CN107814845B - 新的抗pd-1纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种特异性针对人程序性细胞死亡蛋白PD‑1的纳米抗体。本发明公开了一种抗PD‑1的纳米抗体，该抗体具有阻断PD‑1与其配体PD‑L1相互结合的作用。本发明公布了这种纳米抗体及编码该纳米抗体的核苷酸序列，相应的表达载体和能够表达该纳米抗体的宿主细胞，以及本发明纳米抗体的生产方法。同时还公布了人源化的PD‑1纳米抗体序列，人源化后的纳米抗体依然具有阻断PD‑1与其配体PD‑L1相互结合的功能，保留较高的亲和力。

Description

新的抗PD-1纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及针对于程序性细胞死亡蛋白PD-1的纳米抗体及其氨基酸序列。
背景技术
程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death-1,PD-1)，也被称为CD279(分化簇279)，是一种在人体中由PDCD1基因编码的蛋白质。程序性细胞死亡蛋白1是一个含有268个氨基酸的I型跨膜蛋白，它的结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域(21-170位氨基酸)、疏水的跨膜区(171-191位氨基酸)以及胞内区(192-288位氨基酸)。胞内区包括C端和N端氨基酸残基，含有2个独立的磷酸化作用位点，分别为免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif，ITIM)，和免疫受体酪氨酸开关基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif，ITSM)。PD-1是一个细胞表面受体，属于免疫球蛋白超家族，主要表达在活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞表面。PD-1结合两个配体，程序性细胞死亡配体1(programmed cell death 1ligand 1,PD-L1,B7-H1)和程序性细胞死亡配体2(programmed cell death 1ligand 2,PD-L2,B7-DC)。
静息状态下的T细胞不表达PD-1，当T细胞被激活时，PD-1依靠TCR招募下游信号分子被诱导表达。T细胞的激活会产生多种细胞因子，例如IL-2、TNF-a和IFN-γ等。IFN-γ的产生可以诱导PD-1的表达上调。PD-1与PD-L1的结合抑制了T细胞的增殖，降低T细胞的活性。正常的机体利用抑制性受体和配体的结合来影响T细胞的分化、增殖和激活，降低T细胞的激活水平，以保持适度的免疫反应，减少对正常组织和器官的损伤。然而肿瘤细胞可以利用这些抑制性的免疫检查点逃避T细胞对其的识别、攻击和杀伤作用，从而正常的生存和增殖。研究表明，PD-1的表达被高度上调在肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)上，例如在乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，黑色素瘤，非小细胞肺癌和肝癌中。与此同时，多种类型的肿瘤细胞表达PD-L1。PD-L2则表达在巨噬细胞，DC细胞，Th2辅助细胞和部分肿瘤细胞上。PD-1和PD-L1/PD-L2在肿瘤病人体内的诱导表达或表达上调与肿瘤的免疫逃避密切相关。
使用单克隆抗体治疗肿瘤是一个快速发展的领域。毋庸置疑，单克隆抗体治疗癌症是一个巨大的成功，它使我们向个性化治疗更进一步。到目前为止，已经大约有二十多种单克隆抗体经过了FDA批准并成功进入了市场。其中大多数通过结合跨膜受体或可溶性配体，然后干预它们的信号转导通路，抑制肿瘤细胞的增殖和血管生成。然而，由于单克隆抗体大的尺寸(～150kDa)，导致了有限的肿瘤渗透和较慢的分布。相对于单克隆抗体，纳米抗体具有尺寸小，热稳定性强和可溶性好的特征。而且纳米抗体相对容易通过细菌，酵母或哺乳动物细胞，以一种合理的花费大规模生产。分析发现，VHH序列与人源VH基因Ⅲ家族序列具有较高的同源性，这可能暗示了纳米抗体具有低的免疫原性。就肿瘤治疗而言，纳米抗体可以被使用来特异性靶向肿瘤细胞或者肿瘤脉管系统的抗原，阻断其信号通路，抑制肿瘤的生长。此外，纳米抗体还可以被用来阻断抑制型受体和配体的结合，刺激激活型受体和配体的结合，来恢复或增强效应T细胞对肿瘤的正常杀伤作用。纳米抗体具有很多的优点，将会在肿瘤的免疫治疗中发挥更加巨大的作用。本发明期望利用纳米抗体技术获得具有阻断PD-1与PD-L1相互结合的PD-1纳米抗体，从而应用于肿瘤的免疫治疗。
发明内容
本发明提供了一种人源化的PD-1纳米抗体及其氨基酸序列，还提供了编码本发明纳米抗体的核苷酸序列，用于表达本发明的纳米抗体的表达载体和宿主细胞，以及本发明纳米抗体的生产方法。
在本发明的第一方面，提供了一种抗PD-1纳米抗体VHH链的互补决定区CDR区，所述VHH链的互补决定区CDR由SEQ ID NO：5所示的CDR1、SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ IDNO：7所示的CDR3组成。
在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
本发明第二方面，提供了一种抗PD-1纳米抗体的VHH链，所述VHH链包括框架区FR和本发明第一方面所述的互补决定区CDR，所述的框架区FR由
(a)SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQID NO：4所示的FR4组成；或
(b)SEQ ID NO：10所示的FR1，SEQ ID NO：11所示的FR2，SEQ ID NO：12所示的FR3，SEQ ID NO：13所示的FR4组成。
在另一优选例中，所述的抗PD-1纳米抗体的VHH链如SEQ ID NO.:8或14所示。
本发明第三方面，提供了一种抗PD-1纳米抗体，它是针对PD-1表位的纳米抗体，并且具有如SEQ ID NO.:8或SEQ ID NO.:14中所示的氨基酸序列的VHH链。
本发明第四方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本发明第一方面所述的抗PD-1纳米抗体VHH链的CDR区、本发明第二方面所述的抗PD-1纳米抗体的VHH链、或本发明第三方面所述的抗PD-1纳米抗体。
在另一优选例中，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.:9或15所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的多核苷酸包括DNA或RNA。
本发明第五方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第四方面所述的多核苷酸。
本发明第六方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第五方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第四方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞。
本发明七方面，提供了一种产生抗PD-1纳米抗体的方法，包括步骤：
(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养本发明第六方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗PD-1纳米抗体的培养物；以及
(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗PD-1纳米抗体。
在另一优选例中，所述的抗PD-1纳米抗体具有如SEQ ID NO.:8或14所示的氨基酸序列。
本发明第八方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
(a)如本发明第二方面所述的抗PD-1纳米抗体的VHH链、或如本发明第三方面所述的抗PD-1纳米抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明第二方面所述的抗PD-1纳米抗体的VHH链、如本发明第三方面所述的抗PD-1纳米抗体。
在另一优选例中，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明第二方面所述的抗PD-1纳米抗体的VHH链、本发明第三方面所述的抗PD-1纳米抗体。
本发明第九方面，提供了本发明第三方面所述的抗PD-1纳米抗体的用途，用于制备(a)用于检测PD-1分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。
本发明第十方面，提供了一种药物组合物，含有：
(i)本发明第一方面抗PD-1纳米抗体VHH链的互补决定区CDR、本发明第二方面所述的抗PD-1纳米抗体的VHH链、或如本发明第三方面所述的抗PD-1纳米抗体、或本发明第八方面所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
本发明第十一方面，提供了本发明第三方面所述抗PD-1纳米抗体的一种或多种的用途：
(i)用于检测人PD-1分子；
(ii)用于流式检测；
(iii)用于细胞免疫荧光检测；
(iv)用于治疗肿瘤；
(v)用于肿瘤诊断。
在另一优选例中，所述用途为非诊断的和非治疗的。
本发明第十二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第二方面所述的重链可变区VHH的序列或如本发明第三方面所述的纳米抗体的序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签和HA标签
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于PD-1蛋白。
本发明第十三方面，提供了如本发明第二方面所述的VHH链、如本发明第三方面所述的纳米抗体、或本发明第八方面所述的免疫偶联物的用途，它们被用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中PD-1蛋白；
其中，所述药剂用于治疗或预防表达PD-1蛋白(即PD-1阳性)的肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤包括：胃癌、淋巴瘤、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、或肾上腺肿瘤。
本发明第十四方面，提供了一种检测样品中PD-1蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明第三方面所述的纳米抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在PD-1蛋白。
本发明第十五方面，提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用本发明第三方面所述的纳米抗体或本发明第八方面所述的免疫偶联物。
在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。
本发明第十六方面，提供了一种抗PD-1纳米抗体VHH链的框架区FR，所述的VHH链的框架区FR由SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4组成。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是抗原蛋白纯化SDS-PAGE图，条带从左到右依次为核酸分子标准，纯化的PD-1(ECD)-Fc蛋白，用TEV酶酶切去除Fc标签后纯化的PD-1(ECD)蛋白，以上蛋白均由HEK293F细胞表达，纯化得到的抗原纯度可达90％以上，可用于后期的骆驼免疫和针对PD-1纳米抗体的筛选。
图2是构建文库的库容大小检测图，构建好的文库被梯度稀释后涂板，图中显示取1/5梯度稀释104倍、105倍、106倍的克隆数目，经过统计计算，构建的文库库容为2.3×109CFU，库容大。
图3是构建文库的插入率检测图，是构建的纳米抗体文库的插入率检测结果，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为DNA分子标记，其余孔道为检测插入片段的菌落PCR产物，PCR产物带约为500bp；经检测，该文库的插入率达到100％，表明所构建的文库质量高。
图4是PD-1纳米抗体筛选富集过程，经第一轮筛选后未出现富集，第二轮筛选后出现154倍富集，第三轮筛选后出现241倍富集，逐渐增高的富集倍数表明针对PD-1的纳米抗体得到了富集。
图5是1株由大肠杆菌表达的PD-1纳米抗体纯化图，对应SEQ ID NO.8氨基酸序列的纳米抗体，经镍柱亲和层析法纯化后，PD-1纳米抗体的SDS-PAGE的电泳图。结果显示，PD-1纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到90％以上，纯度好，适合后续的实验。
图6是FACS检测PD-1纳米抗体的阻断效果，用瞬转表达人全长PD-1蛋白的HEK293F细胞与不同抗体和生物素化的hPD-L1-Fc蛋白共反应，结果表明，此株纳米抗体具有很好阻断PD-1与其配体PD-L结合的作用。
图7是真核表达人源化前后PD-1纳米抗体纯化图，由HEK293F细胞表达一种人源化的PD-1纳米抗体，条带从左到右依次为蛋白分子标准，人源化前HEK293F细胞表达的纳米抗体，人源化后HEK293F细胞表达的纳米抗体，每株抗体均带有Fc标签，纳米抗体纯度均达到90％以上，纯度高。
图8是ELISA检测PD-1纳米抗体的特异性，结果显示，该纳米抗体只与人和猴子的PD-1胞外段反应(人与猴子的PD-1胞外段序列同源性100％)，不与鼠或家族中的其他成员发生交叉结合反应，表明该纳米抗体特异性高。
图9是FACS检测人源化PD-1纳米抗体的阻断效果，用瞬转表达人全长PD-1蛋白的HEK293F细胞与不同抗体和生物素化的hPD-L1-Fc蛋白共反应，表明人源化后的PD-1纳米抗体仍然具有有效阻断PD-1与PD-L1之间相互结合的功能。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得一类抗PD-1纳米抗体，实验结果表明，本发明获得的PD-1纳米抗体能够有效阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用，经本发明人源化后的PD-1纳米抗体更能够有效阻断PD-1与PD-L1的结合，且经鉴定，人源化后的PD-1纳米抗体亲和力更高、不与PD-1家族其他成员发生交叉反应。在此基础上完成了本发明。
具体地，本发明利用人源的PD-1抗原蛋白免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因文库。然后将PD-1蛋白分子偶联在酶标板上，展示PD-1蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了PD-1特异性的纳米抗体基因。再将此基因转至大肠杆菌中，从而获得了能在大肠杆菌中高效表达的、且特异性高的纳米抗体株。
术语
如本文所用，术语“本发明纳米抗体”、“本发明的抗PD-1纳米抗体”、“本发明PD－1纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于PD-1(包括人PD-1)的纳米抗体。特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8或14所示的纳米抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“单域抗体(VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR 相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗PD-L蛋白抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合PD-1蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
PD-1纳米抗体
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有PD-1蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
Figure BDA0001115081300000091
Figure BDA0001115081300000101
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
表2本发明人源化前后抗体序列对应表：
Figure BDA0001115081300000121
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合PD-1蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
标记的纳米抗体
在本发明的一个优选例中，所述纳米抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗PD-1的纳米抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的纳米抗体。
本发明的抗PD-1纳米抗体具有很好的特异性，很高的效价。
检测方法
本发明还涉及检测PD-1蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中PD-1蛋白的水平。本
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测PD-1水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别PD-1蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
应用
如上所述，本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与PD-1相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对PD-1的临床诊断和靶向治疗。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明纳米抗体高特异性针对人的具有正确空间结构的PD-1蛋白。
(b)本发明纳米抗体的亲和力强。
(c)本发明纳米抗体不与PD-1家族其它成员出现交叉反应，特异性较强。
实施例1：人PD-1蛋白的表达及纯化：
(1)首先从UniProt上查找到人PD-1的氨基酸序列和核苷酸序列，将全长的PD-1核酸序列提交公司合成在pCDNA3.1(-)载体上，然后将其胞外段克隆到pFUSE-hIgG1-Fc2(购自InvivoGen)载体上，并在PD-1胞外段末端引入一个TEV酶切位点及一个GS linker，用于后面切掉标签，获得不带Fc标签的PD-1(ECD)蛋白；
(2)大量培养亚克隆测序正确的pFUSE-PD-1(ECD)-hIgG1-Fc2克隆株，并使用Omega质粒大提试剂盒提取质粒；
(3)将HEK293F细胞培养至2.0×106个/mL；
(4)将过滤除菌之后的质粒与转染试剂PEI以1:3的比例混合均匀至转染培养基F17(Gibco)中静置20min，之后加入到HEK293F细胞中，于37℃，6％CO2摇床培养箱中培养6天；
(5)离心获得上清，将上清与protein A珠子在室温条件下结合1h；
(6)使用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗掉杂蛋白和其他杂质，之后再用0.1M pH3.0的Glycine洗脱带有Fc标签的目的蛋白PD-1(ECD)；
(7)将洗脱得到的目的蛋白超滤至1×PBS溶液中，SDS-PAGE电泳检测纯化得到的目的蛋白纯度；
(8)将纯化得到的带Fc标签的PD-1(ECD)蛋白使用TEV进行酶切，使用0.2mg TEV酶酶切1mg PD-1(ECD)蛋白，4℃酶切16h，将反应液先过protein A柱子，再过镍柱，收集流出液，取样进行SDS-PAGE电泳检测Fc标签切除情况，PD-1(ECD)-Fc蛋白TEV酶切前后SDS-PAGE电泳检测结果如图1所示。
电泳检测结果表明，经过此方法制备的抗原PD-1(ECD)，纯度高，适合后续的骆驼免疫和针对PD-1纳米抗体的筛选。
实施例2：PD-1纳米抗体文库的构建：
(1)将1ml 1mg/ml PD-1(ECD)抗原与弗氏佐剂按1:1比例等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，连续免疫7周，刺激B淋巴细胞产生特异性靶向PD-1(ECD)的纳米抗体；
(2)七次免疫之后，抽取100ml骆驼血分离外周淋巴细胞提取RNA；
(3)将RNA反转录为cDNA之后扩增VHH片段；
(4)使用限制性内切酶PstI和NotI酶切VHH片段以及噬菌体展示载体，之后将酶切好的VHH片段与载体以一定的摩尔比例16℃连接16h；
(5)将连接好的产物电转至TG1感受态细胞中，构建PD-1纳米抗体噬菌体展示文库，并对文库进行质量评价。
经检测，文库的库容大小为2.3×109CFU(如图2所示)，VHH片段正确插入率为100％，图3显示了通过菌落PCR检测VHH片段正确插入情况，表明构建的噬菌体展示文库，质量高，能够用于针对PD-1纳米抗体的筛选。
实施例3：PD-1纳米抗体的筛选及鉴定：
纳米抗体筛选：
(1)取10μg PD-1(ECD)抗原稀释于100ul pH 8.2的100mM NaHCO3溶液中，加入到NUNC酶标板上，4℃包被过夜；
(2)第二天早上吸掉孔中的抗原溶液，用PBST(0.05％PBS+Tween-20)洗5遍之后加入100μl 0.1％BSA，室温封闭2h；
(3)2h之后，加入噬菌体(2×1011CFU免疫骆驼噬菌展示纳米抗体文库)，37℃孵育1h；
(4)用PBST洗5遍，洗掉不与抗原PD-1(ECD)结合的噬菌体展示纳米抗体；
(5)再用100mM三乙醇胺将特异性靶向PD-1纳米抗体的噬菌体洗脱下，并侵染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞，37℃感染1h，过夜培养并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3轮，使得特异性靶向PD-1纳米抗体的噬菌体逐步得到富集，其富集结果如图4所示，逐渐增高的富集倍数表明针对PD-1的纳米抗体得到了富集。
通过噬菌体展示纳米抗体的酶联免疫反应(ELISA)筛选特异性靶向PD-1的单个阳性克隆：
(1)从上述第2轮和第3轮筛选后含有噬菌体的平板上，随机挑取96个单菌落接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的TB培养基(12.52g K2HPO4，2.3g KH2PO4，24g yeastextract，12g peptone，4mL glycerol溶于1L ddH20)中，当菌液OD达到0.6-0.9时，按1000：1的比例加入1M IPTG，28℃诱导16h。
(2)利用渗透压冲击法破碎过夜诱导的菌，获得纳米抗体粗提液，并将纳米抗体粗提液加入到过夜包被PD-1的酶标板孔中，37℃孵育1小时。
(3)用PBST洗5遍，洗掉非特异结合的纳米抗体或其他杂质，加入一抗mouse anti-HA tag antibody(鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司)，37℃孵育1h；
(4)用PBST洗去未结合的一抗，加入goat anti-mouse IgG alkalinephosphatase conjugated antibody(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司)，37℃孵育0.5h；
(5)用PBST洗5遍，洗掉未结合的二抗，加入碱性磷酸酶显色底物溶液，在酶标仪上，405nm波长下读取吸光值；
(6)当实验孔OD值是对照孔OD值3倍或3倍以上时，判为阳性克隆；
(7)将阳性克隆孔对应的菌转摇在LB液体培养基(按1000：1添加100mg/ml的氨苄青霉素储液)中送测序；
(8)对测序结果进行氨基酸序列比对分析，将CDR1，CDR2或CDR3区有差异的纳米抗体视为一株。
实施例4：流式细胞术高通量筛选具有阻断效果的纳米抗体：
(1)将测序正确的不同克隆株接种于1ml含有100μg/ml氨苄青霉素的TB培养基中，37℃恒温摇床培养至对数生长期时加入IPTG诱导剂，终浓度为1mM，28℃诱导16h；
(2)16h之后，利用渗透压冲击法破碎菌体，获得纳米抗体粗提液；
(3)制备hPD-L1-Fc-Biotin蛋白(hPD-L1-Fc制备方法同实施例1)，蛋白生物素化的方法参照试剂盒说明书；
(4)每个样品取1×106个瞬转表达人PD-1全长蛋白的HEK293F细胞重悬于0.5％BSA-PBS buffer中，分别加入上述PD-1纳米抗体粗提液200μl，同时设置阳性对照(Nivolumab)、阴性对照(AF70Nb)，所有样本加入5μg hPD-L1-Fc-Biotin，4℃孵育20min；
(5)1×PBS洗涤2次，加入eBioscience的SA-PE，4℃避光孵育20min，1×PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD FACS Caliber)检测，初步筛选到一株具有良好阻断效果的PD-1纳米抗体。
实施例5：纳米抗体在宿主大肠杆菌菌株中的表达及纯化：
(1)小提初筛得到的具有良好阻断效果的纳米抗体质粒，电转化至大肠杆菌表达菌株WK6中，将其涂布在LA+Glucose平板上(含有氨苄青霉素和葡萄糖)，于恒温培养箱37℃培养过夜；
(2)挑选单个克隆接种于5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养16h；
(3)将1ml的菌液接种至330mL TB培养基中，37℃恒温摇床培养，当OD值达到0.6-0.9时，加入IPTG诱导剂，终浓度为1mM，28℃培养16h诱导纳米抗体表达；
(4)4℃，8000rpm离心收集菌体；
(5)利用渗透压冲击法破碎菌体，将纳米抗体释放出来，离心收集上清即可得到纳米抗体粗提液；
(6)通过镍柱亲和层析法纯化带有His标签的纳米抗体。SDS-PAGE结果显示，PD-1纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到90％以上，纯度好，适合后续的实验。
实施例6：流式细胞术检测纳米抗体的阻断效果
(1)每个样品取1×106个瞬转表达人PD-1全长蛋白的HEK293F细胞重悬于0.5％BSA-PBS buffer中，加入上述纯化得到的PD-1纳米抗体10μg，同时设置阳性对照(Nivolumab)、阴性对照(AF70Nb)，所有样本加入5μg hPD-L1-Fc-Biotin，4℃孵育20min；
(2)1×PBS洗涤2次细胞，加入eBioscience的SA-PE，4℃避光孵育20min，1×PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD FACS Caliber)检测，检测结果如图6所示，流式检测结果表明，此株原核表达的纳米抗体具有很好阻断PD-1与其配体PD-L1结合的作用，且在相同的分子质量下，其阻断效果优于已商品化的PD-1单克隆抗体(Nivolumab，BMS)。
实施例7：PD-1纳米抗体的人源化改造
(1)首先以SEQ NO.8所示的PD-1纳米抗体序列为模板在结构数据库中进行同源结构的搜索，取其中E value＝0.0并且序列等同性≥70％的12个结构；
(2)对这12个结构进行结构比对，并依据晶体结构分辨率大小和构建的进化树，最终选取包括3dwt在内的9个蛋白，进行基于SEQ NO.8所示的PD-1纳米抗体序列的多模板同源模建，最终获得的5个结构，再依据打分函数的高低排序，选取molpdf最低的结构，继续下面的工作；
(3)对模建的最优结构，利用ProtSA服务器计算残基的溶剂可接触性，即残基的折叠态相对于去折叠态的溶剂可接触面积的比值为判据，取大于40％的残基为暴露于溶剂外的残基；
(4)对模建的最优结构和DP-47进行序列比对，替换相应的暴露于溶剂的残基。最终确定出一种人源化PD-1纳米抗体，分别由SEQ ID NO:10、SEQ ID NO.:14所示的氨基酸序列编码。人源化前后的纳米抗体与DP-47骨架区的序列同源性比较如下表所示：
Figure BDA0001115081300000181
实施例8：人源化前后的PD-1纳米抗体在真核细胞HEK293中的表达及纯化
(1)将人源化前后的PD-1纳米抗体(Nb)序列分别合成在pFUSE-hIgG1-Fc2载体上，转化至大肠杆菌DH5α菌株中，大摇并用Omega质粒大提试剂盒提取pFUSE-Nb-hIgG1-Fc2质粒；
(2)将HEK293F细胞培养至2.0×106个/ml；
(3)将过滤除菌之后的质粒与转染试剂PEI以1:3的比例混合均匀至转染培养基F17中静置20min，之后加入到HEK293F细胞中，于37℃，6％CO2摇床培养箱中培养5天；
(4)离心获得上清，将上清与protein A珠子在室温条件下结合1h；
(5)使用pH7.0的磷酸盐缓冲液洗掉杂蛋白和其他杂质，之后再用0.1M pH3.0的Glycine洗脱带有Fc标签的人源化前后的纳米抗体；
(6)将洗脱得到的纳米抗体超滤至1×PBS溶液中，SDS-PAGE电泳检测真核表达纯化得到的人源化前后带Fc标签的纳米抗体，检测结果如图7所示。
检测结果表明，经过真核表达的带Fc标签纳米抗体纯度均可达到90％以上，纯度高。
实施例9：酶联免疫法(ELISA)鉴定纯化的纳米抗体特异性：
(1)将人源化后的纳米抗体基因片段克隆至pMECS载体上，将测序正确的克隆转入WK6菌株中，并进行表达纯化，表达纯化方法同实施例5；
(2)4℃过夜包被抗原蛋白PD-1(人)、PD-1(猴子)、PD-1(鼠)、ICOS(人)、CTLA-4(人)、CD28(人)、IgG1(人)：每孔0.5μg(5μg/mL，100μL)，对照孔为IgG1。
(3)第二天用PBST洗涤5次，加入200μl的1％BSA室温封闭2小时；
(4)将纯化的各株纳米抗体稀释为10μg/mL，分别取100μl与各孔包被的抗原37℃反应1h；
(5)用PBST洗5遍，洗去未结合的纳米抗体，再加入抗mouse anti-HA tagantibody，37℃孵育1h；
(6)用PBST洗去未结合的一抗，加入goat anti-mouse IgG alkalinephosphatase conjugated antibody，37℃孵育0.5h；
(7)用PBST洗5遍，洗掉未结合的二抗，加入碱性磷酸酶显色底物溶液，在酶标仪上，405nm波长下读取吸光值，检测结果如图8所示。
根据吸光值判断纳米抗体的特异性，结果显示，该纳米抗体只与人和猴子的PD-1胞外段反应(人与猴子的PD-1胞外段序列同源性100％)，不与鼠或家族中的其他成员发生交叉结合反应，表明该纳米抗体的特异性高。
实施例10：流式细胞术检测人源化PD-1纳米抗体的阻断功能
方法同实施例6：
(1)每个样品取1×106个瞬转表达人PD-1全长蛋白的HEK293F细胞重悬于0.5％BSA-PBS buffer中，加入上述纯化得到的PD-1纳米抗体10μg，同时设置阳性对照(Nivolumab)、阴性对照(AF70Nb)，所有样本加入5μg hPD-L1-Fc-Biotin，4℃孵育20min；
(2)1×PBS洗涤2次细胞，加入eBioscience的SA-PE，4℃避光孵育20min，1×PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD FACS Caliber)检测，检测结果如图9所示。
检测结果表明人源化后的PD-1纳米抗体仍然具有有效阻断PD-1与PD-L1之间相互结合的功能。
与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明利用人PD-1抗原蛋白免疫新疆双峰驼，构建高质量的纳米抗体基因文库，然后通过噬菌体展示技术筛选该纳米抗体基因文库，从而获得了靶向PD-1高特异性的纳米抗体基因，并建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体表达菌株。本发明获得的PD-1纳米抗体具有很好阻断PD-1与PD-L1之间相互作用的功能。对该抗体的序列进行分析和改造，最终获得一株人源化的PD-1纳米抗体。经流式细胞术分析检测，人源化的PD-1纳米抗体仍然能够有效阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA0001115081350000011
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Claims (22)

1.一种抗PD-1纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的VHH链的互补决定区CDR由SEQID NO：5所示的CDR1、SEQ ID NO：6所示的CDR2、SEQ ID NO：7所示的CDR3组成。
2.一种抗PD-1纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的VHH链包括框架区FR和互补决定区CDR，所述互补决定区CDR由SEQ ID NO：5所示的CDR1、SEQ ID NO：6所示的CDR2、SEQ IDNO：7所示的CDR3组成，所述的框架区FR由
（a）SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ IDNO：4所示的FR4组成；或
（b）SEQ ID NO：10所示的FR1，SEQ ID NO：11所示的FR2，SEQ ID NO：12所示的FR3，SEQID NO：13所示的FR4组成。
3.一种抗PD-1纳米抗体，其特征在于，它是针对PD-1表位的纳米抗体，并且VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO.: 8或SEQ ID NO.: 14所示。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：权利要求1-3中任一项所述的抗PD-1纳米抗体。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.: 9或15所示。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。
8.一种产生抗PD-1纳米抗体的方法，其特征在于，包括步骤：
(a) 在适合产生纳米抗体的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞，从而获得含所述抗PD-1纳米抗体的培养物；以及
(b) 从所述培养物中分离或回收所述的抗PD-1纳米抗体。
9.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a) 如权利要求1或2所述的抗PD-1纳米抗体的VHH链、或如权利要求3所述的抗PD-1纳米抗体；和
(b) 选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
10.如权利要求9所述的免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物含有：多价的如权利要求1或2所述的抗PD-1纳米抗体的VHH链、如权利要求3所述的抗PD-1纳米抗体。
11.如权利要求10所述的免疫偶联物，其特征在于，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如权利要求2所述的抗PD-1纳米抗体的VHH链、权利要求3所述的抗PD-1纳米抗体。
12.如权利要求11所述的免疫偶联物，其特征在于，所述的多价是二价。
13.权利要求3所述的抗PD-1纳米抗体的用途，其特征在于，用于制备(a)用于检测PD-1分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。
15.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
(i) 权利要求1所述的抗PD-1纳米抗体的VHH链、权利要求2所述的抗PD-1纳米抗体的VHH链、或权利要求3所述的抗PD-1纳米抗体、或权利要求9-12中任一项所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为注射剂型。
17.如权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
18.权利要求3所述抗PD-1纳米抗体的一种或多种的用途：
(i) 用于制备用于检测人PD-1分子的试剂；
(ii) 用于制备用于流式检测的试剂；
(iii) 用于制备用于细胞免疫荧光检测的试剂；
(iv) 用于制备用于肿瘤诊断的试剂。
19.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i) 如权利要求1或2所述的纳米抗体的VHH的序列或如权利要求3所述的纳米抗体的序列；以及
(ii) 任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
20.如权利要求19所述的重组蛋白，其特征在于，所述的标签序列包括6His标签和HA标签。
21.权利要求1或2所述的纳米抗体、权利要求3所述的纳米抗体、或权利要求9-12中任一项所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，它们被用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中PD-1蛋白；
其中，所述药剂用于治疗或预防表达 PD-1蛋白，即PD-1阳性的肿瘤。
22.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括：胃癌、淋巴瘤、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、或肾上腺肿瘤。
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