CN101952311A

CN101952311A - 用于抗炭疽毒素的g免疫球蛋白

Info

Publication number: CN101952311A
Application number: CN2008801186354A
Authority: CN
Inventors: P·蒂利耶; C·贝朗
Original assignee: Universite de Montpellier I; Etat Francais
Current assignee: LFB Biotechnologies SAS; Etat Francais
Priority date: 2007-11-29
Filing date: 2008-11-28
Publication date: 2011-01-19
Also published as: EP2235057B1; BRPI0820215A2; BRPI0820215A8; EP2235057A2; US9012608B2; JP2011504743A; US20110201033A1; AU2008332943B2; FR2924431A1; AU2008332943B9; CA2707201A1; KR20100091204A; ES2649565T3; WO2009071860A3; FR2924431B1; WO2009071860A2; AU2008332943A1

Abstract

本发明涉及针对炭疽毒素保护性抗原(PA)的G类免疫球蛋白(IgG)，其包含：轻链可变区，其包含与如说明书中所定义的序列SEQ ID NO：1有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，和重链可变区，其包含与如说明书中所定义的SEQ ID NO：2有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，其特征在于它由IgG1或IgG2组成。

Description

用于抗炭疽毒素的G免疫球蛋白

技术领域

本发明涉及针对细菌炭疸芽孢杆菌(Bacillus anthracis)PA亚基(保护性抗原)的灵长源化G免疫球蛋白。

现有技术

炭疽是由革兰氏阳性细菌炭疽芽孢杆菌引起的传染病。该细菌是非运动性的，其形成具有高度抗性的孢子，在例如人或动物血液或组织的环境中存在时萌发形成营养体型。尽管非常具有抗性，所述孢子不复制，但是另一方面它们可在土壤中存活数十年。

炭疽毒素介导的感染可以下列三种形式发生：皮肤、肺或消化道。肺感染是最常致命的。一旦吸入，炭疽芽孢杆菌孢子穿过肺泡，特别地，在那里它们被巨噬细胞和树突状细胞所吞噬。在这些细胞中所述孢子萌发，营养体型在淋巴结中扩增。然后，细菌进入血液循环，连续复制并产生毒素，部分地对该疾病的致命特性负责。炭疽毒素由三种不同的蛋白质组成：保护性抗原(PA，在细胞内酶切割之前为83kDa，切割后为63kDa)，致死因子(LF，90kDa)和水肿因子(EF，89kDa)。致死毒素由PA和LF形成；水肿毒素由PA和EF形成，在疾病病理中的作用较不显著。

这些蛋白质通过细菌作为无毒单体分泌，聚集在靶细胞表面上形成有毒复合物。

到目前为止，已经使用多种抗生素比如青霉素、多西环素和氟喹啉酮类(例如环丙沙星)治疗炭疽感染。

但是，这些抗生素中的一些可能对一些对抗生素有抗性的菌株无效。特别地，这些治疗中的一些可能不可用于对抗恐怖主义或者细菌战争，在这些情况下可故意传播抗生素抗性株。

另外，因为抗生素不能抑制炭疽毒素作用，有必要将这些抗生素在感染的早期阶段施用，但是由于最初症状是非特异性的，所以很难建立早期诊断。

已经开发出主要成分是保护性抗原PA的疫苗，但是仅用于强烈怀疑接触过炭疽芽孢杆菌的人。另外，由于获得足够的免疫性需要几个月的时间，所以这些疫苗不能用于紧急情况。目前在法国，这些疫苗中没有一种被批准用于人体。因此，需要开发不同于抗生素的新的治疗和预防方法。

通过抗体的被动免疫是中和所述毒素的有效策略。已经进行了一些努力来使用针对保护性抗原(PA)和致死因子(LF)的单克隆抗体中和炭疽致死毒素。通过使用抗体中和炭疽致死毒素，例如可通过抑制PA与其细胞受体的结合、通过抑制PA切割、通过抑制PA与LF的结合或者通过抑制LF作用来实现。

因此，开发能够中和炭疽毒素的新型抗体以预防和有效治疗炭疽受到普遍关注。

在最近的工作中，已经用保护性抗原PA83免疫短尾猴，获得用于治疗炭疽毒素介导的人感染的抗体。本发明人从骨髓扩增了编码PA83-特异抗体片段的基因，并对其克隆以构建文库。

已经分离出称为35PA83的高亲和性(Kd＝3.4nM)和强中和的片段(50％抑制浓度＝5.6+/-0.13nM)(Laffly等人，antimicrobial agents andchemotherapy，2005，49(8)：3414-3420)。

免疫球蛋白片段35PA83通过抑制PA与其细胞受体的任何相互作用来中和炭疽毒素。

但是，在准备用于将此免疫球蛋白片段用于医学(预防或治疗)用途时，改善其亲和性可有利地降低施用给患者的量以及治疗费用。另一方面，因为该免疫球蛋白片段的猿来源，其可带来免疫原性的风险以及人生物利用率的变化。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供获得自所述免疫球蛋白片段35PA83的针对抗原PA的IgG1或IgG2同种型的完全免疫球蛋白，其经过预先修饰使得对抗原的亲和性提高，并具有与人抗体更大的相似性。

因此，本发明的一个目的是提供针对炭疽毒素的保护性抗原(PA)的G类免疫球蛋白(IgG)，其包含抗体35PA83的可变区，其已突变了少数残基，以及一些人来源的恒定区。

本发明的另一个目的是提供编码本发明IgG的核酸，以及包含这些核酸的载体和含有该载体的宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供包含本发明IgG的组合物以及包含所述IgG的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供本发明的IgG在制备用于治疗或预防炭疽芽孢杆菌感染的药物中的用途。

本发明还涉及炭疸毒素检测试剂盒，体外检测炭疽毒素的方法，以及含有本发明IgG的免疫缀合物。

发明详述

因此本发明的一个目的是提供针对炭疽毒素的保护性抗原(PA)的G类免疫球蛋白(IgG)，其包含：

-轻链可变区，其包含与序列SEQ ID NO：1有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，和

-重链可变区，其包含与SEQ ID NO：2有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，并且包含分别对应于25位丝氨酸残基、54位赖氨酸残基和60位精氨酸残基的氨基酸残基，其特征在于由IgG1或IgG2组成。

根据本发明，具有与参考的第二核酸至少90％同一性的第一核酸将具有与所述参考的第二核酸至少90％、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.3％、98.6％、99％、99.6％的核苷酸同一性。

根据本发明，具有与参考的第二多肽至少90％同一性的第一多肽将具有与所述参考的第二多肽至少90％、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、98.3％、98.6％、99％、99.6％的氨基酸同一性。

由通过比较窗口比较两个最佳比对序列来确定如本文使用的两个核酸序列或两个多肽序列之间的“同一性百分比”。

因此，所述比较窗口中核苷酸或氨基酸序列的部分可包含相比于参考序列(其不包含这些添加或缺失)的添加或缺失(例如“缺口”)，从而获得两个序列之间的最佳比对。

通过下述步骤来计算同一性百分比：确定相同的核酸碱基或相同氨基酸残基位置的数目，其可标注于两个比较的序列，然后将观察到两者的核酸碱基或两者的氨基酸残基之间相同的位置的数目除以比较窗口中位置的总数，之后将结果乘以100，获得两个序列之间核苷酸同一性的百分比或者两个序列之间氨基酸同一性的百分比。

可通过计算机使用已知算法来进行所述序列最佳比对的比较。

最优选地，使用CLUSTALW软件(1.82版)确定序列同一性百分比，其参数设置如下：(1)CPU MODE＝ClustalW mp；(2)ALIGNMENT＝″full″；(3)OUTPUT FORMAT＝″aln w/numbers″；(4)OUTPUT ORDER＝″aligned″；(5)COLOR ALIGNMENT＝″no″；(6)KTUP(word size)＝″default″；(7)WINDOW LENGTH＝″default″；(8)SCORE TYPE＝″percent″；(9)TOPDIAG＝″default″；(10)PAIRGAP＝″default″；(11)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE＝″none″；(12)MATRIX＝″default″；(13)GAP OPEN＝″default″；(14)END GAPS＝″default″；(15)GAP EXTENSION＝″default″；(16)GAP DISTANCES＝″default″；(17)TREE TYPE＝″cladogram″和(18)TREE GRAP DISTANCES＝″hide″。

关于本发明抗体的轻链可变区和重链可变区上突变的注释，以及更一般性地补充本发明抗体一些实施方案的说明，本领域技术人员可查阅2007年9月26日提交的法国专利申请No.FR 07/06744“用于抗炭疽毒素的抗体”的说明书，其内容附在本说明书的最后，从48页至75页。

序列SEQ ID NO：2的25位丝氨酸残基的存在对应于图11的“35H”部分上标记为“31A”的突变，在那里此突变也可称为“G/S(31A)”。

序列SEQ ID NO：2的54位赖氨酸残基的存在对应于图11的“35H”部分上突变“66”，在那里此突变也可称为“R/K(66)”。

序列SEQ ID NO：2的60位精氨酸残基的存在对应于可称为“K/R(73)”的突变，并对应于图11的“35H”部分上73位精氨酸残基。

根据本发明，“对应于”25位丝氨酸残基、54位赖氨酸残基和60位精氨酸残基的残基组成上文所述的残基，以及：

(i)其位于与序列SEQ ID NO：2具有至少90％同一性的序列中的相同位置，或

(ii)其位于不同的位置，例如由于相比于作为参考的序列SEQ IDNO：2，与序列SEQ ID NO：2具有90％同一性的序列包含一个或多个氨基酸缺失或添加。

本发明的另一个目的是提供如上文定义的G类免疫球蛋白(IgG)，其特征在于含有：

-具有序列SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的轻链可变区，和

-具有序列SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的重链可变区。

已经通过用炭疽的保护性抗原PA83免疫短尾猴获得由Fd片段的轻链构成的免疫球蛋白片段35PA83，如Laffly等人(2005)所述。

可通过本领域技术人员已知的常规方法测定抗体的亲和性“K_D”。

亲本非修饰抗体(即非突变的)35PA83具有3.4 10^-9M的亲和K_D。已经从通过表面等离振子共振实时测量的结合和解离常数计算得到此亲和常数，如实施例中所述。

本发明IgG的轻链可变区(SEQ ID NO：1)来自于免疫球蛋白片段35PA83的轻链可变区，其序列可获得自计算机数据库，如Genbank，登录号为CAH17921和AJ810487。

有利地，具有序列SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的本发明IgG的轻链可变区另外包含至少一个选自下列的突变：

-无/A(1)

-无/I(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-Y/S(14)

-K/R(18)

-H/R(24)

-L/V(124)。

突变无/A(1)表示氨基酸“A”添加在图11“35L”部分的序列1位处，以及序列SEQ ID NO：1的-4位处，即如果存在的话残基N^o-3紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o-2紧接着的上游，或者如果不存的话残基N^o-1紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o1紧接着的上游。

突变无/I(2)表示氨基酸“I”添加在图11“35L”部分的序列的2位处，以及序列SEQ ID NO：1的-3位处，即如果存在的话残基N^o-2紧接着的上游，或者如果不存的话残基N^o-1紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o1紧接着的上游。

突变无/Q(3)表示氨基酸“Q”添加在图11“35L”部分的序列3位处，以及序列SEQ ID NO：1的-2位处，即如果存在的话残基N^o-1紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o1紧接着的上游。

突变无/L(4)表示氨基酸“L”添加在图11“35L”部分的序列4位处，以及序列SEQ ID NO：1的-1位处，即残基N^o1紧接着的上游。

突变Y/S(14)表示位于图11“35L”部分的序列14位以及序列SEQ IDNO：1的10位的氨基酸″Y″替换为氨基酸“S”。

突变K/R(18)表示位于图11“35L”部分的序列18位以及序列SEQ IDNO：1的14位的氨基酸″K″替换为氨基酸“R”。

突变H/R(24)表示位于图11“35L”部分的序列24位以及序列SEQ IDNO：1的20位的氨基酸″H″替换为氨基酸“R”。

突变L/V(124)表示位于图11“35L”部分的序列124位以及序列SEQ IDNO：1的100位的氨基酸″L″替换为氨基酸“V”。

优选地，添加这些突变中至少一个能够使得相比于其所来源的片段35PA83降低本发明IgG轻链可变区的免疫原性。

特别有利地，具有序列SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的本发明IgG的轻链可变区包含下列的突变：

-无/A(1)

-无/I(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)。

-无/A(1)

-无/I(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-Y/S(14)

-K/R(18)

-H/R(24)

-L/V(124)。

优选地，添加这些残基能够使得相比于其所来源的片段35PA83降低本发明IgG轻链可变区的免疫原性。

本发明IgG的重链可变区(SEQ ID NO：2)来自于免疫球蛋白片段35PA83的Fd片段的可变区，其序列已在计算机数据库中登记，如Genbank，可通过登录号CAH17920和AJ810486获取。

有利地，具有序列SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的重链可变区另外包含至少一个选自下列的突变：

-无/Q(1)

-无/V(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-无/Q(5)

-无/E(6)

-L/V(12)

-A/T(24)

-A/T(122)

-V/L(123)。

突变无/Q(1)表示氨基酸“Q”添加在图11上“35H”部分的序列1位处，以及序列SEQ ID NO：2的-6位处，即如果存在的话残基N^o-5紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o-4紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o-3紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o-2紧接着的上游，或者如果不存的话残基N^o-1紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o1紧接着的上游。

突变无/V(2)表示氨基酸“V”添加在图11上“35H”部分的序列2位处，以及序列SEQ ID NO：2的-5位处，即如果存在的话残基N^o-4紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o-3紧接着的上游，或者如果不存的话残基N^o-2紧接着的上游，或者如果不存的话残基N^o-1紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o1紧接着的上游。

突变无/Q(3)表示氨基酸“Q”添加在图11上“35H”部分的序列3位处，以及序列SEQ ID NO：2的-4位处，即如果存在的话残基N^o-3紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o-2紧接着的上游，或者如果不存的话残基N^o-1紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o1紧接着的上游。

突变无/L(4)表示氨基酸“L”添加在图11上“35H”部分的序列4位处，以及序列SEQ ID NO：2的-3位处，即如果存在的话残基N^o-2紧接着的上游，或者如果不存的话残基N^o-1紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o1紧接着的上游。

突变无/Q(5)表示氨基酸“Q”添加在图11上“35H”部分的序列的5位处，以及序列SEQ ID NO：2的-2位处，即如果存在的话残基N^o-1紧接着的上游，或者如果不存在的话残基N^o1紧接着的上游。

突变无/E(6)表示氨基酸“E”添加在图11上“35H”部分的序列的6位处，以及序列SEQ ID NO：2的-1位处，即残基N^o1紧接着的上游。

突变L/V(12)表示位于图11上“35H”部分的序列的12位处以及序列SEQ ID NO：2的5位处的氨基酸″L″替换为氨基酸V。

突变A/T(24)表示位于图11上“35H”部分的序列的14位处以及序列SEQ ID NO：2的17位处的氨基酸″A″替换为氨基酸T。

突变A/T(122)表示位于图11上“35H”部分的序列的122位处以及序列SEQ ID NO：2的113位处的氨基酸″A″替换为氨基酸T。

突变V/L的(123)表示位于图11上“35H”部分的序列的123位处以及序列SEQ ID NO：2的114位处的氨基酸″V″替换为氨基酸L。

优选地，添加这些突变中至少一个能够使得相比于其所来源的片段35PA83降低本发明IgG重链可变区的免疫原性。

本发明IgG的重链可变区(SEQ ID NO：2)来自于免疫球蛋白片段35PA83的Fd片段的可变区，其序列已经在计算机数据库中登记，如Genbank，可通过登录号CAH17920和AJ810486获取。与免疫球蛋白片段35PA83的可变区相比，本发明的重链可变区(SEQ ID NO：2)经过修饰，因为其包含三个下列突变：G/S(31A)、R/K(66)和K/R(73)。有利地，相比于免疫球蛋白片段35PA83可变区，这三个突变使得能够改善根据本发明IgG重链可变区的亲和性。

特别有利地，具有序列SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的重链可变区另外包含下列的突变：

-无/Q(1)

-无/V(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-无/Q(5)

-无/E(6)。

-无/Q(1)

-无/V(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-无/Q(5)

-无/E(6)

-L/V(12)

-A/T(24)

-A/T(122)

-V/L(123)。

在本发明的一个特定实施方案中，所述抗体的轻链可变区(SEQ IDNO：1)包含下列突变：

-无/A(1)

-无/I(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)，

以及，所述抗体的重链可变区(SEQ ID NO：2)包含下列突变：

-无/Q(1)

-无/V(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-无/Q(5)

-无/E(6)。

有利地，本发明IgG的轻链恒定区包含包含序列SEQ ID NO：3的氨基酸序列，重链恒定区包含包含序列SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

出于说明本发明的目的，术语“免疫球蛋白”旨在表示具有特异性结合特定抗原能力的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子片段。公知的免疫球蛋白片段为例如F(ab′)2、Fab、Fv、scFv和Fd片段。

G型免疫球蛋白(IgG)是由通过二硫键彼此结合的2条重链和2条轻链组成的异二聚体。每个链由N端位置的所述免疫球蛋白针对的抗原特异性的可变区或结构域(轻链由重排的基因V-J编码，重链由V-D-J编码)以及C端位置的恒定区构成，所述恒定区对轻链来说由单个结构域CL或者对重链来说由三个结构域(CH₁、CH₂和CH₃)组成。重链和轻链的可变结构域以及CH₁和CL结构域的相互作用形成Fab部分，其通过非常柔性的铰链区与Fc区域连接，使得每个Fab结合其抗原靶标，同时介导所述抗体效应子性质的Fc区域保持可接近免疫效应子、吞噬细胞或杀伤细胞以及补体；这些恒定区不参与抗原的结合。由2个球形结构域CH₂和CH₃构成的Fc区域在CH₂结构域上糖基化，在两条链的每一条上存在结合于Asn 297的乳糖胺类型的双天线N-聚糖。

关于可变区，其涉及所述抗体与其表位的结合。

恒定区(Fc)已经过酶促切割使得从其中保留绞链区的抗体称为F(ab′)2片段，其保留两个抗原结合位点。

类似地，其恒定区的绞链区已经过酶促切割或者产生没有该区域的恒定区的抗体称为Fab片段，其保留两个抗原结合位点中的一个。

Fd片段由VH和CH₁区域形成。

决定互补性的区域(CDR，互补决定区)位于可变区中，也称为高变区，其直接与抗原相互作用。对CDR进行修饰使得有可能修饰抗体的亲和性。位于可变区中的第二种类型区域称为构架区(FR)，其保留CDR的三级结构。这些构架区对抗体来源的物种来说是相对特异性的。有四个构架区(FR1至FR4)位于在重链和轻链的Fd片段中，其分别由三个CDR(CDR1至CDR3)所隔开。

根据上文对本发明抗PA IgG的重链可变区和轻链可变区氨基酸的描述，本领域技术人员能够合成或使得合成编码这些氨基酸序列的核酸。

有利地，本发明IgG的每个轻链和重链的恒定区是人恒定区。

优选地，本发明IgG每个轻链的恒定区是κ类型。任何同种异型可适用于实施本发明，例如Km(1)、Km(1，2)、Km(1，2，3)或Km(3)，尽管优选的同种异型是Km(3)。

每个抗体重链的恒定区可以是γ1型、γ2型或γ3型，这三种类型的恒定区具有附着人补体的特征，或者γ4型。

优选地，每个抗体重链的恒定区是γ1型，因为此类抗体能够在最大量的个体(人)中诱导ADCC活性。在这方面，任何同种异型可适用于实施本发明，例如G1m(3)、G1m(1，2，17)、G1m(1，17)或G1m(1，3)。优选地，同种异型是G1m(1，17)。

有利地，本发明IgG的每个重链恒定区是γ1型，包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，本发明IgG的每个轻链恒定区包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

有利地，本发明的IgG的每个轻链包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，本发明IgG的每个重链包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供编码本发明IgG的核酸。

本发明IgG的每个轻链可变区由核酸序列SEQ ID NO：7编码，根据本发明的每个抗体重链的可变区由小鼠核酸序列SEQ ID NO：8编码。

在本发明的一个特定方面，本发明IgG的每个重链恒定区由人核酸序列SEQ ID NO：9编码，其每个轻链恒定区由人核酸序列SEQ ID NO：10编码。

更特定地，根据本发明的每个抗体轻链由核酸序列SEQ ID NO：11编码，每个重链由核酸序列SEQ ID NO：12编码。

本发明的另一个目的是提供包含编码本发明IgG的核酸的载体。

本文使用的“载体”表示可通过限制性酶切然后连接插入目的序列的核酸，其用于转移到多种遗传环境及其中或者用于在宿主细胞中表达。载体例如是质粒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)和来源于噬菌体P1的人工染色体(PAC)、病毒来源的载体。克隆载体是能够在宿主细胞中复制的载体，其另外的特征在于存在一个或多个核酸内切酶限制性位点。表达载体是其中通过限制性酶切或连接的方法插入了目的DNA序列使得能够复制和/或转录成RNA的载体。所述载体可另外含有一个或多个标志物，用以选择或鉴定已经被所述载体转化或转染的细胞。

这些核酸可引入到重组载体中，用以克隆或表达本发明的抗体。

本发明包括所有用于真核或原核细胞转化、转染或基因治疗的含编码序列的重组载体。根据分子生物学的常规方法制备这些载体，其还包含合适的启动子，任选地用于输出或分泌的信号序列以及所述核苷酸序列转录所需的调节序列。

纯化本发明抗体可能需要融合多肽。所述融合结构域可包含例如多组氨酸尾，其使得能够在Ni²⁺柱上纯化或者丝状噬菌体膜锚，其特别可用于根据称为“噬菌体展示”的技术筛选文库。

适用于本发明背景的载体有适于接受和表达第一和第二DNA序列的重组DNA分子，使得能够表达异二聚化抗体，例如根据本发明的全长抗体或F(ab′)2或Fab片段。这些载体提供了在载体中所存在的两个分开的盒中独立克隆两种DNA序列的系统，使得形成表达所述异二聚体抗体的第一和第二多肽的两个分离的顺反子。这些表达载体称为双顺反子载体。

本发明的经修饰抗体可在真核细胞比如CHO细胞或者人或小鼠杂交瘤细胞例如以及转基因植物和动物细胞中产生。

本发明的另一个目的是提供原核或真核的宿主细胞，其包含根据本发明的载体。

有利地，本发明表达载体使得能够表达本发明IgG的轻链。在此特定实施方案中，所述载体是核酸分子，其中插入了编码每个IgG轻链的可变区的核酸序列SEQ ID NO：7以及编码每个抗体轻链的恒定区的核酸序列SEQ ID NO：10，从而将它们引入宿主细胞并保持于其中。其使得能够在宿主细胞中表达这些核酸外源片段，因为其具有此表达所需的序列(启动子、多腺苷化序列、选择基因)。这些载体是本领域技术人员公知的，可以是腺病毒、逆转录病毒、质粒或噬菌体，此列表是非限制性的。另外，任何哺乳动物细胞可用作宿主细胞，也就是说表达本发明IgG轻链的表达载体所携带的核酸片段的细胞，例如YB2/0、CHO、CHO dhfr-(例如CHO DXB11、CHO DG44)、CHO Lec13、SP2/0、NS0、293、BHK或COS。

有利地，本发明的表达载体使得能够表达本发明IgG的重链。在此特定实施方案中，所述载体是使得能够表达本发明IgG的分子，其重链由核酸序列SEQ ID NO：12所编码。此载体是核酸分子，其中已经插入编码每个IgG重链的可变区的核酸序列SEQ ID NO：8以及编码每个抗体重链的恒定区的核酸序列SEQ ID NO：9，使得将它们引入宿主细胞并将其保持在那里。其使得能够在宿主细胞中表达这些核酸外源片段，因为其具有此表达所需的序列(启动子、多腺苷化序列、选择基因)。如上所述，所述载体可以是例如质粒、腺病毒、逆转录病毒或噬菌体，并且宿主细胞可以是任何哺乳动物细胞，例如YB2/0、CHO、CHO dhfr-(CHO DX B11、CHODG44)、CHO Lec13、SP2/0、NS0、293、BHK或COS。

本发明的载体可包含编码本发明免疫球蛋白的重链和/或轻链的序列。

实现本发明IgG重链和轻链表达的载体实例在实施例2中给出。此载体是含有针对本发明IgG的重链和轻链的两个转录单元的独特载体。

本发明的另一个目的是提供包含例如如上所述定义的载体的宿主细胞。

有利地，本发明宿主细胞选自：SP2/0，YB2/0，IR983F，Namalwa人骨髓瘤，PERC6，CHO细胞系，特别是CHO-K-1，CHO-Lec10，CHO-Lec1，CHO-Lec13，CHO Pro-5，CHO dhfr-，Wil-2，Jurkat，Vero，Molt-4，COS-7，293-HEK，BHK，K6H6，NS0，SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653。

在一个优选实施方案中，在YB2/0大鼠杂交瘤(YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞，其以登录号ATCC CRL-1662提交于美国典型培养物保藏中心)中产生所述抗体。选择该细胞系是因为其能够产生具有ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性的抗体，其相比于在例如CHO细胞中获得的类似一级结构的抗体有改善。

在本发明的一个特定方面，表达本发明抗体的稳定细胞系，更特别地选自上述的那些群体，整合了例如上述的重链和轻链的表达载体之一或之二。

本发明的另一个目的是提供包含至少一种本发明IgG的组合物。

本发明的另一个目的是提供包含至少一种本发明IgG的药物组合物。

所述药物组合物优选地包含可药用载体。本文使用的这些载体旨在表示不干扰所述组合物活性组分生物活性效力的无毒材料。表述“可药用”指与生物学体系例如细胞、细胞培养物、组织或有机体相容的无毒材料。所述载体的特征依赖于施用方法。

本发明涉及至少一种本发明的IgG在制备用于治疗或预防炭疽芽孢杆菌感染的药物组合物或药物中的用途。

本文使用的术语“预防”意为在个体特别是人中疾病尚未出现之前防止所述疾病的发生。

本文使用的术语“治疗”对应于对该疾病的抑制，即停止其发展、消退、或者疾病的症状和后果消失、或者疾病的原因消失。

可标记本发明的IgG。合适标志物的例子包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物和生物发光化合物。

标志物与抗体的结合方法是本领域技术人员公知的。

另一种标记方法为将所述抗体与低分子量半抗原偶联，所述半抗原可通过第二反应进行具体修饰。合适半抗原的例子包括生物素，其与亲和素反应，或者二硝基酚、吡哆醛或荧光素，其与抗半抗原特异性抗体反应。

本发明的一个目的是提供含PA炭疽毒素检测试剂盒。该试剂盒包含：

-包含至少一种本发明抗PA IgG的容器，该抗体带有标记或未带标记，

-任选地，包含缓冲溶液的容器，

-和任选地包含带标记IgG检测工具的容器，例如与报告分子如荧光或酶标记物相结合的生物素-结合蛋白，如亲和素或链霉亲和素。此容器还可包含非标记的IgG检测工具，即基本上的抗体或抗体片段。

本发明的IgG可用于体外，例如在免疫学测定中，其中它们在液相中或者固定于固相载体上使用。公知载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖、尼龙、淀粉酶、天然或改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖或磁铁。使用本发明抗PA IgG的免疫学测定的实例有放射性免疫测定、组织免疫学标记技术、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀测定、免疫扩散测定、补体固定测定、荧光激活细胞分选测定(Fluorescence-activatedCell Sorting，FACS)或者蛋白质芯片分析。

本发明的另一个目的是提供用于体外检测生物样品中含PA炭疽毒素的方法，其包括下列步骤：

-将所述样品与包含至少一种本发明抗PA IgG相接触，和

-检测所述抗体的结合，作为所述炭疽毒素的存在的指示。

生物样品可以是液体：例如唾液、尿、脑脊液、血清或血液，或者固体或半固体，例如组织或粪便或实体组织例如常规用于组织学诊断的。

本发明的另一个目的是提供用于体内检测含PA炭疽毒素的方法，其中向个体施用带标记的本发明IgG。带标记IgG的施用量应足以使得所述抗体结合待检测的毒素。带标记IgG的施用量取决于一些因素，例如个体的年龄和性别，以及疾病的阶段。所述施用量可以为0.01mg/kg至50mg/kg不等，优选0.1mg/kg至20mg/kg，更优选0.1mg/kg至2mg/kg。

为了实施体内诊断，本发明经修饰的抗PA IgG应直接或通过官能团间接与放射性同位素相连。通常使用的官能团包括例如二亚乙基-三胺-五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。放射性同位素金属离子的例子包括¹¹¹In，⁹⁷Ru，⁶⁷Ga，⁶⁸Ga，⁷²As，⁸⁹Zr和²⁰¹Tl。

为了使用磁共振成像(MRI)或者通过电子自旋共振(ESR)进行诊断，经修饰的本发明抗PA IgG也可用顺磁同位素标记。还可使用发射正电子的γ放射性同位素，例如¹⁵⁷Gd，⁵⁵Mn，¹⁶²Dy，⁶⁸Ga，⁵²Cr和⁵⁶Fe。

本发明的IgG也可用于体外或体内监测疾病治疗的发展，例如通过确定炭疽毒素靶向的细胞数增加或减少，或者生物样品中PA毒素浓度的变化。

本发明的一个目的是提供治疗可能被炭疽芽孢杆菌感染的个体、优选人的方法，其中向所述个体施用治疗有效量的根据本发明修饰的抗PA抗体。

本文使用的表述“治疗有效量”旨在表示在施用给需要治疗的个体时足以实施该治疗的量。治疗有效量取决于个体、所治疗疾病的阶段以及施用方法，其由本领域技术人员通过常规程序确定。

本文使用的术语“炭疽”旨在表示任何由炭疽芽孢杆菌感染直接地或间接地造成的疾病。吸入感染的最初症状与鼻炎类似(发烧、肌肉痛)。数天后，这些症状发展为呼吸困难和脓毒性休克的严重问题。吸入炭疽细菌通常是致命的。

在细菌通过之前存在的皮肤间隙穿透皮肤时，发生炭疽皮肤感染。此感染最初导致形成丘疹，其在两到三天内发展成小泡，之后发展为1至3厘米直径的溃疡，中心有坏死区域。炭疽肠胃传染是由摄入受污染的肉引起的，其特征在于肠道急性炎症。

治疗有效量对应于足以减轻少疾病症状和感染发展的量。该量根据个体的年龄和性别以及疾病阶段而不同，由本领域技术人员所决定。治疗有效量可以是每天一剂或多剂中0.01mg/kg至50mg/kg不等，优选0.1mg/kg至20mg/kg，更优选0.1mg/kg至2mg/kg，持续一天或更长。

施用方法可以是注射或逐渐输注。注射可以是静脉内、腹膜内、肌内、皮下或者透皮类型。

用于胃肠外施用的制剂可包含无菌水溶液或非水溶液、混悬液或乳剂。非水溶剂的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄或者可注射有机酯例如油酸乙酯。水载体包括水、醇/水溶液、乳剂或混悬液。

本发明的另一个目的是提供免疫缀合物，其包含与治疗剂直接或间接相结合的本发明IgG。

这些治疗剂包括化学剂、放射性核素、免疫治疗剂、细胞因子、趋化因子、毒素或酶抑制剂。毒素的例子有白喉毒素A链、外毒素A链、篦麻毒蛋白A链、红豆碱A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲毒素、Aleurite fordii蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白、石碱草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、mitogelline、局限曲菌素(restrictocine)、酚霉素(phenomycine)、enomycine和tricothecenes。放射性核素的例子包括²¹²Bi，¹³¹I，¹³¹In，⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。

有利地，本发明IgG与基于四环素的预防性治疗相结合。通过在基于四环素的快速治疗(“短期治疗”)之后注射本发明IgG，本发明IgG通过在暴露风险之后以安全的方式停止使得能够缩短基于四环素的预防。

有利地，本发明IgG与使用环丙沙星的治愈性治疗相结合。

使用下列有关抗PA IgG制剂例子的补充描述更容易理解本发明。

附图说明：

在下列实施例中，将提及下文以举例形式给出的附图：

图1：区域VKV2(本发明IgG的轻链可变区，其包含表1所述的突变)的扩增示意图。

图2：区域VHV2(本发明IgG的重链可变区，其包含表2所述的突变)的扩增示意图。

图3：载体CHK463-23的图。

图4：载体HK558-12的图。

图5：使用IgG 35PA83v2(包含表1和表2所述突变的本发明IgG)的预防性治疗。2mg/kg的IgG 35PA83v2使得能够获得60％的存活率，5mg/kg使得能获得100％的存活。直至第30天，未观察到新事件。

图6：使用四环素的预防性治疗。在第7天后停止四环素施用，该治疗停止后第4至第7天之间所有小鼠死亡。

图7：使用多西环素的预防性治疗，补充或不补充IgG 35PA83。在A/J小鼠中起始基于四环素的治疗(5mg/kg的每日剂量)。12小时后，用10 000LD₅₀的Sterne菌株孢子感染动物。在注射或不注射35PA83(1或2mg/kg)的情况下，在治疗的第7天停止四环素注射。超过图上所示时间段未观察到特殊事件(第500小时)。在图上用符号″***″指示出高度显著的作用。

图8：基于环丙沙星的治疗，IgG 35PA83v2或其两者。单独使用环丙沙星或IgG 35PA83v2基本上没有存活，而两种分子的组合实现了80％的存活率。直至第30天，未观察到新事件。

图9：使用补充或未补充IgG 35PA83的环丙沙星的治疗。用1000LD₅₀的Steme孢子感染A/J小鼠。感染后12小时，在两个独立的组中(每组10只动物)，开始单独的基于环丙沙星的治疗(每天两次25mg/kg)，持续5天，或者注射单剂IgG 35PA83(10mg/kg)。在感染后的三个不同时间(12、24或48小时)，每次由不同组的动物参加，小鼠接受联合的基于环丙沙星的治疗(每天两次25mg/kg，共5天)加一次注射IgG 35PA83(10mg/kg)。超过图上所示时间段未观察到特殊事件(第150小时)。在图上用符号″*″(p＝0.03)或″**″(p＝0.0007)指示出显著作用。

图10：使用IgG 35PA83的被动预防性治疗。感染(10000LD₅₀)之前12小时施用一次35PA83注射(2mg/kg或5mg/kg)。在第30天，对30天后仍然存活的小鼠再次感染(10 000LD₅₀)。超过图上所示时间段未观察到特殊事件(第40天)。在图上用符号″***″指示出高度显著的作用(p＝0.0001)。

图11：非突变35PA83抗体重链可变区和轻链可变区的珍珠串构型。

IMGT珍珠串构型是与IMGT命名法一致的。点表示非常类似于35PA83的人基因与35PA83的差异。阴影环对应于根据IMGT命名法的缺失位置。

实施例

实施例1：构建Fab(35PA83)突变体文库

材料和方法

大肠杆菌菌株

使用下列大肠杆菌菌株：

-XL1(Stratagène，the jolla，CA)：recA1，endA1，gyrA96 thi-1 hsdR17sup E44 relA1 lac[F’proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)].

-SURE(Stratagène)：e14(McrA)Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5(Kanr)uvrC[F′proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)]

-HB2151(Carte等人，1985)，用于表达可溶性Fab。

毒素

炭疽毒素(PA83，LF和EF)获得自List实验室。

构建35PA83突变体文库

构建免疫球蛋白片段35PA83的突变体以人源化。通过实施如表3和4中所述的突变获得该突变体：

表1：为了人源化35PA83轻链的突变

残基号	35PA83	Hu35PA83
			1	无	A
2	无	I
			3	无	Q
4	无	L

表2：为了人源化35PA83Fd的突变

残基号	35PA83	Hu35PA83
			1	无	Q
2	无	V

3	无	Q
			4	无	L
5	无	Q
			6	无	E

从该人源化突变体开始，通过大规模诱变(Massive mutagenesis@(Biomethods，Evry，France))产生来自基因35PA83的突变体抗体文库。通过使用NNS密码子(N编码A、T、G或C，S编码G或C)将突变引入重链和轻链的CDR中。根据Kabat等人(Wu and Kabat 1970)和IMGT(Lefranc，Pommie等人2003)确定CDR区。

通过电穿孔使用DNA文库转化SURE细胞。将补充了羧苄西林的SB培养基添加到所述培养物并在37摄氏度下孵育1小时之后，将1毫升噬菌体辅助VCSM13(Andris-Widhopf等人，2001)(约10¹²pfu)添加到培养物。孵育2小时后，加入70微克/毫升的卡那霉素，将培养物置于搅拌之下在37摄氏度过夜。

通过噬菌体展示进行抗体选择

通过使用PEG沉淀，然后重悬于3ml的1％PBS-BSA-0.02％叠氮化物，用0.45微米滤器过滤，从50ml培养物中纯化并浓缩噬菌体-Fab颗粒。该噬菌体制剂的效价为约10¹⁰pfu/ml。噬菌体-Fab进行三种感染-选择回收循环，分别对应于5、10和15次清洗，例如之前所述的(Andris-Widhopf，Rader等人2000)。

可溶性Fab表达、周质提取和纯化

在化学感受态的称作HB2151的大肠杆菌菌株中转化每种DNA突变体。在30摄氏度下以250rpm搅拌的1L含50微克/毫升羧苄青霉素和0.1％葡萄糖的SB培养基中培养细胞。当培养物达到λ＝600nm处1.5的吸光度，用1mM IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)在22摄氏度下诱导18小时。

用多粘菌素B硫酸盐(Sigma)提取Fab，根据供应商的说明在镍柱(Ni-NTA离心柱，QIAGEN，Valencia，CA)上纯化，然后用PBS 1X在4摄氏度下透析3小时。

可溶性Fab的定量

通过SDS-PAGE检测Fab纯度，使用软件Quanity One(Biorad)测定其浓度。

表面等离振子共振(SPR)的实时测定

通过使用系统Biacore X SPR(BIAcore，Uppsala，Sweden)确定PA83和35PA83突变体之间相互作用的动力学常数。通过使用注射30微升10mM醋酸钠中2微克/毫升的PA83(pH4.5)的胺偶联方法将PA83固定于CM5灵敏芯片(Biacore)上。为了使再结合的可能性最小化，通过使用高流速(30微升/分钟)和最小量的偶联抗原(约500RU，共振单位)测定KD。使用30微升/分的流速测定PBS中5至400nM范围内多种浓度的Fab的结合率。将结合数据引入BIA评价软件(Biacore)中的1∶1朗缪尔模型。在35摄氏度下测定Fab与PA83结合的结合和解离常数(分别为K_on和K_off)。

序列分析

通过使用ompseq和newpelseq引物(Andris-Widhopf，Rader等人，2000)的基因组表达测序(Genome Express sequencing)(Meylan，France)测定所选择克隆的重链和轻链序列。通过使用IMGT系统(http:/imgt.cines.fr)在线分析序列。

结果

进行体外亲和性成熟，产生具有改善亲和性的新突变体。为了这一目的，通过只突变来自6个CDR的残基即73个位置上的残基建立突变体文库。考虑到大小，文库含有5.4x10⁸个转化子。对45个独立的质粒克隆进行测序，以确定多样性和突变率。实验突变率相当于3个突变/片段(VH+VL)，其使得有可能直接选择改善PA亲和性的突变组合。

与所选文库相比，在非选择的文库中分析靶标CDR中每个位置的突变频率(表1)显示一些位置不耐受变异。因此，位于这些位置的残基似乎是结合抗原的关键残基，保持了抗原结合位点的完整性。特别地，CDR1中的(H31-H40)残基定义为抗原-接触残基。

似乎是在选择过程中行使主要的选择压力，因为非选择文库具有比所选序列更宽的多样性，特别是在L-CDR1和H-CDR1中。

在所有突变的位置中，突变组合显示显著改善的亲和性：克隆v2，其结合亲和性和动力学特征在表3中给出。

表3：Fab 35PA83和克隆v2的结合亲和性和动力学特征。

通过表面等离振子共振(BIAcore)测定结合(K_on)和解离(K_off)常数，根据K_off/K_on比计算K_D。

与35PA83相比，V2三突变体显示较低的解离常数(K_off＝8.1 10⁵s^-1)以及稍微快一些的结合常数(K_on＝1.22 10⁵M^-1.s^-1)，使得亲和性增强x5.15。此突变体在重链可变区中含有3个突变：H-CDR1(重链可变区的CDR1)中的一个突变(G31AS)以及H-CDR2(重链可变区的CDR2)中的2个突变(R66K，K73R)。

第三循环之后，根据两种其它的选择方法筛选噬菌体：在覆盖有抗原的孔中长时间孵育进行淘洗(″长时间孵育选择″)或者使用非常低浓度的可溶性生物素化抗原(″非常低浓度的可溶性抗原选择″)。

实施例2：构建用于表达猕猴-人嵌合IgG 35PA83 v2的表达载体 HK558-12

相比于人源化突变体Fab 35PA83，所选突变体(v2)的重链可变区(VH)含有三个突变：G→＞S(H1的第6残基，根据IMGT命名法)，R→＞K(H2的第二锚定残基)和K→＞R(根据IMGT命名法的FR3的第6残基)。

通过“双”嵌合化，也就是说通过将人前导区添加到猕猴v2序列(克隆在质粒pCOMB(Andris-Widhopf等人，2000)中的v2序列不含前导序列)的5’，将人恒定区CK和G1添加到3’，从优化的独特通用载体CHK463-23-1(参见图3)构建载体HK558-12(参见图4)。

1.方法原理

已经使用分子生物学常规技术来构建载体HK558-12。通过组装PCR来扩增目的DNA序列(用“Proofstart DNA聚合酶”Qiagen参考202 203进行10个循环)，并克隆(通过限制性内切酶消化，然后连接)到质粒或表达载体中。之后，将因此获得的重组质粒引入细菌(转化细菌)用以扩增(培养细菌)，从而产生足够用于转染步骤的载体。纯化在细菌培养过程中获得的载体，然后线性化，以转染进YB2/0和CHO细胞系中。

1.1通过突变体v2轻链可变区(VKv2)的装配PCR进行合成

区域VKv2对应于下列区域的嵌合化：

-轻链可变区的前导区(VK)-起始VK：人序列Z0006(登录号)(亚组VK1，VK1-13)，选择CRSSA-IMGT：

-VK猕猴(质粒pComb3X，描述于Laffly等人，2005的文章，其含有v2的VH和VL序列)。

将人前导序列添加到VK猕猴的5’端，得到下列序列：

ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGT

(SEQ ID N^o13)

(斜体：起始人VK)

该序列不含有任何用于克隆步骤的限制性位点。

区域VKv2的扩增：

引物对VK1_CA和VK2_CA

该引物对使得引入Spe I位点和开始对应于最类似于v2序列的人VK前导序列(VK1-13 Z00006，登录号)的前导序列。

获得的扩增子对应于扩增子1(78pb)。

引物对VK3_CA和VK4_CA

该引物对使得能够引入剩下的前导序列，即人VK(VK1-13 Z00006)的5’区和v2的起始VK。获得的扩增子对应于扩增子2(75pb)。

引物对VK1_CA和VK4_CA

该引物对使得通过扩增子1和2的装配PCR获得扩增子3(136pb)。

引物对VK_CA_Nde和VK_CA_Dra

该引物对通过使用质粒pCOMB v2作为模板获得扩增子4(327pb)。此外，扩增子4含有人VK区域的上游，使得能够与扩增子3进行最后的装配PCR。

引物对VK1_CA和VK_CA_Dra

该引物对使得通过扩增子3和4的装配PCR获得扩增子5(438pb)。其使得人前导序列VK和VK猕猴序列成为相连。

所得引物和扩增子序列在图1中显示。

通过扩增子1和2的装配PCR获得扩增子3，引入SpeI位点、人前导序列VKe和v2的起始VK序列。扩增子4对应于v2的VK编码序列。

通过扩增子3和4的装配PCR获得最后的扩增子5，从而将人VK前导序列和VK猕猴序列相连。

1.2通过重链可变区与突变体v2的装配PCR进行合成(VHV2)

VHv2区域对应于下列区域的嵌合化：

-前导VH-起始VH：人序列M29812(登录号)(亚基VH4，VH4-59)。编码非常类似于35PA83的人基因V：对于Fd的IGHV4-59*01，对于轻链的IGKV1-13*02(IMGT命名法)，如上所述突变

-猕猴VH(质粒pComb3X)

将人序列添加到猕猴VH的5’，得到下述序列：

ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC

(SEQ ID N^o 24)

(斜体：起始人VH)

此序列不含有任何用于克隆步骤的限制性位点。

图2显示使用多个引物对及所得扩增子对VHV2区域的合成。

1.2.1VHV2区域的扩增

在图2中显示VHV2区域的扩增。

引物对VH1_CA和VH2_CA

该引物对使得引入Nhe I位点和对应于人VH(VH4-59M29812，编码最类似于35PA83的序列的人基因V：对于Fd为IGHV4-59*01，对于轻链为IGKV1-13*02(IMGT命名法)，如上所述突变)的前导序列起始。所得扩增子对应于扩增子1(70pb)。

引物对VH3_CA和VH4_CA_mut

该引物对使得引入剩余的前导序列，即人VH(VH4 M29812)的5’区域和v2的VH序列的起始。引物VH4_CA通过诱变缺失了VH起点处的ApaI位点。所得扩增子对应于扩增子2(59pb)。

引物对VH1_CA和VH4_CA_mut

该引物对使得通过扩增子1和2的装配PCR获得扩增子3(111pb)。

引物对5VH_CA_mut和3VH_CA_Apa

该引物对使得通过使用质粒pCOMB V2作为模板获得扩增子4(392个碱基)。此外，扩增子4含有人区域VH的上游，使得实现最后的装配PCR。

引物对VH1_CA和3VH_CA_Apa

该引物对使得通过扩增子3和4的装配PCR获得扩增子5(476pb)。其使得人VH和猕猴VH前导序列相连。

所得引物和扩增子序列在图2中显示。

通过扩增子1和2的装配PCR获得扩增子3，引入NheI位点、人VH前导序列和v2的序列VH的起始。扩增子4对应于v2的VH编码区。

通过扩增子3和4的装配PCR获得最后的扩增子5，从而将人VH和猕猴VH前导序列相连。

1.3对最终载体的测序和FDA(食品和药品管理局)验证

通过Sanger的方法(或者链终止法，参考文献Sanger F.and al，1977，PNAS 74：5463)进行测序。

所述技术涉及随机掺入双脱氧核苷酸(ddNTP)或者“终止物”，从而从固定端(测序引物的固定区域)产生所有以给定碱基(A、C、G或T)结束的片段。在自动化测序仪(大小相关分离和检测)上分析这些片段，使得确定各个碱基的顺序，由此确定给定DNA的序列。

根据FDA质量分级进行测序过程。其为最高的质量水平，测序DNA的双链双覆盖率，4倍的最小冗余度，100％准确性，专用工具，公开质量报告以及所产生文档的存档保存。

测序之后，以比对的形式将供应者提供的序列与理论预期的序列相比较(软件AlignX，Vector NTI，Invitrogen)。

1.4PCR筛选引物

引物5prsvbis

位于TU(转录单元)内含子K或H中的引物，与CK4或GSP2ANP一起使用，能够检测克隆后的VK插入序列(781pb扩增子)和VH插入序列(821扩增子)。

引物CK4

位于人恒定区CK的5’的引物，与5prsvbis一起使用，能够检测克隆后的VK插入序列。

引物GSP2ANP

位于人恒定区G1的5’的引物，与5prsvbis一起使用，能够检测克隆后的VH插入序列。

1.5中间载体K558-12

1.5.1在载体CHK463-23中的克隆

此步骤进行IgG 35PA₈₃ v2κ链的猕猴-人嵌合化。

通过装配PCR进行扩增和使用SpeI和DraIII消化之后，将序列VKv2端对端克隆到载体CHK463-23中的独特位点Spe I和Dra III中。

连接之后，通过PCR使用引物5prsvbis和CK4(781pb扩增子)筛选重组菌落，以检测插入序列的存在。

在通过PCR筛选的23个细菌克隆中，20个是重组的，其带有插入序列VKv2。纯化质粒之后，通过限制性酶Nde I(8536，1246，943个碱基)，DraIII(线性化)和Spe I(线性化)验证克隆1-8。

1.5.2对中间载体K558-12的VKv2区域的测序

通过使用引物CK4测序验证了8个鉴定的重组克隆。

克隆2，3，4，5和8在克隆位点Spe I和Dra III之间具有正确的序列。而克隆1和6含有突变，克隆7没有产生可处理的结果。

保留克隆55806231-2，以继续构建表达载体HK558-12。

1.6最终载体HK558-12

1.6.1克隆到载体K558-12中

该步骤进行抗体(IgG 35PA₈₃v2)重链的猕猴-人嵌合化。

通过组建PCR进行扩增和使用NheI和ApaI消化之后，将序列VHv2端对端克隆到中间载体K558-12中的独特位点Nhe I和Apa I中。连接之后，通过PCR使用引物5prsvbis和GSP2ANP(821pb扩增子)筛选重组菌落，以检测插入序列的存在。在通过PCR筛选的22个细菌克隆中，18个是重组的，并且带有插入序列VHv2。

1.6.2最终载体的VHv2区域的测序以及通过限制性酶的验证

纯化质粒之后，通过使用引物GSP2ANP测序验证克隆1至5、7、9和11。

克隆2、4、7和9在NheI和SpeI位点之间具有正确的序列，而另外四个克隆含有突变。

对克隆2、4、7和9进行限制性酶验证。限制性酶测定Nhe I(线性化)，Apa I(线性化)和Bgl II+Nde I(2900，2222，1975，1879，1246，934，9pb)可确认四个克隆具有预期的限制性酶特征。

选择克隆55806298-9用于表达猕猴-人嵌合抗体(IgG 35PA₈₃)。该载体图在图4中显示。

1.6.3通过消化验证最终载体

进行Not I消化(线性化)和Bgl II+NdeI双消化(2900，2222，1975，1880，1246，934，9pb)来验证来自所选克隆55806298-9的纯化质粒。

根据FDA等级对与预期的克隆55806298-9对应的所得限制性酶切特征测序。序列与预期一致。

1.6.4制备载体HK558-12用以转染

通过NotI(参考1.6.3段落)线性化的在TE缓冲液(10mM Tris pH8和1mM EDTA)中的载体HK558-12的制备物保存于-20℃，然后调整至1μg/μl的浓度，转移到细胞工程部门用以转染YB2/0和CHO细胞系。

实施例3：制备产生针对炭疽保护性抗原的猕猴-人嵌合单克隆抗体 35PA83v2的转化体

在YB2/0细胞系中(抗体EMABling

)和CHO细胞系中(非EMABling

的抗体)产生35PA83v2抗体，以研究在体外和体内糖基化对毒素中和活性的作用。

对于下文的实验，在下述条件下进行ELISA步骤：

在4摄氏度下用PBS中稀释的PA(5μg/ml，100微升/孔)包被96孔微量滴定板(maxisorp，Nunc，Danemark)过夜。通过加入200微升PBS-BSA5％在37摄氏度下保持1小时封闭平板，在37摄氏度下将PBS-0.1％吐温20-1％BSA中系列稀释的血清(100微升/孔)孵育2小时。在37摄氏度下，将抗小鼠IgG碱性磷酸酶缀合物或“抗人IgG碱性磷酸酶缀合物”(Sigma)(1/10000)孵育1小时。然后，在室温下将对硝基苯磷酸底物孵育30分钟。通过使用自动化微板读数仪(iEMS reader MF，Labsystems，Helsinky，Finland)测定405nm的吸光度确定结果。确定最后稀释度(其倒数决定血清效价)，提供低于或等于用作阴性对照的幼稚(

)血清2倍的信号。

在YB2/0细胞系中制备转化体的示意图在本说明书结尾处的表4中显示。

1.1转化体品质的验证

转化率

根据在选择培养基中D+3培养后五周P96中细胞生长率评价转化率。

在使用选择物质G418进行单选择时，转化率为约1/500至1/900。用选择物质G418和MTX(甲氨蝶呤)进行双选择时，其高于1/2200。

平均生产率

在用最多3/4的细胞填充孔时，准备3组8个P24孔，以获得最大生产(D+7)，用以评价平均生产。

这些组使得能够评价给定群体的平均特征，以确保获得最小特征性水平，而关于转化体的数据尚不可用。

载体HK558-12和载体对照组合的平均生产力分别为1.2微克/毫升和3.3微克/毫升。

1.2 Cloide选择

生产率：第一次筛选最大生产的cloides

通过含有3/4细胞的双选择P96孔上清的ELISA确定人IgG的生产，以获得有关生产能力的第一优先级cloides。

进行三次连续筛选(每2或3天)，每次筛选保留10个最佳生产者。在528个转化体中，继续研究27个并将其保存在P24中，对于其D+3的产率以及最大生产(D+7)同时对其进行研究。

D+3的产率以及最大生产(D+7)

所选的15个其中大多数产率高于5pcd并且最大生产高于10微克/毫升的最佳cloide生产者已经在选择性培养基(双选择)中在细胞水平上进行了扩增，以保存在液氮中。

岩藻糖率

通过ELISA对D+3和D+7的15个所选cloide的上清进行岩藻糖化测定。

1.3 cloide DD12的选择和转瓶中IgG的生产

保留Cloide DD12用以在转瓶(19L)中生产IgG，因为其在产率(11.6pcd)，最大生产(20.17μg/ml)和岩藻糖率(D+3时26.9％，和D+7时26.7％)选择标准方法是最佳的cloide。

产生461mg抗体用于纯化。浓缩(x15)和纯化后，获得351mg抗体，即足以进行体内初步测定的量。

1.4 3个cloide的克隆

使用有限稀释克隆最佳的3个生产者cloide DD12，FH2和GA11(产率大于10pcd，最大生产高于20μg/ml并且岩藻糖率低于33％)，从而消除转化体可能的不稳定性。

IgG生产：最佳生产克隆的第一次筛选

通过含有3/4细胞的P96孔中上清液的ELISA(酶联免疫吸附测定)确定人IgG的生产，从而获得有关生产能力的第一优先级克隆。

进行两次连续筛选(间隔7天)，保留每个cloide的8个最佳生产克隆。产量高于6微克/毫升。

D+3的产率

计算这24个克隆在D+3的产率，以选择15个最佳生产克隆，即5个克隆/cloide。其中大部分高于4pcd。

在细胞水平上扩增15个选择的克隆，保存在液氮中。

1.5 克隆DD12-8F2的选择

根据产率(6.6pcd)和D+3岩藻糖率(27.8％)选择标准保留作为最佳者的克隆DD12-8F2。

克隆DD12-8F2的特征接近于其亲本cloide DD12，只有较低的产率(D+3)除外，其是由于使用不同的培养基所致。克隆的产率是均一的，确认cloide的稳定性。

1.6 CHO细胞系中转化体的制备

在本说明书结尾处的表5中给出对应于在CHO细胞系中产生抗体35PA83的转化体制备的流程图。

2.1 转化体品质的验证

转化率

2.2 Cloide选择

生产率：第一次筛选最大生产的cloide。

在单选择和双选择中通过含有3/4细胞的P96孔上清液的ELISA确定人IgG的生产，以获得有关生产能力的第一优先级cloides。

进行三次连续筛选(每2至4天)，每次筛选保留10个最佳生产者。在953个转化体中，继续研究30个并将其保存在P24中，对于其D+4的产率以及最大生产(D+7)同时对其进行研究。

D+4的产率以及最大生产(D+7)

所选的15个最佳cloide生产者中大多数产率高于1pcd并且最大生产高于1微克/毫升，它们已经在选择性培养基(根据制备条件为单选择或双选择)中在细胞水平上进行了扩增，以保存在液氮中。

岩藻糖率

通过ELISA对D+7的15个所选cloide的上清液进行岩藻糖化测定。

在CHO细胞系中所得IgG的岩藻糖率通常高于75％。

2.3 基因扩增

对于具有低生产率并且不能产生所需量抗体的转化体，进行基因扩增以增加整合载体的拷贝数以及由此增加所扩增cloide的产率。

对3个cloide(13G8，9D4和8F11)和2个cloide组(4个cloide的1组(PA1)以及8个cloide的1组(PA2)进行基因扩增。该选择是考虑D+4产率、最大生产和岩藻糖率的所得总体结果做出的。

通过将细胞转移到带有G418和MTX的选择性培养基进行基因扩增。对于没有使用MTX制备的cloide使用5nM浓度的MTX进行扩增第一步骤，而对于使用10nM MTX制备的cloide，则使用40nM。然后，测定D+4的IgG生产。

然后进行进一步的扩增步骤，在扩增第二步骤中增加MTX浓度x4，在扩增第三步骤中为x16。

分析D+4的生产率显示在扩增过程中IgG的生产增加。事实上，产率是基因扩增前所得产率的约4倍。

2.4 两个cloide的选择和cloide 13G8在转瓶中的生产

在扩增后Cloide 13G8和9D4具有最佳生产率，其在扩增第二步骤中达到最大产率。

因此，在选择性培养基中细胞水平上扩增Cloide 13G8(20nM MTX)和9D4(160nM MTX)，用以在液氮中保存。

对来源于cloide 13G8和9D4的纯化IgG进行岩藻糖率测定之后，保留cloide 13G8(20nM MTX)用以在转瓶(5.5L)中生产IgG。相对于纯化的IgG的岩藻糖率为76.6％。

生产65.5mg的IgG用以纯化。纯化后，获得46.2mg的抗体。

2.5结论

对于在YB2/0细胞系中的生产，考虑到所有的选择标准，保留最佳的cloide DD12，其产率为11.6pcd、最大生产为20.17μg/ml以及岩藻糖率为约27％。

该cloide在转瓶(19L)中的生产获得351mg纯化的抗体，其岩藻糖率为26％。

对于在CHO细胞系中的生产，考虑到所有的选择标准，保留最佳的cloide 13G8(20nM MTX)，其产率为8.2pcd以及相对于纯化IgG的岩藻糖率为约76.6％。

该cloide在转瓶(5.5L)中的生产获得46.2mg纯化的抗体，其岩藻糖率为84％。

因此，来自两种细胞系的纯化抗体量都足以进行第一次体内测定。

实施例4：体外中和测定

在YB2/0细胞中生产DD12之后，回收细胞培养物中的上清液，浓缩15倍，然后使用A-Sepharose重组蛋白进行亲和层析。通过阳离子交换柱HiPrep 16/10 SP FF进行第二个纯化步骤。通过SDS-PAGE以及结合重组PA83的ELISA验证纯化的IgG的完整性以及不存在任何杂质。

通过表面等离振子共振(SPR)使用BIAcore^TM(Biacore Uppsala，Sweden)测定亲和性。根据供应者的说明，通过胺结合将PA83(List生物学实验室，Campbell，CA)以210RU的最大值固定于CM5芯片(Biacore)。在测定过程中保持30微升/分的流动。对每个测定，将浓度为10至0.1微克/毫升的HBS-EP缓冲液(Bioacore)中IgG的至少6个稀释物测试1900秒。每次稀释IgG后，用甘氨酸pH1.5(Biacore)再生芯片，以10微升/分流动30秒。通过二价分析物方法(Karlsson等人1991)计算常数，通过内部一致性测试进行检查(Schuck等人1996)。

根据Little等人所述的方案(Little等人，1990)进行体外中和试验。以96孔板上14000细胞/孔的浓度将小鼠巨噬细胞细胞系J774A.1(ATCC-LGC，Molsheim，France)孵育16小时。将各自在PBS中以1毫克/毫升稀释并保存于冷冻状态待用的致死毒素组分：400ng/ml PA(Listlaboratories)和40ng/ml LF同时添加到IgG或者单独的培养基，在37摄氏度下孵育1小时。然后，将孵育产物添加到巨噬细胞，在37摄氏度下孵育4小时。根据供应者的说明使用Cytotox测定(Promega)用以评价细胞的存活。针对100％细胞存活(对照孔不含毒素或IgG)和0％存活力(对照孔含有毒素但不含IgG)校正每个测定。

结果：测得的IgG 35PA83的表观亲和性为80pM，测得的50％中和值(IC₅₀)为0.75±0.02nM(平均值±SD)，其表示：四分之一的(IgG 35PA83/PA)或者二分之一的比值(IgG 35PA83结合位点/PA)。

实施例5：药代动力学分析

为了评价IgG 35PA83的半衰期，将六只六周龄A/J小鼠(Harlan，Gannat，France)分为相同大小的两个小组。所有小鼠接受IgG 35PA83，其通过10mg/kg剂量的单次皮下注射施用。每天交替使用小鼠，从第1天至注射后第6天，然后从第8天至注射后第10天，通过每日眶后穿孔收集血液。在对所得值线性外推之后，从对血清样品组的ELISA测试结果确定IgG 35PA83的半衰期。

对于ELISA检测的实施，通过与在PBS缓冲液(5微克/毫升，100微升/孔)中稀释的抗原PA83或抗原LF(List Laboratories)一起在4摄氏度下孵育过夜覆盖96孔微量滴定板的孔。然后，用200微升体积的PBS缓冲液中5％牛血清白蛋白(BSA)溶液一起在37摄氏度下孵育1小时封闭微量滴定板孔中的自由部位。在0.1％吐温20，1％BSA的PBS缓冲液中制备系列血清稀释物，然后在37摄氏度下在平板中孵育2小时(100微升/孔)。然后，将所述板的孔与1/10000稀释的抗小鼠IgG/碱性磷酸酶缀合物或者抗人IgG/碱性磷酸酶缀合物(Sigma，Saint Louis，Missouri，United States)一起在37摄氏度下孵育1小时。然后，将对硝基苯磷酸底物(Sigma)加入到其中，在实验室温度下孵育平板30分钟。通过使用自动化微板读数仪(iEMS reader MF，Labsystems，Helsinki，Finland)确定405nm的吸光度。有限稀释点定义为信号值为幼稚小鼠血清所测信号两倍的点，其倒数值对应于血清抗体效价。幼稚小鼠血清用作阴性对照。

结果：测得A/J小鼠中IgG 35PA83的半衰期为7.78±1.46天。

实施例6：大鼠中被动保护测定

对于体内测定，向Fischer大鼠(体重250至300g)(C.River，L’Abresle，France)注射每250g大鼠40μg的PA(List biological laboratories，Campbell，CA)和8μg的LF，如Ezzel等人(Ezzell等人，1984)所述，唯一不同在于使用尾静脉。使用每组4只动物，为评价IgG 35PA83，在注射前将IgG添加到PA和LF。一天两次观察大鼠，共10天。该研究中的全部体内测定经过当地动物试验和管理道德委员会的批准。

Sterne菌株孢子的制备和使用：

根据Albrecht等人所述(Albrecht等人，2007)制备炭疽Sterne菌株孢子(巴斯德保藏中心)，在冷冻条件下保存(-20摄氏度)。在冷冻/解冻后通过对存活的平板计数来对孢子进行计数，在每个管用于本研究时验证计数。测得静脉施用给9周龄20至25g体重的A/J雄性小鼠(Harlan，Gannat，France)的这些孢子的LD50值为1x10⁴，导致48至72小时内死亡，接近另一个研究中使用的2x10⁴的值(Albrecht等人，2007)。

结果：注射毒素的大鼠在仅2小时内死亡。当用0.15nmol IgG 35PA83保护时，仅有2只大鼠在4.5小时和5小时时死亡(认为作用是统计学显著的，p＝0.045)。在使用0.2nmol IgG 35PA83时，4只大鼠存活(显著作用，p＝0.03)，对应于0.8的摩尔比(结合位点比IgG/PA83的抗原)。

实施例7：使用IgG 35PA83 v2的预防性治疗、使用四环素的短期治疗，或者两者

对于使用IgG 35PA83v2或仅使用四环素的预防性治疗的研究，在感染前12小时通过皮下途径将IgG注射到10只A/J小鼠组(一次注射5mg/kg或2mg/kg)。通过10 000LD50或1x10⁸孢子进行攻击，一天两次观察小鼠，共2周，然后一周5次，再2周。一个月后通过用相同量孢子再次感染测试存活的小鼠，对其再观察一个月。对于包含四环素和IgG 35PA83的预防性治疗研究，以与使用仅四环素的方案中相同的方式用四环素治疗10只小鼠的组，唯一不同在于在攻击前12小时注射IgG 35PA83v2。为测试主动保护，通过皮下途径用每只小鼠5微克弗氏完全佐剂中的PA注射10只小鼠。第二组接受相同的注射，然后，1个月后，用相同剂量的弗氏不完全佐剂中的PA刺激该组的免疫应答。

结果：用10000LD50攻击前12小时开始预防性治疗，存活曲线在图5和6中显示(四环素，7天)。施用了5mg/kg的IgG 35PA83的所有小鼠存活下来，施用2mg/kg IgG 35PA83的小鼠有60％存活(显著的，p＜0.0001)。在这16只存活的小鼠中，在注射35PA83和攻击一个月之后，通过人抗IgG缀合物不能检测出任何抗体，因此认为此阶段不含有IgG35PA83。针对PA的小鼠IgG的小鼠效价在64000至128000的范围内，针对LF的小鼠IgG的效价在32000至64000的范围内，与接受的剂量无关。在这些小鼠受到10000LD50的Sterne菌株孢子再次攻击时，初始感染之后一个月，所有均存活。

施用了四环素预防性治疗的所有小鼠在治疗期间存活(7天)。但是，这些小鼠在抗生素施用停止后4至7天内死亡。当用一次注射1mg/kg剂量的IgG 35PA83补充此最后注射时，20％的小鼠存活(非显著性结果)，但是在使用2mg/kg剂量时，它们所有均存活(显著性，p＝0.008)。通过一次注射PA主动保护的小鼠在一个月后具有25000至50000的抗PA抗体效价。之后，对它们进行攻击，10只小鼠中有6只存活(认为具有显著性，p＝0.01)。通过两次注射PA主动保护的小鼠在第二次注射后1个月具有160000至640000范围的抗PA抗体效价，其所有均存活。

因此，所实施的检测显示一次注射IgG 35PA83v2能够缩短基于四环素的预防，并且在所述预防性治疗结束时以2mg/kg剂量一次注射抗体时，可在小鼠中观察到100％存活。相反，对通过使用四环素短期治疗(7天)保护的小鼠注射1000LD50的炭疽Sterne菌株，开始治疗后12小时，60％的小鼠存活。在用10000LD50攻击后，施用四环素的所有小鼠在停止抗生素施用的7天内死亡，可能是由于迟发的孢子萌发。因此，证明在暴露风险后可以安全的方式停止四环素的预防性治疗，所述安全的方式即通过用四环素短期治疗然后注射IgG 35PA83。因为这些给药期较短，此方案有利地使得有可能设想由患者摄入抗生素，并且预见由于抗生素剂量降低带来的费用降低。

实施例8：使用IgG 35PA83 v2的预防性治疗、使用多西环素的短期治疗，或者两者

对10只10周龄A/J小鼠组(Harlan，Gannat，France)进行使用多西环素，使用或不使用IgG 35PA83的预防性治疗研究，通过腹膜内途径以每天一次5mg/kg的剂量注射用作预防的抗生素。感染前12小时开始化学预防，持续7天，其代表60天的标准持续时间缩短9/10。

选择约为人标准剂量两倍的多西环素剂量(成年人每日剂量3mg/kg)，证明较小的剂量对于炭疽芽孢杆菌来说是有效的(Friedlander等人，1993，J Infect Dis，Vol.167：1239-1243；Kalns等人，2002，Biochem Biophys ResCommun，Vol.297：506-509)。已经有使用较高的剂量(Heine等人，2007，Antimicrob Agents Chemother，Vol.51：1373-1379)；但是可观察到50mg/kg的剂量似乎不被A/J小鼠很好的耐受，其出现腹胀和竖毛。对于用IgG 35PA83补充多西环素的治疗，注射单剂此抗体(1或2mg/kg)或者不伴随最后一次多西环素给药。通过腹膜内途径使用1x10⁸注射孢子进行感染，其代表10 000LD₅₀。最初两周每天两次观察小鼠，然后接下来的两周一周五次。

结果：在2001年美国的炭疽散播之后，已经关注了使用抗生素的长期预防性治疗的不完全观察结果(60天)。为了确定IgG 35PA83是否能降低治疗持续时间，在使用10000LD50感染之前12小时，开始用5mg/kg每日剂量的多西环素进行预防性治疗，一共仅7天。在所述治疗的最后一天，用单次注射IgG 35PA83补充抗生素预防性治疗，或者没有补充(图7)。但是，当用1mg/kg IgG 35PA83补充此最后一次多西环素注射时，到死亡的平均持续时间增加到288-456小时，20％的小鼠存活，其表示显著的保护作用(与多西环素比较，p＜0.001)。在2mg/kg IgG 35PA83的剂量时，所有十只动物均存活。感染后一个月，全身性收集十二只存活小鼠的血清，合并，保存在-20摄氏度下。通过ELISA检测了血清后，抗PA IgG的抗体效价平均为64000，抗LF IgG的抗体效价平均为32000。

实施例9：使用IgG 35PA93 v2的治疗、使用环丙沙星的短期治疗，或者两者

对于研究治疗方案，使用1000LD50或1x10⁷个孢子攻击10个A/J小鼠的组。12小时后，分别注射IgG 35PA83v2(皮下，1次注射10mg/kg)或环丙沙星(皮下，每天两次50mg/kg，共5天)，或者在第一天注射环丙沙星和IgG 35PA83两者，然后再另外单独注射环丙沙星4天。

结果：1000LD50攻击之后12小时开始治疗，在图8中显示存活曲线(环丙沙星，治疗五天，或者IgG 35PA83或两者)。施用环丙沙星五天的小鼠无一存活，施用IgG 35PA83的小鼠仅有10％存活(无显著性结果)。但是，施用环丙沙星和IgG 35PA83的小鼠有80％存活(显著的，p＝0.0007)。

同时使用环丙沙星和IgG 35PA83能够获得80％的存活率。在治疗性用途中证明了IgG PA83和环丙沙星的强协同效应，有趣地，没有疫苗实现此短期抗生素治疗(5天)，因为此时间限制不允许产生免疫应答。另外，IgG 35PA83最有可能是在此短期抗生素治疗后预防复发，为此，对于半衰期预期比小鼠中至少长3倍的人来说(3至7天对21天)甚至可以更加有效。

实施例10：使用IgG 35PA103 v2的治疗、使用环丙沙星的短期治疗，或者两者(其它测定)

对于治愈性治疗的研究，使用1000LD₅₀或1x10⁷个孢子的剂量感染10个A/J小鼠的组。12小时后，分别用环丙沙星或(皮下，一次初始注射25mg/kg)用IgG 35PA83v2(皮下，一次注射10mg/kg)治疗小鼠；或者在两个不同部位同时注射环丙沙星和IgG 35PA83。开始联合治疗(环丙沙星和IgG 35PA83)之前24小时和48小时，还测试了其它的延迟。在第一次施用所述治疗后，在接下来的4.5天里注射单独的环丙沙星(25mg/kg，一天两次)。选择约为人标准剂量两倍的环丙沙星剂量(成年人每日剂量20mg/kg)，此剂量已经有效用于对抗炭疽芽孢杆菌(Kalns等人，2002，Biochem Biophys Res Commun，Vol.297：506-509)。在开始该研究之前，在A/J小鼠中有利地测试了对该所选剂量的耐受。所述研究的该部分事实上目的在于解决延期治疗之后短期存活的问题，监测限于感染后18天的时期。

结果：在目前的实践中很少遇到炭疽，其诊断和治疗很可能会延迟。在该研究中，单治疗(以50mg/kg/天的剂量用环丙沙星治疗五天，或者10mg/kg的IgG 35PA83的单剂量)在用1000LD50的Sterne菌株孢子感染后延迟12小时，联合治疗(环丙沙星与IgG 35PA83的联合)在相同感染后延迟12、24和48小时(图9)，并测试其效力。用环丙沙星单独治疗的小鼠没有存活，用IgG 35PA83单独治疗使得能够获得测定的全部十只小鼠中仅一只存活(非显著性结果)。但是，在治疗延迟12小时时，用环丙沙星和IgG 35PA83两者治疗的老鼠有80％存活(相比非治疗对照具有显著性，p＝0.0007)，在延迟24小时时，有60％的小鼠存活(相比非治疗对照具有显著性，p＝0.003)。在未治疗的感染后48小时时，十只小鼠中仅有两只存活，但是之后不久尽管施用了联合治疗仍然死亡。感染后18天，收集了十四只存活小鼠的血清，合并，保存，然后通过ELISA进行检测。抗PA IgG抗体效价为32000，抗LF IgG抗体效价为8000。

实施例11：被动预防性和主动预防性抗炭疽治疗的比较

被动预防性抗炭疽治疗由IgG 35PA83治疗组成。主动预防性抗炭疽治疗由抗原PA免疫治疗组成。

为比较主动和被动免疫保护，通过皮下注射5微克弗氏完全佐剂中的PA83免疫十只小鼠的组，一个月后用10000LD₅₀对其进行腹膜内感染。以相同方式免疫另一组十只小鼠，但是四周后接受5微克弗氏不完全佐剂中PA83的“免疫回忆”，然后在第二次注射一个月后进行感染。同时，评价对抗相同感染使用IgG 35PA83的被动保护。对所有感染的动物观察一个月，比较两种预防类型的结果。

结果：基于PA注射的疫苗接种是常规最常用于抗炭疽的预防手段，其效力与抗炭疽的抗体效价相关(Grunow等人，2007，Vaccine，Vol.25：3679-3683)。用PA免疫A/J小鼠，使得产生抗PA效价，其值类似于在接种的人中所观察到的，从而将此疫苗接种的效力与IgG 35PA83所提供的保护进行比较。在免疫一个月后，用单次注射PA83免疫的小鼠具有25000至50000的抗PA抗体效价。用10000LD₅₀Sterne菌株孢子感染小鼠，十只小鼠中六只存活(与对照幼稚小鼠比较，得到显著性结果，p＝0.01)。用两次注射PA83免疫的十只小鼠具有160000至640000的抗PA83抗体效价，在免疫治疗结束一个月后，这十只动物对于类似的感染均存活，其证明，与基于单次注射的治疗相比，基于两次注射的治疗保护的水平显著提高(p＝0.02)。同时评价了使用2或5mg/kg剂量的IgG 35PA83的被动保护。用2mg/kg IgG 35PA83保护的十只小鼠中有六只存活(相比于非治疗的小鼠，具有显著的保护，p＜0.0001，图10)，预防性注射施用5mg/kgIgG 35PA83的小鼠全部存活。在该研究中，因此，通过注射5mg/kg的IgG35PA83获得的完全保护相当于通过用PA83两次免疫获得的完全保护，其本身高于单次注射PA83提供的保护。

在用IgG 35PA83单独被动预防性治疗之后存活的小鼠在初始感染之后另外再观察一个月。在使用PA83作为抗原和抗人IgG缀合物的ELISA检测中，在相应的血清中没有检测到信号，得出如下结论：在注射后一个月的小鼠中没有IgG 35PA83，其符合IgG 35PA83的半衰期值。但是，使用抗小鼠IgG缀合物，检测到针对PA的小鼠IgG，其具有64000至128000范围的效价，以及针对LF的小鼠IgG，其具有32000至64000的效价，与所施用的IgG 35PA83剂量无关。初始感染之后一个月，用10000LD₅₀的Sterne菌株孢子再次感染时，所有动物均存活。

下文表7总结了四种实验条件下所观察到的抗PA IgG抗体效价和抗LF IgG抗体效价的结果。

表7

实验条件	抗PA IgG抗体效价	抗LF IgG抗体效价
			使用多西环素和IgG 35PA83(2mg/kg)的预防性治疗：10份血清合并物，在感染后一个月收集	64000	32000
使用环丙沙星和IgG 35PA83的治愈性治疗：14份血清的合并物，感染后18天收集	64000至12000	32000至64000
			使用PA83免疫：一次注射，在注射后一个月收集血清	25000至50000	NR^*
使用PA83免疫：两次注射，在第二次注射(回忆注射)后一个月收集血清	160000至640000	NR

^*NP＝不相关

体内测定统计学：

使用Graph Prism 4.0软件(GraphPad software，San Diego，CA)进行分析存活数据的Kaplan-Meier比较时序检验检验。

参考文献

Albrecht，M.T.，H.Li，E.D.Williamson，C.S.Lebutt，H.C.Flick-Smith，C.P.Quinn，H.Westra，D.Galloway，A.Mateczun，S.Goldman，H.Groen，and L.W.Baillie.2007.Human monoclonalantibodies against anthrax lethal factor and protective antigen actindependently to protect against Bacillus anthracis infection and enhanceendogenous immunity to anthrax.Infect Immun.

Andris-Widhopf，J.，C.Rader，P.Steinberger，R.Fuller，and C.F.Barbas，3rd.2000.Methods for the generation of chicken monoclonalantibody fragments by phage display.J Immunol Methods 242：159-181.

Andris-Widhopf，J.，P.Steinberger，R.Fuller，C.Rader，and C.F.Barbas，3rd.2001.Generation of antibody libraries：PCR amplificationand assembly of light-and heavy-chain coding sequences.In C.F.Barbas，3rd，D.R.Burton，J.K.Scott，and G.J.Silverman (ed.)，Phage Display：ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York.

Carter，P.，H.Bedouelle，and G.Winter.1985.Improvedoligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors.A nucleicacids Res 13：4431-43.

Ezzell，J.W.，B.E.Ivins，and S.H.Leppla.1984.Immunoelectrophoretic analysis，toxicity，and kinetics of in vitroproduction of the protective antigen and lethal factor components ofBacillus anthracis toxin.Infect Immun 45：761-7.

Karlsson，R.，A.Michaelsson，and L.Mattsson.1991.Kinetic analysisof monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor basedanalytical system.J Immunol Methods 145：229-40).

Laffly，″Selection of a macaque Fab with framework regions like thosein humans，high affinity，and ability to neutralize the protective antigen(PA)of bacillus anthracis by binding to segment of PA between residues686and 694″，Antimicrobial agents and chemotherapy，Aug.2005，p.3414-3420.

Little，S.F.，S.H.Leppla，and A.M.Friedlander.1990.Productionand characterization of monoclonal antibodies against the lethal factorcomponent of Bacillus anthracis lethal toxin.Infect Immun 58：1606-13.

Schuck，P.，and A.P.Minton.1996.Analysis of mass transport-limitedbinding kinetics in evanescent wave biosensors.Anal Biochem 240：262-72.

表4：YB2/0细胞系中转化体的制备

表5：CHO细胞系中转化体的制备

表6：序列表

序列	区域	类型
			1	轻链可变区	肽
2	重链可变区MUTE AFFINITE(31A，66，73)	肽
			3	轻链恒定区	肽
4	重链恒定区	肽
			5	IgG轻链	肽
6	IgG重链MUTEAFFINITE(31A，66，73)	肽
			7	每个IgG轻链的可变区	核酸
8	每个重链MUTEAFFINITE的可变区(31A，66，73)	核酸
			9	每个IgG重链的恒定区	核酸
10	每个其轻链的恒定区	核酸
			11	抗体的轻链	核酸
12	重链MUTEAFFINITE(31A，66，73)	核酸
			13-37	引物	核酸

48页至75页的附录

9月26日提交的法国专利申请No.FR 07/06744“抗炭疽毒素的抗体”的

内容

(含有序列表，不含附图)

抗炭疽毒素的抗体

本发明涉及抗炭疽毒素的抗体。特别地，本发明涉及抗PA抗体，其针对炭疽致死和水肿毒素的PA亚基，其经修饰使得具有改善的亲和性和耐受性能。

炭疽是由革兰氏阳性炭疽芽孢杆菌引起的疾病。该细菌是不运动的，在置于对其存活有害的环境中时形成孢子。所述孢子可在空气中存活24小时，在土壤中存在100年，并且能够经受暴露于热或消毒剂。

炭疽毒素介导的感染可以是三种形式：皮肤、肺或消化道。肺感染经常是致命的。一旦吸入，炭疽芽孢杆菌孢子穿过肺泡，特别地，在那里它们被巨噬细胞和树突状细胞所吞噬。在这些细胞中所述孢子萌发，营养体型在淋巴结中扩增。然后，细菌进入血液循环，连续复制并产生毒素，部分地对该疾病的致命特性负责。炭疽毒素由三种不同的蛋白质组成：保护性抗原(PA，在细胞内酶切割之前为83kDa，切割后为63kDa)，致死因子(LF，90kDa)和水肿因子(EF，89kDa)。致死毒素由PA和LF形成；水肿毒素由PA和EF形成，在疾病病理中的作用较不显著。这些蛋白质通过细菌作为无毒单体分泌，聚集在靶细胞表面上形成有毒复合物。

到目前为止，已经使用几种抗生素比如青霉素、多西环素和氟喹啉酮类治疗炭疽感染。但是，这些抗生素中的一些可能对一些对抗生素有抗性的菌株无效。特别地，这些治疗中的一些可能不可用于对抗恐怖主义或者细菌战争，在这些情况下可故意传播抗生素抗性株。

因此，开发能够中和炭疽毒素的新型抗体以预防和有效治疗炭疽受到普遍关注。在最近的工作中，已经用保护性抗原PA83免疫短尾猴，获得用于治疗炭疽毒素介导的人感染的抗体。本发明人从骨髓扩增了编码PA83-特异抗体片段的基因，并对其克隆以构建文库。

已经分离出称为35PA83的高亲和性(Kd＝3.4nM)和强中和的片段(50％抑制浓度＝5.6+/-0.13nM)(Laffly等人，antimicrobial agents andchemotherapy，2005，49(8)：3414-3420)。本发明人证明了免疫球蛋白片段35PA83通过阻止PA与其细胞受体的任何相互作用来中和炭疽毒素。

然后，本发明人关注通过改善其亲和性和人的耐受性对该免疫球蛋白片段进行修饰以改善其性能，从而将其用于预防性或治疗性医学目的。改善该免疫球蛋白片段的亲和性有利地使得有可能使用减少的免疫球蛋白量获得足够的生物学活性，并且还实现治疗费用的降低。改善人对其的耐受性有利地使得有可能避免针对该抗体片段的免疫应答。因此，本发明的一个目的是提供来自免疫球蛋白片段35P83的经修饰的抗PA抗体。

本发明的另一个目的是提供包含所述经修饰抗体的组合物以及包含所述经修饰抗体的药物组合物。本发明的另一个目的是提供所述经修饰抗体在制备用于治疗或预防炭疽毒素介导感染的药物组合物中的用途。

本发明还涉及包含所述经修饰抗体的炭疽毒素检测试剂盒以及检测炭疽毒素的方法。

借助以下定义更容易理解本发明。

本文所使用的术语“抗体”旨在表示可特异性结合特定抗原的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子片段。公知的免疫球蛋白片段有例如F(ab′)2、Fab、Fv、scFv和Fd片段。

本文使用的术语“炭疽”旨在表示任何直接地或间接地由炭疽芽孢杆菌感染造成的疾病。吸入感染的最初症状类似于鼻炎(发烧、肌肉疼...)。数天后，这些症状发展为呼吸窘迫和脓毒性休克的严重问题。吸入炭疽细菌通常是致命的。

在炭疽通过之前存在的皮肤间隙穿透进入皮肤时，出现炭疽皮肤感染。此感染最初导致形成丘疹，其在2至3天内发展为小泡，之后发展为1至3厘米直径的溃疡，其具有中央坏死区。炭疽肠胃传染是由食用受污染的肉导致的，其特征在于肠道急性炎症。

本文使用的术语“分离的”旨在表示“通过PCR体外扩增的”、“通过克隆重组产生的”、“通过凝胶分离或切割纯化的”或者“通过例如化学合成合成的”。

本文使用的“载体”表示可通过限制性酶切然后连接插入目的序列的核酸，其用于转移到多种遗传环境及其中或者用于在宿主细胞中表达。载体例如是质粒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)和来源于噬菌体P1的人工染色体(PAC)、病毒来源的载体。克隆载体是能够在宿主细胞中复制的载体，其另外的特征在于存在一个或多个核酸内切酶限制性位点。表达载体是其中通过限制性酶切或连接技术插入了目的DNA序列使得能够复制和/或转录成RNA的载体。所述载体可另外含有一个或多个标志物，用以选择或鉴定已经被所述载体转化或转染的细胞。

本文使用的术语“人源化抗体”旨在表示其中一些最初的组分被人组分所替代的动物来源抗体。

本文使用的术语“疾病的预防”旨在表示在尚未发生疾病的个体特别是人中防止该疾病的发生。

本文使用的术语“疾病的治疗”对应于疾病的抑制，即停止其发展、消退或者疾病症状和后果的消失，或者疾病原因的消失。

本文使用的术语“治疗有效量”旨在表示在施用给需要此治疗的个体时足以进行治疗的量。治疗有效量取决于个体、待治疗疾病的阶段以及施用方法，并且可由本领域技术人员通过常规程序来确定。

众所周知，抗体仅仅一部分，可变区，参与所述抗体与其表位的结合。抗体恒定区活化免疫效应子、吞噬细胞或杀伤细胞以及补体；这些恒定区不参与结合所述抗原。恒定区(Fc)已经过酶促切割使得从其中保留绞链区的抗体称为F(ab′)2片段，其保留两个抗原结合位点。

类似地，其恒定区，包括绞链区已经过酶促切割或者产生没有该区域的恒定区的抗体称为Fab片段，其保留两个抗原结合位点中的一个。Fab片段由与称为Fd的重链一部分共价结合的轻链组成。

决定互补性的区域(CDR，互补决定区)位于可变区中，也称为高变区，其直接与抗原相互作用。因此，对CDR进行修饰使得有可能修饰抗体的亲和性。位于可变区中的第二种类型区域称为构架区(FR，framework)，其保留CDR的三级结构。这些构架区对抗体来源的物种来说是相当特异性的。有四个构架区(FR1至FR4)位于在重链和轻链的Fd片段中，其分别由三个CDR(CDR1至CDR3)所隔开。

本发明的一个目的是提供抗PA抗体，其重链可变区含有SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列，其轻链可变区含有SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列，其特征在于所述抗体由重链可变区或轻链可变区中的至少一个突变修饰，使得具有比未修饰抗体更高的亲和性。

由Laffly等人描述的对应于抗体35PA83 Fd片段的肽序列SEQ IDNO：3已经在计算机数据库如Genbank中登记，登录号为CAH17920，对应于抗体35PA83轻链的肽序列SEQ ID NO：4以登录号CAH17921可用同样方式获得。

在图1中这些序列的可变区以二维图的形式显示。

编码抗体35PA83的Fd片段和轻链的DNA序列，其称为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，也可在计算机数据库中获取，登录号分别为AJ810486和AJ810487。

亲本非修饰抗体35P483(即未突变的)具有3.4 10^-9的亲和性K_D。已经从通过表面等离振子共振实时测量的结合和解离常数计算得到此亲和力常数，如实施例中所述。

在本发明的一个实施方案中，本发明的经修饰抗PA抗体由至少一个选自下列的突变修饰：重链可变区中G/S(31A)，R/K(66)，K/R(73)，D/G(28)，G/E(31A)，H/L(55)，S/G(74)，Y/T(113)，S/L(117)，以及轻链可变区中Q/R(68)，Q/R(27)，AP(114)，Q/L(68)，P/S(115)，H/R(24)，S/E(69)，S/R(58)。

重链可变区中的突变G/S(31A)表示31A位(氨基酸位置参见图1)的氨基酸G被氨基酸S所代替。

相比于抗体35PA83，由上文所述重链可变区或轻链可变区中突变的至少之一修饰的此抗PA抗体具有改善的PA亲和性。

因此，本发明提供了本发明经修饰的抗PA抗体的F(ab′)2、Fab、Fv、scFv和Fd片段，以及在其中抗体Fc部分来源于人或非人同源序列的嵌合抗体。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体Fc部分可选择成使得产生IgA、IgM或IgG。

在本发明的另一个实施方案中，所述抗体Fc部分可以是来源于小鼠、马、绵羊、牛或其它哺乳动物的Fc部分。

根据本发明的一个优选实施方案，根据本发明修饰的抗PA抗体包含人来源的Fc部分。这些全长抗体优选用于施用给人，因为它们具有比例如Fab的抗体片段更长的半衰期，其更适于静脉内、腹膜内、肌内、皮下或透皮施用。

因此，本发明的一个目的是提供Fab，其来源于根据本发明修饰的抗PA抗体、比Fab片段更小或更大的此抗体的片段，或者表位结合肽，特别是来源于根据本发明修饰的抗PA抗体高变区的肽。

在本发明的第一个实施方案中，根据本发明修饰的抗PA抗体特征为，所述至少一个突变选自重链可变区中的：G/S(31A)，R/K(66)，K/R(73)，D/G(28)，G/E(31A)，H/L(55)，S/G(74)，Y/T(113)，S/L(117)。

在本发明的第二个实施方案中，根据本发明修饰的抗PA抗体特征为，所述至少一个突变选自轻链可变区中的：Q/R(68)，Q/R(27)，A/P(114)，Q/L(68)，P/S(115)，H/R(24)，S/E(69)，S/R(58)。

在本发明的第三个实施方案中，根据本发明修饰的抗PA抗体特征为，其通过至少一个选自重链可变区中的G/S(31A)，R/K(66)，K/R(73)，D/G(28)，G/E(31A)，H/L(55)，S/G(74)，Y/T(113)，S/L(117)的突变以及至少一个选自轻链可变区中Q/R(68)，Q/R(27)，A/P(114)，Q/L(68)，P/S(115)，H/R(24)，S/E(69)，S/R(58)的突变修饰。

在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明修饰的所述抗PA抗体包含重链可变区中的三个下列突变：

-G/S(31A)

-R/K(66)

-K/R(73)。

在本发明的另一个优选实施方案中，根据本发明修饰的所述抗PA抗体包含重链可变区中的两个下列突变：

-H/L(55)

-S/G(74)，

和轻链可变区中的Q/L(68)突变。

在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明修饰的所述抗PA抗体包含重链可变区中的下列突变：

-S/L(117)

和轻链可变区中的S/R(58)突变。

在本发明的另一个优选实施方案中，根据本发明修饰的所述抗PA抗体包含轻链可变区中的两个下列突变：

-H/R(24)和

-S/E(69)。

本发明的另一个目的是提供相比于非突变的35P483抗体具有改善的亲和性以及相对于人免疫系统具有更好耐受性的经修饰抗PA抗体。这些人源化抗体有利地不诱导任何针对本身的免疫应答或者以较低的程度诱导，并且具有较长的半衰期。

因此，本发明的一个目的是提供根据本发明修饰的并且人源化的抗PA抗体，其特征在于另外包含选自下列的重链可变区中的至少一个突变：

-无/Q(1)

-无/V(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-无/Q(5)

-无/E(6)

-L/V(12)

-A/T(24)

-S/P(45)

-R/N(66)

-K/V(80)

-L/F(87)

-R/S(92)

-A/T(122)

-V/L(123)。

突变无/Q(1)意为在1位添加氨基酸Q(有关氨基酸位置参见图1)。

在本发明的另一个实施方案中，根据本发明修饰的并且人源化的抗PA抗体另外包含选自下列的轻链可变区中的至少一个突变：

-无/A(1)

-无/I(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-Y/S(14)

-K/R(18)

-H/R(24)

-Y/F(87)

-S/P(96)

-S/T(101)

-L/V(124)。

在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明修饰的并且人源化的抗PA抗体包含例如上文所述的重链可变区中的另外至少一个突变，以及例如上文所述的轻链可变区中的至少一个突变。

优选地，根据本发明修饰的并且人源化的所述抗PA抗体另外包含重链可变区中的下列突变：

-无/Q(1)

-无/V(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-无/Q(5)

-无/E(6)

-A/T(122)

-V/L(123)，

以及轻链可变区中的下列突变：

-无/A(1)

-无/I(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-L/V(124)。

关于上文对根据本发明修饰的抗PA抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列的描述，本领域技术人员能合成或使得合成编码这些氨基酸序列的核酸。

因此，本发明的一个目的是提供编码本发明经修饰抗PA抗体的核酸，所述抗体具有与非突变的抗体35PA83相比改善的亲和性，并且其为人源化的或非人源化的。

本发明的另一个目的是提供包含所述核酸的载体。

适用于本发明背景的载体有适于接受和表达第一和第二DNA序列的重组DNA分子，使得能够表达异二聚体抗体，例如根据本发明的全长抗体或F(ab′)2或Fab片段。这些载体提供了在载体中所存在的两个分开的盒中独立克隆两种DNA序列的系统，使得形成表达所述异二聚体抗体的第一和第二多肽的两个分离的顺反子。这些表达载体称为双顺反子载体。

本发明的另一个目的是提供原核或真核的宿主细胞，其包含本发明的载体。

本发明的另一个目的是提供包含至少一种根据本发明修饰以改善其亲和性并且任选人源化的抗PA抗体的组合物。

本发明的另一个目的是提供包含至少一种根据本发明修饰以改善其亲和性并且任选人源化的抗PA抗体的药物组合物。

所述药物组合物优选包含可药用载体。本文使用的这些载体旨在表示不干扰所述组合物活性成分生物学活性效力的无毒材料。表述“可药用”表示与生物学体系例如细胞、细胞培养物、组织或有机体相容的无毒材料。所述载体的特征取决于施用方法。

本发明涉及根据本发明为改善其亲和性而修饰的并且任选人源化的至少一种抗PA抗体在制备用于治疗或预防炭疽芽孢杆菌感染的药物组合物或药物中的用途。

根据本发明为改善其亲和性而修饰并且任选人源化的所述抗PA抗体可以被标记。合适标记物的例子包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物和生物发光化合物。标记物与抗体结合的方法是本领域技术人员公知的。

本发明的一个目的是提供检测含PA炭疽毒素的试剂盒。该试剂盒包含：

-包含至少一种根据本发明为改善其亲和性修饰的并且任选人源化的带有标记或未带标记的抗PA IgG的容器，

-任选地，包含缓冲溶液的容器，

-和任选地包含带标记的经修饰IgG检测工具的容器，例如与报告分子如荧光或酶标记物相结合的生物素-结合蛋白，如亲和素或链霉亲和素。此容器还可包含非标记的经修饰IgG检测工具，即基本上的抗体或抗体片段。

根据本发明为改善亲和性而修饰的并且任选人源化的抗PA抗体可用于体外，例如在免疫学测定中，其中它们在液相中或者固定于固相载体上使用。公知载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖、尼龙、淀粉酶、天然或改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖或磁铁。使用本发明抗PA抗体的免疫学测定的实例有放射性免疫测定、组织免疫学标记技术、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀测定、免疫扩散测定、补体固定测定、荧光激活细胞分选测定(Fluorescence-activated Cell Sorting，FACS)或者蛋白质芯片分析。

-将所述样品与包含至少一种根据本发明为改善其亲和性修饰的并且任选人源化的抗PA抗体相接触，和

-检测所述抗体的结合，作为所述炭疽毒素的存在的指示。

本发明的另一个目的是提供用于体内检测含PA炭疽毒素的方法，其中向个体施用根据本发明为改善其亲和性而修饰的且任选人源化的且带标记的抗PA抗体。带标记经修饰抗体的施用量应足以使得所述抗体结合待检测的毒素。带标记经修饰抗体的施用量取决于一些因素，例如个体的年龄和性别，以及疾病的阶段。所述施用量可以为0.01mg/kg至50mg/kg不等，优选0.1mg/kg至20mg/kg，更优选0.1mg/kg至2mg/kg。

为了实施体内诊断，本发明经修饰的抗PA抗体应直接或通过官能团间接与放射性同位素相连。通常使用的官能团包括例如二亚乙基-三胺-五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。放射性同位素金属离子的例子包括¹¹¹In，⁹⁷Ru，⁶⁷Ga，⁶⁸Ga，⁷²As，⁸⁹Zr和²⁰¹Tl。

为了使用磁共振成像(MRI)或者通过电子自旋共振(ESR)进行诊断，经修饰的本发明抗PA抗体也可用顺磁同位素标记。还可使用发射正电子的γ放射性同位素，例如¹⁵⁷Gd，⁵⁵Mn，¹⁶²Dy，⁶⁸Ga，⁵²Cr和⁵⁶Fe。

根据本发明为改善其亲和性修饰的且任选人源化的抗PA抗体也可用于体外或体内监测疾病治疗的发展，例如通过确定炭疽毒素靶向的细胞数增加或减少，或者生物样品中PA毒素浓度的变化。

本发明的一个目的是提供治疗可能被炭疽芽孢杆菌感染的个体、优选人的方法，其中向所述个体施用治疗有效量的根据本发明为改善其亲和性修饰的且任选人源化的抗PA抗体。

本发明的另一个目的是提供免疫缀合物，其包含与治疗剂直接或间接相结合的根据本发明修饰的抗PA抗体。

通过下列说明，参照抗PA抗体的制备实施例更容易理解本发明。

在下列实施例中，将提及下文以举例形式给出的附图：

图1：35PA483抗体重链可变区和轻链可变区的珍珠串的构型。

图2：3种根据本发明修饰的抗PA抗体(6.20、V2和J24-7)以及亲本抗体35PA83之间序列的比对。

根据IMGT定义(浅灰色)或者Kobat定义(暗灰色，Wu and Kabat1970)的CDR位置。经过突变的残基以粗体显示。所有残基根据IMGT命名法编号。

材料和方法

大肠杆菌菌株

使用下列大肠杆菌菌株：

-XL1(Stratagène，the jolla，CA)：recA1，endA1，gyrA96 thi-1 hsdR17sup E44 relA1 Iac[F′proAB IacIqZΔM15 Tn 10(Tetr)]

-SURE(Stratagène)：e14(McrA)Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 end A1supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5(Kanr)uvrC[F′proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)]

-HB2151，用于表达可溶性Fab。

毒素

炭疽毒素(PA83，LF和EF)获得自List实验室。

构建突变体35P483文库

通过大规模诱变(Massive mutagenesis@(Biomethods，Evry，France))构建来自基因35PA83突变体抗体文库。通过使用NNS密码子将突变引入重链和轻链的CDR中。根据Kabat等人(Wu and Kabat 1970)和IMGT(Lefranc，Pommie等人2003)确定CDR区。

通过电穿孔使用DNA文库转化SURE细胞。将补充了羧苄西林的SB培养基添加到所述培养物并在37摄氏度下孵育1小时之后，将1毫升噬菌体辅助VCSM13(约10¹²pfu)添加到培养物。孵育2小时后，加入70微克/毫升的卡那霉素，将培养物置于搅拌之下在37摄氏度过夜。

噬菌体-介导的抗体选择

通过使用PEG沉淀，然后重悬于3ml的1％PBS-BSA-0.02％叠氮化物，用0.45微米滤器过滤，从50ml培养物中纯化并浓缩噬菌体-Fab颗粒。该噬菌体制剂的效价为约10¹⁰pfu/ml。噬菌体-Fab进行三种感染-选择回收循环，例如之前所述的(Andris-Widhopf，Rader等人2000)。已经分析了一些噬菌体，或者对其进行了一种或多种下述方法：

通过在非常低的抗原浓度下洗脱进行选择

通过使用递减浓度的生物素化PA83(100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM)和包覆有链霉亲和μ素MACS的磁珠(Milteny Biotech)筛选文库。不同浓度的噬菌体和生物素化抗原的多种混合物已经在玻璃管中37摄氏度下孵育30分钟。已经通过使用100微升包覆有链霉亲和素μMACS的磁珠捕获生物素化PA83结合的噬菌体(在室温下5分钟)。噬菌体捕获之后，在PBS将珠子清洗5次，在TPBS(含有0.1％吐温20的PBS)中清洗一遍。然后通过用100微升胰蛋白酶(10微克/毫升)孵育洗脱结合的噬菌体。使用洗脱液感染指数生长期的大肠杆菌SURE细菌。

长时间孵育选择

通过用PBS中5微克/毫升PA83覆盖且用5％MPBS淬灭的平板结合(Nunc Maxisorp)筛选约每孔10⁹-10¹⁰个噬菌体(50μl)。将PA83平板与噬菌体-Fab一起在37摄氏度下孵育2小时，在0.1％吐温20-PBS中清洗5遍，在PBS清洗2遍。然后将噬菌体在4摄氏度下与50微克/毫升的可溶性PA83孵育预定的时间(1、3、13、18和24天)。5个清洗步骤之后，在37摄氏度下用50微升10微克/毫升胰蛋白酶(Sigma)洗脱结合的噬菌体15分钟，然后重新感染指数期的大肠杆菌SURE细菌。

可溶性Fab表达、周质提取和纯化

可溶性Fab的定量

通过SDS-PAGE检测Fab纯度，使用软件Quanity One

(Biorad)测定其浓度。

表面等离振子共振(SPR)的实时测定

序列分析

结果

构建Fab(35PA83)突变体文库

在所选文库中两个位置(黑体)经常突变：H117和L27。除了突变体J24-15之外，残基丝氨酸H117的突变对Fab的抗原结合没有影响(表2)。相反，谷氨酰胺L27残基的突变似乎具有消极的作用，因为它们降低了Fab亲和性(突变体6.7)或者影响Fab表达效率(非公开数据)。

Fd片段

轻链

表1：靶标CDR位置的突变频率

给定位置突变序列的百分比(54个序列)

亲本克隆	序列H	序列L	K_D(M)	K_on(M^-1.s^-1)	K_off(s^-1)
						35PA83	亲本型	亲本型	3.4 10^-9	9.3 10⁴	3.2 10^-5

表2：Fab 35PA83与其突变体的结合亲和性和动力学。

突变体筛选

对突变体文库进行3个循环的(R1，R2和R3)感染-选择-回收循环。在步骤R3后，通过对V_H和V_L测序分析12个独立的克隆。在这8个突变体中，2个显示为相似的。因此，7个个别的Fab表达为可溶性Fab。其中3个以足以使得通过SPR测定亲和性的方式表达。

与35PA83相比，V2三突变体显示较低的解离常数(K_off＝8.1 10⁵s^-1)以及稍微快一些的结合常数(K_on＝1.22 10⁵M^-1.s^-1)，使得亲和性增强x5.15。此突变体含有重链可变区中的3个突变：H-CDR1中的一个突变(G31_AS)以及H-CDR2中的2个突变(R66K，K73R)。

第三个循环之后，根据两种其它的选择方法筛选噬菌体：在覆盖有抗原的孔中长时间孵育进行淘选(″长时间孵育选择″)或者通过使用非常低浓度的可溶性生物素化抗原(″通过非常低浓度的可溶性抗原洗脱的选择″)。

通过非常低浓度的可溶性抗原的选择

实验	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										{生物素化的PA83}nM	100	10	1	0.1	0.01	0.001	0.0001	0.00001	0
洗脱的噬菌体(x10³)	250	192	55	10	8.8	3.4	1	0.7	0.9

通过使用100nM至0.01pM递减浓度的生物素化PA83选择文库R3。1pM是使得能够洗脱比阴性对照更多克隆的最低浓度。通过重链和轻链测序第一次分析从条件6获得的各个克隆。约35％含有野生序列。

条件6

在这28个突变体中，47％充分表达使得能够通过SPR测定亲和性。因为克隆冗余，表达了8个不同突变体，并测定了其动力学常数。具有最佳亲和力常数(K_D＝1.8 10^-10M，其代表18.9的改善倍数)的抗体片段是三突变6.20。此突变体含有重链CDR2中的两个突变(H55L和S74G)，以及轻链CDR2中的一个突变(Q68L)。

长期孵育选择

孵育时间(天)	3	13	18	24	25
						洗脱的噬菌体	4000	5700	4000	18	0

在第24天洗脱的18个克隆中，已经对14个完全测序(V_H和V_L)，仅有3个是野生型。已经充分表达6个突变体，以测定其动力学常数。双突变体J24-7(K_D＝7.8 10^-10M)和J24-15(K_D＝8.8 10^-10M)分别显示结合亲和力增加4.35和3.96倍。

变体的人源化

在为人类型时，注射到人体的抗体非常好的被耐受。相反，动物来源的抗体可能造成有害副作用，并且很快被清楚。但是，为了亲和性成熟，抗体高变区被强烈突变，尽管对其进行了序列分析，仍难以确定其来源。因为Fab没有任何恒定区，构架区是考虑耐受性问题时唯一涉及的区域。

为了改善Fab 35PA83以及来源于其的分子的耐受性，将该Fab人源化。在IMGT服务器(http://imgt.cines.fr)上进行自动化分析，使得在Fab35PA83构架区中定位不同于人生殖系基因(编码最类似于35P483的序列)所编码的残基。偶然合成或突变方法使得有可能获得编码Fab 35PA83突变体并含有一个或少数增加与人序列同源性的突变的核苷酸序列。与35PA83相比，不造成任何显著亲和性改变的突变在表3和4中给出。所有这些突变相关联，形成新的编码Fab的合成基因，其构架区与人生殖系基因编码的构架区有97.75％同一性，相比之下，35PA83亲本Fab为88.69％。但是，该完全人源化突变体的亲和性(K_D＝9x10^-9M)与Fab 35PA83相比下降了约3倍。

残基号	35PA83
			1	无	Q
2	无	V
			3	无	Q
4	无	L
			5	无	Q
6	无	E
			12	L	V
24	A	T
			45	S	P
66	R	N
			80	K	V
87	L	F
			92	R	S
122	A	T
			123	V	L

表3：不改变35PA83亲和性的重链构架区中的突变。

残基号

35PA83

1	无	A
			2	无	I
3	无	Q
			4	无	L
14	Y	S
			18	K	R
24	H	R
			87	Y	F
96	S	P
			101	S	T
124	L	V

表4：不改变35PA83亲和性的轻链构架区中的突变。在先专利FR 07 06744的序列表

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>119

<212>PRT

<213>Macaca fascicularis

<400>1

Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

1 5 10 15

Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile

20 25 30

Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Gly

35 40 45

Ser Thr Ala Asp Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr

50 55 60

Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu Gln Leu Arg Ser

65 70 75 80

Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr

85 90 95

Asn Phe Trp Ser Gly Glu Tyr Tyr Gly Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ala Val Val Thr Val Ser Ser

115

<210>2

<211>103

<212>PRT

<213>Macaca fascicularis

<400>2

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val Gly Asp Lys Val Thr

1 5 10 15

Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Trp Leu Ala Trp Tyr

20 25 30

Gln Gln Lys Pro G1y Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser

35 40 45

Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala

65 70 75 80

Ser Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Ala Pro Leu Ala Phe Gly Pro

85 90 95

Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys

100

<210>3

<211>223

<212>PRT

<213>Macaca fascicularis

<400>3

Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala

1 5 10 15

Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg

20 25 30

Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Gly Ser

35 40 45

Thr Ala Asp Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile

50 55 60

Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu Gln Leu Arg Ser Val

65 70 75 80

Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Asn

85 90 95

Phe Trp Ser Gly Glu Tyr Tyr Gly Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Ala

100 105 110

Val Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Val Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ile Lys Thr Cys Gly Gly

210 215 220

<210>4

<211>209

<212>PRT

<213>Macaca fascicularis

<400>4

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val Gly Asp Lys Val Thr

1 5 10 15

Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Trp Leu Ala Trp Tyr

20 25 30

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser

35 40 45

Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala

65 70 75 80

Ser Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Ala Pro Leu Ala Phe Gly Pro

85 90 95

Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Ala Val Ala Pro Pro Ser Val Phe

100 105 110

Ile Phe Pro Pro Ser Glu Asp Gln Val Thr Ser Gly Thr Val Ser Val

115 120 125

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Ser Val Lys Trp

130 135 140

Lys Val Asp Gly Ala Leu Lys Thr Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

145 150 155 160

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Asn Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Glu Tyr Gln Ser His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

180 185 190

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

195 200 205

Glu

<210>5

<211>670

<212>DNA

<213>Macaca fascicularis

<400>5

cgggcccagg actgctgaag ccttcggaaa ccctgtccct cacctgcgct gtctctggtg

60

actccatcag cggtggttac tactggagct ggatccgcca gtccccaggg aaggggctgg

120

agtggattgg gcatatctat ggtagtactg cggacaccag gtacaacccc tccctcaaga

180

gtcgagtcac catttcaaaa gacacgtcca agaaccagct ctccctgcaa ctgaggtctg

240

tgaccgccgc ggacacggcc gtgtattatt gtgcgagatc gggttacaat ttttggagtg

300

gtgaatatta cggtttggat tcctggggcc aaggggccgt cgtcaccgtc tcctcagcct

360

ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctcctc caggagcacc tccgagagca

420

cagcggcccc gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc gtgtcgtgga

480

actcaggctc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcagggc

540

tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctacg

600

tctgcaacgt aaaccacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagatcaaaa

660

catgtggtgg

670

<210>6

<211>634

<212>DNA

<213>Macaca fascicularis

<400>6

acccagtctc catcgtccct gtctgcatat gtgggagaca aagtcaccat cacttgccat

60

gccagtcagg gtattaacag ttggttagcc tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct

120

aaacttctga tctataaggc gtccagtttg caaagtgggg tcccatcaag gttcagcggc

180

agtggatctg ggacagatta tactctcacc atcagcagct tgcagtctga agactttgct

240

tcttattact gtctacaata tgacagtgcc ccattggctt tcggccccgg gaccaagctg

300

gatatcaaac gggctgtggc tccaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgaagatcag

360

gtgacatctg gaactgtctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc

420

agcgtaaagt ggaaggtgga tggtgccctc aaaacgggta actcccagga gagtgtcaca

480

gagcaggaca gcaaggacaa cacctacagc ctgagcagca ccctgacgct gagcagcaca

540

gagtaccaga gtcacaaagt ctatgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagttcgccc

600

gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt taat

634

序列表

<110>LFB生物技术公司

<120>IgG 35PA83

<130>参考

<160>37

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>103

<212>PRT

<213>食蟹猴

<400>1

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val Gly Asp Lys Val Thr

1 5 10 15

Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Trp Leu Ala Trp Tyr

20 25 30

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser

35 40 45

Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala

65 70 75 80

Ser Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Ala Pro Leu Ala Phe Gly Pro

85 90 95

Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys

100

<210>2

<211>119

<212>PRT

<213>食蟹猴

<400> 2

Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

1 5 10 15

Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile

20 25 30

Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Gly

35 40 45

Ser Thr Ala Asp Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr

50 55 60

Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu Gln Leu Arg Ser

65 70 75 80

Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr

85 90 95

Asn Phe Trp Ser Gly Glu Tyr Tyr Gly Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ala Val Val Thr Val Ser Ser

115

<210>3

<211>107

<212>PRT

<213>人

<400>3

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro ValThr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210>4

<211>330

<212>PRT

<213>人

<400>4

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>5

<211>210

<212>PRT

<213>嵌合构建体

<400>5

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Tyr Val Gly Asp Lys Val Thr

1 5 10 15

Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Trp Leu Ala Trp Tyr

20 25 30

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser

35 40 45

Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala

65 70 75 80

Ser Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Ala Pro Leu Ala Phe Gly Pro

85 90 95

Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

100 105 110

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

115 120 125

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

130 135 140

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

145 150 155 160

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

165 170 175

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

180 185 190

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

195 200 205

Glu Cys

210

<210>6

<211>449

<212>PRT

<213>嵌合构建体

<400>6

Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

1 5 10 15

Ala Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile

20 25 30

Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Ile Tyr Gly

35 40 45

Ser Thr Ala Asp Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr

50 55 60

Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu Gln Leu Arg Ser

65 70 75 80

Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr

85 90 95

Asn Phe Trp Ser Gly Glu Tyr Tyr Gly Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ala Val Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210>7

<211>309

<212>DNA

<213>食蟹猴

<400>7

acccagtctc catcgtccct gtctgcatat gtgggagaca aagtcaccat cacttgccat 60

gccagtcagg gtattaacag ttggttagcc tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct 120

aaacttctga tctataaggc gtccagtttg caaagtgggg tcccatcaag gttcagcggc 180

agtggatctg ggacagatta tactctcacc atcagcagct tgcagtctga agactttgct 240

tcttattact gtctacaata tgacagtgcc ccattggctt tcggccccgg gaccaagctg 300

gatatcaaa 309

<210>8

<211>363

<212>DNA

<213>食蟹猴

<400>8

caggagtcgg gaccaggact gctgaagcct tcggaaaccc tgtccctcac ctgcgctgtc 60

tctggtgact ccatcagcag cggttactac tggagctgga tccgccagtc cccagggaag 120

gggctggagt ggattgggca tatctatggt agtactgcgg acaccaagta caacccctcc 180

ctcaggagtc gagtcaccat ttcaaaagac acgtccaaga accagctctc cctgcaactg 240

aggtctgtga ccgccgcgga cacggccgtg tattattgtg cgagatcggg ttacaatttt 300

tggagtggtg aatattacgg tttggattcc tggggccaag gggccgtcgt caccgtctcc 360

rca 363

<210>9

<211>990

<212>DNA

<213>人

<400>9

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210>10

<211>321

<212>DNA

<213>人

<400>10

cgaactgtgg ctgcaccaag tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg t 321

<210>11

<211>630

<212>DNA

<213>嵌合构建体

<400>11

acccagtctc catcgtccct gtctgcatat gtgggagaca aagtcaccat cacttgccat 60

gccagtcagg gtattaacag ttggttagcc tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct 120

aaacttctga tctataaggc gtccagtttg caaagtgggg tcccatcaag gttcagcggc 180

agtggatctg ggacagatta tactctcacc atcagcagct tgcagtctga agactttgct 240

tcttattact gtctacaata tgacagtgcc ccattggctt tcggccccgg gaccaagctg 300

gatatcaaac gaactgtggc tgcaccaagt gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 360

ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 420

aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 480

gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 540

gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 600

gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 630

<210>12

<211>1353

<212>DNA

<213>嵌合构建体

<400>12

caggagtcgg gaccaggact gctgaagcct tcggaaaccc tgtccctcac ctgcgctgtc 60

tctggtgact ccatcagcag cggttactac tggagctgga tccgccagtc cccagggaag 120

gggctggagt ggattgggca tatctatggt agtactgcgg acaccaagta caacccctcc 180

ctcaggagtc gagtcaccat ttcaaaagac acgtccaaga accagctctc cctgcaactg 240

aggtctgtga ccgccgcgga cacggccgtg tattattgtg cgagatcggg ttacaatttt 300

tggagtggtg aatattacgg tttggattcc tggggccaag gggccgtcgt caccgtctcc 360

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353

<210>13

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggcttctgc tgctctggct cccaggtgcc 60

agatgtgcca tccagttg 78

<210>14

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

ctcagtacta gtgccgccac catggacatg agggtccccg ctcagct 47

<210>15

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

acctgggagc cagagcagca gaagccccag gagctgagcg ggga 44

<210>16

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

tgctctggct cccaggtgcc agatgtgcca tccagttgac cca 43

<210>17

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

ctcccacata tgcagacagg gacgatggag actgggtcaa ctgga 45

<210>18

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

ctcagtacta gtgccgccac catggacatg agggtccccg ctcagct 47

<210>19

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

ctcccacata tgcagacagg gacgatggag actgggtcaa ctgga 45

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

tcgtccctgt ctgcatatgt gggag 25

<210>21

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

gatgaagaca cttggtgcag ccacagttcg tttgatatcc ag 42

<210>22

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

ctcagtacta gtgccgccac catggacatg agggtccccg ctcagct 47

<210>23

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

gatgaagaca cttggtgcag ccacagttcg tttgatatcc ag 42

<210>24

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

atgaaacatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60

gtgcagctgc aggagt 76

<210>25

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

ctcagtgcta gcgccgccac catgaaacat ctgtggttct tccttct 47

<210>26

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

cccatctggg agctgccacc aggagaagga agaaccaca 39

<210>27

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

tggcagctcc cagatgggtc ctgtcccagg tgcagctgca gg 42

<210>28

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

cagtcctggt cccgactcct gcagctgcac ctggg 35

<210>29

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

ctcagtgcta gcgccgccac catgaaacat ctgtggttct tccttct 47

<210>30

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

cagtcctggt cccgactcct gcagctgcac ctggg 35

<210>31

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

cagctgcagg agtcgggacc aggactg 27

<210>32

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

accgatgggc ccttggtgga ggctgaggag acggtgac 38

<210>33

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

ctcagtgcta gcgccgccac catgaaacat ctgtggttct tccttct 47

<210>34

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

accgatgggc ccttggtgga ggctgaggag acggtgac 38

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

gctcgataca ataaacgcca 20

<210>36

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36

tctgggatag aagttattca g 21

<210>37

<211>23

<212>DNA

<213>嵌合构建体

<400>37

ggaagtagtc cttgaccagg cag 23

Claims

1.针对炭疽毒素保护性抗原(PA)的G类免疫球蛋白(IgG)，其包含：

-重链可变区，其包含与SEQ ID NO：2有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，并且包含对应于25位丝氨酸残基、54位赖氨酸残基和60位精氨酸残基的氨基酸残基，

其特征在于它由IgG1或IgG2组成。

2.根据权利要求1的G类免疫球蛋白，其特征在于它包含：

-具有序列SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的轻链可变区，和

-具有序列SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的重链可变区。

3.根据权利要求1的IgG，其特征在于轻链可变区(SEQ ID No：1)包含选自下列的至少一个突变：

-无/A(1)

-无/I(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-Y/S(14)

-K/R(18)

-H/R(24)

-L/V(124)。

4.根据权利要求3的IgG，其特征在于轻链可变区(SEQ ID No：1)包含下列突变：

-无/A(1)

-无/I(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-Y/S(14)

-K/R(18)

-H/R(24)

-L/V(124)。

5.根据前述权利要求任一项的IgG，其特征在于重链可变区(SEQ IDNo：2)包含选自下列突变的至少一个突变：

-无/Q(1)

-无/V(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-无/Q(5)

-无/E(6)

-L/V(12)

-A/T(24)

-A/T(122)

-V/L(123)。

6.根据权利要求4的IgG，其特征在于具有序列SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的重链可变区包含下列突变：

-无/Q(1)

-无/V(2)

-无/Q(3)

-无/L(4)

-无/Q(5)

-无/E(6)

-L/V(12)

-A/T(24)

-A/T(122)

-V/L(123)。

7.根据前述权利要求任一项的IgG，其特征在于其轻链恒定区包含序列SEQ ID NO：3所代表的氨基酸序列，并且重链恒定区包含由序列SEQID NO：4代表的氨基酸序列。

8.根据前述权利要求任一项的IgG，其特征在于其每个重链的恒定区为γ1型。

9.根据前述权利要求任一项的IgG，其特征在于其每个重链的恒定区为γ1型并且包含氨基酸序列SEQ ID NO：7，并且其每个轻链的恒定区包含氨基酸序列SEQ ID No：8。

10.根据前述权利要求任一项的IgG，其特征在于其每个轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO：9，并且其每个重链包含氨基酸序列SEQ ID NO：10。

11.编码权利要求1至10任一项抗体的核酸。

12.包含权利要求11的核酸的载体。

13.包含权利要求12的载体的宿主细胞。

14.根据权利要求13的宿主细胞，其特征在于它是选自：SP2/0，YB2/0，IR983F，Namalwa人骨髓瘤，PERC6，CHO细胞系，特别是CHO-K-1，CHO-Lec10，CHO-Lec1，CHO-Lec13，CHO Pro-5，CHO dhfr-，Wil-2，Jurkat，Vero，Molt-4，COS-7，293-HEK，BHK，K6H6，NS0，SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653的细胞。

15.包含至少一种根据权利要求1至10任一项的人IgG的组合物。

16.包含至少一种根据权利要求1至10任一项的人IgG的药物组合物。

17.根据权利要求1至10任一项的人IgG在制备用于治疗或预防炭疽芽孢杆菌感染的药物中的用途。

18.用于检测含PA炭疽毒素的试剂盒，所述试剂盒包含：

-包含至少一种标记的根据权利要求1至10任一项的IgG的容器，和

-包含检测此经标记的IgG之工具的容器。

19.体外检测生物学样品中含PA炭疽毒素的方法，其包括下列步骤：

-将所述样品与至少一种根据权利要求1至10任一项的IgG相接触，和

-检测所述IgG的结合，作为所述炭疽毒素存在的指示。

20.免疫缀合物，其包含与治疗剂结合的根据权利要求1至10任一项的IgG。