KR20100091204A

KR20100091204A - 탄저균 독소에 대한 ｇ 면역글로불린

Info

Publication number: KR20100091204A
Application number: KR1020107011889A
Authority: KR
Inventors: 필리페 틸리에르; 크리스티앙 베랭
Original assignee: 엘에프비 바이오테크놀로지스; 에따 프랑세 르프레장떼 빠르 르 델레게 제네랄 뿌르 라르망
Priority date: 2007-11-29
Filing date: 2008-11-28
Publication date: 2010-08-18
Also published as: EP2235057B1; BRPI0820215A2; BRPI0820215A8; EP2235057A2; US9012608B2; CN101952311A; JP2011504743A; US20110201033A1; AU2008332943B2; FR2924431A1; AU2008332943B9; CA2707201A1; ES2649565T3; WO2009071860A3; FR2924431B1; WO2009071860A2; AU2008332943A1

Abstract

본 발명은 탄저균 방어 항원(PA)에 대한 G 클래스의 면역글로불린(IgG)에 관한 것으로서,
- 명세서에서 정의된 바와 같이 서열번호 1과 아미노산이 90% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(light-chain variable region); 및
- 명세서에서 정의된 바와 같이 서열번호 2와 아미노산이 90% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(heavy-chain variable region)을 포함하며,
IgG1 또는 IgG2로 구성되는 것을 특징으로 한다.

Description

탄저균 독소에 대한 Ｇ 면역글로불린{G IMMUNOGLOBULIN USED AGAINST ANTHRAX TOXINS}

본 발명은 박테리아 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)의 PA 서브-유닛[방어 항원(protective antigen)]에 대한 영장류화 G 면역글로불린(primatized G immunoglobulin)에 관한 것이다.

탄저병(anthrax)은 그람 양성 박테리아인 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)에 의해 발병하는 감염성 질환이다. 상기 박테리아는 비(非)운동성이며, 인간 또는 동물 혈액 또는 조직과 같은 환경에 존재할 때 영양형(vegetative form)으로 발아하는, 매우 내성적인 포자를 형성한다. 매우 강하기는 하지만, 포자는 복제되지 않으며, 한편으로는 토양에서 10년 동안 성장하기 시작한다. 매우 내성이 높음에도 불구하고, 포자는 복제되지 않으며, 한편으로는 땅속에서 수십년 동안 생존해 있을 수 있다.

탄저균 독소-매개 감염은 피부, 폐 또는 소화기에서 발생할 수 있다. 폐 감염은 가장 치명적이다. 바실러스 안트라시스를 흡입하자마자, 상기 포자는 폐포로 들어가서 대식세포(macrophages) 및 수지상 세포(dendritic cells)에 의해서 포식된다. 상기 포자들은 상기 세포들에서 발아하기 시작하여, 영향형은 림프절안에서 증식한다. 그 후 박테리아가 혈액 순환계로 침투하고, 연속적으로 복제하여, 부분적으로 질병의 치사 특성을 초래하는 독소를 생산한다. 탄저균 독소는 3개의 구별되는 단백질인, 방어 항원(PA, 세포내 효소 절단전 83 kDa, 세포내 효소 절단후 63 kDa), 치사 인자(LF, 90 kDa) 및 부종 인자(EF, 89 kDa)로 이루어져 있다. 상기 치사 독소는 PA와 LF로 형성되고; 부종 독소는 질병 생리에서 덜 두드러진 역할을 하며, PA 및 EF로 형성된다.

상기 단백질은 상기 박테리아로부터 비(非)독성의 모노머로서 분비되고, 표적 세포의 표면에 모두 모여서 독성 복합체를 형성한다.

지금까지, 페니실린, 독시사이클린 및 플루오로퀴논(예를 들어, 시프로플록사신)과 같은 다수의 항생제는 탄저병 감염의 치료를 위해서 사용되어 왔다.

그러나, 상기 일부 항생제는 어떤 종에는 영향을 주지 못하고 항생제에 내성이 발생하였다. 특히 일부 치료 방법은 항생제-내성 종이 의도적으로 살포되는 테러 행위 또는 생화학전에 적합하지 않을 것이다.

또한, 항생제는 탄저균 독소 작용을 저해할 수 없기 때문에, 상기 항생제들이 감염 초기 단계에 투여될 필요가 있지만, 초기 증상이 특이적이지 않기 때문에 조기 진단을 정립하기 어려웠다.

주요 성분이 방어 항원(PA)인 백신이 개발되었지만, 바실러스 안트라시스와 접촉된 것으로 강하게 의심되는 사람에 대해서만 사용되었다. 또한, 충분한 면역원성을 얻기 위해서는 수개월의 시간이 걸리기 때문에, 상기 백신은 응급 상황에서는 사용될 수 없다. 현재 프랑스에서는 상기 백신을 사람에게 사용하는 것은 승인되지 않았다. 그러므로, 항생제와는 다른 신규한 치료제 및 예방제를 개발하는 것이 필요하다.

항체를 통한 수동 면역(passive immunization)은 독소를 중화시키는데 효과적인 전략이다. 방어 항원(PA) 및 치사 인자(LF)에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 탄저병 치사 독소를 중화하려는 몇가지 시도가 이루어졌다. 항체를 사용하여 탄저병 치사 독소를 중화시키는 것은 예를 들어, PA와 이의 세포 수용체의 결합을 저해시키거나, PA 절단을 저해하거나, PA가 LF에 결합하는 것을 저해하거나 또는 LF 작용을 저해하는 것에 의해서 실시되었다.

그러므로, 탄저균 독소를 중화시킬 수 있는 신규한 항체의 개발은 탄저병을 예방하고 효과적으로 치료하는 것에 통상적인 관심이 있다.

최근 연구에서, 마카크(macaque)를 방어 항원 PA83으로 면역화하여 탄저균 독소-매개 사람 감염증을 치료하기 위한 항체를 수득하였다. 본 발명자들은 골수로부터 PA83-특이적 항체 단편을 암호화하는 유전자를 증폭하고 라이브러리를 제작하기 위해서 상기 유전자를 클로닝하였다.

그런 다음, 35PA83으로 언급되는 높은 친화도(affinity, Kd=3.4 nM) 및 강한 중화 단편(neutralizing fragment, 50% 저해 농도 = 5.6 +/- 0.13 nM)이 분리되었다(Laffly and al., antimicrobial agents and chemotherapy, 2005, 49(8): 3414-3420).

면역글로불린 단편 35PA83은 PA와 이의 세포 수용체의 반응을 방지하여 탄저균 독소를 중화하였다.

그러나, 상기 면역글로불린 단편을 의학적(예방 목적 또는 치료 목적) 용도로 적용하기 위한 제조에서, 이의 친화도의 향상은 환자에게 투여될 함량 및 치료비용을 상당히 감소시킬 수 있다. 한편, 상기 면역글로불린 단편이 유인원으로부터 기원되기 때문에, 이의 사람 생물학적 이용가능성(human bioavailability)의 변경 및 면역원성(immunogenicity)에 위험이 있을 수 있다.

그러므로, 본 발명의 목적은, 항원에 대한 이의 친화성을 향상시키고 인간 항체들과 더 유사하게 사전에 변형된, 면역글로불린 단편 35PA83으로부터 수득된 항원 PA에 대한 IgG1 또는 IgG2 이소타입의 완전한 면역글로불린을 제공하는데 있다.

따라서, 본 발명의 목적은, 항체 35PA83의 가변 영역, 돌연변이된 수 개의 잔기 및 일부 사람 기원의 불변 영역을 포함하는, 탄저균 독소의 방어 항원(PA)에 대한 G 클래스의 면역글로불린(IgG)을 제공하는데 있다.

본 발명의 추가적인 목적은 본 발명의 IgG를 암호화하는 핵산, 뿐만 아니라 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 본 발명의 IgG를 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 IgG를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 추가적인 목적은 바실러스 안트라시스에 의한 감염을 치료 또는 예방하기 위한 의약품을 제조하는데 사용되는 본 발명의 IgG의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명은 또한 탄저균 독소 검출 키트, 탄저균 독소를 시험관내에서 검출하는 방법 및 본 발명의 IgG를 포함하는 면역접합체(immunoconjugate)에 관한 것이다.

그러므로 본 발명의 목적은 탄저균 독소의 방어 항원(PA)에 대항하는 G 클래스의 면역글로불린으로서;

- 서열번호 1과 아미노산이 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(light-chain variable region); 및

- 서열번호 2와 아미노산이 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 위치 25에 세린 잔기, 위치 54에 리신 잔기 및 위치 60에 아르기닌 잔기에 각각 해당하는 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역(heavy-chain variable region)을 포함하고, 상기 면역글로불린은 IgG1 또는 IgG2로 구성되는 것을 특징으로 하는, G 클래스의 면역글로불린을 제공하는 데 있다.

본 발명에 따르면, 대조군의 제2 핵산과 적어도 90%의 동일성을 갖는 제1 핵산은 대조군의 제2 핵산과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 98.3% 98.6%, 99%, 99.6%의 뉴클레오티드 동일성을 가질 것이다.

본 발명에 따르면, 대조군의 제2 폴리펩티드와 적어도 90%의 동일성을 갖는 제1 폴리펩티드는 대조군의 제2 폴리펩티드와 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 98.3% 98.6%, 99%, 99.6%의 아미노산 동일성을 가질 것이다.

본원에서 사용되는 2개의 핵산 서열들간의 또는 2개의 폴리펩티드 서열들간의 "동일성 비율(percentage of identity)"은 비교 창(comparison window)을 통해 최적으로 배열된 두 서열들을 비교함으로써 결정된다.

따라서, 비교창에서 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 일부는 대조군 서열(삽입(additions) 또는 결손(deletions)을 포함하지 않음)과 비교하여 2개의 서열들 사이에 최적의 배열을 수득하기 위하여 삽입 또는 결손(예를 들어, "갭(gaps)")을 포함할 수 있다.

동일성 비율은, 2개의 비교된 서열들에 대해서, 동일한 핵산 염기 또는 동일한 아미노산 잔기의 위치의 수를 결정하고, 2개의 핵산 염기 또는 2개의 아미노산 잔기 사이에서 동일성이 관찰된 위치의 수를 비교창내 위치의 전체수로 나누고, 그 수득된 값에 100을 곱하여 2개의 서열들 사이의 뉴클레오티드 동일성 비율 또는 2개의 서열들 사이의 아미노산 동일성 비율을 산출된다.

최적의 서열 배열의 비교는 공지된 알고리즘을 사용하여 컴퓨터에 의해서 계산될 수 있다.

가장 바람직하게는, 서열 동일성 비율은 CLUSTAL W 소프트웨어(버전 1.82)를 사용하여 하기로 설정된 매개변수로 결정된다: (1) CPU MODE = ClustalW mp; (2) ALIGNMENT = "full"; (3) OUTPUT FORMAT = "aln w/numbers"; (4) OUTPUT ORDER = "aligned"; (5) COLOR ALIGNMENT = "no"; (6) KTUP (워드 크기) = "default"; (7) WINDOW LENGTH = "default"; (8) 스코어 타입(SCORE TYPE) = "퍼센트(percent)"; (9) TOPDIAG = "default"; (10) PAIRGAP = "default"; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = "none"; (12) MATRIX = "default"; (13) GAP OPEN = "default"; (14) END GAPS = "default"; (15) GAP EXTENSION = "default"; (16) GAP DISTANCES = "default"; (17) TREE TYPE = "cladogram" 및 (18) TREE GRAP DISTANCES = "hide".

본 발명의 항체의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역에서 돌연변이의 주석에 따라, 더 일반적으로는 본 발명의 항체의 몇 가지의 실시양태의 설명의 보충하기 위하여, 당분야의 통상의 지식을 가진 사람이라면, 본 명세서의 끝에 첨부한 48-75 페이지에 해당하는, 2007년 9월 26일에 출원된 프랑스 특허 N°FR 07/06744. “탄저 독소에 대한 항체”의 명세서를 참조할 수 있다.

서열번호 2(SEQ ID N°2)의 위치 25의 세린 잔기의 존재는 도 11에서 “35H”부분의 “31A”로 표시된 돌연변이에 해당하는 것으로, 상기 돌연변이는 또한 “G/S (31A)”로 언급될 수도 있다.

서열번호 2(SEQ ID N°2)의 위치 54의 리신 잔기의 존재는 도 11에서 “35H”부분의 “66”로 표시된 돌연변이에 해당하는 것으로, 이 돌연변이는 또한 “R/K (66)”로 언급될 수도 있다.

서열번호 2(SEQ ID N°2)의 위치 60의 아르기닌 잔기의 존재는 도 11에서 “35H”부분의 위치 73의 아르기닌 잔기에 해당하는 것으로, “K/R (73)”로 언급될 수도 있는 돌연변이에 해당하는 것이다.

본 발명에 따르면, 위치 25의 세린 잔기, 위치 54의 리신 잔기, 및 위치 60의 아르기닌 잔기에 "해당하는" 잔기는 위에서 언급된 잔기로 구성되며, 및:

(i) 서열번호 2와 적어도 90% 동일성의 서열과 동일한 자리에 위치하거나, 또는

(ii) 다른 자리에 위치하는데,

이는 예를 들어, 서열번호 2 서열과 적어도 90% 동일성의 서열이 대조군으로 작용하는 서열번호 2의 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 결손(들) 또는 삽입(들)을 포함하는데서 기인한다.

본 발명의 다른 목적은 이 명세서에 정의함 바와 같이, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 G 클래스의 면역글로불린(IgG)을 제공한다.

- 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역; 및

- 서열번호 2로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역.

경쇄 및 Fd 단편으로 이루어진 면역글로불린 단편 35PA83은 Laffly 등(2005)에서 기술된 바와 같이, 탄저병의 방어 항원 PA83으로 마카크(macaque)를 면역화시킴으로 수득된다.

항체의 친화도 "K_D"는, 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있는 종래의 방법을 통해 측정될 수 있다.

모체인 변형되지 않은 항체(예를 들어, 돌연변이되지 않음) 35PA83의 친화도 K_D는 3.4×10^-9 M이다. 상기 친화도 상수는, 실시예에서 설명되는 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)을 통해 실시간으로 측정된 결합 상수와 해리 상수로부터 산출되어 진다.

본 발명의 IgG의 경쇄 가변 영역(서열번호 1)은 면역글로불린 단편 35PA83의 경쇄 가변 영역으로부터 유래되며, 면역글로불린 단편 35PA83의 서열은 진뱅크의 승인번호 CAH17921 및 AJ810487와 같은 컴퓨터화된 테이터뱅크(computerized data banks)로부터 얻을 수 있다.

유익하게도, 서열번호 1에 의해서 명시된 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 IgG의 경쇄 가변 영역은 부가적으로, 하기로 부터 선별된 1 이상의 돌연변이를 포함한다:

- none/A (1)

- none/I (2)

- none/Q (3)

- none/L (4)

- Y/S (14)

- K/R (18)

- H/R (24)

- L/V (124).

돌연변이 none/A (1)는 도 11상의 “35L" 부분의 서열의 자리 1 및 서열번호 제 1의 서열의 자리 -4에 아미노산 "A"가 삽입된 것으로, 즉 만약 존재한다면, 잔기 N°-3의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°-2의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면, 잔기 N°-1의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°1에 바로 상위에 존재하는 것을 의미한다.

돌연변이 none/I (2)는 도 11상의 “35L" 부분의 서열의 자리 2 및 서열번호 제 1의 서열의 자리 -3에 아미노산 "I"가 삽입된 것으로, 즉, 만약 존재한다면, 잔기 N°-2의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°-1의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°1에 바로 상위에 존재하는 것을 의미한다.

돌연변이 none/Q (3)는, 아미노산 “Q"가 도 11상의 “35L" 부분의 서열의 자리 3 및 서열번호 제 1의 서열의 자리 -2에 추가된 것으로, 즉, 만약 존재한다면, 잔기 N°-1의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°1의 바로 상위에 존재하는 것을 의미한다.

돌연변이 none/L (4)는 아미노산 “L"이 도 11상의 “35L" 부분의 서열의 자리 4 및 서열번호 제 1의 서열의 자리 -1에 삽입된 것으로, 즉, 잔기 N°1의 바로 상위에 존재하는 것을 의미한다.

돌연변이 Y/S (14)는 도 11상의 “35L" 부분의 서열의 자리 14 및 서열번호 제 1의 서열의 자리 10에 위치한 아미노산 “Y”가 아미노산 “S”로 치환된 것을 의미한다.

돌연변이 K/R (18)는 도 11상의 “35L" 부분의 서열의 자리 18 및 서열번호 제 1의 서열의 자리 14에 위치한 아미노산 “K”가 아미노산 “R”로 치환된 것을 의미한다.

돌연변이 H/R (24)는 도 11상의 “35L" 부분의 서열의 자리 24 및 서열번호 제 1의 서열의 자리 20에 위치한 아미노산 “H”가 아미노산 “R”로 치환된 것을 의미한다.

돌연변이 L/V (124)는 도 11상의 “35L" 부분의 서열의 자리 124 및 서열번호 제 1의 서열의 자리 100에 위치한 아미노산 “L”이 아미노산 “V”로 치환된 것을 의미한다.

바람직하게는, 이들 돌연변이들의 최소 하나의 삽입은, 이것이 유래된 단편 35PA83의 면역원성에 비해, 본 발명의 IgG의 경쇄 가변 영역의 면역원성을 감소시킬 수 있다.

특히 유리하게는, 서열번호 1에 명시된 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 IgG의 경쇄의 가변 영역은, 하기의 돌연변이들을 포함한다:

- none/A (1)

- none/I (2)

- none/Q (3)

- none/L (4).

- none/A (1)

- none/I (2)

- none/Q (3)

- none/L (4)

- Y/S (14)

- K/R (18)

- H/R (24)

- L/V (124).

바람직하게는, 이들 잔기들의 삽입은, 이것이 유래된 단편 35PA83의 면역원성에 비해, 본 발명의 IgG의 경쇄 가변 영역의 면역원성을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 IgG의 중쇄 가변 영역(서열번호 제 2)은 면역글로불린 단편 35PA83의 Fd 단편의 가변 영역에서 유래된 것으로, 이 서열은 진뱅크와 같은 컴퓨터화된 데이터 뱅크에 승인번호 CAH17920 및 AJ810486로 승인 가능하도록 등록되어 있다.

유리하게는, 서열번호 2에 명시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역은, 부가적으로, 하기로부터 선별된 최소 하나의 돌연변이를 포함한다:

- none/Q (1)

- none/V (2)

- none/Q (3)

- none/L (4)

- none/Q (5)

- none/E (6)

- L/V (12)

- A/T (24)

- A/T (122)

- V/L (123).

돌연변이 none/Q (1)는 아미노산 “Q"가 도 11상의 “35H" 부분의 서열의 자리 1 및 서열번호 제 2의 서열의 자리 -6에 추가된 것으로, 즉, 만약 존재한다면, 잔기 N°-5의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°-4의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°-3의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°-2의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°-1의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°1에 바로 상위에 존재하는 것을 의미한다.

돌연변이 none/V (2)는 아미노산 “V"가 도 11상의 “35H" 부분의 서열의 자리 2 및 서열번호 제 2의 서열의 자리 -5에 추가된 것으로, 즉, 만약 존재한다면, 잔기 N°-4의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°-3의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°-2의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°-1의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°1에 바로 상위에 존재하는 것을 의미한다.

돌연변이 none/Q (3)는 아미노산 “Q"가 도 11상의 “35H" 부분의 서열의 자리 3 및 서열번호 제 2의 서열의 자리 -4에 추가된 것으로, 즉, 만약 존재한다면, 잔기 N°-3의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°-2의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°-1의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°1에 직접적으로 존재하는 것을 의미한다.

돌연변이 none/L (4)는 아미노산 “L"이 도 11상의 “35H" 부분의 서열의 자리 4 및 서열번호 제 2의 서열의 자리 -3에 추가된 것으로, 즉, 만약 존재한다면, 잔기 N°-2의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°-1의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°1에 바로 상위에 존재하는 것을 의미한다.

돌연변이 none/Q (5)는 아미노산 “Q"가 도 11상의 “35H" 부분의 서열의 자리 5 및 서열번호 제 2의 서열의 자리 -2에 추가된 것으로, 즉, 만약 존재한다면, N°-1의 바로 상위에 존재하거나, 그렇지 않으면 잔기 N°1에 바로 상위에 존재하는 것을 의미한다.

돌연변이 none/E(6)은 아미노산 “E"가 도 11상의 “35H" 부분의 서열의 자리 6 및 서열번호 제 2의 서열의 자리 -1에 추가된 것으로, 즉, 만약 존재한다면, 잔기 N°1에 바로 상위에 존재하는 것을 의미한다.

돌연변이 L/V (12)는 도 11상의 “35H" 부분의 서열의 자리 12 및 서열번호 제 2의 서열의 자리 5에 위치한 아미노산 “L”이 아미노산 “V”로 치환된 것을 의미한다.

돌연변이 A/T (24)는 도 11상의 “35H" 부분의 서열의 자리 14 및 서열번호 제 2의 서열의 자리 17에 위치한 아미노산 “A”이 아미노산 “T”로 치환된 것을 의미한다.

돌연변이 A/T (122)는 도 11상의 “35H" 부분의 서열의 자리 122 및 서열번호 제 2의 서열의 자리 113에 위치한 아미노산 “A”이 아미노산 “T”로 치환된 것을 의미한다.

돌연변이 V/L (123)는 도 11상의 “35H" 부분의 서열의 자리 123 및 서열번호 제 2의 서열의 자리 114에 위치한 아미노산 “V”가 아미노산 “L”로 치환된 것을 의미한다.

바람직하게는, 이들 돌연변이들 중 최소 하나의 삽입은, 이것이 유래된 단편 35PA83의 면역원성에 비해, 본 발명의 IgG의 중쇄 가변 영역의 면역원성을 감소시키게 할 수 있다.

본 발명의 IgG의 중쇄 가변 영역(서열번호 제 2)은 면역글로불린 단편 35PA83의 Fd 단편의 가변 영역에서 유래된 것으로, 이 서열은 진뱅크와 같은 컴퓨터화된 데이터 뱅크에 승인번호 CAH17920 및 AJ810486로 승인 가능하도록 기록되어 있다. 본 발명의 IgG의 중쇄 가변 영역(서열번호 제 2)은 면역글로불린 단편 35PA83의 가변 영역에 비해 변형된 하기 세 가지 돌연변이를 포함한다: G/S (31A), R/K (66) and K/R (73). 유리하게는, 이들 세 가지 돌연변이들은 면역글로불린 단편 35PA83의 가변 영역에 비해 본 발명의 IgG의 중쇄 가변 영역의 친화성을 향상시키게 할 수 있다.

특히 유리하게는, 서열번호 2(SEQ ID N°2)로 명시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역은 하기 돌연변이들을 추가로 포함한다:

- none/Q (1)

- none/V (2)

- none/Q (3)

- none/L (4)

- none/Q (5)

- none/E (6).

특히 유리하게는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역은, 부가적으로, 하기 돌연변이들을 포함한다:

- none/Q (1)

- none/V (2)

- none/Q (3)

- none/L (4)

- none/Q (5)

- none/E (6)

- L/V (12)

- A/T (24)

- A/T (122)

- V/L (123).

바람직하게는, 이들 돌연변이들 중 최소 하나의 삽입은, 이것이 유래된 단편 35PA83의 면역원성에 비해, 본 발명의 IgG의 중쇄 가변 영역의 면역원성을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 구체적인 하나의 예시에서, 항체(서열번호 제1)의 경쇄 가변 영역은 하기 돌연변이들을 포함하며:

- none/A (1)

- none/I (2)

- none/Q (3)

- none/L (4),

및 항체(서열번호 제2)의 중쇄 가변 영역은 하기 돌연변이들을 포함한다:

- none/Q (1)

- none/V (2)

- none/Q (3)

- none/L (4)

- none/Q (5)

- none/E (6).

놀랍게도, 본 발명의 IgG에서, 경쇄 불변 영역은 서열번호 제 3(SEQ ID N°3) 서열을 포함하는 아미노산을 포함하며, 중쇄 불변 영역은 서열번호 제 4(SEQ ID N°4) 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 명세서에서, 용어 “면역글로불린”은 특정 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 분자의 단편을 의미한다. 면역글로불린 단편은, 잘 알려져 있듯이, 예컨대, F(ab')2, Fab, Fv, scFv 및 Fd 단편들이다.

타입 G의 면역글로불린은 2개의 중쇄와 2개의 경쇄가 이황화결합을 통하여 서로 결합되어 구성된 이형이합체(heterodimers)이다. 각각의 사슬은, n-말단 자리에는 상기 면역글로불린에 대한 항원에 특이적인 가변 영역(variable region) 또는 도메인(domain)(경쇄는 유전자 V-J로 및 중쇄는 V-D-J로 재배열되어 암호화됨)으로 구성되고, C-말단 위치에 경쇄의 한 도메인 CL 또는 중쇄의 세 개의 도메인(CH₁, CH₂ 및 CH₃)으로 구성된 불변 영역으로 이루어져 있다. 가변 도메인과 중경쇄의 CH₁ 와 CL 도메인의 조립은 Fab 부분을 형성하고, 이는 그 항원 표적에 결합하도록 하는 각각의 Fab가 매우 유연한 경첩(hinge) 영역을 통하여 Fc영역에 연결되고, 반면 항체의 효과기(effector) 성질을 매개하는 Fc 영역은 면역 효과기들, 식세포 또는 킬러 세포들, 및 보체들에의 접근할 수 있도록 하며; 이들 불변 영역은 항원과의 결합 (영역)에 포함되지 않는다. CH₂ 및 CH₃의 2개의 구형 도메인으로 구성된 Fc 영역은, Asn 297에 결합된 락토사민(lactosamine) 형태의 바이안테너리(biantennary) N-글리칸 타입의 존재하에 CH₂ 도메인 상에 당화되어 있다.

가변 영역은, 항체와 그의 에피토프의 결합에 관여한다.

불변 영역 (Fc)에서 그로 부터의 경첩 영역이 보존되도록 효소적으로 절단된 항체는 F(ab')2 단편으로 불리며, 두 개의 항원-결합 자리(antigen-binding sites)를 보유한다.

마찬가지로, 경첩 영역을 포함하는 불변영역이 효소적으로 절단되거나 이 영역이 없이 생산된 항체는, Fab 단편이라 하며, 두 개의 항원-결합 자리 중 하나를 보유한다.

Fd 단편은 VH 및 CH₁ 영역으로 형성된다.

소위 초가변(hypervariable) 영역인 상보성을 결정하는 영역(CDRs, complementary determining regions)은 가변 영역에 위치하며, 항원과 직접적으로 상호작용한다. 따라서, CDRs의 변형은 항체의 친화성을 변형시킨다. 소위 프레임워크 영역(framework regions (FRs))이라 불리는, 두 번째 타입의 영역이 가변 영역에 위치하며, 3차 구조의 CDRs를 형성한다. 이 프레임워크 영역은 항체가 유래된 종에 대해 상대적으로 특이적이다(종 특이적이다). 세 개의 CDRs (CDR1 내지 CDR3)에 의해 각각 분리되는 네 개의 프레임워크 영역(FR1 내지 FR4)이 중쇄의 Fd 단편과 경쇄에 위치한다.

이 명세서의 본 발명의 항-PA IgG의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산의 설명에 따르면, 당업자는 이 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 합성하거나, 합성하여 제작할 수 있다.

유리하게도, 본 발명의 IgG의 중쇄 및 경쇄의 각 불변영역들은 인간의 불변 영역이다.

바람직하게, 본 발명의 IgG의 영역 및 경쇄의 각 불변 영역들은 κ 타입이다. 모든 동종이형(allotype)은 발명의 실시에 적합하게 사용될 수 있으며, 예컨대, Km(1), Km(1,2), Km(1, 2, 3) 또는 Km(3)이며, 바람직하게는 동종이형은 Km(3)이다.

각 항체 중쇄의 불변 영역은, 인간의 보체를 고정시키는 특성을 가진 세 가지 타입의 불변 영역인 γ1 타입, γ2 타입 또는 γ3 타입, 또는 γ4 타입일 수도 있다.

바람직하게는, 각 항체 중쇄 불변 영역은 γ1 타입인 것으로, 이러한 항체는 대부분의 개인(사람)에서 ADCC 활성을 유도할 수 있기 때문이다. 이 점에 있어서, 어떤 동종이형은 본 발명을 실시하는데 적합하게 사용될 수 있으며, 예를 들어, G1m(3), G1m (1, 2, 17), G1m(1, 17) 또는 G1m(1.3)이다. 바람직하게는, 동종이형 은 G1m(1.17)이다.

유리하게는, 본 발명의 IgG의 중쇄의 각 불변 영역은 γ1 타입인 것으로, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하며, 본 발명의 IgG의 각 경쇄의 불변 영역은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.

유리하게는, 본 발명의 IgG의 각각의 경쇄는 서열번호 제 5(SEQ ID N°5) 아미노산 서열을 포함하며, 본 발명의 IgG의 각각의 중쇄는 서열번호 제 6(SEQ ID N°6)의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 IgG을 암호화하는 핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 IgG의 각 경쇄의 가변 영역은 서열번호 제 7(SEQ ID NO: 7)의 핵산 서열에 의해 암호화되며, 본 발명에 따르는 각각의 항체 중쇄의 가변 영역은 서열번호 제 8(SEQ ID NO: 8)의 쥣과 핵산 서열에 의해 암호화된다.

본 발명의 하나의 구체적인 측면에서, 본 발명의 IgG의 각각의 중쇄의 불변 영역은 서열번호 제 9(SEQ ID NO: 9) 인간 핵산 서열에 의해 암호화되며, 이의 각각의 경쇄 불변 영역은 서열번호 제 10(SEQ ID NO: 10) 인간 핵산 서열에 의해 암호화된다.

더 구체적으로, 본 발명에 따르는 각 항체의 경쇄는 서열번호 제 11(SEQ ID NO: 11) 핵산 서열에 의해 암호화되며, 각각의 중쇄는 서열번호 제 12(SEQ ID NO: 12) 핵산 서열에 의해 암호화된다.

본 발명의 추가적인 목적은 본 발명의 IgG를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

여기에서 사용된, “벡터”는 제한 효소(restriction)로 목적하는 서열을 삽입한 다음, 라이게이션 하여 다양한 유전적 환경으로 수송되도록 또는 숙주 세포내에서 발현되도록 한 핵산을 의미한다. 벡터들은 예건대, 플라스미드들, 코스미드들, 효모의 인공 염색체(yeast artificial chromosomes (YAC)), 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosomes (BAC)), 박테리오파아지 P1 유래의 인공 염색체(PAC), 및 바이러스 유래 벡터들이 있다. 클로닝 벡터는 숙주 세포에서 복제가능하며, 추가로 하나 또는 그 이상의 엔도뉴클레아제 제한 효소 자리가 존재하는 것을 특징으로 한다. 발현 벡터는, 목적하는 DNA 서열을 제한효소 기술 또는 라이게이션 기술을 통하여 삽입하여 이를 RNA로 복제하고 및/또는 전사하게 할 수 있다. 이 벡터들은, 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염시킨 세포를 선별하거나 또는 동정하기 위하여 하나 또는 그 이상의 마커를 포함할 수 있다.

상기 핵산들은 본 발명의 항체들의 클로닝 및 발현을 위하여 제조합 벡터 내에 합병될 수 있다.

본 발명은, 진핵 또는 원핵의 세포 형질전환, 형질 감염 또는 유전자 치료를 목적으로 하는 암호 서열을 포함하는 모든 재조합 벡터를 포함한다. 이러한 벡터들은 분자생물학의 일반적인 방법에 따라 제조될 수 있으며, 게다가 적합한 프로모터, 선별적으로 배출 또는 분비를 위한 신호 서열, 및 뉴클레오타이드 서열의 전사를 위해 요구되는 조절 서열을 포함할 수 있다.

융합 폴리펩타이드는 본 발명의 항체를 정제하기 위하여 요구될 수 있다. 융합 도메인은, 예를 들어, Ni² ⁺ 컬럼 상에서 정제될 수 있는 폴리히스티딘 꼬리 또는 “파아지 전시(phage display)”라 불리는 기술에 따라 라이브러리 검색용으로 특히 유용한 필라멘트성 파아지 막 엥커(anchor)를 포함한다.

본 발명에서 적합하게 사용되는 벡터는, 가령 본 발명에 따른 전장의(full-length) 항체 또는 F(ab')2 또는 Fab 단편 등의 이형이합체 항체가 발현되도록 제 1 및 제 2 DNA 서열을 수용하여 발현하는데 적합한 재조합 DNA 분자이다. 이러한 벡터는 이형이합체 항체로부터 제 1 및 제 2 폴리펩타이드의 발현을 위한 두 개의 구별되는 시스트론(cistrons)을 형성하기 위하여 벡터에 존재하는 별도의 떨어진 두 카세트에 두 DNA 서열을 각각 클로닝하기 위한 시스템을 제공한다. 이러한 발현 벡터는 디시스트론 벡터(dicistronic vector)라 부른다.

본 발명의 변형된 항체는 CHO 세포, 또는 사람이나 쥣과의 하이브리도마 세포(hybridoma cells)와 같은 진핵 세포에서 뿐만 아니라, 유전자변형 식물과 동물 세포에서 생산될 수 있다.

본 발명의 추가적인 목적은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 제공하는데 있다.

유익하게, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 IgG의 경쇄를 발현할 수 있다. 본 특정 실시양태에서, 벡터는 각 IgG 경쇄의 가변 영역을 코팅하는 서열번호 7의 핵산 서열, 및 각 항체 경쇄의 불변 영역을 암호하는 서열번호 10의 핵산 서열이 삽입되는 핵산 분자이며, 이들을 숙주 세포내로 도입하고 그 안에 이들을 유지시킨다. 상기 숙주 세포는 핵산 외래 단편의 발현을 위해 요구되는 서열(프로모터, 폴리아데닐화 서열, 선별 유전자)을 포함하고 있기 때문에 상기 핵산 외래 단편을 숙주세포에서 발현시킬 수 있다. 상기 벡터는 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 잘 알려져 있으며, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 플라스미드 또는 박테리오파아지일 수 있고, 상기에 한정되는 것은 아니다. 또한, 일부 포유류 세포는 숙주 세포로서 사용될 수 있으며, 즉 본 발명의 IgG의 경쇄의 발현 벡터에 의해서 운반된 핵산 단편을 발현하는 세포, 예를 들어, YB2/0, CHO, CHO dhfr- (예를 들어, CHO DX B11, CHO DG44), CHO Lec13, SP2/0, NS0, 293, BHK 또는 COS이다.

유익하게, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 IgG의 중쇄를 발현하도록 할 수 있다. 본 특정 실시양태에서, 벡터는 본 발명의 IgG를 발현할 수 있는 분자이며, 중쇄는 서열번호 12의 핵산 서열에 의해서 암호화된다. 상기 벡터는 각 IgG 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 서열번호 8의 핵산 서열, 및 각 항체 중쇄의 불변 영역을 암호화하는 서열번호 9의 핵산 서열이 삽입되는 핵산 분자이며, 이들을 숙주 세포내로 도입하고 그 안에 이들을 유지시킨다. 이는 상기 핵산 외래 단편의 발현을 위해 요구되는 서열(프로모터, 폴리아데닐화 서열, 선별 유전자)을 포함하고 있기 때문에 상기 핵산 외래 단편을 숙주세포에서 발현시킬 수 있다. 상술한 바와 같이, 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 박테리오파아지일 수 있고, 숙주 세포는, 예를 들어, YB2/0, CHO, CHO dhfr- (CHO DX B11, CHO DG44), CHO Lec13, SP2/0, NS0, 293, BHK 또는 COS등의 임의의 포유류 세포일 수 있다.

본 발명의 벡터는 본 발명의 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 IgG의 중쇄 및 경쇄를 발현할 수 있는 벡터의 예는 실시예 2에 기술하였다. 상기 벡터는 본 발명의 IgG의 중쇄 및 경쇄에 대한 2개의 전사 유닛(transcription units)을 포함하는 유일한 벡터이다.

본 발명의 다른 목적은 여기에서 정의한 바와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.

유익하게도, 본 발명의 숙주 세포는 SP2/0, YB2/0, IR983F, 나말와 인간 골수종(Namalwa human myeloma), PERC6, CHO 세포주(특히, CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-), Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NS0, SP2/0-Ag 14 및 P3X63Ag8.653으로부터 선별된다.

바람직한 실시양태에서, 항체는 YB2/0 쥐 하이브리도마(rat hybridoma) [YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포, 승인번호 ATCC CRL-1662로 미국 종균 협회(American Type Culture Collection)에 기탁됨]에서 생산된다. 예를 들어, CHO 세포에서 수득된 유사한 1차 구조의 항체와 비교하여 향상된 ADCC 활성(항체-의존성 세포-매개 세포독성)을 갖는 항체를 생산할 수 있기 때문에 상기 세포주가 선별된다.

본 발명의 하나의 특정 측면에서, 본 발명의 항체를 발현하고, 특히 이전에 기술된 그룹으로부터 선별되는 안정한 세포주는 이전에 기술된 바와 같이 중쇄와 경쇄의 하나 또는 두 개의 발현 벡터(들)를 통합한다.

본 발명의 추가적인 목적은 적어도 하나의 본 발명의 IgG를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 추가적인 목적은 적어도 하나의 본 발명의 IgG를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

상기 약학적 조성물은 바람직하게는 약학적 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용된 담체는 조성물 중 활성 성분들의 생물학적 활성 효율을 방해하지 않는 비(非)독성 물질을 의미하는 것이다. "약학적 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"이라는 표현은 세포, 세포 배양액, 조직 또는 생물체와 같은 생물계와 상용할 수 있는 비(非)독성 물질을 나타내는 것이다. 담체 특성은 투여 방법에 따라 다르다.

본 발명은 바실러스 안트라시스에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 약학적 조성물 또는 의약품의 제조에 사용되는, 적어도 하나의 본 발명의 IgG의 용도에 관한 것이다.

본원에서 사용되는, 용어 "예방(prevention)"이라는 표현은, 질병은 아직 나타나지 않은 개체, 특히 사람에서 질병의 발생을 방지하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는, 용어 "치료(treatment)"는 질병의 억제, 예를 들어, 증상 및 질병의 발전의 중단(discontinuation), 쇠퇴 또는 소멸, 또는 질병원의 소멸에 해당한다.

본 발명의 IgG는 표식화(labeled)될 수 있다. 적당한 마커의 예로는 효소, 방사선동위원소(radioisotopes), 형광 화합물, 콜로이드 금속, 화학발광(chimioluminescent) 화합물, 생물발광(bioluminescent) 화합물을 포함한다.

항체에 마커를 결합시키는 방법은 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있다.

또 다른 표식화 방법은 항체를 저분자량 합텐(hapten)에 결합시키는 것이며, 합텐은 제2 반응을 통해서 특이적으로 변형될 수 있다. 적당한 합텐의 예로는 아비딘(avidin)과 반응하는 바이오틴(biotin), 또는 항-합텐 특이적 항체와 반응하는 디니트로페놀, 피리독살 또는 플루오레세인(fluorescein)을 포함한다.

본 발명의 목적은 PA-함유 탄저균 독소 검출 키트를 제공하는데 있다. 상기 키트는 하기를 포함한다:

- 표식화되거나 또는 표식화되지 않은, 적어도 하나의 본 발명의 항-PA IgG를 포함하는 용기,

- 선별적으로, 완충 용액(buffer solutions)을 포함하는 용기, 및

- 선별적으로, 리포터 분자(reporter molecule)(가령, 형광 또는 효소 마커)가 결합된 표식화된 IgG 검출 수단, 가령 바이오틴-결합 단백질(예를 들면, 아비딘 또는 스트렙트아비딘(streptavidine))을 포함하는 용기. 상기 용기는 또한 표식화되지 않은 IgG 검출 수단(예를 들어, 실질적으로 항체 또는 항체 단편)을 포함할 수 있다.

본 발명의 IgG는 액체상에서 또는 고체상에서 담체에 고정되어 시험관내에서(예를 들어, 면역 분석(immunological assays)에서) 사용될 수 있다. 잘 알려져 있는 담체의 예로는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 또는 개질된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 또는 마그네타이트를 포함한다. 본 발명의 항-PA IgG를 사용하는 면역 분석의 예는 방사선면역분석(radioimmunoassay), 히스토면역 표식화링 기술(histoimmunological labeling techniques), ELISAs, 웨스턴 블롯(Western blots), 면역침강 분석(immunoprecipitation assays), 면역 확산 분석(immunodiffusion assays), 보체결합 분석(complement fixation assays), 형광-활성 세포 소팅 분석(Fluorescence-activated Cell Sorting assays, FACS) 또는 단백질-칩 분석(protein-chip analyses)이 있다.

본 발명의 추가적인 목적은 생물학적 시료내 PA-함유 탄저균 독소를 시험관내에서 검출하는 방법을 제공하는데 있으며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

- 상기 생물학적 시료를 적어도 하나의 본 발명의 항-PA IgG와 접촉시키는 단계; 및

- 상기 탄저균 독소의 존재의 지표로서 상기 항체의 결합을 검출하는 단계.

생물학적 시료는 액체(예를 들어, 타액, 소변, 뇌척수액, 혈청 또는 혈액), 또는 고체 또는 반고체(예를 들어, 조직 진단에 전통적으로 사용되는 조직, 또는 대소변 또는 고체 조직)일 수 있다.

본 발명의 추가적인 목적은 PA-함유 탄저균 독소를 생체내에서 검출하는 방법을 제공하는데 있으며, 상기는 본 발명의 표식화된 IgG를 개체에 투여한다. 표식화된 IgG의 투여량은 검출될 독소에 항체를 결합시키기에 충분해야 한다. 표식화된 IgG의 투여량은 개체의 나이 및 성별, 뿐만 아니라 질병의 단계와 같은 몇가지 요인에 좌우될 수 있다. 투여량은 0.01-50　mg/kg, 바람직하게는 0.1-20　mg/kg, 더 바람직하게는 0.1-2　mg/kg으로 다양할 수 있다.

생체내 진단을 실시하기 위하여, 본 발명의 변형된 항-PA IgG는 기능기를 통해서 방사선동위원소에 직접 또는 간접적으로 결합되어야 한다. 통상적으로 사용되는 기능기로는 예를 들어, 디에틸렌-트리아민-펜트아세트산(DTPA) 및 에틸렌-디아민-테트라아세트산(EDTA)을 포함한다. 방사선동위원소 금속 이온의 예로는 ¹¹¹In, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ⁸⁹Zr 및 ²⁰¹Tl을 포함한다.

본 발명의 변형된 항-PA IgGs는 또한 자기공명 영상(MRI)을 사용하거나 또는 전자 스핀 공명(ESR)을 통한 진단용 상자성 동위원소(paramagnetic isotope)로 표식화될 수 있다. 양전자-방출 감마 방사선동위원소(positron-emitting gamma radioisotopes), 가령 ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁶⁸Ga, ⁵²Cr 및 ⁵⁶Fe가 사용될 수 있다.

본 발명의 IgGs는 질병 치료의 전개를 모니터하기 위하여 시험관내 또는 생체내에서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 탄저균 독소에 의한 표적인 세포의 수의 증감을 측정하거나 또는 생물학적 시료내 PA 독소 농도의 변화를 측정함으로써 사용된다.

본 발명의 목적은 바실러스 안트라시스에 의해서 감염될 가능성이 있는 개체, 바람직하게는 사람의 치료 방법을 제공하며, 본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체의 치료적 유효량이 상기 개체로 투여된다.

본원에서 사용되는, "치료적 유효량(therapeutically efficient amount)"이라는 표현은 치료를 필요로 하는 개체에 투여될 때 치료를 실행하는데 충분한 양을 의미하는 것이다. 치료적 유효량은 개체, 치료할 질병의 단계, 및 투여 방법에 따라 좌우되며, 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에 의해서 통상의 절차를 통해 결정될 수 있다.

본원에 사용되는, 용어 "탄저병(anthrax)"은 바실러스 안트라시스에 의한 감염에 의해서 직접 또는 간접적으로 원인이 되는 질병을 의미하는 것이다. 흡입 감염(inhalational infection)의 초기 증상은 코감기(열, 근육통 등)의 증상과 유사하다. 몇일 후에, 상기 증상은 호흡기 통증 및 패혈성 쇼크(septic shock)와 같은 심각한 문제로 발전한다. 탄저균을 흡입하는 것은 통상 치명적이다.

탄저균의 피부 감염은 선재성 피부 열극(preexisting cutaneous interstice)을 통해서 박테리아가 피부로 침투하였을 때 발생한다. 상기 감염은 초기에는 구진을 형성하고 2-3일내에 수포로 발전한 후에 중심 괴사 영역(central necrotic area)을 갖는 1-3 cm의 궤양으로 발전한다. 탄저균 위장관 감염은 오염된 고기의 섭취로부터 기인하며, 급성 장염을 일으키는 것이 특징이다.

치료적 유효량은 질병의 증상 및 감염 진행을 감소시키기에 충분한 양에 해당한다. 상기 양은 개체의 나이와 성별 및 질병의 단계에 따라 좌우되며, 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에 의해서 결정될 수 있다. 치료적 유효량은 1일 또는 그 이상동안 하루 1회 또는 수회투여로 0.01-50 mg/kg, 바람직하게는 0.1-20 mg/kg, 더 바람직하게는 0.1-2 mg/kg으로 다양할 수 있다.

투여 방법은 주사 또는 점진적 주입(gradual infusion)될 수 있다. 주사는 혈관내(intravenous), 복강내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous) 또는 경피(transdermal) 타입을 가질 수 있다.

비경구 투여(parenteral administration)용 제제는 멸균 수성 또는 비(非)수성 용액, 현탁액 또는 유화액을 포함할 수 있다. 비(非)수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 가령 올리브 오일, 또는 주사용 유기 에스테르, 가령 에틸 올레에이트를 포함한다. 수성 담체는 물, 알콜/물 용액, 유화액 또는 현탁액을 포함한다.

본 발명의 추가적인 목적은 치료제와 직접 또는 간접적으로 결합된 본 발명의 IgG를 포함하는 면역접합체를 제공하는데 있다.

상기 치료제는 화학제, 방사성 핵종(radionuclides), 면역치료제, 사이토킨(cytokines), 케모킨(chemokines), 독소 또는 효소 저해제를 포함한다. 기술된 독소의 예로는 디프테리아-독소 사슬 A, 엑소톡신 사슬 A, 리신(ricin) 사슬 A, 아브린(abrine) 사슬 A, 모데신(modeccin) 사슬 A, 알파-사르신(alpha-sarcin), 아로라이트 포르디 단백질(Aleurite fordii proteins), 디안틴 단백질(dianthin proteins), 피토라카 아메리카나 단백질(Phytolaca americana proteins), 모모디카 차란티아 저해제(momordica charantia inhibitor), 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스 저해제(sapaonaria officinalis inhibitor), 겔로닌(gelonine), 미토겔린(mitogelline), 레스트릭토신(restrictocine), 페노마이신(phenomycine), 에노마이신(enomycine) 및 트리코테센(tricothecenes)이 있다. 방사성 핵종의 예로는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re를 포함한다.

유익하게, 본 발명의 IgG는 테트라사이클린계 예방적 처치에 관련된다. 본 발명의 IgG는 위험에 노출된 후에 안전한 방식으로 테트라사이클린계 급속 처리("단기 처리")후 본 발명의 IgG 주입(처치)을 통해 정지(중단)시킴으로써 테트라사이클린계 예방을 단축시킬 수 있다.

유익하게도, 본 발명의 IgG는 시프로플록사신과의 치료적 처치와 관련된다.

본 발명은 항-PA IgG 제제예로 언급되는 하기 상세 보충물을 사용하여 더 용이하게 이해될 것이다.

하기 실시예의 설명을 위해서 이하에 도면을 첨부하였다.
도 1: 영역 VKV2(표 1에 기술된 돌연변이를 포함하는 본 발명의 IgG의 경쇄 가변 영역)의 확대도.
도 2: 영역 VHV2(표 2에 기술된 돌연변이를 포함하는 본 발명의 IgG의 중쇄 가변 영역)의 확대도.
도 3: 벡터 CHK463-23 지도.
도 4: 벡터 HK558-12 지도.
도 5: IgG 35PA83 v2(표 1 및 표 2에 기술된 돌연변이를 포함하는 본 발명의 IgG)에 의한 예방적 처치 결과. 2　mg/kg의 IgG 35PA83 v2는 60%의 생존율을 수득할 수 있고, 5　mg/kg은 100%의 생존율을 수득할 수 있다. 30일까지 새로운 사항이 관찰되지 않았다.
도 6: 테트라사이클린에 의한 예방적 처치 결과. 테트라사이클린 투여는 7일 후에 중단되었고, 치료 중단후 4일에서 7일 사이에 모든 마우스가 사망했다.
도 7: IgG 35PA83과 상보적이거나 또는 상보적이지 않은 독시사이클린에 의한 예방적 처치 결과. 테트라사이클린계 치료(하루 투여량 5 mg/kg)는 A/J 마우스에서 시작되었다. 12시간후에 스테른 균주 포자(Sterne strain spores)의 10000 LD₅₀으로 동물들을 감염시켰다. 테트라사이클린 주사는 35PA83의 주사(1 또는 2　mg/kg)의 존재 또는 부재하에 치료 7일에 중단하였다. 도면에 도시된 시간(500시간)을 넘어서까지 특별한 사항이 관찰되지 않았다. "***"표시로 도면에서 높은 유효성 효과가 나타난다.
도 8: 시프로플록사신계 처치, IgG 35PA83 v2 또는 두 처치의 조합된 형태로 처치. 단독으로 사용된 시프로플록사신 또는 IgG 35PA83 v2는 실질적으로 생존율이 없고 반면에 두 분자들의 조합물은 생존율이 80%이다. 30일까지 새로운 사항이 관찰되지 않았다.
도 9: IgG 35PA83과 상보적이거나 또는 상보적이 아닌 시프로플록사신으로 처치. A/J 마우스는 1000 LD₅₀의 스테른 포자로 감염된다. 2개의 개별 그룹에서 (각 그룹은 10마리의 동물로 이루어짐) 감염되고 12시간후에, 시프로플록사신계로 단독 처리한 것은 5일 동안 개시되었거나(1일 2회 25　mg/kg), 또는 IgG 35PA83 (10　mg/kg)의 1회 투여로 주입되었다. 감염되고 3개의 다른 시간(12시간, 24시간 또는 48시간)에서(각 시간은 다른 동물 그룹에 의해서 나타냄), 시프로플록사신계 처치(5일동안 1일 2회 25　mg/kg) + IgG 35PA83의 1회 주사(10　mg/kg)의 조합된 형태로 마우스를 처치하였다. 도면에서 기술된 기간을 넘어선 시간(150 시간)동안 특정한 사항은 관찰되지 않았다. "*"(p=0.03) 또는 "**"(p=0.0007)의 표시로 도면에서 유효성 효과가 나타났다.
도 10: IgG 35PA83에 의한 수동 예방적 처치(passive prophylactic treatment) 결과. 35PA83의 1회 주사(2　mg/kg 또는 5　mg/kg)가 감염(10000 LD₅₀)되기 12시간 전에 투여되었다. 30일 이상 살아남은 마우스는 30일에 재감염시켰다(10000 LD₅₀). 도면에서 기술된 기간(40일)을 넘어서까지 특정한 사항이 관찰되지 않았다. "***" 표시로 도면에서 높은 유효성를 나타낸다(p=0.0001).
도 11: 돌연변이되지 않은 35PA83 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 pearl-on-a-string 배열.
IMGT pearl-on-a-string 배열은 IMGT 명명법에 따른다. 포인트는 35PA83과 가장 유사한 사람 유전자와 35PA83에서의 차이를 나타낸다. 해치된 서클(hatched circles)은 IMGT 명명법에 따라 결여된 위치에 해당한다.
도 12: 종래문헌의 참조 도.

실시예

실시예 1: Fab (35 PA83 ) 돌연변이체 라이브러리의 구조

재료 및 방법

E. coli 균주

하기의 E. coli 균주가 사용되었다:

- XL1 (Stratagene, the jolla, CA): recA1, endA1, gyrA96 thi-1 hsdR17 sup E44 relA1 lac [F'proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)].

- SURE (Stratagene): e14(McrA)Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F'proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]

- HB2151 (Carte and al., 1985)(수용성 Fabs의 발현을 위해서 사용됨).

독소

탄저균 독소(PA83, LF 및 EF)는 List laboratories에서 얻었다..

돌연변이체 35 PA83 라이브러리의 구조

면역글로불린 단편 35PA83의 인간화(humanized) 돌연변이체를 구성하였다. 상기 돌연변이체는 표 3 및 표 4 및 5에 기술된 돌연변이화를 실시함으로써 수득되었다.

인간화 35PA83 경쇄 돌연변이

잔기번호	35PA83	Hu35PA83
1	None	A
2	None	I
3	None	Q
4	None	L

인간화 35PA83 Fd 돌연변이

잔기번호	35PA83	Hu35PA83
1	None	Q
2	None	V
3	None	Q
4	None	L
5	None	Q
6	None	E

인간화된 돌연변이를 시작으로, 유전자 35PA83으로부터 유래된 돌연변이체 항체 라이브러리를 Massive mutagenesis

방법으로 생산하였다(Biomethods, Evry, France). NNS 코돈을 사용하여 중쇄 및 경쇄의 CDRs에 돌연변이체를 도입하였다(N은 A, T, G 또는 C를 암호화하고, S는 G 또는 C를 암호화함). CDR 영역은 Kabat 등(Wu and Kabat 1970) 및 IMGT (Lefranc, Pommie and al. 2003)의 방법에 따라 정의된 것이다.

전기천공법(electroporation)으로 SURE 세포에 DNA 라이브러리를 형질전환하였다. 카르베니실린-보충 SB 배지를 배양액에 첨가하고 37 ℃에서 1시간동안 배양한 후에, 1 ml의 파아지 헬퍼(phage helper) VCSM13 (Andris-Widhopf and al., 2001) (대략 10¹² pfu)를 배양액에 첨가하였다. 2시간 동안 배양한 후에, 70 ㎍/ml의 카나마이신을 첨가하고, 배양액을 37 ℃에서 한밤동안 교반하였다.

파아지 디스플레이( phage display )에 의한 항체의 선별

PEG 침전 방법으로 파아지-Fab 입자를 정제하고 50 ml의 배양액을 농축한 후에, 3 ml의 1% PBS-BSA -0.02% 아지드(azide)에 재현탁하여, 0.45 ㎛-필터에서 여과하였다. 상기 파아지 제제의 역가(titer)는 약 10¹⁰ pfu/ml이었다. 종래에 기술된 바와 같이(Andris-Widhopf, Rader and al. 2000), 각각 5번, 10번 및 15번 세척하는 것에 해당하는 3가지 감염-선별 회수 사이클(three infection-selection recovery cycles)에 파아지-Fabs를 처리하였다.

수용성 Fab 의 발현, 주변 세포질 추출 및 정제

각 DNA 돌연변이체를, 수용가능하도록 화학적으로 제작된, 소위 HB2151로 불리는 E. coli 균주의 박테리아에 형질전환하였다. 상기 세포를 50㎍/ml의 카르베니실린 및 0.1%의 글루코스를 포함하는 1L의 SB 배지에서 250 rpm으로 교반하면서 30℃에서 배양하였다. λ=600 nm에서 배양액의 흡광도가 1.5에 다다를 때, 22 ℃에서 18시간 동안, 1 mM IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드)에 의한 (발현)유도(induction)를 시행하였다.

Fabs를 폴리믹신 B 설페이트(Sigma)로 추출하고 제조사의 설명서(사용설명서)에 따라 니켈 컬럼(Ni-NTA 스핀 컬럼, QIAGEN, Valencia, CA)상에서 정제한 후, 4℃에서 3시간 동안 PBS 1X로 투석하였다.

수용성 Fabs 의 정량화

SDS-PAGE를 통해 Fab 순도를 테스트하고, 이의 농도는 소프트웨어 Quantity One

(Biorad) 상에서 결정하였다.

표면 플라즈몬 공명( SPR )의 실시간 측정

PA83 돌연변이체와 35PA83 돌연변이체 사이의 상호작용에 대한 카이네틱 상수(kinetic constants)를 시스템 Biacore X SPR (BIAcore, Uppsala, Sweden)을 사용하여 결정하였다. 아민 결합 반응을 사용하여 CM5 민감성 칩(sensitive chip)(Biacore)에 10 mM의 아세트산나트륨(pH 4.5)에 용해된 2㎍/ml의 PA83 30 ㎕를 주입하여 칩상에 PA83을 고정하였다. 재결합 가능성을 최소화하기 위하여, 높은 유속(30　㎕/분)으로, 최소 함량(대략 500 RU, 공명 유닛)의 결합 항원을 사용하여 KD값을 측정하였다. 30㎕/분의 유속에서, 5-400 nM 범위의 다양한 농도로 PBS에 현탁된 Fab에 대한 결합 비율이 측정되었다. BIA 평가 소프트웨어 (Biacore)의 Langmuir 1:1 모델에 결합 데이터 값을 도입하였다. PA83으로의 Fab의 결합에 대한 결합 상수 및 해리 상수(각각 k_on 및 k_off)는 35 ℃에서 결정되었다.

서열 분석

ompseq 및 newpelseq 프라이머(Andris-Widhopf, Rader and al., 2000)를 사용하여 게놈 발현 서열화(Genome Express sequencing(Meylan, France))로 선별된 클론의 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 결정하였다. 서열은 IMGT 시스템을 사용하여 온라인으로 분석하였다. (http:/imgt.cines.fr).

결과

시험관내 친화도 성숙(in vitro affinity maturation)을 실시하여 향상된 친화도를 갖는 신규한 돌연변이체를 생산하였다. 상기 목적을 위해서, 73 위치에 위치한 잔기인, 6 CDRs의 잔기들 만을 돌연변이시켜 돌연변이체 라이브러리를 제작하였다. 상기 라이브러리의 크기는 5.4×10⁸ 형질변형체(transformants)를 포함하였다. 45개의 독립적인 플라스미드 클론이 서열화되었으며, 다양성(diversity) 및 돌연변이율이 결정되었다. 실험에 의한 돌연변이율은 3 돌연변이/단편(VH+VL)에 해당하며, PA에 대한 친화도가 향상된 돌연변이 조합체를 직접 선별할 수 있다.

선별된 라이브러리와 비교하여, 선별되지 않은 라이브러리의 표적 CDR내 각 위치에서 돌연변이 빈도를 분석함으로써 몇개의 위치가 변이에 내성이 없는 것이 알 수 있었다(표 1). 그러므로, 상기 위치에 위치한 잔기는 항원에 결합하기 위한 중요 잔기인 것으로 보이며, 항원-결합 자리를 그대로 보존한다. 특히 CDR1의 (H31-H40)잔기는 항원-접촉 잔기로서 확인되었다.

선별 과정 중에 실질적인 선별 압력이 발휘된다면, 선별되지 않은 라이브러리가 선별된 서열, 특히 L-CDR1 및 H-CDR1에 비해 더 넓은 다양성을 갖는 것으로 보인다.

모든 돌연변이된 위치 중에서, 돌연변이들의 조합은 표 3에 제공된 친화도로서, 클론 v2, 결합 친화도 및 카이네틱스가 크게 향상된 것을 보여주었다.

Fab 35PA83 및 클론 v2에 대한 결합 친화도 및 카이네틱스

모체 클론	서열 H	서열 L	KD (M)	Kon (M-1.s-1)	Koff (s-1)
35PA83	모체타입	모체 타입	3.4×10^-9	9.3×10⁴	3.2×10^-4
클론 v2	G>S (31A)	모체 타입	6.6×10^-10	1.22×10⁵	8.1×10^-5
	R>K (66)
	K>R (73)

결합상수(k_on)와 해리상수(k_off)는 표면 플라즈몬 공명(BIAcore)을 통해 결정되며, K_D는 K_off/K_on 비율에 상응하도록 산출되었다.

V2 3중 돌연변이체는 35PA83보다 더 낮은 해리 상수(K_off = 8.1×10⁵ s-1) 및 약간 더 빠른 결합상수(K_on = 1.22×10⁵ M-1.s-1)를 나타내었으므로, 친화도에 5.15를 곱하였다. 상기 돌연변이체는 중쇄 가변 도메인에서 H-CDR1내 하나의 돌연변이(G31AS)(중쇄 가변영역의 CDR1) 및 H-CDR2의 두개의 돌연변이(R66K, K73R)(중쇄 가변 영역의 CDR2)의 3개의 돌연변이를 포함한다.

제3 사이클 이후에, 2가지의 추가적인 선별 방법에 따라 파아지를 스크리닝하였다: 항원-코팅된 웰에서 장기간 배양하여 팬닝하는 방법("long-lasting incubation selection") 또는 매우 낮은 농도에서 수용성의 바이오티닐화 항원을 사용하는 방법("very low concentration soluble antigen selection").

실시예 2: 원숭이-사람 키메라 IgG 35 PA83 v2 의 발현을 위한 발현 벡터 HK558-12의 제조

선별된 돌연변이체(v2)의 중쇄 가변 영역(VH)은 Fab 35PA83의 인간화 돌연변이체와 비교하여 3가지의 돌연변이를 포함한다: G→＞S (IMGT 명명법에 따라 HI의 6번째 잔기), R→＞K (H2의 2번째 앵커링 잔기(anchoring residue)) 및 K→＞R (IMGT 명명법에 따라 FR3의 6번째 잔기).

벡터 HK558-12(도 4 참조)는 "이중" 키메라화("double" chimerization)를 통해서 최적의 유일한 제너릭 벡터 CHK463-23-1 (도 3 참조)로부터 구성되었으며, 이는, 즉 5'에 원숭이 v2 서열 사람 리더 영역(cynomolgus sequence human leader regions) (플라스미드 pCOMB에 클론된 v2 서열(Andris-Widhopf and al., 2000)은 리더 서열을 포함하지 않음) 및 3'에 사람 불변 영역 CK 및 G1이 삽입되어 있다.

1. 방법의 원리

분자 생물학의 종래 기술은 벡터 HK558-12의 제조에 대해서 실시되어 왔다. 목적하는 DNA 서열은 어젬블리 PCR을 통해서 증폭되고(효소 "Proofstart DNA polymerase" Qiagen ref. 202　203에 의한 10회 사이클), 플라스미드 또는 발현 벡터에서 (제한 효소로 분해한 후에 라이게이션) 클로닝된다. 그러므로 수득된 재조합 플라스미드를 증폭(박테리아의 배양)하기 위해, 박테리아(박테리아의 형질전환)에 도입하여 형질감염시키는 단계에 충분한 양으로, 벡터를 제조하였다. 박테리아 배양과정 중에 수득된 벡터가 정제되어 지고, 이후 YB2/0 및 CHO 세포주에서 형질감염의 기대치로 선형으로 나타낸다.

1.1. 어젬블리 PCR 을 통한 돌연변이 v2 ( VKv2 )의 경쇄 가변 영역의 합성

영역 VKv2는 하기 영역의 키메라화에 해당한다:

- 경쇄 가변 영역의 리더(VK) - 개시 VK: 사람 서열 Z0006 (승인번호)

(서브그룹 VK1, VK1-13), 선별 CRSSA-IMGT:

- VK 원숭이(Laffly 등, 2005의 논문에 기술된 플라스미드 pComb3X, v2의 VH 및 VL 서열을 포함함).

VK 원숭이의 5'에 사람의 리더 서열을 첨가한, 하기 서열을 제공한다:

ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTG (서열번호 13)

(이탤릭체: 개시 사람 VK)

상기 서열은 클로닝 방법에 사용되는 제한 효소 자리를 포함하지 않는다.

영역 VKv2의 증폭:

▷프라이머 쌍 VK1_CA 및 VK2_CA

VK1_CA: 5'-CTCAGTACTAGTGCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCT-3' (서열번호 14)

VK2_CA: 5'-ACCTGGGAGCCAGAGCAGCAGAAGCCCCAGGAGCTGAGCGGGGA-3' (서열번호 15)

상기 프라이머 쌍은 v2의 서열과 가장 유사한 사람 VK 리더(VK1-13 Z00006, 승인번호)에 해당하는 리더 서열의 개시 영역 및 Spe　I 자리를 도입할 수 있다.

수득된 증폭산물(amplicon)은 증폭산물 1(78 pb)에 해당한다.

▷프라이머 쌍 VK3_CA 및 VK4_CA

VK3_CA: 5'-TGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCA-3' (서열번호 16)

VK4_CA: 5'-CTCCCACATATGCAGACAGGGACGATGGAGACTGGGTCAACTGGA-3' (서열번호 17)

상기 프라이머 쌍은 보유하고 있는 리더 서열, 예를 들어, 사람 VK(VK1-13 Z00006)의 영역 5' 및 v2의 VK의 개시 영역을 도입할 수 있다. 수득된 증폭산물은 증폭산물 2(75pb)에 해당한다.

▷프라이머 쌍 VK1_CA 및 VK4_CA

VK1 _ CA : 5'-CTCAGTACTAGTGCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCT-3' (서열번호 18)

VK4 _ CA :

5'-CTCCCACATATGCAGACAGGGACGATGGAGACTGGGTCAACTGGA-3' (서열번호 19)

상기 프라이머 쌍은 증폭산물 1 및 증폭산물 2를 어젬블리 PCR하여 증폭산물 3(136 pb)을 수득할 수 있다.

▷프라이머 쌍 VK_CA_Nde 및 VK_CA_Dra

VK _ CA _ Nde : 5'- TCGTCCCTGTCTGCATATGTGGGAG -3' (서열번호 20)

VK _ CA _ Dra : 5'-GATGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATATCCAG-3' (서열번호 21)

상기 프라이머 쌍은, 플라스미드 pCOMB v2를 주형으로하여, 증폭산물 4(327 pb)를 수득할 수 있다. 또한, 증폭산물 4는 사람 영역 VK를 상위에 포함하며, 이는 증폭산물 3과 최종 어젬블리 PCR을 수행할 수 있다.

▷프라이머 쌍 VK1_CA 및 VK_CA_Dra

VK1 _ CA : 5'-CTCAGTACTAGTGCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCT-3' (서열번호 22)

VK _ CA _ Dra : 5'-GATGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATATCCAG-3' (서열번호 23)

상기 프라이머 쌍을, 증폭산물 3 및 증폭산물 4의 어젬블리 PCR에 이용하면 증폭산물 5(438 pb)를 수득할 수 있다. 이에 의해 사람의 리더 서열 VK 및 VK 원숭이 서열을 연쇄(concatenation)할 수 있다.

수득된 프라이머 및 증폭산물 서열은 도 1에 개시하였다.

증폭산물 3은 증폭산물 1 및 증폭산물 2의 어젬블리 PCR에 의해서 수득되며, 부위 Spe I자리, 사람의 리더 서열 VKe 및 v2의 서열 VK의 개시, 영역이 도입된다. 증폭산물 4는 v2의 VK 암호화 서열에 해당한다.

최종 증폭산물 5는 사람의 VK 리더서열 및 VK 원숭이 서열을 연쇄할 수 있는 증폭산물 3 및 증폭산물 4의 어젬블리 PCR에 의해서 수득된다.

1.2 돌연변이체 v2 ( VHV2 )와 중쇄 가변 영역의 어젬블리 PCR 에 의한 합성

영역 VHv2는 하기 영역의 키메라화에 해당한다:

- 리더 VH - 개시 VH: 사람의 서열 M29812 (승인번호) (서브그룹 VH4, VH4-59). 35PA83에 가장 유사한 서열을 암호화하는 사람의 유전자 V: 상술된 바와 같이 돌연변이화된, Fd에 대한 IGHV4-59*01 및 경쇄에 대한 IGKV1-13*02 (IMGT 명명법)

- 원숭이 VH (플라스미드 pComb3X)

원숭이 VH의 5'에 사람의 서열을 첨가한, 하기의 서열을 제공한다:

ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGT (서열번호 24)

(이탤릭체: 개시 사람 VH)

도 2는 수득된 증폭산물 및 다양한 프라이머 쌍을 갖는 영역 VHV 2의 합성을 보여준다.

1.2.1 영역 VHV2 의 증폭

영역 VHV2의 증폭은 도 2에 도시하였다.

▷프라이머 쌍 VH1_CA 및 VH2_CA

VH1 _ CA : 5'-CTCAGTGCTAGCGCCGCCACCATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCT-3' (서열번호 25)

VH2 _ CA : 5'- CCCATCTGGGAGCTGCCACCAGGAGAAGGAAGAACCACA -3' (서열번호 26)

상기 프라이머 쌍은 v2의 서열과 가장 유사한 사람의 리더 VH(VH4-59 M29812, 35PA83과 가장 유사한 서열을 암호화하는 사람 유전자 V: 상술된 바와 같이, Fd에 있어서 IGHV4-59*01 및 경쇄에 있어서 IGKV1-13*02(IMGT 명명법)로 돌연변이된, 해당하는 리더 서열의 개시 및 Nhe I 제한 효소 자리를 도입할 수 있다. 수득된 증폭산물은 증폭산물 1(70 pb)에 해당한다.

▷프라이머 쌍 VH3_CA 및 VH4_CA_mut

VH3 _ CA : 5'-TGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGG-3' (서열번호 27)

VH4 _ CA _ mut : 5'- CAGTCCTGGTCCCGACTCCTGCAGCTGCACCTGGG -3' (서열번호 28)

상기 프라이머 쌍은 보유하고 있는 리더 서열, 예를 들어, 사람의 VH ( VH4 M29812)의 영역 5' 영역및 v2 의 서열 VH 의 개시 영역을 도입할 수 있다. 프라이머 VH4_CA를 돌연변이시켜 , VH 의 개시영역의 Apa 　I 제한효소자리를 결손하였다 . 수득된 증폭산물은 증폭산물 2(59 pb )에 해당한다.

▷ 프라이머 쌍 VH1 _ CA and VH4 _ CA _ mut

VH1 _ CA : 5'-CTCAGTGCTAGCGCCGCCACCATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCT-3' (서열번호 29)

VH4 _ CA _ mut : 5'- CAGTCCTGGTCCCGACTCCTGCAGCTGCACCTGGG -3' (서열번호 30)

상기 프라이머 쌍을 이용하여, 증폭산물 1 및 증폭산물 2를 어젬블리 PCR을 실시하여, 증폭산물 3(111 pb)을 수득할 수 있다.

▷프라이머 쌍 5VH_CA_mut 및 3VH_CA_Apa

5 VH _ CA _ mut : 5'- CAGCTGCAGGAGTCGGGACCAGGACTG -3' (서열번호 31)

3 VH _ CA _ Apa : 5'- ACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGAC -3' (서열번호 32)

상기 프라이머 쌍은 플라스미드 pCOMB V2 를 주형으로 하여 증폭산물 4(392 염기)를 수득할 수 있다. 또한, 증폭산물 4는 사람의 영역 VH 를 상위에 포함하며, 이는 최종 어젬블리 PCR 을 수행하게 할 수 있다.

▷ 프라이머 쌍 VH1 _ CA 및 3 VH _ CA _ Apa

VH1 _ CA : 5'-CTCAGTGCTAGCGCCGCCACCATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCT-3' (서열번호 33)

3 VH _ CA _ Apa : 5'- ACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGAC -3' (서열번호 34)

상기 프라이머 쌍을 이용하여, 증폭산물 3 및 증폭산물 4의 어젬블리 PCR을 실시하여 증폭산물 5(476 pb)를 수득할 수 있다. 사람의 VH와 원숭이의 VH 리더 서열을 연쇄할 수 있다.

생산된 프라이머 및 증폭산물 서열은 도 2에 개시되어 있다.

증폭산물 3은 증폭산물 1 및 증폭산물 2을 어젬블리 PCR을 수행하였으며, Nhe I 제한효소자리, 사람의 VH 리더서열 및 v2의 서열 VH의 개시영역이 도입된다. 증폭산물 4는 v2의 VH 암호화 영역에 해당한다.

최종 증폭산물 5는, 증폭산물 3 및 증폭산물 4을 어젬블리 PCR을 하여 수득할 수 있으며, 사람의 VH 및 원숭이의 VH 리더 서열을 연쇄한다.

1.3 최종 벡터의 서열화 및 FDA ( Food and Drug Administration )에 의한 검증

서열화(sequencing)는 Sanger의 방법(또는 method of the chain terminators, ref.: Sanger F. and al, 1977, PNAS 74: 5463)을 통해서 실시된다.

상기 기술은, 디데스옥시뉴클레오티드(ddNTP) 또는 "종결자(terminators)"를 램덤 혼입을 포함하며, 모든 단편 말단은 고정말단(서열화 프라이머의 고정된 영역)에서 부터 해당 염기(A, C, G 또는 T)가 생산된다. 생산된다. 자동화 서열기(크기-관련 분리 및 검출)상에서 상기 단편을 분석하여, 다양한 염기의 순서 및 해당 DNA의 서열을 정의할 수 있다.

서열화 방법은 FDA 품질 등급에 따라 실시된다. 상기는 높은 품질 수준이며, 서열화된 DNA의 이중가닥 이중 커버율(double-stranded double coverage rate), 4배의 최소 중복(minimal redundancy), 100% 정확도, 전용 도구(dedicated tool), 품질 보고 출판(quality report publishing) 및 작성된 서류의 기록 보관(archival storage)이 있다.

서열화한 다음, 제공된 서열(software AlignX, Vector NTI, In)을 정렬하여 이론적으로 기대된 서열과 비교하였다.

1.4 PCR 스크리닝 프라이머

▷프라이머 5prsvbis

5'- GCTCGATACAATAAACGCCA -3' (서열번호 35)

TU(전사단위;transcription unit) 인트론 K 또는 H에 대한 프라이머는 CK4 또는 GSP2AN가 사용되며, 클로닝된 후에, VK 삽입(781 pb 증폭산물) 및 VH 삽입(821 증폭산물)이 검출된다.

▷프라이머 CK4

5'- TCTGGGATAGAAGTTATTCAG -3' (서열번호 36)

사용된 사람의 불변 영역 CK의 5'에 대한 프라이머는, 5prsvbis로 가 사용되며, 클로닝 이후에 VK 삽입을 검출할 수 있다.

▷프라이머 GSP2ANP

5'- GGAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG -3' (서열번호 37)

사람의 불변 영역 G1의 5'에 대한 프라이머는 5prsvbis가 사용되면, 클로닝 이후에 VH 삽입을 검출할 수 있다.

1.5 중간체 벡터 K558 -12

1.5.1 벡터 CHK463 -23에서 클로닝

본 단계는 IgG 35PA₈₃ v2의 카파 사슬의 원숭이-사람 키메라화를 실시할 수 있다.

어젬블리 PCR을 통한 증폭 및 Spe I 및 Dra III을 이용한 절단 이후에, 벡터 CHK463-23의 단독 부위인 Spe I 및 Dra III 자리내에 에서 서열 VKv2를 클로닝하였다.

라이게이션 이후에, 프라이머 5prsvbis 및 CK4 (781 pb 증폭산물)가 PCR에 의해 삽입 되었는지를 재조합 콜로니를 스크리닝하여 검출하였다.

PCR에 의해 스크리닝된 23개의 박테리아 클론중에서, 20개가 재조합된 것이며, 삽입 VKv2를 운반하였다. 플라스미드를 정제한 후에, 클론 1-8를 제한효소 Nde　I (8536, 1246, 943 염기), Dra III (선형화) 및 Spe I (선형화)를 처리하였다.

1.5.2. 중간체 벡터 K558 -12의 영역 VKv2 의 서열화

8개의 확인된 재조합 클론을 프라이머 CK4를 이용하여 서열화하였다. 클론 2, 3, 4, 5 및 8은 Spe I과 Dra III 사이의 클로닝 자리에 정확히 서열화 되었다. 그러나, 클론 1 및 6은 돌연변이를 포함하고, 클론 7은 처리가능한 결과를 내지 못했다.

발현 벡터 HK558-12의 구성은 클론 55806231-2에 클론하여 유지시켰다.

1.6 최종 벡터 HK558 -12

1.6.1. 벡터 K558 -12에서 클로닝

본 단계는 항체(IgG 35PA₈₃ v2)의 중쇄의 원숭이-사람 키메라화를 실시한다.

어젬블리 PCR에 의한 증폭 및 Nhe I 및 Apa I 제한효소 절단 후에, 중간매개 벡터 K558-12의 유일한 부위인 Nhe I 및 Apa I 사이에 서열 VHv2을 클로닝하였다. 라이게이션 이후에, 프라이머 5prsvbis 및 GSP2ANP (821 pb 증폭산물)을 사용하여, PCR에 의해 재조합 콜로니를 스크리닝하여 서열 삽입을 검출한다. PCR에 의해 스크리닝된 22개의 박테리아 클론중에서, 18개는 재조합된 것으로, 삽입 VHv2를 운반한다.

1.6.2. 최종 벡터의 영역 VHv 2의 서열화 및 제한효소처리

플라스미드를 정제한 후에, 클론 1-5, 7, 9 및 11을 프라이머 GSP2ANP를 이용하여 서열화하였다.

클론 2, 4, 7 및 9는 부위 Nhe I과 Spe I 사이의 정확한 서열을 가지며, 4개의 다른 클론은 돌연변이를 포함한다.

클론 2, 4, 7 및 9를 제한효소 처리하였다. Nhe I (선형화), Apa I (선형화) 및 Bgl II + Nde I (2900, 2222, 1975, 1879, 1246, 934, 9 pb) 제한효소분석(restriction assay)에 의해, 4개의 클론이 예상되는 제한효소 프로파일을 갖는 것을 확인하였다.

원숭이-사람 키메라 항체(IgG 35PA₈₃)를 발현하는 클론 55806298-9를 선별하였다. 상기 벡터의 지도는 도 4에 나타내었다.

1.6.3. 절단에 의한 최종 벡터의 제어

선별된 클론 55806298-9로부터 유래된, 정제된 플라스미드를 Not I 절단(선형화) 및 Bgl II + NdeI (2900, 2222, 1975, 1880, 1246, 934, 9 pb) 이중 절단을 실시하였다.

클론 55806298-9의 제한효소 프로파일은 FDA 등급에 따라 서열하였었다. 서열은 기대되는 것과 일치하였다.

1.6.4. 형질감염을 위한 벡터 HK -558-12의 제조

TE 완충액(10　mM 트리스 pH 8 및 1　mM EDTA)내 Not I(문단 1.6.3과 비교)에 의해 선형화된 벡터 HK558-12를 현탁하여 -20 ℃에 보관하였으며, 1 ㎍/㎕로 조절한 다음 Cellular Engineering sector을 이용하여 YB2/0 및 CHO 세포주에 형질감염 시켰다.

실시예 3: 탄저균의 방어 항원에 대한 원숭이-사람 키메라 모노클로날 항체 35PA83 v2 를 생산하는 형질전환체의 제조

시험관내 및 생체내 독성-중화 활성에 있어서 글리코실화의 영향을 연구하기 위하여, 35PA83 v2 항체를 YB2/0 세포주(항체 EMABling

) 및 CHO 세포주(항체 비(非) EMABlinging

)에서 생산하였다.

이하의 실험을 위해서, ELISA 방법은 하기 조건하에서 실시된다:

미세적정 96-웰 플레이트(Microtitration 96-well plates, maxisorp, Nunc, Danemark)를 4 ℃에서 한밤동안 PBS(5 ㎍/ml, 웰당 100　㎕)에 희석한 PA로 코팅하였다. 플레이트에 200 ㎕의 PBS-BSA 5%를 첨가하여 37 ℃에서 1시간동안 블라킹하고, PBS-0.1% Tween 20-1%BSA로 연속희석한 혈청을 37 ℃에서 2시간동안 배양하였다(웰당 100 ㎕). 항-마우스 IgG 알카리성 포스파타제 콘쥬게이트 또는 "항-인간 IgG 알카리성 포스파타제 콘쥬게이트"(Sigma)를 37 ℃에서 1시간동안 배양하였다(1/10 000). 그 후 실온에서 30분동안 P-니트로페닐 포스페이트 기질을 배양하였다. 결과는 자동 마이크로플레이트 리더에 의해서 405 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다(iEMS reader MF, Labsystems, Helsinky, Finland). 반전(reversion)이 혈청 역가를 결정하는 최종 희석은 음성 대조군으로 사용된 나이브 혈청(naive serum)보다 낮은 신호를 제공하거나 동일 내지는 2배의 신호를 제공하는 혈청 역가에 의해 결정된다.

YB2/0 세포주에서 형질전환체의 제조 도는 본 명세서 마지막의 표 4 및 5에 기술되었다.

1.1.형질전환 정량

▷형질전환율(transformation rate)

형질전환율은 선별배지에서 D+3에 배양하고 5주후에 P96에서 세포성장율에 근거하여 평가되었.

선별 제제 G418에 의한 단일 선별을 실시할 때, 형질전환율은 약 1/500 내지 1/900이다. 선별 제제 G418 및 MTX (메토트렉세이트)에 의한 이중 선별의 경우에, 1/2200보다 더 높다.

▷평균 생산율

평균 제조를 평가하기위한 최대 생산(D+7)을 수득하기 위하여 8개의 P24 웰의 3개의 풀(pool)을 준비하였으며, 상기 웰은 세포로 3/4까지 채웠다.

상기 풀은 해당 개체의 실측 값을 평가하여, 최소값을 얻었으며, 형질전환체에 관련된 데이터가 아직 이용가능하지 않다는 것을 확인하였다.

벡터 HK558-12 및 벡터 대조군 조합물(vector control combination)의 평균 생산은 각각 1.2 ㎍/ml 및 3.3 ㎍/ml이다.

1.2. 클로이드 선별( Cloide selection )

▷생산율: 가장 제조적인 클로이드의 제1 스크리닝

사람의 IgG의 생산은 세포의 3/4를 포함하는 이중 선별 P96 웰의 상청액을 ELISA를 이용하여 측정하였으며, 이에 의해 이들의 생산 역량에 대한 클로이드의 제1 우선순위을 수득하였다.

3번의 연속적 스크리닝(매 2일 또는 3일)이 실시되었으며, 각 스크리닝에서 10개의 최상의 제1 생산물을 얻었다. 528개의 형질전환체중에서, 27개는 P24에 계속보존하면서, 동시에 D+3에서 이들의 수득율 및 이들의 최대 생산율(D+7)에 관한 연구가 실시되었다.

▷D+3에서 수득율 및 최대 생산율(D+7)

대부분의 형질전환체는 5 pcd보다 더 높은 수득율 및 10 ㎍/ml보다 더 높은 최대 생산율으로 선별된 15개의 최상의 제1 클로이드를 선별배지(이중 선별)에서 세포 수준에서 증폭하고, 액체질소에 보존하였다.

▷푸코스율(Fucose rate)

ELISA를 이용하여 D+3 및 D+7에서 15개의 선별된 클로이드의 상청액을 푸코실화 분석(fucosylation assay)을 실시하였다.

1.3. 클로이드 DD12 의 선별 및 롤러( roller )에서 IgG 의 생산

IgG의 생산을 위해서 롤러(19L)에 클로이드 DD12를 보유시켰으며, 상기 콜로이드는 수득율(11.6 pcd), 최대 생산량(20.17 ㎍/ml) 및 푸코스율(D+3에서 26.9% 및 D+7에서 26.7%) 선별 기준에 있어서 최상의 클로이드이다.

461 mg의 정제용 항체가 생산되었다. 농축(x15) 및 정제 이후에, 351 mg의 항체를 수득하였으며, 예를 들어, 상기 양은 생체내에서 예비 분석을 실시하기에 충분하다.

1.4. 3개의 클로이드의 클로닝

3개의 최상의 제1 생산물 클로이드 DD12, FH2 및 GA11 (10 pcd보다 높은 수득율, 20 ㎍/ml보다 높은 최대 생산량 및 33%보다 낮은 푸코스율)를 제한 희석하여 클로닝하였으며 형질전환체의 가능한 불안정성을 획득하였다.

▷IgG 생산: 최상의 생산자 클론의 제1 스크리닝

사람의 IgG의 생산은, 3/4의 세포를 포함하는 P96 웰내 상청액을 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)에 의해서 측정하였으며, 이들의 생산 역량에 대한 클론의 제1 우선순위를 수득하였다.

2번의 연속된 스크리닝(7일 간격으로)이 실시하였으며, 8개의 각 클로이드의 최상의 생산자 클론를 얻었다. 수득율은 6 ㎍/ml보다 높다.

▷D+3에서 수득율

상기 24개의 클론의 D+3의 수득율이 계산되었으며, 15개의 최상의 생산자 클론, 예를 들어, 5개의 클론/클로이드가 선별되었다. 이들 대부분은 4 pcd보다 높다.

15개의 선별된 클론을 세포성 수준에서 증폭한 다음, 액체 질소에 보존하였다.

1.5. 클론 DD12 -8F2의 선별

클론 DD12-8Fd은 D+3에서의 수득율(6.6 pcd) 및 푸코스율(27.8%)의 선별 기준에 근거하여, 최상의 것으로 보였다.

클론 DD12-8F2의 특성은 이의 모체 클로이드 DD12의 특성과 가까우며, 단 수득율(D+3)에 있어서 사용된 다양한 배지때문에 더 낮다. 클론의 수득율은 균일하며, 클로이드의 안정성을 확인하였다.

1.6. CHO 세포주에서 형질전환체의 제조

CHO 세포주에서 항체 35PA83 v2를 생산하는 형질전환체의 제조에 해당하는 흐름도는 본 명세서의 마지막에 표 6 및 7에 나타내었다.

2.1. 형질전환체 정량

형질전환율(transformation rate)

형질전환율은 선별배지에서, D+3에서 배양 5주 후에 P96에서 세포성장율에 근거하여 평가되었다.

2.2. 클로이드 선별

▷생산율: 최상의 생산 클로이드의 제1 스크리닝

3/4의 세포를 포함하는 P96 웰의 상청액을 단일 및 이중 선별하여, ELISA를 이용하여 사람의 IgG의 생산은을 결정하였으며, 이들 생산 역량에 대한 클로이드의 우선순위를 얻었다.

3번의 연속적 스크리닝(매 2일 내지 4일)을 실시하였으며, 각 스크리닝에서 10개의 최상의 제1 생산물을 얻었다. 953개의 형질전환체로부터, 30개는 계속되고 P24에 계속 보존하면서, 동시에 D+4에서 이들의 수득율 및 이들의 최대 생산율(D+7)에 관한 연구가 실시되었다.

▷D+4에서 수득율 및 최대 생산율(D+7)

대부분의 형질전환체는 1 pcd보다 더 높은 수득율 및 1 ㎍/ml보다 더 높은 최대 생산율을 보였으며, 선별된 15개의 최상의 제1 클로이드 제조자를 선별배지(제제 조건에 따라 단일 또는 이중 선별)에서 세포 수준에서 증폭한다음, 액체 질소에 보관하였다.

▷푸코스율(Fucose rate)

D+7에서, 15개의 선별된 클로이드의 상청액을 ELISA에 의해서 푸코실화 분석하였다.

CHO 세포주에서 생산된 IgG의 푸코스율은 전형적으로 75%보다 더 높다.

2.3 유전자 증폭

생산율이 낮고 요구되는 양의 항체를 제조할 수 없는 형질전환체는, 유전자 증폭을 실시하여 통합된 벡터의 복제수를 증가시켜서 증폭된 클로이드의 수득율을 증가시켰다.

유전자 증폭은 3개의 클로이드(13G8, 9D4 및 8F11) 및 2개의 클로이드 그룹(4개 클로이드의 1개의 풀(PA1) 및 8개의 클로이드의 1개의 풀(PA2))에서 실시하였다. 상기 선별은 D+4에서 수득율, 최대 생산량 및 푸코스율에서 수득된 세계적인 결과를 고려하여 만들어졌다.

유전자 증폭은, G418 및 MTX를 갖는 선별 배양 배지에 세포를 이동시켜 실시되었다. 증폭 제1 단계는, MTX 비함유 제조 콜로이드에 있어서 5nM의 MTX 농도 및 10nM의 MTX를 가지고 제조된 클로이드에 있어서 40nM의 MTX 농도로 실시한다. D+4에서 IgG 가 생산되었다.

이후 증폭 단계에서, 증폭 제2 단계에서 MTX 농도를 4배 증가시키고, 증폭 3단계에서 MTX 농도를 16배 증가시킨다.

D+4에서의 생산율의 분석으로 증폭 과정중에 IgG의 생산이 증가되었음을 나타낸다. 실제로, 수득율은 유전자 증폭전에 얻어진 수득율보다 대략 4배 증가되었다.

2.4. 2개의 클로이드의 선별 및 롤러에서 클로이드 13 G8 의 제조

클로이드 13G8 및 9D4는, 증폭 제2 단계에서 최대 수득율에 도달하는 증폭 이후에 최상의 생산율을 갖는다.

그러므로, 클로이드 13G8 (20 nM MTX) 및 9D4 (160 nM MTX)를 선별배지에서 세포성 수준에서 증폭한 다음, 액체 질소에 보관하였다.

이후 푸코스율 분석은 클로이드 13G8 및 9D4로부터 유래된 정제된 IgG에서 실시되었며, 클로이드 13G8(20nM MTX)을 롤러(5.5L)에서 첨가하여 IgG를 제조하였다. 정제된 IgGs에 대한 푸코스율은 76.6%이다.

65.5 mg의 IgG가 정제를 위해서 제조된다. 정제 이후에, 46.2 mg의 항체가 수득된다.

2.5. 결론

YB2/0 세포주에서 생산될 때, 클로이드 DD12는 모든 선별 기준에서 가장 최상이었으며, l11.6 pcd의 수득율, 20.17 ㎍/ml의 최대 생산 및 약 27%의 푸코스율을 보였다..

상기 클로이드가 롤러(19L)에서 생산될 때, 26%의 푸코스율을 갖는 정제된 항체 351 mg을 수득할 수 있었다.

CHO 세포주에서 생산될 때, 클로이드 13G8 (20 nM MTX)는 모든 선별 기준에서 최상이었으며, 8.2 pcd의 수득율, 76.6%의 정제된 IgG에 대한 푸코스율을 얻었다.

상기 클로이드가 롤러(5.5L)에서 생산될 때, 84%의 푸코스율을 갖는 정제된 항체 46.2 mg을 수득할 수 있었다.

그러므로, 상기 두 세포주로부터 유래된 정제된 항체의 함량은, 제1 생체내 분석을 실시하기에 충분하였다.

실시예 4: 시험관내 중화 분석

YB2/0 세포에서 DD12의 제조 이후에, 세포 배양액에서 상청액을 회수하고, 15배로 농축하여 A-세파로스 재조합 단백질을 사용하는 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography)를 실시하였다. 제2 정제 단계가 양이온 교환 컬럼HiPrep 16/10 SP FF에 의해서 실시하였다. 정제된 IgG 무결성(integrity) 및 오염물의 부재를 SDS-PAGE 및 ELISA를 이용하여 측정한 다음, 재조합 PA83에 결합시켰다.

BIAcore^TM (Biacore Uppsala, Sweden)를 사용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용하여 친화도를 측정하였다. 제조사의 사용지시서에 E따라, 210 RU 최대에서 아민 결합을 통해 CM5 칩(Biacore)상에 PA83(List biological laboratories, Campbell, CA)을 고정하였다. 측정 과정 중에는 30 ㎕/분의 유속을 유지시켰다. 각 측정에 있어서, 농도 10-0.1 ㎍/ml을 갖는 HBS-EP 완충액(Bioacore)내 IgG의 적어도 6개의 희석액은 1900초동안 시험되었다. IgG의 각 희석 이후에, 칩은 글리신 pH1.5(Biacore)로 재생되고, 30초동안 10 ㎕/분의 유속을 갖는다. 상수는 2가 분석(bivalent analyte) 방법(Karlsson and al. 1991)에 의해서 산출하고, 내부 컨시스턴시 시험(internal consistency tests) (Schuck and al. 1996)을 통해서 확인한다.

시험관내 중화 시험(in vitro neutralization test)은 Little and al. (Little and al., 1990)에 의해서 기술된 절차에 따라 실시된다. 마우스 마크로파지 세포주 J774A.1(ATCC-LGC, Molsheim, France)가 96-웰 플레이트에서 14000 세포/웰의 농도에서 16시간동안 배양한다. 치명적 독소 400ng/ml의 PA (List laboratories) 및 40 ng/ml의 LF의 성분(각각은 PBS에서 1 mg/ml로 희석하고, 사용시까지 동결된 상태로 보관)을 동시에 IgG 또는 배지에 첨가하고, 37 ℃에서 1시간동안 배양한다. 그후 배양된 생산물을 마크로파지에 넣고 37 ℃에서 4시간동안 배양한다. Cytotox

분석(Promega)은 제조자의 사용지시서에 따라 세포의 생존 능력을 평가하기 위하여 사용되었다. 각 분석은 100%의 세포 생존 능력으로 조정하고(대조군 웰은 독소도 IgG도 포함하지 않는 것임)과, 0% 세포 생존 능력으로 조정한다(대조군 웰은 독소는 포함하지만 IgG는 포함하지 않은 것임).

결과: 측정된 IgG 35PA83의 겉보기 친화도(apparent affinity)는 80　pM이고, 측정된 50% 중화값(IC₅₀)은 0.75±0.02nM (평균±SD)이며, 1/4의 (IgG 35PA83/PA) 또는 1/2의 (IgG 35PA83 결합 부위/PA) 비율을 나타낸다.

실시예 5: 약동학적 분석

IgG 35PA83의 반감기를 평가하기 위하여, 6주령의 6마리의 A/J 마우스(Harlan, Gannat, France)가 동일한 크기의 2개의 서브그룹으로 분배하였다. 모든 마우스에 10　mg/kg의 투여량으로 일회 경피 주사에 의해서 IgG 35PA83을 주입하였다. 각각의 일자에 마우스를 선별적으로 사용하여 주입후 1일에서 6일까지 매일 안와후방 천자(daily retroorbital puncture)방법으로 혈액을 수집하고, 주입후 8일에서 10일까지 혈액을 수집하였다. IgG 35PA83의 반감기는 혈청 시료 풀에서 실시하는 ELISA 시험 결과로부터 수득된 값을 선형 외삽법에 의해서 결정한다.

ELISA 시험을 실시하기 위하여, PBS 완충액(5　㎍/ml, 웰당 100 ㎕)에 희석된 항원 PA83 또는 항원 LF (List Laboratories)로 미세적정 96-웰 플레이트 웰을 4℃에서 한밤동안 배양하여 코팅하였다. 마이크로플레이트 웰에서 유리 부위(free sites)는 37 ℃에서 1시간동안 PBS 완충액에서 소의 혈청 알부민(BSA)의 5% 용액 200㎕ 부피로 배양함으로써 블로킹하였다. 혈청의 희석은 PBS 0.1% 완충액, Tween

20의 완충액, BSA 1%의 완충액으로 혈청을 연속적으로 희석하고, 그후 37 ℃에서 2시간동안 플레이트(100 ㎕/웰)을 배양하였다. 그후 플레이트 웰을 항-마우스 IgG/알카리성 포스파타제 콘쥬게이트 또는 1/10000으로 희석된 항-사람 IgG/알카리성 포스파타제 콘쥬게이트(Sigma, Saint Louis, Missouri, United States)로 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그후 P-니트로페닐 포스페이트 기질(Sigma)을 첨가하고 플레이트를 30분동안 실험실 온도에서 배양한다. 흡광도는 자동 마이크로플레이트 리더(iEMS reader MF, Labsystems, Helsinki, Finland)를 사용하여 405nm에서 측정하였다. 제한 희석점(limit dilution point)이 정의되고, 역수값(reciprocal value)은 혈청 항체 역가에 해당하고, 상기는 나이브 마우스 혈청에 대해서 측정된 신호값에 2배되는 점이다. 나이브 마우스 혈청은 음성 대조군으로 사용하였다.

결과: A/J 마우스내 IgG 35PA83의 반감기는 7.78±1.46　일인 것으로 측정되었다.

실시예 6: 래트에서 수동 방어 분석( passive protection assays )

생체내 분석을 위하여, Fischer 쥐(중량 250-300　g) (C. River, L'Abresle, France)에 (쥐의 250 g에 대해서) 40 ㎍의 PA (List biological laboratories, Campbell, CA)와 8 ㎍의 LF가 Ezzel 등(Ezzell and al., 1984)에서 기술된 바와 같이 주사하였으며, 꼬리 혈관에서 실시하였다. 그룹당 4마리의 동물이 사용되었으며, IgG 35PA83의 평가를 위하여, 주사 전에 IgG를 PA 및 LF에 첨가하였다. 10일 동안 하루 2번씩 쥐를 관찰하였다. 본 연구에서 제시된 모든 생체내 분석은 지역 동물 실험 및 윤리 위원회에서 승인하였다.

스테른 균주 포자의 제조 및 사용:

바실러스 안트라시스 스테른 균주 포자(collection Pasteur)를 Albrecht 등 (Albrecht and al., 2007)의 문헌에 명시된 바와 같이 제조하였으며, 동결 조건(-20 ℃)하에 보관하였다. 포자는 동결 및 해동 이후에 살아 있는 플레이트를 카운팅하여 계수하고, 계수는 각 튜브가 연구에 사용될 때 입증되었다. 체중 20-25 g의 9주령의 A/J 수컷 마우스(Harlan, Gannat, France)의 정맥내 투여된 상기 포자의 LD50 값은 또 다른 연구에서 사용된 2×10⁴ 값에 가까운 1×10⁴으로 측정되었으며, 이는 48-72시간 내에 사망에 이르게 한다(Albrecht and al., 2007).

결과: 독소를 주입한 래트는 2시간내에 사망했다. 0.15 nmol의 IgG 35PA83으로 보호했을 때, 4.5시간 및 5시간에 오직 2마리의 래트만 사망했다(p = 0.045, 유효성이 고려된 유효 통계). 0.2 nmol의 IgG 35PA83이 사용될 때 4마리의 래트가 생존하였으며(유효성 효과, p = 0.03), 이는 (IgG의 항원으로의 결합 부위/PA83) 몰비 0.8에 해당한다.

실시예 7: IgG 35 PA83 v2 에 의한 예방적 처치, 테트라사이클린에 의한 단기 처치, 또는 IgG 35 PA83 v2 에 의한 예방적 처치와 테트라사이클린에 의한 단기 처치

IgG 35PA83 v2 또는 테트라사이클린에 의한 예방적 처치의 연구를 위하여, 감염되기 12시간전에 피하 경로로 10마리 A/J 마우스 그룹에 IgGs를 주사한다(5　mg/kg 또는 2　mg/kg의 1회 주사). 면역처치(challenge)는 10　000 LD50 또는 1×10⁸ 포자로서 투여되며, 마우스는 2주 동안 하루 2번 관찰하고, 추가 2주 동안 1주에 5번 관찰한다. 살아 있는 마우스는 동일한 양의 포자로 1달 후에 다시 감염시키고 추가 한달 동안 관찰하는 것으로 시험하였다. 테트라사이클린과 IgG 35PA83을 포함하는 예방적 처치의 연구에 있어서, 10마리의 마우스 그룹은 테트라사이클린 단독으로 사용하는 프로그램과 동일한 방식으로 테트라사이클린으로 처리하고 단 IgG 35PA83 v2를 면역처치(challenge) 12시간 전에 추가로 주사한다. 능동 예방(protective protection) 시험에, 10 마리의 마우스를 프런드 완전 보조제(Freund's complete adjuvant)내 마우스당 5 ㎍의 PA으로 피하경로로 주사하였다. 두번째 그룹은 동일한 주사를 맞고, 1달 후에 상기 그룹의 면역 반응이 프런드 불완전 보조제내 동일 투여량의 PA로 자극하였다.

결과: 10000 LD50의 면역처치(challenge) 12시간 전에 예방적 처치가 개시되고, 생존 곡선은 도 5 및 도 6에 개시되었다(테트라사이클린, 7일). 5　mg/kg의 IgG 35PA83이 투여된 모든 마우스는 생존했고, 2　mg/kg의 IgG 35PA83이 투여된 마우스는 60%만 생존했다(유효성, p<0.0001). 상기 생존한 16마리의 마우스로부터, 35PA83의 주사하고 한달 후에 면역처치(challenge)하고, 사람의 항-IgG 콘쥬게이트에 의한 항체가 검출되지 않았고, 그러므로 IgG 35PA83이 상기 단계에서 아직 포함되지 않은 것으로 사료된다. PA에 대한 쥣과 IgG에서 마우스 역가는 64000 내지 128000이고, LF에 대한 쥣과 IgG에서 마우스 역가는 32000 내지 64000이며, 이들은 투여된 양과는 무관하다. 상기 마우스를 10000 LD50의 스테른 균주 포자로 다시 면역처치(challenge)할 때, 초기 감염되고 한달 후에 모두 생존했다.

테트라사이클린으로 예방적 처치가 처방된 마우스들은 치료기간(7일)동안 모두 생존했다. 그러나, 상기 마우스는 항생제 투여 중단하고 4일 내지 7일내에 사망했다. 최종 주사에 1 mg/kg의 투여량으로 IgG 35PA83의 1회 주사를 보충할 때, 20%의 마우스는 생존했지만(비(非)유효성 결과), 2　mg/kg의 투여량이 사용되는 경우 모두 생존했다(유효성, p=0.008). PA의 1회 주사에 의해서 능동적으로 예방된 마우스는 1달 후에 25000 내지 50000 범위의 항-PA 항체 역가를 갖는다. 이후, 이들은 면역처치(challenge)를 하고, 10마리의 마우스 중에 6마리가 생존했다(유효성이 고려됨, p=0.01). PA의 2회 주사로 능동적으로 예방된 마우스는 2차 접종하고 1달 후에 160000 내지 640000 범위의 항-PA 항체 역가를 가지며, 모두 생존했다.

그러므로, 실시된 시험으로 IgG 35PA83 v2의 1회 주사는 테트라사이클린계 예방을 단축시킬 수 있고 항체가 예방적 처치 마지막에 2　mg/kg의 투여량으로 한번 주사할 때 마우스에서 100%의 생존율이 관찰되었다. 대조적으로, 테트라사이클린(7일)에 의한 단기 처리를 통해 방어된 마우스는 1000 LD50의 바실러스 안트라시스 스테른 균주를 주사하고, 치료를 시작하고 12시간 후에 60%의 마우스가 생존했다. 10000 LD50으로 면역처치(challenge) 이후에, 테트라사이클린이 투여된 마우스는 항생제 투여 중단하고 7일 이내, 아마도 최종 포자 발아시까지 모두 사망했다. 그러므로, 상기는 위험에 노출된 후에 테트라사이클린으로 단기 처리 이후에 IgG 35PA83을 주사를 통해 테트라사이클린에 의한 예방적 처치가 안전한 방법으로 중단될 수 있음을 입증하였다. 상기 해결책은 질환자에 의해서 섭취된 항생제를 고찰할 수 있고 투약 기간을 더 단축시키고 항생제 투여량을 더 낮춤으로써 비용을 감소시킬 것으로 예상된다.

실시예 8: IgG 35 PA83 v2 에 의한 예방적 처치, 독시사이클린에 의한 단기 처치, 또는 IgG 35 PA83 v2 에 의한 예방적 처치와 독시사이클린에 의한 단기 처치

IgG 35PA83을 사용하거나 또는 사용하지 않고, 독시사이클린에 의한 예방적 처치의 연구가 10주령의 10-A/J 마우스 그룹에서 실시하며(Harlan, Gannat, France), 항생제가 복강내 경로을 통해 예방 차원에서 5 mg/kg으로 단일 1일 투여된다. 감염되기 12시간 전에 화학적 예방(Chemoprophylaxis)을 개시하며 7일동안 계속하였고, 이는 60일인 표준 기간의 9/10 감소를 나타낸다.

사람의 표준 투여량의 대략 2배로 독시사이클린 투여가 선별되며(사람 성인에 대해서 1일 투여량 3　mg/kg), 더 적은 양으로 투여하는 것이 바실러스 안트라시 스에 효율적으로 대항하는 것이 입증되었다(Friedlander and al., 1993, J Infect Dis, Vol. 167: 1239-1243; Kalns and al., 2002, Biochem Biophys Res Commun, Vol. 297: 506-509). 더 많은 투여량이 사용되었으며(Heine and al., 2007, Antimicrob Agents Chemother, Vol. 51: 1373-1379); 그러나 50　mg/kg의 투여량은 A/J 마우스에서 내성이 잘 생기지 않는 것으로 관찰되며, 복부 팽창 및 입모(piloerection)를 겪는다. 독시사이클린에 의한 처리에 IgG 35PA83를 보충하기 위하여, 상기 항체(1 또는 2　mg/kg)의 단일 투여가 최종 독시사이클린 투여로 주입되거나 또는 동시에 주사되지 않는다. 복강내 경로에 의해서 1×10⁸ 포자를 주사하여 감염시키는 것은 10　000 LD₅₀를 나타낸다. 상기 마우스는 처음 2주동안 하루에 두번 관찰하고, 추가 2주 동안 1주에 5번 관찰한다.

결과: 2001년 미국에서 탄저균이 살포된 이후에, 항생제에 의한 장기간 예방적 처치(60일)가 불완전하다는 것이 알려졌다. IgG 35PA83이 치료기간을 감소시킬 수 있는지를 결정하기 위하여, 10000 LD50으로 감염시키기 12시간 전에 예방적 처치가 7일동안 5　mg/kg의 독시사이클린을 매일 투여함으로써 개시하였다. 치료 마지막날에, 항생제에 의한 예방적 처치는 IgG 35PA83의 단일 투여를 하거나 또는 하지 않고 완료하였다(도 7). 그러나, 독시사이클린의 마지막 주사는 1　mg/kg의 IgG 35PA83로 보충되고, 사망할 때까지의 평균 기간은 288 - 456　시간으로 증가되고, 20%의 마우스가 생존하였으며, 유효성 방어 효과를 나타낸다(대조군 대 독시사이클린, p<0.001). 2　mg/kg의 IgG 35PA83의 투여시에, 모두 10마리의 동물이 생존했다. 감염 한달 후에, 12마리의 생존한 마우스의 혈청은 전체적으로 수집하고, 풀에 조합하여, -20 ℃에서 보관한다. 상기 혈청은 ELISA에 의해서 시험되면, 항-PA IgG 항체 역가는 평균 64000이며, 항-LF IgG 항체 역가는 평균 32000이다.

실시예 9: IgG 35 PA83 v2 에 의한 요법, 시프로플록사신 단기 처치 또는 IgG 35PA83 v2 에 의한 요법과 시프로플록사신 단기 처치

치료 계획을 연구하기 위하여, 10마리의 개체로 이루어진 A/J 마우스 그룹은 1000 LD50의 투여량 또는 1×10⁷ 포자로 면역처치(challenge)한다. 12시간 이후에, IgG 35PA83 v2 (피하, 10　mg/kg의 1회 주사) 또는 시프로플록사신(피하, 5일 동안 1일 2회 50　mg/kg)가 개별적으로 주사되거나, 또는 시프로플록사신 및 IgG 35PA83이 둘다 첫날 주사된 후 시프로플록사신이 단독으로 추가 4일동안 주사된다.

결과: 치료적 처치는 1000 LD50의 면역처치(challenge) 후에 개시하고, 생존 곡선(시프로플록사신 처치 5일, IgG 35PA83 처치, 또는 시프로플록사신 처치 5일 및 IgG 35PA83 처치)이 도 8에 도시되었다. 5일동안 시프로플록사신이 투여된 마우스는 어느 것도 생존하지 못하였으며, IgG 35PA83이 투여된 마우스는 10% 만이 생존했다(비유효성 결과). 그러나, 시프로플록사신과 IgG 35PA83이 둘다 투여된 마우스는 80%가 생존하였다(유효성, p=0.0007).

시프로플록사신 및 IgG 35PA83을 동시에 사용함으로써 80%의 생존율을 수득할 수 있다. IgG PA83과 시프로플록사신의 강한 상승 작용이 치료적 용도에서 입증되었으며, 흥미롭게도 백신은 단기 항생제 처치(5일)할 수 없으며, 이는 시간 제한으로 면역 반응을 일으키지 못하기 때문이다. 또한, IgG 35PA83은 상기 단기 항생제 처치 이후에 재발하는 것을 방지하며, 이러한 이유로 사람의 반감기가 마우스에서의 반감기보다 적어도 3배 더 긴 것으로 예상되기 때문에 사람에 있어서 더 효과적이다(3-7일 대 21일).

실시예 10: IgG 35 PA83 v2 에 의한 요법, 시프로플록사신 단기 처치 또는 IgG 35PA83 v2 에 의한 요법 및 시프로플록사신 단기 처치(기타 분석)

치료적 처치의 연구를 위해서, 10개 개별의 A/J 마우스 그룹은 1000 LD₅₀의 투여량 또는 1×10⁷ 포자로 감염시킨다. 12시간 후에, 마우스는 시프로플록사신(피하, 25　mg/kg의 1회 초기 주사함) 또는 IgG 35PA83 v2 (피하, 10　mg/kg의 1회 주사)로 개별적으로 처치되거나; 또는 시프로플록사신 및 IgG 35PA83이 2개의 상이한 부위에 동시에 주사된다. 조합된 처치(시프로플록사신 및 IgG 35PA83)를 개시하기 24시간 및 48시간 전에 추가적인 지연시험이 있다. 제1 처치 투여 이후에, 시프로플록사신 단독(25　mg/kg, 하루 2번)이 이후 4.5일 동안 주사된다. 시프로플록사신의 투여량은 사람의 표준 투여량(사람 성인에서 20　mg/kg의 매일 투여)보다 대략 2배가 되도록 선별되며, 상기 투여량은 바실러스 안트라시스에 대항하기 위해서 효과적으로 사용된다(Kalns and al., 2002, Biochem Biophys Res Commun, Vol. 297: 506-509). 상기 선별된 투여량에 대한 내성은 유익하게 상기 연구 시작 이전에 A/J 마우스에서 시험되었다. 상기 연구의 일부는 실질적으로 지연된 처치 이후에 단기 생존율의 문제를 해결하는데 목적을 두고 있으며, 모니터링은 감염후 18일로 제한된다.

결과: 탄저병은 실제 거의 걸리지 않으므로, 이의 진단 및 처치가 마찬가지로 지연될 것이다. 본 연구에서, 단일 처치(50　mg/kg/day의 투여량으로 5일간의 시프로플록사신 처치 또는 10　mg/kg의 IgG 35PA83의 단일 투여)가 1000 LD₅₀의 스테른 균주 포자로 감염되고 12시간동안 지연되고, 조합된 처치(IgG 35PA83과 조합된 시프로플록사신)는 동일한 감염 이후에 12시간, 24시간 및 48시간 동안 지연되며(도 9), 이들의 유효성이 시험된다. 시프로플록사신 단독으로 처리된 마우스는 생존하지 않았으며, IgG 35PA83 단독으로 처치는 모두 10개의 분석으로부터 오직 1마리의 마우스만 생존하였다(비-유효성 결과). 그러나, 시프로플록사신과 IgG 35PA83으로 처치된 80%의 마우스는 처치가 12시간동안 지연될 때 생존하며(비처치된 대조군과 비교하여 유효성, p=0.0007), 마우스의 60%는 처치가 24시간동안 지연될 때 생존했다(비처치된 대조군과 비교하여 유효성, p=0.003). 감염시키고 48시간에, 처치하지 않은 10마리의 마우스로부터 오직 두마리만 생존하였지만, 조합된 처치가 투여되었음에도 불구하고 바로 죽었다. 감염되고 18일 후에, 14마리의 살아 있는 마우스의 혈청이 수집되고, 풀에서 조합되어, 보관된 후 ELISA에 의해서 시험된다. 항-PA IgG 항체 역가는 32000이며, 항-LF IgG 항체 역가는 8000이다.

실시예 11: 수동 예방적 항-탄저균 처치와 능동 예방적 항-탄저균 처치사이의 비교

수동 예방적 항-탄저균 처치는 IgG 35PA83으로 처치한다. 능동 예방적 항-탄저균 처치는 항원 PA로 면역화를 통해서 처치한다.

능동 및 수동 면역-방어를 비교하기 위하여, 10개의 마우스 그룹은 프론드 완전 보조제에서 5 ㎍의 PA83의 피하 주사에 의해서 면역화하고, 한달 후에 10　000 LD₅₀에 의해 복강내 감염시킨다. 또다른 10마리의 마우스 그룹은 동일한 방법으로 면역화되지만, 프론드 불완전 보조제에서 5㎍의 PA83의 4주후에 "면역화 리콜(immunization recall)"을 받고, 그후 한달 후에 두번째 주사로 감염된다. 동시에, 동일한 감염에 대항하는 IgG 35PA83에 의한 수동 방어가 평가된다. 모든 감염된 동물은 1달 동안 관찰되고, 두가지 예방 타입의 결과가 비교되었다.

결과: PA 주사에 근거한 백신화는 탄저균에 대항하는 종래에 가장 자주 사용되는 예방적 수단이며, 이의 유효성은 항-탄저균 항체 역가와 관련된다(Grunow and al., 2007, Vaccine, Vol. 25: 3679-3683). A/J 마우스는 PA로 면역화되어 백신화된 사람에서 관찰되는 값과 유사한 값을 갖는 항-PA 역가를 제공하며, 백신화 효율을 IgG 35PA83으로 제공된 방어와 비교한다. PA83의 단일 주사에 의해서 면역화된 마우스는 면역화 한달 후에 25000-50000의 항-PA 항체 역가를 갖는다. 마우스는 스테른 균주 포자의 10000 LD₅₀로 감염되고 10마리의 마우스로부터 6마리는 생존했다(대조군 나이브 마우스와 비교한 유효성 결과, p=0.01). PA83의 두번 주사로 면역화된 10마리 마우스는 160000 내지 640000의 항-PA83 항체 역가를 가지며, 상기 10마리 동물은 면역화 처리하고 1달 후에 유사한 감염에서 생존했으며, 한번 주사에 근거한 처치와 비교하여 두번 주사한 처치에 의해서 유효성 방어 수준(p=0.02)이 증가되는 것이 입증되었다. 동시에 IgG 35PA83에 의한 수동 방어가 2 또는 5　mg/kg의 투여량에서 평가된다. 2　mg/kg의 IgG 35PA83에 의해서 방어된 10마리의 마우스로부터 6마리는 생존했으며(처치되지 않은 마우스와 비교하여 유효성 방어, p<0.0001, 도 10), 5　mg/kg의 IgG 35PA83의 예방적 주사 투여된 모든 마우스가 생존했다. 본 연구에서, 5　mg/kg의 IgG 35PA83의 주사를 통해 수득된 완전한 방어는 PA83에 의한 두번의 면역화를 통해 수득된 완전 방어와 균등하며, 그 자체는 PA83의 단일 주사를 통해 제공된 방어보다 더 높다.

IgG 35PA83 단독에 의한 수동 예방적 처치 이후에 생존한 마우스는 초기 감염되고 한달 동안 추가로 관찰된다. 항원 및 항-사람 IgG 콘쥬게이트로서 PA83을 사용하는 ELISA 시험에서, 상응하는 혈청에서 신호가 검출되지 않았고, 주사하고 한달 후에 마우스에서 IgG 35PA83이 없으며, 이는 IgG 35PA83의 반감기 값과 일치한다. 그러나, 항-마우스 IgG 콘쥬게이트에 의해서, 설치류 IgGs가 검출되고, 64000-128000 범위의 역가로 PA에 직접 대항하며, 투여된 IgG 35PA83의 투여와는 무관하게 설치류 IgG는 32000 내지 64000 범위의 역가로 LF에 직접 대항한다. 초기 감염되고 한달 이후에, 모든 동물은 10000 LD₅₀의 스테른 균주 포자로 재감염에서 생존하였다.

하기 표 9은 관찰된 항-PA IgG 항체 역가 및 항-LF 항체 역가의 결과를 4가지 실험 조건하에서 요약하였다.

실험 조건	항-PA IgG 항체 역가	항-LF IgG 항체 역가
독시사이클린 및 IgG 35PA83(2 mg/kg)에 의한 예방적 처치: 감염되고 한달 후에 수집된 10개의 혈청 풀	64000	32000
시프로플록사신 및 IgG 35PA83에 의한 치료적 처치: 감염되고 18일후에 수집된 14개의 혈청 풀	64000-12000	32000-64000
PA83에 의한 면역화:한번 주사, 주사되고 한달 후에 수집된 혈청	25000-50000	NR^*
PA83에 의한 면역화:두번 주사, 두번째 주사되고 한달 후에 수집된 혈청(recall 주사)	160000-640000	NR

*NP=관련성 없음

생체내 분석 통계:

생존 데이터를 분석하기위한 Kaplan-Meier 비교 로그-순위 검정(comparative log-rank test)이 Graph Prism 4.0 소프트웨어(GraphPad software, San Diego, CA)를 사용하여 실시된다.

참고 연구

Albrecht, M. T., H. Li, E. D. Williamson, C. S. Lebutt, H. C. Flick-Smith, C. P. Quinn, H. Westra, D. Galloway, A. Mateczun, S. Goldman, H. Groen, and L. W. Baillie. 2007. Human monoclonal antibodies against anthrax lethal factor and protective antigen act independently to protect against Bacillus anthracis infection and enhance endogenous immunity to anthrax. Infect Immun.

Andris-Widhopf, J., C. Rader, P. Steinberger, R. Fuller, and C. F. Barbas, 3rd. 2000. Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. J Immunol Methods 242:159-181.

Andris-Widhopf, J., P. Steinberger, R. Fuller, C. Rader, and C. F. Barbas, 3rd. 2001. Generation of antibody libraries: PCR amplification and assembly of light - and heavy-chain coding sequences. In C. F. Barbas, 3rd, D. R. Burton, J. K. Scott, and G. J. Silverman (ed.), Phage Display: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Carter, P., H. Bedouelle, and G. Winter. 1985. Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors. A nucleic acids Res 13:4431-43.

Ezzell, J. W., B. E. Ivins, and S. H. Leppla. 1984. Immunoelectrophoretic analysis, toxicity, and kinetics of in vitro production of the protective antigen and lethal factor components of Bacillus anthracis toxin. Infect Immun 45:761-7.

Karlsson, R., A. Michaelsson, and L. Mattsson. 1991. Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system. J Immunol Methods 145:229-40).

Laffly, "Selection of a macaque Fab with framework regions like those in humans, high affinity, and ability to neutralize the protective antigen (PA) of bacillus anthracis by binding to segment of PA between residues 686 and 694", Antimicrobial agents and chemotherapy, Aug. 2005, p. 3414-3420.

Little, S. F., S. H. Leppla, and A. M. Friedlander. 1990. Production and characterization of monoclonal antibodies against the lethal factor component of Bacillus anthracis lethal toxin. Infect Immun 58:1606-13.

Schuck, P., and A. P. Minton. 1996. Analysis of mass transport-limited binding kinetics in evanescent wave biosensors. Anal Biochem 240:262-72.

서열 목록

서열	영역	타입
1	경쇄 가변 영역	펩티드
2	중쇄 가변 영역 MUTE AFFINITE(31A, 66, 73)	펩티드
3	경쇄 불변 영역	펩티드
4	중쇄 불변 영역	펩티드
5	IgG 경쇄	펩티드
6	IgG 중쇄 MUTE AFFINITE(31A, 66, 73)	펩티드
7	각 IgG 경쇄의 가변 영역	핵산
8	각 중쇄의 가변 영역 MUTE AFFINITE(31A, 66, 73)	핵산
9	각 IgG 중쇄의 불변 영역	핵산
10	이의 각 경쇄의 불변 영역	핵산
11	항체의 경쇄	핵산
12	중쇄 MUTE AFFINITE(31A, 66, 73)	핵산
13-37	프라이머	핵산

부록(48-75 페이지)

프랑스 특허 출원 제 FR 07/06744호(9월 26일 출원) 명세서

"탄저균 독소에 대항하는 항체"

(서열목록을 포함하며 도면은 없음)

탄저균 독소에 대한 항체

본 발명은 탄저균 독소에 대한 항체에 관한 것이다. 특히 본 발명은 탄저균의 PA 서브 유닛의 치명적이고 부종을 일으키는 독소에 직접 대항하고, 친화도 및 내성을 향상시키기위해서 변형된 항-PA 항체에 관한 것이다.

탄저병(anthrax)은 그람 양성 박테리아인 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)에 의해 발병하는 감염성 질환이다. 상기 박테리아는 비(非)운동성이며, 이의 생존에 유해한 환경에 놓이면 포자를 형성한다. 상기 포자는 공기중에서 24시간 생존할 수 있으며, 흙속에서는 대략 100년 동안 생존할 수 있고. 열이나 소독제에 대한 노출에 견딜 수 있다.

탄저균 독소-매개 감염은 피부, 폐 또는 소화기에서 발생할 수 있다. 폐 감염은 가장 치명적이다. 바실러스 안트라시스를 흡입하자마자, 상기 포자는 폐포로 들어가서 대식세포(macrophages) 및 수지상 세포(dendritic cells)에 의해서 포식된다. 상기 포자들은 상기 세포들에서 발아하기 시작하여, 영향형은 림프절안에서 증식한다. 그 후 박테리아가 혈액 순환계로 침투하고, 연속적으로 복제하여, 부분적으로 질병의 치사 특성을 초래하는 독소를 생성한다. 탄저균 독소는 3개의 구별되는 단백질인, 방어 항원(PA, 세포내 효소 절단전 83 kDa, 세포내 효소 절단후 63 kDa), 치사 인자(LF, 90 kDa) 및 부종 인자(EF, 89 kDa)로 이루어져 있다. 상기 치사 독소는 PA와 LF로 형성되고; 부종 독소는 질병 생리에서 덜 두드러진 역할을 하며, PA 및 EF로 형성된다. 상기 단백질은 상기 박테리아로부터 비(非)독성의 모노머로서 분비되고, 표적 세포의 표면에 모두 모여서 독성 복합체를 형성한다.

지금까지, 페니실린, 독시사이클린 및 플루오로퀴논(예를 들어, 시프로플록사신)과 같은 다수의 항생제는 탄저병 감염의 치료를 위해서 사용되어 왔다. 그러나, 상기 일부 항생제는 어떤 종에는 영향을 주지 못하고 항생제에 내성이 발생하였다. 특히 일부 치료 방법은 항생제-내성 종이 의도적으로 살포되는 테러 행위 또는 생화학전에 적합하지 않을 것이다.

그러므로, 탄저균 독소를 중화시킬 수 있는 신규한 항체의 개발은 탄저병을 예방하고 효과적으로 치료하는 것에 통상적인 관심이 있다. 최근 연구에서, 마카크(macaque)를 방어 항원 PA83으로 면역화하여 탄저균 독소-매개 사람 감염증을 치료하기 위한 항체를 수득하였다. 본 발명자들은 골수로부터 PA83-특이적 항체 단편을 암호화하는 유전자를 증폭하고 라이브러리를 제작하기 위해서 상기 유전자를 클로닝하였다.

35PA83으로 언급되는 높은 친화도(affinity, Kd=3.4 nM) 및 강한 중화 단편(neutralizing fragment, 50% 저해 농도 = 5.6 +/- 0.13 nM)이 분리되었다(Laffly and al., antimicrobial agents and chemotherapy, 2005, 49(8): 3414-3420). 본 발명자들은 면역글로불린 단편 35PA83은 PA를 이의 세포 수용체와 반응하는 것을 방지시킴으로써 탄저균 독소를 중화하는 것을 입증하였다.

그후, 발명자들은 상기 면역글로불린 단편을 의약적 목적(예방 목적 또는 치료 목적)으로 적용하기위해 이의 특성을 향상시키기위해서 이의 친화도를 높이거나 또는 사람에 대한 내성을 향상시킴으로써 상기 면역글로불린을 변형하는데 초점을 두었다. 상기 면역글로불린 단편의 친화도를 향상시킴으로써 감소된 면역글로불린의 양을 사용하게 되어 충분한 생물학적 활성을 수득할 뿐만 아니라 치료 비용을 감소시킬 수 있다. 사람에 대한 내성을 향상시킴으로써 상기 항체 단편에 대한 면역 반응을 유익하게 피할 수 있다. 그러므로 본 발명의 목적은 면역글로불린 단편 35P483으로부터 변형된 항-PA 항체를 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 상기 변형된 항체를 포함하는 조성물 뿐만 아니라 상기 변형된 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데 있다. 본 발명의 추가적인 목적은 탄저균 독소-매개 감염을 치료 또는 예방하는데 사용되는 약학적 조성물을 제조하기 위하여 사용되는 상기 변형된 항체의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명은 또한 상기 변형된 항체를 포함하는 탄저균 독소의 검출용 키트 뿐만 아니라 탄저균 독소를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 하기의 정의에 의해서 용이하게 이해될 것이다.

본원에서 사용되는, 용어 "항체"는 특정 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 분자의 단편을 의미한다. 잘 공지되어 있는 면역글로불린 단편은 예를 들어, F(ab')2, Fab, Fv, scFv 및 Fd 단편이 있다.

본원에서 사용되는, 용어 "탄저병"은 바실러스 안트라시스에 의한 감염이 직접 또는 간접적 원인이 되는 질병을 의미하는 것이다. 흡입 감염의 초기 증상은 코감기의 증상(열, 근육통 등)과 유사하다. 몇일 후에, 상기 증상은 호흡기 통증 및 패혈성 쇼크와 같은 심각한 문제로 발전한다. 탄저균을 흡입하는 것은 통상 치명적이다.

탄저균의 피부 감염은 선재성 피부 열극(preexisting cutaneous interstice)을 통해서 박테리아가 피부를 침투하였을 때 발생한다. 상기 감염은 초기에는 구진을 형성하고 2-3일내에 수포로 발전한 후에 중심 괴사 영역을 갖는 1-3 cm의 궤양으로 발전한다. 탄저균 위장관 감염은 오염된 고기의 섭취로부터 기인하며, 급성 장염을 일으키는 것이 특징이다.

본원에서 사용되는, 용어 "분리된"은 "PCR에 의한 시험관내 증폭", "클로닝에 의해 제조된 재조합", "겔 분리 또는 절단에 의한 정제" 또는 "예를 들어, 화학적 합성에 의한 합성"을 의미한다.

본원에서 사용되는, "벡터"는 목적하는 서열이 제한에 의해서 삽입된 후 다양한 유전적 환경으로 및 다양한 유전적 환경내로 운반하기 위하여 또는 숙주세포에서 발현을 위해서 라이게이션되는 핵산을 나타낸다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 효모 합성 크로모좀(YAC), 박테리아 합성 크로모좀(BAC) 및 박테리오파지 P1(PAC)으로부터 유래된 합성 크로모좀, 바이러스-유래 벡터가 있다. 클로닝 벡터는 숙주 세포에서 복제할 수 있는 벡터이며 또한 1 이상의 엔도뉴클레아제 제한 효소 자리가 존재하는 것을 특징으로 한다. 발현 벡터는 관심 있는 DNA 서열이 이의 복제 및/또는 RNA로의 전사를 위해서 제한 또는 라이게이션 기술을 통해서 삽입될 수 있다. 또한 벡터에 의해서 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 세포를 선별하거나 확인하기 위하여 벡터는 1 이상의 마커(marker)를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는, 용어 "인간화 항체(humanized antibodies)"는 몇가지 원래 성분들이 사람의 성분으로 대체되는 동물 기원의 항체를 의미한다.

본원에서 사용되는, 용어 "질병의 예방"이라는 표현은 개체, 특히 사람에서 질병의 발생을 방지하는 것을 의미하며, 여기서의 질병은 아직 나타나지 않은 상태이다.

본원에서 사용되는, 용어 "질병의 치료"는 질병의 억제, 예를 들어, 증상 및 질병의 발전의 중단, 쇠퇴 또는 소멸, 또는 질병원의 소멸에 해당한다.

본원에서 사용되는, 용어 "치료적 유효량"은 치료를 필요로 하는 개체 투여될 때 치료를 실행하는데 충분한 양을 의미하는 것이다. 치료적 유효량은 개체, 치료될 질병의 단계, 및 투여 방법에 따라 좌우되며, 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에 의해서 통상의 절차를 통해 결정될 수 있다.

잘 공지되어 있는 바와 같이, 항체의 일부, 가변 영역은 항체를 이의 에피토프에 결합하는 것에 관여한다. 항체 불변 영역은 면역 이펙터, 식세포 또는 킬러 세포 및 보체를 활성화시키고; 상기 불변 영역은 항원으로의 결합에 관여하지 않는다. 불변 영역(Fc)이 효소적으로 절단되어 이로부터 경첩 영역을 보존하는 항체는 F(ab')2 단편이라 하고, 항원으로의 2개의 결합 부위를 보유한다.

마찬가지로, 경첩 영역을 포함하는 불변 영역은 효소적으로 절단되거나 또는 상기 영역 없이 제조되어진 항체는 Fab 단편이라하고, 항원으로의 2개의 결합 부위 중 하나를 보유한다. Fab 단편은 Fd로 불리는 중쇄의 일부에 공유 결합하는 경쇄로 이루어진다.

상기 가변 영역에서, 초가변 영역(hypervariable regions)이라 불리며 항원과 직접 반응하는 상보성 영역(complementarity)(CDRs, 상보성 결정 영역)이 결정된다. 그러므로, CDRs를 변형함으로써 항체의 친화도를 변형할 수 있다. 프레임워크 영역(framework regions, FRs)이라 불리는 제2 타입의 영역에 있으며, CDRs의 3차원 구조를 유지한다. 상기 프레임워크 영역은 항체가 유래되는 종에 대해서 특이적이다. 중쇄 및 경쇄의 Fd 단편에서 4개의 프레임워크 영역이 존재하며(FR1 내지 FR4), 3개의 CDRs(CDR1 내지 CDR3)에 의해서 각각 분리된다.

본 발명의 목적은 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 서열번호 2로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 항-PA 항체에 제공하는데 있으며, 상기 항체는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역에서 적어도 하나의 돌연변이에 의해서 변형되어 변형되지 않은 항체에서의 친화도보다 더 높은 친화도를 갖는 것을 특징으로 한다.

Laffly and al.에서 기술된 항체 35PA83의 Fd 단편에 해당하는 펩티드 서열인 서열번호 3은 승인번호 CAH17920으로 Genbank와 같은 컴퓨터 데이터 뱅크에 등록되어 있고, 펩티드 서열인 서열번호 4는 승인번호 CAH17921로 동일한 방식으로 접근가능하다.

상기 서열의 가변 영역은 도 1에서 2차원 다이아그램의 형태로 개시되었다.

서열번호 5 및 서열번호 6으로 불리는 항체 35PA83의 Fd 단편 및 경쇄를 암호화하는 DNA 서열은 승인번호 AJ810486 및 AJ810487로 컴퓨터 데이터 뱅크에서 접근가능하다.

항체의 친화도 K_D는 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있는 종래의 방법으로 측정될 수 있다.

모체인 변형되지 않은 항체 35PA83(예를 들어, 돌연변이되지 않음)은 3.4×10^-9 의 친화도 K_D를 갖는다. 상기 친화도 상수는 실시예에서 설명된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명을 통해 실시간으로 측정된 결합 상수와 해리 상수로부터 산출되어 진다.

본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명의 변형된 항-PA 항체는 중쇄 가변 영역에서 G/S (31A), R/K (66), K/R (73), D/G (28), G/E (31A), H/L (55), S/G (74), Y/T (113), S/L (117) 및 경쇄 가변 영역에서 Q/R (68), Q/R (27), AP (114), Q/L (68), P/S (115), H/R (24), S/E (69), S/R (58)로부터 선별된 적어도 하나의 돌연변이에 의해서 변형된다.

중쇄 가변 영역에서 돌연변이 G/S (31A)는 위치 31A에서 아미노산 G(아미노산 위치에 있어서 도 1 참조)가 아미노산 S로 치환되는 것을 의미한다.

중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역에서 적어도 하나의 상기 돌연변이에 의해서 변형된 항-PA 항체는 항체 35PA83과 비교하여 PA에 대한 친화도가 향상되었다.

그러므로 본 발명은 본 발명의 변형된 항-PA 항체의 F(ab')2, Fab, Fv, scFv 및 Fd 단편 뿐만 아니라 키메라 항체를 제공하는데 있으며, 항체 Fc 부분은 사람 또는 사람이 아닌 동일 서열로부터 유래된다.

본 발명의 하나의 실시양태에서, 항체 Fc 부분은 IgAs, IgMs 또는 IgGs를 생산하기 위하여 선별될 수 있다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, 항체 Fc 부분은 마우스, 말, 양, 소 또는 다른 포유류로부터 유래된 Fc 부분일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체는 사람 기원의 Fc 부분을 포함한다. 상기 전체 항체는 사람에게 투여하기에 바람직하며, 이는 Fabs와 같은 항체 단편보다 반감기가 더 길기 때문이며, 혈관내, 복강내, 근육내, 피하내 또는 경피로 투여되기에 적당하다.

그러므로, 본 발명의 목적은 본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체로부터 유래된 Fabs를 제공하는데 있으며, 상기 항체의 단편은 Fab 단편 또는 에피토프-결합 펩티드보다 더 작거나 또는 더 길며, 특히 펩티드는 본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체의 초가변 영역으로부터 유래된다.

본 발명의 제1 실시양태에서, 본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체는 적어도 하나의 돌연변이가 중쇄 가변 영역에서 G/S (31A), R/K (66), K/R (73), D/G (28), G/E (31A), H/L (55), S/G (74), Y/T (113), S/L (117)로부터 선별되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제2 실시양태에서, 본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체는 상기 적어도 하나의 돌연변이가 경쇄 가변 영역내 Q/R (68), Q/R (27), A/P (114), Q/L (68), P/S (115), H/R (24), S/E (69), S/R (58)로부터 선별되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 제3 실시양태에서, 본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체는 중쇄 가변 영역에서 G/S (31A), R/K (66), K/R (73), D/G (28), G/E (31A), H/L (55), S/G (74), Y/T (113), S/L (117)로부터 선별된 적어도 하나의 돌연변이, 및 경쇄 가변 영역에서 Q/R (68), Q/R (27), A/P (114), Q/L (68), P/S (115), H/R(24), S/E (69), S/R (58)으로부터 선별된 적어도 하나의 돌연변이에 의해서 변형되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체는 중쇄 가변 영역에서 하기 3개의 돌연변이를 포함한다:

- G/S (31A)

- R/K (66)

- K/R (73).

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체는 중쇄 가변 영역에서 하기 2개의 돌연변이:

- H/L (55)

- S/G (74),

및 경쇄 가변 영역에서 Q/L (68) 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 추가적인 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체는 중쇄 가변 영역에서 S/L (117) 돌연변이 및 경쇄 가변 영역에서 S/R (58) 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체는 경쇄 가변 영역에서 하기 2개의 돌연변이를 포함한다:

- H/R (24) 및

- S/E (69).

본 발명의 추가적인 목적은 돌연변이되지 않은 35PA83 항체와 비교하여 친화도가 향상되고 사람 면역 시스템과 비교하여 내성이 더 좋은 변형된 항-PA 항체를 제공하는데 있다. 상기 인간화된 항체는 유익하게도 자체에 대항하는 면역 반응을 유발하지 않거나 적은 정도로 일으키며 더 긴 반감기를 갖는다.

그러므로, 본 발명의 목적은 본 발명에 따라 변형되고 인간화된 항-PA 항체를 제공하는데 있으며, 중쇄 가변 영역에서 하기로 구성된 그룹으로부터 선별된 적어도 하나의 돌연변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다:

- none/Q (l)

- none/V (2)

- none/Q (3)

- none/L (4)

- none/Q (5)

- none/E (6)

- L/V (12)

- A/T (24)

- S/P (45)

- R/N (66)

- K/V (80)

- L/F (87)

- R/S (92)

- A/T (122)

- V/L (123).

돌연변이 none/Q (1)은 아미노산 Q가 위치 1에 첨가되는 것을 의미한다(아미노산 위치에 대해서 도 1 참조).

본 발명의 또다른 실시양태에서, 본 발명에 따라 변형되고 인간화된 항-PA 항체는 경쇄 가변 영역에서 하기로 구성된 그룹으로부터 선별된 적어도 하나의 돌연변이를 삽입로 포함한다:

- none/A (1)

- none/I (2)

- none/Q (3)

- none/L (4)

- Y/S (14)

- K/R (18)

- H/R (24)

- Y/F (87)

- S/P (96)

- S/T (101)

- L/V (124).

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 변형되고 인간화된 항-PA 항체는 상술된 바와 같이 중쇄 가변 영역에서 적어도 하나의 돌연변이 및 상술된 바와 같이 경쇄 가변 영역에서 적어도 하나의 돌연변이를 삽입로 포함한다.

바람직하게, 본 발명에 따라 변형되고 인간화된 항-PA 항체는 중쇄 가변 영역에서 하기의 돌연변이를 삽입로 포함하며;

- none/Q (1)

- none/V (2)

- none/Q (3)

- none/L (4)

- none/Q (5)

- none/E (6)

- A/T (122)

- V/L (123),

및 경쇄 가변 영역에서 하기의 돌연변이를 삽입로 포함한다:

- none/A (l)

- none/I (2)

- none/Q (3)

- none/L (4)

- L/V (124).

본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 상술된 바에 따라, 당분야의 통상의 지식을 가진 사람은 상기 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 합성하거나 또는 제조할 수 있다.

그러므로, 본 발명의 목적은 본 발명의 변형된 항-PA 항체를 암호화하는 항체를 제공하는데 있으며, 상기는 돌연변이되지 않은 항체 35PA83과 비교하여 친화도가 향상되며, 인간화되거나 또는 되지 않는다.

본 발명의 추가적인 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공하는데 있다.

상기 핵산은 본 발명의 항체의 클로닝 또는 발현을 위한 재조합 벡터로 혼입될 수 있다.

본 발명은 진핵 또는 원핵 세포 형질전환, 형질감염 또는 유전자 요법에 대한 암호화 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 분자생물학에서 종래 방법에 따라 제조될 것이며, 또한 적당한 프로모터, 선별적으로 방출 또는 분비를 위한 신호 서열, 및 뉴클레오티드 서열의 전사를 위해 요구되는 조절 서열을 포함할 것이다.

융합 폴리펩티드는 본 발명의 항체를 정제하기 위하여 요구될 수 있다. 융합 도메인은 예를 들어, Ni² ⁺ 컬럼 상으로 정제할 수 있는 폴리히스티딘 테일 또는 필라멘트상 파아지 멤브레인 앵커를 포함할 수 있으며, "파아지 디스플레이"로 불리는 기술에 따라 뱅크를 스크리닝에 특히 유용하다.

본 발명의 명세서에서 적당하게 사용될 벡터는 제1 및 제2 DNA 서열을 수용하고 발현하기에 적당한 재조합 DNA 분자이며, 헤테로다이머 항체, 가령 본 발명에 따른 전체-길이 항체 또는 F(ab')2 또는 Fab 단편을 발현할 수 있다. 상기 벡터는 헤테로다이머 항체로부터 제1 및 제2 폴리펩티드의 발현에 대한 2개의 구별되는 시스트론(cistrons)을 형성하기 위하여 벡터내에 존재하는 2개의 개별의 카세트에서 두 DNA 서열들을 독립적으로 클로닝하는 시스템을 제공한다. 상기 발현 벡터는 디시스트론 벡터(dicistronic vector)라고 부른다.

본 발명의 변형된 항체는 CHO 세포 또는 사람 또는 유인원 하이브리도마 세포(hybridoma cells) 뿐만 아니라 유전자변형 식물 및 동물 세포와 같은 진핵 세포에서 생산될 수 있다.

본 발명의 추가적인 목적은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 친화도를 향상시키기위해서 본 발명에 따라 변형되고, 선별적으로 인간화된 적어도 하나의 항-PA 항체를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 친화도를 향상시키기위해서 본 발명에 따라 변형되고, 선별적으로 인간화된 적어도 하나의 항-PA 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적 허용가능한 담체를 포함하는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 담체는 조성물 중 활성 성분의 생물학적 활성 효율을 방해하지 않는 비(非)독성 물질을 의미하는 것이다. 용어 "약학적 허용가능한"이라는 표현은 세포, 세포 배양액, 조직 또는 생물체와 같은 생물계와 상용할 수 있는 비(非)독성 물질을 나타내는 것이다. 담체 특성은 투여 방법에 따라 다르다.

본 발명은 바실러스 안트라시스에 의한 감염을 치료 또는 예방하기위한 약제 또는 약학적 조성물을 제조하기위한 본 발명에 따라, 친화도를 향상시키기위해 변형되고, 선별적으로 인간화된 적어도 하나의 항-PA 항체의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따라 친화도를 향상시키기위해서 변형되고 선별적으로 인간화된 항-PA 항체가 표식화될 수 있다. 적당한 마커의 예로는 효소, 방사선동위원소, 형광 화합물, 콜로이드 금속, 화학발광 화합물, 생물발광 화합물을 포함한다. 항체에 마커를 결합시키는 방법은 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있다.

또다른 표식화 방법은 항체를 저분자량 합텐에 결합시키는 것이며, 합텐은 제2 반응을 통해서 특이적으로 변형될 수 있다. 적당한 합텐의 예로는 바이오틴을 포함하며, 상기는 아비딘, 또는 디니트로페놀, 피리독살 또는 플루오레세인과 반응하며, 항-합텐 특이적 항체와 반응할 수 있다.

- 표식화되거나 또는 표식화되지 않은, 친화도를 향상시키기위해서 본 발명에 따라 변형되고, 선별적으로 인간화된 적어도 하나의 항-PA 항체를 포함하는 용기,

- 선별적으로, 완충 용액을 포함하는 용기, 및

- 선별적으로, 리포터 분자(reporter molecule), 가령 형광 또는 효소 마커에 결합된 표식화되고 변형된 항-PA 항체 검출 수단, 가령 바이오틴-결합 단백질, 예를 들면 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 포함하는 용기. 상기 용기는 또한 표식화되지 않고 변형된 항-PA 항체 검출 수단, 예를 들어, 실질적으로 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 친화도를 향상시키기위해서 변형되고, 선별적으로 인간화된 항-PA 항체는 시험관내에서 예를 들어, 면역 분석에 사용될 수 있고, 이는 액체상에 사용되거나 또는 고체상 담체에 고정된다. 잘 알려져 있는 담체의 예로는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 또는 개질된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 또는 마그네타이트를 포함한다. 본 발명의 항-PA 항체를 사용하는 면역 분석의 예는 방사선면역분석, 히스토면역 표식화링 기술, ELISAs, 웨스턴 블롯, 면역침강 분석, 면역 확산 분석, 보체결합 분석, 형광-활성 세포 소팅 분석(FACS) 또는 단백질-칩 분석이 있다.

- 친화도를 향상시키기위해서 본 발명에 따라 변형되고, 선별적으로 인간화된 적어도 하나의 항-PA 항체와 시료를 접촉시키는 단계; 및

본 발명의 추가적인 목적은 PA-함유 탄저균 독소를 생체내 검출하는 방법을 제공하는데 있으며, 친화도를 향상시키기위해서 본 발명에 따라 변형되고, 선별적으로 인간화되고 표식화된 항-PA 항체를 개체에 투여한다. 표식화되고 변형된 항체의 투여량은 검출될 독소에 항체를 결합시키기에 충절단야 한다. 표식화되고 변형된 항체의 투여량은 개체의 나이 및 성별, 뿐만 아니라 질병의 단계와 같은 몇가지 요인에 좌우될 것이다. 투여량은 0.01-50　mg/kg, 바람직하게는 0.1-20　mg/kg, 더 바람직하게는 0.1-2　mg/kg에서 가변될 수 있다.

생체내 진단을 실시하기 위하여, 본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체는 기능기를 통해서 방사선동위원소에 직접 또는 간접적으로 결합되어야 한다. 통상적으로 사용되는 기능기로는 예를 들어, 디에틸렌-트리아민-펜트아세트산(DTPA) 및 에틸렌-디아민-테트라아세트산(EDTA)을 포함한다. 방사선동위원소 금속 이온의 예로는 ¹¹¹In, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ⁸⁹Zr 및 ²⁰¹Tl을 포함한다.

본 발명의 변형된 항-PA 항체는 또한 자기공명 영상(MRI)을 사용하거나 또는 전자 스핀 공명(ESR)을 통한 진단을 위해서 상자성 동위원소로 표식화될 수 있다. 양전자-방출 감마 방사선동위원소, 가령 ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁶⁸Ga, ⁵²Cr 및 ⁵⁶Fe가 사용될 수 있다.

친화도를 향상시키기위해서 본 발명에 따라 변형되고 선별적으로 인간화된 항-PA 항체는 질병 치료의 전개를 모니터하기 위하여 시험관내 또는 생체내에서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 탄저균 독소에 의한 표적인 세포의 수의 증감을 측정하거나 또는 생물학적 시료내 PA 독소 농도의 변화를 측정함으로써 실시된다.

본 발명의 목적은 바실러스 안트라시스에 의해서 감염될 가능성이 있는 개체, 바람직하게는 사람의 치료 방법을 제공하며, 친화도를 향상시키기위해서 본 발명에 따라 변형되고, 선별적으로 인간화된 항-PA 항체의 치료적 유효량이 상기 채체로 투여된다.

치료적 유효량은 질병 및 감염 진행의 증상을 감소시키기에 충분한 양에 해당한다. 상기 양은 개체의 나이와 성별 및 질병의 단계에 따라 좌우되며, 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에 의해서 결정된다. 치료적 유효량은 1일 또는 그 이상동안 하루 1회 또는 수회투여로 0.01-50 mg/kg, 바람직하게는 0.1-20 mg/kg, 더 바람직하게는 0.1-2 mg/kg에서 가변될 수 있다.

투여 방법은 주사 또는 점진적 주입될 수 있다. 주사는 혈관내, 복강내, 근육내, 피하내 또는 경피 타입을 가질 수 있다.

비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비(非)수성 용액, 현탁액 또는 유화액을 포함할 수 있다. 비(非)수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 가령 올리브 오일, 또는 주사용 유기 에스테르, 가령 에틸 올레에이트를 포함한다. 수성 담체는 물, 알콜/물 용액, 유화액 또는 현탁액을 포함한다.

본 발명의 추가적인 목적은 치료제와 직접 또는 간접적으로 결합된 본 발명에 따라 변형된 항-PA 항체를 포함하는 면역접합체를 제공하는데 있다.

상기 치료제는 화학제, 방사성 핵종, 면역치료제, 사이토킨, 케모킨, 독소 또는 효소 저해제를 포함한다. 기술된 독소의 예로는 디프테리아-독소 사슬 A, 엑소톡신 사슬 A, 리신(ricin) 사슬 A, 아브린 사슬 A, 모데신 사슬 A, 알파-사르신, 아로라이트 포르디 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질, 모모디카 차란티아 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 있다. 방사성 핵종의 예로는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re를 포함한다.

본 발명은 항-PA 항체의 제제예로 언급되는 하기 상세를 통해 더 용이하게 이해될 것이다.

하기 실시예를 설명하기위해 하기에 도면을 하기에 첨부할 것이다.

도 1: 항체 35PA83의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 pearl-on-a-string 배열.

IMGT pearl-on-a-string 배열은 IMGT 명명법에 따른다. 포인트는 35PA83과 가장 유사한 사람 유전자와 35PA83에서의 차이를 나타낸다. 해치된 서클(hatched circles)은 IMGT 명명법에 따라 결여된 위치에 해당한다.

도 2는 본 발명에 따라 변형된 3개의 항-PA 항체(6.20, V2 및 J24-7)와 모체 항체 35PA83 사이의 서열 배열.

CDRs의 위치는 IMGT 정의(연회색) 또는 Kabat 정의(진회색, Wu and Kabat 1970)에 따른다. 돌연변이된 잔기는 진하게 표시하였다. 모든 잔기는 IMGT 명명법에 따라 넘버링하였다.

물질 및 방법

E. coli 균주

하기의 E. coli 균주가 사용된다:

- HB2151 (수용성 Fabs의 발현을 위해서 사용됨).

독소

List laboratories에서 얻어진 탄저균 독소(PA83, LF 및 EF).

돌연변이체 35 PA83 의 라이브러리의 구조

유전자 35PA83으로부터 유래된 돌연변이체 항체의 라이브러리가 Massive mutagenesis

에 의해서 생산된다(Biomethods, Evry, France). 돌연변이가 NNS 코돈을 사용하여 중쇄 및 경쇄의 CDRs로 도입된다. CDR 영역은 Kabat and al. (Wu and Kabat 1970) 및 IMGT (Lefranc, Pommie and al. 2003)에 따라 정의된다.

DNA 라이브러리는 전기천공법에 의한 SURE 세포를 형질전환하는데 사용된다. 카르베니실린-보충 SB 배지를 배양액에 첨가하고 37 ℃에서 1시간동안 배양한 후에, 1 ml의 파아지 헬퍼 VCSM13(대략 10¹² pfu)가 배양액으로 첨가된다. 2시간동안 배양한 후에, 70 ㎍/ml의 카나마이신이 첨가되고 배양액을 37 ℃에서 한밤동안 교반하에 둔다.

항체의 파아지 -매개 선별

파아지-Fab 입자가 정제되고 PEG에 의한 침전으로 50 ml의 배양액으로부터 농축된 후에, 3 ml의 1% PBS-BSA -0.02% 아지드에 재현탁되고, 0.45 ㎛-필터에서 여과한다. 상기 파아지 제제의 역가(titer)는 약 10¹⁰ pfu/ml이다. 종래에 기술된 바와 같이(Andris-Widhopf, Rader and al. 2000), 3가지 감염-선별 회수 사이클에 파아지-Fabs를 처리한다. 몇가지 파아지는 분석되거나, 또는 이하에 기술된 1 이상의 방법으로 처리된다.

매우 낮은 항원 농도에서 용출에 의한 선별

바이오티닐화 PA83의 감소된 농도(100 nM, 10 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM, 0.001 nM)의 및 스트렙트아비딘 μMACS(Milteny Biotech)로 피복된 자기 비드(magnetic beads)를 사용하여 라이브러리가 스크리닝된다. 다른 농도에서 파아지와 바이오티닐화 항원의 다양한 혼합물이 유리 튜브에서 37 ℃에서 30분동안 배양된다. 바이오티닐화 PA83-결합 파아지는 스트렙트아비딘 μMACS로 피복된 자기 비드 100 ㎕를 사용하여 캡쳐된다(실온에서 5분). 파아지 캡쳐후에, 비드는 PBS로 5번 세척하고, 한번은 TPBS(0.1%의 Tween 20를 함유하는 PBS)로 세척한다. 그후 결합된 파아지는 100 ㎕의 트립신(10 ㎍/ml)으로 배양함에 의해 용출시킨다. 용출액은 지수 성장 단계에서 E. coli SURE 박테리아를 감염시키는데 사용된다.

장기 배양 선별

웰(50㎕)당 대략 10⁹-10¹⁰ 파아지가 PBS내 5㎍/ml의 PA83으로 피복된 플레이트 결합(Nunc Maxisorp)을 통해 스크리닝하고, 5%의 MPBS로 퀀칭한다. 상기 PA83 플레이트는 37 ℃에서 2시간동안 파아지-Fab와 배양하고, 0.1% Tween 20-PBS로 5번, PBS로 2번 세척한다. 그후 파아지는 선정된 시간(1, 3, 13, 18, 및 24일)동안 50 ㎍/ml의 수용성 PA83과 4℃에서 배양한다. 5번의 세정 절차 이후에, 결합된 파아지는 37 ℃에서 15분동안 50 ㎕의 트립신 10㎍/ml(Sigma)으로 용출시키고, 지수 단계에서 E. coli SURE 박테리아로 재감염시킨다.

수용성 Fab 의 발현, 주변세포질 추출 및 정제

각 DNA 돌연변이체가 화학적으로 항체반응하는 HB2151로 불리는 E. coli 균주의 박테리아에 형질전환된다. 상기 세포를 30℃에서 배양하고 50㎍/ml의 카르베니실린 및 0.1%의 글루코스를 포함하는 1L의 SB 배지에서 250 rpm으로 교반된다. λ=600 nm에서 배양액의 흡광도가 1.5일때, 1 mM IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드)에 의한 유도(induction)가 22 ℃에서 18시간동안 실시된다.

Fabs가 폴리믹신 B 설페이트(Sigma)에 의해서 추출하고 공급자의 사용지시서에 따라 니켈 컬럼(Ni-NTA 스핀 컬럼, QIAGEN, Valencia, CA)상에서 건조된 후에, 4℃에서 3시간동안 PBS 1X로 투석한다.

수용성 Fabs 의 정량화

Fab 순도는 SDS-PAGE를 통해 시험되고 이의 농도는 소프트웨어 Quantity One

(Biorad)를 사용하여 측정된다.

표면 플라즈몬 공명( SPR )의 실시간 측정

PA83 돌연변이체와 35PA83 돌연변이체 사이의 상호작용에 대한 카이네틱 상수(kinetic constants)가 시스템 Biacore X SPR (BIAcore, Uppsala, Sweden)을 사용하여 측정된다. PA83이 10 mM의 아세트산나트륨 pH 4.5내 2㎍/ml의 PA83에 대해서 30 ㎕를 주입함으로써 아민 결합 반응을 사용함으로써 CM5 민감성 칩(Biacore)상에 고정시킨다. 재결합 가능성을 최소화하기 위하여, KD가 높은 유속(30　㎕/분) 및 결합된 항원의 최소량(대략 500 RU, 공명 유닛)을 사용하여 측정된다. PBS에서 5-400 nM 범위의 다양한 농도와 Fab에 대한 결합 비율은 30㎕/분의 유속으로 측정된다. 결합 데이터가 BIA 평가 소프트웨어 (Biacore)의 Langmuir의 1:1 모델로 도입된다. PA83으로의 Fab의 결합에 대한 결합 상수 및 해리 상수(각각 k_on 및 k_off)가 35 ℃에서 측정된다.

서열 분석

선별된 클론의 중쇄 서열 및 경쇄 서열이 Genome Express sequencing(Meylan, France)을 통해서 ompseq 및 newpelseq 프라이머(Andris-Widhopf, Rader and al., 2000)를 사용함으로써 결정된다. 서열은 IMGT 시스템을 사용하여 온라인으로 분석된다(http:/imgt.cines.fr).

결과

Fab (35 PA83 ) 돌연변이체 라이브러리의 구조

시험관내 친화도 성숙은 향상된 친화도를 갖는 신규한 돌연변이체를 생산하기 위하여 실시된다. 상기 목적을 위해서, 돌연변이체 라이브러리는 6 CDRs로부터 잔기들을 배타적으로 돌연변이화함에 의해서 형성되며, 즉 73 위치에 위치한 잔기이다. 크기와 관련하여, 상기 라이브러리는 5.4×10⁸ 형질변형체를 포함한다. 45개의 독립적인 플라스미드 클론은 다양성(표 1) 및 돌연변이율을 결정하기 위하여 서열화된다. 실험에 의한 돌연변이율은 3 돌연변이/단편(VH+VL)에 해당하며, PA에 대한 친화도가 향상된 돌연변이 조합체를 직접 선별할 수 있다.

선별된 라이브러리(표 1)와 비교하여 선별되지 않은 라이브러리에서 표적 CDR내 각 위치에서 돌연변이 빈도를 분석함으로써 몇개의 위치(음영으로 표시)가 변이에 내성이 없는 것이 알 수 있다. 그러므로, 상기 위치에 위치한 잔기는 항원에 결합하기위한 중요 잔기인 것으로 보이며, 항원-결합 자리를 그대로 보존한다. 특히 CDR1내 (H31-H40)잔기는 항원-접촉 잔기로서 정의된다.

선별 과정 중에 실질적인 선별 압력이 발휘된다면, 선별되지 않은 라이브러리가 선별된 서열, 특히 L-CDR1 및 H-CDR1과 비교하여 더 넓은 다양성을 갖는 것으로 보인다.

선별된 라이브러리에서 2개의 위치(검은색), H117 및 L27가 종종 돌연변이된다. 돌연변이 J24-l5를 제외하고, 잔기 세린 H117의 돌연변이는 Fab의 항원으로의 결합에 영향을 주지 않는다(표 2). 대조적으로, 글루타민 L27 잔기는 Fab 친화도(돌연변이체 6, 7)을 감소시키는데 부정적인 효과를 보이거나, 또는 Fab 발현 효율(커뮤니케이션되지 않은 데이터)에 영향을 주는 것으로 보인다.

Fd 단편

경쇄

표 1: 표적 CDR 위치에서 돌연변이 빈도

해당 위치에서 돌연변이된 서열의 비율(%)(54개의 개별서열)

표 2: Fab 35PA83 및 이의 돌연변이체에 대한 결합 친화도 및 카이네틱스

결합 상수(K_on) 및 해리 상수(K_off)는 표면 플라즈몬 공명(BlAcore)을 통해서 측정되며, K_D는 K_off _/ K_on 비율에 해당하도록 계산된다.

돌연변이체 스크리닝

돌연변이체 라이브러리는 3개의 사이클 (R1, R2 및 R3) 감염-선별성-회수 사이클로 나타낸다. 단계 R3 이후에, 12개의 개별 클론은 V_H와 V_L의 서열화을 통해 분석되었다. 상기 8개의 돌연변이체로부터, 2개는 유사한 것으로 나타났다. 그러므로 7개의 개별 Fabs는 수용성 Fabs로서 나타낸다. 이들 중 3개는 SPR을 통한 친화도를 측정할 수 있는 충분한 방법으로 표현되었다.

V2 삼중 돌연변이체는 35PA83과 비교하여 더 낮은 해리 상수(K_off = 8.1 10⁵ s^-1) 및 약간 빠른 결합 상수(K_on = 1.22 10⁵ M^-1.s^-1)를 보이며, 이는 친화도가 5.15배 증가된 것에 기인한다. 상기 돌연변이체는 중쇄 가변 영역에서 3개의 돌연변이를 포함한다: H-CDR1 (G31_AS)에서 한개 및 H-CDR2 (R66K, K73R)에서 2개의 돌연변이.

제3 사이클 이후에, 파아지가 2가지 삽입 선별 방법에 따라 스크리닝된다: 항원-코팅된 웰에서 장기간 배양하는 방법("long-lasting incubation selection") 또는 매우 낮은 농도에서 수용성 바이오티닐화 항원을 사용하는 방법("very low concentration soluble antigen selection").

매우 낮은 농도의 수용성 항원에서 용출을 통한 선별

라이브러리 R3은 100 nM 내지 0.01 pM 범위의 바이오티닐화 PA83의 농도를 감소시킴으로써 선별된다. 1 pM은 음성 대조군보다 많은 클론을 용출할 수 있는 최저 농도를 나타낸다. 조건 6으로부터 수득된 개별 클론은 처음으로 중쇄 서열 및 경쇄 서열에 의해서 분석된다. 대략 35%는 와일드 서열을 포함한다.

조건 6

상기 28개의 돌연변이체로부터, 47%는 SPR을 통해 친화도가 측정될 수 있도록 충분히 발현된다. 클론 중복성 때문에, 8개의 돌연변이체가 발현되었고, 이들의 카이네틱 상수가 측정된다. 최상의 친화도 상수(K_D= 1.8 10^-10 M, 18.9의 향상된 인자를 나타냄)를 갖는 항체 단편은 3중 돌연변이체 6.20이다. 상기 돌연변이체는 중쇄 CDR2 (H55L 및 S74G)내 2개의 돌연변이 및 경쇄 CDR2 (Q68L)내 한개의 돌연변이를 포함한다.

장기 배양 선별

24일에 용출된 18개의 클론으로부터, 14개는 완전히 서열화되었고(V_H 및 V_L), 오직 3개는 와일드 타입을 갖는다. 6개의 돌연변이체는 이들의 카이네틱 상수를 결정하기 위하여 충분히 발현된다. 이중 돌연변이체 J24-7 (K_D= 7.8 10^-10 M) 및 J24-15 (K_D= 8.8 10^-10 M)는 각각 4.35 및 3.96의 인자에 의해서 결합 친화도가 증가된 것으로 보인다.

변이체의 인간화

사람에게 주입된 항생제는 사람 타입일 때 매우 잘 내성이 생긴다. 대조적으로, 동물 기원의 항생제는 유해한 부작용을 일으킬 수 있으며, 신속하게 폐기된다. 그러나, 항체 초가변 영역은 친화도 돌연변이에 있어서 크게 돌연변이화되어 이의 서열 분석에도 불구하고 이들의 기원을 결정하기 어렵다. Fabs는 불변 영역을 갖지 않기 때문에, 프레임워크 영역은 이들 내성과 관련된 유일한 영역이다.

Fab 35PA83의 내성 및 이로부터 유도된 분자의 내성을 향상시키기위해서, 상기 Fab는 인간화되었다. 자동 분석이 IMGT 서버 (htfp://imgt.cines.fr)에서 실시되며, Fab 35PA83의 프레임워크 영역에서 위치를 결정할 수 있고, 잔기는 사람 제미날 유전자에 의해서 암호화되는 잔기와는 상이하며, 35PA83의 것과 가장 유사한 서열을 암호화한다. 임시 합성(occasional synthesis) 또는 돌연변이 절차는 Fab 35PA83 돌연변이체를 암호화하고 사람 서열과 동일성이 증가된 소수의 돌연변이를 갖는 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. 35PA83과 비교하여 유효성 친화도 변경을 일으키지 않는 돌연변이는 표 3 및 표 4 및 5에 나타내었다. 모든 돌연변이들이 조합되어 35PA83 모체 Fab에 대해서 88.69%인 것과 비교하여 사람 제미날 유전자에 의해서 암호된 프레임워크 영역과 97.75% 동일한 Fab 프레임워크 영역을 암호화하는 신규한 합성 유전자를 형성한다. 그러나, 상기 완전 인간화 돌연변이의 친화도(K_D= 9 10^-9 M)는 Fab 35PA83과 비교하여 대략 3의 인자로 절단된다.

표 3 : 35 PA83 의 친화도를 변경하지 않는 중쇄 프레임워크 영역내 돌연변이

표 4 및 5: 35PA83의 친화도를 변경하지 않는 경쇄 프레임워크 영역에서 돌연변이

종래 출원 FR 07 06744의 서열목록

<110> LFB Biotechnologies ETAT FRANCAIS REPRESENTE PAR LE DELEGUE GENERAL POUR L'ARMEMENT <120> G IMMUNOGLOBULIN USED AGAINST ANTHRAX TOXINS <130> ip-2010-0052 <150> FR0759419 <151> 2007-11-29 <150> PCT/FR2008/052160 <151> 2008-11-28 <160> 37 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 103 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 1 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val Gly Asp Lys Val Thr 1 5 10 15 Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Trp Leu Ala Trp Tyr 20 25 30 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser 35 40 45 Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala 65 70 75 80 Ser Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Ala Pro Leu Ala Phe Gly Pro 85 90 95 Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys 100 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 2 Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys 1 5 10 15 Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile 20 25 30 Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Gly 35 40 45 Ser Thr Ala Asp Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr 50 55 60 Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu Gln Leu Arg Ser 65 70 75 80 Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 85 90 95 Asn Phe Trp Ser Gly Glu Tyr Tyr Gly Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ala Val Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 4 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 5 <211> 210 <212> PRT <213> chimeric construct <400> 5 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val Gly Asp Lys Val Thr 1 5 10 15 Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Trp Leu Ala Trp Tyr 20 25 30 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser 35 40 45 Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala 65 70 75 80 Ser Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Ala Pro Leu Ala Phe Gly Pro 85 90 95 Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 100 105 110 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 115 120 125 Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 130 135 140 Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 145 150 155 160 Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 165 170 175 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 180 185 190 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 195 200 205 Glu Cys 210 <210> 6 <211> 449 <212> PRT <213> chimeric construct <400> 6 Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys 1 5 10 15 Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile 20 25 30 Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Gly 35 40 45 Ser Thr Ala Asp Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr 50 55 60 Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu Gln Leu Arg Ser 65 70 75 80 Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr 85 90 95 Asn Phe Trp Ser Gly Glu Tyr Tyr Gly Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ala Val Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 7 <211> 309 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 7 acccagtctc catcgtccct gtctgcatat gtgggagaca aagtcaccat cacttgccat 60 gccagtcagg gtattaacag ttggttagcc tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct 120 aaacttctga tctataaggc gtccagtttg caaagtgggg tcccatcaag gttcagcggc 180 agtggatctg ggacagatta tactctcacc atcagcagct tgcagtctga agactttgct 240 tcttattact gtctacaata tgacagtgcc ccattggctt tcggccccgg gaccaagctg 300 gatatcaaa 309 <210> 8 <211> 363 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 8 caggagtcgg gaccaggact gctgaagcct tcggaaaccc tgtccctcac ctgcgctgtc 60 tctggtgact ccatcagcag cggttactac tggagctgga tccgccagtc cccagggaag 120 gggctggagt ggattgggca tatctatggt agtactgcgg acaccaagta caacccctcc 180 ctcaggagtc gagtcaccat ttcaaaagac acgtccaaga accagctctc cctgcaactg 240 aggtctgtga ccgccgcgga cacggccgtg tattattgtg cgagatcggg ttacaatttt 300 tggagtggtg aatattacgg tttggattcc tggggccaag gggccgtcgt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 9 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990 <210> 10 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cgaactgtgg ctgcaccaag tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321 <210> 11 <211> 630 <212> DNA <213> chimeric construct <400> 11 acccagtctc catcgtccct gtctgcatat gtgggagaca aagtcaccat cacttgccat 60 gccagtcagg gtattaacag ttggttagcc tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct 120 aaacttctga tctataaggc gtccagtttg caaagtgggg tcccatcaag gttcagcggc 180 agtggatctg ggacagatta tactctcacc atcagcagct tgcagtctga agactttgct 240 tcttattact gtctacaata tgacagtgcc ccattggctt tcggccccgg gaccaagctg 300 gatatcaaac gaactgtggc tgcaccaagt gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 360 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 420 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 480 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 540 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 600 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 630 <210> 12 <211> 1353 <212> DNA <213> chimeric construct <400> 12 caggagtcgg gaccaggact gctgaagcct tcggaaaccc tgtccctcac ctgcgctgtc 60 tctggtgact ccatcagcag cggttactac tggagctgga tccgccagtc cccagggaag 120 gggctggagt ggattgggca tatctatggt agtactgcgg acaccaagta caacccctcc 180 ctcaggagtc gagtcaccat ttcaaaagac acgtccaaga accagctctc cctgcaactg 240 aggtctgtga ccgccgcgga cacggccgtg tattattgtg cgagatcggg ttacaatttt 300 tggagtggtg aatattacgg tttggattcc tggggccaag gggccgtcgt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 13 <211> 78 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 13 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggcttctgc tgctctggct cccaggtgcc 60 agatgtgcca tccagttg 78 <210> 14 <211> 47 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 14 ctcagtacta gtgccgccac catggacatg agggtccccg ctcagct 47 <210> 15 <211> 44 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 15 acctgggagc cagagcagca gaagccccag gagctgagcg ggga 44 <210> 16 <211> 43 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 16 tgctctggct cccaggtgcc agatgtgcca tccagttgac cca 43 <210> 17 <211> 45 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 17 ctcccacata tgcagacagg gacgatggag actgggtcaa ctgga 45 <210> 18 <211> 47 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 18 ctcagtacta gtgccgccac catggacatg agggtccccg ctcagct 47 <210> 19 <211> 45 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 19 ctcccacata tgcagacagg gacgatggag actgggtcaa ctgga 45 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 20 tcgtccctgt ctgcatatgt gggag 25 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 21 gatgaagaca cttggtgcag ccacagttcg tttgatatcc ag 42 <210> 22 <211> 47 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 22 ctcagtacta gtgccgccac catggacatg agggtccccg ctcagct 47 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 23 gatgaagaca cttggtgcag ccacagttcg tttgatatcc ag 42 <210> 24 <211> 76 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 24 atgaaacatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60 gtgcagctgc aggagt 76 <210> 25 <211> 47 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 25 ctcagtgcta gcgccgccac catgaaacat ctgtggttct tccttct 47 <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 26 cccatctggg agctgccacc aggagaagga agaaccaca 39 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 27 tggcagctcc cagatgggtc ctgtcccagg tgcagctgca gg 42 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 28 cagtcctggt cccgactcct gcagctgcac ctggg 35 <210> 29 <211> 47 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 29 ctcagtgcta gcgccgccac catgaaacat ctgtggttct tccttct 47 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 30 cagtcctggt cccgactcct gcagctgcac ctggg 35 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 31 cagctgcagg agtcgggacc aggactg 27 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 32 accgatgggc ccttggtgga ggctgaggag acggtgac 38 <210> 33 <211> 47 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 33 ctcagtgcta gcgccgccac catgaaacat ctgtggttct tccttct 47 <210> 34 <211> 38 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 34 accgatgggc ccttggtgga ggctgaggag acggtgac 38 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 35 gctcgataca ataaacgcca 20 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> s?uence artificielle : amorce <400> 36 tctgggatag aagttattca g 21 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> chimeric construct <400> 37 ggaagtagtc cttgaccagg cag 23

Claims

탄저균 독소의 방어 항원(PA)에 대한 G 클래스의 면역글로불린(IgG)으로서,
- 서열번호 1과 아미노산이 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(light-chain variable region); 및
- 서열번호 2와 아미노산이 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 위치 25에서 세린 잔기, 위치 54에서 리신 잔기 및 위치 60에서 아르기닌 잔기에 해당하는 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역(heavy-chain variable region)을 포함하는,
IgG1 또는 IgG2로 구성되는 것을 특징으로 하는, G 클래스의 면역글로불린(IgG).
제 1 항에 있어서,
- 서열번호 1로 명시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및
- 서열번호 2로 명시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 G 클래스의 면역글로불린(IgG).
제 1 항에 있어서,
경쇄 가변 영역(서열번호 1)은 하기로부터 선택된 1 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 G 클래스의 면역글로불린(IgG):
- none/A (1)
- none/I (2)
- none/Q (3)
- none/L (4)
- Y/S (14)
- K/R (18)
- H/R (24)
- L/V (124).
제 3 항에 있어서,
경쇄 가변 영역(서열번호 1)은 하기 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 G 클래스의 면역글로불린(IgG):
- none/A (1)
- none/I (2)
- none/Q (3)
- none/L (4)
- Y/S (14)
- K/R (18)
- H/R (24)
- L/V (124).
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
중쇄 가변 영역(서열번호 2)은 하기 돌연변이로부터 선택된 1 이상의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 G 클래스의 면역글로불린(IgG):
- none/Q (1)
- none/V (2)
- none/Q (3)
- none/L (4)
- none/Q (5)
- none/E (6)
- L/V (12)
- A/T (24)
- A/T (122)
- V/L (123).
제 4 항에 있어서,
서열번호 2로 명시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역은, 하기 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 G 클래스의 면역글로불린(IgG):
- none/Q (1)
- none/V (2)
- none/Q (3)
- none/L (4)
- none/Q (5)
- none/E (6)
- L/V (12)
- A/T (24)
- A/T (122)
- V/L (123).
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
경쇄의 불변 영역은 서열번호 3으로 명시된 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄 불변 영역은 서열번호 4로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 G 클래스의 면역글로불린(IgG).
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
각 중쇄들의 불변 영역은 γ1 타입을 갖는 것을 특징으로 하는 G 클래스의 면역글로불린(IgG).
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
각 중쇄들의 불변 영역은 γ1 타입을 가지며 서열번호 7의 아미노산을 포함하고, 각 경쇄들의 불변 영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 G 클래스의 면역글로불린(IgG).
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
각 경쇄들은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하며, 각 중쇄들은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 G 클래스의 면역글로불린(IgG).
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 핵산.
제 11 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
제 12 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 13 항에 있어서,
SP2/0, YB2/0, IR983F, 나말와 사람 골수종(Namalwa human myeloma), PERC6, CHO 세포주, 특히 CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NS0, SP2/0-Ag 14 및 P3X63Ag8.653으로부터 선택된 세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 1 이상의 사람 IgG를 포함하는 조성물.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 1 이상의 사람 IgG를 포함하는 약학적 조성물.
제 1 항 내지 제 10 항에 따른 사람 IgG를 바실러스 안트라시스에 의한 감염을 치료 또는 예방하기 위한 의약품 제조에 사용하는 것을 특징으로 하는 사람 IgG의 용도.
하기를 포함하는, PA-함유 탄저균 독소를 검출하기 위한 키트:
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 표식화된 IgG를 포함하는 용기,
- 상기 표식화된 IgG를 검출하기위한 수단을 포함하는 용기.
하기 단계를 포함하는, 생물학적 시료내 PA-함유 탄저균 독소를 시험관내 검출하는 방법:
- 상기 생물학적 시료를 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 IgG와 접촉시키는 단계; 및
- 상기 탄저균 독소의 존재의 지표로서 상기 IgG의 결합을 검출하는 단계.
치료제에 결합된 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 IgG를 포함하는 면역접합체(immunoconjugate).