CN110540998B - 一种快速构建多价抗体表达载体的方法和试剂 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种快速构建多价抗体表达载体的方法和试剂。本申请方法包括，用化学合成的两端有酶切位点的抗体基因和连接肽基因组成的插入片段构建载体‑抗体基因‑linker‑1；采用定点突变，构建载体‑抗体基因‑linker‑2和载体‑抗体基因‑3，使三个克隆载体中，前一个克隆载体插入片段3’端酶切的黏末端与后一个载体插入片段5’端酶切的黏末端互补，使三个克隆载体酶切产物能依序相连；采用定点突变将预设的位于多价抗体表达载体两端的酶切位点加入表达载体骨架中，并将多价抗体表达载体接入表达载体骨架。本申请的方法，采用一种核酸内切酶，对所有片段统一进行酶切和连接，即可实现各片段有序连接，获得多价抗体表达载体，大大简化了多价抗体表达载体构建流程。
Description
技术领域
本申请涉及多价抗体制备领域，特别是涉及一种快速构建多价抗体表达载体的方法和试剂。
背景技术
双价抗体(缩写BsAbs)的研究是从20世纪60年代开始的，多克隆血清中的两个不同抗原结合片段(Fabs)重新结合，形成双特异性F(ab')2分子。相比于天然的单特异性抗体，双价抗体识别同一或不同抗原上的两种不同的抗原表位。双价抗体，又称双特异性抗体，是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子或功能细胞之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种，它能够结合一个抗原的两个表位，或者结合两种抗原的表位。自然产生的抗体Fc域可以介导一系列的效应：ADCC、CDC、抗原呈递、FcRn-介导循环(长半衰期)等，而传统的重组单抗只能结合一个表位，且不能募集T细胞，因其不表达Fc受体，因而往往不能充分利用免疫系统的效应；然而双价抗体拥有两种特异性抗原结合位点，可以同时与靶细胞和功能细胞，一般为T细胞，相互作用，进而增强对靶细胞的杀伤作用。
BsAbs以三功能抗体(Triomab)和双特异性T细胞衔接器(Bispeific T cellEngager，BiTE)为代表，与普通抗体相比具备更强特异性、引导T细胞杀伤肿瘤和降低脱靶毒性等显著优势，目前已经在肿瘤和炎症等相关疾病中应用。数据显示，BsAb杀伤肿瘤效果是普通抗体的100-1000倍；用量最低可降为普通抗体的1/2000，在药效和价格上比一般抗体更具竞争优势。
BsAbs作为潜在的癌症治疗药物已提出了几十年，但直到最近才开始结出果实。BsAbs的优势包括：(1)BsAbs可以将特定的免疫细胞定向至肿瘤细胞以增强对肿瘤的杀伤力；(2)BsAbs可以同时阻断两种不同介质/通路而发挥独特的或重叠的功能；(3)BsAbs与两种不同的细胞表面抗原结合，相对而言能增加结合特异性。BsAbs已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。目前，双价抗体已经被用做为癌症、慢性炎症疾病、自身免疫、神经变性、出血性疾病和感染等疾病的潜在治疗方法。
抗体药物是目前新药研发的主要方向，在传染病的诊断、防治和生物科学研究领域都已得到了广泛的应用。到2015年截止，已经有48个抗体药物成功上市，仅2014年4月至2015年3月期间就有7个抗体药物成功获批。2014年全球销售排名前10的药物中有6个都为抗体药物。过去几年，双价纳米抗体药物的研制取得了巨大的成就，同时也有一批药物上市或正进行临床试验，可以预见，随着大量双价纳米抗体设计优化研究的进一步发展，必然将扩展其在临床上的应用范围并提高其治疗的有效性。
纳米抗体是骆驼或者鲨鱼产生的重链抗体的单臂可变区，即VHH或者VNAR。最早是被Hamers Casterman等人从昏睡病的骆驼血中发现，随后在一些软骨鱼类如护士鲨体内也发现了类似的抗体。纳米抗体自从被发现之后，在基础研究、诊断、治疗等方面的研究飞速发展。
相比于传统抗体，纳米抗体具有以下几个优势：(1)VHH仅有15kDa，为传统抗体的1/10，相对小的体积使得纳米抗体具有较强的组织穿透性，也能穿过血脑屏障，进而成为治疗阿兹海默症潜在药物；(2)纳米抗体的水溶性很高，很容易在细菌如E.coli中大量生产；(3)纳米抗体在极端恶劣条件也能保持活性，稳定性强，pH耐受范围大，在存在蛋白酶和离液剂的情况下仍具有活性，在37℃放置一周仍能保持相对稳定。以上这些优点，使得纳米抗体研究的前景非常可观。再者，VHH有三个可变区(CDR)，四个骨架区(FR)，而常规抗体有两个这样的结构。纳米抗体的VHH序列和人的VH的基因同源性高达80％-90％，改变纳米抗体的FR2的亲疏水性，可以将其人源化，继而阻止人体产生抗纳米抗体的免疫反应。然而，纳米抗体也有一些弊端：(1)未修饰的纳米抗体不能跨越细胞膜，而纳米抗体作为药物往往需要转染或者转导入细胞，可能的解决方法是将纳米抗体偶联穿膜肽或者大肠杆菌的蛋白分泌系统；(2)在细胞内表达的纳米抗体会失去其功能性；(3)纳米抗体的产生从动物饲养，免疫动物，文库构建到噬菌体展示相对比较昂贵。
纳米抗体在结晶学、实体瘤、HIV等方面的应用逐渐成熟。纳米抗体在结晶学的应用，主要是在结构生物学中用于结晶伴侣。结晶可以用来研究蛋白质的三维结构，但是X射线能级高，会使得检测蛋白不稳定而很难得到理想的结果。通过抗原抗体结合反应，用抗体中和抗原表位，使其更具疏水性，依靠抗原抗体结合的四个力的相互作用，稳定抗原的结构。通过将待测蛋白作为抗原，用纳米抗体技术产生抗该抗原的抗体，作为结晶伴侣对其进行中和，稳定蛋白的构象，使得更好的检测蛋白的3D结构。目前已经有很多成功的案例阐述纳米抗体辅助X射线结晶技术。天冬氨酸蛋白酶β位点淀粉前体蛋白剪切酶(BACE2)，淀粉前体蛋白(APP)是阿兹海默症的标志，BACE2发挥活性，会导致葡萄糖动态平衡失衡，胰岛素含量降低，进而诱发糖尿病。实验发现抑制BACE2的活性可以增加胰岛素抵抗小鼠的胰岛素水平，降低糖尿病的发生风险。以BACE2为抗原，产生抗BACE2的纳米抗体，用于结合BACE2并稳定其构象，增加晶体衍射的稳定性，更好的研究BACE2的3D结构。β2肾上腺素受体(β2AR)，它能发挥类似G蛋白的功能，进而稳定GPCR(G蛋白偶联受体)，GPCR的结构研究很困难，因为它只有在G蛋白存在的情况下才能展现活性。通过产生抗β2AR的纳米抗体，最终获得在分子结晶中稳定的β2AR和纳米抗体复合体，用于β2AR的结构研究。传递激活信号以激活G蛋白腺苷活化酶反应的蛋白，在结晶过程中，T4L-β2AR-Gs--Nb35能使得结晶衍射增加。
纳米抗体在实体瘤的应用，主要是用于实体瘤的癌症治疗。对于实体瘤的治疗，抗体技术可以中和实体瘤产生的特异性的生长信号分子，进而减缓甚至抑制其癌变的发展，纳米抗体由于大小相对于传统抗体小，可以很好的穿过血管壁进入靶点，而纳米抗体同时可以偶联药物，作为“引路”分子，将药物带到靶点发挥作用。实体瘤的一些异常活化的信号分子有EGFR2、VEGFR2、c-Met、CXCR7等，这些都可以作为靶点，用纳米抗体抑制其发挥作用。通过纳米抗体建库技术筛选出高亲和力的抗体后，将纳米抗体通过静脉注入病人血液中，下一步，在肿瘤局部通过负压作用从血管壁渗透入组织液。然后，纳米抗体捕获抗原，中和抗原，发挥作用。一般可以将纳米抗体偶联Fc片段，利用Fc片段介导的内吞作用，将目标抗原清除，或者将纳米抗体结合抗肿瘤的药物，如阿霉素，将药物带到作用局部，而使得药物发挥作用，或者结合人的血清白蛋白，用以增加其在血液中的半衰期。纳米抗体技术治疗肿瘤，可以实现个体化治疗，能更好的处理肿瘤异质性。这是一个发展相对成熟的技术，但是，从实验室到临床还需要一定的时间。
纳米抗体在HIV的应用，主要是利用AIDS中HIV-1靶点进行治疗。对于HIV-1的治疗一直没有突破性的进展，通过纳米抗体技术，产生抗gp120的抗体，进而阻遏gp120和T细胞表面受体铆钉，能极大的改善HIV-1患者的感染扩展和恶化状况。同时VHH可以实现多亚型，如A或B或C亚型，的结合，使得在HIV-1小的变异范围内大范围的中和gp120信号的作用。由于VHH制作成本低，且VHH相对很稳定，纳米抗体将会成为治疗AIDS的下一个潜力疗法。
多价纳米抗体的制备，通常需要构建多价纳米抗体表达载体，然后再由多价纳米抗体表达载体进行表达获得多价纳米抗体。其中，多价纳米抗体表达载体的构建方法有两种：第一种是直接通过化学合成的方法，将所需要的表达序列顺序合成出来，如三价的纳米抗体，需合成VHH-linker-VHH-linker-VHH。第二种方法采用分子克隆的方法，在VHH和linker的两端分别加上不同的酶切位点，将3个VHH和2个linker共计五个片段，先后连接到表达载体骨架上，总共需要五次克隆-酶解-连接才能完成。
化学合成的方法，由于纳米抗体序列的高度相似性，利用现有技术构建双价纳米抗体时，纳米抗体VHH和连接肽linker往往不能高效、正确的连接，造成构建效率低下、可靠性不高，而且合成费用较高，周期较长。分子克隆的方法，虽然能够准确连接，但是，需要进行多次克隆-酶切-连接反应，步骤繁琐，耗时长。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的快速构建多价抗体表达载体的方法，以及基于该方法的用于快速构建多价纳米抗体表达载体的试剂。
本申请具体采用了以下技术方案：
本申请一方面公开了一种快速构建多价抗体表达载体的方法，具体包括以下步骤：
载体-抗体基因-linker-1构建步骤，将化学合成的第一插入片段构建到载体上，其中，第一插入片段由5’端至3’端依序包括第一酶切位点、抗体基因片段、连接肽基因片段、第二酶切位点，获得载体-抗体基因-linker-1；
载体-抗体基因-linker-2构建步骤，以载体-抗体基因-linker-1为模板，采用定点突变技术，将第一插入片段5’端的第一酶切位点突变为所述第二酶切位点，将第一插入片段3’端的第二酶切位点突变为第三酶切位点，获得载体-抗体基因-linker-2；所获得的载体-抗体基因-linker-2中抗体基因的5’端具有第二酶切位点，连接肽基因的3’端具有第三酶切位点；
载体-抗体基因-3构建步骤，以载体-抗体基因-linker-1或载体-抗体基因-linker-2为模板，采用定点突变技术，将第一插入片段5’端的酶切位点突变为第三酶切位点，并突变去除第一插入片段中的连接肽基因片段，同时将第一插入片段3’端的酶切位点突变为第四酶切位点，获得载体-抗体基因-3；所获得的载体-抗体基因-3中，抗体基因的5’端具有第三酶切位点，抗体基因的3’端具有第四酶切位点；
表达载体骨架改造步骤，以表达载体骨架为模板，采用定点突变技术在载体的多克隆位点序列中加入第一酶切位点和第四酶切位点，获得改造后的表达载体骨架；
其中，第一酶切位点、第二酶切位点、第三酶切位点和第四酶切位点，能够被相同的II型核酸内切酶识别，并产生不同的粘性末端；
酶切连接步骤，采用II型核酸内切酶对载体-抗体基因-linker-1、载体-抗体基因-linker-2、载体-抗体基因-3和改造后的表达载体骨架进行酶切，并采用连接酶进行连接，获得pET28-抗体基因-linker-抗体基因-linker-抗体基因，即获得本申请的多价抗体表达载体。
需要说明的是，本申请的关键在于实现合成包括抗体基因片段和连接肽基因片段的插入片段，并且在插入片段的两端插入识别位点相同，但是切割位点不同的II型核酸内切酶；然后通过对切割位点进行突变，获得一系列识别位点相同，但是酶切后产生不同粘性末端的抗体基因片段和连接肽基因片段；因此，采用本申请的方法，可以一次性对多个片段进行同时酶切、连接，实现多价抗体表达载体的构建；特别是在已经构建好载体-抗体基因-linker-1、载体-抗体基因-linker-2、载体-抗体基因-3和pET28的情况下，直接一次酶切、连接反应，就可以获得多价抗体表达载体；大大简化了多价抗体表达载体的构建流程。
本申请的方法最终构建的是pET28-抗体基因-linker-抗体基因-linker-抗体基因三价抗体表达载体，可以理解，如果需要还可以根据相同的思路构建载体-抗体基因-linker-n，实现四价、五价甚至更多价抗体表达载体的构建，在此不做具体限定。另外，本申请的一种实现方式中，表达载体骨架采用的是pET28a，根据不同的试验或生产需求，也可以采用其它表达载体骨架，只要表达载体骨架的酶切识别位点不与本申请选用的酶切识别位点重合，并且确保表达载体骨架的抗性基因与载体-抗体基因-linker-1、载体-抗体基因-linker-2和载体-抗体基因-3的抗性不同即可。
优选的，酶切连接步骤中，获得pET28-抗体基因-linker-抗体基因-linker-抗体基因，还包括将酶切连接产物转化大肠杆菌，挑取克隆进行鉴定，选择其中按照pET28-抗体基因-linker-抗体基因-linker-抗体基因顺序正确连接的克隆，即获得本申请的多价抗体表达载体。
其中，大肠杆菌是常见的克隆菌株，不排除可以采用其它工程菌，只要能够将克隆质粒在菌株内复制即可，在此不做具体限定。
优选的，抗体基因片段为纳米抗体基因VHH。
优选的，载体为pUC19，表达载体骨架为pET28。
优选的，II型核酸内切酶为BsaI内切酶，第一酶切位点、第二酶切位点、第三酶切位点和第四酶切位点具有以下通式结构，
5’-GGTCTCN-3’
3’-CCAGAGNNNNN-5’
其中，N表示任意碱基，“GGTCTC”为BsaI内切酶的识别位点，酶切后形成四个碱基的粘性末端。
BsaI内切酶的通式结构中，第一行为正义链，第二行为反义链，根据该通式结构可以看出，酶切后形成的粘性末端具体是指在反义链的5’端形成5’四个碱基凸起的粘性末端。
需要说明的是，本申请的一种实现方式中，特别以多价纳米抗体的多价纳米抗体表达载体构建为例进行了说明，其优选的方案中，抗体基因片段VHH，采用的载体为pUC19，采用的II型核酸内切酶为BsaI内切酶。可以理解，本申请的方法不仅限于多价纳米抗体表达载体构建，其它多价抗体同样可以采用本申请的方法构建；同样的，载体也可以采用与pUC19近似的载体系列，例如pUC18、pMD19-T、pMD18-T等，只要不与所采用的II型核酸内切酶的酶切识别位点重合即可；并且，除BsaI内切酶以外，还可以采用其它的识别位点和切割位点不同，且产生粘性末端的II型核酸内切酶，在此不做具体限定。
本申请的另一方面公开了一种快速构建多价纳米抗体表达载体的试剂，包括第一突变引物组、第二突变引物组、第三突变引物组、第四突变引物组和第五突变引物组；
第一突变引物组和第二突变引物组分别用于对载体-抗体基因-linker-1中的第一插入片段进行酶切位点突变，将第一插入片段5’端的第一酶切位点突变为第二酶切位点，将第一插入片段3’端的第二酶切位点突变为第三酶切位点，以构建载体-抗体基因-linker-2；
第三突变引物组和第四组突变引物组用于对载体-抗体基因-linker-1或载体-抗体基因-linker-2的酶切位点进行突变，具体的，将第一插入片段5’端的酶切位点突变为第三酶切位点，并突变去除第一插入片段中的连接肽基因片段，同时将第一插入片段3’端的酶切位点突变为第四酶切位点，以构建载体-抗体基因-3；
第五突变引物组用于将第一酶切位点和第四酶切位点加入表达载体骨架的多克隆位点序列中。
需要说明的是，本申请快速构建多价抗体表达载体的方法中，采用定点突变技术改变酶切位点，实际上就是通过PCR扩增进行酶切位点改变；例如设计引物的3’端与原本酶切位点序列3’端相邻的一段碱基序列互补，而引物的5’端或者引物的中间位置则设计为需要替换的酶切位点，则在进行PCR扩增后，指数扩增的PCR扩增产物就被替换为所设计的酶切位点，以此实现酶切位点突变。相同的，删除连接肽基因片段，也是通过PCR扩增实现的，实际上就是利用PCR对抗体基因片段进行选择扩增。基于以上原则，可以任意设计第一突变引物组、第二突变引物组、第三突变引物组、第四突变引物组和第五突变引物组。
优选的，第一突变引物组的正反向引物分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列，第二突变引物组的正反向引物分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列，第三突变引物组的正反向引物分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列，第四突变引物组的正反向引物分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列，第五突变引物组的正反向引物分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列；
SEQ ID NO.1：
5’-GCCTGCAGGTCGACGGTCTCCATTGGCTGTTCAGCTG-3’
SEQ ID NO.2：
5’-CAGCTGAACAGCCAATGGAGACCTGCAGGCATGCAAG-3’
SEQ ID NO.3：
5’-GTGGCGGTGGTAGTGGTCTCAGGCATCTAGAGGAT-3’
SEQ ID NO.4：
5’-CCGGGGATCCTCTAGATGCCTGAGACCACTACCACC-3’
SEQ ID NO.5：
5’-GCCTGCAGGTCGACGGTCTCAGGCAGCTGTTCAGCTG-3’
SEQ ID NO.6：
5’-CAGCTGAACAGCTGCCTGAGACCTGCAGGCATGCAAG-3’
SEQ ID NO.7：
5’-ACCGTTACCAGCGGTCTCGATCTAAGCTTGCGGCCGC-3’
SEQ ID NO.8：
5’-AAGCTTAGATCGAGACCGCTGGTAACGGTAACCAGGGT-3’
SEQ ID NO.9：
5’-AAGCTTGCGGCCGCGGTCTCATCCGACTAGTGGTCTCGATCTCACCACCACCACCAC-3’
SEQ ID NO.10：
5’-GTGAGATCGAGACCACTAGTCGGATGAGACCGCGGCCGCAAGCTTCGTACGGAGCTC-3’。
需要说明的是，SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.10所示序列的引物组，是本申请一种实现方式中，用于多价纳米抗体表达载体构建的引物。可以理解，首先，这十条引物序列中，除了涉及的BsaI内切酶识别和切割位点以外，其它序列在不影响PCR扩增，也不改变原有的BsaI内切酶识别和切割位点的情况下，都可以进行删减，在此不做具体限定；其次，对于不同的多价抗体表达载体，按照本申请的发明思路还可以设计出更多的引物，不仅限于SEQID NO.1至SEQ ID NO.10所示序列的十条引物，在此不做具体限定。
还需要说明的是，本申请采用第一突变引物组和第二突变引物组对载体-抗体基因-linker-1进行扩增，由于两组引物之间有一部分的重叠区域，因此，可以对载体-抗体基因-linker-1整体进行扩增，并将第一插入片段5’端的第一酶切位点突变为第二酶切位点，将第一插入片段3’端的第二酶切位点突变为第三酶切位点，获得载体-抗体基因-linker-2。
本申请的再一面还公开了一种用于快速构建多价纳米抗体表达载体的试剂盒，该试剂盒中包括本申请的试剂。
优选的，本申请的试剂盒中还包括pUC19载体和/或pET28a载体。
优选的，本申请的试剂盒中还包括PCR扩增反应试剂以及克隆载体转化的菌株和试剂。
可以理解，本申请的试剂盒或者试剂，其目的是为了方便进行多价纳米抗体表达载体构建，因此，在整个构建过程中所涉及的试剂都可以包括在本申请的试剂盒中；当然，考虑到一些试剂本身是实验室的常规试剂，并且避免试剂盒太过冗余，也可以在试剂盒中只包括本申请的用于多价纳米抗体表达载体构建的引物组，至于载体、PCR扩增试剂、克隆载体转化试剂等可以自行购置，在此不做具体限定。
本申请的有益效果在于：
本申请快速构建多价抗体表达载体的方法，率先合成包括抗体基因和连接肽基因片段的插入片段，然后利用II型核酸内切酶具有识别位点和切割位点相分离的特性，在不改变识别位点的情况下，将不同的片段突变为不同的切割位点，使得采用一种核酸内切酶，对所有片段统一进行一次酶切和连接，即可实现各片段的有序连接，从而一次性获得多价抗体表达载体，大大简化了多价抗体表达载体的构建流程，提高了生产质量和效率。
附图说明
图1是本申请实施例中快速构建多价纳米抗体表达载体的结构示意图；
图2是本申请实施例中PCR扩增突变酶切位点的原理示意图。
具体实施方式
现有的多价抗体表达载体制备方法中，化学合成法，效率低、易连接错误、可靠性不高，而且合成费用较、周期较；分子克隆法需要进行多次克隆-酶切-连接反应，步骤繁琐、耗时长。
为此，本申请创造性的率先合成一个包含抗体基因和连接肽基因的片段，并在片段的两头设计相同的酶切识别位点，以及不同的切割位点，使得通过一个酶切产生两个不同的粘性末端；通过粘性末端的突变，实现抗体基因和连接肽基因的有序重复连接，从而达到快速构建多价抗体表达载体的目的。
本申请的多价抗体表达载体是指在工程菌中能够分泌表达多价抗体的克隆载体，例如pET28-VHH-linker-VHH-linker-VHH三价纳米抗体表达载体，其中包含了三个纳米抗体基因片段VHH，和两个连接肽基因片段linker，以及骨架载体pET28。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例以三价纳米抗体表达载体的构建为例进行试验，本例的纳米抗体基因片段的序列为SEQ ID NO.11所示序列，标记为VHH；连接肽基因片段的序列为SEQ ID NO.12所示序列，标记为linker。
SEQ ID NO.11：
5’-GCTGTTCAGCTGGTTGATAGCGGTGGTGGTAGTGTTCAGGCAGGTGGTAATCTGACCCTGAGCTGTGCAGCAAGCCGTTATTTTGCACGTAATTGTCGTGGTTGGTTTCGTCAGGCACCGGGTAAAGAAAGCGAAGGTGTTGCAAGCATTGGTCAGGGTGGTACCTGGAGCGATGTTGCAGCAAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCAGGATAATGCAAAAAATACCGTTTATCTGCAGATGGATAGCCTGAAACCGGAAGATACCGCAATGTATTATTGTGCAGCAGATTTTCGTGGTATTACCCGTGTTCTGGCACGTCGTCCGAATAGCTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTACCAGC-3’
SEQ ID NO.12：
5’-GGTGGTGGAGGCAGTGGTGGTGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGTAGT-3’。
本例三价纳米抗体表达载体的构建方法如图1所示，包括分别构建pUC19-VHH-linker-1、pUC19-VHH-linker-2、pUC19-VHH-3和pET28，然后统一进行一次酶切连接，获得多价纳米抗体表达载体pET28-VHH-linker-VHH-linker-VHH，详细如下：
1.单价抗体-连接肽基因的合成
采用化学合成的方法，合成包含单价纳米抗体基因片段和连接肽基因片段的第一插入片段，其中，单价纳米抗体基因片段即SEQ ID NO.11所示序列，连接肽基因片段即SEQID NO.12所示序列；并且，在第一插入片段的5’端设计第一酶切位点，3’端设计第二酶切位点。第一酶切位点为SEQ ID NO.13所示序列，第二酶切位点为SEQ ID NO.14所示序列。
SEQ ID NO.13：5’-GGTCTCATCCG-3’
SEQ ID NO.14：5’-GGTCTCCATTG-3’。
因此，合成的第一插入片段从5’端至3’端依序由SEQ ID NO.13所示序列、SEQ IDNO.11所示序列、SEQ ID NO.12所示序列和SEQ ID NO.14所示序列组成。
将合成的第一插入片段直接构建至商用克隆载体pUC19上，构建完成载体pUC19-VHH-linker-1。其中，VHH上游的BsaI内切酶位点为SEQ ID NO.13所示序列，linker下游的BsaI内切酶位点为SEQ ID NO.14所示序列。
2.突变载体的构建
(1)根据pUC19-VHH-linker-1上游的BsaI位点，设计第一突变引物组，第一突变引物组的正向引物即F1为SEQ ID NO.1所示序列，反向引物即R1为SEQ ID NO.2所示序列。
F1：5’-GCCTGCAGGTCGACGGTCTCCATTGGCTGTTCAGCTG-3’
R1：5’-CAGCTGAACAGCCAATGGAGACCTGCAGGCATGCAAG-3’
以pUC19-VHH-linker-1为模板采用F1和R1进行PCR扩增，获得第一插入片段5’端的酶切位点突变的产物。
需要说明的是，PCR扩增产物为环状，本例的这种扩增方式模仿细菌的滚环复制，得到的是环状产物，其原理如图2所示，变性后双链的环状质粒变为单链环状，退火时，正反向引物分别结合到两个单链环上，然后延伸形成环状的复制环状链，由于正反向引物的中间部分为突变的酶切位点，因此，复制链的酶切位点也被改变为引物所设计的酶切位点，经过正反向引物的扩增，酶切位点突变的复制环状链的数量呈指数倍增长，最终形成大量的酶切位点突变的双链环状质粒。
PCR反应体系包括：2×Phusion Mix 5μL、pUC19-VHH-linker-1质粒20ng、F1引物0.2μL、R1引物0.2μL，补充超纯水至10μL。
PCR反应条件为：98℃预变性1min，然后进入20个循环：98℃10s、60℃30s、72℃2min，循环结束后，72℃5min，16℃2min。
PCR结束后，将2μL DpnI限制内切酶直接加入PCR扩增产物中，使用枪上下吹打、混合混匀，瞬离，然后37℃，1h。
需要说明的是，DpnI的作用是消化去除模板质粒。因为模板质粒来源于细菌，是经过甲基化的，而PCR扩增得到的产物是未甲基化的。DpnI内切酶可以消化甲基化的模板质粒，而不能消化未甲基化的PCR扩增产物。
取2μL DpnI处理过的PCR扩增产物，转化大肠杆菌，挑选克隆进行测序，从中挑选正确的克隆，即该克隆中VHH上游的BsaI酶切位点改变为SEQ ID NO.14所示序列。
(2)根据pUC19-VHH-linker-1下游的BsaI位点，设计第二突变引物组，第二突变引物组的正向引物即F2为SEQ ID NO.3所示序列，反向引物即R2为SEQ ID NO.4所示序列。
F2：5’-GTGGCGGTGGTAGTGGTCTCAGGCATCTAGAGGAT-3’
R2：5’-CCGGGGATCCTCTAGATGCCTGAGACCACTACCACC-3’
以第一突变引物组PCR扩增产物转化挑选的正确克隆的质粒为模板采用F2和R2进行PCR扩增，获得第一插入片段3’端的酶切位点突变的产物。
PCR反应体系和条件与第一突变引物组相同。
PCR结束后，将2μL DpnI限制内切酶直接加入PCR扩增产物中，使用枪上下吹打、混合混匀，瞬离，然后37℃反应1h。取2μL DpnI处理过的PCR扩增产物，转化大肠杆菌，挑选克隆进行测序，从中挑选正确的克隆，即该克隆中pUC19-VHH-linker-1下游的BsaI酶切位点改变为第三酶切位点，第三酶切位点为SEQ ID NO.15所示序列。
SEQ ID NO.15：5’-GGTCTCAGGCA-3’。
所挑取的正确克隆即载体pUC19-VHH-linker-2，其中，VHH上游的BsaI内切酶位点为SEQ ID NO.14所示序列，linker下游的BsaI内切酶位点为SEQ ID NO.15所示序列。
(3)根据pUC19-VHH-linker-1上游的BsaI位点，设计第三突变引物组，第三突变引物组的正向引物即F3为SEQ ID NO.5所示序列，反向引物即R3为SEQ ID NO.6所示序列。
F3：5’-GCCTGCAGGTCGACGGTCTCAGGCAGCTGTTCAGCTG-3’
R3：5’-CAGCTGAACAGCTGCCTGAGACCTGCAGGCATGCAAG-3’
以pUC19-VHH-linker-1为模板采用F3和R3进行PCR扩增，获得第一插入片段5’端的酶切位点突变的产物。
PCR反应体系和条件与第一突变引物组相同。
PCR结束后，将2μL DpnI限制内切酶直接加入PCR扩增产物中，使用枪上下吹打、混合混匀，瞬离，然后37℃反应1h。取2μL DpnI处理过的PCR扩增产物，转化大肠杆菌，挑选克隆进行测序，从中挑选正确的克隆，即该克隆中VHH上游的BsaI酶切位点改变为SEQ IDNO.15所示序列。
(4)根据pUC19-VHH-linker-1的VHH下游，设计第四突变引物组，第四突变引物组的正向引物即F4为SEQ ID NO.7所示序列，反向引物即R4为SEQ ID NO.8所示序列。
F4：5’-ACCGTTACCAGCGGTCTCGATCTAAGCTTGCGGCCGC-3’
R4:5’-AAGCTTAGATCGAGACCGCTGGTAACGGTAACCAGGGT-3’
以第三突变引物组PCR扩增产物转化挑选的正确克隆的质粒为模板采用F4和R4进行PCR扩增，获得只扩增有纳米抗体基因片段，并且纳米抗体基因片段的5’端为第三酶切位点，3’端为第四酶切位点的产物。
PCR反应体系和条件与第一突变引物组相同。
PCR结束后，将2μL DpnI限制内切酶直接加入PCR扩增产物中，使用枪上下吹打、混合混匀，瞬离，然后37℃反应1h。取2μL DpnI处理过的PCR扩增产物，转化大肠杆菌，挑选克隆进行测序，从中挑选正确的克隆，即该克隆中插入片段只有纳米抗体基因，不包含连接肽基因片段，并且纳米抗体基因片段的5’端为第三酶切位点即SEQ ID NO.15所示序列，3’端为第四酶切位点，第四酶切位点为SEQ ID NO.16所示序列。该克隆即载体pUC19-VHH-3。
SEQ ID NO.16：5’-GGTCTCGATCT-3’。
(5)根据商用骨架载体pET28a的序列，设计第五突变引物组，第五突变引物组的正向引物即F5为SEQ ID NO.9所示序列，反向引物即R5为SEQ ID NO.10所示序列。
F4：5’-AAGCTTGCGGCCGCGGTCTCATCCGACTAGTGGTCTCGATCTCACCACCACCACCAC-3’
R4：5’-GTGAGATCGAGACCACTAGTCGGATGAGACCGCGGCCGCAAGCTTCGTACGGAGCTC-3’
以骨架载体pET28a为模板采用F5和R5进行PCR扩增，将第一酶切位点和第四酶切位点插入pET28a的多克隆位点中，即完成载体pET28的构建。
PCR反应体系和条件与第一突变引物组相同。
3.多片段的连接与鉴定
分别取质粒pUC19-VHH-linker-1、pUC19-VHH-linker-2、pUC19-VHH-3和pET28各100ng，混匀；向混合物中加入T4DNA ligase 1μL，BsaI内切酶1μL，T4 ligase buffer 2μL，用水补充至20μL。
在PCR仪上按照如下反应条件进行酶切连接：首先，进行10个循环的反应：37℃反应5min、16℃反应10min；循环结束后，再50℃反应5min、80℃反应5min。完成连接反应。
对酶切连接产物进行plasmid-safe nuclease处理，降解一切未连接的线性双链DNA，包括不完全连接产物、切开的载体和片段。具体的，向酶切连接产物中加入1μL的plasmid-safe nuclease，37℃反应1h。
将2μLDpnI限制内切酶直接加入plasmid-safe nuclease处理产物中，使用枪上下吹打、混合混匀，瞬离，然后37℃，1h。取2μL DpnI处理过的产物，转化大肠杆菌，挑选单克隆对pET28的插入片段进行测序。
测序结果显示，本例获得了多个序列为SEQ ID NO.17所示序列的单克隆，
SEQ ID NO.17：
5’-GGTCTCATCCGGCTGTTCAGCTGGTTGATAGCGGTGGTGGTAGTGTTCAGGCAGGTGGTAATCTGACCCTGAGCTGTGCAGCAAGCCGTTATTTTGCACGTAATTGTCGTGGTTGGTTTCGTCAGGCACCGGGTAAAGAAAGCGAAGGTGTTGCAAGCATTGGTCAGGGTGGTACCTGGAGCGATGTTGCAGCAAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCAGGATAATGCAAAAAATACCGTTTATCTGCAGATGGATAGCCTGAAACCGGAAGATACCGCAATGTATTATTGTGCAGCAGATTTTCGTGGTATTACCCGTGTTCTGGCACGTCGTCCGAATAGCTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTACCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGGTGGTGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGTAGTGGTCTCCATTGGCTGTTCAGCTGGTTGATAGCGGTGGTGGTAGTGTTCAGGCAGGTGGTAATCTGACCCTGAGCTGTGCAGCAAGCCGTTATTTTGCACGTAATTGTCGTGGTTGGTTTCGTCAGGCACCGGGTAAAGAAAGCGAAGGTGTTGCAAGCATTGGTCAGGGTGGTACCTGGAGCGATGTTGCAGCAAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCAGGATAATGCAAAAAATACCGTTTATCTGCAGATGGATAGCCTGAAACCGGAAGATACCGCAATGTATTATTGTGCAGCAGATTTTCGTGGTATTACCCGTGTTCTGGCACGTCGTCCGAATAGCTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTACCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGGTGGTGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGTAGTGGTCTCAGGCAGCTGTTCAGCTGGTTGATAGCGGTGGTGGTAGTGTTCAGGCAGGTGGTAATCTGACCCTGAGCTGTGCAGCAAGCCGTTATTTTGCACGTAATTGTCGTGGTTGGTTTCGTCAGGCACCGGGTAAAGAAAGCGAAGGTGTTGCAAGCATTGGTCAGGGTGGTACCTGGAGCGATGTTGCAGCAAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCAGGATAATGCAAAAAATACCGTTTATCTGCAGATGGATAGCCTGAAACCGGAAGATACCGCAATGTATTATTGTGCAGCAGATTTTCGTGGTATTACCCGTGTTCTGGCACGTCGTCCGAATAGCTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTACCAGCGGTCTCGATCT-3’
对SEQ ID NO.17所示序列进行分析显示，这些pET28克隆质粒中的插入片段依序由VHH-linker-VHH-linker-VHH组成，可见，本例成功构建了多价纳米抗体表达载体pET28-VHH-linker-VHH-linker-VHH。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 一种快速构建多价抗体表达载体的方法和试剂
<130> 18I26073
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcctgcaggt cgacggtctc cattggctgt tcagctg 37
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagctgaaca gcagaccgtc gacctgcagg catgcaag 38
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtggcggtgg tagtggtctc aggcatctag aggat 35
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccggggatcc tctagatgcc tgagaccact accacc 36
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gttaccgtta ccagctaagg tctcaggcat ctagaggat 39
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccggggatcc tctagatgcc tagatgcctg agacctta 38
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
accgttacca gcggtctcga tctaagcttg cggccgc 37
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aagcttagat cgagaccgct ggtaacggta accagggt 38
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aagcttgcgg ccgcggtctc atccgactag tggtctcgat ctcaccacca ccaccac 57
<210> 10
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtgagatcga gaccactagt cggatgagac cgcggccgca agcttcgtac ggagctc 57
<210> 11
<211> 369
<212> DNA
<213> 纳米抗体基因片段
<400> 11
gctgttcagc tggttgatag cggtggtggt agtgttcagg caggtggtaa tctgaccctg 60
agctgtgcag caagccgtta ttttgcacgt aattgtcgtg gttggtttcg tcaggcaccg 120
ggtaaagaaa gcgaaggtgt tgcaagcatt ggtcagggtg gtacctggag cgatgttgca 180
gcaagcgtta aaggtcgttt taccattagc caggataatg caaaaaatac cgtttatctg 240
cagatggata gcctgaaacc ggaagatacc gcaatgtatt attgtgcagc agattttcgt 300
ggtattaccc gtgttctggc acgtcgtccg aatagctggg gtcagggtac cctggttacc 360
gttaccagc 369
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 连接肽基因片段
<400> 12
ggtggtggag gcagtggtgg tggtggctca ggtggcggtg gtagt 45
<210> 13
<211> 11
<212> DNA
<213> 第一酶切位点
<400> 13
ggtctcatcc g 11
<210> 14
<211> 11
<212> DNA
<213> 第二酶切位点
<400> 14
ggtctccatt g 11
<210> 15
<211> 11
<212> DNA
<213> 第三酶切位点
<400> 15
ggtctcaggc a 11
<210> 16
<211> 11
<212> DNA
<213> 第四酶切位点
<400> 16
ggtctcgatc t 11
<210> 17
<211> 1241
<212> DNA
<213> 多价纳米抗体表达载体
<400> 17
ggtctcatcc ggctgttcag ctggttgata gcggtggtgg tagtgttcag gcaggtggta 60
atctgaccct gagctgtgca gcaagccgtt attttgcacg taattgtcgt ggttggtttc 120
gtcaggcacc gggtaaagaa agcgaaggtg ttgcaagcat tggtcagggt ggtacctgga 180
gcgatgttgc agcaagcgtt aaaggtcgtt ttaccattag ccaggataat gcaaaaaata 240
ccgtttatct gcagatggat agcctgaaac cggaagatac cgcaatgtat tattgtgcag 300
cagattttcg tggtattacc cgtgttctgg cacgtcgtcc gaatagctgg ggtcagggta 360
ccctggttac cgttaccagc ggtggtggag gcagtggtgg tggtggctca ggtggcggtg 420
gtagtggtct ccattggctg ttcagctggt tgatagcggt ggtggtagtg ttcaggcagg 480
tggtaatctg accctgagct gtgcagcaag ccgttatttt gcacgtaatt gtcgtggttg 540
gtttcgtcag gcaccgggta aagaaagcga aggtgttgca agcattggtc agggtggtac 600
ctggagcgat gttgcagcaa gcgttaaagg tcgttttacc attagccagg ataatgcaaa 660
aaataccgtt tatctgcaga tggatagcct gaaaccggaa gataccgcaa tgtattattg 720
tgcagcagat tttcgtggta ttacccgtgt tctggcacgt cgtccgaata gctggggtca 780
gggtaccctg gttaccgtta ccagcggtgg tggaggcagt ggtggtggtg gctcaggtgg 840
cggtggtagt ggtctcaggc agctgttcag ctggttgata gcggtggtgg tagtgttcag 900
gcaggtggta atctgaccct gagctgtgca gcaagccgtt attttgcacg taattgtcgt 960
ggttggtttc gtcaggcacc gggtaaagaa agcgaaggtg ttgcaagcat tggtcagggt 1020
ggtacctgga gcgatgttgc agcaagcgtt aaaggtcgtt ttaccattag ccaggataat 1080
gcaaaaaata ccgtttatct gcagatggat agcctgaaac cggaagatac cgcaatgtat 1140
tattgtgcag cagattttcg tggtattacc cgtgttctgg cacgtcgtcc gaatagctgg 1200
ggtcagggta ccctggttac cgttaccagc ggtctcgatc t 1241
Claims (6)
1.一种快速构建多价抗体表达载体的方法，其特征在于：包括以下步骤，
载体-抗体基因-linker-1构建步骤，将化学合成的第一插入片段构建到载体上，所述第一插入片段由5’端至3’端依序包括第一酶切位点、抗体基因片段、连接肽基因片段、第二酶切位点，获得载体-抗体基因-linker-1；
载体-抗体基因-linker-2构建步骤，以载体-抗体基因-linker-1为模板，采用定点突变技术，将所述第一插入片段5’端的第一酶切位点突变为所述第二酶切位点，将所述第一插入片段3’端的第二酶切位点突变为第三酶切位点，获得载体-抗体基因-linker-2；
载体-抗体基因-3构建步骤，以载体-抗体基因-linker-1或载体-抗体基因-linker-2为模板，采用定点突变技术，将所述第一插入片段5’端的酶切位点突变为第三酶切位点，并突变去除所述第一插入片段中的连接肽基因片段，同时将所述第一插入片段3’端的酶切位点突变为第四酶切位点，获得载体-抗体基因-3；
表达载体骨架改造步骤，以表达载体骨架为模板，采用定点突变技术在载体的多克隆位点序列中加入所述第一酶切位点和所述第四酶切位点，获得改造后的表达载体骨架；
所述第一酶切位点、第二酶切位点、第三酶切位点和第四酶切位点，能够被相同的II型核酸内切酶识别，并产生不同的粘性末端；
酶切连接步骤，采用所述II型核酸内切酶对载体-抗体基因-linker-1、载体-抗体基因-linker-2、载体-抗体基因-3和改造后的表达载体骨架进行酶切，并采用连接酶进行连接，获得pET28-抗体基因-linker-抗体基因-linker-抗体基因，即所述多价抗体表达载体；
所述II型核酸内切酶为BsaI内切酶，所述第一酶切位点、第二酶切位点、第三酶切位点和第四酶切位点具有以下通式结构，
5’-GGTCTCN-3’
3’-CCAGAGNNNNN-5’
其中，N表示任意碱基，“GGTCTC”为BsaI内切酶的识别位点，酶切后形成四个碱基的粘性末端；
所述抗体基因片段为纳米抗体基因VHH，其序列为SEQ ID NO.11所示序列；
SEQ ID NO.11：
5’-GCTGTTCAGCTGGTTGATAGCGGTGGTGGTAGTGTTCAGGCAGGT GGTAATCTGACCCTGAGCTGTGCAGCAAGCCGTTATTTTGCACGTAATTGTCGTGGTTGGTTTCGTCAGGCACCGGGTAAAGAAAGCGAAGGTGTTGCAAGCATTGGTCAGGGTGGTACCTGGAGCGATGTTGCAGCAAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCAGGATAATGCAAAAAATACCGTTTATCTGCAGATGGATAGCCTGAAACCGGAAGATACCGCAATGTATTATTGTGCAGCAGATTTTCGTGGTATTACCCGTGTTCTGGCACGTCGTCCGAATAGCTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTACCAGC-3’
所述连接肽基因片段linker的序列为SEQ ID NO.12所示序列；
SEQ ID NO.12：
5’-GGTGGTGGAGGCAGTGGTGGTGGTGGCTCAGGTGGCGGTGGTAG T-3’
所述载体为pUC19，所述表达载体骨架为pET28。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶切连接步骤中，获得pET28-抗体基因-linker-抗体基因-linker-抗体基因，还包括将酶切连接产物转化大肠杆菌，挑取克隆进行鉴定，选择其中按照pET28-抗体基因-linker-抗体基因-linker-抗体基因顺序正确连接的克隆，即获得所述多价抗体表达载体。
3.一种快速构建多价纳米抗体表达载体的试剂，其特征在于：包括第一突变引物组、第二突变引物组、第三突变引物组、第四突变引物组和第五突变引物组；
所述第一突变引物组和第二突变引物组分别用于对载体-抗体基因-linker-1中的第一插入片段进行酶切位点突变，将所述第一插入片段5’端的第一酶切位点突变为所述第二酶切位点，将所述第一插入片段3’端的第二酶切位点突变为第三酶切位点，以构建载体-抗体基因-linker-2；
所述第三突变引物组和第四组突变引物组用于对载体-抗体基因-linker-1或载体-抗体基因-linker-2的酶切位点进行突变，具体的，将所述第一插入片段5’端的酶切位点突变为第三酶切位点，并突变去除所述第一插入片段中的连接肽基因片段，同时将所述第一插入片段3’端的酶切位点突变为第四酶切位点，以构建载体-抗体基因-3；
所述第五突变引物组用于将所述第一酶切位点和所述第四酶切位点加入表达载体骨架的多克隆位点序列中；
所述第一酶切位点、第二酶切位点、第三酶切位点和第四酶切位点，能够被相同的II型核酸内切酶识别，并产生不同的粘性末端；
所述第一突变引物组的正反向引物分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列，所述第二突变引物组的正反向引物分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列，所述第三突变引物组的正反向引物分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列，所述第四突变引物组的正反向引物分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列；所述第五突变引物组的正反向引物分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列；
SEQ ID NO.1：
5’-GCCTGCAGGTCGACGGTCTCCATTGGCTGTTCAGCTG-3’
SEQ ID NO.2：
5’-CAGCTGAACAGCCAATGGAGACCTGCAGGCATGCAAG-3’
SEQ ID NO.3：
5’-GTGGCGGTGGTAGTGGTCTCAGGCATCTAGAGGAT-3’
SEQ ID NO.4：
5’-CCGGGGATCCTCTAGATGCCTGAGACCACTACCACC-3’
SEQ ID NO.5：
5’-GCCTGCAGGTCGACGGTCTCAGGCAGCTGTTCAGCTG-3’
SEQ ID NO.6：
5’-CAGCTGAACAGCTGCCTGAGACCTGCAGGCATGCAAG-3’
SEQ ID NO.7：
5’-ACCGTTACCAGCGGTCTCGATCTAAGCTTGCGGCCGC-3’
SEQ ID NO.8：
5’-AAGCTTAGATCGAGACCGCTGGTAACGGTAACCAGGGT-3’
SEQ ID NO.9：
5’-AAGCTTGCGGCCGCGGTCTCATCCGACTAGTGGTCTCGATCTCAC CACCACCACCAC-3’
SEQ ID NO.10：
5’-GTGAGATCGAGACCACTAGTCGGATGAGACCGCGGCCGCAAGCT TCGTACGGAGCTC-3’。
4.一种用于快速构建多价纳米抗体表达载体的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括权利要求3所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括pUC19载体和/或pET28a载体。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR扩增反应试剂以及克隆载体转化的菌株和试剂。
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