CN110003333A - 多肽、pd-l1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒 - Google Patents

多肽、pd-l1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种多肽、PD‑L1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒，其中，该多肽序列如下：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Cys Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Ser Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Glu Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ser Ser Thr Thr Gly Trp Gly Thr Ile Cys Asp Ala Leu Asp Ala Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser。本发明技术方案通过结合基因工程的方法得到一种特异性结合PD‑L1蛋白的单域抗体，该抗体特异性结合PD‑L1蛋白的活性高，表达量高，成本低，易改造。

Description

多肽、PD-L1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种多肽、PD-L1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒。
背景技术
程序性死亡分子受体1(programmed death 1，PD-1)属于CD28/CTLA-4家族，是一种I型跨膜受体蛋白，由268个氨基酸组成，包括胞内区、跨膜区以及胞外免疫球蛋白可变区。在胞内区中有两个独立的磷酸化位点，分别为N端的免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)以及c端的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，可通过T细胞抗原和细胞因子受体进行激活，具有调节T细胞间抑制性信号传导的作用。
PD-1主要在激活的T细胞和B细胞中表达，功能是抑制细胞的激活，这是免疫系统的一种自稳机制，避免过度的T/B细胞激活会引起自身免疫病。然而，肿瘤微环境会诱导浸润的T细胞高表达PD-1分子。肿瘤细胞会诱导微环境中PD-1通路持续激活，抑制T细胞功能，导致其无法杀伤肿瘤细胞，从而实现肿瘤细胞的免疫逃逸。而该通路的拮抗剂——例如PD-1的抗体可以阻断这一通路，部分恢复T细胞的功能，使T细胞能够对肿瘤细胞进行杀伤。
然而，现有技术中的PD-1抗体亲和力尚不足，表达量也很低。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种多肽序列，旨在提高PD-L1抗体的活性。
为实现上述目的，本发明提出一种多肽，序列如下：
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly TrpTyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Cys Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Ser Ala GlyGly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp AsnAla Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala GluTyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ser Ser Thr Thr Gly Trp Gly Thr Ile Cys Asp Ala LeuAsp Ala Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser。
本发明还提出一种PD-L1单域抗体，包括多肽序列，所述多肽序列如下：Glu ValGln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu SerCys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln AlaPro Gly Lys Glu Cys Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Ser Ala Gly Gly Ser Thr AsnTyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn ThrVal Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Glu Tyr Tyr Cys AsnAla Glu Ser Ser Thr Thr Gly Trp Gly Thr Ile Cys Asp Ala Leu Asp Ala Phe GlyGln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser。
本发明还提供一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码的多肽或PD-L1单域抗体中包含有如下序列：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro GlyGly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Ala MetGly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Cys Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr SerAla Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser ArgAsp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp ThrAla Glu Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ser Ser Thr Thr Gly Trp Gly Thr Ile Cys AspAla Leu Asp Ala Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser。
在一实施例中，所述核苷酸序列如下：
GAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGTGCGAGTTGGTCGCAACTATTACTAGCGCTGGTGGTAGCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGAGTATTACTGCAACGCAGAAAGCTCGACTACGGGTTGGGGTACCATCTGCGATGCTTTGGACGCATTCGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
本发明还提供一种试剂盒，包括多肽或者PD-L1单域抗体，所述多肽和所述PD-L1单域抗体包含序列如下：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln ProGly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr AlaMet Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Cys Glu Leu Val Ala Thr Ile ThrSer Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Leu SerArg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu AspThr Ala Glu Tyr Tyr Cys Asn Ala Glu Ser Ser Thr Thr Gly Trp Gly Thr Ile CysAsp Ala Leu Asp Ala Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser；
或者所述试剂盒包括核苷酸序列，所述核苷酸序列如下：GAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGTGCGAGTTGGTCGCAACTATTACTAGCGCTGGTGGTAGCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGAGTATTACTGCAACGCAGAAAGCTCGACTACGGGTTGGGGTACCATCTGCGATGCTTTGGACGCATTCGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
本发明技术方案通过结合基因工程的方法得到一种特异性结合PD-L1蛋白的单域抗体，该抗体特异性结合PD-L1蛋白的活性高，表达量高，成本低，易改造。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明第一轮PCR单域抗体基因电泳图；
图2为为图1中1道中800bp-500bp范围内条带，以及2道和3道中的条带进行第二轮PCR单域抗体基因扩增后的电泳图；
图3为蛋白表达纯化图；
图4为本发明PD-L1单域抗体与PD-L1抗原结合活性图。
图5为本发明PD-L1单域抗体亲和力检测过程与线性拟合对比图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实提出了一种多肽、PD-L1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒。下述内容将针对所述多肽及其筛选过程作详细介绍。
首先，本发明的多肽具有三个框架区和两个可变区：
FR1：Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlySer Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Pro Gly Asn Ile Phe Ser；
CDR1：Asp Asn Ala Met Gly；
FR2：Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala；
CDR2：His Ile Thr Thr Arg Ser Gly Ala Gly Tyr Val Asp Ser Val Lys；
FR3：Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr LeuGln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn；
CDR3：Thr Asn Pro Pro Met Trp Thr；
FR4：Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser。
一、抗体库的构建
PD-L1抗原：厂家Acro，货号PD1-H82E5。
使用1.2mg上述抗原与等体积福氏佐剂混合。选择成年健康的羊驼，注射该抗原，分6次免疫，第4次免疫后，采取羊驼血清，通过化学发光的方法，测定抗原免疫效价。
当免疫效价达到1万倍以上时，采全血130ml，使用QIAGEN试剂盒(QIAamp RNABlood Mini Kit(50)，货号，52304)分离淋巴细胞。
将分离后的淋巴细胞裂解，然后得到CDNA文库，使用QIAGEN试剂盒(QIAamp RNABlood Mini Kit(50)，货号，52304)，测定得到CDNA的浓度。
用cDNA合成试剂盒(MiniBESTAgarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0，TAKARA公司)，采用巢式PCR方法，进行两轮PCR扩增抗体重链可变区VHH基因片段。
第一轮PCR扩增，可得到大于800bp的普通抗体基因片段，800bp～500bp之间的为缺失轻链的重链抗体基因片段，以及500bp的重链抗体可变区片段VHH.通过电泳，筛选出800bp～500bp的基因片段和500bp的基因片段，然后切胶回收。具体请参阅图1，1号带为普通抗体DNA和重链抗体DNA，能够看到其中的两条亮带，有大于800bp的(普通抗体DNA)，也有在500bp～750bp之间的(重链抗体DNA)，将该图中位于750bp～500bp的条带切胶回收；2号和3号带为重链抗体可变区片段VHH，大小在500bp；将2号和3号带目的条带也进行回收。
以回收的完整重链抗体及其重链可变区的基因片段为模板，用VHH特异性引物经第二轮PCR扩增，得到VHH目的基因(500bp)。请参阅图2，可以看到一条亮带，VHH目的基因大约为500bp，也就是该亮带中混杂有多种500bp左右的VHH目的基因。
上述第一轮PCR引物包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3核苷酸序列。
其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2配对使用，扩增得到图1中1道所示的两个条带；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3配对使用，扩增得到图1中2道所示的一条条带。
第二轮PCR引物包括SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5核苷酸序列。SEQ ID NO：4和SEQID NO：5配对使用，得到图2所示的500bp目的基因。
将上述得到的VHH片段连接到pHEN6噬菌体展示载体质粒(通过BamHI,XhoI双酶切)，之后将VHH片段及pHEN6载体(ZL20111028003.1)经连接酶连接，电转化至TG1感受态细胞中，然后将感受态细胞涂布平板，经菌落PCR验证VHH基因插入率。
当验证VHH基因插入成功后，对重组基因进行克隆效率检测：取电转化菌液涂布LB/Amp平板上，32℃，过夜培养，次日用菌落PCR的方法验证抗体的连接效率，
其中，菌落PCR的方法如下：1、用高压灭菌的牙签或枪头挑取单个菌落，先在抗性平板上点单克隆保存(标记)，然后置于20ul Triton－x100(或去离子水)中搅和。2、将装有20ul Tritonx－100的EP管在100℃下煮2分钟。3、取1ul上清为模板，加入PCR体系进行PCR反应，PCR体系可以为20ul。4、琼脂糖凝胶电泳观察结果。
当噬菌体抗体库的连接效率低于90％时，说明在操作失误，需要重复上述实验过程；当噬菌体抗体库的效率达到90％时，进行下一步操作。
将电转化菌液涂布LB/Amp平板上，32℃，过夜培养物用2YT培养基洗下，以1:1000比例在2YT培养基下进行扩大培养，加入辅助噬菌体M13K07(Invitrogen)进行感染，过夜培养，离心，收集上清后加入20％PEG-2.5M NaCl混匀(噬菌体在上清中)，离心收集沉淀，加入PBS和甘油进行重悬，并保藏于-80℃备用。
二、特异性噬菌体的筛选
由于经过巢式PCR扩增出来的VHH片段有多种，而这些片段中，并非所有这些基因片段都是目标片段，将这些片段VHH片段转入噬菌体后，需要对目标噬菌体进行富集，下述内容为富集目标噬菌体的步骤：
a1:CPBS溶液的配备。将少量无脂牛奶加入到PBS溶液中，其中，无脂牛奶的占比在1％-5％(封闭作用)；将溶解在CPBS溶液中的PD-L1蛋白稀释至80μg/ml～150μg/ml，在此以100μg/ml为例进行操作；
b1：将PD-L1蛋白稀释液后，进行包被(具体以150μl/孔进行操作)；
c1：静置，并弃包被液，加入封闭液(1％CPBS)300μl/孔，37℃封闭2h；
d1：将筛选出来的噬菌体加入到微孔中，并加入封闭液混匀至每孔体积150μl；
e1：室温孵育2h(噬菌体的外壳上分泌抗体，抗体与PD-L1蛋白结合)；
f1：筛孔分别用PBST(含0.05％Tween20)、PBS各洗涤10次，每次2min，将没有结合的噬菌体洗掉；
g1：加入TEA到筛孔中洗脱噬菌体，吹吸混悬均匀，室温静置10min；
h1：再次吹吸混悬均匀后加入到预冷的1M Tris-HCl中混匀，进行滴度的测定；
i1:扩增并纯化扩增后的噬菌体。
上述步骤a1至步骤i1，重复三轮，并以步骤i1的噬菌体作为下一轮步骤d1中的加入微孔的噬菌体(第一轮的噬菌体来源于上述-80℃保藏备用的)。
筛选结果详见下表
筛选次数 加入噬菌体抗体库总量 洗脱液+Tris-HCl
第一轮 5.00E+11 400ul+200ul
第二轮 5.00E+11 400ul+200ul
第三轮 5.00E+11 400ul+200ul
上述步骤a1至步骤i1以包被PD-L1蛋白作为靶标，采用固相筛选法从总噬菌体抗体库进行3轮筛选，经过三轮筛选后，PD-L1特异性噬菌体得到了高效富集。
三、筛选特异性阳性单克隆
虽然上述噬菌体已经得到了高效富集，但是任然残留有少量非特异性的噬菌体，在在下述内容中，将进一步纯化特异性PD-L1单域抗体基因。具体步骤如下：
a2：通过SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5核苷酸序列，对上述已经富集的PD-L1特异性噬菌体进行PCR扩增，获得的特异性PD-L1单域抗体基因(带有限制性内切酶BbsI和BamHI位点的PCR产物)；
b2：用限制性内切酶BbsI和BamHI分别处理PCR产物和pSJF2载体(ZL201110280031)，经T4连接酶连接重组，而获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒sdAb-pSJF2；
c2：从生长菌落的琼脂平板上随机挑取多个单菌落(例如50个至95个)，然后接种在含有Amp的2YT液体培养基的96孔深孔培养板中；
d2：培养4小时后，将单克隆一一对应接种在带编号的以小格分隔的含Amp的LB固体平板上；
e2：向深孔培养板加入IPTG至终浓度0.5mM诱导；
f2：培养过夜后，收获表达蛋白的菌上清液；
g2：以PD-L1抗原进行ELISA测定，选出Anti-PD-L1阳性克隆ELISA测定结果；
h2：挑选出的PD-L1阳性克隆，经DNA测序以鉴定抗PD-L1单域抗体克隆的基因序列SEQ ID NO：6(或者与SEQ ID NO：6互补的SEQ ID NO：7)。
SEQ ID NO：6序列如下：
GAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGTGCGAGTTGGTCGCAACTATTACTAGCGCTGGTGGTAGCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGAGTATTACTGCAACGCAGAAAGCTCGACTACGGGTTGGGGTACCATCTGCGATGCTTTGGACGCATTCGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
四、PD-L1单域抗体在宿主大肠杆菌中表达、纯化
得到上述阳性单克隆后，需要将其表达方可得到PD-L1抗体，后续主要是通过大肠杆菌表达，然后纯化，即可得到所需的PD-L1单域抗体。具体操作过程如下：
a3：将上述含有质粒PD-L1的菌种接种在含氨基苄青霉素的LB培养板上，37℃过夜。在此，由于pSJF2载体自身对氨基苄青霉素具备抗性，从而，在含氨基苄青霉素的LB培养板上，只有含有pSJF2载体的大肠杆菌能生长，避免了其它杂菌的干扰；
b3：挑选单个菌落接种于5ml的含氨基苄青霉素的LB培养液中，37℃，摇床培养过夜；
c3：转种2ml过夜培养物于200mL含氨基苄青霉素的LB培养液中；
d3：37℃摇床培养，240转/分，培养到OD值达0.4～0.6时，加入0.5～1.0mM IPTG，继续培养过夜，然后离心，收菌。
e3：高渗法裂解细菌，离心，收上清中可溶性单域抗体蛋白；
f3：经Ni+离子亲和层析获得纯度达95％以上的蛋白。
具体请参照图3，在图3中，M为蛋白分子标准，条带1为破菌后总蛋白粗提样品。
条带2为总蛋白粗提过镍柱后的样品，说明只有少量的样本被洗脱下来，Ni+柱中还剩余有大量的样本蛋白。
条带3为用含有40毫摩咪唑的洗脱过脱镍柱后剩余的样品，说明经过进一步洗脱后，大部分蛋白都被洗脱下来。
条带4为用含有100毫摩咪唑的洗脱液过镍柱后剩余的样品，通过此条带可以看出，Ni+柱的蛋白几乎全部被洗脱下来，洗脱下来的目标蛋白较纯。五、单域抗体与PD-L1抗原结合活性测定
上述过程已经将目标抗体筛选并纯化出来，为了验证目标抗体的活性，实验步骤如下：
a4：以0.05M Na2CO3·NaHCO3(pH 9.5)稀释PD-L1抗原至2μg/ml，100μl/孔，抗原包被96孔板，4℃孵育过夜；
b4：用PBS洗板三次，300μl 2％BSA(或1％CPBS)封闭96孔板，37℃，孵育2小时；
c4：加入不同稀释浓度的纯化的PD-L1单域抗体，按100μl/孔加入，37℃，孵育1小时；
d4：用0.05％PBST洗板三次；
e4：加5000倍稀释的antiMyctag antibody(HRP)，按100μl/孔加入，37℃，孵育1小时；
f4：用0.05％PBST洗板三次，加TMB100μl/孔，避光室温静置10分钟。g4：加入2MH2SO4 50μl/孔终止反应；
g4：用酶标仪测定450nm波长下的样品OD值。
从图4可以看出，即便PD-L1单域抗体与PD-L1抗原结合后的浓度在1μg/ml时，依然可以检测到较高的活性。
图5为亲和力检测过程图与测算结果。其中，四条曲线分别为使用不同浓度梯度抗体测得结果(1号线对应浓度为235.3nM的抗体，2号线对应浓度为470.6nM的抗体，3号线对应浓度为941.2nM的抗体，4号线对应浓度为1882nM的抗体)。横坐标为时间轴(0-900秒)，纵坐标为实验过程中机器读取的反应数值(Response)。根据实验设计，300秒前为抗原抗体结合过程，300秒-900秒为解离过程，参照图5中的分割线。根据结合过程中机读数值随时间的变化，可得结合常数Kon(1/Ms)。根据解离过程中机读数值随时间的变化，可得解离常数Kdis(1/s)。根据公式：
亲和力常数KD＝解离常数Kdis/结合常数Kon，可得使用不同浓度测得的IL17RA抗体亲和力常数KD＝4.59E-8M。各浓度梯度下检测结果一致，实验结果可靠(参照图5中拟合曲线及下表，R2＝0.973)。
Conc.(nM) Response KD(M) kon(1/Ms) kdis(1/s) FullR^2
235.3 0.106 4.59E-08 1.28E+04 5.89E-04 0.973
470.6 0.145 4.59E-08 1.28E+04 5.89E-04 0.973
941.2 0.195 4.59E-08 1.28E+04 5.89E-04 0.973
1882.4 0.246 4.59E-08 1.28E+04 5.89E-04 0.973
对于PD-L1单抗体生产效率，本发明使用分光光度计对纯化后得到的PD-L1抗体进行浓度测定，测得经表达、提取、纯化后蛋白总量为2.85mg。因实施例中所用表达体系为200ml，因此，本实施例中构建的PD-L1单域抗体原核表达系统单位表达量为1.43mg/100ml。
通过分析计算最终获得的表达量，可以证明实施例中所用的表达体系对蛋白的表达效率，即单位表达体积可获得的蛋白质量。通常情况下，表达量达到0.5mg/100ml，即认为体现出了较高的表达水平(相对于现有技术中的最高水准)，本次PD-L1单域抗体的表达量达到了1.43mg/100ml，达到了较理想的表达量。
由于本发明中，PD-L1单域抗体是一种纳米抗体，成本低，便于生产，也利于后续对其进行改造。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳普瑞金生物药业有限公司
<120> 多肽、PD-L1纳米抗体、核苷酸序列及试剂盒
<130> 123
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Val Ala Leu Gly Leu Asn Val Ala Leu Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly
1 5 10 15
Leu Tyr Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Gly Leu
20 25 30
Tyr Ser Glu Arg Ala Arg Gly Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Ala Leu Ala
35 40 45
Ala Leu Ala Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Pro His Glu Ala Leu Ala Pro
50 55 60
His Glu Ser Glu Arg Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Met Glu
65 70 75 80
Thr Gly Leu Tyr Thr Arg Pro Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Gly Leu Asn
85 90 95
Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Cys Tyr Ser Val Ala Leu Ala
100 105 110
Leu Ala Thr His Arg Ile Leu Glu Thr His Arg Ser Glu Arg Ala Leu
115 120 125
Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Ser Asn
130 135 140
Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Ala Ser Pro Ser Glu Arg Val Ala Leu Leu
145 150 155 160
Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Pro His Glu Thr His Arg Ser Glu
165 170 175
Arg Ala Arg Gly Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ala Leu Ala Leu Tyr Ser
180 185 190
Ala Ser Asn Thr His Arg Val Ala Leu Thr Tyr Arg Gly Leu Asn Met
195 200 205
Glu Thr Ala Ser Asn Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Thr His
210 215 220
Arg Ala Leu Ala Thr Tyr Arg Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Ala Ser Asn
225 230 235 240
Ala Leu Ala Ser Glu Arg Ser Glu Arg Thr His Arg Thr His Arg Gly
245 250 255
Leu Tyr Thr Arg Pro Gly Leu Tyr Thr His Arg Ile Leu Glu Cys Tyr
260 265 270
Ser Ala Ser Pro Ala Leu Ala Ala Ser Pro Ala Leu Ala Pro His Glu
275 280 285
Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Thr His Arg Gly Leu Asn Val
290 295 300
Ala Leu Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Ser Glu Arg
305 310 315
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgccatcaag gtaccagttg a 21
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgggatccca ggtacagctg gtggagtctg ggggag 36
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgctcgagt acttcattcg ttcctgagga gacggt 36
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccgctcgagt gaggagacgg tgacctgg 28
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgggatccga ggtacagctg gtggagtctg ggggag 36
<210> 7
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaggtacagc tggtggaatc tgggggaggc ttggcgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt agctatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagg agtgcgagtt ggtcgcaact attactagcg ctggtggtag cacaaactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccctc tccagagaca atgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgagt attactgcaa cgcagaaagc 300
tcgactacgg gttggggtac catctgcgat gctttggacg cattcggcca ggggacccag 360
gtcaccgtct cctca 375

Claims (5)

1.一种多肽，其特征在于，序列如下：
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly SerLeuArg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly TrpTyrArg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Cys Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Ser Ala GlyGlySer Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp AsnAlaLys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala GluTyrTyr Cys Asn Ala Glu Ser Ser Thr Thr Gly Trp Gly Thr Ile Cys Asp Ala LeuAspAla Phe Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser。
2.一种PD-L1单域抗体，其特征在于，包括如权利要求1所述的多肽序列。
3.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1所述的多肽或者编码如权利要求2所述的PD-L1单域抗体。
4.如权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如下：
GAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCTTTCAGTAGCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGTGCGAGTTGGTCGCAACTATTACTAGCGCTGGTGGTAGCACAAACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGAGTATTACTGCAACGCAGAAAGCTCGACTACGGGTTGGGGTACCATCTGCGATGCTTTGGACGCATTCGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的多肽，或者包括如权利要求2所述的PD-L1单域抗体，或者包括如权利要求3或4所述的核苷酸序列。
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