JPH0779795A - ヒトモノクローナル抗体産生株の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ヒトモノクローナル抗体産生株製造法の提供。 【構成】ヒトリンパ球を移植した重症免疫不全（ＳＣＩ
Ｄ）マウスを抗原感作し、得られた感作リンパ球を株化
しヒトモノクローナル抗体産生株を製造する。 【効果】本発明の製造法によると、抗体陽性者より調製
したヒト末梢血リンパ球を形質転換する従来法に比較し
て、ヒトモノクローナル抗体産生株の取得率が非常に高
い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトリンパ球を移植した
重篤複合免疫不全(severe combined immunodeficienc
y：ＳＣＩＤ)マウス系を用いて目的とする抗原に対して
特異的なヒトモノクローナル抗体の産生株を誘導する方
法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】１９７５年にケーラーとミルスタインが
細胞融合技術を確立して以来、種々のモノクローナル抗
体が作成され、分析，測定，診断あるいは治療に応用さ
れている。現在までに報告されているモノクローナル抗
体はほとんどが動物、特にマウス由来であり、免疫動物
の抗体産生細胞を細胞融合法を用いて不死化することに
よって取得されている。モノクローナル抗体は、抗体サ
ブクラスにおいて均一であり、抗原結合特異性が高く、
非常に小さなクリアランスをもつという点から考えても
魅力ある薬物キャリアーであり、これを利用した新たな
Drug Delivery System（ＤＤＳ）が検討されている。し
かしながら、上記のように動物を抗原感作させて得られ
る動物由来の抗体は、ヒトへ投与した場合、抗体自体が
免疫原性を示すことが懸念され、治療薬として常用する
ことは困難である。この免疫原性を避けるために、動物
由来のモノクローナル抗体を例えばＦab₂，Ｆ(ab)'₂ な
どへフラグメント化あるいはヒト抗体とのキメラ化やヒ
ト化するなどの手法により抗原性を低下させる、あるい
は実際の患者からスクリーニングして得られた抗体産生
細胞やイン ビトロ（in vitro）感作させたヒトリンパ
球を用いてヒト抗体産生細胞株を樹立する手法などが検
討されている。しかし、いずれの手法も抗原性の残留、
あるいはヒト抗体産生株樹立の困難性、細胞培養時の抗
体生産能の低下や等の点で問題があり、別のアピプロー
チによる簡便かつ効率的なヒト抗体の樹立方法の確立が
強く望まれている。

【０００３】ＳＣＩＤマウスはＢＡＬＢ/ｃマウスの免
疫グロブリン(Ｉg)重鎖のアロタイプ共通遺伝子(alloty
pe congenic)系マウスであるＣ. Ｂ−１７マウスより、
血中免疫グロブリン濃度の極端に低いマウスとして発見
された〔ネイチャー 第３０１巻，５２７頁(１９８
３)〕。このマウスは重症の免疫不全症を呈しており、
免疫系の主要な担当細胞である成熟ＴおよびＢ細胞を欠
損していることが示されている〔ジャーナル オブ イム
ノロジー 第１３２巻，１０８４頁(１９８４)〕。Ｔ、
Ｂ細胞の成熟にはそれぞれＴ細胞レセプターや膜型免疫
グロブリン分子の発現が必要であるが、ＳＣＩＤマウス
にはこれらの分子を発現するために不可欠な遺伝子の再
構成に関わる酵素(recombinase)群に異常があり、特に
recombinaseの基質特異性に欠陥があることが明らかに
されている〔ジャーナル オブ イムノロジー 第１３４
巻，２２７頁(１９８５)〕。その結果、ＳＣＩＤマウス
のＴ、Ｂ細胞はほとんど未成熟な分化段階に留まってお
り、ＳＣＩＤマウスでは自己の抗体はほとんど産生され
ず、したがって抗体依存性細胞傷害作用(ＡＤＣＣ)も認
められない。一方、抗原提示細胞〔プロシーディングス
オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ
第８３巻，３４２７頁(１９８８)〕やＮＫ細胞〔セル
第５５巻，７頁(１９８８)〕の機能については異常は認
められていない。

【０００４】ヌードマウスや放射線照射によって一次的
に免疫機能を失わせたマウスとは異なるこのようなＳＣ
ＩＤマウスの性質を応用して、(１)異種動物の各種組
織、特にヒトリンパ系組織などを移植したヒトＴ、Ｂ細
胞機能の解析〔ジャーナル オブ イムノロジー 第１
３２巻，１８０４頁(１９８４)〕、(２)ヒト腫瘍を移植
した抗癌剤の作用機作の解析〔ジャーナル オブ エクス
ペリメンタル メディスン 第１７２巻，１０５５頁(１
９９０)〕、(３)後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)〔カ
レント トピックス イン ミクロバイオロジー アンド
イムノロジー 第１５２巻，２５９頁(１９８９)〕やエ
プスタイン バー ウイルス(ＥＢＶ)〔サイエンス 第２
４１巻，５４６頁(１９９０)〕などのヒトに特異的な感
染症のモデルの作製などに広く応用されている。ヒト免
疫機能をＳＣＩＤマウスで再構築する方法として報告さ
れているものにはヒト胎児胸腺と胎児肝の小片を腎皮膜
下に組織学的構造を保持したまま移植したＳＣＩＤ−hu
マウス〔ネイチャー 第２５１巻，７９１頁(１９９
１)〕と呼ばれるものと、ヒト末梢血リンパ球(ＰＢＬ)
を腹腔内に移植したhu−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウス〔サイ
エンス 第２４７巻，５６４頁(１９９０)〕と呼ばれる
ものがあり、後者においてはマウスを免疫することによ
り破傷風毒素やB型肝炎ウイルスＣ抗原に対するヒト抗
体を誘導できることが報告されている〔ジャーナル オ
ブ エクスペリメンタル メディスン 第１７３巻，１４
７頁(１９９１)〕。さらに自己免疫疾患モデルへの応用
もなされ、全身性エリスマトーデス患者のリンパ球を移
植したＳＣＩＤマウスではヒト抗核抗体の産生やＳＬＥ
類似の腎糸球体病変の出現が報告されている。このよう
にＳＣＩＤマウスは種々の異種異系の組織、特にヒト組
織の移植により他の動物では得られないヒト型病態を示
すモデル動物となり得る。

【０００５】緑膿菌〔シュードモナス・エルギノーサ
（Pseudomonas aeruginosa）〕は、湿潤な環境には比較
的普遍的に存在するグラム陰性桿菌であり、健康な状態
では何ら問題とならない菌である。しかし、白血病、広
範囲熱傷、慢性呼吸器疾患など人体の感染防御機構に破
綻をきたした場合には、しばしば致命的な感染症を引き
おこす。例えば、抵抗力の弱い入院患者が病院内でこの
菌の二次感染（日和見感染）を受けたり、免疫機能が未
発達であり感染防御に重要な役割を果している腸内常在
菌叢が形成されていない新生児が重篤な感染を受ける場
合があり、現在、緑膿菌の病院内感染や新生児室感染は
重要な問題となっている。緑膿菌感染症の治療のための
化学療法では、抗緑膿菌抗生物質であるゲンタマイシ
ン、コリスチン、ポリミキシンＢ等が従来から使用さ
れ、最近ではペニシリン系抗生物質（チカルシリン、ピ
ペラシリン等）、セファロスポリン系抗生物質（セフス
ロジン、セフォタキシム等）、アミノグリコシド系抗生
物質（シソマイシン、ミクロマイシン等）が用いられる
（講談社刊、医科学大辞典「ENCYCLOPEDIA OF MEDICAL
SCIENCE」第４９巻、１５８〜１５９頁参照）。しかし
ながら、緑膿菌は、本来、抗生物質に対して比較的抵抗
性があるところから化学療法にも限界があり、感染防御
機構の減弱または欠落に際して発生する難治性感染症の
原因となっている。ＣＤ２分子は、主にヒトＴ細胞に発
現している細胞接着分子であり、ヒツジ赤血球と結合す
る分子として同定された分子量約５万の糖蛋白質であ
る。ＣＤ２分子のｃＤＮＡのクローニングとそれに基づ
く一次構造の報告〔Sewell WA ら プロシーディングス
オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス（Proc.
Natl.Acad. Sci.）U.S.A 第83巻 8718頁（1986)〕か
ら、この分子は３３６個のアミノ酸残基からなる膜貫通
型の蛋白質であることが明らかとなっている。また、Ｃ
Ｄ２分子の細胞外部に免疫グロブリン様の構造を有する
ことから、免疫グロブリン・スーパーファミリーに属す
ると考えられている〔Williams AF アニュアルリビュー
オブ イムノロジー（Ann. Rev. Immunol.）第6巻 381
頁（1988)〕。ＣＤ２分子は、モノクローナル抗体によ
って３つのエピトープＴ11₁，Ｔ11₂およびＴ11₃を持つ
ことが判明している。抗原提示細胞上などに発現してい
るＬＦＡ-３との結合に関与するＴ11₁およびＴ11₂は第
１ドメイン内に存在し〔Peterson Aおよび Seed B ネイ
チャー（Nature）第329巻 842頁(1987)〕、ＬＦＡ-３に
よりその発現が誘導されるＴ11₃は第２ドメイン内に存
在することが知られている〔Mueer S C ら セル（Cel
l）第36巻 897頁(1984)〕。ＣＤ２分子は免疫系におい
て、Ｔ細胞の分化、増殖を抑制する接着分子として機能
しているが、慢性関節リウマチなどの炎症性疾患や多発
性硬化症などの自己免疫疾患においては自己反応性Ｔ細
胞の活性化を誘導し、症状を増悪する分子の一つである
と考えられている。従って、この分子の活性を中和し得
る抗ＣＤ２抗体は、例えばリウマチでは関節内でのＴ細
胞の活性化を抑制することによりＩＬ−１やＴＮＦ−α
等の組織破壊作用のあるリンフォカインの産生を低下さ
せて症状を改善させることが期待され、また炎症性疾患
あるいは自己免疫疾患においては、自己反応性Ｔ細胞の
活性化を抑制することにより、同様の治療効果が期待で
きる。このような理由からヒト抗ＣＤ２抗体の調製法の
樹立が強く望まれている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、目的とする
抗原に対して特異的なヒトモノクローナル抗体を効率的
かつ簡便に得る抗体産生株を提供しようとするものであ
る。

【０００７】

【発明が解決するための手段】本発明者らは、ヒトリン
パ球を移植した重篤複合免疫不全（以下、ＳＣＩＤと略
記することがある）マウスを抗原感作して得られた感作
リンパ球を株化することによって効率的にヒトモノクロ
ーナル抗体産生細胞を取得できることを見い出し、さら
に検討を重ね本発明を完成した。すなわち、本発明は、 １）ヒトリンパ球を移植した重篤複合免疫不全マウスを
抗原感作し、得られた感作リンパ球を株化することを特
徴とするヒトモノクローナル抗体産生株の製造法、 ２）エプスタイン バー ウイルスにより株化する前記
（１）記載のヒトモノクローナル抗体産生株の製造法、 ３）ヒトミエローマ細胞株との細胞融合により株化する
前記（１）記載の製造法、 ４）抗原が緑膿菌膜成分である前記（１）記載の製造
法、 ５）抗原がＣＤ２分子である前記（１）記載の製造法、 ６）抗体がＩgＧ抗体である前記（１）記載の製造法お
よび、 ７）ヒトリンパ球を移植した重篤複合免疫不全マウスを
抗原感作し、得られた感作リンパ球を株化することによ
り得られたヒトモノクローナル抗体産生細胞株である。

【０００８】本発明においてＳＣＩＤマウスは通常５な
いし１５週令、好ましくは８ないし１２週令のＳＣＩＤ
マウスを用いる。このＳＣＩＤマウスの腹腔内あるいは
静脈内に、ヒトの免疫細胞を含む抹梢血、骨髄液、また
は免疫系組織、例えば脾臓などから公知の方法で精製し
たヒトリンパ球画分を生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩
水(ＰＢＳ)等の細胞および生体に影響を与えない溶液に
懸濁した１×１０⁷個から５×１０⁸個、好ましくは約１
×１０⁸個のヒトリンパ球を腹腔内あるいは静脈内に移
植する。移植手段の１つとして、免疫隔離膜に封入した
移植細胞を腹腔内に移植する方法を採用してもよい。こ
の方法では、免疫隔離膜により移植後に移植細胞と宿主
の組織が接触しないため、ＧＶＨ(graft-versus-host；
移植片対宿主)反応が抑えられ、目的とする抗原に対す
る抗体産生の効率を高められる。

【０００９】目的とする抗原としては主に蛋白質または
ペプチドが対象となるが、その他の化学物質等でも抗原
とすることが可能である。具体的にはあらゆる可溶性の
外来抗原はもとより緑膿菌などの感染性の細菌膜画分、
肝炎ウイルスなどのウイルス膜成分、各種癌細胞などの
不溶化抗原や免疫系細胞膜成分、さらにはヒトの生体内
微量成分もこれに含まれる。最初の抗原投与は移植と同
時もしくは１日後に行い、抗原の追加免疫は最初の抗原
投与から３日ないし１４日の間、好ましくは約７日後に
行い、その後、３日ないし１４日おきに、好ましくは約
７日おきに行う。抗原の投与経路としては腹腔、静脈、
筋肉などが挙げられるが、好ましくは腹腔にマウスに負
荷を与えすぎない量の抗原を生理食塩水、リン酸緩衝生
理食塩水などの細胞および生体に影響しない溶液に溶解
し投与する。

【００１０】ヒト抗原特異抗体産生細胞の回収は通常移
植後７日ないし６０日の間に行うがなかでも７日ないし
２８日、特に２５ないし２８日の間が好ましい。特に回
収効率の点から移植後７日目ごろから毎週、ＳＣＩＤマ
ウスの眼窩より適量の血液を採血し、ヒト抗体量の上昇
およびヒト抗原特異抗体価の上昇を検査することが好ま
しい。ヒト抗体量およびヒト抗原特異抗体価の測定に
は、酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡと略記することがあ
る）、受動的赤血球凝集反応法、蛍光抗体法、オクタロ
ニー法など様々なものがあるが、抗原が可溶性抗原の場
合、公知の抗ヒトイムノグロブリン抗体と目的とする抗
原を固相化したイムノプレート（例えば、ヌンク社、デ
ンマーク製など）を使用する酵素免疫測定法が好ましく
用いられる。これらの方法で高い抗体量、抗体価を示し
たＳＣＩＤマウスよりヒト抗体産生細胞を回収する。

【００１１】ＳＣＩＤマウスの各臓器から、適宜、抗体
産生細胞が回収できるがなかでもリンパ節から回収する
と、回収率、純度の点で非常に有利である。本発明で得
られるヒトモノクローナル抗体産生細胞は従来の試験管
内におけるヒト抗体産生細胞の誘導に比べ、抗体価測定
またはプラーク法や蛍光免疫測定法などでヒト抗体産生
細胞を誘導し得る点において非常に優れており、ヒトモ
ノクローナル抗体取得に非常に有利である。本発明のヒ
ト抗体産生細胞の回収および精製の具体的な方法として
は例えば以下の方法が用いられる。最初に、各臓器を物
理的に単細胞化する。ここで、臓器から回収した細胞に
占める抗体産生細胞の割合が大きければ、そのまま抗体
産生細胞の株化に用いることができるが、抗体産生細胞
の純度が低いとき、例えばＳＣＩＤマウスの細胞の混入
が甚だしい場合は比重遠心法、抗原を用いたパンニング
法、マウスの細胞を除去するために抗マウス細胞抗体と
補体を用いた細胞溶解法、または公知の抗ヒトＢ細胞抗
体を用いたアフイニティーカラム法などで精製すること
により抗体産生細胞の純度を上昇させる。

【００１２】次に、精製されたヒト抗体産生細胞は以下
のような方法で株化することができる。株化の方法とし
ては主にエプスタインバーウイルスによる形質転換法、
または適当な増殖性の細胞と融合することによる細胞融
合法が挙げられる。エプスタインバーウイルスによる形
質転換には公知の方法で調製されたエプスタインバーウ
イルス、例えば細胞株Ｂ９５.８の培養上清などをヒト
抗体産生細胞を増殖培地に０.５ないし５×１０⁷個/ml
で懸濁したものに対して１：１０〜１０：１の割合で添
加し、３７℃で１時間ないし１８時間反応する。反応
後、室温で遠心し増殖培地で１×１０⁶個／mlないし１
×１０⁵個／mlの細胞濃度で９６穴プレートに０.１mlず
つ分注する。３７℃のフラン器で培養し、７日ないし３
０日の間に形質転換細胞の増殖が認められた穴の培養上
清を採取して、それを上記に示したようなＥＩＡなどの
適切なスクリーニング系を用いて、目的とする抗体を産
生している形質転換細胞を単離する。細胞融合法は公知
の方法によって実施され、融合剤としてポリエチレング
リコール（以下、ＰＥＧと略記することがある）、セン
ダイウイルスなどが用いられる。また、融合剤を用いな
い電気融合法を用いることもできるが好ましくはＰＥＧ
が用いられる。

【００１３】ＰＥＧとしては、平均分子量１０００〜９
０００のものが用いられ、特に好ましくはＰＥＧ４００
０またはＰＥＧ６０００が用いられる。濃度は１０ない
し８０％、好ましくは４０ないし５０％の範囲で用い
る。細胞融合はＳＣＩＤマウスより得られた抗体産生細
胞と適切な細胞株、好ましくはヒトミエローマおよびヒ
トリンフォーマ細胞株、特に好ましくはヒトリンフォー
マＡＣ−３３株を適当な無血清培地で洗浄し、通常１：
１ないし１０：１の比率で混合し、室温で７００回転、
５分間遠心して細胞ペレットを得る。細胞ペレットを３
７℃の恒温槽で温めながらほぐし、予め温めておいたＰ
ＥＧ溶液を徐々に加えながら混ぜる。通常ＰＥＧ量は１
０⁸個細胞当たり１ml加えられるが、必要に応じて増減
してもよい。ついで予め温めておいた培地を細胞溶液に
徐々に滴下しＰＥＧ濃度を下げていく。通常は１０分位
の時間をかけて１ないし３０mlの培地を加える。室温で
遠心して細胞を集め、１０％牛胎児血清（以下、ＦＣＳ
と略記することがある）を含む培地で親細胞株として１
ないし５×１０⁵個／mlの細胞濃度で１晩放置後、ＨＡ
Ｔおよび１０％ＦＣＳを含む培地（ＨＡＴ培地）を添加
する。この操作を省略するために細胞融合後、細胞を直
接ＨＡＴ培地に懸濁してもよい。２ないし３週間に数回
の培地交換を行う。培地の交換方法としては培地０.１
から０.２mlを除き、新鮮な等量のＨＡＴ培地を加え
る。この間、ハイブリドーマの出現が認められれば、出
来るだけ早急に上記に示したようなＥＩＡなどの適切な
スクリーニング系を用いて、目的とする抗体を産生して
いるハイブリドーマ細胞を単離する。得られたハイブリ
ドーマは直ちに適当な方法でクローニングを行う。

【００１４】細胞培養に使用する液体培地としては、一
般的にダイゴＴ培地（日本製薬）ダルベッコ改変イーグ
ル培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、イスコフ改変ダルベ
ッコ培地などが挙げられるが、好ましくはダイゴＴ培地
（日本製薬、東京）を用いる。エプスタインバーウイル
スによる形質転換法の場合は、これらの培地に約２０％
ＦＣＳを添加し増殖培地とする。細胞融合法では１０な
いし１５％のＦＣＳを添加して増殖培地とする。こうし
て得られたヒト特異抗体産生細胞株は公知の方法でヒト
モノクローナル抗体を得ることができる。例えば、ＳＣ
ＩＤマウスの腹腔にヒト抗体産生細胞株を移植すること
により、マウスハイブリドーマなどと同様なモノクロー
ナル抗体を高濃度に含む腹水が得られる。また、適当な
無血清培地、例えばＧＩＴ培地（日本製薬）、ＨＢ１０
４（ハナメディア社）、ハイブリティ１（日本薬品開発
社）などを用いて、大量培養を行うことも可能である。
これら腹水もしくは培養上清から公知の分離、精製法を
適切に組み合わせれば高純度のヒトモノクローナル抗体
を大量に得ることができる。例えば、抗体を含む溶液を
遠心分離後、上清液を塩析する。通常は硫酸アンモニウ
ムを用いる。得られた蛋白沈殿物を適当な緩衝液に溶解
し透析後、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥイオン
交換カラム、ヒドロキシルアパタイトカラム、ゲル濾過
カラム、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムな
ど）、イムノアフィニティクロマトグラフィなどに供
し、目的とするヒトモノクローナル抗体を分離、精製す
ることができる。これらの方法で精製したヒトモノクロ
ーナル抗体の純度は９９.９％以上であり、医薬として
ヒトに投与する場合に好都合である。

【００１５】こうして得られる本発明のヒトモノクロー
ナル抗体は感染症、薬物中毒における抗血清の代替物、
抗イディオタイプ抗体を用いたワクチン、炎症反応を鎮
静化させるための接着分子に対する抗体、または触媒型
抗体などモノクローナル抗体で計画されている種々の治
療、診断の分野において使用する場合、抗原性が低いな
いし無いという点で非常に有利である。具体的には、例
えば本発明抗体を診断薬として用いる場合、酵素，色
素，放射性同位原素等の適当な標識物質と化学的あるい
は遺伝子工学的に結合した標識抗体として用いればよ
く、また例えば治療薬として用いる場合には、例えば抗
原が毒素等の活性物質の場合、好ましくは抗原の活性に
対する中和能を有する本発明抗体を単独あるいは適当な
併用薬剤等との混合剤として、また例えば癌や血栓症等
の治療においては、適当な薬剤と化学的あるいは遺伝子
工学的に結合させた抗体ターゲッティング製剤として調
製し、投与することができる。

【００１６】本発明のヒトモノクローナル抗体は、必要
により例えばメンブレインフィルター等による濾過、除
菌操作の後に、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容
され得る担体、賦形剤、希釈剤などと混合し、常法に従
い非経口剤好ましくは注射剤などとして製剤化して、哺
乳動物（マウス、ラット、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、サ
ル、ヒトなど）の皮下、静脈内あるいは筋肉内に投与
し、各種の疾患の治療に用いることが可能である。ま
た、本発明のヒトモノクローナル抗体を、リン酸緩衝
液、生理食塩水、リンゲル液などの適当な担体に溶解
し、常法に従って、例えば無菌濾過により無菌化し、ア
ンプルに密封することにより製造することができる。さ
らに、これらの液状の医薬を常法に従って凍結乾燥等に
より固形状の医薬とすることができる。

【００１７】本発明のモノクローナル抗体の投与量は、
投与対象の体重，年齢，性別や対象となる疾患、症状あ
るいは投与ルートなどによって異なるが、イムノグロブ
リン量として１μg〜１mg／kg 体重／１日の範囲から１
日１ないし数回を連続的にあるいは間欠的に投与するこ
とができる。本発明で取得された緑膿菌に対するヒトモ
ノクローナル抗体はそれ自体で菌に対して溶菌作用を示
すことが期待でき、また、ヒトに対しても毒性が非常に
少ないと考えられることから上記のような難治性の感染
症の治療に期待できる。また、同様に本発明により取得
されたＣＤ２分子に対するヒトモノクローナル抗体は、
各種の炎症性疾患や自己免疫疾患の診断に、またこれら
疾患発症時のＴ細胞活性化を中和する機能を持ちかつヒ
トに対して低毒性であると考えられるので、治療におい
ての利用が期待できる。

【００１８】

【実施例】以下に参考例および実施例を挙げて本発明を
具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制限する
ものではないことは言うまでもない。なお、後述の実施
例で得られたヒトＥＢＶトランスフォーマントは、以下
のとおり財団法人発酵研究所（ＩＦＯ；大阪市淀川区十
三本町２丁目１７番８５号）および通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所(ＮＩＢＨ)にそれぞれ寄託さ
れている。

【表１】 ─────────────────────────────────── ＩＦＯ ＮＩＢＨ 名 称 (ＩＦＯ No.) （ＦＥＲＭ No.） ─────────────────────────────────── ヒトＥＢＶトランスフォーマント ５０４０５ ＢＰ−４３６７ Ｓ８４Ｔ２−６ (1993年7月12日) (1993年7月21日) ─────────────────────────────────── （ ）内は寄託日を示す。

【００１９】参考例１ 抗原の調製 緑膿菌（Psuedomonas aeruginosa；ＩＦＯ No. ３４４
５）を Tripricate soybroth 培地１.２リットルで６時
間、３７℃で培養し、毎分５０００回転で１０分間遠心
して集菌した。得られた菌体をリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）で２回洗い、超音波処理で破砕した後、毎分
９０００回転１０分間の遠心で膜画分とその他の不溶物
を分離した。膜画分はＰＢＳを用い、毎分２３０００回
転３０分の超遠心で３回洗い、可溶性の蛋白質などを除
いて精製した後、小量のＰＢＳで懸濁し、これを抗原と
した。抗原の蛋白量はバイオラッド社のプロテインアッ
セイキットを用いて定量した。

【００２０】参考例２ ヒトリンパ球の移植および免疫
操作 ヒトヒト白血球分画（buffy coat）４０mlをＲＰＭＩ−
１６４０培地（フローラボラトリーズ，米国）と等量混
合し、３０mlの Ficoll Paque 溶液（ファルマシア社）
に重層した。毎分２４００回転２０分間の遠心で単核球
画分を得て、これをヒト末梢血リンパ球(ヒトＰＢＬ)と
して用いた。その後、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回遠
心洗浄し、ＰＢＳ０.５mlにヒトＰＢＬ ０.５〜１×１
０⁸個と抗原５０μg を混合しＳＣＩＤマウス腹腔に移
植した。なお、実験には生化学的検査、ウイルス抗体検
査、血球数検査などに合格したヒト血液のみを用いた。
抗原の追加免疫は抗原１０μg を移植後８−９日目から
７日間おきにヒトＰＢＬを移植したＳＣＩＤマウスに腹
腔内投与した。血中ヒト抗体測定のため、追加免疫を行
う前にマウス眼窩静脈よりヘパリン処理ヘマトクリット
毛細管（Drummond）を用いて、採血した。血清を遠心分
離後、０.０１％チメロサ―ル（シグマ社）を含むＰＢ
Ｓで２０倍希釈にして測定まで４℃に保存した。

【００２１】参考例３ ヒト免疫グロブリン測定 血中ヒトＩgＧおよびＩgＭの濃度は酵素免疫測定法（Ｅ
ＩＡ)で定量した。精製ヤギ抗ヒトＩgＧまたは抗ヒトＩ
gＭ抗体（カペル社 米国)を０.０１Ｍ 食塩を含む０.０
１Ｍリン酸緩衝液（pＨ８.０）で１０μg/mlの濃度に調
製し、５０μlずつ９６穴イムノプレ―ト（ヌンク社，
デンマーク）に分注し、４℃、１８時間静置して抗体を
結合させた。次に抗体溶液を除去した後、０.０１％チ
メロサールを添加した８倍希釈ブロックエース（大日本
製薬）溶液を１００μl ずつ分注し、４℃、１８時間の
ブロッキングを行った。更に、ブロックエース溶液を除
去し、検体である血清を０.２％ Tween ２０（バイオラ
ット社）を含むＰＢＳ（ＣＴ−ＰＢＳ）で任意に希釈
し、抗体結合プレートに５０μl ずつ２穴に加え、３７
℃、１時間反応させた。反応後、０.０５％ Tween２０
を含むＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）で洗浄し、１００００倍希
釈西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ)標識精製ヤギ
抗ヒトＩgＧ抗体または抗ヒトＩgＭ抗体、または抗マウ
スＩgＧ＋ＩgＭ＋ＩgＡ抗体溶液を５０μl ずつ添加
し、更に３７℃、１時間反応させた。Ｔ−ＰＢＳでプレ
ートを洗浄後、５０μl の２０mＭ o−フェニレンジア
ミン（シグマ社）、０.０２％過酸化水素水を含む０.１
Ｍクエン酸緩衝液（pＨ５.５）を添加し５分間、室温で
酵素反応を行った。１Ｎ硫酸を添加し、酵素反応を停止
させた後、マルチスキャン(タイターテック社製)で４９
２nmの吸光度を測定し、各抗体量を定量した。

【００２２】参考例４ 抗原特異的抗体測定 参考例１で得られた抗原を０.１Ｍ重炭酸緩衝液（pＨ
９.６）に１０μg／mlの濃度に調製し、５０μl ずつ９
６穴イムノプレートに分注し、４℃、１８時間反応さ
せ、抗原を結合させた。次に抗原溶液を除去した後、
０.０１％チメロサールを添加した８倍希釈ブロックエ
ース溶液を１００μl ずつ分注し４℃、１８時間ブロッ
キングを行った。更に、ブロックエース溶液を除去し、
検体である血清をＣＴ−ＰＢＳで１００倍希釈し、抗体
結合プレートに５０μl ずつ２穴に加え、３７℃、１時
間反応させた。反応後、Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、１０００
０倍に希釈したＨＲＰ標識精製ヤギ抗ヒトＩgＧ抗体あ
るいは抗ヒトＩgＭ抗体を５０μlずつ添加し、更に３７
℃、１時間反応させた。Ｔ−ＰＢＳでプレートを洗浄
後、５０μl の２０mＭ o−フェニレンジアミン０.０２
％過酸化水素水を含む０.１Ｍクエン酸緩衝液（pＨ５.
５）を添加し５分間、室温で酵素反応を行った。１Ｎ硫
酸を添加し、酵素反応を停止させた後、マルチスキャン
で４９２nmの吸光度を測定し、抗体価を定量した。

【００２３】参考例５ 緑膿菌凝集試験 緑膿菌生菌に１０％ホルマリンリン酸緩衝液（pＨ７.
０）を添加し、懸濁した後４℃、１８時間固定した。検
体であるhu−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウス血清をＰＢＳで２
倍段階希釈した。ＰＢＳで３回洗浄し１０％懸濁液とし
たホルマリン固定緑膿菌５０μl と希釈した血漿５０μ
l を９６穴Ｖ底プレート上で混合し、３７℃、１時間反
応させた。また、ＩgＧの抗体凝集能を見るためには更
に１００倍希釈精製ヤギ抗ヒトＩgＧ抗体５０μl を添
加し、同様に反応させた。反応後、凝集が認められる検
体の最大希釈倍数をその検体の凝集価とした。対照には
正常ＳＣＩＤマウス血清を用いた。

【００２４】参考例６ フローサイトメトリー法を使っ
た抗原特異的抗体の測定 ホルマリン固定菌１０％懸濁液５０μl に２０倍に希釈
した検体血清５０μlを添加し、氷中で３０分間反応さ
せた。２％牛胎児血清（ＦＣＳ）、０.２％アジ化ナト
リウムを含むＰＢＳ（ＦＣＳ−ＰＢＳ）で２回遠心洗浄
した。沈査となった固定菌に２０倍希釈したフルオレセ
イン−イソシアネート標識ヤギ抗ＩgＧ抗体５０μlを添
加し、更に氷中にて３０分間反応させた。反応後、ＦＣ
Ｓ−ＰＢＳで２回遠心洗浄し、細胞自動解析分離装置
（ＦＡＣ Star；Becton Deckinson）にて解析した。

【００２５】参考例７ ＥＩＡ結合競争阻害実験 参考例４で高い抗体価を示した培養上清とＣＴ−ＰＢＳ
に各種濃度で溶解した抗原を等量混合し、抗原を結合さ
せた９６穴イムノプレートにその混合液５０μl を添加
し、３７℃、１時間反応させた。反応後、Ｔ−ＰＢＳで
洗浄し、１００００倍希釈ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩgＧ
抗体を５０μlずつ添加し、更に３７℃、１時間反応さ
せた。Ｔ−ＰＢＳでプレートを洗浄後、抗原特異的抗体
測定の項で述べた方法に従って酵素反応を行い、固相化
抗原と可溶性抗原間の競争阻害を調べた。

【００２６】実施例１ （１）ヒトリンパ球の調製 ヒト白血球分画４０mlをＲＰＭＩ−１６４０培地（フロ
ー ラボラトリーズ 米国）と等量混合し、３０mlの Fic
oll Paque溶液（ファルマシア社）に重層した。毎分２
４００回転２０分間の遠心で単核球画分を得て、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地で３回遠心洗浄し、これをヒト末梢血
リンパ球(ヒトＰＢＬ)として用いた。 （２）ＳＣＩＤマウスへのヒトＰＢＬの移植と免疫操作 ＰＢＳ０.５mlにヒトＰＢＬ０.５−１×１０⁸個と抗原
５０μgを混合しＳＣＩＤマウス腹腔に移植した。な
お、実験には生化学的検査、ウイルス抗体検査、血球数
検査などに合格したヒト血液のみを用いた。抗原の追加
免疫は抗原１０μg を移植後８−９日目から７日間おき
にヒトＰＢＬを移植したＳＣＩＤマウス腹腔内に投与し
た。血中ヒト抗体測定のため、追加免疫を行う前にマウ
ス眼窩静脈よりヘパリン処理ヘマトクリット毛細管(ド
ラモンド社)を用いて、採血した。血漿を遠心分離後、
０.０１％チメロサ―ル(シグマ社)を含むＰＢＳで２０
倍希釈にして測定まで４℃に保存した。

【００２７】（３）ＥＢＶトランスフォーメーション 参考例２および３に記載のＥＩＡで血中抗体価を測定
し、抗原特異的抗体価の高いhu−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウ
スを選択した。これらのマウスから腸管膜リンパ節を注
意深く取り出し、ステンレスメッシュとハサミあるいは
擦りガラスで単細胞化した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地
で３回洗浄した。洗浄したリンパ節細胞は後述のＥＢＶ
を含む上清を加え、３７℃、１時間反応させた。反応
後、２０％ＦＣＳを含むダイゴＴ培地（日本製薬)に５
×１０⁵ 個／mlの濃度に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ₂の
インキュベーター内で培養した。ＥＢＶはマーモセット
Ｂ細胞株Ｂ９５.８の培養上清を小分けして、−８０℃
に保存していたものを解凍して用いた。３−４週間後、
トランスフォ―マントの増殖の認められたウェルより培
養上清を得た。実験では６匹のＰＢＬ移植ＳＣＩＤマウ
スリンパ節より０.８×１０⁷個の細胞を得た。それをＥ
ＢＶで処理後、マイクロプレートの９６穴に分注した。
９６穴から３２穴のトランスフォーマントを得た。

【００２８】（４）トランスフォーマントの選択 トランスフォーマント培養上清を参考例３に記載の方法
でスクリーニングした。得られたトランスフォーマント
３２穴をスクリーニングした結果、全穴に特異抗体陽性
トランスフォーマントの樹立を確認した。得られたトラ
ンスフォーマントの１つを、Ｓ８４Ｔ２−６と命名し、
その培養上清希釈曲線を〔図１〕に示す。本トランスフ
ォーマントはＩgＧタイプの抗原特異的ヒト抗体を産生
し、その産生ＩgＧ量は参考例２に記載の方法で定量し
た結果１３.３μg／mlであった。また、その抗原特異性
を確認するために参考例５に記載のＥＩＡ結合競合阻害
実験を行ったところ、特異抗体の固相抗原に対する結合
が可溶性抗原により濃度依存的に阻害された〔図２〕。
また、参考例４に記載のフローサイトメトリー法で調べ
たところ、抗体の緑膿菌表面への結合が確認された〔図
３〕。これらのことからこの株は緑膿菌に対する特異的
ヒト抗体を産生していることが確認された。

【００２９】実施例 ２ （１） ＣＤ２抗原の調製 ヒト抗ＣＤ２抗体を得るため、まず免疫原であるＣＤ２
抗原の調製を行った。３３６アミノ酸残基からなるＣＤ
２分子［W. A. Swelle ら，プロシーディングス ナショ
ナル アカデミー オブ サイエンス（Proc. Natl. Acad.
Sci.）U.S.A 第83巻 8718-8722頁(1986)］のうち、第
１ドメインを含むＮ末端１０７アミノ酸残基に相当する
ｃＤＮＡを化学合成し、これに翻訳開始コドンを付加し
て公知の発現ベクターｐＥＴ３ｃ［F. W. Studier ら，
ジャーナル セル バイオロジー（J. Cell Biol.）第189
巻 113-130頁（1987)；A. H. Rozenberg ら，ジーン（G
ene）第56巻 125-135頁（1987)］に組込み、プラスミド
ｐＴＢ１２５５を作製した。これを大腸菌 ＭＭ２９４
(ＤＥ３)/ｐＬｙｓＳに組み込んだ後ＬＢ培地で培養
し、イソプロピルチオβ-D ガラクトシドを用いて遺伝
子発現を誘導した。この菌体を超音波処理により破砕し
たのち、１４０００rpmで１０分間遠心した。その遠心
上清を２mＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍ ＡＰＭＳＦ含有１０m
Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.０)で６倍希釈し、２分の１溶
量の飽和硫安溶液を添加し、１２０００rpmで１５分間
遠心した。沈殿物を７Ｍ塩酸グアニジンに溶解し、セフ
ァクリルＳ−３００ＨＲ（ファルマシア社）カラムにか
け０.１Ｍ硫酸ソーダ−６Ｍウレア含有リン酸緩衝液(ｐ
Ｈ７.０)で流出した。得られた活性画分を６Ｍウレア−
２５mＭ トリス塩酸緩衝液(ｐＨ１０)に対して透析し、
Ｑ−セファロ−スＦＦ（ファルマシア社）カラムを用い
た陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、０−０.２
Ｍ食塩のグラディエントにより組換え可溶性CD２抗原を
抽出精製した。

【００３０】（２）ヒトＰＢＬを移植したＳＣＩＤマウ
スの免疫操作 ヒトＰＢＬの調製は実施例１に記載の方法と同様に行っ
た。移植および免疫操作は以下の通りに行った。０.３
ｍｌのＰＢＳにヒトＰＢＬ１ｘ１０⁸個とＣＤ２抗原５
０μｇを混合しＳＣＩＤマウスに腹腔内移植した。さら
に免疫反応を増強するため、抗原５０μｇを移植１週間
後から７日おきにこのＳＣＩＤマウスに腹腔内投与し
た。血中ヒト抗ＣＤ２抗体価はマウス眼窩静脈よりヘパ
リン処理ヘマトクリット毛細管(ドラモンド社)を用いて
採血した血清により測定した。 （３）細胞融合と抗原特異的ヒト抗体産生株の取得 ヒトＰＢＬの移植後３週の時点で上記において測定した
血中ヒト抗ＣＤ２抗体価の高い１０匹のＳＣＩＤマウス
を選択し、脾臓および腸管膜リンパ節を摘出した。それ
らを研摩スライドガラスを用い単細胞化し混合してＲＰ
ＭＩ-１６４０培地で３回洗浄した。前述ヒトリンフォ
ーマＡＣ-３３株とＳＣＩＤマウスからの細胞１ｘ１０⁹
個を１：１０の比率で混合し、遠心機にかけ細胞ペレッ
トとして、３７℃の恒温槽で温めながらほぐし１ｍｌの
ＰＥＧ６０００溶液（ＰＥＧ６０００ ５.４ｇを６.６
ｍｌのＰＢＳに溶かし、さらにＤＭＳＯを加え１２％
(ｖ/ｖ)溶液とした）を徐々に加えながら撹拌した。つ
いで２０ｍｌのＲＰＭＩ-１６４０培地を細胞溶液に徐
々に滴下して懸濁し、室温で遠心して細胞を集め、１０
％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ-１６４０培地で１ｘ１０⁵/ｍ
ｌの細胞濃度で９６穴プレート１０枚に０.１ｍｌずつ
分注した。１晩放置後、ＨＡＴ培地（ＨＡＴおよび１０
％ ＦＣＳを含むＲＰＭＩ-１６４０培地）０.１ｍｌを
添加し、その後週に１回、培地交換を行なった。３週間
後、ハイブリドーマの増殖を確認後、細胞培養上清を参
考例４に記載の方法に従いＣＤ２抗原特異性についてス
クリーニングして、抗原特異的抗体産生株を２株得た。
これらの抗体産生株は共にヒトＩｇＧ抗体を産生してい
た。

【００３１】（４）ＣＤ２抗原に対するヒト抗体の結合
特異性 上記(３)で得られた２株からのヒト抗ＣＤ２抗体の抗原
特異性を確認するために結合阻害試験を行った。１ｘ１
０⁷/ｍｌに調製したヒトＰＢＬ懸濁液を１００ｍｌずつ
９６穴Ｖ字底プレート（ヌンク社，デンマーク)に分注
した。２％牛胎児血清と０.０２％アジ化ナトリウムを
含むＰＢＳでそれぞれ０、１あるいは２０ｍｇ/ｍｌに
なるように調製した培養上清からのヒト抗ＣＤ２抗体溶
液を添加し、ヒトＰＢＬと４℃３０分間反応させた。さ
らに陽性対照としてフルオレセイン-イソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）標識マウス抗ＣＤ２モノクローナル抗体
（生化学工業）、また陰性対照として、ＦＩＴＣ標識マ
ウス抗スカシガイヘモシアニン(ＫＬＨ)モノクローナル
抗体（ベクトンデキンソン社）０.５ｍｇを含む反応液
５０ｍｌをそれぞれ添加し、４℃３０分反応した。プレ
ートを洗浄した後、細胞自動解析分離装置（ＦＡＣＳｔ
ａｒ：ベクトンデキンソン）にて解析したところ、ヒト
抗ＣＤ２抗体添加量に依存して陽性対照抗体の結合阻害
が認められた（図４）。すなわち、陽性対照抗体はヒト
抗ＣＤ２抗体と競合して置換されるため、ヒトＰＢＬの
蛍光強度が添加抗体濃度に依存的に減少した。これは得
られたヒト抗ＣＤ２抗体が陽性対照抗体と同じ結合能を
もつことを示唆する。また、得られた２株から産生され
たヒト抗体の活性を比較したところ両者はほぼ同等だっ
た。これらのことからこのヒト抗ＣＤ２抗体は陽性対照
抗体と同じ結合能を持つことが示され、疾患におけるＴ
細胞の活性化を抑制する可能性が示唆された。

【００３２】

【発明の効果】本発明のヒトモノクローナル抗体産生株
の製法は、例えば抗緑膿菌抗体産生株の樹立において、
抗体陽性者より調製したＰＢＬを形質転換してトランス
フォーマントを取得する従来法と、樹立に要したＰＢＬ
供与者数及び目的の特異抗体産生トランスフォーマント
の取得率を試算して比較したところ、本発明では従来法
の約１／５程度のＰＢＬ供与者で約４５０倍の目的トラ
ンスフォーマント取得率となり、従来法に比べ非常に樹
立効率が高い。また、抗体陽性者の有無に左右されずに
目的の抗体を調製できる点でも有利である。例えば、本
実施例において抗ＣＤ２抗体を作製しているが、自己成
分であるＣＤ２分子に対する抗体の産生はヒト生体内の
免疫寛容機構により抑制されるため、従来の技術ではこ
のような抗体産生株の樹立はほぼ不可能であった。この
ことは、本発明がこの種のヒト抗自己成分抗体産生株の
樹立を可能にし、自己成分が関与する癌や自己免疫疾
患、炎症等を含むあらゆる疾患において応用が期待され
る抗体を提供し得ることを示している。さらに、本発明
方法で得られたヒトモノクローナル抗体はヒトに対して
免疫原性が極めて低いと考えられ治療や診断に用いる際
に非常に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体産生トランス
フォーマントの培養上清希釈線を示す。

【図２】固相化抗原と可溶性抗原の競合反応による抗緑
膿菌ヒトモノクローナル抗体の結合阻害曲線を示す。

【図３】抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体のホルマリン
固定緑膿菌への結合を示す。

【図４】実施例２で得られたヒト抗ＣＤ２抗体のヒトリ
ンパ球への結合特異性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＺ Ｊ Ｃ０７Ｋ 16/14 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｋ // Ｇ０１Ｎ 33/577 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトリンパ球を移植した重篤複合免疫不全
   マウスを抗原感作し、得られた感作リンパ球を株化する
   ことを特徴とするヒトモノクローナル抗体産生株の製造
   法。
2. 【請求項２】エプスタイン バー ウイルスにより株化
   する請求項１記載の製造法。
3. 【請求項３】ヒトミエローマ細胞株との細胞融合により
   株化する請求項１記載の製造法。
4. 【請求項４】抗原が緑膿菌膜成分である請求項１記載の
   製造法。
5. 【請求項５】抗原がＣＤ２分子である請求項１記載の製
   造法。
6. 【請求項６】抗体がＩgＧ抗体である請求項１記載の製
   造法。
7. 【請求項７】ヒトリンパ球を移植した重篤複合免疫不全
   マウスを抗原感作し、得られた感作リンパ球を株化する
   ことにより得られたヒトモノクローナル抗体産生細胞
   株。