CN110835371A - 抗ccr8单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗CCR8单克隆抗体及其应用。本发明公开了一种抗CCR8的单克隆抗体，该抗体具有阻断CCR8与其配体之间结合的功能，并且本发明单克隆抗体特异性靶向肿瘤组织中浸润的具有免疫抑制活性的Treg细胞，而对炎性Treg细胞和非Treg类型的T细胞不具有靶向性。相比于其他靶向广谱Treg细胞抗体，本发明靶向CCR8的治疗性抗体具有更好的安全性和有效性，因此特别适用于肿瘤的免疫治疗。

Description

抗CCR8单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及抗CCR8单克隆抗体及其应用。
背景技术
伴随多个靶向PD-1/PD-L1肿瘤免疫调节药物的成功上市，肿瘤免疫治疗取得了革命性的成功。但是，由于肿瘤组织中浸润了大量的免疫抑制性细胞，使得不同类型肿瘤患者人群对PD-1/PD-L1肿瘤免疫疗法的临床反应率仍然处在很低的水平。
限制PD-1/PD-L1免疫疗法临床响应率的原因很多，包括肿瘤组织浸润的杀伤性T细胞数量、肿瘤微环境中大量TGFβ、IDO、腺苷等免疫抑制因子的存在、以及包括Treg、MDSC等多种免疫抑制细胞在肿瘤组织的浸润。
因此，通过鉴定和开发能够特异性靶向和清除肿瘤组织中浸润的调节性T细胞的单克隆靶向治疗抗体，有望实现改善肿瘤免疫抑制微环境、提高肿瘤患者对 PD-1/PD-L1肿瘤免疫调节药物的临床反应率及进一步延长肿瘤患者的生存期的目标。
此外，单克隆抗体在癌症的检测及生物靶向治疗方面成功的应用，引起了肿瘤治疗的变革。然而，传统的单抗(150kD)分子质量过大，难穿透组织，造成肿瘤区域的有效浓度较低，治疗效果不充分；传统的抗体具有很高的免疫原性，而改造的抗体很难达到原来的亲和力。此外，完全人源化的传统抗体开发周期长，生产成本高，稳定性不够等诸多因素限制其在临床中的应用及普及。
纳米抗体是目前最小的抗体分子，其分子量是普通抗体的1/10。纳米抗体除具备单克隆抗体的抗原反应性外，还拥有一些独特的功能特性，如分子质量小，稳定性强、可溶性好、易表达、免疫原性弱、穿透性强、靶向性强、人源化简单，制备成本低廉等，几乎完美克服了传统抗体开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷。
然而，目前本领域尚缺乏令人满意的针对CCR8单克隆抗体(尤其是纳米抗体)。因此，本领域迫切需要开发新的有效针对CCR8的特异性单克隆抗体，尤其是可特异性靶向和清除肿瘤组织中浸润的调节性T细胞的单克隆靶向治疗抗体。
发明内容
本发明的目的就是提供一类有效针对CCR8的特异性单克隆抗体，以及所述抗体在特异性靶向和清除肿瘤组织中浸润的调节性T细胞方面的应用。
在本发明的第一方面，一种抗CCR8单克隆抗体，所述的单克隆抗体特异性针对CCR8。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体特异性靶向肿瘤组织中浸润的具有免疫抑制活性的Treg细胞。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体对炎性Treg细胞和非Treg类型的T细胞不具有靶向性。
在另一优选例中，所述的炎性Treg细胞分泌IL-6和/或IL-17。
在另一优选例中，所述抗CCR8单克隆抗体具有VH链和VL链。
在另一优选例中，所述的VH链的互补决定区CDR由CDR1H、CDR2H和CDR3H 组成。
在另一优选例中，所述的VL链的互补决定区CDR由CDR1L、CDR2L和CDR3L 组成。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体包括人源化抗体。
在另一优选例中，所述的人源化抗体包括全人源化抗体。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体包括纳米抗体。
在另一优选例中，所述抗CCR8纳米抗体VHH链的互补决定区CDR由CDR1、CDR2 和CDR3组成。
在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、 FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，所述VHH链包括框架区FR和所述的互补决定区CDR，所述的框架区FR由FR1、FR2、FR3和FR4组成。
在另一优选例中，所述的抗体包括单链抗体。
在另一优选例中，所述的抗体包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的抗体包括双特异性或多特异性抗体或融合蛋白。
本发明第二方面，提供了一种抗CCR8单克隆抗体的用途，它被用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于靶向肿瘤组织中浸润的具有免疫抑制活性的Treg细胞。
在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。
在另一优选例中，所述的制剂或组合物中还包括：额外的抗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述的额外的抗肿瘤的药物选自下组：小分子药物、抗体药物、针对其他免疫检测点的药物、或其组合。
在另一优选例中，所述的额外的抗肿瘤的药物包括：针对PD-1/PD-L1的小分子药物或抗体。
本发明第三方面，提供了提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
(a)如本发明一方面所述的抗CCR8单克隆抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂) 或任何形式的纳米颗粒等。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明抗CCR8纳米抗体的VHH链、或所述的抗CCR8纳米抗体。
在另一优选例中，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明所述的抗CCR8纳米抗体的VHH链、或本发明所述的抗CCR8纳米抗体。
本发明第四方面，提供了一种药物组合物，含有：
(i)本发明第一方面抗CCR8的单克隆抗体、或本发明第三方面所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：肝癌、胃癌、肝癌、白血病、肾瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、卵巢癌、胶质瘤、黑色素瘤、膀胱肿瘤、或其组合。
本发明第五方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本发明第一方面所述的抗CCR8单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的多核苷酸包括DNA或RNA。
本发明第六方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第五方面所述的多核苷酸。
本发明第七方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第六方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第五方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞。
本发明八方面，提供了一种产生抗CCR8单克隆抗体的方法，包括步骤：
(a)在适合产生单克隆抗体的条件下，培养本发明第七方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗CCR8单克隆抗体的培养物；以及
(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗CCR8单克隆抗体。
本发明第九方面，提供了本发明所述的抗CCR8单克隆抗体的用途，用于制备 (a)用于检测CCR8分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。
在另一优选例中，所述的治疗肿瘤的药物含有(a)本发明的抗CCR8单克隆抗体抗体以及(b)抗PD-1/PD-L1的小分子药物或抗体。
本发明第十方面，提供了本发明所述的抗CCR8单克隆抗体的一种或多种的用途：
(i)用于检测人CCR8分子；
(ii)用于流式检测；
(iii)用于细胞免疫荧光检测；
(iv)用于治疗肿瘤；
(v)用于肿瘤诊断。
在另一优选例中，所述用途为非诊断的和非治疗的。
本发明第十一方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明所述的单克隆抗体的序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签和HA标签
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于CCR8蛋白。
本发明第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的单克隆抗体、或本发明第三方面所述的免疫偶联物的用途，它们被用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中CCR8蛋白；
其中，所述药剂用于清除肿瘤组织中浸润的调节性T细胞。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：肝癌、胃癌、肝癌、白血病、肾瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、卵巢癌、胶质瘤、黑色素瘤、膀胱肿瘤、或其组合。
本发明第十三方面，提供了一种检测样品中CCR8蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明第一方面所述的单克隆抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CCR8 蛋白。
本发明第十四方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第三方面所述的免疫偶联物。
在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得一类抗CCR8单克隆抗体。实验结果表明，本发明获得的CCR8单克隆抗体能够有效阻断CCR8与其配体(尤其是CCL1)之间的相互作用，令人意外的是，本发明的人源化CCR8单克隆抗体或纳米抗体更能够有效阻断CCR8与其配体的结合，经鉴定，本发明的CCR8 单克隆抗体(尤其是全人源抗体)的亲和力高，稳定性好，且高效而特异性靶向肿瘤组织浸润的Treg细胞，副作用小。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明人利用全人源抗体酵母筛选平台，通过人源的CCR8+CHO细胞稳转株筛选CCR8特异性单克隆抗体。
此外，本发明人还利用人源的CCR8抗原蛋白免疫骆驼或羊驼，获得高质量的免疫纳米抗体(VHH)的基因文库。然后将CCR8蛋白分子偶联在酶标板上，展示CCR8 蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了CCR8特异性的纳米抗体基因。再将此基因转至宿主细胞中，从而获得了能高效表达的、且特异性高的纳米抗体株。
实验表明，本发明的单克隆抗体是性能优异的治疗性抗体，它可特异性靶向肿瘤组织中浸润的、具有免疫抑制活性的Treg细胞。本发明抗体具有通过改善肿瘤免疫抑制微环境，提高现有免疫疗法临床反应率的潜力。在临床上,本发明单克隆抗体可与PD-1/PD-L1治疗性抗体联用，进而提高PD-1/PD-L1免疫疗法的临床反应率。
缩写
Treg:调节性T细胞
CCR8:趋化因子(C-C基序)受体8
Teff:效应性T细胞
术语
本发明的单克隆抗体可通过特异性靶向和清除肿瘤组织中Treg来改善肿瘤免疫抑制性微环境，具有提高现有免疫疗法临床治疗响应率的潜力。
如本文所用，术语“本发明抗体”、“本发明单克隆抗体”/“本发明的抗 CCR8单克隆抗体”、“本发明CCR8单克隆抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于CCR8(包括人CCR8)的单克隆抗体。所述术语包括一般抗体(免疫球蛋白)和纳米抗体，也包括其具有相同或相似的针对CCR8结合活性的抗体片段、融合蛋白、或衍生多肽。
如本文所用，术语“本发明纳米抗体”、“本发明的抗CCR8纳米抗体”、“本发明CCR8纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于CCR8(包括人CCR8) 的纳米抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000 道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“单域抗体(VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等, NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗CCR8蛋白抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合CCR8蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR 与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或 (ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv) 附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有CCR8蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地 1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N 末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内) 氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA 所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明单克隆抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1 进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3) 仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且, 可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子 (或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、 COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用 CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、 PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等；11、用于治疗肿瘤的药物，其中包括但并不限于：抗肿瘤的小分子药物、抗体药物、针对其他免疫检测点的药物，尤其是针对PD-1/PD-L1的小分子药物或抗体。
CCR8
CCR8在单核细胞和Th2淋巴细胞以及脑，脾和胸腺中表达，它是趋化因子CCL1 的受体，其对Th2细胞具有趋化性。
人和一些非人哺乳动物的CCR8的氨基酸序列和核苷酸序列是已知的。
在本发明中，CCR8的序列包括野生型和突变型的序列。特别优选的是人的野生型序列。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合CCR8蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。所述的其他治疗剂包括但并不限于：抗肿瘤的小分子药物、抗体药物、针对其他免疫检测点的药物，尤其是针对PD-1/PD-L1的小分子药物或抗体。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克 /千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
标记的纳米抗体
在本发明的一个优选例中，所述纳米抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗CCR8的纳米抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的纳米抗体。
本发明的抗CCR8纳米抗体具有很好的特异性，很高的效价。
检测方法
本发明还涉及检测CCR8蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中CCR8蛋白的水平。本
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测CCR8水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别CCR8 蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
应用
如上所述，本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与CCR8相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对CCR8的临床诊断和靶向治疗。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明单克隆抗体高特异性针对人的具有正确空间结构的CCR8蛋白。
(b)本发明单克隆抗体的亲和力强。
(c)本发明单克隆抗体的生产简便。
(d)虽然目前已有一些抗体具有靶向和清除Treg活性，例如包括anti-CTLA-4mAb,IL2-Fc和Anti-CCR4mAb等，然而与这些抗体，本发明的靶向CCR8的单克隆抗体的最大优势在于：可特异性靶向肿瘤组织中浸润的具有免疫抑制活性的Treg 细胞，而对分泌IL-6、IL-17的炎性Treg细胞和非Treg类型的T细胞不具有靶向性。
(f)相比于其他靶向广谱Treg细胞抗体，本发明靶向CCR8的治疗性抗体具有更好的安全性和有效性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：人CCR8蛋白的表达纯化
将人CCR8的核苷酸序列合成在市售载体，将制备的将质粒与转染试剂PEI 1:3 混合均匀后静置20min，然后加入到合适的细胞(HEK293F细胞)中，37℃，6％CO2摇床培养箱中培养5-6天；收集细胞上清，与Protein A珠子在室温下结合1小时；用磷酸盐缓冲液pH7.0洗涤珠子后，再用0.1M pH3.0Glycine洗脱蛋白；
将洗脱的蛋白超滤至PBS中，测定产量后取样进行SDS-PAGE检测，其余蛋白保存于-80℃冰箱；
实施例2：CCR8单克隆抗体的制备
在本实施例中，采用一全人源抗体酵母筛选平台，通过CCR8+CHO细胞稳转株筛选CCR8特异性单克隆抗体。
实施例3纳米抗体的制备
将一定量的hCCR8抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只羊驼，每周一次，共免疫多次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。免疫结束后，提取100mL 外周血淋巴细胞并提取总RNA；合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；并构建噬菌体展示文库。
通过筛选及鉴定，获得多株纳米抗体。
实施例4：单克隆抗体的性能测定
在本实施例中，采用常规方法，进行以下项目的测定：
(a)抗CCR8 mAb与CCR8+Treg细胞的结合实验
(b)抗CCR8 mAb的ADCC效应实验；
(c)抗CCR8 mAb与肿瘤组织中功能性Treg细胞的结合实验
结果表明：
(a)抗CCR8 mAb特异性结合于CCR8+Treg细胞。
(b)抗CCR8 mAb具有ADCC效应。
(c)抗CCR8 mAb优先结合于肿瘤组织中功能性Treg细胞。
讨论
Treg是一群异质性T细胞亚群，在炎症和肿瘤等疾病中发挥着重要的免疫调节作用。尤为重要的是，在肿瘤组织中浸润的免疫抑制性细胞中，调节性T 细胞(Treg)是主要的组成成分之一。有研究报道，靶向和清除肿瘤组织中的 Treg细胞是决定CTLA-4单克隆抗体(Yervoy)肿瘤免疫治疗临床疗效的关键作用机制。
Vazquez-Lombardi等人报道了野生型IL2-Fc融合蛋白可通过Fc介导的免疫效应作用清除Treg细胞，进而增强机体的抗肿瘤作用。
Koji Kurose等报道了利用CCR4单克隆靶向抗体靶向和清除Treg细胞，以及用于肿瘤临床治疗的研究。虽然肿瘤组织中浸润的功能性Treg细胞的 CCR4表达水平比外周Treg表达水平偏低，但临床1期结果显示CCR4单克隆抗体可以有效清除外周的Treg细胞并展现了很好的临床应用安全性(Koji Kurose et al.,J Thorac Oncol.,2015；KojiKurose et al.,Clin Cancer Res.,2015)。
本发明人研究表明，胰腺癌肿瘤组织中浸润的调节性T细胞中 Helios-CCR8-Treg细胞亚群可以释放高水平的IL-2和IFNγ；Helios+CCR8-Treg 可以释放中等水平IL-2和IFNγ；Helios+CCR8+Treg基本不释放IL-2和IFNγ。
同时，还发现CCR8的表达水平与Treg细胞的免疫抑制活性呈现正相关性，而与肿瘤患者的生存期呈现负相关性。
Daniel等人报道了乳腺癌、肠癌、肺癌等肿瘤组织中浸润的Treg细胞中， CCR8呈现特异性的上调表达，并发现靶向CCR8特异性抗体可以显著抑制结直肠癌小鼠肿瘤模型中肿瘤的生长和延长小鼠的生存期(Daniel O Villarreal et al.,Cancer Res.2018)。
本发明人通过大量筛选而获得的高特异性的针对CCR8的单克隆抗体，不仅可以高效地特异性清除肿瘤浸润的Treg细胞，增强机体的抗肿瘤免疫反应；而且还可以有效地抑制CCR8阳性Treg细胞向肿瘤组织浸润。
本发明抗体与其他一些抗体的比较见下表2。
表2本发明抗体与针对其他靶点的抗体的比较
Figure RE-GDA0001803681830000161
本发明的研究表明，通过CCR8特异性抗体(尤其是本发明抗体)来靶向和清除具有免疫抑制活性的Treg细胞，而对抗肿瘤具有辅助作用、释放炎性因子的Treg细胞不具杀伤作用的治疗性抗体具有巨大的临床意义和市场价值。
此外，本发明的单克隆抗体可高特异性靶向肿瘤组织中浸润的、具有免疫抑制活性的Treg细胞,而不具有靶向肿瘤组织中炎性Treg细胞、外周Treg细胞、及Teff细胞的功能，因此，特别适合治疗性抗体。本发明抗体可在临床上与PD-1/PD-L1治疗性抗体或其他针对免疫检测点的抗体联用，进而提高 PD-1/PD-L1免疫疗法或类似免疫检测点疗法的临床反应率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种抗CCR8单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体特异性针对CCR8。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体特异性靶向肿瘤组织中浸润的具有免疫抑制活性的Treg细胞。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体对炎性Treg细胞和非Treg类型的T细胞不具有靶向性。
4.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体包括人源化抗体。
5.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体包括纳米抗体。
6.如权利要求1所述的抗CCR8单克隆抗体的用途，其特征在于，它被用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于靶向肿瘤组织中浸润的具有免疫抑制活性的Treg细胞。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的组合物包括药物组合物。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的制剂或组合物中还包括：额外的抗肿瘤的药物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的额外的抗肿瘤的药物选自下组：小分子药物、抗体药物、针对其他免疫检测点的药物、或其组合；
较佳地，所述的额外的抗肿瘤的药物包括：针对PD-1/PD-L1的小分子药物或抗体。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：
(a)权利要求1所述的抗CCR8单克隆抗体和/或其免疫偶联物；以及
(b)药学上可接受的载体。
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