、40或48中的任一个所示的可变重链序列。
161.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:7中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:8中所示的可变重链序列。
162.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:15中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:16中所示的可变重链序列。
163.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:23中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:24中所示的可变重链序列。
164.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:31中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:32中所示的可变重链序列。
165.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:39中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:40中所示的可变重链序列。
166.根据权利要求143至146中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:47中所示的可变轻链序列和/或如SEQ ID NO:48中所示的可变重链序列。
167.根据权利要求153至166中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv并且所述可变轻链位于所述可变重链的c末端。
168.根据权利要求153至166中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是scFv并且所述可变重链位于所述可变轻链的c末端。
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