CN110835374A - 抗ccr8×ctla-4双特异性抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗CCR8×CTLA‑4双特异性抗体及其应用，具体地，本发明提供一种双特异性抗体，包括：(a)抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA‑4)的抗体或元件；和(b)与所述抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA‑4)的抗体或元件相连接的抗CCR8的抗体或元件。本发明的双特异性抗体可同时与CTLA‑4及CCR8结合，从而特异性靶向并清除肿瘤组织中浸润的一群具有免疫抑制活性的调节性T细胞(Treg)的活性，因此特别适用于肿瘤的免疫治疗。

Description

抗CCR8×CTLA-4双特异性抗体及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤免疫学领域，具体地，涉及一种抗CCR8×CTLA-4双特异性抗体及其应用。
背景技术
伴随多个靶向PD-1/PD-L1肿瘤免疫调节药物的成功上市，肿瘤免疫治疗取得了革命性的成功。但是，由于肿瘤组织中浸润了大量的免疫抑制性细胞，使得不同类型肿瘤患者人群对PD-1/PD-L1肿瘤免疫疗法的临床反应率仍然处在很低的水平。
限制PD-1/PD-L1免疫疗法临床响应率的原因很多，包括肿瘤组织浸润的杀伤性T细胞数量、肿瘤微环境中大量TGFβ、IDO、腺苷等免疫抑制因子的存在、以及包括Treg、MDSC等多种免疫抑制细胞在肿瘤组织的浸润。
因此，通过鉴定和开发能够特异性靶向和清除肿瘤组织中浸润的调节性T细胞的单克隆靶向治疗抗体，有望实现改善肿瘤免疫抑制微环境、提高肿瘤患者对PD-1/PD-L1肿瘤免疫调节药物的临床反应率及进一步延长肿瘤患者的生存期的目标。
此外，单克隆抗体在癌症的检测及生物靶向治疗方面成功的应用，引起了肿瘤治疗的变革。然而，传统的单抗(150kD)分子质量过大，难穿透组织，造成肿瘤区域的有效浓度较低，治疗效果不充分；传统的抗体具有很高的免疫原性，而改造的抗体很难达到原来的亲和力。此外，完全人源化的传统抗体开发周期长，生产成本高，稳定性不够等诸多因素限制其在临床中的应用及普及。
然而，目前本领域尚缺乏令人满意的针对CCR8单克隆抗体(尤其是纳米抗体)。因此，本领域迫切需要开发新的有效针对CCR8的特异性单克隆抗体，尤其是可特异性靶向和清除肿瘤组织中浸润的调节性T细胞的单克隆靶向治疗抗体，尤其是具有特异性的抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结构稳定、特异性佳且易于制备的双特异性抗体及其应用。
在本发明第一方面，提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括：
(a)抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的抗体或元件；和
(b)与所述抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的抗体或元件相连接的抗CCR8的抗体或元件。
在另一优选例中，所述抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的抗体或元件和所述抗CCR8的抗体或元件通过连接肽相连；优选地，所述连接肽包括抗体恒定区序列。
在另一优选例中，所述的元件包括配体或蛋白的胞外区。
在另一优选例中，所述的元件包括CCR8的配体(如CCL1)或蛋白的胞外区。
在另一优选例中，所述的元件包括CTLA-4的配体或蛋白的胞外区。
在另一优选例中，所述抗CCR8的抗体或元件连接到所述抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的抗体的选自下组的区域：重链可变区、重链恒定区、轻链可变区、或其组合。
在另一优选例中，所述抗CCR8的抗体或元件连接到所述抗CTLA-4的抗体的重链恒定区的末端。
在另一优选例中，所述抗CTLA-4的抗体或元件连接到所述抗CCR8的抗体的选自下组的区域：重链可变区、重链恒定区、轻链可变区、或其组合。
在另一优选例中，所述抗CTLA-4的抗体或元件连接到所述抗CCR8的抗体的重链恒定区的末端。
在另一优选例中，所述的抗CCR8的抗体选自下组：纳米抗体、单链抗体。
在另一优选例中，所述的抗CTLA-4的抗体选自下组：纳米抗体、单链抗体。
在另一优选例中，所述双特异性抗体为同源二聚体。
在另一优选例中，所述双特异性抗体从N端到C端具有式Ia或Ib所示的结构：
Figure BDA0001769977250000021
其中，
D各自独立地为无或抗CCR8的抗体或元件，且至少一个D为抗CCR8的抗体或元件；
VL代表抗CTLA-4抗体的轻链可变区；
VH代表抗CTLA-4抗体的重链可变区；
CH代表抗CTLA-4抗体的重链恒定区；
或者，在在式Ia或Ib中，
各D均代表抗CTLA-4的抗体或元件；
VL代表抗CCR8抗体的轻链可变区；
VH代表抗CCR8抗体的重链可变区；
CH代表抗CCR8抗体的重链恒定区；
L1、L2、L3、L4、L5、L6各自独立地为键或接头元件；
“～”代表二硫键或共价键；
“-”代表肽键；
其中，所述双特异性抗体具有同时结合CTLA-4以及结合CCR8的活性；
在另一优选例中，所述的抗CCR8抗体特异性靶向肿瘤组织中浸润的具有免疫抑制活性的Treg细胞。
在另一优选例中，所述的抗CCR8抗体对炎性Treg细胞和非Treg类型的T细胞不具有靶向性。
在另一优选例中，所述的炎性Treg细胞分泌IL-6和/或IL-17。
在另一优选例中，所述抗CCR8抗体具有VH链和VL链。
在另一优选例中，所述的VH链的互补决定区CDR由CDR1H、CDR2H和CDR3H组成。
在另一优选例中，所述的VL链的互补决定区CDR由CDR1L、CDR2L和CDR3L组成。
在另一优选例中，所述的抗CCR8抗体包括人源化抗体。
在另一优选例中，所述的人源化抗体包括全人源化抗体。
在另一优选例中，所述的抗CCR8抗体包括纳米抗体。
在另一优选例中，所述抗CCR8纳米抗体VHH链的互补决定区CDR由CDR1、CDR2和CDR3组成。
在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，所述VHH链包括框架区FR和所述的互补决定区CDR，所述的框架区FR由FR1、FR2、FR3和FR4组成。
在另一优选例中，所述的抗体包括单链抗体。
在另一优选例中，“D-L1-D-L2”中的D均为抗CCR8的抗体(对应于抗体D、E和F)。
在另一优选例中，所述接头元件可以相同或不相同。
在另一优选例中，所述双特异性抗体还含有(优选偶联有)可检测标记物、靶向标记、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述双特异性抗体偶联有肿瘤靶向标记偶联物。
在另一优选例中，所述双特异性抗体还包括所述双特异性抗体的活性片段和/或衍生物，其中，所述活性片段和/或所述衍生物保留了所述双特异性抗体的70-100％(如70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的抗CTLA-4活性和70-100％的抗CCR8活性。
在另一优选例中，所述抗体的衍生物具有与本发明抗体至少85％的序列同一性。
在另一优选例中，所述抗体的衍生物是本发明抗体经过一个或几个氨基酸缺失、插入和/或取代后并保持至少85％的同一性的序列。
在另一优选例中，所述抗体的衍生物具有与本发明抗体至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。
在另一优选例中，所述的取代为保守性取代。
在另一优选例中，所述双特异性抗体从N端到C端具有式IIa或IIb所示的结构：
Figure BDA0001769977250000041
其中，
各D均代表抗CCR8的抗体或元件；
VL代表抗CTLA-4抗体的轻链可变区；
VH代表抗CTLA-4抗体的重链可变区；
CH代表抗CTLA-4抗体的重链恒定区；
或者，
在式IIa或IIb中，
各D均代表抗CTLA-4的抗体或元件；
VL代表抗CCR8抗体的轻链可变区；
VH代表抗CCR8抗体的重链可变区；
CH代表抗CCR8抗体的重链恒定区；
L1、L2、L3、L4分别代表无或接头元件；
“～”代表二硫键；
“-”代表肽键；
其中，所述双特异性抗体具有同时结合CTLA-4以及结合CCR8的活性。
在本发明第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的双特异性抗体。
在本发明第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体同时含有本发明第二方面所述多核苷酸中的所有多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体分别含有本发明第二方面所述多核苷酸中的多核苷酸。
在另一优选例中，所述载体为表达载体。
在另一优选例中，所述载体包括质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
在本发明第五方面，提供了一种制备本发明第一方面所述双特异性抗体的方法，包括步骤：
(i)在合适的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，获得含有本发明第一方面所述的双特异性抗体的混合物；
(ii)对步骤(i)中得到的混合物进行纯化和/或分离，从而获得本发明第一方面所述的双特异性抗体。
在另一优选例中，所述纯化可以通过蛋白A亲和柱纯化分离获得目标抗体。
在另一优选例中，所述经过纯化分离后的目标抗体纯度大于95％，大于96％、大于97％、大于98％、大于99％，优选为100％。
在本发明第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(I)如本发明第一方面所述的双特异性抗体或其免疫偶联物；和
(II)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物中还含有额外的抗肿瘤剂。
在另一优选例中，所述药物组合物为单元剂型。
在另一优选例中，所述抗肿瘤剂包含紫杉醇、多柔比星、环磷酰胺、阿西替尼、乐伐替尼、或派姆单抗。
在另一优选例中，所述的抗肿瘤剂可以与所述双特异性抗体单独存在于独立的包装内，或所述抗肿瘤剂可以与所述双特异性抗体偶联。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括胃肠给药剂型或胃肠外给药剂型。
在另一优选例中，所述的胃肠外给药剂型包括静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射、颅内注射、或腔内注射。
在本发明第七方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：
(a)如本发明第一方面所述的双特异性抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联物部分选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在本发明第八方面，提供了如本发明第一方面所述双特异性抗体或如本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途，它被用于制备治疗肿瘤的药物组合物。
在另一优选例中，所述肿瘤为实体肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤为恶性肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：肝癌、胃癌、肝癌、白血病、肾瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、卵巢癌、胶质瘤、黑色素瘤、膀胱肿瘤、或其组合。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：向需要的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的抗体或本发明第六方面所述的药物组合物。
在本发明第九方面，提供了本发明第一方面所述的双特异性抗体的用途，它被用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于靶向肿瘤组织中浸润的具有免疫抑制活性的Treg细胞。
在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。
在另一优选例中，所述的制剂或组合物中还包括：额外的抗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述的额外的抗肿瘤的药物选自下组：小分子药物、抗体药物、针对其他免疫检测点的药物、或其组合。
在另一优选例中，所述的额外的抗肿瘤的药物包括：针对PD-1/PD-L1的小分子药物或抗体。
本发明第十方面，提供了如本发明第一方面所述的双特异性抗体、或其免疫偶联物的用途，它们被用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中CCR8蛋白和/或CTLA-4蛋白；
其中，所述药剂用于清除肿瘤组织中浸润的调节性T细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是显示了本发明一个实例中抗CCR8×CTLA-4双特异性抗体的结构示意图。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地获得一种双特异性抗体，由抗CTLA-4的抗体或其配体和抗CCR8单克隆抗体串联而成。优选地，本发明的双特异性抗体为同源二聚体。体外实验证实，本发明的双特异性抗体可同时针对CTLA-4及CCR8(尤其是可有效阻断CCR8与其配体(如CCL1)的结合)，经鉴定，本发明的双特异性抗体的亲和力高，稳定性好，且高效而特异性靶向肿瘤组织浸润的Treg细胞，副作用小，因此，本发明的双特异性抗体可以被开发为一种疗效优越的抗肿瘤药物。在此基础上，本发明人完成了本发明。
实验表明，本发明的双特异性抗体是性能优异的治疗性抗体，同时靶向人趋化因子(C-C基序)受体8(CCR8)与人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)。本发明抗体可特异性靶向肿瘤组织中浸润的、具有免疫抑制活性的Treg细胞。本发明抗体具有通过改善肿瘤免疫抑制微环境，提高现有免疫疗法临床反应率的潜力。在临床上,本发明抗体可与PD-1/PD-L1治疗性抗体联用，进而提高PD-1/PD-L1免疫疗法的临床反应率。
缩写
Treg:调节性T细胞
CCR8:趋化因子(C-C基序)受体8
Teff:效应性T细胞
术语
本发明的双特异性抗体可通过特异性靶向和清除肿瘤组织中Treg来改善肿瘤免疫抑制性微环境，具有提高现有免疫疗法临床治疗响应率的潜力。
如本文所用，术语“本发明抗体”、“本发明双特异抗体”“本发明的抗CCR8×CTLA-4抗体”、可互换使用，均指特异性识别和结合于CCR8(包括人CCR8)和CTLA-4的双功能的抗体。
如本文所用，术语“抗CCR8单克隆抗体”、“本发明CCR8单克隆抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于CCR8(包括人CCR8)的单克隆抗体。所述术语包括一般抗体(免疫球蛋白)和纳米抗体，也包括其具有相同或相似的针对CCR8结合活性的抗体片段、融合蛋白、或衍生多肽。
如本文所用，术语“本发明纳米抗体”、“本发明的抗CCR8纳米抗体”、“本发明CCR8纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于CCR8(包括人CCR8)的纳米抗体。
所述术语包括一般抗体(免疫球蛋白)和纳米抗体，也包括其具有相同或相似的针对CCR8结合活性的抗体片段、融合蛋白、或衍生多肽。
通常，“抗体”也称为“免疫球蛋白“其可以是天然或常规的抗体，其中两条重链通过二硫键彼此连接且每条重链与轻链通过二硫键连接。存在两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。存在五种主要的重链种类(或同型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每种链包含不同的序列结构域。轻链包括两个结构域或区，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，重链可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区都决定对抗原的结合识别和特异性。轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定区(CH)赋予重要的生物性质如抗体链结合、分泌、经胎盘的移动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性取决于抗体结合位点和抗原决定区间的结构互补。抗体结合位点由主要来自高度可变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高度可变或框架区(FR)的残基影响整体结构域结构且进而影响结合位点。互补决定区或CDR指共同限定结合亲和力和天然免疫球蛋白结合位点天然Fv区的特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各具有三个CDR，分另称为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。常规抗体抗原结合位点因此包括六个CDR，包含来自每个重链和轻链v区的CDR集合。
如本文所用，术语“单域抗体”、“纳米抗体”具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β-折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用，术语“框架区”(FR)指插入CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。优选地，本发明的FR是人抗体FR或其衍生物，所述人抗体FR的衍生物与天然存在的人抗体FR基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文所用，术语″人框架区″是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”指针对特定抗原的具有单一氨基酸组成的抗体分子，且不应理解为需要通过任何特定方法产生该抗体。单克隆抗体可由B细胞或杂交瘤的单一克隆产生，但还可为重组的，即通过蛋白工程产生。
如本文所用，术语“抗原”或“靶抗原”指能够由抗体或抗体样结合蛋白所结合的分子或分子的部分。该术语进一步指能够用于动物以产生能够与该抗原的表位结合的抗体的分子或分子的部分。靶抗原可具有一个或多个表位。对于每种由抗体或由抗体样结合蛋白识别的靶抗原，抗体样结合蛋白能够与识别靶抗原的完整抗体竞争。
如本文所用，术语“亲和力”理论上通过完整抗体和抗原间的平衡缔合来定义。本发明双特异性抗体的亲和力可以通过KD值(解离常数)(或其它测定方式)进行评估或测定，例如生物膜层干涉技术(Bio-layer interferometry BLI)，使用FortebioRed96仪器测量确定。
如本文所用，术语“接头”是指插入免疫球蛋白结构域中为轻链和重链的结构域提供足够的可动性以折叠成交换双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基。
合适的接头实例包括单甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)残基，接头中氨基酸残基的标识和序列可随着接头中需要实现的次级结构要素的类型而变化。。一种优选的接头如下：
抗CCR8抗体
本发明抗CCR8抗体的序列可以采用已知的或用常规方法制备的或经筛选或展示技术而开发的纳米抗体。本领域技术人员也可以通过本领域熟知的技术对本发明抗CCR8抗体进行修饰或改造，例如添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基，从而进一步增加抗CCR8的亲和力或结构稳定性，并通过常规的测定方法获得修饰或改造后的结果。
本发明抗CCR8抗体与哺乳动物CCR8结合，优选为人CCR8结合。
优选地，本发明的抗CCR8抗体是纳米抗体。
抗CTLA-4抗体
本发明抗CTLA-4抗体的序列可以采用已知的或用常规方法制备的或经筛选或展示技术而开发的纳米抗体。本领域技术人员也可以通过本领域熟知的技术对本发明抗CTLA-4抗体进行修饰或改造，例如添加、缺失和/或取代一个或几个氨基酸残基，从而进一步增加抗CTLA-4的亲和力或结构稳定性，并通过常规的测定方法获得修饰或改造后的结果。
本发明抗CTLA-4抗体与哺乳动物CTLA-4结合，优选为人CTLA-4结合。
双特异性抗体
如本文所用，术语“本发明双特异性抗体”、、“本发明抗CCR8×CTLA-4双抗”、“本发明双功能融合抗体”可互换使用，是指同时结合CCR8和CTLA-4的抗CCR8×CTLA-4双特异性抗体。
在本发明中，所述双特异性抗体包括：
(a)抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的抗体；和
(b)与所述抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的抗体相连接的抗CCR8的抗体。
在一优选实施方式中，本发明的双特异性抗体从N端到C端具有式Ia或Ib所示的结构。
在一优选实施方式中，本发明双抗由细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抗体以及抗程序性死亡因子1(CCR8)的纳米抗体融合而成，且具有相互对称的两对肽链，每对肽链含有轻链L链和重链H链，所有的肽链均由二硫键相连，其中任一一对肽链从N端到C端具有式IIa或IIb中所示的L链和H链结构。
在本发明中，两条如式Ia或Ib结构式所示的序列通过二硫键相连，从而形成对称的双特异性抗体结构。
本发明双特异性抗体不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明双特异性抗体指具有抗CCR8以及抗CTLA-4活性的、包括两条上述式I结构的抗体。该术语还包括具有与本发明双特异性抗体相同功能的、包括两条上述式I结构的抗体的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明双特异性抗体的活性片段和活性衍生物。
该双特异性抗体的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“本发明双特异性抗体的保守性变异体”指与本发明双特异性抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
Figure BDA0001769977250000121
Figure BDA0001769977250000131
编码核酸和表达载体
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明的核酸(以及核酸组合)可用于在合适的表达系统产生本发明的重组抗体。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的双特异性抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.肿瘤治疗剂(例如，顺铂)或任何形式的抗肿瘤药物等；11、用于治疗肿瘤的药物，其中包括但并不限于：抗肿瘤的小分子药物、抗体药物、针对其他免疫检测点的药物，尤其是针对PD-1/PD-L1的小分子药物或抗体。
CCR8
CCR8在单核细胞和Th2淋巴细胞以及脑，脾和胸腺中表达，它是趋化因子CCL1的受体，其对Th2细胞具有趋化性。
人和一些非人哺乳动物的CCR8的氨基酸序列和核苷酸序列是已知的。
在本发明中，CCR8的序列包括野生型和突变型的序列。特别优选的是人的野生型序列。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有本发明上述的双特异性抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射(如腹膜内)、颅内注射、或腔内注射。
本发明的药物组合物可直接用于结合CCR8蛋白分子或CTLA-4，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
1.本发明双特异性抗体可以同时结合CTLA-4以及CCR8，且保持双特异性抗体与结合靶标的结合构型不变，分子稳定。
2.本发明双特异性抗体可以高效表达，且制法简便，获得的抗体纯度高。
3.本发明双特异性抗体与结合靶标的结合亲和力高，阻断活性好，具有协同的阻断活性。
4.本发明有效地解决了靶向肿瘤浸润Treg细胞优先性和外周Treg细胞特异性的关键问题。本发明的双特异性抗体优先靶向和清除肿瘤浸润Treg细胞，且对外周Treg细胞保留一定的杀伤作用，但是对Teff仅有极其微弱的杀伤活性或无杀伤活性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
如无特别说明，实施例中所用的材料或试剂均为市售产品。
实施例1：人CCR8蛋白的表达纯化
将人CCR8的核苷酸序列合成在市售载体，将制备的将质粒与转染试剂PEI 1:3混合均匀后静置20min，然后加入到合适的细胞(HEK293F细胞)中，37℃，6％CO2摇床培养箱中培养5-6天；收集细胞上清，与Protein A珠子在室温下结合1小时；用磷酸盐缓冲液pH7.0洗涤珠子后，再用0.1M pH3.0 Glycine洗脱蛋白；
将洗脱的蛋白超滤至PBS中，测定产量后取样进行SDS-PAGE检测，其余蛋白保存于-80℃冰箱；
实施例2：CCR8单克隆抗体的制备
在本实施例中，采用一全人源抗体酵母筛选平台，通过CCR8+CHO细胞稳转株筛选CCR8特异性单克隆抗体。
实施例3抗CCR8纳米抗体的制备
将一定量的hCCR8抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只羊驼，每周一次，共免疫多次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。免疫结束后，提取100mL外周血淋巴细胞并提取总RNA；合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；并构建噬菌体展示文库。
通过筛选及鉴定，获得多株纳米抗体。
实施例4：单克隆抗体的性能测定
在本实施例中，采用常规方法，进行以下项目的测定：
(a)抗CCR8mAb与CCR8+Treg细胞的结合实验
(b)抗CCR8mAb的ADCC效应实验；
(c)抗CCR8mAb与肿瘤组织中功能性Treg细胞的结合实验
结果表明：
(a)抗CCR8mAb特异性结合于CCR8+Treg细胞。
(b)抗CCR8mAb具有ADCC效应。
(c)抗CCR8mAb优先结合于肿瘤组织中功能性Treg细胞。
实施例5：抗CCR8×CTLA-4双特异性抗体分子序列设计
本发明提供的可同时结合CCR8和CTLA-4胞外结构域的双特异性抗体结构如图1所示。
实施例6：抗CCR8×CTLA-4双特异性抗体表达纯化
将合成基因所在的质粒共同瞬转至HEK293F细胞中，表达后，通过与protein A的结合进行纯化，使用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗掉杂蛋白和其他杂质，之后再用0.1M pH3.0的Glycine洗脱目标抗体蛋白，从而获得抗CCR8×CTLA-4的双特异性抗体。
制备后的抗体分别分装置于-80℃保存。
实施例7：双特异性抗体亲和力测定
7.1针对人CCR8的结合
对于上述获得的双特异性抗体，测定其对重组的人CCR8的结合性能。
结果表明，双特异性抗体针对人CCR8有高亲和力。
7.2针对人CTLA-4的结合
同样地，测定上述获得的双特异性抗体对重组的人CTLA-4的结合性能。
结果表明，双特异性抗体针对人CTLA-4有高亲和力。
7.3双特异抗体与CCR8+Treg、CTLA4+Treg和CCR8+CTLA4+Treg细胞的结合实验
结果表明，双特异性抗体特异性结合于CCR8+Treg细胞和CCR8+CTLA4+Treg细胞。
7.4双特异抗体对CCR8+Treg、CTLA4+Treg和CCR8+CTLA4+Treg细胞的ADCC效应实验；
结果表明，双特异性抗体对CCR8+Treg、CTLA4+Treg和CCR8+CTLA4+Treg细胞均具有ADCC效应
7.5双特异抗体与肿瘤组织中功能性Treg细胞的结合实验
结果表明，双特异性抗体优先结合于肿瘤组织中功能性Treg细胞。
讨论
Treg是一群异质性T细胞亚群，在炎症和肿瘤等疾病中发挥着重要的免疫调节作用。尤为重要的是，在肿瘤组织中浸润的免疫抑制性细胞中，调节性T细胞(Treg)是主要的组成成分之一。有研究报道，靶向和清除肿瘤组织中的Treg细胞是决定CTLA-4单克隆抗体(Yervoy)肿瘤免疫治疗临床疗效的关键作用机制。
Vazquez-Lombardi等人报道了野生型IL2-Fc融合蛋白可通过Fc介导的免疫效应作用清除Treg细胞，进而增强机体的抗肿瘤作用。
Koji Kurose等报道了利用CCR4单克隆靶向抗体靶向和清除Treg细胞，以及用于肿瘤临床治疗的研究。虽然肿瘤组织中浸润的功能性Treg细胞的CCR4表达水平比外周Treg表达水平偏低，但临床1期结果显示CCR4单克隆抗体可以有效清除外周的Treg细胞并展现了很好的临床应用安全性(Koji Kurose et al.,J Thorac Oncol.,2015；Koji Kurose etal.,Cl in Cancer Res.,2015)。
本发明人研究表明，胰腺癌肿瘤组织中浸润的调节性T细胞中Helios-CCR8-Treg细胞亚群可以释放高水平的IL-2和IFNγ；Helios+CCR8-Treg可以释放中等水平IL-2和IFNγ；Helios+CCR8+Treg基本不释放IL-2和IFNγ。
同时，还发现CCR8的表达水平与Treg细胞的免疫抑制活性呈现正相关性，而与肿瘤患者的生存期呈现负相关性。
Daniel等人报道了乳腺癌、肠癌、肺癌等肿瘤组织中浸润的Treg细胞中，CCR8呈现特异性的上调表达，并发现靶向CCR8特异性抗体可以显著抑制结直肠癌小鼠肿瘤模型中肿瘤的生长和延长小鼠的生存期(Daniel O Villarreal et al.,Cancer Res.2018)。
本发明人通过大量筛选而获得的高特异性的针对CCR8的单克隆抗体，不仅可以高效地特异性清除肿瘤浸润的Treg细胞，增强机体的抗肿瘤免疫反应；而且还可以有效地抑制CCR8阳性Treg细胞向肿瘤组织浸润。
研究表明，抗CTLA-4单克隆抗体在有效清除Treg细胞，也可以清除激活的Teff细胞，导致抗CTLA-4单克隆抗体在临床应用中造成很强的毒副作用。
此外，本发明所制备的双特异性抗体，可同时靶向CCR8和CTLA-4。该双特异性抗体，具有靶向肿瘤组织Treg细胞的优先性和靶向Treg细胞的特异性的双重优点。因此，该双特异抗体优先结合高表达CCR8或CTLA-4抗原的Treg细胞，具有优先清除肿瘤组织中浸润Treg细胞的优势，同时保留一定的外周Treg细胞杀伤作用。此外，本发明的双特异性抗体对低表达CTLA-4的Teff细胞杀伤作用极弱，因此具有很高的安全性。
本发明抗体与其他一些抗体的比较见下表2。
表2本发明抗体与针对其他靶点的抗体的比较
Figure BDA0001769977250000201
本发明的研究表明，通过CCR8特异性抗体(尤其是本发明的双特异性抗体)来靶向和清除具有免疫抑制活性的Treg细胞，而对抗肿瘤具有辅助作用、释放炎性因子的Treg细胞不具杀伤作用的治疗性抗体具有巨大的临床意义和市场价值。
此外，本发明的双特异性抗体可高特异性靶向肿瘤组织中浸润的、具有免疫抑制活性的Treg细胞,而不具有靶向肿瘤组织中炎性Treg细胞、外周Treg细胞、及Teff细胞的功能，因此，特别适合治疗性抗体。本发明抗体可在临床上与PD-1/PD-L1治疗性抗体或其他针对免疫检测点的抗体联用，进而提高PD-1/PD-L1免疫疗法或类似免疫检测点疗法的临床反应率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括：
(a)抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的抗体或元件；和
(b)与所述抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的抗体或元件相连接的抗CCR8的抗体或元件。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体从N端到C端具有式Ia或Ib所示的结构：
Figure FDA0001769977240000011
其中，
D各自独立地为无或抗CCR8的抗体或元件，且至少一个D为抗CCR8的抗体或元件；
L1、L2、L3、L4、L5、L6各自独立地为键或接头元件；
VL代表抗CTLA-4抗体的轻链可变区；
VH代表抗CTLA-4抗体的重链可变区；
CH代表抗CTLA-4抗体的重链恒定区；
“～”代表二硫键或共价键；
“-”代表肽键；
其中，所述双特异性抗体具有同时结合CTLA-4以及结合CCR8的活性。
3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体从N端到C端具有式IIa或IIb所示的结构：
Figure FDA0001769977240000012
其中，
各D均代表抗CCR8的抗体或元件；
L1、L2、L3、L4分别代表无或接头元件；
VL代表抗CTLA-4抗体的轻链可变区；
VH代表抗CTLA-4抗体的重链可变区；
CH代表抗CTLA-4抗体的重链恒定区；
“～”代表二硫键；
“-”代表肽键；
其中，所述双特异性抗体具有同时结合CTLA-4以及结合CCR8的活性。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的双特异性抗体。
5.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的载体或基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种制备权利要求1所述的双特异性抗体的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)在合适的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，获得含有权利要求1所述的双特异性抗体的混合物；
(ii)对步骤(i)中得到的混合物进行纯化和/或分离，从而获得权利要求1所述的双特异性抗体。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
(I)如权利要求1所述的双特异性抗体；和
(II)药学上可接受的载体。
9.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：
(a)如权利要求1所述的双特异性抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
10.如权利要求1所述双特异性抗体或如权利要求9所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物组合物。
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