CN111097043B - 一种胃癌药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种胃癌药物组合物及其应用，所述药物组合物包括抗PSCA CAR‑T细胞。本发明采用抗PSCA的CAR‑T细胞靶向胃肿瘤细胞，在体内外实现了对不同类型的胃肿瘤细胞的杀伤作用，有效控制了异种移植胃癌小鼠模型中的肿瘤生长，为胃癌治疗中由于肿瘤异质性导致的治疗失败提供了新的治疗思路。

Description

一种胃癌药物组合物及其应用
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，属于肿瘤的细胞免疫治疗技术领域，涉及一种胃癌药物组合物及其应用。
背景技术
胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，发病存在明显的地域性差别，我国西北部与东部沿海地区是胃癌的高发区。胃癌的好发年龄在50岁以上，男女比例约为2:1。由于饮食结构、工作压力以及幽门螺杆菌感染等原因，近年来胃癌呈现年轻化趋势。胃癌可发生于胃的任何部位，其中半数以上发生于胃窦部、胃大弯、胃小弯及前后壁。绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或仅出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等慢性胃病症状相似，易被忽略，因此，胃癌被确诊时，通常已发展为晚期。目前我国胃癌的早期诊断率较低，对于早期诊断的患者，化疗、放疗、靶向治疗或联合治疗的方法可以显著提高治愈率。不幸的是，由于胃癌确诊时通常已处于晚期，患者对先前疗法的应答率降低。因此，寻找新的更有效的治疗方法是目前科学家们亟需解决的问题。
嵌合抗原受体(CAR)是基因修饰的受体，可将T细胞重定向至肿瘤表面抗原。CAR分子最初产生于1980年代末，到2010年代初得到迅猛发展。目前，常见的CAR分子通常包括细胞外抗原结合结构域、细胞内信号传导结构域和一个或两个额外的细胞内共刺激信号传导结构域。临床使用时，首先从患者或者健康供体中获取T细胞，对其进行基因编辑以表达特定的受体蛋白，在体外扩增后注入患者体内。作为活体药物，CAR-T细胞疗法正迅速发展成为治疗血液学和非血液学恶性肿瘤最有前景的新疗法之一。2017年，FDA批准了诺华的Tisagenlecleucel用于治疗儿童B细胞前体急性淋巴细胞白血病(ALL)，批准了Kite的Axicabtagene ciloleucel用于治疗成人弥漫性大B细胞淋巴瘤，推动了CAR-T细胞疗法的迅猛发展。CAR-T疗法在治疗血液肿瘤中取得的惊人成果，鼓励和激发着更多的科学家投入到实体瘤的研究中。人们期待，CAR-T疗法也能在实体瘤中获得相似的成功，因此，越来越多的临床前和临床试验正如火如荼地进行着。
目前，靶向胃癌的CAR-T包括EpCAM、claudin和mesothelin，部分已在临床前试验阶段取得了较好的治疗效果。众所周知，实体瘤免疫治疗的一个重大障碍在于抗原异质性，同一种抗原在不同患者中的分布差异较大，同一患者的肿瘤中，不同抗原的表达差异也较大。因此，寻找更多有效的胃癌治疗靶点迫在眉睫。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种胃癌药物组合物及其应用，所述药物组合物在体内外对胃肿瘤细胞具有良好的杀伤效果，能够有效清除肿瘤，为胃癌治疗中由于肿瘤异质性导致的治疗失败提供了新的治疗思路。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种胃癌药物组合物，所述药物组合物包括抗PSCA CAR-T细胞。
本发明中，前列腺干细胞抗原PSCA是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的细胞表面蛋白，属于Thy-1/Ly-6家族，采用抗PSCA的CAR-T细胞靶向胃肿瘤细胞，在体内外实现了对胃肿瘤细胞的杀伤作用，有效清除了肿瘤组织，为临床患者提供了更多的生机和希望。
优选地，所述抗PSCA CAR-T细胞的CAR分子包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。
优选地，所述抗原结合结构域包括抗PSCA单链抗体。
本发明中，采用抗PSCA单链抗体作为CAR分子的胞外抗原结合结构域，由此制备的抗PSCA CAR-T细胞对胃肿瘤细胞具有显著的细胞毒性作用，并在异种移植胃癌小鼠模型中实现了对肿瘤的有效控制。
优选地，所述抗PSCA单链抗体包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVRFIHWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSSPFTFGQGTKVEIKGSTS。
优选地，所述铰链区包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2：
GGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
优选地，所述跨膜结构域包括CD28。
本发明中，跨膜结构域为CD28的完整信号结构，由CD28胞外区、CD28跨膜区和CD28胞内区组成。
优选地，所述CD28包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:3：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV。
优选地，所述胞内信号传导结构域包括CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD3ζ和DAP10。
优选地，所述CD3ζ包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:4：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSFE。
优选地，所述DAP10包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:5：
LCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG。
优选地，所述CAR分子还包括信号肽，所述信号肽包括GM-CSF信号肽和/或CD8α信号肽，优选为GM-CSF信号肽。
优选地，所述GM-CSF信号肽包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:6：
METDTLLLWVLLLWVPGSTG。
优选地，所述CAR分子由GM-CSF信号肽、抗PSCA单链抗体、铰链区、CD28、CD3ζ和DAP10串联组成。
优选地，所述CAR分子包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:7：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVRFIHWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSSPFTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYIHWVRQAPGKGLEWVAWIDPENGDTEFVPKFQGRATISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCKTGGFWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSFELCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供了一种编码抗PSCA CAR分子的核酸分子。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如第二方面所述的核酸分子。
优选地，所述CAR分子由GM-CSF信号肽、抗PSCA单链抗体、铰链区、CD28、CD3ζ和DAP10串联组成。
优选地，所述GM-CSF信号肽包括如SEQ ID NO:8所示的核酸序列；
SEQ ID NO:8：
atggagacagacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccaccggt。
优选地，所述抗PSCA单链抗体包括如SEQ ID NO:9所示的核酸序列；
SEQ ID NO:9：
gacattcagctgacccaatctccaagctctttgtccgcctctgtgggggatagggtcaccatcacctgcagtgccagttcaagtgtaagattcattcactggtaccagcagaaaccaggaaaagctcccaaaagactcatctatgacacatccaaactggcttctggcgtcccttctaggttcagtggctccgggtctgggacagacttcaccctcaccattagcagtctgcagccggaagatttcgccacctattactgtcagcagtggagtagtagcccattcacgttcggacaggggaccaaggtggagataaaaggcagtactagcggcggtggctccggaggcggctccggaggtggcggcagctcagaggttcagctggtggagtctgggggtggccttgtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgcgcagcttctggcttcaacattaaagactactatatacactgggtgcgtcaggcccctggtaagggcctggaatgggttgcatggattgatcctgagaatggtgacactgaatttgtcccgaagttccagggccgtgccactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgtaaaacgggggggttctggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcgagcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgc。
优选地，所述铰链区包括如SEQ ID NO:10所示的核酸序列；
SEQ ID NO:10：
ggcggaggtagctctggcggtggatccggcgggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa。
优选地，所述CD28包括如SEQ ID NO:11所示的核酸序列；
SEQ ID NO:11：
attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc。
优选地，所述CD3ζ包括如SEQ ID NO:12所示的核酸序列；
SEQ ID NO:12：
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。
优选地，所述DAP10包括如SEQ ID NO:13所示的核酸序列；
SEQ ID NO:13：
ctgtgcgcacgcccacgccgcagccccgcccaagaagatggcaaagtctacatcaacatgccaggcaggggc。
优选地，所述表达载体包括病毒载体。
优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。
第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用如第三方面所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。
优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合。
第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的药物组合物的制备方法，所述方法包括将如第二方面所述的核酸分子、如第三方面所述的表达载体或如第四方面所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。
第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的药物组合物、如第二方面所述的核酸分子、如第三方面所述的表达载体或如第四方面所述的重组慢病毒在制备胃癌治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的anti-PSCA CAR-T细胞对不同类型的胃肿瘤靶细胞BGC-823-GL、KATO-Ⅲ-GL和MKN28-GL均具有显著的杀伤作用；
(2)本发明的anti-PSCA CAR-T与BGC-823或MKN28-GL细胞共培养后，CAR-T细胞表现出上调的激活标记，并分泌出丰富的细胞因子，增强了T细胞的免疫力；
(3)本发明的anti-PSCA CAR-T细胞可以有效控制异种移植胃癌小鼠模型中的肿瘤生长，为胃癌治疗中由于肿瘤异质性导致的治疗失败提供了新的治疗思路。
附图说明
图1为体外比较anti-PSCA CAR-T和GFP-T对胃肿瘤靶细胞BGC-823-GL、KATO-Ⅲ-GL和MKN28-GL的杀伤效果；
图2为体外比较anti-PSCA CAR-T和GFP-T的细胞因子分泌能力；
图3(A)为胃癌细胞系BGC823的动物实验实施示意图，图3(B)为肿瘤体积(TumorVolume)变化曲线，图3(C)为第44天(处死当天)的肿瘤体积，图3(D)为不同处理组的肿瘤重量(Tumor Weight)，图3(E)为不同处理组的肿瘤中T细胞的比例(T cells in tumor)，图3(F)为不同处理组的外周血中T细胞的比例(T cells in PB)，图3(G)为对应的流式图，图3(H)为不同处理组的脾脏中T细胞的比例(T cells in spleen)，图3(I)为对应的流式图；
图4(A)为胃癌细胞系MKN-28的动物实验实施示意图，图4(B)为肿瘤体积(TumorVolume)变化曲线，图4(C)为第44天(处死当天)的肿瘤体积，图4(D)为不同处理组的肿瘤重量(Tumor Weight)，图4(E)为不同处理组的肿瘤中T细胞的比例(T cells in tumor)，图4(F)为不同处理组的外周血中T细胞的比例(T cells in PB)，图4(G)为对应的流式图，图4(H)为不同处理组的脾脏中T细胞的比例(T cells in spleen)，图4(I)为对应的流式图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1抗PSCA CAR-T细胞的制备
(1)CAR分子慢病毒载体的构建
基因合成由GM-CSF信号肽、抗PSCA单链抗体(single chain variable fragment，scFv)、铰链区、CD28、CD3ζ和DAP10组成的CAR分子，核酸序列如SEQ ID NO:8～13所示，并在CAR分子的C端添加限制性内切酶Pme1的识别位点，N端添加限制性内切酶Spe1的识别位点，合成的基因序列暂时连接在PUC57载体上；
采用Pme1和Spe1双酶切，分别获得线性化的CAR分子和Pwpxld-eGFP序列，琼脂糖凝胶电泳后回收上述片段；
采用TAKARA的solution 1，将线性化的CAR分子和Pwpxld-eGFP连接，获得环状质粒；
将环状质粒转化到stbl3感受态大肠杆菌中，涂板、挑选单克隆后扩大培养，去除内毒素质粒小提，获得低内毒素的质粒溶液。
(2)重组慢病毒包装
①复苏293T细胞，用DMEM高糖培养基(GIBCO)+10％FBS+1％PS进行培养，传至2-3代；
②当10mm培养皿中的293T细胞密度达到70％～80％时，更换培养基为DMEM+1％FBS+1％PS培养基，使细胞饥饿2-6小时；
③饥饿处理后，采用PEI将pWPXLD-antiPSCA-CD28-CD3ζ-DAP10-2A-eGFP或Pwpxld-eGFP(对照组)，与pMD2.G辅助质粒和psPAX2共同转导入293T细胞，体系如表1所示：
表1
Figure BDA0002364629700000101
Figure BDA0002364629700000111
④质粒转染6小时后进行换液，再分别经过24、48和72小时后，收集培养基上清；
⑤培养基上清收集完毕后，将含有病毒的培养基上清在2000g下离心10min，用0.45μm微孔滤膜过滤，得到重组慢病毒，4℃暂存备用。
(3)T细胞激活和慢病毒转导
①采用Ficoll密度梯度离心法从外周血中分离出单核细胞(PBMC)，然后用美天旎的Pan-T磁珠分选出T细胞；
②采用预包被CD2、CD3和CD28抗体的磁珠(美天旎)激活T细胞48小时；
③将激活的T细胞去磁珠操作后，用重组慢病毒转导，同时加入6μg/mL的polybrene，转导24h后，300g离心5min去除病毒，用T551+10％培养基+1％PS+300IU/mL IL2的培养基进行扩大培养；
④T细胞去病毒后培养48小时，流式细胞仪检测CAR-T细胞的比例；细胞扩增时的浓度约为1×106/mL，隔天进行半量换液，培养到10～14天进行细胞冻存。
实施例2体外检测anti-PSCA CAR-T细胞对胃肿瘤细胞的杀伤能力
(1)将实施例1制备的anti-PSCA CAR-T细胞和GFP-T细胞分别与靶细胞BGC-823-GL、KATO-Ⅲ-GL以及MKN28-GL以不同的比例共孵育18～24小时，用荧光素酶底物检测活细胞比例，CAR-T细胞和肿瘤细胞的效靶比为2:1、1:1、1:2或1:4，靶细胞量为1×104个/孔(96孔板)，孵育体积为200μL；
(2)共孵育完成后，取100μL孵育上清暂存于-20℃，检测细胞因子的分泌量；
(3)将100×的荧光素钠盐用PBS稀释到2×后，每孔100μL加入到步骤(2)剩余的细胞液中，充分混匀，同时避免气泡产生，37℃孵育5～10min，采用荧光照度计检测RLU(relative light unit)；
细胞杀伤比例的计算公式为：
细胞杀伤比例＝(1-试验孔读数/对照孔读数)×100％
结果如图1所示，anti-PSCA CAR-T细胞在体外对不同类型的胃肿瘤靶细胞BGC-823-GL、KATO-Ⅲ-GL和MKN28-GL均具有显著的杀伤作用。
实施例3体外检测anti-PSCA CAR-T和GFP-T的细胞因子分泌能力
(1)将实施例2步骤(2)暂存于-20℃的培养上清液取出，解冻后稀释相应比例；
(2)采用细胞因子检测试剂盒(ebioscience)分别检测上清液中IL-2、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的含量。
结果如图2所示，anti-PSCA CAR-T较GFP-T具有明显提高的IL-2、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α分泌能力。
实施例4体内评估anti-PSCA CAR-T的肿瘤杀伤能力
(1)将5×105个BGC823细胞皮下移植到NSI小鼠左侧腹股沟，构建胃癌肿瘤小鼠模型，建模小鼠共计25只；
(2)定期测量小鼠的肿瘤结节大小，移植20天后将小鼠分为5组，每组5只，其中，第一组设置为阴性对照组，第二组尾静脉注射2×106个GFP-T细胞，第三组癌旁注射2×106个GFP-T细胞，第四组尾静脉注射2×106个anti-PSCA CAR-T细胞，第五组癌旁注射2×106个anti-PSCA CAR-T细胞；
(3)每周测量2次肿瘤大小，并记录追踪肿瘤生长曲线；
(4)移植44天后测量肿瘤大小，随后处死小鼠，取肿瘤、脾脏和外周血，测量肿瘤重量，分别检测外周血、脾脏和肿瘤中的T细胞的比例。
动物实验实施示意图如图3(A)所示，肿瘤体积(Tumor Volume)变化曲线如图3(B)所示，第44天(处死当天)的肿瘤体积如图3(C)所示，肿瘤重量(Tumor Weight)如图3(D)所示，肿瘤中T细胞的比例(T cells in tumor)如图3(E)所示，外周血中T细胞的比例(Tcells in PB)如图3(F)所示，对应的流式图如图3(G)所示，脾脏中T细胞的比例(T cellsin spleen)如图3(H)所示，对应的流式图如图3(I)所示。
可以看出，癌旁注射的anti-PSCA CAR-T细胞可以显著抑制胃癌细胞BGC823在体内的扩增。
实施例5体内评估anti-PSCA CAR-T的肿瘤杀伤能力
(1)将2.5×106个MKN-28细胞皮下移植到NSI小鼠左侧腹股沟，构建胃癌肿瘤小鼠模型，建模小鼠共计25只；
(2)定期测量小鼠的肿瘤结节大小，移植35天后将小鼠分为5组，每组5只，其中，第一组设置为阴性对照组，第二组尾静脉注射2×106个GFP-T细胞，第三组癌旁注射2×106个GFP-T细胞，第四组尾静脉注射2×106个anti-PSCA CAR-T细胞，第五组癌旁注射2×106个anti-PSCA CAR-T细胞；
(3)每周测量2次肿瘤大小，并记录追踪肿瘤生长曲线；
(4)移植64天后测量肿瘤大小，随后处死小鼠，取肿瘤、脾脏和外周血，测量肿瘤重量，分别检测外周血、脾脏和肿瘤中的T细胞的比例。
动物实验实施示意图如图4(A)所示，肿瘤体积(Tumor Volume)变化曲线如图4(B)所示，第64天(处死当天)的肿瘤体积如图4(C)所示，肿瘤重量(Tumor Weight)如图4(D)所示，肿瘤中T细胞的比例(T cells in tumor)如图4(E)所示，外周血中T细胞的比例(Tcells in PB)如图4(F)所示，对应的流式图如图4(G)所示，脾脏中T细胞的比例(T cellsin spleen)如图4(H)所示，对应的流式图如图4(I)所示。
可以看出，癌旁注射的anti-PSCA CAR-T细胞可以显著抑制胃癌细胞MKN-28在体内的扩增。
综上所述，本发明的anti-PSCA CAR-T细胞对不同类型的胃肿瘤靶细胞BGC-823-GL、KATO-Ⅲ-GL和MKN28-GL均具有显著的杀伤作用，通过分泌细胞因子IL-2、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α，增强了T细胞的免疫力；所述anti-PSCA CAR-T细胞可以有效控制异种移植胃癌小鼠模型中的肿瘤生长，在体内外实现了对胃肿瘤细胞的杀伤作用，为胃癌治疗中由于肿瘤异质性导致的治疗失败提供了新的治疗思路。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司
<120> 一种胃癌药物组合物及其应用
<130> 20200110
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Phe Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser
100 105 110
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro
1 5 10 15
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
20 25 30
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
35 40 45
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
50 55 60
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
65 70 75 80
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
85 90 95
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
100 105 110
Leu Ser Pro Gly Lys
115
<210> 3
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
Thr Ser Phe Glu
115
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<211> 24
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
20
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 7
<211> 637
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser
35 40 45
Val Arg Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser
100 105 110
Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
130 135 140
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
165 170 175
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
180 185 190
Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Phe Val Pro Lys Phe
195 200 205
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Lys Thr Gly Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250 255
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
275 280 285
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
290 295 300
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
305 310 315 320
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
325 330 335
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
340 345 350
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
355 360 365
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
370 375 380
Pro Gly Lys Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu
385 390 395 400
Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His
405 410 415
Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val
420 425 430
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
435 440 445
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
450 455 460
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
465 470 475 480
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
485 490 495
Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
500 505 510
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
515 520 525
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
530 535 540
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
545 550 555 560
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
565 570 575
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
580 585 590
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
595 600 605
Arg Thr Ser Phe Glu Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln
610 615 620
Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
625 630 635
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccaccggt 60
<210> 9
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gacattcagc tgacccaatc tccaagctct ttgtccgcct ctgtggggga tagggtcacc 60
atcacctgca gtgccagttc aagtgtaaga ttcattcact ggtaccagca gaaaccagga 120
aaagctccca aaagactcat ctatgacaca tccaaactgg cttctggcgt cccttctagg 180
ttcagtggct ccgggtctgg gacagacttc accctcacca ttagcagtct gcagccggaa 240
gatttcgcca cctattactg tcagcagtgg agtagtagcc cattcacgtt cggacagggg 300
accaaggtgg agataaaagg cagtactagc ggcggtggct ccggaggcgg ctccggaggt 360
ggcggcagct cagaggttca gctggtggag tctgggggtg gccttgtgca gccagggggc 420
tcactccgtt tgtcctgcgc agcttctggc ttcaacatta aagactacta tatacactgg 480
gtgcgtcagg cccctggtaa gggcctggaa tgggttgcat ggattgatcc tgagaatggt 540
gacactgaat ttgtcccgaa gttccagggc cgtgccacta taagcgcaga cacatccaaa 600
aacacagcct acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 660
aaaacggggg ggttctgggg tcaaggaacc ctggtcaccg tctcgagcga gcccaaatct 720
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 750
<210> 10
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
ggcggaggta gctctggcgg tggatccggc gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 60
ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 120
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 180
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 240
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 300
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 351
<210> 11
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120
tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240
atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 300
gacttcgcag cctatcgctc c 321
<210> 12
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 13
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
ctgtgcgcac gcccacgccg cagccccgcc caagaagatg gcaaagtcta catcaacatg 60
ccaggcaggg gc 72

Claims (1)

1.抗PSCA CAR-T细胞在制备胃癌治疗药物中的应用；
所述抗PSCA CAR-T细胞的CAR分子包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域和胞内信号传导结构域；
所述CAR分子由GM-CSF信号肽、抗PSCA单链抗体、铰链区、CD28、CD3ζ和DAP10串联组成；
所述CAR分子的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
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