JP4690196B2 - 復活技術によって生成された炭疽菌毒素に対する中和ヒト抗体 - Google Patents

Description

本発明は、完全ヒトモノクローナル抗体の分野、その製造方法、ならびに炭疽菌の予防および治療への応用におけるそれらの使用に関する。より詳しくは、炭疽菌防御抗原（ＰＡ）毒素に対して結合特異性を有する抗体が提供される。

炭疽菌は、世界の多くの地方特有の人畜共通土壌生物である。炭疽菌生物は、開発された最初の細菌戦争剤の１つであり、この点で重大な脅威であり続ける。ワクチン株が開発されているが、現在、それらの効力および入手可能性に関して懸念がある。受動免疫法は、中期保護を付与するのに役立つかもしれず、また、抗生物質治療だけが有効な時点の後、治療法を捜し求める免疫のない患者にも有益である可能性がある。Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ａ．、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，８：８（２００２）；Ｍａｙｎａｒｄ，Ｊ．Ａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：５９７（２００２）。哺乳類により吸入された後、炭疽菌胞子は肺胞マクロファージ内で発芽し、その後リンパ節に移動し、そこで増殖して血流に入る。増殖期の細菌は、疾患の病因となる３部からなる外毒素を排出する。莢膜に加えて、炭疽菌の毒性株は、１組の３つの異なる抗原タンパク質成分、すなわち防御抗原（ＰＡ）、浮腫因子（ＥＦ）および致死因子（ＬＦ）を分泌する。ＰＡはＬＦまたはＥＦのいずれかと結合して、致死毒素（ＬｅＴｘ）または浮腫毒素（ＥｄＴｘ）を形成することができる。ひとまとめにして、これらの２つの毒素は、炭疽菌毒素と呼ばれる複合外毒素と見なされる。毒素の各成分は、８０ｋＤａを超える分子量の熱不安定性のタンパク質である。浮腫因子（ＥＦ）は、炭疽菌感染で見られる浮腫の原因であるアデニル酸シクラーゼである。致死因子（ＬＦ）は、マクロファージに対する炭疽菌毒素の致死作用に必須である亜鉛メタロプロテアーゼである。防御抗原（ＰＡ）は炭疽菌毒素の結合領域を含み、これは、最近特定された細胞表面の受容体に結合して、エンドサイトーシスによる細胞内へのＬＦまたはＥＦの移動を可能にする。

ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤ系が復活（recall）抗体反応を得るために使用することができるという証拠は、Ｍｏｓｉｅｒおよび共同研究者による方法の最初の発表に遡る。Ｍｏｓｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３５：２５６（１９８８）。この報告では、ヒトＰＢＬを植え付けたマウスに破傷風トキソイドを投与し、破傷風に対するヒト抗体が免疫化後の血清中で見つかった。この最初の報告以来、世界中の様々な研究室の多くの研究者がｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤ系を使用して、多数の抗原に対するヒト復活抗体反応の態様を検討してきた。Ｎｏｎｏｙａｍａ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：３８９４（１９９３）；Ｗａｌｋｅｒ，Ｗ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５：１４２５（１９９５）；Ｅｌｓｅ，Ｋ．Ｊ．およびＢｅｔｔｓ．Ｃ．Ｊ．、Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９：４８５（１９９７）。しかし、そのような植え付けられたマウスからの有用なモノクローナル抗体の生成を記載している報告は散発的である。Ｓａｔｏｈ，Ｎ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７：１１３（１９９５）；Ｄｕｃｈｏｓａｌ，Ｍ．Ａ．ら、Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｔｏ Ｎａｔｕｒｅ：２５８（１９９１）；Ｓｍｉｔｈｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３６：１１３（１９９９）；Ｃｏｃｃｉａ，Ｍ．Ａ．およびＰ．Ｂｒａｍｓ、Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔｓ：５７７２（１９９８）；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１（１９９７）；およびＵｃｈｉｂａｙａｓｈｉ，Ｎ．ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １４：３１３（１９９５）。

したがって、特定の抗原に特異的なヒトモノクローナル抗体を産生する有効な方法が依然として必要である。さらに、炭疽菌毒素に特異的なヒトモノクローナル抗体が依然として必要である。

本発明のいくつかの実施形態の目的は、３部からなる炭疽菌外毒素のＰＡ成分に結合する抗体を提供することである。これらの抗体は、単剤として、またはカクテル中、組み合わせられて防護を与える。他の目的は、一連の完全ヒト抗炭疽菌ＰＡ毒素抗体を生成する方法を提供することである。

一実施形態では、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を特異的に認識する、完全ヒトモノクローナル抗体またはその断片が開示される。一変形形態では、炭疽菌外毒素の一部は、防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）からなる群から選択される。

好ましい一実施形態では、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を認識する完全ヒト免疫グロブリンまたはその断片が開示され、前記免疫グロブリンまたはその断片は図５に示すアミノ酸配列を含んでいる免疫グロブリン重鎖を含む。一変形形態では、前記免疫グロブリンまたはその断片は、図５に示すヌクレオチド配列によってコードされている。

他の実施形態では、前記免疫グロブリンまたはその断片は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖を含み、ＣＤＲ１は図５に示すアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ２は図５に示すアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ３は図５に示すアミノ酸配列からなる。一変形形態では、免疫グロブリンのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は、それぞれ図５に示すヌクレオチド配列によってコードされている。

他の好ましい一実施形態では、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を認識する完全ヒト免疫グロブリンまたはその断片が開示され、前記免疫グロブリンまたはその断片は図６に示すアミノ酸配列を含んでいる免疫グロブリン軽鎖を含む。一変形形態では、前記免疫グロブリンまたはその断片は、図６に示すヌクレオチド配列によってコードされている。

他の実施形態では、前記免疫グロブリンまたはその断片は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖を含み、ＣＤＲ１は図６に示すアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ２は図６に示すアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ３は図６に示すアミノ酸配列からなる。一変形形態では、免疫グロブリンのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は、それぞれ図６に示すヌクレオチド配列によってコードされている。

本発明の好ましい一実施形態では、完全ヒト免疫グロブリンまたはその断片は、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を認識する一本鎖である。

好ましい一実施形態では、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を認識する完全ヒト免疫グロブリンまたはその断片が開示され、前記免疫グロブリンまたはその断片はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つの相補性決定領域を含む免疫グロブリン重鎖を含み、ＣＤＲ１は図５に示すアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ２は図５に示すアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ３は図５に示すアミノ酸配列からなる。

好ましい一実施形態では、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を認識する完全ヒト免疫グロブリンまたはその断片が開示され、前記免疫グロブリンまたはその断片はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つの相補性決定領域を含む免疫グロブリン軽鎖を含み、ＣＤＲ１は図６に示すアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ２は図６に示すアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ３は図６に示すアミノ酸配列からなる。

他の好ましい一実施形態では、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を認識する完全ヒト免疫グロブリンまたはその断片が開示され、前記免疫グロブリンまたはその断片は図８に示すアミノ酸配列を含んでいる免疫グロブリン重鎖または軽鎖を含む。

他の好ましい一実施形態では、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を認識する完全ヒト免疫グロブリンまたはその断片が開示され、前記免疫グロブリンまたはその断片は図９に示すアミノ酸配列を含んでいる免疫グロブリン重鎖または軽鎖を含む。

他の好ましい一実施形態では、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を認識する完全ヒト免疫グロブリンまたはその断片が開示され、前記免疫グロブリンまたはその断片は図１０に示すアミノ酸配列を含んでいる免疫グロブリン重鎖または軽鎖を含む。

本発明の他の実施形態に従い、図５および図６にそれぞれ示すヌクレオチド配列が開示される。これらのヌクレオチド配列は、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を認識する完全ヒト免疫グロブリンまたはその断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれコードする。

本発明の他の実施形態に従い、図８に示すヌクレオチド配列が開示される。これらのヌクレオチド配列は、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を認識する完全ヒト免疫グロブリンまたはその断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれコードする。

本発明の他の実施形態に従い、図９に示すヌクレオチド配列が開示される。これらのヌクレオチド配列は、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を認識する完全ヒト免疫グロブリンまたはその断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれコードする。

本発明の他の実施形態に従い、図１０に示すヌクレオチド配列が開示される。これらのヌクレオチド配列は、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を認識する完全ヒト免疫グロブリンまたはその断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれコードする。

本発明の他の好ましい一実施形態では、炭疽菌外毒素の少なくとも一部を特異的に認識する完全ヒトモノクローナル抗体を生成する方法が開示される。この方法は、炭疽菌に曝露された１人以上のヒトドナーからの末梢血単核細胞を免疫無防備状態の動物に投与することと、前記動物から少なくとも１つのリンパ球細胞を単離することと、前記少なくとも１つのリンパ球細胞をハイブリドーマ融合パートナーと融合させ、それによって完全ヒトモノクローナル抗体を生成することとを含む。

上記の方法の変形形態では、この方法は、生成された抗体をスクリーニングすること、前記リンパ球細胞の少なくとも一部をＥＢＶで形質転換すること、試験採血を使用して動物の免疫反応を特徴付けること、動物に炭疽菌抗原のブースター注射を１回以上行うこと、動物に抗ＣＤ８注射を１回以上行うこと、望ましくない細胞を逆選択する二重選択法を使用することをさらに含むことができ、前記二重選択法はＨＡＴ選択を使用すること、またはウアバインを使用することを含む。

この方法の更なる変形形態では、前記ヒトドナーは炭疽菌ワクチン接種されたドナーであり、および／または、前記ヒトドナーは炭疽菌に偶然に曝露された者である。

好ましい実施形態では、前記動物はＳＣＩＤマウスである。

好ましくは、前記ハイブリドーマ融合パートナーはマウス骨髄腫ＭＯＰＣ２１に由来する。一実施形態では、前記ハイブリドーマ融合パートナーは骨髄腫である。他の一実施形態では、前記ハイブリドーマ融合パートナーはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３である。

好ましい一実施形態では、炭疽菌外毒素の一部は、ＰＡ、ＬＦおよびＥＦからなる群から選択される。

本発明の他の好ましい一実施形態に従って、ヒトの受容体上での炭疽菌外毒素の防御抗原（ＰＡ）の集合を妨げる方法が開示される。好ましくは、この方法は、そのようなヒトに図５、６、８、９および１０に記載されているものを含む上記の免疫グロブリンまたはその断片のいずれかの抗体を投与することを含む。

本発明の他の一実施形態に従って、哺乳類に炭疽菌に対するワクチン接種をするための薬剤組成物が開示される。この薬剤組成物は、図５、６、８、９および１０に記載されているものを含む上記の免疫グロブリンまたはその断片のいずれかの完全ヒトモノクローナル抗体を含む。

本発明の他の一実施形態に従って、炭疽菌外毒素に曝露された哺乳類を治療するための薬剤組成物が開示される。この薬剤組成物は、図５、６、８、９および１０に記載されているものを含む上記の免疫グロブリンまたはその断片のいずれかの完全ヒトモノクローナル抗体を含む。

他の一実施形態では、哺乳類に炭疽菌に対するワクチン接種をする方法が開示される。この方法は、哺乳類に対して、図５、６、８、９および１０に記載されているものを含む上記の免疫グロブリンまたはその断片のいずれかの完全ヒトモノクローナル抗体の免疫量を投与することを含む。

炭疽菌に曝露された哺乳類を治療する方法も開示される。この方法は、哺乳類に対して、図５、６、８、９および１０に記載されているものを含む上記の免疫グロブリンまたはその断片のいずれかの完全ヒトモノクローナル抗体の治療量を投与することを含む。

本発明の他の一実施形態に従って、試料中の炭疽菌外毒素の存在を確認する方法が開示される。この方法は、前記試料の少なくとも一部を、図５、６、８、９および１０に記載されているものを含む上記の免疫グロブリンまたはその断片のいずれかの完全ヒトモノクローナル抗体と接触させることと、前記試料中の炭疽菌の存在の指標である、炭疽菌外毒素と抗体との結合を測定することを含む。

試料中の炭疽菌外毒素の存在を確認するためのキットも開示される。このキットは、図５、６、８、９および１０に記載されているものを含む上記の免疫グロブリンまたはその断片のいずれかの完全ヒトモノクローナル抗体と、前記試料中の炭疽菌の存在の指標である、炭疽菌外毒素と抗体との結合を測定するためのアッセイシステムを含む。

図５、６、８、９および１０に記載されているものを含む上記の免疫グロブリンまたはその断片のいずれかの他の好ましい一実施形態では、炭疽菌外毒素は３部からなる。一変形形態では、前記外毒素は天然のものか、または合成されたものである。

３部からなる炭疽菌外毒素の１つ以上の構成要素に結合する抗体、前記抗体の製造方法、および前記抗体の使用方法が提供される。いくつかの実施形態においては、これらの抗体は単剤として、またはカクテル中、組み合わせられて防護を与える。本明細書で定義される炭疽菌は、その通常の意味が与えられているものとし、また、合成物であろうが天然物であろうが、３部からなる炭疽菌毒素を含むものとし、また広義に定義されて、合成物であろうが天然物であろうが、以下の構成要素、すなわち防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）の１つ以上を含むものとする。したがって、「炭疽菌」に対する抗体は、炭疽菌毒素の１つ以上の構成要素のいかなる部分に対する抗体も含むものとする。さらに、本明細書で使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに異なった規定をしていない限り、複数形を含む。したがって、例えば「宿主細胞（a host cell）」と言うときは、複数のそのような宿主細胞を含み、「抗体（an antibody）」と言うときは、当業者に公知の１つ以上の抗体およびその同等物にも言及している。

図１に一般的に示されているように、一実施形態では、炭疽菌外毒素の防御抗原（ＰＡ）の少なくとも一部を特異的に認識する完全ヒトモノクローナル抗体を調製する方法が提供される。一実施形態では、この方法は、ヒトドナーから末梢血単核細胞を得ることを含む。ドナーから末梢血単核細胞を得た後、これらの血球を免疫無防備状態の動物に投与する。リンパ球細胞を単離し、ハイブリドーマ融合パートナーと融合させる。

好ましい一実施形態では、炭疽菌に曝露されたドナーからの血球を得る。そのような曝露は、曝露によって自然に起こったものでもよいし、ワクチン接種によって起こったものでもよい。さらに、一実施形態では、曝露はドナーの血球を得る数十年前、数年前または数日前に起こったものであってもよい。一実施形態では、前記曝露の「記憶」が捕えられるか呼び戻され、移植ＳＣＩＤマウスを免疫化することによって選択可能に拡張される。したがって、好ましい一実施形態においては、前記復活技術（recall technology）は、ヒトモノクローナル抗体を生成するために使用される。一実施形態では、ヒトドナーは、炭疽菌に対するワクチン接種をされている。炭疽菌または他の標的抗原に「予め曝露されていた」ヒト血球の使用は、驚くべき、予期しない利点をもたらす。これらの利点には、親和性がより高く、特異性がより高く、中和能がより強力な抗体の生成が含まれる。

他の一実施形態では、曝露されていない、または実験、投薬を受けてない血球が使用される。一実施形態では、曝露されていない血球は、免疫不全のマウスへの移植前に、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで炭疽菌に曝露される。このようにして、最初は曝露されていない細胞が曝露された細胞に形質転換され、上述の復活技術に従って使用することができる。

好ましい一実施形態では、末梢血単核細胞はドナーから得られる。他の一実施形態では、他の細胞型、例えば、それらに限定されないが、リンパ球、脾細胞、骨髄、リンパ節細胞および免疫細胞などが得られる。

一実施形態では、血球は免疫無防備状態または免疫不全の動物に投与される。一実施形態では、この動物はＳＣＩＤマウスである。

本発明の一態様では、動物の免疫反応が試験採血を使用して特徴付けされる。他の一実施形態では、生成された抗体はスクリーニングされて単離される。さらなる他の一実施形態では、リンパ球細胞はＥＢＶで形質転換される。一実施形態では、免疫無防備状態の動物に炭疽菌抗原のブースター注射が１回以上行われる。他の一実施形態では、動物に抗ヒトＣＤ８注射が１回以上行われる。さらなる他の態様では、望ましくない細胞を逆選択する二重選択法が使用され、これにはＨＡＴおよびウアバインの使用が含まれるが、これに限定されるものではない。本発明の一実施形態では、ハイブリドーマ融合パートナーは、マウス骨髄腫Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３である。本発明の他の一実施形態では、ハイブリドーマ融合パートナーはマウス骨髄腫Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３に由来する。

本発明の一実施形態では、一連のヒト抗炭疽菌ＰＡ毒素抗体が提供される。一実施形態では、モノクローナル抗体（ＩＪ８：２１Ｄ９または「２１Ｄ９」）が提供される。図４に示されるように、抗体２１Ｄ９は、ＲＡＷ細胞アッセイにおいて、毒性抑制に有効であった。抗体２１Ｄ９はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、マウスマクロファージ細胞系を毒素攻撃から保護することも示された。２１Ｄ９のＩＣ_５０値は、ピコモルの範囲にあり、また投入ＰＡ毒素とほぼ等モルの化学量論にあることがわかった。ＢｉａＣｏｒｅ分析で測定した平衡解離定数（Ｋ_ｄ）は、この実施形態が抗原と、ピコモルの範囲で、高親和性で結合することを明らかにした。２１Ｄ９ハイブリドーマの重鎖および軽鎖ｃＤＮＡから導かれたアミノ酸配列は、公知のＶＨおよびＶＬ遺伝子ファミリーへの帰属を許したが、これらの生殖細胞系配列からの著しい変化も観察され、それによって体細胞超変異の発生を示していた。一実施形態では、２１Ｄ９が保護を与えるメカニズムも提供される。抗体２１Ｄ９、および本明細書に記載される他の抗体は、炭疽菌Ａ級細菌戦毒素の予防および治療のためのｉｎ ｖｉｖｏでのヒトの使用のために使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、炭疽菌感染を予防するための方法が提供される。一実施形態では、炭疽菌感染を予防するために哺乳類にワクチン接種をする方法が提供される。他の一実施形態では、炭疽菌に曝露された哺乳類を治療する方法が提供される。

一実施形態では、抗体２２Ｇ１２、およびこれを製造および使用する方法が提供される。他の一実施形態では、抗体１Ｃ６、およびこれを製造および使用する方法が提供される。他の一実施形態では、抗体４Ｈ７、およびこれを製造および使用する方法が提供される。

好ましい実施形態では、炭疽菌外毒素の構成要素またはその構成要素の組合せに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体が提供される。炭疽菌外毒素は３部からなる形態でもよく、また、炭疽菌毒素は天然のものでも、合成されたものでもよい。３部からなる形態では、炭疽菌外毒素は防御抗原（ＰＡ）、浮腫因子（ＥＦ）および致死因子（ＬＦ）を含む。

好ましい実施形態では、抗体産生細胞から抗体可変領域をコードしている遺伝子を取り出し、全ＩｇＧ／κまたはＩｇＧ／λを産生する安定組換え細胞株を確立することによって、モノクローナル抗体が生産される。一実施形態では、免疫動物から回収される抗体産生細胞は、適当な融合パートナーと細胞融合させられる。得られたハイブリドーマは、次いで、生産された抗体の活性に関してスクリーニングされる。選択されたハイブリドーマは、まず、３部からなる炭疽菌外毒素の構成要素との結合活性に関してスクリーニングされる。一実施形態では、ハイブリドーマは、ＥＬＩＳＡ試験などのイムノアッセイおよびバイオアッセイにおけるＰＡ、ＬＦおよび／またはＥＦタンパク質との結合能に基づいて選択される。一実施形態では、ハイブリドーマはバイオアッセイにおいて保護作用を示す。陽性ウェルからの細胞は、ｍＲＮＡを単離するために使用される。ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡが逆転写される。ＣＨ１ドメインまたは軽鎖のフレームワーク４のプライマーおよび逆方向プライマーのどちらかを使用して、可変ドメインがＰＣＲ増幅される。

一実施形態では、ＰＡ、ＬＦおよび／またはＥＦとの所望の結合活性を有する抗体の可変領域を構成しているアミノ酸配列、およびこれらをコードするヌクレオチド配列が提供される。いくつかの実施形態では、図５、６、８、９および１０に示されるアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を含んでいる免疫グロブリン可変領域が提供される。図５は、２１Ｄ９ ＭＡｂ重鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。図６は、２１Ｄ９ ＭＡｂ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。他の一実施形態では、図５および図６に示すヌクレオチド配列を含んでいる免疫グロブリン可変領域をコードするｃＤＮＡが提供される。一実施形態では、これらのアミノ酸配列またはｃＤＮＡヌクレオチド配列は必ずしも同一ではなく、ＰＡ、ＬＦおよび／またはＥＦに対する特異的結合活性が維持される限り変化してもよい。他の一実施形態では、ヌクレオチド配列の変形形態が提供される。後で記載するように、いくつかの実施形態では、ＣＤＲに対応する部位は非常に変異しやすい。ＣＤＲ領域では、ときには全てのアミノ酸が変化することがある。

一実施形態では、各免疫グロブリン分子は、分子量のより大きい重鎖と、分子量のより小さな軽鎖とからなる。重鎖および軽鎖はそれぞれ、Ｎ末端に約１１０のアミノ酸残基の「可変領域」と呼ばれる領域を有し、それらは分子間で異なる。重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、ＶＨおよびＶＬと称される。抗原結合部位は、重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬの間の静電的相互作用を通して二量体を形成することによって形成される。可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワークからなる。ＣＤＲは抗原分子と相補性立体構造を形成し、抗体の特異性を決定する。４つのフレームワーク領域（ＦＲ）の間に挿入された３つのＣＤＲは、可変領域においてモザイク状に存在する（Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ｖｏｌ．１、第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、１９９１年）。ＦＲのアミノ酸配列はよく保存されているが、ＣＤＲのアミノ酸配列は非常に変化しやすく、したがって超可変領域と呼ばれることがある。一部の実施形態では、ＰＡ、ＬＦおよび／またはＥＦを特異的に認識する抗体のアミノ酸配列の中で、抗原への結合活性を決定するＣＤＲが提供される。好ましい実施形態では、図５および図６に示され、その図に応じてラベルされているＣＤＲが提供される。

免疫グロブリン分子の可変領域をコードしているヌクレオチド配列をもつｃＤＮＡは、３部からなる炭疽菌外毒素のＰＡ、ＬＦおよび／またはＥＦに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマからクローニングすることができる。配列を増幅するために、ＰＣＲを実施することができる。活性クローンを確認するために、ＥＬＩＳＡを使用して、３部からなる炭疽菌外毒素のＰＡ、ＬＦおよび／またはＥＦとの結合を決定することができる。３部からなる炭疽菌外毒素のＰＡ、ＬＦおよび／またはＥＦに結合することができる抗体の親和性に関するさらなる研究は、結合親和力および結合動態を測定するためのＢｉａＣｏｒｅ（ＢｉａＣｏｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）表面プラズモン共鳴装置などの装置を使用した動態学的および熱力学的研究で決定することができる。したがって、一実施形態では、特定のｃＤＮＡ配列が提供される。

一実施形態では、炭疽菌外毒素のＰＡ構成要素のオリゴマー化を妨げることができるモノクローナル抗体が提供される。したがって、好ましい実施形態のモノクローナル抗体は、予防的または治療的な用途を有することができる。好ましいモノクローナル抗体は、炭疽菌に対しての哺乳類のワクチン接種として、または炭疽菌外毒素に曝露された哺乳類の治療法としての薬剤組成物で使用することができる。したがって、好ましい実施形態では、哺乳類に炭疽菌に対するワクチン接種をする方法および／または炭疽菌に曝露された哺乳類を治療する方法が提供される。

いくつかの実施形態のモノクローナル抗体は、薬剤組成物として投与することができる。したがって、一実施形態では、抗体はいくつかの異なる経路により、例えば、それらには限定されないが、経口、非経口および局所的経路により投与することができる。本明細書で使用される用語「非経口」は、その通常の意味が与えられているものとし、また、それらには限定されないが、皮下、静脈内、動脈内の注射または注入法も含むものとする。本明細書で使用される用語「局所的」は、その通常の意味が与えられているものとし、また、皮膚ならびに口および鼻の粘膜というより一般的な経路と同様に、直腸投与および吸入スプレーによる投与も含むものとする。当業者ならば、投与すべき適当な投薬量を理解するであろう。薬剤組成物中の好ましい抗体の実際の投薬量レベルは、特定の患者に対して所望の治療反応を達成するために有効な好ましい抗体の量を投与するように変えることができる。選択される投薬量レベルは、その化合物の活性、投与経路、治療している病気の重篤度、および治療している患者の状態と以前の既往歴による。しかし、その化合物の用量を、所望の治療効果を達成するのに必要とされるものより低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで、投薬量を徐々に増加させることは当業者の技術の範囲内である。所望により、有効な１日用量は、投与のために複数回投与に、例えば１日につき２〜４回の投与に分割することができる。しかし、いかなる特定の患者のための特定の用量レベルは、体重、全般的な健康状態、食事、投与時間および経路、他の薬剤との組合せ、ならびに治療しているその疾患の重篤度を含む様々な要因に依存することは理解されよう。本発明のいくつかの実施形態によれば、この医薬製剤は様々な形態、例えば、それらには限定されないが、注射液、坐薬、散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁剤、液剤およびエリキシル剤をとることができる。

本発明の好ましい実施形態では、試料中の炭疽菌外毒素の存在を確認するためのキットが提供される。好ましいキットは、炭疽菌外毒素の構成要素の少なくとも一部を特異的に認識するモノクローナル抗体を含む。試料は、炭疽菌外毒素の構成要素の少なくとも一部を特異的に認識するモノクローナル抗体と接触させる。炭疽菌外毒素が存在するならば、炭疽菌外毒素とモノクローナル抗体との結合を測定することができる。

以下の開示は、本発明のいくつかの実施形態に従って化合物を製造するための好ましい方法を示す、具体的な実施例である。これらの実施例は、その範囲を限定するものではなく、むしろ好ましい実施形態を例示するものである。例えば、以下の実施例は炭疽菌に対する抗体の生成を記載しているが、他の抗原に対する抗体も以下に示す実施例に従って製造することができる。本明細書に記載されているプロトコルを適合するための様々な改変および変更は当業者ならば理解するであろう。

＜実施例１＞
間接ＥＬＩＳＡ
平底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｆ９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍＬの濃度の炭疽菌防御抗原（ＰＡ）および致死因子（ＬＦ）（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（市、州））５０μｌで、４℃で一晩コーティングした。プレートはＴｗｅｅｎ ２０を０．１％加えたＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌの希釈血清を室温で１時間ウェルに加えた。プレートを前のように洗浄し、５０μｌの二次抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｆｃγ特異的−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０９−０３６−０９８）またはヤギ抗ヒトＩｇＭ，Ｆｃ５μ特異的−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０９−０３６−０４３）を加え、室温で１時間インキュベートした。もう１回の洗浄工程の後、クエン酸緩衝剤（ｐＨ５．０で０．０２５Ｍ）中、ＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド）を０．４ｍｇ／ｍＬ含む基質溶液１００μＬを加えた。１５分後に、２５μｌの３Ｎ ＨＣｌを加えて反応を停止し、その後、プレートをマイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で、４９０ｎｍで読み取った。

＜実施例２＞
ＲＡＷ２６４．７細胞株 ｉｎ ｖｉｔｒｏ バイオアッセイ
抗血清中の炭疽菌毒素ＰＡおよび／またはＬＦに対する中和（保護）抗体の存在を、マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７標的細胞株を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ保護バイオアッセイを使用して測定した。Ｈａｎｎａ，Ｐ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９０：１０１９８（１９９３）。ＰＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＬＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）は、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ培地の有効体積１００μｌ中、３７℃で３０分間、示された抗血清希釈液と共にプレインキュベートした。その後、この１００μｌ体積を、１００μｌの同じ培地中で１×１０^４のＲＡＷ２６４．７細胞／ウェルを含む９６ウェル平底組織培養プレートに移した。培養物は、３７℃で３時間インキュベートした。ウェルは、培地で２回洗浄した。残りの付着している細胞を溶解し、解離した乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のレベルをＣｙｔｏＴｏｘ ９６キット（Ｃａｔ＃ＰＡＧ１７８０ Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して測定した。簡単に言うと、１０μｌの溶解液を１ウェルにつき１００μｌの培地に加え、その混合物を５％ＣＯ_２、３７℃の加湿チャンバー内で４５分間インキュベートした。溶解物のアリコート（５０μｌ）を新しいプレートに移し、５０μｌのアッセイ緩衝液を加えた。プレートは３０分間インキュベートした。その後、５０μｌの停止液を加えた。プレートは、Ｔｅｃａｎ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｆｌｕｏｒ（Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）リーダーを使用して４９０ｎｍで読み取った。

＜実施例３＞
炭疽菌ワクチン接種されたドナーからのヒトＰＢＭＣのＳＣＩＤマウスへの移植
末梢血単核細胞は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ，１０７７−１（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用した密度勾配により、炭疽菌ワクチン接種されたドナーの全血から濃縮した。本発明のいくつかの実施形態に従って、他の型の細胞も使用することができることを当業者は理解するであろう。典型的には、ドナーから１単位の血液を得た。１２週齢の雌のＳＣＩＤ／ｂｇマウスそれぞれに、２．５ｅ７の単離されたヒトＰＢＭＣを移植した（腹腔内接種によって）。それらのマウスは、細胞外６２０ハイブリドーマ無血清培地（ＪＲＨ、ＫＳ）および０．２ｍｇの抗ＣＤ８抗体（さらなる精製をすることなく、直接使用された）を含む２ｍＭのＬ−グルタミン中で成長させたＯＫＴ８マウスハイブリドーマからの調整培地１容量で同時に腹腔内投与した。これらのマウスは、ミョウバン（Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に吸着させた各２μｇのＰＡおよびＬＦの組合せで（腹腔内）免疫化され、その後、７日目、１９日目および２６日目にブースト（腹腔内注射）した。マウスには、７日目に、Ｂ９５−８マーモセット細胞株の使用済み調整培養培地から得られた０．５ｍｌのＥＢＶを接種した。試験採血は、１４日目および２９日目に、眼窩洞から得た。４２日目に融合のために細胞を採取し、また同時に、さらなる試験採血試料を得る前に、２つの連続した、ＰＡおよびＬＦの腹腔内および静脈内ブーストを行った（生理食塩水に溶解したものを４０日目および４１日目にそれぞれの経路で５μｇ投与）。

＜実施例４＞
ヒトハイブリドーマの生成
脾細胞および大細胞リンパ腫（ＬＣＬ）腫瘍を、４２日目に、間接ＥＬＩＳＡで陽性の試験採血を示したマウスから採取した。ヒトハイブリドーマは、Ｋｅａｒｎｅｙ ＪＦ、Ｒａｄｂｒｕｃｈ Ａ、Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ Ｂ、Ｒａｊｅｗｓｋｉ Ｋ（１９７９年）に記載されているように、融合のためのＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３：リンパ球の比率が１：３〜１：５となるように変更して、マウス骨髄腫Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３をＰＥＧ−１５００（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に使用し、別々の融合体としてこれらから生成した。マウス骨髄腫細胞株は、免疫グロブリン発現を失っているが、抗体分泌ハイブリドーマ細胞株の構築を可能にする。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １２３：１５４８〜１５５８。

この例示的な方法ではＰ３ｘ６３ａｇ８．６５３を使用したが、本発明の様々な実施形態に従って、いくつかの融合パートナー、例えば、それらには限定されないが、マウス骨髄腫ＭＯＰＣ２１、トリオーマなどに由来する細胞を使用することができることを当業者は理解するであろう。ＥＢＶ−ＬＣＬおよび融合していないＰ３ｘ６３ａｇ８．６５３融合パートナーを逆選択する二重選択は、ＨＡＴ選択およびウアバインの組合せを使用して実施した。濃度８μＭのウアバイン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用した。本発明のいくつかの実施形態に従って、Ｎａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰアーゼに干渉する他の毒または毒素も使用することができることを当業者は認めるであろう。加えて、他の選択方法も使用できることを当業者は理解するであろう。

＜実施例５＞
２１Ｄ９ハイブリドーマ細胞の処理およびサブクローニング
融合の１６日後に、９６ウェルプレートからのハイブリドーマ上清を間接ＥＬＩＳＡで試験した。１２４８ウェル（１３プレート）中、約１７ウェルは、ＰＡについて初期陽性ＥＬＩＳＡシグナルを示した。それらの全てはさらなる分析のために選択され、１０％のＦＢＳ、２０％のハイブリドーマクローニング因子（ＩＧＥＮ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｏｕｇ、ＭＤ）、５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ６（Ｉ−１８８、Ｌｅｉｃｏ）、１×ＨＴ（Ｓｉｇｍａ）、１×ビタミン類（Ｏｍｅｇａ）、１×ピルビン酸ナトリウム（Ｏｍｅｇａ）、１×ＮＥＡＡ（Ｏｍｅｇａ）、２×Ｌ−グルタミン（Ｏｍｅｇａ）を加え、抗生物質を含まないＲＰＭＩ（Ｏｍｅｇａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中の放射線を照射されたＮＨＬＦ（Ｃａｔ＃ＣＣ−２５１２、Ｃａｍｂｒｉｘ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）のフィーダー層上で、５細胞／ウェルでサブクローニングした。サブクローニングプレートは、１０日後に、間接ＥＬＩＳＡで試験した。陽性の強いウェルからの個々のコロニーは、先を引っ張って鋭くしたパスツールピペットを使用して、顕微鏡下、手で採取した。２週間後に、個々に採取したクローンを間接ＥＬＩＳＡで再試験した。陽性細胞を回収し、免疫グロブリンをコードしている転写ｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを形成した。抗体２１Ｄ９についての方法論が本明細書に記載されているが、本明細書に記載されている例示的な方法論が本明細書に記載され、クレームされている他の抗体を製造および試験するためにも使用できることを当業者は理解するであろう。

＜実施例６＞
可変領域２１Ｄ９ ＩＧＧおよびＩＧＫのｃＤＮＡクローニングおよび発現
総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用し、特定のＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマから調製した。ＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡの混合物を合成し、同じ試験管内でワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して増幅した。サイクルパラメーターは、５０℃で３５分間、９５℃で１５分間、１サイクル：９４℃で３０秒間、５２℃で２０秒間および７２℃で１分１５秒間を３５サイクル、７２℃で５分間であった。

ＲＴ−ＰＣＲのためにプライマーを使用した。これらのＲＴ−ＰＣＲのために使用したプライマーは以下のものである。

ＲＴ−ＰＣＲの後に、高フィデリティ白金ＰＣＲミックス（High Fidelity Platinum PCR Mix；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で、ネストＰＣＲを実施した。１マイクロリットルのＲＴ−ＰＣＲ生成物を、別々の試験管で、ＶＨγ、ＶＬκまたはＶＬλ特異的ｃＤＮＡ増幅のために使用した。実質的に同時に、制限酵素部位を両端に導入した。サイクルパラメーターは、９４℃で２分間、６℃で３０秒間および６８℃で４５秒間を１サイクル、１サイクル：９４℃で４０秒間、５４℃で２５秒間および６８℃で４５秒間を３５サイクル、６８℃で５分間であった。

各特異的ＰＣＲ生成物を別々に精製し、制限酵素で消化して、下記のように適当な哺乳類の完全長Ｉｇ発現ベクターにサブクローニングした。

＜実施例７＞
ベクターへのサブクローニング
ネストＰＣＲのためのプライマーを使用した。これらのプライマーは以下の通りである。

ＶＨγＰＣＲ生成物をＢｓｒＧ ＩおよびＡｐａ Ｉで消化し、Ｓｐｌ ＩおよびＡｐａ Ｉ二重消化によって線状化されるｐＥＥＧ１．１ベクターに連結する。

ＶＬκＰＣＲ生成物をＡｇｅ ＩおよびＳｐｌ Ｉで消化し、Ｘｍａ ＩおよびＳｐｌ Ｉ二重消化によって線状化されるｐＥＥＫ１．１ベクターに連結する。

ＶＬλＰＣＲ生成物をＡｐａ ＩおよびＡｖｒ ＩＩで消化し、Ａｐａ ＩおよびＡｖｒ ＩＩ二重消化によって線状化されるｐＥＥＬｇベクターに連結する。陽性クローンは、一時的な同時トランスフェクションの後に、ＰＡでコーティングされたプレート上での間接ＥＬＩＳＡによって上清中の発現を測定することにより同定された。ＣＨＯ Ｋ１細胞は、リポフェクトアミン−２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、ＩｇＧおよびＩｇＫのｃＤＮＡの異なる組合せでトランスフェクションした。上清は、トランスフェクションの約４８時間〜約７２時間後に採取した。複数の陽性クローンをＡＢＩ ３７００自動シーケンサ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で配列決定をし、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ｖ４．１．４ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）で分析した。

＜実施例８＞
安定した細胞株の確立
Ｉｇ重鎖または軽鎖の発現ベクターをＮｏｔ ＩおよびＳａｌ Ｉで二重消化し、次に、両方の断片を連結して、二重遺伝子発現ベクターを形成した。６ウェルプレート内のＣＨＯ−Ｋ１細胞を、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、二重遺伝子発現ベクターでトランスフェクションした。２４時間後、トランスフェクション細胞を選択培地（１０％の透析ＦＢＳ、５０μＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＧＳサプリメントを加えたＤ．ＭＥＭ）の入っている１０ｃｍのペトリ皿に移した。２週間後、ＭＳＸ抵抗性のトランスフェクタントを単離して増大させた。ＰＡ特異ＥＬＩＳＡアッセイで上清を測定することによって、抗ＰＡ抗体高生産性クローンを選択した。ＭＳＸ濃度を５０μＭから１００μＭまで高くして、抗体生産性を高めた。

＜実施例９＞
無血清適応手法
細胞を液体窒素保存から解凍し、この細胞を１×ＧＳ（ＪＲＨ、ｃａｔ．＃５８６７２−１００Ｍ）および２５〜１００ｍＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．＃Ｍ５３７９）を含むＥｘＣｅｌｌ ３０２無血清培地（ＪＲＨ、ｃａｔ．＃１４３１２−１０００Ｍ）の１０％ＦＢＳ中に入れた。細胞をトリプシン（Ｏｍｅｇａ、ｃａｔ．＃ＴＥ−９１）で処理し、１：５で分割した。培養培地を５％のＦＢＳを含んでいる培地に変え、２日間細胞を培養した。細胞が５％のＦＢＳを含んでいる培地での成長に適応したとき、培地を１００％の無血清培地＋２．５％のｄｉ ＦＢＳに変えて１〜２日間おき、次いで、１００％の無血清培地に変えた。この時点で、細胞は懸濁状であった。この細胞を、無血清培地での小規模生産のためのインテグラフラスコに拡張した。使用済み培養培地を０．２μのフィルターを通してろ過し、次いで、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に直接流し入れ、続いて２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４で洗浄することによって精製を行い、０．１ＭのグリシンＨＣｌｐＨ３．４で抗体を溶出して、直ちに１／１０容量の１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．０で中和した。分画タンパク質含有量は２８０ｎｍの吸光度で測定し、抗体を含んでいる分画をプールして、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（２×５００容量）に対して透析し、０．２μのフィルターを通してろ過殺菌した。抗体の特性をＳＤＳ−ＰＡＧＥでさらに調べ、純度は９５％を上回っていた。

＜実施例１０＞
親和性の測定
親和定数は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の原理とＢｉａｃｏｒｅ ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）とを使用して測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５チップは、製造業者の使用説明書に従って、ＣＭ５チップの２つのフローセルに接合されたアフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と一緒に使用した。まず、最適濃度の抗体調製物を２つのフローセルの１つに導入し、抗ヒトＩｇによって捕獲する。次に、既定濃度の抗原を既定期間、両方のフローセルに導入し、抗体を含まないフローセルを参照シグナルとして使用する。抗原が捕獲された関心の抗体に結合するにつれて、ＳＰＲシグナルに変化が起こり、これは結合した抗原の量に比例する。既定期間の後、抗原溶液を緩衝液で置換し、次いで、抗体からの抗原の解離を再びＳＰＲシグナルによって測定する。Ｂｉａｃｏｒｅによって提供される曲線適合ソフトウェアは、会合速度および解離速度、親和性の推定値を出す。

この研究からの結果は、下記の表１に要約する。２１Ｄ９ ＭＡｂの組換え型についての平衡解離定数（Ｋ_ｄ）は、ＢｉａＣｏｒｅ分析で測定した。速度定数ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆは、ＢｉａＣｏｒｅ分析においてセンサーグラムから直接評価し、Ｋ_ｄを導いた。

＜実施例１１＞
免疫酵素アッセイによるヒトＩｇＧ定量化
平底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ Ｆ９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍＬの濃度のヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｆｃγ特異的（ｃａｔ＃ １０９−００５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）５０μｌで、４℃で一晩コーティングした。プレートは、ＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で４回洗浄した。一方、別の調製プレートにおいて、標準品（ｄｕｐｌｏ中）および未知のものの希釈物を、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む１００μｌ容量のＰＢＳ中で調製した。精製したモノクローナルヒトＩｇＧ１Ｋ骨髄腫タンパク質（ｃａｔ＃Ｉ−５１５４ Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を標準として使用し、異なるＩｇＧ１Ｋ骨髄腫タンパク質（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｔｈｅｎｓ、Ｇｅｏｒｇｉａ）が比較のための内部較正物質として働いた。希釈された試験試料（５０μｌ）をアッセイプレートのウェルへ移し、室温で１時間インキュベートした。プレートを前のように洗浄し、５０μｌの検出抗体（１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：４０００）ヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰ（Ｃａｔ．＃２０６０−０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａｂａｍａ）を加えて、室温で１時間インキュベートした。もう１回の洗浄工程の後、クエン酸緩衝剤（ｐＨ５．０で０．０２５Ｍ）中、ＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド）を０．４ｍｇ／ｍＬ含む基質溶液１００μＬを加えた。１５分間の基質インキュベーションの後に、２５μｌの３Ｎ ＨＣｌ停止溶液を加え、プレートをマイクロプレートリーダー（ＶｅｒｓａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で、４９０ｎｍで読み取った。未知溶液は、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ ｖ４．０ソフトウェア（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用し、標準曲線値から内挿した。

＜実施例１２＞
結果
炭疽菌ワクチン接種されたドナーからのヒトＰＢＭＣを移植し、さらにｉｎ ｖｉｖｏで予防接種によってブーストしたマウスから試験採血を得た。図２Ａ〜Ｈは、移植マウスの血清と比較してのドナー血漿中の抗炭疽菌毒素レベルの比較結果を示す。図２Ａ〜Ｈは、マウス血清中の機能的免疫反応性（間接ＥＬＩＳＡ）抗体のレベルが、ドナーで観察されたものよりもかなり高いことを示している。様々なレベルの免疫反応性抗体が移植マウスで観察された。移植マウスからの試験採血はまた、マウスマクロファージＲＡＷ細胞バイオアッセイにおいて、抗ＰＡ／ＬＦ防御抗体の存在についても評価した（図３）。このバイオアッセイでは、細胞へのＰＡ／ＬＦ複合体の移動は、細胞死に至るシグナル伝達事象（ＭＡＰＫＫ媒介）、および低いバイオアッセイシグナルを引き起こす。防御抗体の存在はこれを逆転させる。元のドナー血漿は、移植マウスと比較すると、検出可能なレベルの防御抗体を含んでいないようであった（低希釈溶液で試験した場合でさえも）。移植マウスにおける免疫反応性（ＥＬＩＳＡ）抗体の増加および血清防御の様相の両方は、ヒトＰＢＭＣ移植ＳＣＩＤマウスの反復免疫化によって導き出される、炭疽菌毒素に対する血清防御免疫反応の増幅を示す。一実施形態では、適当な血清陽性の存在は、ヒトハイブリドーマを生成するための融合のために適当な動物を選択するための好ましい一基準である。

移植マウスの様々な区画（腹膜洗浄（ＰＷ）、脾臓（ＳＰ）または腹腔内のＬＣＬ腫瘍（ＴＵ）のいずれか）から得られた細胞を用いて、一連の１４の個々の融合を実施した。いくつかの融合では、融合の前に間接ＥＬＩＳＡおよびＲＡＷ細胞バイオアッセイによって特異的抗炭疽菌毒素抗血清を生産していると決定されたいくつかの移植マウスから、細胞をプールした。融合の結果の概要を表２に示す。

最初に、間接ＥＬＩＳＡにおいてポリスチレンマイクロタイタープレートウェルに吸着したＰＡ（８３ｋＤ）タンパク質と結合する能力に基づいて、ハイブリドーマを選択した。広範囲にわたる、上清中の特異的抗ＰＡ抗体の相対量についての値が観察された。平行して、各上清を炭疽菌毒素防御ＲＡＷ細胞バイオアッセイで個々に試験した。

ＰＡ（８３ｋＤ）およびＬＦ毒素のカクテルを使用し、有効なｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＣ_５０保護濃度を評価するために、ＲＡＷ細胞バイオアッセイにおけるハイブリドーマ由来の２１Ｄ９の用量反応曲線を使用した。０．２１ｎＭの抗体ＩＣ_５０値が観察された（図５）。

２１Ｄ９抗体は、ＰＡ毒素の切断型（６３ｋＤ）と同様に非切断型（８３ｋＤ）に結合するが、七量体にはより低い度合いで結合することがＢｉａＣｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｅａｐａｃｋ、ＮＪ）を使用して見出された。さらに、ＢｉａＣｏｒｅでの連続したインキュベーションによって決定されたように、この抗体がＰＡ（６３ｋＤ）七量体へのＬＦ結合を妨げることができるという証拠はなかった。この知見は、ＰＡ毒素のドメイン２が、この抗体によってブロックされるエピトープであることを含意している可能性がある。

２１Ｄ９ ＭＡｂ重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列が決定された（図５および図６）。

Ｖ ＢＡＳＥ ＤＮＡＰＬＯＴソフトウェア（１８）を使用した可変領域のアラインメントは、２１Ｄ９重鎖が、ＶＨ３ファミリーからのＶＨ遺伝子（３〜４３遺伝子座）、Ｎ領域付加したＤ領域セグメント６〜１９（第１の読み枠内）およびＪＨ４ｂを使用することを示した。２１Ｄ９軽鎖は、ＶＫＩファミリー（Ｌ１２遺伝子座）からのものであり、ＪＫＩ領域セグメントを使用した。最も緊密に関連した生殖細胞系からの突然変異の数は、２６（重鎖）および１４（軽鎖）であった。生殖細胞系Ｖ遺伝子との比較は、２１Ｄ９のＶ領域で、Ａｇ誘導免疫反応の特徴である広範な体細胞変異が起きたことを示唆している。

＜実施例１１＞
免疫化されたドナーからのヒトモノクローナル抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで炭疽菌致死毒素から保護する
炭疽菌によって生産される主要な毒性因子である炭疽菌外毒素は、防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）の３部の組合せである。これらの毒素は、炭疽菌病原において重要な役割を有しており、最初は免疫系を害し、炭疽菌が免疫学的監視を逃れて拡散し、高濃度に達することを可能にし、感染後期には、毒素はヒトを含む宿主動物の死に直接寄与すると考えられる。外毒素のＰＡ構成要素を中和する抗体は、感染初期および可能性としては後期においても、炭疽菌毒素曝露からの有効な保護を与えることができた。一実施形態では、ワクチン接種されたドナーから得られるＰＢＭＣに由来する、一群の非常に強力な完全ヒト抗ＰＡ中和抗体の生成が提供される。

これらの抗体は、ヒトＰＢＭＣで再構成されたＳＣＩＤマウスのｉｎ ｖｉｖｏ免疫化の併用（米国特許第５，４７６，９９６号、第５，６９８，７６７号、第５，８１１，５２４号、第５，９５８，７６５号、第６，４１３，７７１号、第６，５３７，８０９号）と、続いての抗ＰＡ抗体を発現しているヒトＢ細胞の回収およびマウス骨髄腫細胞との細胞融合による不死化を通して生成された。ヒト免疫グロブリンｃＤＮＡを単離して、哺乳類の発現ベクターにサブクローニングした。組換え抗体は、まず、ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞株を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイによってスクリーニングした。さらに、選択された抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｆｉｓｈｅｒ３４４ラットボーラス毒素攻撃モデルにおける致死毒素の中和について評価した。

可変領域の分析は、ＳＣＩＤマウスから回収された抗体は多様であり、超変異していることを示した。これらの抗体の中で、ＡＶＰ−２１Ｄ９またはＡＶＰ−２２Ｇ１２の単回静脈内投与が、ラット毒素攻撃予防モデルで、ＰＡに対して０．５×（ＡＶＰ−２１Ｄ９）または１×（ＡＶＰ−２２Ｇ１２）モル過剰なだけで完全な保護を与えることが見出された。アグリコシル化ＰＡ中和抗体も、致死毒素攻撃からラットを保護した。以下の理論に束縛されることを望むものではないが、ｉｎ ｖｉｖｏのＰＡ毒素中和活性はＦｃ媒介エフェクター作用に依存しないと考えられる。

一実施形態では、生成されるこれらの強力な完全ヒト抗ＰＡ毒素中和抗体は、炭疽菌Ａ級バイオテロリズム毒素に対する予防および／または治療のためにｉｎ ｖｉｖｏでヒトのために使用することができる。

＜実施例１２＞
免疫されたドナーからの一群の強力な炭疽菌毒素中和ヒトモノクローナル抗体のキャラクタリゼーション
一実施形態では、３部からなる炭疽菌毒素のＰＡ構成要素に結合し、単剤として保護を与える抗体が提供される。一実施形態では、抗体２１Ｄ９が提供される。他の一実施形態では、抗体２２Ｇ１２が提供される。他の一実施形態では、抗体１Ｃ６が提供される。一実施形態では、これらの抗体は、炭疽菌感染の予防および／または治療において、単剤として使用される。他の実施形態では、これらの抗体の２つ以上の組合せを使用して、エアロゾル化炭疽菌胞子に曝露された、または他の形態の炭疽菌に曝露された哺乳類を治療する。

一実施形態では、表面プラズモン共鳴（ＢｉａＣｏｒｅ ３０００）で測定されるように、約８２ｐＭから約７００ｐＭの範囲の高親和性でＰＡに結合する抗体が提供される。実験データは、特有の非競合部位を認識し、また可溶性ＴＥＭ−８のＰＡ認識を妨げないようである抗体１Ｃ６、２１Ｄ９および２２Ｇ１２が提供されることを示した。これら３つの抗体の生物学的効力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ炭疽菌致死毒素中和アッセイにおいて測定した。３つの抗体はすべて、ＲＡＷ２６４．７細胞を毒素誘導細胞死から保護し、また等モル未満の毒素に対する抗体の比率で５０％の中和をもたらした。

多数の本発明の好ましい実施形態およびその変形形態を詳述したが、有用な他の変更および方法は当業者にとって容易に明らかになるであろう。したがって、様々な応用、変更および置換形態が、本発明の精神または請求項の範囲から逸脱することなく、同等物となることを理解するべきである。

炭疽菌ワクチン接種されたドナーからのヒトＰＢＭＣのＳＣＩＤマウスへの移植のスケジュールを示す図である。 移植マウスと比較してのドナー血漿中の抗炭疽菌毒素レベルを示す図である。 移植マウスと比較してのドナー血漿中の抗炭疽菌毒素レベルを示す図である。 移植マウスと比較してのドナー血漿中の抗炭疽菌毒素レベルを示す図である。 移植マウスと比較してのドナー血漿中の抗炭疽菌毒素レベルを示す図である。 移植マウスと比較してのドナー血漿中の抗炭疽菌毒素レベルを示す図である。 移植マウスと比較してのドナー血漿中の抗炭疽菌毒素レベルを示す図である。 移植マウスと比較してのドナー血漿中の抗炭疽菌毒素レベルを示す図である。 移植マウスと比較してのドナー血漿中の抗炭疽菌毒素レベルを示す図である。 ドナーおよびＨｕＰＢＬ−ＳＣＩＤ移植マウス血清中の中和ＰＡ生物活性の存在の試験を示す図である。 ２１Ｄ９ ＭＡｂによる炭疽菌ＰＡ毒素生物活性の抑制の用量反応曲線を示す図である。 ２１Ｄ９ ＭＡｂ重鎖可変領域の全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。 ２１Ｄ９ ＭＡｂ軽鎖可変領域の全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。 ラット保護モデルにおける生存データを示す図である。 １Ｃ６ Ｍａｂ ＶＨおよびＶＫ鎖可変領域の全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。 ４Ｈ７ Ｍａｂ ＶＨおよびＶＬ鎖可変領域の全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。 ２２Ｇ１２ Ｍａｂ ＶＨおよびＶＬ鎖可変領域の全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図である。

Claims (27)

1. 炭疽菌外毒素の防御抗原（ＰＡ）部分に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、
   重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号２の３１〜３５番目、５０〜６６番目および９９〜１１０番目のアミノ酸をそれぞれ含み、かつ、軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号４の２４〜３４番目、５０〜５６番目および８９〜９６番目のアミノ酸をそれぞれ含むことを特徴とする単離抗体またはその抗原結合性断片。
2. 重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
3. 軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
4. 重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
5. 重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号１の９１〜１０５番目、１４８〜１９８番目および２９５〜３３０番目のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
6. 重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号１のヌクレオチド配列にコードされることを特徴とする、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
7. 軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号３の７０〜１０２番目、１４８〜１６８番目および２６５〜２８８番目のヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
8. 軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号３のヌクレオチド配列にコードされることを特徴とする、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
9. 前記炭疽菌外毒素の防御抗原（ＰＡ）部分が、天然のものか合成されたものであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
10. 前記抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
11. 前記抗体が、完全ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
12. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む炭疽菌感染の治療または炭疽菌感染に対するワクチン接種のための薬剤組成物。
13. 炭疽菌感染の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項１２に記載の薬剤組成物の使用。
14. 炭疽菌感染に対するワクチン接種のための薬剤の製造における請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項１２に記載の薬剤組成物の使用。
15. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含むハイブリドーマ。
16. 前記抗体またはその抗原結合性断片がＣＨＯ細胞中の組み換えタンパク質として発現することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
17. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を発現させる安定ＣＨＯ細胞株。
18. 炭疽菌外毒素の防御抗原（ＰＡ）部分に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号２の３１〜３５番目、５０〜６６番目および９９〜１１０番目のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
19. 配列番号１のヌクレオチド配列を含む請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
20. 炭疽菌外毒素の防御抗原（ＰＡ）部分に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号４の２４〜３４番目、５０〜５６番目および８９〜９６番目のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
21. 配列番号３のヌクレオチド配列を含む請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
22. 請求項１８〜２１のいずれか１項またはこれらの組合せのポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
23. 請求項２２の発現ベクターを含む単離されたＣＨＯ細胞。
24. インビトロにおいて炭疽菌外毒素の防御抗原（ＰＡ）の集合を抑制する方法であって、前記集合を分裂するために、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を与える方法。
25. 試料中の炭疽菌細胞外毒素の存在を確認する方法であって、
    前記試料の少なくとも一部を請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させること、および
    前記試料中の炭疽菌の存在の指標である、炭疽菌外毒素またはその一部と前記抗体またはその抗原結合性断片との結合を測定することを含む方法。
26. 試料中の炭疽菌外毒素の存在を確認するためのキットであって、
    請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、
    前記試料中の炭疽菌の存在の指標である、炭疽菌外毒素またはその一部と前記抗体またはその抗原結合性断片の結合を測定するためのアッセイシステムとを含むキット。
27. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の完全ヒトモノクローナル抗体を生成する方法であって、炭疽菌に曝露された１人以上のヒトドナーからの末梢血単核細胞を免疫無防備状態の非ヒト動物に投与することと、
    前記非ヒト動物から少なくとも１つのリンパ球細胞を単離することと、
    前記少なくとも１つのリンパ球細胞をハイブリドーマ融合パートナーと融合させ、それによって炭疽菌外毒素の少なくとも一部を認識する完全ヒトモノクローナル抗体を生成することと
    を含む方法。

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