CN114106184B - 抗ca125抗原vhh结构域及含有其的双特异性抗体 - Google Patents

抗ca125抗原vhh结构域及含有其的双特异性抗体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗CA125抗原的VHH结构域及单域抗体，以及含有两种VHH结构域的双特异性抗体，所述抗体由两条不同的重链序列融合而成，可以分别识别CA125抗原的不同表位。所述单域抗体以及双特异性抗体均具有优异的抗体识别能力，显著的ADCC效应、并具有较长的体内半衰期，在体内外诊断和药物制备领域具有广阔的应用前景。

Description

抗CA125抗原VHH结构域及含有其的双特异性抗体
技术领域
本发明公开了一种多肽，更具体地，公开了一种抗体，属于免疫学领域。
背景技术
CA125(Cancer Antigen 125)卵巢癌相关抗原发现于1981年，是卵巢上皮性类癌的相关性抗原。由胚胎期上皮细胞分泌，正常情况下不分泌或极少分泌，但是当卵巢发生恶性病变时，即使临床上没有表现或病理上难以识别时，CA125值也会升高，因而是较好的卵巢癌诊断及筛查指标，并与卵巢癌的转移及预后有密切关系。CA125最初是由Bast等通过卵巢细胞系OVCA433免疫原，介导鼠源性单克隆抗体OC125应答，继而识别并确认其存在。CA125抗原为相对分子质量达200ku的糖蛋白，兼有膜结合型与游离型两种态性，是迄今为止研究最全面的卵巢癌血清标志物之一。90％进展期的卵巢癌患者血清中的CA125浓度都会呈现不同程度的升高。
尽管卵巢癌患者首选手术或化疗等治疗方法，但其预后的效果并不理想。肿瘤复发，尤其是腹腔内复发以及化疗耐药，往往是影响预后的重要因素。目前，卵巢癌新的治疗方案，特别是生物治疗技术发展迅速，且已部分应用于离体和体内研究及临床试验中。卵巢癌生物治疗包括细胞因子、单克隆抗体、转基因疗法等多种形式。在诸多途径中，CA125单克隆抗体疗法尤其引人瞩目。目前CA125单克隆抗体治疗卵巢癌的技术包括抗原抗体复合物介导人体免疫应答和放射性元素与抗肿瘤药物靶向性诱导两类。抗原抗体复合物介导免疫应答是依靠激发机体内源性抗肿瘤反应，从而达到清除病灶和自我修复调控的目的。应用于该技术中最具代表性的抗体为抗CA125/抗T细胞表面因子双特异性抗体(BsAb)和鼠源性单克隆抗体B43.13。抗CA125/抗T细胞表面因子双特异性抗体通过与卵巢癌细胞表面CA125抗原结合，继而与T细胞表面因子识别诱导T细胞，产生T细胞针对肿瘤组织的细胞毒作用，将病灶杀灭。除此之外，该疗法还能激发机体自身产生和维持较长时间的主动免疫状态。该方法虽然制备方式多样且产量稳定，但是仍有较多问题亟待解决，比如详细的体内药物代谢动力学特征尚不明确，预判其体内应用剂量和激活T淋巴反应后细胞毒作用程度较困难；制备工艺人源化水平较低且毒副反应较明显；BsAb、肿瘤及T淋巴细胞的特异性和亲和力方面均需进一步提高；抗体Fc片段功能仍需改良等。而鼠源性单克隆抗体B43.13则通过结合CA125抗原形成免疫复合物，启动经典的独特型免疫应答。其作用机制为人源抗鼠抗体激活抗独特型链式反应，进而引起针对CA125的多克隆抗体体液免疫应答。此免疫应答疗法耐受性好，无不良反应或非依从等暂停用药情况，但无法始终保持人体对肿瘤细胞的敏感应答状态，亦不能克服肿瘤免疫逃逸机制。放射性元素与抗肿瘤药物靶向性诱导技术是另外一种CA125单克隆抗体治疗技术。卵巢癌肿瘤细胞减灭术后，残留癌细胞仍在腹腔内种植。一般情形下，这类种植细胞或细胞簇临床不易发现，化疗耐药率高，但其在放射免疫破坏下却相当脆弱。基于该特点，卵巢癌放射免疫疗法发展迅猛。目前的放射免疫疗法主要选择含抗CA125表位的鼠源性单克隆抗体，同位素标记后，靶向定位及放疗。多项试验证实，放射元素标记后，CA125单克隆抗体与其抗原的亲和性并不减弱。然而，传统的单克隆抗体直接放射标记法缺陷较多，尤其是网状内皮系统中放射毒性蓄积及实体瘤疗效欠佳。网状内皮系统蓄积，极大地削弱了同位素标记抗体靶向定位率。至于实体瘤放射免疫疗效欠佳，一般归咎为肿瘤组织摄取浓度低于最适放疗浓度，血浆清除率低及骨髓毒性等。
基于CA125在临床诊断方面所表现出的突出特性以及在肿瘤治疗领域的巨大应用前景，研发出针对CA125的特异性结合抗体，改善临床诊断和治疗效率成为现有技术的迫切需求。但是基于传统抗体的一些缺点，例如亲和力不高，免疫识别效率低下，对于一些隐蔽程度较高的抗原难以达到理想的结合和中和效果。双特异性抗体是近几年发展起来的一种抗体技术，可以同时识别2种不同的抗原。利用双特异性抗体，可以研发同时针对同一抗原不同表位的双价抗体。
抗体分子是通过其重链和轻链可变区共同组成一个特定的空间结构，识别抗原分子，普通的抗体有四条多肽链组成，2条相同的轻链，2条相同的重链，只能识别同一个抗原分子。双特异性抗体可以利用不同的技术获得，如将2种不同抗体的可变区序列串联在同一个恒定区序列基因上，这样表达出来的抗体分子有2种不同的抗原结合区；或者利用化学的方法，将2个不同轻链、2个不同的重链分子连接成一个抗体样结构的分子。抗体分子的重链和轻链可变区可以形成一定的空间结构，识别特定的抗原分子。有研究发现，不同的抗体分子间，存在轻链序列或者重链序列相同的现象，证明轻链和重链通过空间结构的相互契合，可以识别不同的抗原分子或者识别同一抗原的不同表位，这也是抗体分子交叉反应的理论基础。
1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼、单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体(H2)的抗体，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(Heavy chain only like Antibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kDa，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识。这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。
相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。
纳米抗体来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质例如处于极端温度和pH环境中的稳定性，使之可以低成本制造大产量，而且可以克服传统抗体实体肿瘤渗透性差，靶向效应低等固有缺陷。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
鉴于CA125分子量较大，且糖基化位点较多，常规抗体与之结合难以充分识别一些隐匿于间隙或空腔里的抗原决定簇，如果抗体识别抗原决定簇过于单一或者位点过于接近或者重叠，都会导致特异性的抗原抗体结合反应收到影响，从而严重影响检测效率。因此研发抗CA125的纳米抗体，充分发挥纳米抗体超强的抗原识别能力成为抗体技术领域的一种新的需求。本发明的目的提供一种能够特异性识别CA125抗原的纳米抗体，以及能够同时针对CA125抗原不同表位的双特异性纳米抗体。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗CA125抗原的VHH结构域，所述VHH结构域的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别为SEQ ID NO.1的第26-33、51-58、97-112位氨基酸序列所示，或者如SEQ ID NO.3的第26-33、51-57、96-113位氨基酸序列所示。
在一个优选的技术方案中，所述VHH结构域的序列由SEQ ID NO.1或者SEQ IDNO.3所述氨基酸序列组成。在本发明中纳米抗体4A4即具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的VHH结构域，纳米抗体6C1即具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的VHH结构域。
其次，本发明还提供了一种编码上述VHH结构域的核酸，所述核酸的序列由SEQ IDNO.2或者SEQ ID NO.4所示，其中，SEQ ID NO.2编码纳米抗体4A4的VHH结构域，SEQ IDNO.4编码纳米抗体6C1的VHH结构域。
第三，本发明提供了一种含有上述核酸的表达载体，所述表达载体为pMES4。
第四，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
第五，本发明还提供了一种含有上述VHH结构域的单域抗体，所述抗体的恒定区序列如SEQ ID NO.5所示；所述单域抗体即带有缺失CH1的恒定区序列的VHH结构域序列。
第六，本发明还提供了一种双特异性抗体，所述抗体含有两条序列不同的重链，所述两条序列不同的重链由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列串联而成，所述两条序列不同的重链分别识别CA125不同位点。
在一个优选的技术方案中，由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列位于串联的氨基端。
在另一个优选的技术方案中，所述串联的两条序列不同的重链可变区之间设有连接肽，所述连接肽为(G4S)n，其中n为1-6之间的整数。
更为优选地，所述n＝4。
再为优选地，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
第七，本发明还提供了一种编码上述双特异性抗体的核酸，所述核酸的序列由SEQID NO.7所示。
尤为优选地，在所述双特异性抗体的羧基端还带有抗体恒定区，其恒定区序列如SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列所示。
第八，本发明还提供了一种编码上述带有恒定区的双特异性抗体的核酸，所述编码序列由SEQ ID NO.8所示。
第九，本发明提供了一种含有上述核酸的表达载体，所述表达载体为pFUSEhIgG1-Fc2。
第十，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为HEK293细胞。
最后，本发明还提供了所述抗CA125的VHH结构域或单域抗体以及上述双特异性抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
本发明提供的抗CA125双特异性抗体对CA125具有优异的抗原识别能力，而与其他非特异性交叉反应性蛋白没有反应。在针对CA125表达阳性的OVCAR-3肿瘤细胞的ADCC细胞毒性实验中，本发明提供的双特异性抗体和抗CA125纳米抗体均能显著诱导LAK细胞的ADCC活性，且双特异性抗体诱导能力更为显著，其肿瘤细胞裂解率达到81％，高于单独CA125纳米抗体的联合应用，更显著高于两种抗体的单独应用。且本发明提供的双特异性抗体与单独纳米抗体相比具有较长的体内半衰期，这显示出本发明的双特异性抗体在临床治疗CA125抗原阳性的肿瘤以及药物制备领域的应用价值。
附图说明
图1.SDS-PAGE与Western blot检测亲和纯化CA125鉴定图；
图2.SDS-PAGE与Western blot检测分子筛纯化CA125鉴定图；
图3.提取的总RNA电泳鉴定图；
图4.第一轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；
图5.第二轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；
图6.pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图；
图7.菌落PCR鉴定转化子电泳鉴定图；
图8.纳米抗体纯化SDS-PAGE图；
图9.Biacore分析纳米抗体亲和力曲线图；
图10.双特异性抗体纯化SDS-PAGE图；
图11.Biacore分析双特异性抗体亲和力曲线图
图12.带恒定区的双特异性抗体纯化SDS-PAGE图；
图13.ADCC细胞毒性试验结果图；
图14.双特异性抗体与纳米抗体在兔体内的代谢曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
实施例1.天然CA125抗原的制备
1.1饱和硫酸铵沉淀法纯化卵巢癌患者腹水中的CA125
将2L卵巢癌患者的腹水在磁力搅拌器上冰浴搅拌，慢慢加入228g硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为20％，4℃静置过夜，10000g离心10分钟，保留上清液。将上清液在磁力搅拌器上冰浴搅拌，慢慢加入524g硫酸铵，使硫酸铵的终浓度为60％，4℃静置过夜，10000g离心10分钟，保留沉淀。用约400ml PBS溶液吹打混匀沉淀，10000g离心10分钟，保留上清液。将上清液用100kD超滤管4000g浓缩至200ml，分装为50ml/管。
1.2免疫亲和层析纯化卵巢癌患者腹水中的CA125
在10ml离心管中加入置换了缓冲液的Affi-Gel Hz HydrazideGel与去除氧化剂的Anti-hCA125 McAb，颠倒混匀，用封口膜封口，将离心管插入浮漂固定好后，在30℃的水平摇床中混匀10-24小时。将离心管在室温静置直至Hydrazide Gel沉降至管底，用1ml的微量移液器去除上层溶液后，加入5ml PBS溶液，颠倒混匀，室温静置直至Hydrazide Gel沉降至管底，用1ml的微量移液器去除上层溶液，重复用5ml PBS溶液洗3-5次。将交联好的Affi-Gel Hz Hydrazide Gel与40ml腹水浓缩液加入到50ml离心管中，在30℃，240rpm水平摇床中亲和结合过夜。将Affi-Gel Hz Hydrazide Gel与腹水混合液通过重力柱，收集穿透液。用含0.5M NaCl的PBS溶液洗脱10个柱体积(洗脱杂蛋白)，用0.1M柠檬酸(pH 3.0)洗脱5个柱体积(洗脱目的蛋白)，收集洗脱液。将Affi-Gel Hz Hydrazide Gel用PBS溶液平衡5个柱体积。将收集的洗脱液用100kD超滤管4000g浓缩并置换为PBS溶液，至终体积为1ml，于-20℃保存。将收集的洗脱液用0.22μm的滤膜过滤，与平衡过的Affi-Gel Hz Hydrazide Gel在50ml离心管中，于30℃，240rpm水平摇床中亲和结合过夜，经还原性SDS-PAGE、Westernblot及质谱分析，亲和纯化的CA125(大小为180kD、55kD及25kD处均为CA125的部分蛋白条带)中含有部分人血清白蛋白(大小为70kD的蛋白条带)(图1：M为彩虹180广谱蛋白分子量标记；1-3为亲和纯化后的CA125)。
1.3利用分子筛分离CA125及白蛋白
利用HiPrep 16/60Sephacryl S-300High Resolution(GE)分离亲和纯化后的CA125与白蛋白，将收集的洗脱液用10kD超滤管4000g浓缩洗脱液至1ml，通过还原性SDS-PAGE及Western blot分析纯化效果(图2：M为彩虹180广谱蛋白分子量标记；1为未经分子筛纯化的CA125；2-9为分段收集的CA125洗脱液)。可见在3-5段和7-9段收集的蛋白中含有大部分的人血清白蛋白，因此将2段和6段收集的蛋白合并浓缩，即得到纯度较高的CA125蛋白。
实施例2.纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选
2.1羊驼的免疫
选取健康成年羊驼一只，将CA125抗原(GenBank:AAO52683.1，通过HindⅢ和EcoRⅠ两个酶切位点构建在pCDNA3.1载体上，通过人293细胞采用常规分子生物学技术进行表达)与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，按6-7μg/kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。
2.2驼源淋巴细胞的分离
将采集的羊驼外周血利用骆驼外周血淋巴细胞分离液试剂盒(天津灏洋公司，货号LTS1076)说明书操作进行分离淋巴细胞，每2.5×107个活细胞加入1ml RNA分离试剂，取1ml进行RNA提取，其余-80℃保存。
2.3总RNA提取
将含有淋巴细胞的1ml Tipure Isolation Reagent反复吹打，放置5分钟；加入200μl氯仿，涡旋30秒后继续放置5分钟；4℃，12000g离心15分钟，吸取水相转入新的EP管中；加入等量异丙醇，放置10分钟；4℃，12000g离心10分钟，弃上清；用1ml预冷的70％乙醇洗涤，4℃，7500g离心5分钟，弃上清并干燥5分钟；加入30μl RNase-free水溶解沉淀，调整浓度到1μg/μl进行凝胶电泳检测，结果见图3。
2.4反转录合成cDNA
根据逆转录试剂盒说明书(Roche公司的transcripor first stand cDNAsynthesis KIT)以2.3步骤获得的RNA为模板进行逆转录cDNA。
2.5抗体可变区基因扩增
将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：
CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃7分钟。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μl(图4：M为Trans 2K DNA Marker；1为第一轮PCR产物)。第二轮PCR的引物序列如下：
VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，15个循环；72℃7分钟。使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物(图5：M为Marker；1为第二轮PCR产物)。
2.6载体构建
将pMES4(购自Biovector)与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μl T4 DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μl总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μl水洗脱。1％琼脂糖电泳凝胶检测pMES4载体双酶切结果(图6：M为Trans 2K DNA Marker；1为pMES4载体未酶切质粒；2为pMES4载体双酶切后产物)。
2.7电转化及库容测定
取10μl纯化后的连接产物，加入到含有50μl大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(美国BTX的ECM630电转仪)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选克隆，进行菌落PCR鉴定(图7：M为Marker；1-19为随机挑选的单克隆PCR鉴定产物)。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性率×10)。引物序列如下：
MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG
GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG
2.8噬菌体扩增
取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃200rpm培养到培养物OD600＝0.5。取出10ml菌液加入4×1010VCSM13，37℃静止感染30分钟。4000rpm，常温离心10分钟，去净上清。用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。离心取上清40ml管中，加入10ml PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1ml冰PBS洗涤离心，取上清250μl预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。
测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD600＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。
噬菌体滴度(pfu/ml)＝稀释倍数×噬菌斑数目×100
2.9纳米抗体筛选
通过ELISA方法以抗原筛选阳性克隆。以抗原包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μl噬菌体上清液，37℃放置1小时。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1小时。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5小时，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。
2.10纳米抗体在大肠杆菌中的表达和纯化
挑选噬菌体ELISA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清(周质提取物)，并将周质提取物透析至PBS，使用Ni-NTA树脂进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，最后将纳米抗体透析到PBS中。
通过羊驼免疫、细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，筛选出抗CA125的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行抗体轻链和重链基因的分析，以确定可变区的框架区(Framework Regions，FR)和互补决定区(Complementary Determining Regions，CDR)。
本发明筛选到的一个优选实施方案的纳米抗体被命名为“4A4”和“6C1”。通过DNA测序，所述纳米抗体4A4重链核酸序列为SEQ ID NO.2所示，可变区氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示，其中第1-25位氨基酸序列为FR1，第26-33位氨基酸序列为CDR1，第34-50位氨基酸序列为FR2，第51-58位氨基酸序列为CDR2，第59-96位氨基酸序列为FR3，第97-112位氨基酸序列为CDR3，第113-123位氨基酸序列为FR4。所述纳米抗体6C1重链核酸序列为SEQ IDNO.4所示，可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，其中第1-25位氨基酸序列为FR1，第26-33位氨基酸序列为CDR1，第34-50位氨基酸序列为FR2，第51-57位氨基酸序列为CDR2，第58-95位氨基酸序列为FR3，第96-113位氨基酸序列为CDR3，第114-124位氨基酸序列为FR4。
实施例3.纳米抗体的制备
3.1纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1:1000比例接种于5ml新鲜的LB-A培养基，37℃200rpm过夜培养。次日，使用Plasmid mini kit(OMEGA)按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1μl转化于100μl感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟，42℃水浴热击90秒，冰浴冷却3分钟。向离心管加入600μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。取上清100μl，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。
3.2纳米抗体的诱导表达
挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1:100比例加入100ml新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3小时至菌液OD600＝0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10分钟收集菌体，加入1.5ml的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2分钟后，轻柔振荡30秒，重复此循环6次。加3.0ml TES/4(将TES用水稀释4倍)，轻柔振荡30秒后，冰浴静置2分钟，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10分钟，收集约4.5ml的上清(周质提取物)。
3.3纳米抗体的纯化和鉴定
将IMAC Sepharose(GE公司)重悬后，取2ml加入到重力柱内，静置30分钟，使sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存缓冲液。加入2倍柱体积的硫酸镍溶液(0.1M)，按照约8秒/滴的流速流出硫酸镍溶液；加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤sepharose，流速维持不变；将样品使用平衡缓冲液2倍稀释后，加入重力柱中，调节流速为6秒/滴，收集穿透液；加入10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤sepharose，维持流速不变，收集洗涤液；加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，流速维持在6秒/滴，收集含有目的蛋白的洗脱液；最后依次加入10倍柱体积的平衡缓冲液、10倍柱体积的纯水和10倍柱体积的20％乙醇洗涤sepharose，并最终保留4ml的20％乙醇来保存柱子。上述收集的样品分别进行SDS-PAGE检测(图8:M为彩虹180广谱蛋白Marker；1为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体6C1；2为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体4A4)。
实施例4.纳米抗体与抗原的亲和活性测定
4.1芯片抗原偶联
将抗原用不同pH的醋酸钠缓冲液(pH 5.5，pH 5.0，pH 4.5，pH 4.0)配制成20μg/ml的工作液，同时准备50mM的NaOH再生溶液，利用Biacore T100蛋白相互作用分析系统仪器中的模板方法对不同pH条件的抗原与芯片(GE公司)表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍RL为标准，选择合适的最偏中性的pH体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择Target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60分钟。
4.2分析物浓度设置条件探索及再生条件优化
采取手动进样模式，选择1，2通道2-1模式进样，流速设置为30μl/分钟。进样条件均为120秒，30μl/分钟。再生条件均为30秒，30μl/分钟。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，建议设置200μg/ml，150μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，20μg/ml，10μg/ml，2μg/ml。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个pH梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200μg/ml分析物样品，观察2通道，从最偏中性pH的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200μg/ml分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200μg/ml分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5％，即认为此pH的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低pH的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。
4.3亲和力测试
按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60秒，30μl/min；解离时间：600秒；再生条件：30秒，30μl/min)对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200分钟。
4.4结果分析
选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1：1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数(见表1和图9)。抗CA125纳米抗体4A4的亲和力数值为3.593E-09，抗CA125纳米抗体6C1的亲和力数值为1.983E-10。表1中，4H10、2H7和4C1均为中国发明专利申请CN108178799A中公开的三株纳米抗体；5D2为中国发明专利申请CN113512119A中公开的纳米抗体。
表1：纳米抗体亲和力数据
样品编号 结合常数 解离常数 亲和力
4A4 1.687E+06 6.061E-03 3.593E-09
6C1 2.341E+06 4.643E-04 1.983E-10
5D2 7.624E+05 2.326E-04 3.051E-10
VHH-CA125-4H10 2.381E+05 6.775E-05 2.85E-10
VHH-CA125-2H7 5.374E+04 3.857E-05 7.18E-10
VHH-CA125-4C1 1.593E+05 1.012E-04 6.35E-10
实施例5.纳米抗体的ELISA叠加数据分析
5.1抗原饱和浓度的确定
以2μg/ml的浓度包被抗原，100μl/孔，4℃包被24小时，洗板5遍。以1％BSA作为封闭剂过夜封闭，洗板5遍。酶标板中加入不同梯度稀释的纳米抗体、阴性对照(阴性血清1:100)、PBS空白对照，37℃孵育30分钟，洗板5遍。加入1:4000比例稀释的HRP标记的羊抗羊驼IgG，37℃孵育30分钟，洗板5遍。加TMB显色液，37℃孵育10分钟，2M硫酸终止反应。读取吸光值450nm读数，绘制抗体饱和曲线，根据结果选择随浓度增加读数不再增加的浓度为饱和浓度。
5.2位点叠加实验
先加入第一种抗体进行反应，洗板后再加第二种抗体，洗板后加酶标二抗，TMB显色读数(方法同5.1)。计算两株抗体叠加率AI，AI>50％说明被测2株抗体抗原位点不同，AI<50％说明被测两株抗体抗原表位相同，AI值越大，位点重叠可能性越低。公式为：AI＝[2×A(1+2)-(A1+A2)]/A(1+2)×100％
A1—第一株抗体读数
A2—第二株抗体读数
A(1+2)—叠加2种抗体读数
表2：抗体抗原表位叠加实验
Figure BDA0003416261110000141
Figure BDA0003416261110000151
实验结果见表2，4A4与6C1纳米抗体相较于已经公开的抗CA125的纳米抗体识别CA125不同的抗原表位，这预示着在纳米抗体的诊断和治疗应用上，4A4和6C1可以作为表位互补的组合物联合应用，从而可以增大诊断或治疗的效率。
实施例6.利用Biacore分析纳米抗体结合位点
Biacore系统主要原理就是通过表面分子的浓度改变使SPR(折射率)发生偏移，在监测器上表现为RU值的变化。由于该系统的灵敏度更高，我们设计了相关实验来验证ELISA叠加的实验结果。首先重复进2针第一个纳米抗体A，观察RU值的变化，以确认相应的抗原结合位点的饱和并记录；之后进入第二个纳米抗体B，观察并记录RU值：如该RU值比单一的纳米抗体B的RU值相差不超过20％，即可认为两者识别不同的抗原决定簇；如相差值超过20％但低于60％，认为两者有位阻效应；若相差值超过了60％，判定两者识别了同一抗原。具体操作为首先单纯进样抗体B记录RU增加值RB1，并对芯片再生；之后重复进两次抗体A，记录RU增加值RA，并确认饱和后，直接进样抗体B，观察RU值的增加量RB2；之后使用公式(RB2-RA)/RB1来计算位阻率，以此判定二者是否识别同一抗原决定簇。该实施例结果见表3。可见纳米抗体4A4、6C1与已经公开的抗CA125的纳米抗体相比均识别不同抗原位点，该结果与ELISA叠加实验推测的结果一致。更加验证了这两株纳米抗体在CA125抗体领域的应用前景。
表3：Biacore检测纳米抗体叠加实验RU值变化表
Figure BDA0003416261110000152
Figure BDA0003416261110000161
实施例7.抗CA125双特异性纳米抗体的制备及亲和力测定
7.1抗CA125双特异性纳米抗体的制备
将4A4和6C1进行蛋白融合表达，将两个抗体的可变区串联后送往华大基因公司进行基因合成。两个可变区之间用柔性多肽(G4S)4进行连接，合成后的基因两端保留HindⅢ和EcoRⅠ两个酶切位点，且连接在pUC57载体上获得pUC57-4A4-6C1。合成的抗体核酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。将pUC57-4A4-6C1与pCDNA3.1(+)同时利用HindⅢ和EcoRⅠ(NEB公司)进行双酶切，利用T4连接酶(NEB公司)将双酶切后的载体与双纳米抗体基因连接过夜，构建pCDNA3.1(+)-4A4-6C1，转化DH5α感受态后利用无内毒素大提试剂盒(天根公司)提取质粒。转染人293细胞，采用离子交换层析的方法从293细胞的培养上清中纯化双特异性抗体，结果见图10(M：彩虹180广谱蛋白Marker；1为纯化后的双特异性抗体)。
7.2双特异性纳米抗体亲和力测定
按照实施例4的方法优化双特异性抗体的浓度梯度，按照优化后的样品浓度梯度和再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60s，30μl/min；解离时间：600s；再生条件：30s，30μl/min)对双特异性抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1:1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数。结果见表4和图11。从结果可以看出，本发明获得的双特异性抗体与CA125抗原的亲和活性明显高于单株纳米抗体的亲和活性。
表4.双特异性抗体亲和力数据
样品编号 结合常数 解离常数 亲和力
4A4-6C1 2.266E+06 1.741E-04 7.683E-11
4A4 1.687E+06 6.061E-03 3.593E-09
6C1 2.341E+06 4.643E-04 1.983E-10
实施例8.带恒定区的双特异性抗体的制备及其诱导的ADCC活性测定
8.1带恒定区的双特异性抗体的制备
pFUSE hIgG1-Fc2载体(青岛捷世康生物，货号JR442)上自表达人源IgG1的Fc片段，将双特异性抗体连入pFUSE hIgG1-Fc2，即可获得带有恒定区的双特异性抗体。具体操作为：以pUC57-4A4-6C1为模板，PCR扩增融合纳米抗体。引物序列如下：
Doubleab-F：TTATGAATTCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT
Doubleab-R：CCACAGATCTTGAGGAGACGGTGACCTGG
利用EcoRⅠ和BglⅡ限制性内切酶(NEB公司)将PCR产物与融合表达载体pFUSEhIgG1-Fc2(恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)分别进行双酶切，通过T4连接酶(NEB公司)将双酶切后的载体与双特异性抗体连接过夜，构建重组质粒pFUSE hIgG1-Fc2-4A4-(G4S)4-6C1，转化DH5α感受态后利用无内毒素大提试剂盒(天根公司)提取质粒。转染人293细胞，采用Protein A层析的方法从293细胞的培养上清中纯化双特异性纳米抗体，核酸序列如SEQ ID NO.8所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。并将纯化后的双特异性纳米抗体进行SDS-PAGE分析(图12：M为彩虹180广谱蛋白Marker；1为纯化后的带恒定区的双特异性纳米抗体)。
8.2双特异性抗体诱导的ADCC活性测定
8.2.1 LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞，lymphokine activated killercells)制备
取静脉血2ml，放入加有抗凝剂的试管中，轻轻混匀。将试管直立静置于室温或37℃温箱中30-60min，待红细胞自然沉降。此时可见试管中的悬液分3层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，在紧贴红细胞层上有一呈灰白色的白细胞层(PMBC)。用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液，移入另一试管中。加入无Ca2+、Mg2+Hank’s液至离试管口3cm处，混匀，以水平离心机2000r/min离心10min，弃上清，相同方法洗涤两次。沉淀细胞用适量10％-20％灭活小牛血清的Hank’s液重悬，计数，配成所需的细胞浓度的悬液，接种在15ml的细胞培养瓶中(一般常用2×106/ml，RPMI1640培养基含有1000U/ml的白介素-2)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，3天后收集即为LAK细胞。
8.2.2肿瘤细胞的培养
将高表达CA125的OVCAR-3细胞(人卵巢癌细胞，购买于ATCC)与不表达CA125的A431细胞(人皮肤鳞癌细胞，购买于ATCC)在含10％胎牛血清中的RPMI-1640培养基中培养至75-80％的密度，弃培养基，用预热至37℃的PBS洗涤细胞2次，加2ml胰蛋白酶-EDTA溶液，室温放置5min，加2ml含10％胎牛血清的培养基终止反应，采用一次性的无菌吸管反复吹打细胞至单细胞悬液，以水平离心机2000r/min离心10min，弃上清，PBS再洗涤两次，计数后，用培养基重悬细胞至2×106个/ml备用。
8.2.3细胞毒性试验
在96孔细胞微孔板内接种OVCAR-3和A431细胞(5×103个/孔)，5％CO2环境下37℃孵育培养24h后弃培养液，然后根据特定比例加入LAK细胞、抗CA125融合纳米抗体4A4-fc、6C1-fc(抗CA125纳米抗体4A4与6C1的fc融合表达抗体制备同8.1，其中4A4-fc的核酸序列如SEQ ID NO.10所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；6C1-fc的核酸序列如SEQ IDNO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示)或IgG抗体对照(抗体终浓度均为2μg/ml，加入总体积为100μl)，LAK细胞与靶细胞的比例为1、5、10、15、20:1。在5％CO2环境下37℃孵育6h，弃上清(LAK细胞和死亡的肿瘤细胞)。使用MTS方法进行细胞活力测定(abcam公司，货号：ab197010)。
细胞裂解率(％)＝【实验靶细胞的OD490】/【对照靶细胞的OD490】×100
结果如图13所示，纵坐标为肿瘤细胞的裂解率，横坐标为LAK细胞与靶细胞的比例。抗CA125纳米抗体4A4-fc、6C1-fc以及双特异性抗体均能显著诱导LAK细胞的ADCC活性。在LAK与靶细胞比例为20:1的条件下，OVCAR-3细胞裂解率在58％-81％之间，在不表达CA125的A431细胞中未观察到这种裂解现象。本发明提供的双特异性抗体显著增强了抗体介导LAK细胞杀伤OVCAR-3细胞的活性，且高于抗CA125纳米抗体4A4-fc和6C1-fc的单独应用。此结果显示出本发明的双特异性抗体在临床治疗CA125抗原阳性肿瘤的应用价值。
实施例9.双特异性抗体在家兔血浆中的代谢
本实施例以新西兰兔为对象，进行药物代谢动力学的初步研究，每6只新西兰兔为一组，采取背部皮下给药，双特异性纳米抗体和抗CA125纳米抗体4A4和6C1的给药剂量均为1nmol/kg。给药后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、120h、144h进行耳缘静脉采血，分离血清进行抗体滴度的测定，绘制药物滴度时间曲线，结果见图14所示。
结果显示纳米抗体在72h后基本已经代谢完毕，纳米抗体处于较低水平，而双特异性抗体在72h后仍然具有明显滴度，具有治疗效果。使用GraphPad Prism软件分析药物代谢动力学参数，结果见表5。
表5.纳米抗体和双特异性抗体的家兔体内药物代谢动力学参数
Figure BDA0003416261110000191
表5中，tmax是指抗体滴度达到最大时的时间；t1/2是指抗体达到最大浓度后代谢掉一半时的时间。从表中可以看到，双特异性抗体在新西兰兔体内的半衰期长达36小时，明显长于纳米抗体单独给药的18小时和双纳米抗体给药的24小时。
序列表
<110> 深圳市国创纳米抗体技术有限公司
<120> 抗CA125抗原VHH结构域及含有其的双特异性抗体
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Thr
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Arg Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Asp Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Arg Gly Pro Ile Thr Tyr Val Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Glu Pro Gly Pro Gly Tyr Val Gly Ser Tyr Ala Leu Ser Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 369
<212> DNA
<213> Lama pacos
<400> 2
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctggcacctc tctgacactc 60
tcctgtgcag cctctgaacg cacctttagt gcctatgaca tgaactggta ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagct tgtcgcagct attagctggc gtggtcctat cacatacgtt 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccatct attactgtaa tgccgagccg 300
gggccggggt acgtgggaag ttatgccctc tcctactggg gccaggggac ccaggtgacc 360
gtctcctca 369
<210> 3
<211> 124
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Met Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Ala Gln Thr Arg Leu Pro Asn Ser Ala Asp Arg Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 372
<212> DNA
<213> Lama pacos
<400> 4
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaaa catgttcagt gtcaatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgctact attactagtg gtggtagcac aaactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gccgtctatt actgtaatgc agcccagacg 300
cgacttccta acagccctga ccgttatgaa tatgactact ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 5
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 6
<211> 267
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Thr
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Arg Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Asp Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Arg Gly Pro Ile Thr Tyr Val Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Glu Pro Gly Pro Gly Tyr Val Gly Ser Tyr Ala Leu Ser Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser
145 150 155 160
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Met Phe Ser Ile Asn Ala
165 170 175
Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
180 185 190
Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
195 200 205
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln
210 215 220
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala
225 230 235 240
Ala Gln Thr Arg Leu Pro Asn Ser Ala Asp Arg Tyr Glu Tyr Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 7
<211> 801
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctggcacctc tctgacactc 60
tcctgtgcag cctctgaacg cacctttagt gcctatgaca tgaactggta ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagct tgtcgcagct attagctggc gtggtcctat cacatacgtt 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccatct attactgtaa tgccgagccg 300
gggccggggt acgtgggaag ttatgccctc tcctactggg gccaggggac ccaggtgacc 360
gtctcctcag gaggaggagg atcaggtgga ggtggaagcg gaggaggagg ttctggaggt 420
ggaggaagcc aggtgcagct gcaggagtct ggaggaggct tggtgcaggc tggggggtct 480
ctgagactct cctgtgcagc ctctggaaac atgttcagtg tcaatgccat gggctggtac 540
cgccaggctc cagggaagca gcgcgagttg gtcgctacta ttactagtgg tggtagcaca 600
aactatgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaacacg 660
gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaacct gaggacacag ccgtctatta ctgtaatgca 720
gcccagacgc gacttcctaa cagccctgac cgttatgaat atgactactg gggccagggg 780
acccaggtca ccgtctcctc a 801
<210> 8
<211> 1482
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctggcacctc tctgacactc 60
tcctgtgcag cctctgaacg cacctttagt gcctatgaca tgaactggta ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagct tgtcgcagct attagctggc gtggtcctat cacatacgtt 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccatct attactgtaa tgccgagccg 300
gggccggggt acgtgggaag ttatgccctc tcctactggg gccaggggac ccaggtgacc 360
gtctcctcag gaggaggagg atcaggtgga ggtggaagcg gaggaggagg ttctggaggt 420
ggaggaagcc aggtgcagct gcaggagtct ggaggaggct tggtgcaggc tggggggtct 480
ctgagactct cctgtgcagc ctctggaaac atgttcagtg tcaatgccat gggctggtac 540
cgccaggctc cagggaagca gcgcgagttg gtcgctacta ttactagtgg tggtagcaca 600
aactatgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaacacg 660
gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaacct gaggacacag ccgtctatta ctgtaatgca 720
gcccagacgc gacttcctaa cagccctgac cgttatgaat atgactactg gggccagggg 780
acccaggtca ccgtctcctc agacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 840
ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 900
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 960
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1020
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1080
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1140
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1200
tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1260
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1320
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1380
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcacga ggctctgcac 1440
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 1482
<210> 9
<211> 494
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Thr
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Arg Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Asp Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Arg Gly Pro Ile Thr Tyr Val Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Glu Pro Gly Pro Gly Tyr Val Gly Ser Tyr Ala Leu Ser Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser
145 150 155 160
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Met Phe Ser Ile Asn Ala
165 170 175
Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala
180 185 190
Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
195 200 205
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln
210 215 220
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala
225 230 235 240
Ala Gln Thr Arg Leu Pro Asn Ser Ala Asp Arg Tyr Glu Tyr Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
260 265 270
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
275 280 285
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
290 295 300
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
305 310 315 320
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
325 330 335
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
340 345 350
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
355 360 365
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
370 375 380
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
385 390 395 400
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
405 410 415
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
420 425 430
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
435 440 445
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
450 455 460
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
465 470 475 480
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490
<210> 10
<211> 1050
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctggcacctc tctgacactc 60
tcctgtgcag cctctgaacg cacctttagt gcctatgaca tgaactggta ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgtgagct tgtcgcagct attagctggc gtggtcctat cacatacgtt 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccatct attactgtaa tgccgagccg 300
gggccggggt acgtgggaag ttatgccctc tcctactggg gccaggggac ccaggtgacc 360
gtctcctcag acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 420
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 480
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 540
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 600
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 660
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 720
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 780
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 840
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 900
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 960
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcacgagg ctctgcacaa ccactacacg 1020
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1050
<210> 11
<211> 1053
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 11
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaaa catgttcagt gtcaatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgctact attactagtg gtggtagcac aaactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gccgtctatt actgtaatgc agcccagacg 300
cgacttccta acagccctga ccgttatgaa tatgactact ggggccaggg gacccaggtc 360
accgtctcct cagacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 420
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 480
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 540
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 600
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 660
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 720
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 780
gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 840
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 900
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 960
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcacg aggctctgca caaccactac 1020
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1053
<210> 12
<211> 350
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Thr
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Arg Thr Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Asp Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Arg Gly Pro Ile Thr Tyr Val Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Glu Pro Gly Pro Gly Tyr Val Gly Ser Tyr Ala Leu Ser Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
115 120 125
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
130 135 140
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
145 150 155 160
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
165 170 175
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
180 185 190
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
195 200 205
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
210 215 220
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
225 230 235 240
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
245 250 255
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
260 265 270
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
275 280 285
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
290 295 300
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
305 310 315 320
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
325 330 335
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 13
<211> 351
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Met Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Ala Gln Thr Arg Leu Pro Asn Ser Ala Asp Arg Tyr Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His
115 120 125
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
145 150 155 160
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
165 170 175
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
180 185 190
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
210 215 220
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
245 250 255
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
260 265 270
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
275 280 285
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
290 295 300
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
305 310 315 320
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
325 330 335
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350

Claims (14)

1.一种抗ca125抗原的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3分别为SEQ ID NO.1的第26-33、51-58、97-112位氨基酸序列所示。
2. 根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的序列如SEQ IDNO.1。
3. 一种编码权利要求2所述单域抗体的核酸，其特征在于，所述核酸的序列由SEQ IDNO.2所示。
4.一种含有权利要求3所述的核酸的表达载体，其特征在于，所述载体为pMES4。
5.一种含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。
6. 一种双特异性抗体，其特征在于，所述抗体含有两条序列不同的重链，所述两条序列不同的重链由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列串联而成。
7.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述两条序列不同的重链之间设有连接肽，所述连接肽为（G4S）n，其中，n为1-6之间的整数。
8. 根据权利要求7所述的双特异性抗体，其特征在于，所述n=4，所述双特异性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
9. 根据权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，在所述双特异性抗体的羧基端还带有抗体恒定区，其恒定区序列如SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列所示。
10. 一种编码权利要求8所述抗体的核酸，所述核酸的序列由SEQ ID NO.7所示。
11.一种含有权利要求10所述核酸的表达载体，其特征在于，所述载体为pFUSE hIgG1-Fc2。
12.一种含有权利要求11所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为HEK293细胞。
13.权利要求1或2所述单域抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
14.权利要求6-9任一所述双特异性抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
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