JP2023539591A - Bcmaキメラ抗原受容体 - Google Patents
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Abstract
本開示は、B細胞関連状態のための養子T細胞療法のための改善された組成物を提供する。本開示は一般に、T細胞療法を生成するための改善されたベクター、抗体、抗体断片およびキメラ抗原受容体(CAR)ならびにそれを使用する方法を提供する。特に、本開示は、改善された抗BCMA抗体、抗体断片およびキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。より詳細には、本開示は、改善されたヒト抗BCMA抗体、抗体断片、またはCARを提供する。【選択図】図1
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年8月25日に出願された米国仮出願第63/069,784号の35 U.S.C.§ 119(e)の下、利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年8月25日に出願された米国仮出願第63/069,784号の35 U.S.C.§ 119(e)の下、利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、BLUE-131PC_ST25.txtである。テキストファイルは、96.4KBで、2021年8月22日に作成され、仕様の提出と同時にEFS-Webを介して電子的に提出されている。
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、BLUE-131PC_ST25.txtである。テキストファイルは、96.4KBで、2021年8月22日に作成され、仕様の提出と同時にEFS-Webを介して電子的に提出されている。
本発明は、一般に、B細胞関連状態を治療するための改善された組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、ヒト抗B細胞成熟抗原(抗BCMA)抗体またはその抗原結合断片を含む改善されたキメラ抗原受容体(CAR)、これらのCARを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞、およびB細胞関連状態を効果的に治療するためのこれらの組成物の使用に関する。
関連分野に関する記載
いくつかの重要な疾患は、Bリンパ球、すなわちB細胞を含む。B細胞の悪性形質転換は、リンパ腫を含むがこれらに限定されない癌、例えば、多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫をもたらす。異常なB細胞の生理機能は、全身性エリテマトーデス(SLE)を含むがこれらに限定されない自己免疫疾患の発症にもつながり得る。
いくつかの重要な疾患は、Bリンパ球、すなわちB細胞を含む。B細胞の悪性形質転換は、リンパ腫を含むがこれらに限定されない癌、例えば、多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫をもたらす。異常なB細胞の生理機能は、全身性エリテマトーデス(SLE)を含むがこれらに限定されない自己免疫疾患の発症にもつながり得る。
非ホジキンリンパ腫(NHL)および多発性骨髄腫(MM)を含む、B細胞悪性腫瘍を有する患者の大部分は、癌死亡率に大きく寄与している。様々な形態の治療に対するB細胞悪性腫瘍の応答が混合される。化学療法、放射線療法および抗体治療など、B細胞悪性腫瘍を治療する従来の方法は、限られた成功しかもたらさなかった。
最近では、BCMAを標的とする治療用抗体またはキメラ抗原受容体(CAR)を使用することによって、B細胞悪性腫瘍を治療する試みは、有望ではあるが限られた成功を収めている。実際、これらの治療法で治療した場合、すべての患者が治癒する、または完全な寛解を経験するわけではない。このような治療法を開発する際の一つの困難は、治療用抗体またはCARに使用される所与の抗原結合ドメインの治療有効性が予測不可能であることである。例えば、抗原結合ドメインが強すぎると、CAR T細胞は大量のサイトカイン放出を誘発し、「サイトカインストーム」と見なされる致命的な免疫反応を引き起こす可能性があり、抗原結合ドメインの結合が弱すぎると、CAR T細胞は、癌細胞を除去するのに十分な治療効果を示さない。さらに、一部のCARは、T細胞機能障害(T細胞枯渇と呼ばれることもある)を引き起こす抗原非依存性シグナル伝達の法外なレベルを示し、有効性を制限する。
したがって、抗原非依存性シグナル伝達およびT細胞機能障害を制限しながら改善された有効性を有する抗BCMA CARを特定する必要性が依然として存在する。
本開示は一般に、T細胞療法を生成するための改善されたベクター、抗体、抗体断片およびキメラ抗原受容体(CAR)ならびにそれを使用する方法を提供する。特に、本開示は、改善された抗BCMA抗体、抗体断片およびキメラ抗原受容体(CAR)を提供する。より詳細には、本開示は、改善されたヒト抗BCMA抗体、抗体断片、またはCARを提供する。
本開示の一態様において、キメラ抗原受容体(CAR)が提供され、a)配列番号7、15、23、31、39もしくは47に記載される可変軽鎖アミノ酸配列内の可変軽鎖CDRL1、CDRL2およびCDRL3領域、ならびに配列番号8、16、24、32、40もしくは48に記載される可変重鎖アミノ酸配列内の可変重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3領域を含む、ヒトBCMAポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗BCMA(B細胞成熟抗原)抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞外ドメイン、b)膜貫通ドメイン、c)一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにd)一次シグナル伝達ドメイン、を含む。
別の態様において、キメラ抗原受容体(CAR)が提供され、a)ヒトBCMAポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗BCMA(B細胞成熟抗原)抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメインであって、配列番号1~3、9~11、17~19、25~27、33~35もしくは41~43に記載される可変軽鎖CDRL1、CDRL2およびCDRL3配列、ならびに配列番号4~6、12~14、20~22、28~30、36~38もしくは44~46に記載の可変重鎖CDRH1、CDRH2およびCDRH3配列を含み、b)膜貫通ドメイン、c)一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにd)一次シグナル伝達ドメイン、を含む。
様々な実施形態において、可変軽鎖アミノ酸配列は、配列番号7に記載され、および/または可変重鎖アミノ酸配列は、配列番号8に記載される。様々な実施形態において、可変軽鎖アミノ酸配列は、配列番号15に記載され、および/または可変重鎖アミノ酸配列は、配列番号16に記載される。様々な実施形態において、可変軽鎖アミノ酸配列は、配列番号23に記載され、および/または可変重鎖アミノ酸配列は、配列番号24に記載される。様々な実施形態において、可変軽鎖アミノ酸配列は、配列番号31に記載され、および/または可変重鎖アミノ酸配列は、配列番号32に記載される。様々な実施形態において、可変軽鎖アミノ酸配列は、配列番号39に記載され、および/または可変重鎖アミノ酸配列は、配列番号40に記載される。様々な実施形態において、可変軽鎖アミノ酸配列は、配列番号47に記載され、および/または可変重鎖アミノ酸配列は、配列番号48に記載される。
様々な実施形態では、抗BCMA抗体または抗原結合断片は、以下からなる群から選択される:キャメルIg、Ig NAR、Fab断片、Fab’断片、F(ab)’2断片、F(ab)’3断片、Fv、一本鎖Fv抗体(「scFv」)、bis-scFv、(scFv)2、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Fvタンパク質(「dsFv」)、およびシングルドメイン抗体(sdAb、ナノボディ)。いくつかの実施形態では、抗BCMA抗体または抗原結合断片はscFvである。
様々な実施形態において、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1~3のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号4~6のいずれかに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む。いくつかの実施形態では、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号9~11のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号12~14のいずれかに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む。特定の実施形態では、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号17~19のいずれか一つに記載の一つ以上の軽鎖CDR、および/または配列番号20~22のいずれか一つに記載の一つ以上の重鎖CDR配列を含む。特定の実施形態では、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号25~27のいずれか一つに記載の一つ以上の軽鎖CDR、および/または配列番号28~30のいずれか一つに記載の一つ以上の重鎖CDR配列を含む。特定の実施形態では、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号33~35のいずれか一つに記載の一つ以上の軽鎖CDR、および/または配列番号36~38のいずれか一つに記載の一つ以上の重鎖CDR配列を含む。特定の実施形態では、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号41~43のいずれか一つに記載の一つ以上の軽鎖CDR、および/または配列番号44~46のいずれか一つに記載の一つ以上の重鎖CDR配列を含む。
様々な実施形態において、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号7、15、23、31、39もしくは47のいずれか一つに記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号8、16、24、32、40もしくは48のいずれかに記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号7に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号8に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号15に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号16に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号23に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号24に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号31に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号32に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号39に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号40に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号31に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号48に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。
様々な実施形態において、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号7、15、23、31、39もしくは47のいずれか一つに記載される可変軽鎖配列および/または配列番号8、16、24、32、40もしくは48のいずれか一つに記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号7に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号8に記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号15に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号16に記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号23に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号24に記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号31に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号32に記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号39に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号40に記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片は、配列番号47に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号48に記載される可変重鎖配列を含む。
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、scFvであり、可変軽鎖は可変重鎖のそれに対してc末端に位置する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、scFvであり、可変重鎖は可変軽鎖のそれに対してc末端に位置する。
様々な実施形態において、CAR膜貫通ドメインは、T細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、CDδ、CD3ε、CDγ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、およびPD1からなる群から選択されるポリペプチドから単離される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、以下からなる群から選択されるポリペプチドから単離される:CD8α;CD4、CD45、PD1およびCD152。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインはCD8αから単離される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、PD1から単離される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、CD152から単離される。
様々な実施形態において、一つ以上のCAR共刺激シグナル伝達ドメインは、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、およびZAP70からなる群から選択される共刺激分子から単離される。いくつかの実施形態において、一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28、CD134、およびCD137からなる群から選択される共刺激分子から単離される。いくつかの実施形態において、一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28から単離される。いくつかの実施形態において、一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、CD134から単離される。いくつかの実施形態において、一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、CD137から単離される。
様々な実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dからなる群から選択されるポリペプチドから単離される。いくつかの実施形態において、一次シグナル伝達ドメインはCD3ζから単離される。
様々な実施形態において、CARは、ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域ポリペプチドは、CD8αのヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域ポリペプチドは、PD1のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域ポリペプチドは、CD152のヒンジ領域を含む。
様々な実施形態において、CARは、スペーサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、スペーサー領域ポリペプチドは、IgG1、IgG2、IgG4、またはIgDのCH2およびCH3領域を含む。
様々な実施形態において、CARはシグナルペプチドをさらに含む。
様々な実施形態において、CARは、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、66、および68のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号50に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号52に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号54に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号56に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号58に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号60に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号62に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号64に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号66に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、CARは、配列番号68に記載されるアミノ酸配列を含む。
様々な実施形態において、CARは、本明細書において企図されるCARのいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
本開示の別の態様において、本明細書で企図されるCARまたはポリペプチドのいずれか一つをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、65、および67のいずれか一つに記載されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、65および67のいずれか一つに記載されるポリヌクレオチド配列を含む。
本開示の別の態様において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドのいずれか一つを含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、本質的に以下からなる群から選択される:ヒト免疫不全ウイルス1(HIV-1)、ヒト免疫不全ウイルス2(HIV-2)、ビスナマエディウイルス(VMV)ウイルス、カプリン関節炎-脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、およびシミアン免疫不全ウイルス(SIV)。
特定の実施形態において、ベクターはさらに、左(5’)レトロウイルスLTR、Psi(Ψ)パッケージングシグナル、中央ポリプリン管/DNAフラップ(cPPT/FLAP)、レトロウイルス輸出要素、請求項45に記載のポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーター、および右(3’)レトロウイルスLTRを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、異種ポリアデニル化配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、B型肝炎ウイルス転写後調節エレメント(HPRE)またはウッドチャック転写後調節エレメント(WPRE)をさらに含む。いくつかの実施形態において、5’LTRのプロモーターは、異種プロモーターで置換される。いくつかの実施形態において、異種プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、またはシミアンウイルス40(SV40)プロモーターである。いくつかの実施形態において、5’LTRまたは3’LTRは、レンチウイルスLTRである。いくつかの実施形態において、3’LTRは、一つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態において、3’LTRは、一つ以上の欠失を含む。いくつかの実施形態において、3’LTRは、自己不活性化(SIN)LTRである。いくつかの実施形態において、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化またはシグナルウサギβ-グロビンポリアデニル化配列である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、最適化されたKozak配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、以下からなる群から選択される:サイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーター(CMV)、伸長因子1アルファプロモーター(EF1-α)、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1プロモーター(PGK)、ユビキチン-Cプロモーター(UBQ-C)、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリベータ-アクチンプロモーター(CAG)、ポリオーマエンハンサー/単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(MC1)、ベータアクチンプロモーター(β-ACT)、シミアンウイルス40プロモーター(SV40)、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーであって、陰性対照領域が欠失し、DL587REVプライマー結合部位が置換された(MND)U3プロモーター。
本開示の別の態様において、本明細書に企図されるCARまたはポリペプチドのいずれか一つを発現する細胞が提供される。いくつかの実施形態において、細胞は、本明細書に企図されるポリヌクレオチドのいずれか一つ、または本明細書に企図されるベクターのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、遺伝子操作された宿主細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は造血細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、造血幹細胞または前駆細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、CD34+造血幹または前駆細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、T細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、CD3+、CD4+及び/又はCD8+細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、又はヘルパーT細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、αβ-T細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、γδ-T細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞である。いくつかの実施形態では、ナチュラルキラー細胞は、ナチュラルキラーT(NKT)細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、マクロファージである。
様々な実施形態において、免疫エフェクター細胞は、本明細書で企図されるベクターのいずれか一つで形質導入され、PI3K経路の阻害剤の存在下で活性化および刺激され、それによって、PI3K経路の阻害剤の非存在下で、活性化および刺激された形質導入免疫エフェクター細胞の増殖と比較して、形質導入された免疫エフェクター細胞の増殖を維持する。いくつかの実施形態において、PI3K経路の阻害剤の存在下で、活性化され刺激された免疫エフェクター細胞は、i)CD62L、CD127、CD197、及びCD38からなる群より選択される一つ以上のマーカーの発現を増加させた、又はii)CD62L、CD127、CD197、及びCD38の全てのマーカーを、PI3K経路の阻害剤の非存在下で、活性化された刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた。いくつかの実施形態では、PI3K経路の阻害剤の存在下で活性化され、刺激された免疫エフェクター細胞は、i)CD62L、CD127、CD27、及びCD8からなる群より選択される一つ以上のマーカーの発現を増加させた、又はii)CD62L、CD127、CD27、及びCD8の全てのマーカーを、PI3K経路の阻害剤の非存在下で、活性化された刺激された免疫エフェクター細胞に比べて増加させた。いくつかの実施形態において、PI3K阻害剤はZSTK474である。
様々な実施形態において、細胞またはその子孫は、BCMA発現細胞との共培養において高いIFNγ放出を示す。いくつかの実施形態において、細胞またはその子孫は、CARがマウス由来の抗BCMA scFvを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じ細胞と比較して、BCMA発現細胞との共培養において、類似またはより高いIFNγ放出を示す。いくつかの実施形態において、共培養されたBCMA発現細胞は、Daudi細胞、HT1080.BCMA細胞、および/またはRPMI-8226細胞である。いくつかの実施形態では、細胞またはその子孫は、低BCMA発現細胞との共培養において高いIFNγ放出を示す。いくつかの実施形態において、低BCMA発現細胞は、Daudi、HT1080.BCMA、および/またはRPMI-8226細胞と比較して、少なくとも5倍少ない表面BCMA発現を有する。いくつかの実施形態において、低BCMA発現細胞は、HT1080.BCMA細胞と比較して、少なくとも10倍少ない表面BCMA発現を有する。いくつかの実施形態において、低BCMA発現細胞は、RPMI-8226細胞と比較して少なくとも10倍少ない表面BCMA発現を有する。いくつかの実施形態において、低BCMA発現細胞は、RLおよび/またはToledo細胞である。いくつかの実施形態において、CAR T細胞は、CARがマウス由来の抗BCMA scFvを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じCART細胞と比較して、低抗原密度細胞との共培養において、より高いIFNγ放出を示す。いくつかの実施形態において、細胞は低い抗原非依存性シグナル伝達を示す。いくつかの実施形態において、細胞は、CARがマウス由来の抗BCMA scFvを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じCAR T細胞と比較して低い抗原非依存性シグナル伝達を示す。
本開示の別の態様において、本明細書に企図される細胞のいずれか一つおよび生理学的に許容される賦形剤を含む組成物が提供される。
本開示の別の態様において、本明細書に企図されるCARまたはポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞を生成する方法が提供され、本明細書に企図されるベクターのいずれか一つを免疫エフェクター細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、免疫エフェクター細胞を刺激し、CD3に結合する抗体およびCD28に結合する抗体と細胞を接触させることによって、細胞を増殖させるように誘導し、それによって、免疫エフェクター細胞の集団を生成すること、をさらに含む。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ベクターを導入する前に刺激され、増殖するように誘導される。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞はTリンパ球を含む。様々な実施形態において、免疫エフェクター細胞は、NK細胞を含む。いくつかの実施形態において、PI3K経路の阻害剤の存在下で、免疫エフェクター細胞は、活性化され刺激され、i)CD62L、CD127、CD197、及びCD38からなる群より選択される一つ以上のマーカーの発現を増加させた、又はii)CD62L、CD127、CD197、及びCD38の全てのマーカーを、PI3K経路の阻害剤の非存在下で、活性化された刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた。いくつかの実施形態において、PI3K経路の阻害剤の存在下で、免疫エフェクター細胞は、活性化され刺激され、i)CD62L、CD127、CD27およびCD8からなる群より選択される一つ以上のマーカーの発現を増加させた、又はii)CD62L、CD127、CD27およびCD8の全てのマーカーを、PI3K経路の阻害剤の非存在下で、活性化された刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた。いくつかの実施形態において、PI3K阻害剤はZSTK474である。
本開示の別の態様において、それを必要とする対象におけるB細胞関連状態を治療する方法が提供され、本明細書に提供されるいずれか一つの組成物の治療効果量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、B細胞関連状態は癌である。いくつかの実施形態では、癌は、固体癌である。いくつかの実施形態では、癌は、液性癌である。いくつかの実施形態では、癌は、血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、B細胞関連状態は、多発性骨髄腫(MM)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、不確かな悪性電位のB細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少症紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、ANCA関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、および急速に進行する糸球体腎炎、重鎖疾患、原発性または免疫細胞関連アミロイドーシス、または重要性が不明のモノクローナルガンモパシーである。いくつかの実施形態において、B細胞関連状態は、B細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、B細胞悪性腫瘍は、多発性骨髄腫(MM)または非ホジキンリンパ腫(NHL)である。幾つかの実施形態では、MMは、顕性多発性骨髄腫、くすぶり多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、IgD骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、および髄外形質細胞腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、NHLは、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫(CLL/SLL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、B細胞関連状態は、形質細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、B細胞関連状態は、自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデスである。いくつかの実施形態において、B細胞関連状態は、関節リウマチである。いくつかの実施形態において、B細胞関連状態は、特発性血小板減少症紫斑病、重症筋無力症、又は自己免疫性溶血性貧血である。
本開示の別の態様において、対象においてBCMAを発現する癌に関連する一つ以上の症状を改善する方法が提供され、BCMAを発現する癌細胞に関連する少なくとも一つの症状を改善するのに十分な量の本明細書に提供される組成物のいずれか一つを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、改善される一つ以上の症状は、脱力、疲労、息切れ、あざができやすい及び出血しやすい、頻発する感染、リンパ節の拡張、腹部膨張又は腹部疼痛、骨又は関節の疼痛、骨折、予期せぬ体重減少、食欲低下、寝汗、持続性の微熱、並びに排尿減少からなる群から選択される。
本開示の別の態様において、対象においてBCMAを発現する細胞数を減少させる方法が提供され、投与前にBCMAを発現する細胞の数と比較して、BCMAを発現する細胞の数を減少させるのに十分な量の請求項116に記載の組成物を対象に投与することを含む。
本開示の別の態様において、ヒトBCMAポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片提供され、以下を含む:配列番号7、15、23、31、39または47に記載の可変軽鎖アミノ酸配列内の可変軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3領域、ならびに/または配列番号8、16、24、32、40、または48に記載される可変重鎖アミノ酸配列内の可変重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3領域。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号1~3、9~11、17~19、25~27、33~35もしくは41~43のいずれか一つに記載される可変軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに/または配列番号4~6、12~14、20~22、28~30、36~38もしくは44~46に記載される可変重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。
特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、以下からなる群から選択される:キャメルIg、Ig NAR、Fab断片、Fab’断片、F(ab)’2断片、F(ab)’3断片、Fv、一本鎖Fv抗体(「scFv」)、bis-scFv、(scFv)2、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Fvタンパク質(「dsFv」)、およびシングルドメイン抗体(sdAb、ナノボディ)。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、scFvである。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1~3のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号4~6のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号9~11のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号12~14のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号17~19のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号20~22のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号25~27のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号28~30のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号33~35のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号36~38のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号41~43のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号44~46のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号7、15、23、31、39もしくは47のいずれか一つに記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号8、16、24、32、40もしくは48のいずれかに記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号7に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号8に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号15に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号16に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号23に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号24に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号31に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号32に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号39に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号40に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号47に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号48に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%若しくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号7、15、23、31、39もしくは47のいずれか一つに記載される可変軽鎖配列および/または配列番号8、16、24、32、40もしくは48のいずれか一つに記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号7に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号8に記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号15に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号16に記載の可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号23に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号24に記載の可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号31に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号32に記載の可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号39に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号40に記載の可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号47に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号48に記載の可変重鎖配列を含む。
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、scFvであり、可変軽鎖は可変重鎖のそれに対してc末端に位置する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、scFvであり、可変重鎖は可変軽鎖のそれに対してc末端に位置する。
配列番号に関する簡単な説明
配列番号1~48は、本明細書に企図される抗BCMA CARのための例示的な軽鎖CDR配列、重鎖CDR配列、可変軽鎖および可変重鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号1~48は、本明細書に企図される抗BCMA CARのための例示的な軽鎖CDR配列、重鎖CDR配列、可変軽鎖および可変重鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号49~68は、本明細書に企図される例示的なBCMA CAR構築物のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を記載する。
配列番号69は、ヒトBCMAのアミノ酸配列を記載する。
配列番号71~81は、様々なリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号82~106は、プロテアーゼ切断部位および自己切断ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を記載する。
前述の配列において、Xは、存在する場合には任意のアミノ酸を指し、またはアミノ酸の非存在を指す。
詳細な説明
A.概要
本発明は、一般に、B細胞関連状態を治療するための改良された組成物および方法に関する。特に、本発明は、B細胞関連状態(例えば、癌)を治療するための改良されたヒト抗BCMA抗体、CAR、およびCAR T細胞に関する。
A.概要
本発明は、一般に、B細胞関連状態を治療するための改良された組成物および方法に関する。特に、本発明は、B細胞関連状態(例えば、癌)を治療するための改良されたヒト抗BCMA抗体、CAR、およびCAR T細胞に関する。
本明細書において使用される場合、用語「B細胞関連状態」は、不適切なB細胞活性およびB細胞悪性腫瘍を伴う状態に関する。特定の実施形態において、本開示は、遺伝子改変免疫エフェクター細胞を用いたB細胞関連状態の改善された養子細胞療法に関する。遺伝的方法は、免疫認識と癌細胞の排除を強化する可能性のある手段をもたらす。
有望な戦略の一つは、免疫エフェクター細胞を遺伝子操作して、細胞毒性を癌細胞に向け直すキメラ抗原受容体(CAR)を発現させることである。しかしながら、任意のCARの潜在的な治療効果には、適切な構造ドメイン(ヒンジまたは膜貫通ドメインなど)の選択、適切なシグナル伝達ドメインまたは共刺激ドメイン(4-1BBまたはCD3ζなど)、および適切な抗原結合ドメインの選択を含むがこれらに限定されない、CARのいくつかの成分間の微妙なバランスが含まれる。例えば、好ましくは、抗原結合ドメインは、癌細胞上で発現され、非癌細胞上で比較的低い(または存在しない)発現を有する抗原に結合する。さらに、結合は、シグナル伝達が得られない、またはシグナル伝達が多すぎることのないように、強すぎるまたは弱すぎることはできない。
BCMAを標的とする治療用抗体またはキメラ抗原受容体(CAR)の使用を通じて、B細胞成熟抗原(BCMA、CD269または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーとしても知られる、メンバー17;TNFRSF17)を標的とすることによりB細胞悪性腫瘍を治療しようとする近年の試みは、有望ではあるが限られた成功を収めている。実際、多くの患者は、これらの患者集団ではこれまで見られなかった測定可能な治療上の利益を経験しているが、これらの治療を受けている患者の全てが完全な寛解と多くの再発を経験するわけではない。したがって、これらの患者集団には、抗BCMA抗体および/またはCAR(CAR T療法を含む)の改善を含む、改善された治療法に対する重要な満たされていないニーズが残っている。
BCMAは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである(例えば、Thompsonら、J.Exp.Medicine、192(1):129-135、2000年およびMackayら、Annu.Rev.Immunol、21:231-264、2003年を参照されたい)。BCMAは、B細胞活性化因子(BAFF)および増殖誘導リガンド(APRIL)に結合する(例えば、Mackayら、2003年およびKalledら、Immunological Reviews、204:43-54、2005年を参照されたい)。非悪性細胞の中で、BCMAは主に形質細胞および成熟B細胞のサブセットで発現することが報告されている(例えば、Laabiら、EMBO J.、77(1):3897-3904、1992年;Laabiら、Nucleic Acids Res.、22(7):1147-1154、1994年;Kalledら、2005年;O’Connorら、J.Exp.Medicine、199(1):91-97、2004年;Ngら、J.Immunol.、73(2):807-817、2004年を参照されたい)。BCMAを欠損したマウスは健康であり、正常な数のB細胞を有するが、長寿命の形質細胞の生存は損なわれている(例えば、O’Connorら、2004年;Xuら、Mol.Cell.Biol、21(12):4067-4074、2001年;Schiemannら、Science、293(5537):2 111-21 14、2001年)。BCMA RNAは、多発性骨髄腫細胞および他のリンパ腫において普遍的に検出されており、BCMAタンパク質は、複数の研究者によって多発性骨髄腫患者の形質細胞の表面で検出されている(例えば、Novakら、Blood、103(2):689-694、2004年;Neriら、Clinical Cancer Research、73(19):5903-5909、2007年;Bellucciら、Blood、105(10):3945-3950、2005年;Moreauxら、Blood、703(8):3148-3157、2004年を参照されたい)。
したがって、本明細書に開示される養子細胞療法の改善された組成物および方法は、BCMAを発現する細胞を標的とし、ヒト由来の抗原結合ドメインを有し、改善されたサイトカイン放出、および/または低い抗原非依存性シグナル伝達を示す遺伝子改変免疫エフェクター細胞(例えば、CAR T細胞)を提供する。特定の実施形態において、ヒト抗BCMA抗体または抗原結合断片、膜貫通ドメイン、および一つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARが提供される。さらなる実施形態において、改善されたCAR T細胞は、低抗原密度細胞との共培養において高いIFNγ放出を示す。
一実施形態において、本明細書で企図されるCARを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞が提供される。CARを発現するT細胞は、本明細書ではCAR T細胞またはCAR修飾T細胞と呼ばれる。
様々な実施形態において、本明細書で企図される遺伝子改変免疫エフェクター細胞は、B細胞関連状態、例えばB細胞またはB細胞悪性腫瘍に関連する自己免疫疾患を有する患者に投与される。
他の実施形態において、改善された抗BCMA抗体またはその断片が提供される。
本発明の実施は、特に反対に示されない限り、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を採用し、これらは当業者の技術の範囲内であり、その多くは例示の目的で以下に記載される。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版、2001年);Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、1989年);Maniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982年);Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons、2008年7月に更新)、Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience;Glover、DNA Cloning:A Practical Approach、I & II巻(IRL Press、Oxford、1985年);Anand、Techniques for the Analysis of Complex Genomes(Academic Press、New York、1992年)、Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins編、1984年)、Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning(1984年)、Harlow and Lane、Antibodies、(Cold Spring Harbor LaboratoryPress、Cold Spring Harbor、N.Y.,1998年)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan、A.M.Kruisbeek、D.H.Margulies、E.M.Shevach and W.Strober編、1991年);Annual Review of Immunology;並びにAdvances in Immunologyなどの専門誌の研究論文を参照されたい。
B.定義
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書において使用されるべきある特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ちうる。
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書において使用されるべきある特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ちうる。
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載するものと類似した、又は均等の方法及び材料を、特定の実施形態の実施又は検証に使用することができるが、本明細書においては好ましい組成物、方法及び材料の実施形態を開示している。本開示の目的に対し、以下の用語を、以下に規定する。
冠詞「a」、「an」及び「the」は、本明細書において、当該冠詞の文法上の対象の一つ又は複数(すなわち少なくとも一つ、又は一つもしくは複数)を指すために使用される。例示として、「an element」とは、一つの要素、又は一つもしくは複数の要素を意味する。
選択肢(例、「又は」)の使用は、いずれか一つ、両方、又はその選択肢の任意の組み合わせを意味すると理解されたい。
「および/または」という用語は、いずれか一つ、またはその選択肢の両方を意味すると理解されたい。
本明細書において使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さに対し、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%までも変化する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さを指す。一つの実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さに関し、±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%または±1%の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さの範囲を指す。
一実施形態では、例えば、1~5、約1~5、又は約1~約5といった範囲は、当該範囲に包含される各数値を指す。例えば、一つの非限定的かつ単に例示的な実施形態では、範囲「1~5」は、表現1、2、3、4、5、又は1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、もしくは5.0、又は1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、もしくは5.0と同等である。
本明細書中で使用するように、用語「実質的に」は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さと比較して、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はそれ以上である数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さとほぼ同じである効果、例えば、生理学的効果を生じる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。
本明細書全体を通じて、文脈が別段要求しない限り、語句「含む(comprise)」、「含む(comprises)」及び「含むこと」は、規定される工程もしくは要素又は工程もしくは要素のグループを含むことを暗示するが、任意の他の工程もしくは要素又は工程もしくは要素のグループを除外することを暗示しないことは理解されるだろう。「~からなる」とは、語句「からなる」に先行するもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。ゆえに、「~からなる」という文言は、列記される要素が必要又は義務であり、他の要素は存在し得ないことを示す。「本質的に~からなる」とは、当該文言の後に列記される任意の要素、及び列記される要素に関して本開示中に特定される活性若しくは作用に干渉しない、又は寄与しない他の要素に限定される任意の要素を含むことを意味する。このように、文言「本質的に~からなる」は、列記される要素が必須又は義務であり、しかし列記される要素の活性又は作用に実質的に影響を与える他の要素は存在しないことを示す。
本明細書全体を通じて「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加的な実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、又はそれらの組み合わせに対する参照は、当該実施形態と関連付けて記載される特定の性質、構造又は特徴が、少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。このように、本明細書全体の様々な箇所での前述の文言の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の性質、構造、又は特徴は、一つ以上の実施形態において任意の適切な様式で組み合わされうる。また、一実施形態でのある特徴の肯定的な列挙は、特定の実施形態での当該特徴を除外するための根拠として機能することが理解される。
追加の定義は、本開示全体を通じて記載されている。
C.ヒト抗BCMA抗体
特定の実施形態において、ヒトBCMAに結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。
特定の実施形態において、ヒトBCMAに結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。
「抗体」という用語は、免疫細胞によって認識されるものなどの、ペプチド、脂質、多糖類、または抗原決定基を含有する核酸などの一つ以上の抗原のエピトープを特異的に認識し、結合する軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域またはその断片を少なくとも含むポリペプチドである結合剤を指す。
「抗体」という用語は、本明細書の他の箇所にさらに記載されるような、任意の天然に存在する、組換え、改変または操作された免疫グロブリン様構造または抗原結合断片もしくはその一部、またはそれらの誘導体を包含する。したがって、この用語は、標的抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指し、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および二重特異性抗体を含む。インタクトな抗体は、一般に、少なくとも二つの完全長重鎖および二つの完全長軽鎖を含むが、場合によっては、重鎖のみを含むことができるラクダ科動物に天然に存在する抗体などのより少ない鎖を含むことができる。抗体は、単一の供給源のみから誘導することができ、または「キメラ」であり得、すなわち、抗体の異なる部分を二つの異なる抗体から誘導することができる。抗体またはその抗原結合部分は、ハイブリドーマにおいて、組換えDNA技術によって、またはインタクト抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生され得る。
「抗原結合断片」または「抗原結合部分」という用語は、抗原(例えば、BCMA)に特異的に結合する能力を保持する抗体の一つ以上の断片を指す。抗原結合断片は、限定するものではないが、複合体を形成する抗原に特異的に結合する任意の天然に存在する、酵素的に取得可能な、合成された、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、抗体の抗原結合部分は、例えば、抗体可変および任意に定常ドメインをコードするDNAの操作および発現を含むタンパク質分解消化または組換え遺伝子工学技術などの任意の適切な標準技術を用いて、完全な抗体分子から誘導され得る。好ましい実施形態では、抗原結合断片は、一本鎖可変断片(svFv)である。
「一本鎖Fv」または「scFv」抗体断片は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に、いずれかの配向(例えば、VL-VHまたはVH-VL)で存在する。例えば、いくつかの実施形態において、scFv可変軽鎖は、可変重鎖のそれに対してc末端に位置する。いくつかの実施形態において、scFv可変重鎖は、可変軽鎖のそれに対してc末端に位置する。概して、scFvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによりscFvは抗原結合のための所望の構造を形成することができる。scFvのレビューについては、例えば、Pluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、113巻、Rosenburg and Moore編、(Springer-Verlag、New York、1994年)、pp.269-315を参照されたい。
「単離された抗体またはその抗原結合断片」は、その自然環境の構成要素から識別され、分離および/または回収された抗体またはその抗原結合断片を指す。
「抗原(Ag)」は、抗体または断片が特異的に結合する結合領域内の抗原決定基を含む任意の分子を広く含む。特定の実施形態において、「抗原(Ag)」とは、動物における抗体の産生またはT細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質を指し、動物に注射または吸収される組成物(癌特異的タンパク質を含むものなど)を含む。抗原は、例えば、開示される抗原などの異種抗原により誘導される産物を含む、特異的な液性免疫又は細胞性免疫の産物と反応する。特定の実施形態において、標的抗原は、BCMAポリペプチド(例えば、ヒトBCMAポリペプチド)のエピトープである。
抗原は、単一単位分子(タンパク質モノマーや断片など)または複数の成分で構成される複合体であってもよい。抗原は、エピトープ、例えば、分子もしくは分子の一部、または分子もしくは分子の部分の複合体を提供し、抗原結合タンパク質(例えば抗体を含む)などの選択的結合剤によって結合され得る。したがって、選択的結合剤は、複合体中の二つ以上の成分によって形成される抗原に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態において、抗原は、その抗原に結合することができる抗体を産生するために動物に使用することができる。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、例えば抗体と相互作用することができる一つ以上のエピトープを有することができる。
「エピトープ」又は「抗原性決定基」とは、結合物質が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置される連続アミノ酸又は非連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒への曝露で保持され、一方で三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒を用いた処理で失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間構造に少なくとも3個、より一般的には少なくとも5個、約9個、又は約8~10個のアミノ酸を含む。
本明細書において使用される用語「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合する」または「特異的結合」または「特異的標的」は、バックグラウンド結合よりも大きい結合親和性でのBCMA(例えば、ヒトBCMA)への抗BCMA抗体またはその抗原結合断片(またはそれを含むCAR)の結合を記載する。結合ドメイン(または結合ドメインまたは結合ドメインを含む融合タンパク質を含むCAR)は、例えば約105M-1以上の親和性またはKa(すなわち、1/Mの単位との特定の結合相互作用の平衡会合定数)でBCMAに結合する、またはBCMAと会合する場合、BCMAに「特異的に結合」する。ある特定の実施形態では、結合ドメイン(又は融合タンパク質)は、約106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1、又は1013M-1以上のKaで標的に結合する。「高親和性」結合ドメイン(またはその一本鎖融合タンパク質)は、少なくとも107M-1、少なくとも108M-1、少なくとも109M-1、少なくとも1010M-1、少なくとも1011M-1、少なくとも1012M-1、少なくとも1013M-1またはそれより大きいKaを有する結合ドメインを指す。
あるいは、親和性は、M単位(例えば、10-5M~10-13M、またはそれ未満)での特定の結合相互作用の平衡解離定数(Kd)として定義されてもよい。本開示による結合ドメインポリペプチドとCARタンパク質の親和性は、従来の技術を用いて容易に決定することができ、例えば、競合ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、または結合会合によって、または標識リガンドを用いた置換アッセイによって、またはBiacore社、Piscataway、NJから入手可能なBiacore T100などの表面プラズモン共鳴装置を使用して、または、Corning社およびPerkin Elmer社からそれぞれ入手可能なEPICシステムまたはEnSpireなどの光学バイオセンサ技術が挙げられる(例えば、Scatchardら(1949年)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660;および米国特許第5,283,173号;第5,468,614号、または同等のものも参照されたい)。
一実施形態では、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合より約2倍高いか、バックグラウンド結合より約5倍高いか、バックグラウンド結合より約10倍高いか、バックグラウンド結合より約20倍高いか、バックグラウンド結合より約50倍高いか、バックグラウンド結合より約100倍高いか、又はバックグラウンド結合より約1000倍高いか、又はそれ以上である。
特定の実施形態において、CARの細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。CARの文脈において、「抗体」とは、抗原のエピトープを特異的に認識し結合する軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を少なくとも含むポリペプチドである結合剤を指し、例えば、ペプチド、脂質、多糖類、または免疫細胞によって認識されるものなどの抗原決定基を含む核酸が挙げられる。
当業者によって理解されるであろうように、及び本明細書の他の箇所に記載されるように、完全抗体は、二つの重鎖及び二つの軽鎖を含む。各重鎖は、可変領域、並びに第一、第二、及び第三の定常領域からなるが、一方で、各軽鎖は、可変領域及び定常領域からなる。
軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、三つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域を含み、これは「相補性決定領域」又は「CDR」とも呼ばれる。CDRは、Kabatらによる配列など、従来の方法によって定義または同定することができる(Wu,TTおよびKabat、E.A.,J Exp Med.132(2):211-50、(1970年);Borden,P.およびKabat、E.A、PNAS、84:2440-2443(1987年);(Kabatら、Sequences of Protein of Immunological Interest、U.S.Department of Health and Human Services、1991年、これは参照により本明細書に組み込まれる)、またはChothiaらによる構造による(Chothia,C.およびLesk、A.M.、J Mol.Biol.、196(4):901-917(1987年)、Chothia,C.ら、Nature、342:877-883(1989)を産所されたい)。
Kabat CDRと重複するCDRを定義する他の境界は、Padlan(1995年)FASEB J.9:133-139およびMacCallum(1996)J.Mol.Biol.262(5):732-45に記載されている。さらに他のCDR境界定義は、本明細書のシステムの一つに厳密に従っていないかもしれないが、それにもかかわらず、特定の残基または残基のグループ、あるいはCDR全体でさえ抗原結合に有意に影響を及ぼさないという予測または実験的所見に照らして、短縮または延長され得るが、Kabat CDRと重複する。例えば、抗体のCDRは、Kabat CDRとChothia構造ループの間の妥協を表すAbM超可変領域を参照し、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェア(Oxford Molecular Group,Inc.社)によって使用されるAbM番号付けスキームに従って決定することができる。
さらに、抗体のCDRは、Lefranc M-P、(1999年)The Immunologist 7:132-136およびLefranc M-Pら、(1999年)Nucleic Acids Res 27:209-212に記載されているように、IMGTナンバリングシステムに従って決定することができる。
CDR決定のさらに他の方法は、MacCallum R Mら、(1996)J Mol Biol 262:732-745に開示されている。例えば、Martin A.“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domain,”in Antibody Engineering,Kontermann and Dubel編、31節、pp.422-439、Springer-Verlag、Berlin(2001年)も参照されたい。本明細書に記載されるCDR定義のいずれかに基づいてCDRを決定するために使用することができる専有および公に利用可能なプログラム、例えば、abYsis(abysis.org/abysis/)およびIMGT/V-QUEST(imgt.org/IMGT_vquest)は、当業者に公知である。
軽鎖CDRを予測するためのルールの例示的な例には、CDRL1は約残基24で始まり、前にCysがあり、約10~17残基であり、その後にTrpが続く(典型的にはTrp-Tyr-Glnであるが、Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln、Trp-Tyr-Leu)が続く。CDRL2は、CDRL1の終了後約16残基から始まり、一般にIle-Tyr、Val-Tyr、Ile-Lys、Ile-Pheによっても先行され、7残基である。CDRL3は、CDRL2の終了後約33残基から始まり、Cysが先行し、7~11残基であり、その後にPhe-Gly-XXX-Gly(配列番号108)が続く(XXXは任意のアミノ酸である)。
重鎖CDRを予測するためのルールの例示的な例には、CDRH1が約26残基から始まり、Cys-XXX-XXX-XXX(配列番号109)が先行し、10~12残基であり、その後にTrp(典型的にはTrp-Valであるが、Trp-Ile、Trp-Ala)が続き;CDRH2は、CDRH1の終了後約15残基から始まり、一般にLeu-Glu-Trp-Ile-Gly(配列番号110)またはいくつかのバリエーションが先行し、16~19残基であり、その後にLys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Alaが続き、AbM定義は7残基早く終わり;CDRH3は、CDRH2の終了後約33残基から始まり、Cys-XXX-XXX(典型的にはCys-Ala-Arg)が先行し、3~25残基であり、その後にTrp-Gly-XXX-Gly(配列番号111)が続く。
したがって、特定の実施形態において、本開示は、ヒトBCMAタンパク質に特異的に結合し、可変軽鎖配列番号7、15、23、31、39、または47に記載されるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3領域アミノ酸配列ならびに/または可変重鎖配列番号8、16、24、32、40または48に記載される CDRH1、CDRH2およびCDRH3 領域アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む単離された抗体、その抗原結合断片を提供し、CDRは、Kabat定義、Chothia定義、Kabat定義とChothia定義の組合せ、IMGT定義、AbM定義、またはCDRの接触定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、CDRは、Kabat定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、CDRは、Chothia定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、CDRは、AbM定義に従って規定される。いくつかの実施形態において、CDRは、IMGT定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、CDRは、接触定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、CDRは、上述のCDR定義のいずれか一つの組合せによって定義される。
本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片に適した軽鎖CDRの例示的な例として、配列番号1~3、9~11、17~19、25~27、33~35、または41~43に記載のCDR配列が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片に適した重鎖CDRの例示的な例には、配列番号4~6、12~14、20~22、28~30、36~38、または44~46に記載のCDR配列が含まれるが、これらに限定されない。
「VH」または「VH」への言及は、抗体、Fv、scFv、dsFv、Fabまたは本明細書に開示される他の抗体断片を含む、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「VL」または「VL」への言及は、抗体、Fv、scFv、dsFv、Fabまたは本明細書に開示される他の抗体断片を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
特定の実施形態では、抗原特異的結合ドメインは、ヒトBCMAポリペプチドに結合するscFvである。本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片に適した可変重鎖の例示的な例として、配列番号8、16、24、32、40、および48に記載のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片に適した可変軽鎖の例示的な例として、配列番号7、15、23、31、39、および47に記載のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で提供されるBCMA特異的結合ドメインはまた、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのCDRを含む。このようなCDRは、軽鎖のCDRL1、CDRL2およびCDRL3ならびに重鎖のCDRH1、CDRH2およびCDRH3から選択されるヒトまたは非ヒトCDRまたは改変された非ヒトCDRであり得る。特定の実施形態では、BCMA特異的結合ドメインは、(a)軽鎖CDRL1、軽鎖CDRL2、および軽鎖CDRL3を含む軽鎖可変領域、および(b)重鎖CDRH1、重鎖CDRH2、および重鎖CDRH3を含む重鎖可変領域を含む。好ましい実施形態において、CDRはヒトCDRである。
本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片に適した軽鎖CDRの例示的な例として、配列番号1~3、9~11、17~19、25~27、33~35、または41~43に記載のCDR配列が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片に適した重鎖CDRの例示的な例には、配列番号4~6、12~14、20~22、28~30、36~38、または44~46に記載のCDR配列が含まれるが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、対応するCDR領域と比較して、CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、および/またはCDRL3と実質的に類似した一つ以上のCDR配列を含む。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、一つ以上のCDR配列(例えば、配列番号1~6、9~14、17~22、25~30、33~38または41~46)を含み得、配列番号1~6、9~14、17~22、25~30、33~38または41~46のいずれか一つの対応するCDR領域に比べて、それぞれ最大1、2、3、4、5個のアミノ酸残基のバリエーションを含む。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸変動」または「アミノ酸変化」または「アミノ酸残基の変化」という語句は、参照配列と比較した一つ以上のアミノ酸の違いを指し、アミノ酸の修飾、置換、挿入、および/または欠失を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、以下から選択される少なくとも三つのCDRを含み、場合により、CDRのそれぞれについて最大3個のアミノ酸変化、例えば1、2、または3個のアミノ酸変化を含む:CDRL1:配列番号1;CDRL2:配列番号2;CDRL3:配列番号3;CDRH1:配列番号4;CDRH2:配列番号5;およびCDRH3:配列番号6。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、以下から選択される少なくとも三つのCDRを含み、場合により、CDRのそれぞれについて最大3個のアミノ酸変化、例えば1、2、または3個のアミノ酸変化を含む:CDRL1:配列番号9;CDRL2:配列番号10;CDRL3:配列番号11;CDRH1:配列番号12;CDRH2:配列番号13;およびCDRH3:配列番号14。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、以下から選択される少なくとも三つのCDRを含み、場合により、CDRのそれぞれについて最大3個のアミノ酸変化、例えば1、2、または3個のアミノ酸変化を含む:CDRL1:配列番号17;CDRL2:配列番号18;CDRL3:配列番号19;CDRH1:配列番号20;CDRH2:配列番号21;およびCDRH3:配列番号22。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、以下から選択される少なくとも三つのCDRを含み、場合により、CDRのそれぞれについて最大3個のアミノ酸変化、例えば1、2、または3個のアミノ酸変化を含む:CDRL1:配列番号25;CDRL2:配列番号26;CDRL3:配列番号27;CDRH1:配列番号28;CDRH2:配列番号29;およびCDRH3:配列番号30。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、以下から選択される少なくとも三つのCDRを含み、場合により、CDRのそれぞれについて最大3個のアミノ酸変化、例えば1、2、または3個のアミノ酸変化を含む:CDRL1:配列番号33;CDRL2:配列番号34;CDRL3:配列番号35;CDRH1:配列番号36;CDRH2:配列番号37;およびCDRH3:配列番号38。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、以下から選択される少なくとも三つのCDRを含み、場合により、CDRのそれぞれについて最大3個のアミノ酸変化、例えば1、2、または3個のアミノ酸変化を含む:CDRL1:配列番号41;CDRL2:配列番号42;CDRL3:配列番号43;CDRH1:配列番号44;CDRH2:配列番号45;およびCDRH3:配列番号46。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号1、2、および3に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号4、5、および6に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号1、2、および3に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに配列番号4、5、および6に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号9、10、および11に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号12、13、および14に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号9、10、および11に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに配列番号12、13、および14に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号17、18、および19に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号20、21、および22に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号17、18、および19に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに配列番号20、21、および22に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号25、26、および27に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号28、29、および30に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号25、26、および27に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに配列番号28、29、および30に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号33、34、および35に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号36、37、および38に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号33、34、および35に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに配列番号36、37、および38に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号41、42、および43に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号44、45、および46に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号41、42、および43に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに配列番号44、45、および46に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。
本発明の態様は、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含むヒトBCMAに選択的に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号7、15、23、31、39、または47と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号8、16、24、32、40、または48と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号7と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および/または少配列番号8と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号15と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および/または少配列番号16と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号23と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および/または少配列番号24と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号31と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および/または少配列番号32と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号39と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および/または少配列番号40と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号47と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および/または少配列番号48と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域配列は、本明細書中で提供されるCDR配列のいずれにおいても変化しない。例えば、いくつかの実施形態において、配列変動の程度(例えば、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%)は、本明細書中で提供されるCDR配列のいずれかを除く重鎖可変および/または軽鎖可変アミノ酸配列内で生じ得る。
いくつかの実施形態において、二つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、KarlinおよびAltschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68、1990年、Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993。USA 90:5873-77、1993年のアルゴリズムを用いて決定される。Biol.215:403-10、1990年のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム(スコア=50、ワード長=3)を使用して実行して、目的のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を取得することができる。二つの配列の間にギャップが存在する場合、Gapped BLASTは、Altschulら、Nucleic Acids Res.25(l7):3389-3402、1997年に記載されるように利用することができる。BLASTおよびギャップBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ(XBLASTおよびNBLASTなど)を使用することができる。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号7に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび/または配列番号8に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号15に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび/または配列番号16に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号23に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび/または配列番号24に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号31に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび/または配列番号32に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号39に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび/または配列番号40に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号47に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび/または配列番号48に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片のいずれかにおいて、一つ以上の保存的変異を、残基が抗体-抗原相互作用に関与する可能性が低い位置でCDRまたはフレームワーク配列に導入することができる。いくつかの実施形態では、そのような保存的変異は、結晶構造に基づいて決定されるように、残基がBCMAとの相互作用に関与する可能性が低い位置でCDRまたはフレームワーク配列に導入され得る。いくつかの実施形態では、ありそうな界面(例えば、抗原-抗体相互作用に関与する残基)は、構造的類似性を共有する他の抗原に関する既知の構造情報から推定され得る。
様々な実施形態において、本開示は、本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片との結合について競合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本開示の態様は、本明細書に提供されるような特異的抗体またはその抗原結合断片のいずれかと競合または交差競合する抗体、例えば、上記のような一つ以上のCDR配列(1、2、3、4、5、または6つのCDR配列)を有する抗体に関する。一実施形態において、本開示は、配列番号1~3、9~11、17~19、25~27、33~35、または41~43に記載される軽鎖CDR配列および/または配列番号4~6、12~14、20~22、28~30、36~38、または44~46に記載される重鎖CDR配列を有する抗体と競合または交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号7、15、23、31、39、または47を含む軽鎖可変領域配列および/または配列番号8、16、24、32、40、または48を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
一実施形態において、本開示は、配列番号1~3に記載される軽鎖CDR配列および/または配列番号4~6に記載される重鎖CDR配列を有する抗体と競合または交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号7を含む軽鎖可変領域配列および/または配列番号8を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
一実施形態において、本開示は、配列番号9~11に記載される軽鎖CDR配列および/または配列番号12~14に記載される重鎖CDR配列を有する抗体と競合または交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号15を含む軽鎖可変領域配列および/または配列番号16を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
一実施形態において、本開示は、配列番号17~19に記載される軽鎖CDR配列および/または配列番号20~22に記載される重鎖CDR配列を有する抗体と競合または交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号23を含む軽鎖可変領域配列および/または配列番号24を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
一実施形態において、本開示は、配列番号25~27を含む軽鎖可変領域配列および/または配列番号28~30を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号31を含む軽鎖可変領域配列および/または配列番号32を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
一実施形態において、本開示は、配列番号33~35に記載される軽鎖CDR配列および/または配列番号36~38に記載される重鎖CDR配列を有する抗体と競合または交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号39を含む軽鎖可変領域配列および/または配列番号40を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
一実施形態において、本開示は、配列番号41~43に記載される軽鎖CDR配列および/または配列番号44~46に記載される重鎖CDR配列を有する抗体と競合または交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号47を含む軽鎖可変領域配列および/または配列番号48を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書中で提供される抗体のいずれかと同じエピトープまたはその近傍で結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、エピトープの15個以下のアミノ酸残基以内に結合する場合、エピトープの近くに結合する。いくつかの実施形態において、本明細書中で提供される抗体またはその抗原結合断片のいずれかは、本明細書中で提供される抗体のいずれかによって結合されるエピトープの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アミノ酸残基内に結合する。
別の実施形態において、本明細書に提供される抗原のいずれか(例えば、ヒトBCMA)に、10-8M未満の抗体とタンパク質間の平衡解離定数KDで、競合または交差競合する抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。他の実施形態において、抗体は、10-11M~10-8Mの範囲のKDで、BCMAと競合または交差競合する。いくつかの実施形態において、本明細書に企図される抗体または抗原結合断片と競合するBCMA特異的抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、本明細書中で提供されるのは、本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片と同じエピトープに結合するBCMA特異的抗体またはその抗原結合断片である。
本明細書中で提供される抗体は、任意の適切な方法を用いて特徴付けることができる。例えば、一つの方法は、抗原が結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。例えば、Harlow and Laneの11節、Using Antibodies,a Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.,、1999年に記載されるように、抗体-抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドベースのアッセイなど、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴付けるための多くの適切な方法がある。追加の例では、エピトープマッピングを使用して、抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープは、直鎖状エピトープ、すなわち、アミノ酸の単一のストレッチに含まれること、または必ずしも単一のストレッチに含まれるとは限らないアミノ酸の三次元的相互作用によって形成される立体構造エピトープ(一次構造線状配列)であり得る。
様々な長さ(例えば、少なくとも4~19アミノ酸長)のペプチドを単離または合成し(例えば、組換え的に)、抗体との結合アッセイに使用することができる。別の例において、抗体が結合するエピトープは、標的抗原配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗体による結合を決定することによって、系統的スクリーニングにおいて決定され得る。遺伝子断片発現アッセイによれば、標的抗原をコードするオープンリーディングフレームは、ランダムにまたは特定の遺伝子構造によって断片化され、抗原の発現断片と試験される抗体との反応性が決定される。遺伝子断片は、例えば、PCRによって産生され、次いで、放射性アミノ酸の存在下でインビトロでタンパク質に転写および翻訳され得る。次に、放射性標識抗原断片への抗体の結合は、免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定される。特定のエピトープは、ファージ粒子の表面に表示されたランダムペプチド配列の大きなライブラリ(ファージライブラリー)を用いることによっても同定することができる。あるいは、重複するペプチド断片の規定されたライブラリーを、単純な結合アッセイにおいて、試験抗体への結合について試験することができる。追加の例では、抗原結合ドメインの突然変異誘発、ドメイン交換実験およびアラニン走査突然変異誘発を実施して、エピトープ結合に必要、十分、および/または必要な残基を同定することができる。例えば、ドメインスワッピング実験は、BCMAの様々な断片が、BCMAタンパク質ファミリーの別のメンバーのような、密接に関連しているが抗原的に異なるタンパク質からの配列で置換(スワップ)されている標的抗原の変異体を用いて行うことができる。変異型BCMAへの抗体の結合を評価することにより、抗体結合に対する特定の抗原断片の重要性を評価することができる。
あるいは、抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、同じ抗原に結合することが知られている他の抗体を用いて競合アッセイを実施することができる。競合アッセイは、当業者に周知である。
さらに、本明細書中で提供される任意の抗体とBCMA中の一つ以上の残基との相互作用は、日常的な技術によって決定することができる。例えば、結晶構造を決定することができ、BCMAにおける残基と、抗体(または抗原結合断片)における一つ以上の残基との間の距離を、それに応じて決定することができる。このような距離に基づいて、BCMA中の特定の残基が抗体中の一つ以上の残基と相互作用するかどうかを決定することができる。さらに、競合アッセイおよび標的突然変異誘発アッセイなどの適切な方法を適用して、候補抗体の優先的結合を決定することができる。
いくつかの実施形態において、BCMAに選択的に結合する本開示の抗体またはその抗原結合断片は、本明細書で企図される一つ以上の相補性決定領域(CDR)を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるように、BCMAに選択的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を提供する。一実施形態において、核酸分子は、本明細書で企図されるCDR配列のうちの一つ以上をコードする。
D.キメラ抗原受容体
様々な実施形態において、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性をBCMA発現細胞(例えば、B細胞)に向けて向け直す改良された遺伝子操作された受容体が提供される。これらの遺伝子操作された受容体を本明細書ではキメラ抗原受容体(CAR)と呼ぶ。CARは、所望の抗原(BCMAなど)に対する抗体ベースの特異性とT細胞受容体活性化細胞内ドメインを組み合わせて、特異的な抗BCMA細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、異なる起源に由来する異なるタンパク質部分又はDNA部分から構成されるものを表す。
様々な実施形態において、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性をBCMA発現細胞(例えば、B細胞)に向けて向け直す改良された遺伝子操作された受容体が提供される。これらの遺伝子操作された受容体を本明細書ではキメラ抗原受容体(CAR)と呼ぶ。CARは、所望の抗原(BCMAなど)に対する抗体ベースの特異性とT細胞受容体活性化細胞内ドメインを組み合わせて、特異的な抗BCMA細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、異なる起源に由来する異なるタンパク質部分又はDNA部分から構成されるものを表す。
本明細書で企図されるCARは、BCMAに結合する細胞外ドメイン(結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも呼ばれる)、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。CARの抗BCMA抗原結合ドメインが標的細胞の表面上でBCMAと結合すると、CARのクラスタリングが生じ、CAR含有細胞に活性化刺激がもたらされる。CARの主な特徴は、免疫エフェクター細胞の特異性を再指向化させる能力であり、この能力によって、増殖、サイトカイン産生、ファゴサイトーシス、または標的抗原発現細胞の細胞死を、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)非依存性の様式で介在し得る分子の産生が誘発され、モノクローナル抗体、可溶性リガンドまたは細胞特異的コレセプターの細胞特異的標的化能力が引き出される。
様々な実施形態において、CARは、抗BCMA特異的結合ドメインを含む細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメインと、一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
特定の実施形態において、CARは、抗BCMA抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外結合ドメイン、一つ以上のヒンジドメインまたはスペーサードメイン、膜貫通ドメインと、を含み、膜貫通ドメインは、一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
1.結合ドメイン
特定の実施形態において、本明細書で企図されるCARは、B細胞上に発現されるヒトBCMAポリペプチドに特異的に結合する抗BCMA抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ヒトBCMAポリペプチドの一つ以上のエピトープに特異的に結合する。特定の実施形態において、抗BCMA抗体または抗原結合断片は、ヒト抗体または抗原結合断片である。様々な実施形態において、CARは、本明細書において企図される抗BCMA抗体または抗原結合断片を含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるCARは、B細胞上に発現されるヒトBCMAポリペプチドに特異的に結合する抗BCMA抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ヒトBCMAポリペプチドの一つ以上のエピトープに特異的に結合する。特定の実施形態において、抗BCMA抗体または抗原結合断片は、ヒト抗体または抗原結合断片である。様々な実施形態において、CARは、本明細書において企図される抗BCMA抗体または抗原結合断片を含む。
本明細書において使用される場合、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は互換的に使用され、目的の標的抗原、例えばBCMAに特異的に結合する能力を有するCARを提供する。結合ドメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるCARは、scFvである抗原特異的結合ドメインを含む。様々な実施形態において、scFvドメインは、単一のポリペプチド鎖中およびいずれかの配向(例えば、VL-VHまたはVH-VL)に存在する。例えば、いくつかの実施形態において、scFv可変軽鎖は、可変重鎖のそれに対してc末端に位置する。他の実施形態において、scFv可変重鎖は、可変軽鎖のそれに対してc末端に位置する。例えば、図1を参照されたい。概して、scFvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによりscFvは抗原結合のための所望の構造を形成することができる。
本明細書に企図されるBCMA CARを構築するのに適した可変重(VH)鎖の例示的な例には、配列番号8、16、24、32、40、および48に記載されるアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に企図されるBCMA CARを構築するのに適した可変軽(VL)鎖の例示的な例には、配列番号7、15、23、31、39、および47に記載されるアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で提供されるBCMA特異的結合ドメインはまた、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのCDRを含む。このようなCDRは、軽鎖のCDRL1、CDRL2およびCDRL3ならびに重鎖のCDRH1、CDRH2およびCDRH3から選択される非ヒトCDRまたは改変された非ヒトCDRであり得る。特定の実施形態では、BCMA特異的結合ドメインは、(a)軽鎖CDRL1、軽鎖CDRL2、および軽鎖CDRL3を含む軽鎖可変領域、および(b)重鎖CDRH1、重鎖CDRH2、および重鎖CDRH3を含む重鎖可変領域を含む。
したがって、特定の実施形態において、本開示は、CAR細胞外結合ドメインを提供し、このドメインはヒトBCMAタンパク質に結合し、可変軽鎖配列番号7、15、23、31、39もしくは47に記載されるCDRL1、CDRL2、およびCDRL3領域アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ならびに/または可変重鎖配列番号8、16、24、32、40もしくは48に記載されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3領域アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、各CDRは、Kabat定義、Chothia定義、Kabat定義とChothia定義の組合せ、IMGT定義、AbM定義、またはCDRの接触定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、CDRは、Kabat定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、CDRは、Chothia定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、CDRは、AbM定義に従って規定される。いくつかの実施形態において、CDRは、IMGT定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、CDRは、接触定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、CDRは、上述のCDR定義のいずれか一つの組合せによって定義される。
本明細書に企図されるヒト化BCMA CARを構築するのに適した軽鎖CDRの例示的な例として、配列番号1~3、9~11、17~19、25~27、33~35、または41~43に記載のCDR配列が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に企図されるヒト化BCMA CARを構築するのに適した重鎖CDRの例示的な例として、配列番号4~6、12~14、20~22、28~30、36~38または44~46に記載のCDR配列が挙げられるが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、対応するCDR領域と比較して、CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、および/またはCDRL3に実質的に類似した一つ以上のCDR配列を含む。例えば、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号1~6、9~14、17~22、25~30、33~38または41~46のいずれか一つにおいて、対応するCDR領域と比較して、それぞれ1、2、3、4、または5アミノ酸残基のバリエーションを含む一つ以上のCDR配列(例えば、配列番号1~6、9~14、17~22、25~30、33~38、または41~46)を含む。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸のバリエーション」または「アミノ酸の変化」または「アミノ酸残基の変化」という語句は、アミノ酸の置換および/または欠失を含む。
一実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、以下から選択される少なくとも三つのCDRを含み、場合により、最大3個のアミノ酸変化、例えば各CDRについて1、2、または3個のアミノ酸変化を含む:CDRL1:配列番号1;CDRL2:配列番号2;CDRL3:配列番号3;CDRH1:配列番号4;CDRH2:配列番号5;およびCDRH3:配列番号6。
一実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、以下から選択される少なくとも三つのCDRを含み、場合により、最大3個のアミノ酸変化、例えば各CDRについて1、2、または3個のアミノ酸変化を含む:CDRL1:配列番号9;CDRL2:配列番号10;CDRL3:配列番号11;CDRH1:配列番号12;CDRH2:配列番号13;およびCDRH3:配列番号14。
一実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、以下から選択される少なくとも三つのCDRを含み、場合により、最大3個のアミノ酸変化、例えば各CDRについて1、2、または3個のアミノ酸変化を含む:CDRL1:配列番号17;CDRL2:配列番号18;CDRL3:配列番号19;CDRH1:配列番号20;CDRH2:配列番号21;およびCDRH3:配列番号22。
一実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、以下から選択される少なくとも三つのCDRを含み、場合により、最大3個のアミノ酸変化、例えば各CDRについて1、2、または3個のアミノ酸変化を含む:CDRL1:配列番号25;CDRL2:配列番号26;CDRL3:配列番号27;CDRH1:配列番号28;CDRH2:配列番号29;およびCDRH3:配列番号30。
一実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、以下から選択される少なくとも三つのCDRを含み、場合により、最大3個のアミノ酸変化、例えば各CDRについて1、2、または3個のアミノ酸変化を含む:CDRL1:配列番号33;CDRL2:配列番号34;CDRL3:配列番号35;CDRH1:配列番号36;CDRH2:配列番号37;およびCDRH3:配列番号38。
一実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、以下から選択される少なくとも三つのCDRを含み、場合により、最大3個のアミノ酸変化、例えば各CDRについて1、2、または3個のアミノ酸変化を含む:CDRL1:配列番号41;CDRL2:配列番号42;CDRL3:配列番号43;CDRH1:配列番号44;CDRH2:配列番号45;およびCDRH3:配列番号46。
いくつかの実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号1、2、および3に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列を含む。いくつかの実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号4、5、および6に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。特定の実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号1、2、および3に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに配列番号4、5、および6にそれぞれ記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。
いくつかの実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号9、10、および11に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列を含む。いくつかの実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号12、13、および14に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。特定の実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号9、10、および11に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに配列番号12、13、および14にそれぞれ記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。
いくつかの実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号17、18、および19に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列を含む。いくつかの実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号20、21、および22に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。特定の実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号17、18、および19に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに配列番号20、21、および22にそれぞれ記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。
いくつかの実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号25、26、および27に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列を含む。いくつかの実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号28、29、および30に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。特定の実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号25、26、および27に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに配列番号28、29、および30にそれぞれ記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。
いくつかの実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号33、34、および35に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列を含む。いくつかの実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号36、37、および38に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。特定の実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号33、34、および35に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに配列番号36、37、および38にそれぞれ記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。
いくつかの実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号41、42、および43に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列を含む。いくつかの実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号44、45、および46に記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。特定の実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号41、42、および43に記載される軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに配列番号44、45、および46にそれぞれ記載される重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3配列を含む。
本開示の態様は、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含むヒトBCMAに選択的に結合する細胞外結合ドメイン(BCMA特異的結合ドメイン)を含むCARに関する。
様々な実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号7、15、23、31、39、または47と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号8、16、24、32、40、または48と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号7と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および/または少配列番号8と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号15と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および/または配列番号16と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号23と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および/または配列番号24と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号31と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および/または配列番号32と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号39と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および/または配列番号40と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号47と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および/または配列番号48と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域配列は、本明細書中で提供されるCDR配列のいずれにおいても変化しない。例えば、いくつかの実施形態において、配列変動の程度(例えば、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%)は、本明細書中で提供されるCDR配列のいずれかを除く重鎖可変および/または軽鎖可変アミノ酸配列内で生じ得る。
様々な実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号7に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび/または配列番号8に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ド
様々な実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号15に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび/または配列番号16に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号23に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび/または配列番号24に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号31に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび/または配列番号32に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号39に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび/または配列番号40に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、BCMA特異的結合ドメインは、配列番号47に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび/または配列番号48に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
本明細書で企図されるBCMA特異的結合ドメインのいずれかにおいて、一つ以上の保存的変異を、残基が抗体-抗原相互作用に関与する可能性が低い位置で、CDRまたはフレームワーク配列に導入することができる。いくつかの実施形態では、そのような保存的変異は、結晶構造に基づいて決定されるように、残基がBCMAとの相互作用に関与する可能性が低い位置でCDRまたはフレームワーク配列に導入され得る。いくつかの実施形態では、ありそうな界面(例えば、抗原-抗体相互作用に関与する残基)は、構造的類似性を共有する他の抗原に関する既知の構造情報から推定され得る。
2.リンカー
特定の実施形態において、本明細書で企図されるCARは、様々なドメイン間のリンカー残基、例えば、分子の適切な間隔および立体配座のために付加され得る。特定の実施形態では、リンカーは、可変領域を結合させる配列である。「可変領域を結合させる配列」は、VH及びVLを繋げるアミノ酸配列であり、二つの下位結合ドメインの相互作用と適合可能なスペーサー機能を提供し、得られたポリペプチドは、同じ軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的結合親和性を保持する。本明細書で企図されるCARは、一つ、二つ、三つ、四つ、または五つ以上のリンカーを含み得る。特定の実施形態では、リンカーの長さは、約1~約25個のアミノ酸、約5~約20個のアミノ酸、又は約10~約20個のアミノ酸、又はアミノ酸の任意の介在する長さである。いくつかの実施形態では、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個、又はそれ以上のアミノ酸長である。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるCARは、様々なドメイン間のリンカー残基、例えば、分子の適切な間隔および立体配座のために付加され得る。特定の実施形態では、リンカーは、可変領域を結合させる配列である。「可変領域を結合させる配列」は、VH及びVLを繋げるアミノ酸配列であり、二つの下位結合ドメインの相互作用と適合可能なスペーサー機能を提供し、得られたポリペプチドは、同じ軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的結合親和性を保持する。本明細書で企図されるCARは、一つ、二つ、三つ、四つ、または五つ以上のリンカーを含み得る。特定の実施形態では、リンカーの長さは、約1~約25個のアミノ酸、約5~約20個のアミノ酸、又は約10~約20個のアミノ酸、又はアミノ酸の任意の介在する長さである。いくつかの実施形態では、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個、又はそれ以上のアミノ酸長である。
リンカーの例としては、グリシンポリマー(G)n、グリシン-セリンポリマー(G1-5S1-5)n(式中、nは、少なくとも1、2、3、4または5の整数である)、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、および当分野で公知の他の柔軟性のあるリンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン-セリンポリマーは比較的不定形であり、したがって、本明細書で企図されるCARなどの融合タンパク質のドメイン間の中性テザーとして機能し得る。グリシンは、アラニンよりも有意に多くのphi-psi空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ない(Scheraga、Rev.Computational Chem.11173-142(1992)を参照のこと)。当業者は、特定の実施形態におけるCARの設計は、すべてまたは部分的に柔軟であるリンカーを含むことができ、その結果、リンカーは、柔軟なリンカーならびに所望のCAR構造を提供するために、より柔軟性の低い構造を付与する一つ以上の部分を含むことができることを認識するであろう。
他の例示的なリンカーとしては、以下のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない:GGG;DGGGS(配列番号71);TGEKP(配列番号72)(例えば、Liuら、PNAS 5525-5530(1997年)を参照されたい);GGRR(配列番号73)(Pomerantzら1995年、上記);(GGGGS)n、ここで=1,2,3,4または5(配列番号74)(Kimら、PNAS 93、1156-1160(1996年);EGKSSGSGSGSESKVD(配列番号75)(Chaudhary et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070);KESGSVSSEQLAQFRSLD(配列番号76)(Birdら、1988年、Science 242:423-426)、GGRRGGGS(配列番号77);LRQRDGERP(配列番号78);LRQKDGGGSERP(配列番号79);LRQKd(GGGS)2ERP(配列番号80)。あるいは、DNA結合部位およびペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータプログラム(Desjarlais & Berg、PNAS 90:2256-2260(1993年)、PNAS 91:11099-11103(1994年)またはファージディスプレイ法によって、フレキシブルリンカーを合理的に設計することができる。一実施形態において、リンカーは、以下のアミノ酸配列を含む:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(配列番号81)(Cooperら、Blood、101(4):1637-1644(2003年))。
3.スペーサードメイン
特定の実施形態において、CARの結合ドメインの後には、一つ以上の「スペーサードメイン」が続き、これは、適切な細胞/細胞接触、抗原結合および活性化を可能にするために抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から遠ざける領域を指す(Patelら、Gene Therapy、1999年;6:412-419)。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。ある実施形態では、スペーサードメインは、一つまたは複数の重鎖定常領域、例えばCH2およびCH3などを含む免疫グロブリン部分である。スペーサードメインは、天然発生型免疫グロブリンヒンジ領域、又は改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでもよい。
特定の実施形態において、CARの結合ドメインの後には、一つ以上の「スペーサードメイン」が続き、これは、適切な細胞/細胞接触、抗原結合および活性化を可能にするために抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から遠ざける領域を指す(Patelら、Gene Therapy、1999年;6:412-419)。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。ある実施形態では、スペーサードメインは、一つまたは複数の重鎖定常領域、例えばCH2およびCH3などを含む免疫グロブリン部分である。スペーサードメインは、天然発生型免疫グロブリンヒンジ領域、又は改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでもよい。
一実施形態において、スペーサードメインは、IgG1、IgG2、もしくはIgG4のCH2およびCH3ドメイン、またはそれらの適切な組合せを含む。
4.ヒンジドメイン
CARの結合ドメインの後には、一般に一つ以上の「ヒンジドメイン」が続き、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して配置し、ヒンジドメインは、適切な細胞/細胞接触、抗原結合および活性化を可能にする役割を果たす。CARは、一般的に、結合ドメインと膜貫通ドメイン(TM)の間の一つまたは複数のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然発生型免疫グロブリンヒンジ領域、又は改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでもよい。
CARの結合ドメインの後には、一般に一つ以上の「ヒンジドメイン」が続き、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して配置し、ヒンジドメインは、適切な細胞/細胞接触、抗原結合および活性化を可能にする役割を果たす。CARは、一般的に、結合ドメインと膜貫通ドメイン(TM)の間の一つまたは複数のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然発生型免疫グロブリンヒンジ領域、又は改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでもよい。
本明細書で企図されるCARにおける使用に適した例示的なヒンジドメインは、CD8α、CD4、CD28およびCD7を含むがこれらに限定されない1型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含み、これらはこれらの分子由来の野生型ヒンジ領域であってもよく、または改変されていてもよい。一実施形態では、ヒンジは、PD-1ヒンジ又はCD152ヒンジである。別の実施形態において、ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロビンヒンジ領域、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4ヒンジまたはそれらの適切な組合せを含む。別の実施形態では、ヒンジドメインは、IgG1ヒンジ/CH2/CH3、IgG1ヒンジ/CH3/ヒンジ/M1、IgG4ヒンジ/CH2/CH3、又はIgG4ヒンジ/CH2を含む。
様々な実施形態において、本明細書で企図されるCARは、改変されたヒンジ領域を含む。本明細書において使用される場合、用語「改変されたヒンジ領域」、「改変されたヒンジ領域」、および「改変されたヒンジドメイン」は互換的に使用され、(a)最大30%のアミノ酸変化(例えば、最大25%、20%、15%、10%、または5%のアミノ酸置換または欠失)を有する天然に存在するヒンジ領域、(b)少なくとも10個のアミノ酸である天然に存在するヒンジ領域の一部(例えば、少なくとも12、13、14または15個のアミノ酸)の長さで、最大30%のアミノ酸変化(例えば、最大25%、20%、15%、10%、または5%のアミノ酸置換または欠失)、または(c)コアヒンジ領域を含む天然に存在するヒンジ領域の一部(これは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、もしくは15、または少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、もしくは15アミノ酸長)。
様々な実施形態において、改変されたヒンジ領域は、本明細書において企図される、および/または当該技術分野において公知の適切なヒンジドメイン/領域に対して、少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99% のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で企図されるヒンジ配列を含む改変ヒンジ領域は、4個以下、3個以下の、または2個以下のアミノ酸置換および/または欠失を有する。
特定の実施形態にいおいて、天然に存在するヒンジ領域/ドメインにおける一つ以上のシステイン残基は、改変されたヒンジドメインを生成するために一つ以上の他のアミノ酸残基によって置換され得る。いくつかの実施形態では、修飾ヒンジドメインは、セリン又はアラニンで置換された一つ以上のシステイン残基を含む。別の実施形態では、修飾ヒンジドメインは、セリンで置換された一つ以上のシステイン残基を含む。別の実施形態において、改変されたヒンジドメインは、アラニンで置換された一つ以上のシステイン残基を含む。
特定の実施形態において、改変されたヒンジ領域は、別のアミノ酸残基(例えば、セリン残基)によるプロリン残基の置換を含む。
5.膜貫通(TM)ドメイン
「膜貫通ドメイン」とは、細胞外結合部分と細胞内シグナル伝達ドメインとを融合し、CARを免疫エフェクター細胞の形質膜に固定するCARの部分である。TMドメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。TMドメインは、T細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、およびPD1に由来する(すなわち、少なくともの膜貫通領域を含む)ことができる。特定の実施形態では、TMドメインは合成であり、主にロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む。
「膜貫通ドメイン」とは、細胞外結合部分と細胞内シグナル伝達ドメインとを融合し、CARを免疫エフェクター細胞の形質膜に固定するCARの部分である。TMドメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。TMドメインは、T細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、およびPD1に由来する(すなわち、少なくともの膜貫通領域を含む)ことができる。特定の実施形態では、TMドメインは合成であり、主にロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む。
一実施形態において、CARは、PD1、CD152、CD28、またはCD8αに由来するTMドメインを含む。別の実施形態では、CARは、PD1、CD152、CD28、またはCD8αに由来するTMドメインと、短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーとを含み、好ましくは、場合によっては、TMドメインとCARの細胞内シグナル伝達または共刺激ドメインとを連結する長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸の間であってもよい。グリシン-セリンベースのリンカーは、特に好適なリンカーを提供する。
6.細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態において、本明細書で企図されるCARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、ヒトBCMAポリペプチドに結合する有効なBCMA CARのメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達してエフェクター細胞機能を誘発することに関与するCARの部分を指し、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖および細胞傷害活性、CAR結合標的細胞への細胞傷害因子の放出を含み、または細胞外CARドメインに結合する抗原で誘発される他の細胞応答がある。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるCARは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、ヒトBCMAポリペプチドに結合する有効なBCMA CARのメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達してエフェクター細胞機能を誘発することに関与するCARの部分を指し、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖および細胞傷害活性、CAR結合標的細胞への細胞傷害因子の放出を含み、または細胞外CARドメインに結合する抗原で誘発される他の細胞応答がある。
「エフェクター機能」という用語は、免疫エフェクター細胞の専門的な機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルプ又は活性であってもよい。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に専門化機能を行うよう指向するタンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメインの全体が採用され得るが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される程度まで、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを形質導入する限り、ドメイン全体の代わりに使用され得る。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
TCRによって生成されたシグナル単独ではT細胞の完全な活性化に不十分であり、二次的すなわち共刺激性のシグナルも必要であることが知られている。したがって、T細胞活性化は、二つの明確に異なるクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン、すなわち、TCR(例えば、TCR/CD3複合体)によって抗原依存性一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメインと、抗原依存様式で作用して二次的すなわち共刺激性のシグナルを提供する共刺激シグナル伝達ドメインとによって媒介されると言うことができる。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるCARは、一つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激方法又は阻害方法のいずれかで、TCR複合体の一次活性化を調節する。刺激性に作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)又はITAMとして知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明において特に使用される一次シグナル伝達ドメインを含むITAMの例示的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが挙げられる。特に好ましい実施形態では、CARは、CD3ζ一次シグナル伝達ドメイン及び一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に連結され得る。
本明細書で企図されるCARは、CAR受容体を発現するT細胞の有効性および増殖を増強するための一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」又は「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原に結合するとTリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要とされる第二のシグナルを提供する、抗原受容体又はFc受容体以外の細胞表面分子である。このような共刺激分子の例示的な例として、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、およびZAP70が挙げられる。
一実施形態において、CARは、CD28、CD137、CD134およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインからなる群から選択される一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
別の実施形態において、CARは、CD28およびCD137共刺激シグナル伝達ドメインならびにCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
さらに別の実施形態において、CARは、CD28およびCD134共刺激シグナル伝達ドメインならびにCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、CARは、CD137およびCD134共刺激シグナル伝達ドメインとCD3ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
E.CARの例示的な実施形態
一実施形態において、CARは、抗原に結合する抗体またはその抗原特異的結合断片、ヒンジ領域と、膜貫通ドメインと、共刺激分子からの一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、および一次シグナル伝達ドメインと、を含む。特定の実施形態において、本明細書で企図されるCARは、B細胞上に発現されるBCMAポリペプチドに特異的に結合する抗BCMA抗体またはその抗原結合断片を含む。
一実施形態において、CARは、抗原に結合する抗体またはその抗原特異的結合断片、ヒンジ領域と、膜貫通ドメインと、共刺激分子からの一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、および一次シグナル伝達ドメインと、を含む。特定の実施形態において、本明細書で企図されるCARは、B細胞上に発現されるBCMAポリペプチドに特異的に結合する抗BCMA抗体またはその抗原結合断片を含む。
一実施形態において、CARは、BCMAポリペプチドに結合する抗BCMA scFv;スペーサーまたはヒンジドメイン;以下からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン:T細胞受容体のα、βまたはゼータ鎖、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、およびPD1;以下からなる群より選択される共刺激分子からの一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン:TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(アイコス)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、TNFR2、およびZAP70;ならびにTCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dからの一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、CARは、BCMAポリペプチドに結合する抗BCMA scFv;以下からなる群から選択されるスペーサードメインまたはヒンジドメイン:CD8αヒンジ、CD4ヒンジ、CD28ヒンジ、CD7ヒンジ、PD-1ヒンジ、CD152ヒンジ、IgG1ヒンジ、IgG2ヒンジ、IgG3ヒンジ、IgG4ヒンジ、IgG1ヒンジ/CH2/CH3、IgG1ヒンジ/CH3/ヒンジ/M1、IgG4ヒンジ/CH2/CH3、またはIgG4ヒンジ/CH2;以下からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン:T細胞受容体のα、βまたはゼータ鎖、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、およびPD1;以下からなる群より選択される共刺激分子からの一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン:TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(アイコス)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、TNFR2、およびZAP70;ならびにTCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dからの一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、CARは、BCMAポリペプチドに結合する抗BCMA scFv;以下からなる群から選択されるヒンジドメイン:CD8αヒンジ、CD4ヒンジ、CD28ヒンジ、CD7ヒンジ、PD-1ヒンジ、CD152ヒンジ、IgG1ヒンジ、IgG2ヒンジ、IgG3ヒンジ、IgG4ヒンジ、IgG1ヒンジ/CH2/CH3、IgG1ヒンジ/CH3/ヒンジ/M1、IgG4ヒンジ/CH2/CH3、またはIgG4ヒンジ/CH2;以下からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン:T細胞受容体のα、βまたはゼータ鎖、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、およびPD1;TMドメインをCARの細胞内シグナル伝達ドメインに連結させる、好ましくは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10アミノ酸長の、短オリゴリンカー又はポリペプチドリンカーと、以下からなる群より選択される共刺激分子からの一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン:TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(アイコス)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、TNFR2、およびZAP70;ならびにTCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dからの一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、CARは、BCMAポリペプチドに結合する抗BCMA scFv、IgG2および/またはIgG4ヒンジ/CH2/CH3ポリペプチドの一つ以上の断片を含むスペーサードメイン、CD28膜貫通ドメイン、CD137細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、CD3ζ一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
特定の実施形態では、CARは、BCMAポリペプチドに結合する抗BCMA scFv、IgG1ヒンジ/CH2/CH3ポリペプチドおよびCD8αポリペプチドを含むヒンジドメインと、約3~約10個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むCD8α膜貫通ドメイン、CD137細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、CD3ζ一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
特定の実施形態では、CARは、BCMAポリペプチドに結合する抗BCMA scFv、CD8αポリペプチドを含むヒンジドメインと、約3~約10個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むCD8α膜貫通ドメイン、CD134細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、CD3ζ一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
特定の実施形態では、CARは、BCMAポリペプチドに結合する抗BCMA scFv、CD8αポリペプチドを含むヒンジドメインと、約3~約10個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むCD8α膜貫通ドメイン、CD28細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、CD3ζ一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
さらに、本明細書で企図されるCARの設計は、非改変T細胞または他のCARを発現するように改変されたT細胞と比較して、CARを発現するT細胞における改善された増殖、長期持続性、および認容できる細胞傷害性を可能にする。
様々な実施形態において、本明細書に開示される養子細胞療法の改善された組成物および方法は、BCMAを発現する細胞を標的とし、ヒト由来の抗原結合ドメインを有し、改善されたサイトカイン放出、および低い抗原非依存性シグナル伝達を示す遺伝子改変免疫エフェクター細胞(例えば、CAR T細胞)を提供する。
特定の実施形態では、改良されたCAR T細胞は、BCMA発現細胞との共培養において高いIFNγ放出を示す。いくつかの実施形態において、改善されたCAR T細胞は、CARがマウス由来の抗BCMA scFvを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じCART細胞と比較して、BCMA発現細胞との共培養において類似またはより高いIFNγ放出を示す。いくつかの実施形態において、共培養されたBCMA発現細胞は、Daudi細胞および/またはHT1080.BCMA細胞である。
特定の実施形態では、改善されたCAR T細胞は、低い抗原密度(低BCMA発現)細胞との共培養において高いIFNγ放出を示す。細胞または細胞株は、Daudi、HT1080.BCMA、および/またはRPMI-8226細胞よりも少なくとも5倍(例えば、少なくとも10倍、少なくとも5倍、少なくとも15倍、または少なくとも20倍)少ない表面BCMA発現を有する場合、低いBCMA発現を有するものとして特徴付けられる。いくつかの実施形態において、細胞は、同一または類似の培養条件下で培養される。いくつかの実施形態において、低BCMA発現細胞は、Daudi、HT1080.BCMA、および/またはRPMI-8226細胞と比較して、少なくとも5倍少ない表面BCMA発現を有する。いくつかの実施形態において、低BCMA発現細胞は、HT1080.BCMA細胞と比較して、少なくとも10倍少ない表面BCMA発現を有する。いくつかの実施形態において、低BCMA発現細胞は、RPMI-8226細胞と比較して少なくとも10倍少ない表面BCMA発現を有する。タンパク質表面発現を測定するためのアッセイは、当業者に公知である(例えば、FACS分析)。
いくつかの実施形態において、改善されたCAR T細胞は、CARがマウス由来の抗BCMA scFvを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じCART細胞と比較して、低い抗原密度(低BCMA発現)細胞との共培養においてより高いIFNγ放出を示す。いくつかの実施形態において、低BCMA発現細胞は、RL細胞および/またはToledo細胞である。
いくつかの実施形態において、改善されたCAR T細胞は、CARがマウス由来の抗BCMA scFvを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じCAR T細胞と比較してより低い抗原非依存性シグナル伝達を示す。
いくつかの実施形態において、改善されたCAR T細胞は、CARがマウス由来の抗BCMA scFvを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じCAR T細胞と比較してより低い抗原非依存性シグナル伝達を示す。
F.ポリペプチド
本開示は、部分的には、CARポリペプチドおよびその断片、それを含む細胞および組成物、ならびにポリペプチドを発現するベクターを企図する。好ましい実施形態において、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、66、および68に記載される一つ以上のCARを含むポリペプチドが提供される。
本開示は、部分的には、CARポリペプチドおよびその断片、それを含む細胞および組成物、ならびにポリペプチドを発現するベクターを企図する。好ましい実施形態において、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、66、および68に記載される一つ以上のCARを含むポリペプチドが提供される。
「ポリペプチド」「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、反対であることが明記されない限り、従来的な意味、すなわちアミノ酸配列として相互交換可能に使用される。ポリペプチドは特定の長さに限定されず、例えばポリペプチドは、全長タンパク質配列または全長タンパク質の断片を含有してもよく、ポリペプチドは、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのポリペプチドの翻訳後修飾を含んでもよく、ならびに当分野に公知の天然および非天然の他の修飾を含んでもよい。様々な実施形態において、本明細書で企図されるCARポリペプチドは、タンパク質のN末端におけるシグナル(またはリーダー)配列を含み、これは、タンパク質の共翻訳的または翻訳後伝達を指示する。本明細書に開示されるCARにおいて有用な好適なシグナル配列の例示的な例には、IgG1重鎖シグナル配列およびCD8αシグナル配列が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドは、様々な周知の組み換え技術および/または合成技術のいずれかを使用して調製され得る。本明細書で企図されるポリペプチドは、本開示のCAR、または本明細書に開示されるCARの一つ以上のアミノ酸からの欠失、付加、および/または置換を有する配列を詳細には包含する。
本明細書において使用される場合、「単離ペプチド」または「単離ポリペプチド」などは、細胞環境からの、および細胞の他の構成要素との会合からの、ペプチド分子またはポリペプチド分子のインビトロでの単離および/または精製を指す。すなわち、インビボでの物質と実質的に関連づけられていない。同様に、「単離細胞」は、インビボ組織または臓器から取得され、細胞外基質を実質的に含まない細胞を指す。
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、一つ以上の置換、欠失、付加、及び/又は挿入により、天然発生型ポリペプチドとは異なっている場合がある。そうしたバリアントは、天然であってもよく、または例えば上述のポリペプチド配列の一つ以上を改変することにより合成的に生成されてもよい。例えば特定の実施形態では、一つ以上の置換、欠失、付加および/または挿入を結合ドメイン、ヒンジ、TMドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインまたはCARポリペプチドの一次シグナル伝達ドメインに導入することにより、CARの結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。好ましくは、本明細書で企図されるポリペプチドは、それらに対して少なくとも約65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%、または99%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
ポリペプチドには「ポリペプチド断片」が含まれる。ポリペプチド断片は、天然に存在するまたは組換え的に産生されたポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および/または内部欠失もしくは置換を有する、単量体または多量体であり得るポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも5~約500アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、又は450アミノ酸長である。特に有用なポリペプチド断片は、抗原結合ドメイン又は抗体の断片を含む機能性ドメインを含む。マウス抗BCMA抗体の場合、有用な断片としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:CDR領域、重鎖または軽鎖のCDR3領域、重鎖または軽鎖可変領域、二つのCDRを含む抗体鎖または可変領域の一部、など。
ポリペプチドはまた、ポリペプチド(例えば、ポリ-His)の合成、精製、または同定の容易さのために、または固体支持体へのポリペプチドの結合を増強するために、インフレームで融合されてもよく、またはリンカーもしくは他の配列に結合されてもよい。
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断および挿入を含む、様々な方法で改変されてもよい。そうした操作のための方法は、当分野において一般的に公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、DNA中の変異により作製され得る。変異誘導およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当分野に公知である。例えば、Kunkel(1985、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:488-492)、Kunkelら、(1987、Methods in Enzymol、154:367-382)、米国特許第4,873,192号、Watson、J.D.ら、(Molecular Biology of the Gene、Fourth Edition、Benjamin/Cummings、Menlo Park、Calif.、1987)、およびそれらにおいて引用される参照文献を参照のこと。対象となるタンパク質の生物活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Dayhoffら、(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.、Washington、D.C.)のモデルに見出され得る。
特定の実施形態では、バリアントは保存的置換を含む。「保存的置換」は、アミノ酸が、類似した性能を有する別のアミノ酸に置換される置換であり、ペプチド化学分野の当業者であれば、そうした置換によって、ポリペプチドの二次構造及び疎水親水的性質が実質的に変化しないと予測するであろう。改変は、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において行われ得、依然として所望の特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子を得ることができる。本明細書で企図されるような等価な、または改善されたバリアントポリペプチドを作成するためにポリペプチドのアミノ酸配列を改変することが望まれる場合、当業者は、例えば、例えば表1に従って、コードDNA配列の一つ以上のコドンを変更させることができる。
生物学的活性を消失させることなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失させることができるかを決定する際の指針は、DNASTARTMソフトウェアなどの当技術分野で周知のコンピュータプログラムを使用して見出すことができる。本明細書に開示されるタンパク質バリアント中のアミノ酸の変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち類似した荷電アミノ酸、または非荷電アミノ酸の置換であることが好ましい。保存的アミノ酸変化には、その側鎖で関連付けられているアミノ酸ファミリーの一つの置換を含む。天然アミノ酸は一般的に以下の四つのファミリーに分けられる:酸性アミノ酸(アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性アミノ酸(リシン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性アミノ酸(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、及び非荷電極性アミノ酸(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン)。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、合わせて芳香族アミノ酸として分類される場合もある。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適切な保存的置換は当業者に公知であり、一般的に得られる分子の生物活性を変化させることなく行うことができる。当業者であれば、ポリペプチドの非必須領域中の一アミノ酸置換は概して、生物活性を大きくは変化させないと認識している(例えば、Watsonら Molecular Biology of the Gene、4th Edition、1987、The Benjamin/Cummings Pub.Co.、p.224を参照のこと)。例示的な保存的置換は、米国仮特許出願第61/241,647号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
そのような変更を行う際には、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する上でのヒドロパシー性アミノ酸指数の重要性は、当該技術分野において一般的に理解されている(Kyte and Doolittle、1982年、参照により本明細書に組み込まれる)。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている(Kyte and Doolittle、1982年)。これらの値は、以下である:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/システイン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(-0.4);トレオニン(-0.7);セリン(-0.8);トリプトファン(-0.9);チロシン(-1.3);プロリン(-1.6);ヒスチジン(-3.2);グルタミン酸(-3.5);グルタミン(-3.5);アスパラギン酸(-3.5);アスパラギン(-3.5);リジン(-3.9);およびアルギニン(-4.5)。
特定のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、依然として類似の生物学的活性を有するタンパク質をもたらすこと、すなわち、依然として生物学的に機能的に等価なタンパク質を得ることが当該技術分野において公知である。このような変更を行う際には、疎水性親水性指標が±2以内のアミノ酸の置換が好ましく、±1内のアミノ酸が特に好ましく、±0.5以内のアミノ酸がさらに特に好ましい。類似のアミノ酸の置換は親水性に基づいて効果的に行うことができることも当技術分野において理解される。
米国特許第4,554,101号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン(+3.0);リジン(+3.0);アスパラギン酸(+3.0±1);グルタミン酸(+3.0±1);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0)、トレオニン(-0.4);プロリン(-0.5±1);アラニン(-0.5);ヒスチジン(-0.5);システイン(-1.0);メチオニン(-1.3);バリン(-1.5);ロイシン(-1.8);イソロイシン(-1.8);チロシン(-2.3);フェニルアラニン(-2.5);トリプトファン(-3.4)。アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換することができ、それでも生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なタンパク質を得ることができることが理解される。このような変化において、親水性値が±2以内のアミノ酸の置換が好ましく、±1内のアミノ酸が特に好ましく、±0.5以内のアミノ酸がさらに特に好ましい。
上述のように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなどの相対的類似性に基づいてもよい。
ポリペプチドバリアントにはさらに、グリコシル化形態、他の分子との凝集コンジュゲート、および無関係な化学部分(例えば、ペグ化分子)との共有結合コンジュゲートが含まれる。共有結合バリアントは、当該技術分野で既知であるように、アミノ酸鎖中、又はN末端残基若しくはC末端残基中に存在する基に機能性を連結することによって調製することができる。バリアントにはまた、対立遺伝子バリアント、種バリアント、及び変異タンパク質が含まれる。タンパク質の機能的活性に影響を与えない領域の切断又は欠失もバリアントである。
一実施形態において、二つ以上のポリペプチドの発現が望まれる場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の他の箇所で論じるようなIRES配列によって分離することができる。別の実施形態において、二つ以上のポリペプチドは、一つ以上の自己切断ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。
本開示のポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、融合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えばCARが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質とは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10個以上のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。融合ポリペプチドは、典型的には、C末端からN末端に連結されているが、それらは、C末端からC末端に、N末端からN末端に、又はN末端からC末端に連結されてもよい。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序又は指定された順序であってもよい。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の転写活性が維持される限り、保存的に改変された変異体、多型変異体、対立遺伝子、変異体、サブ配列、および種間相同体を含むこともできる。融合ポリペプチドは、化学合成法により、または二つの部分の間の化学的結合により作製されてもよく、または他の標準的な方法を使用して一般的に調製されてもよい。融合ポリペプチドを含む連結されたDNA配列は、本明細書の他の箇所で論じるように適切な転写または翻訳制御エレメントに作動可能に連結される。
一実施形態において、融合パートナーは、天然の組換えタンパク質よりも高い収率でタンパク質(発現エンハンサー)を発現するのを補助する配列を含む。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解性を増加させるように、またはタンパク質が所望の細胞内区画に標的化されることを可能にするように、または細胞膜を通じて融合タンパク質の輸送を容易にするように選択され得る。
融合ポリペプチドは、本明細書で企図されるポリペプチドドメインの各々間のポリペプチド切断シグナルをさらに含み得る。なお、ポリペプチド部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルとしては、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位(例えば、まれな制限酵素認識部位、自己切断リボザイム認識部位)、および自己切断ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が挙げられる(deFelipe and Ryan,2004年、Traffic、5(8);616-26を参照のこと)。
適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは、当業者に公知である(例えば、Ryan et al.,1997.J.Gener.Virol.78,699-722;Scymczak et al.(2004)Nature Biotech.5,589-594を参照のこと)。プロテアーゼ切断部位の例としては限定されないが、ポティウイルスNIaプロテアーゼ(例えばタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ)、ポティウイルスHCプロテアーゼ、ポティウイルスP1(P35)プロテアーゼ、ビオウイルス(byovirus)NIaプロテアーゼ、ビオウイルスRNA-2-コードプロテアーゼ、アフトウイルスLプロテアーゼ、エンテロウイルス2Aプロテアーゼ、ライノウイルス2Aプロテアーゼ、ピコルナ3Cプロテアーゼ、コモウイルス24Kプロテアーゼ、ネポウイルス24Kプロテアーゼ、RTSV(ワイカウイルス)3C様プロテアーゼ、PYVF(パースニップ黄斑ウイルス)3C様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Xa因子、およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられる。その高い切断ストリンジェンシーのために、TEV(タバコエッチングウイルス)プロテアーゼ切断部位が一実施形態において好ましく、例えば、EXXYXQ(G/S)(配列番号82)、例えば、ENLYFQG(配列番号83)およびENLYFQS(配列番号84)であり、ここでXは任意のアミノ酸を表す(TEVによる切断はQとGまたはQとSの間で起こる)。
特定の実施形態において、ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピング配列である。
リボソームスキッピング配列の例示的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:2Aまたは2A様部位、配列またはドメイン(Donnellyら、2001年J.Gen.Virol.82:1027-1041)。特定の実施形態では、ウイルス2Aペプチドは、アフトウイルス2Aペプチド、ポティウイルス2Aペプチド、またはカルジオウイルス2Aペプチドである。
一実施形態では、ウイルス2Aペプチドは、口蹄疫ウイルス(FMDV)2Aペプチド、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)2Aペプチド、ゾセアアシグナウイルス(TaV)2Aペプチド、ブタテスコウイルス-1(PTV-1)2Aペプチド、タイロウイルス2Aペプチド、および脳心筋炎ウイルス2Aペプチドからなる群から選択される。
好ましい実施形態において、本明細書で企図されるポリペプチドは、CARポリペプチドを含む。
G.ポリヌクレオチド
好ましい実施形態において、一つ以上のCARポリペプチド、例えば配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、65、および67をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、66、および68のいずれかに記載されるアミノ酸配列をコードする。
好ましい実施形態において、一つ以上のCARポリペプチド、例えば配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、65、および67をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、66、および68のいずれかに記載されるアミノ酸配列をコードする。
他の実施形態において、抗BMCA CARをコードするポリヌクレオチド、抗体、またはその断片が提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号1~3、9~11、17~19、25~27、33~35または41~43に記載される可変軽鎖CDRL1、CDRL2、およびCDRL3配列、ならびに/または配列番号4~6、12~14、20~22、28~30、36~38または44~46に記載される可変重鎖CDRH1、CDRH2およびCDRH3配列を含む抗BMCA CAR、抗体またはその断片をコードする。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号7、15、23、31、39、または47のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗BMCA CAR、抗体、またはその断片をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号8、16、24、32、40または48のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗BMCA CAR、抗体、またはその断片をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号7、15、23、31、39、または47のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖と、配列番号8、16、24、32、40、または48のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む抗BMCA CAR、抗体、またはその断片をコードする。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、及びDNA/RNAハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってもよく、かつ組換え、合成、又は単離のいずれかであってもよい。ポリヌクレオチドには、これらに限定されないが、プレメッセンジャーRNA(プレmRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、RNA、ゲノムDNA(gDNA)、PCR増幅DNA、相補的DNA(cDNA)、合成DNA、又は組換えDNAが含まれる。ポリヌクレオチドとは、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも5000、少なくとも10000、または少なくとも15000以上のヌクレオチドの長さのヌクレオチドの多量体型を指し、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかタイプのヌクレオチドの改変型、ならびにすべての中間の長さのものを指す。本文脈において、「中間の長さ」とは、例えば、6、7、8、9など、101、102、103など、151、152、153など、201、202、203などの引用されている値の間の任意の長さを意味すると、容易に理解されるであろう。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対し、少なくとも、もしくは約50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%,76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。
本明細書において使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、断片に通常隣接している配列から除去されたDNA断片を指す。特定の実施形態では、「単離されたポリヌクレオチド」はまた、自然界には存在せず、人為的に作製された、相補的DNA(cDNA)、組換えDNA、又は他のポリヌクレオチドも指す。特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチド、半合成ポリヌクレオチド、または組み換え源から取得された、もしくは誘導されたポリヌクレオチドである。
様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするmRNAを含有する。ある実施形態では、mRNAは、キャップ、一つ以上のヌクレオチド、そしてポリ(A)尾部を含有する。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されてもよい。本明細書で使用される場合、「コドン最適化」という用語は、ポリペプチドの発現、安定性、及び/又は活性を増加させるためにポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中のコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響を及ぼす因子としては限定されないが、以下のうちの一つ以上が挙げられる:(i)二つ以上の生物体または遺伝子または合成構築されたバイアステーブルの間のコドンバイアスの変動、(ii)生物体、遺伝子または遺伝子セット内のコドンバイアスの程度の変動、(iii)コンテキストを含むコドンの体系的変動、(iv)その解読tRNAに伴うコドンの変動、(v)三つ組全体または三つ組の一つの位置のいずれかのGC%に伴うコドンの変動、(vi)例えば天然配列などの参照配列に対する類似性における変動、(vii)コドン頻度のカットオフにおける変動、(viii)DNA配列から転写されたmRNAの構造的性質、(ix)コドン置換セットの設計の基礎となるDNA配列の機能に関する予備知識、(x)各アミノ酸に対するコドンセットの合成的変動、および/または(xi)誤った翻訳開始位置の分離された除去。
本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と相当の配列同一性を呈するポリヌクレオチド、または本明細書において規定されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、一つ以上のヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドに比べて、付加若しくは欠失若しくは異なるヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドを含む。この点に関し、当分野において、参照ポリヌクレオチドに対し、変異、付加、欠失および置換を含むある変更が為され、変更されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または生物活性を保持し得ると理解されている。
ポリヌクレオチドバリアントは、生物学的に活性なポリペプチド断片またはバリアントをコードするポリヌクレオチド断片が含まれる。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド断片」という用語は、少なくとも100%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%、少なくとも40%、少なくとも30%、少なくとも20%、少なくとも10%、又は少なくとも5%の天然発生型ポリペプチド活性を保持するポリペプチドをコードする、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700以上のヌクレオチド長のポリヌクレオチド断片を指す。ポリヌクレオチド断片はアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、カルボキシ末端欠失、及び/若しくは内部欠失又は天然発生型若しくは組換え産生ポリペプチドの一つ以上のアミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
「配列同一性」、又は例えば「~に対して50%同一の配列」を含む、という文章は、本明細書において使用される場合、比較ウィンドウ上で配列が、ヌクレオチドごとで同一である、又はアミノ酸ごとで同一である程度を指す。ゆえに「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウ上の二つの最適アライメント配列を比較すること、同一核酸塩基(例えばA、T、C、G、I)または同一アミノ酸残基(例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、CysおよびMet)が、両方の配列中に存在する位置の数を決定して、合致位置数を算出すること、合致位置数を、比較ウィンドウ中の総位置数(すなわちウィンドウサイズ)で割ること、および結果に100を掛けて、配列同一性の百分率を算出すること、により計算されてもよい。本明細書で企図される参照配列のいずれかに対して、少なくとも約50%、55%、60%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、86%、97%、98%、または99%の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、典型的には、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を維持する。
二つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列関係を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、及び「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、長さが、少なくとも12個の単量体単位であり、多くの場合、15~18個の単量体単位であり、多くの場合、少なくとも25個の単量体単位である、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含む。二つのポリヌクレオチドはそれぞれ、(1)二つのポリヌクレオチド間で類似する配列(すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ)、および(2)二つのポリヌクレオチド間で発散する配列を含んでもよく、二つの(またはそれ以上の)ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために、二つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」で比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、少なくとも6個の連続する位置、通常は、約50~約100、より一般的には約100~約150の概念セグメントを指し、配列は、二つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続する位置の参照配列と比較される。比較ウィンドウは、二つの配列の最適なアライメントのため、参照配列(付加または欠失を含まない)と比較して約20%以下の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含みうる。比較ウィンドウを整列するための配列の最適なアラインメントは、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group、575 Science Drive Madison、WI、USAにおけるアルゴリズム(GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)のコンピュータ化実行によって、または選択された様々な方法のいずれかによって生成される検査および最良のアラインメント(すなわち、比較ウィンドウにわたり最も高い相同性をもたらす)によって行われ得る。例えば、Altschulら、1997、Nucl.Acids Res.25:3389により開示されるプログラムのBLASTファミリーを参照されたい。配列解析の詳細な考察は、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons Inc.、1994~1998年、第15章のユニット19.3に見ることができる。
ポリヌクレオチドの方向性を記載する用語には、5’(通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端)および3’(通常、遊離ヒドロキシル(OH)基を有するポリヌクレオチドの末端)が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、5’から3’の配向又は3’から5’の配向で注釈付けされ得る。DNA及びmRNAについて、5’から3’の鎖は、その配列が、プレメッセンジャー(プレmRNA)の配列と同一であるために、「センス」鎖、「プラス」鎖、又は「コード」鎖と指定される[DNA中のチミン(T)の代わりに、RNA中のウラシル(U)を除く]。DNA及びmRNAについては、RNAポリメラーゼによって転写された鎖である相補的な3’から5’鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、又は「非コード」鎖として指定される。本明細書で使用される場合、用語「逆配向」は、3’~5’配向に書かれた5’~3’配列、または5’~3’方向に書かれた3’~5’配列を指す。
用語「相補的」および「相補性」は、塩基対形成規則によって関連付けられるポリヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチドの配列)を指す。例えば、DNA配列5’AGTCATG3’の相補鎖は、3’TCAGTAC5’である。後者の配列は、しばしば、5’末端が左に、3’末端が右にある、5’ C A T G A C T 3’、逆相補体として記載される。その逆相補鎖と等しい配列は、パリンドローム配列であると言われる。相補性は、核酸塩基の一部のみが塩基対合規則に従って一致する、「部分的」であり得る。又は、核酸間には、「完全」又は「総合的な」相補性が存在し得る。
さらに、遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書で企図されるようなポリペプチドまたはそのバリアントの断片をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者に理解される。これらポリヌクレオチドのうちのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して、最小の相同性を担持する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差異によって変化するポリヌクレオチドが企図され、特定の実施形態では、例えば、ヒト及び/又は霊長類のコドン選択に最適化されたポリヌクレオチドが企図される。更に、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も使用され得る。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および/または置換など、一つまたは複数の変異の結果として改変される内在性遺伝子である。
本明細書において使用される場合、「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、RNAを発現し、その後にポリペプチドを発現することができるベクター中の遺伝子配列を指す。一つの実施形態では、核酸カセットは、対象となる遺伝子、例えば対象となるポリヌクレオチドを含有する。別の実施形態では、核酸カセットは、一つまたは複数の発現制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリ(A)配列、および例えば対象となるポリヌクレオチドなどの対象となる遺伝子を含有する。ベクターは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、ベクター内で位置的に、そして連続的に方向付けられる。それにより、カセット中の核酸はRNAに転写されることができ、必要な場合にはタンパク質またはポリペプチドへと翻訳され、形質転換細胞での活動に必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画に標的化されることで生物活性に適した区画へと移行され、または細胞外区画へと分泌されることができる。カセットは、ベクター内への即時の挿入に適合された3’末端および5’末端を有することが好ましく、例えば各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有している。好ましい実施形態において、核酸カセットはCARをコードする。カセットは取り出され、そして単一ユニットとしてプラスミドまたはウイルスベクター内に挿入されることができる。
ポリヌクレオチドは、対象となるポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「対象のポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチド、ポリペプチドバリアント、又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。ベクターは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の目的のポリヌクレオチドを含んでもよい。ある特定の実施形態では、対象のポリヌクレオチドは、疾患又は傷害の治療又は予防において治療効果を提供するポリペプチドをコードする。対象のポリヌクレオチド、及びそれからコードされるポリペプチドは、野生型ポリペプチド、並びに機能的バリアント及び断片をコードする両方のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、対応する野生型参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対して、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の同一性を有する。特定の実施形態では、機能的バリアントまたは断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物活性の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%を有する。
本明細書において想定されるポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書の他の箇所に開示されるか当該技術分野で知られている、プロモーターおよび/またはエンハンサー、非翻訳領域(UTR)、シグナル配列、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位(IRES)、リコンビナーゼ認識部位(例えば、LoxP、FRT、およびAtt部位)、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のDNA配列と組み合わされてもよく、その結果、それらの全体的な長さが大幅に変動してもよい。したがって、ほぼ任意の長さのポリヌクレオチド断片が特定の実施形態で使用されてもよく、全長は、意図される組み換えDNAプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限されることが好ましい。
ポリヌクレオチドは、当分野で公知および利用可能な様々な確立された技術のいずれかを使用して調製され、操作され、および/または発現されてもよい。所望のポリペプチドを発現するために、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切なベクターに挿入されてもよい。
ベクターの例示としては限定されないが、プラスミド、自己複製配列、および転位因子、例えば、piggyBac、Sleeping Beauty、Mos1、Tc1/mariner、Tol2、mini-Tol2、Tc3、MuA、Himar I、Frog Princeおよびその誘導体が挙げられる。
ベクターの追加的な例示としては限定されないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、例えば酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、またはP1由来人工染色体(PAC)などの人工染色体、例えばラムダファージまたはM13ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。
ベクターとして有用なウイルスの例示としては限定されないが、レトロウイルス(レンチウイルスを含む)、アデノウイルス、アデノ随伴型ウイルス、ヘルペスウイルス(例えば単純ヘルペスウイルス)、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス(例えばSV40)が挙げられる。
発現ベクターの例示としては限定されないが、哺乳動物細胞における発現用のpClneoベクター(Promega社)、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス介在性の遺伝子導入および発現のためのpLenti4/V5-DEST(商標)、pLenti6/V5-DEST(商標)、およびpLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen社)が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞でのポリペプチドの発現のために、そうした発現ベクター内にライゲートされてもよい。
一実施形態において、本明細書で企図されるCARをコードするベクターは、配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、65、および67に記載のポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、ベクターは、エピソームベクター、又は染色体外で維持されるベクターである。本明細書において使用される場合、「エピソーム性」という用語は、宿主の染色体DNAに統合されることなく複製することができるベクターであり、宿主細胞の分裂により徐々に減少することがないということは、当該ベクターが染色体外で、またはエピソーム性に複製することも意味している。
発現ベクター中に存在する「制御要素」、「制御配列」は、ベクターの非翻訳領域であり、複製起源、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル(Shine Dalgarno配列またはKozak配列)、イントロン、ポリアデニル化配列、5’および3’の非翻訳領域が挙げられ、宿主の細胞タンパク質と相互作用して、転写と翻訳を実行する。そうした因子は、その強度および特異性を変化させてもよい。利用するベクターシステムおよび宿主に応じて、ユビキタスプロモーターおよび誘導性プロモーターをはじめとする任意の数の適切な転写因子および翻訳因子を使用してもよい。
特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターおよびウイルスベクターを含むが、これに限定されないが、プロモーターおよび/またはエンハンサーなどの外因性、内因性、または異種制御配列を含む。「内因性」制御配列は、ゲノム中で所与の遺伝子と自然に連結される配列である。「外因性」制御配列は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー/プロモーターによって指向されるように、遺伝子操作の手段(すなわち、分子生物学的技法)によって遺伝子と並立に配置されるものである。「異種」制御配列は、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。
本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、RNAポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)の認識部位を指す。RNAポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始及び転写する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞で動作するプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ25~30塩基上流に位置するAT-リッチ領域、および/または転写開始部位から70~80塩基上流に存在する別の配列であるCNCAAT領域を含有し、式中、Nは任意のヌクレオチドであり得る。
「エンハンサー」という用語は、転写の強化を提供することができる配列を含むDNAセグメントを指し、一部の場合では、別の制御配列に対する方向性に関係なく機能することができる。エンハンサーは、プロモーター及び/又は他のエンハンサーエレメントと協働して、又は相加的に機能することができる。「プロモーター/エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含むDNAセグメントを指す。
「操作可能に連結した」という用語は、記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある並置を意味する。一実施形態では、用語は、核酸発現制御配列(プロモーターおよび/またはエンハンサーなど)と第二のポリヌクレオチド配列、例えば、対象のポリヌクレオチドとの間の機能的結合を指し、ここで、発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。
本明細書において使用される場合、「構造的発現制御配列」という用語は、操作可能に連結された配列の継続的な、または連続的な転写を可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター/エンハンサーを指す。構造的発現制御配列は、様々な細胞型と組織型での発現を可能にする「ユビキタス」なプロモーター、エンハンサー、プロモーター/エンハンサーであってもよく、または限定的な細胞型および組織型での発現を可能にする、それぞれ「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞株特異的」、または「組織特異的」なプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター/エンハンサーであってもよい。
特定の実施形態における使用に適したユビキタス発現制御配列の例示としては限定されないが、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター、ウイルス性シミアンウイルス40(SV40)(例えば初期または後期)、モロニ-マウス白血病ウイルス(MoMLV)LTRプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTR、単純ヘルペスウイルス(HSV)(チミジンキナーゼ)プロモーター、ワクシニアウイルス由来のH5、P7.5およびP11プロモーター、伸長因子1アルファ(EF1a)プロモーター、初期増殖応答タンパク質1(EGR1:early growth response 1)、フェリチンH(FerH)、フェリチンL(FerL)、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素(GAPDH)、真核細胞翻訳開始因子4A1(EIF4A1)、ヒートショック70kDaタンパク質5(HSPA5)、ヒートショックタンパク質90kDa ベータ、メンバー1(HSP90B1)、ヒートショックタンパク質70kDa(HSP70)、β-キネシン(β-KIN)、ヒトROSA 26座位(Irions et al.,Nature Biotechnology 25,1477 - 1482(2007))、ユビキチンCプロモーター(UBC)、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK)プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ-アクチン(CAG)プロモーター、β-アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、ネガティブ制御領域欠失型、dl587revプライマー結合部位置換(MND)U3プロモーター(Haas et al.Journal of Virology.2003;77(17):9439-9450)が挙げられる。
一つの実施形態では、ベクターは、MNDU3プロモーターを含有する。
一つの実施形態では、ベクターは、ヒトEF1a遺伝子の第一イントロンを含むEF1aプロモーターを含有する。
一つの実施形態では、ベクターは、ヒトEF1a遺伝子の第一イントロンを欠くEF1aプロモーターを含有する。
特定の実施形態では、T細胞特異的プロモーター由来のCARを含むポリヌクレオチドを発現させることが望ましい場合がある。
本明細書で使用される場合、「条件付き発現」とは、限定されないが、誘導性発現、抑制性発現、特定の生理学的状態、生物学的状態もしくは疾患状態を有する細胞または組織における発現などをはじめとする任意のタイプの条件付き発現を指す場合がある。この定義は、細胞型特異的または組織特異的な発現を除外することは意図されない。ある実施形態は、対象となるポリヌクレオチドの条件付き発現を提供するものであり、例えば発現は、細胞、組織、生物体を、ポリヌクレオチドが発現される処理または条件、または対象となるポリヌクレオチドにコードされるポリヌクレオチドの発現が増加もしくは減少する処理または条件に曝すことにより制御される。
誘導性プロモーター/システムの例示としては限定されないが、ステロイド誘導性プロモーター、例えばグルココルチコイド受容体またはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター(対応するホルモンの処理で誘導可能)、メタロチオネインプロモーター(様々な重金属の処理で誘導可能)、MX-1プロモーター(インターフェロンで誘導可能)、「GeneSwitch」ミフェプリストン制御性システム(Sirin et al.,2003,Gene,323:67)、クミン酸塩(cumate)誘導性遺伝子スイッチ(WO2002/088346)、テトラサイクリン依存性制御システムなどが挙げられる。
条件付き発現は、部位特異的DNAリコンビナーゼを使用することによっても達成され得る。ある特定の実施形態によれば、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えについて少なくとも一つの(典型的には二つの)部位を含む。本明細書で使用される場合、用語「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」は、一つ以上の組換え部位(例えば、2、3、4、5、7、10、12、15、20、30、50等)を含む組換え反応に関与するexcisiveまたは組込タンパク質、酵素、補助因子または関連タンパク質を含み、野生型タンパク質(Landy,Current Opinion in Biotechnology 3:699-707(1993)を参照のこと)、または変異体、誘導体(例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含む融合タンパク質)、断片およびそのバリアントであってもよい。特定の実施形態での使用に好適なリコンビナーゼの例示的な例には、これらに限定されないが、Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3リゾルバーゼ、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1、及びParAが挙げられる。
ベクターは、広範囲の部位特異的リコンビナーゼのいずれかに対して一つ以上の組換え部位を含んでもよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの統合に必要とされる任意の部位(複数可)に追加されることが理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「組み換え配列」、「組み換え部位」、または「部位特異的組み換え部位」は、リコンビナーゼが認識および結合する特定の核酸配列を指す。
例えば、Creリコンビナーゼの一つの組み換え部位は、8塩基対コア配列に隣接する二つの13塩基対逆位リピート(リコンビナーゼ結合部位として残る)を含む34塩基対配列であるloxPである(Sauer,B.,Current Opinion in Biotechnology 5:521-527(1994)の図1を参照)。他の例示的なloxP部位としては、以下に限定されないが、lox511(Hoess et al.、1996;Bethke and Sauer、1997)、lox5171(Lee and Saito、1998)、lox2272(Lee and Saito、1998)、m2(Langer et al.、2002)、lox71(Albert et al.、1995)、およびlox66(Albert et al.、1995)が挙げられる。
FLPリコンビナーゼの好適な認識部位としては、これらに限定されないが、FRT(McLeodら、1996年)、F1、F2、F3(Schlake and Bode、1994年)、F4、F5(Schlake and Bode、1994年)、FRT(LE)(Senecoffら、1988年)、FRT(RE)(Senecoffら、1988年)が挙げられる。
認識配列のその他の例は、attB、attP、attL、およびattR配列であり、これはリコンビナーゼ酵素のλインテグラーゼ、例えば、phi-c31によって認識される。φC31 SSRは、ヘテロタイプ部位attB(長さ34bp)とattP(長さ39 bp)との間でのみ組換えを媒介する(Grothら、2000年)。attBとattPは、それぞれ細菌ゲノムとファージゲノム上のファージインテグラーゼの付着部位にちなんで名付けられましたが、どちらもφC31ホモ二量体によって結合されている可能性が高い不完全な反転反復を含んでいる(Grothら、2000年)。生成物部位、attLおよびattRは、さらにφC31媒介性組換えに対して効果的に不活性(Belteki et al.,2003)であり、反応を不可逆的にする。挿入を触媒するために、attP部位がゲノムattB部位に挿入するよりもattB担持DNAのほうが容易にゲノムattP部位に挿入されることが見出されている(Thyagarajan et al.,2001;Belteki et al.,2003)。したがって、典型的な戦略は、相同組み換えによって、attP担持する「ドッキング部位」を定義された座位に位置付け、その後、挿入のためのattB担持incoming配列と結合される。
本明細書において使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「IRES」とは、シストロン(タンパク質コード領域)の例えばATGなどの開始コドンに内部リボソームが直接侵入することを促進し、キャップ非依存性の遺伝子翻訳を生じさせる因子を指す。例えば、Jackson et al.,1990.Trends Biochem Sci 15(12):477-83)およびJackson and Kaminski.1995.RNA 1(10):985-1000を参照のこと。特定の実施形態では、ベクターは、一つ以上のポリペプチドをコードする一つ以上の対象のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、自己切断ポリペプチドをコードする一つ以上のIRES配列又はポリヌクレオチド配列によって分離され得る。一つの実施形態では、本明細書において予期されるポリヌクレオチドに使用されるIRESは、EMCV IRESである。
本明細書において使用される場合、「Kozak配列」という用語は、リボソーム小サブユニットへのmRNAの初期結合を大きく促進し、翻訳を増加させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスKozak配列は(GCC)RCCATGG(配列番号107)であり、ここでRはプリン(AまたはG)である(Kozak、1986年Cell.44(2):283-92およびKozak、1987年Nucleic Acids Res.15(20):8125-48)。特定の実施形態では、ベクターは、所望のポリペプチド、例えばCARをコードするコンセンサスKozak配列を有するポリヌクレオチドを含む。
異種核酸転写物の効率的な終止とポリアデニル化を誘導する因子は、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは、概して、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態では、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列3’を含む。本明細書で使用される場合、「ポリA部位」又は「ポリA配列」という用語は、RNAポリメラーゼIIによって発生期のRNA転写物の終止及びポリアデニル化の両方を指向するDNA配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリAテールをコード配列の3’末端に付加することによってmRNA安定性を促進することができ、したがって、翻訳効率の向上に寄与する。切断及びポリアデニル化は、RNA中のポリ(A)配列によって指向される。哺乳類プレmRNAのコアポリ(A)配列は、切断ポリアデニル化部位に隣接する二つの認識エレメントを有する。典型的には、ほぼ不変のAAUAAA六量体が、U残基又はGU残基が豊富な、より可変性であるエレメントの上流20~50ヌクレオチドに存在する。初期転写物の切断はこれら二つのエレメントの間で発生し、5’切断産物に最大で250個のアデノシンが付加される。特定の実施形態では、コアポリ(A)配列は、最良のポリA配列(例えば、AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)である。特定の実施形態では、ポリ(A)配列は、SV40のポリA配列、ウシ成長ホルモンポリA配列(BGHpA)、ウサギβ-グロビンポリA配列(rβgpA)、それらのバリアント、または当分野に公知の別の適切な異種または内因性ポリA配列である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを保有する細胞は、直接的な毒性および/または非制御増幅のリスクを減少させるための誘導性自殺遺伝子をはじめとする自殺遺伝子を利用する。特定の態様では、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドを保有する宿主、又は細胞に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ-9又はカスパーゼ-8又はシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ-9は、二量体形成の特定の化学誘導物質(CID:chemical inducer of dimerization)を使用して活性化され得る。
H.ベクター
特定の実施形態では、CARをコードする一つ以上のポリヌクレオチドが、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)に導入される。いくつかの実施形態において、CARをコードするポリシストロニックポリヌクレオチドは、非ウイルスまたはウイルスベクターによって細胞に導入される。
特定の実施形態では、CARをコードする一つ以上のポリヌクレオチドが、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)に導入される。いくつかの実施形態において、CARをコードするポリシストロニックポリヌクレオチドは、非ウイルスまたはウイルスベクターによって細胞に導入される。
「ベクター」という用語は、本明細書において、もう一つの核酸分子を移送または輸送することができる核酸分子を指すために使用される。伝達された核酸は、一般的に、例えば、ベクター核酸分子に挿入される。ベクターは、細胞内で自己複製を指向する配列を含んでもよく、又は宿主細胞DNAへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態では、非ウイルスベクターを使用して、本明細書で意図される一つまたは複数のポリヌクレオチドをT細胞に送達する。
非ウイルス性ベクターの例示としては限定されないが、mRNA、プラスミド(例えばDNAプラスミドまたはRNAプラスミド)、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が挙げられる。
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドまたはベクターの非ウイルス送達の例示的方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティックス、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、裸DNA、人工ビリオン、DEAE-デキストラン媒介転写、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられる。
特定の実施形態において企図される特定の実施形態での使用に適したポリヌクレオチド送達システムの例示としては限定されないが、Amaxa Biosystems,Maxcyte,Inc.、BTX Molecular Delivery Systems、およびCopernicus Therapeutics Inc.により提供されるシステムが挙げられる。リポフェクション試薬は市販されている(例えば、Transfectam(商標)およびLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的な受容体-認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Liu et al.(2003)Gene Therapy.10:180-187;およびBalazs et al.(2011)Journal of Drug Delivery.2011:1-12を参照のこと。抗体標的化送達、細菌誘導送達、非生物ナノセル系送達も特定の実施形態において予期される。
様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、所望のポリペプチドを一過性に発現させるために細胞内に導入されるmRNAである。
本明細書で使用される場合、「一過性」とは、数時間、数日、または数週間の期間にわたる非統合型導入遺伝子の発現を指し、発現期間は、細胞内のゲノムに統合されるか、または安定的なプラスミドレプリコン内に含有される場合、ポリヌクレオチドの発現期間よりも短い。
特定の実施形態では、ポリペプチドをコードするmRNAは、インビトロに転写されたmRNAである。本明細書で使用される場合、「インビトロで転写されたRNA」は、インビトロで合成されたRNA、好ましくはmRNAを指す。概して、インビトロで転写されたRNAは、インビトロ転写ベクターから生成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写RNAを生成するために使用されるテンプレートを含む。
特定の実施形態では、mRNAは、5’キャップまたは修飾5’キャップ、および/またはポリ(A)配列をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、5’キャップ(RNAキャップ、RNA 7-メチルグアノシンキャップ、又はRNA m7Gキャップとも呼ばれる)は、転写開始の直後に真核性メッセンジャーRNAの「前」又は5’末端に添加された修飾グアニンヌクレオチドである。5’キャップは、第一の転写ヌクレオチドに連結され、リボソームによって認識され、RNaseから保護される末端基を含む。キャッピング部分は、翻訳の安定性又は効率など、mRNAの機能を調節するように修飾され得る。特定の実施形態では、mRNAは、約50~約5000個のアデニンのポリ(A)配列を含む。一実施形態では、mRNAは、約100~約1000塩基、約200~約500塩基、又は約300~約400塩基のポリ(A)配列を含む。一実施形態では、mRNAは、約65塩基、約100塩基、約200塩基、約300塩基、約400塩基、約500塩基、約600塩基、約700塩基、約800塩基、約900塩基、又は約1000塩基以上のポリ(A)配列を含む。ポリ(A)配列は、局在化、安定性、又は翻訳の効率などのmRNA機能を調節するために、化学的又は酵素的に修飾され得る。
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターは、個々の患者に投与することにより、典型的には以下に記載されるように全身投与(例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または頭蓋内点滴)または局所適用することによりインビボで送達され得る。あるいはベクターは、例えば個々の患者から外植された細胞(例えば動員(mobilized)された末梢血、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検等)またはユニバーサルドナーの造血幹細胞などの細胞に生体外で送達されてもよく、その後、患者に当該細胞を再移植してもよい。
一実施形態では、CARをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与する。あるいは、ネイキッドDNAが投与されてもよい。投与は、これらに限定されないが、注射、注入、局所適用、及びエレクトロポレーションを含む、血液又は組織細胞との最終接触に分子を導入するために通常使用される任意の経路による。そうした核酸の適切な投与方法は当業者に利用可能および公知であるが、複数の経路を使用して特定の組成物を投与してもよく、特定の経路はしばしば、別の経路よりも即時性で高い効果的反応を提供することができる。
本明細書で意図される特定の実施形態での使用に適したウイルスベクターシステムの例示には、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、CARをコードする一つ以上のポリヌクレオチドは、一つ以上のポリヌクレオチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)で細胞を形質導入することによって、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞に導入される。
AAVは、小さな(約26nm)複製欠損、主に、エピソーム非エンベロープで覆われたウイルスである。AAVは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。組換えAAV(rAAV)は典型的には、最小で導入遺伝子とその制御配列、並びに5’及び3’のAAV逆位末端反復(ITR)から構成される。ITR配列は約145bpの長さである。特定の実施形態では、rAAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9またはAAV10から単離されたITRとカプシド配列を含有する。
一部の実施形態では、キメラrAAVが使用される。ITR配列は、一つのAAV血清型から単離され、カプシド配列は別のAAV血清型から単離される。例えば、AAV2由来のITR配列及びAAV6由来のカプシド配列を含むrAAVは、AAV2/AAV6と呼ばれる。特定の実施形態では、rAAVベクターは、AAV2由来のITRと、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9又はAAV10のうちのいずれか一つに由来するカプシドタンパク質とを含み得る。好ましい実施形態では、rAAVは、AAV2由来のITR配列及びAAV6由来のカプシド配列を含む。好ましい実施形態では、rAAVは、AAV2由来のITR配列と、AAV2由来のカプシド配列を含有する。
一部の実施形態では、操作と選択の方法をAAVカプシドに行って、それらが対象となる細胞に形質導入される確率を高くしてもよい。
rAAVベクターの構築、その製造、および精製は、例えば、米国特許第9,169,494号、第9,169,492号、第9,012,224号、第8,889,641号、第8,809,058号、及び第8,784,799号に開示されており、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態において、CARをコードする一つ以上のポリヌクレオチドを免疫エフェクター細胞に導入し、細胞をレトロウイルス、例えばレンチウイルスで形質導入することによって、一つ以上のポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムRNAを直鎖二本鎖DNAコピーに逆転写し、その後、そのゲノムDNAを宿主ゲノムに共有的に組み込むRNAウイルスを指す。特定の実施形態での使用に好適な例示的なレトロウイルスには、これらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MuLV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(MoMSV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MuMTV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、ネコ白血病ウイルス(FLV)、スプマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)及びラウス肉腫ウイルス(RSV))、並びにレンチウイルスが含まれる。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群(又は属)を指す。例示的なレンチウイルスには、これらに限定されないが、HIV(ヒト免疫不全ウイルス、HIV1型及びHIV2を含む)、ビスナマエディウイルス(VMV)ウイルス、カプリン関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、およびシミアン免疫不全ウイルス(SIV)が含まれる。一つの実施形態では、HIVをベースとしたベクター骨格(すなわちHIVシス作用性配列因子)が好ましい。
様々な実施形態では、本明細書に企図されるレンチウイルスベクターは、一つまたは複数のLTR、および以下のアクセサリー因子のうちの一つまたは複数またはすべてを含有する:cPPT/FLAP、Psi(Ψ)パッケージシグナル、輸出因子(export element)、ポリ(A)配列。および任意で、本明細書において別段に検討されるように、WPREまたはHPRE、インシュレーター因子、選択マーカー、および細胞自殺遺伝子を含有してもよい。
特定の実施形態では、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、統合的、または非統合的、または統合能力を欠くレンチウイルスであってもよい。本明細書で使用される場合、「組み込み欠損レンチウイルス」又は「IDLV」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む能力を欠いているインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組み込み-インコンピテントウイルスベクターは、特許出願WO2006/010834に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
インテグラーゼ活性を低減するのに好適なHIV-1 pol遺伝子における例示的な変異には、これらに限定されないが、H12N、H12C、H16C、H16V、S81 R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D1161、D116A、N120G、N1201、N120E、E152G、E152A、D35E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199c、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221 L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A、及びK264Hが挙げられる。
一実施形態では、HIV-1インテグラーゼ欠失pol遺伝子は、D64V、D116I、D116A、E152G、若しくはE152A変異、D64V、D116I、及びE152G変異、又はD64V、D116A、及びE152A変異を含む。
一実施形態では、HIV-1インテグラーゼ欠失pol遺伝子は、D64V変異を含む。
「長末端反復(LTR:long terminal repeat)」という用語は、レトロウイルスDNAの末端に位置する塩基対のドメインを指し、本来の配列ではLTRはダイレクトリピートであり、U3、RおよびU5領域を含有する。
本明細書において使用される場合、「FLAP因子」、または「cPPT/FLAP」という用語は、その配列が、例えばHIV-1およびHIV-2などのレトロウイルスの中心ポリプリン帯(central polypurine tract)と中心末端配列(central termination sequences)(cPPTおよびCTS)を含む核酸を指す。適切なFLAP因子は、米国特許第6,682,907号およびZennou,et al.,2000,Cell,101:173に記載されている。別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、cPPTおよび/またはCTS要素中の一つ以上の変異を有するFLAP要素を含有する。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、cPPTまたはCTS要素のいずれかを含む。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、cPPTまたはCTS要素を含まない。
本明細書において使用される場合、「パッケージシグナル」または「パッケージ配列」という用語は、レトロウイルスゲノム内に位置するpsi[Ψ]配列を指し、ウイルスカプシドまたはウイルス粒子内にウイルスRNAを挿入するために必要とされる。例えば、Clever et al.,1995.J.of Virology,Vol.69、No.4、pp.2101-2109を参照されたい。
「輸出因子」という用語は、シス作用性の転写後制御因子を指し、細胞の核から細胞質へのRNA転写物の輸送を制御する。RNA輸出因子の例としては限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)のrev反応性因子(RRE)(例えば、Cullen et al.,1991.J.Virol.65:1053;およびCullen et al.,1991.Cell 58:423を参照のこと)およびB型肝炎ウイルスの転写後制御因子(HPRE)が挙げられる。
特定の実施形態では、ウイルスベクター中の異種配列の発現は、転写後制御因子、効率的ポリアデニル化部位、および任意で転写終止シグナルをベクターに組み込むことで増加する。様々な転写後調節エレメントは、タンパク質における異種核酸の発現を増加させることができ、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素(WPRE;Zuffereyら、1999年J.Virol.、73:2886);B型肝炎ウイルス(HPRE)に存在する転写後調節エレメント(Huangら、Mol.Cell.Biol.、5:3864);及び同様のもの(Liuら、1995年Genes Dev.、9:1766)がある。
レンチウイルスベクターは、好ましくは、LTRの修飾の結果としていくつかの安全性の増強を含む。「自己不活化」(SIN:self-inactivating)ベクターとは、複製能力を欠いたベクターを指し、例えば右(3’)LTRエンハンサー-プロモーター領域はU3領域として知られているが、この領域が(例えば欠失または置換により)改変されて、ウイルス複製の最初のラウンドを超えたウイルス転写が阻害される。追加的な安全性の増強は、5’LTRのU3領域を、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を誘導する異種プロモーターと置き換えることで提供される。使用され得る異種プロモーターの例としては例えば、シミアンウイルス40(SV40)(例えば初期または後期)、サイトメガロウイルス(CMV)(例えば前初期)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、および単純ヘルペスウイルス(HSV)(チミジンキナーゼ)のプロモーターが挙げられる。
本明細書において使用される場合、「偽型」または「偽型の」という用語は、好ましい特性を有する別のウイルスのエンベロープタンパク質と置き換えられたウイルスエンベロープタンパク質を有するウイルスを指す。例えば、HIVエンベロープタンパク質(env遺伝子にコードされる)は通常、CD4+提示細胞に対してウイルスを標的化するが、水泡性口炎ウイルスのG-タンパク質(VSV-G)エンベロープタンパク質でHIVを偽型化することで、広範な細胞にHIVが感染できるようになる。
ある実施形態では、レンチウイルスベクターは、公知の方法により産生される。例えば、Kutnerら、BMC Biotechnol.2009;9:10.doi:10.1186/1472-6750-9-10;Kutnerら Nat.Protoc.2009年;4(4):495-505.doi:10.1038/nprot.2009.22を参照されたい。
本明細書に企図されるある特定の実施形態によると、ほとんど、またはすべてのウイルスベクターの骨格配列は、例えばHIV-1などのレンチウイルスに由来する。しかしながら、レトロウイルス及び/若しくはレンチウイルス配列の多くの異なる源を使用することができるか、又はある特定のレンチウイルス配列の組み合わせられた多数の置換及び改変が、移入ベクターの本明細書に記載される機能を行う能力を損なうことなく適応され得ることが理解されるべきである。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野において公知である、Naldiniら(1996a、1996bおよび1998年);Zuffereyら、(1997)、Dullら、1998年、米国特許第6,013,516号、及び第5,994,136号を参照されたく、それらの多くが、本明細書に企図されるウイルスベクター又はトランスファープラスミドの産生に適合され得る。
様々な実施形態において、CARをコードする一つ以上のポリヌクレオチドは、一つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで細胞を形質導入することによって免疫エフェクター細胞に導入される。
アデノウイルスを基にしたベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そうしたベクターを用いることで、高力価及び高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に産生され得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がAd E1a、E1b、及び/又はE3遺伝子を置き換えるように操作され、その後、トランスで欠失した遺伝子機能を供給するヒト293細胞において、複製欠損ベクターが増殖される。Adベクターは、例えば肝臓、腎臓および筋肉中に存在する細胞などの非分裂細胞、分化細胞を含む、複数のタイプの組織にインビボで形質導入することができる。従来的なAdベクターは、大きな運搬能力を有している。
複製能力を欠く現在のアデノウイルスベクターの作製と増幅は、293と呼ばれるユニークなヘルパー細胞株を利用する場合がある。この細胞株は、ヒト胚腎臓細胞からAd5 DNA断片により形質転換されたものであり、E1タンパク質を構造的に発現している(Graham et al.,1977)。E3領域は、アデノウイルスゲノムには不必要であるため(Jones&Shenk,1978)、現行のアデノウイルスベクターは、293細胞を利用して、E1、D3、又は両方のいずれかの領域に外来DNAを運搬する(Graham&Prevec,1991)。アデノウイルスベクターは、真核細胞遺伝子の発現(Levrero et al.,1991;Gomez-Foix et al.,1992)およびワクチン開発(Grunhaus & Horwitz,1992;Graham & Prevec,1992)に使用されている。組み換えアデノウイルスを様々な組織に投与する実験としては、気管滴下(Rosenfeld et al.,1991;Rosenfeld et al.,1992)、筋肉注射(Ragot et al.,1993)、末梢静脈注射(Herz & Gerard,1993)、および脳内への定位性接種(Le Gal La Salle et al.,1993)が挙げられる。臨床試験におけるAdベクターの使用例には、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫を目的としたポリヌクレオチド療法が含まれる(Sterman et al.,Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998))。
様々な実施形態において、CARをコードする一つ以上のポリヌクレオチドは、単純ヘルペスウイルス、例えばHSV-1、HSV-2で細胞を形質導入することによって免疫エフェクター細胞に導入され、一つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、CARをコードするポリシストロニックメッセージをコードする一つ以上のポリヌクレオチドは、単純ヘルペスウイルスで細胞を形質導入することによって免疫エフェクター細胞に導入され、例えば、HSV-1、HSV-2、一つ以上のポリヌクレオチドを含む。
成熟HSVビリオンは、152kbである直鎖二本鎖DNA分子からなるウイルスゲノムを含むエンベロープで覆われた二十面体カプシドからなる。一実施形態では、HSVを基にしたウイルスベクターは、一つ以上の必須又は非必須HSV遺伝子において欠損している。一実施形態では、HSVを基にしたウイルスベクターは、複製欠損である。ほとんどの複製欠損HSVベクターは、複製を防ぐために一つ以上の最早期、早期、又は後期HSV遺伝子を除去するための欠失を含む。例えばHSVベクターは、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される最早期遺伝子が欠損であり得る。HSVベクターの利点は、長期間のDNA発現をもたらし得る潜伏期に入る能力、及び最大25kbの外因性DNAを収容し得るその大きなウイルスDNAゲノムである。HSV系のベクターは、例えば米国特許第 5,837,532号、第5,846,782号および第5,804,413号、ならびに国際特許出願WO 91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637およびWO 99/06583に記載されており、それらはその全体で参照により本明細書に援用される。
I.遺伝子改変細胞
様々な実施形態において、細胞は、本明細書で企図されるCARを発現するように遺伝子改変された、B細胞関連状態の治療に使用する。本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」又は「遺伝子修飾された」という用語は、DNA又はRNAの形態の追加的な遺伝物質を、細胞中の総遺伝物質に加えることを指す。「遺伝子修飾された細胞」、「修飾細胞」、及び「再指向された細胞」という用語は、相互交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、「遺伝子治療」という用語は、遺伝子の発現を回復、修正、もしくは改変する細胞内の全遺伝物質へのDNAまたはRNAの形態の余分な遺伝物質の導入、または治療用ポリペプチド、例えばCARを発現する目的で、DNAまたはRNAの形態の余分な遺伝物質を導入することを指す。
様々な実施形態において、細胞は、本明細書で企図されるCARを発現するように遺伝子改変された、B細胞関連状態の治療に使用する。本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」又は「遺伝子修飾された」という用語は、DNA又はRNAの形態の追加的な遺伝物質を、細胞中の総遺伝物質に加えることを指す。「遺伝子修飾された細胞」、「修飾細胞」、及び「再指向された細胞」という用語は、相互交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、「遺伝子治療」という用語は、遺伝子の発現を回復、修正、もしくは改変する細胞内の全遺伝物質へのDNAまたはRNAの形態の余分な遺伝物質の導入、または治療用ポリペプチド、例えばCARを発現する目的で、DNAまたはRNAの形態の余分な遺伝物質を導入することを指す。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるCARは、それらの特異性を対象の標的抗原、例えばBCMAポリペプチドに向け直すように免疫エフェクター細胞に導入および発現される。「免疫エフェクター細胞」は、一つまたは複数のエフェクター機能(例えば細胞傷害性の細胞殺傷活性、サイトカイン分泌、ADCCおよび/またはCDCの誘導など)を有する免疫系の任意の細胞である。本明細書に企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、これらに限定されないが、細胞傷害性T細胞(CTL;CD8+T細胞)、TIL、及びヘルパーT細胞(HTL;CD4+T細胞)を含む、Tリンパ球である。特定の実施形態では、細胞は、αβ T細胞を含む。特定の実施形態では、細胞は、γδ T細胞を含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞を含む。一つの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーT(NKT)細胞を含む。
免疫エフェクター細胞は、自己(self)または非自己(non-self、例えば同種、同系または異種)であってもよい。本明細書で使用される場合、「自己」とは、同じ対象に由来する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同種」とは、比較した細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同系」とは、比較した細胞と遺伝的に同一である、異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「異種」とは、比較した細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、細胞は自己である。
特定の実施形態において企図されるCARと共に使用される例示的な免疫エフェクター細胞は、Tリンパ球を含む。「T細胞」または「Tリンパ球」という用語は、当分野において認識されており、胸腺細胞、未成熟Tリンパ球、成熟Tリンパ球、静止Tリンパ球、または活性化Tリンパ球を含むことが意図される。T細胞は、Tヘルパー(Th)細胞、例えば、Tヘルパー1(Th1)又はTヘルパー2(Th2)細胞であり得る。T細胞は、ヘルパーT細胞(HTL;CD4+T細胞)CD4+T細胞、細胞傷害性T細胞(CTL;CD8+T細胞)、CD4+CD8+T細胞、CD4-CD8-T細胞、又はT細胞の任意の他のサブセットであり得る。特定の実施形態での使用に適したT細胞の他の例示的な集団としては、ナイーブT細胞(TN)、Tメモリー幹細胞(TSCM)、中央メモリーT細胞(T CM)、エフェクターメモリーT細胞(T EM)、およびエフェクターT細胞(TEFF )が挙げられる。
当業者によって理解されるように、他の細胞も、本明細書においてCARを有する免疫エフェクター細胞として使用され得る。特に、免疫エフェクター細胞は、NK細胞、NKT細胞、好中球およびマクロファージも含む。免疫エフェクター細胞は、エフェクター細胞の前駆体も含み、このような前駆細胞は、インビボまたはインビトロで免疫エフェクター細胞に分化するように誘導されてもよい。したがって、特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、臍帯血、骨髄または動員された末梢血に由来する細胞のCD34+集団内に含まれる造血幹細胞(HSC)などの免疫エフェクター細胞の前駆体を含み、これは、対象への投与時に成熟免疫エフェクター細胞に分化し、または成熟免疫エフェクター細胞に分化するようにインビトロで誘導することができる。
本明細書において使用される場合、「CD34+細胞」という用語は、その細胞表面上にCD34タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書において使用される場合、「CD34」とは、細胞-細胞接着因子として作用することが多く、リンパ節へのT細胞の侵入に関与する細胞表面糖タンパク質(例えばシアロムチンタンパク質)を指す。CD34+細胞集団は、造血幹細胞(HSC)を含有し、HSCは患者に投与されたときに分化し、T細胞、NK細胞、NKT細胞、好中球、および単球/マクロファージ系統の細胞を含むすべての造血系の元となる。
本明細書で企図されるCARを発現する免疫エフェクター細胞を作製するための方法は、特定の実施形態において提供される。一実施形態において、この方法は、免疫エフェクター細胞が本明細書で企図される一つ以上のCARを発現するように個体から単離された免疫エフェクター細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含む。ある実施形態では、免疫エフェクター細胞は、インビトロでのさらなる操作を伴わずに個体から単離され、および遺伝子改変される。次いでそうした細胞を当該個体に直接再投与してもよい。さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞は、CARを発現するように遺伝子改変される前に、インビトロで増殖するように最初に活性化および刺激される。これに関して、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される(すなわち、本明細書で企図されるCARを発現するように形質導入またはトランスフェクトされる)前および/または後に培養され得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図される免疫エフェクター細胞のインビトロ操作または遺伝子改変の前に、細胞の供給源は対象から取得される。特定の実施形態では、改変された免疫エフェクター細胞は、T細胞を含有する。
特定の実施形態において、PBMCはCARを発現するために、本明細書に企図される方法を使用して直接遺伝子改変されてもよい。特定の実施形態では、PBMCの単離後、Tリンパ球をさらに単離し、特定の実施形態において、細胞傷害性Tリンパ球とヘルパーTリンパ球の両方を、遺伝子改変および/または増殖の前または後のいずれかに、ナイーブ、メモリーおよびエフェクターT細胞亜集団に保存することができる。
例えばT細胞などの免疫エフェクター細胞は、公知の方法を使用して単離された後に遺伝子改変されてもよく、または免疫エフェクター細胞は、インビトロで活性化および拡張されて(または前駆細胞の場合には分化されて)、その後に遺伝子改変されてもよい。特定の実施形態において、T細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書で企図されるキメラ抗原受容体で遺伝的に改変され(例えば、CARをコードする核酸またはCARをコードするポリシストロニックメッセージを含むウイルスベクターで形質導入され)、次いでインビトロで活性化および増殖される。様々な実施形態において、T細胞は、CARを発現するための遺伝子改変の前または後に活性化および増殖することができ、例えば米国特許第6,352,694号、第6,534,055号、第6,905,680号、第6,692,964号、第5,858,358号、第6,887,466号、第6,905,681号、第7,144,575号、第7,067,318号、第7,172,869号、第7,232,566号、第7,175,843号、第5,883,223号、第6,905,874号、第6,797,514号、第6,867,041号、および米国特許出願公開20060121005に記載される方法を使用して、遺伝子改変の前または後に、活性化および拡張されてもよい。
一つの実施形態では、CD34+細胞は、本明細書で予期される核酸構築物で形質導入される。特定の実施形態では、形質導入されたCD34+細胞は、対象、一般に細胞が最初に単離された対象に投与された後、インビボで成熟免疫エフェクター細胞に分化する。別の実施形態において、CD34+細胞は、本明細書で企図されるCARで遺伝子改変される前または後に、前述の方法に従って(Asheuerら、2004;、2004)、以下のサイトカイン:Flt-3リガンド(FLT3)、幹細胞因子(SCF)、巨核球増殖分化因子(TPO)、IL-3およびIL-6の一つ以上を用いてインビトロで刺激され得る。
特定の実施形態において、癌の治療のための改変免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書で企図されるCARを含む。例えば、修飾された免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に記載されるB細胞悪性腫瘍と診断された患者(自己ドナー)から得られた末梢血単核細胞(PBMC)から調製される。PBMCは、CD4+、CD8+、またはCD4+およびCD8+であってもよいTリンパ球の異種集団を形成する。
PBMCはまた、NK細胞またはNKT細胞などの他の細胞傷害性リンパ球を含み得る。特定の実施形態において企図されるCARのコード配列を担持する発現ベクターは、ヒトドナーT細胞、NK細胞またはNKT細胞の集団に導入される。特定の実施形態において、発現ベクターを担持する首尾よく形質導入されたT細胞は、フローサイトメトリーを用いてCD3陽性T細胞を単離し、次いで、抗CD3抗体およびまたは抗CD28抗体およびIL-2または本明細書の他の箇所に記載されるような当技術分野で公知の任意の他の方法を用いた細胞活性化に加えて、T細胞を発現するこれらのCARタンパク質の数を増加させるようにさらに増殖させることができる。標準的な手順は、ヒト対象で使用するための保存および/または調製のためのCARタンパク質T細胞を発現するT細胞の凍結保存に使用される。一実施形態では、T細胞のインビトロ形質導入、培養、および/または増殖は、胎児仔ウシ血清および胎児ウシ血清などの非ヒト動物由来産物の非存在下で実施される。PBMCの不均一な集団が遺伝子的に改変されるので、結果として生じる形質導入細胞は、本明細書で企図されるようなCARを標的とするBCMAを含む改変細胞の不均一な集団である。
さらなる実施形態では、例えば、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、またはそれ以上の異なる発現ベクターの混合物を、免疫エフェクター細胞のドナー集団を遺伝子改変する際に使用することができ、各ベクターは、本明細書で企図される異なるキメラ抗原受容体タンパク質をコードする。結果として生じる修飾された免疫エフェクター細胞は、修飾された細胞の混合集団を形成する。
T細胞を含む遺伝子操作された細胞は、当技術分野で公知の様々な方法を用いて製造することができ、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2016/094304号を参照されたい。
J.組成物および製剤
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体溶液の製剤は、当業者に周知であり、本明細書で企図される特定の組成物を様々な治療レジメンに使用するための好適な投薬および治療レジメンの開発と同様に、例えば、経腸および非経口、例えば、血管内、静脈内、子宮内、骨内、脳室内、脳内、頭蓋内、脊髄内、髄腔内、および髄内投与および処方を含む。当業者であれば、本明細書に予期される特定の実施形態は、例えば、薬学分野で公知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,volume I and volume II.22nd Edition.Edited by Loyd V.Allen Jr.Philadelphia,PA:Pharmaceutical Press;2012に記載される製剤などの他の製剤を含み得ることを理解するであろう。
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体溶液の製剤は、当業者に周知であり、本明細書で企図される特定の組成物を様々な治療レジメンに使用するための好適な投薬および治療レジメンの開発と同様に、例えば、経腸および非経口、例えば、血管内、静脈内、子宮内、骨内、脳室内、脳内、頭蓋内、脊髄内、髄腔内、および髄内投与および処方を含む。当業者であれば、本明細書に予期される特定の実施形態は、例えば、薬学分野で公知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,volume I and volume II.22nd Edition.Edited by Loyd V.Allen Jr.Philadelphia,PA:Pharmaceutical Press;2012に記載される製剤などの他の製剤を含み得ることを理解するであろう。
本明細書で企図される組成物は、本明細書で企図されるような一つ以上の抗BCMA抗体またはその断片、CARポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、または遺伝子改変免疫エフェクター細胞等を含み得る。組成物としては限定されないが、医薬組成物が挙げられる。好ましい実施形態において、組成物は、CARを発現するように改変された一つ以上の細胞を含む。
「医薬組成物」とは、細胞または動物への投与に対し、薬学的に許容可能な溶液または生理学的に許容可能な溶液中で、単独で、または一つまたは複数の他の治療モダリティと併用されて製剤化される組成物を指す。所望の場合には、組成物は、例えばサイトカイン、増殖因子、ホルモン、低分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬剤、抗体、または他の様々な薬学的に活性な剤などの他の剤も同様に併用されて投与され得ることも理解されたい。事実上、組成物に含有され得る他の構成要素に制限はないが、追加される剤は、意図される療法を送達する組成物の能力に有害な影響を与えないものとする。好ましい実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤、ならびに本明細書に企図されるCARを発現するように改変された一つ以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書で企図される薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤ならびに抗BCMA抗体またはその断片を含む。
本明細書において、「薬学的に許容可能」という文言は、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用することに適し、合理的な利益/リスク比に見合った、それら化合物、物質、組成物および/または剤型を指すために採用される。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤」は、限定するものではないが、ヒト又は家畜での使用に許容されるものとして米国食品医薬品局によって承認されている、アジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、染料/着色剤、香味剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、又は乳化剤を含む。例示的な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、ラクトース、グルコース、及びショ糖などの糖;トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン;セルロース、並びにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのその誘導体;トラガカンス;麦芽;ゼラチン;タルク;ココアバター、ワックス、動物及び植物性脂肪、パラフィン、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛;ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びダイズ油などの油;プロピレングリコールなどのグリコール;グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール;オレイン酸エチル及びラウレートエチルなどのエステル;寒天;水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤;アルギン酸;パイロジェンフリー水;等張生理食塩水;リンゲル液;エチルアルコール、リン酸緩衝液、および医薬製剤で採用される任意の他の適合性のある物質が挙げられる。
特定の実施形態において、組成物は、本明細書において企図される量のCAR発現免疫エフェクター細胞を含む。他の実施形態において、組成物は、本明細書で企図される量の抗BCMA抗体またはその断片を含む。本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益または所望の予防または治療結果を達成するために、遺伝子改変された治療用細胞、例えば、T細胞などの「有効な量」または「有効量」を指す。
「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために有効な遺伝子改変された治療用細胞の量を指す。必ずではないが典型的には、予防的投与量は、疾患の早期ステージの前、または早期ステージの対象において使用されるため、予防的有効量は、治療有効量よりも少ない。
遺伝子改変された治療用細胞の「治療有効量」は、個体の病態、年齢、性別、および体重などの因子、ならびに個体において所望の応答を引き出す幹細胞および前駆細胞の能力に応じて変化し得る。治療有効量はまた、ウイルス又は形質導入された治療用細胞の任意の毒性又は有害な影響を、治療上有益な効果が上回るものである。用語「治療有効量」は、対象(例えば、患者)を「治療する」のに有効な量を含む。治療的な量が示されている場合、投与される組成物の正確な量は、患者(対象)の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染又は転移の程度、及び状態における個々の差を考慮し、医師により決定され得る。
一般に、本明細書で企図されるT細胞を含む医薬組成物は、102~1010細胞/kg体重、好ましくは105~106細胞/kg体重の投与量で投与され得ると述べることができ、それらの範囲内の全ての整数値を含む。細胞数は、組成物の意図される最終用途、組成物中に含有される細胞のタイプに依存する。本明細書において提示される用途に関し、細胞は一般的に、リットル以下の量であり、500mL以下、更には250mL又は100mL以下であり得る。ゆえに所望される細胞の密度は、多くの場合、106細胞/ml超であり、一般的には、107細胞/ml超、一般的には108細胞/ml以上である。臨床的に関連する免疫細胞数は、複数回の点滴に分けられてもよく、累積的には105、106、107、108、109、1010、1011または1012細胞以上となる。いくつかの態様では、具体的には注入される全細胞は特定の標的抗原へと再指向化されるため、106/キログラム(患者当たり106~1011)の範囲の少ない数の細胞が投与される場合がある。組成物は、これらの範囲内の用量で複数回投与されてもよい。細胞は、療法を受けている患者にとって同種、同系、異種、又は自己であってもよい。所望であれば、治療は、免疫応答の誘導を増強するために本明細書で企図されるマイトジェン(例えば、PHA)またはリンホカイン、サイトカイン、および/またはケモカイン(例えば、IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-アルファ、IL-18、およびTNF-ベータ、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1αなど)の投与も含み得る。
一般に、本明細書で企図されるように活性化および増殖した細胞を含む組成物は、免疫不全である個体に生じる疾患の治療および予防に利用され得る。特定の実施形態において、本明細書で企図されるCARを発現するように改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物は、癌(例えば、B細胞悪性腫瘍)の治療に使用される。修飾された免疫エフェクター細胞は、単独で投与されてもよく、又は担体、希釈剤、賦形剤を併用した医薬組成物として、及び/又は例えばIL-2若しくは他のサイトカイン若しくは他の細胞集団などの他の構成要素を併用した医薬組成物として投与されてもよい。特定の実施形態では、医薬組成物は、遺伝子修飾されたT細胞の量を、一つ以上の薬学的若しくは生理学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と併用して含む。
CARを発現するように改変された免疫エフェクター細胞集団(例えば、T細胞)または抗体、もしくはその断片を含む医薬組成物は、緩衝液、例えば中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など;グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物;タンパク質;ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸;抗酸化物質;EDTA又はグルタチオンなどのキレート剤;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);防腐剤を含み得る。組成物は、非経口投与、例えば、血管内(静脈内または動脈内)腹腔内または筋肉内投与のために製剤化されることが好ましい。
液体医薬組成物は、溶液、懸濁液、又は他の類似の形態であるかどうかにかかわらず、以下:注射用水、生理食塩水、好ましくは生理食塩液、リンガー液、等張食塩水、溶媒又は懸濁媒として役立ち得る合成モノ又はジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の溶媒などの滅菌希釈剤;ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸又は亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化物質;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの等張性の調整のための薬剤、のうちの一つ以上を含み得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、又はガラス若しくはプラスチックで作製された複数回用量バイアルに封入され得る。注射用医薬組成物は、滅菌であることが好ましい。
一実施形態において、本明細書で企図される免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地中に製剤化される。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容可能な細胞培養培地は、無血清培地である。
無血清培地は、血清含有培地を超える利点をいくつか有しており、シンプルでより明白な組成、汚染物質量の低下、感染性実体の源となる可能性の排除、およびコスト低下が挙げられる。様々な実施形態では、無血清培地は、動物質を含まず、任意で無タンパク質であってもよい。任意選択で、培地はバイオ医薬品的に受容可能な組換えタンパク質を含み得る。「動物質を含まない」培地とは、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中で天然動物性タンパク質を置き換え、その栄養素は合成、植物又は微生物の源から得られる。「タンパク質を含まない」培地は、対照的に、実質的にタンパク質を含まないと規定される。
特定の組成物において使用される無血清培地の例示としては限定されないが、QBSF-60(Quality Biological、Inc.)、StemPro-34(Life Technologies社)、およびX-VIVO 10が挙げられる。
ある好ましい実施形態では、本明細書に予期される免疫エフェクター細胞を含む組成物は、PlasmaLyte Aを含む溶液中で製剤化される。
別の好ましい実施形態では、本明細書で予期される免疫エフェクター細胞を含む組成物は、凍結保存媒体を含む溶液中で製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地を使用して、融解後の高い細胞活性成績を維持してもよい。特定の組成物において使用される凍結保存培地の例示としては限定されないが、CryoStor CS10、CryoStor CS5、およびCryoStor CS2が挙げられる。
より好ましい実施形態では、本明細書で予期される免疫エフェクター細胞を含む組成物は、CryoStor CS10に対してPlasmaLyte Aを50:50で含む溶液中で製剤化される。
特定の実施形態では、組成物は、CARを発現するように改変された有効量の免疫エフェクター細胞を、単独で、または一つ以上の治療薬と組み合わせて含む。したがって、CAR発現免疫エフェクター細胞組成物は、単独で、または放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光力学的療法などの他の公知の癌治療と組み合わせて投与されてもよい。組成物は、抗生物質と併用して投与されてもよい。このような治療剤は、特定の癌などの本明細書で企図される特定の疾患状態に対する標準的な治療として当該技術分野において受け入れられ得る。特定の実施形態において予期される治療剤の例としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、NSAID、DMARD、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法、治療用抗体、またはは他の活性で補助的な剤が挙げられる。
特定の実施形態では、CARを発現するように改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と併せて投与され得る。
様々な他の治療薬を、本明細書で企図される組成物と併せて使用してもよい。一実施形態において、免疫エフェクター細胞、CARを含む組成物が、抗炎症剤と共に投与される。
一つの態様において、CARである免疫エフェクター細胞を含む組成物は、治療用抗体と共に投与される。特定の実施形態において企図されるCAR修飾T細胞との併用に適した治療用抗体の例示的な例として、限定するものではないが、アテゾリズマブ、アベルマブ、バビツキシマブ、ベバシズマブ(アバスチン)、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、セミプリマブ、コナツムマブ、クリゾチニブ、ダラツムマブ、デュリゴツマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デュルバルマブ、エロツズマブ(HuLuc63)、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、イピリムマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、ミラツズマブ、モクセツモマブ、ニボルマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、ペムブロリズマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、テプロツムマブ、およびウブリツキシマブが挙げられる。
K.治療方法
本明細書において企図されるCARを発現する遺伝子改変免疫エフェクター細胞は、免疫調節状態および血液悪性腫瘍を含むがこれらに限定されないB細胞関連状態の予防、治療、および改善に使用するための養子免疫療法の改良された方法を提供する。
本明細書において企図されるCARを発現する遺伝子改変免疫エフェクター細胞は、免疫調節状態および血液悪性腫瘍を含むがこれらに限定されないB細胞関連状態の予防、治療、および改善に使用するための養子免疫療法の改良された方法を提供する。
様々な実施形態では、本明細書に企図される遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞は、対象において癌細胞における細胞傷害性を増加させる、又は対象において癌細胞の数の減少に使用される養子免疫治療の改善された方法を提供する。
特定の実施形態では、一次免疫エフェクター細胞の特異性は、本明細書で企図されるように、CARで一次免疫エフェクター細胞を遺伝子改変することによって、特定の抗原を発現する細胞、例えば癌細胞に向け直される。様々な実施形態において、ウイルスベクターは、CARをコードする特定のポリヌクレオチドで免疫エフェクター細胞を遺伝的に改変するために使用される。特定の実施形態では、CARは、BCMAポリペプチドに結合する抗BCMA抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通(TM)ドメインであって、TMドメインをCARの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカー、一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
一実施形態において、癌細胞を発現するBCMAを標的とするCARを発現するようにT細胞が遺伝子改変され、T細胞がそれを必要とするレシピエントに注入されるタイプの細胞療法が提供される。注入された細胞は、レシピエントにおいて疾患を引き起こす細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、T細胞療法は、インビボで複製することができ、その結果、持続的な癌治療をもたらすことができる長期持続性をもたらす。
一実施形態では、CARを発現するT細胞は、強固なインビボT細胞増殖を経ることができ、長期間持続することができる。別の実施形態では、CARを発現するT細胞は、任意のさらなる腫瘍形成または増殖を阻害するために再活性化することができる特定のメモリーT細胞または幹細胞メモリーT細胞に進化する。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるCARを発現する免疫エフェクター細胞を含む組成物は、特定の抗原発現癌細胞または癌幹細胞に関連する状態の治療に使用される。
本明細書で企図されるCARを含む免疫エフェクター細胞を用いて治療、予防または改善することができる状態の例示的な例として、これらに限定されないが、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、ANCA関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、および急速に進行する糸球体腎炎が挙げられる。
改変された免疫エフェクター細胞は、重鎖疾患、原発性または免疫細胞関連アミロイドーシス、および重要性不明のモノクローナルガンモパシー(MGUS)などの形質細胞障害にも適用することができる。
本明細書での使用において、「B細胞悪性腫瘍」は、後述で論じるようにB細胞(免疫系細胞の一種)において形成される癌の一種を指す。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるCARを発現するT細胞を含む組成物は、骨肉腫またはユーイング肉腫の治療に使用される。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるCARを発現するT細胞を含む組成物は、液体癌または血液学的癌の治療に使用される。
ある特定の実施形態では、液性癌又は血液癌は、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。
特定の実施形態では、液体または血液学的癌は、以下からなる群から選択される:急性リンパ性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病(HCL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、および慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄単球性白血病(CMML)および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優勢ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆体Bリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Tリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、IgD骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、髄外形質細胞腫。
特定の実施形態では、液性癌又は血液癌は、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、ヘアリー細胞白血病(HCL)、多発性骨髄腫(MM)、急性骨髄性白血病(AML)、又は慢性骨髄性白血病(CML)からなる群から選択される。
好ましい実施形態において、液体または血液学的癌は、多発性骨髄腫(MM)である。
好ましい実施形態において、液体または血液学的癌は、再発/難治性多発性骨髄腫(MM)である。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるCARを発現する免疫エフェクター細胞の治療有効量を、またはそれを含む組成物を、それを必要とする患者に、単独で、または一つ以上の治療薬と組み合わせて、投与することを含む方法が提供される。特定の実施形態において、細胞は、癌または癌細胞に関連する状態を発症するリスクのある患者の治療に使用される。したがって、特定の実施形態では、癌の少なくとも一つの症状または異常なB細胞活性に関連する状態(例えば、B細胞悪性腫瘍)の治療または予防または改善のための方法であり、本明細書で企図されるCARを発現する修飾T細胞の治療有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む。
本明細書において使用される場合、「個体」および「対象」という用語はしばしば相互交換可能に使用され、本明細書において別段に予期される遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、および方法で治療され得る疾患、傷害または病の症状を呈する任意の動物を指す。好ましい実施形態では、対象は、遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、および本明細書において別段に予期される方法を用いて治療され得る癌に関連する疾患、傷害、または病態の症状を呈する任意の動物を含む。適切な対象(例えば、患者)としては、実験動物(例えば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモット)、家畜(farm animal、domestic animal)、またはペット(例えば、ネコまたはイヌ)が挙げられる。非ヒト霊長類、好ましくはヒト患者も含まれる。典型的な対象は、癌(例えば、B細胞悪性腫瘍)を有する、癌(例えば、B細胞悪性腫瘍)と診断された、あるいは癌(例えば、B細胞悪性腫瘍)を有するリスクのある、ヒト患者を含む。
本明細書で使用される場合、用語「患者」は、遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、および本明細書の他の場所で開示される方法を用いて治療され得る特定の疾患、傷害または病態と診断された対象を指す。
本明細書で使用される「治療(treatment)」または「治療すること(treating)」には、疾患または病態の症状もしくは病理に対する、あらゆる有益な作用または望ましい作用を含み、治療される疾患または状態の一つ以上の測定可能なマーカーの最小の低減さえも含み得る。治療には、任意で、疾患若しくは病態の減少、又は疾患若しくは病態の進行の遅延のいずれかが含まれてもよい。「治療」は必ずしも、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な排除または治癒を示すものではない。
本明細書において使用される場合、「予防する」、および例えば「予防される」、「予防すること」といった類似の文言は、疾患もしくは状態の予防、阻害、または発生もしくは再発の可能性の低下を目的としたアプローチを示す。更に、疾患若しくは状態の発生又は再発の遅延、又は疾患若しくは状態の症状の発生又は再発の遅延も指す。本明細書において使用される場合、「予防」およびその類似文言も、疾患もしくは症状の発生または再発の前の、疾患もしくは状態の強度、作用、症状、および/または負荷量の低下を含む。
本明細書において使用される場合、「~の少なくとも一つの症状の改善」とは、対象が治療される疾患もしくは状態の一つまたは複数の症状の減少を指す。特定の実施形態では、治療される疾患または状態は、癌であり、この場合において改善される一つまたは複数の症状としては限定されないが、脱力、疲労、息切れ、あざができやすい、および出血しやすい、頻発する感染、リンパ節の拡張、腹部膨張または腹部疼痛(膨張した腹部臓器が原因)、骨または関節の疼痛、骨折、予期せぬ体重減少、食欲低下、寝汗、持続性の微熱、および排尿減少(腎機能の障害が原因)が挙げられる。
「増強する」または「促進する」または「増加させる」または「拡大する」とは、一般に、本明細書で企図される組成物、例えば、CARを発現する遺伝子組み換えT細胞が、ビヒクルまたは制御分子/組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より大きな生理学的応答(すなわち、下流効果)を産生、誘発、または引き起こす能力を指す。測定可能な生理学的反応としては特にT細胞の拡張、活性化、持続性、および/または癌細胞殺傷能力の増加が挙げられ、当分野および本明細書の記載の理解から明白である。「増加した」または「強化された」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によりもたらされる反応の1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30またはそれ以上(例えば500倍、1000倍)(その間および1を超えるすべての整数および小数点を含む、例えば1.5、1.6、1.7、1.8など)である増加を含む場合がある。
「減少する」、または「下げる」、または「低める」、または「低下する」、または「弱める」とは概して、本明細書において予期される組成物が、ビヒクルまたは対照の分子/組成物による反応と比較して、小さな生理学的反応(すなわち下流効果)をもたらす、惹起させる、または発生させる能力を指す。「減少」または「低下した」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物によりもたらされる反応、または特定の細胞株での反応の1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30またはそれ以上(例えば500倍、1000倍)(その間および1を超えるすべての整数および小数点を含む、例えば1.5、1.6、1.7、1.8など)である減少を含む場合がある。
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化がない」、または「実質的な変化がない」、または「実質的な減少が無い」とは概して、本明細書において予期される組成物が、ビヒクル、対照の分子/組成物により生じた反応、または特定の細胞株での反応と比較して、細胞において類似した、または同等の生理学的反応(すなわち、下流効果)を生成する、惹起させる、または生じさせることを指す。同等の反応は、基準反応と実質的に違わない、又は測定可能な程度に違わない反応である。
一実施形態において、それを必要とする対象におけるB細胞関連状態または癌を治療する方法は、有効量、例えば、本明細書で企図される遺伝子改変免疫エフェクター細胞を含む組成物の治療有効量を投与することを含む。投与の量ならびに頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプおよび重大度といった因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定されてもよい。
一実施形態において、対象に投与される組成物において、CARを発現する免疫エフェクター細胞、例えばT細胞の量は、少なくとも0.1×105細胞、少なくとも0.5×105細胞、少なくとも1×105細胞、少なくとも5×105細胞、少なくとも1×106細胞、少なくとも0.5×107細胞、少なくとも1×107細胞、少なくとも0.5×108細胞、少なくとも1×108細胞、少なくとも0.5×109細胞、少なくとも1×109細胞、少なくとも2×109細胞、少なくとも3×109細胞、少なくとも4×109細胞、少なくとも5×109細胞または少なくとも1×1010細胞である。
特定の実施形態では、約1×107T細胞~約1×109T細胞、約2×107T細胞~約0.9×109T細胞、約3×107T細胞~約0.8×109T細胞、約4×107T細胞~約0.7×109T細胞、約5×107T細胞~約0.6×109T細胞、又は約5×107T細胞~約0.5×109T細胞が対象に投与される。
一つの態様において、対象に投与される組成物中の免疫エフェクター細胞、例えば、CARを発現するT細胞の量は、少なくとも0.1×104細胞/kg体重、少なくとも0.5×104細胞/kg体重、少なくとも1×104細胞/kg体重、少なくとも5×104細胞/kg体重であり、少なくとも1×105細胞/kg体重、少なくとも0.5×106細胞/kg体重、少なくとも1×106細胞/kg体重、少なくとも0.5×107細胞/kg体重、少なくとも1×107細胞/kg体重、少なくとも0.5×108細胞/kg体重、少なくとも1×108細胞/kg体重、少なくとも2×108細胞/kg体重、少なくとも3×108細胞/kg体重、少なくとも4×108細胞/kg体重、少なくとも5×108細胞/kg体重、または少なくとも1×109細胞/kg体重である。
特定の実施形態では、約1×106T細胞/体重kg~約1×108T細胞/体重kg、約2×106T細胞/体重kg~約0.9×108T細胞/体重kg、約3×106T細胞/体重kg~約0.8×108T細胞/体重kg、約4×106T細胞/体重kg~約0.7×108T細胞/体重kg、約5×106T細胞/体重kg~約0.6×108T細胞/体重kg、または約5×106T細胞/体重kg~約0.5×108T細胞/体重kgが対象に投与される。
当業者であれば、所望の治療効果を発揮させるために、本明細書に企図される組成物の複数回の投与が必要とされる場合があることを認識するであろう。例えば、組成物は、1週、2週、3週、1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、1年、2年、5年、10年またはそれ以上の期間にわたり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10回以上投与される場合がある。
ある実施形態では、対象に活性化された免疫エフェクター細胞が投与され、次いで対象から採血して(またはアフェレーシス療法を実施し)、それに由来する免疫エフェクター細胞を活性化し、そしてこれら活性化および拡張された免疫エフェクター細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週ごとに複数回実施されてもよい。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、10cc~400ccの採血から活性化されてもよい。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc、又は400cc以上の採血から活性化される。学説には拘束されないが、複数回の採血/複数回の再注入のプロトコルを使用することで、免疫エフェクター細胞のある群の選択に役立つ場合がある。
本明細書で予期される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植、または移植を含む、任意の都合の良い方法で実施されうる。好ましい実施形態では、組成物は非経口的に投与される。本明細書で使用される場合、「非経口投与」及び「非経口的に投与」という語句は、経腸投与及び局所投与以外の投与様式を指し、通常は注射によって、限定されるものではないが、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内の、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。一実施形態では、本明細書で予期される組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位への直接注射によって対象に投与される。
一実施形態では、対象のB細胞関連状態に対する細胞性免疫反応を増加させる組成物の有効量がそれを必要とする対象に投与される。免疫応答は、感染細胞を殺傷することができる細胞傷害性T細胞、制御T細胞、ヘルパーT細胞応答によって媒介される細胞免疫応答を含んでもよい。主にB細胞を活性化することができるヘルパーT細胞によって媒介され、したがって抗体産生をもたらす液性免疫応答も誘発され得る。様々な技術を使用して、組成物によって誘導される免疫応答のタイプを分析してもよく、それら技術は当分野において例えば、例えば、Current Protocols in Immunology、John E.Coligan、Ada M.Kruisbeek、David H.Margulies、Ethan M.Shevach、Warren Strober編(2001年)John Wiley & Sons,NY、N.Y.。
一実施形態において、B細胞関連状態または癌と診断された対象を治療する方法が提供され、癌またはBCMA発現B細胞関連状態と診断された対象から免疫エフェクター細胞を除去し、本明細書で企図されるCARをコードする核酸を含むベクターで前記免疫エフェクター細胞を遺伝子改変することを含み、これにより改変免疫エフェクター細胞の集団を作製し、改変免疫エフェクター細胞の集団をこの対象に投与する。好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞は、T細胞を含む。
特定の実施形態において、対象における標的細胞集団に対する免疫モジュレーター応答を媒介する免疫エフェクター細胞を刺激するための方法が提供され、CAR分子をコードする核酸構築物を発現する免疫エフェクター細胞集団を対象に投与するステップを含む。
特定の実施形態に企図される細胞組成物を投与する方法は、対象においてCARを直接的に発現するか、又は対象に導入するときにCARを発現する成熟免疫エフェクター細胞に分化する免疫エフェクター細胞の遺伝子改変された前駆体を再導入するかのいずれかである、エクスビボで遺伝子改変された免疫エフェクター細胞の再導入をもたらすのに効果的である任意の方法を含む。一つの方法は、本明細書に予期される核酸構築物を用いて生体外で末梢血T細胞を形質導入することと、当該形質導入細胞を対象に戻すことと、を含む。
本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、及び登録された特許は、あたかも個々の刊行物、特許出願、又は登録された特許が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示したかのように、参照により本明細書中に組み込まれる。
前述の実施形態は、明確性及び理解を目的として、図及び実施例により詳細に記載されているが、本明細書において企図される教示に照らし、特定の変化及び改変が、添付の請求の範囲の主旨又は範囲から逸脱することなく実施されうることが当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、解説のみを目的として提供されるものであり、限定ではない。当業者であれば、本質的に類似した結果をもたらすために変更又は修正されうる様々な非臨界パラメータを容易に認識するであろう。
実施例1
ヒト抗-BCMA CARの構築
ヒト抗BCMA CARを含む構築物を含むレンチウイルスベクターを設計、構築、および検証した。CD8αシグナル配列、ヒト抗BCMA scFv、CD8αヒンジおよび膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む抗BCMA CARに作動可能に連結されたMNDU3プロモーターを含む構築物をレンチウイルスベクターにクローニングした。抗BCMA scFvは、ポリグリシン-セリンリンカーを使用してVH / VLおよびVL / VHの両方の向きで設計および評価した 例示的な抗BCMA CARポリペプチド配列は、配列番号{ut}50、52、54、56、58、60、62、64、66、および68に記載され、例示的な抗BCMA CARポリヌクレオチド配列は、配列番号{ut}49、51、53、55、57、59、61、63、65、および67{ut}に記載される。
ヒト抗-BCMA CARの構築
ヒト抗BCMA CARを含む構築物を含むレンチウイルスベクターを設計、構築、および検証した。CD8αシグナル配列、ヒト抗BCMA scFv、CD8αヒンジおよび膜貫通ドメイン、CD137共刺激ドメイン、およびCD3ζ一次シグナル伝達ドメインを含む抗BCMA CARに作動可能に連結されたMNDU3プロモーターを含む構築物をレンチウイルスベクターにクローニングした。抗BCMA scFvは、ポリグリシン-セリンリンカーを使用してVH / VLおよびVL / VHの両方の向きで設計および評価した 例示的な抗BCMA CARポリペプチド配列は、配列番号{ut}50、52、54、56、58、60、62、64、66、および68に記載され、例示的な抗BCMA CARポリヌクレオチド配列は、配列番号{ut}49、51、53、55、57、59、61、63、65、および67{ut}に記載される。
実施例2
ヒト抗BCMA CAR T細胞の評価
BCMAに特異的でヒトscFv(例えば、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、66、および68)を有するキメラ抗原受容体(CAR)を、マウス由来scFvを有する既知の抗BCMA CAR(「コンパレーター」)と比較して、BCMA発現細胞に対するCAR発現および生物学的活性について評価した。抗BCMA CAR T細胞は、G-REX(登録商標)フラスコを用いた7日間のプロセスで作製した。簡潔に説明すると、末梢血単核球(PBMC)を、IL-2(CellGenix,GmbH)社ならびにCD3およびCD28に特異的な抗体(Miltenyi Biotec,Inc.社)を含む培地中で培養した。抗BCMA CARをコードするレンチウイルスを培養開始の1日後に添加した。4日目に、CAR T細胞を24ウェルプレートから24ウェルのG-REXフラスコに移し、ここで7日目の採取まで細胞を維持した。CAR T細胞は、ゲノムDNAへのレンチウイルスベクターの組込みについて調べられた。細胞当たりのベクターコピーは、形質導入細胞について、導入遺伝子の1~4コピーの範囲であった。図2Aに示されるように、全ての形質導入細胞は、コンパレーター抗BMCA CAR T細胞と同等またはそれ以上のベクターコピー数を示す。
ヒト抗BCMA CAR T細胞の評価
BCMAに特異的でヒトscFv(例えば、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、66、および68)を有するキメラ抗原受容体(CAR)を、マウス由来scFvを有する既知の抗BCMA CAR(「コンパレーター」)と比較して、BCMA発現細胞に対するCAR発現および生物学的活性について評価した。抗BCMA CAR T細胞は、G-REX(登録商標)フラスコを用いた7日間のプロセスで作製した。簡潔に説明すると、末梢血単核球(PBMC)を、IL-2(CellGenix,GmbH)社ならびにCD3およびCD28に特異的な抗体(Miltenyi Biotec,Inc.社)を含む培地中で培養した。抗BCMA CARをコードするレンチウイルスを培養開始の1日後に添加した。4日目に、CAR T細胞を24ウェルプレートから24ウェルのG-REXフラスコに移し、ここで7日目の採取まで細胞を維持した。CAR T細胞は、ゲノムDNAへのレンチウイルスベクターの組込みについて調べられた。細胞当たりのベクターコピーは、形質導入細胞について、導入遺伝子の1~4コピーの範囲であった。図2Aに示されるように、全ての形質導入細胞は、コンパレーター抗BMCA CAR T細胞と同等またはそれ以上のベクターコピー数を示す。
CAR T細胞はまた、フローサイトメトリーを用いて細胞表面CAR発現について分析した。CAR T細胞は、組換え体、フィコエリスリン(PE)標識された、BCMA細胞外ドメイン-FC融合タンパク質(Creative BioMart,Inc社)を用いて染色した。陽性Fc-BCMA結合による表面CAR発現は、発現を有さなかったCAR3を除く様々なレベルで、すべての形質導入条件について検出された。これらの試薬は、T細胞が抗BCMA CARを特異的に発現することを確認する。図2Bに示されるように、CAR1、CAR4、またはCAR5で形質導入されたT細胞は、コンパレーター抗BMCA CAR T細胞と比較して同等またはそれ以上のCAR発現レベルを有する。
さらに、CAR T細胞の生物学的活性を、インターフェロンガンマ産生について単独で、または腫瘍細胞株との共培養で評価した。詳細には、BCMAを発現しないRD細胞株またはHT1080細胞との単独または共培養におけるCAR T細胞による抗原非依存性IFNγ産生を評価した。図3Aおよび3Bに示すように、CAR4を除くすべてのCARは、抗原とは無関係に最小限のIFNγを産生する。同様の結果は、図3Dおよび3EのCAR7-10でも見られる。また、CAR T細胞とバーキットリンパ腫細胞(Daudi細胞)またはBCMAを発現するHT.1080.BCMA細胞との共培養後のインターフェロンガンマ産生を測定した。図3Cおよび3Fに示すように、CAR1、CAR4、CAR5、CAR9、およびCAR10は、コンパレーター抗BCMA CARと同等またはそれ以上のIFNγを産生した。同様に、CAR1またはCAR5を単独で、または抗原陰性(HT1080)または抗原陽性(HT1080)腫瘍細胞株との共培養で、IFNγ産生について評価した場合、CAR1およびCAR5は、図3Iに示すように、抗原依存的に最小のIFNγを産生する一方で(図3Gおよび3Hに示される)、同様に、抗原依存的にも同程度またはそれ以上の量のIFNγを産生した。
さらに、CAR1、CAR5、CAR9、およびCAR10を抗原低(Jeko1)または抗原高(RPMI8336)腫瘍細胞株との共培養でIL2サイトカイン産生について評価したところ、図3Jおよび3Kに示すように、CAR1およびCAR5はコンパレーターCARよりも多くのIL2を産生した。
実施例3
低および高抗原発現腫瘍細胞に対するヒト抗BCMA CAR T細胞活性化の評価
別の実験では、抗BCMA CAR T細胞は、大規模な臨床製造工程に対して直接スケーラブルなシステムを使用して生産された。簡潔に説明すると、末梢血単核球(PBMC)を、IL-2(CellGenix,GmbH)社ならびにCD3およびCD28に特異的な抗体(Miltenyi Biotec,Inc.社)を含む培地中で培養した。抗BCMA CARをコードするレンチウイルスは、培養開始の1日後に指定された感染多重度(MOI)で添加された。CAR T細胞は、IL-2を含む新鮮な培地を添加して合計10日間培養することにより、対数期に維持した。抗BCMA CAR T細胞は、結合したBCMA-Fc抗原のフローサイトメトリー分析によって表面CAR発現について分析し、正規化された数のCAR陽性CAR T細胞を単独で、または様々な抗原密度の腫瘍細胞と共に培養物に添加した。B細胞リンパ腫細胞株RLおよびToledoは、バーケットリンパ腫細胞株(Daudi)および操作された細胞株HT1080.BCMAと比べて、低いBCMA応現を有する。
低および高抗原発現腫瘍細胞に対するヒト抗BCMA CAR T細胞活性化の評価
別の実験では、抗BCMA CAR T細胞は、大規模な臨床製造工程に対して直接スケーラブルなシステムを使用して生産された。簡潔に説明すると、末梢血単核球(PBMC)を、IL-2(CellGenix,GmbH)社ならびにCD3およびCD28に特異的な抗体(Miltenyi Biotec,Inc.社)を含む培地中で培養した。抗BCMA CARをコードするレンチウイルスは、培養開始の1日後に指定された感染多重度(MOI)で添加された。CAR T細胞は、IL-2を含む新鮮な培地を添加して合計10日間培養することにより、対数期に維持した。抗BCMA CAR T細胞は、結合したBCMA-Fc抗原のフローサイトメトリー分析によって表面CAR発現について分析し、正規化された数のCAR陽性CAR T細胞を単独で、または様々な抗原密度の腫瘍細胞と共に培養物に添加した。B細胞リンパ腫細胞株RLおよびToledoは、バーケットリンパ腫細胞株(Daudi)および操作された細胞株HT1080.BCMAと比べて、低いBCMA応現を有する。
図4Aに示すように、CAR1およびCAR5の両方は、抗原に依存せず、かつコンパレーター抗BCMA CAR T細胞よりも少ない最小限のIFNγを産生する。しかし、低BCMA密度細胞株との共培養から産生されたIFNγ産生は、CAR1およびCAR5のIFNγ産生がコンパレーターよりも高いことを示唆している(図4B)。さらに、高BCMA密度細胞株との共培養から産生されたIFNγ産生は、CAR1およびCAR5のIFNγ産生がコンパレーターと類似していることを示唆している(図4C)。このデータは、ヒトCAR1およびCAR5 T細胞が、1)低抗原密度細胞に対してコンパレーターCARよりも潜在的に強力であり、2)コンパレーターCARと比較して高抗原密度細胞に対して少なくとも同程度強力であり、3)抗原非依存性IFNγ放出が低いことを示唆している。
実施例4
抗原発現腫瘍細胞に対するヒト抗BCMA CAR T細胞傷害性の評価
BCMA発現癌細胞を殺す抗BCMA CAR T細胞の能力を評価するために、抗BCMA CAR T細胞を、実施例3で上述したような大規模な臨床製造プロセスに直接スケーラブルなシステムを使用して最初に作製した。培養10日後、核赤色蛍光タンパク質(HT1080-nucRed)またはBCMAを発現するように操作された誘導体株(HT.1080-nucRed.BCMA)を発現するHT.1080細胞株を用いて、同数の抗BCMA発現CAR T細胞を様々なエフェクター対標的細胞比(E:T)で培養した。
抗原発現腫瘍細胞に対するヒト抗BCMA CAR T細胞傷害性の評価
BCMA発現癌細胞を殺す抗BCMA CAR T細胞の能力を評価するために、抗BCMA CAR T細胞を、実施例3で上述したような大規模な臨床製造プロセスに直接スケーラブルなシステムを使用して最初に作製した。培養10日後、核赤色蛍光タンパク質(HT1080-nucRed)またはBCMAを発現するように操作された誘導体株(HT.1080-nucRed.BCMA)を発現するHT.1080細胞株を用いて、同数の抗BCMA発現CAR T細胞を様々なエフェクター対標的細胞比(E:T)で培養した。
図5に示すように、CAR1、CAR5、CAR9およびCAR10およびHT.1080-nucRed.BCMA細胞株との共培養において、さまざまな程度の抗原依存性細胞傷害が経時的に観察された。
実施例5
内因性および改変細胞株におけるBCMA抗原密度
別の実験では、BCMA受容体密度を、内因的に発現するBCMA(例えば、RL、Toledo、Daudi、およびRPMI-8226)およびBCMAを発現するように操作された(例えば、HT.1080.BCMA)の両方を有する様々な細胞株で評価した。BCMA密度は、Quantum(商標)Simply Cellular(登録商標)Assay(Bangs Laboratories,Inc.社)を用いて抗BCMA抗体クローン19F2(Biolegend社)を用いて評価した。図6に示すように、改変細胞株HT.1080BCMAおよび多発性骨髄腫細胞株RPMI-8226は、平均20,000個の受容体を有する最高量のBCMAを発現した。リンパ腫株Daudi、ToledoおよびRLは、HT.1080.BCMAまたはRPMI-8226よりも10~50倍少ないBCMA抗原を発現する。
内因性および改変細胞株におけるBCMA抗原密度
別の実験では、BCMA受容体密度を、内因的に発現するBCMA(例えば、RL、Toledo、Daudi、およびRPMI-8226)およびBCMAを発現するように操作された(例えば、HT.1080.BCMA)の両方を有する様々な細胞株で評価した。BCMA密度は、Quantum(商標)Simply Cellular(登録商標)Assay(Bangs Laboratories,Inc.社)を用いて抗BCMA抗体クローン19F2(Biolegend社)を用いて評価した。図6に示すように、改変細胞株HT.1080BCMAおよび多発性骨髄腫細胞株RPMI-8226は、平均20,000個の受容体を有する最高量のBCMAを発現した。リンパ腫株Daudi、ToledoおよびRLは、HT.1080.BCMAまたはRPMI-8226よりも10~50倍少ないBCMA抗原を発現する。
実施例6
ヒト抗BCMA CAR T細胞抗原依存性増殖の評価
BCMA発現癌細胞の存在下で増殖する抗BCMA CAR T細胞の能力を評価するために、実施例2に記載したものと同様の系を用いて抗BCMA CAR T細胞を最初に作製した。培養10日後、核赤色蛍光タンパク質を発現するHT.1080細胞株(HT1080-nucRed)またはBCMAを発現するように操作された誘導体株(HT.1080-nucRed.BCMA)を用いて、同数の抗BCMA発現CAR T細胞を、条件ごとに各細胞タイプの5E3から培養した。
ヒト抗BCMA CAR T細胞抗原依存性増殖の評価
BCMA発現癌細胞の存在下で増殖する抗BCMA CAR T細胞の能力を評価するために、実施例2に記載したものと同様の系を用いて抗BCMA CAR T細胞を最初に作製した。培養10日後、核赤色蛍光タンパク質を発現するHT.1080細胞株(HT1080-nucRed)またはBCMAを発現するように操作された誘導体株(HT.1080-nucRed.BCMA)を用いて、同数の抗BCMA発現CAR T細胞を、条件ごとに各細胞タイプの5E3から培養した。
図7Aに示すように、CAR T細胞添加後6日目にHT.1080-nucRed細胞株に対しては、最小から全く増殖が認められなかった。しかしながら、HT.1080-nucRed.BCMA細胞株を発現するBCMAとの共培養において増殖が観察された(図7B)。
概して、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定させるものと解釈されるべきではないが、かかる特許請求の範囲が権利を与える等価物の完全な範囲とともに全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、請求の範囲は、本開示により限定されない。
Claims (168)
- キメラ抗原受容体(CAR)であって、
a)配列番号7、15、23、31、39もしくは47に記載の可変軽鎖アミノ酸配列内の可変軽鎖CDRL1、CDRL2およびCDRL3領域、ならびに配列番号8、16、24、32、40もしくは48に記載の可変重鎖アミノ酸配列内の可変重鎖CDRH1、CDRH2、およびCDRH3領域を含む、ヒトBCMAポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗BCMA(B細胞成熟抗原)抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞外ドメイン、
b)膜貫通ドメイン、
c)一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
d)一次シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体(CAR)。 - 前記可変軽鎖アミノ酸配列が配列番号7に記載され、および/または前記可変重鎖アミノ酸配列が配列番号8に記載される、請求項1に記載のCAR。
- 前記可変軽鎖アミノ酸配列が配列番号15に記載され、および/または前記可変重鎖アミノ酸配列が配列番号16に記載される、請求項1に記載のCAR。
- 前記可変軽鎖アミノ酸配列が配列番号23に記載され、および/または前記可変重鎖アミノ酸配列が配列番号24に記載される、請求項1に記載のCAR。
- 前記可変軽鎖アミノ酸配列が配列番号31に記載され、および/または前記可変重鎖アミノ酸配列が配列番号32に記載される、請求項1に記載のCAR。
- 前記可変軽鎖アミノ酸配列が配列番号39に記載され、および/または前記可変重鎖アミノ酸配列が、配列番号40に記載される、請求項1に記載のCAR。
- 前記可変軽鎖アミノ酸配列が配列番号47に記載され、および/または前記可変重鎖アミノ酸配列が配列番号48に記載される、請求項1に記載のCAR。
- キメラ抗原受容体(CAR)であって、
a)配列番号1~3、9~11、17~19、25~27、33~35または41~43に記載の可変軽鎖CDRL1、CDRL2およびCDRL3配列、ならびに配列番号4~6、12~14、20~22、28~30、36~38、または44~46に記載の可変重鎖CDRH1、CDRH2、CDRH3配列を含むヒトBCMAポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗BCMA(B細胞成熟抗原)抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン、
b)膜貫通ドメイン、
c)一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
d)一次シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体(CAR)。 - 前記抗BCMA抗体または抗原結合断片が、キャメルIg、Ig NAR、Fab断片、Fab’断片、F(ab)’2断片、F(ab)’3断片、Fv、一本鎖Fv抗体(「scFv」)、bis-scFv、(scFv)2、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Fvタンパク質(「dsFv」)、およびシングルドメイン抗体(sdAb、ナノボディ)からなる群から選択される、請求項1~8のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体または抗原結合断片がscFvである、請求項1~9のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号1~3のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号4~6のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号9~11のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号12~14のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号17~19のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号20~22のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号25~27のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号28~30のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号33~35のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号36~38のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号41~43のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号44~46のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号7、15、23、31、39もしくは47のいずれか一つに記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号8、16、24、32、40もしくは48のいずれか一つに記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号7に記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号8に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号15に記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号16に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号23に記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号24に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号31に記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号32に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号39に記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号40に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号31に記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号48に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号7、15、23、31、39もしくは47のいずれか一つに記載される可変軽鎖配列および/または配列番号8、16、24、32、40もしくは48のいずれか一つに記載される可変重鎖配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号7に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号8に記載される可変重鎖配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号15に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号16に記載される可変重鎖配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号23に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号24に記載される可変重鎖配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号31に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号32に記載される可変重鎖配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号39に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号40に記載される可変重鎖配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号47に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号48に記載される可変重鎖配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記抗体またはその抗原結合断片はscFvであり、前記可変軽鎖は前記可変重鎖のそれに対してc末端に位置する、請求項1~30のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がscFvであり、前記可変重鎖は前記可変軽鎖のそれに対してc末端に位置する、請求項1~30のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記膜貫通ドメインが、T細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、CDδ、CD3ε、CDγ、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、およびPD1からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項1~32のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記膜貫通ドメインがCD8α CD4、CD45、PD1およびCD152からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項1~33のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記膜貫通ドメインがCD8αから単離される、請求項1~34のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記膜貫通ドメインがPD1から単離される、請求項1~34のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記膜貫通ドメインがCD152から単離される、請求項1~34のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、およびZAP70からなる群から選択される共刺激分子から単離される、請求項1~37のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、CD28、CD134、およびCD137からなる群から選択される共刺激分子から単離される、請求項1~38のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインがCD28から単離される、請求項1~39のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインがCD134から単離される、請求項1~39のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインがCD137から単離される、請求項1~39のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記一次シグナル伝達ドメインが、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b及びCD66dからなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項1~42のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記一次シグナル伝達ドメインがCD3ζから単離される、請求項1~43のいずれか一項に記載のCAR。
- ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む、請求項1~44のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記ヒンジ領域ポリペプチドが、CD8αのヒンジ領域を含む、請求項45に記載のCAR。
- 前記ヒンジ領域ポリペプチドが、PD1のヒンジ領域を含む、請求項45に記載のCAR。
- 前記ヒンジ領域ポリペプチドが、CD152のヒンジ領域を含む、請求項45に記載のCAR。
- シグナルペプチドをさらに含む、請求項1~48のいずれか一項に記載のCAR。
- スペーサー領域をさらに含む、請求項1~49のいずれか一項に記載のCAR。
- 前記スペーサー領域ポリペプチドが、IgG1、IgG2、IgG4またはIgDのCH2領域およびCH3領域を含む、請求項50に記載のCAR。
- 配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、66および68のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1~51のいずれか一項に記載のCAR。
- 配列番号50に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1~52のいずれか一項に記載のCAR。
- 配列番号52に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1~52のいずれか一項に記載のCAR。
- 配列番号54に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1~52のいずれか一項に記載のCAR。
- 配列番号56に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1~52のいずれか一項に記載のCAR。
- 配列番号58に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1~52のいずれか一項に記載のCAR。
- 配列番号60に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1~52のいずれか一項に記載のCAR。
- 配列番号62に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1~52のいずれか一項に記載のCAR。
- 配列番号64に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1~52のいずれか一項に記載のCAR。
- 配列番号66に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1~52のいずれか一項に記載のCAR。
- 配列番号68に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1~52のいずれか一項に記載のCAR。
- 請求項1~62のいずれか一項に記載のCARのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
- 請求項1~63のいずれか一項に記載のCARまたはポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、65および67のいずれか一つに記載されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項64に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、65および67のうちのいずれか一つに記載されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項64に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項64~66のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 前記ベクターが発現ベクターである、請求項67に記載のベクター。
- 前記ベクターがエピソームベクターである、請求項67または68に記載のベクター。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項67~69のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項67~70のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項67~71のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス1(HIV-1)、ヒト免疫不全ウイルス2(HIV-2)、ビスナマエディウイルス(VMV)ウイルス、カプリン関節炎 - 脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、およびシミアン免疫不全ウイルス(SIV)から本質的になる群から選択される、請求項72に記載のベクター。
- 左(5’)レトロウイルスLTR、Psi(Ψ)パッケージングシグナル、中心ポリプリン管/DNAフラップ(cPPT/FLAP)、レトロウイルス輸出要素、請求項45に記載のポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーター、および右(3’)レトロウイルスLTRを含む、請求項70~73のいずれか一項に記載のベクター。
- 異種ポリアデニル化配列をさらに含む、請求項70~74のいずれか一項に記載のベクター。
- B型肝炎ウイルス転写後調節エレメント(HPRE)またはウッドチャック転写後調節エレメント(WPRE)をさらに含む、請求項70~75のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記5’-LTRの前記プロモーターが異種プロモーターで置換される、請求項70~76のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記異種プロモーターが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラス肉腫ウイルス(RSV)プロモーターまたはシミアンウイルス40(SV40)プロモーターである、請求項77に記載のベクター。
- 前記5’LTRまたは3’LTRがレンチウイルスLTRである、請求項74~78のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記3’LTRが一つ以上の改変を含む、請求項74~79のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記3’LTRが一つ以上の欠失を含む、請求項74~80のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記3’LTRが自己不活化(SIN)LTRである、請求項74~81のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ポリアデニル化配列が、ウシ成長ホルモンポリアデニル化またはシグナルラビットのβ-グロビンポリアデニル化配列である、請求項75~82のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項64~66のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが、最適化されたKozak配列を含む、請求項67~83のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項64に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結された前記プロモーターが、サイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーター(CMV)、伸長因子1アルファプロモーター(EF1-α)、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1プロモーター(PGK)、ユビキチン-Cプロモーター(UBQ-C)、サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリベータ-アクチンプロモーター(CAG)、ポリオーマエンハンサー/単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(MC1)、ベータアクチンプロモーター(β-ACT)、シミアンウイルス40プロモーター(SV40)、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーであって、陰性対照領域が欠失し、dl587revプライマー結合部位が置換された(MND)U3プロモーターからなる群から選択される、請求項74~84のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項1~63のいずれか一項に記載のCARまたはポリペプチドを発現する、細胞。
- 請求項64~66のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項67~85のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
- 前記細胞が遺伝子操作された宿主細胞である、請求項86または87に記載の細胞。
- 前記細胞が造血細胞である、請求項86~88のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、造血幹細胞又は前駆細胞である、請求項86~89のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、CD34+造血幹細胞又は前駆細胞である、請求項86~90のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項86~89のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、T細胞である、請求項86~89および92のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、CD3+、CD4+および/またはCD8+細胞である、請求項86~89、92および93のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、またはヘルパーT細胞である、請求項86~89および92~94のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記T細胞が、αβ-T細胞である、請求項93~95のいずれか一項に記載のT細胞。
- 前記T細胞が、γδ-T細胞である、請求項93~95のいずれか一項に記載のT細胞。
- 前記宿主細胞が、ナチュラルキラー(NK)細胞である、請求項86~89および92のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記ナチュラルキラー細胞が、ナチュラルキラーT(NKT)細胞である、請求項98に記載の細胞。
- 前記細胞がマクロファージである、請求項86~89および92のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記免疫エフェクター細胞が、請求項67~85のいずれか一項に記載のベクターで形質導入され、PI3K経路の阻害剤の存在下で活性化および刺激され、それによって、PI3K経路の前記阻害剤の非存在下で活性化および刺激された形質導入免疫エフェクター細胞の増殖と比較して、前記形質導入免疫エフェクター細胞の増殖を維持する、請求項92~100のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
- PI3K経路の前記阻害剤の存在下で、活性化され刺激された前記免疫エフェクター細胞が、i)CD62L、CD127、CD197、及びCD38からなる群から選択される一つ以上のマーカー、またはii)CD62L、CD127、CD197、及びCD38の全ての前記マーカーを、PI3K経路の前記阻害剤の非存在下で活性化され刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた、請求項101に記載の免疫エフェクター細胞。
- PI3K経路の前記阻害剤の存在下で、活性化され刺激された前記免疫エフェクター細胞が、i)CD62L、CD127、CD27、及びCD8からなる群から選択される一つ以上のマーカー、またはii)CD62L、CD127、CD27、及びCD8の全ての前記マーカーを、PI3K経路の前記阻害剤の非存在下で、活性化され刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた、請求項101に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記PI3K阻害剤がZSTK474である、請求項101~103のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
- 前記細胞またはその子孫が、BCMA発現細胞との共培養において高いIFNγ放出を示す、請求項86~104のいずれか一項に記載の細胞またはその子孫。
- 前記細胞または子孫が、前記CARがマウス由来抗BCMA scFvを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じ細胞と比較してBCMA発現細胞との共培養において、類似またはより高いIFNγ放出を呈する、請求項86~105のいずれか一項に記載の細胞またはその子孫。
- 前記共培養されたBCMA発現細胞が、Daudi細胞、HT1080.BCMA細胞、および/またはRPMI-8226細胞である、請求項105もしくは請求項106に記載の細胞またはその子孫。
- 前記細胞またはその子孫が、低BCMA発現細胞との共培養において高いIFNγ放出を示す、請求項86~107のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記低BCMA発現細胞が、Daudi細胞、HT1080.BCMA細胞、および/またはRPMI-8226細胞と比較して、少なくとも5倍少ない表面BCMA発現を有する、請求項108に記載の細胞。
- 前記低BCMA発現細胞が、HT1080.BCMA細胞と比較して、少なくとも10倍少ない表面BCMA発現を有する、請求項108または請求項109に記載の細胞。
- 前記低BCMA発現細胞が、RPMI-8226細胞と比較して、少なくとも10倍少ない表面BCMA発現を有する、請求項108~110のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記低BCMA発現細胞が、RL細胞および/またはToledo細胞である、請求項108~111のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記CAR T細胞が、前記CARがマウス由来抗BCMA scFvを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じCAR T細胞と比較して、低抗原密度細胞との共培養においてより高いIFNγ放出を呈する、請求項108~112のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、低抗原非依存性シグナル伝達を示す、請求項86~113のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、前記CARがマウス由来抗BCMA scFvを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じCAR T細胞と比較して、低抗原非依存性シグナル伝達を示す、請求項86~114のいずれか一項に記載の細胞。
- 請求項86~115のいずれか一項に記載の細胞および生理学的に許容可能な賦形剤を含む、組成物。
- 請求項1~63のいずれか一項に記載のCARまたはポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞を生成する方法であって、請求項67~85のいずれか一項に記載のベクターを免疫エフェクター細胞に導入することを含む、方法。
- 前記免疫エフェクター細胞を刺激すること、ならびに前記細胞をCD3に結合する抗体およびCD28に結合する抗体と接触させることによって前記細胞の増殖を誘発すること、それによって、免疫エフェクター細胞の集団を生成すること、をさらに含む、請求項117に記載の方法。
- 前記免疫エフェクター細胞が前記ベクターを導入する前に刺激され、増殖を誘発される、請求項118に記載の方法。
- 前記免疫エフェクター細胞が、Tリンパ球を含む、請求項118または請求項119に記載の方法。
- 前記免疫エフェクター細胞がNK細胞を含む、請求項118または請求項119に記載の方法。
- PI3K経路の前記阻害剤の存在下で、前記免疫エフェクター細胞が、活性化され刺激され、i)CD62L、CD127、CD197、及びCD38からなる群から選択される一つ以上のマーカー、またはii)CD62L、CD127、CD197、およびCD38の全ての前記マーカーを、PI3K経路の前記阻害剤の非存在下で活性化され刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた、請求項117~121のいずれか一項に記載の方法。
- PI3K経路の前記阻害剤の存在下で、前記免疫エフェクター細胞が、活性化され刺激され、i)CD62L、CD127、CD27、及びCD8からなる群から選択される一つ以上のマーカー、またはii)CD62L、CD127、CD27、およびCD8の全ての前記マーカーを、PI3K経路の前記阻害剤の非存在下で活性化され刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた、請求項117~121のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PI3K阻害剤がZSTK474である、請求項122または請求項123に記載の方法。
- 請求項116に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象のB細胞関連状態を治療する方法。
- 前記B細胞関連状態が癌である、請求項125に記載の方法。
- 前記癌が固形癌である、請求項126に記載の方法。
- 前記癌が液性癌である、請求項126に記載の方法。
- 前記癌が、血液悪性腫瘍である、請求項126に記載の方法。
- 前記B細胞関連状態が、多発性骨髄腫(MM)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、不確かな悪性電位のB細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少症紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、ANCA関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、および急速に進行する糸球体腎炎、重鎖疾患、原発性または免疫細胞関連アミロイドーシス、または重要性が不明のモノクローナルガンモパシーである、請求項125に記載の方法。
- 前記B細胞関連状態がB細胞悪性腫瘍である、請求項125~130のいずれか一項に記載の方法。
- 前記B細胞悪性腫瘍が、多発性骨髄腫(MM)または非ホジキンリンパ腫(NHL)である、請求項131に記載の方法。
- 前記MMが、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、IgD骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、および髄外形質細胞腫からなる群から選択される、請求項132に記載の方法。
- 前記NHLが、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫(CLL/SLL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆体Bリンパ芽球性リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項132に記載の方法。
- 前記B細胞関連状態が形質細胞悪性腫瘍である、請求項125に記載の方法。
- 前記B細胞関連状態が自己免疫疾患である、請求項125に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項136に記載の方法。
- 前記B細胞関連状態が関節リウマチである、請求項125に記載の方法。
- 前記B細胞関連状態が、特発性血小板減少症紫斑病、または重症筋無力症、または自己免疫性溶血性貧血である、請求項125に記載の方法。
- 対象においてBCMAを発現する癌に関連する一つ以上の症状で改善する方法であって、BCMAを発現する癌細胞に関連する少なくとも一つの症状を改善するのに十分な量の請求項116に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記改善される一つ以上の症状が、脱力感、疲労、息切れ、容易な打撲傷および出血、頻繁な感染症、リンパ節の肥大、腹部の膨満または痛みを伴う、骨または関節の痛み、骨折、計画外の体重減少、食欲不振、寝汗、持続性の軽度の発熱、および排尿の減少からなる群から選択される、請求項140に記載の方法。
- 対象においてBCMAを発現する細胞数を減少させるための方法であって、投与前のBCMAを発現する細胞の数と比較して、BCMAを発現する細胞数を減少させるのに十分な量の請求項116に記載の組成物を前記対象に前記投与することを含む、方法。
- 配列番号7、15、23、31、39または47に記載される可変軽鎖アミノ酸配列内の可変軽鎖CDRL1、CDRL2およびCDRL3領域、ならびに配列番号8、16、24、32、40または48に記載される可変重鎖アミノ酸配列内の可変重鎖CDRH1、CDRH2およびCDRH3領域を含む、ヒトBCMAポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片。
- 配列番号1~3、9~11、17~19、25~27、33~35または41~43のいずれか一つに記載される可変軽鎖CDRL1、CDRL2およびCDRL3配列、ならびに配列番号4~6、12~14、20~22、28~30、36~38または44~46に記載される可変重鎖CDRH1、CDRH2およびCDRH3配列を含む、ヒトBCMAポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体または抗原結合断片が、キャメルIg、Ig NAR、Fab断片、Fab’断片、F(ab)’2断片、F(ab)’3断片、Fv、一本鎖Fv抗体(「scFv」)、bis-scFv、(scFv)2、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Fvタンパク質(「dsFv」)、およびシングルドメイン抗体(sdAb、ナノボディ)からなる群から選択される、請求項143または請求項144に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体または抗原結合断片が、scFvである、請求項145に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号1~3のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号4~6のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号9~11のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号12~14のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号17~19のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号20~22のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号25~27のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号28~30のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号33~35のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号36~38のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号41~43のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖CDRおよび/または配列番号44~46のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖CDRを含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号7、15、23、31、39、もしくは47のいずれか一つに記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号8、16、24、32、40、または48のいずれか一つに記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号7に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号8に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号15に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号16に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号23に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号24に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号31に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号32に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号39に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号40に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号47に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに/または配列番号48に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗BCMA抗体またはその抗原結合断片が、配列番号7、15、23、31、39もしくは47のいずれか一つに記載される可変軽鎖配列および/または配列番号8、16、24、32、40もしくは48のいずれか一つに記載される可変重鎖配列を含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号7に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号8に記載される可変重鎖配列を含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号15に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号16に記載される可変重鎖配列を含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
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- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号47に記載される可変軽鎖配列および/または配列番号48に記載される可変重鎖配列を含む、請求項143~146のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がscFvであり、前記可変軽鎖は前記可変重鎖のそれに対してc末端に位置する、請求項153~166のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がscFvであり、前記可変重鎖は前記可変軽鎖のそれに対してc末端に位置する、請求項153~166のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
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