CN110117329B - 包含趋化因子与结合伴侣的融合多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域。具体的，本发明涉及的分离的多肽，所述分离的多肽包含第一和第二部分，所述第一部分包含趋化因子或其功能性片段，所述第二部分包含能够与抗原特异性结合的结合伴侣。更具体地，所述趋化因子为CCL19。本发明还涉及编码该分离的多肽的核酸分子、包含该核酸分子的载体和包含该载体的宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生该分离的多肽的方法。最后，本发明涉及包含该分离的多肽、核酸分子、载体和/或宿主细胞的药物组合物，特别用于杀伤肿瘤细胞以及治疗癌症。

Description

包含趋化因子与结合伴侣的融合多肽及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体的，本发明涉及一种分离的多肽，所述分离的多肽包含第一和第二部分，所述第一部分包含趋化因子或其功能性片段，所述第二部分包含能够与抗原特异性结合的结合伴侣。更具体地，所述趋化因子为CCL19。本发明还涉及编码该分离的多肽的核酸分子、包含该核酸分子的载体和包含该载体的宿主细胞。本发明进一步涉及用于产生该分离的多肽的方法。最后，本发明涉及包含该分离的多肽、核酸分子、载体和/或宿主细胞的药物组合物，特别用于杀伤肿瘤细胞以及治疗癌症。

发明背景

近几十年来，世界范围内肿瘤的发病率和病死率越来越高。虽然针对肿瘤的治疗手段有了很多新的进展，但绝大多数肿瘤患者仍无法获得根治，容易复发和转移，恶性肿瘤患者的生存时间和生活质量始终较低。近年来各种免疫治疗方法以及药物发展迅速，在抗体、免疫调节剂以及细胞治疗等各方面都取得重大进展。例如针对CD20的单克隆抗体、针对CD19、CD33的嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR-T)，在急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗中都展现了巨大的应用前景。但在实体瘤方面，由于肿瘤特异性抗原的缺乏和肿瘤抑制微环境的存在，使得各类疗法的效果均不甚理想。

单克隆抗体是指由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，简称单抗。最早被用于疾病治疗是在1982年，美国斯坦福医学中心Levy等人利用制备的抗独特型单抗治疗B细胞淋巴瘤，治疗后患者病情缓解，瘤体消失。在实体瘤方面，针对HER2+的乳腺癌的曲妥珠单抗(赫赛汀)也在临床广泛应用。但随着使用单抗进行治疗的病例数的增加，药物抗性的问题也越来越明显。一般认为ADCC是抗体发挥杀伤作用的重要机制，单抗通过Fc段与效应细胞表面激活性受体FcYR I/FcYR III结合发挥杀伤作用，但具有免疫杀伤作用的T细胞因为表面缺乏上述受体而不能被有效介导，从而削弱了机体对肿瘤的免疫效应。同时单克隆抗体分子量大，难以穿透肿瘤组织，这些弊端均限制了单抗的应用。因此使抗体小型化的同时，又要使抗体更有效的刺激机体的免疫系统，方能降低耐药性的产生。

肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)的概念是在长期的研究中逐步发展形成的。肿瘤干细胞是指癌瘤组织中少量存在的具有自我更新能力及分化潜能的细胞，该群细胞属于成体干细胞的范畴且自我更新失控。研究认为肿瘤干细胞是肿瘤形成的起始细胞，可能是肿瘤发生、发展、转移及复发的根源。目前研究表明，肿瘤干细胞存在于包括白血病、乳腺癌、脑肿瘤、结直肠癌及胰腺癌等恶性肿瘤中。而对肝细胞肝癌的研究显示肝细胞癌的发生发展过程中也有肿瘤干细胞的参与。寻找特异性的表面标记物，通过其分选肿瘤干细胞，是进一步研究肿瘤发生、转移、复发和预后的关键。众多研究显示，CD133为肿瘤干细胞表面特异标记分子。人CD133基因位于4号染色体，基因全长约160kb，包含至少约37个外显子。通过细胞表面标记CD133分子，可有效地识别和鉴定多种肿瘤的肿瘤干细胞，从而对肿瘤干细胞的特性进行分析。并且CD133与肿瘤的转移、肿瘤的血管生成都有关系，因而认为CD133可以作为某些肿瘤的预后指标。而对肝癌干细胞的研究表明CD133抗原是肝癌干细胞的表面标记物。

本领域需要可以打破肿瘤的免疫抑制微环境，募集机体免疫细胞浸润到肿瘤组织内的活性表达产物并进一步提高抗肿瘤作用的构建体。

发明内容

在第一方面，本发明提供一种分离的多肽，所述多肽包含第一和第二部分，所述第一部分包含趋化因子或其功能性片段，所述第二部分包含能够与抗原特异性结合的结合伴侣。

在第二方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码本发明的多肽。

在第三方面，本发明提供一种载体，其包含本发明的多核苷酸。

在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或本发明的载体。

在第五方面，本发明提供一种产生多肽的方法，其包括培养本发明的宿主细胞。

在第六方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的多肽和药学上可接受的载体。

在第七方面，本发明提供本发明的多肽或本发明的药物组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤或癌症的药物中的用途。

在第八方面，本发明提供一种预防和/或治疗肿瘤或癌症的方法，包括给对象施用治疗有效量的本发明的多肽或本发明的药物组合物。

在第九方面，本发明提供一种试剂盒，其包含本发明的多肽或本发明的药物组合物。

附图说明

图1.CCL19-PSCA scFv基因片段的琼脂糖凝胶电泳。泳道1：克隆入pUC57质粒的人CCL19基因片段(1128bp)；泳道2：人源化抗PSCA scFv基因片段(783bp)；泳道3：CCL19-PSCAscFv基因片段(381bp)；M：Marker。

图2.CCL19-PSCA scFv基因片段琼脂糖凝胶电泳。泳道1：连接入pcDNA3.1表达质粒的人CCL19基因片段(1128bp)；泳道2：人源化抗PSCA scFv基因片段(783bp)；泳道3：CCL19-PSCA scFv基因片段(381bp)；M：Marker。

图3.CCL19-PSCA scFv结构示意图。

图4.pcDNA3.1-CCL19-PSCA scFv蛋白表达载体示意图。

图5.IL7-CCL19-CD133 scFv基因片段的琼脂糖凝胶电泳。泳道1：人工合成并克隆连接入pcDNA3.1表达质粒的人源化抗CD133 scFv基因片段(813bp)；泳道2：人IL7-CCL19基因片段(963bp)；泳道3：IL7-CCL19-CD133 scFv基因片段(1724bp)；M：Marker。

图6.IL7-CCL19-CD133 scFv结构示意图。

图7.pcDNA3.1-IL7-CCL19-CD133 scFv蛋白表达载体示意图。

图8.纯化后SDS-PAGE的电泳鉴定。泳道1-2：CCL19-PSCA scFv(40.7kDa)；泳道3-4：PSCA scFv(27.8kDa)；泳道5-6：CCL19(14kDa)；M：Marker。

图9.CCL19-PSCA scFv的western blot分析。泳道1：CCL19(40.7KDa)；泳道2：PSCAscFv(27.8KDa)；泳道3：CCL19-PSCA scFv(14KDa)；M：Marker。

图10.蛋白纯化后SDS-PAGE电泳鉴定。泳道1：IL7-CCL19(36.3KDa)；泳道2：CD133scFv(29KDa)；泳道3：IL7-CCL19-CD133 scFv(63.9KDa)；M：Marker。

图11.IL7-CCL19-CD133 scFv的western blot分析。泳道1：IL7-CCL19-CD133scFv(63.9KDa)；泳道2：IL7-CCL19(36.6KDa)；泳道3：CD133 scFv(29KDa)；M：Marker。

图12.CCL19-PSCA scFv结合曲线及Scatchard分析。

图13.IL7-CCL19-CD133 scFv结合曲线及Scatchard分析。

图14.竞争性免疫荧光抑制试验结果及流式细胞术分析。

图15.竞争性免疫荧光抑制试验结果及流式细胞术分析。

图16.CCL19、PSCA scFv、CCL19+PSCA scFv、CCL19-PSCA scFv介导的CTL细胞毒活性。

图17.IL7-CCL19、CD133 scFv、IL7-CCL19+CD133 scFv、IL7-CCL19-CD133 scFv介导的CTL细胞毒活性。

图18.CCL19、PSCA scFv、CCL19+PSCA scFv、CCL19-PSCA scFv介导的细胞因子释放。

图19.IL7-CCL19、CD133 scFv、IL7-CCL19+CD133 scFv、IL7-CCL19-CD133 scFv介导的细胞因子IFN-γ释放。

图20.IL7-CCL19、CD133 scFv、IL7-CCL19+CD133 scFv、IL7-CCL19-CD133 scFv介导的细胞因子IL-2释放。

图21.CCL19、PSCA scFv、CCL19+PSCA scFv、CCL19-PSCA scFv对NOD/SCID荷瘤小鼠的治疗作用。

图22.小鼠肿瘤组织的免疫组化染色。其中A组为CCL19-PSCA scFv治疗组，B组为PSCA scFv治疗组，自左至右依次为HE染色，抗CD3染色，抗CD19染色，抗CD56染色。

图23.IL7-CCL19、CD133 scFv、IL7-CCL19+CD133 scFv、IL7-CCL19-CD133 scFv对NOD/SCID荷瘤小鼠的治疗作用研究。

发明详述

定义

除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook等人，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual”(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin，“Genes IV”，Oxford University Press，New York，(1990)；及Roitt等人，“Immunology”(第2版)，Gower Medical Publishing，London，New York，(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。

氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸编码加以表示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与另一序列相比，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在取代的情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。所述保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如保守氨基酸取代优选是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。

两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。对于序列相同性的确定，可以参见例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of SequenceData，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，NewYork，1991。

一般而言，“特异性”是指结合至抗原特定结合位点的能力，当特定结合位点的数量越少，则“特异性”的程度越大。“特异性”程度可以通过经典的免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。通常，任何大于10^-4M的Kd值一般都视为指示非特异性结合。

一般而言，术语“竞争性”“竞争可能性”指不同抗体结合同一抗原所存在的竞争，其可通过本领域常规实验测得。根据非限制性理论，两个存在较高竞争可能性的抗体结合抗原相同或相关的(例如结构类似或空间接近)的表位。

术语“分离”，当应用于多肽或多核苷酸时，指多肽或多核苷酸基本上不含与其在天然状态下相关的其他细胞组分。它可以是一个均匀的状态，尽管它可以在干燥或水溶液中。均匀性或者分子是否被分离可以使用分析化学技术测定，如聚丙烯酰胺凝胶电泳法或高效液相色谱法。存在于制剂中的主要种类的多肽是基本上分离的。术语“分离”指多肽或多核苷酸在电泳凝胶中基本上产生一个条带。尤其是，其指多肽或多核苷酸在一些实施方式中至少大约50％纯净，在一些实施方式中至少大约85％纯净，并且在一些实施方式中至少大约99％纯净。

如在此使用的术语“处置”、“治疗”或“疗法”指减轻或消除疾病和/或其伴随的症状的方法。如在此使用的术语“阻止”、“预防”或“防止”指将受试者排出在获得疾病和/或其伴随的症状之外的方法。在某些实施方式中，术语“阻止”、“预防”或“防止”指降低获得疾病和/或其伴随的症状的风险的方法。

在药理学意义上，在本发明的上下文中，组合物的“有效量”指有效用于组合物有效的治疗的疾病的预防或治疗的量。“疾病”指将从使用该组合物进行治疗中受益的任一状态。

用于治疗目的的“对象”为人或非人哺乳动物，其中所述非人哺乳动物包括非人灵长类、驯养和饲养动物，以及动物园、运动或宠物动物，如狗、猫、牛、猪、马、羊、小鼠、大鼠等。优选地，所述对象是人。

术语“抑制”是指与参考药剂相比，如果反应或疾病在一种药剂的施用后在数量上减少了，或者如果在一种药剂的施用后其减少了，则该药剂抑制反应或疾病。类似地，术语“防止”不必需指药剂完全消除反应或疾病，只要反应或疾病的至少一个特征被消除即可。因此，降低或防止感染或反应(如病理学反应)的组合物可以但是不必需完全消除该感染或反应，只要所述感染或反应在缺乏药剂或相对于参考药剂(即至10％以下)时，可测量地减少，例如，所述感染或反应的至少大约50％，如至少大约70％或大约80％，或者甚至大约90％即可。

趋化因子-结合伴侣的分离的多肽

本申请提供一种分离的多肽，其中所述分离的多肽包含第一部分以及第二部分，所述第一部分由趋化因子或其功能性片段组成，所述第二部分由能够与抗原特异性结合的结合伴侣组成。

趋化因子已被证明介导一些涉及运动性、侵入、粘附、增殖和存活的细胞功能。在适当水平和表达下，这些趋化性细胞因子促进适当的伤口愈合、新血管形成或免疫力。如果不适当地表达，这些因素可决定慢性疾病，如瘢痕形成、血管再生、癌细胞的转移/耐药性、自身免疫性、移植排斥、炎症(例如关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、多发性硬化、COPD等)、糖尿病。有益和有害的功能通过趋化因子受体(其为A、G类蛋白偶联受体)的结合和活化来调节。CCL19属于CC类趋化因子，又称EB病毒诱导分子、人巨噬细胞炎性蛋白3β，主要在次级淋巴组织和器官如脾脏和淋巴结的T细胞中表达，能够强力趋化幼稚T细胞、成熟DC细胞、巨噬细胞、NK细胞等免疫细胞。其特异性受体CCR7不仅在成熟DC细胞、巨噬细胞、T细胞上表达，同时也在许多肿瘤组织如结直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和头颈部肿瘤中表达。近年来研究发现CCL19/CCR7轴在抑制肿瘤的增殖、迁移及侵袭中发挥重要作用。这可能与CCL19趋化树突状细胞、T细胞、巨噬细胞、NK细胞等免疫细胞浸润到肿瘤组织中并发挥抗原呈递、吞噬和分泌细胞因子、细胞毒性等作用有关。

在一些实施方式中，所述第一部分由选自人CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL16、XCL1、XCL2、CX3CL1和它们的功能性变体的趋化因子或其功能性片段组成。如在此使用的，本文记录的每个趋化因子指趋化因子的所有异构体。在一些实施方式中，所述趋化因子部分包括CCL19或其功能性变体。在一些具体实施方式中，所述趋化因子部分为CCL19。在一些具体实施方式中，所述CCL19的编码氨基酸序列示于SEQ ID NO：5。在一些具体实施方式中所述趋化因子部分与SEQ ID NO：5具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性。在一些具体实施方式中，编码所述CCL19的氨基酸序列的核苷酸序列示于SEQ ID NO：6。在一些具体实施方式中编码所述趋化因子部分的氨基酸序列的核苷酸序列与SEQ ID NO：6具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性。

在一些实施方式中，所述第一部分进一步包括一种或多种额外的细胞因子，所述额外的细胞因子位于趋化因子的另一端。在一些实施方式中，所述额外的细胞因子为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、生长因子。在一些实施方式中，所述额外的细胞因子为IL7，即所述趋化因子可进一步与IL7融合。在一些实施方式中，所述IL7的编码氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。IL-7是一种使T细胞保持活性所必须的细胞因子，IL-7向T细胞提供增殖信号并介导T细胞抗原受体(TCR)-y链的基因重组，IL-7介导的抗凋亡和共刺激促增殖效应对初始T细胞的存活至关重要。IL-7介导的抗凋亡和共刺激增殖的信号传导是通过IL-7受体(IL-7R)完成的，IL-7R的表达在T细胞的分化发育过程中受到严密调控，在T细胞被激活后，其表面的IL-7R将会明显下调，IL-7R只会选择性地表达于少数效应T细胞，这些效应T细胞将会转化为中枢记忆性T细胞，因此IL-7对于效应T细胞向记忆性T细胞的转化发挥调控作用。并且，T细胞本身不具备产生IL-7的能力。

在一些实施方案中，所述分离的多肽的第二部分为抗体或抗体片段，其选自scFv、Fab、单结构域抗体(sdAb)、VNAR或VHH。在一些实施方案中，编码所述能够与抗原特异性结合的结合伴侣的核酸是经过密码子优化的，以适合在特定宿主细胞中表达。在一些实施方案中，所述结合伴侣是人或人源化的。sdAb片段可以来源于VHH、VNAR、工程改造的VH结构域或VK结构域。VHH可以由骆驼仅重链抗体产生。VNAR可以由软骨鱼仅重链抗体产生。已经采用多种方法来从常规异二聚体VH和VK结构域产生单体sdAb，包括界面工程改造和特定种系家族的选择。所述scFv包含重链可变区VH和轻链可变区VL，更具体地，所述重链可变区和轻链可变区通过15-20个氨基酸的短肽连接而成的抗体。由于scFv中仅含有全抗的可变区片段，使分子量大大减小，所以免疫原性小，不会产生HAMA反应，且易穿透致密的肿瘤屏障，可进入实体瘤周围的微循环，体内半衰期短，又因为缺乏Fc片段，失去了Fc介导的受体结合作用，使其能快速向靶部位集中且较好的保持了抗原的亲和性。

在一些实施方案中，编码本发明的分离的多肽的核酸分子是经过密码子优化获得的，以适合在特定宿主细胞中表达。在一些实施方案中，编码本发明的分离的多肽中的第一部分或第二部分的核酸分子是经过密码子优化获得的，以适合在特定宿主细胞中表达。在一些实施方案中，本发明的分离的多肽中的结合伴侣是scFv，编码所述scFv的核酸分子是经过密码子优化的。在一些实施方案中，编码所述scFv的VH和/或VL的核酸分子是经过密码子优化的。密码子优化可以具有一个或多个核苷酸残基变化，所述变化导致对特定宿主细胞的偏爱性有所增加以及mRNA高级结构得到优化。

本领域已充分描述了人源化过程(Jones等，1986，Queen等，1989，Riechmann等，1988，Verhoeyen，Milstein和Winter 1988)。术语人源化描述了非人抗体，例如鼠衍生的抗体的抗原结合位点转移至人受体框架，例如人种系序列(Retter等，2005)。抗体或其片段的人源化基本原理可见于使人体内发生针对该抗体的免疫原性应答的风险最小化(Rebello等1999)。这些抗体或其片段经引入另外的突变而被人源化，以降低在人体中潜在的免疫原性，并优化其与T细胞的结合。本发明的人源化抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变，或保守取代以促进稳定性或制造)。在一些实施方案中，本发明的分离的多肽的第一部分或第二部分是经过人源化的。在一些实施方案中，本发明的分离的多肽中的结合伴侣是scFv，所述scFv是经过人源化的。在一些实施方案中，所述scFv的VH和/或VL是经过人源化的。

在一些实施方案中，编码本发明的分离的多肽中的第一部分或第二部分的核酸分子是经过密码子优化以及本发明的分离的多肽中的第一部分或第二部分是人的或经过人源化的。在一些实施方案中，本发明的分离的多肽中的结合伴侣是scFv，编码所述scFv的核酸分子是经过密码子优化以及所述scFv是人的或经过人源化的。在一些实施方案中，编码所述scFv的VH和/或VL的核酸分子是经过密码子优化以及所述scFv的VH和/或VL是人的或经过人源化的。在一些具体实施方案中，所述经过密码子优化和人源化的scFv包含SEQ IDNO：9或11的氨基酸序列。在另一些实施方案中，所述人源化的scFv包含与SEQ ID NO：9或11具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性的氨基酸序列。或者，所述scFv的氨基酸序列与SEQ ID NO：9或11相比包含一或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。优选地，经过密码子优化以及人源化的scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO：10或12所示。在一些实施方案中，多核苷酸与SEQ ID NO：10或12具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性。

在一些实施方案中，编码本发明的分离的多肽的核酸分子是经过密码子优化以及本发明的分离的多肽是人的或经过人源化的。优选地，经过密码子优化以及人源化的分离的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1或3所示。在一些实施方案中，经过密码子优化以及人源化的分离的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或3具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性。或者，所述分离的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或3相比包含一或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。优选地，编码经过密码子优化以及人源化的分离的多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：2或4所示。在一些实施方案中，编码经过密码子优化以及人源化的分离的多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO：2或4具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性。

在另一方面，本发明的能够与抗原特异性结合的结合伴侣还涵盖能够与由SEQ IDNO：9或11的氨基酸序列组成的scFv结合相同表位的结合伴侣。

在一些实施方案中，本发明的所述结合伴侣特异性结合的抗原为PSCA。在一些实施方案中，本发明的所述结合伴侣为PSCA scFv。PSCA作为前列腺癌的特异性膜抗原，具有严格的表达方式。不管是原发性前列腺癌还是转移瘤的肿瘤细胞表面均有PSCA高表达，并且不论在激素依赖性前列腺癌还是非激素依赖性前列腺癌的表达水平与前列腺癌的评分和分期相关联。有研究发现在大多数膀胱癌，胰腺癌和透明细胞肾癌中也有PSCA的表达。

在一些实施方案中，本发明的所述结合伴侣特异性结合的抗原为CD133。在一些实施方案中，本发明的所述结合伴侣为CD133 scFv。

分离的多肽中不同部分的相互协同与各部分的正确的空间构象密切相关。在本领域中，在分离的多肽的构建中可以用“连接肽”来连接分离的多肽的不同部分，使各部分充分展开，互不干扰地充分折叠成各自天然构象。本发明的分离的多肽中的第一部分和第二部分可进一步包含连接子。这也意味着连接子可能不存在，并且第二部分可以直接连接到第一部分。然而，也可以存在第一部分与第二部分的连接子。

在后一种情况中，一般而言，所述连接子可以连接至结合伴侣和趋化因子的任意位置，通常连接在分离的多肽一部分的C-末端和另一部分的N-末端之间。合适的连接子是本领域已知的，并且例如，在Chen等人(2013)“Fusion protein linkers：property，designand functionality”Adv Drug Deliv Rev；65(10)：1357-69中描述。因此，所述连接子可以是本领域已知的任何连接子。

例如，所述连接子可以是通过活化的链侧基如氨基-、硫醇基或羟基与该两种配偶体联接的基于直链或支链烃的部分。所述连接子还可包含环状部分。如果连接部分是基于烃的部分，则连接子的主链可以仅包含碳原子，但也可以含有诸如氧(O)、氮(N)或硫(S)原子的杂原子。例如，所述连接子可以包含C1-C20碳原子链或如具有-(O-CH2-CH2)-重复单元的聚乙二醇基链的聚醚基链。

在一些实施方案中，所述连接子是连接肽。所述连接肽通常是由低疏水性和低电荷效应的氨基酸组成的柔性多肽接头。本领域常用的接头连接肽富含Gly、Ser、Pro、Ala、Thr等氨基酸，尤其是Gly和Ser，但还可包含诸如Thr和Ala的另外的氨基酸来维持柔性，以及诸如Lys和Glu的极性氨基酸来改善溶解度。所述连接肽可包含2个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、或20个或更多个氨基酸残基。所述连接肽可以包含任意氨基酸残基。示例性柔性连接子包括但不限于(GGGGS)n，示例性刚性连接子包括但不限于A(EAAAK)nA。

在一个实施方案中，本发明的分离的多肽包括包含甘氨酸和丝氨酸的连接子。所述连接子可以，例如，包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS((4-甘氨酸1-丝氨酸)4)。在N-末端和/或C-末端，如“甘氨酸-丝氨酸”连接子可进一步包含在结合伴侣和/或趋化因子之间排列的氨基酸。例如，这些另外的氨基酸可以由于用于产生本发明分离的多肽的克隆策略而存在。在一个这样的说明性实例中，诸如(GGGGS)4连接子的“甘氨酸-丝氨酸”连接子可具有另外的N-末端丝氨酸。

因此，本发明的分离的多肽中的第一部分和第二部分可以通过连接子连接。在一个实施方案中，在能够特异性结合抗原的结合伴侣单独由抗体的VH和VL组成的情况下，例如所述结合伴侣为scFv，所述连接子还可以是连接VH和VL的铰链区。在一个实施方案中，在本发明的分离的多肽中的第一部分进一步包括额外的细胞因子的情况下，所述额外的细胞因子通过或不通过连接子与趋化因子的C端/N端连接。

本发明的分离的多肽中的所述第一部分可以位于第二部分的C端或N端。在一些具体实施方式中，所述第一部分可进一步包含额外的细胞因子，所述额外的细胞因子可以位于趋化因子的C端或N端。在一些具体实施方式中，所述第二部分中的VH可以位于VL的C端或N端。在一具体实施方式中，本发明的分离的多肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽从N端到C端具有以下结构：趋化因子-连接肽-结合伴侣的VH-连接肽-结合伴侣的VL。在一些实施方案中，所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽从N端到C端具有以下结构：趋化因子-连接肽-结合伴侣的VL-连接肽-结合伴侣的VH。在一些实施方案中，所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽从N端到C端具有以下结构：结合伴侣的VH-连接肽-结合伴侣的VL-连接肽-趋化因子。在一些实施方案中，所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽从N端到C端具有以下结构：结合伴侣的VL-连接肽-结合伴侣的VH-连接肽-趋化因子。在一些实施方案中，所述分离的多肽的第一部分进一步包括额外的细胞因子，并通过或不通过连接肽与趋化因子的C端/N端连接，例如，从N端到C端为，额外的细胞因子-连接肽-趋化因子-连接肽-结合伴侣的VH-连接肽-结合伴侣的VL；趋化因子-连接肽-额外的细胞因子-连接肽-结合伴侣的VH-连接肽-结合伴侣的VL。在一些实施方案中，编码所述结合伴侣的核酸分子是经过密码子优化的和/或所述结合伴侣是人源化的。

在一些实施方案中，本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽还可以包含适于多肽表达、检测、分离和/或纯化的标签。例如，所述标签包括但不限于His标签(例如His6)、HA标签、GST标签等。

本发明的分离的多肽还可以包括额外的修饰，例如与生物相容性大分子聚合物共价连接，从而延长分离的多肽在体内的半衰期，降低免疫原性，避免蛋白酶的降解或增加可溶性。在一些实施方式中，用聚乙二醇(PEG)修饰本发明的分离的多肽。使用的聚乙二醇可以具有例如约5kD-约50kD、约20kD-约40kD或约20kD的分子量。在一具体的实施方式中，用来修饰分离的多肽的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇。在一更具体的实施方式中，使用单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰本发明的分离的多肽。用PEG修饰蛋白质的方法为本领域技术人员所熟知。

本发明的所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽特异性结合抗原的Kd值可以小于1×10^-5M、优选小于1×10^-6M、更优选小于1×10^-7M。这种用于以Kd测量蛋白质相互作用的方法在本领域是众所周知的，并且包括例如ELISA、流式细胞术、表面等离子体共振法、biacore测量法等。

在本发明范围内，还有与本发明的分离的多肽竞争结合至特定抗原的其他结合分子(参考结合分子)(例如抗体或抗体结合片段)。为了确定竞争性抑制，可以采用本领域普通技术人员已知的各种测定。例如，交叉竞争测定可用于确定抗体或其抗原结合片段是否通过另一种抗体或抗原结合片段竞争性抑制与特定抗原的结合。这些包括采用流式细胞术或固相结合分析的基于细胞的方法。还可以使用评价抗体或其抗原结合片段交叉竞争在细胞表面、固相或溶液相中不表达的特定抗原的能力的其它测定。例如，在实施例7和8中给出了可以测试交叉竞争的测定。在一些实施方案中，在存在参考结合分子的情况下，本发明的所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽竞争对特定抗原表位的竞争性效率占比大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％或大于80％。

在一些实施方案中，本发明的所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽为CCL19-PSCA scFv分离的多肽。在一些实施方案中，本发明的所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。在一些实施方案中，所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性。或者，所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相比包含一或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，所述CCL19-PSCA scFv分离的多肽从N端到C端具有以下结构：CCL19-连接肽-PSCA scFv的VH-连接肽-PSCA scFv的VL；PSCA scFv的VH-连接肽-PSCAscFv的VL-连接肽-CCL 19；CCL19-连接肽-PSCA scFv的VL-连接肽-PSCA scFv的VH，或PSCAscFv的VL-连接肽-PSCA scFv的VH-连接肽-CCL19。在一些具体实施方式中，编码所述PSCAscFv的核酸分子是经过密码子优化的和/或所述PSCA scFv是人源化的。

在一些实施方案中，本发明的所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽为IL7-CCL19-CD133 scFv分离的多肽。在一些实施方案中，本发明的所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的编码氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。在一些实施方案中，所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3具有至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％、甚至更优选地至少99％的序列相同性。或者，所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3相比包含一或多个氨基酸取代，优选保守氨基酸取代。例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，所述IL7-CCL19-CD133 scFv分离的多肽从N端到C端具有以下结构：IL7-连接肽-CCL19-连接肽-CD133 scFv的VH-连接肽-CD133 scFv的VL；CD133 scFv的VH-连接肽-CD133 scFv的VL-连接肽-IL7-连接肽-CCL19；IL7-连接肽-CCL19-连接肽-CD133 scFv的VL-连接肽-CD133 scFv的VH；CD133 scFv的VL-连接肽-CD133 scFv的VH-连接肽-IL7-连接肽-CCL19；CCL19-连接肽-IL7-连接肽-CD133 scFv的VH-连接肽-CD133scFv的VL；CD133 scFv的VH-连接肽-CD133 scFv的VL-连接肽-CCL19-连接肽-IL7；CCL19-连接肽-IL7-连接肽-CD133 scFv的VL-连接肽-CD133 scFv的VH，或CD133 scFv的VL-连接肽-CD133 scFv的VH-连接肽-CCL19-连接肽-IL7。在一些具体实施方式中，编码所述CD133scFv的核酸分子是经过密码子优化的和/或所述CD133 scFv是人源化的。

核酸、载体、宿主细胞

本发明还涉及编码本文提供和描述的所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的核酸分子。本发明还涉及仅编码本文描述和提供的所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的部分的核酸分子，例如，其仅编码分离的多肽的CCL19和/或IL7、PSCA结合蛋白、CD133结合蛋白。例如，本发明涉及根据SEQ ID NO：6、8、10、12的核酸分子或其通过核酸键连接的组合，只要编码根据本发明的分离的多肽或其一部分(例如，CCL19和/或IL7、PSCA结合蛋白、CD133结合蛋白)即可。本发明还涉及这样的核酸分子：与根据SEQ ID NO：6、8、10、12的核酸分子或其通过核酸键连接的组合相比，所述核酸分子中的30、27、24、21、18、15、12、9、6、3或0个核苷酸已被置换(优选不导致翻译的氨基酸变化的沉默突变)、缺失或插入，只要编码根据本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或其一部分(例如，CCL19和/或IL7、PSCA结合蛋白、CD133结合蛋白)即可。原则上，本发明优选涉及编码本文中具体描述和实施的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的核酸。一般来说，SEQ ID NO：12和11分别显示了经过密码子优化及人源化的鼠抗人PSVA scFv的核酸和氨基酸序列；SEQ ID NO：10和9分别显示了经过密码子优化及人源化的鼠抗人CD133 scFv的核酸和氨基酸序列；SEQ ID NO：8和7分别显示了IL-7的人核酸和氨基酸序列，其中描述了IL-7的主要转录物；SEQ ID NO：6和5分别显示了CCL19的人核酸和氨基酸序列，其中描述了CCL19的主要转录物。

如本文所用，除非另有特别定义，术语“核酸”或“核酸分子”与“寡核苷酸”、“核酸链”、“多核苷酸”等同义使用，并且表示包含一个、两个或更多个核苷酸的聚合物。术语“核酸分子”涉及包含嘌呤和嘧啶碱基的由多核苷酸组成的碱基序列，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构。本文中，术语“核酸分子”包括所有种类的核酸，包括DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、DNA的合成形式以及包含两个或更多个这些分子的混合聚合物，并且优选地涉及DNA和cDNA。如本领域技术人员容易理解的，本文提供的核酸序列表示DNA序列，并且还包括相应的RNA序列，其中T被U代替。术语“核酸分子”一般包括正义链和反义链。“核酸分子”还可包括非天然或衍生的核苷酸碱基以及天然或人工核苷酸类似物，例如，为了保护核酸分子免受本领域技术人员容易理解的内切酶和/或外切酶的影响。

根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸是基本上分离的核酸。优选地，编码趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和4所示。在一些实施方案中，编码本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的核酸分子的序列经过密码子优化。在一些实施方案中，编码本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的核酸分子的序列经过人源化。

本发明还涉及包含本文描述和提供的核酸分子的载体。

本文所使用的术语“载体”一般包括所有种类的能够在适合的宿主细胞中自主复制的线性或环形核酸分子。此类载体包括但不限于质粒、黏粒、噬菌体、病毒(例如，腺-、腺相关-、慢-或优选逆转录病毒载体)和本领域已知的其他载体或穿梭载体，它们适合携带并将基因转移到宿主细胞中，以便允许本发明趋化因子-结合伴侣的分离的多肽在宿主细胞中稳定或瞬时翻译以及组成型或条件型表达。所述载体通常不整合到细胞基因组中，但也可以被整合。根据本发明包含本文所述和提供的核酸分子的载体优选地允许本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽在宿主细胞中稳定表达(表达载体)。本发明的载体还可以包含标记物基因、启动子和/或增强子序列(可操作地连接到本发明的核酸分子)、适合于相应宿主细胞的复制起点、限制性定位、多克隆位点、标记和如本领域已知的进一步的功能性单位。这些载体尤其可以通过穿梭载体如病毒(它本身可以被认为是载体)转移到宿主细胞中，或者裸转化或转导到宿主细胞中。优选地，该载体被改造以适应其被转化或转导到的相应的宿主细胞。本领域技术人员会很容易理解不同的宿主细胞需要不同种类的载体。例如，载体(质粒)pGEM是适合转化到细菌细胞中的载体，而逆转录病毒载体pMP71则适合转导到真核细胞(例如，T细胞)中。在本发明的一个特定的实施方案中，所述载体是pcDNA3.1。

在本发明的一个实施方案中，本发明的载体是病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，例如逆转录病毒载体。适合的逆转录病毒载体的实例在本领域中是已知的，并且包括例如PMP71-PRE(Leisegang，K Mol Med(2008)，86(5)：573-583)、SAMEN CMV/SRa、LZRS-id3-IHRES(Heemskerk等，J.Exp.Med.186(1997)，1597-1602)、FeLV(Neil等，Nature 308(1984)，814-820)、SAX(Kantoff等，Proc.Natl.Acad.Sei.USA 83(1986)，6563-6567)、pDOL(Desiderio，J.Exp.Med.167(1998)，372-388)、N2(Kasid等，Proc.Natl.Acad.Sei.USA 87(1990)，473-477)、LNL6(Tiberghien等，Blood 84(1994)，1333-1341)、pZipNEO(Chen等，J.Immunol.153(1994)，3630-3638)、LASN(Mullen等，Hum.Gene Ther.7(1996)，1123-1129)、pGIXsNa(Taylor等，J.Exp.Med.184(1996)，2031-2036)、LCNX(Sun等，Hum.GeneTher.8(1997)，1041-1048)、SFG(Gallardo等，Blood 90(1007))、LXSN(Sun等，Hum.GeneTher.8(1997)，1041-1048)、SFG(Gallardo等，Blood 90(1007)，952-957)、HMB-Hb-Hu(Vieillard等，Proc.Natl.Acad.Sei.USA 94(1997)，11595-11600)、pMV7(Cochlovius等，Cancer Immunol.Immunother.46(1998)，61-66)、pSTITCH(Weitjens等，Gene Ther 5(1998)，1195-1203)、pLZR(Yang等，Hum.Gene Ther.10(1999)，123-132)、pBAG(Wu等，Hum.Gene Ther.10(1999)，977-982)、rKat.43.267bn(Gilham等，J.Immunother.25(2002)，139-151)、pLGSN(Engels等，Hum.Gene Ther.14(2003)，1155-1168)、pMP71(Engels等，Hum.Gene.Ther.14(2003)，1155-1168)、pGCSAM(Morgan等，J.Immunol.171(2003)，3287-3295)、pMSGV(Zhao等，J.Immunol.174(2005)，4415-4423)或pMX(de Witte等，J.Immunol.181(2008)，5128-5136)。

本发明的核酸可基于关于本文给出的序列信息通过已知的方式(例如通过自动DNA合成和/或重组DNA技术)制备或获得，和/或可从适合的天然来源加以分离。

本发明进一步涉及包含本文所描述和提供的所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，用本文所描述和提供的核酸分子或载体来转导或转化本发明的宿主细胞。

一般来说，除非另有特定定义，本文所用的“转导(transduced)”或“转化(transformed)”(以及“转导(transduction)”或“转化(transformation)”)或类似的词可以互换使用，并且通常意指核酸分子和/或载体到宿主细胞中的任意种类的转移，不论宿主细胞的种类，不论转移方式(例如，(化学)转化、(病毒)转导、电穿孔、转染等)。

核酸分子和/或载体可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，或者是染色体外的(即瞬时表达)。适用于实现在宿主细胞中瞬时表达的方法的示例是本领域已知的，包括mRNA转染。在一个实施方案中，核酸分子和/或载体稳定地整合到基因组中。

在本发明的上下文中描述和提供的包含本文所描述和提供的核酸分子或载体的宿主细胞优选能够稳定或瞬时(例如，稳定)(组成型或条件型)表达本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽。宿主细胞通常可以用任何适合的核酸分子或载体通过任何方法转导或转化。在一个实施方案中，宿主细胞用逆转录病毒或慢病毒(例如逆转录病毒)载体转导，该载体包含编码如上所述的本发明的趋化因子结合伴侣的分离的多肽或其部分(例如，CCL19和/或IL7、PSCA结合蛋白、CD133结合蛋白)的核酸分子。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞用逆转录病毒载体转导，所述载体包含编码如上文所述的本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或其部分(例如，CCL19和/或IL7、PSCA结合蛋白、CD133结合蛋白)的核酸分子，并稳定(组成型或条件型)表达所述趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或其部分。

在另一方面中，本发明涉及表达或能够表达一种或多种本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽和/或含有本发明的核酸或载体的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。

适合的细菌细胞包括革兰氏阴性细菌菌株(例如大肠杆菌(Escherichia coli)菌株、变形杆菌属(Proteus)菌株及假单胞菌属(Pseudomonas)菌株)及革兰氏阳性细菌菌株(例如芽孢杆菌属(Bacillus)菌株、链霉菌属(Streptomyces)菌株、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株及乳球菌属(Lactococcus)菌株)的细胞。

适合的真菌细胞包括木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)及曲菌属(Aspergillus)的物种的细胞；或者包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))及汉森酵母属(Hansenula)的物种的细胞。

适合的哺乳动物细胞包括例如HEK293细胞、CHO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞等。在一个实施方案中，宿主细胞是T细胞(如CD8+T细胞、CD4+T细胞)、TCR(如(但不限于)TCR-T58或TCR-D115 T细胞)。

然而，本发明也可使用两栖类细胞、昆虫细胞、植物细胞及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。

在本发明的上下文中，包含如本文所描述和提供的所述核酸分子或所述载体的宿主细胞涉及一种基因改造的细胞，其中所述核酸分子或所述载体被转导、转化或以其他方式被引导到宿主细胞中。如前所述，本发明的宿主细胞可以是瞬时或稳定表达本发明的趋化因子-特定抗原结合分子的分离的多肽的细胞。例如，编码本发明的分离的多肽的核酸分子可以通过逆转录病毒或慢病毒(例如，逆转录病毒)转导稳定地整合到细胞的基因组中。在一个实施方案中，本发明的所述宿主细胞是HEK 239T细胞。

本发明还提供产生本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的方法，所述方法通常包含以下步骤：

-在允许表达本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的条件下培养本发明的宿主细胞；及

-从培养物回收由所述宿主细胞表达的分离的多肽；及

-任选进一步纯化和/或修饰本发明的分离的多肽。

在一个优选的实施方案中，本发明的分离的多肽使用大肠杆菌细胞产生。本发明的分离的多肽可以在大肠杆菌细胞中获得高表达。

在一个优选的实施方案中，本发明的分离的多肽使用哺乳动物细胞产生。本发明的分离的多肽可以在哺乳动物细胞中获得高表达。

本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽可在如上所述细胞中以细胞内方式(例如在细胞质中、在周质中或在包涵体中)产生，接着从宿主细胞分离且任选进一步纯化；或其可以细胞外方式(例如在培养宿主细胞的培养基中)产生，接着自培养基分离且任选进一步纯化。

用于重组产生多肽的方法及试剂，例如特定适合表达载体、转化或转染方法、选择标记物、诱导蛋白表达的方法、培养条件等在本领域中是已知的。类似地，适用于制造本发明的分离的多肽的方法中的蛋白分离及纯化技术为本领域技术人员所公知。

然而，本发明的分离的多肽也可以通过本领域已知的其它产生蛋白质的方法获得，例如化学合成，包括固相或液相合成。

药物组合物以及治疗性T细胞

另一方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体配制在一起的本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽。

另一方面，本发明提供一种治疗性T细胞，其包含本发明的多核苷酸。在另一个实施方案，所述治疗性T细胞例如为T细胞受体(TCR)T细胞或嵌合抗原受体(CAR)T细胞。

本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即趋化因子-结合伴侣的分离的多肽包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂，除了任何与活性化合物不相容的范围外，都可能在本发明的药物组合物中。

治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。

通过将活性化合物即趋化因子-结合伴侣的分离的多肽以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物即趋化因子-结合伴侣的分离的多肽掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。

可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分即趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的量根据所治疗的对象和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。

可以调节剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一推注，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的对象的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。

对于趋化因子-结合伴侣的分离的多肽的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至20mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重或20mg/kg体重，或在1-20mg/kg范围内。所述剂量也可以最大为20mg/m2/天、15mg/m2/天、10mg/m2/天、7.5mg/m2/天、6mg/m2/天、4mg/m2/天或更低。

示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至每3-6个月一次)。

或者，趋化因子-结合伴侣的分离的多肽也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据分离的多肽在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。

本发明的分离的多肽的“治疗有效量”优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于相关肿瘤或癌症的治疗，相对于未接受治疗的对象，“治疗有效量”优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。治疗有效量的治疗性化合物能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。

本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明的药物组合物的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脑内、脑室内、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

或者，本发明的药物组合物也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。非肠胃外递送模式是，例如，诸如以如丸剂、片剂、胶囊、溶液或悬浮液的形式的口服递送的肠内递送模式，或如以栓剂形式的直肠递送。但是，优选非口服递送。局部应用途径包括表皮下的(epicutaneous)或吸入的应用。例如，Patton等人(2004)(J.S.Patton等人Thelungs as a portal of entry forsystemic drug delivery.Proc.Amer.ThoracicSoc.2004 Vol.1 pages 338-344)给出了关于肺部给药的综述，即通过吸入气溶胶(其也可以用于鼻内施用)或气管内滴注。通常，本发明的融合蛋白和药物组合物可以在包含本文要求和描述的常规无毒的药学上可接受的赋形剂或载体、添加剂和媒介物的制剂中施用。

活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见，例如，Sustainedand controlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。

治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药，如在美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利No.4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入微量输注泵；美国专利No.4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利No.4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利No.4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，该专利公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统：和美国专利No.4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专利引入本文作为参考。本领域技术人员公知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物可配制为确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过BBB(如果需要时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个靶向部分，从而增强靶向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。靶向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，Low你等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

疾病预防和治疗

在另一方面，本发明提供了本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物在预防和/或治疗与肿瘤或癌症相关的疾病中用途和方法。本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物可以在体内、体外显著抑制癌细胞的增殖、杀伤肿瘤或癌症细胞。

因此，在一方面，本发明提供一种预防和/或治疗肿瘤或癌症的方法，包括给该对象施用治疗有效量的本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物。所述对象也可以指人或动物。所述对象还可以是患有肿瘤或癌症或自身免疫性疾病的。所述对象可以是脊椎动物，更优选地为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动用动物、宠物、灵长类动物、小鼠和大鼠。优选地，哺乳动物为如狗、猫、牛、猪、马、羊、小鼠、大鼠等。因此，在一个实施方案中，所述对象为脊椎动物，优选为人。

在另一方面，本发明提供了本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物在体外杀伤细胞中的用途，其中所述杀伤细胞的杀伤活性为大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、或大于95％或更高。

在另一方面，本发明提供了本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物在打破肿瘤或癌症组织中的免疫抑制微环境的用途。在另一方面，本发明提供了本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物在肿瘤或癌症组织中趋化多种免疫细胞的用途。在另一方面，本发明提供了本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物在多种免疫细胞协同的肿瘤杀伤效应的用途。在另一方面，所述免疫细胞例如幼稚T细胞、成熟DC细胞、巨噬细胞、NK细胞。在另一方面，本发明提供了本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物在介导肿瘤细胞刺激T细胞活化，促进分泌有利于抗肿瘤免疫的细胞因子，促进活化T的克隆性增殖的用途。在另一方面，本发明提供了本发明的CCL19-PSCA scFv分离的多肽在靶向表达PSCA的细胞并抑制其生长的用途。在另一方面，本发明提供了本发明的IL7-CCL19-CD133 scFv分离的多肽在杀灭CD133阳性的肿瘤干细胞以防治肿瘤或癌症转移及复发，和/或有效杀灭CD133阴性的普通肿瘤细胞，从而发挥放大抗肿瘤免疫的效果的用途。

在另一方面，本发明提供了本发明的分离的多肽或药物组合物在促进T细胞IL-2释放的用途，其中所述IL-2的释放为大于300pg/ml、大于350pg/ml、大于400pg/ml、大于450pg/ml、大于500pg/ml、大于550pg/ml、大于600pg/ml、大于650pg/ml、大于700pg/ml、大于750pg/ml、大于800pg/ml、大于850pg/ml、大于900pg/ml、大于1000pg/ml、大于1050pg/ml、大于1100pg/ml、大于1150pg/ml、大于1200pg/ml、大于1250pg/ml、或大于1300pg/ml或在300pg/ml-1300pg/ml的范围内。

在另一方面，本发明提供了本发明的分离的多肽或药物组合物在促进T细胞IFN-γ释放的用途，其中所述IFN-γ的释放为大于400pg/ml、大于500pg/ml、大于600pg/ml、大于700pg/ml、大于800pg/ml、大于900pg/ml、大于1000pg/ml、大于1100pg/ml、大于1200pg/ml、大于1300pg/ml、大于1400pg/ml、大于1500pg/ml、大于1600pg/ml、大于1700pg/ml、大于1800pg/ml、大于1900pg/ml、大于2000pg/ml、大于2100pg/ml、大于2200pg/ml、大于2300pg/ml、大于2400pg/ml、或大于2500pg/ml或在400pg/ml-2500pg/ml的范围内。

在另一方面，本发明提供了本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物在控制肿瘤或癌症生长、延长荷瘤对象的生存期的用途。在另一方面，本发明提供了本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物在(体内)减小肿瘤体积的用途，其中所述肿瘤体积为与未经本发明的分离的多肽或药物组合物处理的对照组相比的小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、或小于5％或更小。

在另一方面，本发明提供本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤或癌症的药物中的用途。

可以通过本发明的方法或药物治疗的肿瘤或癌症包括但不限于脑癌、肾癌、肝癌、肾上腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、阴道癌、皮肤癌、白血病、甲状腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、头颈癌或黑色素瘤。

本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物也可以与标准癌症治疗组合，例如标准化疗和/或放疗。

本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物还可以与靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体联合使用。所述靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体包括但不限于，抗EGFR抗体、抗EGFR变体的抗体、抗VEGFa抗体、抗HER2抗体。优选所述抗体是单克隆抗体。本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物还可以与治疗性T细胞联合使用，所述治疗性T细胞例如为T细胞受体(TCR)T细胞或嵌合抗原受体(CAR)T细胞。本发明的趋化因子-结合伴侣的分离的多肽或药物组合物还可以与其他核酸分子联合使用，例如与编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子联合使用。

试剂盒

本发明的范围内还包括试剂盒，该试剂盒包括本发明的分离的多肽或药物组合物，以及使用说明。该试剂盒可以进一步包括至少一种另外的试剂(例如缓冲剂)。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。

实施例

为了便于理解本发明，下面将参照相关具体实施例及附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1：表达本发明核酸编码的CCL19-PSCA scFv融合基因工程蛋白的质粒构建

下表解释了本发明示例的融合基因工程蛋白各部分的连接顺序，该连接还可参见图4所示。

融合基因工程蛋白	结构
		CCL19-PSCA scFv1	CCL19-连接肽-VH-linker-VL
CCL19-PSCA scFv2	CCL19-连接肽-VL-linker-VH
		PSCA scFv1-CCL19	VH-linker-VL-连接肽-CCL19
PSCA scFv2-CCL19	VL-linker-VH-连接肽-CCL19

1.人CCL19基因克隆：

1.1从美国国立医学图书馆网站(http：//www.ncbi.nlm.gov/entrze)Genbank数据库中检索到人CCL19 cDNA序列(gene ID 6363)，目的基因大小294bp，进行合成(南京德泰基因公司)。

1.2合成产物连接入pUC57载体中，经酶切证实插入片段正确后，将阳性菌落3ml进行DNA序列测定(上海生工生物工程公司)，将测序结果与GenBank数据库公布的序列比较以证实序列正确。

2.人源化抗人PSCA scFv基因克隆：

本实验室构建的鼠抗人PSCA单克隆抗体杂交瘤细胞株，可以分泌能够特异性识别人PSCA表面抗原的抗PSCA单克隆抗体，应用RT-PCR方法从该杂交瘤细胞株中克隆出抗体的VH、VL基因，经过密码子优化及人源化，进行合成(南京德泰基因公司)。

3.CCL19、PSCA scFv、CCL19-PSCA scFv表达载体的构建：

根据真核表达载体pcDNA3.1的酶切图谱以及抗人PSCA scFv cDNA序列、人CCL19cDNA序列、CCL19-PSCA scFv序列，分别在CCL19基因、抗人PSCA scFv基因、CCL19-PSCAscFv基因的N端引入His 6基因序列。

将各组目的基因全基因序列合成(南京德泰基因公司)，合成后的基因序列亚克隆在pUC57载体中，经过酶切测序证实序列正确后，切胶回收各目的基因片段并连接入pcDNA3.1中。在一个实施例中，CCL19-PSCA scFv载体质粒构建的CCL19-PSCA scFv融合基因工程蛋白结构如图4。

结果见图1、图2。

实施例2：表达本发明核酸编码的IL7-CCL19-CD133 scFv融合基因工程蛋白的质粒构建

下表解释了本发明示例的IL7-CCL19-CD133 scFv融合基因工程蛋白各部分的连接顺序，该连接还可参见图7所示。

1.人IL7-CCL19基因克隆：

1.1从美国国立医学图书馆网站(http：//www.ncbi.nlm.gov/entrze)GenBank数据库中检索到人IL7 cDNA序列(gene ID 9606)，目的基因大小531bp，人CCL19 cDNA序列(gene ID 6363)，目的基因大小294bp；进行合成(南京德泰基因公司)。

2.2合成产物连接入pcDNA3.1载体中，经酶切证实插入片段正确后，将阳性菌落3ml进行DNA测序(上海生工生物工程公司)，将测序结果与GenBank数据库公布的序列比较以证实序列正确。

2.人源化抗人CD133 scFv基因克隆：

本实验室构建的鼠抗人CD133单克隆抗体杂交瘤细胞株，可以分泌能够特异性识别人CD133表面抗原的抗CD133单克隆抗体，应用RT-PCR方法从该杂交瘤细胞株中克隆出抗体的VH、VL基因，经过密码子优化及人源化，进行合成(南京德泰基因公司)。

3.IL7-CCL19、CD133 scFv、IL7-CCL19-CD133 scFv表达载体的构建：

3.1根据真核表达载体pcDNA3.1的酶切图谱以及抗人CD133 scFv cDNA序列或人IL7-CCL19 cDNA序列分别在IL7-CCL19基因、抗人CD133 scFv基因、IL7-CCL19-CD133 scFv基因的N端引入His 6基因序列。

3.2将各组目的基因全基因序列合成(南京德泰基因公司)，合成后的基因序列亚克隆在pUC57载体中，经过酶切测序证实序列正确后切胶回收各目的基因片段并连接入pcDNA3.1中。

在一个实施例中，IL7-CCL19-CD133 scFv载体质粒构建的IL7-CCL19-CD133 scFv融合基因工程蛋白结构如图7。

结果见图5。

实施例3：CCL19蛋白、PSCA scFv抗体、CCL19-PSCA scFv融合基因工程蛋白的纯化、浓缩及鉴定

1.pcDNA3.1-CCL19、pcDNA3.1-PSCA scFv、pcDNA3.1-CCL19-PSCA scFv分别转染HEK293T细胞株：

将已经构建好的pcDNA3.1-CCL19、pcDNA3.1-PSCA scFv、pcDNA3.1-CCL19-PSCAscFv质粒分别和LipofectamineTM 2000(Invitrogen)加入HEK293T细胞中，37℃，5％CO2培养箱培养48h-72h，通过SDS-PAGE检测，可见CCL19、PSCA scFv、CCL19-PSCA scFv融合蛋白表达。

2.融合基因工程蛋白的纯化、浓缩及鉴定：

2.1细胞蛋白上清的制备：

2.1.1小心去掉细胞培养液，将细胞收集到离心管中；

2.1.2将蛋白抽提试剂进行预冷，按照1∶99比例加入蛋白酶抑制剂混合物，使蛋白酶抑制剂混合物在抽提试剂中成1×工作液；

2.1.3加入适量哺乳动物蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟，让细胞充分裂解；

2.1.4将细胞于4℃，17000×g离心10分钟，转移上清液至新管中，用于进一步分析；

2.2蛋白纯化：按照Ni-NTA Agarose(QIGEN)说明书要求纯化蛋白：

2.2.1在细胞裂解后得到的上清蛋白加入柱料中，使用Wash buffer(50mM PBS PH8.0，0.3M NaCl，40mM咪唑)重悬结合融合蛋白的beads，用Wash buffer洗柱3次；

2.2.2用Elution buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3M NaCl，150mM咪唑)洗脱目的蛋白；

2.2.3将洗脱后得到的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定；

2.2.4将洗脱下的、纯化的融合蛋白溶液装入已经处理好的透析袋，放入透析缓冲液(50mM PBS PH 8.0，0.15M NaCl)中4℃过夜，以去除纯化蛋白中含有的咪唑；

2.3蛋白浓缩：次日，将透析后的蛋白过浓缩柱进行浓缩，4℃、4000rpm离心10min。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(按照说明书要求)，测量浓缩后的融合蛋白浓度。

结果见图8。

2.4蛋白的鉴定：采用Western blot鉴定CCL19蛋白、PSCA scFv抗体、CCL19-PSCAscFv融合基因工程蛋白：

2.4.1分别取CCL19蛋白、PSCA scFv抗体、CCL19-PSCA scFv融合基因工程蛋白20μl，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸10min，取20μl进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白样品；

2.4.2 80V恒压电泳30min，使蛋白样品在浓缩胶中压成一条线，待蛋白样品跑出浓缩胶进入分离胶中，提高电压至130V，待溴酚蓝前沿完全跑出胶后，电泳完成；

2.4.3将PVDF膜在甲醇中活化20s，迅速转移到转移缓冲液(1L转移缓冲液中含Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml)中，将上下滤纸和SDS-PAGE胶浸泡在转移缓冲液中；

2.4.4在半干转移器上顺次放滤纸、PVDF膜、胶及另一张滤纸，22V转膜30-60min。将膜放入1×TBST缓冲液配制5％的脱脂奶粉溶液中，水平摇床上封闭2小时；

2.4.5 5％的脱脂奶粉溶液稀释HIS抗体(稀释比例1∶5000)，使膜与一抗在室温结合2hr，或4℃结合过夜。1×TBST缓冲液洗3次，每次10min。5％的脱脂奶粉溶液配制相应二抗(稀释比例1∶1500)，室温结合1-2hr；

2.4.6 1×TBST缓冲液洗4-5次，每次10min。将发光底物(SuperSignal WestFemto)的A液和B液等体积混匀后，适量加到PVDF膜上(一张膜100μl)，使用AlphaFluorChem Q蛋白印迹成像和定量分析系统拍照成像。

结果见图9。

实施例4：IL7-CCL19蛋白、CD133 scFv抗体、IL7-CCL19-CD133 scFv融合基因工程蛋白的纯化、浓缩及鉴定

1.pcDNA3.1-IL7-CCL19、pcDNA3.1-CD133 scFv、pcDNA3.1-IL7-CCL19-CD133scFv分别转染HEK 293T细胞株：

将已经构建好的pcDNA3.1-IL7-CCL19、pcDNA3.1-CD133 scFv、pcDNA3.1-IL7-CCL19-CD133 scFv质粒，分别和Lipofectamine TM2000(Invitrogen)一起加入HEK 293T细胞中，37℃，5％CO2培养箱中培养48h-72h，通过SDS-PAGE检测，可见IL7-CCL19、CD133scFv、IL7-CCL19-CD133 scFv融合蛋白表达。

1.IL7-CCL19蛋白、CD133 scFv抗体、IL7-CCL19-CD133 scFv融合基因工程蛋白的纯化、浓缩及鉴定：

1.1细胞蛋白上清的制备：

1.1.1小心去掉细胞培养液，将细胞收集到离心管中；

1.1.2将蛋白抽提实际进行预冷，按照1∶99比例加入蛋白酶抑制剂混合物，使蛋白酶抑制剂混合物在抽提试剂中成1×工作液；

1.1.3加入适量哺乳动物蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟，让细胞充分裂解；

1.1.4将细胞于4℃，17,000×g离心10分钟，转移上清液至新管中，用于进一步分析；

1.2按照Ni-NTA Agarose(QIGEN)说明书要求纯化蛋白：

1.2.1在细胞裂解后得到的上清蛋白加入柱料中，使用Wash buffer(50mM PBS PH8.0，0.3M NaCl，40mM咪唑)重悬结合融合蛋白的beads，用Wash buffer洗柱3次；

1.2.2用Elution buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3M NaCl，150mM咪唑)洗脱目的蛋白；

1.3将洗脱后得到的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定：

1.3.1将洗脱下的、纯化的融合蛋白溶液装入已经处理好的透析袋，放入透析缓冲液(50mM PBS PH 8.0，0.15M NaCl)中4℃过夜，以去除纯化蛋白中含有的咪唑；

1.3.2次日，将透析后的蛋白过浓缩柱进行浓缩，4℃、4000rpm离心10min；

1.3.3使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(按照说明书要求)，测量浓缩后的融合蛋白浓度。

结果见图10。

1.4 Western blot鉴定IL7-CCL19蛋白、CD133 scFv抗体、IL7-CCL19-CD133 scFv融合基因工程蛋白：

1.4.1分别取IL7-CCL19蛋白、CD133 scFv抗体、IL7-CCL19-CD133 scFv融合基因工程蛋白20μl，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸10min，取20μl进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白样品；

1.4.2 80V恒压电泳30min，使蛋白样品在浓缩胶中压成一条线，待蛋白样品跑出浓缩胶进入分离胶中，提高电压至130V，待溴酚蓝前沿完全跑出胶后，电泳完成；

1.4.3将PVDF膜在甲醇中活化20s，迅速转移到转移缓冲液(1L转移缓冲液中含Tris 3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml)中，将上下滤纸和SDS-PAGE胶浸泡在转移缓冲液中；

1.4.4在半干转移器上顺次放滤纸、PVDF膜、胶及另一张滤纸，22V转膜30-60min。将膜放入1×TBST缓冲液配制5％的脱脂奶粉溶液中，水平摇床上封闭2小时；

1.4.5 5％的脱脂奶粉溶液稀释HIS抗体(稀释比例1∶5000)，使膜与一抗在室温结合2hr，或4℃结合过夜。1×TBST缓冲液洗3次，每次10min。5％的脱脂奶粉溶液配制相应二抗(稀释比例1∶1500)，室温结合1-2hr；

1.4.6 1×TBST缓冲液洗4-5次，每次10min。将发光底物(Super Signal WestFemto)的A液和B液等体积混匀后，适量加到PVDF膜上(一张膜100μl)，使用Alpha FluorChem Q蛋白印迹成像和定量分析系统拍照成像。

结果见图11。

实施例5：CCL19-PSCA scFv基因工程蛋白活性测定---结合常数的测定

1.1在96孔酶标板中加入100μl PSCA表达阳性的膀胱移行上皮癌细胞系RT4细胞裂解液，37℃包被2小时；

1.2甩去包被液，PBS(含0.05％Tween-20)洗3次，加入封闭液(PBS含3％牛血清白蛋白，10％羊血清)封闭2h；

1.3甩去封闭液，PBS洗3次，实验组中一式两孔加入100μl 1∶3倍比稀释的CCL19-PSCA scFv基因工程蛋白，对照组加入等体积的3％的牛血清蛋白溶液，37℃孵育2h；

1.4甩净板中的液体，PBS洗3次，加入抗His-tag单抗(1∶2000稀释，0.1μg/ml)，37℃孵育2h；

1.5甩去第一抗体溶液，PBS洗3次，加入辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠IgG(1∶1000稀释)，37℃孵育2h；

1.6甩净板中的液体，PBS洗3次，加100μl显色液(OPD，H₂O₂)反应10min，加入终止液终止反应；

1.7用酶标仪(Vamed Engineering，Austria)测定各孔在492nm的OD值，每孔取均值。

使用公式：ΔA＝ΔMAX×L/(Kd+L)，其中ΔA为实验组和对照组的OD值的差，L为加入的CCLl9-PSCA scFv基因工程蛋白浓度。回归分析，计算解离常数Kd值。

结果见图12。

实施例6：IL7-CCL19-CD133 scFv基因工程蛋白活性测定---结合常数的测定

1.1在96孔酶标板中加入100μl CD133表达阳性的肝细胞癌细胞系Huh7细胞裂解液，37℃包被2小时；

1.2甩去包被液，PBS(含0.05％Tween-20)洗3次，加入封闭液(PBS含3％牛血清白蛋白，10％羊血清)封闭2h；

1.3甩去封闭液，PBS洗3次，实验组中一式两孔加入100μl 1∶3倍比稀释的IL7-CCL19-CD133 scFv基因工程蛋白，对照组加入等体积的3％的牛血清蛋白溶液，37℃孵育2h；

1.4甩净板中的液体，PBS洗3次，加入抗His-tag单抗(1∶2000稀释，0.1μg/ml)，37℃孵育2h；

1.5甩去第一抗体溶液，PBS洗3次，加入辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠IgG(1∶1000稀释)，37℃孵育2h；

1.6甩净板中的液体，PBS洗3次，加100μl显色液(OPD，H202)反应10min，加入终止液终止反应；

1.7用酶标仪(Vamed Engineering，Austria)测定各孔在492nm的OD值，每孔取均值。使用公式：ΔA＝ΔMAX×L/(Kd+L)，其中ΔA为实验组和对照组的OD值的差，L为加入的IL7-CCL19-CD133 scFv基因工程蛋白浓度。回归分析，计算解离常数Kd值。

结果见图13。

实施例7：CCL19-PSCA scFv基因工程蛋白竞争性免疫荧光抑制试验

1.1胰酶消化贴壁的PSCA表达阳性的膀胱移行上皮癌细胞系RT4细胞，使用PBS重悬计数，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml；

1.2分别取100μl RT4细胞悬液(1×106个)加入流式细胞管中，阳性对照组加入10μl PE-labeled mouse anti-PSCA lgG1(美国santa-cruz公司)，PSCA scFv组加入10μlPE-labeled mouse anti-PSCA lgG1和10μl PSCA scFv，CCL19-PSCA scFv组加入10μl PE-labeled mouse anti-PSCA lgG1和10μlCCL19-PSCA scFv；

1.3避光孵育20min，300g，20℃离心5min，弃去上清液；

1.4 PBS洗涤细胞，重复3遍，之后通过FACS检测荧光强度。

结果见图14。

实施例8：IL7-CCL19-CD133 scFv基因工程蛋白竞争性免疫荧光抑制试验

1.1胰酶消化贴壁的CD133表达阳性的肝细胞癌细胞系Huh7细胞，使用PBS重悬计数，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml；

1.2分别取100μl Huh7细胞悬液(1×106个)加入流式细胞管中，阳性对照组加入10μl PE-labeled mouse anti-CD133 lgG1(美国santa-cruz公司)，CD133 scFv组加入10μl PE-labeled mouse anti-CD133 lgG1和10μl CD133 scFv，IL7-CCL19-CD133 scFv组加入10μl PE-labeled mouse anti-CD133 lgG1和10μl IL7-CCL19-CD133 scFv；

1.3避光孵育20min，300g，20℃离心5min，弃去上清液；

1.4 PBS洗涤细胞，重复3遍，之后通过FACS检测荧光强度。

结果见图15。

实施例9：CCL19-PSCA scFv基因工程蛋白的体外生物学活性

1.1人外周血淋巴细胞采用Ficoll法分离；其中淋巴细胞完全培养基中加入终浓度为300U/ml的rhIL-2；

1.2阴性对照组、CCL19组、PSCA scFv组、CCL19+PSCA scFv组、CCL19-PSCA scFv组每孔均加入1×10⁴个RT4细胞，贴壁4小时；CCL19组、PSCA scFv组、CCL19+PSCA scFv组、CCL19-PSCA scFv组分别加入10μl 50μg/ml的CCL19，10μl 50μg/ml的PSCA scFv，5μl 50μg/ml的PSCA scFv+5μl 50μg/ml的CCL19，10μl 100μg/ml的CCL19-PSCA scFv基因工程蛋白，阴性对照组加入10μl PBS；

1.3各孔按照效靶比(E∶T)5∶1、10∶1、20∶1加入100μl淋巴细胞，37℃，5％CO2条件下孵育48h；

1.4弃去培养液，PBS洗板三次将不贴壁的细胞洗掉，每孔加入100μl不含FBS的培养基；

1.5每孔加入10μl CCK-8溶液，在37℃，5％CO₂条件下培养4h，然后在10min内是用酶标仪测定在450nm处的OD值；

1.6杀伤效率的计算采用下列公式：

杀伤活性％＝(1-各组OD值/阴性对照组OD值)×100％。

结果如图16。

实施例10.IL7-CCL19-CD133 scFv基因工程蛋白的体外生物学活性

1.1人外周血淋巴细胞采用Ficoll法分离；其中淋巴细胞完全培养基中加入终浓度为300U/ml的rhIL-2；

1.2阴性对照组、IL7-CCL19组、CD133 scFv组、IL7-CCL19+CD133 scFv组、IL7-CCL19-CD133 scFv组每孔均加入1×10⁴个Huh7细胞，贴壁4小时；IL7-CCL19组、CD133 scFv组、IL7-CCL19+CD133 scFv组、IL7-CCL19-CD133 scFv组分别加入10μl 50μg/ml的IL7-CCL19，10μl 50μg/ml的CD133 scFv，5μl 50μg/ml的CD133 scFv+5μl 50μg/ml的IL7-CCL19，10μl 100μg/ml的IL7-CCL19-CD133 scFv基因工程蛋白，阴性对照组加入10μl PBS；

1.3各孔按照效靶比(E∶T)5∶1、10∶1、20∶1加入100μl淋巴细胞，37℃，5％CO₂条件下孵育48h；

1.4弃去培养液，PBS洗板三次将不贴壁的细胞洗掉，每孔加入100μl不含FBS的培养基；

1.5每孔加入10μl CCK-8溶液，在37℃，5％CO₂条件下培养4h，然后在10min内是用酶标仪测定在450nm处的OD值；

1.6杀伤效率的计算采用下列公式：杀伤活性％＝(1-各组OD值/阴性对照组OD值)×100％。

结果如图17。

实施例11：ELISA法测定CCL19-PSCA scFv促进人T细胞IL-2和IFN-γ释放活性

1.1人外周血淋巴细胞及RT4细胞制备过程同步骤八，阴性对照组、CCL19组、PSCAscFv组、CCL19+PSCA scFv组、5组按照PBMC和RT4效靶比10∶1共培养72h，其中CCL19组、PSCAscFv组、CCL19+PSCA scFv组、CCL19-PSCA scFv组分别加入10μl 50μg/ml的CCL19，10μl 50μg/ml的PSCA scFv，5μl 50μg/ml的PSCA scFv+5μl 50μg/ml的CCL19，10μl 100μg/ml的CCL19-PSCA scFv基因工程蛋白，阴性对照组加入10μl PBS；分别离心收集上清作为待测样本；

1.2人IL-2 ELISA试剂盒和人IFN-γ ELISA试剂盒(均购自美国eBioscience公司)的操作过程严格按照试剂盒操作说明。将浓缩洗涤液、标准品、标准品稀释液、密封板条从冰箱取出室温预温；

1.3标准品的制备：加入标准品稀释液至冻干标准品中，待彻底溶解后静置混匀，按照2∶1的梯度进行稀释制备不同浓度的标准品；

1.4除空白孔外，分别将标本和不同浓度的标准品放入相应孔中，封板后37℃孵育90min；

1.5配制洗涤液和生物素化抗体工作液：按照1∶20的比例使用双蒸水稀释浓缩洗涤液，按照1∶200的比例使用生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体；

1.6使用洗板液洗板5次，加入生物素化抗体工作液100μl/孔，封板后37℃孵育60min；

1.7配制酶结合物工作液：按照1∶200的比例使用酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物；

1.8使用洗板液洗板5次，除空白空外加入酶结合物工作液100μl/孔，封板后37℃孵育60min；

1.9使用洗板液洗板5次，加入显色剂100μl/孔，37℃避光孵育10min；

1.10加入终止液100μl/孔，混匀后5min内使用酶标仪测定450nm处的OD值。

1.11绘制标准曲线，通过标本的OD值在标准曲线上查出其浓度；

结果见图18。

实施例12：ELISA法测定IL7-CCL19-CD133 scFv促进人T细胞IL-2和IFN-γ释放活性

1.1人外周血淋巴细胞及Huh7细胞制备过程同步骤八，阴性对照组、IL7-CCL19组、CD133 scFv组、IL7-CCL19+CD133 scFv组、IL7-CCL19-CD133 scFv组按照PBMC和Huh7效靶比10∶1共培养72h，其中IL7-CCL19组、CD133 scFv组、IL7-CCL19+CD133 scFv组、IL7-CCL19-CD133 scFv组分别加入10μl 50μg/ml的IL7-CCL19，10μl 50μg/ml的CD133 scFv，5μl 50μg/ml的CD133 scFv+5μl 50μg/ml的IL7-CCL19，10μl 100μg/ml的IL7-CCL19-CD133scFv基因工程蛋白，阴性对照组加入10μl PBS；分别离心收集上清作为待测样本；

1.2人IL-2 ELISA试剂盒和人IFN-γ ELISA试剂盒(均购自天津灏阳)的操作过程严格按照试剂盒操作说明。将浓缩洗涤液、标准品、标准品稀释液、密封板条从冰箱取出室温预温；

1.3标准品的制备：加入标准品稀释液至冻干标准品中，待彻底溶解后静置混匀，按照2∶1的梯度进行稀释制备不同浓度的标准品；

1.4除空白孔外，分别将标本和不同浓度的标准品放入相应孔中，封板后37℃孵育90min；

1.5配制洗涤液和生物素化抗体工作液：按照1∶20的比例使用双蒸水稀释浓缩洗涤液，按照1∶200的比例使用生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体；

1.6使用洗板液洗板5次，加入生物素化抗体工作液100μl/孔，封板后37℃孵育60min；

1.7配制酶结合物工作液：按照1∶200的比例使用酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物；

1.8使用洗板液洗板5次，除空白空外加入酶结合物工作液100μl/孔，封板后37℃孵育60min；

1.9使用洗板液洗板5次，加入显色剂100μl/孔，37℃避光孵育10min；

1.10加入终止液100μl/孔，混匀后5min内使用酶标仪测定450nm处的OD值；

1.11绘制标准曲线，通过标本的OD值在标准曲线上查出其浓度。

结果见图19、20。

实施例13：CCL19-PSCA scFv基因工程蛋白的体内生物学活性

1.1实验动物及荷瘤小鼠模型的建立：

1.1.1取25只4-6周龄雄性NOD/SCID雄性小鼠(北京维通利华公司)，SPF级环境中饲养一周后接受150cGy/只铯源(Cs137)照射清髓，随后在小鼠左上肢背部皮下注射0.5ml；

1.1.2 5×10⁶个RT4细胞，待小鼠背部皮下肿瘤可触及后随机分为A、B、C、D、E五组，每组5只；

1.1.3 PBMCs的制备同步骤8.1；

1.1.4每隔三天检测使用游标卡尺肿瘤体积，按照下列公式计算肿瘤体积：V＝1/2ab2，其中a为肿瘤长轴，b为肿瘤的短轴。

1.1.5待肿瘤体积增长为200mm3时，各组NOD/SCID小鼠通过鼠尾静脉注射500μl的PBS混合悬液：

A组：1×10⁷PBMCs；

B组：1×10⁷PBMCs+10μg PSCA scFv，混合后立即注射，第24h和72h再分别补充注射10μg PSCA scFv；

C组：1×10⁷PBMCs+10μg CCL19，混合后立即注射，第24h和72h再分别补充注射10μg CCL19；

D组：1×10⁷PBMCs+10μg PSCA scFv+10μg CCL19，混合后立即注射，第24h和72h再分别补充注射10μg PSCA scFv+10μg CCL19；

E组：1×10⁷PBMCs+20μg CCL19-PSCA scFv，混合后立即注射，第24h和72h再补充注射20μg CCL19-PSCA scFv；

1.1.6密切观测小鼠的体重、肿瘤体积的变化、各类症状及生存期，绘制曲线。解剖死亡小鼠，并取下肿瘤组织标本保存于福尔马林溶液中。在A组小鼠全部死亡当天，处死其余各组剩余小鼠，取下肿瘤组织标本。

1.2肿瘤组织进行PSCA及人CD3、CD19、CD56免疫组织化学染色：

1.2.1取各组肿瘤组织标本置入10％中性缓冲福尔马林液，固定24小时，常规石蜡包埋，4μm连续切片，脱蜡；

1.2.2进行PBS清洗，每次5min，共3次，3％的过氧化氢-甲醇中孵育20min，进行PBS清洗，每次5min，共3次；

1.2.3水浴锅进行加热抗原修复，92-98℃，20min，之后血清封闭，孵育30min；

1.2.4用力甩掉标记血清，稀释一抗，在4℃湿盒中冰箱过夜，进行PBS清洗，每次5min，共3次；

1.2.5加入与一抗相应的生物素标记的二抗，37℃湿盒中孵育30min，进行PBS清洗，每次5min，共3次；

1.2.6加入辣根酶标记的链酶卵白素，37℃湿盒中孵育30min，进行PBS清洗，每次5min，共3次；

1.2.7使用自来水进行充分冲洗，苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、树脂封片后镜下观察肿瘤细胞胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。

实验结果见图21、图22。

实施例14：IL7-CCL19-CD133 scFv基因工程蛋白的体内生物学活性

1.1实验动物及荷瘤小鼠模型的建立：

1.1.1 25只4-6周龄雄性NOD/SCID雄性小鼠(北京维通利华公司)，SPF级环境中饲养一周后接受150cGy/只铯源(Cs137)照射清髓；

1.1.2随后在小鼠左上肢背部皮下注射5×10⁶个Huh7细胞/0.5ml；

1.1.3待小鼠背部皮下肿瘤可触及后随机分为A、B、C、D、E五组，每组5只；

1.1.4 PBMCs的获取同步骤8.1；

1.1.5每隔三天检测使用游标卡尺肿瘤体积，按照下列公式计算肿瘤体积：V＝1/2ab2，其中a为肿瘤长轴，b为肿瘤的短轴。

1.1.6待肿瘤体积增长为200mm3时，各组NOD/SCID小鼠通过鼠尾静脉注射500μl的PBS混合悬液：

A组：1×10⁷PBMCs；

B组：1×10⁷PBMCs+10μg CD133 scFv，混合后立即注射，第24h和72h再分别补充注射10μg CD133 scFv；

C组：1×10⁷PBMCs+10μg IL7-CCL19，混合后立即注射，第24h和72h再分别补充注射10μg IL7-CCL19；

D组：1×10⁷PBMCs+10μg CD133 scFv+10μg IL7-CCL19，混合后立即注射，第24h和72h再分别补充注射10μg CD133 scFv+10μg IL7-CCL19；

E组：1×10⁷PBMCs+20μg IL7-CCL19-CD133 scFv，混合后立即注射，第24h和72h再补充注射20μg IL7-CCL19-CD133 scFv；

1.1.7密切观测小鼠的体重、肿瘤体积的变化、各类症状及生存期，绘制曲线。解剖死亡小鼠，并取下肿瘤组织标本保存于福尔马林溶液中。在A组小鼠全部死亡当天，处死其余各组剩余小鼠，取下肿瘤组织标本。

结果见图23。

序列表

SEQ ID NO：1

CCL19-PSCA scFv peptide

SEQ ID NO：2

CCL19-PSCA scFv基因

SEQ ID NO：3

IL7-CCL19-CD133 scFv氨基酸序列

SEQ ID NO：4

IL7-CCL19-CD133 scFv核苷酸序列

SEQ ID NO：5

CCL19氨基酸序列

SEQ ID NO：6

CCL19核苷酸序列

SEQ ID NO：7

IL-7氨基酸序列

SEQ ID NO：8

IL-7核苷酸序列

SEQ ID NO：9

CD133 scFv氨基酸序列

SEQ ID NO：10

CD133 scFv核苷酸序列

SEQ ID NO：11

PSCA-scFv氨基酸序列：

SEQ ID NO：12

PSCA-scFv核苷酸序列：

序列表

<110> 河北浓孚雨生物科技有限公司

<120> 包含趋化因子与结合伴侣的融合多肽及其用途

<130> I2018TC2972CB

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 360

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CCL19-PSCA scFv peptide

<400> 1

Glu Phe Ala Ala Thr Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val

1 5 10 15

Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu

20 25 30

Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val

35 40 45

Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala

50 55 60

Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp

65 70 75 80

Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala

85 90 95

Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser Gln Asn Ala Val Leu Val Arg Tyr Thr

100 105 110

Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro

115 120 125

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser

130 135 140

Ala Ser Ser Ser Val Arg Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

145 150 155 160

Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly

165 170 175

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

180 185 190

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

195 200 205

Gln Trp Ser Ser Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

210 215 220

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

245 250 255

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp

260 265 270

Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

275 280 285

Val Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Phe Val Pro Lys

290 295 300

Phe Gln Gly Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala

305 310 315 320

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

325 330 335

Cys Lys Thr Gly Gly Phe Trp Gly Gln Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

340 345 350

His His His His His His Lys Leu

355 360

<210> 2

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CCL19-PSCA scFv基因

<400> 2

gaattcgccg ccaccatggc tttattgctt gccctctctc tactggtttt atggacttcc 60

cctgcaccca ccttgtcagg tacaaatgat gcggaagact gttgcctttc ggtcacgcaa 120

aaaccaattc cgggctatat cgtacgtaac tttcattacc tcctaataaa ggatggatgt 180

cgcgtgcctg ctgttgtctt cactaccctg cgagggcggc agttatgcgc ccccccagac 240

caaccgtggg tagagagaat tatccagagg ttgcaacgta caagtgcaaa aatgaagcgc 300

cgcagctctc agaatgcagt attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 360

gacatccagc tgacccagtc tcctagcagc ctgagcgcca gcgtgggaga tagagtgacc 420

atcacctgta gcgcctcttc tagcgtgcgg ttcatccatt ggtaccagca gaagcccgga 480

aaggccccta agcggctgat ctacgacacc tctaagctgg ccagcggcgt gcctagcaga 540

ttcagcggca gcggaagcgg caccgacttt accctgacca tcagcagcct gcagccagaa 600

gacttcgcca cctactattg ccagcagtgg agcagcagcc cctttacatt tggccagggc 660

acaaaggtgg agatcaaggg tggcggtggc tcgggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga 720

tctgaggtgc agctggtgga atcaggagga ggactggtgc agccaggagg atctctgaga 780

ctgtcttgcg ccgccagcgg cttcaacatc aaggactact acatccattg ggtccggcag 840

gctccaggaa aaggactcga gtgggtggct tggatcgatc cagagaacgg cgacaccgag 900

ttcgtgccca agttccaggg aagagccacc atcagcgccg ataccagcaa gaacaccgcc 960

tacctgcaga tgaacagcct gagagccgag gacaccgccg tgtactattg caagaccggc 1020

ggattttggg gccagaccct ggtgaccgtg tcttctcatc atcatcatca tcattaaaag 1080

ctt 1083

<210> 3

<211> 528

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL7-CCL19-CD133 scFv 氨基酸序列

<400> 3

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp

20 25 30

Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu

35 40 45

Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Asn Asn Glu Phe Asn Phe

50 55 60

Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Arg Lys Arg Gln Phe Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp

85 90 95

Leu His Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr

100 105 110

Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Gly Glu Ala Gln Pro Thr

115 120 125

Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn

130 135 140

Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp

145 150 155 160

Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Glu Phe Ala Ala Thr Met

165 170 175

Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro Ala

180 185 190

Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val

195 200 205

Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu

210 215 220

Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu

225 230 235 240

Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg

245 250 255

Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser

260 265 270

Ser Gln Asn Ala Val Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val

275 280 285

Ser Thr Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser

290 295 300

Phe Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala

305 310 315 320

Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly

325 330 335

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly

340 345 350

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

355 360 365

Lys Ile Ser Thr Ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr Cys Leu

370 375 380

Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

385 390 395 400

Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

405 410 415

Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro

420 425 430

Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser

435 440 445

Asp Phe Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu

450 455 460

Trp Ile Gly Asp Ile Asp Pro Gly Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Leu

465 470 475 480

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr

485 490 495

Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

500 505 510

Tyr Cys Thr Leu Gly Ala Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

515 520 525

<210> 4

<211> 1617

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL7-CCL19-CD133 scFv 核苷酸序列

<400> 4

atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60

ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 120

ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180

aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240

ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 300

gatctccact tattaaaagt ttcagaaggc acaacaatac tgttgaactg cactggccag 360

gttaaaggaa gaaaaccagc tgccctgggt gaagcccaac caacaaagag tttggaagaa 420

aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacttgt gtttcctaaa gagactatta 480

caagagataa aaacttgttg gaataaaatt ctaatgggaa ctaaggagca cgaattcgcc 540

gccaccatgg ctttattgct tgccctctct ctactggttt tatggacttc ccctgcaccc 600

accttgtcag gtacaaatga tgcggaagac tgttgccttt cggtcacgca aaaaccaatt 660

ccgggctata tcgtacgtaa ctttcattac ctcctaataa aggatggatg tcgcgtgcct 720

gctgttgtct tcactaccct gcgagggcgg cagttatgcg cccccccaga ccaaccgtgg 780

gtagagagaa ttatccagag gttgcaacgt acaagtgcaa aaatgaagcg ccgcagctct 840

cagaatgcag tattagttcg ttacaccaag aaagtacccc aagtgtcaac tgatgttctg 900

atgacccaaa ccccgctgag tctgccggtt tcttttggcg atcaagttag cattagctgt 960

cgtagcagtc agagtctggc aaatagctac ggcaacacct atctgagctg gtacctgcat 1020

aaaccgggtc aaagtccgca actgctgatt tacggcatct cgaatcgctt cagcggtgtt 1080

ccggatcgtt tttctggttc tggtagcggt accgatttca ccctgaaaat cagcaccatc 1140

aaaccggaag atctgggcat gtactattgt ctgcagggta cccatcaacc gtataccttt 1200

ggcggcggta ccaaactgga aattaaacgt ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg 1260

ggtggcggcg gatctcaggt tcagctgaaa gattctggcg cagaactggt tcgtccgggc 1320

gcgagcgtga aactgagctg caaagcgagc ggttatacct tttccgactt cgagatgcac 1380

tgggtcaaac aaaccccggt acacggtctg gagtggattg gcgatattga tccgggtacc 1440

ggcgataccg cgtataacct gaaattcaaa ggcaaagcga ccctgaccac cgataaaagc 1500

agctctaccg cgtatatgga actgcgtagt ctgaccagcg aagattctgc agtttattat 1560

tgcaccctgg gcgcattcgt ttattggggt cagggtacgc tggttaccgt ttctgca 1617

<210> 5

<211> 120

<212> PRT

<213> 人类

<400> 5

Glu Phe Ala Ala Thr Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val

1 5 10 15

Leu Trp Thr Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu

20 25 30

Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val

35 40 45

Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala

50 55 60

Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp

65 70 75 80

Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala

85 90 95

Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser Gln Asn Ala Val Leu Val Arg Tyr Thr

100 105 110

Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr

115 120

<210> 6

<211> 360

<212> DNA

<213> 人类

<400> 6

gaattcgccg ccaccatggc tttattgctt gccctctctc tactggtttt atggacttcc 60

cctgcaccca ccttgtcagg tacaaatgat gcggaagact gttgcctttc ggtcacgcaa 120

aaaccaattc cgggctatat cgtacgtaac tttcattacc tcctaataaa ggatggatgt 180

cgcgtgcctg ctgttgtctt cactaccctg cgagggcggc agttatgcgc ccccccagac 240

caaccgtggg tagagagaat tatccagagg ttgcaacgta caagtgcaaa aatgaagcgc 300

cgcagctctc agaatgcagt attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 360

<210> 7

<211> 170

<212> PRT

<213> 人类

<400> 7

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp

20 25 30

Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu

35 40 45

Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Asn Asn Glu Phe Asn Phe

50 55 60

Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Phe Arg

65 70 75 80

Ala Ala Arg Lys Arg Gln Phe Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp

85 90 95

Leu His Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr

100 105 110

Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Gly Glu Ala Gln Pro Thr

115 120 125

Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn

130 135 140

Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp

145 150 155 160

Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His

165 170

<210> 8

<211> 531

<212> DNA

<213> 人类

<400> 8

atgttccatg tttcttttag gtatatcttt ggacttcctc ccctgatcct tgttctgttg 60

ccagtagcat catctgattg tgatattgaa ggtaaagatg gcaaacaata tgagagtgtt 120

ctaatggtca gcatcgatca attattggac agcatgaaag aaattggtag caattgcctg 180

aataatgaat ttaacttttt taaaagacat atctgtgatg ctaataagga aggtatgttt 240

ttattccgtg ctgctcgcaa gttgaggcaa tttcttaaaa tgaatagcac tggtgatttt 300

gatctccact tattaaaagt ttcagaaggc acaacaatac tgttgaactg cactggccag 360

gttaaaggaa gaaaaccagc tgccctgggt gaagcccaac caacaaagag tttggaagaa 420

aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacttgt gtttcctaaa gagactatta 480

caagagataa aaacttgttg gaataaaatt ctaatgggaa ctaaggagca c 531

<210> 9

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD133 scFv 氨基酸序列

<400> 9

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly

1 5 10 15

Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser

20 25 30

Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Thr Ile Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly

85 90 95

Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gln Val Gln Leu Lys Asp Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

130 135 140

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Phe

145 150 155 160

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

165 170 175

Gly Asp Ile Asp Pro Gly Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Leu Lys Phe

180 185 190

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

195 200 205

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

210 215 220

Thr Leu Gly Ala Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ala

<210> 10

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD133 scFv核苷酸序列

<400> 10

gatgttctga tgacccaaac cccgctgagt ctgccggttt cttttggcga tcaagttagc 60

attagctgtc gtagcagtca gagtctggca aatagctacg gcaacaccta tctgagctgg 120

tacctgcata aaccgggtca aagtccgcaa ctgctgattt acggcatctc gaatcgcttc 180

agcggtgttc cggatcgttt ttctggttct ggtagcggta ccgatttcac cctgaaaatc 240

agcaccatca aaccggaaga tctgggcatg tactattgtc tgcagggtac ccatcaaccg 300

tatacctttg gcggcggtac caaactggaa attaaacgtg gtggcggtgg ctcgggcggt 360

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtt cagctgaaag attctggcgc agaactggtt 420

cgtccgggcg cgagcgtgaa actgagctgc aaagcgagcg gttatacctt ttccgacttc 480

gagatgcact gggtcaaaca aaccccggta cacggtctgg agtggattgg cgatattgat 540

ccgggtaccg gcgataccgc gtataacctg aaattcaaag gcaaagcgac cctgaccacc 600

gataaaagca gctctaccgc gtatatggaa ctgcgtagtc tgaccagcga agattctgca 660

gtttattatt gcaccctggg cgcattcgtt tattggggtc agggtacgct ggttaccgtt 720

tctgca 726

<210> 11

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PSCA-scFv氨基酸序列

<400> 11

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Phe Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Asp Pro Glu Asn

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Phe Val Pro Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Ile Ser

180 185 190

Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Thr Gly Gly Phe Trp Gly

210 215 220

Gln Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

225 230

<210> 12

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PSCA-scFv核苷酸序列

<400> 12

gacatccagc tgacccagtc tcctagcagc ctgagcgcca gcgtgggaga tagagtgacc 60

atcacctgta gcgcctcttc tagcgtgcgg ttcatccatt ggtaccagca gaagcccgga 120

aaggccccta agcggctgat ctacgacacc tctaagctgg ccagcggcgt gcctagcaga 180

ttcagcggca gcggaagcgg caccgacttt accctgacca tcagcagcct gcagccagaa 240

gacttcgcca cctactattg ccagcagtgg agcagcagcc cctttacatt tggccagggc 300

acaaaggtgg agatcaaggg tggcggtggc tcgggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga 360

tctgaggtgc agctggtgga atcaggagga ggactggtgc agccaggagg atctctgaga 420

ctgtcttgcg ccgccagcgg cttcaacatc aaggactact acatccattg ggtccggcag 480

gctccaggaa aaggactcga gtgggtggct tggatcgatc cagagaacgg cgacaccgag 540

ttcgtgccca agttccaggg aagagccacc atcagcgccg ataccagcaa gaacaccgcc 600

tacctgcaga tgaacagcct gagagccgag gacaccgccg tgtactattg caagaccggc 660

ggattttggg gccagaccct ggtgaccgtg tcttct 696

Claims (24)

1.一种分离的多肽，所述多肽由第一部分和第二部分以及任选存在的第一部分与第二部分之间的连接肽组成，所述第一部分为趋化因子，所述第二部分为能够与抗原特异性结合的结合伴侣，

其中所述趋化因子为CCL19，且所述结合伴侣为PSCA scFv。

2.权利要求1的多肽，其中所述CCL19的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

3.权利要求1的多肽，其中所述PSCA scFv的氨基酸序列为SEQ ID NO:11。

4.权利要求1的多肽，其中所述结合伴侣是人的或经过人源化的。

5.权利要求1的多肽，其中所述多肽是人的或经过人源化的。

6.权利要求1的多肽，所述多肽从N端到C端具有以下结构：CCL19-连接肽-PSCA scFv的VH-连接肽-PSCA scFv的VL。

7.权利要求1-6任一项的多肽，其中所述多肽进一步包含适于多肽表达、检测、分离和/或纯化的标签。

8.权利要求1-6任一项的多肽，其中所述多肽以小于1×10^-5M的Kd值与抗原特异性结合。

9.权利要求1-6任一项的多肽，其中所述多肽以小于1×10^-6M的Kd值与抗原特异性结合。

10.权利要求1-6任一项的多肽，其中所述多肽以小于1×10^-7M的Kd值与抗原特异性结合。

11.权利要求1-6任一项的多肽，其中在存在参考结合分子的情况下，所述多肽竞争对特定抗原表位的竞争性效率占比大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％或大于80％。

12.权利要求1-6任一项的多肽，其中所述多肽为CCL19-PSCA scFv。

13.权利要求1-6任一项的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

14.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-13中任一项的多肽。

15.一种载体，其包含权利要求14的多核苷酸。

16.一种宿主细胞，其包含权利要求14的多核苷酸或权利要求15的载体。

17.权利要求14的多核苷酸或权利要求15的载体，其中所述多核苷酸经过密码子优化以适合在权利要求16的宿主细胞中表达。

18.一种产生多肽的方法，其包括培养权利要求16的宿主细胞。

19.权利要求18的方法，所述方法通常包含以下步骤：

-在允许表达权利要求1-13任一项的多肽的条件下培养权利要求16的宿主细胞；及

-从培养物回收由所述宿主细胞表达的所述多肽；及

-任选地进一步纯化和/或修饰所述多肽。

20.一种药物组合物，其包含权利要求1-13任一项的多肽和药学上可接受的载体。

21.一种治疗性T细胞，其包含权利要求14或权利要求17的多核苷酸。

22.权利要求1-13任一项的多肽或权利要求20的药物组合物在制备用于以下的药物中的用途：

1)预防和/或治疗与肿瘤或癌症相关的疾病；

2)控制肿瘤或癌症的生长、延长荷瘤对象的生存期；和/或

3)防治肿瘤或癌症转移及复发；

所述肿瘤或癌症选自膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌和透明细胞肾癌。

23.权利要求1-13任一项的多肽或权利要求20的药物组合物以及治疗性T细胞在制备用于以下的药物中的用途：

1)预防和/或治疗与肿瘤或癌症相关的疾病；

2)控制肿瘤或癌症的生长、延长荷瘤对象的生存期；和/或

3)防治肿瘤或癌症转移及复发；

所述肿瘤或癌症选自膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌和透明细胞肾癌。

24.一种试剂盒，其包含权利要求1-13任一项的多肽或权利要求20的药物组合物。

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