DE69124683T2 - Monoklonale Antikörper gegen Glykolipid-Karbohydratketten - Google Patents
Monoklonale Antikörper gegen Glykolipid-KarbohydratkettenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper der Nebenklasse IgG3 die mit wenigstens einem GD3-Gangliosid und mit 3',8'-LD1 reagieren.
- Ganglioside, welche eine Klasse von Zellmembran- Glycolipiden bilden, sind Moleküle, bestehend aus einer Kohlehydrat- oder Oligosaccharid-Kette, welche eine hydrophile Seitenkette darstellt, und einem Sphingosin und einer Fettsäure, welche hydrophobe Reste darstellen.
- Es ist bekannt, dass sich die Gangliosidexpression je nach Zelle, Organ und tierischer Spezies unterscheidet. Darüber hinaus wird allmählich klar, dass Ganglioside, welche während des Prozesses der onkogenen Zelltransformation exprimiert werden, Veränderungen in Bezug auf Menge und Qualitat zeigen [Cancer Res., 45, 2405 (1985)].
- Beispielsweise ist berichtet worden, dass Ganglioside, die GD2, GD3 und GM2, die in normalen Zellen kaum nachgewiesen werden können, in abnormaler Weise als Krebsantigene in Neuroblastomen, kleinzelligen Lungenkarzinomen, Gliomen und Melanomen, wobei es sich um neuroectodermale Tumoren handelt, denen hohe Malignität nachgesagt wird, exprimiert werden (J. Exp. Med., 155, 1133 (1982); J. Biol. Chem., 257, 12752 (1982); Canner Res., 47, 225 (1987); ibid., 47, 1098 (1987); ibid., 45, 2642 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 5392 (1983)].
- Für die Analyse und die Behandlung solcher Tumoren wurden monoklonale Antikörper produziert, welche mit dem Gangliosid GD2 reagieren [Cancer Res., 47, 1098 (1987); ibid., 45, 2642 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 7629 (19829] und monoklonale Antikörper, welche mit dem Gangliosid GM2 reagieren [Cancer Res., 46, 4116 (1986); ibid., 48, 6154 (1988); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 5392 (1983)].
- Die Gangliosidspezies GD3 enthält die Kohlehydratkette NeuAcα2T8NeuAcα2T3Gal, NeuAcα2T8NeuGcα2T3Gal, NeuGcα2T8NeuAcαT3Gal oder NeuGcα2T8NeuGcα2T3Gal am nichtreduzierenden Ende. Diese werden häufig in neuroektodermalen Tumoren, insbesondere in Melanomen exprimiert. Bisher wurden fünf monoklonale Anti-Gangliosid-GD3-Antikörper, die zur Klasse IgM oder zur Nebenklasse IgG3 gehören, produziert und über deren Reaktivität gegenüber GD3 wurde berichtet [Int. J. Cancer, 29, 269 (1982); J. Biol. Chem., 257, 12752 (1982); Cancer Res., 47, 225 (1987); Acta Neuropathol., 79, 317 (1989); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 6114 (1980); J. Exp. Med., 155, 1133 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81, 5767 (1984)].
- Die Behandlung von Melanom-Patienten unter Verwendung eines Anti-Gangliosid-GD3-Antikörpers der Nebenklasse IgG3 wurde angestrebt [Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 24, Suppl. 2. S65 (1988); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 1242 (1985)]. Die therapeutischen Effekte sind jedoch bisher noch nicht zufriedenstellend.
- Andererseits ist berichtet worden, dass das Gangliosid 3',8'-LD1, das dieselbe Kohlehydratkette wie GD3 am nichtreduzierenden Ende aufweist, im Gliom, einem der neuroektodermalen Tumoren, exprimiert wird. Der Bericht behandelt außerdem einen zur Klasse IgM zugehörigen monoklonalen Antikörper der mit 3',8'-LD1 reagiert [Acta Neuropathol., 79, 317 (1989)]. Demzufolge kann 3',8'-LD1 als ein wichtiges Krebs-Antigen betrachtet werden.
- Darüber hinaus ist ein zur Klasse IgM gehöriger monoklonaler Antikörper, der Kreuzreaktivität mit den Gangliosid-Antigenen GD3 und 3',8'-LD1 zeigt, bekannt [Acta Neutropathol., 79, 317 (1989)]. Es sind jedoch keine Antikörper der Klasse IgG bekannt, welche mit GD3 und 3',8'-LD1 reagieren.
- Brodin et al. beschreiben in Biochimica et Biophysica Acta 837 (1985) 349-553 monoklonale Mausantikörper 282 und 1F4, der Nebenklasse IgG3, die spezifisch für Gangliosid GD3 sind.
- Monoklonale Antikörper, welche mit den Gangliosiden GD3 und 3',8'-LD1 reagieren und zur Klasse IGG gehören, wären, falls erhältlich, brauchbar für die Behandlung von Karzinomen neuroektodermalen Ursprungs.
- Es wurde nunmehr festgestellt, dass bestimmte monoklonale Antikörper der Klasse IgG, welche von Hybridomen produziert werden, die erfindungsgemäß unter Verwendung eines GD3-Gangliosids oder von GD3-exprimierenden Zellen als Immunogen etabliert wurden, gleichzeitig mit den Gangliosiden GD3 und 3',8'-LD1 reagieren können und zytotoxische Aktivität besitzen und somit für die Krebsbehandlung brauchbar sind.
- Die Figuren 1 und 2 zeigen die Ergebnisse von Beispiel 2, die man mit Hilfe der Immunofluoreszenz-Methode erhält, wobei die Zellzahl auf der Ordinate und die Fluoreszenzintensität auf der Abszisse dargestellt ist. Die Daten in Reihe (a) zeigen die Reaktivität von KM-641 mit Gangliosid GD3-positiven KHm-1/4-, IMR32-, SK-MEL-28- und WM-266-4-Zellen; die Daten in Reihe (b) zeigen die Reaktivität von KM-643, die Daten in Reihe (c) diejenige von KM-644 und die Daten in Reihe (d) diejenige von R24.
- Figur 3 zeigt die Veränderung des Tumorvolumens in Abhängigkeit von der Zeit, ausgedrückt in Tagen nach Tumortransplantation, bestimmt gemäß Beispiel 5. In Figur 3 stehen offene Kreise für die Kontrollgruppe, der AMC-462 (200 µg/Tier) verabreicht wurde, geschlossene Kreise für die Testgruppe, der KM- 641 (200 µg/Tier) ab dem Tag der Transplantation verabreicht wurde und offene Quadrate stehen für die Testgruppe, der KM-641 (200 $g/Tier) ab dem siebten Tag nach der Transplantation verabreicht wurde.
- Figur 4 zeigt die Überlebensrate von Mäusen bestimmt gemäß Beispiel 5. Die Symbole in Figur 4 haben die für Figur 3 angegebenen Bedeutungen.
- Figur 5 zeigt die Veränderung des Tumorvolumens in Abhängigkeit von der Zeit in Tagen nach Thmortransplantation bestimmt gemäß Beispiel 5. In Figur 5 stehen offene Kreise für die Kontrollgruppe, der AMC-462 (200 µg/Tier) verabreicht wurde, geschlossene Kreise für die Testgruppe, der KM-641 (200 µg/Tier) verabreicht wurde und offene Quadrate für die Testgruppe, der KM-641 (100 µg/Tier) verabreicht wurde.
- Das im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verwendende GD3-Gangliosid ist ausgewählt unter GD3-Gangliosidspezies mit einer Kohlehydratkette des Typs NeuAcα2T8NeuAcα2T3Gal NeuAcα2T8NeuGcα2T3Gal, NeuGcα2T8NeuAcα2T3Gal oder NeuGcα2T8NeuGcα2T3Gal.
- Die erfindungsgemäßen Antikörper können hergestellt werden, indem man Hybridorne präpariert indem man Splenozyten (Milzzellen) einer mit dem GD3-Gangliosid oder Krebszellen, in denen das GD3-Gangliosid exprimiert wurde, immunisierten Maus mit einer Mausmyelomzellinie fusioniert, ein Hybridom selektioniert, welches einen monoklonalen Antikörper produziert, der mit dem GD3-Gangliosid und 3',8'-LD1 reagiert, dieses Hybridom in einem Medium kultiviert oder dieses Hybridom Mäusen verabreicht, um dieses dadurch in der Aszitesflüssigkeit der Mäuse zu vermehren, und den auf dieses Weise produzierten monoklonalen Antikörper aus der Kultur oder der Aszitesflüssigkeit isoliert.
- Als typische Beispiele für ein zur Produktion eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers bef ähigtes Hybridom sind zu nennen die Hybridome KM-641, KM-643 und KM-644 welche beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science und Technology, Japan, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Japan unter den Hinterlegungsnummern FERM BP-3116, FERM BP-3117 bzw. FERM BP-3118, gemäß Budapester Vertrag seit 27. September 1990 hinterlegt sind. Die von dieses Hybridomen jeweils produzierten Antikörper werden als KM-641, KM-643 und KM-644 bezeichnet.
- Ein Verfahren zur Herstellung erf indungsgemäßer monoklonaler Antikörper wird im folgenden genauer beschrieben.
- (1) Immunisierung von Tieren und Herstellung von Antikörper produzierenden Zellen
- Mäuse in einem Alter von 3 bis 20 Wochen werden mit einem GD3-Gangliosid-Antigen immunisiert und die Antikörper-produzierenden Zellen werden aus der Milz, den Lymphknoten oder aus Peripherblut der Tiere präpariert.
- Das Immunisierungsverfahren umfaßt beispielsweise die subkutane, intravenöse oder intraperitoneale Verabreichung des GD3-Gangliosids, auf einem Träger, wie z.B. Escherichia coli oder anderen Bakterienzellen, an Tiere, die Verabreichung von Krebszellen, in welchen das GD3-Gangliosid exprirniert wurde, an Tiere in der gleichen Weise, oder die Verabreichung von GD3- Gangliosid, das zusammen mit Lipid A von Liposomen getragen wird, die aus Lipid aufgebaut sind, wie z.B. einem Phospholipid oder Cholesterol, an Tiere in gleicher Weise. Eine derartige Verabreichung erfolgt fünf- bis zehnmal in 1- bis 2-wöchigen Intervallen nach der ersten Verabreichung. Drei bis sieben Tage nach jeder Verabreichung wird Blut aus dem Venengeflecht am Fundus des Ohrs entnommen und das davon abgeleitete Serum der Blutprobe wird beispielsweise mit der unten beschriebenen Enzymimmunoassay-Technik (vgl. Monographie "Koso Meneki Sokuteiho (ELISA)", veröffentlicht von Igaku Shoin, 1976] daraufhin überprüft, ob es mit dem GD3-Gangliosid reagiert.
- Enzym-Immunoassay (ELISA):
- Eine Ethanollösung, enthaltend ein GD3-Gangliosid, ein Phospholipid und Cholesterol verteilt man in 20 µl-Portionen (20 Picomol Gangliosid pro Vertiefung) auf Vertiefungen einer 96er EIA-Platte (Flow Laboratories). Nach Lufttrocknung verteilt man auf die Vertiefungen in 100 bis 200 µl-Portionen PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung; hergestellt, indem man 1,83 g Dinatriumphosphat, 0,21 Monokaliumphosphat und 7,65 g Natriumchlorid in 1 Liter destilliertem Wasser auflöst; pH 7,2) enthaltend 1% BSA (Rinderserumalbumin) (BSA-PBS), und läßt die Platte 10 bis 30 Stunden bei 4º0 stehen, um die auf der Platte verbleibenden Proteinbindungsgruppen zu blockieren. Dann wird BSA-PBS verworfen, die Platte wird sorgfältig mit entionisiertem Wasser oder PBS gewaschen, eine Verdünnung der Probe (Mausserum, Hybridomkulturüberstand oder gereinigter monoklonaler Antikörper) in BSA-PBS wird als erster Antikörper in 100 µl- Portionen auf die Vertiefungen verteilt und man läßt die Platte 10 Stunden bei 4ºC stehen. Die Platte wäscht man einmal mit entionisiertem Wasser und dann 6-fach mit 2M Natriumchloridlösung. Anschließend gibt man eine 400-fache Verdünnung von Kaninchen-Anti-Mausimmunoglobulin-Antikörper-Peroxidase-Konjugat (Dako) als zweiten Antikörper in 100 µl-Portionen in die Vertiefungen. Die Platte läßt man bei Zimmertemperatur 2 Stunden stehen
- Nach sorgfältigem Waschen der Platten mit PBS gibt man einen ABTS-Substratlösung [hergestellt durch Lösen 550 rng 2,2'- Azinobis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) Diammoniumsalz in 1 Liter 0,1M Citratpuffer (pH 4,2) und Zugabe, unmittelbar vor der Verwendung, von Wasserstoffperoxid in einer Menge von 1 µl/ml] zu der Platte und mißt die Farbentwicklung für jeder Vertiefung über die optische Dichte bei 415nm (OD415nm).
- Für die Zellfusion werden Splenozyten hergestellt, indem man die Milz aus immunisierten Mäusen 3 bis 4 Tage nach der letzten Immunogen-Verabreichung entnimmt. Die Milz zerschneidet man in MEM (Nissui Pharmaceutical) in Stücke und lockert diese mit einern Zangenpaar auf. Nach Zentrifugation (1200 Upm, 5 Minuten) verwirft man den Überstand und behandelt das Sediment mit Tris-Ammoniumchloridpuffer (pH 7,65) über einen Zeitraum von 1 bis 2 Minuten, um Erythrozyten zu eliminieren. Die verbleibenden Zellen wäscht man dreimal mit MEM und stellt das Präparat zur Zellfusion bereit.
- Von Mäusen abgeleitete etablierte Zellinien werden als Myelomzellen verwendet. So können beispielsweise die 8-Azaguanin-resistenten Maus (BALB/c-abgeleiteten)- Myelomzellinien P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) [Current Topicas in Microbiology und Immunology, 81, 1-7 (1978)] [European J. Immunology. 6, 511-519 (1976)], Sp2/0-Ag14 (SP-2) (Nature, 276, 269-270 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) (J. Immunology, 123, 1548-1550 (1989)] und P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495-497 (1975)] verwendet werden. Diese Zellinien werden in einem 8-Azaguaninmedium [hergestellt durch Ergänzung von RPMI-1640-Medium mit Glutamin (1,5 mM), 2- Mercaptoethanol (5 × 10&supmin;&sup5; M), Gentamicin (10 µg/ml) und fetalem Kälberserum (FCS) (CSL; 10%) und weiterer Supplementierung des resultierenden Normalmediums mit 8-Azaguanin (15 mg/ml)] subkultiviert. Drei bis vier Tage vor der Zellfusion wird die Subkultivierung in Normalmedium durchgeführt, um dadurch eine Zellzahl von nicht weniger 2 × 10&sup7; Zellen am Tag der Zellfusion herzustellen.
- Die Antikörper-produzierenden Zellen, die wie unter (1) beschrieben erhalten wurden, und die Myelomzellen, die wie unter (2) beschrieben erhalten wurden, werden jeweils sorgfältig mit MEM-Medium oder PBS gewaschen und in einem Verhältnis von 5 bis 10 Antikörper-produzierenden Zellen pro Myelomzelle gemischt. Das Gemisch wird zentrifugiert (1200 Upm, 5 Minuten). Der Überstand wird verworfen und das Sediment (Zellen) wird aufgelockert. Zu den Zellen gibt man 2 g Polyethylenglycol-1000 (PEG-1000) und ein Gemisch von 2 ml MEM und 0,7 ml Dimethylsulfoxid in einer Menge von 0,2 bis 1 ml/10³ Antikörper-produzierenden Zellen bei 37ºC unter Rühren. Mehrere 1 bis 2 ml-Portionen MEM gibt man in 1- bis 2-minütigen Intervallen hinzu und stellt dann das Gesamtvolumen durch weitere Zugabe von MEM auf 50 ml ein. Nach Zentrifugation (900 Upm, 5 Minuten) verwirft man den Überstand und lockert die Zellen vorsichtig auf. Zu den Zellen gibt man 100 ml Normalmedium (RPMI-1640-Medium, enthaltend 10% FCS) und suspendiert die Zellen in dem Medium durch vorsichtiges Aufziehen in und Auslaufen aus einer Meßpipette.
- Diese Suspension verteilt man in 100 µl-Portionen in die Vertiefungen einer 96er Inkubationsplatte und führt die Inkubation in einem Inkubator (5% CO&sub2;) 24 Stunden bei 37ºC durch. HAT- Medium [hergestellt, indem man Normalmedium mit Hypoxanthin (10&supmin;&sup4; M), Thymidin (1,5 × 10&supmin;&sup5; M) und Aminopterin (4 × 10&supmin;&sup7; M) supplementiert] gibt man zu der Inkubationsplatte in einer Menge von 100 µl/Vertiefung hinzu und inkubiert weitere 24 Stunden. Anschließend verwirft man in 24-stündigen Intervallen über 2 Tage 100 µl des Kulturüberstandes und gibt das gleiche Volumen frisches HAT-Medium hinzu. Die Inkubation wird 10 bis 14 Tage in Gegenwart von 5% CO&sub2; bei 37ºC fortgesetzt.
- Aus denjenigen Vertiefungen, in denen fusionierte Zellen wuchsen und Kolonien bildeten, wird der Überstand (100 µl) verworfen und statt dessen wird das gleiche Volumen HT-Medium (HAT-Medium ohne Aminopterin) zugesetzt. Der Mediumaustausch mit frischem HT-Medium wird in 24-stündigen Intervallen 2 Tage durchgeführt.
- Nach 3- bis 4-tägiger Kultivierung in HT-Medium wird ein Teil des Kulturüberstandes aus jeder Vertiefung entnommen und der Antikörpertiter gegen Gangliosid GD3 wird mit oben beschriebenem Enzymimmunoassay oder durch immunohistologische Bewertung (ABC-Methode) [vgl. Monographie "Koso Kotai Ho (Enzyme-labeled Antibody Techniques)", S. 100, Hrsg. Gakusai Kikaku, 1985] bestimmt. Gleichzeitig wird die Reaktivität mit den anderen Gangliosiden, wie z.B. GM3, mit der gleichen Methode getestet. Vertiefungen, die eine spezifische Reaktivitat mit dem Gangliosid GD3 zeigen, werden selektiert und für Vertiefungen, die eine starke Reaktivität mit Gangliosid GD3 und keine Reaktivität mit anderen Gangliosiden, wie z.B. GM3, zeigen, wird die Klonierung zweimal mit der limitierenden Verdünnungstechnik wiederholt. Aus diesem Weg werden Klone mit stabil hohem Antikörpertiter gegen Gangliosid GD3 als monoklonale Anti-Gangliosid GD3-Antikörper-produzierende Hybridomzellinien selektiert.
- Eine Hybridomzellinie, welche monoklonale Anti-Gangliosid GD3-Antikörper produziert, die wie oben unter (3) beschrieben erhalten wurde, wird in RPMI-1640-Medium kultiviert, das mit 10% FCS ergänzt ist, oder in serumfreiem RPMI-1640-Medium, bis die Zellen konfluent werden. Dann wird der Kulturüberstand isoliert. Diesen Überstand stellt man mit Natriumhydroxid auf pH 8,9 ein und behandelt zur Antikörper-Adsorption mit Protein A- Sepharose 4B (Pharmacia) entweder chromatographisch oder batchweise. Im ersten Fall wird der Kulturüberstand mit eingestelltem pH-Wert auf eine Säule aufgetragen, die mit Protein A-Sepharose 4B bepackt ist. Bei batchweiser Behandlung wird Protein A-Sepharose 4B dem Kulturüberstand zugesetzt und das resultierende Gel wird in eine Säule gepackt. In beiden Fällen wird die Säule mit Bindungspuffer (1,5 M Glycin, 3 M Natriumchlorid, pH 8,9) gewaschen und die Elution wird unter Verwendung eines Elutionspuffers (0,1 M Zitronensäure, pH 4,0) durchgeführt. IgG- Fraktionen werden vereinigt, auf pH 7-8 mit Natriumhydroxid eingestellt und gegen 2 M Natriumchlorid-PBS dialysiert, wodurch man einen gereinigten monoklonalen Antikörper erhält.
- Die Nebenklasse des Antikörpers kann unter Verwendung eines Typisierungs-Kits für monoklonale Mausantik"rper (Zymed Laboratories) bestimmt werden.
- Die Proteinmenge kann mit Hilfe der Folin-Methode bestimmt werden, gefolgt von einer Berechnung basierend auf der optischen Dichte bei 280 nm [1,0 (OD&sub2;&sub8;&sub0;) entspricht etwa 1 mg Immunglobulin pro ml].
- Die erfindungsgemäßen monoklonalen Anti-Gangliosid GD3- Antikörper gemäß vorliegender Erfindung besitzen hohe reaktive Spezifität und sind deshalb, z.B. für die Detektion und Analyse von GD3-Gangliosiden brauchbar. Darüber hinaus besitzen die monoklonalen Antikörper selbst Komplement-abhängige zytotoxische Aktivität (CDC Aktivität) und Antikörper-abhängige zellvermittelte zytotoxische Aktivität (ADCC Aktivität) und besitzen wahrscheinlich Antitumor-Effekte, z.B. zytozidische Effekte, auf Tumorzellen, welche die Ganglioside GD3 und 3',8'-LD1 exprimieren, indem sie an diese Zellen binden, ohne normale Zellen zu beeinträchtigen.
- Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Veranschauhchung der vorliegenden Erfindung
- Eine Lösung von 5 µg eines GD3-Gangliosides (Iatron Laboratories) mit der Kohlehydratkette NeuAcα2T8NeuAcα2T3Gal) am nichtreduzierenden Ende, 0,5 µmol Dipalmitoylphosphatidylcholin (Sigma), 0,5 µmol Cholesterol (Nakalai Tesque) 0,05 µmol Dipalmitoylphosphatidsäure (Sigma) und 0,5 µg Lipid A (Funakoshi Yakuhin) in 30 ml eines 2:1 Gemisches von Chloroform und Methanol erwärmt man auf 45ºC. wodurch das Lösungsmittel unter Bildung eines dünnen, einheitlichen Lipidfilms entfernt wird. Außerdem erfolgt Absaugen über einen Zeitraum von 1 Stunde mit einer Vakuumpumpe, um eine vollständige Entfernung des Lösungsmittels zu erreichen. Anschließend gibt man 0,5 ml PBS hinzu, gefolgt von Rühren bei 45ºC, wobei man eine Antigenlösung erhält.
- Mäuse immunisiert man, indem man 0,5 ml der Antigenlösung, die wie oben unter (1) beschrieben hergestellt wurde, einmal wöchentlich über einen Zeitraum von 7 Wochen in die Kaudalvene verabreicht. Zur weiteren Immunisierung werden GD3-Gangliosidpositive SK-MEL-28 (ATCC HTB72)-Zellen (1 × 10&sup7; Zellen) einmal wöchentlich über einen Zeitraum von 3 Wochen intraperitoneal verabreicht. Am dritten Tag nach der letzten Verabreichung werden Splenozyten aus jeder Maus präpariert und zur Zellfusion bereitgestellt.
- Die 8-Azaguanin-resistente Mausmyelomzellinie P3-U1 kultiviert man in Normalmedium, wobei man nicht weniger als 2 × 10&sup7; Zellen für die Zellfusion erhält, und man diese als Elternstamm für die Zeilfusion verwendet.
- Die wie oben unter (2) und (3) beschrieben erhaltenen Milzzellen und Myelomzellen werden in einem Verhältnis von 10:1 eingesetzt und entsprechend den oben beschriebenen Prozeduren der Fusion unterzogen. Die Kultivierung wurde in HAT-Medium über einen Zeitraum von 14 Tagen bei 37ºC in Gegenwart von 5% CO&sub2; durchgeführt. Anschließend wurden die fusionierten Zellen selektiert. Nach Mediumwechsel zum HT-Medium wurde die Kultivierung fortgesetzt. Anschließend wurden aktive Vertiefungen durch Bestimmung des Antikörpertiters gegen Gangliosid GD3 selektiert und nach Mediumwechsel zu Normalmedium wurde die Klonierung zweimal wiederholt. Die spezifisch mit Gangliosid GD3 reaktiven Hybridome wurden mit Hilfe des Enzymimmunoassays oder durch immunohistologische Bewertung (ABC-Methode) selektiert. Hierzu wurden 2 ng Gangliosid GM3 [gereinigt aus Hundeerythrozyten mit Hilfe des Verfahrens von Nor et al. J. Immunol., 139, 3171 (1987)] oder 2 ng Gangliosid GD3 (latron) in 2 ml Ethanol, enthaltend 5 ng Phosphatidylcholin (Sigma) und 2,5 ng Cholesterol (Sigma), gelöst. Die resultierende Lösung wurde in 20 µl-Portionen in die Vertiefungen von 96er Mikrotiterplatten (Flow Laboratories) verteilt. Nach Lufttrocknen, erfolgte eine Blockierung mit 1% BSA-PBS. Der Hybridomkultur-Überstand wurde in 50 µl-Portionen auf die Vertiefungen von Platten verteilt, welche das Gangliosid GD3 in absorbierter Form enthielten, sowie auf Vertiefungen von Platten verteilt, welche das Gangliosid GM3 in absorbierter Form enthielten. Anschließend wurde die Reaktion über 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt.
- Anschließend wurden die aus Cancer Res., 46, 4438 (1986) bekannte Reaktionsprozedur befolgt und es wurden diejenigen Hybridomstämme, welche monoklonale Mausantikörper produzierten, die spezifische Reaktivität gegenüber GD3-Gangliosid, nicht jedoch gegenüber GM3-Gangliosid zeigten, selektiert.
- Diese monoklonale Mausantikörper werden im folgenden als monoklonale Mausantikörper KM-641, KM-643 und KM-644 bezeichnet.
- Bromcyan-aktivierten Sepharose-4B (Pharmacia) (trockenes Pulver, 15 g) ließ man in 100 ml 1 mM Salzsäure 15 Minuten quellen. Sie wurde anschließend mit 3 l 1 mM Salzsäure gewaschen. Das aus diese Weise erhaltene Gel wurde mit 75 ml Bindungspuffer [0,5 M Natriumchlorid, 0,1 M Natriumhydrogencarbonat, pH 8,3] gewaschen, wobei man eine Gelsuspension erhielt.
- Eine Lösung von 500 mg Protein A (Pharmacia) in dem gleichen Bindungspuffer wie oben erwähnt, den man im voraus hergestellt hatte, wurde schnell mit der oben erwähnten Gelsuspension vermischt. Anschließend wurde das Gemisch vorsichtig bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Nach dem Rühren wurde das Gel mit 200 ml Blockierungsreagenz (0,2 M Glycin, pH 8,0) bei Zimmertemperatur 2 Stunden zur Blockierung der verbleibenden aktiven Gruppen umgesetzt. Zur Entfernung des adsorbierten Teils an überschüssigem Protein wurde das Gel abwechselnd mit fünf 100 ml-Portionen 0,5 M Natriumchlorid- 0,1 M Essigsäurepuffer (pH 4,0) und fünf 100 ml-Portionen 0,5 M Natriumchlorid-Bindungspuffer gewaschen, wobei man 50 ml Protein A-Sepharose 48 (Gel) erhielt.
- Die Hybridome KM-641, KM-643 und KM-644 wurden jeweils bei 37ºC in einem serumf reien Medium (jeweils 1 Liter Medium, enthalten 10,4 g RPMI-1640 (Nissui Pharmaceutical), 20 ml 7,5 %iges Natriumhydrogencarbonat, 10 mM N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N -2-ethansulfonsäure (Hepes), 0,29 g Glutamin, 3 mg Insulin (Sigma), 5 µLg Transferrin (Sigma), 15 mM Natriumpyruvat, 125 nM Natriumselenit, 1 g Galaktose und 0,1% Pepol B-188 (Toho Chiba Chemical) kultiviert. Nach Erreichen des konfluenten Zustandes wurde der jeweilige Kulturüberstand isoliert und bei -20ºC eingefroren aufbewahrt.
- Die in eingefrorenem Zustand aufbewahrten Kulturüberstände (60 l KM-641, 18 l KM-643 und 33 l KM-644) wurden jeweils aufgetaut, auf pH 8,9 mit Natriumhydroxid eingestellt und mit Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Nakalai Tesque) und Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz (EDTA, Wako Pure Chemical) in Endkonzentrationen von 0,1 mM bzw. 5 mM supplementiert. Nach sorgfältigem Mischen wurde das jeweilige Gemisch zur Entfernung von Zellfragmenten filtriert. Zu jedem der auf diese Weise behandelten Kulturüberstände gab man 40 ml des wie oben unter (a) beschrieben hergestellten Protein A-Sepharose 4B-Gels und rührte das Gemisch 12 bis 20 Stunden bei 4ºC. Das Gel wurde von jedem der Kulturüberstände abgetrennt, in eine Säule gepackt und mit 600 ml Bindungspuffer (1,5 M Glycin, 3 M Natriumchlorid, pH 8,9) gewaschen. Die Elution erfolgte dann mit 200 ml Elutions puffer (0,1 M Zitronensäure, pH 4,0). Das Eluat wurde in 10 ml- Portionen fraktioniert und die IGG-Fraktionen wurden durch Bestimmung der optischen Dichte bei 280 nm (OD280 nm) identifiziert. Die IgG-Fraktionen wurden vereinigt, auf pH 7 bis 8 mit Natriumhydroxid eingestellt und gegen 2 M Natriumhydrochlorid in PBS dialysiert, wobei man einen gereinigten Antikörper erhielt.
- Mit Hilfe eines ELISA unter Verwendung eines Typisierungskits für monoklonale Mausantikörper (Zymed) wurde gezeigt, dass die monoklonalen Mausantikörper KM-641, KM-643 und KM-644 der Nebenklasse IgG 3 zuzuordnen sind.
- Die Ganglioside, die als Standards bei der Bestimmung der Reaktionsspezifität von KM-641, KM-643 und KM-644 verwendet wurden, nämlich die N-Acetylgalactosamine (GalNAc)GM1b, GD1a, GD1b und GT1b, waren Typ V-Ganglioside&sub1; bezogen von Sigma Chemical, und das Gangliosid GD3 sowie N-Acetyl-GM2 wurden von Iatron Laboratories bezogen. Die Ganglioside GM3, GM1, N-Glycolyl-GM2 und GD2 wurden aus Hundeerythrozyten, Rinderhirn, Mausleber bzw. der kultivierten Zellinie IMR32 (ATCC CCL127) im wesentlichen wie in der Literatur beschrieben [Journal of Biological Chemistry, 263, 10915, 2079 (1988)] hergestellt.
- Die Antikörper KM-641, KM-643 und KM-644 wurden mit Hilfe der TLC (Dünnschichtchromatographie), durch Immunfärbung und mit Hilfe des Enzymimmunoassays, wie im folgenden beschrieben auf Spezifität getestet.
- Die TLC-Immunfärbung wurde mit Hilfe der TLC-Resorcinol (Merck)-Färbemethode im wesentlichen wie in der Literatur beschrieben [J. Biol. Chem., 257, 14365 (1982)] durchgeführt. Hierzu wurden die Ganglioside GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, Ga1NAcGM1b, 3',8'-LD1 und GT1b auf HPTLC-Platten (Whatman) getüpfelt und unter Verwendung eines Entwicklersystems aus Chloroform-Methanol-0,25%-igem wässrigem Calciumchlorid (50:40:10) entwickelt. Die Platten wurden in eine 0,5%-ige Lösung von Poly(isobutylmethacrylat) (Aldrich) in Ethanol getaucht und nach dem Trocknen mit 1% BSA-PBS zur Blockierung 1 Stunde behandelt. Anschließend wurden KM-641, KM-643 und KM-644 jeweils als erster Antikorper in Form einer 10 µg/ml Lösung in 1% BSA-PBS verwendet und die Inkubation wurde bei Zimmertemperatur 18 Stunden durchgeführt. Nach dem Waschen der Platten mit PBS wurde biotinylierter Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper (Dako) als zweiter Antikörper zugesetzt und 1 Stunde inkubiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Platten mit Avidin-Peroxidase (Dako) 1 Stunde behandelt, gefolgt von einer Farbentwicklung mit dem HRP- Farbentwicklungsreagenz von Bio-Rad.
- KM-641 und KM-644 reagierten mit GD3 und 3',8'-LD1 und KM- 643 reagierte mit GD3, 3',8'-LD1, GD1b und GT1b.
- Die Ganglioside N-Acetyl-GM3, N-Glycolyl-GM3, N-Acetyl- GM2, N-Glycolyl-GM2, GM1, GD3, GD1la, GD2, GD1b, GT1b und GQ1b wurden als Antigene verwendet. Man ließ sie in den entsprechenden Vertiefungen von 96er EIA-Platten (Flow Laboratories) adsorbieren und deren Reaktivität mit KM-641D KM-643 und KM-644 wurde mit Hilfe der oben erwähnten ELISA-Technik bestimmt.
- Phosphatidylcholin und Cholesterin wurden als Kontrollen verwendet. Methanollösungen, welche diese Verbindungen enthielten, wurden in 20 µl-Portionen auf Vertiefungen der EIA-Platten verteilt. Anschließend wurde die gleiche Prozedur wie oben beschrieben befolgt und optische Dichtemessungen wurden durchgeführt. Die auf diese Weise mit KM-641 erhaltenen Resultate sind in Tabelle 1 gezeigt. KM-641 reagiert stark mit dem Gangliosid GD3. Tabelle 1
- KM-643 und KM-644 wurden auf Reaktivität mit verschiedenen Gangliosiden in gleicher Weise wie oben erwähnt getestet.
- Die Kontrollversuche wurden in gleicher Weise wie oben beschrieben, gefolgt von einer Messung der optischen Dichte, durchgeführt.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 2 Tabelle 3
- Reaktivitätsuntersuchung von KM-641, KM-643 und KM-644 mit der Fluoreszenz-Antikörpertechnik
- Die kultivierten menschlichen malignen Melanomzellinien SK-MEL-28 (ATCC HTB 72), WM266-4 (ATCC CRL1676) und KHM-1/4 [J. Natl. Cancer Inst., 59, 775 (1977)] und die kultivierte menschliche Neuroblastomzellinie IMR32 (ATCC CCLK127) wurden verwendet. Für jede Zellinie wurden 1 × 10&sup6; Zellen in ein Mikroröhrchen (Treff) plaziert und durch Zentrifugation (1200 Upm, 5 Minuten) mit PBS gewaschen. 50 µl KM-641, KM-643 oder KM-644 (10 µl/ml) wurden zugesetzt und nach Rühren wurde 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal durch Zentrifugation (1200 Upm, 5 Minuten) mit PBS gewaschen, dann wurden 20 µl Fluoresceinisothiocyanat-markierter Maus-IgG-Antikörper und IgM-Antikörper (Cappel Laboratories, 20-fach verdünnt) zugesetzt und nach Rühren wurde das Gemisch 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Danach wurden die Zellen dreimal durch Zentrifugation (1200 Upm, 5 Minuten) mit PBS gewaschen, in PBS suspendiert und unter Verwendung des Nippon Bunko Modell FCS-1 Flusszellsorters einer Analyse unterzogen.
- Zusätzlich wurde der Anti-Gangliosid GD3-Antikörper R24 (MEL-1, Signet) der Nebenklasse IgG3 an Stelle von KM-641, KM- 643 oder KM-644 verwendet und die Analyse wurde wie oben be schrieben durchgeführt.
- Kontrollversuche ohne Zugabe von KM-641, KM-643 oder KM- 644 wurden mit dem oben beschriebenen Analyseverfahren durchgeführt.
- Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 1 und in Figur 2 zusammengefaßt. Die Fluoreszenzintensitätspeaks für KM-641, KM-643 und KM-644 zeigten eine Rechtsverschiebung (erhöhte Fluoreszenzintensität) verglichen mit den Kontrollwerten, was darauf hinweist, dass diese Antikörper direkt mit Glycolipidkohlehydratketten reagierten, die auf der Oberfläche verschiedener Zellen exprimiert werden. Die Reaktivität differierte in gewissem Umfang zwischen des Antikörpern. KM-641, KM- 643 und KM-644 zeigten eine stärkere Reaktivität als der Anti- Gangliosid GD3-Antikörper R24.
- Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC)
- (a) Herstellung von Target-Zellen
- Suspensionen der Target-Zellen, nämlich der Gangliosid GD3-positiven G361-Zellen (JCRB) und SK-MEL-28-Zellen, in RPMI- 1640 Medium, supplementiert mit 10% FCS, wurden jeweils auf eine Zellkonzentration von 1 × 10&sup7; Zellen/ml eingestellt. Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; wurde in einer Konzentration von 100 µCi/1 × 10&sup7; Zellen zugesetzt, eine Inkubation wurde 1 Stunde bei 37ºC durchgeführt und anschließend wurden die Zellen dreimal mit dem Medium gewaschen. Die Zellen ließ man 30 Minuten bei 40C in dem Medium zur spontanen Dissoziation stehen und führte dann eine Zentrifugation (1200 Upm, 5 Minuten) durch. Dann wurde Medium zugesetzt, um die Zellkonzentration auf 4 × 10&sup6; Zellen/ml einzustellen.
- Zu einer wässrigen Lösung lyophilisierten Kaninchen-Komplements (Cedarlane Laboratories) gab man 2 × 10&sup7; Target-Zellen, welche wie oben unter (a) beschrieben hergestellt wurden. Die Inkubation führte man 30 Minuten bei 4ºC durch. Der Überstand wurde zentrifugiert (1200 Upm, 5 Minuten). 2 × 10&sup7; Target-Zellen wurden erneut zugesetzt und die Inkubation wurde in gleicher Weise wie oben beschrieben durchgeführt. Dann gab man die Suspension über einen Filter, um Zellen zu entfernen. Das Filtrat wurde als Komplementlösung verwendet.
- KM-641, KM-643 oder KM-644 wurde in einer Endkonzentration im Bereich von 0,05 µg/ml bis 50 µg/ml zu 96er Platten mit U- förmigen Boden gegeben. In jede Vertiefung gab man 2 × 10&sup5; Target-Zellen. Die Inkubation wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Überstände wurden durch Zentrifugation (1200 Upm, 5 Minuten) entfernt. Die Komplementlösung, die wie oben unter (b) beschrieben hergestellt wurde, wurde in 50 µl-Portionen zugegeben und die Inkubation wurde 1 Stunde bei 37ºC durchgeführt. Nach Zentrifugation (1200 Upm, 5 Minuten) wurde die Menge an ³¹Cr in jedem Überstand mit Hilfe eines Gamma-Zählers bestimmt. Die Menge an &sup5;¹CR, die aus der spontanen Dissoziation resultiert, wurde bestimmt, indem man zu Target-Zellen Medium ohne Antikörper und Komplementlösung zugab und die Menge an &sup5;¹Cr im Überstand in gleicher Weise wie oben beschrieben bestimmte. Die Gesamtmenge an freiem &sup5;¹Cr wurde durch Zugabe von 5 N Natriumhydroxid an Stelle er Komplementlösung, Behandlung wie oben beschrieben und Bestimmung der &sup5;¹Cr-Menge im Überstand bestimmt.
- Die CDC-Aktivität wurde wie folgt berechnet:
- CDC-Aktivität (%) = Menge an &sup5;¹Cr im Probenüberstand - Menge an &sup5;¹Cr resultierend aus der spontanen Dissoziation / Geamtmenge an freiem &sup5;¹Cr - Menge an &sup5;¹Cr resultierend aus der spontanen Dissoziation × 100
- Als Kontrolle wurde Medium an Stelle der Komplementlösung verwendet, wobei oben beschriebene Prozedur angewendet wurde und die &sup5;¹Cr-Menge des Kontrollwertes für die CDC-Aktivitätsberechnung bestimmt wurde.
- Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. KM-641, KM-643 und KM-644 zeigten eine starke Zytotoxizität gegenüber den GD3-positiven Zellen G361 und SK-MEL- 28. Tabelle 4
- Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC)
- Suspensionen der Target-Zellen SK-MEL-28 und G361 in RPMI- 1640-Medium, supplementiert mit 10% FCS, wurden jeweils auf eine Zellkonzentration von 1 × 10&sup6; Zellen/0,5 ml eingestellt. Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; wurde in einer Konzentration von 50 µCi/1 × 10&sup6; Zellen zugesetzt. Die Inkubation wurde 1 Stunde bei 37ºC durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit Medium gewaschen. Die Zellen ließ man anschließend in Medium 30 Minuten bei 4ºC zur spontanen Dissoziation stehen. Anschließend wurden sie durch Zentrifugation (1200 Upm, 5 Minuten) abgetrennt und auf 2 × 10&sup5; Zellen/ml durch Zugabe von Medium eingestellt.
- Menschliches venöses Blut (50 ml) wurde gesammelt, 0,5 ml Heparin-Natrium (Takeda Chemical Industries, 1000 U/ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde vorsichtig gerührt. Anschließend erfolgte eine Zentrifugation (1500 bis 1800 g, 15 Minuten) unter Verwendung einer Leuko-PREP (Becton Dickinson Japan). Die Zellschicht wurde abgetrennt und die Zellen wurden dreimal durch Zentrifugation (1500 bis 1800 g, 15 Minuten) mit RPMI- 1640 Medium gewaschen und in RPMI-1640 Medium, supplementiert mit 10% FCS (5 × 10&sup6; Zellen/ml) zur Verwendung als Effektorzellen (Lymphozyten) suspendiert.
- KM-641, KM-643 oder KM-644 gab man in 50 ml-Portionen in Endkonzentrationen von 0,05 µg/ml bis 50 µg/ml zu 96er Platten mit U-förmigem Boden. In jede Vertiefung gab man 1 × 10&sup4; Target- Zellen (50 µg) und 5 × 10&sup5; Effektorzellen (100 µl). Die Inkubation wurde 4 Stunden bei 37ºC durchgeführt, gefolgt von einer Zentrifugation (1200 Upm, 5 Minuten). Die Menge an &sup5;¹Cr in Überstand wurde unter Verwendung eines Gamma-Zählers bestimmt. Die Menge an &sup5;¹Cr, die aus der spontanen Dissoziation resultierte, wurde bestimmt, indem man an Stelle des Antikörpers und der Effektorzellen Medium zu den Target-Zellen gab und die Menge an &sup5;¹Cr im Überstand in der gleichen Weise wie oben beschrieben bestimmte. Die Gesamtmenge an freiem &sup5;¹Cr bestimmte man durch Zugabe von 5 N Natriumhydroxid an Stelle des Antikörpers und der Effektorzellen, Behandlung wie oben beschrieben und Bestimurung der Menge an &sup5;¹Cr im überstand
- Die ADCC-Aktivität wurde wie folgt berechnet:
- ADCC-Aktivität (%) =
- Menge an &sup5;¹Cr im Probenüberstand - Menge an &sup5;¹Cr resultierend aus der spontanen Dissoziation / Geamtmenge an freiem &sup5;¹Cr - Menge an &sup5;¹Cr resultierendaus der spontanen Dissoziation
- Als Kontrolle wurde Medium an Stelle der Effektorzellen zugesetzt, das Verfahren wurde wie oben beschrieben durchgeführt und die Menge an &sup5;¹Cr im Kontrollüberstand wurde für die ADCC-Aktivitätsberechnung bestimmt.
- Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. KM- 641, KM-643 und KM-644 zeigten eine zelivermittelte Zytotoxizität gegenüber den Gangliosid GD3-positiven Zellen SK-MEL-28 und G361 in Abhängigkeit von der Antikörperkonzentration. Tabelle 5
- Menschliche Melanomzellen C24.22 (2 × 10&sup7; Zellen) wurden intrakutan auf abdominale Bereiche von Balb/c nu/nu Mäusen (7 Tiere/Gruppe) transplantiert. Der monoklonale Antikörper KM-641 (200 µg/Tier) wurde, beginnend mit dem Tag der Transplantation der Tumorzellen (im folgenden als Testgruppe A bezeichnet) oder ab dem siebten Tag nach der Transplantation (im folgenden Testgruppe B bezeichnet) den Mäusen intravenös verabreicht. Den Mäusen der Kontrollgruppe wurde der monoklonale Anti-Sialyl-Lea Antikörper AMC-462 (ECACC 86050801) in gleicher Weise wie oben beschrieben verabreicht. Der therapeutische Effekt auf transplantierte Tumorzellen wurde bestimmt über die Überlebenszeit der Mäuse in Tagen und der Turnorgröße (Volumen), berechnet nach folgender Gleichung:
- Tumorgröße (mm³) = 0,4 × a × b²
- a: Hauptachse
- b: Nebenachse
- Die Ergebnisse sind in Figur 3 und Figur 4 gezeigt.
- Ein dosisabhängiger Effekt wurde aus den Ergebnissen bestimmt, die man durch Verabreichung von AMC-462 an Mäuse der Kontrollgruppe bei einer Dosis von 200 µg/Tier ab dem Tag der Transplantation und durch Verabreichung von KM-641 an Mäuse der Testgruppe bei einer Dosis von 200 µg/Tier oder 100 µg/Tier erhielt. Die Ergebnisse sind in Figur 5 gezeigt.
- Wie in Figur 3 und in Figur 4 gezeigt, ist ein deutliches Tumorwachstum in der Kontrollgruppe zu beobachten, während in der Testgruppe A das Tumorwachstum signifikant unterdrückt und die Überlebenszeit in Tagen verlängert wurde. In der Testgruppe B wurde das Tumorwachstum im Vergleich zur Kontrollgruppe si gnifikant unterdrückt, obwohl keine Verlängerung der Lebenszeit beobachtet wurde. Die Anzahl der Mäuse in denen Tumorzellen 100 Tage nach der Transplantation entnommen wurde, betrug sieben Tiere von sieben Tieren in der Kontrollgruppe, sieben Tiere von sieben Tieren in der Testgruppe B und vier Tiere von sieben Tieren in der Testgruppe A.
- Wie in Figur 5 gezeigt, konnte eine Dosis von 100 µg KM- 641/Tier das Tumorwachstum wirksam unterdrücken, ebenso eine Dosis von 200 µg/Tier.
- Wie oben ausführlich beschrieben, werden erfindungsgemäß monoklonale Antikörper der Klasse IgG bereitgestellt, welche mit den Gangliosiden GD3 und 3',8'-LD1 reagieren und zur Behandlung von neuroektodermalen Karzinomen brauchbar sind. 58/194
Claims (12)
1. Monoklonaler Antikörper, der der Subkiasse IgG3 angehört
und gleichzeitig gegenüber GD3-Gangliosid und 3',8'-LD1
reaktiv ist.
2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, wobei das GD3-
Gangliosid ausgewählt ist unter GD3-Gangliosiden, die die
Kohl enhydratkette
NeuAcα2T8NeuAcα2T3Gal, NeuAcα2T8NeuGcα2T3Gal,
NeuGcα2T8NeuAcα2T3Gal oder NeuGcα2T8NeuGcα2T3Gal
aufweisen.
3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, produziert von
Hybridom KM-641 (FERN BP-3116), KM-643 (FERN BP-3117) oder
KM-644 (FERN BP-3118).
4. Hybridom, das befähigt ist, einen der Subkiasse IgG3
angehörenden und gleichzeitig gegenüber GD3-Gangliosid und
3',8'-LD1 reaktiven Antikörper zu produzieren.
5. Hybridou nach Anspruch 4, wobei das Hybridom ausgewählt
ist unter den Hybridomen KM-641 (FERN BP-3116), KM-643
(FERN BP-3117) und KN-644 (FERN BP-3118).
6. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der
Anspruche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikamentes zur
Diagnose und/oder. Behandlung eines neuroectodermalen
Tumors.
7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei der behandelte Tumor ein
menschliches Melanom ist.
8. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der
Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikamentes zur
Verringerung der Größe eines neuroectodermalen Tumors.
9. Verwendung nach Anspruch 6, wobei der behandelte Tumor ein
menschliches Melanom ist.
10. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gemäß
einem der Ansprüche 1 bis 3, das folgende Schritte
umfasst:
a) Fusionieren der Splenozyten einer mit dem
GD3-Gangliosid oder mit Krebszellen, in denen das
GD3-Gangliosid exprimiert worden ist, immunisierten Maus und
einer geeigneten Maus-Myeloin-Zellinie,
b) Selektieren eines Hybridoms, das einen monoklonalen
Antikörper produziert, der gegenüber dem
GD3-Gangliosid und 3',8'-LD1 reaktiv ist,
c) Kultivieren des Hybridoms oder Verabreichung des
Hybridoms an Mäuse, um dieses in der Ascitesflüssigkeit
der Mäuse zu züchten, und
d) Isolierung des so produzierten monoklonalen
Antikörpers aus der Kultur oder aus der Ascitesflüssigkeit.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge
wenigstens eines monoklonalen Antikörpers gemäß einem der
Anspruche 1 bis 3, gegebenenfalls zusammen mit einem
pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Adjuvans, enthält.
12. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, wobei man eine wirksame Menge
wenigstens eines monoklonalen Antikörpers gemäß einem der
Anspruche 1 bis 3 in einer zur Verabreichung geeigneten
Form, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch
akzeptablen Träger oder Adjuvans, bereitstellt.
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