JPH02486A - 遊離ｎ−アセチルノイラミン酸を認識するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なハイブリドーマ、その製造法およびそ
れによって産生されるＮ−アセチルノイラミン酸に対し
て特異性を有するモノクローナル抗体に関する。

〔従来の技術〕

関連技術の説明 １９７５年にケーラーほか（Ｋ６’ｈｌｏｒ　ａｎｄ！
、ｌ１ｌｌｓｔｅｉｎ　）は均一な特異性及び性質を有
する抗体のはザ無限量の生成を可能にする雑種細胞（ハ
イブリドーマ）を用いる単クローン性抗体を製造する方
法を導入した。それより前に動物を腫瘍細胞または他の
抗原で免疫処置することにより生成された普通の抗血清
が特異性および性質の異なる種々の抗体を含むことがＳ
忍められていた。ケーラーほかの（Ｋ６’ｈｌｏｒ−！
、ｌ１ｌｌｓｔｅｉｎ　）方法は免疫処置動物の脾臓細
胞とイモータル骨髄腫細胞系との融合を必要とする。ハ
イブリドーマとして知られる融合細胞から目的とする特
異性有する抗体を生ずるクローンを選ばれる。各クロー
ンはその１抗体のみを生成し続ける。ハイブリドーマ細
胞は無限に培養でき、または液体窒素中に凍結して貯蔵
することができ、その個々の抗体の安定供給が保証され
る。

抗体は、抗原として知られる他の分子との結合およびそ
れを認識する能力を有するタンパク質である。単クロー
ン性抗体は他の抗体と異ならないが、しかしそれらはそ
の性質が非常に均一であり、ただ１種の抗原または抗原
決定基を認識する。腫瘍細胞と免疫動物由来の抗体産生
細胞との融合に起因するハイブリドーマクローンがすべ
て目的の抗原に対して特異性であるわけではない。さら
に異なるハイブリドーマクローンにより生成された抗体
が同一分子の異なる抗原決定基と反応できるので、主題
抗原に対する抗体でもクローン毎に異なる。従って、個
々の単クローン性抗体が抗原分子のどの特定部分を認識
できるかを予め予測することができない。単クローン性
抗体およびハイブリドーマを生成させる多くの技術は、
参照により加入される最近の図書「単クローン性ハイブ
リドーマ抗体：技術および適用（ゝＪｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ　Ｈｙｂｒｉ−ｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　
　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌ＋ｃａｔ
ｉｏｎｓ）　ｊ　　（バレル（Ｊｏｈｎ　　Ｇ、Ｈｕｒ
ｒｅｌｌ　　）　ｑ５．１９８３］により証明されるよ
うに今日普通である。

Ｎ−アセチルノイラミン酸は複合糖質の糖鎖末端に存在
し、種々の重要な生物学的機能を担っている事が知られ
ている。近年、悪性腫瘍や急性炎症性疾患などにおいて
血中あるいは尿中の遊離Ｎ−アセチルノイラミン酸量が
増加する事が報告されており、その意義が注目されてい
る。

したがって、上記遊離型Ｎ−アセチルノイラミン酸に対
して特異性を有するモノクローナル抗体の作成は、その
すぐれた抗原特異性と高い検出感度を特徴とすることか
ら、癌マーカーとして癌患者の血清診断などに応用でき
、早期診断、早期治療等の目的から期待されていた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記のような背景からＮ−アセチルノイラミン酸の高感
度検出・定量法が望まれていたが、従来確立されている
方法ではいずれもその特異性、簡便性などの点で難があ
っグこ。

一方、天然型複合糖質糖鎖末端に存在するＮ−アセチル
ノイラミン酸は全てα配位を有し、その一方遊離型Ｎ−
アセチルノイラミン酸はβ配位である。これら複合糖質
に対するモノクローナル抗体のうち、Ｎ−アセチルノイ
ラミン酸を含む部位をエピトープとするものも多く得ら
れているが、上記理由からこれらはいずれも遊離Ｎ−ア
セチルノイラミン酸をＭＥ　ｍ結合する能力を持たない
。さらにＮ−アセチルノイラミン酸は低分子ハブテンで
あるため、そのまま抗原として免疫してもその抗原性の
低さからモノクローナル抗体の取得は困難と考えられる
。

したがって、本発明の目的は、悪性腫瘍や急性炎症性疾
患などにおいて血中あるいは尿中の遊離型Ｎ−アセチル
ノイラミン酸のある特定のエピトープ（抗原決定基）に
対して、免疫特異性を有する゛モノクローナル抗体を産
生ずるハイブリドーマ、その製造法およびそのハイブリ
ドーマから産生されるモノクローナル抗体に関する。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上記問題点に鑑み、β配位のシアル酸化
合物を化学合成し、これを免疫原としてモノクローナル
抗体を作成し、当該モノクローナル抗体が高い特異性を
有するエピトープ（抗原決定基）を同定し、本発明を完
成した。

すなわち、本発明は、エピトープ（抗原決定基）として
β配位を有するＮ−アセチルノイラミン酸る。

本発明についてさらに詳細に説明する。

本発明のハイブリドーマは、ケーラー等の方法、すなわ
ち、抗原を動物に免疫して得られるＢ細胞（リンパ球）
と骨髄腫細胞とを細胞融合させることにより調製される
。ここで、本発明に使用される「抗原」としては、β配
位を有するＮ−アセチルノイラミン酸誘導体である。

以下、それらの化合物の具体例を挙げる。

また、本発明は、（Ａ）β配位を有するＮ−アセチルノ
イラミン酸誘導体を抗原として動物に免疫して得られた
Ｂ細胞（リンパ球）と （Ｂ）　　骨髄腫細胞とを細胞融合することを特徴とす
るハイブリドーマの製造法に関する。

さらに、本発明はエピトープ（抗原決定基）としてβ配
位を有するＮ−アセチルノイラミン酸に対して特異性を
有するモノクローナル抗体に関す（Ｂ） ｌ′ＩＵ （Ｃ） λＨＣＯＣｚＪ４７ 次に本発明のモ、“クローナル抗体に抗原特異性を示さ
ないα配位を有するＮ−アセチルノイラミ酸誘導体の具
体例を以下に示す。

（Ｊ） Ｈυ Ｕ■ 本発明のハイブリドーマから産生されるモノクローナル
抗体は上記したβ配位のシアル酸をエピトープ（抗原決
定基）として認識し、特異的に反応する。したがって、
本発明の７１イブリドーマから産生されるモノクローナ
ル抗体はβ配位を有するＮ−アセチルノイラミン酸およ
びその誘導体であればいずれのものでも高い特異性を有
する。

まず、上記した抗原をマウスの筋肉、皮下、腹腔内に免
疫する。この免疫の際、アジュバント、すなわち免疫増
強剤としては、不完全アジュバントまたは完全アジュバ
ントのいずれも使用でき、例えば、油、乳化剤、結核死
菌、サルモネラ死菌およびこれらの混合物、好ましくは
サルモネラ・ミネソタ死菌が使用できる。

次に、上記で得られたＢ細胞とミエローマ細胞とを細胞
融合する。

ここで、融合剤としては、ポリエチレングリコール、Ｈ
ＶＪ等が使用でき、好ましくはポリエチレングリコール
４０００である。

また、培養液としては、ハイブリドーマ細胞とミエロー
マ細胞とを選択するためＨＡＴ培地を使用するのが好ま
しい。さらに、得られたハイブリドーマヲクローニンク
法、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、また
は限界希釈法を用いて単一クローンを分離する。

かくして得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドー
マについて、常法にて抗体価をチエツクし、抗体価の大
きいハイブリドーマを選択して保存する。

（発明の効果） 本発明のハイブリドーマから産生されるモノクローナル
抗体は、競合ＲｒＡなどの方法によりヒトまたは動物血
中・尿中Ｎ−アセチルノイラミン酸の検出・定量に使用
できる。

従っである種の癌や急性炎症性疾患などの診断・予後観
察など臨床的応用が可能である。さらに、これらの疾患
の他糖脂質関連疾患類におけるＮ−アセチルノイラミン
酸の関与、また生体内で重要な機能を果たすＮ−アセチ
ルノイラミン酸や、シアリダーゼ、シアリルトランスフ
ェラーゼの基礎研究にも利用できる。他に、このように
して製造したモノクローナル抗体をアフィニティクロマ
トグラフィーに用いてＮ−アセチルノイラミン酸の精製
に利用する事も可能である。

実施例 （Ａ＞免疫原の調製 （１）化合物（Ａ）の合成法 ３−０−　Ｃメチル（５−アセタシド−４，７゜８．９
−テトラ−０−アセチル−３，５−ジデオキシ−β−Ｄ
−グリセローＤ−ガラクトー２−ノニュロピラノシル）
オネート］−１．２−ジー０−テトラデシル−３ｎ−グ
リセロールをメタノールに溶解後、室温下ＩＮ−水酸化
ナトリウムで加水分解した。得られた反応生成物をアン
バーライトにて中和後、逆相カラムクロマトグラフィー
により精製を行い化合物（Ａ）を得て免疫原とした。（
特開昭第５９−１６４７９８号） （２）実験動物 ５匹のメスの６退会Ｂａｌｂ／Ｃマウスを空調室にて７
日間飼育したものを実験に使用した。

（３）抗原溶液の調製 化合物（Ａ）１ｍｇとアジュバントとして酢酸処理した
サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｍｉｎｅ
ｓｏｔａ）　Ｒ５９５４ｍｇとをリン酸援衡生理食塩水
（ＰＢＳ　（−））１　ｍｌにて混合して抗原溶液とし
た。

（４）培　地 培地：ニッスイＲＰＭ　［１６４０を使用した。

使用時にペニシリンＧカリウム１００ＬＩ／ｍＪ、スト
レプトマイシン硫酸塩１ｍｇ力価／　ｍｌ、ピルビン酸
ナトリウム１ｍＭ、牛胎児血清（ＦＢＳ）を１０％とす
る様添加した。

ＨＡＴ培地：チミジン０．０３８８　ｇとヒポキサンチ
ン０．１３６１　ｇとを蒸留水１００ｍ１に加熱融解し
、１００倍濃度の保存溶液とし一２０℃で保存した。同
様に０．（１０）７６ｇのアミノプテリンを蒸留水１０
０ｍｊ！に少量のＩＮ水酸化ナトリウム水溶液を加えて
溶かし、これをＲＰ　！、＋　１１６４０培地にて１０
倍に希釈し、１００＠濃度の保存液として一２０℃で遮
光して保存した。

使用時には、１０９６　Ｆ８ＳＲＰ！Ｊ［ｌ　６４０培
地にそれぞれ１／１０（１０）ずつ加え、ＨＡＴ培地と
した。

また、ＨＴ培地としては、チミジンおよびピポキサンチ
ン保存液のみを１／１００ｆｆｉ加え使用した。

（５）親細胞 細胞融合を行う際の親細胞としては、Ｂａｌｂ／ｃマウ
ス由来のミエローマ細ｎ包であるＸ６３−Ａｇ　８−６
．５．３細胞を使用した。この細胞を１０％ＦＢＳ添加
ＲＰＭＩ　　１６４０培地により継代を行い、培地にＣ
−チオグアニンを３μｇ７ｍｌの濃度となる様に加える
事により突然変異体の出現を阻止した。

（Ｂ）ハイブリドーマの製造 （１）免疫法 メスの６退会Ｂａｌｂ／ｃマウスを、免疫原として化合
物（Ａ）Ｉｍｇとアジュバントとしてサル、モネラ・ミ
ネソタ４ｍｇとをリン酸１１　新生理食塩水（Ｐｕｓ（
−）　、Ｃａ　ＳＭｇを除いた）１ｍｌにて混合し、適
宜希釈したのち、前記マウスの腹腔内に初日５μｇ、１
２日目１０μｇ１１６日目１０μｇ、２６日目１５μｇ
１３５日目１５μｇの免疫スケジュールで免疫した。３
回目の免疫後、肺細胞リンパ球をマウスから取り出し、
次に単一細胞の懸濁液をつくった。

（２）細胞融合法 上記で得られた肺細胞リンパ球と前記親細胞のマウスミ
エローマ細胞との細胞融合をケーラーおよびミルシュタ
イ゛ン（Ｋδ旧ｅｒおよびλ１ｉｌｓｔｅｉｎ）の方法
に従って実施した。すなわち、最終免疫してから３日後
に１０’個の肺細胞リンパ球を、培地中で５０９６のポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）（７）存在下
で、１０’個（７）骨髄腫細胞と融合した。

（３）ハイブリドーマの選択および成長細胞融合後、得
られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ保存液及び１０％Ｆ
ＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で１５日間培
養した。

１５日間培養した後、この培養液の上清を酵素抗体法を
用いて化合物（Ａ）に対する抗体産生についてスクリー
ニングした。

（Ｃ）モノクローナル抗体とβ配位を有するＮ　−アセ
チルノイラミン酸誘導体との反応性の評価 （１）酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法） ９６穴平底プレート（ファルコン社製）ヲエタノールで
前処理して実験に使用した。濃度２％としたＮ−アセチ
ルノイラミン酸誘導体のエタノール溶液５０μｌを各プ
レートに分注し蒸発させた後、０．２％カガインＰＢＳ
　（−）溶液２００μｌを加え２時間室温に放置した。

溶液を吸引除去後、−次抗体としてハイプリドーマ培養
上清を５０μ！加え室温に１時間放置した。

同様にしてプレートから一次抗体を除きＰＢＳ（−）溶
液１５０μβを加え３回ウェルを洗浄した後に０．２％
カゼインＰ　Ｂ　Ｓ　（−）溶液２００μ！を加え３０
分間放置した。この溶液を除いた後に０．２％カゼイン
ＰＢＳ　（−）にて至適濃度に希釈した２次抗体５０μ
ｌを加え室温で１時間３０分放置した。−次抗体と同様
にＰＢＳ（−）で３回ウェルを洗浄し反応溶液１００μ
ｌをウェルに注ぎ暗所にて反応させた。反応溶液はクエ
ン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ＝　５　）にオルトフェニレ
ンジアミン、過酸化水素水の最終濃度が０．４ｍｇ／ｍ
β、０．（１０）％となる隨調製し実験に使用した。反
応は８Ｎ硫酸を３０μ！加えて停止させ、４９０ｎｍの
吸収波長にて比色測定を行った。２次抗体としては西洋
ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩ
ｇＧＳＭ、Ａ抗体を使用した、 この方法により、β配位を有する化合物Ａ〜Ｆおよびα
配位を有する化合物Ｇ−Ｌについて調べ、第１図〜第３
図の結果を得た。

第１図および第２図はそれぞれβ配位を有するＮ−アセ
チルノイラミン酸を含有する化合物を抗原として使用し
、本発明の抗化合物Ａ抗体との交叉反応について調べた
ものである。

この結果からβ配位を有する化合物はすべて陽性である
ことが判る。

また第３図はα配位を有するＮ−アセチルノイラミン酸
を含有する化合物を抗原として使用し、同様に交叉反応
性について調べた。

この結果からα配位を有する化合物はすべて陰性である
ことが判る。

化合物Ａを抗原としてコートしたプレート上で本発明の
モノクローナル抗体（抗化合物Ａ抗体）を加え化合物Ａ
と反応させる際に遊離Ｎ−アセチルノイラミン酸を共存
させ、抗化合物Ａ抗体と化合物へとの結合に対する阻害
作用を調べ、第４図の結果を得た。

この図から、遊離Ｎ−アセチルノイラミン酸が抗化合物
Ａ抗体の抗原結合部位に結合して、化合物１へとの結合
を濃度依存的に阻害することがわかる。したがって、抗
化合物Ａ抗体は、遊離型Ｎ−アセチルノイラミン酸と特
異的に結合する抗体である事を示唆している。

抗化合物Ａ抗体の上清を１〜６４倍に段階希釈した後、
各ウェルに加え、抗体を吸着させる。

その後、〔ＩＣ）Ｎ−アセチルノイラミン酸溶液を添加
してインキュベーションした後、ウェルを洗浄し残査放
射活性を調べた。その結果を第５図に示す。この図から
、コートした抗体量依存的に（１４Ｃ）Ｎ−アセチルノ
イラミン酸由来の放射活性が高いことが判る。

また、対象としてグルコサミンを抗原として用いたが結
合がみられなかった。

このことから、本発明のモノクローナル抗体はβ配位を
有するＮ−アセチルノイラミン酸と特異的に反応するこ
とがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は酵素抗体法によるβ配位Ｎ−アセチル
ノイラミン酸各種誘導体との交叉反応を示し、第４図は
酵素抗体法における競合反応による遊離Ｎ−アセチルノ
イラミン酸との特異的反応を示し、第５図は放射性同位
体標識Ｎ−アセチルノイラミン酸と本抗体との結合反応
を示す。 第 図 ○、Ｄ （Ｕ（−Ｊ〕 第２図 希釈１＆率

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）エピトープ（抗原決定基）としてβ配位を有する
   Ｎ−アセチルノイラミン酸に対して特異性を有するモノ
   クローナル抗体を産生する新規なハイブリドーマ。
2. （２）（Ａ）β配位を有するＮ−アセチルノイラミン酸
   誘導体を抗原として動物に免疫して得られたＢ細胞（リ
   ンパ球）と （Ｂ）骨髄腫細胞とを細胞融合することを特徴とするハ
   イブリドーマの製造法。
3. （３）動物がＢａｌｂ／ｃマウスである特許請求の範囲
   第（２）項記載のハイブリドーマの製造法。
4. （４）Ｂ細胞がＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞である特
   許請求の範囲第（３）項記載のハイブリドーマの製造法
   。
5. （５）骨髄腫細胞がヒト、ラット、マウス由来のミエロ
   ーマ細胞である特許請求の範囲第（４）項記載のハイブ
   リドーマの製造法。
6. （６）マウス由来のミエローマ細胞がＢａｌｂ／ｃマウ
   ス由来のミエローマ細胞である特許請求の範囲第（５）
   項記載のハイブリドーマの製造法。
7. （７）細胞融合にポリエチレングリコールを融合剤とし
   て用いる特許請求の範囲第（２）項記載のハイブリドー
   マの製造法。
8. （８）免疫する際アジュバントとしてサルモネラミネソ
   タＲ５９５を使用する特許請求の範囲第（２）項記載の
   ハイブリドーマの製造法。
9. （９）エピトープ（抗原決定基）としてβ配位を有する
   Ｎ−アセチルノイラミン酸に対して特異性を有するモノ
   クローナル抗体。
10. （１０）ＩｇＧタイプの免疫グロブリン分子である特許
    請求の範囲第（９）項記載のモノクローナル抗体。
11. （１１）悪性腫瘍または急性炎症性疾患における血清ま
    たは尿診断に使用しうる特許請求の範囲第（１０）項記
    載のモノクローナル抗体。