CN110642951A

CN110642951A - 一种抗ca125糖类抗原的高中和活性纳米抗体及其应用

Info

Publication number: CN110642951A
Application number: CN201910911656.1A
Authority: CN
Inventors: 宋海鹏; 于建立; 刘原源
Original assignee: Shenzhen Creation Nanometer Antibody Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Creation Nanometer Antibody Technology Co Ltd
Priority date: 2018-01-20
Filing date: 2018-01-20
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2038-01-20
Also published as: CN108178799A; CN110642951B; CN110590952A; CN108178799B; CN110590952B

Abstract

本发明公开了一种抗CA125糖类抗原的高中和活性纳米抗体，所述纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，本发明还公开了所述纳米抗体在制备肿瘤治疗药物和肿瘤诊断试剂中的应用。本发明提供的抗CA125纳米抗体对CA125具有高度特异的识别和结合能力，并且对卵巢癌细胞具有显著的ADCC效应，而且可以在小鼠体内实现肿瘤的精确成像。

Description

一种抗CA125糖类抗原的高中和活性纳米抗体及其应用

技术领域

本发明公开了一种抗体，更具体地，本发明公开了一种纳米抗体。

背景技术

CA125卵巢癌相关抗原发现于1981年，是卵巢上皮性类癌的相关性抗原。由胚胎期上皮细胞分泌，正常情况下不分泌或极少分泌，但是当卵巢发生恶性病变时，即使临床上没有表现或病理上难以识别时，CA125值也会升高，因而是较好的卵巢癌诊断及筛查指标，并与卵巢癌的转移及预后有密切关系。最初是由Bast等通过卵巢细胞系OVCA433免疫原，介导鼠源性单克隆抗体OC125应答，继而识别并确认其存在。CA125抗原为分子质量达200ku的糖蛋白，兼有膜结合型与游离型两种态性，是迄今为止，研究最全面的卵巢癌血清标志物之一。90％进展期卵巢癌患者血清CA125浓度呈不同程度升高。

尽管卵巢癌患者首选手术或化疗等方法，但其预后仍不十分理想。肿瘤复发，尤其是腹腔内复发，以及化疗耐药，往往是影响预后的重要因素。目前，卵巢癌新的治疗方案，特别是生物治疗技术发展迅速，且已部分应用于离体和体内研究及临床试验中。卵巢癌生物治疗包括细胞因子、单克隆抗体、转基因疗法等多种形式。在诸多途径中，卵巢癌相关抗原CA125单克隆抗体疗法较为引人瞩目。目前CA125单克隆抗体治疗卵巢癌的技术包括抗原抗体复合物介导人体免疫应答和放射性元素与抗肿瘤药物靶向性诱导两类。抗原抗体复合物介导免疫是依靠激发机体内源性抗肿瘤反应，达到清除病灶、自我修复调控的目的。应用于该技术中最具代表性的抗体为抗CA125/抗T细胞表面分子双特异性抗体(BsAb)和鼠源性单克隆抗体B43.13。抗CA125/抗T细胞表面分子双特异性抗体通过与卵巢癌细胞表面CA125抗原结合，继而以抗T细胞表面分子表位识别诱导T细胞，产生T细胞针对肿瘤组织的细胞毒作用，将病灶杀灭。除此之外，该疗法还能激发机体自身产生和维持较长时间的主动免疫状态。目前抗CA125/抗T细胞表面分子BsAb虽然表现出优异的治疗效果，但是仍有较多问题亟待解决，比如详细的体内药物代谢动力学特征尚不明确；预判其体内应用剂量和激活T淋巴反应后细胞毒作用程度较困难；制备工艺人源化水平较低且毒副反应较明显；BsAb、肿瘤及T淋巴细胞的特异性和亲和力方面均需进一步提高；抗体Fc片段功能仍需改良；抗体肿瘤组织渗透性不高，由此带来了体内肿瘤定位不强、非目的清除率较高的技术问题。鼠源性单克隆抗体B43.13则通过结合CA125抗原形成免疫复合物，启动经典的独特型免疫应答。其作用机制为人源抗鼠抗体激活抗独特型链式反应，进而引起针对CA125的多克隆抗体体液免疫应答。此免疫应答疗法耐受性好，无不良反应或非依从等暂停用药情况，但无法始终保持人体对肿瘤细胞的敏感应答状态，亦不能克服肿瘤免疫逃逸机制。放射性元素与抗肿瘤药物靶向性诱导技术是另外一种CA125单克隆抗体治疗技术。卵巢癌肿瘤细胞减灭术后，残留癌细胞仍在腹腔内种植。一般情形下，这类种植细胞或细胞簇临床不易发现，化疗耐药率高，但其在放射免疫破坏下却相当脆弱。基于该特点，卵巢癌放射免疫疗法发展迅猛。目前的放射免疫疗法主要选择含抗CA125表位的鼠源性单克隆抗体，同位素标记后，靶向定位及放疗。多项试验证实，放射元素标记后，CA125单克隆抗体与其抗原的亲和性并不减弱。然而，传统的单克隆抗体直接放射标记法缺陷较多，尤其是网状内皮系统中放射毒性蓄积及实体瘤疗效欠佳。网状内皮系统蓄积，极大地削弱了同位素标记抗体靶向定位率。至于实体瘤放射免疫疗效欠佳，一般归咎为肿瘤组织摄取浓度低于最适放疗浓度，血浆清除率低及骨髓毒性等。

基于CA125在临床诊断方面所表现出的突出特性以及在肿瘤治疗领域的巨大应用前景，研发出针对CA125的特异性结合抗体，改善临床诊断和治疗效率成为现有技术的迫切需求。但是基于传统抗体的一些缺点，例如亲和力不高，免疫识别效率低下，对于一些隐蔽程度较高的抗原难以达到理想的结合和中和效果。

1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体(H₂)的抗体，其主要是IgG₂和IgG₃类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(Heavy chain only like Antibody，HCAbs)，其抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kD，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识。该类型抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。

相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。

纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。

本发明的目的就是提供一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，既具有优异的特异性抗原结合能力，又能克服传统抗体实体肿瘤渗透性差，靶向效应低等固有缺陷的抗CA125的纳米抗体，并进一步提供其在肿瘤尤其是在卵巢癌治疗药物和诊断制剂制备中的应用。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗CA125的高中和活性纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由下述氨基酸序列组成:由SEQ ID NO.7所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.8所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.9所述氨基酸序列组成。

在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ ID NO.10所述氨基酸序列组成。

第二，本发明还提供了一种含有上述纳米抗体可变区的抗体，所述抗体还具有恒定区，所述抗体的恒定区序列由SEQ ID NO.5所述氨基酸序列组成。

第三，本发明还提供了一种编码上述抗体序列的多核苷酸，所述多核苷酸的序列由SEQ ID NO.11所示。

第四，本发明提供了一种含有上述多核苷酸的表达载体。

在一个优选的技术方案中，所述载体为pMES4。

第五，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

第六，本发明还提供了上述抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。

在一个优选的技术方案中，所述肿瘤为卵巢肿瘤。

最后，本发明提供了上述的纳米抗体在制备肿瘤诊断试剂中的应用。

本发明提供的抗CA125的纳米抗体，由于具有独特的CDR1、2和3区序列，使所述抗体对CA125抗原具有特异的识别和结合能力。而与其他非特异性交叉反应性蛋白没有反应。本发明提供的纳米抗体具有显著的ADCC效应，能够诱导表达CA125的肿瘤细胞OVCAR-3的裂解，而对于不表达CA125的A431细胞则不具有这种效应，显示了在肿瘤治疗药物制备中的应用前景。而且，本发明提供的抗CA125纳米抗体可以在小鼠体内实现肿瘤的精确成像，显示了在诊断试剂制备和体内成像技术中的应用前景。

附图说明

图1.SDS-PAGE与Western blot检测亲和纯化CA125鉴定图谱；

图2.SDS-PAGE与Western blot检测分子筛纯化CA125鉴定图谱；

图3.pMES4表达载体结构示意图；

图4.提取的总RNA电泳鉴定图谱；

图5.第一轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图谱；

图6.第二轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图谱；

图7.pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图谱；

图8.菌落PCR鉴定转化子电泳鉴定图谱；

图9.纳米抗体表达SDS-PAGE鉴定图谱；

图10.融合表达载体构建示意图；

图11.纳米抗体纯化SDS-PAGE图谱；

图12.纳米抗体ADCC效应曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1.抗CA125纳米抗体的制备

1.1CA125抗原制备

1.1.1饱和硫酸铵沉淀法纯化卵巢癌患者腹水中的CA125：将2L腹水在磁力搅拌器上边冰浴搅拌边慢慢加228g硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为20％，4℃静置过夜，10000rpm离心10分钟，保留上清液。将上清液在磁力搅拌器上边冰浴搅拌边慢慢加524g硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为60％，4℃静置过夜，10000rpm离心10分钟，保留沉淀。用约400mL PBS溶液吹打混匀沉淀，10000rpm离心10分钟，保留上清液。将上清液用100kD超缩管4000rpm浓缩至200mL，分装为50mL/管。

1.1.2免疫亲和层析纯化卵巢癌患者腹水中的CA125

在一10mL离心管中加入置换了缓冲液的Affi-Gel Hz HydrazideGel与去除氧化剂的Anti-h CA125McAb，颠倒混匀，用封口膜封管口，将离心管插入浮漂固定好后，在30℃的水平摇床中混匀10-24小时。将离心管在室温静置直至Hydrazide Gel沉降至管底，用1mL的微量移液器去除上层溶液后，加入5mL PBS溶液，颠倒混匀，室温静置直至Hydrazide Gel沉降至管底，用1mL的微量移液器去除上层溶液，重复用5mL PBS溶液洗3-5次。将交联好的Affi-Gel Hz Hydrazide Gel与40mL腹水浓缩液加入到一50mL离心管中，在30℃，240rpm水平摇床中亲和结合过夜。将Affi-Gel Hz Hydrazide Gel与腹水混合液过重力柱，收集穿透液。用含0.5M NaCl的PBS溶液洗脱10个柱体积(洗脱杂蛋白)，用0.1M柠檬酸(pH 3.0)洗脱5个柱体积(洗脱目的蛋白)，收集洗脱液。将Affi-Gel Hz Hydrazide Gel用PBS溶液平衡5个柱体积。将收集的洗脱液用100kD超缩管4000rpm浓缩并置换为PBS溶液，至终体积为1mL，于-20℃保存。将收集的洗脱液用0.22μm的滤膜过滤，与平衡过的Affi-Gel HzHydrazideGel在一50mL离心管中，于30℃，240rpm水平摇床中亲和结合过夜，经还原性SDS-PAGE、Western blot及质谱分析，亲和纯化的CA125(大小为180kD、55kD及25kD处均为CA125的部分蛋白条带)中含有部分人血清白蛋白(大小为70kD的蛋白条带)(图1：M为彩虹180广谱蛋白分子量标记；1-3为亲和纯化后的CA125)。

1.1.3利用分子筛分离CA125及白蛋白

利用HiPrep 16/60Sephacryl S-300High Resolution(GE)分离亲和纯化后的CA125与白蛋白，将收集的洗脱液用10kD超滤管4000rpm浓缩洗脱液至1mL，通过还原性SDS-PAGE及Western blot分析纯化效果(图2：M为彩虹180广谱蛋白分子量标记；1为未经分子筛纯化的CA125；2-9为分段收集的CA125洗脱液)。可见在3-5段和7-9段收集的蛋白中含有大部分的人血清白蛋白，因此将2段和6段收集的蛋白合并浓缩，即得到纯度较高的CA125蛋白。

1.2抗CA125纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选

1.2.1羊驼的免疫：选取健康成年羊驼一只羊，将纯化的CA125与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，按6-7μg/Kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。

1.2.2.驼源淋巴细胞的分离：按照本技术领域常规程序从采集的驼源抗凝全血中分析淋巴细胞，每2.5×10⁷个活细胞加入1mL RNA分离试剂，取1mL进行RNA提取，其余-80℃保存。

1.2.3总RNA提取：按照本技术领域常规程序提取总RNA，用RNase-free水调整浓度到1μg/μL(见图4)。

1.2.4.反转录合成cDNA：根据逆转录试剂盒说明书(Roche公司的transcriporfirst stand cDNA synthesis KIT)以2.3步骤获得的RNA为模板进行逆转录cDNA。

1.2.5抗体可变区基因扩增：将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：

CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG

CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃7分钟使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μl(图5：M为Trans 2K DNA分子量标记；1为第一轮PCR产物)。

第二轮PCR的引物序列如下：

VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG

VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT

PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，15个循环；72℃7分钟使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物(图6：M为Trans 2K DNA分子量标记；1为第二轮PCR产物)。

1.2.6载体构建：将pMES4(购自Biovector，其结构示意图见图3)与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μL T₄DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μL总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μL水洗脱。1％琼脂糖电泳凝胶检测pMES4载体双酶切结果(图7：M为Trans 2K DNA分子量标记；1为pMES4载体未酶切质粒；2为pMES4载体双酶切后产物)。

1.2.7电转化及库容测定：取10μL纯化后的连接产物，加入到含有50μL大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(美国BTX的ECM630电转仪)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选18个克隆，进行菌落PCR鉴定(图8：M为Trans 2K DNA分子量标记；1-19为随机挑选的单克隆PCR鉴定产物)。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性率×10)。

引物序列如下：

MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG

GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG

1.2.8噬菌体扩增：取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃200rpm培养到培养物OD₆₀₀＝0.5。取出10ml菌液加入4×10¹⁰VCSM13，37℃静止感染30分钟。4000rpm，常温离心10分钟，去净上清。用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。离心取上清40ml管中，加入10ml PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1ml冰PBS洗涤离心，取上清250μl预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。

测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD₆₀₀＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。

噬菌体滴度(pfu/ml)＝稀释倍数×噬菌斑数目×100

1.2.9纳米抗体筛选：通过ELISA方法以CA125抗原筛选阳性克隆。以CA125抗原包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μl噬菌体上清液，37℃放置1小时。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1小时。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5小时，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。

1.2.10纳米抗体在大肠杆菌中的表达和纯化：挑选噬菌体ELSIA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL₂₁感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清(周质提取物)，并将周质提取物透析至PBS，使用Ni-NTA树脂进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，最后将纳米抗体透析到PBS中。

通过羊驼免疫、细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，共筛选出3株抗CA125的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行分析，登录IMGT(http:// www.imgt.org/IMGT_vquest)，对抗体轻链和重链基因进行分析，以确定可变区的框架区(Framework Regions，FR)和互补决定区(Complementary Determining Regions，CDR)。

纳米抗体VHH-CA125-4H10重链核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示，可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，其中第1-20位氨基酸序列为FR1，第21-28位氨基酸序列为CDR1，第29-45位氨基酸序列为FR2，第46-53位氨基酸序列为CDR2，第54-91位氨基酸序列为FR3，第92-108位氨基酸序列为CDR3，第109-113位氨基酸序列为FR4。

纳米抗体VHH-CA125-2H7重链核苷酸序列为SEQ ID NO.11，可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示，其中第1-20位氨基酸序列为FR1，第21-28位氨基酸序列为CDR1，第29-45位氨基酸序列为FR2，第46-53位氨基酸序列为CDR2，第54-91位氨基酸序列为FR3，第92-108位氨基酸序列为CDR3，第109-113位氨基酸序列为FR4。

纳米抗体VHH-CA125-4C1重链核苷酸序列为SEQ ID NO.16，可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.15，其中第1-20位氨基酸序列为FR1，第21-28位氨基酸序列为CDR1，第29-45位氨基酸序列为FR2，第46-52位氨基酸序列为CDR2，第53-90位氨基酸序列为FR3，第91-108位氨基酸序列为CDR3，第109-113位氨基酸序列为FR4。

1.3筛选出的纳米抗体的表达、纯化

1.3.1纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL₂₁(DE₃)：将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1：1000比例接种于5mL新鲜的LB-A培养基，37℃，200rpm过夜培养。次日，使用Plasmid mini kit(OMEGA)按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1μl转化于100μl感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟，42℃水浴热击90秒，冰浴冷却3分钟。向离心管加入600μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。取上清100μl，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。

1.3.2纳米抗体的诱导表达和提取：挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1：100比例加入100ml新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3小时至菌液OD₆₀₀＝0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10分钟收集菌体，加入1.5mL的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2分钟后，轻柔振荡30秒，重复此循环6次。加3.0ml TES/4(将TES用水稀释4倍)，轻柔振荡30秒后，冰浴静置2分钟，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10分钟，收集约4.5mL的上清(周质提取物)，将上清进行蛋白电泳分析。

1.3.3纳米抗体的纯化和鉴定：将IMAC Sepharose(GE公司)重悬后，取2ml加入到重力柱内，静置30分钟，使sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存缓冲液。加入2倍柱体积的硫酸镍溶液(0.1M)，按照约8秒/滴的流速流出硫酸镍溶液；加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤sepharose，流速维持不变；将样品使用平衡缓冲液2倍稀释后，加入重力柱中，调节流速为6秒/滴，收集穿透液；加入10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤sepharose，维持流速不变，收集洗涤液；加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，流速维持在6秒/滴，收集含有目的蛋白的洗脱液；最后依次加入10倍柱体积的平衡缓冲液、10倍柱体积的纯水和10倍柱体积的20％乙醇洗涤sepharose，并最终保留4ml的20％乙醇来保存柱子。上述收集的样品分别进行SDS-PAGE检测(图9:M为彩虹180广谱蛋白分子量标记；1-3为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体VHH-CA125-4H10、VHH-CA125-2H7和VHH-CA125-4C1)。

实施例2.抗CA125纳米抗体与抗原的亲和活性测定

2.1芯片抗原偶联：将抗原用不同pH的醋酸钠缓冲液(pH 5.5，pH 5.0，pH 4.5，pH4.0)配制成20μg/mL的工作液，同时准备50mM的NaOH再生溶液，利用Biacore T100蛋白相互作用分析系统仪器中的模板方法对不同pH条件的抗原与芯片(GE公司)表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍RL为标准，选择合适的最偏中性的pH体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择Target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60分钟。

2.2分析物浓度设置条件探索及再生条件优化：采取手动进样模式，选择1，2通道2-1模式进样，流速设置为30μL/分钟。进样条件均为120秒，30μL/分钟。再生条件均为30秒，30μL/分钟。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，建议设置200μg/mL，150μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，20μg/mL，10μg/mL，2μg/mL。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个pH梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200μg/mL分析物样品，观察2通道，从最偏中性pH的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200μg/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200μg/mL分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5％，即认为此pH的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低pH的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。

2.3亲和力测试：按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60秒，30μL/分钟；解离时间：600秒；再生条件：30秒，30μL/分钟)对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200分钟。在具体实验中，将芯片上的纳米体俘获到适当的信号值，然后用系统运行缓冲液HBS-EP(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％P20)以30μL/分钟的流速注射到芯片上，获得纳米抗体与抗原相互作用的动态过程。分别使用该方法测试了3个纳米抗体与抗原结合和解离的能力。

2.4结果分析：选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1：1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数。筛选的三株纳米抗体亲和力均达到10^-10。

表1：纳米抗体亲和力数据

实施例3.抗CA125纳米抗体诱导的ADCC活性测定

利用引物，以VHH-pMES4为模板，PCR扩增纳米抗体基因。引物序列如下：

F:CCGAAATTCGAGTCTGGAGGAGG

R:GGAAGATCTCTGGGTCCCCTGGCCC

利用EcoRⅠ和Bgl II限制性内切酶(NEB)将PCR产物与融合表达载体pFUSE-hIgG1-Fc分别进行双酶切(载体示意图参见图10，该载体带有抗体恒定区的编码基因，所述编码基因表达出的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示)。利用T4连接酶(NEB)将双酶切后的载体与纳米抗体基因连接过夜，转化DH5α感受态后利用无内毒素大提试剂盒(天根)提取质粒。转染人293细胞，采用蛋白A亲和层析的方法从293细胞的培养上清中纯化融合有恒定区序列的抗CA125纳米抗体(结果见图11：M为彩虹180广谱蛋白分子量标记；1-3为Fc融合表达纯化后的抗体VHH-CA125-4H10-Fc、VHH-CA125-2H7-Fc和VHH-CA125-4C1-Fc)。在96孔细胞微孔板内培养OVCAR-3和A431细胞(3×10⁴/孔)48小时，然后根据特定比例加入LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞，lymphokine activated killer cells)、抗CA125融合纳米抗体VHH-CA125-4H10-Fc、VHH-CA125-2H7-Fc、VHH-CA125-4C1-Fc或者IgG抗体对照，LAK细胞与靶细胞的比例为1、5、10、15、20:1，抗体浓度均为2μg/ml。在5％CO₂环境下37℃孵育6小时，吸去LAK细胞和死亡的肿瘤细胞，使用MTS方法进行细胞活力测定。细胞毒性(％)＝[实验靶细胞的OD₄₉₀/对照靶细胞的OD₄₉₀]×100

结果显示，抗CA125融合纳米抗体VHH-CA125-4H10-Fc、VHH-CA125-2H7-Fc、VHH-CA125-4C1-Fc均能显著诱导LAK细胞的ADCC活性，肿瘤细胞裂解率在55-75％之间，在不表达CA125的A431细胞中未观察到这种裂解现象(结果参见图12)。

实施例4.抗CA125纳米抗体对异种移植瘤小鼠的体内成像定位

配制OVCAR-3细胞溶液(5×10⁶OVCAR-3细胞溶于0.2ml PBS)，皮下注射于SCID小鼠的背部，待肿瘤生长20天后，通过尾静脉注射的方法分别给予小鼠金属¹⁸⁸Re标记的抗CA125纳米抗体VHH-CA125-4H10、VHH-CA125-2H7、VHH-CA125-4C1或者对照抗体IgG(30μg/0.1ml)，在小动物活体成像系统中对小鼠的移植肿瘤进行成像定位。

结果显示，本发明提供的抗CA125纳米抗体都可以在小鼠体内实现肿瘤的精确成像，将来可用于相关肿瘤的精准体内诊断。

序列表

<110> 深圳市国创纳米抗体技术有限公司

<120> 一种抗CA125糖类抗原的高中和活性纳米抗体及其应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 1

Glu Phe Thr Leu Glu His Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 2

Ile Ser Ser Ser Gln Glu Asn Thr

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 3

Ala Ala Arg Arg Phe Gly Leu Cys Val Ile Ser Pro Gly Tyr Phe Glu

1 5 10 15

Val

<210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 4

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Leu Glu His Tyr Ala Ile Gly Trp Phe

20 25 30

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Gly Cys Ile Ser Ser

35 40 45

Ser Gln Glu Asn Thr Tyr Val Glu Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr

50 55 60

Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser

65 70 75 80

Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Arg Phe

85 90 95

Gly Leu Cys Val Ile Ser Pro Gly Tyr Phe Glu Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr

<210> 5

<211> 231

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Ala His His Ser Glu Asp Pro Ser Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Gly

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Thr Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Val Leu Ser Ile Thr Arg Lys Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Gly Lys Glu Asp Pro Glu Ile Glu Phe Ser Trp Ser Val

50 55 60

Asp Asp Thr Glu Val His Thr Ala Glu Thr Lys Pro Lys Glu Glu Gln

65 70 75 80

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Ala Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu Ala

130 135 140

Lys Asp Thr Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Phe Pro Ala

145 150 155 160

Asp Ile Asn Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly

165 170 175

Thr Tyr Ala Thr Thr Leu Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr Phe

180 185 190

Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Gln Gly Glu

195 200 205

Val Phe Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Ser Thr

210 215 220

Gln Lys Ser Ile Ser Gln Ser

225 230

<210> 6

<211> 1050

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

gagtctggag gaggcttggt gcagcctggg gggtctctga gactctcctg tgcagcctct 60

gaattcactt tggaacatta tgctataggc tggttccgcc aggccccagg gaaggagcgt 120

gagggggtcg gatgtataag tagtagtcaa gaaaacacat atgttgaaga ctccgcgaag 180

ggccgattca ccatctccag agataatgtc aagaacacgg tatatctgca gatgaacagt 240

ctgaaacctg aggacacagc cgtttattac tgtgcagcac gaagattcgg gctatgtgta 300

atatcccctg ggtatttcga agtttggggc cagggcaccc aggtcaccgt ctcctcggcg 360

caccacagcg aagaccccag ctccaagtgt cccaaatgcc caggccctga gctccttgga 420

gggcccacgg tcttcatctt ccccccgaaa cccaaggacg tcctctccat cacccgaaaa 480

cctgaggtca cgtgcgttgt ggtggacgtg ggtaaggaag accctgagat cgagttcagc 540

tggtccgtgg atgacacaga ggtacacacg gctgagacaa agccaaagga ggaacagttc 600

aacagcacgt accgcgtggt cagcgtcctg cccatccagc accaggactg gctgacgggg 660

aaggaattca agtgcaaggt caacaacaaa gctctcccag cccccatcga gaggaccatc 720

tccaaggcca aagggcagac ccgggagccg caggtgtacg ccctggcccc acaccgggaa 780

gagctggcca aggacaccgt gagcgtaacc tgcctggtca aaggcttctt cccagctgac 840

atcaacgttg agtggcagag gaacgggcag ccggagtcag agggcaccta cgccaccacg 900

ctgccccagc tggacaacga cgggacctac ttcctctaca gcaaactctc cgtgggaaag 960

aacacgtggc agcagggaga agtcttcacc tgtgtggtga tgcacgaggc tctacacaat 1020

cactccaccc agaaatccat ctcccagtct 1050

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 7

Asp Ala Pro His Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 8

Ile Thr Trp Ser Gly Gly Thr Thr

1 5

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 9

Ala Val Gly Leu Gly Gly Gly Ala Tyr Arg Glu Asp His Gln Tyr Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 10

<211> 113

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 10

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Glu Arg Ser Asp Ala Pro His Ser Pro Tyr Thr Met Gly Trp Phe

20 25 30

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Thr Trp

35 40 45

Ser Gly Gly Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

50 55 60

Ile Ser Arg Gly Ile Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Thr

65 70 75 80

Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Val Gly Leu Gly

85 90 95

Gly Gly Ala Tyr Arg Glu Asp His Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr

<210> 11

<211> 1050

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

gagtctggag gaggattggt gcaggctggg ggctctctga gactctcctg tgaacgttcg 60

gacgcaccgc acagtcccta taccatgggc tggttccgcc aggctccagg gaaggaccgt 120

gaatttgtag caacaattac ttggagtggt ggtaccacac tctatgcaga ctccgtgaag 180

ggccgattca ccatctccag aggcattgcc aagaacacgg catatcttca aatgaacact 240

ctgaaacctg aggacacggc cgtttattac tgtgcagttg gactgggggg cggtgcctat 300

cgagaagatc atcagtatga ctactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctcggcg 360

caccacagcg aagaccccag ctccaagtgt cccaaatgcc caggccctga gctccttgga 420

gggcccacgg tcttcatctt ccccccgaaa cccaaggacg tcctctccat cacccgaaaa 480

cctgaggtca cgtgcgttgt ggtggacgtg ggtaaggaag accctgagat cgagttcagc 540

tggtccgtgg atgacacaga ggtacacacg gctgagacaa agccaaagga ggaacagttc 600

aacagcacgt accgcgtggt cagcgtcctg cccatccagc accaggactg gctgacgggg 660

aaggaattca agtgcaaggt caacaacaaa gctctcccag cccccatcga gaggaccatc 720

tccaaggcca aagggcagac ccgggagccg caggtgtacg ccctggcccc acaccgggaa 780

gagctggcca aggacaccgt gagcgtaacc tgcctggtca aaggcttctt cccagctgac 840

atcaacgttg agtggcagag gaacgggcag ccggagtcag agggcaccta cgccaccacg 900

ctgccccagc tggacaacga cgggacctac ttcctctaca gcaaactctc cgtgggaaag 960

aacacgtggc agcagggaga agtcttcacc tgtgtggtga tgcacgaggc tctacacaat 1020

cactccaccc agaaatccat ctcccagtct 1050

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 12

Gly Asn Thr Phe Asn Ile Asn Ala

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 13

Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 14

<211> 18

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 14

Asn Ala Val Gln Thr Arg Leu Pro Asn Ser Pro Asp Arg Tyr Glu Tyr

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 15

<211> 113

<212> PRT

<213> Lama pacos

<400> 15

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Phe Asn Ile Asn Ala Met Gly Trp Tyr

20 25 30

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Ser

35 40 45

Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

50 55 60

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu

65 70 75 80

Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala Val Gln Thr Arg

85 90 95

Leu Pro Asn Ser Pro Asp Arg Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr

<210> 16

<211> 1050

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

gagtctgggg gaggcttggt gcaggctggg gggtctctga gactctcctg tgcagcctct 60

ggaaacactt tcaatatcaa tgccatgggc tggtaccgcc aggctccagg gaagcagcgc 120

gagttggtcg ctacaattac tagtggtggt agcacaaact atgcagactc cgtgaagggc 180

cgattcacca tctcgagaga caacgccaag aacacggtgt ttctgcaaat gaacagcctg 240

aaaccagagg acacagccgt ctattactgt aatgcggtcc agacgcgact tccgaacagc 300

ccagaccgtt atgagtatga ctactggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctcggcg 360

caccacagcg aagaccccag ctccaagtgt cccaaatgcc caggccctga gctccttgga 420

gggcccacgg tcttcatctt ccccccgaaa cccaaggacg tcctctccat cacccgaaaa 480

cctgaggtca cgtgcgttgt ggtggacgtg ggtaaggaag accctgagat cgagttcagc 540

tggtccgtgg atgacacaga ggtacacacg gctgagacaa agccaaagga ggaacagttc 600

aacagcacgt accgcgtggt cagcgtcctg cccatccagc accaggactg gctgacgggg 660

aaggaattca agtgcaaggt caacaacaaa gctctcccag cccccatcga gaggaccatc 720

tccaaggcca aagggcagac ccgggagccg caggtgtacg ccctggcccc acaccgggaa 780

gagctggcca aggacaccgt gagcgtaacc tgcctggtca aaggcttctt cccagctgac 840

atcaacgttg agtggcagag gaacgggcag ccggagtcag agggcaccta cgccaccacg 900

ctgccccagc tggacaacga cgggacctac ttcctctaca gcaaactctc cgtgggaaag 960

aacacgtggc agcagggaga agtcttcacc tgtgtggtga tgcacgaggc tctacacaat 1020

cactccaccc agaaatccat ctcccagtct 1050

Claims

1.一种抗CA125糖类抗原的高中和活性纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.7所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.8所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.9所述氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ IDNO.10所述氨基酸序列组成。

3.一种含有权利要求2所述的纳米抗体可变区的抗体，其特征在于，所述抗体还具有恒定区，所述抗体的恒定区序列由SEQ ID NO.5所述氨基酸序列组成。

4.一种编码权利要求3所述抗体的多核苷酸，所述编码序列由SEQ ID NO.11所示。

5.一种含有权利要求4所述的多核苷酸的表达载体。

6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体为pMES4。

7.一种含有权利要求6所述表达载体的宿主细胞，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.权利要求3所述的抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为卵巢肿瘤。

10.权利要求1或2所述的纳米抗体在制备肿瘤诊断试剂中的应用。