CN109306014A - 一种靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途。具体而言，本发明提供的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有膜蛋白信号肽、抗间皮素近膜端单链抗体、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域和免疫受体酪氨酸活化基序。本发明还包括表达本文所述嵌合抗原受体的T细胞，该T细胞可以特异性杀伤间皮素高表达的肿瘤细胞株，且对不表达的肿瘤细胞株杀伤作用较小或无，具有很好的特异性。

Description

一种靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途
技术领域
本发明属于基因工程学和免疫学，涉及一种靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途。
背景技术
癌症现在已成为人类健康的头号杀手，快速的生活节奏、巨大的工作压力、不健康的饮食习惯、糟糕的环境都是癌症发生的帮凶，使得癌症的高发率和年轻化趋势也越来越明显。目前常用的治疗手段效果十分有限，仍需探索一个更加有效的治疗方法，来提高癌症患者的生存率和生存质量。
针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得了令人瞩目的临床疗效。自2011年，Nature及临床肿瘤最顶级杂志JCO分别发表相同题目“肿瘤免疫治疗的时代已经来临”的评论文章(Nature.2011；480(7378):480；J Clin Oncol.2011；29(36):4828)，肿瘤免疫细胞治疗迎来新一轮的研究热潮。
嵌合抗原受体T细胞疗法作为肿瘤免疫治疗的重要分支之一，在恶性血液肿瘤中已经取得了非常好的疗效，对复发难治性B细胞白血病的完全缓解率超过90％。嵌合抗原受体是一种人工合成受体，它通常包含胞外抗原结合域、跨膜铰链区和胞内信号转导区。通过将识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)的抗体单链可变区(single-chainfragment variable，scFv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-based activation motifs，ITAM)”在体外进行基因重组。再通过病毒或其它载体系统将其导入T细胞中，这样经过基因改造的T细胞称之为CAR-T细胞。CAR-T细胞在体外经大规模扩增后，回输到患者体内，能够以非MHC限制性的模式表现强效的抗癌作用。
但是，CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效目前仍不足。主要原因包括：1.实体瘤异质性高，缺乏适合CAR-T治疗的细胞表面靶点。2.实体瘤具有强烈抑制免疫的微环境。
间皮素是一种通过磷脂酰肌醇区(GPI)锚定在细胞质膜上的糖蛋白，高表达于多种肿瘤组织中，少量表达于正常胸膜、心包和腹膜的间皮细胞中。间皮素基因编码一种69kDa的前体蛋白，经加工形成一个40kDa的膜结合蛋白和一个31kDa称之为巨核细胞促进因子(MPF)的脱落片断并释放出细胞外，我们通常所说的间皮素指的是锚定在膜上的片段，根据其蛋白结构可以分为Region I、II、III三个区域。它一方面可以通过其GPI结构域激活NFκB、MAPK和PI3K细胞内信号通路，促进细胞增殖，抵抗细胞凋亡；另一方面与其受体CA125/MUC16相互作用导致异常的细胞粘附，促进癌细胞转移。由于间皮素在正常组织中的分布有限而在多种恶性肿瘤(间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌等)中过表达，因此是一个很有潜力的肿瘤特异性治疗靶点。
目前，以间皮素为靶点的小分子药物、抗毒素已经取得了很好的效果，以此为靶点的CAR-T细胞研究也在如火如荼的展开，以间皮素(mesothelin)为靶点CAR-T细胞治疗的临床试验已有5项，在除CD19外的其它靶点中占据第四位，主要是针对胰腺癌(NCT01897415,NCT02465983)，间皮瘤(NCT01355965,NCT02414269)，肺癌和乳腺癌(NCT02414269)。
以间皮素为靶点的CAR-T细胞在多种癌症中都显示出了一定的疗效，但是对于间皮素高表达的卵巢癌却效果不佳。究其原因可能在于，目前以间皮素为靶点的CAR-T细胞多是以间皮素N末端Ⅰ区(Region I，296-390，远膜端)为识别位点，但同时卵巢癌患者血清中的CA125/MUC16蛋白与间皮素的相互作用也是通过这一位点，它们与CAR-T细胞竞争性结合间皮素Region I，从而影响了疗效的发挥。
发明内容
因此，本文提供一种IgG4 Fc CH2CH3铰链区，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。
本文还提供所述IgG4 Fc CH2CH3铰链区的编码序列，包括其互补序列。
在一个或多个实施方案中，IgG4 Fc CH2CH3铰链区的编码序列如SEQ ID NO:14第817-1500位碱基所示。
本文还提供一种嵌合抗原受体(CAR)，从N端到C端，该嵌合抗原受体依次含有信号肽、抗间皮素单链抗体、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域和免疫受体酪氨酸活化基序。
在一个或多个实施方案中，所述信号肽是膜蛋白信号肽。
在一个或多个实施方案中，所述信号肽选自CD8信号肽、CD28信号肽和CD4信号肽。
在一个或多个实施方案中，所述信号肽是CD8信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗间皮素单链抗体为间皮素III区的特异性抗体。
在一个或多个实施方案中，所述间皮素III区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗间皮素III区的单链抗体的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗间皮素单链抗体为间皮素I区的特异性抗体，且所述嵌合抗原受体含有IgG4 Fc CH2CH3铰链区。
在一个或多个实施方案中，所述间皮素I区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗间皮素I区的单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。
在一个或多个实施方案中，所述铰链区为CD8铰链区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在一个或多个实施方案中，所述铰链区是IgG4 Fc CH2CH3铰链区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在一个或多个实施方案中，所述跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述跨膜区为CD8跨膜区，其氨基酸序列优选如SEQ IDNO:7所示。
在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子胞内结构域选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS和DAP10胞内结构域中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子胞内结构域是CD28胞内结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子胞内结构域是CD137胞内结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
在一个或多个实施方案中，所述免疫受体酪氨酸活化基序为CD3ζ和/或FcεRIγ的酪氨酸活化基序。
在一个或多个实施方案中，所述免疫受体酪氨酸活化基序为CD3ζ酪氨酸活化基序，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有CD8信号肽、抗间皮素III区单链抗体、CD8铰链区或IgG4 Fc CH2CH3铰链区、CD8跨膜区、CD28胞内结构域和CD3ζ的酪氨酸活化基序。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有CD8信号肽、抗间皮素III区单链抗体、IgG4 Fc CH2CH3铰链区、CD8跨膜区、CD28胞内结构域和CD3ζ的酪氨酸活化基序。
在一个或多个实施方案中，，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有CD8信号肽、抗间皮素I区单链抗体、IgG4 Fc CH2CH3铰链区、CD8跨膜区、CD137胞内结构域和CD3ζ的酪氨酸活化基序。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
本文也提供本文嵌合抗原受体的编码序列，包括其互补序列。
在一个或多个实施方案中，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
本文还提供一种核酸构建物，其含有本文所述嵌合抗原受体的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体，用于表达本文所述的嵌合抗原受体。
在一个或多个实施方案中，所述表达载体是转座子载体。
在一个或多个实施方案中，所述转座子载体含有选自piggybac、sleepingbeauty、frog prince、Tn5和Ty的转座元件。
本文还提供一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞含有本文所述嵌合抗原受体的编码序列或本文所述的核酸构建物。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为T细胞。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为原代培养T细胞。
在一个或多个实施方案中，所述细胞表达本文所述的嵌合抗体受体。
本文还提供下述用途：(1)所述IgG4 Fc CH2CH3铰链区或其编码序列在制备本文所述嵌合抗原受体或其编码序列中的用途；(2)本文所述嵌合抗原受体的编码序列在制备重组表达载体中的用途；(3)本文所述的核酸构建物在制备重组宿主细胞中的用途；以及(4)本文所述的重组宿主细胞在制备治疗或预防癌症用的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述癌症选自：腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的重组宿主细胞。
附图说明
图1A：各种针对间皮素的嵌合抗原受体基因结构模式图。
图1B：载体质粒图谱(pNB328-meso3CAR)。
图2：western blot检测两种不同信号肽的meso3CAR-T细胞中CAR基因表达情况检测。
图3：包含CD8铰链区与突变型IgG4Fc铰链区的meso3CAR-T对宫颈癌细胞Hela、卵巢癌细胞SK-OV-3和胃癌细胞HGC-27的杀伤对比。
图4：针对间皮素不同区域的meso1CAR-T细胞与meso3CAR-3-T细胞在间皮素抗原刺激下IL-2，IL-4，IL-6,IL-10，TNF-和IFN-细胞因子分泌的变化。
图5：针对间皮素不同区域的meso1CAR-T细胞与meso3CAR-3-T细胞对都高表达间皮素的CA125/MUC16阳性细胞株(OVCAR-3)以及阴性细胞株(PANC-1)的杀伤结果。
图6：meso1CAR-T细胞与meso3CAR-3-T细胞对CA125/MUC16阳性的OVCAR-3卵巢癌小鼠移植瘤模型的治疗效果。
具体实施方式
因此，我们设计了一种新型靶向间皮素的CAR-T细胞，以间皮的Region III(近膜端)为识别位点。由于这一抗原表位存在于近膜端，我们设计了2种不同铰链长度的CAR结构，一种是CD8铰链区与CD8跨膜区组合形成的跨膜铰链区，一种是由IgG4 Fc CH2CH3铰链区与CD8跨膜区组合形成的跨膜铰链区。此外由于CAR上存在的IgG4 Fc片段容易被单核/巨噬细胞识别而引起T细胞AICD反应，我们对CAR上的IgG4 Fc CH2CH3铰链区进行改造以满足我们的CAR片段既可以很好的识别抗原又不引起AICD反应，从而达到良好的识别抗原和细胞杀伤作用。
本文的嵌合抗原受体(CAR)，从N端到C端，依次含有信号肽、抗间皮素(meso)单链抗体、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域和免疫受体酪氨酸活化基序。
信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有时不一定在N端)，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。本文的信号肽为膜蛋白信号肽，可选自CD8信号肽、CD28信号肽和CD4信号肽。在优选的实施方案中，本发明使用CD8信号肽。示范性的CD8信号肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO：1所示。
单链抗体(scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。本文所述的抗meso单链抗体可以是针对间皮素的Region I或III的单链抗体。优选的是，该单链抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列来自针对间皮素Region I或III的氨基酸序列的抗体。在某些实施方案中，间皮素Region I的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；间皮素Region III的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。示例性的抗间皮素Region I的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。示例性的抗间皮素Region III的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。本文中，如果没有特别说明，间皮素指锚定在膜上的间皮素片段。
铰链区指免疫球蛋白重链CH1和CH2功能区之间的区域，该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。适用于本文的铰链区可选自CD8的胞外铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28的胞外铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区的任意一种或多种，优选是长50个氨基酸残基以上、更优选长80个氨基酸残基以上的铰链区。在某些实施方案中，本文使用CD8α铰链区和IgG4 Fc CH2CH3铰链区。示例性的CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。示例性的IgG4 FcCH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
跨膜区可选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种。优选地，用于本文的嵌合抗原受体的跨膜区为CD8跨膜区。示例性的CD8跨膜区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:7所示。
共刺激信号分子胞内结构域可选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS和DAP10胞内结构域中的一种或多种。在某些实施方案中，使用CD28的胞内结构域或CD137的胞内结构域。示例性的CD28胞内结构域的氨基酸序列可如SEQ ID NO:8所示；示例性的CD137胞内结构域的氨基酸序列可如SEQ ID NO:9所示。
免疫受体酪氨酸活化基序可为CD3ζ和/或FcεRIγ的酪氨酸活化基序。示例性的CD3ζ酪氨酸活化基序的氨基酸序列可如SEQ ID NO:10所示。
形成本文嵌合抗原受体的上述各部分，如CD8信号肽、抗meso单链抗体的轻链可变区和重链可变区、铰链区、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域以及免疫受体酪氨酸活化基序等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本文的CAR的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
在某些实施方案中，本文的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有CD8信号肽、抗mesoscFv、CD8铰链区、CD8跨膜区、CD28胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序。
在其它实施方案中，本文的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有CD8信号肽、抗mesoscFv、IgG4 FcCH2CH3铰链区、CD8跨膜区、CD28胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序。
优选地，所述抗meso scFv为针对间皮素III区的单链抗体。优选地，当所述间皮素单链抗体为针对间皮素I区的单链抗体时，该嵌合抗原受体含IgG4 FcCH2CH3铰链区。
示例性的嵌合抗原受体的氨基酸序列可如SEQ ID NO:13所示。
本文还包括编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列。本文的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
本文还包括核酸构建物，其含有本文所述的编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。具体而言，可将本文CAR的编码序列克隆入许多类型的载体，例如这些类型的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体可以是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述CAR的编码序列，以及任选的可选择的标记。
合适的启动子包括但不限于即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。在某些实施方案中，可使用CN201510021408.1所公布的各种启动子序列，包括但不限于该申请SEQID NO:1所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的CCEF启动子；SEQ ID NO:2所示的含CD3e增强子和EF1α启动子的TEF启动子；SEQ ID NO:3所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的TCEF启动子；SEQ ID NO:4所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的CCEFI启动子；SEQ ID NO:5所示的含CD3e增强子和含内含子的EF1α启动子的TEFI启动子；以及SEQ ID NO:5所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的TCEFI启动子。本文将该申请的全部内容以引用的方式纳入本文。
可选择的标记包括可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从被病毒载体感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。
在某些实施方案中，本文的表达载体真核表达载体，具体是转座子载体。在某些实施方案中，该转座子载体是含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。这类转座子载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’ITR)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’ITR)。例如，在某些实施方案中，本文的核酸构建物或表达载体从5’到3’依次含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、CD8信号肽编码序列、抗meso scFv编码序列、CD8铰链区编码序列或IgG4 Fc CH2CH3铰链区编码序列、CD8跨膜区编码序列、CD28胞内结构域编码序列、CD3ζ酪氨酸活化基序编码序列以及转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)。所述转座子载体还可含有转座酶编码序列和控制转座酶编码序列表达的启动子。在某些实施方案中，所述真核表达载体是pNB328载体。
可采用常规的方法将本文的载体导入宿主细胞中，这些方法包括显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等。在某些实施方案中，本文采用电穿孔法将本文的核酸构建物导入宿主细胞中。具体地，将重组的质粒经电转仪高压电的作用转到感兴趣的宿主细胞中。
适用于本文的宿主细胞可以是本领域周知的哺乳动物细胞，优选是T细胞，包括各种来源的各种类型的T细胞。例如，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。在某些实施方案中，T细胞为原代培养T细胞。
因此，本文也包括一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞含有本文所述嵌合抗原受体的编码序列或本文所述的核酸构建物；和/或所述重组宿主细胞表达本文所述的嵌合抗原受体。该重组宿主细胞可以是前文所述的转入了本文所述载体的宿主细胞。
用于本文嵌合抗原受体中的IgG4 Fc CH2CH3铰链区及其编码序列也包括在本文的范围之内。更具体而言，本文包括其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的IgG4 Fc CH2CH3铰链区及其编码序列(包括互补序列)。
本文还包括前文提及的各种氨基酸序列、核酸序列、重组宿主细胞等的用途。具体而言，本文包括所述IgG4 Fc CH2CH3铰链区和/或其编码序列在制备本文所述嵌合抗原受体和/或其编码序列中的用途；所述嵌合抗原受体的编码序列在制备重组表达载体中的用途；所述核酸构建物在制备重组宿主细胞中的用途；以及所述重组宿主细胞在制备治疗或预防癌症用的药物中的用途。在某些实施方案中，本文包括所述IgG4 Fc CH2CH3铰链区和/或其编码序列、所述嵌合抗原受体和/或其编码序列以及所述核酸构建物在制备用于治疗或预防癌症的重组宿主细胞中的应用。
适用于本文所述CAR或其表达细胞进行治疗或预防的癌症优选间皮素阳性癌症，具体包括癌细胞表面异常表达间皮素的癌症。具体而言，这类癌症可选自：间皮瘤、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。在某些实施方案中，本文的其单链抗体针对间皮素III区的CAR或其表达细胞，对同时高表达CA125/MUC16的癌症，如卵巢癌，具有优异的杀伤效果，因此，本文的这类CAR或其表达细胞可特别用于治疗或预防同时高表达间皮素和CA125/MUC16的癌症。
本文还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有本文所述的重组表达载体。试剂盒还可含有适用于将所述重组表达载体转入细胞中的试剂，以及任选的指导本领域技术人员将所述重组表达载体转入细胞的说明书。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的重组宿主细胞和药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以是本领域周知的适用于细胞给药的载体，包括但不限于pNB328载体。
治疗或预防癌症的方法也包括在本文的范围之内，所述方法包括将本文所述的重组宿主细胞或药物组合物给予有需要的个体的步骤。给予的方法可以是细胞治疗中常用的方法。给予的剂量可根据病患性别、年龄、所患疾病、身体状况等因素加以考虑。
本文提供的mesoCAR-T细胞可以特异性杀伤间皮素高表达的肿瘤细胞株，且对不表达的肿瘤细胞株杀伤作用较小或无，表明其具有很好的特异性。此外，本文提供的针对间皮素III区的meso3CAR-T细胞识别间皮素III区，不会受到CA125/MUC16的影响，因此对同时高表达间皮素和CA125/MUC16的肿瘤/癌症具有特别好的杀伤效果。在OVCAR-3卵巢癌小鼠移植瘤模型中，本文的meso3CAR-T细胞肿瘤抑制能力明显强于meso1CAR-T细胞。因此，本文提供的meso3CAR-T尤其可用于CA125/MUC16与间皮素同时高表达的癌症的过继性免疫细胞治疗中。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1：重组质粒pNB328-mesoCAR的构建
人工合成编码含有信号肽(CD8信号肽或轻链信号肽)、抗原识别单链抗体(anti-meso3scFv或anti-meso1scFv)、铰链区(CD8铰链区或IgG4铰链区)、CD8跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域和免疫受体酪氨酸活化基序的mesoCAR的外源基因(分别命名为meso3CAR-1、meso3CAR-2、meso3CAR-3和meso1CAR，如图1A所示)，并在其上游引入多克隆酶切位点(BglII-XbaI-EcoRI-BamHI)，在其下游插入酶切位点(SalI-NheI-HindIII-SpeI)，委托上海捷瑞生物公司合成，将其装入用EcoR1+SalI双酶切的pNB328-EF1α载体中(含EF1α启动子的pNB328，pNB328载体见CN 201510812654.9)，构建重组质粒pNB328-mesoCAR，分别命名为pNB328-meso3CAR-1、pNB328-meso3CAR-2、pNB328-meso3CAR-3和pNB328-meso1CAR，其示意性结构如图1B所示。图1B中，“EF1promoter”为EF1启动子；“meso3CAR”代表上述三种抗原识别单链抗体为anti-meso3scFv的任一种mesoCAR，替换成meso1CAR，则该质粒为pNB328-meso1CAR。
CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；anti-meso3scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；anti-meso1scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；CD8铰链区的氨基酸如SEQ ID NO:5所示；IgG4铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；共刺激信号分子胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示。
实施例2：靶向间皮素的mesoCAR-T细胞构建
外周血单核细胞(PBMCs)由上海细胞治疗生产中心分离获得。将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp，离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp，离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤；取两个1.5ml离心管，每管加入5×106个细胞，编号a、b，1200rmp,离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)，a、b管按比例加入电转试剂共100ul，a管加入6ug构建好的重组质粒pNB328-mesoCAR，重悬混匀细胞，b管加入6ug对照质粒(即pNB328空质粒)；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培液的六孔板中(含2％FBS的AIM-Ⅴ培液)，混匀，置于37℃，5％CO2培养箱培养，六小时后加入刺激因子IL-2和anti-CD3/anti-CD28，37℃，5％CO2培养3～4天，观察T细胞的生长情况，获得表达mesoCAR基因的T细胞。
实施例3：不同信号肽meso3CAR-T的表达量对比
分别收集实施例2制备得到的两种meso3CAR-T细胞(meso3CAR-1与meso3CAR-2)，生理盐水洗涤两遍，加入160μl细胞裂解液，冰上放置10min；待细胞充分裂解后，12000rmp，4℃，离心10min，收集上清。加入40ul 5×loading Buffer，100℃煮10min，冰上放置5min。分别使用鼠抗人CD3ζ抗体(购自abcam公司)，GAPDH抗体(购自Beyotime公司)，HRP羊抗鼠二抗(购自Jackson公司)，western blot检测外源基因的表达。
结果如图2所示，使用轻链抗体信号肽的meso3CAR-1不能正常表达。
实施例4：不同胞外铰链区meso3CAR-T的杀伤功能对比
选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例2获得的两种meso3CAR-T细胞(meso3CAR-2与meso3CAR-3)的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：宫颈癌细胞Hela，卵巢癌细胞SK-OV-3、胃癌HGC-27(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停步骤2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，以转入pNB328空载体的Mock T细胞作为对照，开始步骤3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线；
结果如图3所示。使用突变型IgG4Fc铰链区的meso3CAR-3细胞对肿瘤细胞的杀伤作用明显强于使用CD8铰链区的meso3CAR-2细胞以及对照T细胞。
实施例5：meso1CAR与meso3CAR在间皮素抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比
用2ug/ml的间皮素抗原包被96孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，加入1×105的实施例2制备得到的meso1CAR、meso3CAR-3细胞以及对照的Mock T细胞(转入pNB328空载体)，培养24h后收集细胞上清。用BDTMCBA Human Th1/Th2Cytokine Kit II检测这三种T细胞受间皮素抗原刺激后细胞因子的分泌情况，具体步骤如下：
(1)混合人的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF、IFN-γ捕获磁珠，涡旋振荡混匀捕获磁珠，每管加入50ul混匀后的捕获磁珠；
(2)加入50ul人的Th1/Th2细胞因子标准品(倍比稀释5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)和50ul的待测样品(经稀释液2倍稀释)。
(3)每管加入50ul的人的Th1/Th2-II-PE的检测抗体；
(4)室温避光孵育3h；
(5)每管加入1ml的洗涤缓冲液，200离心5min，弃上清；
(6)每管加入300ul的洗涤缓冲液重悬细胞，并转移至流式管中，用流式细胞仪检测荧光值；
结果如图4所示，meso1CAR-T、meso3CAR-3-T细胞各种细胞因子的分泌量相较于Mock T细胞，都有显著提高，且meso3CAR-3T细胞更高于meso1CAR-T细胞。
实施例6：meso1CAR与meso3CAR杀伤CA125阳性或阴性细胞的活性对比
选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用艾森公司实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测两种mesoCAR-T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：选取高表达CA125的卵巢癌细胞OVCAR-3和不表达CA125的胰腺癌细胞PANC-1(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停步骤2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，以空载质粒的Mock T细胞作为对照，开始步骤3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线；
结果如图5所示，对于不表达CA125的胰腺癌细胞PANC-1，两种mesoCAR-T细胞都有一定的杀伤作用，meso3CAR-3-T细胞稍强于meso1CAR-T细胞；对于高表达CA125的卵巢癌细胞OVCAR-3，meso1CAR-T细胞几乎没有杀伤作用，而meso3CAR-3-T细胞仍然具有很好的杀伤。
实施例7：meso1CAR与meso3CAR杀伤CA125阳性的OVCAR-3卵巢癌移植瘤的活性对比
1：4～6周龄NSG完全免疫缺陷小鼠15只，平均重量22～27g，由北京维通达生物技术有限公司提供，SPF级动物实验室饲养。
2：体外培育人卵巢癌细胞OVCAR-3-luc，取对数生长期贴壁生长细胞，0.25％胰酶消化，离心、收集细胞后用PBS液重悬，1000rmp室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×107个/ml。
3：于小鼠右肋背部皮下接种OVCAR-3-luc细胞，0.1ml/只。接种10天后，可通过活体成像仪观察肿瘤大小，将NSG免疫缺陷小鼠随机分为3组。给药途径为直接瘤内多点注射。
4：每日观察小鼠的生活状态并每隔10天通过活体成像仪观察小鼠肿瘤变化。
结果如图6所示，在CA125高表达的卵巢癌小鼠移植瘤模型中，meso3CAR-3-T细胞具有较好的治疗作用。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述。本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 上海细胞治疗研究院
上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司
<120> 一种靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途
<130> 174383
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8信号肽的氨基酸序列
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链信号肽的氨基酸序列
<400> 2
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly
20
<210> 3
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间皮素区III的单链抗体
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Gly Phe Tyr
20 25 30
Phe Tyr Ala Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn
100 105 110
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr
180 185 190
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp Ser Asn Asn Trp His Ala
225 230 235 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 4
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 区I的单链抗体
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
130 135 140
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
145 150 155 160
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser
165 170 175
Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro
180 185 190
Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
210 215 220
Ser Lys His Pro Leu Thr Tyr Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 5
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α铰链区氨基酸序列
<400> 5
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
50 55 60
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
65 70 75 80
His Arg Asn
<210> 6
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 Fc CH2CH3铰链区氨基酸序列
<400> 6
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 7
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8跨膜区的氨基酸序列
<400> 7
Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 8
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28胞内共刺激信号结构区域氨基酸序列
<400> 8
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 9
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD137胞内共刺激信号结构区域氨基酸序列
<400> 9
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
1 5 10 15
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
20 25 30
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40 45
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ的酪氨酸活化基序
<400> 10
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 11
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间皮素区I氨基酸序列
<400> 11
Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile
1 5 10 15
Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val
20 25 30
Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro
35 40 45
Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu Lys His Lys Leu Asp Glu Leu
50 55 60
Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile Arg Lys Trp Asn Val
85 90
<210> 12
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间皮素区III氨基酸序列
<400> 12
Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr
1 5 10 15
Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu
20 25 30
Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met
35 40 45
Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln
50 55 60
Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His
65 70 75 80
Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp
85 90 95
Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu
100 105 110
<210> 13
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> meso3CAR-3的氨基酸序列
<400> 13
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Asp Leu Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
85 90 95
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
100 105 110
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg
115 120 125
Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
165 170 175
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser
180 185 190
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp
245 250 255
Ser Asn Asn Trp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
260 265 270
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
275 280 285
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Ser Leu Gly Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
500 505 510
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
515 520 525
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
530 535 540
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
545 550 555 560
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
565 570 575
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
580 585 590
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
595 600 605
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
610 615 620
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
625 630 635 640
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
645 650 655
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
660 665 670
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
675 680
<210> 14
<211> 2043
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> meso3CAR-3的编码序列
<400> 14
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgagcgagg tgcagctggt ggagtccggg ggaggcctgg tccagcctgg gggatccctg 120
agactctcct gcgcagcctc tggattcgac ctcggtttct acttttacgc ctgttgggtc 180
cgccaggctc cagggaaggg cctggagtgg gtctcatgca tttatactgc tggtagtggt 240
agcacgtact acgcgagctg ggcgaaaggc cgattcacca tctccagaga caattcgaag 300
aacacgctgt atctgcaaat gaacagtctg agagccgagg acacggccgt gtattactgt 360
gcgagatcta ctgctaatac tagaagtact tattatctta acttgtgggg ccaaggcacc 420
ctggtcaccg tctcctcagg cggaggcgga tcaggtggtg gcggatctgg aggtggcgga 480
agcgacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtggg agacagagtc 540
accatcactt gccaggccag tcagaggatt agtagttact tatcctggta tcagcagaaa 600
ccagggaaag ttcccaagct cctgatctat ggtgcatcca ctctggcatc tggggtcccc 660
tcgcggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 720
cctgaagatg ttgccactta ctactgtcag agttatgctt attttgatag taataattgg 780
catgctttcg gcggagggac caaggtggag atcaaagagt ccaaatatgg tcccccatgc 840
ccaccatgcc cagcacctcc cgtggccgga ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc 900
aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc 960
caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc 1020
aagacaaagc cgcgggagga gcagttccag agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080
gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc 1140
ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agagccacag 1200
gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260
ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380
agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 1440
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 1500
cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 1560
gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 1620
atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 1680
ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 1740
gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1800
tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 1860
aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 1920
agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 1980
ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 2040
cgc 2043

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，从N端到C端，该嵌合抗原受体依次含有膜蛋白信号肽、抗间皮素近膜端的单链抗体、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域和免疫受体酪氨酸活化基序。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗间皮素单链抗体为间皮素III区的特异性抗体；
优选地，所述间皮素III区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
更优选地，所述抗间皮素III区的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有以下一个或多个特征：
所述信号肽选自CD8信号肽、CD28信号肽和CD4信号肽；优选地，所述信号肽是CD8信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述长50个氨基酸残基以上的铰链区选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰链区和IgG4Fc CH2CH3铰链区；优选地，所述铰链区是CD8α铰链区或IgG4Fc CH2CH3铰链区；更优选地，所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述IgG4Fc CH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种；优选地，所述跨膜区为CD8跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述共刺激信号分子胞内结构域选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS和DAP10胞内结构域中的一种或多种；优选地，所述共刺激信号分子胞内结构域是CD28胞内结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，或所述共刺激信号分子胞内结构域是CD137胞内结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；和
所述免疫受体酪氨酸活化基序为CD3ζ和/或FcεRIγ的酪氨酸活化基序；优选地，所述免疫受体酪氨酸活化基序为CD3ζ酪氨酸活化基序，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
4.如权利要求1－3中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有CD8信号肽、抗间皮素III区单链抗体、CD8铰链区或IgG4FcCH2CH3铰链区、CD8跨膜区、CD28胞内结构域和CD3ζ酪氨酸活化基序；或
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。
5.一种多核苷酸序列，选自：
(1)编码权利要求1－4中任一项所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列；和
(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；
优选地，所述多核苷酸序列选自SEQ ID NO:14所示的多核苷酸序列或其互补序列。
6.一种核酸构建物，其含有权利要求5所述的多核苷酸序列；
优选地，所述核酸构建物是表达载体；
更优选地，所述表达载体是真核表达载体，优选含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty的转座元件。
7.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞含有权利要求6所述的核酸构建物，或表达权利要求1－4中任一项所述的嵌合抗原受体；
优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞；更优选地，所述宿主细胞为T细胞；更优选地，所述宿主细胞为原代培养T细胞。
8.权利要求1－4所述的嵌合抗原受体和/或其编码序列和/或权利要求6所述的核酸构建物在制备用于治疗或预防癌症的重组宿主细胞中的应用；以及权利要求7所述的重组宿主细胞在制备治疗或预防癌症用的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述癌症为其癌细胞表面异常表达间皮素的癌症；优选地，所述癌症选自：腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌；更优选地，所述癌症是间皮素和CA125/MUC16同时高表达的癌症。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求7所述的重组宿主细胞和药学上可接受的载体。
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