JPH1121300A - 抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマ細胞株 - Google Patents
抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマ細胞株Info
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- JPH1121300A JPH1121300A JP9178059A JP17805997A JPH1121300A JP H1121300 A JPH1121300 A JP H1121300A JP 9178059 A JP9178059 A JP 9178059A JP 17805997 A JP17805997 A JP 17805997A JP H1121300 A JPH1121300 A JP H1121300A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 糖鎖認識性を有するヒト由来のトランスフェ
リンに対するモノクローナル抗体及びこれを産生するハ
イブリドーマを提供する。 【解決手段】 ヒト由来のトランスフェリンの糖鎖部分
を認識することを特徴とする抗ヒトトランスフェリンモ
ノクローナル抗体。
リンに対するモノクローナル抗体及びこれを産生するハ
イブリドーマを提供する。 【解決手段】 ヒト由来のトランスフェリンの糖鎖部分
を認識することを特徴とする抗ヒトトランスフェリンモ
ノクローナル抗体。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗ヒトトランスフ
ェリンモノクローナル抗体とこれを産生するハイブリド
ーマ細胞株に関するものであり、さらに詳しくは、糖鎖
認識性を有するヒト由来のトランスフェリンに対するモ
ノクローナル抗体と、これを産生するハイブリドーマ細
胞株に関するものである。
ェリンモノクローナル抗体とこれを産生するハイブリド
ーマ細胞株に関するものであり、さらに詳しくは、糖鎖
認識性を有するヒト由来のトランスフェリンに対するモ
ノクローナル抗体と、これを産生するハイブリドーマ細
胞株に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】トランスフェリンは別名鉄結合性グロブ
リンとも呼ばれ、血中の輸送鉄と結合する分子量約８万
の蛋白質である。このトランスフェリンを先天的に欠損
している患者は無トランスフェリン血症と呼ばれてい
る。トランスフェリンは尿中に微量排泄されており、こ
のトランスフェリンの量を測定することによって糖尿病
性腎症を早期診断することが近年報告されている（臨床
病理、４３巻、４５４頁、１９９５年）。さらに、トラ
ンスフェリンの糖鎖のもつ電気的特性の差が腎症の進行
度に関係していること（同上文献）及び糖尿性網膜症の
進行度とも相関していることが報告されている（臨床病
理、４３巻、１２３５頁、１９９５年）。また、近年ヒ
ト血清中のトランスフェリンの糖鎖部分の構造が癌によ
って種々変化することが報告されるようになり、例えば
木幡は、血清トランスフェリンの糖鎖を認識する抗体を
用いた酵素免疫法〔エンザイム リンクド イムノソル
ベント アッセイ（以下ＥＬＩＳＡと略す）法〕により
肝癌、肝硬変と肝炎とを明らかに区別できるのではない
かとの考えを発表している（代謝、２７巻増刊号、２６
３頁、１９９０年）。さらに、木幡らは、糖鎖構造に特
徴を有するトランスフェリンを数例報告しており、この
ようなトランスフェリンを抗原として用いて対応する抗
トランスフェリン抗体が得られれば、肝癌の診断に有用
であろうと提言している（特開平２ ３４６０１号公
報）。
リンとも呼ばれ、血中の輸送鉄と結合する分子量約８万
の蛋白質である。このトランスフェリンを先天的に欠損
している患者は無トランスフェリン血症と呼ばれてい
る。トランスフェリンは尿中に微量排泄されており、こ
のトランスフェリンの量を測定することによって糖尿病
性腎症を早期診断することが近年報告されている（臨床
病理、４３巻、４５４頁、１９９５年）。さらに、トラ
ンスフェリンの糖鎖のもつ電気的特性の差が腎症の進行
度に関係していること（同上文献）及び糖尿性網膜症の
進行度とも相関していることが報告されている（臨床病
理、４３巻、１２３５頁、１９９５年）。また、近年ヒ
ト血清中のトランスフェリンの糖鎖部分の構造が癌によ
って種々変化することが報告されるようになり、例えば
木幡は、血清トランスフェリンの糖鎖を認識する抗体を
用いた酵素免疫法〔エンザイム リンクド イムノソル
ベント アッセイ（以下ＥＬＩＳＡと略す）法〕により
肝癌、肝硬変と肝炎とを明らかに区別できるのではない
かとの考えを発表している（代謝、２７巻増刊号、２６
３頁、１９９０年）。さらに、木幡らは、糖鎖構造に特
徴を有するトランスフェリンを数例報告しており、この
ようなトランスフェリンを抗原として用いて対応する抗
トランスフェリン抗体が得られれば、肝癌の診断に有用
であろうと提言している（特開平２ ３４６０１号公
報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、具体的に糖鎖
認識性を有するトランスフェリンの抗体が取得されたと
の報告はなく、糖鎖認識性を有するトランスフェリンの
抗体の開発が望まれている。本発明は、糖鎖認識性を有
する抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体及びこ
のような抗体を産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とするものである。
認識性を有するトランスフェリンの抗体が取得されたと
の報告はなく、糖鎖認識性を有するトランスフェリンの
抗体の開発が望まれている。本発明は、糖鎖認識性を有
する抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体及びこ
のような抗体を産生するハイブリドーマを提供すること
を目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究の結果、細胞融合により糖
鎖認識性を有するヒト由来のトランスフェリンに対する
抗体を取得することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、第１の発明は、ヒト由来のトランスフェ
リンの糖鎖部分を認識することを特徴とする抗ヒトトラ
ンスフェリンモノクローナル抗体を要旨とするものであ
る。また、第２の発明は、上記のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞株を要旨とするものであ
る。
題を解決するために鋭意研究の結果、細胞融合により糖
鎖認識性を有するヒト由来のトランスフェリンに対する
抗体を取得することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、第１の発明は、ヒト由来のトランスフェ
リンの糖鎖部分を認識することを特徴とする抗ヒトトラ
ンスフェリンモノクローナル抗体を要旨とするものであ
る。また、第２の発明は、上記のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞株を要旨とするものであ
る。
【０００５】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。この発明のモノクローナル抗体は、上記の通り、
ヒト由来のトランスフェリンの糖鎖部分、特に正常な糖
鎖部分を認識し、糖鎖の遊離したトランスフェリンは認
識しないという性質を有するものである。
する。この発明のモノクローナル抗体は、上記の通り、
ヒト由来のトランスフェリンの糖鎖部分、特に正常な糖
鎖部分を認識し、糖鎖の遊離したトランスフェリンは認
識しないという性質を有するものである。
【０００６】このようなモノクローナル抗体は、例え
ば、ヒト由来のトランスフェリンを免疫した動物から調
製したリンパ球と、ミエローマ細胞とを融合し、得られ
たハイブリドーマからヒト由来のトランスフェリンに対
する抗体を特異的に産生する細胞を選別し、これをクロ
ーン化して細胞株としたうえで、この細胞株を培養する
ことにより得ることができる。
ば、ヒト由来のトランスフェリンを免疫した動物から調
製したリンパ球と、ミエローマ細胞とを融合し、得られ
たハイブリドーマからヒト由来のトランスフェリンに対
する抗体を特異的に産生する細胞を選別し、これをクロ
ーン化して細胞株としたうえで、この細胞株を培養する
ことにより得ることができる。
【０００７】すなわち、まず、ヒト由来のトランスフェ
リン（例えば、シグマ社製）を抗原として哺乳動物、好
ましくはマウス又はラットに免疫する。抗原の使用量、
投与部位、アジュバントの使用等の免疫の方法として
は、従来の抗血清を得る方法に準ずればよく、例えば、
マウスを用いる場合、マウス１匹あたり１回につき０．
００１〜１０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１ｍｇのヒト
由来のトランスフェリンを、初回はアジュバント（例え
ば、フロイントの完全アジュバンド）とよく混合して、
皮下、腹腔内等に投与する。２週間以上経過後、ヒト由
来のトランスフェリンを再びアジュバント（例えば、フ
ロイントの不完全アジュバント）とよく混合して、皮
下、腹腔内等に投与する。さらに２週間以上経過後、ヒ
ト由来のトランスフェリンのみを静脈内、皮下、腹腔等
に投与して、十分免疫する。この様にして免疫された動
物を好ましくは最終免疫から２〜４日後に殺し、リンパ
球を採取する。リンパ球調製には、脾臓、リンパ節、抹
消血等を用いることができる。このようにして得られた
リンパ球はイーグル最小培地（以下、ＭＥＭ培地と略
す）やＲＰＭＩ（Rosewell Park Memorial institute)
１６４０培地等に懸濁状態にほぐしておけばよい。
リン（例えば、シグマ社製）を抗原として哺乳動物、好
ましくはマウス又はラットに免疫する。抗原の使用量、
投与部位、アジュバントの使用等の免疫の方法として
は、従来の抗血清を得る方法に準ずればよく、例えば、
マウスを用いる場合、マウス１匹あたり１回につき０．
００１〜１０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１ｍｇのヒト
由来のトランスフェリンを、初回はアジュバント（例え
ば、フロイントの完全アジュバンド）とよく混合して、
皮下、腹腔内等に投与する。２週間以上経過後、ヒト由
来のトランスフェリンを再びアジュバント（例えば、フ
ロイントの不完全アジュバント）とよく混合して、皮
下、腹腔内等に投与する。さらに２週間以上経過後、ヒ
ト由来のトランスフェリンのみを静脈内、皮下、腹腔等
に投与して、十分免疫する。この様にして免疫された動
物を好ましくは最終免疫から２〜４日後に殺し、リンパ
球を採取する。リンパ球調製には、脾臓、リンパ節、抹
消血等を用いることができる。このようにして得られた
リンパ球はイーグル最小培地（以下、ＭＥＭ培地と略
す）やＲＰＭＩ（Rosewell Park Memorial institute)
１６４０培地等に懸濁状態にほぐしておけばよい。
【０００８】このリンパ球に、同じくＭＥＭ培地やＲＰ
ＭＩ１６４０培地等に懸濁したミエローマを混合し、融
合促進剤を用いて細胞融合を行う。ミエローマとして
は、被免疫動物と同じ種由来のものであることが好まし
い。さらに、薬剤抵抗性の変異株であることが好まし
く、未融合のミエローマがハイブリドーマ選択培地で生
育しないものが好ましい。最も一般には８−アザグアニ
ン抵抗性の細胞ラインが用いられる。これは、ヒポキサ
ンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ
（Hypoxantin guanine phosphoribosyl transferase ）
が欠損しており、選択培地の一種ヒポキサンチン−アミ
ノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地で生育できないと
いう特徴を有している。また、使用するミエローマ自身
が抗体を分泌しないものが望ましい。以上の点から、例
えば、市販のマウスミエローマＰ３・Ｘ６３・Ａｇ８・
６・５・３（Ｘ６３・６・５・３）、Ｐ３・Ｘ６３・Ａ
ｇ８・Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ラットミエローマ210 ・ＲＣ
Ｙ３・Ａｇ１・２・３等を用いることが好ましい。この
ようなミエローマは、血清、好ましくは牛胎児血清を含
有するＭＥＭ培地やＲＰＭＩ１６４０培地等で培養すれ
ばよい。
ＭＩ１６４０培地等に懸濁したミエローマを混合し、融
合促進剤を用いて細胞融合を行う。ミエローマとして
は、被免疫動物と同じ種由来のものであることが好まし
い。さらに、薬剤抵抗性の変異株であることが好まし
く、未融合のミエローマがハイブリドーマ選択培地で生
育しないものが好ましい。最も一般には８−アザグアニ
ン抵抗性の細胞ラインが用いられる。これは、ヒポキサ
ンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ
（Hypoxantin guanine phosphoribosyl transferase ）
が欠損しており、選択培地の一種ヒポキサンチン−アミ
ノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地で生育できないと
いう特徴を有している。また、使用するミエローマ自身
が抗体を分泌しないものが望ましい。以上の点から、例
えば、市販のマウスミエローマＰ３・Ｘ６３・Ａｇ８・
６・５・３（Ｘ６３・６・５・３）、Ｐ３・Ｘ６３・Ａ
ｇ８・Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ラットミエローマ210 ・ＲＣ
Ｙ３・Ａｇ１・２・３等を用いることが好ましい。この
ようなミエローマは、血清、好ましくは牛胎児血清を含
有するＭＥＭ培地やＲＰＭＩ１６４０培地等で培養すれ
ばよい。
【０００９】リンパ球とミエローマ細胞との混合比とし
ては、特に限定されるものではないが、好ましくはリン
パ球：ミエローマが細胞数で１：１〜２０：１であり、
さらに好ましくは５：１〜１０：１である。
ては、特に限定されるものではないが、好ましくはリン
パ球：ミエローマが細胞数で１：１〜２０：１であり、
さらに好ましくは５：１〜１０：１である。
【００１０】融合促進剤としては、種々の高分子物質や
ウイルス等を用いることができるが、好ましくはポリエ
チレングリコール（以下、ＰＥＧと略す）やセンダイウ
イルスである。ＰＥＧとしては、平均分子量４００〜２
０，０００のものが好ましく、特に１，０００〜７，５
００のものが好ましい。また、使用濃度としては、４０
〜６０vol.％が好ましい。融合方法としては、一般的な
融合方法に従って行えばよく、例えば、イムノロジカル
メソッズ（Immunological Methodos）２巻、２８５頁に
従って行えばよい。
ウイルス等を用いることができるが、好ましくはポリエ
チレングリコール（以下、ＰＥＧと略す）やセンダイウ
イルスである。ＰＥＧとしては、平均分子量４００〜２
０，０００のものが好ましく、特に１，０００〜７，５
００のものが好ましい。また、使用濃度としては、４０
〜６０vol.％が好ましい。融合方法としては、一般的な
融合方法に従って行えばよく、例えば、イムノロジカル
メソッズ（Immunological Methodos）２巻、２８５頁に
従って行えばよい。
【００１１】このようにして融合させた細胞を洗浄して
融合促進剤を除去した後、５〜１５vol.％の血清を含む
ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等の細胞培養用培地
に懸濁して９６穴培養皿等に０．５〜５×１０6 ／穴の
割合で分注し、さらに、各穴に選択培地（例えばＨＡＴ
培地）を加え、選択培地を交換しながら培養すると、１
０〜１４日後には、未融合のミエローマは死滅し、ま
た、リンパ球も長時間生体外（in vitro）では生育でき
ず、死滅するため、ハイブリドーマのみを選択すること
ができる。
融合促進剤を除去した後、５〜１５vol.％の血清を含む
ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等の細胞培養用培地
に懸濁して９６穴培養皿等に０．５〜５×１０6 ／穴の
割合で分注し、さらに、各穴に選択培地（例えばＨＡＴ
培地）を加え、選択培地を交換しながら培養すると、１
０〜１４日後には、未融合のミエローマは死滅し、ま
た、リンパ球も長時間生体外（in vitro）では生育でき
ず、死滅するため、ハイブリドーマのみを選択すること
ができる。
【００１２】次に、このハイブリドーマからヒト由来の
トランスフェリンに対するモノクローナル抗体を特異的
に産生するハイブリドーマを選別する。そのための方法
としては、ＥＬＩＳＡ法を用いることができ、例えば、
市販のＥＬＩＳＡプレート等の固相にヒト由来のトラン
スフェリンを吸着させ、これにハイブリドーマ上清を加
え、洗浄後、市販の免疫動物の免疫グロブリンに対する
標識抗体〔例えば、ホース ラディッシュ パーオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体あるいは１２５Ｉ標識抗体〕
を添加し、標識によるシグナルの有無を手がかりとし
て、ヒト由来のトランスフェリンに対する抗体が産生さ
れているウェルを選択する。さらに、限界希釈法によっ
てクローニングを行うことによりハイブリドーマ細胞株
を創製することができる。
トランスフェリンに対するモノクローナル抗体を特異的
に産生するハイブリドーマを選別する。そのための方法
としては、ＥＬＩＳＡ法を用いることができ、例えば、
市販のＥＬＩＳＡプレート等の固相にヒト由来のトラン
スフェリンを吸着させ、これにハイブリドーマ上清を加
え、洗浄後、市販の免疫動物の免疫グロブリンに対する
標識抗体〔例えば、ホース ラディッシュ パーオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体あるいは１２５Ｉ標識抗体〕
を添加し、標識によるシグナルの有無を手がかりとし
て、ヒト由来のトランスフェリンに対する抗体が産生さ
れているウェルを選択する。さらに、限界希釈法によっ
てクローニングを行うことによりハイブリドーマ細胞株
を創製することができる。
【００１３】最後に、このようにして得られたハイブリ
ドーマ細胞株から、抗体を採取し、糖鎖認識性を有する
抗体を選択する。ハイブリドーマ細胞株から、抗体の採
取方法としては、大きく分けて２通りの方法がある。１
つは、培地を用い、フラスコ等の培養容器で培養し、そ
の上清液から抗体を採取する方法である。例えば、２〜
１０vol.％の血清を含むＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ１６４
０培地に、０．５〜５×１０5 個のハイブリドーマ細胞
株を植えると、２〜４日で１０〜２０倍に生育するの
で、その培養後の上澄液から抗体を採取する方法であ
る。もう１つの方法は、このようにして培養容器で培養
したハイブリドーマ細胞株を、同系の動物に接種する方
法である。すなわち、このようにして培養したハイブリ
ドーマ細胞株１０5 〜１０7 個を同系の動物の皮下又は
腹腔内等に投与し、７〜２０日後ハイブリドーマ細胞株
が増殖し、腫瘍が大きくなったときに、血清又は腹水を
採取する方法である。腹腔内に投与する場合には、投与
する３〜７日前に２、６、１０、１４−テトラメチルペ
ンタデカン等の鉱物油を投与しておくことにより多量の
腹水を得ることができる。
ドーマ細胞株から、抗体を採取し、糖鎖認識性を有する
抗体を選択する。ハイブリドーマ細胞株から、抗体の採
取方法としては、大きく分けて２通りの方法がある。１
つは、培地を用い、フラスコ等の培養容器で培養し、そ
の上清液から抗体を採取する方法である。例えば、２〜
１０vol.％の血清を含むＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ１６４
０培地に、０．５〜５×１０5 個のハイブリドーマ細胞
株を植えると、２〜４日で１０〜２０倍に生育するの
で、その培養後の上澄液から抗体を採取する方法であ
る。もう１つの方法は、このようにして培養容器で培養
したハイブリドーマ細胞株を、同系の動物に接種する方
法である。すなわち、このようにして培養したハイブリ
ドーマ細胞株１０5 〜１０7 個を同系の動物の皮下又は
腹腔内等に投与し、７〜２０日後ハイブリドーマ細胞株
が増殖し、腫瘍が大きくなったときに、血清又は腹水を
採取する方法である。腹腔内に投与する場合には、投与
する３〜７日前に２、６、１０、１４−テトラメチルペ
ンタデカン等の鉱物油を投与しておくことにより多量の
腹水を得ることができる。
【００１４】このようにして得られた抗体は、必要に応
じて精製する。精製の方法としては、硫安分画、イオン
交換クロマトグラフィー、プロテインＡを固定したアフ
ィニティークロマトグラフィー等、通常タンパク質の精
製に適用されうる手段を用いることができる。
じて精製する。精製の方法としては、硫安分画、イオン
交換クロマトグラフィー、プロテインＡを固定したアフ
ィニティークロマトグラフィー等、通常タンパク質の精
製に適用されうる手段を用いることができる。
【００１５】抗体の糖鎖認識性の確認は、糖鎖を遊離し
たヒト由来のトランスフェリンを用いたウエスタンブロ
ット法によって行うことができる。ヒト由来のトランス
フェリンの糖鎖を遊離する方法としては、ヒト由来のト
ランスフェリンに、例えばＮ−グリコシダーゼＦ、エン
ドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＨ等の酵
素を作用させればよい。反応条件としては、各酵素の至
適ｐＨ、温度において、ヒト由来トランスフェリンを分
解するのに必要な酵素量を作用させればよく、特に全て
の糖鎖を遊離する必要はない。糖鎖が遊離したことの確
認は、ヒト由来のトランスフェリンと酵素を作用させた
ヒト由来のトランスフェリンのドデシル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）を行い、ヒト由来トランスフェリンよりもバンドが
低分子側へシフトすることにより確認することができる
〔バイオケミストリー（Biochemistry）、24、4665-467
1(1985) 〕。
たヒト由来のトランスフェリンを用いたウエスタンブロ
ット法によって行うことができる。ヒト由来のトランス
フェリンの糖鎖を遊離する方法としては、ヒト由来のト
ランスフェリンに、例えばＮ−グリコシダーゼＦ、エン
ドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＨ等の酵
素を作用させればよい。反応条件としては、各酵素の至
適ｐＨ、温度において、ヒト由来トランスフェリンを分
解するのに必要な酵素量を作用させればよく、特に全て
の糖鎖を遊離する必要はない。糖鎖が遊離したことの確
認は、ヒト由来のトランスフェリンと酵素を作用させた
ヒト由来のトランスフェリンのドデシル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）を行い、ヒト由来トランスフェリンよりもバンドが
低分子側へシフトすることにより確認することができる
〔バイオケミストリー（Biochemistry）、24、4665-467
1(1985) 〕。
【００１６】また、ウエスタンブロットの方法として
は、糖鎖を遊離したヒト由来のトランスフェリンを、陰
性対照にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、陽性対照にヒ
ト由来のトランスフェリンを用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等
のこれらの蛋白質の分離が可能な電気泳動を行う。この
泳動ゲル中の蛋白質を例えばニトロセルロース、二フッ
化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）等の蛋白質に対して高い
結合性をもつメンブレンに電気的に転写する。蛋白質を
転写させたメンブレンは、非特異的反応による抗体の結
合を防止する目的で、例えばＢＳＡ、スキムミルク、ゼ
ラチン等の蛋白質で表面をブロッキングした後、上記で
得た抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体を反応
させる。メンブレンを洗浄した後、さらに市販の免疫動
物免疫グロブリンに対する標識抗体（例えば、ＨＲＰ標
識抗体あるいは金コロイド標識抗体等）を二次抗体とし
て作用させる。このようにすれば糖鎖認識性を有する抗
体では、糖鎖を遊離したヒト由来のトランスフェリンに
は反応が現れないので、抗体の糖鎖認識性を確認するこ
とができる。
は、糖鎖を遊離したヒト由来のトランスフェリンを、陰
性対照にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、陽性対照にヒ
ト由来のトランスフェリンを用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等
のこれらの蛋白質の分離が可能な電気泳動を行う。この
泳動ゲル中の蛋白質を例えばニトロセルロース、二フッ
化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）等の蛋白質に対して高い
結合性をもつメンブレンに電気的に転写する。蛋白質を
転写させたメンブレンは、非特異的反応による抗体の結
合を防止する目的で、例えばＢＳＡ、スキムミルク、ゼ
ラチン等の蛋白質で表面をブロッキングした後、上記で
得た抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体を反応
させる。メンブレンを洗浄した後、さらに市販の免疫動
物免疫グロブリンに対する標識抗体（例えば、ＨＲＰ標
識抗体あるいは金コロイド標識抗体等）を二次抗体とし
て作用させる。このようにすれば糖鎖認識性を有する抗
体では、糖鎖を遊離したヒト由来のトランスフェリンに
は反応が現れないので、抗体の糖鎖認識性を確認するこ
とができる。
【００１７】以上の方法に従って創製した糖鎖認識性を
有する抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞株の１株をハイブリドーマＵ
ＨＴＦ１と命名し、平成９年５月１４日に工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託の手続きを行った。その受
託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１６２２３である。このＵＨＴ
Ｆ１は、−１２０℃以下でほぼ永久的に冷凍保存が可能
であって、たえず頒布可能な状態に置かれている。
有する抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞株の１株をハイブリドーマＵ
ＨＴＦ１と命名し、平成９年５月１４日に工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託の手続きを行った。その受
託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１６２２３である。このＵＨＴ
Ｆ１は、−１２０℃以下でほぼ永久的に冷凍保存が可能
であって、たえず頒布可能な状態に置かれている。
【００１８】このハイブリドーマＵＨＴＦ１は通常用い
られる培地で増殖可能である。例えば、牛胎児血清を２
〜２０vol.％含有するＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培
地等の細胞培養用培地で、３７℃、炭酸ガス濃度５vol.
％含有空気下で増殖させることができる。また、ミエロ
ーマの造腫瘍性をも有しているので、生体内（例えば、
同系の動物、ヌードマウス等）で増殖し、糖鎖認識性を
有するヒト由来のトランスフェリンに対するモノクロー
ナル抗体を産生することができる。
られる培地で増殖可能である。例えば、牛胎児血清を２
〜２０vol.％含有するＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培
地等の細胞培養用培地で、３７℃、炭酸ガス濃度５vol.
％含有空気下で増殖させることができる。また、ミエロ
ーマの造腫瘍性をも有しているので、生体内（例えば、
同系の動物、ヌードマウス等）で増殖し、糖鎖認識性を
有するヒト由来のトランスフェリンに対するモノクロー
ナル抗体を産生することができる。
【００１９】
【実施例】次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。 実施例１ （１）ハイブリドーマの作成 １ｍｇ／ｍｌのヒト由来のトランスフェリン（シグマ社
より入手）を完全フロイントアジュバント（シグマ社よ
り入手）と容量比で１：１に混合乳化し、これを８週齢
のマウスＢａｌｂ／ｃ（オリエンタルバイオサービスよ
り入手）の腹腔内に１匹当たり２００μｌずつ投与し
た。２週間後、１ｍｇ／ｍｌのヒト由来のトランスフェ
リンを不完全フロイントアジュバント（シグマ社より入
手）と容量比で１：１に混合乳化し、腹腔内に１匹当た
り２００μｌずつ投与した。さらに２週間後、１ｍｇ／
ｍｌのヒト由来のトランスフェリン２００μｌを腹腔内
に投与して、３日後に脾臓を取り出し、ＭＥＭ培地（半
井化学より入手）にほぐして懸濁洗浄した。この脾細胞
４×１０8 個を、２日前から培養し、対数増殖期にある
細胞を遠心分離で集めておいたマウスのミエローマＸ６
３・６・５・３（京都大学より入手）４×１０7 個と混
合し、遠心によりペレットした後、３７℃の水浴中で５
０vol.％のＰＥＧ4000（シグマ社製）−ＧＩＴ培地（和
光純薬より入手）２ｍｌを徐々に１分間で加え、１分間
緩やかに撹拌した後、さらに２０ｍｌのＧＩＴ培地を徐
々に加えてＰＥＧ4000を希釈した。遠心分離によりＰＥ
Ｇ溶液を除去した後、ペレットに１０vol.％の牛胎児血
清（ハイクローン社製）を含むＨＡＴ培地２０ｍｌを加
え、２皿の９６穴培養皿（コーニング社製）の各穴に
０．２ｍｌずつ分注した。４、９日目の計２回にわた
り、半分量の培地を捨て、新しいＨＡＴ培地を加えた。
その結果、１２日後には、３８４穴中１８７穴でハイブ
リドーマの生育が観察された。
る。 実施例１ （１）ハイブリドーマの作成 １ｍｇ／ｍｌのヒト由来のトランスフェリン（シグマ社
より入手）を完全フロイントアジュバント（シグマ社よ
り入手）と容量比で１：１に混合乳化し、これを８週齢
のマウスＢａｌｂ／ｃ（オリエンタルバイオサービスよ
り入手）の腹腔内に１匹当たり２００μｌずつ投与し
た。２週間後、１ｍｇ／ｍｌのヒト由来のトランスフェ
リンを不完全フロイントアジュバント（シグマ社より入
手）と容量比で１：１に混合乳化し、腹腔内に１匹当た
り２００μｌずつ投与した。さらに２週間後、１ｍｇ／
ｍｌのヒト由来のトランスフェリン２００μｌを腹腔内
に投与して、３日後に脾臓を取り出し、ＭＥＭ培地（半
井化学より入手）にほぐして懸濁洗浄した。この脾細胞
４×１０8 個を、２日前から培養し、対数増殖期にある
細胞を遠心分離で集めておいたマウスのミエローマＸ６
３・６・５・３（京都大学より入手）４×１０7 個と混
合し、遠心によりペレットした後、３７℃の水浴中で５
０vol.％のＰＥＧ4000（シグマ社製）−ＧＩＴ培地（和
光純薬より入手）２ｍｌを徐々に１分間で加え、１分間
緩やかに撹拌した後、さらに２０ｍｌのＧＩＴ培地を徐
々に加えてＰＥＧ4000を希釈した。遠心分離によりＰＥ
Ｇ溶液を除去した後、ペレットに１０vol.％の牛胎児血
清（ハイクローン社製）を含むＨＡＴ培地２０ｍｌを加
え、２皿の９６穴培養皿（コーニング社製）の各穴に
０．２ｍｌずつ分注した。４、９日目の計２回にわた
り、半分量の培地を捨て、新しいＨＡＴ培地を加えた。
その結果、１２日後には、３８４穴中１８７穴でハイブ
リドーマの生育が観察された。
【００２０】（２）ヒト由来のトランスフェリンに対す
る抗体を特異的に産生するハイブリドーマ細胞株の創製 ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製）に５０ｍＭの炭酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解したヒト由来の
トランスフェリンを各穴につき５０μｌずつ分注し、２
５℃で２時間放置した後、この溶液を除去し、１．０重
量％ＢＳＡ、０．１５Ｍの塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．２）からなる洗浄液で各穴をよく洗浄してヒト由来
のトランスフェリン固定化プレートを作成した。このプ
レートに生育が観察されたウェルのハイブリドーマ上清
５０μｌを添加して２５℃で２時間放置した後、上述の
洗浄液で充分に洗浄した。各穴にＨＰＲ標識ヤギ抗マウ
スＩｇＧ（バイオラッド社製）１μｇ／１ｍｌを５０μ
ｌづつ加え、２５℃で２０分反応させた後、１０重量％
のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）５０μｌを添加し
てパーオキシダーゼ活性を停止させ、４１５ｎｍの吸光
度（Ａ４１５）を測定した。対照としてハイブリドーマ
上清のかわりにＨＡＴ培地を用い、この対照より高いシ
グナルを示したウェルを選択し、限界希釈法にてクロー
ニングを行い、モノクローンのハイブリドーマ細胞株１
０株を得た。
る抗体を特異的に産生するハイブリドーマ細胞株の創製 ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製）に５０ｍＭの炭酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解したヒト由来の
トランスフェリンを各穴につき５０μｌずつ分注し、２
５℃で２時間放置した後、この溶液を除去し、１．０重
量％ＢＳＡ、０．１５Ｍの塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．２）からなる洗浄液で各穴をよく洗浄してヒト由来
のトランスフェリン固定化プレートを作成した。このプ
レートに生育が観察されたウェルのハイブリドーマ上清
５０μｌを添加して２５℃で２時間放置した後、上述の
洗浄液で充分に洗浄した。各穴にＨＰＲ標識ヤギ抗マウ
スＩｇＧ（バイオラッド社製）１μｇ／１ｍｌを５０μ
ｌづつ加え、２５℃で２０分反応させた後、１０重量％
のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）５０μｌを添加し
てパーオキシダーゼ活性を停止させ、４１５ｎｍの吸光
度（Ａ４１５）を測定した。対照としてハイブリドーマ
上清のかわりにＨＡＴ培地を用い、この対照より高いシ
グナルを示したウェルを選択し、限界希釈法にてクロー
ニングを行い、モノクローンのハイブリドーマ細胞株１
０株を得た。
【００２１】（３）モノクローナル抗体の採取 このようにして得られたハイブリドーマ細胞株１０株を
２vol.％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬より
購入）で培養し、細胞濃度が２×１０6 細胞／ｍｌに達
した時点で培養物５０ｍｌを遠心分離し、その上清を孔
径０．４／μｍのフィルターで濾過した後、プロテイン
Ｇ−セファロース（ＢＩＯ ＲＡＤ社製：ｐＨ９．０）
に吸着させ、クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出して
ヒト由来のトランスフェリンに対する抗体を得た。
２vol.％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬より
購入）で培養し、細胞濃度が２×１０6 細胞／ｍｌに達
した時点で培養物５０ｍｌを遠心分離し、その上清を孔
径０．４／μｍのフィルターで濾過した後、プロテイン
Ｇ−セファロース（ＢＩＯ ＲＡＤ社製：ｐＨ９．０）
に吸着させ、クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出して
ヒト由来のトランスフェリンに対する抗体を得た。
【００２２】（４）糖鎖認識性抗体の選択 ヒト由来のトランスフェリン（シグマ社製）２５０μｇ
とＮ−グリコシダーゼＦ（ベーリンガーマンハイム社
製）１Ｕを１２ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）２０
０μｌに溶解し、３７℃で４６時間反応させて糖鎖を遊
離させた。糖鎖が遊離していることは、このＮ−グリコ
シダーゼ処理を行ったヒト由来のトランスフェリンを、
Ｎ−グリコシダーゼ処理を行っていないヒト由来のトラ
ンスフェリンと共にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｎ−グリ
コシダーゼ処理を行ったヒト由来のトランスフェリン
（糖鎖を遊離したヒト由来のトランスフェリン）のバン
ドがヒト由来のトランスフェリンのバンドよりも低分子
側へシフトしていることから確認した。次いで、一般的
に知られているウエスタンブロット法を用いて抗体の糖
鎖認識性の確認を行なった。すなわち、このようにして
得た糖鎖を遊離したヒト由来のトランスフェリンを、陰
性対照としてＢＳＡ（シグマ社製）、陽性対照としてヒ
ト由来のトランスフェリンを用い、これらと同時にＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを行った。この泳動ゲルからＰＶＤＦメン
ブレン（MILLIPORE 社製）へ電気的に蛋白質を転写し、
メンブレンを水洗後、ブロッキング剤（大日本製薬より
入手）に室温で３０分間浸漬することによりブロッキン
グを行った。このメンブレンに上記（３）で採取したモ
ノクローナル抗体を添加して室温（約２０℃）で１時間
反応させた後、ＴＢＳＴ（Tris Bufferd Salines in Tw
een20 ）で洗浄し、さらに、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩ
ｇＧ抗体（バイオラッド社製）と室温で１時間作用させ
た。ＴＴＢＳで洗浄した後、パーオキシダーゼ測定試薬
（フナコシより入手）を用いて、ＨＲＰによるシグナル
を検出した。その結果、１０株の産生する抗体のうちの
一つで陽性対照であるヒト由来のトランスフェリンのバ
ンドにはシグナルが現れたにもかかわらず糖鎖を遊離し
たヒト由来のトランスフェリンのバンドにはシグナルが
認められなかった。この抗体を産生するハイブリドーマ
細胞株をＵＨＴＦ１と命名し、平成９年５月１４日付け
で工業技術院生命工学工業研究所に寄託した。その受託
番号はＦＥＲＭ Ｐ−１６２２３である。
とＮ−グリコシダーゼＦ（ベーリンガーマンハイム社
製）１Ｕを１２ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）２０
０μｌに溶解し、３７℃で４６時間反応させて糖鎖を遊
離させた。糖鎖が遊離していることは、このＮ−グリコ
シダーゼ処理を行ったヒト由来のトランスフェリンを、
Ｎ−グリコシダーゼ処理を行っていないヒト由来のトラ
ンスフェリンと共にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｎ−グリ
コシダーゼ処理を行ったヒト由来のトランスフェリン
（糖鎖を遊離したヒト由来のトランスフェリン）のバン
ドがヒト由来のトランスフェリンのバンドよりも低分子
側へシフトしていることから確認した。次いで、一般的
に知られているウエスタンブロット法を用いて抗体の糖
鎖認識性の確認を行なった。すなわち、このようにして
得た糖鎖を遊離したヒト由来のトランスフェリンを、陰
性対照としてＢＳＡ（シグマ社製）、陽性対照としてヒ
ト由来のトランスフェリンを用い、これらと同時にＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを行った。この泳動ゲルからＰＶＤＦメン
ブレン（MILLIPORE 社製）へ電気的に蛋白質を転写し、
メンブレンを水洗後、ブロッキング剤（大日本製薬より
入手）に室温で３０分間浸漬することによりブロッキン
グを行った。このメンブレンに上記（３）で採取したモ
ノクローナル抗体を添加して室温（約２０℃）で１時間
反応させた後、ＴＢＳＴ（Tris Bufferd Salines in Tw
een20 ）で洗浄し、さらに、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩ
ｇＧ抗体（バイオラッド社製）と室温で１時間作用させ
た。ＴＴＢＳで洗浄した後、パーオキシダーゼ測定試薬
（フナコシより入手）を用いて、ＨＲＰによるシグナル
を検出した。その結果、１０株の産生する抗体のうちの
一つで陽性対照であるヒト由来のトランスフェリンのバ
ンドにはシグナルが現れたにもかかわらず糖鎖を遊離し
たヒト由来のトランスフェリンのバンドにはシグナルが
認められなかった。この抗体を産生するハイブリドーマ
細胞株をＵＨＴＦ１と命名し、平成９年５月１４日付け
で工業技術院生命工学工業研究所に寄託した。その受託
番号はＦＥＲＭ Ｐ−１６２２３である。
【００２３】参考例１ 実施例１で得たハイブリドーマ細胞株ＵＨＴＦ１の産生
する抗体（以下、ＵＨＴＦＡｂと略す）とペプシン（シ
グマ社製）をｐＨ３．５の条件下で重量比２００：１で
混合し、３７℃で６時間消化を行ってＵＨＴＦ１Ａｂの
Ｆ（ａｂ’）2を得た。さらに、これに２−メルカプト
エチルアミンを重量比３：１で混合し、３７℃で９０分
間反応させてＦａｂ’を得た。ＨＲＰ（シグマ社製）に
Ｎ−スクシニミジル・マレイミドカルボキシレートを重
量比１０：３で混合し、３０℃で１時間反応させてマレ
イミド基を導入した後、このマレイミド基を導入したＨ
ＲＰとＵＨＴＦ１Ａｂ・Ｆａｂ’を重量比１：１で混合
し、３０℃で１時間反応させてＨＲＰ標識ＵＨＴＦ１Ａ
ｂ・Ｆａｂ’を作製した。
する抗体（以下、ＵＨＴＦＡｂと略す）とペプシン（シ
グマ社製）をｐＨ３．５の条件下で重量比２００：１で
混合し、３７℃で６時間消化を行ってＵＨＴＦ１Ａｂの
Ｆ（ａｂ’）2を得た。さらに、これに２−メルカプト
エチルアミンを重量比３：１で混合し、３７℃で９０分
間反応させてＦａｂ’を得た。ＨＲＰ（シグマ社製）に
Ｎ−スクシニミジル・マレイミドカルボキシレートを重
量比１０：３で混合し、３０℃で１時間反応させてマレ
イミド基を導入した後、このマレイミド基を導入したＨ
ＲＰとＵＨＴＦ１Ａｂ・Ｆａｂ’を重量比１：１で混合
し、３０℃で１時間反応させてＨＲＰ標識ＵＨＴＦ１Ａ
ｂ・Ｆａｂ’を作製した。
【００２４】参考例２ 参考例１で作製したＨＲＰ標識ＵＨＴＦ１Ａｂ・Ｆａ
ｂ’を用い、肝癌患者と健常人の血清トランスフェリン
を以下の方法によって酵素免疫学的に測定した。まず、
ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製）にリン酸緩衝液
（１リットル中にＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、
ＫＨ2 ＰＯ4 ０．２ｇ、Ｎａ2 ＨＰＯ4・１２Ｈ2 Ｏ
２．９ｇ、ｐＨ７．５）で抗体濃度５０μｌに調製し
たマウス抗ヒトトランスフェリン抗体（フナコシ社製）
を各穴に５０μｌずつ分注し、２５℃で２時間放置し
た。この液を除去した後、１．０重量％のＢＳＡを含む
０．１５ＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）で各穴をよ
く洗浄し、マウス抗ヒトトランスフェリン抗体固定化プ
レートを作成した。次いで、このプレートに正常人及び
肝癌患者の血清をＰＢＳで１００倍に希釈したものを５
０μｌ添加し、２５℃で２時間放置した後、各穴を１．
０重量％のＢＳＡを含む０．１５ＭのＮａＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．２）で十分に洗浄し、１μｇ／ｍｌのＨＰＲ
標識ＵＨＴＦ１Ａｂ・Ｆａｂ’を各穴に５０μｌ加え、
２５℃で２０分反応させ、１０重量％のＳＤＳを５０μ
ｌ添加してパーオキシダーゼ活性を停止させ、４１５ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。その結果を表１に示す。
ｂ’を用い、肝癌患者と健常人の血清トランスフェリン
を以下の方法によって酵素免疫学的に測定した。まず、
ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ社製）にリン酸緩衝液
（１リットル中にＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、
ＫＨ2 ＰＯ4 ０．２ｇ、Ｎａ2 ＨＰＯ4・１２Ｈ2 Ｏ
２．９ｇ、ｐＨ７．５）で抗体濃度５０μｌに調製し
たマウス抗ヒトトランスフェリン抗体（フナコシ社製）
を各穴に５０μｌずつ分注し、２５℃で２時間放置し
た。この液を除去した後、１．０重量％のＢＳＡを含む
０．１５ＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）で各穴をよ
く洗浄し、マウス抗ヒトトランスフェリン抗体固定化プ
レートを作成した。次いで、このプレートに正常人及び
肝癌患者の血清をＰＢＳで１００倍に希釈したものを５
０μｌ添加し、２５℃で２時間放置した後、各穴を１．
０重量％のＢＳＡを含む０．１５ＭのＮａＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．２）で十分に洗浄し、１μｇ／ｍｌのＨＰＲ
標識ＵＨＴＦ１Ａｂ・Ｆａｂ’を各穴に５０μｌ加え、
２５℃で２０分反応させ、１０重量％のＳＤＳを５０μ
ｌ添加してパーオキシダーゼ活性を停止させ、４１５ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。その結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】表１から、本発明のモノクローナル抗体を
用いてトランスフェリンの測定を行うと肝癌患者では正
常人に比べて低い吸光度を示すことがわかる。
用いてトランスフェリンの測定を行うと肝癌患者では正
常人に比べて低い吸光度を示すことがわかる。
【００２７】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、ヒト由
来のトランスフェリンの糖鎖認識性を有するので、癌等
の疾患の診断に用いることができ、さらにはその他疾患
に関する基礎研究に貢献することが可能となる。また、
本発明のハイブリドーマ細胞株は、このようなヒト由来
のトランスフェリンの糖鎖認識性を有するモノクローナ
ル抗体を産生することができる。
来のトランスフェリンの糖鎖認識性を有するので、癌等
の疾患の診断に用いることができ、さらにはその他疾患
に関する基礎研究に貢献することが可能となる。また、
本発明のハイブリドーマ細胞株は、このようなヒト由来
のトランスフェリンの糖鎖認識性を有するモノクローナ
ル抗体を産生することができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒト由来のトランスフェリンの糖鎖部分
を認識することを特徴とする抗ヒトトランスフェリンモ
ノクローナル抗体。 - 【請求項２】 請求項１記載のモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9178059A JPH1121300A (ja) | 1997-07-03 | 1997-07-03 | 抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマ細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9178059A JPH1121300A (ja) | 1997-07-03 | 1997-07-03 | 抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマ細胞株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1121300A true JPH1121300A (ja) | 1999-01-26 |
Family
ID=16041896
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9178059A Pending JPH1121300A (ja) | 1997-07-03 | 1997-07-03 | 抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマ細胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1121300A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013071127A1 (en) * | 2011-11-09 | 2013-05-16 | Alper Biotech, Llc | Monoclonal antibodies against serotransferrin antigens, and uses therefor |
-
1997
- 1997-07-03 JP JP9178059A patent/JPH1121300A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013071127A1 (en) * | 2011-11-09 | 2013-05-16 | Alper Biotech, Llc | Monoclonal antibodies against serotransferrin antigens, and uses therefor |
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