CN113912722B - 抗pd-l1纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体领域，特别涉及抗PD‑L1纳米抗体及其应用。本发明公开了一种抗PD‑L1的纳米抗体，所述纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，本发明还提供了含有该纳米抗体可变区编码序列的表达载体，以及含有该表达载体的宿主细胞，本发明还提供了所述纳米抗体在制备PD‑L1检测试剂盒中的应用。本发明提供的抗PD‑L1纳米抗体对PD‑L1具有特异的识别和结合能力，该纳米抗体亲和力可达到1.422E‑10，具有独特的抗原决定簇识别位点，能够在PD‑L1免疫检测特别是双抗体夹心法中获得优异的检测效果。

Description

抗PD-L1纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体领域，特别涉及抗PD-L1纳米抗体及其应用。
背景技术
细胞程式死亡-配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PD-L1)也称为表面抗原分化簇274(cluster of differentiation 274，CD274)或B7同源体(B7homolog 1，B7-H1)，是人类体内的一种蛋白质，由CD274基因编码。PD-L1是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，激发具有抗原特异性的细胞毒杀性T细胞。而细胞程序化死亡受体-1(PD-1)与细胞程式死亡-配体1(PD-L1)结合，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结CD8+T细胞的增生，而且PD-1还可以借由调节Bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性T细胞的聚积。在肿瘤微环境中的异常高表达被认为是肿瘤免疫逃逸的作用之一。PD-L1通过与表达在免疫细胞上的PD-L1相互作用，往往可导致免疫细胞上PD-1抑制性信号的活化与转导，从而发挥强有力的免疫抑制作用。而相关研究报道，在某些肿瘤环境中PD-L1的异常高表达，能抑制免疫系统清除功能，促进肿瘤进展并导致肿瘤免疫逃逸。
1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体抗体H2，其主要是IgG2和IgG3类型。此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(heavychain-only-like Antibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kD，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识，这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，从而形成一种重链二聚体。
相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。
纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点的相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较mAb容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
鉴于PD-1/PD-L1免疫疗法在多种难治愈的癌症上都具有良好的治疗效果，但其总体治疗的客观反应率偏低。且有研究表明，对肿瘤患者的PD-L1表达量检测分析能一定程度上判断PD-1/PD-L1靶向药物的治疗效果，为临床上PD-1/PD-L1靶向药物的个体化及最佳化治疗提供一定的参考价值。因此研发抗PD-L1的纳米抗体，充分发挥纳米抗体超强的抗原识别能力，特别是识别一些隐匿于裂隙或空腔里的抗原决定簇成为抗体技术领域的一种新的需求。但是鉴于纳米抗体分子过低而存在的一些诸如亲和力低、易于集聚、血清半衰期短等结构缺陷却阻碍着纳米抗体的进一步应用。而在PD-L1的免疫检测具体应用中，如果抗PD-L1抗体识别PD-L1的抗原决定簇过于单一或者位点过于接近或者重叠，都会导致特异性的抗原抗体结合反应受到影响，从而严重影响检测效率。
因此，提供抗PD-L1纳米抗体及其应用具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了抗PD-L1纳米抗体及其应用。本发明提供的抗PD-L1纳米抗体对PD-L1具有特异的识别和结合能力，该纳米抗体亲和力可达到1.422E-10，具有独特的抗原决定簇识别位点，能够在PD-L1免疫检测特别是双抗体夹心法中获得优异的检测效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了抗PD-L1抗原的纳米抗体，包含可变区；
所述可变区包含CDR1、CDR2或CDR3序列中的任意一个或多个：
(I)、所述CDR1具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
所述CDR2具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或
所述CDR3具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述可变区具有：
(I)、如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；或
(II)、如(I)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(I)所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或
(III)、与如(I)或(II)所述的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个氨基酸中的多个为2个、3个、4个或5个。
本发明还提供了编码所述纳米抗体的核酸分子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述核酸分子具有：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或两个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列具有至少90％序列一致性的核苷酸序列。
本发明还提供了表达载体，包括所述的核酸分子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体为pMES4。
此外，本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆BL21(DE3)。
本发明还提供了结合物，包含经化学标记或生物标记的所述的纳米抗体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物；所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。所述酶标记优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
更重要的是，本发明还提供了试剂盒，包括所述纳米抗体、所述核酸分子、所述表达载体、所述宿主细胞、所述结合物和/或所述偶联物，以及检测中可接受的助剂。
本发明提供的抗PD-L1的纳米抗体1A10对PD-L1抗原具有特异的识别和结合能力，该纳米抗体亲和力可达到1.422E-10，且与几种抗PD-L1纳米抗体相比，识别不同的抗原决定簇，具有独特的抗原决定簇识别位点，因此，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示纳米抗体1A10的SDS-PAGE鉴定图；
图2示Biacore分析纳米抗体结合位点流程图。
具体实施方式
本发明公开了抗PD-L1纳米抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
定义：
本发明首先提供了一种抗PD-L1抗原的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID No.1所述氨基酸序列组成，并且CDR2序列由SEQ ID No.2所述氨基酸序列组成，并且CDR3序列由SEQ ID No.3所述氨基酸序列组成。所述抗体具有独特的抗原决定簇识别位点
在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ ID No.4所述氨基酸序列组成。在本发明中具有该可变区序列的纳米抗体的一个优选实施例为纳米抗体1A10。
在另一个优选的技术方案中，本发明还提供了一种上述纳米抗体序列的核苷酸编码序列，所述编码序列由SEQ ID No.5所示。
在另一个优选的技术方案中，本发明提供了一种含有上述核苷酸编码序列的表达载体，所述表达载体为pMES4。
在另一个优选的技术方案中，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
在另一个优选的技术方案中，本发明还提供了上述的纳米抗体在制备PD-L1检测试剂盒中的应用。
本发明提供的抗PD-L1的纳米抗体1A10对PD-L1抗原具有特异的识别和结合能力，该纳米抗体亲和力可达到1.422E-10，且与几种抗PD-L1纳米抗体相比，识别不同的抗原决定簇，具有独特的抗原决定簇识别位点，因此，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。
实施例1纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选
1.1羊驼的免疫：选取健康成年羊驼一只羊，将重组蛋白PD-L1与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，按6-7μg/Kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。
1.2驼源淋巴细胞的分离：按照本技术领域常规程序从采集的驼源抗凝全血中分析淋巴细胞，每2.5×107个活细胞加入1mL RNA分离试剂，取1mL进行RNA提取，其余-80℃保存。
1.3总RNA提取：按照本技术领域常规程序提取总RNA，用RNase-free水调整浓度到1μg/μL。
1.4反转录合成cDNA：
根据逆转录试剂盒说明书(Roche公司的transcripor first stand cDNAsynthesis KIT)以1.3步骤获得的RNA为模板进行逆转录cDNA
1.5抗体可变区基因扩增：将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：
CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG(如SEQ ID No.11所示)
CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC(如SEQ ID No.12所示)
PCR反应条件及程序为：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，30cycles；72℃7min
使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μl。
第二轮PCR的引物序列如下：
VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG(如SEQ ID No.13所示)
VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT(如SEQ ID No.14所示)
PCR反应条件及程序为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，15cycles；72℃7min
使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物。
1.6载体构建
将pMES4与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μL T4 DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μL总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μL水洗脱。
1.7电转化及库容测定
取10μL纯化后的连接产物，加入到含有50μL大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(美国BTX的ECM630电转仪)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选克隆，进行菌落PCR鉴定。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×[阳性率]PCR鉴定×10)。
引物序列如下：
MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG(如SEQ ID No.15所示)
GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG(如SEQ ID No.16所示)
1.8噬菌体扩增
取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃200rpm培养到培养物OD600＝0.5。取出10ml菌液加入4×1010VCSM13，37℃静止感染30min。4000rpm，常温离心10min，去净上清。用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。离心取上清40ml管中，加入10ml PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1ml冰PBS洗涤离心，取上清250μl预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。
测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD600＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。
噬菌体滴度(pfu/ml)＝稀释倍数×噬菌斑数目×100
1.9纳米抗体筛选
通过ELISA方法以重组PD-L1抗原筛选阳性克隆。以重组PD-L1抗原包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μl噬菌体上清液，37℃放置1h。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1h。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5min，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。
挑选噬菌体ELSIA结果阳性的克隆，提取质粒。用Vector NTI软件对测序结果进行分析，登录IMGT(http://www.imgt.org/IMGT_vquest)，对抗体轻链和重链基因进行分析，以确定可变区的框架区(framework regions，FR)和互补决定区(complementaritydetermining regions，CDR)。
抗PD-L1纳米抗体1A10重链核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示，其中第1-23位氨基酸序列为FR1，第24-32位氨基酸序列为CDR1，第33-49位氨基酸序列为FR2，第50-57位氨基酸序列为CDR2，第58-95位氨基酸序列为FR3，第96-103位氨基酸序列为CDR3，第104-114位氨基酸序列为FR4。
实施例2抗PD-L1纳米抗体的制备
2.1纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1：1000比例接种于5mL新鲜的LB-A培养基，37℃，200rpm过夜培养。次日，使用Plasmid mini kit(OMEGA)按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1μl转化于100μl感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30min，42℃水浴热击90s，冰浴冷却3min。向离心管加入600μlLB培养基，37℃振荡培养60min。取上清100μl，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。
2.2纳米抗体的诱导表达
挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1：100比例加入100ml新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3h至菌液OD600＝0.8左右，加入终浓度为1mMIPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10min收集菌体，加入1.5mL的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2min后，轻柔振荡30s，重复此循环6次。加3.0mlTES/4(将TES用水稀释4倍)，轻柔振荡30s后，冰浴静置2min，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10min，收集上清即为周质提取物。
2.3纳米抗体的纯化和鉴定
将IMAC Sepharose(GE公司)重悬后，取2ml加入到重力柱内，静置30min，使sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存缓冲液。加入2倍柱体积的硫酸镍溶液(0.1M)，按照约8s/滴的流速流出硫酸镍溶液；加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤sepharose，流速维持不变；将样品使用平衡缓冲液2倍稀释后，加入重力柱中，调节流速为6s/滴，收集穿透液；加入10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤sepharose，维持流速不变，收集洗涤液；加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，流速维持在6s/滴，收集含有目的蛋白的洗脱液；最后依次加入10倍柱体积的平衡缓冲液、10倍柱体积的纯水和10倍柱体积的20％乙醇洗涤sepharose，并最终保留4ml的20％乙醇保存层析柱。将上述收集的样品分别进行SDS-PAGE检测(图1：M为彩虹180广谱蛋白Marker；1为纳米抗体表达原液提取的周质；2-6为穿透液；7为纯化后的纳米抗体)。
实施例3抗PD-L1纳米抗体与抗原的亲和活性
3.1芯片抗原偶联
将PD-L1抗原用不同pH的醋酸钠缓冲液(pH 5.5，pH5.0，pH4.5，pH4.0)配制成20μg/mL的工作液，同时准备50mM的NaOH再生溶液，利用Biacore T100蛋白相互作用分析系统仪器中的模板方法对不同pH条件的抗原与芯片(GE公司)表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍RL为标准，选择合适的最偏中性的pH体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择Target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60min。
3.2分析物浓度设置条件探索及再生条件优化
采取手动进样模式，选择1，2通道2-1模式进样，流速设置为30μL/min。进样条件均为120s，30μL/min。再生条件均为30s，30μL/min。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，建议设置200μg/mL，150μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，20μg/mL，10μg/mL，2μg/mL。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个pH梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200μg/mL分析物样品，观察2通道，从最偏中性pH的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200μg/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200μg/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5％，即认为此pH的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低pH的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。
3.3亲和力测试
按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60s，30μL/min；解离时间：600s；再生条件：30s，30μL/min)对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200min。
3.4结果分析
选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1:1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数。结果见表1。抗PD-L1纳米抗体1A10的亲和力数值为1.422E-10。
表1
样品编号 结合常数Ka 解离常数Kd 亲和力KD
1A10 6.156×10+5 8.755×10-5 1.422E-10
1H3 1.024×10+4 2.356×10-5 2.301E-9
2D2 8.451×10+4 7.855×10-5 9.294E-10
2E3 3.024×10+4 4.565×10-5 1.510E-9
实施例4纳米抗体1A10 ELISA叠加数据分析
4.1抗原饱和浓度的确定
以2μg/ml的浓度包被PD-L1抗原，100μl/孔，4℃包被24h，洗板5遍。以1％BSA作为封闭剂过夜封闭，洗板5遍。酶标板中加入不同梯度稀释的纳米抗体，阴性对照(阴性血清1:100)，PBS空白对照，37℃孵育30min，洗板5遍。加入1：4000比例稀释的HRP标记的羊抗羊驼IgG，37℃孵育30min，洗板5遍。加TMB显色液，37℃孵育10min，2M硫酸终止反应。读取吸光值450nm读数，绘制抗体饱和曲线，根据结果选择随浓度增加读数不再增加的浓度为饱和浓度。
4.2位点叠加实验
先加入第一种抗体进行反应，洗板后再加第二种抗体，洗板后加酶标二抗，TMB显色读数(方法同4.1)。计算两株抗体叠加率AI，AI>50％说明被测2株抗体抗原位点不同，AI<50％说明被测两株抗体抗原表位相同，AI值越大，位点重叠可能性越低。公式为：AI＝[2*A(1+2)-(A1+A2)]/A(1+2)*100％
A1—第一株抗体读数
A2—第二株抗体读数
A(1+2)—叠加2种抗体读数
表2：抗体抗原表位叠加实验
1st抗体 2nd抗体 1st抗体+2nd抗体 叠加率
1A10+1H3 0.343 0.614 0.705 64.26％
1A10+2D2 0.343 0.579 0.714 70.87％
1A10+2E3 0.343 0.592 0.682 62.90％
实验结果见表2，1A10与1H3(可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示)、2D2(可变区氨基酸序列为SEQ ID No.7所示)、2E3(可变区氨基酸序列为SEQ ID No.8所示)三株纳米抗体分别针对PD-L1抗原不同的抗原表位，这预示着在纳米抗体的诊断和治疗应用上，1A10纳米抗体可以作为其他纳米抗体的表位互补的组合物联合应用，从而可以增大诊断或治疗的效率。
实施例5利用Biacore分析纳米抗体1A10结合位点
Biacore系统主要原理就是通过表面分子的浓度改变使SPR(折射率)发生偏移，在监测器上表现为RU值的变化。由于该系统的的灵敏度更高，我们设计了相关实验来验证ELISA叠加的实验结果。如图2所示，首先重复进2针第一个纳米抗体A，观察RU值的变化，以确认相应的抗原结合位点的饱和并记录；之后进入第二个纳米抗体B，观察并记录RU值：如该RU值比单一的纳米抗体B的RU值相差不超过20％，即可认为两者识别不同的抗原决定簇；如相差值超过20％但低于60％，认为两者有位阻效应；若相差值超过了60％，判定两者识别了同一抗原。具体操作为首先单纯进样抗体B记录RU增加值RB1，并对芯片再生；之后重复进两次抗体A，记录RU增加值RA，并确认饱和后，直接进样抗体B，观察RU值的增加量RB2；之后使用公式(RB2-RA)/RB1来计算位阻率，以此判定二者是否识别同一抗原决定簇。该实施例结果见表3。1A10纳米抗体与1H3、2D2、2E3三株纳米抗体的位阻率分别为9.46％、7.80％和15.09％。依次判断1A10与其他三株纳米抗体均识别不同抗原位点，该结果与ELISA叠加实验推测的结果一致。更加验证了抗PD-L1纳米抗体1A10在检测PD-L1领域的应用前景。
表3：Biacore检测纳米抗体叠加实验RU值变化表
实施例6纳米抗体1A10在检测PD-L1试剂盒中的应用
以人碱性磷酸酶的结合位点序列作为化学发光区氨基酸序列，如SEQ ID NO:9所示。使之通过柔性多肽与1A10纳米抗体相融合成为带有化学发光区序列的纳米抗体1A10-HAP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。在所述核苷酸编码序列的两个末端添加有HindⅢ和EcoRⅠ两个酶切位点，以该两个酶切位点连接到载体pcDNA3.1(+)上。无内毒素大提质粒后利用状态处于对数生长的293细胞进行转染。获得转染的细胞培养至36h后将细胞培养液倒入50ml离心管中，12000g离心5min，收集上清，用0.22um滤膜过滤，利用阴离子交换层析对培养上清进行纯化。利用实施例3相同的方法对1A10-HAP进行亲和力测试，结果1A10-HAP的亲和力数值为9.836E-11。经过筛选配对，选取2D2为捕获一抗,1A10-HAP为酶标二抗进行双抗体夹心免疫法检测血清标本中的PD-L1抗原，获得了优异的检测效果，具体过程如下：
使用无菌CBS稀释纳米抗体2D2至终浓度为6μg/ml；按照每孔100μl加入96孔酶标板中，4℃静置18h；弃上清后，每孔加入300μL洗涤液，水平震动3min，吸弃上清；重复洗板四次。每孔加入200μl1％BSA，于37℃静置2h。重复洗板四次；每孔中加入100μL阳性对照、阴性对照或者待测样本；随即每孔加入100μL新鲜稀释的纳米抗体1A10-HAP，稀释至工作浓度为1mg/ml，置于摇床上摇动3～5s；37℃下温育1h。重复洗板四次；每孔加入100μL AP化学发光显色液(BMChemiluminescence ELISA Substrate)，在摇床上摇动3～5s；室温避光孵育10min；选择酶标仪程序Luminescence，测定各孔的Lum值并计算质控血清的PD-L1值。结果1A10与2D2纳米抗体对呈现出最佳配对结果:
(1)经添加回收试验，3次回收率分别是92％，88％，105％，均在85-115％之间。
(2)检测样品稀释液20次，得均值M＝0.127，SD＝0.032，空白限＝0.127+2*0.032＝0.191，<0.2，所以空白限<0.2ng/ml。
(3)线性范围0.2-100ng/ml范围内，r2＝0.98。
(4)批内差：经检测，批内CV＝5.3％，<10％。
(5)批间差：经检测，批间差CV＝8.2％，<15％。
(6)稳定性：经热稳定性实验，结果提示，在37℃放置7天，试剂各项指标满足要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛大学附属医院
<120> 抗PD-L1纳米抗体及其应用
<130> MP21009857
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 1
Gly Arg Arg Asn Ile Asp Asn Tyr Asp
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 2
Ile Arg Arg His Asp Thr Ser Thr
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 3
Asn Ala Val Arg Leu Gly Ser Tyr
1 5
<210> 4
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 4
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Arg Asn Ile Asp Asn Tyr Asp
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
35 40 45
Ser Ile Arg Arg His Asp Thr Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Val Arg Leu Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 5
<211> 344
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 5
cagctgcagg agtctggggg aggattggtg caggctgggg gctctctgag actctcctgc 60
gcagcctctg gacgacgcaa tatcgataac tatgacatgg cctggtaccg ccaggctcca 120
ggaaaggagc gtgagtttgt cgccagtatt aggcggcacg atactagcac acactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagagaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gtctgaaacc tgaggacacg gccagctatt actgtaatgc agtgcggttg 300
ggcagctact ggggccaggg gacccaggtc accgtctcct caca 344
<210> 6
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 6
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Ala
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ala Phe His Phe
20 25 30
His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gln
35 40 45
Ile Tyr Asp Gly Gly Arg Arg Thr Leu Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met His Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Lys
85 90 95
Gly Arg Glu Ser Leu Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 7
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Arg Asn Ala Met
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Ser Arg Phe Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Ala
85 90 95
Asn Arg Ile Phe Gly Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 8
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Thr Ser Tyr Thr Met
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Ser Arg Ser Gly Ala Asn Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val Phe Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala
85 90 95
Asn Leu Ile Arg Arg Phe Gly Gly Pro Arg Glu Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 9
Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn Arg Glu Ala
1 5 10 15
Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala Gln Thr Ala
20 25 30
Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr
35 40 45
Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp Lys Leu Gly
50 55 60
Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser
65 70 75 80
Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly Ala Thr Ala
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr Ile Gly Leu
100 105 110
Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu
115 120 125
Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Val Gly
130 135 140
Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Thr Tyr
145 150 155 160
Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Val Pro Ala
165 170 175
Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Ile Ser
180 185 190
Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe
195 200 205
Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Gly
210 215 220
Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp Leu Ala Lys
225 230 235 240
Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu Met Gln Ala
245 250 255
Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Gly
260 265 270
Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser Leu
275 280 285
Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser Arg Asn Pro Arg
290 295 300
Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His
305 310 315 320
Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met Phe Asp Asp
325 330 335
Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp Thr Leu Ser
340 345 350
Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Pro
355 360 365
Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Arg Asp
370 375 380
Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Val
385 390 395 400
Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu Ser Gly Ser
405 410 415
Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Glu Glu Thr His
420 425 430
Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu
435 440 445
Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val Met Ala Phe
450 455 460
Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala
465 470 475 480
Gly Thr Thr Asp
<210> 10
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 10
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Arg Asn Ile Asp Asn Tyr Asp
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
35 40 45
Ser Ile Arg Arg His Asp Thr Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Val Arg Leu Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn Arg Glu
130 135 140
Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala Gln Thr
145 150 155 160
Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser
165 170 175
Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp Lys Leu
180 185 190
Gly Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly Ala Thr
210 215 220
Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr Ile Gly
225 230 235 240
Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn
245 250 255
Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Val
260 265 270
Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Thr
275 280 285
Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Val Pro
290 295 300
Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Ile
305 310 315 320
Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met
325 330 335
Phe Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr Ser Gln
340 345 350
Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp Leu Ala
355 360 365
Lys Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu Met Gln
370 375 380
Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro
385 390 395 400
Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser
405 410 415
Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser Arg Asn Pro
420 425 430
Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His
435 440 445
His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met Phe Asp
450 455 460
Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp Thr Leu
465 470 475 480
Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr
485 490 495
Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Arg
500 505 510
Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr
515 520 525
Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu Ser Gly
530 535 540
Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Glu Glu Thr
545 550 555 560
His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His
565 570 575
Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val Met Ala
580 585 590
Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro
595 600 605
Ala Gly Thr Thr Asp
610
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 11
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 12
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 13
gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 14
ctagtgcggc cgctggagac ggtgacctgg gt 32
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 15
ttatgcttcc ggctcgtatg 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial sequence)
<400> 16
ccacagacag ccctcatag 19

Claims (8)

1.抗PD-L1抗原的纳米抗体，其特征在于，包含可变区；
所述可变区包含CDR1、CDR2和CDR3序列：
所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
以及所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。
3.编码如权利要求1或2所述的纳米抗体的核酸分子。
4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为：
（Ⅰ）、如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；或
（Ⅱ）、如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
（Ⅲ）、与（Ⅰ）或（Ⅱ）的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与（Ⅰ）或（Ⅱ）的核苷酸序列不同的核苷酸序列。
5.表达载体，包括如权利要求4所述的核酸分子。
6.转化或转染如权利要求5所述表达载体的宿主细胞。
7.结合物，其特征在于，包含经化学标记或生物标记的如权利要求1或2所述的纳米抗体。
8.试剂盒，包括如权利要求1或2所述的纳米抗体、如权利要求3或4所述的核酸分子、如权利要求5所述的表达载体、如权利要求6所述的宿主细胞和/或如权利要求7所述的结合物，以及检测中可接受的助剂。
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