JPH04126094A - ヒトＩｇＥに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒト免疫グロブリンＥ（以下１ｇＥ）に対する
モノクローナル抗体、該モノクローナル抗体の混合物、
該モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ、およ
び該モノクローナル抗体を用いるヒトＩｇＥの免疫測定
法に関する０本発明のモノクローナル抗体は、ヒト血清
１ｇＥを測定する臨床検査薬用抗体として有用である。

良困弦（ ＩｇＥは、１９６６年石板らにより発見された免疫グロ
ブリンであり、肥満細胞や好塩基球表面のＦｃレセプタ
ーを介して結合し、アレルゲンと反応することによって
即時型アレルギーを引き起こす主要因となることが知ら
れている。また、ＩｇＥは他の免疫グロブリンに比べそ
の血中濃度が極めて低いが、アレルギー性疾患をはじめ
として、肝障害や寄生虫感染などの疾患を伴う場合可成
りの程度までＩｇＥ濃度が上昇するなど、血中濃度分布
の広範なことが特徴である。このようなことから、血中
ＩｇＥ濃度の測定を行なうことは、アレルギー性疾患や
、寄生虫感染症の診断に有用と考えられており、現在−
船釣に普及している方法は、ラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）法や、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法で
ある。

明が　　しようとする課 ヒトＩｇＥに特異的に反応するモノクローナル抗体は、
既に市森らによって報告されている［市森ら、バイブリ
ド−７（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　）　４．４７（１９８５
）］ものなど多数知られており、更に、これらのヒトＩ
ｇＥ特異的モノクローナル抗体を用いたヒト血中ＩｇＥ
測定法もＪ、ブラシらによって報告されている［Ｊ、ブ
ラシ（Ｇｒａｓｓｉ　）ら、ザ・ジル−ナル・才ブ・ア
レルギー・アンド・クノニカル・イムノロジー（Ｊ、　
Ａｌｌｅｒｇｙ、　ＣｌｉｎＩｍＣ１１ｎＩ、　）　７
ユ、８０Ｂ（１９８６）コ例など幾つか知られている。

しかしながら、これらのモノクローナル抗体を用いた従
来の方法で、ヒト血中ＩｇＥ量を測定しようとする際に
は、ＩｇＥの測定範囲が狭い、測定操作が煩雑となる。

検量線が直線的でないために、測定濃度域毎の感度が−
様でなく、測定される濃度に−様な信頼性を期待しにく
い、あるいは測定に特殊な装置を必要とするなどの問題
点があり、これら全てを同時に解決する手段は見出諮れ
ていないのが現状である。

課　を　決するための手段 本発明が提供するヒトＩｇＥ特異的モノクローナル抗体
は、４種のモノクローナル抗体のそれぞれがヒトＩｇＥ
の異なる領域に結合し、なおかつこれら４種の中ではヒ
トＩｇＥに対する他の抗体の結合に影響妨れることなく
ヒトＩｇＥに結合することができる。更に、４種のヒト
ＩｇＥ特異的モノクローナル抗体のそれぞれがヒトＩｇ
Ｅに対して異なる親和性で結合するので、これらを混合
することによってヒトＩｇＥに対する反応性の強きを調
節することができるという特長を備えている。これらの
ことから、本発明にかかるヒトＩｇＥ特異的モノクロー
ナル抗体を用いることにより、極めて簡便な操作で特殊
な装置を必要とすることなく、広範囲のヒト血中ＩｇＥ
濃度を高い信頼性で測定することが可能である。したが
って、本発明モノクローナル抗体は、ヒト血中ＩｇＥ測
定用臨床検査薬として利用することができる。

１）ハイブリドーマの調製 マウスをヒトＩｇＥで免疫する。免疫されたマウスから
抗体産生細胞を得、これと骨髄腫細胞を融合し、得られ
たハイブリドーマのうち免疫したヒトＩｇＥおよび由来
の異なるヒトＩｇＥに強く反応し、ヒトＩｇＧには反応
しないハイブリドーマのウェルを選択する。選択された
ハイブリドーマをクローニングし、出現したハンプリド
−マクローンｌ二つき、由来の異なるヒトＩｇＥ３種お
よびヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧに対する抗体
の反応特異性を詳しく検定し、免疫したヒトＩｇＥおよ
び由来の異なるヒトＩｇＥに対しては強く反応する力釈
他のヒト免疫グロブリンには反応しないクローンを選択
し、これを＠養してモノクローナル抗体を回収する。免
疫法、細胞融合法、融合ｍ砲の選択等は公知の通常の方
法によって行うことができる。

２）モノクローナル抗体の作製 選択したハイブリドーマをｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養法又Ｉ
ｔ　ｉｎ　ｖｉｖｏ培養法により増殖許せ、モノクロー
ナル抗体を得る。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　＠養法としては、
ハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で増殖限界になるま
で培養し、その培養上清を回収することにょってモノク
ローナル抗体を得ることができる。１ｎｖｉｖｏ培養法
としては、あらかじめブリステンを腹腔的投与処理した
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５×１０６〜１０７個のハイブ
リドーマを腹腔内に移植し、約３週後にマウスの腹部肥
大を確かめて、その腹水を採取し、腹水からＩｇＧ画分
を分離精製することによってモノクローナル抗体を得る
ことができる。

本発明においては、上記の方法により、ヒトＩｇＥに特
異的に結合するモノクローナル抗体ＨＥ３９Ｅ、ＨＥ−
２２Ａ、ＨＥ−６９ＢおよびＨＥ−３５Ａが得られた。

これらの抗体を産生ずるハイブリドーマＨＥ−３９Ｅジ
オツギ、ＨＥ−２２Ａンオノギ、ＨＥ−６９Ｂジオツギ
およびＨＥ−３５Ａンオノギは、それぞれ、微工研菌寄
第１１３８１号、微工研菌寄第１１３８２号、微工研菌
寄第１１３８３号および微工研菌寄第１１３８４号とし
て、茨城県つくば南東１−１−３の微生物工業技術研究
所に、平成２年３月２７日から寄託きれている。

本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇ
ＧおよびヒトＩｇＭとは反応せず、ヒトＩｇＥ・λおよ
びヒトＩｇＥ・にと強く反応し、ヒトＩｇＥに特異的で
ある。

モノクローナル抗体ＨＥ−２２Ａは、糖タンパク質糖鎖
を切断するエンドグリコシダーゼＦで処理したヒトＩｇ
Ｅと反応せず、ヒトＩｇＥの糖鎖と密接に関連する構造
を認識するものと推定された。

モノクローナル抗体ＨＥ−３５Ａは、熱変性ヒトＩｇＥ
に対する反応性が著しく低く、熱処理によりヒトＩｇＥ
のＤε２ドメインの構造変化が起こることが知られてい
るので、ヒトＩｇＥのＤε２ドメインを認識するものと
推定された。

モノクローナル抗体ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−６９Ｂは
、市販のモノクローナル抗りε１抗体（セロチック社）
により、ヒトＩｇＥへの結合を阻害されたので、ヒトＩ
　ｇＥＯＤε１ドメインを認識するものと推定された。

但し、モノク。−ナル抗体ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−６
９Ｂは、互いにヒトＩｇＥへの結合を阻害することはな
く、Ｄε１ドメインの異なる部分を認識している。

以上から、本発明のモノクローナル抗体は、それぞれが
ヒトＩｇＥの異なる領域に結合し、なおかつ他のモノク
ローナル抗体のヒトＩｇＥに対する結合に影響されるこ
となくヒトＩｇＥに結合することができる。

本発明のモノクローナル抗体は全て、未変性のヒｌ−Ｔ
ｇＥに強く結合するが、塩酸グアニジンおよび２−メル
カプトエタノールで変性したヒト■ｇＨには結合しない
。

木発すのモノクローナル抗体は全て、マウスの免疫グロ
ブリンＧに属する。

本発明のモノクローナル抗体は、それぞれ、ヒトＩｇＥ
に対して異なる親和性で結合するので、その２種以上を
混合することにより、ヒトＩｇＥに対する反応性の強き
を調節することができる。

例えば、固相化モノクローナル抗体ＨＥ−６９Ｂを用い
るサンドウィッチイムノアッセイにおいて、標識抗体と
して、標識物の抗体当りの比活性が同一であるモノクロ
ーナル抗体ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５ＡおよびＨＥ−３
９Ｅをタンパクｊｉｉ１１度比２〜７：１：５〜２０で
混合したものを用いれは、ＩｇＥの測定範囲が広く、検
量線の調節が可能になる。このように、本発明のモノク
ローナル抗体ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５ＡおよびＨＥ−
３９Ｅからなる群から選択される異なる２種以上のモノ
クローナル抗体を混合した、ヒトＩｇＥに対して所望の
反応性をもつモノクローナル抗体混合物を得ることがで
きる。

また、１２６エなどの放射性同位体、西洋ワサビペルオ
キシダーゼなどの酵素、そのほかビオチン、アビンンな
との公知の標識化合物により標識された本発明のモノク
ローナル抗体およびモノクローナル抗体混合物も本発明
に包含される。

本発明は、きらに、上記のモノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマ細胞系を提供する。

本発明は、上記のモノクローナル抗体ＨＥ−２２Ａ、Ｈ
Ｅ−３５Ａ、ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−６９Ｂからなる
群から選択されるモノクローナル抗体を固相化し、得ら
れた固相化抗体をヒトＩｇＥを含有する試料と接触させ
ることにより該固相化固体と該ヒトＩｇＥを結合許せ、
該固相化抗体に結合した該ヒトＩｇＥに、該群から選択
きれ該固相化抗体とは異なる標識されたモノクローナル
抗体を結合させるヒトＩｇＥの免疫ｆｉ１１定法を提供
する０本発明のモノクローナル抗体は、それぞれの認識
部位が異なり、かつ互いに他の抗体のＩｇＥへの結合を
阻害しないので、このようなサンドウィッチ免疫測定法
が可能になる。後記実施例に示すとおり、いずれの抗体
を固相化抗体としても、他の３種の抗体のいずれも標識
化抗体として用いることができる。

きらに、本発明は上記のモノクローナル抗体ＨＥ−６９
Ｂを固相化し、得られた固相化抗体をヒトＩｇＥを含有
する試料と接触させることにより該固相化抗体と該ヒト
ＩｇＥを結合させ、該固相化抗体に結合した該ヒトＩｇ
Ｅに、標識した上記モノクローナル抗体混合物を結合さ
せるヒトＩｇＥの免疫測定法を提供する。この方法によ
れば、ＩｇＥの測定範囲が広く、検量線が直線的になる
ので、より望ましい。

本発明はまた、固相化抗原にヒトＩｇＥを含有する試料
を接触させ、該試料中の該抗原に特異的なヒトＩｇＥ抗
体を該固相化抗原に結合させ、該固相化抗原に結合した
抗原特異性ヒトＩｇＥ抗体に、標識した上記のモノクロ
ーナル抗体を結合させる抗原特異性ヒトＩｇＥ抗体の免
疫測定法を提供する。例えば、固相化抗原としてダニ抗
原を用いれば、ヒト血液などの試料中の、ダニ抗原特異
ＩｇＥ抗体のみを測定することができる。

測定された試料中のＩｇＥｆｉ度は、種々の濃度のＩｇ
Ｅを用いて作成された検量線から求めることができる。

犬」ｌ乳１ （１）免疫 ８通合の雌Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス３匹に、それ
ぞれ２００μｇのヒトＩｇＥをフロイント完全アジュバ
ントとともに腹腔内投与し、３週間後に、更に２０μｇ
のヒトＩｇＥをミョウバン沈降懸濁液として腹腔内に３
日連続投与した。

■　１砲融合 最終免疫の翌日に、３匹の肺臓を摘出し、ＲＰＭＩ培地
を用いて１砲浮遊液を調製した。この３×１０ａ個の肺
細胞と９Ｘ１０’個の骨ｍ腫細胞Ｎ５−１とを混合し、
遠沈後、沈渣に５０％ポリエチレングリコール（平均分
子量４０００）１ｍｌをゆるやかに攪拌しながら加え、
更に１分間攪拌した。ＲＰＭＩ培地１培地１エｌ間を要
して加え、同しく１ｍｌを追加した後、更に、７＋ｎｌ
を３分間を要して加えた。遠沈後、沈残を１５％ウシ胎
児血清を含むＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ培地）　６０
ｍｌに浮遊させ、９６六マイクロ培養プレ一ト６枚の各
ウェルに０１ｍｌずつ接種し、７％次酸ガスの存在下、
３７℃で培養した。２４時間後、ヒポキサンチン１００
μＭ、アミノプテリン０４μＭ、チミジン１６μＭを含
む完全ＲＰＭＩ培地（）（ＡＴ培地）、０　、１　ｆｆ
１ｌ加える。培養開始後、２．３．５および８日目に、
培養上清０　、１　ｍｌを捨て、ＨＡＴ培地０　、１　
ｍｌを加えた。１１および１４日目に、培養上清０　、
１　ｍｌを捨て、ヒポキサンチン１１００ｔｔ、チミジ
ン１６μＭを含む完全ＲＰＭＩ培地（ＨＴ培地）０．１
ｍｌを加えた。計５０６ウエルの中で４６０のウェルか
らハイブリドーマのコロニーが出現した。

（：３）　　ハイブリドーマの選択 培養ウェル中のハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で培
養し、その培養土清中の特異抗体産生の有無を次のよう
にして検出した。

ポリスチレン製マイクロタイタープレートの各ウェルに
、ヒトＩｇＥ（免疫に用いたもの；工ｇＥ・λ）を０．
ＯＩＭ’Ｊン酸緩衝食塩液（ｐＨ７４）にとかした溶液
（１０μｇ／ｍ１）５０μ１２を入れ、３７℃で１時間
放置した後、１０％ウシ胎児血清を含む０．ＯＩＭリン
酸緩衝食塩漬（ｐＨ７４）１００μｐを加え、３７℃で
２０分間ブロックした。０．０５％ツイーン２０を含む
０．ＯＩＭノン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，４）で洗浄し、
ヒトＩｇＥ固相ウェルを作製した。ヒトＩｇＥ固相つエ
ルに培養上清５０μＰを加え、３７°Ｃで１時間インキ
ュベートした。上記と同様に洗浄後、第２抗体として、
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識家兎抗マウスＩｇＧ（
Ｈ＋Ｌ）抗体５０μｉを加え、３７℃で１時間インキュ
ベートした。同様に洗浄後、１．１％過酸化水素水と１
５０μｇ　／　ｍｌのアジノービス（３−エチルベンゾ
デアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を含む５０
ｆｆＩＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４，５）５０μρを加え
、２５°Ｃで５分間発色せせた。停止液として２ｍＭア
ジ化ナトリウムを５０μ！加え、４５０ｎｍの吸光度を
マイクロプレート用の分光光度計により測定し、０５以
上の吸光度のあるハイブリドーマを計１４５ウェル選択
した。

免疫原としてのヒトＩｇＥに対して抗体産生を行なって
いるハイブリドーマについて、由来の異なるヒトＩｇＥ
（ＩｇＥ・に）およびヒトＩｇＧに対する反応の有無を
、上記と同様にＥＬＩＳＡ法で調べた。その結果、２種
のヒトＩｇＥに強く反応し、ヒトＩｇＧには反応しない
ハイブリドーマ４０ウエルを選択した。選択されたハイ
ブリドーマを限界希釈法によりクローニングし、出現し
たハイブリドーマクローンの培養上清につき、ヒト　エ
　ｇ　Ｅ　・　λ　、　　ヒ　ト　ＩｇＥ　　拳　に　
、　　ヒ　ト　ＩｇＡ　、　　ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＭ
およびヒト免疫グロブログノンＬ鎖λタイプ、Ｌｆｉに
タイプに対する抗体の反応特異性をＥＬＩＳＡ法で検定
した。

このようにして、ヒトＩｇＥに特異的に反応するモノク
ローナル抗体を産生ずるハイブリドーマが４０クローン
得られた。

これらのうちから、前記の特性を有し、後記実験例から
明らかな様に、本発明のヒトＩｇＥの免疫測定方法に適
したモノクローナル抗体ＨＥ−３９Ｅ、ＨＥ−２２Ａ、
ＨＥ−６９ＢおよびＨＥ−３５Ａを産生ずるハイブリド
ーマＨＥ−３９Ｅジオツギ（微工研菌寄第１１３８１号
）、ＨＥ−２２Ａンオノギ（微工研菌寄第１１３８２号
）、ＨＥ−６９Ｂジオツギ（微工研菌寄第１１３８３号
）およびＨＥ−３５Ａジオツギ（微工研菌寄第１１３８
４号）を選択した。

（（モノクローナル抗体の作製 （ａ）　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養法 ハイブリドーマを完全ＲＰＭＩ培地で増殖限界（ＩＸＩ
Ｏ’個／ｍ１）になるまで培養し、その培養上清を回収
した。

（ｂ）　　ｉｎ　ｖｉｖｏ培養法 あらかじめブリステン０　、５　ｍｌで腹腔内投与処理
したＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに、５Ｘ１０’個の
ハイブリドーマを腹腔内に移植した。約３週間後、マウ
スの腹部肥大を確かめて、その腹水を採取した。

（９モノクローナル抗体の精製 前工程で得られた腹水を１８％硫酸ナトリウム溶液で塩
析し、生じた沈殿を０．０１Ｍホウ酸緩衝食塩液（ｐＨ
８，０）に溶解後、同液にて透析した。塩析により得ら
れたモノクローナル抗体２０ｍｇを０．０１Ｍホウ酸緩
衝食塩液（ｐ）１８　、０　）　２ｍｌにとかし、プロ
ティンＡ−セファロース［ファルマシア社（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　ＡＢ　）　］のカラム（１，６Ｘ５ｃｍ）に
吸着びせた。まず、０．ＯＩＭホウ酸緩衝食塩液（ｐＨ
８，Ｏ）約５０ｍ１で不純物を流出し、次いで００１Ｍ
クエン酸緩衝食塩液（ｐＨ４，０）約１００＋ｎｌで溶
出して、精製モノクローナル抗体を得た。

ポリスチレン製マイクロタイタープレートの各ウェルに
、ヒトＩｇＥ２種［ＩｇＥ・λ（免疫原）、ＩｇＥ・に
（セロチック社）］、ヒヒトＩｇＧカペル社）、ヒトＩ
　ｇＭ（マイルス社）、ヒトＩｇＧ（マイルス社）およ
びヒト免疫グロブリンＬ鎖λタイプ、Ｌｕ４にタイプを
それぞれ０．０１ＭＩＪン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，４）
にとかした溶液（１０μｇ／ａ＋１）５０μ！を入れ、
３７℃で１時間放置した後、１０％ウシ胎児血清を含む
００１Ｍリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，４）　１００μＰ
を加え、３７℃で２０分間ブロックした。０．０５％ツ
イーン２０を含む０．ＯＩＭリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７
，４）で洗浄し、各種ヒト免疫グロブリン固相ウェルを
作製した０次に、１０％０％ラン血清を含む０．ＯＩＭ
ＩＪン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，４）にとかした精製モノ
クローナル抗体ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ−３
９ＥおよびＨＥ−６９Ｂ（１０μｇ／ｍ１）５０μＮを
加え、３７℃で１時間反応させた。上記と同様に洗浄後
、実施例１−（３）と同様の方法で発色させて吸光度を
測定した。

表１に示すように、ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ
−３９ＥおよびＨＥ−６９Ｂのモノクローナル抗体は、
２種のヒトＩｇＥにはそれぞれ反応するが、他のヒト免
疫グロブリンには反応しなかった。

１．３，４．６−チトラクロロー３α、６α−ジフェニ
ルグリコールウリル（ＩＯＤＯ−ＧＥＮ、ピアスケミカ
ル社）のジクロロメタン溶液（４０μｇ／ｍ１）５０μ
ｉをガラス試験管に入れ、風乾した。この試験官に０　
、１　Ｍ　ｌ）ン酸緩衝液（ｐＨ７，４）にとかしたモ
ノクローナル抗体ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ−
３９ＥまたはＨＥ−６９Ｂ（２ｍｇ／ｍ１）２５μｆｆ
ｉを加え、次いで放射性ヨウ化ナトリウム（Ｎａ”’１
　）０．５ｍＣ１１５μＰを加えて、室温で１５分間静
かに振壷した。

得られた反応液をセファデックスＧ−２５（ファルマシ
ア社）のカラム（１，６Ｘ１Ｂｃｍ）に通してリン酸緩
衝食塩水で溶出した。最先溶出区分を分取して、１′工
標識モノクロ一ナル抗体ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、
ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−６９Ｂをそれぞれ得た。

５ｔｎｇのＨＲＰを２ｍｌの００１Ｍ酢酸緩衝液にとか
し、同緩衝液０　、２　ｍｌにとかしたメタ過ヨウ素酸
ナトリウム２ｍｇを加え、２５°Ｃで２０分間反応させ
た。得られた反応液を、セファデックスＧ−２５のカラ
ム（１，６Ｘ１８ｃｍ）に通して、０００１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ４，５）で溶出した。最先溶出区分を分取して
、４１３ｎｍの吸光度から、１．４ｍｇの活性化ＨＲＰ
を得た。これに、１．２１の０．１Ｍ炭ｒＩ＆緩衝食塩
水にとかした２ｍｇのモノクローナル抗体ＨＥ−２２Ａ
、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ−３９ＥまたはＨＥ−６９Ｂを加
えて、２５℃で２時間反応許せた０次に０　、２　ｍｇ
の水素化ホウ素ナトリウム水溶液０　、１　ｍｌを加え
て、４℃で２時間反応させた。得られた反応液を、セフ
ァデックスＧ−２５のカラム（１，６Ｘ１Ｂｃｍ）に通
して、０．ＯＩＭリン際緩衝食塩水（ｐＨ７，４）で溶
出した。最先溶出区分４ｍｌを分取して、セフアクノル
Ｓ−２００（ファルマシア社）のカラム（１６Ｘ７０ｃ
ｍ）に通して、０．０１Ｍリン酸緩衝食塩水（ｐ）１７
．４）で溶出した。最先溶出区分を分取して、ＨＲＰｆ
ｆ識モノクローナル抗体ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、
ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−６９Ｂをそれぞれ得た。

東ｊ１乳エ ヒトＩ　ｇＥ（１０μｇ／＋ｎｌ）の１０％つ〉胎児血
清を含む０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，４）
１．５ｍｌを、５６℃で２時間熱処理した。

実験例１と同様の方法で、モノクローナル抗体ＨＥ−２
２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−６９Ｂ
の固相プレートを作製した０次いで、上記の熱処理ヒト
ＩｇＥ５００．１６７．５６．１９および２．１　（ｎ
　ｇ／ｍｌ）　５０　ｉｔ　ｌを加え、３７°Ｃで１時
間反応きせた。また、対照実験として、未処理ヒトＩｇ
Ｅを同様の濃度で反応きせた。洗浄の後、ＨＲＰ標識モ
ノクローナル抗体ＩＤ−１５Ｆ（本抗原ヒトＩｇＥのイ
ディオタイプ部分に反応する特性を有する）（１０μｇ
／ｍ１）５０μＰを加えて、３７℃で１時間反応移せた
。洗浄後、実施例１−（３）と同様の方法で全色移せて
吸光値を測定した。

図１に示すように、モノクローナル抗体ＨＥ−２２Ａお
よびＨＥ−６９Ｂは熱処理ヒトエｇＥに対して良く反応
したが、ＨＥ−３５Ａは熱処理ヒト１ｇＨに対する反応
が顕著に低下した。このような熱処理により、ＩｇＥの
Ｄε２領域の構造変化が起こることが知られており、Ｈ
Ｅ−３５Ａは、Ｄε２領域の熱感受性の構造を認識する
と考えられる。

Δ葺 エンドグリフジダーゼＦは、糖タンパク質の糖鎖部分に
作用して、切断する酵票である。

ヒトＩ　ｇ　Ｅ　（５ｍｇ／１Ｉｌｌ）の生理食塩溶液
０．１ｍｌに、エンドグリコンダーゼＦ　（８、３Ｕ／
ｍｌ）のエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（５０ｍｍ
ｏｌ／り、０．０５％アジ化ナトリウム、０．５％ドデ
シル硫酸ナトリウムおよび０．０５％ンイーン２０を含
む０．１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ６，１）０゜１２ｍ１
を加えて、３７℃で２００時間反応せてエンドグリコシ
ダーゼＦ処理ヒトＩｇＥを得た。

実施例１−（３）と同様の方法でエンドグリコシダーゼ
処理ヒトＩｇＥ固相プレートを作製した。また、対照実
験として未処理ヒトＩｇＥ固相プレートを作製した。次
に、ＨＲＰ！ｍモノクローナル抗体ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ
−３５Ａ、ＨＥ−２２ＡおよびＨＥ−６９Ｂの１０％ウ
シ胎児血清を含む００１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，４
）５０μＰを加えて３７°Ｃで１時間反応させた。洗浄
後、実施例１−（３）と同様の方法で発色啓せて吸光値
を測定した。

表２に示すように、モノクローナル抗体ＨＥ−３５Ａ、
ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−６９Ｂはエンドグルフシダー
ゼＦ処理ヒトＩｇＥにそれぞれ反応するが、ＨＥ−２２
ＡはニンドグリコシダーゼＦ処理ヒｌ−ＩｇＥに反応し
なかった。従って、ＨＥ−２２ＡはＩｇＥの糖鎖と密接
に関連する構造を認識すると考えられる。

実験例６ インヒビシヨンテストによるモノクローナル抗体の反応
特性 実施例１−（３）と同様の方法で、ヒト１ｇＥ固相プレ
ートを作製した。次にＨＲＰ標議モノクローナル抗体Ｈ
Ｅ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ３９ＥおよびＨＥ−６
９Ｂ（１０μｇ／ｍ１）５０μｅと、それぞれ未標識の
モノクローナル抗体ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ
−３９Ｅ、ＨＥ−６９Ｂおよび抗ＤＥ！抗体、抗Ｃε４
抗体（２０００，５００，１２５，３１２，７８および
Ｏμｇ／ｎ＋１）５０μＮずつを加えて、３７°Ｃで１
時間反応芒せた。洗浄後、実施例１−（３）と同様の方
法で発色許せて吸光値を測定した。

表３に示すように、ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ
−３９ＥおよびＨＥ−６９Ｂは、それぞれ同種の抗体に
よるヒトＩｇＥに対する反応阻害効果が認められたが、
異なる抗体間での反応阻害は認められなかった。又、Ｈ
Ｅ−３９ＥおよびＨＥ−６９Ｂは、モノクローナル抗り
ε１抗体による反応阻害が認められた。モノクローナル
抗Ｃε４抗体により阻害される抗体は認められなかっ叉
１１礼ヱ ヒトＩ　ｇ　Ｅ　（５ｍｇ／ｍｌ）の生理食塩溶液０．
２ｍｌに塩酸グアニジン（ｓＭ／Ｎ）および４％の２−
メルカブトエタノールを含む水溶液０　、２　ｍｌを加
えて、６０℃で２時間作用許せて、変性ヒトＩｇＥを得
た。

実施例１−（３）と同様の方法でモノクローナル抗体Ｈ
Ｅ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−
６９Ｂ固相プレートを作製した。

洗浄後、上記の変性ヒトＩｇＥ（１μｇ／＋ｎｌ）の１
０％ウシ胎児血清を含む０．ＯＬＭリン酸緩衝食塩溶液
５０μ！を加え、３７°Ｃで１時間反応きせた。又、こ
の時対照実験として、未変性ヒトＩｇ　Ｅ　（１ａ　ｇ
／ｍｌ）溶液５０μ！を加え、同様に３７°Ｃで１時間
反応させた。洗浄後、ＨＲＰ標識モノクローナル抗体Ｈ
Ｅ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−
６９Ｂ（１０μｇ／ｍ１）の１０％ウシ胎児血清を含む
００１Ｍリン＠緩衝食塩溶液５０μｐを加え、３７°Ｃ
で１時間反応源せた。洗浄後、実施例１−（３）と同様
の方法で発色許せて吸光価を測定した。

表４に示すように、モノクローナル抗体ＨＥ−２２Ａ、
ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−６９Ｂは、未
変性ＩｇＥと反応するが、変性工ｇＥとは反応しなかっ
た。

実施例１−（３）と同様の方法でモノクローナル抗体Ｈ
Ｅ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−
６９Ｂ同相プレートを作製した。

洗浄後、ヒトＩｇＥ１００００．２０００．４００．８
０．１６およびＯ（ｍｇ／　ｍｌ　）の１０％ウシ胎児
血清を含む０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝溶液（ｐＨ７４）５
０μＰを加え、３７°Ｃで１時間反応源せた。洗浄後実
験例５と同様の方法でＨＲＰ標識モノクローナル抗体Ｈ
Ｅ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−
６９Ｂと反応させた後、発色いせて吸光度を測定した。

図２に示すように、固相モノクローナル抗体と、ＨＲＰ
標識モノクローナル抗体の間で、異なる抗体の組合わせ
例ではヒトＩｇＥに対して反応性の高いアッセイ系とな
り、同種の抗体の組合わせ例では反応性の低いアッセイ
系となった。

実験例９ ヒｌ−Ｉ　　Ｅ抗体に対する　相定数 ヤケヒ５ウヒダニ（デルマトファコ゛イデス　ブテロニ
ンナス：　ＤＰ）特異ＩｇＥ陽性ヒト血清を混合して、
５０＋ｎｌのプール血清とした。このプール血清２００
μｇを試験官（ジオツギチューブ）に秤り取り、ＤＰ抗
原結合ビーズ（ダニ特異ＩｇＧテスト；ンオノギ製薬）
１個を加えて、２５°Ｃで３時間振盪しながら反応きせ
た０次に、０．０５％ツイーン２０を含む００１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，４）で洗浄した後、１ｌｌＩ−標識
モノクロナル抗体ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ−
３９ＥおよびＨＥ−６９Ｂ１０．５．２．５．１２５．
０６２５．０．３１３および０．１５６（μＣｉ／ｍｌ
）の１０％ウシ胎児血清を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，４）２００ｔｌｆを加えて、２５℃で１６時
間振盪しながら反応させた。

洗浄後、各試験管の放射能量を７−カウンターにて測定
した。

表５に示すように、ＤＰ特異１ｇＥ抗体の親和性は、Ｈ
Ｅ−３５Ａ＞ＨＥ−６９Ｂ＞ＨＥ−２２ＡＣＨＥ−３９
Ｅの順に高く、同様にモノクローナル抗体の結合可能部
位（エピトープ密度）も、ＨＥ−３５Ａ＞ＨＥ−６９Ｂ
＞ＨＥ−２２Ａ＞ＨＥ−３９Ｈの順に高かった。

ポリスチレンビーズ（イムノケミカルネ土）１０００個
に、モノクローナル抗体ＨＥ−６９Ｂ（４０Ｉｔ　ｇ／
ｍｌ）　０．ＯＬＭリン酸緩衝食塩溶液（ｐＨ７，４）
２００ｍｌを加え、３７℃で２０時間放置した。モノク
ローナル抗体溶液を除去した後、０、ＯＬＭリン酸緩衝
食塩液（ｐＨ７，４）でビーズを洗浄し、次に０１％の
ラン血清アルブミンを含む０．ＯＬＭリン！＃緩衝食塩
液（ｐ）１７．４　）　２００ｍ１を加え、３７℃で３
時間放置した。００５％ツイーン２０を含む００１Ｍリ
ン＃！緩衝液（ｐＨ７，４）で洗浄し、モノクローナル
抗体ＨＥ−６９Ｂ結合ビーズを作製した。

ヒトＩｇＥを、１０％ウシ胎児血清を含む０゜０１Ｍリ
ン酸緩衝食塩液で、５０００．１０００．２００．４０
．８．１．６およびＯＩＵ／ｍｌとなるように調製して
、試験管にそれぞれ５０μＰずつ秤取した０次に、各試
験管に＋＋ＡＩ＝標識モノクローナル抗体ＨＥ−２２Ａ
、ＨＥ−３５ＡまたはＨＥ−３９Ｅ（３，７，ｚｃｉ／
＋ｎ１）１００μＰを加えて混和した。また、あらかし
め混合したＨＥ−２２ＡＸＨＥ−３５ＡおよびＨＥ−３
９Ｅ（３，７μｃｉ／＋ｎｌ）　１００　Ｉｔ　Ｉ！を
加えて混和した。モノクローナル抗体ＨＥ−６９Ｂ結合
ビーズを各試験管に１個ずつ加え、２５°Ｃで３時間反
応許せた。洗浄後、各試験管の放射能量を７−カウンタ
ーにて測定した。

図３に示すように、ＨＥ−３５ＡではヒトＩｇＥ　０．
３２〜２００　　Ｉ　Ｕ／ｍｌ（６２５倍）、ＨＥ−２
２Ａでは１．６〜１０００　　ＩＵ／ｍ１（６２５倍）
、ＨＥ−３９ＥＴは、４０〜５０００ＩＵ／ｍｌ（１２
５倍）の濃度領域で、それぞれヒトエｇＥ濃度に対して
感度曲線が得られた。一方、同一の比放射能量を有する
ＩＩＪ−標識モノクローナル抗体ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−
３５Ａお誹びＨＥ−３９Ｅを、あらかじめ適当なタンパ
ク質濃度比（３：１：６）で混合した場合、ヒトＩｇＥ
０゜３２〜５０００　　ＩＵ／ｍ１（１５６２５倍）に
宜る広い濃度領域で感度曲線が得られた。

（以下余白） 十＋：強陽性 陽性 ：　陰性 吸光値 ＾４８０ ＋＋：　　強陽性 ：　陽性 陰性 表４ サンドウィッチＥＬＴＳＡ系に於けるモノクロ獣性ｒｇ
Ｅに対する反応性 ナル抗体の 強陽性 陽性 陰性

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のモノクローナル抗体の熱処理ＩｇＥ
に対する反応性を示した図。 第２図は、本発明のモノクローナル抗体を組み合わせた
サンドウィッチＥＬＩＳＡ系における、モノクローナル
抗体のＩｇＥ感度曲線を示した区。 第３図は、本発明のモノクローナル抗体ＨＥ−６９Ｂの
固相ビーズを用いたサンドウィッチＲＩＡ系での、３種
のモノクローナル抗体（ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、
ＨＥ−３９Ｅ）およびこれら３種の混合抗体によるＩｇ
Ｅ感度曲線を示した図。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ヒトＩｇＥに特異的に結合するモノクローナル抗
   体ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ−３９ＥおよびＨ
   Ｅ−６９Ｂからなる群から選択されるモノクローナル抗
   体。 （２）ヒトＩｇＥの糖鎖と密接に関連する構造を認識す
   る請求項１記載のモノクローナル抗体ＨＥ−２２Ａ。 （３）ヒトＩｇＥのＤε２ドメインを認識する請求項１
   記載のモノクローナル抗体ＨＥ−３５Ａ。 （４）モノクローナル抗体ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−６
   ９Ｂからなる群から選択され、ヒトＩｇＥのＤε１ドメ
   インを認識し、なおかつ互いに異なる部分に結合する請
   求項１記載のモノクローナル抗体。 （５）未変性のヒトＩｇＥに強く結合するが、変性した
   ヒトＩｇＥには結合しない請求項１記載のモノクローナ
   ル抗体。 （６）請求項１記載の群のそれぞれのモノクローナル抗
   体がヒトＩｇＥの異なる領域に結合し、なおかつ該群中
   の他のモノクローナル抗体のヒトＩｇＥに対する結合に
   影響されることなくヒトＩｇＥに結合することのできる
   請求項１記載のモノクローナル抗体。 （７）モノクローナル抗体ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ
   およびＨＥ−３９Ｅからなる群から選択されるモノクロ
   ーナル抗体であって、該群中のそれぞれのモノクローナ
   ル抗体がヒトＩｇＥに対して異なる親和性で結合し、な
   おかつこれらを混合することによってヒトＩｇＥに対す
   る反応性の強さを調節することのできることを特徴とす
   る請求項１記載のモノクローナル抗体。 （８）マウスのＩｇＧに属する請求項１記載のモノクロ
   ーナル抗体。 （９）請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル
   抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。 （１０）請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナ
   ル抗体ＨＥ−２２Ａ、ＨＥ−３５ＡおよびＨＥ−３９Ｅ
   からなる群から選択される異なる２種以上のモノクロー
   ナル抗体を混合し、ヒトＩｇＥに対して所望の反応性を
   もつようにしたモノクローナル抗体混合物。（１１）請
   求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体ＨＥ
   −２２Ａ、ＨＥ−３５Ａ、ＨＥ−３９ＥおよびＨＥ−６
   ９Ｂからなる群から選択されるモノクローナル抗体を固
   相化し、得られた固相化抗体をヒトＩｇＥを含有する試
   料と接触させることにより該固相化固体と該ヒトＩｇＥ
   を結合させ、該固相化抗体に結合した該ヒトＩｇＥに、
   該群から選択され該固相化抗体とは異なる標識されたモ
   ノクローナル抗体を結合させるヒトＩｇＥの免疫測定法
   。 （１２）請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナ
   ル抗体ＨＥ−６９Ｂを固相化し、得られた固相化抗体を
   ヒトＩｇＥを含有する試料と接触させることにより該固
   相化抗体と該ヒトＩｇＥを結合させ、該固相化抗体に結
   合した該ヒトＩｇＥに標識した請求項１０に記載のモノ
   クローナル抗体混合物を結合させるヒトＩｇＥの免疫測
   定法。 （１３）固相化抗原にヒトＩｇＥを含有する試料を接触
   させ、該試料中の該抗原に特異的なヒトＩｇＥ抗体を該
   固相化抗原に結合させ、該固相化抗原に結合した該抗原
   特異性ヒトＩｇＥ抗体に標識した請求項１〜８のいずれ
   かに記載のモノクローナル抗体を結合させる抗原特異性
   ヒトＩｇＥ抗体の免疫測定法。