JPS62205034A

JPS62205034A - 生物活性抗腫瘍抗体による腫瘍療法

Info

Publication number: JPS62205034A
Application number: JP62037706A
Authority: JP
Inventors: カール　エリック　ヘルストロム; インゲガード　ヘルストロム
Original assignee: Oncogen LP
Current assignee: Oncogen LP
Priority date: 1986-02-21
Filing date: 1987-02-20
Publication date: 1987-09-09
Also published as: EP0234122A3; EP0234122A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）発明の分野本発明には（ａ）腫瘍細胞の表面上の糖脂質抗原を指向
し、ら）補体を活性化するか、および（または）抗体依
存性細胞障害を仲介して抗体が結合する腫瘍細胞の溶解
を生じることができる抗体が含まれる。本発明の抗体は
腫瘍の治療に使用することができる。

（２）発明の背景（２，１）腫瘍細胞抗原および抗腫瘍抗体腫瘍細胞はこ
れに対応した正常細胞には存在しないかまたは小量存在
する一定の抗原を発現する。

この多（は分化抗原であり、腫瘍および一定胚細胞によ
り共有される。腫瘍中に、十分な選択性をもって出現す
る抗原のあるものは治療剤の可能な標的として役立つこ
とができる。これは最近、これに関して最も研究された
ヒト腫瘍の１つである悪性黒色腫〔ヘルストロムほか（
Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ　ａｎｄＨｅｌｌｓｔｒｏｎ）、「
ガン研究にみける業績（Ａｃｏｏｍｐｌｉｓｈｍｅｎｔ
　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）−１９３４
受賞年、ゼネラル・モーターズ・癌研究基金」、フォー
トナーはか（Ｊ、Ｇ、Ｆｏｒｔｎｅｒ　＆　Ｊ、　Ｅ、
Ｒｈｏａｄｓ）編、ジェー・ビー・リッピンコット社（
Ｊ、Ｂ、ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏｍｐａｎｙ　５Ｐｈ
ｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ｌ　９８５、ｐ２１６〜２４
０　〕、並びに他の腫瘍〔バーチエルほか（Ｂｕｒｃｈ
ｅｌｌ　ａｎｄＴａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉ
ｏｕ）　、パルドウインはか（ＲｏＷ、　Ｂａｌｄｗｉ
ｎａｎｄ　Ｖ、　Ｓ、　Ｂｙｅｒ’ｓ）編、「腫瘍検出
および薬物標的代車クローン性抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｔｕｍｏｒ　Ｄｅ
ｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｉｎｇ
）　Ｊ　、アカデミツク・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｒｅｓｓ）、１９８５、ｐｐｌ　〜１５；ケムスヘッド
（Ｋｅｍｓｈｅａｄ）、止揚、ｐｐ、２８１〜３０２）
について論評された。

多くの抗体は正常組織よりもヒト腫瘍により多量に発現
される細胞表面抗原に対して作られた。

細胞表面抗原に対する抗体が補体の存在下に腫瘍細胞に
対して細胞毒性であることができること〔ヘルストロム
（）ｌｅｌｌｓｔｒｏｍ）　ほか、１９６２、プログレ
ス・イン・アレルギー（Ｐｒｏｇｒ、Ａｌｌｅｒｇｙ）
　　９：１５８〜２４５〕および若干の抗体が抗体依存
性細胞障害を仲介できること〔バールマン（Ｐｅｒｌｍ
ａｎｎ）ほか、１９６９、アトパンシス・イン・イムノ
ロジー（Ａｄｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）、１１：１１７
〜１９３、マクレナン（Ｍａｃｌｅｎｎａｎ）　ほか、
１９６９、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）、１７
：８９７〜９１０；シュルザク（Ｓｈｕｒｚａｋ）ほか
、１９７２、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・
メディシン（Ｊ、）Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）　、１３５　
：９９７〜１００２　；ボラック　（Ｐｏｌｌａｃｋ）
ほか、１９７２、インターナショナル・ジャーナル・オ
ブ・カンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ）、９：３
１６〜３２３］もまた十分に立証された。初めの場合に
適当な補体源（一般にウサギまたはモルモット）、後者
の場合にエフェクター細胞源（一般にマウス由来）が必
要である。

腫瘍関連抗原に対する抗体は、そのような抗原に対する
抗体が補体源としてヒト血清の存在下に腫瘍細胞を殺す
ことができる証拠のように〔ヘルストロム（）ｌｅｌｌ
ｓｔｒｏｍ）　ほか、１９８５、プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）、８
２：１４９９〜１５０２　；ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓ
ｔｒｏｍ）ほか、１９８５、単クローン性抗体および癌
療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　
ａｎｄ　ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ）、ＵＳＣＬＡシ
ンポジア・オン・モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー（ＵＳＣＬＡ　　Ｓｙｍｐｏｓｉａ　ｏｎ　
、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ、　２７、ｐｐｌ　４９〜１６４
、アラン・アール・リス社（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓＳ
Ｉｎｃ、　、ＮＹ）　）、ヒトエフェクター細胞の存在
下にヒト腫瘍細胞を殺すことができることは極く最近明
らかにされたことである〔ヘルストロム（Ｈｅｌ　Ｉｓ
ｔｒｏｍ）　ほか、１９３１、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅ
ｒ、　２７　：　２８１〜２８５，１　。

（２，３）放射性同位元素、毒素または薬物の担体とし
て抗腫瘍抗体の治療使用抗癌剤を製造する魅力的方法には抗体を放射性同位元素
で標識する〔ラルソン（Ｌａｒｓｏｎ）　ほか、１９８
３、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲー
ション（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　）、７２：
２１０１〜２１１４　；オーダー（Ｏｒｄｅｒ）ほか、
１９８４、コンプル・セル・（Ｃｏｍｐｒ、Ｔｈｅｒ、
）、１０：９〜１８；カラスキーｏ　（Ｃａｒｒａｓｑ
ｕｉｌｌｏ）ほか、１９８４、カンサー・トリートメン
ト・レポート（Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅｎｔ＋ｒ＋ｅｎｔ
　Ｒｅｐｏｒｔｓ）、６８：３１７〜３２８；ドナルド
（ｄｅ　Ｎａｒｄｏ）ほか、１９８５、インターナショ
ナル・ジャーナル・オブ・ラジェーション　オンコロジ
ー、バイオロジー、フィジックス（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｒ
ａｄｉａｔｉｏｎ　［Ｉｎｃｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏｌ、Ｐ
ｈｙｓ、　）、１１：３３５〜３４８〕か、あるいは毒
素〔ヤンセン（Ｊａｎｓｅｎ）ほか、１９８２、イムノ
ロジカル・レビｘ　−（Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、）
、６２　１８５〜２１６；ビテックほか（Ｖｉｔｅｔｔ
ａ　ａｎｄ口ｈｒ）、１９８４、トランスプランテーシ
ョン（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）、３７：５３５〜５３８
〕、あるいは抗癌薬〔ゴースト（Ｇｈｏｓｔ）　ほか、
ブリテイッシニ・メディカル・ジャーナル（Ｂｒｉｔ　
Ｍｅｄ、Ｊ、）　、３　：　４９５〜４９９　；ハーウ
イッッ（Ｈｕｒｗｉｔｚ）　　ほか、１９７５、カンサ
ー・リサーチ；１１７５〜１１８１；ローランド（Ｒｏ
ｗｌａｎｄ）ほか、１９８５、カンサー・イムノロジー
・アンド・イムノセラビイ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ・Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｙ、）、１９：１〜７〕に抗
体ヲ抱合スルことが含まれる。抗体は特異性を与え、同
位元素または薬物は腫瘍を破壊する能力を与える。しか
し、この方法の不利益は抗癌薬および放射性同位元素が
、ともに正常組織に対して高水準の毒素を有する事実で
ある。従って種々の器官例えば腎臓、肝臓または骨髄中
の非特異性とり込みが重篤な副作用を生ずることになる
。

（３〕発明の概要本発明は腫瘍細胞の表面における糖脂質抗原を指向し、
血清補体の活性化および（または）ヒトエフェクター細
胞による抗体依存性細胞障害の仲介をすることができる
種類の免疫グロブリンに属する抗体に関する。本発明の
抗体は試験管内および生体内の両方でこれらの抗原を発
現する腫瘍細胞を溶解できる。

本発明はまた本発明の抗体を治療剤として使用して生体
内で腫瘍を治療する方法を指向する。生体内に投与後、
本発明の抗体は糖脂質抗原を発現する腫瘍細胞に優先的
に結合する。腫瘍細胞に結合すると血清補体が活性化さ
れるか、または抗体依存性細胞障害を仲介して腫瘍細胞
の溶解を生ずる。

本発明の方法は、正常組織に対し高水準の毒性を示す放
射性同位元素および（または）毒素を要しないので、抗
体接合体の使用を含む技術にまさる若干の利点を提供す
る。さらに本発明の非修飾抗体分子の正常組織による非
特異的とり込みが療　　　　法の副作用を最小にとどめ
ることが出来る。

（３，１）定義次にあげた語は示した意味を有する：ＡＤＣＣ＝抗体依存性細胞障害（４）発明の詳細な説明本発明には（ａ）腫瘍関連糖脂質抗原を指向し、ら）抗
体分子が結合する腫瘍細胞の溶解を媒介できるサブクラ
スまたはアイソタイプに属する抗体の使用に基づく方法
が含まれる。より特定的には、これらの抗体は糖脂質腫
瘍関連抗原と結合すると血清補体を活性化し、および（
または）エフェクター細胞例えばナチュラルキラー細胞
またはマクロファージを活性化することにより抗体依存
性細胞障害（ＡＤＣＣ）を仲介するサブクラスまたはア
イソタイプに属しよう。

本発明はまた、これらの抗体をその自然形態でヒト腫瘍
の療法に使用することを指向する。例えば、腫瘍関連細
胞表面糖脂質抗原と称する多くのＩｇＧ２ａおよびＩｇ
Ｇ　３マウス抗体を腫瘍療法のために生体内に使用でき
る。事実、多くの腫瘍関連糖脂質抗原が存在し〔ハコモ
ＩＪ　（Ｈａｋａｍｏｒｉ）、１９８４、アン・レブー
イムノル−（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　、２　：　１０３〜ｌ　２６）　
、若干の抗体は、ここに記載するＬ６のように、広スペ
クトルのヒト腫瘍と反応するので、抗体およびその治療
　“使用は一般的適用性を有する。

（４，１）発明の抗体分子の特徴抗体の生物学的活性は抗体分子のＦｃ領域により広い範
囲まで決定されることが知られている〔ウアニｓ−ほか
（ＩＪａｎｎｕｅ　ａｎｄ　Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆ　）
、１９８４、免疫学テキストブック（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ
　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　、２版、ウィリアムズ
ほか（ＷｉｌｌｉａｍＳ１！１ｉｌｋｉｎｓ）、１２章
、ｐ９．２１８〜２３８）、これには補体を活性化し、
ナチュラルキラー細胞またはマクロファージにより作用
される抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介する能力
が含まれる、異なる種類およびサブクラスの抗体はこの
点で異なり、本発明によれば、所望の生物学的活性を有
する種類の抗体を選択すべきである。例えば１ｇＧ３お
よびＩｇＧ２ａクラスのマウス免疫グロブリンは同族抗
原を発現する標的細胞に結合して血清補体を活性化でき
る。

一般にＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ　３サブクラス、並びに
場合によりＩｇＧ　　１の抗体はＡＤＣＣを仲介するこ
とができ、ＩｇＧ　３、ＩｇＧ２ａおよび１ｇ３４　サ
ブクラスの抗体は結合して血清補体を活性化する。補体
活性化は一般に少くとも２つの１ｇ６分子の標的細胞上
非常に接近した結合を必要とする。しかし、単に１つの
１ｇＭ分子の結合が血清補体を活性化する。

本発明は、一部は特定抗体サブクラスにより仲介される
腫瘍細胞溶解の有効性が、抗体が指向する腫瘍抗原の型
により異なることを見出したことに基く。例えば、腫瘍
細胞表面糖脂質抗原を指向し、補体源としてヒト血清、
またはエフェクター細胞源としてヒトリンパ細胞の存在
下にヒト腫瘍細胞の殺作用を仲介できる若干のマウスＩ
ｇＧ　３またはＩｇＧ２ａ抗体が認識されている。これ
に対して同じ腫瘍細胞上のタンパク質抗原を指向する同
じサブクラスの抗体は有効ではない。

補体活性化および（または’）ＡＤＣＣによる腫瘍細胞
標的の溶解を仲介する個々の抗体の能力は実施例に記載
される試験系を用いて検定することができる。

従って、問題の腫瘍細胞は試験管内で成長させて標識す
ることができ、抗体は、血清補体と、または抗原抗体複
合体により活性化できるリンパ球と組合せて腫瘍細胞培
養に添加される。標的腫瘍細胞の細胞溶解は溶解した細
胞から遊離される標識により検出される。事実、抗体は
患者自身の血清を補体源としておよび（または）　リン
パ球を用いてスクリーンすることができる。試験管内試
験で補体を活性化できるかまたはＡＤＣＣを仲介できる
抗体は次にその特定患者に治療的に使用できる。

事実上任意由来の抗体を、それが腫瘍関連糖脂質抗原を
規定し、補体を活性化するかまたはＡＤＣＣを仲介でき
れば本発明により使用することができる。単クローン性
抗体は連続的にアンプルで供給できる利点を有する。事
実、マウスを腫瘍関連糖脂質抗原で免疫処置し、そのよ
うな抗原に対し抗体を作るハイブリドーマを作り、ヒト
補体の存在下に腫瘍細胞を溶解できる抗体を作るハイブ
リドーマを選択し、ここに記載する手順と同様の手順を
用いることにより、多様のヒト腫瘍と反応し、溶解でき
る抗体のパネルを速やかに決定することが可能であろう
。

本発明はマウス単クローン性抗体の使用を示すけれども
、本発明はそれに限定されず、事実、ヒト抗体を用いる
ことができ、それが好ましいことを証明できる。そのよ
うな抗体はヒトハイブリドーマを用いることにより〔コ
ート（Ｃｏｔｅ）ほか、１９８３、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、５ｃｉ１．８０　：２０２６〜２０３０〕
またはヒ）Ｂ細胞をＥＢＶウィルスで試験管内形質転換
により〔コール（Ｃｏｌｅ）ほか、１９８５　、Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃ
ａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐ’Ｊ　％アラーン・アール・リ
ス（Ａ１１ａｒｒＲ。

１ｉｓｓ　ｐｐ、　７７〜９６）〕得ることができる。

事実、本発明によれば、適当な抗原特異性のマウス抗体
分子からの遺伝子、並びに適当な生物学的活性（例えば
ヒト補体の活性化およびＡＤＣＣの仲介をする能力）を
有するヒト抗体からの遺伝子をスプライシングすること
による「キメラ抗体」の製造に最近開発された技術〔モ
リソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ほか、ｌ　９８４、Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ１．８１　：６８５１
〜６８５５；ノイバーガー（Ｎｅｕｂａｒｇｅｒ）ほか
、１９８４、ネーチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、３１２：
６０４〜６０８；タケダ（Ｔａｋｅｄａ）ほか、１９８
５、Ｎａｔｕｒｅ、　３１４　：４５２〜４５４］を用
いることができ、そのような抗体は、それらが細胞表面
糖脂質抗原を特異性化し、ＡＤＣＣをヒトエフェクター
細胞とともに仲介し、および（または）ヒト補体を活性
化できれば本発明の範囲内にある。

（４，２）抗体の治療使用本発明の方法を用いて機構が補体活性化溶解であっても
ＡＤＣＣであっても、腫瘍細胞の溶解により腫瘍の減少
を生じる十分な量で自然抗体を投与することにより抗体
を腫瘍の治療に適用する巳とができる。

治療のための抗体サブクラスの選択は腫瘍抗原の性質に
よる。例えば、ＩｇＭは糖脂質抗原が腫瘍標的に非常に
特異的であり、正常細胞上に生じることが稀である状態
に選ぶことができる。しかし、腫瘍関連抗原もまた正常
組織中に発現される場合に非常に低い水準にもかかわら
ずＩｇＧサブクラスを次の理由により選ぶことができる
：非常に接近した少くとも２つの１ｇ６分子の結合が補
体の活性化に必要であるので、抗原の発現がより少なく
、従ってほとんどＩｇＧ抗体分子と結合しない正常細胞
中での補体仲介による損傷が一層少ない。さらに、１ｇ
６分子が少量であるほどＩｇＭ分子より多く腫瘍組織に
局在化できる。

生体内補体活性化は、炎症性応答の誘発およびマクロフ
ァージの活性化を含めて種々の生物学的効果を生じる証
拠がある〔ウナニューほか（Ｕｎａｎｕｅａｎｄ　　Ｂ
ｅｎｅｃｅｒｒａｆ）　　、　　１　９　８　４　　、
　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　
２液、ウィリアムズはか（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆　Ｗｉｌ
ｋｉｎｓ）、１２章、ｐｐ、２１８〜２３８）、腫瘍細
胞は活性化したマクロファージの細胞溶解効果に対し正
常細胞よりも一層感受性である〔フイドラーはか（Ｆｉ
ｄｌｅｒ　ａｎｄ　Ｐｏ５ｔｅ）、１９８２’、スプリ
ンガー・セミン（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｓｅｍ１ｎ）、イ
ムツバソロジー（Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、）　、５
　：　１６１〜ｌ　７４）。

炎症を伴なう高血管拡張は種々の抗癌剤、例えば化学療
法薬、放射性標識抗体などの腫瘍中に局在化する能力を
高めることができる。従って、本発明による型特異性の
抗原−抗体組合せを多くの方法で治療に使用でき、腫瘍
細胞集団の不均一性により通常生ずる多（の問題を回避
することができる（その理由は抗原陰性細胞もまた本発
明の方法を用いて殺すことができるからである）。さら
に、そのような抗原に関する精製糖脂質抗原〔ハコモリ
（）ｌａｋｏｍｏｒ　ｉ）、１９８４　、Ａｎｎ、Ｒｅ
ｖ、Ｉ＋ｙ＋＋＋＋ｕｎｏ１９．２：１０３〜１２６〕
または抗イデイオタイプ抗体〔ネボム（Ｎｅｐｏｍ）ほ
か、１９８５　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　　、８１　：２８６４〜２８６７
　；コブロウスキ（Ｋｏｐｒｏｗｓｋ　ｉ）ほか、１９
８４、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、８１　：　２１６〜２１９Ｆは
ヒト癌患者中の活性免疫応答の誘発に用いることができ
た。

そのような応答にはヒト補体の活性化およびＡＤＣＣの
仲介をすることができる抗体の形成が含まれ、そのよう
な機構により腫瘍が破壊される。

本発明の方法を例示する実施例において、ヒト黒色腫か
らの細胞により発現されるＧＤ３ガングリオシド抗原に
特異性である４つのＩｇＧ　　３個＝ＭＧ−２１，２Ｂ
２、ＩＦ−４およびＭＧ−２３、並びにヒト非小細胞（
ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ　ｃａｌｌ）肺癌、乳癌、および結
腸癌からの細胞により発現されるガングリオシド抗原に
特異性である１つのＩｇＧ　２〕抗体、Ｌ６が１．補体
がヒト血清の形態で与えられるかまたはエフェクター細
胞がヒト血液リンパ球の形態で与えられれば、短時間（
２または４時間Ｓ　Ｉ（：　ｒ検定）でそれぞれの腫瘍
からの細胞を殺すこときができ、３つの抗体、ＭＧ−２
１、ＭＧ−２３およびＬ６、はいずれもＡＤＣＣおよび
補体依存性細胞障害を仲介する。抗ＧＤ３抗体で標的と
して使用される細胞上に発現される２つの黒色腫関連タ
ンパク質抗原、ｐ９７およびプロテオグリカンのいずれ
に対する抗体もＡＤＣＣも補体依存性細胞障害反応も生
じなかった。またＬ６抗原を発現するヒト肺癌細胞上の
タンパク質抗原に対する抗体はＡＤＣＣまたは補体依存
性細胞障害を仲介しなかった。マウス（またはヒト）リ
ンパ球の存在下にヒト黒色腫細胞でＡＤＣＣを仲介する
ＩｇＧ　３抗体はヌードマウス中のヒト黒色腫の小移植
組織を破壊することができたが、ＡＤＣＣを仲介しない
抗体は同様に試験したときに破壊できなかった。

癌患者からの血清は播種性態であっても補体源として働
くことができた。転移筋の患者からのリンパ球はＡＤＣ
Ｃを仲介しなかったが、しかしＴ細胞増殖因子に対する
暴露によりそれを仲介するようにすることができた。正
しい抗体（ＩｇＧ２ａまたは１ｇＧ３）および正しい抗
原（細胞表面糖脂質）の組合せが腫瘍細胞の有効な殺作
用を可能にすることができ、この機構、並びにＡＤＣＣ
の仲介またはヒト補体の活性化に対する抗体の能力に関
連する他の機構はヒト腫瘍療法の開発の基礎として用い
ることができる。

（４，２，１）黒色腫の治療４つ、のＩｇＧ　　３抗体：２Ｂ２、ＩＦ４、Ｍ　Ｇ　
−２１およびＭＧ−２３はヒト黒色腫関連ＧＤ３抗原に
強く結合することが記載されている。それらはヒトエフ
ェクター細胞と２抗体：ＭＧ−２１およびＭＧ２３とを
組合せるとＡＤＣＣを仲介し、補体源としてのヒト血清
の存在下に黒色腫細胞を殺す。

またマウスエフェクター細胞とともにＡ　Ｄ　ＣＣを与
える抗体２Ｂ２がヌードマウス中でヒト黒色腫の成長を
阻害することが認められている。文献に記載された多く
の他の抗腫瘍抗体がそれらの抗原標的に関係なくこれら
の特性を欠くけれども、シｘ　／１／　７　（Ｓｃｈｕ
ｌｔｚ）　　ほか、［１９８３、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８０：５４０７〜５４１
１）により記載された黒色腫細胞のプロテオグリカン抗
原に対する抗体は、２Ｂ２と同様と思われる抗腫瘍効果
を有することが報告された。

ヒトリンパ球を抗体に結合させ、多量のＧＤ３抗原を発
現する細胞に対して５ｌＣｒ遊離検定で試験したときに
高細胞溶解活性は、２時間後検出されたが、リンパ球ま
たは抗体単独では有効でなかった。顕著なＡＤＣＣはｌ
　Ｏｎｇ／ｒｎ１の抗体用量でも、１リンパ球毎標的細
胞で認めることができた。ＡＤＣＣ効果は、ＧＤ３抗原
を欠く細胞が殺されなかったので抗原特異性であり、ま
たその効果は抗原陽性腫瘍細胞の添加により競争的な阻
害であった。

抗体２Ｂ２はまたエフェクターとしてマウス肺臓リンパ
球とともに有意なＡＤＣＣを与えたが、しかし抗体ＩＦ
４は与えなかった。これは高水準のＧＤ３抗原を発現す
るヒト黒色腫を移植したマウス中の２抗体の抗腫瘍活性
の研究に対して刺激を与えた。抗体２Ｂ２は処置マウス
の大部分において腫瘍成長を防ぎ、一方抗体ＩＦ４は腫
瘍阻害を与えなかった。しかし、このデータから抗体２
Ｂ２の生体内効果がＡＤＣＣを経て作動すると結論する
ことができず、それは腫瘍細胞に対する直接抗体効果〔
ジポルド（Ｄｉｐｐｏｌｄ）ほか、１９８３、Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｒｅｓ、　　、４４　：　８０９〜９１０）およ
びマクロファージ活性化を含む他の機構を有すると考え
ることができた。

抗体２Ｂ２はヌードマウス中の小（ｌｆｆｉｌｎ直径）
腫瘍移植組織を破壊することができ、そのＡＤＣＣ活性
はマウスよりもヒトのリンパ球の存在下で大きかったの
で、それはまたヒト中の小黒色腫移植組織（小転移の形
態で）を破壊できると推論できる。

これは、もし真実であれば、深く浸透した一次黒色腫従
って不十分な予後を有する患者における治療適用を有す
ることができる。進行黒色腫を有する患者（予備試験に
通常選ばれる）に関する研究はそのような患者の大部分
からのリンパ球が有意なＡＤＣＣを与えない事実により
複雑である。しかし、これらの患者からのリンパ球を初
めにＴ細胞成長因子にさらしたときにはＡＤＣＣが検出
された。

抗体２Ｂ２、ＩＦ４およびＭＧ−２１はまたへ／ｌｚス
トロム（）ｔｅｌｌｓｔｒｏｍ）　　ほか、ｌ　９８５
　、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ　、　８２　：
１４９９〜１５０２に記載されており、この文献は参照
によりここに加入される。ＭＧ−２１抗体はまた代理人
整理番号５６２４−０１３を有する同時提出同時係属米
国出願に記載され、それは参照としてここに示されてい
る。

（４，２，２）癌の治療ＩｇＧ　２ａ抗体、Ｌ６、は大抵のヒト非小細胞肺癌、
乳癌および結腸癌の細胞により発現されるガングリオシ
ド抗原に非常に特異性であることが記載される。Ｌ６抗
体およびそれを規定する抗原は同時係属米国出願第６８
４．７５９号（１９８４年１２月２１日提出）および第
７７６、３２１号（１９８５年１０月１８日提出）によ
り完全に記載され、それらはいずれも参照としてここに
示されている。

Ｌ６抗体はヒトリンパ球またはマクロファージの存在下
に腫瘍標的細胞のＡＤＣＣを仲介することができる。さ
らに、Ｌ６抗体はヒト血清の存在下に標的腫瘍細胞に結
合して補体を活性化することができる。従って、Ｌ６抗
体は肺癌、乳癌および（または）結腸癌の治療のために
生体内に投与することができる。

（５）単クローン性抗体の調製次のサブセクションでは後記実施例に用いた抗体を調製
した方法を記載する。

抗体の特異性の確認に用いた結合検定は放射性標識抗体
〔ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ほか、１９８１、Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７８：５３９〜５４
３〕を使用して行ない、培養した細胞（１０６）は、培
養基中の熱不活性化（５６℃で３０分）ウシ胎仔血清１
００μｆ中の１２５　）標識抗体ＩＱ’ｃｐｍとともに
４℃で３０分間インキニベートした。

ＰＢＳ５ｆ（７）添加後、細胞は２５０ｇＸｇでｌ。

分間遠心分離することによりペレットにした。上澄みを
吸出し、ペレットを１２５　■について検定した。非特
異的結合の測定のために、競争者として非標識抗体１０
μｇを用いて平行培養を行った〔ブラウン（Ｂｒｏｗｎ
）　　ほか、ｌ　９８１　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、７８　：　５３９〜５４３）　
ｏある場合には、結合検定はプラスチック培養皿に付着
した細胞単層上で類似の方法で行なった。

（５，１）黒色腫糖脂質を指向する単クローン性抗体黒色腫細胞の腫瘍関連糖脂質抗原を指向する抗体を調製
するため、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを黒色腫細胞
系、ＳＫ−ＭＥＬ２８で免疫処置し、次いでその膵臓細
胞をＭＳ−１細胞とハイブリッド形成させた。ハイブリ
ドーマ上澄みを、黒色腫組織から分離し、前に記載した
〔イエ−（Ｙｅｈ）ほか、１９８２、　Ｉｎｔｊ、Ｃｏ
ｎｃｅｒ、　　２　９　　＝　２　６　９〜２　７　５
　〕　’のようにファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）　３０３
４マイクロ試験プレートのウェルの表面に付着したＧＤ
３に対する結合についてスクリーンした。無関係なガン
グリオシドを対照として用いた。ハイブリドーマ２Ｂ２
およびＩＦ４は１ハイブリドーマ形成から誘導し、ハイ
ブリドーマＭＧ−２１は異なるものから誘導した。ＭＧ
−２３はＭＧ−２１に類似の特性を有する抗体である。

それらを限定した希釈により２回クローンした：すべで
ゲル拡散によりＩｇＧ　　３である抗体を形成する。

比較のため、２つの異なる抗体、９６．５および４８．
７を用いた。前者はｐ９７、即ちＭｒ９７．０００の黒
色腫細胞系タンパク質を指向するＩｇＧ　２ａ抗体であ
り〔ウッドバリー（Ｗｏｏｄｂａｒｙ）ほか、１９８０
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　
？　７　：　２１８３〜２１８６　；プラウ’／　（Ｂ
ｒｏｗｎ）ほか、１９８１、ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）、１２７　：５３９
〜５４６）、後者は大部分の黒色腫により発現されるプ
ロテオグリカン抗原に特異性のＩｇＧ　２ｂ抗体である
〔ヘルストロム〕ほか、１９８３、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３０　：１４６７〜１４７２：１
．これらの抗体は、前記試験においてヌードマウス中の
ヒト黒色腫の有意なＡＤＣＣまたは阻害を与えなかった
。

一！＝７７０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　　ＣＬ−４
Ｂ　Ｃファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製〕に共有
結合した球菌タンパク質Ａのカラム上で０．１Ｍクエン
酸塩援衡液、ｐＨ３，５または４．５〔ブラウン（Ｂｒ
ｏｗｎ）ほか、１９８１、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１
２７：５３９〜５４６）で溶離することにより抗体をア
フィニティー精製した。

黒色腫に対する抗体特異性は抗体４．２に対して報告さ
れているように〔イエ−（Ｙｅｈ）　ほか、１９８２、
Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　２９　：　２６９〜２７
５；ヌープルーｒ　ン（Ｎｕｄｅｌｍａｎ）ほか、１９
８２、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、）、２５７：１２７
５２〜１２７５６）培養細胞による結合検定により決定
された。特異性は凍結切片に対する免疫組織研究〔ガリ
ーグス（Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ）ほか、１９８２、Ｉｎｔ
、　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ。

２９：５１１〜５１５〕により確認され、抗体　　２Ｂ
２、ＩＦ４およびＭＧ−２１は転移黒色腫の約８０％の
試料を染色し、腎臓および脳を含む正常標識は染色され
なかった；２Ｂ２に対する特異性データは発表されてい
る〔ヘルムストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ほか、１９
８４、腫瘍学に対する寄与シリーズ（Ｃｏｎｔｒｉｂｕ
ｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　５ｅｒｉｅｓ）：
癌細胞中の遺伝子および抗原（Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ａ
ｎｔｉｇｅｎｓ　１ｎＣａｎｃｅｒ　Ｃａ１ｌｓ）　、
ｌｉ集ソリ−スミニラ−か　”（Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅ
ｒ、　Ｇ、、Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、　Ｈｏ、Ｖａｎ　Ｋ
１１ｅｓｔ、Ｓ、＆？Ｊｕｎｋ、　Ｋ、）、　〔カルゲ
ル、バーゼル（Ｋａｒｇｅｒ　。

Ｂａ５ｅｌ〉〕、ｐｐ、１２１〜１３１〕。

（５，２）非小細胞肺癌糖脂質指向単クローン性抗体Ｌ６単クローン性抗体は同時係属米国出願第６８４、７
５９号（１９８４年１２月２１日提出）および同時係属
米国出願第７７６、３２１号（１９８５年１０月１８日
提出）に記載されているように調製され、そのそれぞれ
の出願は参照としてここに示される。

単クローン性抗体Ｌ６の調製は次に簡単に記載される。

単クローン性抗体は３刃金Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウ
スをヒト肺腺癌２９８１の外植細胞で免疫処置すること
により生成させた。免疫処置は約１０７細胞を４回マウ
スに腹腔内に注入することにより行なった。最後の免疫
処置３日後に膵臓をとり出し、培養基中に懸濁させ、Ｍ
Ｓ−１マウス骨髄腫細胞〔コーラ−ほか（Ｋｏｈｌｅｒ
　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　、１９７５、Ｎａｔｕ
ｒｅ、　２５６　：　４９５〜４９７］と融合させた。

混合物を接種して１口触合細胞（クローン）由来の低密
度培養を形成した：ハイブリッド形成に用いた方法は前
にイエ−（Ｙｅｈ）ほかにより記載されている（１９８
２、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　２９　：　２６９〜
２７５〕。

ハイブリッド細胞からの上澄みは、とりわけ細胞膜を含
む免疫処置に用いた腫瘍からの抽出物に対するＥＬＩＳ
Ａ検定およびオートラジオグラフィー間接１２８　Ｉ標
識プロティンＡ検定〔ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ほか、１
９７９、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソーズ
（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、）　、３１：２０１
〜２０９〕の両方を用いることによりスクリーンした。

これらの抽出物はコルシャー（Ｃｏｌｃｈｅｒ）　　ほ
か（１９８１ＳＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　、４１：１４
５１〜１４５９；イエ−（Ｙｅｈ）ほか、１９８２、Ｉ
ｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　２９　：　２６９〜２７５
］の改良法を用いて調製した。抽出物を調製するために
組織を洗浄し、ＰＢＳで懸濁させ；インタクト腫瘍につ
いてステンレス鋼スクリーンにプレスして通すことによ
りこれを行なった。この後１ｍＭフェニルメチルスルホ
ニルフルオリド〔カルビオケム・ベーリング社（Ｃｏｌ
ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、　　、Ｓ
ａｎＤｉｅｇｏ　、　ＣＡ）製〕を含むｌ　ｍＭ−Ｎａ
ＨＣＯ３を加え、次いで物質を氷上で均質化した。２７
．０００　Ｘ　ｇで１５分間遠心した後上澄みを除き、
ペレットを再びＰＢＳに懸濁させ、１分間超音波処理し
、−７０℃で貯蔵した。

細胞膜抽出物に結合する抗体を生ずるハイブリドーマを
クローンし、試験管内で拡張させ、さらに抗体特異性に
ついて試験した。この試験は免疫組織学技術〔ガリーグ
ス（Ｇａｒｒ　ｉｇｕｅｓ）ほか、１９８２、Ｉｎｔ、
　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、２９：５１１〜５１５：ｌの使用
により行ない肺癌、他の腫瘍および正常ヒト組織の凍結
切片に結合する抗体の能力について試験した。

ヒト肺癌に対する明らかに特異性の抗体を生ずるハイブ
リドーマを再びクローンし、拡張させ、プリスタン感作
した３刃金Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに注入し、腹
水腫瘍として成長させた。

腹水中へ分泌された抗体はプロティンＡセファロース〔
アイ（Ｂｙ）ほか、１９７９、イムノヶミスト　リー（
Ｉｒｎｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　　、　１　５　
　：　　４２９〜４３６　〕上で、ま′たはセフ７クリ
ル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　　Ｓ　−３００中のゲル濾
過により精製した。精製した抗体は、さらに細胞表面に
結合する抗体を決定するためのインタクト細胞上の免疫
組織学結合検定および放射性免疫沈降試験による追加特
異性試験を含む確認に用いた。

単クローン性抗体Ｌ６は上記の相当するハイブリドーマ
から生成された。

（６）単クローン性抗体の確認に用いた検定（６，１）
アイソタイプの決定アイソタイプの決定に２つの方法：オクタ−ロング（Ｏ
ｕｃｈｔｅｒ　ｌｏｎｇ）免疫拡散法および９６ウエル
プレートで行なう検定を用いた。

オフクーロング免疫拡散法には個々のハイブリドーマ細
胞の上澄みの一部を２％寒天平板の中心ウェル中に置い
た。単一特異性ウサギ抗マウスＩｇアイソタイプ抗体〔
メロイ・ラボラトリ−（ＭｅｌｏｙＬａｂ、Ｓｐｒｉｎ
ｇｆｉｅｌｄ　５Ｖｌ）製〕を外側ウェル中に入れ、平
板を室温で２時間、および４℃で一部インキユベートし
た。

軟質ポリ塩化ビニル９６ウエルプレート〔コスタ−（Ｃ
ｏｓｔａｒ）製〕を０．１　ｍｇ／Ｍヤギ抗マウ抗マウ
ス１マ抗７℃で２時間被覆し、３％ＢＳＡ溶液で３７℃
で２時間カウンターコートした。次いでハイブリドーマ
上澄みを３７℃で２時間インキニベートした。ＰＢＳで
洗浄した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）プレートを
、ペルオキシダーゼに結合した単一特異性ウサギ抗マウ
ス■ｇアイソタイプ抗体〔ザイムド（Ｚｙｍｅｄ、　５
ｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）製〕と
ともに３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後プレ
ートを０．１Ｍクエン酸塩緩衝液、ｐＨ４，５中の１ｍ
ｇ／−オルトフェニ゛レンジアミンおよび０．０３％Ｈ
２０□とともにインキユベートした。

６３０ｎｍの波長における光学濃度をダイナチク（Ｄｙ
ｎａｔｅｃ）　　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａプレートリーダー
で測定した。　　。

（６，２）抗体依存性細胞障害検定短時間Ｓ　＋　Ｃｒ遊離試験を標的腫瘍細胞のＡＤＣＣ
の検出に用いた〔サロチニ（Ｃｅｒｒｏｔｉｎｉ）　ほ
か、１９７４、Ａｄｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１８　：　
６７〜１３２］。

５健康ヒト被験者の末梢血液リンパ球をフィニル・ハイ
パツク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）　〔ヘルスト
ロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）　　ほか、１９８１、Ｉｎ
ｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ。

２７：２８１〜２８５〕上で分離してエフェクター細胞
を得、ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞に対する低く１０％または
それ未満）ナチュラルキラー細胞反応性について予めス
クリーンし、特に示さなければリンパ球と標的細胞との
比は１００：１であった。正常Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ
マウスからの牌臓リンパ球もまたた２試験においてイン
キュベートした。

標的細胞（１０”）を”Ｃｒの１００　、ＵＣｉ　（Ｉ
Ｃｉ＝３７ＧＢｇ）とともに３７℃で２時間インキニベ
ートすることにより標識し、その後それらを３回洗浄し
、培地中に再び懸濁させた。標識した細胞をマイクロタ
イターＶ底プレート〔カタログＮ１１ｌ−２２０−２５
Ｘ、ダイナチク・ラボラトリーズ（Ｄｙｎａｔｅｃｋ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ　、
　ＶＡ）製〕中へ接種した（２　Ｘ　１０’細胞毎ウエ
ル、２０μβ中）。次いで精製した抗体（１００μβ毎
ウエル）、次に１００μβ中２Ｘ１０’　　リンパ球毎
ウェルを加え、また低数度のリンパ球毎ウェルおよび低
抗体濃度で試験を行なった。混合物を２〜４時間インキ
ニベートシ（表およびテキスト参照）、その後、プレー
トを４００Ｘｇで遠心分離した。

上澄みを除去し、１００μｌ試料中の放射能をγ−カウ
ンターで測定した。毎群２反復があり、反復間の変動は
常に１０％未満であった。自然遊離は検定の終りにおけ
る浸透的に溶解した標的細胞から培地中へ遊離されたｃ
ｐｍと規定した。細胞障害％は以下のように計算した：（６，２，１）’Ｊンパ球の分離およびエフェクター細
胞のＦａ、認ヒト血・液リンパ球および血清の供与体の２つの型を試
験した。最初に２５〜４５才の健康成人ヒト被験体を用
いた。第２に黒色腫を有する患者を試験した。ヘパリン
２０車位／ｒｎｌ−血液を用いて血液試料を採った後、
リンパ球をフィニル・ハイパツク〔ヘルストロム（Ｈｅ
ｌｌｓｔｒｏｍ）ほか、１９８１、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎ
ｃｅｒ、　２７　：　２８１〜２８５　Ｅ上で分離した
。

試験の大部分は前に記載された〔ヘルストロム（Ｈｅｌ
ｌｓｔｒｏｍ）　　ほか、１９８１、［ｎｔ、Ｊ、Ｃａ
ｎｃｅｒ、　２７：２８１〜２８５〕ように、１０％ジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　、２０％ウシ胎仔血
清およびＲＰＭＩ培養基の混合物〔グランド・アイラン
ド・バイオロジカル社（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ　５Ｇｔａｎｄ　ｌ
５ｌａｎｄ　　５ＮＹ）製〕中で凍結リンパ球について
行ない、試験前に３７℃で解凍した。

エフェクター細胞をｖ１認するために試験を行ない、フ
ィニル・ハイパツク上で分離することにより得られたリ
ンパ球調製物をプラスチック培養フラスコ中で、３７℃
で１時間インキュベートして付着細胞を除き、その後そ
れをナイロンウールカラム〔ジニリウス（Ｊｕｌｉｕｓ
）ほか、１９７３、ユーロビアン・ジャーナル・オブ・
イムノロジー（Ｂｕｒ。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、＞　　３　：　６４５〜３６９］
を通し、カラム流出液中の細胞をエフェクター細胞源と
して用いた。他の試験において、フィニル・ハイパツク
精製リンパ球を、０．１μｇ／１０’！Ｊンパ球の濃度
における抗Ｌｅｕ−１１ｂ抗体〔ベクトン・デイッキン
７　ン（Ｂｅｃｔｏｎ−ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＪれ、Ｖｉ
ｅｗ、ＣＡ）製〕および１：５に希釈したウサギ血ａ（
補体源として）の混合物とともに３７℃で１時間インキ
ユベートシた；これはナチニラルキラー（ＮＫ）細胞に
より仲介される反応性を破壊するために行なった〔トン
プソン（Ｔｈｏｍｐｏｓｏｎ）　　ほか、１９８２、ア
メリカン・アソシエーション・フオ・クリニカル・ヒス
トコンパティビリティ・テ叉ティング（Ａｍｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｃ１１ｎｉｃ
ａｌ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐ。

Ｔｅｓｔｉｎｇ）、第８年金、ｐ、Ａ２３］。

（６，２，２）Ｔ細胞増殖因子によるリンパ球の処理末
梢血、液リンパ球（１０６／ｍｊりを、リンパ球を試験
管内で１０％ヒト細胞増殖因子［：ＴＧＦ。

セルラー・プロダクツ社（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ、　Ｉｎｃ。

Ｂｕｆｆａｌｏ　、ＮＹ）製）〕、２０％ヒトＡＢ血清
および７０％ＲＰＭＩ培地の存在下に５日間インキュベ
ートすることによりＴ細胞増殖因子で処理した。

（６，２，３）標的細胞転移腫瘍からの５種のヒト黒色腫細胞系を用いた。Ｍ−
２６３４、を除いたすべてが、前に記載したように〔イ
エ−（Ｙｅｈ）　ほか、１９８２、Ｉｎｔ。

Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　２９　：　２６９〜２７５　；ヌ
デルマン（Ｎｕｄｅｌｍａｎ）ほか、１９８２、Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍｏ、２５７二１２７５２〜１２７５６
）行なった結合検定により高水準のＧＤ３抗原を発現し
た。４系統、ＳＫ−ＭＥＬ−２８（ウッドバリー（Ｗｏ
ｏｄｂｕｒｙ）ほか、１９８０、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７７　：　２１８３〜２
１８６）、Ｍ　　２６６９クローン１３、Ｍ−２６３４
およびＭ−２７６５、を試験管内で増殖させた。試験管
内で成長せず、従ってヌードマウス中に連続移植した第
５の系統、Ｍ−２５８６は他系統のどれよりも良好に成
長した。ヒト肺（気管支）癌系統ＣＨ２７を抗体特異性
に対する対照として用いた。それは検出可能なＧＤ３抗
原を発現しない。

（６，３）補体仲介細胞障害検定５ＩＣｒ遊離検定を用い、補体源としてヒト血清の存在
下に黒色腫細胞を殺す抗体の能力もまた試験した。それ
はＡＤＣＣに対する検定と同様に行なったがしかし非希
釈非過熱ヒト血清１００μｌをエフェクター細胞の懸濁
液の代りに毎マイクロテストウェルに加えた；この血清
は正常ヒト被験体から誘導した。

（６，４）全体内抗体活性試験無胸腺ヌード（ｎｕ／ｎｕ）　２〜３月令おすマウスを
チャールス・リバー・ブリーディング・ラボラトリーズ
（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から人手し、コンドミニラム
設備中に配置したフィルタートップケージ中に収容した
（５マウス毎ケージ）。

マウスは両側復部にｐ９７　〔ウッドバリー（Ｗｏｏｄ
ｂｕｒｙ）ほか、１９８０　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７７：２１８３〜２１８６）およびＧＤ３抗原
〔イｘ　−（Ｙｅｈ）ほか、１９８２、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃ
ａｎｃｅｒ。

２９：２６９〜２７５〕の両方を発現する黒色腫Ｍ−２
５８６の小片（ＩＸ１ｍｍ直径）を移植した。

各試験群には５マウスが含まれた。マウスは両側部に移
植したのでこれは１０「部位」に相当する。

対照群１０マウス（２０部位）を有した。

移植の翌日およびその後３日日毎にマウスに尾静脈を通
してリン酸緩衝溶液中の抗体１ｍｇを注入した；この用
量は処置マウス中に過剰の抗体を与えるように選択した
。個々の群に抗体２Ｂ２、ＩＦ４または９６．５あるい
はこの３つの組合せを与え、最後の群は各抗体の１７３
用量を注入した。

合計６回の抗体注入を３日間隔で与えた。対照群は同時
間に等容量の培地を注入した。

マウスは週３回６ケ月にわたって検査し、６ケ月の終り
までに対照マウスはすべて腫瘍で死亡した。各検査にお
いて各触知腫瘍の２垂直直径を測定して平均腫瘍直径（
±ＳＥ）を計算した；腫瘍はその平均直径が２ｍｍまた
はそれ以上であるときに触知可能であるとみなす。デー
タは注入部位全数中の群当りの触知可能腫瘍を有した数
として表わされる。

（７）単クロー・ン抗体体ＭＧ−２１ハイブリドーマＭＧ−２１はセクション（５，１）に記
載したヒト黒色腫細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−２８で免疫処置
したマウスからのマウス肺臓細胞の１ハイブリツド形成
から誘導した。単クローン性抗体ＭＧ−２１はヒト黒色
腫のＧＤ３抗原を指向するＩｇＧ　　３抗体である。次
のサブセクションには抗体ＭＧ−２１のＡＤＣＣおよび
（または）黒色腫細胞補体仲介殺作用を誘発する能力を
示す種々の検定の結果が記載される。ＭＧ−２３はＭＧ
＝２１と同様の特性を有する。

（７，１）抗体依存性細胞障害検定最初の組の試験において、ＧＤ３ガングリオシド抗原の
細胞当り１００．０００分子以上を発現するヒト黒色腫
細胞であるＭ−２６６９細胞系を精製λＩＧ−２１およ
び正常ヒト被験体からの末梢血液リンパ球とともにイン
キュベートした。表１に示されるデータは黒色腫標的細
胞の有意な殺作用が認められたことを示す。事実、黒色
腫標的細胞の有意な殺作用が抵抗体濃度（１μｇ　／　
ｍｌ）および低リンパ球と標的細胞との比（１０：　１
）でも認められた。対照的に、リンパ球単独、ＭＧ−２
１抗体単独または、ｐ９７、腫瘍関連タンパク質抗原、
指向する抗体９６．５、およびプロテオグリカンを指向
する抗体４８．７とともにインキュベートしたリンパ球
は有意な同位元素の遊離を生じなかった。

表　　　■ １０　６４５２　ＮＯＮｏ１　１４１３　ＮＯＮＯ細胞障害は４時間Ｓ　Ｉ　Ｃｒ遊離検定で決定した。抗
体単独は細胞障害を与えず、リンパ球単独は５％または
それ未満の細胞障害を与えた。

ＮＤ：行なわず表■の結果は正常被験体からのリンパ球を抗Ｌｅｕ−１
１ｂ抗体および補体とともにインキュベートするとＭＧ
−２！ｔの存在下に標的細胞を溶解する（すなわちＡＤ
ＣＣを仲介する）　リンパ球の能力が破壊されること示
す。これはリンパ球がナチュラルキラ−（ＮＫ）細胞の
特性〔トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ほか、１９８２
　、Ａｍ、Ａｓ５ｏｃ、　ｆｏｒ　Ｃ１ｉｎｉｃａｌＨ
ｉｓｔｏｃｏｍｐ　ａＦｅｓｔｉｎｇ　、第８年令、ｐ
、Ａ２３）を有したことを示す。

表　　　■ ％細胞溶解６なしく培地）　　　　　　３　　　　２４補体　　　　
　　　　　３　　　　２２ヒト癌に対する療法の開発に
おける関心を考えて、次の段階は、播種性転移を有する
患者が治療試験に対する確かな第１候補であると思われ
たので、これらの患者からのリンパ球がＡＤＣＣ検定に
おいてエフェクター細胞として役立つことができるかど
うかを調べることであった。表■に示されるように、そ
のような患者からのリンパ球は有意なＡＤＣＣを仲介し
なかった。しかし、リンパ球を初めにＴ細胞増殖因子を
含む調製物とともに５日間インキエベートすれば、リン
パ球単独による有意な殺作用並びにリンパ球およびＭＧ
−２１抗体による一層大きい殺作用が認められた二表■
参照。

表　　　■ 正常被験体Ｎ−３６５５ ■期黒色腫Ｍ−３４２Ｍ−５３７Ｉ期黒色腫Ｍ−２０３１１００エフエクター細胞（リンパ球）／標的細胞表　　
　■ ■期　乳癌　　１０　　　　０　　　　２．６８（７，
２）補体仲介細胞障害検定補体源としてのヒト血清の存在下のＧＤ３陽性黒色腫細
胞に対する抗体ＭＧ−２１の細胞障害をＡＤＣＣ検定に
類似の、しかしリンパ球の代りに非希釈非加熱ヒト血清
を加えた４時間５１（’ｒ遊離検定を用いて測定した。

表■および表■に示されるように抗体ＭＧ２１はヒト血
清の存在下に強い細胞障害効果を与えた。ヒト血清の熱
不活性化（５６℃、３０分間）はその効果を無効にした
。

表■の結果は１００％までの標的細胞が抗体ＭＧ−２１
およびヒト血清の両方を加えたときに溶解されたことを
示す。抗体ＭＧ−２１単独およびヒト血清単独は黒色腫
細胞に対する細胞溶解効果を有さず、補体の不活性化は
細胞溶解効果を失効した。

表　　　ＶＳＫ−λ１ＢＬ−２８＋＋十　不活性　　５００細胞障
害は４時間５ｌＣｒ遊離検定で測定した。細胞系、Ｈ−
３０２１およびＨ−２７２２は検出可能量のＧＤ３抗原
を発現しない非黒色腫である。

表■中の結果は、ＭＧ−２１に対比して、Ｍ−２６６９
細胞、ｐ９７糖タンパク質およびプリチオグリカン中に
それぞれ強く発現される黒色腫関連抗原に特異性である
抗体９６．５および４８．７が補体の存在下にλ、１−
２６６９標的細胞を殺さなかったことを示す。

表　　■ ＭＧ−２１６４２４９６，５３２４８，７１７抗体９６．５はｐｌ）７黒色腫関連糖タンパク質抗原に
特異性でり、抗体４８．７は黒色腫関連プロテオグリカ
ン抗原をリポする；その両者はまたＭ　−２６６９ａ的
細■；）表面上に強く発現される。

ヒト癌に対する療法の開発における関心を考えて、次の
段階は播種性転移を有する患者からの血清が適当な補体
源として抗体ＭＧ−２１で役立つことができるかどうか
を調べることであった。表■中の結果はＭＧ−２１の補
体依存性細胞障害が、正常被験体からの血清よりも■期
黒色腫を有する患者から誘導された血清でわずかに一層
大きかったことを示す。

表　　　■ 正常　　　　　　７９　　５７　　０ ■期黒色腫Ｍ−７８３６４０％細胞障害は０．０１またはそれ以下のｐで統計的に０
と異なる。抗体または血清単独を検定したときに細胞障
害が認められなかった。

（８）単クローン性抗体２Ｂ２ハイブリドーマ２Ｂ２およびＩＦ４はセクション（５，
１）に記載したように各ヒト黒色腫細胞系ＳＫ−ＭＥＬ
−２８で免疫処置したマウスからの肺臓細胞の１ハイブ
リツド形成から誘導された。

単クローン性抗体２Ｂ２はヒト黒色腫のＧＤ３抗原を指
向するＩｇＧ　３抗体である。次のサブセクションには
黒色腫細胞の抗原依存性細胞障害を誘発し、ヌードマウ
ス中の小腫瘍移植組織を破壊する抗体２Ｂ２の能力を示
す種々の検定の結果が記載される。

（８，１）抗体依存性細胞障害検定最初の組の試験において、細胞当り１００．０００分子
以上のＧＤ３ガングリオシド抗原を発現するヒト黒色腫
細胞系を精製２Ｂ２および正常ヒト被験体またはマウス
からの末梢血液リンパ球とともにインキュベートした。

表■に示されるデータは有意な殺作用が認められたこと
を示す。

表　　■ 細胞障害は３時間ＩＩ（：ｒ遊離検定で決定したがＭ−
２６６９が標的細胞であった場合の検定は細胞障害は４
時間インキュベーシヨンで決定した。

対比のため、リンパ球単独、２Ｂ２抗体単独または、腫
瘍関連糖タンパク質抗原ｐ９７を指向する抗体９６．５
、および同じ黒色腫細胞により強く発現されるプロテオ
グリカンを指向する抗体４８．７とともにインキュベー
トしたリンパ球は同位元素の有意な遊離を生じなかった
。抗体２Ｂ２およびリンパ球はＧＤ３抗原を発現しない
対照腫瘍ＣＨ−２７からの標的細胞に対する効果を有し
なかった。抗体２Ｂ２はまたエフェクターとしてのマウ
ス牌１ｉｆｔ　ＩＪンパ球で有意なＡＤＣＣを与えたが
、しかし抗体ＩＦ４でこれを与えなかった。

抗体２Ｂ２のＡＤＣＣ活性を５つの異なる正常供与体か
らのリンパ球の存在下に評価した。表■に示されるよう
に、各供与体からのエフェクター細胞は強いＡＤＣＣを
与えた。

表　　　■ Ａ　　　８２　５０Ｂ　　　５５　２６Ｃ６４ＮＤＤ　　　８５　　ＮＤＥ　　　８８　　ＮＤ細胞障害は４時間Ｓ　Ｉ　Ｃｒ遊離検定で決定した。抗
体単独は細胞障害を示さず、リンパ球単独は５％または
それ未満の細胞障害を与えた。

ＮＤ：行なわなかった。

播種性転移を有する患者からのリンパ球が抗体２Ｂ２に
よるΔＤＣＣ検定においてエフェクター細胞として役立
つことができるかどうかもまた調べた。表Ｘに示される
ように、そのような患者からのリンパ球はＡＤＣＣを仲
介しなかった。これらのデータはＭＧ−２１に対し表■
に与えたものに類似する。

表　　　Ｘ正常被験体Ｎ−１６３４Ｎ−３６３８Ｎ期黒色腫Ｍ−３４３ ■期黒色腫Ｍ−２０１５１００エフエクター細胞（リンパ球）／標的細胞（８，
２）補体仲介細胞障害検定補体源としてのヒト血清存在下のＧＤ３陽性黒色腫の細
胞障害を、ＡＤＣＣ検定に類似の、しかしリンパ球の代
りに非希釈非加熱ヒト血清を加えた４時間Ｓ　Ｌ（：　
ｒ遊離検定を用いて決定した。抗体ＭＧ−２１と異なり
抗体２Ｂ２は効果を与えなかった。

（８，３）生体内の抗体２Ｂ２の抗腫瘍効果抗体２Ｂ２
またはＩ　Ｆ４が生体内で抗腫瘍効果を有するかどうか
試験した。これらの抗体は２Ｂ２がマウスエフェクター
細胞でＡＤＣＣを与えたが、しかしＩＦ４はこれを与え
なかったので選ばれた　゛（表■参照）。黒色腫Ｍ−２
５８６はそれがヌードマウス中で非常によく成長してＧ
Ｄ３抗原を発現するので、２Ｂ２仲介ＡＤＣＣに対する
標的として使用でき、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞に対する
ＡＤＣＣを競争的に阻害できる。Ｍ−２５８６はヌード
マウスの両側復部上に移植し、マウスに生体内ＡＤＣＣ
のために必要であるものを越える血液濃度を与えると予
想される抗体用量で注入した。

抗ｐ９７抗体９６．５は３抗体すべての組合せ（同様の
全抗体濃度）と同様に平行的に試験した。

表ＸＴに示されるように、抗体２Ｂ２は黒色腫移植組織
の成長をほぼ完全に抑制し、対照における２０中１９部
位に比べて１０中１注射部位のみが移植後に検出可能腫
瘍を４ケ月有した。従って、小移植腫瘍片は２Ｂ２群中
の全１０部位で１部位を除いて拒絶された。移植６月後
に２Ｂ２群中４マウスが生存し、＠瘍がなかったが、し
かし対照はすべて死亡し、大（直径１５ｍｍ以上）腫瘍
を有した。抗体９６．５も抗体ＩＦ４も腫瘍の成長を阻
害しなかった。抗体２Ｂ２、ＩＦ４および９６．５＝の
組合せを受は入れた群もまた阻害を示し、１０中３部位
が進行性成長腫瘍を生じた。

抗体２Ｂ２により仲介された阻害は、対照群との比較を
＠瘍を有する部位の数を基にしてフィッシャー表（Ｐ、
Ｏ，ＯＯ１以下）を用いて、平均腫瘍直径を基にしてス
チニーデン）１試験（Ｐ、０．００１以下）を用いて行
なっても腫瘍を移植した２ケ月後から統計的に有意であ
った。

表　　　ＸＩ対照（培養基）　　　　　　　　１８／２０　　　１９
／２０抗体２Ｂ２（抗ＧＤ３）　　　　　　　　　ｌ／
１０　　　　１／１０抗体ＩＦ４（抗ＧＤ３）　　　　
　　　　　８／１０　　　１０／１０抗体９６．５（抗
ｐ９７）　　　　　　　　　９／１０　　　　１０／１
０組合せ（２Ｂ２、ＩＦ４および９６．５）　　３／１
０　　　　３／１０１０１Ｘ１腫瘍片（ヒト黒色腫Ｍ−
２５８６）をヌードマウスの各側腹部に移植した。翌日
およびその後５回３日間隔で抗体Ｌｍｇを静脈内注射し
た。

毎群５マウス（１０部位）であったが、しかし対照は１
０マウス（２０部位）を有した。

０抗体２Ｂ２を受入れた５中４マウスおよび組合せを受
入れた５中２マウス（これらのマウスはすべて生存し、
腫瘍を含まなかった）を除いて（９）単クローン性抗体
Ｌ６ハイブリドーマＬ６はセクション（５，２）に記載した
ようにヒトの肺の腺癌、２９８１で免疫処置したマウス
からの膵臓細胞の１ハイブリツド形成から誘導した。単
クローン性抗体Ｌ６は非小細胞肺癌および一定の他の腫
瘍からの細胞の表面に多量に発現されたガングリオシド
抗原を指向する［ｇＧ２ａ抗体である。次のサブセクシ
ョンは抗体依存性細胞障害および（または）多量のＬ６
ガングリオシド抗原を発現する肺癌細胞の補体仲介役作
用を誘発する抗体Ｌ６の能力を示す種々の検定の結果を
記載する。

（９，１）抗体依存性細胞障害検定ヒトリンパ球と組合せたときにＬ６抗体が多量のＬ６ガ
ングリオシド抗原（約ｉｏｏ、　ｏｏｏ分子毎細胞）を
発現する標的細胞のＡＤＣＣを仲介するが、少量のＬ６
抗原を発現する標的細胞は殺されなかった、表Ｘ■参照
。多量のＬ６抗原を発現する細胞系の中で細胞系２９８
１は系統ＣＨ２７よりも一層感受性の標的であった。エ
フェクター細胞はＬｅｕ−ｆｉｂ抗原を発現すると認め
られ、従って、ＭＧ２１の存在下に黒色腫の細胞仲介Ａ
ＤＣＣに類似する。対照的に、標的細胞系２９８１によ
り発現される３つのタンパク質抗原を指向する抗体はＡ
ＤＣＣを仲介できなかった。

表　　　Ｘ■ 細胞障害は４時間Ｓ　Ｉ　Ｃｒ遊離検定で測定した。

１これらの結果は次の障害値：６６．７４．７６．８３
．８４を有したＬ６抗体５プールに基く。

（９，２）補体仲介細胞障害検定表ＸＩ中の試験は抗体Ｌ６が、補体源としてヒト血清の
存在下にＬ６ガングリオシド抗原を発現する腫瘍細胞を
溶解できるが、しかし抗原金欠く細胞は溶解しないこと
を示す：後者の細胞はＧＤ３陽性であり、抗体ＭＧ−２
１により活性化された補体により溶解され、従って検定
に用い、だ補体は不活性化さなかったことを示す。

表　　　Ｘ■ 表Ｘ■の試験に用いな標的細胞系２９８１により発現さ
れた３つのタンパク質抗原に対する抗体は補体依存性細
胞障害を活性化できなかった、表■参照。

表　　　ＸＩＶＬ６　　　　　　　　　３４Ｌ３　　　　　　　　　　３Ｌ５　　　　　　　　　　　６なし　　　　　　　　１抗体Ｌ３、Ｌ５およびＬｉ２は２９８１細胞により発現
されたタンパク質抗原を指向する。

α〔細胞系統の寄託次の細胞系をＡＤＣＣ，ロックビル、ＭＤに寄託し、次
の寄託番号が指定された：細胞系　　　　　寄託番号ＭＧ−２１８Ｂ９０１１Ｌ６　　　　　　ＨＢ８６７７本発明は特に上記態様について詳細に記載された。しか
し、本発明は開示されたＢｐＨまたは寄託細胞系により
範囲を限定されるものでなく、それらが発明の観点の例
示として意図されていることは理解されよう。

事実、ここに示され、記載されたものに加えて、発明の
種々の変形は前記記載から当業者に明らかになろう。そ
のような変形は特許請求の範囲内に属するものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）腫瘍により発現される糖脂質抗原を指向し、糖脂
質腫瘍関連抗原と結合して、血清補体を活性化するかま
たは抗体依存性細胞障害を仲介して腫瘍の細胞を殺す免
疫グロブリンサブクラスを含む抗体分子の有効量を生体
内に投与することを含む、腫瘍を治療する方法。
（２）抗体が単クローン性抗体を含む、特許請求の範囲
第（１）項記載の方法。
（３）抗体がＩｇＭ免疫グロブリンを含む、特許請求の
範囲第（１）項または第（２）項記載の方法。
（４）抗体がＩｇＧ免疫グロブリンを含む、特許請求の
範囲第（１）項または第（２）項記載の方法。
（５）抗体がＩｇＧ１免疫グロブリンを含む、特許請求
の範囲第（１）項または第（２）項記載の方法。
（６）抗体がＩｇＧ３免疫グロブリンを含む、特許請求
の範囲第（１）項または第（２）項記載の方法。
（７）抗体が、ヒト黒色腫細胞により発現されるＧＤ３
ガングリオシド抗原に特異性であるＭＧ−２１を含む、
特許請求の範囲第（６）項記載の方法。
（８）抗体がＩｇＧ２ａ免疫グロブリンを含む、特許請
求の範囲第（１）項または第（２）項記載の方法。
（９）抗体がヒト非小細胞肺癌細胞により発現されたガ
ングリオシド抗原に特異性であるＬ６を含む、特許請求
の範囲第（８）項記載の方法。
（１０）抗体が注入により投与される、特許請求の範囲
第（１）項または第（２）項記載の方法。
（１１）抗体が静脈内に投与される、特許請求の範囲第
（１）項または（２）項記載の方法。
（１２）黒色腫により発現されるＧＤ３糖脂質抗原を指
向し、ＧＤ３抗原と結合して、血清補体を活性化するか
または抗体依存性細胞障害を仲介して腫瘍の細胞を殺す
ＩｇＧ３抗体分子の有効量を生体内に投与することを含
むヒト黒色腫を治療する方法。
（１３）抗体がＭＧ−２１を含む、特許請求の範囲第（
１２）項記載の方法。
（１４）神経膠腫により発現されたＧＤ３糖脂質抗原を
指向し、ＧＤ３抗原と結合して、血清補体を活性化する
かまたは抗体依存性細胞障害を仲介して腫瘍の細胞を殺
すＩｇＧ３抗体分子の有効量を生体内に投与することを
含むヒト神経膠腫を治療する方法。
（１５）抗体がＭＧ−２１を含む、特許請求の範囲第（
１４）項記載の方法。