DE3881344T2 - In beta-stellung n-acetylneuraminsaeure identifizierungsfaehige monoklonale antikoerper. - Google Patents
In beta-stellung n-acetylneuraminsaeure identifizierungsfaehige monoklonale antikoerper.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Hybridom, ein Verfahren zur Schaffung desselben, sowie auf monoklonale, für N-Acetylneuraminsäure in der β-Anordnung spezifische Antikörper, die durch das Hybridom hergestellt werden.
- 1975 entwickelten Köhler und Millstein ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper unter Verwendung eines Hybridoms, das es ermöglicht, fast fortwährend einen solchen Antikörper mit gleichmäßiger Spezifität und sonstigen Charakteristika herzustellen. Vor dieser Zeit wurde erkannt, daß gewöhnliche, durch Immunisierung eines Tieres mit einem Antigen einschließlich Tumorzellen hergestellte Antiseren unterschiedliche Antikörper enthalten, die sich in ihrer Spezifität und ihren charakteristischen Eigenschaften voneinander unterscheiden. Das Verfahren von Köhler et al erfordert die Verschmelzung von Milzzellen eines immunisierten Tieres mit einer unsterblichen Myelomzell-Linie und das Auslesen von durch die Zellverschmelzung geschaffenen Hybridomen für die gewünschte Antikörperherstellung, d.h. die Wahl eines Klons, der einen Antikörper mit einer gewünschten Spezifität aus so erzeugten verschmolzenen und als "Hybridom" bezeichneten Zellen herstellen oder absondern kann. Ein solcher Klon kann fortlaufend einen ihm zugehörenden Antikörper herstellen. Das geklonte Hybridom kann fortwährend kultiviert werden, und es kann andererseits im gefrorenen Zustand in Flüssigstickstoff aufbewahrt werden. Somit kann die gleichbleibende Bereitstellung individueller Antikörper sichergestellt werden.
- Antikörper sind Proteine, die fähig sind, spezifisch andere, als Antigene bekannte Moleküle oder Substanzen zu erkennen, und die auch fähig sind, sich mit diesen zu verbinden. Ein monoklonaler Antikörper ist natürlich ein Antikörper, aber seine charakteristischen Eigenschaften sind sehr einheitlich, und er erkennt nur ein Antigen oder eine antigene Determinante. Unterschiedliche Hybridome werden durch Zellverschmelzungstechnik geschaffen, aber nicht alle der durch Verschmelzung gebildeten geklonten Hybridome, zum Beispiel Myelomzellen mit von einem immunisierten Tier stammenden, Antikörper herstellenden Zellen, sind spezifisch für ein gewünschtes Antigen. Weil mittels verschiedener geklonter Hybridome hergestelle Antikörper mit verschiedenen antigenen Determinanten an demselben Molekül reagieren können, ist darüber hinaus ein mittels eines spezifischen geklonten Hybridoms hergestellter Antikörper unterschiedlich zu denjenigen, die mittels anderer Klone hergestellt wurden, selbst wenn sie spezifisch in bezug auf ein gewünschtes Antigen sind. Deshalb ist es unmöglich, die spezifische Stelle eines antigenen Moleküls, die von jedem einzelnen monoklonalen Antikörper erkannt werden kann, genau vorauszusagen. Heutzutage sind im Stand der Technik unterschiedliche Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper sowie solche zur Erzeugung von Hybridomen, die fähig sind, diese herzustellen, wohlbekannt. In dieser Hinsicht kann auf eine kürzliche Veröffentlichung "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", herausgegeben von John G. Hurrell, 1983, Bezug genommen werden.
- Es ist bekannt, daß N-Acetylneuraminsäure am Ende einer Zuckerkette eines Glykokonjugats (komplexes Kohlehydrat) vorhanden ist und unterschiedliche biologisch wichtige Rollen spielt. Es wurde kürzlich berichtet, daß die wesentliche Zunahme an Gehalt von freier N-Acetylneuraminsäure im Blut oder Urin bei Patienten beobachtet wird, die an bösartigen Tumor- oder akuten Entzündungserkrankungen leiden, und folglich hat ihre quantitative und/oder qualitative Messung in jüngster Zeit besonderes Interesse erweckt.
- Mit anderen Worten, da der monoklonale Antikörper in bezug auf ein spezielles Antigen von hoher Spezifität ist und dieses folglich mit einer großen Empfindlichkeit erkennt, wäre die Anwendung eines solchen monoklonalen Antikörpers bei der Diagnose von Krebs zum Zwecke der Frühdiagnose oder frühen Behandlung desselben zu erwarten. Die Diagnose würde durch Ermittlung von z.B. in dem Serum eines Individuums vorhandener N-Acetylneuraminsäure durchgeführt, indem ein monoklonaler Antikörper als ein Krebsmarkierer verwendet wird, wenn ein solcher, in bezug auf die vorgenannte freie N- Acetylneuraminsäure spezifischer monoklonaler Antikörper erhalten werden kann.
- Unter solchen Umständen wurden unterschiedliche Verfahren zur Ermittlung oder mengenmäßigen Bestimmung der freien N-Actylneuraminsäure mit hoher Empfindlichkeit vorgeschlagen. Jedoch kranken diese herkömmlich etablierten Verfahren an Problemen betreffend Einfachheit und Spezifität in bezug auf ein gewünschtes Antigen oder eine gewünschte antigene Determinante.
- Alle an den Enden von Zuckerketten von natürlich vorkommendem komplexen Kohlehydrat vorliegenden N- Acetylneuraminsäurereste sind in der α-Anordnung und andererseits ist die freie N-Acetylneuraminsäure in der β-Anordnung. Aus den für diese komplexen Kohlehydrate spezifischen monoklonalen Antikörpern werden viele monoklonale Antikörper erhalten, die spezifisch Stellen erkennen, die N-Acetylneuraminsäurereste als das Epitop enthalten, aber aus den obigen Gründen hat nicht jeder Antikörper eine Fähigkeit, solche freie N-Acetylneuraminsäure zu erkennen, und die Fähigkeit, sich daran zu binden. Darüber hinaus ist N-Acetylneuraminsäure ein Hapten mit einem niedrigen Molekulargewicht, und somit hat es nur eine geringe Antigenität. Deshalb scheint es sehr schwierig zu sein, monoklonale Antikörper zu erhalten, selbst wenn ein Tier mit einem solchen Hapten mit niedrigem Molekulargewicht immunisiert wird.
- In der US-A-4 694 076 sind Sialinsäurederivate in α- und β-Anordnung und ihre mögliche Verwendung als ein synthetisches Antigen offenbart.
- Deshalb ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Hybridom zur Verfügung zu stellen, das fähig ist, einen monoklonalen Antikörper mit einer hohen Immunspezifität in bezug auf freie N-Acetylneuraminsäurereste herzustellen, die in einer erhöhten Konzentration in dem Blut und/oder Urin von Patienten vorhanden sind, die an bösartigen Tumor- oder akuten Entzündungserkrankungen leiden.
- Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen für das freie N-Acetylneuraminsäurereste tragende Epitop spezifischen monoklonalen Antikörper zur Verfügung zu stellen.
- Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben unterschiedliche Studien zur Beseitigung der obigen, mit den herkömmlichen Techniken verbundenen Probleme durchgeführt und erkannt, daß ein in bezug auf ein gewünschtes Epitop oder eine gewünschte Antigendeterminante spezifischer monoklonaler Antikörper erhalten werden kann, indem ein chemisch synthetisiertes Sialinsäurederivat in der β-Anordnung als ein Immunogen verwendet wird. Somit wurde die vorliegende Erfindung auf der Grundlage einer solchen Erkenntnis verwirklicht.
- Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neues Hybridom zur Verfügung gestellt, das einen monoklonalen Antikörper herstellt, der spezifisch freie N-Acetylneuraminsäure, β-Glykoside oder β-Glykokonjugate davon bindet, und bei dem der monoklonale Antikörper nicht mit einem α-Glykosid oder einem α-Glykokonjugat von N-Acetylneuraminsäure kreuzreagiert.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper zur Verfügung gestellt, der spezifisch freie N-Acetylneuraminsäure, β-Glykoside oder β-Glykokonjugate davon bindet, und wobei der monoklonale Antikörper nicht mit einem α-Glycosid oder einem α-Glykokonjugat von N-Acetylneuraminsäure kreuzreagiert.
- Fig. 1 bis 3 sind Diagramme, die die Ergebnisse der Kreuzreaktion zwischen dem monoklonalen Antikörper dieser Erfindung und unterschiedlichen Derivaten von N-Acetylneuraminsäure in der β-Anordnung zeigen, die aufgrund Enzym-gekoppelter Immunnachweis-Technik erhalten wurden.
- Fig. 4 ist ein Diagramm, das die konkurrierende hemmende Wirkung von freier N-Acetylneuraminsäure auf die Bindung des monoklonalen Antikörpers dieser Erfindung an die Verbindung (A), die als ein Antigen dient, zeigt, die gemäß der Enzym-gekoppelten Immunnachweis-Technik geprüft wird; und
- Fig. 5 zeigt die Ergebnisse von Bindungsreaktion zwischen dem monoklonalen Antikörper und mit einem Radioisotop markierter N-Acetylneuraminsäure.
- Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend detaillierter beschrieben.
- Das Hybridom der vorliegenden Erfindung kann gemäß dem vorgenannten Verfahren von Kohlor et al erzeugt werden. Das Verfahren ist nicht Gegenstand der vorliegenden Anmeldung, sondern wird zum Zwecke der Veranschaulichung erläutert. Mit anderen Worten, das Hybridom kann hergestellt werden, indem von einem Tier, das mit einem Antigen immunisiert ist, erhaltene B-Zellen und Myelomzellen verschmolzen werden. Hierbei ist das hier verwendete "Antigen" ein N-Acetylneuraminsäurederivat in der β-Anordnung. Spezifische Beispiele davon sind die folgenden: Verbindung (A) Verbindung (B) Verbindung (C) Verbindung (D) Verbindung (E) Verbindung (F)
- Spezifische Beispiele von N-Acetylneuraminsäurederivaten in der α-Anordnung, die nicht-reaktiv in bezug auf die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind, sind die folgenden: Verbindung (H) Verbindung (I) Verbindung (J)
- In den obigen Formeln ist Ac eine Acetylgruppe.
- Der von dem Hybridom der vorliegenden Erfindung hergestellte monoklonale Antikörper erkennt N- Acetylneuraminsäure in der β-Anordnung als ein Epitop oder eine Antigendeterminante und reagiert spezifisch damit. Deshalb würde der von dem Hybridom gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte monoklonale Antikörper hohe Spezifität bezüglich N-Acetylneuraminsäure und irgendwelchen Derivaten davon aufweisen, soweit diese in der β-Anordnung sind.
- In dem Verfahren zur Herstellung des Hybridoms der vorliegenden Erfindung wird eines der vorstehend aufgeführten N-Acetylneuraminsäurederivate einem Tier, beispielsweise einer Maus, intramuskulär, intravenös, subkutan oder intraperitoneal injiziert, um es zu sensibilisieren und dadurch B-Zellen, insbesondere Milz-B-Zellen oder Lymphozyten, zu erhalten. Für diese Immunisierung können entweder unvollständige Adjuvanzien oder vollständige Adjuvanzien als ein Adjuvans verwendet werden, d.h. ein Mittel zur immunologischen Steigerung; spezifische Beispiele davon sind Öle, Emulsionsmittel, getöteter Tuberkulosebazillus, getötete Salmonella und Mischungen davon, vorzugsweise getötete Salmonella minesota R 595.
- Dann werden die so erhaltenen B-Zellen mit Myelom- Zellen verschmolzen. Als das bei dieser Zellverschmelzung verwendete Verschmelzungsmittel kann beispielsweise Polyethylenglykol und HVJ genannt werden, vorzugsweise Polyethylenglykol 4.000. Darüber hinaus ist es vorzuziehen, ein HAT-Medium als das Kulturmedium zu verwenden, um Hybridomzellen von den Myelomzellen zu trennen, die unverschmolzen bleiben.
- Danach werden die resultierenden Hybridomzellen einem Klonierprozeß, wie beispielsweise Methylcelluloseverfahren, weichem Agaroseverfahren oder limitierendem Verdünnungsverfahren, unterzogen, um einen gewünschten einzelnen Klon abzutrennen.
- Der Antikörpertiter des so erhaltenen, den monoklonalen Antikörper herstellenden Hybridoms kann gemäß dem Standardverfahren geprüft werden, um Hybridom mit hohem Antikörpertiter auszuwählen. Das so hergestellte Hybridom wird dann gelagert.
- Das Hybridom der vorliegenden Erfindung ist bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungs-Nummer HB 9619 hinterlegt.
- Der von dem Hybridom der vorliegenden Erfindung hergestellte Antikörper kann verwendet werden zum Auffinden von im Blut oder Urin von Menschen oder Tieren enthaltener freier N-Acetylneuraminsäure und/oder zur Bestimmung der Menge derselben gemäß einem Verfahren, wie beispielsweise dem konkurrierenden RIA-Verfahren.
- Es wird deshalb erwartet, den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung zu klinischen Zwecken, wie Diagnose und Prognose von bestimmten Arten von Krebs- und akuten Entzündungserkrankungen, zu verwenden. Daneben kann er weiterhin für die Basisstudien der Funktionen von N-Acetylneuraminsäure bei Glycolipid-bezogenen Erkrankungen sowie derjenigen Substanzen verwendet werden, die eine wichtige Rolle in lebenden Organismen spielen, wie N-Actylneuraminsäure, Sialidase und Sialyltransferase. Es ist auch möglich, N-Acetylneuraminsäure in der β-Anordnung zu reinigen, indem der so hergestellte monoklonale Antikörper in Affinitätschromatographie verwendet wird.
- Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf das folgende, nicht-beschränkende Arbeitsbeispiel detaillierter erläutert.
- Es wurde in Methanol 3-O-(Methyl-(5-acetamid- 4,7,8,9-tetra-0-acetyl-3,5-dideoxy-beta-D-glycero- D-galakto-2-nonulpyranosyl)-onat)-1,2-di-O- tetradecyl-Sn-glyzerin aufgelöst, und die resultierende Lösung wurde mit 1N Natriumhydroxidlösung bei Zimmertemperatur hydrolysiert. Das resultierende Reaktionsprodukt wurde mit Amberlite (Handelsname von Rhome & Haas Co.) neutralisiert und dann mittels Umkehrphasenchromatographie gereinigt, um so Verbindung (A) zu erhalten, die dann als ein Immunogen (siehe japanische Patent-Veröffentlichung ohne vorherige Prüfung No. 59-164798) verwendet wurde.
- 5 weibliche, 6 Wochen alte Balb/c-Mäuse wurden zu Experimenten verwendet, nachdem sie 7 Tage in einem klimatisierten Raum gezüchtet worden waren.
- Verbindung (A) (1 mg) und mit Essigsäure behandelte Salmonella minesota R 595 (4 mg) wurden dispergiert in und gemischt mit 1 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS (-)), um eine Antigen-Lösung zu bilden.
- Kulturmedium: Nissui RPMI 1640 wurde als Kulturmedium verwendet. Dem Medium wurden 100 E/ml Penicillin-G-Kalium, 1 mg Titer/ml Streptomycinsulfat, 1 mM Natriumpyruvat und 10 % Rinderfötenserum (FBS) hinzugefügt, bevor es verwendet wurde.
- HAT-Medium: 0,0388 g Thymidin und 0,1361 g Hypoxanthin wurden in 100 ml destilliertem Wasser unter Erwärmung aufgelöst, und die resultierende Lösung (a) wurde bei -20ºC als eine Vorratslösung mit einer 100-mal höheren Konzentration als der gewünschten gelagert. Desgleichen wurden 0,0176 g Aminopterin in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst, indem eine kleine Menge wäßriger 1N Natriumhydroxidlösung hinzugefügt wurde, dann wurde diese 10-fach mit RPMI 1640 Kulturmedium verdünnt und die resultierende Lösung (b) wurde bei -20ºC als eine Vorratslösung, die ein 100faches der gewünschten Konzentration enthielt, unter Lichtabschirmung gelagert. HAT-Medium wurde hergestellt, indem eine Menge von jeweils 1/100 dieser beiden Lösungen dem 10 % FBSRPMI 1640 Medium unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt wurden.
- Weiterhin wurde HT-Medium hergestellt, indem einfach eine Menge von 1/100 der Hypoxanthin und Thymidin enthaltenden Vorratslösung (a) demselben 10%igen FBSRPMI 1640 Medium hinzugefügt wurde.
- Als Mutterzellen zur Zellverschmelzung wurden Myelomzellen (X63-Ag8-6.5.3-Zellen) verwendet, die von Balb/c-Mäusen erhalten wurden. Diese Zellen wurden dem Subkultivieren in RPMI 1640 Medium unterzogen, dem 10 % FBS hinzugefügt wurde, während die Erzeugung von Mutanten gehemmt wurde, indem 6- Thioguanin dem Medium hinzugefügt wurde, so daß die Konzentration desselben 3 ug/ml entsprach.
- 6 Wochen alte, weibliche Balb/c-Mäuse wurden immunisiert, indem intraperitoneal die folgende Immunogenlösung gemäß dem folgenden Immunisationsplan injiziert wurde: anfänglich 5 ug; jeweils 10 ug 12 Tage und 16 Tage später; und jeweils 15 ug 26 Tage und 35 Tage später. Drei Tage nach der letzten Immunisation wurden die Mäuse geopfert, um Milzzellen (Lymphozyten) zu erhalten, und dann wurde eine Suspension einzelner Milzzellen von denselben hergestellt.
- Immunogenlösung: 1 mg der Verbindung (A) als Immunogen und 4 mg Salmonella minesota als Adjuvans wurden in 1 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS(-); frei von Ca und Mg) gemischt, und die resultierende Lösung wurde dann angemessen zur Verwendung als die Immunogenlösung verdünnt.
- Verschmelzung von Milzzellen (Lymphozyten) und den Mäuse-Myelomzellen als die Mutterzellen wurde gemäß dem Verfahren von Kohlor und Millstein durchgeführt. Genauer, es wurden 108 Milzlymphozyten, die 3 Tage nach der letzten Immunisation erhalten wurden, mit 10&sup7; Myelomzellen in Gegenwart von 50 % Polyethylenglykol (PEG 4000) in einem Kulturmedium verschmolzen.
- Nach der Zellverschmelzung wurden die resultierenden Hybridomzellen für 15 Tage in RPMI-1640-Medium kultiviert, dem HAT-Medium und 10 % FBS hinzugefügt wurden.
- Nach der Kultivierung für 15 Tage wurde der Überstand des Kulturmediums mit Enzym-gekoppeltem Immunnnachweis geprüft, ob die Hybridomzellen (A)- Verbindung-spezifische Antikörper hergestellt haben oder nicht.
- Eine Platte mit 96 flachbodigen Vertiefungen (erhältlich von Falcon Co., Ltd.) wurde mit Ethanol vor Verwendung in Experimenten vorbehandelt. Jeweils 50 ul 0,002 % Ethanollösung von N-Acetylneuraminsäurederivat wurden in Vertiefungen der Platte pipettiert, dann wurde das Lösungsmittel daraus verdampft, jeweils 200 ul 0,2 % Kasein PBS(-)Lösung wurden in die Vertiefungen gefüllt, und sie wurde für 2 h bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Lösung wurde durch Absaugung entfernt, dann wurden jeweils 50 ul des Überstands des Hybridomkulturmediums in die Vertiefungen gefüllt und die Platte für eine h bei Zimmertemperaturstehengelassen. Desgleichen wurde der primäre Antikörper von der Platte entfernt, dann wurden die Vertiefungen dreimal gewaschen, indem 150 ul PBS(-)Lösung hinzugefügt wurden, und für 30 min bei Zimmertemperatur nach der Hinzufügung von jeweils 200 ul 0,2 % Kasein PBS(-)Lösung stehengelassen. Nach dem Entfernen der Lösung wurden jeweils 50 ul des sekundären Antikörpers, der zu einer optimalen Konzentration mit 0,2 % Kasein- PBS(-)Lösung verdünnt worden war, in die Vertiefungen gefüllt, und sie wurden für 1,5 h bei Zimmertemperatur stehengelassen. Wie im Falle des primären Antikörpers wurden die Vertiefungen dreimal mit PBS(-)Lösung gewaschen und wurden jeweils 100 ul einer Reaktionslösung hinzugefügt, um Reaktion im Dunkeln zu veranlassen. Die Reaktionslösung wurde hergestellt, indem in Citratphosphat-Puffer (pH 5,0) o-Phenylendiamin und Wasserstoffperoxid aufgelöst wurden, so daß die endgültigen Konzentrationen davon 0,4 mg/ml bzw. 0,01 % betragen. Die Reaktion wurde beendet durch die Hinzufügung von jeweils 30 ul 8N Schwefelsäurelösung, und dann wurde das Produkt mittels Kolorimetrie bei 490 nm geprüft. Als der sekundäre Antikörper wurden mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markierte Ziegen-Antimaus-IgG-, IgM- und IgA-Antikörper verwendet.
- Die Spezifität des monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung in bezug auf Verbindungen (A) bis (F) in der β-Anordnung und Verbindungen (H) bis (L) in der α-Anordnung wurde gemäß dem oben erläuterten Verfahren geprüft, und die erhaltenen Ergebnisse sind in den hier beigefügten Fig. 1 bis 3 gezeigt.
- Fig. 1 und 2 zeigen die Ergebnisse der Kreuzreaktion zwischen dem Anti-Verbindung (A)-Antikörper der vorliegenden Erfindung und den jeweils als ein Antigen verwendeten Verbindungen, die N-Acetylneuraminsäure in der β-Anordnung enthalten. Wie aus den im Diagramm aufgetragenen Ergebnissen der Fig. 1 und 2 ersichtlich, sind alle N-Acetylneuraminsäure in der β-Anordnung enthaltenden Verbindungen positiv in der Kreuzreaktion.
- Fig. 3 zeigt in ähnlicher Weise das Ergebnis der Kreuzreaktion zwischen dem Antikörper der vorliegenden Erfindung und als Antigen verwendeten Verbindungen, die N-Acetylneuraminsäure in der α-Anordnung enthalten. Im Ergebnis wurde festgestellt, daß alle N-Acetylneuraminsäure in der α-Anordnung enthaltenden Verbindungen negativ in der Kreuzreaktion sind.
- Der monoklonale Antikörper (Anti-Verbindung (A)- Antikörper) der vorliegenden Erfindung wurde zur Reaktion mit der Verbindung (A) gebracht, die als ein Antigen in Gegenwart von freier N-Acetylneuraminsäure auf eine Platte gestrichen war, um die Hemmwirkung durch Konkurrenz von freier N- Acetylneuraminsäure gegen die Bindung des Anti- Verbindung (A)-Antikörpers und der Verbindung (A) zu untersuchen, und die erhaltenen Ergebnisse wurden in Fig. 4 aufgetragen.
- Die in Fig. 4 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß sich die freie N-Acetylneuraminsäure mit Antigen- Bindungsstellen des Anti-Verbindung (A)-Antikörpers verbindet, um die Bindung der Verbindung (A) im Verhältnis zu der Konzentration der Säure zu hemmen. Damit ist nahegelegt, daß der Anti-Verbindung (A)-Antikörper der vorliegenden Erfindung ein Antikörper ist, der sich spezifisch mit freier N-Acetylneuraminsäure verbindet.
- Der die Anti-Verbindung (A)-Antikörper enthaltende Überschuß wurde schrittweise um das 1- bis 64-fache verdünnt und in jede Vertiefung eingeführt, um den Antikörper daran zu haften. Dann wurde eine Lösung aus (¹&sup4;C)N-Acetylneuraminsäure in die Vertiefungen gegeben, danach inkubiert, die Zellen wurden gewaschen und die Rückstandsradioaktivität jeder Vertiefung geprüft. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 aufgetragen. Aufgrund der in Fig. 5 aufgetragenen Ergebnisse wurde festgestellt, daß die (¹&sup4;C)N- Acetylneuraminsäure zuzuschreibende Radioaktivität im Verhältnis zu der aufgetragenen Menge des Antikörpers ansteigt.
- Die gleichen Verfahren wie vorstehend wurden wiederholt, indem Glukosamin als ein Antigen (Kontrolle) verwendet wurde, aber es wurde keine Verbindung zwischen dem Anti-Verbindung (A)-Antikörper und dem Glukosamin festgestellt. Dies zeigt ebenfalls deutlich, daß der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung spezifisch mit N-Acetylneuraminsäure in der β-Anordnung reagiert.
Claims (6)
1. Ein Hybridom, das einen monoklonalen
Antikörper herstellt, der spezifisch freie
N-Acetylneuraminsäure, β-Glykoside davon oder β-
Glykokonjugate davon bindet, und bei dem der
monoklonale Antikörper nicht mit einem
α-Glykosid oder einem α-Glykokonjugat von
N-Acetylneuraminsäure kreuz reagiert.
2. Ein Hybridom nach Anspruch 1, das ATCC HB
9619 ist.
3. Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch
freie N-Acetylneuraminsäure, β-Glykoside davon
oder β-Glykokonjugate davon bindet, und der
nicht mit einem α-Glykosid oder einem
α-Glykokonjugat von N-Acetylneuraminsäure
kreuzreagiert.
4. Ein monoklonaler Antikörper nach Anspruch 3,
der ein Immunglobulinmolekül vom IgG-Typ ist.
5. Ein monoklonaler Antikörper nach Anspruch 3
oder 4, der durch ein ATCC HB 9619-Hybridom
hergestellt ist.
6. Ein monoklonaler Antikörper nach irgendeinem
der Ansprüche 3 bis 5, der zur Diagnose von
bösartigen Tumoren oder akuten entzündlichen
Erkrankungen eingesetzt wird, indem er die im
Blut oder Urin vorhandene freie
N-Acetylneuraminsäure auffindet und quantitativ bestimmt.
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