JP2023539591A - Ｂｃｍａキメラ抗原受容体 - Google Patents

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Abstract

本開示は、Ｂ細胞関連状態のための養子Ｔ細胞療法のための改善された組成物を提供する。本開示は一般に、Ｔ細胞療法を生成するための改善されたベクター、抗体、抗体断片およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ならびにそれを使用する方法を提供する。特に、本開示は、改善された抗ＢＣＭＡ抗体、抗体断片およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。より詳細には、本開示は、改善されたヒト抗ＢＣＭＡ抗体、抗体断片、またはＣＡＲを提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月２５日に出願された米国仮出願第６３／０６９，７８４号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§ １１９（ｅ）の下、利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＢＬＵＥ－１３１ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、９６．４ＫＢで、２０２１年８月２２日に作成され、仕様の提出と同時にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
本発明は、一般に、Ｂ細胞関連状態を治療するための改善された組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、ヒト抗Ｂ細胞成熟抗原（抗ＢＣＭＡ）抗体またはその抗原結合断片を含む改善されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、これらのＣＡＲを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞、およびＢ細胞関連状態を効果的に治療するためのこれらの組成物の使用に関する。
関連分野に関する記載
いくつかの重要な疾患は、Ｂリンパ球、すなわちＢ細胞を含む。Ｂ細胞の悪性形質転換は、リンパ腫を含むがこれらに限定されない癌、例えば、多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫をもたらす。異常なＢ細胞の生理機能は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含むがこれらに限定されない自己免疫疾患の発症にもつながり得る。
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）を含む、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者の大部分は、癌死亡率に大きく寄与している。様々な形態の治療に対するＢ細胞悪性腫瘍の応答が混合される。化学療法、放射線療法および抗体治療など、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療する従来の方法は、限られた成功しかもたらさなかった。
最近では、ＢＣＭＡを標的とする治療用抗体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用することによって、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療する試みは、有望ではあるが限られた成功を収めている。実際、これらの治療法で治療した場合、すべての患者が治癒する、または完全な寛解を経験するわけではない。このような治療法を開発する際の一つの困難は、治療用抗体またはＣＡＲに使用される所与の抗原結合ドメインの治療有効性が予測不可能であることである。例えば、抗原結合ドメインが強すぎると、ＣＡＲ Ｔ細胞は大量のサイトカイン放出を誘発し、「サイトカインストーム」と見なされる致命的な免疫反応を引き起こす可能性があり、抗原結合ドメインの結合が弱すぎると、ＣＡＲ Ｔ細胞は、癌細胞を除去するのに十分な治療効果を示さない。さらに、一部のＣＡＲは、Ｔ細胞機能障害（Ｔ細胞枯渇と呼ばれることもある）を引き起こす抗原非依存性シグナル伝達の法外なレベルを示し、有効性を制限する。
したがって、抗原非依存性シグナル伝達およびＴ細胞機能障害を制限しながら改善された有効性を有する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを特定する必要性が依然として存在する。
本開示は一般に、Ｔ細胞療法を生成するための改善されたベクター、抗体、抗体断片およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ならびにそれを使用する方法を提供する。特に、本開示は、改善された抗ＢＣＭＡ抗体、抗体断片およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。より詳細には、本開示は、改善されたヒト抗ＢＣＭＡ抗体、抗体断片、またはＣＡＲを提供する。
本開示の一態様において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供され、ａ）配列番号７、１５、２３、３１、３９もしくは４７に記載される可変軽鎖アミノ酸配列内の可変軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３領域、ならびに配列番号８、１６、２４、３２、４０もしくは４８に記載される可変重鎖アミノ酸配列内の可変重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域を含む、ヒトＢＣＭＡポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞外ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、ｃ）一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにｄ）一次シグナル伝達ドメイン、を含む。
別の態様において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供され、ａ）ヒトＢＣＭＡポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメインであって、配列番号１～３、９～１１、１７～１９、２５～２７、３３～３５もしくは４１～４３に記載される可変軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号４～６、１２～１４、２０～２２、２８～３０、３６～３８もしくは４４～４６に記載の可変重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列を含み、ｂ）膜貫通ドメイン、ｃ）一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにｄ）一次シグナル伝達ドメイン、を含む。
様々な実施形態において、可変軽鎖アミノ酸配列は、配列番号７に記載され、および／または可変重鎖アミノ酸配列は、配列番号８に記載される。様々な実施形態において、可変軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１５に記載され、および／または可変重鎖アミノ酸配列は、配列番号１６に記載される。様々な実施形態において、可変軽鎖アミノ酸配列は、配列番号２３に記載され、および／または可変重鎖アミノ酸配列は、配列番号２４に記載される。様々な実施形態において、可変軽鎖アミノ酸配列は、配列番号３１に記載され、および／または可変重鎖アミノ酸配列は、配列番号３２に記載される。様々な実施形態において、可変軽鎖アミノ酸配列は、配列番号３９に記載され、および／または可変重鎖アミノ酸配列は、配列番号４０に記載される。様々な実施形態において、可変軽鎖アミノ酸配列は、配列番号４７に記載され、および／または可変重鎖アミノ酸配列は、配列番号４８に記載される。
様々な実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片は、以下からなる群から選択される：キャメルＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、およびシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片はｓｃＦｖである。
様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１～３のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号４～６のいずれかに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９～１１のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号１２～１４のいずれかに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７～１９のいずれか一つに記載の一つ以上の軽鎖ＣＤＲ、および／または配列番号２０～２２のいずれか一つに記載の一つ以上の重鎖ＣＤＲ配列を含む。特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２５～２７のいずれか一つに記載の一つ以上の軽鎖ＣＤＲ、および／または配列番号２８～３０のいずれか一つに記載の一つ以上の重鎖ＣＤＲ配列を含む。特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３～３５のいずれか一つに記載の一つ以上の軽鎖ＣＤＲ、および／または配列番号３６～３８のいずれか一つに記載の一つ以上の重鎖ＣＤＲ配列を含む。特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４１～４３のいずれか一つに記載の一つ以上の軽鎖ＣＤＲ、および／または配列番号４４～４６のいずれか一つに記載の一つ以上の重鎖ＣＤＲ配列を含む。
様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７、１５、２３、３１、３９もしくは４７のいずれか一つに記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号８、１６、２４、３２、４０もしくは４８のいずれかに記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号８に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１５に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号１６に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２３に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号２４に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３１に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号３２に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３９に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号４０に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３１に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号４８に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。
様々な実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７、１５、２３、３１、３９もしくは４７のいずれか一つに記載される可変軽鎖配列および／または配列番号８、１６、２４、３２、４０もしくは４８のいずれか一つに記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号８に記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１５に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号１６に記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２３に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号２４に記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３１に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号３２に記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３９に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号４０に記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４７に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号４８に記載される可変重鎖配列を含む。
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖであり、可変軽鎖は可変重鎖のそれに対してｃ末端に位置する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖであり、可変重鎖は可変軽鎖のそれに対してｃ末端に位置する。
様々な実施形態において、ＣＡＲ膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドから単離される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、以下からなる群から選択されるポリペプチドから単離される：ＣＤ８α；ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１およびＣＤ１５２。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインはＣＤ８αから単離される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＰＤ１から単離される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ１５２から単離される。
様々な実施形態において、一つ以上のＣＡＲ共刺激シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子から単離される。いくつかの実施形態において、一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択される共刺激分子から単離される。いくつかの実施形態において、一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８から単離される。いくつかの実施形態において、一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３４から単離される。いくつかの実施形態において、一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７から単離される。
様々な実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離される。いくつかの実施形態において、一次シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζから単離される。
様々な実施形態において、ＣＡＲは、ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＰＤ１のヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＣＤ１５２のヒンジ領域を含む。
様々な実施形態において、ＣＡＲは、スペーサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、スペーサー領域ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。
様々な実施形態において、ＣＡＲはシグナルペプチドをさらに含む。
様々な実施形態において、ＣＡＲは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、および６８のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号５２に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号５４に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号５６に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号５８に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号６２に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号６４に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号６６に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号６８に記載されるアミノ酸配列を含む。
様々な実施形態において、ＣＡＲは、本明細書において企図されるＣＡＲのいずれか一つのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
本開示の別の態様において、本明細書で企図されるＣＡＲまたはポリペプチドのいずれか一つをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、および６７のいずれか一つに記載されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５および６７のいずれか一つに記載されるポリヌクレオチド配列を含む。
本開示の別の態様において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドのいずれか一つを含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、本質的に以下からなる群から選択される：ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）、ビスナマエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、カプリン関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）。
特定の実施形態において、ベクターはさらに、左（５’）レトロウイルスＬＴＲ、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、中央ポリプリン管／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸出要素、請求項４５に記載のポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーター、および右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、異種ポリアデニル化配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）またはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、５’ＬＴＲのプロモーターは、異種プロモーターで置換される。いくつかの実施形態において、異種プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。いくつかの実施形態において、５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲは、レンチウイルスＬＴＲである。いくつかの実施形態において、３’ＬＴＲは、一つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態において、３’ＬＴＲは、一つ以上の欠失を含む。いくつかの実施形態において、３’ＬＴＲは、自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲである。いくつかの実施形態において、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化またはシグナルウサギβ－グロビンポリアデニル化配列である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、最適化されたＫｏｚａｋ配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、以下からなる群から選択される：サイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１－α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチン－Ｃプロモーター（ＵＢＱ－Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β－ＡＣＴ）、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーであって、陰性対照領域が欠失し、ＤＬ５８７ＲＥＶプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）Ｕ３プロモーター。
本開示の別の態様において、本明細書に企図されるＣＡＲまたはポリペプチドのいずれか一つを発現する細胞が提供される。いくつかの実施形態において、細胞は、本明細書に企図されるポリヌクレオチドのいずれか一つ、または本明細書に企図されるベクターのいずれか一つを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、遺伝子操作された宿主細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は造血細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、造血幹細胞または前駆細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋造血幹または前駆細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、又はヘルパーＴ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、αβ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、γδ－Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、ナチュラルキラー細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、マクロファージである。
様々な実施形態において、免疫エフェクター細胞は、本明細書で企図されるベクターのいずれか一つで形質導入され、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化および刺激され、それによって、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の非存在下で、活性化および刺激された形質導入免疫エフェクター細胞の増殖と比較して、形質導入された免疫エフェクター細胞の増殖を維持する。いくつかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で、活性化され刺激された免疫エフェクター細胞は、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群より選択される一つ以上のマーカーの発現を増加させた、又はｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の全てのマーカーを、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の非存在下で、活性化された刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化され、刺激された免疫エフェクター細胞は、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群より選択される一つ以上のマーカーの発現を増加させた、又はｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８の全てのマーカーを、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の非存在下で、活性化された刺激された免疫エフェクター細胞に比べて増加させた。いくつかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＺＳＴＫ４７４である。
様々な実施形態において、細胞またはその子孫は、ＢＣＭＡ発現細胞との共培養において高いＩＦＮγ放出を示す。いくつかの実施形態において、細胞またはその子孫は、ＣＡＲがマウス由来の抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じ細胞と比較して、ＢＣＭＡ発現細胞との共培養において、類似またはより高いＩＦＮγ放出を示す。いくつかの実施形態において、共培養されたＢＣＭＡ発現細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞、ＨＴ１０８０．ＢＣＭＡ細胞、および／またはＲＰＭＩ－８２２６細胞である。いくつかの実施形態では、細胞またはその子孫は、低ＢＣＭＡ発現細胞との共培養において高いＩＦＮγ放出を示す。いくつかの実施形態において、低ＢＣＭＡ発現細胞は、Ｄａｕｄｉ、ＨＴ１０８０．ＢＣＭＡ、および／またはＲＰＭＩ－８２２６細胞と比較して、少なくとも５倍少ない表面ＢＣＭＡ発現を有する。いくつかの実施形態において、低ＢＣＭＡ発現細胞は、ＨＴ１０８０．ＢＣＭＡ細胞と比較して、少なくとも１０倍少ない表面ＢＣＭＡ発現を有する。いくつかの実施形態において、低ＢＣＭＡ発現細胞は、ＲＰＭＩ－８２２６細胞と比較して少なくとも１０倍少ない表面ＢＣＭＡ発現を有する。いくつかの実施形態において、低ＢＣＭＡ発現細胞は、ＲＬおよび／またはＴｏｌｅｄｏ細胞である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲがマウス由来の抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じＣＡＲＴ細胞と比較して、低抗原密度細胞との共培養において、より高いＩＦＮγ放出を示す。いくつかの実施形態において、細胞は低い抗原非依存性シグナル伝達を示す。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＡＲがマウス由来の抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じＣＡＲ Ｔ細胞と比較して低い抗原非依存性シグナル伝達を示す。
本開示の別の態様において、本明細書に企図される細胞のいずれか一つおよび生理学的に許容される賦形剤を含む組成物が提供される。
本開示の別の態様において、本明細書に企図されるＣＡＲまたはポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞を生成する方法が提供され、本明細書に企図されるベクターのいずれか一つを免疫エフェクター細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、免疫エフェクター細胞を刺激し、ＣＤ３に結合する抗体およびＣＤ２８に結合する抗体と細胞を接触させることによって、細胞を増殖させるように誘導し、それによって、免疫エフェクター細胞の集団を生成すること、をさらに含む。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ベクターを導入する前に刺激され、増殖するように誘導される。いくつかの実施形態において、免疫エフェクター細胞はＴリンパ球を含む。様々な実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で、免疫エフェクター細胞は、活性化され刺激され、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群より選択される一つ以上のマーカーの発現を増加させた、又はｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の全てのマーカーを、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の非存在下で、活性化された刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた。いくつかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で、免疫エフェクター細胞は、活性化され刺激され、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７およびＣＤ８からなる群より選択される一つ以上のマーカーの発現を増加させた、又はｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７およびＣＤ８の全てのマーカーを、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の非存在下で、活性化された刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた。いくつかの実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＺＳＴＫ４７４である。
本開示の別の態様において、それを必要とする対象におけるＢ細胞関連状態を治療する方法が提供され、本明細書に提供されるいずれか一つの組成物の治療効果量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞関連状態は癌である。いくつかの実施形態では、癌は、固体癌である。いくつかの実施形態では、癌は、液性癌である。いくつかの実施形態では、癌は、血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞関連状態は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、不確かな悪性電位のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少症紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、および急速に進行する糸球体腎炎、重鎖疾患、原発性または免疫細胞関連アミロイドーシス、または重要性が不明のモノクローナルガンモパシーである。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞関連状態は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞悪性腫瘍は、多発性骨髄腫（ＭＭ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。幾つかの実施形態では、ＭＭは、顕性多発性骨髄腫、くすぶり多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、および髄外形質細胞腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＮＨＬは、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞関連状態は、形質細胞悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞関連状態は、自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデスである。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞関連状態は、関節リウマチである。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞関連状態は、特発性血小板減少症紫斑病、重症筋無力症、又は自己免疫性溶血性貧血である。
本開示の別の態様において、対象においてＢＣＭＡを発現する癌に関連する一つ以上の症状を改善する方法が提供され、ＢＣＭＡを発現する癌細胞に関連する少なくとも一つの症状を改善するのに十分な量の本明細書に提供される組成物のいずれか一つを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、改善される一つ以上の症状は、脱力、疲労、息切れ、あざができやすい及び出血しやすい、頻発する感染、リンパ節の拡張、腹部膨張又は腹部疼痛、骨又は関節の疼痛、骨折、予期せぬ体重減少、食欲低下、寝汗、持続性の微熱、並びに排尿減少からなる群から選択される。
本開示の別の態様において、対象においてＢＣＭＡを発現する細胞数を減少させる方法が提供され、投与前にＢＣＭＡを発現する細胞の数と比較して、ＢＣＭＡを発現する細胞の数を減少させるのに十分な量の請求項１１６に記載の組成物を対象に投与することを含む。
本開示の別の態様において、ヒトＢＣＭＡポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片提供され、以下を含む：配列番号７、１５、２３、３１、３９または４７に記載の可変軽鎖アミノ酸配列内の可変軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域、ならびに／または配列番号８、１６、２４、３２、４０、または４８に記載される可変重鎖アミノ酸配列内の可変重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域。いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号１～３、９～１１、１７～１９、２５～２７、３３～３５もしくは４１～４３のいずれか一つに記載される可変軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに／または配列番号４～６、１２～１４、２０～２２、２８～３０、３６～３８もしくは４４～４６に記載される可変重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。
特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、以下からなる群から選択される：キャメルＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、およびシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）。いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１～３のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号４～６のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９～１１のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号１２～１４のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７～１９のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号２０～２２のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２５～２７のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号２８～３０のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３～３５のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号３６～３８のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４１～４３のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号４４～４６のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７、１５、２３、３１、３９もしくは４７のいずれか一つに記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号８、１６、２４、３２、４０もしくは４８のいずれかに記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号８に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１５に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号１６に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２３に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号２４に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３１に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号３２に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３９に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号４０に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４７に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号４８に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７、１５、２３、３１、３９もしくは４７のいずれか一つに記載される可変軽鎖配列および／または配列番号８、１６、２４、３２、４０もしくは４８のいずれか一つに記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号８に記載される可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１５に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号１６に記載の可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２３に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号２４に記載の可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３１に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号３２に記載の可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３９に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号４０に記載の可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４７に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号４８に記載の可変重鎖配列を含む。
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖであり、可変軽鎖は可変重鎖のそれに対してｃ末端に位置する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ｓｃＦｖであり、可変重鎖は可変軽鎖のそれに対してｃ末端に位置する。
図１は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物の例示的概略図を示す。 図２Ａ～２Ｄは、細胞あたりのベクターコピー（図２Ａおよび２Ｃ）およびＦＡＣＳによって評価されたＴ細胞上のＣＡＲ構築物の発現（図２Ｂおよび２Ｄ）を示す。 同上。 図３Ａ～３Ｉは、ＢＣＭＡ発現Ｄａｕｄｉ細胞（図３Ｃ）またはＨＴ．１０８０．ＢＣＭＡ細胞（図３Ｆおよび３Ｉ）と比較して、単独（図３Ａ、３Ｄ、および３Ｇ）またはＢＣＭＡ陰性横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞（図３Ｂ）もしくはＨＴ１０８０細胞（図３Ｅおよび３Ｈ）との２４時間の共培養における抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞から放出されるＩＦＮγの量を示す。 同上。 同上。 図３Ｊおよび３ｋは、ＢＣＭＡ低Ｊｅｋｏ１細胞（図３Ｊ）またはＢＣＭＡ高ＲＰＭＩ８２２６細胞（図３Ｋ）との共培養において、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞から放出されるＩＬ２の量を示す。 図４Ａ～４Ｃは、コンパレーターＣＡＲ、ＣＡＲ１またはＣＡＲ５を単独で（図４Ａ）または癌細胞との共培養（図４Ｂおよび４Ｃ）で発現する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞から放出されるＩＦＮγの量を示す。細胞を、抗原低細胞株ＲＬおよびトレド（図４Ｂ）、ならびに抗原高細胞株ＤａｕｄｉおよびＨＴ１０８０．ＢＣＭＡ（図４Ｃ）と２４時間共培養した。 図５は、ＨＴ．１０８０細胞を発現するＢＣＭＡに対するコンパレーターＣＡＲ、ＣＡＲ１、またはＣＡＲ５を発現するＴ細胞の経時的な細胞毒性を示す。 図６は、ＨＴ．１０８０、ＲＬ、トレド、Ｄａｕｄｉ、ＲＰＭＩ－８２２６、およびＨＴ．１０８０．ＢＣＭＡ癌細胞におけるＢＣＭＡ抗原の発現／密度を示す。 図７Ａおよび図７Ｂは、ＢＣＭＡを発現しないＨＴ１０８０－ｎｕｃＲｅｄ細胞（抗原非依存性増殖；図７Ａ）またはＢＣＭＡを発現するＨＴ１０８０－ｎｕｃＲｅｄ．ＢＣＭＡ細胞（抗原依存的増殖；図７Ｂ）と共培養したＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を示す。
配列番号に関する簡単な説明
配列番号１～４８は、本明細書に企図される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲのための例示的な軽鎖ＣＤＲ配列、重鎖ＣＤＲ配列、可変軽鎖および可変重鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号４９～６８は、本明細書に企図される例示的なＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を記載する。
配列番号６９は、ヒトＢＣＭＡのアミノ酸配列を記載する。
配列番号７１～８１は、様々なリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号８２～１０６は、プロテアーゼ切断部位および自己切断ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を記載する。
前述の配列において、Ｘは、存在する場合には任意のアミノ酸を指し、またはアミノ酸の非存在を指す。
詳細な説明
Ａ．概要
本発明は、一般に、Ｂ細胞関連状態を治療するための改良された組成物および方法に関する。特に、本発明は、Ｂ細胞関連状態（例えば、癌）を治療するための改良されたヒト抗ＢＣＭＡ抗体、ＣＡＲ、およびＣＡＲ Ｔ細胞に関する。
本明細書において使用される場合、用語「Ｂ細胞関連状態」は、不適切なＢ細胞活性およびＢ細胞悪性腫瘍を伴う状態に関する。特定の実施形態において、本開示は、遺伝子改変免疫エフェクター細胞を用いたＢ細胞関連状態の改善された養子細胞療法に関する。遺伝的方法は、免疫認識と癌細胞の排除を強化する可能性のある手段をもたらす。
有望な戦略の一つは、免疫エフェクター細胞を遺伝子操作して、細胞毒性を癌細胞に向け直すキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させることである。しかしながら、任意のＣＡＲの潜在的な治療効果には、適切な構造ドメイン（ヒンジまたは膜貫通ドメインなど）の選択、適切なシグナル伝達ドメインまたは共刺激ドメイン（４－１ＢＢまたはＣＤ３ζなど）、および適切な抗原結合ドメインの選択を含むがこれらに限定されない、ＣＡＲのいくつかの成分間の微妙なバランスが含まれる。例えば、好ましくは、抗原結合ドメインは、癌細胞上で発現され、非癌細胞上で比較的低い（または存在しない）発現を有する抗原に結合する。さらに、結合は、シグナル伝達が得られない、またはシグナル伝達が多すぎることのないように、強すぎるまたは弱すぎることはできない。
ＢＣＭＡを標的とする治療用抗体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の使用を通じて、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーとしても知られる、メンバー１７；ＴＮＦＲＳＦ１７）を標的とすることによりＢ細胞悪性腫瘍を治療しようとする近年の試みは、有望ではあるが限られた成功を収めている。実際、多くの患者は、これらの患者集団ではこれまで見られなかった測定可能な治療上の利益を経験しているが、これらの治療を受けている患者の全てが完全な寛解と多くの再発を経験するわけではない。したがって、これらの患者集団には、抗ＢＣＭＡ抗体および／またはＣＡＲ（ＣＡＲ Ｔ療法を含む）の改善を含む、改善された治療法に対する重要な満たされていないニーズが残っている。
ＢＣＭＡは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９２（１）：１２９－１３５、２０００年およびＭａｃｋａｙら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２１：２３１－２６４、２００３年を参照されたい）。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合する（例えば、Ｍａｃｋａｙら、２００３年およびＫａｌｌｅｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０４：４３－５４、２００５年を参照されたい）。非悪性細胞の中で、ＢＣＭＡは主に形質細胞および成熟Ｂ細胞のサブセットで発現することが報告されている（例えば、Ｌａａｂｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．、７７（１）：３８９７－３９０４、１９９２年；Ｌａａｂｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２（７）：１１４７－１１５４、１９９４年；Ｋａｌｌｅｄら、２００５年；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９（１）：９１－９７、２００４年；Ｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７３（２）：８０７－８１７、２００４年を参照されたい）。ＢＣＭＡを欠損したマウスは健康であり、正常な数のＢ細胞を有するが、長寿命の形質細胞の生存は損なわれている（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、２００４年；Ｘｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、２１（１２）：４０６７－４０７４、２００１年；Ｓｃｈｉｅｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３（５５３７）：２ １１１－２１ １４、２００１年）。ＢＣＭＡ ＲＮＡは、多発性骨髄腫細胞および他のリンパ腫において普遍的に検出されており、ＢＣＭＡタンパク質は、複数の研究者によって多発性骨髄腫患者の形質細胞の表面で検出されている（例えば、Ｎｏｖａｋら、Ｂｌｏｏｄ、１０３（２）：６８９－６９４、２００４年；Ｎｅｒｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７３（１９）：５９０３－５９０９、２００７年；Ｂｅｌｌｕｃｃｉら、Ｂｌｏｏｄ、１０５（１０）：３９４５－３９５０、２００５年；Ｍｏｒｅａｕｘら、Ｂｌｏｏｄ、７０３（８）：３１４８－３１５７、２００４年を参照されたい）。
したがって、本明細書に開示される養子細胞療法の改善された組成物および方法は、ＢＣＭＡを発現する細胞を標的とし、ヒト由来の抗原結合ドメインを有し、改善されたサイトカイン放出、および／または低い抗原非依存性シグナル伝達を示す遺伝子改変免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）を提供する。特定の実施形態において、ヒト抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片、膜貫通ドメイン、および一つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが提供される。さらなる実施形態において、改善されたＣＡＲ Ｔ細胞は、低抗原密度細胞との共培養において高いＩＦＮγ放出を示す。
一実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞が提供される。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、本明細書ではＣＡＲ Ｔ細胞またはＣＡＲ修飾Ｔ細胞と呼ばれる。
様々な実施形態において、本明細書で企図される遺伝子改変免疫エフェクター細胞は、Ｂ細胞関連状態、例えばＢ細胞またはＢ細胞悪性腫瘍に関連する自己免疫疾患を有する患者に投与される。
他の実施形態において、改善された抗ＢＣＭＡ抗体またはその断片が提供される。
本発明の実施は、特に反対に示されない限り、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を採用し、これらは当業者の技術の範囲内であり、その多くは例示の目的で以下に記載される。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００８年７月に更新）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ ＆ ＩＩ巻（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５年）；Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２年）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）、Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．，１９９８年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、１９９１年）；Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；並びにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの専門誌の研究論文を参照されたい。
Ｂ．定義
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書において使用されるべきある特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ちうる。
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載するものと類似した、又は均等の方法及び材料を、特定の実施形態の実施又は検証に使用することができるが、本明細書においては好ましい組成物、方法及び材料の実施形態を開示している。本開示の目的に対し、以下の用語を、以下に規定する。
冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、当該冠詞の文法上の対象の一つ又は複数（すなわち少なくとも一つ、又は一つもしくは複数）を指すために使用される。例示として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」とは、一つの要素、又は一つもしくは複数の要素を意味する。
選択肢（例、「又は」）の使用は、いずれか一つ、両方、又はその選択肢の任意の組み合わせを意味すると理解されたい。
「および／または」という用語は、いずれか一つ、またはその選択肢の両方を意味すると理解されたい。
本明細書において使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さに対し、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％までも変化する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さを指す。一つの実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さに関し、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、または長さの範囲を指す。
一実施形態では、例えば、１～５、約１～５、又は約１～約５といった範囲は、当該範囲に包含される各数値を指す。例えば、一つの非限定的かつ単に例示的な実施形態では、範囲「１～５」は、表現１、２、３、４、５、又は１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０、又は１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０と同等である。
本明細書中で使用するように、用語「実質的に」は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上である数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さとほぼ同じである効果、例えば、生理学的効果を生じる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。
本明細書全体を通じて、文脈が別段要求しない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと」は、規定される工程もしくは要素又は工程もしくは要素のグループを含むことを暗示するが、任意の他の工程もしくは要素又は工程もしくは要素のグループを除外することを暗示しないことは理解されるだろう。「～からなる」とは、語句「からなる」に先行するもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。ゆえに、「～からなる」という文言は、列記される要素が必要又は義務であり、他の要素は存在し得ないことを示す。「本質的に～からなる」とは、当該文言の後に列記される任意の要素、及び列記される要素に関して本開示中に特定される活性若しくは作用に干渉しない、又は寄与しない他の要素に限定される任意の要素を含むことを意味する。このように、文言「本質的に～からなる」は、列記される要素が必須又は義務であり、しかし列記される要素の活性又は作用に実質的に影響を与える他の要素は存在しないことを示す。
本明細書全体を通じて「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加的な実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、又はそれらの組み合わせに対する参照は、当該実施形態と関連付けて記載される特定の性質、構造又は特徴が、少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。このように、本明細書全体の様々な箇所での前述の文言の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の性質、構造、又は特徴は、一つ以上の実施形態において任意の適切な様式で組み合わされうる。また、一実施形態でのある特徴の肯定的な列挙は、特定の実施形態での当該特徴を除外するための根拠として機能することが理解される。
追加の定義は、本開示全体を通じて記載されている。
Ｃ．ヒト抗ＢＣＭＡ抗体
特定の実施形態において、ヒトＢＣＭＡに結合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。
「抗体」という用語は、免疫細胞によって認識されるものなどの、ペプチド、脂質、多糖類、または抗原決定基を含有する核酸などの一つ以上の抗原のエピトープを特異的に認識し、結合する軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域またはその断片を少なくとも含むポリペプチドである結合剤を指す。
「抗体」という用語は、本明細書の他の箇所にさらに記載されるような、任意の天然に存在する、組換え、改変または操作された免疫グロブリン様構造または抗原結合断片もしくはその一部、またはそれらの誘導体を包含する。したがって、この用語は、標的抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指し、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および二重特異性抗体を含む。インタクトな抗体は、一般に、少なくとも二つの完全長重鎖および二つの完全長軽鎖を含むが、場合によっては、重鎖のみを含むことができるラクダ科動物に天然に存在する抗体などのより少ない鎖を含むことができる。抗体は、単一の供給源のみから誘導することができ、または「キメラ」であり得、すなわち、抗体の異なる部分を二つの異なる抗体から誘導することができる。抗体またはその抗原結合部分は、ハイブリドーマにおいて、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクト抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生され得る。
「抗原結合断片」または「抗原結合部分」という用語は、抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の一つ以上の断片を指す。抗原結合断片は、限定するものではないが、複合体を形成する抗原に特異的に結合する任意の天然に存在する、酵素的に取得可能な、合成された、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、抗体の抗原結合部分は、例えば、抗体可変および任意に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含むタンパク質分解消化または組換え遺伝子工学技術などの任意の適切な標準技術を用いて、完全な抗体分子から誘導され得る。好ましい実施形態では、抗原結合断片は、一本鎖可変断片（ｓｖＦｖ）である。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に、いずれかの配向（例えば、ＶＬ－ＶＨまたはＶＨ－ＶＬ）で存在する。例えば、いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ可変軽鎖は、可変重鎖のそれに対してｃ末端に位置する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ可変重鎖は、可変軽鎖のそれに対してｃ末端に位置する。概して、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによりｓｃＦｖは抗原結合のための所望の構造を形成することができる。ｓｃＦｖのレビューについては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９４年）、ｐｐ．２６９－３１５を参照されたい。
「単離された抗体またはその抗原結合断片」は、その自然環境の構成要素から識別され、分離および／または回収された抗体またはその抗原結合断片を指す。
「抗原（Ａｇ）」は、抗体または断片が特異的に結合する結合領域内の抗原決定基を含む任意の分子を広く含む。特定の実施形態において、「抗原（Ａｇ）」とは、動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質を指し、動物に注射または吸収される組成物（癌特異的タンパク質を含むものなど）を含む。抗原は、例えば、開示される抗原などの異種抗原により誘導される産物を含む、特異的な液性免疫又は細胞性免疫の産物と反応する。特定の実施形態において、標的抗原は、ＢＣＭＡポリペプチド（例えば、ヒトＢＣＭＡポリペプチド）のエピトープである。
抗原は、単一単位分子（タンパク質モノマーや断片など）または複数の成分で構成される複合体であってもよい。抗原は、エピトープ、例えば、分子もしくは分子の一部、または分子もしくは分子の部分の複合体を提供し、抗原結合タンパク質（例えば抗体を含む）などの選択的結合剤によって結合され得る。したがって、選択的結合剤は、複合体中の二つ以上の成分によって形成される抗原に特異的に結合し得る。いくつかの実施形態において、抗原は、その抗原に結合することができる抗体を産生するために動物に使用することができる。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、例えば抗体と相互作用することができる一つ以上のエピトープを有することができる。
「エピトープ」又は「抗原性決定基」とは、結合物質が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置される連続アミノ酸又は非連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒への曝露で保持され、一方で三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒を用いた処理で失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間構造に少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個、約９個、又は約８～１０個のアミノ酸を含む。
本明細書において使用される用語「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合する」または「特異的結合」または「特異的標的」は、バックグラウンド結合よりも大きい結合親和性でのＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）への抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片（またはそれを含むＣＡＲ）の結合を記載する。結合ドメイン（または結合ドメインまたは結合ドメインを含む融合タンパク質を含むＣＡＲ）は、例えば約１０５Ｍ－１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位との特定の結合相互作用の平衡会合定数）でＢＣＭＡに結合する、またはＢＣＭＡと会合する場合、ＢＣＭＡに「特異的に結合」する。ある特定の実施形態では、結合ドメイン（又は融合タンパク質）は、約１０６Ｍ－１、１０７Ｍ－１、１０８Ｍ－１、１０９Ｍ－１、１０１０Ｍ－１、１０１１Ｍ－１、１０１２Ｍ－１、又は１０１３Ｍ－１以上のＫａで標的に結合する。「高親和性」結合ドメイン（またはその一本鎖融合タンパク質）は、少なくとも１０７Ｍ－１、少なくとも１０８Ｍ－１、少なくとも１０９Ｍ－１、少なくとも１０１０Ｍ－１、少なくとも１０１１Ｍ－１、少なくとも１０１２Ｍ－１、少なくとも１０１３Ｍ－１またはそれより大きいＫａを有する結合ドメインを指す。
あるいは、親和性は、Ｍ単位（例えば、１０－５Ｍ～１０－１３Ｍ、またはそれ未満）での特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義されてもよい。本開示による結合ドメインポリペプチドとＣＡＲタンパク質の親和性は、従来の技術を用いて容易に決定することができ、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、または結合会合によって、または標識リガンドを用いた置換アッセイによって、またはＢｉａｃｏｒｅ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能なＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００などの表面プラズモン共鳴装置を使用して、または、Ｃｏｒｎｉｎｇ社およびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社からそれぞれ入手可能なＥＰＩＣシステムまたはＥｎＳｐｉｒｅなどの光学バイオセンサ技術が挙げられる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９年）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０；および米国特許第５，２８３，１７３号；第５，４６８，６１４号、または同等のものも参照されたい）。
一実施形態では、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合より約２倍高いか、バックグラウンド結合より約５倍高いか、バックグラウンド結合より約１０倍高いか、バックグラウンド結合より約２０倍高いか、バックグラウンド結合より約５０倍高いか、バックグラウンド結合より約１００倍高いか、又はバックグラウンド結合より約１０００倍高いか、又はそれ以上である。
特定の実施形態において、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。ＣＡＲの文脈において、「抗体」とは、抗原のエピトープを特異的に認識し結合する軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を少なくとも含むポリペプチドである結合剤を指し、例えば、ペプチド、脂質、多糖類、または免疫細胞によって認識されるものなどの抗原決定基を含む核酸が挙げられる。
当業者によって理解されるであろうように、及び本明細書の他の箇所に記載されるように、完全抗体は、二つの重鎖及び二つの軽鎖を含む。各重鎖は、可変領域、並びに第一、第二、及び第三の定常領域からなるが、一方で、各軽鎖は、可変領域及び定常領域からなる。
軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、三つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域を含み、これは「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれる。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによる配列など、従来の方法によって定義または同定することができる（Ｗｕ，ＴＴおよびＫａｂａｔ、Ｅ．Ａ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１－５０、（１９７０年）；Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ．およびＫａｂａｔ、Ｅ．Ａ、ＰＮＡＳ、８４：２４４０－２４４３（１９８７年）；（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１年、これは参照により本明細書に組み込まれる）、またはＣｈｏｔｈｉａらによる構造による（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ、Ａ．Ｍ．、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６（４）：９０１－９１７（１９８７年）、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７－８８３（１９８９）を産所されたい）。
Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（１９９５年）ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－１３９およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２－４５に記載されている。さらに他のＣＤＲ境界定義は、本明細書のシステムの一つに厳密に従っていないかもしれないが、それにもかかわらず、特定の残基または残基のグループ、あるいはＣＤＲ全体でさえ抗原結合に有意に影響を及ぼさないという予測または実験的所見に照らして、短縮または延長され得るが、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複する。例えば、抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループの間の妥協を表すＡｂＭ超可変領域を参照し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．社）によって使用されるＡｂＭ番号付けスキームに従って決定することができる。
さらに、抗体のＣＤＲは、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐ、（１９９９年）Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ７：１３２－１３６およびＬｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐら、（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：２０９－２１２に記載されているように、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って決定することができる。
ＣＤＲ決定のさらに他の方法は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ Ｒ Ｍら、（１９９６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２：７３２－７４５に開示されている。例えば、Ｍａｒｔｉｎ Ａ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ，”ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ編、３１節、ｐｐ．４２２－４３９、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（２００１年）も参照されたい。本明細書に記載されるＣＤＲ定義のいずれかに基づいてＣＤＲを決定するために使用することができる専有および公に利用可能なプログラム、例えば、ａｂＹｓｉｓ（ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／ａｂｙｓｉｓ／）およびＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ（ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ）は、当業者に公知である。
軽鎖ＣＤＲを予測するためのルールの例示的な例には、ＣＤＲＬ１は約残基２４で始まり、前にＣｙｓがあり、約１０～１７残基であり、その後にＴｒｐが続く（典型的にはＴｒｐ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎであるが、Ｔｒｐ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ、Ｔｒｐ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ、Ｔｒｐ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ）が続く。ＣＤＲＬ２は、ＣＤＲＬ１の終了後約１６残基から始まり、一般にＩｌｅ－Ｔｙｒ、Ｖａｌ－Ｔｙｒ、Ｉｌｅ－Ｌｙｓ、Ｉｌｅ－Ｐｈｅによっても先行され、７残基である。ＣＤＲＬ３は、ＣＤＲＬ２の終了後約３３残基から始まり、Ｃｙｓが先行し、７～１１残基であり、その後にＰｈｅ－Ｇｌｙ－ＸＸＸ－Ｇｌｙ（配列番号１０８）が続く（ＸＸＸは任意のアミノ酸である）。
重鎖ＣＤＲを予測するためのルールの例示的な例には、ＣＤＲＨ１が約２６残基から始まり、Ｃｙｓ－ＸＸＸ－ＸＸＸ－ＸＸＸ（配列番号１０９）が先行し、１０～１２残基であり、その後にＴｒｐ（典型的にはＴｒｐ－Ｖａｌであるが、Ｔｒｐ－Ｉｌｅ、Ｔｒｐ－Ａｌａ）が続き；ＣＤＲＨ２は、ＣＤＲＨ１の終了後約１５残基から始まり、一般にＬｅｕ－Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ（配列番号１１０）またはいくつかのバリエーションが先行し、１６～１９残基であり、その後にＬｙｓ／Ａｒｇ－Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａが続き、ＡｂＭ定義は７残基早く終わり；ＣＤＲＨ３は、ＣＤＲＨ２の終了後約３３残基から始まり、Ｃｙｓ－ＸＸＸ－ＸＸＸ（典型的にはＣｙｓ－Ａｌａ－Ａｒｇ）が先行し、３～２５残基であり、その後にＴｒｐ－Ｇｌｙ－ＸＸＸ－Ｇｌｙ（配列番号１１１）が続く。
したがって、特定の実施形態において、本開示は、ヒトＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合し、可変軽鎖配列番号７、１５、２３、３１、３９、または４７に記載されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域アミノ酸配列ならびに／または可変重鎖配列番号８、１６、２４、３２、４０または４８に記載される ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３ 領域アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む単離された抗体、その抗原結合断片を提供し、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の組合せ、ＩＭＧＴ定義、ＡｂＭ定義、またはＣＤＲの接触定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＡｂＭ定義に従って規定される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、接触定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、上述のＣＤＲ定義のいずれか一つの組合せによって定義される。
本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片に適した軽鎖ＣＤＲの例示的な例として、配列番号１～３、９～１１、１７～１９、２５～２７、３３～３５、または４１～４３に記載のＣＤＲ配列が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片に適した重鎖ＣＤＲの例示的な例には、配列番号４～６、１２～１４、２０～２２、２８～３０、３６～３８、または４４～４６に記載のＣＤＲ配列が含まれるが、これらに限定されない。
「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂまたは本明細書に開示される他の抗体断片を含む、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂまたは本明細書に開示される他の抗体断片を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
特定の実施形態では、抗原特異的結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合するｓｃＦｖである。本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片に適した可変重鎖の例示的な例として、配列番号８、１６、２４、３２、４０、および４８に記載のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片に適した可変軽鎖の例示的な例として、配列番号７、１５、２３、３１、３９、および４７に記載のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で提供されるＢＣＭＡ特異的結合ドメインはまた、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのＣＤＲを含む。このようなＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ならびに重鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３から選択されるヒトまたは非ヒトＣＤＲまたは改変された非ヒトＣＤＲであり得る。特定の実施形態では、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、（ａ）軽鎖ＣＤＲＬ１、軽鎖ＣＤＲＬ２、および軽鎖ＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、および（ｂ）重鎖ＣＤＲＨ１、重鎖ＣＤＲＨ２、および重鎖ＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。好ましい実施形態において、ＣＤＲはヒトＣＤＲである。
本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片に適した軽鎖ＣＤＲの例示的な例として、配列番号１～３、９～１１、１７～１９、２５～２７、３３～３５、または４１～４３に記載のＣＤＲ配列が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片に適した重鎖ＣＤＲの例示的な例には、配列番号４～６、１２～１４、２０～２２、２８～３０、３６～３８、または４４～４６に記載のＣＤＲ配列が含まれるが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、対応するＣＤＲ領域と比較して、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、および／またはＣＤＲＬ３と実質的に類似した一つ以上のＣＤＲ配列を含む。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、一つ以上のＣＤＲ配列（例えば、配列番号１～６、９～１４、１７～２２、２５～３０、３３～３８または４１～４６）を含み得、配列番号１～６、９～１４、１７～２２、２５～３０、３３～３８または４１～４６のいずれか一つの対応するＣＤＲ領域に比べて、それぞれ最大１、２、３、４、５個のアミノ酸残基のバリエーションを含む。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸変動」または「アミノ酸変化」または「アミノ酸残基の変化」という語句は、参照配列と比較した一つ以上のアミノ酸の違いを指し、アミノ酸の修飾、置換、挿入、および／または欠失を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、以下から選択される少なくとも三つのＣＤＲを含み、場合により、ＣＤＲのそれぞれについて最大３個のアミノ酸変化、例えば１、２、または３個のアミノ酸変化を含む：ＣＤＲＬ１：配列番号１；ＣＤＲＬ２：配列番号２；ＣＤＲＬ３：配列番号３；ＣＤＲＨ１：配列番号４；ＣＤＲＨ２：配列番号５；およびＣＤＲＨ３：配列番号６。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、以下から選択される少なくとも三つのＣＤＲを含み、場合により、ＣＤＲのそれぞれについて最大３個のアミノ酸変化、例えば１、２、または３個のアミノ酸変化を含む：ＣＤＲＬ１：配列番号９；ＣＤＲＬ２：配列番号１０；ＣＤＲＬ３：配列番号１１；ＣＤＲＨ１：配列番号１２；ＣＤＲＨ２：配列番号１３；およびＣＤＲＨ３：配列番号１４。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、以下から選択される少なくとも三つのＣＤＲを含み、場合により、ＣＤＲのそれぞれについて最大３個のアミノ酸変化、例えば１、２、または３個のアミノ酸変化を含む：ＣＤＲＬ１：配列番号１７；ＣＤＲＬ２：配列番号１８；ＣＤＲＬ３：配列番号１９；ＣＤＲＨ１：配列番号２０；ＣＤＲＨ２：配列番号２１；およびＣＤＲＨ３：配列番号２２。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、以下から選択される少なくとも三つのＣＤＲを含み、場合により、ＣＤＲのそれぞれについて最大３個のアミノ酸変化、例えば１、２、または３個のアミノ酸変化を含む：ＣＤＲＬ１：配列番号２５；ＣＤＲＬ２：配列番号２６；ＣＤＲＬ３：配列番号２７；ＣＤＲＨ１：配列番号２８；ＣＤＲＨ２：配列番号２９；およびＣＤＲＨ３：配列番号３０。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、以下から選択される少なくとも三つのＣＤＲを含み、場合により、ＣＤＲのそれぞれについて最大３個のアミノ酸変化、例えば１、２、または３個のアミノ酸変化を含む：ＣＤＲＬ１：配列番号３３；ＣＤＲＬ２：配列番号３４；ＣＤＲＬ３：配列番号３５；ＣＤＲＨ１：配列番号３６；ＣＤＲＨ２：配列番号３７；およびＣＤＲＨ３：配列番号３８。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、以下から選択される少なくとも三つのＣＤＲを含み、場合により、ＣＤＲのそれぞれについて最大３個のアミノ酸変化、例えば１、２、または３個のアミノ酸変化を含む：ＣＤＲＬ１：配列番号４１；ＣＤＲＬ２：配列番号４２；ＣＤＲＬ３：配列番号４３；ＣＤＲＨ１：配列番号４４；ＣＤＲＨ２：配列番号４５；およびＣＤＲＨ３：配列番号４６。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１、２、および３に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号４、５、および６に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１、２、および３に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号４、５、および６に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号９、１０、および１１に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１２、１３、および１４に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号９、１０、および１１に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号１２、１３、および１４に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１７、１８、および１９に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２０、２１、および２２に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１７、１８、および１９に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号２０、２１、および２２に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２５、２６、および２７に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２８、２９、および３０に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号２５、２６、および２７に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号２８、２９、および３０に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３３、３４、および３５に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３６、３７、および３８に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３３、３４、および３５に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号３６、３７、および３８に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号４１、４２、および４３に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号４４、４５、および４６に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号４１、４２、および４３に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号４４、４５、および４６に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。
本発明の態様は、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含むヒトＢＣＭＡに選択的に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７、１５、２３、３１、３９、または４７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８、１６、２４、３２、４０、または４８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または少配列番号８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または少配列番号１６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または少配列番号２４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または少配列番号３２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または少配列番号４０と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または少配列番号４８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域配列は、本明細書中で提供されるＣＤＲ配列のいずれにおいても変化しない。例えば、いくつかの実施形態において、配列変動の程度（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）は、本明細書中で提供されるＣＤＲ配列のいずれかを除く重鎖可変および／または軽鎖可変アミノ酸配列内で生じ得る。
いくつかの実施形態において、二つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８、１９９０年、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３。ＵＳＡ ９０：５８７３－７７、１９９３年のアルゴリズムを用いて決定される。Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０、１９９０年のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を使用して実行して、目的のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を取得することができる。二つの配列の間にギャップが存在する場合、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（ｌ７）：３３８９－３４０２、１９９７年に記載されるように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴなど）を使用することができる。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号１６に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２３に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片のいずれかにおいて、一つ以上の保存的変異を、残基が抗体－抗原相互作用に関与する可能性が低い位置でＣＤＲまたはフレームワーク配列に導入することができる。いくつかの実施形態では、そのような保存的変異は、結晶構造に基づいて決定されるように、残基がＢＣＭＡとの相互作用に関与する可能性が低い位置でＣＤＲまたはフレームワーク配列に導入され得る。いくつかの実施形態では、ありそうな界面（例えば、抗原－抗体相互作用に関与する残基）は、構造的類似性を共有する他の抗原に関する既知の構造情報から推定され得る。
様々な実施形態において、本開示は、本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片との結合について競合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本開示の態様は、本明細書に提供されるような特異的抗体またはその抗原結合断片のいずれかと競合または交差競合する抗体、例えば、上記のような一つ以上のＣＤＲ配列（１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲ配列）を有する抗体に関する。一実施形態において、本開示は、配列番号１～３、９～１１、１７～１９、２５～２７、３３～３５、または４１～４３に記載される軽鎖ＣＤＲ配列および／または配列番号４～６、１２～１４、２０～２２、２８～３０、３６～３８、または４４～４６に記載される重鎖ＣＤＲ配列を有する抗体と競合または交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号７、１５、２３、３１、３９、または４７を含む軽鎖可変領域配列および／または配列番号８、１６、２４、３２、４０、または４８を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
一実施形態において、本開示は、配列番号１～３に記載される軽鎖ＣＤＲ配列および／または配列番号４～６に記載される重鎖ＣＤＲ配列を有する抗体と競合または交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号７を含む軽鎖可変領域配列および／または配列番号８を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
一実施形態において、本開示は、配列番号９～１１に記載される軽鎖ＣＤＲ配列および／または配列番号１２～１４に記載される重鎖ＣＤＲ配列を有する抗体と競合または交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号１５を含む軽鎖可変領域配列および／または配列番号１６を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
一実施形態において、本開示は、配列番号１７～１９に記載される軽鎖ＣＤＲ配列および／または配列番号２０～２２に記載される重鎖ＣＤＲ配列を有する抗体と競合または交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号２３を含む軽鎖可変領域配列および／または配列番号２４を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
一実施形態において、本開示は、配列番号２５～２７を含む軽鎖可変領域配列および／または配列番号２８～３０を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号３１を含む軽鎖可変領域配列および／または配列番号３２を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
一実施形態において、本開示は、配列番号３３～３５に記載される軽鎖ＣＤＲ配列および／または配列番号３６～３８に記載される重鎖ＣＤＲ配列を有する抗体と競合または交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号３９を含む軽鎖可変領域配列および／または配列番号４０を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
一実施形態において、本開示は、配列番号４１～４３に記載される軽鎖ＣＤＲ配列および／または配列番号４４～４６に記載される重鎖ＣＤＲ配列を有する抗体と競合または交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、本開示は、配列番号４７を含む軽鎖可変領域配列および／または配列番号４８を含む重鎖可変領域配列を有する抗体またはその抗原結合断片と競合または交差競合する抗体を提供する。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、本明細書中で提供される抗体のいずれかと同じエピトープまたはその近傍で結合する。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、エピトープの１５個以下のアミノ酸残基以内に結合する場合、エピトープの近くに結合する。いくつかの実施形態において、本明細書中で提供される抗体またはその抗原結合断片のいずれかは、本明細書中で提供される抗体のいずれかによって結合されるエピトープの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸残基内に結合する。
別の実施形態において、本明細書に提供される抗原のいずれか（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に、１０－８Ｍ未満の抗体とタンパク質間の平衡解離定数ＫＤで、競合または交差競合する抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。他の実施形態において、抗体は、１０－１１Ｍ～１０－８Ｍの範囲のＫＤで、ＢＣＭＡと競合または交差競合する。いくつかの実施形態において、本明細書に企図される抗体または抗原結合断片と競合するＢＣＭＡ特異的抗体またはその抗原結合断片が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、本明細書中で提供されるのは、本明細書で企図される抗体またはその抗原結合断片と同じエピトープに結合するＢＣＭＡ特異的抗体またはその抗原結合断片である。
本明細書中で提供される抗体は、任意の適切な方法を用いて特徴付けることができる。例えば、一つの方法は、抗原が結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅの１１節、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．，、１９９９年に記載されるように、抗体－抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドベースのアッセイなど、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴付けるための多くの適切な方法がある。追加の例では、エピトープマッピングを使用して、抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープは、直鎖状エピトープ、すなわち、アミノ酸の単一のストレッチに含まれること、または必ずしも単一のストレッチに含まれるとは限らないアミノ酸の三次元的相互作用によって形成される立体構造エピトープ（一次構造線状配列）であり得る。
様々な長さ（例えば、少なくとも４～１９アミノ酸長）のペプチドを単離または合成し（例えば、組換え的に）、抗体との結合アッセイに使用することができる。別の例において、抗体が結合するエピトープは、標的抗原配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗体による結合を決定することによって、系統的スクリーニングにおいて決定され得る。遺伝子断片発現アッセイによれば、標的抗原をコードするオープンリーディングフレームは、ランダムにまたは特定の遺伝子構造によって断片化され、抗原の発現断片と試験される抗体との反応性が決定される。遺伝子断片は、例えば、ＰＣＲによって産生され、次いで、放射性アミノ酸の存在下でインビトロでタンパク質に転写および翻訳され得る。次に、放射性標識抗原断片への抗体の結合は、免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定される。特定のエピトープは、ファージ粒子の表面に表示されたランダムペプチド配列の大きなライブラリ（ファージライブラリー）を用いることによっても同定することができる。あるいは、重複するペプチド断片の規定されたライブラリーを、単純な結合アッセイにおいて、試験抗体への結合について試験することができる。追加の例では、抗原結合ドメインの突然変異誘発、ドメイン交換実験およびアラニン走査突然変異誘発を実施して、エピトープ結合に必要、十分、および／または必要な残基を同定することができる。例えば、ドメインスワッピング実験は、ＢＣＭＡの様々な断片が、ＢＣＭＡタンパク質ファミリーの別のメンバーのような、密接に関連しているが抗原的に異なるタンパク質からの配列で置換（スワップ）されている標的抗原の変異体を用いて行うことができる。変異型ＢＣＭＡへの抗体の結合を評価することにより、抗体結合に対する特定の抗原断片の重要性を評価することができる。
あるいは、抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、同じ抗原に結合することが知られている他の抗体を用いて競合アッセイを実施することができる。競合アッセイは、当業者に周知である。
さらに、本明細書中で提供される任意の抗体とＢＣＭＡ中の一つ以上の残基との相互作用は、日常的な技術によって決定することができる。例えば、結晶構造を決定することができ、ＢＣＭＡにおける残基と、抗体（または抗原結合断片）における一つ以上の残基との間の距離を、それに応じて決定することができる。このような距離に基づいて、ＢＣＭＡ中の特定の残基が抗体中の一つ以上の残基と相互作用するかどうかを決定することができる。さらに、競合アッセイおよび標的突然変異誘発アッセイなどの適切な方法を適用して、候補抗体の優先的結合を決定することができる。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡに選択的に結合する本開示の抗体またはその抗原結合断片は、本明細書で企図される一つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるように、ＢＣＭＡに選択的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を提供する。一実施形態において、核酸分子は、本明細書で企図されるＣＤＲ配列のうちの一つ以上をコードする。
Ｄ．キメラ抗原受容体
様々な実施形態において、免疫エフェクター細胞の細胞傷害性をＢＣＭＡ発現細胞（例えば、Ｂ細胞）に向けて向け直す改良された遺伝子操作された受容体が提供される。これらの遺伝子操作された受容体を本明細書ではキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ぶ。ＣＡＲは、所望の抗原（ＢＣＭＡなど）に対する抗体ベースの特異性とＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインを組み合わせて、特異的な抗ＢＣＭＡ細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、異なる起源に由来する異なるタンパク質部分又はＤＮＡ部分から構成されるものを表す。
本明細書で企図されるＣＡＲは、ＢＣＭＡに結合する細胞外ドメイン（結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも呼ばれる）、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲの抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインが標的細胞の表面上でＢＣＭＡと結合すると、ＣＡＲのクラスタリングが生じ、ＣＡＲ含有細胞に活性化刺激がもたらされる。ＣＡＲの主な特徴は、免疫エフェクター細胞の特異性を再指向化させる能力であり、この能力によって、増殖、サイトカイン産生、ファゴサイトーシス、または標的抗原発現細胞の細胞死を、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）非依存性の様式で介在し得る分子の産生が誘発され、モノクローナル抗体、可溶性リガンドまたは細胞特異的コレセプターの細胞特異的標的化能力が引き出される。
様々な実施形態において、ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ特異的結合ドメインを含む細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメインと、一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外結合ドメイン、一つ以上のヒンジドメインまたはスペーサードメイン、膜貫通ドメインと、を含み、膜貫通ドメインは、一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
１．結合ドメイン
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、Ｂ細胞上に発現されるヒトＢＣＭＡポリペプチドに特異的に結合する抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＢＣＭＡポリペプチドの一つ以上のエピトープに特異的に結合する。特定の実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片は、ヒト抗体または抗原結合断片である。様々な実施形態において、ＣＡＲは、本明細書において企図される抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片を含む。
本明細書において使用される場合、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は互換的に使用され、目的の標的抗原、例えばＢＣＭＡに特異的に結合する能力を有するＣＡＲを提供する。結合ドメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、ｓｃＦｖである抗原特異的結合ドメインを含む。様々な実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、単一のポリペプチド鎖中およびいずれかの配向（例えば、ＶＬ－ＶＨまたはＶＨ－ＶＬ）に存在する。例えば、いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ可変軽鎖は、可変重鎖のそれに対してｃ末端に位置する。他の実施形態において、ｓｃＦｖ可変重鎖は、可変軽鎖のそれに対してｃ末端に位置する。例えば、図１を参照されたい。概して、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによりｓｃＦｖは抗原結合のための所望の構造を形成することができる。
本明細書に企図されるＢＣＭＡ ＣＡＲを構築するのに適した可変重（ＶＨ）鎖の例示的な例には、配列番号８、１６、２４、３２、４０、および４８に記載されるアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に企図されるＢＣＭＡ ＣＡＲを構築するのに適した可変軽（ＶＬ）鎖の例示的な例には、配列番号７、１５、２３、３１、３９、および４７に記載されるアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で提供されるＢＣＭＡ特異的結合ドメインはまた、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、または六つのＣＤＲを含む。このようなＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ならびに重鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３から選択される非ヒトＣＤＲまたは改変された非ヒトＣＤＲであり得る。特定の実施形態では、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、（ａ）軽鎖ＣＤＲＬ１、軽鎖ＣＤＲＬ２、および軽鎖ＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、および（ｂ）重鎖ＣＤＲＨ１、重鎖ＣＤＲＨ２、および重鎖ＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。
したがって、特定の実施形態において、本開示は、ＣＡＲ細胞外結合ドメインを提供し、このドメインはヒトＢＣＭＡタンパク質に結合し、可変軽鎖配列番号７、１５、２３、３１、３９もしくは４７に記載されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、ならびに／または可変重鎖配列番号８、１６、２４、３２、４０もしくは４８に記載されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３領域アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、各ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の組合せ、ＩＭＧＴ定義、ＡｂＭ定義、またはＣＤＲの接触定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＡｂＭ定義に従って規定される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、接触定義に従って定義される。いくつかの実施形態において、ＣＤＲは、上述のＣＤＲ定義のいずれか一つの組合せによって定義される。
本明細書に企図されるヒト化ＢＣＭＡ ＣＡＲを構築するのに適した軽鎖ＣＤＲの例示的な例として、配列番号１～３、９～１１、１７～１９、２５～２７、３３～３５、または４１～４３に記載のＣＤＲ配列が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に企図されるヒト化ＢＣＭＡ ＣＡＲを構築するのに適した重鎖ＣＤＲの例示的な例として、配列番号４～６、１２～１４、２０～２２、２８～３０、３６～３８または４４～４６に記載のＣＤＲ配列が挙げられるが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、対応するＣＤＲ領域と比較して、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、および／またはＣＤＲＬ３に実質的に類似した一つ以上のＣＤＲ配列を含む。例えば、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号１～６、９～１４、１７～２２、２５～３０、３３～３８または４１～４６のいずれか一つにおいて、対応するＣＤＲ領域と比較して、それぞれ１、２、３、４、または５アミノ酸残基のバリエーションを含む一つ以上のＣＤＲ配列（例えば、配列番号１～６、９～１４、１７～２２、２５～３０、３３～３８、または４１～４６）を含む。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸のバリエーション」または「アミノ酸の変化」または「アミノ酸残基の変化」という語句は、アミノ酸の置換および／または欠失を含む。
一実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、以下から選択される少なくとも三つのＣＤＲを含み、場合により、最大３個のアミノ酸変化、例えば各ＣＤＲについて１、２、または３個のアミノ酸変化を含む：ＣＤＲＬ１：配列番号１；ＣＤＲＬ２：配列番号２；ＣＤＲＬ３：配列番号３；ＣＤＲＨ１：配列番号４；ＣＤＲＨ２：配列番号５；およびＣＤＲＨ３：配列番号６。
一実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、以下から選択される少なくとも三つのＣＤＲを含み、場合により、最大３個のアミノ酸変化、例えば各ＣＤＲについて１、２、または３個のアミノ酸変化を含む：ＣＤＲＬ１：配列番号９；ＣＤＲＬ２：配列番号１０；ＣＤＲＬ３：配列番号１１；ＣＤＲＨ１：配列番号１２；ＣＤＲＨ２：配列番号１３；およびＣＤＲＨ３：配列番号１４。
一実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、以下から選択される少なくとも三つのＣＤＲを含み、場合により、最大３個のアミノ酸変化、例えば各ＣＤＲについて１、２、または３個のアミノ酸変化を含む：ＣＤＲＬ１：配列番号１７；ＣＤＲＬ２：配列番号１８；ＣＤＲＬ３：配列番号１９；ＣＤＲＨ１：配列番号２０；ＣＤＲＨ２：配列番号２１；およびＣＤＲＨ３：配列番号２２。
一実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、以下から選択される少なくとも三つのＣＤＲを含み、場合により、最大３個のアミノ酸変化、例えば各ＣＤＲについて１、２、または３個のアミノ酸変化を含む：ＣＤＲＬ１：配列番号２５；ＣＤＲＬ２：配列番号２６；ＣＤＲＬ３：配列番号２７；ＣＤＲＨ１：配列番号２８；ＣＤＲＨ２：配列番号２９；およびＣＤＲＨ３：配列番号３０。
一実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、以下から選択される少なくとも三つのＣＤＲを含み、場合により、最大３個のアミノ酸変化、例えば各ＣＤＲについて１、２、または３個のアミノ酸変化を含む：ＣＤＲＬ１：配列番号３３；ＣＤＲＬ２：配列番号３４；ＣＤＲＬ３：配列番号３５；ＣＤＲＨ１：配列番号３６；ＣＤＲＨ２：配列番号３７；およびＣＤＲＨ３：配列番号３８。
一実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、以下から選択される少なくとも三つのＣＤＲを含み、場合により、最大３個のアミノ酸変化、例えば各ＣＤＲについて１、２、または３個のアミノ酸変化を含む：ＣＤＲＬ１：配列番号４１；ＣＤＲＬ２：配列番号４２；ＣＤＲＬ３：配列番号４３；ＣＤＲＨ１：配列番号４４；ＣＤＲＨ２：配列番号４５；およびＣＤＲＨ３：配列番号４６。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号１、２、および３に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号４、５、および６に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。特定の実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号１、２、および３に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号４、５、および６にそれぞれ記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号９、１０、および１１に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号１２、１３、および１４に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。特定の実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号９、１０、および１１に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号１２、１３、および１４にそれぞれ記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号１７、１８、および１９に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号２０、２１、および２２に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。特定の実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号１７、１８、および１９に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号２０、２１、および２２にそれぞれ記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号２５、２６、および２７に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号２８、２９、および３０に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。特定の実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号２５、２６、および２７に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号２８、２９、および３０にそれぞれ記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号３３、３４、および３５に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号３６、３７、および３８に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。特定の実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号３３、３４、および３５に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号３６、３７、および３８にそれぞれ記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号４１、４２、および４３に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含む。いくつかの実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号４４、４５、および４６に記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。特定の実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、それぞれ配列番号４１、４２、および４３に記載される軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号４４、４５、および４６にそれぞれ記載される重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む。
本開示の態様は、重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含むヒトＢＣＭＡに選択的に結合する細胞外結合ドメイン（ＢＣＭＡ特異的結合ドメイン）を含むＣＡＲに関する。
様々な実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号７、１５、２３、３１、３９、または４７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。一実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８、１６、２４、３２、４０、または４８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または少配列番号８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号１５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または配列番号１６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号２３と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または配列番号２４と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号３１と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または配列番号３２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号３９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または配列番号４０と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号４７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および／または配列番号４８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域配列は、本明細書中で提供されるＣＤＲ配列のいずれにおいても変化しない。例えば、いくつかの実施形態において、配列変動の程度（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）は、本明細書中で提供されるＣＤＲ配列のいずれかを除く重鎖可変および／または軽鎖可変アミノ酸配列内で生じ得る。
様々な実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ド
様々な実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号１５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号１６に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号２３に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
様々な実施形態において、ＢＣＭＡ特異的結合ドメインは、配列番号４７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインおよび／または配列番号４８に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
本明細書で企図されるＢＣＭＡ特異的結合ドメインのいずれかにおいて、一つ以上の保存的変異を、残基が抗体－抗原相互作用に関与する可能性が低い位置で、ＣＤＲまたはフレームワーク配列に導入することができる。いくつかの実施形態では、そのような保存的変異は、結晶構造に基づいて決定されるように、残基がＢＣＭＡとの相互作用に関与する可能性が低い位置でＣＤＲまたはフレームワーク配列に導入され得る。いくつかの実施形態では、ありそうな界面（例えば、抗原－抗体相互作用に関与する残基）は、構造的類似性を共有する他の抗原に関する既知の構造情報から推定され得る。
２．リンカー
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、様々なドメイン間のリンカー残基、例えば、分子の適切な間隔および立体配座のために付加され得る。特定の実施形態では、リンカーは、可変領域を結合させる配列である。「可変領域を結合させる配列」は、ＶＨ及びＶＬを繋げるアミノ酸配列であり、二つの下位結合ドメインの相互作用と適合可能なスペーサー機能を提供し、得られたポリペプチドは、同じ軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的結合親和性を保持する。本明細書で企図されるＣＡＲは、一つ、二つ、三つ、四つ、または五つ以上のリンカーを含み得る。特定の実施形態では、リンカーの長さは、約１～約２５個のアミノ酸、約５～約２０個のアミノ酸、又は約１０～約２０個のアミノ酸、又はアミノ酸の任意の介在する長さである。いくつかの実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、又はそれ以上のアミノ酸長である。
リンカーの例としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（Ｇ１－５Ｓ１－５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４または５の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および当分野で公知の他の柔軟性のあるリンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン－セリンポリマーは比較的不定形であり、したがって、本明細書で企図されるＣＡＲなどの融合タンパク質のドメイン間の中性テザーとして機能し得る。グリシンは、アラニンよりも有意に多くのｐｈｉ－ｐｓｉ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ、Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３－１４２（１９９２）を参照のこと）。当業者は、特定の実施形態におけるＣＡＲの設計は、すべてまたは部分的に柔軟であるリンカーを含むことができ、その結果、リンカーは、柔軟なリンカーならびに所望のＣＡＲ構造を提供するために、より柔軟性の低い構造を付与する一つ以上の部分を含むことができることを認識するであろう。
他の例示的なリンカーとしては、以下のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＧＧ；ＤＧＧＧＳ（配列番号７１）；ＴＧＥＫＰ（配列番号７２）（例えば、Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ ５５２５－５５３０（１９９７年）を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号７３）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら１９９５年、上記）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ここで＝１，２，３，４または５（配列番号７４）（Ｋｉｍら、ＰＮＡＳ ９３、１１５６－１１６０（１９９６年）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号７５）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６－１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号７６）（Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号７７）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号７８）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号７９）；ＬＲＱＫｄ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号８０）。あるいは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ、ＰＮＡＳ ９０：２２５６－２２６０（１９９３年）、ＰＮＡＳ ９１：１１０９９－１１１０３（１９９４年）またはファージディスプレイ法によって、フレキシブルリンカーを合理的に設計することができる。一実施形態において、リンカーは、以下のアミノ酸配列を含む：ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号８１）（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、１０１（４）：１６３７－１６４４（２００３年））。
３．スペーサードメイン
特定の実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインの後には、一つ以上の「スペーサードメイン」が続き、これは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合および活性化を可能にするために抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から遠ざける領域を指す（Ｐａｔｅｌら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９９年；６：４１２－４１９）。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。ある実施形態では、スペーサードメインは、一つまたは複数の重鎖定常領域、例えばＣＨ２およびＣＨ３などを含む免疫グロブリン部分である。スペーサードメインは、天然発生型免疫グロブリンヒンジ領域、又は改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでもよい。
一実施形態において、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、またはそれらの適切な組合せを含む。
４．ヒンジドメイン
ＣＡＲの結合ドメインの後には、一般に一つ以上の「ヒンジドメイン」が続き、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して配置し、ヒンジドメインは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合および活性化を可能にする役割を果たす。ＣＡＲは、一般的に、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）の間の一つまたは複数のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然発生型免疫グロブリンヒンジ領域、又は改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでもよい。
本明細書で企図されるＣＡＲにおける使用に適した例示的なヒンジドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ７を含むがこれらに限定されない１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含み、これらはこれらの分子由来の野生型ヒンジ領域であってもよく、または改変されていてもよい。一実施形態では、ヒンジは、ＰＤ－１ヒンジ又はＣＤ１５２ヒンジである。別の実施形態において、ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロビンヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４ヒンジまたはそれらの適切な組合せを含む。別の実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３／ヒンジ／Ｍ１、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、又はＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２を含む。
様々な実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、改変されたヒンジ領域を含む。本明細書において使用される場合、用語「改変されたヒンジ領域」、「改変されたヒンジ領域」、および「改変されたヒンジドメイン」は互換的に使用され、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失）を有する天然に存在するヒンジ領域、（ｂ）少なくとも１０個のアミノ酸である天然に存在するヒンジ領域の一部（例えば、少なくとも１２、１３、１４または１５個のアミノ酸）の長さで、最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失）、または（ｃ）コアヒンジ領域を含む天然に存在するヒンジ領域の一部（これは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５アミノ酸長）。
様々な実施形態において、改変されたヒンジ領域は、本明細書において企図される、および／または当該技術分野において公知の適切なヒンジドメイン／領域に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％ のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で企図されるヒンジ配列を含む改変ヒンジ領域は、４個以下、３個以下の、または２個以下のアミノ酸置換および／または欠失を有する。
特定の実施形態にいおいて、天然に存在するヒンジ領域／ドメインにおける一つ以上のシステイン残基は、改変されたヒンジドメインを生成するために一つ以上の他のアミノ酸残基によって置換され得る。いくつかの実施形態では、修飾ヒンジドメインは、セリン又はアラニンで置換された一つ以上のシステイン残基を含む。別の実施形態では、修飾ヒンジドメインは、セリンで置換された一つ以上のシステイン残基を含む。別の実施形態において、改変されたヒンジドメインは、アラニンで置換された一つ以上のシステイン残基を含む。
特定の実施形態において、改変されたヒンジ領域は、別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）によるプロリン残基の置換を含む。
５．膜貫通（ＴＭ）ドメイン
「膜貫通ドメイン」とは、細胞外結合部分と細胞内シグナル伝達ドメインとを融合し、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の形質膜に固定するＣＡＲの部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、又は組換えの供給源のいずれかに由来し得る。ＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ１に由来する（すなわち、少なくともの膜貫通領域を含む）ことができる。特定の実施形態では、ＴＭドメインは合成であり、主にロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２、ＣＤ２８、またはＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２、ＣＤ２８、またはＣＤ８αに由来するＴＭドメインと、短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーとを含み、好ましくは、場合によっては、ＴＭドメインとＣＡＲの細胞内シグナル伝達または共刺激ドメインとを連結する長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸の間であってもよい。グリシン－セリンベースのリンカーは、特に好適なリンカーを提供する。
６．細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合する有効なＢＣＭＡ ＣＡＲのメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達してエフェクター細胞機能を誘発することに関与するＣＡＲの部分を指し、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖および細胞傷害活性、ＣＡＲ結合標的細胞への細胞傷害因子の放出を含み、または細胞外ＣＡＲドメインに結合する抗原で誘発される他の細胞応答がある。
「エフェクター機能」という用語は、免疫エフェクター細胞の専門的な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルプ又は活性であってもよい。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に専門化機能を行うよう指向するタンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメインの全体が採用され得るが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される程度まで、そのような切断部分は、エフェクター機能シグナルを形質導入する限り、ドメイン全体の代わりに使用され得る。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
ＴＣＲによって生成されたシグナル単独ではＴ細胞の完全な活性化に不十分であり、二次的すなわち共刺激性のシグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、二つの明確に異なるクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン、すなわち、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって抗原依存性一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメインと、抗原依存様式で作用して二次的すなわち共刺激性のシグナルを提供する共刺激シグナル伝達ドメインとによって媒介されると言うことができる。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、一つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激方法又は阻害方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激性に作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ）又はＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明において特に使用される一次シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭの例示的な例として、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特に好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメイン及び一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に連結され得る。
本明細書で企図されるＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および増殖を増強するための一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」又は「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原に結合するとＴリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要とされる第二のシグナルを提供する、抗原受容体又はＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。このような共刺激分子の例示的な例として、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が挙げられる。
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインからなる群から選択される一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
別の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８およびＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメインならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
さらに別の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８およびＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメインならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１３７およびＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメインとＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
Ｅ．ＣＡＲの例示的な実施形態
一実施形態において、ＣＡＲは、抗原に結合する抗体またはその抗原特異的結合断片、ヒンジ領域と、膜貫通ドメインと、共刺激分子からの一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、および一次シグナル伝達ドメインと、を含む。特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、Ｂ細胞上に発現されるＢＣＭＡポリペプチドに特異的に結合する抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片を含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合する抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ；スペーサーまたはヒンジドメイン；以下からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン：Ｔ細胞受容体のα、βまたはゼータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ１；以下からなる群より選択される共刺激分子からの一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン：ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７８（アイコス）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＴＮＦＲ２、およびＺＡＰ７０；ならびにＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからの一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合する抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ；以下からなる群から選択されるスペーサードメインまたはヒンジドメイン：ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ７ヒンジ、ＰＤ－１ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３／ヒンジ／Ｍ１、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、またはＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２；以下からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン：Ｔ細胞受容体のα、βまたはゼータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ１；以下からなる群より選択される共刺激分子からの一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン：ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７８（アイコス）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＴＮＦＲ２、およびＺＡＰ７０；ならびにＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからの一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合する抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ；以下からなる群から選択されるヒンジドメイン：ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ７ヒンジ、ＰＤ－１ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ３／ヒンジ／Ｍ１、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、またはＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２；以下からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン：Ｔ細胞受容体のα、βまたはゼータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ１；ＴＭドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結させる、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸長の、短オリゴリンカー又はポリペプチドリンカーと、以下からなる群より選択される共刺激分子からの一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン：ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７８（アイコス）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、ＴＮＦＲ２、およびＺＡＰ７０；ならびにＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからの一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合する抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ＩｇＧ２および／またはＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ポリペプチドの一つ以上の断片を含むスペーサードメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合する抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ポリペプチドおよびＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメインと、約３～約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合する抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメインと、約３～約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３４細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合する抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメインと、約３～約１０個のアミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
さらに、本明細書で企図されるＣＡＲの設計は、非改変Ｔ細胞または他のＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞と比較して、ＣＡＲを発現するＴ細胞における改善された増殖、長期持続性、および認容できる細胞傷害性を可能にする。
様々な実施形態において、本明細書に開示される養子細胞療法の改善された組成物および方法は、ＢＣＭＡを発現する細胞を標的とし、ヒト由来の抗原結合ドメインを有し、改善されたサイトカイン放出、および低い抗原非依存性シグナル伝達を示す遺伝子改変免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）を提供する。
特定の実施形態では、改良されたＣＡＲ Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ発現細胞との共培養において高いＩＦＮγ放出を示す。いくつかの実施形態において、改善されたＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲがマウス由来の抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じＣＡＲＴ細胞と比較して、ＢＣＭＡ発現細胞との共培養において類似またはより高いＩＦＮγ放出を示す。いくつかの実施形態において、共培養されたＢＣＭＡ発現細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞および／またはＨＴ１０８０．ＢＣＭＡ細胞である。
特定の実施形態では、改善されたＣＡＲ Ｔ細胞は、低い抗原密度（低ＢＣＭＡ発現）細胞との共培養において高いＩＦＮγ放出を示す。細胞または細胞株は、Ｄａｕｄｉ、ＨＴ１０８０．ＢＣＭＡ、および／またはＲＰＭＩ－８２２６細胞よりも少なくとも５倍（例えば、少なくとも１０倍、少なくとも５倍、少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍）少ない表面ＢＣＭＡ発現を有する場合、低いＢＣＭＡ発現を有するものとして特徴付けられる。いくつかの実施形態において、細胞は、同一または類似の培養条件下で培養される。いくつかの実施形態において、低ＢＣＭＡ発現細胞は、Ｄａｕｄｉ、ＨＴ１０８０．ＢＣＭＡ、および／またはＲＰＭＩ－８２２６細胞と比較して、少なくとも５倍少ない表面ＢＣＭＡ発現を有する。いくつかの実施形態において、低ＢＣＭＡ発現細胞は、ＨＴ１０８０．ＢＣＭＡ細胞と比較して、少なくとも１０倍少ない表面ＢＣＭＡ発現を有する。いくつかの実施形態において、低ＢＣＭＡ発現細胞は、ＲＰＭＩ－８２２６細胞と比較して少なくとも１０倍少ない表面ＢＣＭＡ発現を有する。タンパク質表面発現を測定するためのアッセイは、当業者に公知である（例えば、ＦＡＣＳ分析）。
いくつかの実施形態において、改善されたＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲがマウス由来の抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じＣＡＲＴ細胞と比較して、低い抗原密度（低ＢＣＭＡ発現）細胞との共培養においてより高いＩＦＮγ放出を示す。いくつかの実施形態において、低ＢＣＭＡ発現細胞は、ＲＬ細胞および／またはＴｏｌｅｄｏ細胞である。
いくつかの実施形態において、改善されたＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲがマウス由来の抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じＣＡＲ Ｔ細胞と比較してより低い抗原非依存性シグナル伝達を示す。
いくつかの実施形態において、改善されたＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲがマウス由来の抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じＣＡＲ Ｔ細胞と比較してより低い抗原非依存性シグナル伝達を示す。
Ｆ．ポリペプチド
本開示は、部分的には、ＣＡＲポリペプチドおよびその断片、それを含む細胞および組成物、ならびにポリペプチドを発現するベクターを企図する。好ましい実施形態において、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、および６８に記載される一つ以上のＣＡＲを含むポリペプチドが提供される。
「ポリペプチド」「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、反対であることが明記されない限り、従来的な意味、すなわちアミノ酸配列として相互交換可能に使用される。ポリペプチドは特定の長さに限定されず、例えばポリペプチドは、全長タンパク質配列または全長タンパク質の断片を含有してもよく、ポリペプチドは、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのポリペプチドの翻訳後修飾を含んでもよく、ならびに当分野に公知の天然および非天然の他の修飾を含んでもよい。様々な実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲポリペプチドは、タンパク質のＮ末端におけるシグナル（またはリーダー）配列を含み、これは、タンパク質の共翻訳的または翻訳後伝達を指示する。本明細書に開示されるＣＡＲにおいて有用な好適なシグナル配列の例示的な例には、ＩｇＧ１重鎖シグナル配列およびＣＤ８αシグナル配列が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドは、様々な周知の組み換え技術および／または合成技術のいずれかを使用して調製され得る。本明細書で企図されるポリペプチドは、本開示のＣＡＲ、または本明細書に開示されるＣＡＲの一つ以上のアミノ酸からの欠失、付加、および／または置換を有する配列を詳細には包含する。
本明細書において使用される場合、「単離ペプチド」または「単離ポリペプチド」などは、細胞環境からの、および細胞の他の構成要素との会合からの、ペプチド分子またはポリペプチド分子のインビトロでの単離および／または精製を指す。すなわち、インビボでの物質と実質的に関連づけられていない。同様に、「単離細胞」は、インビボ組織または臓器から取得され、細胞外基質を実質的に含まない細胞を指す。
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、一つ以上の置換、欠失、付加、及び／又は挿入により、天然発生型ポリペプチドとは異なっている場合がある。そうしたバリアントは、天然であってもよく、または例えば上述のポリペプチド配列の一つ以上を改変することにより合成的に生成されてもよい。例えば特定の実施形態では、一つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入を結合ドメイン、ヒンジ、ＴＭドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインまたはＣＡＲポリペプチドの一次シグナル伝達ドメインに導入することにより、ＣＡＲの結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。好ましくは、本明細書で企図されるポリペプチドは、それらに対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
ポリペプチドには「ポリペプチド断片」が含まれる。ポリペプチド断片は、天然に存在するまたは組換え的に産生されたポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または内部欠失もしくは置換を有する、単量体または多量体であり得るポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５～約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０アミノ酸長である。特に有用なポリペプチド断片は、抗原結合ドメイン又は抗体の断片を含む機能性ドメインを含む。マウス抗ＢＣＭＡ抗体の場合、有用な断片としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域、重鎖または軽鎖可変領域、二つのＣＤＲを含む抗体鎖または可変領域の一部、など。
ポリペプチドはまた、ポリペプチド（例えば、ポリ－Ｈｉｓ）の合成、精製、または同定の容易さのために、または固体支持体へのポリペプチドの結合を増強するために、インフレームで融合されてもよく、またはリンカーもしくは他の配列に結合されてもよい。
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断および挿入を含む、様々な方法で改変されてもよい。そうした操作のための方法は、当分野において一般的に公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡ中の変異により作製され得る。変異誘導およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当分野に公知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８－４９２）、Ｋｕｎｋｅｌら、（１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５４：３６７－３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．ら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．、１９８７）、およびそれらにおいて引用される参照文献を参照のこと。対象となるタンパク質の生物活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆら、（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出され得る。
特定の実施形態では、バリアントは保存的置換を含む。「保存的置換」は、アミノ酸が、類似した性能を有する別のアミノ酸に置換される置換であり、ペプチド化学分野の当業者であれば、そうした置換によって、ポリペプチドの二次構造及び疎水親水的性質が実質的に変化しないと予測するであろう。改変は、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において行われ得、依然として所望の特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子を得ることができる。本明細書で企図されるような等価な、または改善されたバリアントポリペプチドを作成するためにポリペプチドのアミノ酸配列を改変することが望まれる場合、当業者は、例えば、例えば表１に従って、コードＤＮＡ配列の一つ以上のコドンを変更させることができる。
Figure 2023539591000001
生物学的活性を消失させることなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失させることができるかを決定する際の指針は、ＤＮＡＳＴＡＲＴＭソフトウェアなどの当技術分野で周知のコンピュータプログラムを使用して見出すことができる。本明細書に開示されるタンパク質バリアント中のアミノ酸の変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち類似した荷電アミノ酸、または非荷電アミノ酸の置換であることが好ましい。保存的アミノ酸変化には、その側鎖で関連付けられているアミノ酸ファミリーの一つの置換を含む。天然アミノ酸は一般的に以下の四つのファミリーに分けられる：酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、合わせて芳香族アミノ酸として分類される場合もある。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適切な保存的置換は当業者に公知であり、一般的に得られる分子の生物活性を変化させることなく行うことができる。当業者であれば、ポリペプチドの非必須領域中の一アミノ酸置換は概して、生物活性を大きくは変化させないと認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８７、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、ｐ．２２４を参照のこと）。例示的な保存的置換は、米国仮特許出願第６１／２４１，６４７号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
そのような変更を行う際には、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する上でのヒドロパシー性アミノ酸指数の重要性は、当該技術分野において一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年、参照により本明細書に組み込まれる）。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。これらの値は、以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）。
特定のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、依然として類似の生物学的活性を有するタンパク質をもたらすこと、すなわち、依然として生物学的に機能的に等価なタンパク質を得ることが当該技術分野において公知である。このような変更を行う際には、疎水性親水性指標が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１内のアミノ酸が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸がさらに特に好ましい。類似のアミノ酸の置換は親水性に基づいて効果的に行うことができることも当技術分野において理解される。
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）、トレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換することができ、それでも生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なタンパク質を得ることができることが理解される。このような変化において、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１内のアミノ酸が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸がさらに特に好ましい。
上述のように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなどの相対的類似性に基づいてもよい。
ポリペプチドバリアントにはさらに、グリコシル化形態、他の分子との凝集コンジュゲート、および無関係な化学部分（例えば、ペグ化分子）との共有結合コンジュゲートが含まれる。共有結合バリアントは、当該技術分野で既知であるように、アミノ酸鎖中、又はＮ末端残基若しくはＣ末端残基中に存在する基に機能性を連結することによって調製することができる。バリアントにはまた、対立遺伝子バリアント、種バリアント、及び変異タンパク質が含まれる。タンパク質の機能的活性に影響を与えない領域の切断又は欠失もバリアントである。
一実施形態において、二つ以上のポリペプチドの発現が望まれる場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の他の箇所で論じるようなＩＲＥＳ配列によって分離することができる。別の実施形態において、二つ以上のポリペプチドは、一つ以上の自己切断ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。
本開示のポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、融合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えばＣＡＲが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質とは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。融合ポリペプチドは、典型的には、Ｃ末端からＮ末端に連結されているが、それらは、Ｃ末端からＣ末端に、Ｎ末端からＮ末端に、又はＮ末端からＣ末端に連結されてもよい。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序又は指定された順序であってもよい。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の転写活性が維持される限り、保存的に改変された変異体、多型変異体、対立遺伝子、変異体、サブ配列、および種間相同体を含むこともできる。融合ポリペプチドは、化学合成法により、または二つの部分の間の化学的結合により作製されてもよく、または他の標準的な方法を使用して一般的に調製されてもよい。融合ポリペプチドを含む連結されたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所で論じるように適切な転写または翻訳制御エレメントに作動可能に連結される。
一実施形態において、融合パートナーは、天然の組換えタンパク質よりも高い収率でタンパク質（発現エンハンサー）を発現するのを補助する配列を含む。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解性を増加させるように、またはタンパク質が所望の細胞内区画に標的化されることを可能にするように、または細胞膜を通じて融合タンパク質の輸送を容易にするように選択され得る。
融合ポリペプチドは、本明細書で企図されるポリペプチドドメインの各々間のポリペプチド切断シグナルをさらに含み得る。なお、ポリペプチド部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルとしては、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、まれな制限酵素認識部位、自己切断リボザイム認識部位）、および自己切断ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が挙げられる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ ａｎｄ Ｒｙａｎ，２００４年、Ｔｒａｆｆｉｃ、５（８）；６１６－２６を参照のこと）。
適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは、当業者に公知である（例えば、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９－７２２；Ｓｃｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９－５９４を参照のこと）。プロテアーゼ切断部位の例としては限定されないが、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えばタバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ－２－コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（ワイカウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられる。その高い切断ストリンジェンシーのために、ＴＥＶ（タバコエッチングウイルス）プロテアーゼ切断部位が一実施形態において好ましく、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号８２）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号８３）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号８４）であり、ここでＸは任意のアミノ酸を表す（ＴＥＶによる切断はＱとＧまたはＱとＳの間で起こる）。
特定の実施形態において、ポリペプチド切断シグナルは、ウイルス自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピング配列である。
リボソームスキッピング配列の例示的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２Ａまたは２Ａ様部位、配列またはドメイン（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、２００１年Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。特定の実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
一実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、ゾセアアシグナウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテスコウイルス－１（ＰＴＶ－１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。
２Ａ部位の例示を表２に提示する。
Figure 2023539591000002
好ましい実施形態において、本明細書で企図されるポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドを含む。
Ｇ．ポリヌクレオチド
好ましい実施形態において、一つ以上のＣＡＲポリペプチド、例えば配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、および６７をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、および６８のいずれかに記載されるアミノ酸配列をコードする。
他の実施形態において、抗ＢＭＣＡ ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、抗体、またはその断片が提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１～３、９～１１、１７～１９、２５～２７、３３～３５または４１～４３に記載される可変軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列、ならびに／または配列番号４～６、１２～１４、２０～２２、２８～３０、３６～３８または４４～４６に記載される可変重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列を含む抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ、抗体またはその断片をコードする。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７、１５、２３、３１、３９、または４７のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ、抗体、またはその断片をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号８、１６、２４、３２、４０または４８のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ、抗体、またはその断片をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７、１５、２３、３１、３９、または４７のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖と、配列番号８、１６、２４、３２、４０、または４８のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ、抗体、またはその断片をコードする。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってもよく、かつ組換え、合成、又は単離のいずれかであってもよい。ポリヌクレオチドには、これらに限定されないが、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、又は組換えＤＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドとは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００以上のヌクレオチドの長さのヌクレオチドの多量体型を指し、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかタイプのヌクレオチドの改変型、ならびにすべての中間の長さのものを指す。本文脈において、「中間の長さ」とは、例えば、６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などの引用されている値の間の任意の長さを意味すると、容易に理解されるであろう。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対し、少なくとも、もしくは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。
本明細書において使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、断片に通常隣接している配列から除去されたＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態では、「単離されたポリヌクレオチド」はまた、自然界には存在せず、人為的に作製された、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、又は他のポリヌクレオチドも指す。特定の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチド、半合成ポリヌクレオチド、または組み換え源から取得された、もしくは誘導されたポリヌクレオチドである。
様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含有する。ある実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ、一つ以上のヌクレオチド、そしてポリ（Ａ）尾部を含有する。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されてもよい。本明細書で使用される場合、「コドン最適化」という用語は、ポリペプチドの発現、安定性、及び／又は活性を増加させるためにポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中のコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響を及ぼす因子としては限定されないが、以下のうちの一つ以上が挙げられる：（ｉ）二つ以上の生物体または遺伝子または合成構築されたバイアステーブルの間のコドンバイアスの変動、（ｉｉ）生物体、遺伝子または遺伝子セット内のコドンバイアスの程度の変動、（ｉｉｉ）コンテキストを含むコドンの体系的変動、（ｉｖ）その解読ｔＲＮＡに伴うコドンの変動、（ｖ）三つ組全体または三つ組の一つの位置のいずれかのＧＣ％に伴うコドンの変動、（ｖｉ）例えば天然配列などの参照配列に対する類似性における変動、（ｖｉｉ）コドン頻度のカットオフにおける変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造的性質、（ｉｘ）コドン置換セットの設計の基礎となるＤＮＡ配列の機能に関する予備知識、（ｘ）各アミノ酸に対するコドンセットの合成的変動、および／または（ｘｉ）誤った翻訳開始位置の分離された除去。
本明細書において使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と相当の配列同一性を呈するポリヌクレオチド、または本明細書において規定されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、一つ以上のヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドに比べて、付加若しくは欠失若しくは異なるヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドを含む。この点に関し、当分野において、参照ポリヌクレオチドに対し、変異、付加、欠失および置換を含むある変更が為され、変更されたポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または生物活性を保持し得ると理解されている。
ポリヌクレオチドバリアントは、生物学的に活性なポリペプチド断片またはバリアントをコードするポリヌクレオチド断片が含まれる。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド断片」という用語は、少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、又は少なくとも５％の天然発生型ポリペプチド活性を保持するポリペプチドをコードする、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００以上のヌクレオチド長のポリヌクレオチド断片を指す。ポリヌクレオチド断片はアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、カルボキシ末端欠失、及び／若しくは内部欠失又は天然発生型若しくは組換え産生ポリペプチドの一つ以上のアミノ酸の置換を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
「配列同一性」、又は例えば「～に対して５０％同一の配列」を含む、という文章は、本明細書において使用される場合、比較ウィンドウ上で配列が、ヌクレオチドごとで同一である、又はアミノ酸ごとで同一である程度を指す。ゆえに「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウ上の二つの最適アライメント配列を比較すること、同一核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一アミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が、両方の配列中に存在する位置の数を決定して、合致位置数を算出すること、合致位置数を、比較ウィンドウ中の総位置数（すなわちウィンドウサイズ）で割ること、および結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を算出すること、により計算されてもよい。本明細書で企図される参照配列のいずれかに対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、典型的には、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を維持する。
二つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列関係を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、及び「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、長さが、少なくとも１２個の単量体単位であり、多くの場合、１５～１８個の単量体単位であり、多くの場合、少なくとも２５個の単量体単位である、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含む。二つのポリヌクレオチドはそれぞれ、（１）二つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）二つのポリヌクレオチド間で発散する配列を含んでもよく、二つの（またはそれ以上の）ポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために、二つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」で比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、少なくとも６個の連続する位置、通常は、約５０～約１００、より一般的には約１００～約１５０の概念セグメントを指し、配列は、二つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続する位置の参照配列と比較される。比較ウィンドウは、二つの配列の最適なアライメントのため、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。比較ウィンドウを整列するための配列の最適なアラインメントは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡにおけるアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化実行によって、または選択された様々な方法のいずれかによって生成される検査および最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたり最も高い相同性をもたらす）によって行われ得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９により開示されるプログラムのＢＬＡＳＴファミリーを参照されたい。配列解析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、１９９４～１９９８年、第１５章のユニット１９．３に見ることができる。
ポリヌクレオチドの方向性を記載する用語には、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）および３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の配向又は３’から５’の配向で注釈付けされ得る。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについて、５’から３’の鎖は、その配列が、プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるために、「センス」鎖、「プラス」鎖、又は「コード」鎖と指定される［ＤＮＡ中のチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡ中のウラシル（Ｕ）を除く］。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼによって転写された鎖である相補的な３’から５’鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、又は「非コード」鎖として指定される。本明細書で使用される場合、用語「逆配向」は、３’～５’配向に書かれた５’～３’配列、または５’～３’方向に書かれた３’～５’配列を指す。
用語「相補的」および「相補性」は、塩基対形成規則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は、３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は、しばしば、５’末端が左に、３’末端が右にある、５’ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ ３’、逆相補体として記載される。その逆相補鎖と等しい配列は、パリンドローム配列であると言われる。相補性は、核酸塩基の一部のみが塩基対合規則に従って一致する、「部分的」であり得る。又は、核酸間には、「完全」又は「総合的な」相補性が存在し得る。
さらに、遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書で企図されるようなポリペプチドまたはそのバリアントの断片をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者に理解される。これらポリヌクレオチドのうちのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して、最小の相同性を担持する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差異によって変化するポリヌクレオチドが企図され、特定の実施形態では、例えば、ヒト及び／又は霊長類のコドン選択に最適化されたポリヌクレオチドが企図される。更に、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も使用され得る。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換など、一つまたは複数の変異の結果として改変される内在性遺伝子である。
本明細書において使用される場合、「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、ＲＮＡを発現し、その後にポリペプチドを発現することができるベクター中の遺伝子配列を指す。一つの実施形態では、核酸カセットは、対象となる遺伝子、例えば対象となるポリヌクレオチドを含有する。別の実施形態では、核酸カセットは、一つまたは複数の発現制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および例えば対象となるポリヌクレオチドなどの対象となる遺伝子を含有する。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、ベクター内で位置的に、そして連続的に方向付けられる。それにより、カセット中の核酸はＲＮＡに転写されることができ、必要な場合にはタンパク質またはポリペプチドへと翻訳され、形質転換細胞での活動に必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画に標的化されることで生物活性に適した区画へと移行され、または細胞外区画へと分泌されることができる。カセットは、ベクター内への即時の挿入に適合された３’末端および５’末端を有することが好ましく、例えば各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有している。好ましい実施形態において、核酸カセットはＣＡＲをコードする。カセットは取り出され、そして単一ユニットとしてプラスミドまたはウイルスベクター内に挿入されることができる。
ポリヌクレオチドは、対象となるポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「対象のポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチド、ポリペプチドバリアント、又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の目的のポリヌクレオチドを含んでもよい。ある特定の実施形態では、対象のポリヌクレオチドは、疾患又は傷害の治療又は予防において治療効果を提供するポリペプチドをコードする。対象のポリヌクレオチド、及びそれからコードされるポリペプチドは、野生型ポリペプチド、並びに機能的バリアント及び断片をコードする両方のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、機能的バリアントは、対応する野生型参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。特定の実施形態では、機能的バリアントまたは断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を有する。
本明細書において想定されるポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書の他の箇所に開示されるか当該技術分野で知られている、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされてもよく、その結果、それらの全体的な長さが大幅に変動してもよい。したがって、ほぼ任意の長さのポリヌクレオチド断片が特定の実施形態で使用されてもよく、全長は、意図される組み換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限されることが好ましい。
ポリヌクレオチドは、当分野で公知および利用可能な様々な確立された技術のいずれかを使用して調製され、操作され、および／または発現されてもよい。所望のポリペプチドを発現するために、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切なベクターに挿入されてもよい。
ベクターの例示としては限定されないが、プラスミド、自己複製配列、および転位因子、例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｍｏｓ１、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ、Ｔｏｌ２、ｍｉｎｉ－Ｔｏｌ２、Ｔｃ３、ＭｕＡ、Ｈｉｍａｒ Ｉ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅおよびその誘導体が挙げられる。
ベクターの追加的な例示としては限定されないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、例えばラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。
ベクターとして有用なウイルスの例示としては限定されないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴型ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えばＳＶ４０）が挙げられる。
発現ベクターの例示としては限定されないが、哺乳動物細胞における発現用のｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス介在性の遺伝子導入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞でのポリペプチドの発現のために、そうした発現ベクター内にライゲートされてもよい。
一実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲをコードするベクターは、配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、および６７に記載のポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、ベクターは、エピソームベクター、又は染色体外で維持されるベクターである。本明細書において使用される場合、「エピソーム性」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡに統合されることなく複製することができるベクターであり、宿主細胞の分裂により徐々に減少することがないということは、当該ベクターが染色体外で、またはエピソーム性に複製することも意味している。
発現ベクター中に存在する「制御要素」、「制御配列」は、ベクターの非翻訳領域であり、複製起源、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）、イントロン、ポリアデニル化配列、５’および３’の非翻訳領域が挙げられ、宿主の細胞タンパク質と相互作用して、転写と翻訳を実行する。そうした因子は、その強度および特異性を変化させてもよい。利用するベクターシステムおよび宿主に応じて、ユビキタスプロモーターおよび誘導性プロモーターをはじめとする任意の数の適切な転写因子および翻訳因子を使用してもよい。
特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターおよびウイルスベクターを含むが、これに限定されないが、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの外因性、内因性、または異種制御配列を含む。「内因性」制御配列は、ゲノム中で所与の遺伝子と自然に連結される配列である。「外因性」制御配列は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指向されるように、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子と並立に配置されるものである。「異種」制御配列は、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。
本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始及び転写する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞で動作するプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴ－リッチ領域、および／または転写開始部位から７０～８０塩基上流に存在する別の配列であるＣＮＣＡＡＴ領域を含有し、式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る。
「エンハンサー」という用語は、転写の強化を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指し、一部の場合では、別の制御配列に対する方向性に関係なく機能することができる。エンハンサーは、プロモーター及び／又は他のエンハンサーエレメントと協働して、又は相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指す。
「操作可能に連結した」という用語は、記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある並置を意味する。一実施形態では、用語は、核酸発現制御配列（プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）と第二のポリヌクレオチド配列、例えば、対象のポリヌクレオチドとの間の機能的結合を指し、ここで、発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。
本明細書において使用される場合、「構造的発現制御配列」という用語は、操作可能に連結された配列の継続的な、または連続的な転写を可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構造的発現制御配列は、様々な細胞型と組織型での発現を可能にする「ユビキタス」なプロモーター、エンハンサー、プロモーター／エンハンサーであってもよく、または限定的な細胞型および組織型での発現を可能にする、それぞれ「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞株特異的」、または「組織特異的」なプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。
特定の実施形態における使用に適したユビキタス発現制御配列の例示としては限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば初期または後期）、モロニ－マウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５およびＰ１１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答タンパク質１（ＥＧＲ１：ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、真核細胞翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、ヒートショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、ヒートショックタンパク質９０ｋＤａ ベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、ヒートショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（β－ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ ２６座位（Ｉｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１４７７ － １４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、ネガティブ制御領域欠失型、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）Ｕ３プロモーター（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００３；７７（１７）：９４３９－９４５０）が挙げられる。
一つの実施形態では、ベクターは、ＭＮＤＵ３プロモーターを含有する。
一つの実施形態では、ベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第一イントロンを含むＥＦ１ａプロモーターを含有する。
一つの実施形態では、ベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第一イントロンを欠くＥＦ１ａプロモーターを含有する。
特定の実施形態では、Ｔ細胞特異的プロモーター由来のＣＡＲを含むポリヌクレオチドを発現させることが望ましい場合がある。
本明細書で使用される場合、「条件付き発現」とは、限定されないが、誘導性発現、抑制性発現、特定の生理学的状態、生物学的状態もしくは疾患状態を有する細胞または組織における発現などをはじめとする任意のタイプの条件付き発現を指す場合がある。この定義は、細胞型特異的または組織特異的な発現を除外することは意図されない。ある実施形態は、対象となるポリヌクレオチドの条件付き発現を提供するものであり、例えば発現は、細胞、組織、生物体を、ポリヌクレオチドが発現される処理または条件、または対象となるポリヌクレオチドにコードされるポリヌクレオチドの発現が増加もしくは減少する処理または条件に曝すことにより制御される。
誘導性プロモーター／システムの例示としては限定されないが、ステロイド誘導性プロモーター、例えばグルココルチコイド受容体またはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター（対応するホルモンの処理で誘導可能）、メタロチオネインプロモーター（様々な重金属の処理で誘導可能）、ＭＸ－１プロモーター（インターフェロンで誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン制御性システム（Ｓｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クミン酸塩（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性制御システムなどが挙げられる。
条件付き発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによっても達成され得る。ある特定の実施形態によれば、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えについて少なくとも一つの（典型的には二つの）部位を含む。本明細書で使用される場合、用語「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」は、一つ以上の組換え部位（例えば、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、５０等）を含む組換え反応に関与するｅｘｃｉｓｉｖｅまたは組込タンパク質、酵素、補助因子または関連タンパク質を含み、野生型タンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９－７０７（１９９３）を参照のこと）、または変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含む融合タンパク質）、断片およびそのバリアントであってもよい。特定の実施形態での使用に好適なリコンビナーゼの例示的な例には、これらに限定されないが、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、及びＰａｒＡが挙げられる。
ベクターは、広範囲の部位特異的リコンビナーゼのいずれかに対して一つ以上の組換え部位を含んでもよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの統合に必要とされる任意の部位（複数可）に追加されることが理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「組み換え配列」、「組み換え部位」、または「部位特異的組み換え部位」は、リコンビナーゼが認識および結合する特定の核酸配列を指す。
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの一つの組み換え部位は、８塩基対コア配列に隣接する二つの１３塩基対逆位リピート（リコンビナーゼ結合部位として残る）を含む３４塩基対配列であるｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１－５２７（１９９４）の図１を参照）。他の例示的なｌｏｘＰ部位としては、以下に限定されないが、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ ｅｔ ａｌ．、１９９６；Ｂｅｔｈｋｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ、１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ、１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ、１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９９５）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９９５）が挙げられる。
ＦＬＰリコンビナーゼの好適な認識部位としては、これらに限定されないが、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６年）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ、１９９４年）、Ｆ４、Ｆ５（Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ、１９９４年）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８年）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８年）が挙げられる。
認識配列のその他の例は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列であり、これはリコンビナーゼ酵素のλインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ－ｃ３１によって認識される。φＣ３１ ＳＳＲは、ヘテロタイプ部位ａｔｔＢ（長さ３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さ３９ ｂｐ）との間でのみ組換えを媒介する（Ｇｒｏｔｈら、２０００年）。ａｔｔＢとａｔｔＰは、それぞれ細菌ゲノムとファージゲノム上のファージインテグラーゼの付着部位にちなんで名付けられましたが、どちらもφＣ３１ホモ二量体によって結合されている可能性が高い不完全な反転反復を含んでいる（Ｇｒｏｔｈら、２０００年）。生成物部位、ａｔｔＬおよびａｔｔＲは、さらにφＣ３１媒介性組換えに対して効果的に不活性（Ｂｅｌｔｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）であり、反応を不可逆的にする。挿入を触媒するために、ａｔｔＰ部位がゲノムａｔｔＢ部位に挿入するよりもａｔｔＢ担持ＤＮＡのほうが容易にゲノムａｔｔＰ部位に挿入されることが見出されている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｂｅｌｔｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。したがって、典型的な戦略は、相同組み換えによって、ａｔｔＰ担持する「ドッキング部位」を定義された座位に位置付け、その後、挿入のためのａｔｔＢ担持ｉｎｃｏｍｉｎｇ配列と結合される。
本明細書において使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」とは、シストロン（タンパク質コード領域）の例えばＡＴＧなどの開始コドンに内部リボソームが直接侵入することを促進し、キャップ非依存性の遺伝子翻訳を生じさせる因子を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７－８３）およびＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ １（１０）：９８５－１０００を参照のこと。特定の実施形態では、ベクターは、一つ以上のポリペプチドをコードする一つ以上の対象のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、自己切断ポリペプチドをコードする一つ以上のＩＲＥＳ配列又はポリヌクレオチド配列によって分離され得る。一つの実施形態では、本明細書において予期されるポリヌクレオチドに使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳである。
本明細書において使用される場合、「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、リボソーム小サブユニットへのｍＲＮＡの初期結合を大きく促進し、翻訳を増加させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスＫｏｚａｋ配列は（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号１０７）であり、ここでＲはプリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ、１９８６年Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３－９２およびＫｏｚａｋ、１９８７年Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５－４８）。特定の実施形態では、ベクターは、所望のポリペプチド、例えばＣＡＲをコードするコンセンサスＫｏｚａｋ配列を有するポリヌクレオチドを含む。
異種核酸転写物の効率的な終止とポリアデニル化を誘導する因子は、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは、概して、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態では、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される場合、「ポリＡ部位」又は「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって発生期のＲＮＡ転写物の終止及びポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリＡテールをコード配列の３’末端に付加することによってｍＲＮＡ安定性を促進することができ、したがって、翻訳効率の向上に寄与する。切断及びポリアデニル化は、ＲＮＡ中のポリ（Ａ）配列によって指向される。哺乳類プレｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断ポリアデニル化部位に隣接する二つの認識エレメントを有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡ六量体が、Ｕ残基又はＧＵ残基が豊富な、より可変性であるエレメントの上流２０～５０ヌクレオチドに存在する。初期転写物の切断はこれら二つのエレメントの間で発生し、５’切断産物に最大で２５０個のアデノシンが付加される。特定の実施形態では、コアポリ（Ａ）配列は、最良のポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０のポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ－グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、それらのバリアント、または当分野に公知の別の適切な異種または内因性ポリＡ配列である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを保有する細胞は、直接的な毒性および／または非制御増幅のリスクを減少させるための誘導性自殺遺伝子をはじめとする自殺遺伝子を利用する。特定の態様では、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドを保有する宿主、又は細胞に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ－９又はカスパーゼ－８又はシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ－９は、二量体形成の特定の化学誘導物質（ＣＩＤ：ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を使用して活性化され得る。
Ｈ．ベクター
特定の実施形態では、ＣＡＲをコードする一つ以上のポリヌクレオチドが、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）に導入される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードするポリシストロニックポリヌクレオチドは、非ウイルスまたはウイルスベクターによって細胞に導入される。
「ベクター」という用語は、本明細書において、もう一つの核酸分子を移送または輸送することができる核酸分子を指すために使用される。伝達された核酸は、一般的に、例えば、ベクター核酸分子に挿入される。ベクターは、細胞内で自己複製を指向する配列を含んでもよく、又は宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態では、非ウイルスベクターを使用して、本明細書で意図される一つまたは複数のポリヌクレオチドをＴ細胞に送達する。
非ウイルス性ベクターの例示としては限定されないが、ｍＲＮＡ、プラスミド（例えばＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が挙げられる。
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドまたはベクターの非ウイルス送達の例示的方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティックス、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸ＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介転写、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられる。
特定の実施形態において企図される特定の実施形態での使用に適したポリヌクレオチド送達システムの例示としては限定されないが、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．により提供されるシステムが挙げられる。リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体－認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０－１８７；およびＢａｌａｚｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１－１２を参照のこと。抗体標的化送達、細菌誘導送達、非生物ナノセル系送達も特定の実施形態において予期される。
様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、所望のポリペプチドを一過性に発現させるために細胞内に導入されるｍＲＮＡである。
本明細書で使用される場合、「一過性」とは、数時間、数日、または数週間の期間にわたる非統合型導入遺伝子の発現を指し、発現期間は、細胞内のゲノムに統合されるか、または安定的なプラスミドレプリコン内に含有される場合、ポリヌクレオチドの発現期間よりも短い。
特定の実施形態では、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、インビトロに転写されたｍＲＮＡである。本明細書で使用される場合、「インビトロで転写されたＲＮＡ」は、インビトロで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。概して、インビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから生成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡを生成するために使用されるテンプレートを含む。
特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップまたは修飾５’キャップ、および／またはポリ（Ａ）配列をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７－メチルグアノシンキャップ、又はＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも呼ばれる）は、転写開始の直後に真核性メッセンジャーＲＮＡの「前」又は５’末端に添加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第一の転写ヌクレオチドに連結され、リボソームによって認識され、ＲＮａｓｅから保護される末端基を含む。キャッピング部分は、翻訳の安定性又は効率など、ｍＲＮＡの機能を調節するように修飾され得る。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、約５０～約５０００個のアデニンのポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、約１００～約１０００塩基、約２００～約５００塩基、又は約３００～約４００塩基のポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、約６５塩基、約１００塩基、約２００塩基、約３００塩基、約４００塩基、約５００塩基、約６００塩基、約７００塩基、約８００塩基、約９００塩基、又は約１０００塩基以上のポリ（Ａ）配列を含む。ポリ（Ａ）配列は、局在化、安定性、又は翻訳の効率などのｍＲＮＡ機能を調節するために、化学的又は酵素的に修飾され得る。
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターは、個々の患者に投与することにより、典型的には以下に記載されるように全身投与（例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または頭蓋内点滴）または局所適用することによりインビボで送達され得る。あるいはベクターは、例えば個々の患者から外植された細胞（例えば動員（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）された末梢血、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検等）またはユニバーサルドナーの造血幹細胞などの細胞に生体外で送達されてもよく、その後、患者に当該細胞を再移植してもよい。
一実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与する。あるいは、ネイキッドＤＮＡが投与されてもよい。投与は、これらに限定されないが、注射、注入、局所適用、及びエレクトロポレーションを含む、血液又は組織細胞との最終接触に分子を導入するために通常使用される任意の経路による。そうした核酸の適切な投与方法は当業者に利用可能および公知であるが、複数の経路を使用して特定の組成物を投与してもよく、特定の経路はしばしば、別の経路よりも即時性で高い効果的反応を提供することができる。
本明細書で意図される特定の実施形態での使用に適したウイルスベクターシステムの例示には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、ＣＡＲをコードする一つ以上のポリヌクレオチドは、一つ以上のポリヌクレオチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）で細胞を形質導入することによって、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に導入される。
ＡＡＶは、小さな（約２６ｎｍ）複製欠損、主に、エピソーム非エンベロープで覆われたウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は典型的には、最小で導入遺伝子とその制御配列、並びに５’及び３’のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）から構成される。ＩＴＲ配列は約１４５ｂｐの長さである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０から単離されたＩＴＲとカプシド配列を含有する。
一部の実施形態では、キメラｒＡＡＶが使用される。ＩＴＲ配列は、一つのＡＡＶ血清型から単離され、カプシド配列は別のＡＡＶ血清型から単離される。例えば、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列及びＡＡＶ６由来のカプシド配列を含むｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と呼ばれる。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶ１０のうちのいずれか一つに由来するカプシドタンパク質とを含み得る。好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列及びＡＡＶ６由来のカプシド配列を含む。好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列と、ＡＡＶ２由来のカプシド配列を含有する。
一部の実施形態では、操作と選択の方法をＡＡＶカプシドに行って、それらが対象となる細胞に形質導入される確率を高くしてもよい。
ｒＡＡＶベクターの構築、その製造、および精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号、第９，１６９，４９２号、第９，０１２，２２４号、第８，８８９，６４１号、第８，８０９，０５８号、及び第８，７８４，７９９号に開示されており、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
様々な実施形態において、ＣＡＲをコードする一つ以上のポリヌクレオチドを免疫エフェクター細胞に導入し、細胞をレトロウイルス、例えばレンチウイルスで形質導入することによって、一つ以上のポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態での使用に好適な例示的なレトロウイルスには、これらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、並びにレンチウイルスが含まれる。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（又は属）を指す。例示的なレンチウイルスには、これらに限定されないが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２を含む）、ビスナマエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、カプリン関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。一つの実施形態では、ＨＩＶをベースとしたベクター骨格（すなわちＨＩＶシス作用性配列因子）が好ましい。
様々な実施形態では、本明細書に企図されるレンチウイルスベクターは、一つまたは複数のＬＴＲ、および以下のアクセサリー因子のうちの一つまたは複数またはすべてを含有する：ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージシグナル、輸出因子（ｅｘｐｏｒｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）、ポリ（Ａ）配列。および任意で、本明細書において別段に検討されるように、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、インシュレーター因子、選択マーカー、および細胞自殺遺伝子を含有してもよい。
特定の実施形態では、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、統合的、または非統合的、または統合能力を欠くレンチウイルスであってもよい。本明細書で使用される場合、「組み込み欠損レンチウイルス」又は「ＩＤＬＶ」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む能力を欠いているインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組み込み－インコンピテントウイルスベクターは、特許出願ＷＯ２００６／０１０８３４に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
インテグラーゼ活性を低減するのに好適なＨＩＶ－１ ｐｏｌ遺伝子における例示的な変異には、これらに限定されないが、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１ Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１ Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、及びＫ２６４Ｈが挙げられる。
一実施形態では、ＨＩＶ－１インテグラーゼ欠失ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｅ１５２Ｇ、若しくはＥ１５２Ａ変異、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、及びＥ１５２Ｇ変異、又はＤ６４Ｖ、Ｄ１１６Ａ、及びＥ１５２Ａ変異を含む。
一実施形態では、ＨＩＶ－１インテグラーゼ欠失ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ変異を含む。
「長末端反復（ＬＴＲ：ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指し、本来の配列ではＬＴＲはダイレクトリピートであり、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域を含有する。
本明細書において使用される場合、「ＦＬＡＰ因子」、または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、その配列が、例えばＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２などのレトロウイルスの中心ポリプリン帯（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）と中心末端配列（ｃｅｎｔｒａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。適切なＦＬＡＰ因子は、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴおよび／またはＣＴＳ要素中の一つ以上の変異を有するＦＬＡＰ要素を含有する。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴまたはＣＴＳ要素のいずれかを含む。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴまたはＣＴＳ要素を含まない。
本明細書において使用される場合、「パッケージシグナル」または「パッケージ配列」という用語は、レトロウイルスゲノム内に位置するｐｓｉ［Ψ］配列を指し、ウイルスカプシドまたはウイルス粒子内にウイルスＲＮＡを挿入するために必要とされる。例えば、Ｃｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９、Ｎｏ．４、ｐｐ．２１０１－２１０９を参照されたい。
「輸出因子」という用語は、シス作用性の転写後制御因子を指し、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を制御する。ＲＮＡ輸出因子の例としては限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｒｅｖ反応性因子（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；およびＣｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ ５８：４２３を参照のこと）およびＢ型肝炎ウイルスの転写後制御因子（ＨＰＲＥ）が挙げられる。
特定の実施形態では、ウイルスベクター中の異種配列の発現は、転写後制御因子、効率的ポリアデニル化部位、および任意で転写終止シグナルをベクターに組み込むことで増加する。様々な転写後調節エレメントは、タンパク質における異種核酸の発現を増加させることができ、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９９年Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：２８８６）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）に存在する転写後調節エレメント（Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：３８６４）；及び同様のもの（Ｌｉｕら、１９９５年Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、９：１７６６）がある。
レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲの修飾の結果としていくつかの安全性の増強を含む。「自己不活化」（ＳＩＮ：ｓｅｌｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ベクターとは、複製能力を欠いたベクターを指し、例えば右（３’）ＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域はＵ３領域として知られているが、この領域が（例えば欠失または置換により）改変されて、ウイルス複製の最初のラウンドを超えたウイルス転写が阻害される。追加的な安全性の増強は、５’ＬＴＲのＵ３領域を、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を誘導する異種プロモーターと置き換えることで提供される。使用され得る異種プロモーターの例としては例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば前初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）のプロモーターが挙げられる。
本明細書において使用される場合、「偽型」または「偽型の」という用語は、好ましい特性を有する別のウイルスのエンベロープタンパク質と置き換えられたウイルスエンベロープタンパク質を有するウイルスを指す。例えば、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子にコードされる）は通常、ＣＤ４＋提示細胞に対してウイルスを標的化するが、水泡性口炎ウイルスのＧ－タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質でＨＩＶを偽型化することで、広範な細胞にＨＩＶが感染できるようになる。
ある実施形態では、レンチウイルスベクターは、公知の方法により産生される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒら、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２－６７５０－９－１０；Ｋｕｔｎｅｒら Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９年；４（４）：４９５－５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
本明細書に企図されるある特定の実施形態によると、ほとんど、またはすべてのウイルスベクターの骨格配列は、例えばＨＩＶ－１などのレンチウイルスに由来する。しかしながら、レトロウイルス及び／若しくはレンチウイルス配列の多くの異なる源を使用することができるか、又はある特定のレンチウイルス配列の組み合わせられた多数の置換及び改変が、移入ベクターの本明細書に記載される機能を行う能力を損なうことなく適応され得ることが理解されるべきである。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野において公知である、Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６ａ、１９９６ｂおよび１９９８年）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、（１９９７）、Ｄｕｌｌら、１９９８年、米国特許第６，０１３，５１６号、及び第５，９９４，１３６号を参照されたく、それらの多くが、本明細書に企図されるウイルスベクター又はトランスファープラスミドの産生に適合され得る。
様々な実施形態において、ＣＡＲをコードする一つ以上のポリヌクレオチドは、一つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで細胞を形質導入することによって免疫エフェクター細胞に導入される。
アデノウイルスを基にしたベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そうしたベクターを用いることで、高力価及び高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に産生され得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、及び／又はＥ３遺伝子を置き換えるように操作され、その後、トランスで欠失した遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞において、複製欠損ベクターが増殖される。Ａｄベクターは、例えば肝臓、腎臓および筋肉中に存在する細胞などの非分裂細胞、分化細胞を含む、複数のタイプの組織にインビボで形質導入することができる。従来的なＡｄベクターは、大きな運搬能力を有している。
複製能力を欠く現在のアデノウイルスベクターの作製と増幅は、２９３と呼ばれるユニークなヘルパー細胞株を利用する場合がある。この細胞株は、ヒト胚腎臓細胞からＡｄ５ ＤＮＡ断片により形質転換されたものであり、Ｅ１タンパク質を構造的に発現している（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムには不必要であるため（Ｊｏｎｅｓ＆Ｓｈｅｎｋ，１９７８）、現行のアデノウイルスベクターは、２９３細胞を利用して、Ｅ１、Ｄ３、又は両方のいずれかの領域に外来ＤＮＡを運搬する（Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核細胞遺伝子の発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｇｏｍｅｚ－Ｆｏｉｘ ｅｔ ａｌ．，１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２；Ｇｒａｈａｍ ＆ Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）に使用されている。組み換えアデノウイルスを様々な組織に投与する実験としては、気管滴下（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、末梢静脈注射（Ｈｅｒｚ ＆ Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、および脳内への定位性接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３）が挙げられる。臨床試験におけるＡｄベクターの使用例には、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫を目的としたポリヌクレオチド療法が含まれる（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－９（１９９８））。
様々な実施形態において、ＣＡＲをコードする一つ以上のポリヌクレオチドは、単純ヘルペスウイルス、例えばＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２で細胞を形質導入することによって免疫エフェクター細胞に導入され、一つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードするポリシストロニックメッセージをコードする一つ以上のポリヌクレオチドは、単純ヘルペスウイルスで細胞を形質導入することによって免疫エフェクター細胞に導入され、例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、一つ以上のポリヌクレオチドを含む。
成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである直鎖二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを含むエンベロープで覆われた二十面体カプシドからなる。一実施形態では、ＨＳＶを基にしたウイルスベクターは、一つ以上の必須又は非必須ＨＳＶ遺伝子において欠損している。一実施形態では、ＨＳＶを基にしたウイルスベクターは、複製欠損である。ほとんどの複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を防ぐために一つ以上の最早期、早期、又は後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含む。例えばＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される最早期遺伝子が欠損であり得る。ＨＳＶベクターの利点は、長期間のＤＮＡ発現をもたらし得る潜伏期に入る能力、及び最大２５ｋｂの外因性ＤＮＡを収容し得るその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶ系のベクターは、例えば米国特許第 ５，８３７，５３２号、第５，８４６，７８２号および第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願ＷＯ ９１／０２７８８、ＷＯ ９６／０４３９４、ＷＯ ９８／１５６３７およびＷＯ ９９／０６５８３に記載されており、それらはその全体で参照により本明細書に援用される。
Ｉ．遺伝子改変細胞
様々な実施形態において、細胞は、本明細書で企図されるＣＡＲを発現するように遺伝子改変された、Ｂ細胞関連状態の治療に使用する。本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」又は「遺伝子修飾された」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡの形態の追加的な遺伝物質を、細胞中の総遺伝物質に加えることを指す。「遺伝子修飾された細胞」、「修飾細胞」、及び「再指向された細胞」という用語は、相互交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、「遺伝子治療」という用語は、遺伝子の発現を回復、修正、もしくは改変する細胞内の全遺伝物質へのＤＮＡまたはＲＮＡの形態の余分な遺伝物質の導入、または治療用ポリペプチド、例えばＣＡＲを発現する目的で、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態の余分な遺伝物質を導入することを指す。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲは、それらの特異性を対象の標的抗原、例えばＢＣＭＡポリペプチドに向け直すように免疫エフェクター細胞に導入および発現される。「免疫エフェクター細胞」は、一つまたは複数のエフェクター機能（例えば細胞傷害性の細胞殺傷活性、サイトカイン分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導など）を有する免疫系の任意の細胞である。本明細書に企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、これらに限定されないが、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、及びヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）を含む、Ｔリンパ球である。特定の実施形態では、細胞は、αβ Ｔ細胞を含む。特定の実施形態では、細胞は、γδ Ｔ細胞を含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一つの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。
免疫エフェクター細胞は、自己（ｓｅｌｆ）または非自己（ｎｏｎ－ｓｅｌｆ、例えば同種、同系または異種）であってもよい。本明細書で使用される場合、「自己」とは、同じ対象に由来する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同種」とは、比較した細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同系」とは、比較した細胞と遺伝的に同一である、異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「異種」とは、比較した細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、細胞は自己である。
特定の実施形態において企図されるＣＡＲと共に使用される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含む。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当分野において認識されており、胸腺細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことが意図される。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）又はＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞、又はＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。特定の実施形態での使用に適したＴ細胞の他の例示的な集団としては、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、Ｔメモリー幹細胞（ＴＳＣＭ）、中央メモリーＴ細胞（Ｔ ＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ ＥＭ）、およびエフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ ）が挙げられる。
当業者によって理解されるように、他の細胞も、本明細書においてＣＡＲを有する免疫エフェクター細胞として使用され得る。特に、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球およびマクロファージも含む。免疫エフェクター細胞は、エフェクター細胞の前駆体も含み、このような前駆細胞は、インビボまたはインビトロで免疫エフェクター細胞に分化するように誘導されてもよい。したがって、特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、臍帯血、骨髄または動員された末梢血に由来する細胞のＣＤ３４＋集団内に含まれる造血幹細胞（ＨＳＣ）などの免疫エフェクター細胞の前駆体を含み、これは、対象への投与時に成熟免疫エフェクター細胞に分化し、または成熟免疫エフェクター細胞に分化するようにインビトロで誘導することができる。
本明細書において使用される場合、「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書において使用される場合、「ＣＤ３４」とは、細胞－細胞接着因子として作用することが多く、リンパ節へのＴ細胞の侵入に関与する細胞表面糖タンパク質（例えばシアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋細胞集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を含有し、ＨＳＣは患者に投与されたときに分化し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、および単球／マクロファージ系統の細胞を含むすべての造血系の元となる。
本明細書で企図されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作製するための方法は、特定の実施形態において提供される。一実施形態において、この方法は、免疫エフェクター細胞が本明細書で企図される一つ以上のＣＡＲを発現するように個体から単離された免疫エフェクター細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含む。ある実施形態では、免疫エフェクター細胞は、インビトロでのさらなる操作を伴わずに個体から単離され、および遺伝子改変される。次いでそうした細胞を当該個体に直接再投与してもよい。さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される前に、インビトロで増殖するように最初に活性化および刺激される。これに関して、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される（すなわち、本明細書で企図されるＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトされる）前および／または後に培養され得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図される免疫エフェクター細胞のインビトロ操作または遺伝子改変の前に、細胞の供給源は対象から取得される。特定の実施形態では、改変された免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含有する。
特定の実施形態において、ＰＢＭＣはＣＡＲを発現するために、本明細書に企図される方法を使用して直接遺伝子改変されてもよい。特定の実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、Ｔリンパ球をさらに単離し、特定の実施形態において、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球の両方を、遺伝子改変および／または増殖の前または後のいずれかに、ナイーブ、メモリーおよびエフェクターＴ細胞亜集団に保存することができる。
例えばＴ細胞などの免疫エフェクター細胞は、公知の方法を使用して単離された後に遺伝子改変されてもよく、または免疫エフェクター細胞は、インビトロで活性化および拡張されて（または前駆細胞の場合には分化されて）、その後に遺伝子改変されてもよい。特定の実施形態において、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書で企図されるキメラ抗原受容体で遺伝的に改変され（例えば、ＣＡＲをコードする核酸またはＣＡＲをコードするポリシストロニックメッセージを含むウイルスベクターで形質導入され）、次いでインビトロで活性化および増殖される。様々な実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現するための遺伝子改変の前または後に活性化および増殖することができ、例えば米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開２００６０１２１００５に記載される方法を使用して、遺伝子改変の前または後に、活性化および拡張されてもよい。
一つの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、本明細書で予期される核酸構築物で形質導入される。特定の実施形態では、形質導入されたＣＤ３４＋細胞は、対象、一般に細胞が最初に単離された対象に投与された後、インビボで成熟免疫エフェクター細胞に分化する。別の実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、本明細書で企図されるＣＡＲで遺伝子改変される前または後に、前述の方法に従って（Ａｓｈｅｕｅｒら、２００４；、２００４）、以下のサイトカイン：Ｆｌｔ－３リガンド（ＦＬＴ３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球増殖分化因子（ＴＰＯ）、ＩＬ－３およびＩＬ－６の一つ以上を用いてインビトロで刺激され得る。
特定の実施形態において、癌の治療のための改変免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書で企図されるＣＡＲを含む。例えば、修飾された免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に記載されるＢ細胞悪性腫瘍と診断された患者（自己ドナー）から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋であってもよいＴリンパ球の異種集団を形成する。
ＰＢＭＣはまた、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞などの他の細胞傷害性リンパ球を含み得る。特定の実施形態において企図されるＣＡＲのコード配列を担持する発現ベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞の集団に導入される。特定の実施形態において、発現ベクターを担持する首尾よく形質導入されたＴ細胞は、フローサイトメトリーを用いてＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離し、次いで、抗ＣＤ３抗体およびまたは抗ＣＤ２８抗体およびＩＬ－２または本明細書の他の箇所に記載されるような当技術分野で公知の任意の他の方法を用いた細胞活性化に加えて、Ｔ細胞を発現するこれらのＣＡＲタンパク質の数を増加させるようにさらに増殖させることができる。標準的な手順は、ヒト対象で使用するための保存および／または調製のためのＣＡＲタンパク質Ｔ細胞を発現するＴ細胞の凍結保存に使用される。一実施形態では、Ｔ細胞のインビトロ形質導入、培養、および／または増殖は、胎児仔ウシ血清および胎児ウシ血清などの非ヒト動物由来産物の非存在下で実施される。ＰＢＭＣの不均一な集団が遺伝子的に改変されるので、結果として生じる形質導入細胞は、本明細書で企図されるようなＣＡＲを標的とするＢＣＭＡを含む改変細胞の不均一な集団である。
さらなる実施形態では、例えば、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、またはそれ以上の異なる発現ベクターの混合物を、免疫エフェクター細胞のドナー集団を遺伝子改変する際に使用することができ、各ベクターは、本明細書で企図される異なるキメラ抗原受容体タンパク質をコードする。結果として生じる修飾された免疫エフェクター細胞は、修飾された細胞の混合集団を形成する。
Ｔ細胞を含む遺伝子操作された細胞は、当技術分野で公知の様々な方法を用いて製造することができ、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０９４３０４号を参照されたい。
Ｊ．組成物および製剤
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体溶液の製剤は、当業者に周知であり、本明細書で企図される特定の組成物を様々な治療レジメンに使用するための好適な投薬および治療レジメンの開発と同様に、例えば、経腸および非経口、例えば、血管内、静脈内、子宮内、骨内、脳室内、脳内、頭蓋内、脊髄内、髄腔内、および髄内投与および処方を含む。当業者であれば、本明細書に予期される特定の実施形態は、例えば、薬学分野で公知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌｕｍｅ Ｉ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ．２２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ Ｊｒ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；２０１２に記載される製剤などの他の製剤を含み得ることを理解するであろう。
本明細書で企図される組成物は、本明細書で企図されるような一つ以上の抗ＢＣＭＡ抗体またはその断片、ＣＡＲポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、または遺伝子改変免疫エフェクター細胞等を含み得る。組成物としては限定されないが、医薬組成物が挙げられる。好ましい実施形態において、組成物は、ＣＡＲを発現するように改変された一つ以上の細胞を含む。
「医薬組成物」とは、細胞または動物への投与に対し、薬学的に許容可能な溶液または生理学的に許容可能な溶液中で、単独で、または一つまたは複数の他の治療モダリティと併用されて製剤化される組成物を指す。所望の場合には、組成物は、例えばサイトカイン、増殖因子、ホルモン、低分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬剤、抗体、または他の様々な薬学的に活性な剤などの他の剤も同様に併用されて投与され得ることも理解されたい。事実上、組成物に含有され得る他の構成要素に制限はないが、追加される剤は、意図される療法を送達する組成物の能力に有害な影響を与えないものとする。好ましい実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤、ならびに本明細書に企図されるＣＡＲを発現するように改変された一つ以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書で企図される薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤ならびに抗ＢＣＭＡ抗体またはその断片を含む。
本明細書において、「薬学的に許容可能」という文言は、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用することに適し、合理的な利益／リスク比に見合った、それら化合物、物質、組成物および／または剤型を指すために採用される。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤」は、限定するものではないが、ヒト又は家畜での使用に許容されるものとして米国食品医薬品局によって承認されている、アジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、染料／着色剤、香味剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、又は乳化剤を含む。例示的な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、ラクトース、グルコース、及びショ糖などの糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、並びにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガカンス；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター、ワックス、動物及び植物性脂肪、パラフィン、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウレートエチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、リン酸緩衝液、および医薬製剤で採用される任意の他の適合性のある物質が挙げられる。
特定の実施形態において、組成物は、本明細書において企図される量のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む。他の実施形態において、組成物は、本明細書で企図される量の抗ＢＣＭＡ抗体またはその断片を含む。本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益または所望の予防または治療結果を達成するために、遺伝子改変された治療用細胞、例えば、Ｔ細胞などの「有効な量」または「有効量」を指す。
「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために有効な遺伝子改変された治療用細胞の量を指す。必ずではないが典型的には、予防的投与量は、疾患の早期ステージの前、または早期ステージの対象において使用されるため、予防的有効量は、治療有効量よりも少ない。
遺伝子改変された治療用細胞の「治療有効量」は、個体の病態、年齢、性別、および体重などの因子、ならびに個体において所望の応答を引き出す幹細胞および前駆細胞の能力に応じて変化し得る。治療有効量はまた、ウイルス又は形質導入された治療用細胞の任意の毒性又は有害な影響を、治療上有益な効果が上回るものである。用語「治療有効量」は、対象（例えば、患者）を「治療する」のに有効な量を含む。治療的な量が示されている場合、投与される組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染又は転移の程度、及び状態における個々の差を考慮し、医師により決定され得る。
一般に、本明細書で企図されるＴ細胞を含む医薬組成物は、１０２～１０１０細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５～１０６細胞／ｋｇ体重の投与量で投与され得ると述べることができ、それらの範囲内の全ての整数値を含む。細胞数は、組成物の意図される最終用途、組成物中に含有される細胞のタイプに依存する。本明細書において提示される用途に関し、細胞は一般的に、リットル以下の量であり、５００ｍＬ以下、更には２５０ｍＬ又は１００ｍＬ以下であり得る。ゆえに所望される細胞の密度は、多くの場合、１０６細胞／ｍｌ超であり、一般的には、１０７細胞／ｍｌ超、一般的には１０８細胞／ｍｌ以上である。臨床的に関連する免疫細胞数は、複数回の点滴に分けられてもよく、累積的には１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１または１０１２細胞以上となる。いくつかの態様では、具体的には注入される全細胞は特定の標的抗原へと再指向化されるため、１０６／キログラム（患者当たり１０６～１０１１）の範囲の少ない数の細胞が投与される場合がある。組成物は、これらの範囲内の用量で複数回投与されてもよい。細胞は、療法を受けている患者にとって同種、同系、異種、又は自己であってもよい。所望であれば、治療は、免疫応答の誘導を増強するために本明細書で企図されるマイトジェン（例えば、ＰＨＡ）またはリンホカイン、サイトカイン、および／またはケモカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１８、およびＴＮＦ－ベータ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与も含み得る。
一般に、本明細書で企図されるように活性化および増殖した細胞を含む組成物は、免疫不全である個体に生じる疾患の治療および予防に利用され得る。特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲを発現するように改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物は、癌（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍）の治療に使用される。修飾された免疫エフェクター細胞は、単独で投与されてもよく、又は担体、希釈剤、賦形剤を併用した医薬組成物として、及び／又は例えばＩＬ－２若しくは他のサイトカイン若しくは他の細胞集団などの他の構成要素を併用した医薬組成物として投与されてもよい。特定の実施形態では、医薬組成物は、遺伝子修飾されたＴ細胞の量を、一つ以上の薬学的若しくは生理学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と併用して含む。
ＣＡＲを発現するように改変された免疫エフェクター細胞集団（例えば、Ｔ細胞）または抗体、もしくはその断片を含む医薬組成物は、緩衝液、例えば中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸；抗酸化物質；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；防腐剤を含み得る。組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）腹腔内または筋肉内投与のために製剤化されることが好ましい。
液体医薬組成物は、溶液、懸濁液、又は他の類似の形態であるかどうかにかかわらず、以下：注射用水、生理食塩水、好ましくは生理食塩液、リンガー液、等張食塩水、溶媒又は懸濁媒として役立ち得る合成モノ又はジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化物質；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの等張性の調整のための薬剤、のうちの一つ以上を含み得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、又はガラス若しくはプラスチックで作製された複数回用量バイアルに封入され得る。注射用医薬組成物は、滅菌であることが好ましい。
一実施形態において、本明細書で企図される免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地中に製剤化される。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態では、薬学的に許容可能な細胞培養培地は、無血清培地である。
無血清培地は、血清含有培地を超える利点をいくつか有しており、シンプルでより明白な組成、汚染物質量の低下、感染性実体の源となる可能性の排除、およびコスト低下が挙げられる。様々な実施形態では、無血清培地は、動物質を含まず、任意で無タンパク質であってもよい。任意選択で、培地はバイオ医薬品的に受容可能な組換えタンパク質を含み得る。「動物質を含まない」培地とは、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中で天然動物性タンパク質を置き換え、その栄養素は合成、植物又は微生物の源から得られる。「タンパク質を含まない」培地は、対照的に、実質的にタンパク質を含まないと規定される。
特定の組成物において使用される無血清培地の例示としては限定されないが、ＱＢＳＦ－６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびＸ－ＶＩＶＯ １０が挙げられる。
ある好ましい実施形態では、本明細書に予期される免疫エフェクター細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む溶液中で製剤化される。
別の好ましい実施形態では、本明細書で予期される免疫エフェクター細胞を含む組成物は、凍結保存媒体を含む溶液中で製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地を使用して、融解後の高い細胞活性成績を維持してもよい。特定の組成物において使用される凍結保存培地の例示としては限定されないが、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２が挙げられる。
より好ましい実施形態では、本明細書で予期される免疫エフェクター細胞を含む組成物は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０に対してＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを５０：５０で含む溶液中で製剤化される。
特定の実施形態では、組成物は、ＣＡＲを発現するように改変された有効量の免疫エフェクター細胞を、単独で、または一つ以上の治療薬と組み合わせて含む。したがって、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞組成物は、単独で、または放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光力学的療法などの他の公知の癌治療と組み合わせて投与されてもよい。組成物は、抗生物質と併用して投与されてもよい。このような治療剤は、特定の癌などの本明細書で企図される特定の疾患状態に対する標準的な治療として当該技術分野において受け入れられ得る。特定の実施形態において予期される治療剤の例としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法、治療用抗体、またはは他の活性で補助的な剤が挙げられる。
特定の実施形態では、ＣＡＲを発現するように改変された免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と併せて投与され得る。
様々な他の治療薬を、本明細書で企図される組成物と併せて使用してもよい。一実施形態において、免疫エフェクター細胞、ＣＡＲを含む組成物が、抗炎症剤と共に投与される。
一つの態様において、ＣＡＲである免疫エフェクター細胞を含む組成物は、治療用抗体と共に投与される。特定の実施形態において企図されるＣＡＲ修飾Ｔ細胞との併用に適した治療用抗体の例示的な例として、限定するものではないが、アテゾリズマブ、アベルマブ、バビツキシマブ、ベバシズマブ（アバスチン）、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、セミプリマブ、コナツムマブ、クリゾチニブ、ダラツムマブ、デュリゴツマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、デュルバルマブ、エロツズマブ（ＨｕＬｕｃ６３）、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、イピリムマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、ミラツズマブ、モクセツモマブ、ニボルマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、ペムブロリズマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、テプロツムマブ、およびウブリツキシマブが挙げられる。
Ｋ．治療方法
本明細書において企図されるＣＡＲを発現する遺伝子改変免疫エフェクター細胞は、免疫調節状態および血液悪性腫瘍を含むがこれらに限定されないＢ細胞関連状態の予防、治療、および改善に使用するための養子免疫療法の改良された方法を提供する。
様々な実施形態では、本明細書に企図される遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞は、対象において癌細胞における細胞傷害性を増加させる、又は対象において癌細胞の数の減少に使用される養子免疫治療の改善された方法を提供する。
特定の実施形態では、一次免疫エフェクター細胞の特異性は、本明細書で企図されるように、ＣＡＲで一次免疫エフェクター細胞を遺伝子改変することによって、特定の抗原を発現する細胞、例えば癌細胞に向け直される。様々な実施形態において、ウイルスベクターは、ＣＡＲをコードする特定のポリヌクレオチドで免疫エフェクター細胞を遺伝的に改変するために使用される。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合する抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメインであって、ＴＭドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカー、一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインと、を含む。
一実施形態において、癌細胞を発現するＢＣＭＡを標的とするＣＡＲを発現するようにＴ細胞が遺伝子改変され、Ｔ細胞がそれを必要とするレシピエントに注入されるタイプの細胞療法が提供される。注入された細胞は、レシピエントにおいて疾患を引き起こす細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、Ｔ細胞療法は、インビボで複製することができ、その結果、持続的な癌治療をもたらすことができる長期持続性をもたらす。
一実施形態では、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、強固なインビボＴ細胞増殖を経ることができ、長期間持続することができる。別の実施形態では、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、任意のさらなる腫瘍形成または増殖を阻害するために再活性化することができる特定のメモリーＴ細胞または幹細胞メモリーＴ細胞に進化する。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を含む組成物は、特定の抗原発現癌細胞または癌幹細胞に関連する状態の治療に使用される。
本明細書で企図されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を用いて治療、予防または改善することができる状態の例示的な例として、これらに限定されないが、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、および急速に進行する糸球体腎炎が挙げられる。
改変された免疫エフェクター細胞は、重鎖疾患、原発性または免疫細胞関連アミロイドーシス、および重要性不明のモノクローナルガンモパシー（ＭＧＵＳ）などの形質細胞障害にも適用することができる。
本明細書での使用において、「Ｂ細胞悪性腫瘍」は、後述で論じるようにＢ細胞（免疫系細胞の一種）において形成される癌の一種を指す。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲを発現するＴ細胞を含む組成物は、骨肉腫またはユーイング肉腫の治療に使用される。
特定の実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲを発現するＴ細胞を含む組成物は、液体癌または血液学的癌の治療に使用される。
ある特定の実施形態では、液性癌又は血液癌は、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。
特定の実施形態では、液体または血液学的癌は、以下からなる群から選択される：急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優勢ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、髄外形質細胞腫。
特定の実施形態では、液性癌又は血液癌は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群から選択される。
好ましい実施形態において、液体または血液学的癌は、多発性骨髄腫（ＭＭ）である。
好ましい実施形態において、液体または血液学的癌は、再発／難治性多発性骨髄腫（ＭＭ）である。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の治療有効量を、またはそれを含む組成物を、それを必要とする患者に、単独で、または一つ以上の治療薬と組み合わせて、投与することを含む方法が提供される。特定の実施形態において、細胞は、癌または癌細胞に関連する状態を発症するリスクのある患者の治療に使用される。したがって、特定の実施形態では、癌の少なくとも一つの症状または異常なＢ細胞活性に関連する状態（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍）の治療または予防または改善のための方法であり、本明細書で企図されるＣＡＲを発現する修飾Ｔ細胞の治療有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む。
本明細書において使用される場合、「個体」および「対象」という用語はしばしば相互交換可能に使用され、本明細書において別段に予期される遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、および方法で治療され得る疾患、傷害または病の症状を呈する任意の動物を指す。好ましい実施形態では、対象は、遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、および本明細書において別段に予期される方法を用いて治療され得る癌に関連する疾患、傷害、または病態の症状を呈する任意の動物を含む。適切な対象（例えば、患者）としては、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモット）、家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ、ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）、またはペット（例えば、ネコまたはイヌ）が挙げられる。非ヒト霊長類、好ましくはヒト患者も含まれる。典型的な対象は、癌（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍）を有する、癌（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍）と診断された、あるいは癌（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍）を有するリスクのある、ヒト患者を含む。
本明細書で使用される場合、用語「患者」は、遺伝子療法ベクター、細胞系治療剤、および本明細書の他の場所で開示される方法を用いて治療され得る特定の疾患、傷害または病態と診断された対象を指す。
本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」には、疾患または病態の症状もしくは病理に対する、あらゆる有益な作用または望ましい作用を含み、治療される疾患または状態の一つ以上の測定可能なマーカーの最小の低減さえも含み得る。治療には、任意で、疾患若しくは病態の減少、又は疾患若しくは病態の進行の遅延のいずれかが含まれてもよい。「治療」は必ずしも、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な排除または治癒を示すものではない。
本明細書において使用される場合、「予防する」、および例えば「予防される」、「予防すること」といった類似の文言は、疾患もしくは状態の予防、阻害、または発生もしくは再発の可能性の低下を目的としたアプローチを示す。更に、疾患若しくは状態の発生又は再発の遅延、又は疾患若しくは状態の症状の発生又は再発の遅延も指す。本明細書において使用される場合、「予防」およびその類似文言も、疾患もしくは症状の発生または再発の前の、疾患もしくは状態の強度、作用、症状、および／または負荷量の低下を含む。
本明細書において使用される場合、「～の少なくとも一つの症状の改善」とは、対象が治療される疾患もしくは状態の一つまたは複数の症状の減少を指す。特定の実施形態では、治療される疾患または状態は、癌であり、この場合において改善される一つまたは複数の症状としては限定されないが、脱力、疲労、息切れ、あざができやすい、および出血しやすい、頻発する感染、リンパ節の拡張、腹部膨張または腹部疼痛（膨張した腹部臓器が原因）、骨または関節の疼痛、骨折、予期せぬ体重減少、食欲低下、寝汗、持続性の微熱、および排尿減少（腎機能の障害が原因）が挙げられる。
「増強する」または「促進する」または「増加させる」または「拡大する」とは、一般に、本明細書で企図される組成物、例えば、ＣＡＲを発現する遺伝子組み換えＴ細胞が、ビヒクルまたは制御分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より大きな生理学的応答（すなわち、下流効果）を産生、誘発、または引き起こす能力を指す。測定可能な生理学的反応としては特にＴ細胞の拡張、活性化、持続性、および／または癌細胞殺傷能力の増加が挙げられ、当分野および本明細書の記載の理解から明白である。「増加した」または「強化された」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によりもたらされる反応の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０またはそれ以上（例えば５００倍、１０００倍）（その間および１を超えるすべての整数および小数点を含む、例えば１．５、１．６、１．７、１．８など）である増加を含む場合がある。
「減少する」、または「下げる」、または「低める」、または「低下する」、または「弱める」とは概して、本明細書において予期される組成物が、ビヒクルまたは対照の分子／組成物による反応と比較して、小さな生理学的反応（すなわち下流効果）をもたらす、惹起させる、または発生させる能力を指す。「減少」または「低下した」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物によりもたらされる反応、または特定の細胞株での反応の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０またはそれ以上（例えば５００倍、１０００倍）（その間および１を超えるすべての整数および小数点を含む、例えば１．５、１．６、１．７、１．８など）である減少を含む場合がある。
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化がない」、または「実質的な変化がない」、または「実質的な減少が無い」とは概して、本明細書において予期される組成物が、ビヒクル、対照の分子／組成物により生じた反応、または特定の細胞株での反応と比較して、細胞において類似した、または同等の生理学的反応（すなわち、下流効果）を生成する、惹起させる、または生じさせることを指す。同等の反応は、基準反応と実質的に違わない、又は測定可能な程度に違わない反応である。
一実施形態において、それを必要とする対象におけるＢ細胞関連状態または癌を治療する方法は、有効量、例えば、本明細書で企図される遺伝子改変免疫エフェクター細胞を含む組成物の治療有効量を投与することを含む。投与の量ならびに頻度は、患者の状態、患者の疾患のタイプおよび重大度といった因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定されてもよい。
一実施形態において、対象に投与される組成物において、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０５細胞、少なくとも０．５×１０５細胞、少なくとも１×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも０．５×１０７細胞、少なくとも１×１０７細胞、少なくとも０．５×１０８細胞、少なくとも１×１０８細胞、少なくとも０．５×１０９細胞、少なくとも１×１０９細胞、少なくとも２×１０９細胞、少なくとも３×１０９細胞、少なくとも４×１０９細胞、少なくとも５×１０９細胞または少なくとも１×１０１０細胞である。
特定の実施形態では、約１×１０７Ｔ細胞～約１×１０９Ｔ細胞、約２×１０７Ｔ細胞～約０．９×１０９Ｔ細胞、約３×１０７Ｔ細胞～約０．８×１０９Ｔ細胞、約４×１０７Ｔ細胞～約０．７×１０９Ｔ細胞、約５×１０７Ｔ細胞～約０．６×１０９Ｔ細胞、又は約５×１０７Ｔ細胞～約０．５×１０９Ｔ細胞が対象に投与される。
一つの態様において、対象に投与される組成物中の免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲを発現するＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０４細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０４細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０４細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０４細胞／ｋｇ体重であり、少なくとも１×１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０７細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０７細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０８細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０８細胞／ｋｇ体重、または少なくとも１×１０９細胞／ｋｇ体重である。
特定の実施形態では、約１×１０６Ｔ細胞／体重ｋｇ～約１×１０８Ｔ細胞／体重ｋｇ、約２×１０６Ｔ細胞／体重ｋｇ～約０．９×１０８Ｔ細胞／体重ｋｇ、約３×１０６Ｔ細胞／体重ｋｇ～約０．８×１０８Ｔ細胞／体重ｋｇ、約４×１０６Ｔ細胞／体重ｋｇ～約０．７×１０８Ｔ細胞／体重ｋｇ、約５×１０６Ｔ細胞／体重ｋｇ～約０．６×１０８Ｔ細胞／体重ｋｇ、または約５×１０６Ｔ細胞／体重ｋｇ～約０．５×１０８Ｔ細胞／体重ｋｇが対象に投与される。
当業者であれば、所望の治療効果を発揮させるために、本明細書に企図される組成物の複数回の投与が必要とされる場合があることを認識するであろう。例えば、組成物は、１週、２週、３週、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１年、２年、５年、１０年またはそれ以上の期間にわたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上投与される場合がある。
ある実施形態では、対象に活性化された免疫エフェクター細胞が投与され、次いで対象から採血して（またはアフェレーシス療法を実施し）、それに由来する免疫エフェクター細胞を活性化し、そしてこれら活性化および拡張された免疫エフェクター細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週ごとに複数回実施されてもよい。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血から活性化されてもよい。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、又は４００ｃｃ以上の採血から活性化される。学説には拘束されないが、複数回の採血／複数回の再注入のプロトコルを使用することで、免疫エフェクター細胞のある群の選択に役立つ場合がある。
本明細書で予期される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植、または移植を含む、任意の都合の良い方法で実施されうる。好ましい実施形態では、組成物は非経口的に投与される。本明細書で使用される場合、「非経口投与」及び「非経口的に投与」という語句は、経腸投与及び局所投与以外の投与様式を指し、通常は注射によって、限定されるものではないが、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内の、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。一実施形態では、本明細書で予期される組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位への直接注射によって対象に投与される。
一実施形態では、対象のＢ細胞関連状態に対する細胞性免疫反応を増加させる組成物の有効量がそれを必要とする対象に投与される。免疫応答は、感染細胞を殺傷することができる細胞傷害性Ｔ細胞、制御Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞応答によって媒介される細胞免疫応答を含んでもよい。主にＢ細胞を活性化することができるヘルパーＴ細胞によって媒介され、したがって抗体産生をもたらす液性免疫応答も誘発され得る。様々な技術を使用して、組成物によって誘導される免疫応答のタイプを分析してもよく、それら技術は当分野において例えば、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ編（２００１年）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ、Ｎ．Ｙ．。
一実施形態において、Ｂ細胞関連状態または癌と診断された対象を治療する方法が提供され、癌またはＢＣＭＡ発現Ｂ細胞関連状態と診断された対象から免疫エフェクター細胞を除去し、本明細書で企図されるＣＡＲをコードする核酸を含むベクターで前記免疫エフェクター細胞を遺伝子改変することを含み、これにより改変免疫エフェクター細胞の集団を作製し、改変免疫エフェクター細胞の集団をこの対象に投与する。好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
特定の実施形態において、対象における標的細胞集団に対する免疫モジュレーター応答を媒介する免疫エフェクター細胞を刺激するための方法が提供され、ＣＡＲ分子をコードする核酸構築物を発現する免疫エフェクター細胞集団を対象に投与するステップを含む。
特定の実施形態に企図される細胞組成物を投与する方法は、対象においてＣＡＲを直接的に発現するか、又は対象に導入するときにＣＡＲを発現する成熟免疫エフェクター細胞に分化する免疫エフェクター細胞の遺伝子改変された前駆体を再導入するかのいずれかである、エクスビボで遺伝子改変された免疫エフェクター細胞の再導入をもたらすのに効果的である任意の方法を含む。一つの方法は、本明細書に予期される核酸構築物を用いて生体外で末梢血Ｔ細胞を形質導入することと、当該形質導入細胞を対象に戻すことと、を含む。
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Figure 2023539591000013
本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、及び登録された特許は、あたかも個々の刊行物、特許出願、又は登録された特許が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示したかのように、参照により本明細書中に組み込まれる。
前述の実施形態は、明確性及び理解を目的として、図及び実施例により詳細に記載されているが、本明細書において企図される教示に照らし、特定の変化及び改変が、添付の請求の範囲の主旨又は範囲から逸脱することなく実施されうることが当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、解説のみを目的として提供されるものであり、限定ではない。当業者であれば、本質的に類似した結果をもたらすために変更又は修正されうる様々な非臨界パラメータを容易に認識するであろう。
実施例１
ヒト抗－ＢＣＭＡ ＣＡＲの構築
ヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを含む構築物を含むレンチウイルスベクターを設計、構築、および検証した。ＣＤ８αシグナル配列、ヒト抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲに作動可能に連結されたＭＮＤＵ３プロモーターを含む構築物をレンチウイルスベクターにクローニングした。抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、ポリグリシン－セリンリンカーを使用してＶＨ ／ ＶＬおよびＶＬ ／ ＶＨの両方の向きで設計および評価した 例示的な抗ＢＣＭＡ ＣＡＲポリペプチド配列は、配列番号｛ｕｔ｝５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、および６８に記載され、例示的な抗ＢＣＭＡ ＣＡＲポリヌクレオチド配列は、配列番号｛ｕｔ｝４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、および６７｛ｕｔ｝に記載される。
実施例２
ヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の評価
ＢＣＭＡに特異的でヒトｓｃＦｖ（例えば、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、および６８）を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を、マウス由来ｓｃＦｖを有する既知の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ（「コンパレーター」）と比較して、ＢＣＭＡ発現細胞に対するＣＡＲ発現および生物学的活性について評価した。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｇ－ＲＥＸ（登録商標）フラスコを用いた７日間のプロセスで作製した。簡潔に説明すると、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＩＬ－２（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，ＧｍｂＨ）社ならびにＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．社）を含む培地中で培養した。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスを培養開始の１日後に添加した。４日目に、ＣＡＲ Ｔ細胞を２４ウェルプレートから２４ウェルのＧ－ＲＥＸフラスコに移し、ここで７日目の採取まで細胞を維持した。ＣＡＲ Ｔ細胞は、ゲノムＤＮＡへのレンチウイルスベクターの組込みについて調べられた。細胞当たりのベクターコピーは、形質導入細胞について、導入遺伝子の１～４コピーの範囲であった。図２Ａに示されるように、全ての形質導入細胞は、コンパレーター抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ Ｔ細胞と同等またはそれ以上のベクターコピー数を示す。
ＣＡＲ Ｔ細胞はまた、フローサイトメトリーを用いて細胞表面ＣＡＲ発現について分析した。ＣＡＲ Ｔ細胞は、組換え体、フィコエリスリン（ＰＥ）標識された、ＢＣＭＡ細胞外ドメイン－ＦＣ融合タンパク質（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ，Ｉｎｃ社）を用いて染色した。陽性Ｆｃ－ＢＣＭＡ結合による表面ＣＡＲ発現は、発現を有さなかったＣＡＲ３を除く様々なレベルで、すべての形質導入条件について検出された。これらの試薬は、Ｔ細胞が抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを特異的に発現することを確認する。図２Ｂに示されるように、ＣＡＲ１、ＣＡＲ４、またはＣＡＲ５で形質導入されたＴ細胞は、コンパレーター抗ＢＭＣＡ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して同等またはそれ以上のＣＡＲ発現レベルを有する。
さらに、ＣＡＲ Ｔ細胞の生物学的活性を、インターフェロンガンマ産生について単独で、または腫瘍細胞株との共培養で評価した。詳細には、ＢＣＭＡを発現しないＲＤ細胞株またはＨＴ１０８０細胞との単独または共培養におけるＣＡＲ Ｔ細胞による抗原非依存性ＩＦＮγ産生を評価した。図３Ａおよび３Ｂに示すように、ＣＡＲ４を除くすべてのＣＡＲは、抗原とは無関係に最小限のＩＦＮγを産生する。同様の結果は、図３Ｄおよび３ＥのＣＡＲ７－１０でも見られる。また、ＣＡＲ Ｔ細胞とバーキットリンパ腫細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）またはＢＣＭＡを発現するＨＴ．１０８０．ＢＣＭＡ細胞との共培養後のインターフェロンガンマ産生を測定した。図３Ｃおよび３Ｆに示すように、ＣＡＲ１、ＣＡＲ４、ＣＡＲ５、ＣＡＲ９、およびＣＡＲ１０は、コンパレーター抗ＢＣＭＡ ＣＡＲと同等またはそれ以上のＩＦＮγを産生した。同様に、ＣＡＲ１またはＣＡＲ５を単独で、または抗原陰性（ＨＴ１０８０）または抗原陽性（ＨＴ１０８０）腫瘍細胞株との共培養で、ＩＦＮγ産生について評価した場合、ＣＡＲ１およびＣＡＲ５は、図３Ｉに示すように、抗原依存的に最小のＩＦＮγを産生する一方で（図３Ｇおよび３Ｈに示される）、同様に、抗原依存的にも同程度またはそれ以上の量のＩＦＮγを産生した。
さらに、ＣＡＲ１、ＣＡＲ５、ＣＡＲ９、およびＣＡＲ１０を抗原低（Ｊｅｋｏ１）または抗原高（ＲＰＭＩ８３３６）腫瘍細胞株との共培養でＩＬ２サイトカイン産生について評価したところ、図３Ｊおよび３Ｋに示すように、ＣＡＲ１およびＣＡＲ５はコンパレーターＣＡＲよりも多くのＩＬ２を産生した。
実施例３
低および高抗原発現腫瘍細胞に対するヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞活性化の評価
別の実験では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、大規模な臨床製造工程に対して直接スケーラブルなシステムを使用して生産された。簡潔に説明すると、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ＩＬ－２（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，ＧｍｂＨ）社ならびにＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．社）を含む培地中で培養した。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするレンチウイルスは、培養開始の１日後に指定された感染多重度（ＭＯＩ）で添加された。ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＩＬ－２を含む新鮮な培地を添加して合計１０日間培養することにより、対数期に維持した。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、結合したＢＣＭＡ－Ｆｃ抗原のフローサイトメトリー分析によって表面ＣＡＲ発現について分析し、正規化された数のＣＡＲ陽性ＣＡＲ Ｔ細胞を単独で、または様々な抗原密度の腫瘍細胞と共に培養物に添加した。Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＲＬおよびＴｏｌｅｄｏは、バーケットリンパ腫細胞株（Ｄａｕｄｉ）および操作された細胞株ＨＴ１０８０．ＢＣＭＡと比べて、低いＢＣＭＡ応現を有する。
図４Ａに示すように、ＣＡＲ１およびＣＡＲ５の両方は、抗原に依存せず、かつコンパレーター抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも少ない最小限のＩＦＮγを産生する。しかし、低ＢＣＭＡ密度細胞株との共培養から産生されたＩＦＮγ産生は、ＣＡＲ１およびＣＡＲ５のＩＦＮγ産生がコンパレーターよりも高いことを示唆している（図４Ｂ）。さらに、高ＢＣＭＡ密度細胞株との共培養から産生されたＩＦＮγ産生は、ＣＡＲ１およびＣＡＲ５のＩＦＮγ産生がコンパレーターと類似していることを示唆している（図４Ｃ）。このデータは、ヒトＣＡＲ１およびＣＡＲ５ Ｔ細胞が、１）低抗原密度細胞に対してコンパレーターＣＡＲよりも潜在的に強力であり、２）コンパレーターＣＡＲと比較して高抗原密度細胞に対して少なくとも同程度強力であり、３）抗原非依存性ＩＦＮγ放出が低いことを示唆している。
実施例４
抗原発現腫瘍細胞に対するヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞傷害性の評価
ＢＣＭＡ発現癌細胞を殺す抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の能力を評価するために、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、実施例３で上述したような大規模な臨床製造プロセスに直接スケーラブルなシステムを使用して最初に作製した。培養１０日後、核赤色蛍光タンパク質（ＨＴ１０８０－ｎｕｃＲｅｄ）またはＢＣＭＡを発現するように操作された誘導体株（ＨＴ．１０８０－ｎｕｃＲｅｄ．ＢＣＭＡ）を発現するＨＴ．１０８０細胞株を用いて、同数の抗ＢＣＭＡ発現ＣＡＲ Ｔ細胞を様々なエフェクター対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で培養した。
図５に示すように、ＣＡＲ１、ＣＡＲ５、ＣＡＲ９およびＣＡＲ１０およびＨＴ．１０８０－ｎｕｃＲｅｄ．ＢＣＭＡ細胞株との共培養において、さまざまな程度の抗原依存性細胞傷害が経時的に観察された。
実施例５
内因性および改変細胞株におけるＢＣＭＡ抗原密度
別の実験では、ＢＣＭＡ受容体密度を、内因的に発現するＢＣＭＡ（例えば、ＲＬ、Ｔｏｌｅｄｏ、Ｄａｕｄｉ、およびＲＰＭＩ－８２２６）およびＢＣＭＡを発現するように操作された（例えば、ＨＴ．１０８０．ＢＣＭＡ）の両方を有する様々な細胞株で評価した。ＢＣＭＡ密度は、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ（登録商標）Ａｓｓａｙ（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社）を用いて抗ＢＣＭＡ抗体クローン１９Ｆ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いて評価した。図６に示すように、改変細胞株ＨＴ．１０８０ＢＣＭＡおよび多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ－８２２６は、平均２０，０００個の受容体を有する最高量のＢＣＭＡを発現した。リンパ腫株Ｄａｕｄｉ、ＴｏｌｅｄｏおよびＲＬは、ＨＴ．１０８０．ＢＣＭＡまたはＲＰＭＩ－８２２６よりも１０～５０倍少ないＢＣＭＡ抗原を発現する。
実施例６
ヒト抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞抗原依存性増殖の評価
ＢＣＭＡ発現癌細胞の存在下で増殖する抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の能力を評価するために、実施例２に記載したものと同様の系を用いて抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を最初に作製した。培養１０日後、核赤色蛍光タンパク質を発現するＨＴ．１０８０細胞株（ＨＴ１０８０－ｎｕｃＲｅｄ）またはＢＣＭＡを発現するように操作された誘導体株（ＨＴ．１０８０－ｎｕｃＲｅｄ．ＢＣＭＡ）を用いて、同数の抗ＢＣＭＡ発現ＣＡＲ Ｔ細胞を、条件ごとに各細胞タイプの５Ｅ３から培養した。
図７Ａに示すように、ＣＡＲ Ｔ細胞添加後６日目にＨＴ．１０８０－ｎｕｃＲｅｄ細胞株に対しては、最小から全く増殖が認められなかった。しかしながら、ＨＴ．１０８０－ｎｕｃＲｅｄ．ＢＣＭＡ細胞株を発現するＢＣＭＡとの共培養において増殖が観察された（図７Ｂ）。
概して、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定させるものと解釈されるべきではないが、かかる特許請求の範囲が権利を与える等価物の完全な範囲とともに全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、請求の範囲は、本開示により限定されない。

Claims (168)

  1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
    ａ）配列番号７、１５、２３、３１、３９もしくは４７に記載の可変軽鎖アミノ酸配列内の可変軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３領域、ならびに配列番号８、１６、２４、３２、４０もしくは４８に記載の可変重鎖アミノ酸配列内の可変重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域を含む、ヒトＢＣＭＡポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞外ドメイン、
    ｂ）膜貫通ドメイン、
    ｃ）一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
    ｄ）一次シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  2. 前記可変軽鎖アミノ酸配列が配列番号７に記載され、および／または前記可変重鎖アミノ酸配列が配列番号８に記載される、請求項１に記載のＣＡＲ。
  3. 前記可変軽鎖アミノ酸配列が配列番号１５に記載され、および／または前記可変重鎖アミノ酸配列が配列番号１６に記載される、請求項１に記載のＣＡＲ。
  4. 前記可変軽鎖アミノ酸配列が配列番号２３に記載され、および／または前記可変重鎖アミノ酸配列が配列番号２４に記載される、請求項１に記載のＣＡＲ。
  5. 前記可変軽鎖アミノ酸配列が配列番号３１に記載され、および／または前記可変重鎖アミノ酸配列が配列番号３２に記載される、請求項１に記載のＣＡＲ。
  6. 前記可変軽鎖アミノ酸配列が配列番号３９に記載され、および／または前記可変重鎖アミノ酸配列が、配列番号４０に記載される、請求項１に記載のＣＡＲ。
  7. 前記可変軽鎖アミノ酸配列が配列番号４７に記載され、および／または前記可変重鎖アミノ酸配列が配列番号４８に記載される、請求項１に記載のＣＡＲ。
  8. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
    ａ）配列番号１～３、９～１１、１７～１９、２５～２７、３３～３５または４１～４３に記載の可変軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号４～６、１２～１４、２０～２２、２８～３０、３６～３８、または４４～４６に記載の可変重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３配列を含むヒトＢＣＭＡポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン、
    ｂ）膜貫通ドメイン、
    ｃ）一つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、及び
    ｄ）一次シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  9. 前記抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片が、キャメルＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、およびシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  10. 前記抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合断片がｓｃＦｖである、請求項１～９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  11. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１～３のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号４～６のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  12. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号９～１１のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号１２～１４のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  13. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７～１９のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号２０～２２のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  14. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２５～２７のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号２８～３０のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  15. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３３～３５のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号３６～３８のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  16. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４１～４３のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号４４～４６のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  17. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７、１５、２３、３１、３９もしくは４７のいずれか一つに記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号８、１６、２４、３２、４０もしくは４８のいずれか一つに記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  18. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７に記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号８に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  19. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５に記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号１６に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  20. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２３に記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号２４に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  21. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３１に記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号３２に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  22. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３９に記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号４０に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  23. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３１に記載の可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号４８に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  24. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７、１５、２３、３１、３９もしくは４７のいずれか一つに記載される可変軽鎖配列および／または配列番号８、１６、２４、３２、４０もしくは４８のいずれか一つに記載される可変重鎖配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  25. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号８に記載される可変重鎖配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  26. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号１６に記載される可変重鎖配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  27. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２３に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号２４に記載される可変重鎖配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  28. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３１に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号３２に記載される可変重鎖配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  29. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３９に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号４０に記載される可変重鎖配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  30. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４７に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号４８に記載される可変重鎖配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  31. 前記抗体またはその抗原結合断片はｓｃＦｖであり、前記可変軽鎖は前記可変重鎖のそれに対してｃ末端に位置する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  32. 前記抗体またはその抗原結合断片がｓｃＦｖであり、前記可変重鎖は前記可変軽鎖のそれに対してｃ末端に位置する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  33. 前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  34. 前記膜貫通ドメインがＣＤ８α ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１およびＣＤ１５２からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項１～３３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  35. 前記膜貫通ドメインがＣＤ８αから単離される、請求項１～３４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  36. 前記膜貫通ドメインがＰＤ１から単離される、請求項１～３４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  37. 前記膜貫通ドメインがＣＤ１５２から単離される、請求項１～３４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  38. 前記一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子から単離される、請求項１～３７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  39. 前記一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択される共刺激分子から単離される、請求項１～３８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  40. 前記一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインがＣＤ２８から単離される、請求項１～３９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  41. 前記一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインがＣＤ１３４から単離される、請求項１～３９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  42. 前記一つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインがＣＤ１３７から単離される、請求項１～３９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  43. 前記一次シグナル伝達ドメインが、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項１～４２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  44. 前記一次シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζから単離される、請求項１～４３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  45. ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  46. 前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む、請求項４５に記載のＣＡＲ。
  47. 前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＰＤ１のヒンジ領域を含む、請求項４５に記載のＣＡＲ。
  48. 前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＣＤ１５２のヒンジ領域を含む、請求項４５に記載のＣＡＲ。
  49. シグナルペプチドをさらに含む、請求項１～４８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  50. スペーサー領域をさらに含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  51. 前記スペーサー領域ポリペプチドが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４またはＩｇＤのＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む、請求項５０に記載のＣＡＲ。
  52. 配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６および６８のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  53. 配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  54. 配列番号５２に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  55. 配列番号５４に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  56. 配列番号５６に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  57. 配列番号５８に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  58. 配列番号６０に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  59. 配列番号６２に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  60. 配列番号６４に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  61. 配列番号６６に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  62. 配列番号６８に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
  63. 請求項１～６２のいずれか一項に記載のＣＡＲのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  64. 請求項１～６３のいずれか一項に記載のＣＡＲまたはポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  65. 前記ポリヌクレオチドが配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５および６７のいずれか一つに記載されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項６４に記載のポリヌクレオチド。
  66. 前記ポリヌクレオチドが配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５および６７のうちのいずれか一つに記載されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項６４に記載のポリヌクレオチド。
  67. 請求項６４～６６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  68. 前記ベクターが発現ベクターである、請求項６７に記載のベクター。
  69. 前記ベクターがエピソームベクターである、請求項６７または６８に記載のベクター。
  70. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項６７～６９のいずれか一項に記載のベクター。
  71. 前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項６７～７０のいずれか一項に記載のベクター。
  72. 前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項６７～７１のいずれか一項に記載のベクター。
  73. 前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）、ビスナマエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、カプリン関節炎 － 脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群から選択される、請求項７２に記載のベクター。
  74. 左（５’）レトロウイルスＬＴＲ、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、中心ポリプリン管／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス輸出要素、請求項４５に記載のポリヌクレオチドに作動可能に結合されたプロモーター、および右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む、請求項７０～７３のいずれか一項に記載のベクター。
  75. 異種ポリアデニル化配列をさらに含む、請求項７０～７４のいずれか一項に記載のベクター。
  76. Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）またはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項７０～７５のいずれか一項に記載のベクター。
  77. 前記５’－ＬＴＲの前記プロモーターが異種プロモーターで置換される、請求項７０～７６のいずれか一項に記載のベクター。
  78. 前記異種プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターまたはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである、請求項７７に記載のベクター。
  79. 前記５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲがレンチウイルスＬＴＲである、請求項７４～７８のいずれか一項に記載のベクター。
  80. 前記３’ＬＴＲが一つ以上の改変を含む、請求項７４～７９のいずれか一項に記載のベクター。
  81. 前記３’ＬＴＲが一つ以上の欠失を含む、請求項７４～８０のいずれか一項に記載のベクター。
  82. 前記３’ＬＴＲが自己不活化（ＳＩＮ）ＬＴＲである、請求項７４～８１のいずれか一項に記載のベクター。
  83. 前記ポリアデニル化配列が、ウシ成長ホルモンポリアデニル化またはシグナルラビットのβ－グロビンポリアデニル化配列である、請求項７５～８２のいずれか一項に記載のベクター。
  84. 請求項６４～６６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが、最適化されたＫｏｚａｋ配列を含む、請求項６７～８３のいずれか一項に記載のベクター。
  85. 請求項６４に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結された前記プロモーターが、サイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１－α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチン－Ｃプロモーター（ＵＢＱ－Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β－ＡＣＴ）、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーであって、陰性対照領域が欠失し、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）Ｕ３プロモーターからなる群から選択される、請求項７４～８４のいずれか一項に記載のベクター。
  86. 請求項１～６３のいずれか一項に記載のＣＡＲまたはポリペプチドを発現する、細胞。
  87. 請求項６４～６６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項６７～８５のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
  88. 前記細胞が遺伝子操作された宿主細胞である、請求項８６または８７に記載の細胞。
  89. 前記細胞が造血細胞である、請求項８６～８８のいずれか一項に記載の細胞。
  90. 前記細胞が、造血幹細胞又は前駆細胞である、請求項８６～８９のいずれか一項に記載の細胞。
  91. 前記細胞が、ＣＤ３４＋造血幹細胞又は前駆細胞である、請求項８６～９０のいずれか一項に記載の細胞。
  92. 前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項８６～８９のいずれか一項に記載の細胞。
  93. 前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項８６～８９および９２のいずれか一項に記載の細胞。
  94. 前記細胞が、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞である、請求項８６～８９、９２および９３のいずれか一項に記載の細胞。
  95. 前記細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、請求項８６～８９および９２～９４のいずれか一項に記載の細胞。
  96. 前記Ｔ細胞が、αβ－Ｔ細胞である、請求項９３～９５のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  97. 前記Ｔ細胞が、γδ－Ｔ細胞である、請求項９３～９５のいずれか一項に記載のＴ細胞。
  98. 前記宿主細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項８６～８９および９２のいずれか一項に記載の細胞。
  99. 前記ナチュラルキラー細胞が、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項９８に記載の細胞。
  100. 前記細胞がマクロファージである、請求項８６～８９および９２のいずれか一項に記載の細胞。
  101. 前記免疫エフェクター細胞が、請求項６７～８５のいずれか一項に記載のベクターで形質導入され、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化および刺激され、それによって、ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化および刺激された形質導入免疫エフェクター細胞の増殖と比較して、前記形質導入免疫エフェクター細胞の増殖を維持する、請求項９２～１００のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
  102. ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の存在下で、活性化され刺激された前記免疫エフェクター細胞が、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される一つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の全ての前記マーカーを、ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化され刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた、請求項１０１に記載の免疫エフェクター細胞。
  103. ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の存在下で、活性化され刺激された前記免疫エフェクター細胞が、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択される一つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８の全ての前記マーカーを、ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の非存在下で、活性化され刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた、請求項１０１に記載の免疫エフェクター細胞。
  104. 前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＺＳＴＫ４７４である、請求項１０１～１０３のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
  105. 前記細胞またはその子孫が、ＢＣＭＡ発現細胞との共培養において高いＩＦＮγ放出を示す、請求項８６～１０４のいずれか一項に記載の細胞またはその子孫。
  106. 前記細胞または子孫が、前記ＣＡＲがマウス由来抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じ細胞と比較してＢＣＭＡ発現細胞との共培養において、類似またはより高いＩＦＮγ放出を呈する、請求項８６～１０５のいずれか一項に記載の細胞またはその子孫。
  107. 前記共培養されたＢＣＭＡ発現細胞が、Ｄａｕｄｉ細胞、ＨＴ１０８０．ＢＣＭＡ細胞、および／またはＲＰＭＩ－８２２６細胞である、請求項１０５もしくは請求項１０６に記載の細胞またはその子孫。
  108. 前記細胞またはその子孫が、低ＢＣＭＡ発現細胞との共培養において高いＩＦＮγ放出を示す、請求項８６～１０７のいずれか一項に記載の細胞。
  109. 前記低ＢＣＭＡ発現細胞が、Ｄａｕｄｉ細胞、ＨＴ１０８０．ＢＣＭＡ細胞、および／またはＲＰＭＩ－８２２６細胞と比較して、少なくとも５倍少ない表面ＢＣＭＡ発現を有する、請求項１０８に記載の細胞。
  110. 前記低ＢＣＭＡ発現細胞が、ＨＴ１０８０．ＢＣＭＡ細胞と比較して、少なくとも１０倍少ない表面ＢＣＭＡ発現を有する、請求項１０８または請求項１０９に記載の細胞。
  111. 前記低ＢＣＭＡ発現細胞が、ＲＰＭＩ－８２２６細胞と比較して、少なくとも１０倍少ない表面ＢＣＭＡ発現を有する、請求項１０８～１１０のいずれか一項に記載の細胞。
  112. 前記低ＢＣＭＡ発現細胞が、ＲＬ細胞および／またはＴｏｌｅｄｏ細胞である、請求項１０８～１１１のいずれか一項に記載の細胞。
  113. 前記ＣＡＲ Ｔ細胞が、前記ＣＡＲがマウス由来抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、低抗原密度細胞との共培養においてより高いＩＦＮγ放出を呈する、請求項１０８～１１２のいずれか一項に記載の細胞。
  114. 前記細胞が、低抗原非依存性シグナル伝達を示す、請求項８６～１１３のいずれか一項に記載の細胞。
  115. 前記細胞が、前記ＣＡＲがマウス由来抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むことを除いて、同じＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、低抗原非依存性シグナル伝達を示す、請求項８６～１１４のいずれか一項に記載の細胞。
  116. 請求項８６～１１５のいずれか一項に記載の細胞および生理学的に許容可能な賦形剤を含む、組成物。
  117. 請求項１～６３のいずれか一項に記載のＣＡＲまたはポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞を生成する方法であって、請求項６７～８５のいずれか一項に記載のベクターを免疫エフェクター細胞に導入することを含む、方法。
  118. 前記免疫エフェクター細胞を刺激すること、ならびに前記細胞をＣＤ３に結合する抗体およびＣＤ２８に結合する抗体と接触させることによって前記細胞の増殖を誘発すること、それによって、免疫エフェクター細胞の集団を生成すること、をさらに含む、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記免疫エフェクター細胞が前記ベクターを導入する前に刺激され、増殖を誘発される、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔリンパ球を含む、請求項１１８または請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記免疫エフェクター細胞がＮＫ細胞を含む、請求項１１８または請求項１１９に記載の方法。
  122. ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の存在下で、前記免疫エフェクター細胞が、活性化され刺激され、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される一つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８の全ての前記マーカーを、ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化され刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた、請求項１１７～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の存在下で、前記免疫エフェクター細胞が、活性化され刺激され、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択される一つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、およびＣＤ８の全ての前記マーカーを、ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化され刺激された免疫エフェクター細胞に比べて発現を増加させた、請求項１１７～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記ＰＩ３Ｋ阻害剤がＺＳＴＫ４７４である、請求項１２２または請求項１２３に記載の方法。
  125. 請求項１１６に記載の組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象のＢ細胞関連状態を治療する方法。
  126. 前記Ｂ細胞関連状態が癌である、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記癌が固形癌である、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記癌が液性癌である、請求項１２６に記載の方法。
  129. 前記癌が、血液悪性腫瘍である、請求項１２６に記載の方法。
  130. 前記Ｂ細胞関連状態が、多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、不確かな悪性電位のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少症紫斑病、抗リン脂質症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発性動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、および急速に進行する糸球体腎炎、重鎖疾患、原発性または免疫細胞関連アミロイドーシス、または重要性が不明のモノクローナルガンモパシーである、請求項１２５に記載の方法。
  131. 前記Ｂ細胞関連状態がＢ細胞悪性腫瘍である、請求項１２５～１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、多発性骨髄腫（ＭＭ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記ＭＭが、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、および髄外形質細胞腫からなる群から選択される、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記ＮＨＬが、バーキットリンパ腫、慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項１３２に記載の方法。
  135. 前記Ｂ細胞関連状態が形質細胞悪性腫瘍である、請求項１２５に記載の方法。
  136. 前記Ｂ細胞関連状態が自己免疫疾患である、請求項１２５に記載の方法。
  137. 前記自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項１３６に記載の方法。
  138. 前記Ｂ細胞関連状態が関節リウマチである、請求項１２５に記載の方法。
  139. 前記Ｂ細胞関連状態が、特発性血小板減少症紫斑病、または重症筋無力症、または自己免疫性溶血性貧血である、請求項１２５に記載の方法。
  140. 対象においてＢＣＭＡを発現する癌に関連する一つ以上の症状で改善する方法であって、ＢＣＭＡを発現する癌細胞に関連する少なくとも一つの症状を改善するのに十分な量の請求項１１６に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  141. 前記改善される一つ以上の症状が、脱力感、疲労、息切れ、容易な打撲傷および出血、頻繁な感染症、リンパ節の肥大、腹部の膨満または痛みを伴う、骨または関節の痛み、骨折、計画外の体重減少、食欲不振、寝汗、持続性の軽度の発熱、および排尿の減少からなる群から選択される、請求項１４０に記載の方法。
  142. 対象においてＢＣＭＡを発現する細胞数を減少させるための方法であって、投与前のＢＣＭＡを発現する細胞の数と比較して、ＢＣＭＡを発現する細胞数を減少させるのに十分な量の請求項１１６に記載の組成物を前記対象に前記投与することを含む、方法。
  143. 配列番号７、１５、２３、３１、３９または４７に記載される可変軽鎖アミノ酸配列内の可変軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３領域、ならびに配列番号８、１６、２４、３２、４０または４８に記載される可変重鎖アミノ酸配列内の可変重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３領域を含む、ヒトＢＣＭＡポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片。
  144. 配列番号１～３、９～１１、１７～１９、２５～２７、３３～３５または４１～４３のいずれか一つに記載される可変軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３配列、ならびに配列番号４～６、１２～１４、２０～２２、２８～３０、３６～３８または４４～４６に記載される可変重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３配列を含む、ヒトＢＣＭＡポリペプチドの一つ以上のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片。
  145. 前記抗体または抗原結合断片が、キャメルＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、およびシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される、請求項１４３または請求項１４４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  146. 前記抗体または抗原結合断片が、ｓｃＦｖである、請求項１４５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  147. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１～３のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号４～６のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  148. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号９～１１のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号１２～１４のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  149. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７～１９のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号２０～２２のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  150. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２５～２７のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号２８～３０のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  151. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３３～３５のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号３６～３８のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  152. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４１～４３のいずれか一つに記載される一つ以上の軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号４４～４６のいずれか一つに記載される一つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  153. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７、１５、２３、３１、３９、もしくは４７のいずれか一つに記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号８、１６、２４、３２、４０、または４８のいずれか一つに記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  154. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号８に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  155. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号１６に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  156. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２３に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号２４に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  157. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３１に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号３２に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  158. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３９に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号４０に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  159. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４７に記載される可変軽鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、ならびに／または配列番号４８に記載される可変重鎖アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  160. 前記抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７、１５、２３、３１、３９もしくは４７のいずれか一つに記載される可変軽鎖配列および／または配列番号８、１６、２４、３２、４０もしくは４８のいずれか一つに記載される可変重鎖配列を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  161. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号８に記載される可変重鎖配列を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  162. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号１６に記載される可変重鎖配列を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  163. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２３に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号２４に記載される可変重鎖配列を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  164. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３１に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号３２に記載される可変重鎖配列を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  165. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３９に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号４０に記載される可変重鎖配列を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  166. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４７に記載される可変軽鎖配列および／または配列番号４８に記載される可変重鎖配列を含む、請求項１４３～１４６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  167. 前記抗体またはその抗原結合断片がｓｃＦｖであり、前記可変軽鎖は前記可変重鎖のそれに対してｃ末端に位置する、請求項１５３～１６６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  168. 前記抗体またはその抗原結合断片がｓｃＦｖであり、前記可変重鎖は前記可変軽鎖のそれに対してｃ末端に位置する、請求項１５３～１６６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
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