CN113939536B - Tigit和pd-1/tigit-结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合人TIGIT的多肽分子、和结合人PD‑1和人TIGIT的多肽分子，且所述多肽分子可单独和与化学疗法和/或电离辐射组合用于治疗实体肿瘤。

Description

TIGIT和PD-1/TIGIT-结合分子
本发明处于医药领域中。具体地，本发明涉及拮抗人TIGIT或拮抗人TIGIT和人PD-1两者的新型多肽分子、包含此类多肽分子的组合物、和单独或与化学疗法和其他癌症治疗剂组合使用此类多肽分子治疗实体肿瘤的方法。
免疫检查点是在免疫细胞(例如，T细胞&树突细胞)上表达的一组膜蛋白，包括多个共抑制和共刺激受体，其在调节适应性免疫应答中发挥重要作用。检查点包括人程序性细胞死亡配体(PD-1) (NCBI NP_005009.2)和具有Ig和ITIM结构域的人T细胞免疫受体(TIGIT) (NCBI NP_776160.2)。
PD-1及其配体(程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)和程序性细胞死亡配体2 (PD-L2))之间的相互作用提供了抑制信号，其已被显示在肿瘤免疫逃逸和在肿瘤微环境中发生的免疫抑制中发挥关键作用。尽管抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体对PD-1抑制性信号传导的阻断被临床验证，并且已经导致某些癌症的治疗的重大的临床进展，但有许多患者或者对PD-1或PD-L1抗体治疗不应答、复发、获得对其的抗性，或者以其他方式对治疗不耐受。
像PD-1一样，TIGIT是在活化和耗尽的T细胞上表达的共抑制受体。TIGIT结合肿瘤细胞上的脊髓灰质炎病毒受体(PVR，也称为CD155)，且使得能够反向信号传导至肿瘤细胞，其导致T细胞阻抑性细胞因子的分泌。尽管CD155被认为是TIGIT的主要配体，但TIGIT也可与CD112和CD113相互作用(Blake等人，Clin Cancer Res; 2016; 22(21): 5182-5188)。已研究TIGIT作为抑制性免疫检查点受体的作用。TIGIT是CD226/TIGIT途径的一部分，其中TIGIT不仅与CD226 (一种共刺激免疫受体)竞争结合CD155，而且与细胞膜中的CD226直接相互作用，并阻断CD226同二聚化。(Blake等人, S, Clin Cancer Res; 2016; 22(21):5182-5188；Johnston等人, Cancer Cell 2014; 26: 923–937；Mahnke等人, Journal of Investigative Dermatology 2016; 136: 9-11)。
抗-TIGIT抗体是本领域已知的，包括公开于US 2016/0355589、US 2017/143825、US 2017/088613、US 2016/376365、US 2018/169238、US 2016/176963和US 2019/100591中的那些。然而，尚无抗-人TIGIT抗体获得监管批准以单独或与抗-人PD-L1或抗-人PD-1抗体组合用于在人中的治疗用途。此外，尚无靶向TIGIT和PD-1或TIGIT和PD-L1的双特异性抗体获得监管批准用于在人中的治疗用途。因此，存在对靶向免疫检查点途径的额外治疗的需求。
因此，本发明涉及新型抗-人TIGIT抗体和新型抗-人TIGIT/抗-人PD-1双特异性抗体。此外，与其他抗-人TIGIT抗体不同，本发明的抗体的效应物功能是无效的，即，经工程改造（engineered）以使Fc受体结合最小化。因此，与其他抗-人TIGIT抗体不同，本发明的抗体不含可促进T调控细胞耗竭和免疫应答不良事件的天然人IgG1构架。此外，本发明的抗-人TIGIT/抗-人PD-1双特异性抗体含有不同类型的轻链，其中抗-人TIGIT臂轻链是κ轻链且抗-人PD-1轻链是λ轻链，其通过降低轻链-轻链二聚化的潜能来促进异单抗(heteromab)双特异性抗体形成。
双特异性分子的制备通常已知是不可预测的努力。例如，共表达两条重链和两条轻链以产生IgG双特异性抗体可导致一些错误装配和不想要的副产物、抗体Fab内的异源二聚体相互作用（ameheterodimeric interaction）(Lewis SM等人, Nature Biotechnology 2014; 32: 191-202；Leaver-Fay A, 等人, Structure 2016; 24: 641-651)。因此，本发明提供了抗-人TIGIT/抗-人PD-1双特异性分子，其使Fc受体结合最小化、使氧化最小化、促进异单抗装配且与人TIGIT/PD-1和食蟹猴TIGIT/PD-1交叉反应，并在确立的肿瘤模型中表现出体内效力。
令人惊讶地，当与抗-人PD-1和抗-人TIGIT抗体组合疗法比较时，本发明的抗-人TIGIT/抗-人PD-1双特异性抗体表现出显著的体内抗-肿瘤效力。更令人惊讶地，用本发明的双特异性抗体治疗导致CD226+ CD8 T细胞和CD226+ NK细胞二者的百分比增加，这可有助于观察到的显著体内效力。
本发明还提供了结合人TIGIT (SEQ ID NO:31)或人TIGIT胞外结构域(例如SEQID NO:32)的多肽分子，其包含SEQ ID NO:1-6的重和轻互补决定区(CDR)氨基酸序列(参见表1)。在一个实施方案中，所述多肽进一步包含SEQ ID NO:7-12的CDR氨基酸序列，其中所述多肽分子还结合人PD-1 (SEQ ID NO:29)或PD-1胞外结构域(例如SEQ ID NO:30)。
在一个实施方案中，所述多肽分子是scFv分子。在另一个实施方案中，所述多肽分子是多特异性scFv分子。在另一个实施方案中，所述多特异性scFv分子是双特异性scFv分子。
在一个实施方案中，所述多肽分子是抗体或其人TIGIT-结合片段，包含分别具有SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的三个HCDR和分别具有SEQ ID NO:4-6的氨基酸序列的三个LCDR。在另一个实施方案中，所述多肽分子是抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是单特异性抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是多特异性抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是还结合人PD-1的双特异性抗体。
在另一个实施方案中，所述多肽分子是抗体或其人TIGIT-结合片段，其包含具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个实施方案中，所述多肽分子是包含具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链的抗体。
在另一个实施方案中，所述抗体或其人TIGIT-结合片段还结合人PD-1 (SEQ IDNO:31)或人TIGIT胞外结构域(例如SEQ ID NO:32)和人PD-1 (SEQ ID NO:29)或人PD-1胞外结构域(例如SEQ IDNO: 30)，且进一步包含分别具有SEQ ID NO:7-9的氨基酸序列的三个HCDR和分别具有SEQ ID NO:10-12的氨基酸序列的三个LCDR。
在另一个实施方案中，所述多肽分子是抗体或其人TIGIT和人PD-1结合片段，包含：具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第一重链可变区；具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和具有SEQ IDNO:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
在另一个实施方案中，所述多肽分子是包含以下的抗体：具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一重链；具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一轻链；具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第二重链；和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的第二轻链。
本发明还提供了能够表达本发明的多肽分子的哺乳动物细胞。
本发明还提供了DNA分子，其包含编码SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列中的一种或多种的多核苷酸。本发明还提供了权利要求17的DNA分子，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:28的DNA序列中的一种或多种。
本发明还提供了包含本发明的DNA分子的哺乳动物细胞。本发明还提供了用于产生抗体的方法，包括培养本发明的哺乳动物细胞，和回收多肽分子。本发明还提供了通过所述方法产生的多肽分子。
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的多肽分子和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供了治疗实体肿瘤癌的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本发明的多肽分子。在一个实施方案中，所述实体肿瘤癌是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。在另一个实施方案中，所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。在另一个实施方案中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。在另一个实施方案中，所述多肽分子与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述多肽分子与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
本发明还提供了本发明的多肽分子，用于疗法中。在一个实施方案中，所述用途是治疗实体肿瘤癌的用途。在另一个实施方案中，所述实体肿瘤癌是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。在另一个实施方案中，所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。在另一个实施方案中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。在另一个实施方案中，所述多肽分子与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述多肽分子与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
本发明还提供了本发明的多肽分子在制备用于治疗实体肿瘤癌的药物中的用途。在一个实施方案中，所述用途是治疗实体肿瘤癌的用途。在另一个实施方案中，所述实体肿瘤癌是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。在另一个实施方案中，所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。在另一个实施方案中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。在另一个实施方案中，所述多肽分子与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述多肽分子与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
在一个实施方案中，本发明的抗体是双特异性抗体。本发明的双特异性抗体被设计为有利于两条不同的重链的异源二聚体配对并且不利于同源二聚体的形成。优选地，本文所述的双特异性抗体包含衍生自人IgG1的Fc部分。已知人IgG1结合Fc-γ受体(FcγR)家族的蛋白以及C1q。结合FcγR或C1q的IgG1分别诱导抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，优选地，本文所述的抗体是经工程改造以降低抗体与FcγR以及C1q的结合的人IgG1。优选地，将EU编号中的位置L234A、L235A和P329A的氨基酸取代引入CH2区域，以降低抗体与FcγR以及C1q的结合。任选地，引入EU编号中的位置N297Q的氨基酸取代以进一步降低抗体的ADCC和CDC活性。
使用与North, 等人. J. Mol. Biol. 2011; 406: 228-256的方法一致的注释规则注释本文所述的序列的每一抗体中的构架和CDR序列。
本发明还提供了结合人TIGIT (SEQ ID NO:31)或TIGIT胞外结构域(例如SEQ IDNO:32)的抗体，包含：
a)重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；和
b)轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。
本发明还提供了抗体，其包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区；和
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明还提供了抗体，其包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链；和
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链。
在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
在另一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了DNA分子，其包含编码至少一种具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列和SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一个优选实施方案中，所述DNA分子包括包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26中的至少一个的多核苷酸。
本发明还提供了包含DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含编码至少一种具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列和SEQ ID NO:22的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：
a)重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；和
b)轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区；和
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链；和
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链。
本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体；其中所述抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：
a)重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；和
b)轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区；
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明还提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链；
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链。
本发明还提供了药物组合物，其包含抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述抗体结合人TIGIT (SEQ ID NO:31)或TIGIT胞外结构域(例如SEQ ID NO:32)，所述抗体包含：
a)重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；和
b)轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了药物组合物，其包含抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区；
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明还提供了药物组合物，其包含抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链；
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链。
在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，其中所述抗体结合人TIGIT (SEQ ID NO:31)或TIGIT胞外结构域(例如SEQ ID NO:32)，所述抗体包含：
a)重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；和
b)轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区；和
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链；
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链。
在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了治疗方法和使用方法。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述癌症是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述癌症是三阴性乳腺癌。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与电离辐射组合施用。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与一种或多种化学治疗剂组合施用。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂组合施用。
在一个实施方案中，本发明还提供了治疗癌症的方法，包括与一种或多种抗-肿瘤剂同时、分开或依次组合施用有效量的本文公开的双特异性抗体。抗-肿瘤剂的非限制性实例包括雷莫芦单抗(ramucirumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奥拉妥单抗(olaratumab)、吉西他滨(gemcitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、galunisertib、阿贝西利(abemaciclib)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、达卡巴嗪(dacarbazine)、脂质体多柔比星(liposomal doxorubicin)、多西他赛(docetaxel)、环磷酰胺(cyclophosphamide)和多柔比星(doxorubicin)、诺维本(navelbine)、艾瑞布林(eribulin)、紫杉醇(paclitaxel)、用于可注射混悬液的紫杉醇蛋白-结合的颗粒、伊沙匹隆(ixabepilone)、卡培他滨(capecitabine)、FOLFOX (甲酰四氢叶酸(leucovorin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)和奥沙利铂(oxaliplatin))、FOLFIRI (甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康(irinotecan))、西妥昔单抗(cetuximab)、EGFR抑制剂、Raf抑制剂、B-Raf抑制剂、CDK4/6抑制剂、CDK7抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂、TGFβ抑制剂、TGFβ受体抑制剂、IL-10和聚乙二醇化IL-10 (例如pegilodecakin)。
本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，其中所述抗体结合人TIGIT (SEQ ID NO:31)或TIGIT胞外结构域(例如SEQ ID NO:32)，所述抗体包含：
a)重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；和
b)轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区；和
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链；和
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链。
在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。本发明进一步提供了用于治疗肺癌的抗体，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明还提供了用于治疗乳腺癌的抗体，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
在一个实施方案中，所述抗体与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗癌症的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述抗体结合人TIGIT (SEQ ID NO:31)或TIGIT胞外结构域(例如SEQ IDNO:32)，所述抗体包含：
a)重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；和
b)轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗癌症的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区；和
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗癌症的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链；和
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链。
在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了包含用于治疗癌症的抗体的药物组合物，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。本发明进一步提供了包含用于治疗肺癌的抗体的药物组合物，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明进一步提供了包含用于治疗乳腺癌的抗体的药物组合物，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
在一个实施方案中，所述组合物与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述药物组合物与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述药物组合物与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体结合人TIGIT (SEQ ID NO:31)或TIGIT胞外结构域(例如SEQ ID NO:32)，所述抗体包含：
a)重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；和
b)轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的重链与所述抗体的轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的两条重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区；和
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链；和
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链。
在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。本发明进一步提供了本发明的抗体在制备用于治疗肺癌的药物中的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明进一步提供了本发明的抗体在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
在一个实施方案中，所述抗体与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
在是指如本文所述的治疗方法的实施方案中，此类实施方案也是用于该治疗中或可替代地用于制备用于该治疗中的药物的进一步实施方案。
有用的化学治疗剂的非限制性实例包括5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、培美曲塞、甲氨蝶呤、多柔比星、依托泊苷、卡铂、顺铂、环磷酰胺、美法仑、达卡巴嗪、紫杉醇(taxol)、喜树碱、FOLFIRI、FOLFOX、多西他赛、道诺霉素、紫杉醇(paclitaxel)、奥沙利铂及其组合。
本发明的抗体或包含其的药物组合物可通过肠胃外途径施用，其非限制性实例是静脉内施用。可以单独地将本发明的抗体与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以单一或多个剂量施用于人患者。本发明的药物组合物可以通过本领域已知的方法制备(例如,Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版 (2012), A. Loyd等人,Pharmaceutical Press)。
在一个实施方案中，本发明的多肽分子是无菌的。在另一个实施方案中，本发明的多肽分子是实质上纯的。在另一个实施方案中，本发明的多肽分子是实质上纯的且无菌的。
本发明的双特异性抗体是异二聚体，其中部分由于两条不同重链和两条不同轻链，抗体的每一臂表现出与其同源抗原的选择性单价结合。在本发明中，所述双特异性抗体的一个臂结合人PD-1 (SEQ ID NO:29)或人PD-1胞外结构域(ECD) (例如，ECD-His表达产物(SEQ ID NO:30))，而另一臂结合人TIGIT (SEQ ID NO:31)或TIGIT ECD (例如，ECD-His表达产物(SEQ ID NO:32))。在一个优选实施方案中，所述抗体的一个臂拮抗人PD-1 (SEQID NO:29)，且另一臂拮抗人TIGIT (SEQ ID NO:31)。
本发明还提供了抗体，其结合人PD-1 (SEQ ID NO:29)或PD-1胞外结构域(例如SEQ ID NO:30)，且结合人TIGIT (SEQ ID NO:31)或TIGIT胞外结构域(例如SEQ ID NO:32)，所述抗体包含：
a)第一重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；
b)第一轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；
c)第二重链，其包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR3；和
d)第二轻链，其包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LCDR3。
本发明还提供了抗体，其包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第一重链可变区；
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；
c)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和
d)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
本发明还提供了抗体，其包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一重链；
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一轻链；
c)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第二重链；和
d)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的第二轻链。
本发明还提供了抗体(本文中称为抗体A)，其具有：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一重链；
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一轻链；
c)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第二重链；和
d)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的第二轻链。
在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
在另一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了DNA分子，其包含编码至少一种具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列、SEQ ID NO:22的氨基酸序列、SEQ ID NO:23的氨基酸序列和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在一个优选实施方案中，所述DNA分子包含多核苷酸，其包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中的至少一种。
本发明还提供了包含DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含编码至少一种具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列、SEQ ID NO:22的氨基酸序列、SEQ ID NO:23的氨基酸序列和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：
a)第一重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；
b)第一轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；
c)第二重链，其包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR3；和
d)第二轻链，其包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第一重链可变区；
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；
c)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和
d)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一重链；
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一轻链；
c)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第二重链；和
d)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的第二轻链。
本发明还提供了用于产生抗体的方法，其包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体；其中所述抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：
a)第一重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；
b)第一轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；
c)第二重链，其包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR3；和
d)第二轻链，其包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第一重链可变区；
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；
c)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和
d)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
本发明还提供了通过如下方法产生的抗体，所述方法包括培养能够表达所述抗体的哺乳动物细胞和回收所述抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一重链；
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一轻链；
c)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第二重链；和
d)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的第二轻链。
本发明还提供了药物组合物，其包含抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述抗体结合人PD-1 (SEQ ID NO:29)或人PD-1胞外结构域(例如SEQ ID NO:30)，且结合人TIGIT (SEQ ID NO:31)或人TIGIT胞外结构域(例如SEQ ID NO:32)，所述抗体包含：
a)第一重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；
b)第一轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；
c)第二重链，其包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR3；和
d)第二轻链，其包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了药物组合物，其包含抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第一重链可变区；
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；
c)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和
d)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
本发明还提供了药物组合物，其包含抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一重链；
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一轻链；
c)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第二重链；和
d)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的第二轻链。
在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，其中所述抗体结合人PD-1 (SEQ ID NO:29)或人PD-1胞外结构域(例如SEQ ID NO:30)，且结合人TIGIT (SEQ ID NO:31)或人TIGIT胞外结构域(例如SEQ ID NO:32)，所述抗体包含：
a)第一重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；
b)第一轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；
c)第二重链，其包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR3；和
d)第二轻链，其包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第一重链可变区；
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；
c)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和
d)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一重链；
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一轻链；
c)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第二重链；和
d)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的第二轻链。
本发明还提供了治疗方法和使用方法。
在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述癌症是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明进一步提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述癌症是三阴性乳腺癌。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与电离辐射组合施用。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与一种或多种化学治疗剂组合施用。
本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的人患者施用有效量的本文所述的抗体，其中所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂组合施用。
在一个实施方案中，本发明还提供了治疗癌症的方法，包括与一种或多种抗-肿瘤剂同时、分开或依次组合施用有效量的本文公开的双特异性抗体。抗-肿瘤剂的非限制性实例包括雷莫芦单抗(ramucirumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奥拉妥单抗(olaratumab)、吉西他滨(gemcitabine)、培美曲塞(pemetrexed)、galunisertib、阿贝西利(abemaciclib)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、达卡巴嗪(dacarbazine)、脂质体多柔比星(liposomal doxorubicin)、多西他赛(docetaxel)、环磷酰胺(cyclophosphamide)和多柔比星(doxorubicin)、诺维本(navelbine)、艾瑞布林(eribulin)、紫杉醇(paclitaxel)、用于可注射混悬液的紫杉醇蛋白结合的颗粒、伊沙匹隆(ixabepilone)、卡培他滨(capecitabine)、FOLFOX (甲酰四氢叶酸(leucovorin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)和奥沙利铂(oxaliplatin))、FOLFIRI (甲酰四氢叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康(irinotecan))、西妥昔单抗(cetuximab)、EGFR抑制剂、Raf抑制剂、B-Raf抑制剂、CDK4/6抑制剂、CDK7抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶抑制剂、TGFβ抑制剂、TGFβ受体抑制剂、IL-10和聚乙二醇化IL-10 (例如pegilodecakin)。
本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，其中所述抗体结合人PD-1 (SEQ ID NO:29)或人PD-1胞外结构域(例如SEQ ID NO:30)，且结合人TIGIT (SEQ ID NO:31)或人TIGIT胞外结构域(例如SEQ ID NO:32)，所述抗体包含：
a)第一重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；
b)第一轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；
c)第二重链，其包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR3；和
d)第二轻链，其包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第一重链可变区；
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；
c)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和
d)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一重链；
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一轻链；
c)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第二重链；和
d)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的第二轻链。
在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了用于治疗癌症的抗体，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。本发明进一步提供了用于治疗肺癌的抗体，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明还提供了用于治疗乳腺癌的抗体，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
在一个实施方案中，所述抗体与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗癌症的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述抗体结合人PD-1 (SEQ ID NO:29)或人PD-1胞外结构域(例如SEQ IDNO:30)，且结合人TIGIT (SEQ ID NO:31)或人TIGIT胞外结构域(例如SEQ ID NO:32)，所述抗体包含：
a)第一重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；
b)第一轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；
c)第二重链，其包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR3；和
d)第二轻链，其包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗癌症的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第一重链可变区；
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；
c)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和
d)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
本发明还提供了药物组合物，其包含用于治疗癌症的抗体和可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一重链；
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一轻链；
c)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第二重链；和
d)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的第二轻链。
在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了包含用于治疗癌症的抗体的药物组合物，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。本发明进一步提供了包含用于治疗肺癌的抗体的药物组合物，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明进一步提供了包含用于治疗乳腺癌的抗体的药物组合物，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
在一个实施方案中，所述组合物与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述药物组合物与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述药物组合物与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述抗体结合人PD-1 (SEQ ID NO:29)或人PD-1胞外结构域(例如SEQ ID NO:30)，且结合人TIGIT(SEQ ID NO:31)或人TIGIT胞外结构域(例如SEQ ID NO:32)，所述抗体包含：
a)第一重链，其包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HCDR3；
b)第一轻链，其包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的LCDR3；
c)第二重链，其包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR2和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR3；和
d)第二轻链，其包含具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的LCDR2和具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的LCDR3。
在一个实施方案中，所述抗体的第一重链与所述抗体的第一轻链形成至少一个二硫键，所述抗体的第二重链与所述抗体的第二轻链形成至少一个二硫键，且所述抗体的第一重链与所述抗体的第二重链形成至少一个二硫键。
本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的第一重链可变区；
b)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第一轻链可变区；
c)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二重链可变区；和
d)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第二轻链可变区。
本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一重链；
b)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一轻链；
c)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第二重链；和
d)具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的第二轻链。
在一个实施方案中，抗体是经工程改造以减少所述抗体与Fcγ受体的结合的人IgG1。
本发明还提供了本发明的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌或肝细胞癌。本发明进一步提供了本发明的抗体在制备用于治疗肺癌的药物中的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌或小细胞肺癌。本发明进一步提供了本发明的抗体在制备用于治疗乳腺癌的药物中的用途，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
在一个实施方案中，所述抗体与电离辐射同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。在另一个实施方案中，所述抗体与电离辐射和一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
在是指如本文所述的治疗方法的实施方案中，此类实施方案也是用于该治疗中或可替代地用于制备用于该治疗中的药物的进一步实施方案。
有用的化学治疗剂的非限制性实例包括5-氟尿嘧啶、羟基脲、吉西他滨、培美曲塞、甲氨蝶呤、多柔比星、依托泊苷、卡铂、顺铂、环磷酰胺、美法仑、达卡巴嗪、紫杉醇（taxol）、喜树碱、FOLFIRI、FOLFOX、多西他赛、道诺霉素、紫杉醇（paclitaxel）、奥沙利铂及其组合。
本发明的抗体或包含其的药物组合物可通过肠胃外途径施用，其非限制性实例是静脉内施用。可以单独地将本发明的抗体与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂以单一或多个剂量施用于人患者。本发明的药物组合物可以通过本领域已知的方法制备(例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版 (2012), A. Loyd等人,Pharmaceutical Press)。
在一个实施方案中，本发明的多肽分子是无菌的。在另一个实施方案中，本发明的多肽分子是实质上纯的。在另一个实施方案中，本发明的多肽分子是实质上纯的且无菌的。
可调整施用本发明的多肽分子的剂量方案以提供最佳期望应答(例如治疗作用)。
在一个实施方案中，当本发明的多肽分子结合人TIGIT时，其拮抗人TIGIT。在另一个实施方案中，当本发明的多肽分子结合人PD-1时，其拮抗人PD-1。如本文所用，术语“拮抗”是指阻断、中断、阻抑、抑制或降低目标生物活性的行为。在这方面，本发明的多肽分子(例如抗体)通过结合人PD-1并阻断人PD-L1与人PD-1的结合而拮抗人PD-1，且通过结合人TIGIT并阻断人TIGIT与CD155和或与CD112的结合而拮抗人TIGIT。
如本文所用的术语“抗体”是指具有识别并结合靶标(如蛋白、肽或多肽)的重链和轻链的单体或二聚体免疫球蛋白分子。在一个实施方案中，抗体特异性结合靶标。每条重链由N-末端HCVR (重链可变区)和HCCR (重链恒定区)构成。每条轻链由N-末端LCVR (轻链可变区)和LCCR (轻链恒定区)构成。重链的恒定区含有CH1、CH2和CH3结构域。
术语“抗体片段”是保留结合完整抗体所结合的靶标的能力的抗体片段。在一个实施方案中，抗体片段特异性结合靶标。在另一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的HCDR1-3和LCDR 1-3。在另一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的HCVR和LCVR。
除非本文另有指示，否则“TIGIT”是指人TIGIT，且“PD-1”是指人PD-1。
如本文所用的术语“结合”是指两个分子(例如本发明的多肽分子与TIGIT、PD-1或TIGIT和PD-1)之间的分子相互作用。术语“单特异性结合”是指结合一个靶标(例如人TIGIT或人PD-1)。术语“双特异性结合”是指结合人TIGIT和人PD-1。术语“多特异性结合”是指结合人TIGIT、人PD-1和一个或两个其他靶标。
术语“选择性结合(selectively binds)”或“特异性结合(specifically binds)”意指本发明的多肽分子比其他物质更频繁地、更快速地、以更长的持续时间、以更大的亲和力、或以上述的一些组合与人TIGIT或与PD-1或与人TIGIT和人PD-1相互作用。在一个实施方案中，“特异性结合”意指本发明的多肽分子以约0.1 mM或更小的KD结合人TIGIT、或人PD-1、或人TIGIT和人PD-1。在另一个实施方案中，“特异性结合”意指本发明的多肽分子以约0.01 mM或更小的KD结合人TIGIT、或人PD-1、或人TIGIT和人PD-1。在另一个实施方案中，“特异性结合”意指本发明的多肽分子以约0.001 mM或更小的KD结合人TIGIT、或人PD-1、或人TIGIT和人PD-1。在另一个实施方案中，“特异性结合”意指本发明的多肽分子以约0.0001mM或更小的KD结合人TIGIT、或人PD-1、或人TIGIT和人PD-1。在另一个实施方案中，本发明的多肽分子以不同于该多肽分子结合人PD-1的KD的KD结合人TIGIT。在另一个实施方案中，多肽分子结合人TIGIT的紧密程度是其结合人PD-1的紧密程度的约10倍。
在一个实施方案中，如本文所用的术语“多肽分子”是指包含氨基酸残基的聚合物的分子。在另一个实施方案中，多肽分子由氨基酸残基的聚合物组成。
在一个实施方案中，多肽分子是结合人TIGIT、或人PD-1、或人TIGIT和人PD-1的scFv分子。在另一个实施方案中，所述scFv分子特异性结合人TIGIT、或人PD-1、或人TIGIT和人PD-1。所述scFv分子可以是单特异性的(结合人TIGIT或人PD-1)、双特异性的(结合人TIGIT和人PD-1)或多特异性的(结合人PD-1、人TIGIT和/或另外的靶标)。
在一个实施方案中，多肽分子是结合人TIGIT、或人PD-1、或人TIGIT和人PD-1的抗体。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合人TIGIT、或人PD-1、或人TIGIT和人PD-1。所述抗体可以是单特异性的(结合人TIGIT或人PD-1)、双特异性的(结合人TIGIT和人PD-1)或多特异性的(结合人PD-1、人TIGIT和一个或两个其他靶标)。
在一个实施方案中，多肽分子是结合人TIGIT、或人PD-1、或人TIGIT和人PD-1的抗体片段。在另一个实施方案中，所述抗体片段特异性结合人TIGIT、或人PD-1、或人TIGIT和人PD-1。所述抗体片段可以是单特异性的(结合人TIGIT或人PD-1)、双特异性的(结合人TIGIT和人PD-1)或多特异性的(结合人PD-1、人TIGIT和一个或两个其他靶标)。
如本文所用的术语“实质上纯的”是指至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%不含污染物的材料，例如本发明的多肽分子。
“TIGIT”的同义词是WUCAM、Vstm3和VSIG9。
“CD155”的同义词是脊髓灰质炎病毒受体、PVR、Necl-5、NECL5、Tage4、HVED和PVS。
“CD112”的同义词是粘连蛋白细胞粘着分子2、粘连蛋白-2、NECTIN2、PRR-2、PVRL2、PVRR2和HVEB。
“CD226”的同义词是DNAX辅助分子-1、DNAM-1、DNAM1、PTA1和TLiSA1。
术语“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment))”是指减缓、中断、阻止、缓解、停止、减轻或逆转现有症状、病症、病况或疾病的进展或严重程度。
术语“有效量”意指本发明的多肽分子或包含本发明的抗体的药物组合物引起研究者、医师或其他临床医师寻求的对组织、系统、动物、哺乳动物或人的生物或医学应答或期望的治疗作用的量。多肽分子的有效量可根据因素而变化，所述因素如个体的疾病状态、年龄、性别和重量以及多肽分子在个体中引起期望应答的能力。有效量也是治疗上有益的作用胜过抗体的任何毒性或有害作用的量。
可以通过将编码HCVR的DNA可操作连接至编码重链恒定区的另一DNA分子来将编码HCVR区的分离DNA分子转化成全长重链基因。人以及其他哺乳动物重链恒定区基因的序列是本领域已知的。可以例如通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区的DNA片段。
可以通过将编码LCVR的DNA可操作连接至编码轻链恒定区的另一DNA分子来将编码LCVR区的分离DNA分子转化成全长轻链基因。人以及其他哺乳动物轻链恒定区基因的序列是本领域已知的。可以通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区的DNA片段。
如本文所用，术语“CDR”是指抗体互补决定区，术语“HCDR”是指抗体重链CDR，且术语“LCDR”是指抗体轻链CDR。出于本发明的目的，使用North CDR定义。North CDR定义(North等人, “A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations”, Journal ofMolecular Biology, 406, 228-256 (2011))基于用大量晶体结构的亲和力传播聚类。
如本文所用的术语“修饰的人IgG1”意指经工程改造以降低人IgG1与至少一种人Fcγ受体的结合的人IgG1。通常，这通过使残基突变、导致抗体与Fcγ受体的结合减少来进行，例如P329A、L234A和L235A突变。
术语“实体肿瘤”是指不是血液、淋巴或骨髓的组织中的肿瘤。
用于体外测定TIGIT活性的方法是本领域普通技术人员已知的，例如在以下中：He等人, Cancer Res 2017; 77: 6375-6388；Yu等人, Nature Immunology 2009; 10(1):48-57； Johnston等人, Cancer Cell 2014; 26: 923–937；Stanietskya,等人, PNAS 2009; 106(42): 17858–17863；Lozano等人, J Immunol. 2012; 188(8): 3869–3875。
用于体外测定PD-1活性的方法是本领域普通技术人员已知的，例如在以下中：Carpenito等人, J Immunother Cancer 2018; 6(1):31；Ghosh等人, Mol Cancer Ther. 2019;18(3):632-641；Stewart等人, Cancer Immunol Res. 2015; 3(9):1052-62；Maute等人, PNAS 2015; 112(47): E6506-14。
实体肿瘤的体内鼠模型是本领域普通技术人员已知的，如本文所示，且如以下中所公开：例如Sanmamed MF,等人, Ann. Oncol. 2016; 27: 1190-1198；Manning HC,等人,J. Nucl. Med 2016; 57(Suppl. 1): 60S-68S; Teich BA. Cancer Ther. 2006; 5:2435；Rongvaux A,等人, Ann. Rev. Immunol. 2013; 31: 635-74；Stylli SS,等人, J. Clin. Neurosci 2015; 619-26；Oh T,等人, J. Transl. Med. 2014; 12: 107-117；Newcomb, EW,等人, Radiation Res. 2010; 173: 426-432；Song Y,等人, Proc Natl. Acad. Sci. USA 2013; 110: 17933-8；和Rutter EM,等人, Scientific Reports 2017;7: DOI:10.1038/s41598-017-02462-0。
本发明的DNA分子是包含非天然存在的多核苷酸序列的DNA分子，所述非天然存在的多核苷酸序列编码具有本发明的抗体中的至少一种多肽的氨基酸序列的多肽。
在将序列可操作连接至表达控制序列之后，可以在宿主细胞中表达本发明的多核苷酸。表达载体通常可在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标记(例如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶)以允许检测用期望DNA序列转化的那些细胞。
可以通过已知方法将含有目标多核苷酸序列的表达载体(例如，编码多肽分子的多肽的多核苷酸和表达控制序列)转移至宿主细胞中，所述方法根据宿主细胞的类型而变化。
本发明的多肽分子可以容易地在哺乳动物宿主细胞中产生，所述哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括CHO、NS0、HEK293或COS细胞。可以使用本领域已知的技术培养宿主细胞。
可以采用各种蛋白纯化方法来纯化本发明的抗体，且此类方法是本领域已知的，且描述于，例如，Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)和Scopes,Protein Purification: Principles and Practice, 第3版, Springer, NY (1994)中。
本文提及的序列根据表1中列出的序列标识符编号来编号。
HCCR：重链恒定区；LCCR：轻链恒定区；
HCVR：重链可变区；LCVR：轻链可变区；
ECD：胞外结构域。
实施例
抗体A表达和纯化
可以基本上如下所述表达和纯化本发明的抗体。可以用使用最佳预定重链：轻链载体比率的用于分泌抗体的表达系统、或编码重链和轻链两者的单一载体系统瞬时或稳定转染适当的宿主细胞(如HEK 293或CHO)。可以用使用一种或多种DNA分子的用于分泌抗体的表达系统瞬时或稳定转染本发明的抗体A，所述DNA分子编码具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一轻链、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第二重链和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的第二轻链。
所述抗体可以使用许多常用技术之一纯化。例如，可以将培养基便利地施加至已用相容缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4))平衡的MabSelect柱(GE Healthcare)或KappaSelect柱(GE Healthcare)。可以洗涤该柱以除去非特异性结合组分。可以例如通过pH梯度(如20mM Tris缓冲液pH 7.0至10mM柠檬酸钠缓冲液pH 3.0，或磷酸盐缓冲盐水pH7.4至100mM甘氨酸缓冲液pH 3.0)洗脱结合抗体。可以诸如通过UV吸光度或SDS-PAGE检测抗体级分，且然后可合并。根据预期用途，进一步纯化是任选的。可以使用常用技术浓缩和/或无菌过滤纯化的抗体。可通过常用技术(包括尺寸排阻、疏水性相互作用、离子交换、多模态或羟基磷灰石色谱)有效地除去可溶性聚集物和多聚体。纯化的抗体可以立即在-70℃冷冻或可以冻干。
抗体A结合人PD-1和人TIGIT
使用Biacore® T200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ)在37℃通过表面等离子共振测量抗体A与可溶性人PD-1-胞外结构域(ECD) (Sino Biologicals, Cat＃10377-H08H)和人TIGIT-ECD的结合动力学和亲和力。将样品稀释于HBS-EP+ (10 mM HEPES, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.6)运行缓冲液(Teknova Cat＃H8022)中。蛋白A CM5 S系列传感器芯片(GE HealthcareCat＃29127555)购自GE Healthcare。
通过抗体捕获方法，使用多循环动力学评估结合。每个循环都在37℃以10 μL/min的流速进行，用于将抗体捕获至蛋白A芯片，并以100μL/min的流速进行，用于分析物缔合和解离。每个循环由以下步骤组成：注入HBS-EP+中的2 μg/mL的抗体A，目标为流动室上50 RU的Rmax值，注入180或200秒的HBS-EP+中的分析物(对于PD-1-ECD-His (人PD1-ECD-his(Sino Biologicals, Cat:10377-H08H)和人TIGIT-ECD-His (SEQ ID NO:32)，浓度范围分别为1000 nM至1.95 nM (通过两倍连续稀释))，随后为600秒解离阶段，并使用5 μL的10mM甘氨酸盐酸盐pH 1.5经30秒接触时间，利用10 μL/min的流速进行再生。利用单体分子量(MW)值测定所有分析物浓度。人PD-1-ECD的缔合速率(kon)和解离速率(koff)使用双重参考(通过减去流动室1参考以及减去0nM空白)进行评估，并拟合至BIAevaluation软件版本4.1中的“1:1 (Langmuir)结合”模型。根据关系KD = Koff/Kon从结合动力学计算解离常数(KD)。化学计量 = [RUmax / RU捕获的] / [MW分析物/ MW抗体]，其中MW抗体A是150 kDa。值报告为平均值±标准偏差。
在基本上如上文所述进行的实验中，表2中的结果表明抗体A结合人PD-1-ECD、人TIGIT-ECD、食蟹猴PD-1和食蟹猴TIGIT。
表2
。
在基于细胞的测定中抗体A拮抗人PD-1/PD-L1活性
使用NFAT-Luc报告子测定，测试抗体A拮抗由人PD-1与人PD-L1结合介导的活性的能力。简而言之，将表达人PD-L1和人工细胞表面T细胞受体(TCR)激活蛋白的CHO-K1细胞(Promega CS187108，PD1/PD-L1 Blockade Assay System的一部分，Propagation ModelCS187109)用作抗原呈递细胞。通过逆转录病毒转移将人TIGIT引入表达人PD-1和NFAT-Luc2报告子的Jurkat细胞(GloResponse NFAT-luc2/PD-1 Jurkat, Promega CS187102,PD-1/PD-L1 Blockade Assay System的一部分, Propagation Model CS187109)。CHO-K1+PD-L1+PVR+TCR激活蛋白细胞(在第7-9代)用胰蛋白酶分离，并以40,000个细胞/孔接种在白色不透明96-孔组织培养板(Costar 35-3296)中的100 ul生长培养基中。CHO-K1+PD-L1+TCR激活蛋白生长培养基由具有10%限定的FBS (HyClone SH30070.03)、200 µg/ml潮霉素B(Thermo Fisher 10687-010)和250 µg/ml G418 (遗传霉素，Corning 30-234-CI)的Ham'sF-12培养基(Corning Cellgro 10-080-CV)组成。使细胞在37℃、5% CO2和95% RH生长过夜。第二天，在具有2 mM L-谷氨酰胺和10 mM HEPES (Gibco 22400)与2%限定的FBS(HyClone SH30070.03)的RPMI 1640中以2X工作浓度制备如表3中所示的抗体。
将表达人PD-1、人TIGIT和NFAT-Luc2报告子的Jurkat细胞在具有2 mM L-谷氨酰胺和10 mM HEPES (Gibco)、10%限定的FBS (HyClone)、100 μg/ml潮霉素B (ThermoFisher)、500 µg/ml G418 (遗传霉素，Corning)和1 µg/mL嘌呤霉素(Calbiochem 540411，在无菌水中)的RPMI 1640中繁殖。将第5代至第7代间的Jurkat细胞离心，并以1.25 x 106个细胞/mL的浓度重悬浮于RPMI/2%限定的FBS中。从96-孔板中的CHO+PD-L1+PVR+TCR激活蛋白细胞的单层小心移除95 µl培养基。对于每次处理，一式三份地添加40 μl如上制备的2X浓度的抗体(包括单独培养基对照)，如表3中所示。然后，每孔添加40 µl重悬浮的Jurkat+PD-1+TIGIT+NFAT-Luc2细胞(50,000个细胞/孔)。将测定板在37℃、5% CO2、95% RH孵育6小时。在孵育结束时，将板在室温(RT)平衡5至10分钟。添加80 µl/孔的重构的Bio-Glo™荧光素酶底物(Promega G7940)，并将板在室温进一步孵育5-10分钟。在具有EnVisionManager软件v.1.13.3009.1409、超灵敏模式和0.2秒积分时间的Perkin Elmer EnvisionMultimode Reader上读取板。在每个板内，将发光值(相对光单位(RLU))针对从用单独培养基处理的细胞获得的值归一化(诱导倍数(fold induction)= RLU处理/RLU单独培养基对照)。使用GraphPad Prism 7软件计算EC50值。
在基本上如上所述进行的实验中，表3中的结果表明，抗体A和抗-人PD-1-IgG4-PAA的EC50值分别为1.838 nM和1.226 nM，并且在基于细胞的测定中，抗体A结合并拮抗-人PD-1/人PD-L1结合。
表3
。
在基于细胞的测定中抗体A拮抗人TIGIT
人PD-1和TIGIT两者在活化的肿瘤浸润淋巴细胞中表达或共表达。在JurkatNFAT-Luc报告子测定(其经工程改造以共表达人PD-1 (9,000个PD-1受体/细胞)和人TIGIT(5,500个TIGIT受体/细胞))中测试抗体A拮抗人TIGIT-介导的活性的能力。简而言之，将如表4中所示的抗体与Jurkat+人TIGIT+人PD-1+NFAT-Luc细胞孵育6小时。添加Bio-Glo荧光素酶底物，并在孵育结束时读取发光。在表4中，数据(诱导倍数= RLU处理/RLU单独培养基对照)表示为每种处理一式三份孔的平均值。
在基本上如上所述进行的实验中，表4中的结果表明在基于细胞的测定中，抗体A结合并拮抗人TIGIT。
表4
。
在基于细胞的测定中抗体A同时结合PD-1和TIGIT
PD-1和TIGIT受体分别用Prolink和酶激活蛋白标记，并在293细胞中共表达。在抗体A与人PD-1和人TIGIT受体结合后，使受体紧密接近，使得能够重构活性β-半乳糖苷酶，其水解底物以产生化学发光信号。
在基本上如上所述进行的实验中，表5中的结果表明，抗体A同时与人PD-1和人TIGIT受体物理接合。用对照IgG1或抗-人TIGIT和抗-人PD-1抗体或用抗-人TIGIT与抗-人PD1抗体的组合未看到作用。
表5
。
在混合白细胞反应(MLR反应)中抗体A诱导T细胞活化
在人同种异体(allo) MLR测定中检查抗体A的人PD-1阻断功能。人PBMC由冷冻获得(AllCells)或从进行血浆去除术的新鲜全血(Indiana Blood Center)获得，并以Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare)密度梯度分离。用人单核细胞分离试剂盒II或CD14Microbeads (Miltenyi Biotec)和AutoMACS Pro分离器(Miltenyi Biotec)分离CD14+单核细胞。未成熟的树突细胞(DC)通过如下生成：将单核细胞在含有10% FBS的完全RPMI-1640培养基中在1,000 IU/mL hGM-CSF (R&D; 215-GM-050，或Sanofi; Leukine, 沙格司亭; NDC 0024-5843-01)和500 IU/mL hIL-4 (R&D; 204-IL-050或另外的来源)存在的情况下培养2天(表6)。使用人CD4+ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从不同健康供体的新鲜人PBMC (AllCells或Indiana Blood Center)纯化CD4+ T细胞。然后将来自不同供体的两种类型的细胞在96-孔V型底板中的完全AIM-V培养基(Thermo Fisher Scientific)中混合，每孔含有5x104至1x105个CD4+ T细胞和5x103个未成熟DC。将表6中所示的抗体连续稀释，且以100 uL/孔一式三份添加至板。将板在37℃在5% CO2中孵育4天。收获上清液，并根据制造商的说明进行人IFN-γ ELISA (R&D Systems; SIF50, 或DY285)。在九个不同的供体对中测试抗体。用GraphPad Prism软件(GraphPad Software)，使用来自三个T:DC供体对的数据计算EC50值。
在基本如上所述进行的实验中，表6中的结果令人惊讶地表明，当与单独的抗PD-1抗体或与抗-人PD-1+抗-人TIGIT组合相比时，抗体A表现出增强的人PD-1阻断活性，如通过相对于IgG1对照的IFNγ水平的最大倍数增加所测量的。
表6
。
在破伤风回忆测定（tetanus recall assay）中抗体A诱导T细胞活化
用温热的完全AIM-V培养基解冻来自破伤风类毒素应答者的冷冻PBMC，并静置24小时。静置后，使细胞通过30微米过滤器以除去大碎片和聚集体。计数细胞并在完全AIM-V培养基中重悬浮至2.5 x106个细胞/mL，并以200 uL以5x105个细胞/孔接种于U形底96孔板中。以20ug/ml添加如表7中所示的抗体，并以1:3连续稀释。用4 ng/mL破伤风类毒素刺激细胞，并在37℃孵育48小时。然后用MSD试剂盒(Mesoscale Discovery)定量上清液中的IFNγ水平。
在基本上如上所述进行的实验中，表7和表8中的结果表明，添加抗体A (表7)或抗-人PD-1+抗-人TIGIT组合(表8)以剂量依赖性方式增强T细胞活化，如通过IFNγ释放所测量的。
在用人T细胞移植的HCC827 NSG肿瘤异种移植模型中抗体A表现出抗肿瘤效力。
在第0天，将10x106个HCC827细胞重悬浮于0.2 mL基质胶溶液中，并皮下植入用人T细胞移植的雌性NOD/SCIDγ (NSG)小鼠(Jackson Laboratories)的右胁腹中。在第40天，以n =8随机化小鼠，且每个治疗组以10 mg/kg每周一次腹膜内(ip)给药，持续4周。治疗组包括对照IgG、抗体A、抗-人PD-1-hIgG4-PAA、抗-人TIGIT-hIgG1-EN和抗-人PD-1-hIgG4-PAA +抗-人TIGIT-hIgG1-EN抗体。抗体A也以1 mg/kg和3 mg/kg每周给药，持续4周。每周两次测量体重和肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)计算为π/6 * 长度 * 宽度2且% T/C计算为100 ×ΔT /ΔC，如果几何平均值的ΔT ＞ 0。使用SAS软件中的程序进行统计学分析。
在基本上如上所述进行的实验中，表9中的结果表明，相对于对照IgG治疗组，以1mg/kg、3 mg/kg或10 mg/kg给药的抗体A显著抑制人T细胞移植的小鼠中的肿瘤生长(分别地p ＜ .001)。令人惊讶地，当与抗-人PD-1 + 抗-人TIGIT组合治疗组相比时，所有3个剂量的抗体A也表现出统计学上显著的效力，其中分别地p ＜ .001和p ＜ .334。
在HCC827 NSCLC CD34 NSG肿瘤异种移植模型中抗体A表现出抗肿瘤效力和增加 的CD226+ CD8 T细胞和CD226+ NK细胞。
在第0天，将10x106个HCC827皮下植入用CD34+ 造血干细胞移植的雌性NOD/SCIDγ (NSG)小鼠(Jackson Laboratories)的右胁腹中。在第21天，以n =8/组随机化小鼠，且每个治疗组以10 mg/kg每周一次腹膜内(ip)给药，持续4周。治疗组包括对照IgG、抗体A、抗-人PD-1-hIgG4-PAA、抗-人TIGIT-hIgG1-EN和抗-人PD-1-hIgG4-PAA +抗-人TIGIT-hIgG1-EN抗体。每周两次测量体重和肿瘤体积。肿瘤体积(mm3)计算为π/6 * 长度 * 宽度2且% T/C计算为100 × ΔT /ΔC，如果几何平均值的ΔT ＞ 0。使用SAS软件中的MIXED程序进行统计学分析。
在基本上如上所述进行的实验中，表10中的结果表明，相对于对照IgG治疗组，以10 mg/kg给药的抗体A显著抑制人CD34+造血干细胞移植的小鼠中的肿瘤生长(p ＜.001)。令人惊讶地，当与抗-人PD-1 + 抗-人TIGIT组合治疗组相比时，抗体A也表现出显著的抗-肿瘤效力，其中分别地p ＜ .001和p ＜ .006。
在研究结束时，收集肿瘤并处理成单细胞悬浮液。用300 ul FACS缓冲液中的抗体对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)进行染色。使用LSRFortessa X20获取流数据，并使用FlowJo 10分析。CD226+ CD8 T细胞在表11中显示为每只小鼠的TIL中总CD8 T细胞(CD8+CD3+CD45+活淋巴细胞)的%。CD226+ NK细胞在表11中显示为每只小鼠的TIL中总NK细胞(CD56+CD3-CD45+活淋巴细胞)的%。
在基本上如上所述进行的实验中，表11和表12中的结果表明，抗体A治疗的小鼠表现出CD226+ CD8T细胞和CD226+ NK细胞的百分比增加，而抗-人PD-1治疗的小鼠仅显示CD226+ NK细胞的增加。由于已显示CD226信号传导对抗-肿瘤活性至关重要，所以抗体A治疗组中CD8和NK细胞群体二者中CD226+细胞的增加可指示增强的细胞毒性的潜能，此可有助于研究中观察到的抗体A的抗-肿瘤活性。
表11 - % CD226阳性CD8 T细胞
。
表12 - % CD226阳性NK细胞
。
最后剂量后6天，经由ELISA分析抗-人PD-1-hIgG4-PAA、抗-人TIGIT-hIgG1-EN和抗体A的血清水平。重组人PD-1-his (R&D Systems，Cat：8986-PD)和重组人TIGIT-his (R&D Systems，Cat：9525-TG)分别用于PD-1和TIGIT捕获ELISA。小鼠抗-人IgG Fc HRP(Southern Biotech/9040-05)用于检测。
在基本上如上所述进行的实验中，表13中的结果表明，如通过人PD-1和人TIGIT抗原捕获ELISA二者测量的抗体A血清水平是相当的，因此表明抗体的体内稳定性。
。
氨基酸和核苷酸序列
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
<110> 伊莱利利公司
<120> TIGIT和PD-1/TIGIT-结合分子
<130> X21329
<150> 62853816
<151> 2019-05-29
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
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Gly
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Gly
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Pro Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Phe Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Glu Val
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Arg Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Pro Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Leu Asp Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Arg Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
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Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Val His Thr Ser
85 90 95
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100 105 110
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Ala Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Gly Asp
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Gln Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Ala Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
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<223> 合成构建体
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Lys
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Arg Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Tyr Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Ile Pro Ser Phe Asp Thr Ala Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Ala Ile Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ala Glu His Ser Ser Thr Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Asp Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn His Leu Pro Phe
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val Ala Thr Gly Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Met Cys Leu Val Tyr Gly Phe Tyr
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
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Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Tyr Ile Ser Asp
20 25 30
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Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Pro Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Ile Phe Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Glu Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Ser Tyr Gly Tyr Ala Tyr Ala Leu Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Ala Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Ala Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Pro Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Leu Asp Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Arg Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
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Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Val His Thr Ser
85 90 95
Ser Gly Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Lys Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Arg Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 23
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Tyr Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Ile Pro Ser Phe Asp Thr Ala Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Ala Ile Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Glu His Ser Ser Thr Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Ala Thr Gly Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Ser
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Met Cys Leu Val Tyr Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Val Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 24
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Asp Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn His Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln Pro Lys Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala
115 120 125
Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Tyr Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala
130 135 140
Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val
145 150 155 160
Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Trp
165 170 175
Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr
180 185 190
Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala
195 200 205
Pro Thr Glu Cys
210
<210> 25
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
atggagacgg acactctgct cctgtgggtg ctcctgcttt gggtaccggg ttcaacggga 60
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc 120
tcctgtgctg cttctggatt cgacttcagt agttatggag tgccctgggt ccgcaaggct 180
ccagggaagg ggctggagtg ggttggctac attgatccta tttttggtcc cacatactac 240
gcagacgagg tgaagggcag attcaccatc tcagctgatg attcaaagaa ctcactgtat 300
ctgcaaatga acagcctgaa aaccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagactat 360
agttatggtt atgcttatgc tctcgacatc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 420
tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc gccgactact tccccgaacc ggtgacggtg 540
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 600
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacga gagagttgag 720
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcaggg 780
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900
tggtatgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 960
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaagactg gctgaatggc 1020
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcgccg cccccatcga gaaaaccatc 1080
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccggggg 1140
gacatgacca agaaccaagt ccagctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gcttccaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggc aaa 1413
<210> 26
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
atggaaactg acaccctgct gctctgggta ctgctccttt gggttcctgg gagcacaggc 60
cggattgtga tgacccagac tccactctct ctgtccgtca cccctggaca gccggcctcc 120
atctcctgcc aggccagtca gagaattagt ccctacttag cctggtacct ggacaagcca 180
ggccagcctc cacagctcct gatctcccgg gcatccaaac tggcatctgg agtgccagat 240
aggttcagtg gcagcgggtc agggacagat ttcacactga aaatcagccg ggtggaggct 300
gaggatgttg gggtttatta ctgccaaagt tattatgttc acactagtag tggttatgct 360
ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa cggaccgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgataagca gttgaaatct ggaactgcca gagttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcact 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg c 711
<210> 27
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
atggaaaccg atacgctcct gctgtgggtt ctcctcttgt gggtccccgg ctctaccggg 60
caggtccagc tcgtgcagag tggcgccgag gtcaaaaaac ccggttcaag cgtgaaggtg 120
tcttgtaaag catctggagg aacctttagt tcctacgcca ttagttgggt gaggtacgct 180
cccggccagg gcttggaatg gatgggtttg attattccca gctttgatac agctggatac 240
gcgcagaagt tccagggacg cgtggccatc accgtggatg aaagcacttc aactgcctac 300
atggaactgt catccttgag aagcgaggat actgctgttt actactgcgc tagggcagag 360
cactcctcca ccgggacctt cgactattgg ggtcgaggta ctctcgtgac cgtgagcagc 420
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg gccaccggcc cggctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgcaggggga 780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tatgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aagactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcgccgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtccaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140
atgaccaaga accaagtcag cctgatgtgc ctggtctatg gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctat tccgtgctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggcaaa 1410
<210> 28
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg atccactggt 60
gacatccaga tgacacagtc accttcaagc gtctccgcct ccgtgggaga cagggttact 120
attacatgta gggccagcca ggggatctct tcatggctgg cgtggtacca acggaagcca 180
ggcgacgccc ccaagctcct tatctccgct gcctcctctc tgcagtccgg agttccctcc 240
cgcttcagcg gtagcgggtc aggcactgac ttcaccctta caatctcttc tctgcaacct 300
gaggacttcg ccacatatta ttgccagcag gcaaaccatt tgccatttac ttttggcgga 360
ggtactaagg ttgagattaa aggccagcct aaagctgccc ctagcgttac ccttttccca 420
ccgagctccg aggagctgca ggccaataaa gcaaccttgg tctgctacat atcagatttt 480
taccctggcg ccgtgaccgt agcatggaaa gctgattcat cccctgtgaa ggccggtgtt 540
gaaactacaa ccccttccaa acaatctaac aataaatacg cggcatggtc ctacctgtcc 600
ttgacacccg agcagtggaa atctcacaga tcttacagct gccaggtcac ccacgagggg 660
agcactgtgg agaagaccgt cgcgcccact gagtgc 696
<210> 29
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 30
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala
1 5 10 15
Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe
20 25 30
Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro
35 40 45
Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln
50 55 60
Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg
65 70 75 80
Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr
85 90 95
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro
115 120 125
Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln His
130 135 140
His His His His His
145
<210> 31
<211> 244
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala
1 5 10 15
Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
20 25 30
Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser
35 40 45
Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln
50 55 60
Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln
85 90 95
Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr
100 105 110
Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
115 120 125
Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly
130 135 140
Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val
145 150 155 160
Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu
165 170 175
Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser
180 185 190
Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp
210 215 220
Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe
225 230 235 240
Thr Glu Thr Gly
<210> 32
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
His His His His His His Gly Gly Gly Gly Ser Met Met Thr Gly Thr
1 5 10 15
Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile
20 25 30
Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn
35 40 45
Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly
50 55 60
Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly
65 70 75 80
Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr
85 90 95
Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile
100 105 110
Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe
115 120 125
Gln Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His
130 135 140

Claims (16)

1.结合由SEQ ID NO:31的氨基酸序列表示的人TIGIT和由SEQ ID NO:29的氨基酸序列表示的人PD-1的多肽分子，其中所述多肽分子是包含以下的抗体：
a)由SEQ ID NO:21的氨基酸序列表示的第一重链；
b)由SEQ ID NO:22的氨基酸序列表示的第一轻链；
c)由SEQ ID NO:23的氨基酸序列表示的第二重链；和
d)由SEQ ID NO:24的氨基酸序列表示的第二轻链。
2.哺乳动物细胞，其能够表达权利要求1所述的多肽分子。
3.编码权利要求1所述的多肽分子的DNA分子，其包含编码SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列的多核苷酸。
4.权利要求3所述的DNA分子，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的DNA序列。
5.哺乳动物细胞，其包含权利要求3或权利要求4所述的DNA分子。
6.用于产生抗体的方法，包括培养权利要求2或5所述的哺乳动物细胞和回收多肽分子。
7.通过权利要求6所述的方法产生的多肽分子。
8.药物组合物，其包含权利要求1或7所述的多肽分子和可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
9.权利要求1或7所述的多肽分子在制备用于治疗实体肿瘤癌的药物中的用途。
10.权利要求9所述的用途，其中所述实体肿瘤癌是肺癌、乳腺癌、头颈癌、黑色素瘤、肝癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫内膜癌。
11.权利要求10所述的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
12.权利要求10所述的用途，其中所述肺癌是小细胞肺癌。
13.权利要求10所述的用途，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
14.权利要求10所述的用途，其中所述肝癌是肝细胞癌。
15.权利要求9-14中任一项所述的用途，其中所述多肽分子与电离辐射同时、分开或依次组合施用。
16.权利要求9-14中任一项所述的用途，其中所述多肽分子与一种或多种化学治疗剂同时、分开或依次组合施用。
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