JP2004506603A - ヒトｌｄｌ受容体に対するモノクローナル抗体、その産生および用途 - Google Patents
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Abstract
ＬＤＬの同定および精製、および、たとえばＣ型肝炎感染の治療において有用なヒトＬＤＬ受容体に対するモノクローナル抗体を提供する。
Description
【０００１】
［本発明の分野］
本発明は、低密度リポタンパク質に対するヒト受容体（ＬＤＬＲ）を特異的に認識するモノクローナル抗体に関する。それらの抗体は、たとえば、生産工程におけるヒト可溶性ＬＤＬＲ（ｈｓＬＤＬＲ）の同定および精製、ならびにＣ型肝炎感染（ＨＣＶ）などの疾患の同定および治療において有用である。
【０００２】
［本発明の背景］
すべての真核生物の形質膜の成分であるコレステロールは、高等生物における細胞の増殖および生存に必須である。しかしながら、コレステロールの高い血清レベルは、全身の動脈におけるアテローム硬化性のプラーク形成の一因となることにより、疾患および死を引き起こす。哺乳動物におけるコレステロール合成の主な部位は肝臓である。コレステロールのかなりの量が腸によっても形成されている。それらの臓器によるコレステロール形成の速度は、食事供給源（ｄｉｅｔａｒｙ ｓｏｕｒｃｅｓ）から吸収されるコレステロールの量に対して非常に反応しやすい。肝臓および腸以外の細胞は、新たなコレステロールの合成によってではなく、血漿からコレステロールを得る。コレステロールおよびほかの脂質は、増加する密度にしたがって分類されるリポタンパク質により、体液に輸送される。リポタンパク質は、極性脂質とアポタンパク質とからなる外皮に囲まれた疎水性脂質のコアからなる粒子である。そのようなリポタンパク質は、高い疎水性の脂質を可溶化し、特異的な標的細胞や組織の中および外への特定の脂質の移動を制御するシグナルを収容するという、２つの役割を担う。コレステロールは、非肝細胞の形質膜上にある特異的受容体に結合する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）により、体液に輸送される。ついで、受容体−ＬＤＬ複合体は、受容体媒介エンドサイトーシスとして知られる輸送機構により、細胞の中へと内在化される（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． １９７９）。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体は、哺乳動物細胞において多数のリガンドのエンドサイトーシスを媒介する、構造的に関連付けられた細胞表面受容体のファミリーのプロトタイプである。
【０００３】
ＬＤＬ受容体は８２２アミノ酸残基からなり、１６４０００の分子量を示す。ＬＤＬ受容体はいくつかのドメインからなり、そのドメイン中には他のタンパク質に配列相同性を有するものがある。そのＮＨ２末端のリガンド結合ドメインは、７つのシステインリッチの不完全な繰り返しを配された２９２残基からなる。各繰り返しは、１つから３つのパターンでジスルフィド結合された６つのシステイン残基を含有する（Ｂｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ． １９９５）。このドメインに、４つのさらなるドメインが続く。第１番目は４００アミノ酸残基からなりかつＥＧＦ受容体に相同性を有しており、第２番目はＯ−結合糖に富む５８アミノ酸残基からなるものであり、第３番目は２２アミノ酸残基からなる１つの膜貫通ドメインであり、および第４番目は５０アミノ酸残基からなる細胞質ドメインである（Ｓｕｄｈｏｆ ｅｔ ａｌ． １９８５）、（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ． １９８６）。
【０００４】
ＬＤＬ受容体の生理学的な重要性は、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）に関するＢｒｏｗｎおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎの研究により明らかにされた。当該疾患は、ＬＤＬに対する機能的な受容体の欠如または欠失を生じる分子遺伝学的障害が原因で発見された（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ． １９７６）。ＦＨ突然変異の種類のいくつかは特徴づけられた（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． １９７５）。
【０００５】
抗ウイルス活性を示す可溶型のｓＬＤＬＲは、インターフェロンに誘導された細胞の培養上清から（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９３）および体液において（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９４）同定され単離された。インターフェロンに誘導されるタンパク質のいくつかは、ＩＦＮによる抗ウイルス状態の誘導に役立つものとして同定されている。抗ウイルス活性を示すそのようなタンパク質の１つが、ヒト羊膜ＷＩＳＨ細胞の培養上清に産生され蓄積された。このタンパク質が均質に精製され、そしてｓＬＤＬＲとして同定された（ＥＰ０５５３６６７およびＦｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９３を参照）。ｓＬＤＬＲは、インターフェロンに応答して抗ウイルス状態にはいる哺乳動物細胞により、培地中に分泌されることが見出された。インターフェロンと異なり、ｓＬＤＬＲは細胞において抗ウイルス状態を誘導しないが、それ自体で抗ウイルス性である。ｓＬＤＬＲは、ウイルスの複製、成熟および出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）の過程で存在していなければならないようであることが分かり、ｓＬＤＬＲは、ウイルスの集合または出芽の阻害を導く複雑な過程に関連しているかもしれないことが示唆された（未公開データ）。Ｃ型肝炎ウイルスのエンドサイトーシスは、培養細胞上のＬＤＬ受容体により媒介されていることが最近示された（Ａｇｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ． １９９９）。それらおよびほかの発見は、ＬＤＬ受容体のファミリーがウイルス受容体として働き得ることを示唆する。したがって、ｓＬＤＬＲ受容体に対する抗体は、細胞のＬＤＬ受容体に結合することによるウイルス粒子の侵入および出芽を妨害するかもしれない。
【０００６】
これまでに知られているＬＤＬＲの唯一入手可能なモノクローナル抗体は、ウシＬＤＬＲの抗体であるＣ７であり（Ｂｅｉｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ． １９８１，アマシャム社、ＵＫより商業的に入手可能）、均質に精製されたウシ副腎皮質ＬＤＬＲによるマウスの免疫化により製造された。ウシ副腎皮質由来の膜が可溶化され、受容体はＤＥＡＥセルロースカラムからの溶出により部分的に精製された（Ｂｅｉｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ． １９８１）。ウシＬＤＬＲの抗体は、ヒトＬＤＬＲと弱い交差反応を示すのみである。
【０００７】
実際、ウシＬＤＬＲに対するＣ７Ｍａｂは、組換えヒトＬＤＬＲの検出および定量に使用される際に著しい不利益を有することが分かった：
ａ）Ｃ７Ｍａｂは、ヒトＬＤＬＲに対して非常に低い親和性を有する。
ｂ）Ｃ７Ｍａｂは、細胞培養物由来の不純物と顕著に交差反応する。
【０００８】
ヒトＬＤＬＲの特異的な抗体は、以前は入手可能ではなかった。精製、同定のために、または検定開発目的のために新規タンパク質に対する抗体をおこすことは非常に一般的であるため、これは驚くべきことである。モノクローナル抗体を生成するための条件は、効果的なマウスの免疫化を可能とする、利用可能な充分に量の多い高度に精製された抗原であるため、そのような抗体はこれまでつくられていないということが考えられる。高度に精製された抗原は、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて単一の大きなピークとしてあらわれるものである。さらには、精製過程で抗原の同定および定量の方法を確立することは容易ではなかった。本発明により、本願明細書において説明される抗ウイルス活性検定は、精製過程でＬＤＬＲの同定に使用された。
【０００９】
効果的な免疫検定（ＥＬＩＳＡ）を開発するための方法、およびウェスタンブロットにおいてタンパク質を同定するための方法を提供するために、ヒト可溶性ＬＤＬＲに対する特異的Ｍａｂを生成する必要がある。それらの抗体は、組換えヒト可溶性ＬＤＬＲの産生および精製過程の進行中における組換えタンパク質の記録および定量のために、および天然タンパク質の検出のために必要とされる。
【００１０】
［本発明の要旨］
本発明は、ヒトＬＤＬ受容体およびその断片を特異的に認識して結合することができるモノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞株の生成を可能とする。
【００１１】
さらに詳細には、本発明は、ヒト可溶性ＬＤＬ受容体を特異的に認識して結合することができるモノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞株の生成を可能とする。
【００１２】
したがって、本発明は、モノクローナル抗体Ｃ７を除く、ヒトＬＤＬ受容体およびその断片を特異的に認識して結合するモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗−抗Ｉｄ抗体またはそれらの断片に関する。
【００１３】
本発明は、ヒト可溶性ＬＤＬＲを認識して結合し、下記の要求を満たすモノクローナル抗体を提供する。
１．ヒト可溶性ＬＤＬＲの検出のためのＥＬＩＳＡ、たとえばサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、における対として使用され得るＭａｂ
２．ウェスタンブロット分析におけるＬＤＬＲの同定のために使用され得るＭａｂ
３．ヒト可溶性ＬＤＬＲの抗ウイルス性生物学的活性を中和するために使用され得るＭａｂ
４．ＨＣＶなどのウイルス感染を阻害するために使用され得るＭａｂ。
【００１４】
本発明はさらに、ヒトＬＤＬＲの検出および／または定量の目的で、既知の方法での本発明の特異的モノクローナル抗体の使用を含む、ヒトＬＤＬＲの検出および／または定量方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、組換えヒトＬＤＬＲで免疫化した哺乳動物由来の脾臓細胞および均質もしくは不均質のリンパ系細胞からなるクローン化されたハイブリドーマを提供する。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体は、従来の方法で、たとえばｈｓＬＤＬで免疫化した哺乳動物由来の脾臓細胞および均質もしくは不均質のリンパ系細胞からなるクローン化されたハイブリドーマを液体培地または哺乳動物の腹腔において増殖させ、ハイブリドーマがモノクローナル抗体を産出および蓄積することを可能にすることにより、製造される。
【００１７】
さらにもうひとつの態様において、本発明は、粗ＬＤＬＲ含有する材料を本発明のモノクローナル抗体に接触させることを含むヒトＬＤＬＲの精製方法を提供する。吸着させたＬＤＬＲ特異的なモノクローナル抗体を含むカラムは、組換えタンパク質の精製方法におけるアフィニティー精製工程として使用し得る。
【００１８】
組換え体ヒトＬＤＬＲの検出および測定方法は、実施例５に記載されているようなＥＬＩＳＡ検定において、本発明のモノクローナル抗体を抗体として使用することを含む。
【００１９】
動物用を免疫化するためのＬＤＬＲまたはＬＤＬＲの断片としては、温血哺乳動物のＬＤＬＲであるかぎり、いかなるＬＤＬＲも使用し得る。ＬＤＬＲのムテインもまた使用し得る。そのような哺乳動物のヒト可溶性ＬＤＬＲの代表例は、ヒトＬＤＬＲの配列の位置＋４のアミノ酸Ａｓｐで始まり位置＋２９１のアミノ酸Ｇｌｕで終わるアミノ酸配列を含む可溶性ＬＤＬＲ＋２９１型であり、＋２９２型などのほかの型も同様に使用し得る。
【００２０】
［本発明の詳細な説明］
ヒト可溶性ＬＤＬＲ（ｈｓＬＤＬＲ）に対するモノクローナル抗体を生成する。それらのモノクローナル抗体を使用することにより、ｈｓＬＤＬＲの同定のためのＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングならびにｈｓＬＤＬＲの抗ウイルス活性に対する中和検定を開発した。
【００２１】
Ｍａｂは、ヒト可溶性ＬＤＬＲのＡｓｐ＋４からＧｌｕ＋２９１までのＮ末端リガンド結合ドメインからなるｈｓＬＤＬＲの組換え体＋２９１型で免疫化したマウスにおいて、生成された。ｈｓＬＤＬＲの組換え体＋２９１型はＣＨＯ細胞で産生され、均質に精製された。
【００２２】
免疫化したマウスは、著しい力価の特異的抗体を産生した。ハイブリドーマのスクリーニングののち、５つのクローン（番号１２、２８、２９、３０および５０）が、高抗体プロデューサーとして同定された。サブクローニングのために、それらのクローンはさらに選択された。サブクローニングののち、高抗体産生能を有する２９のサブクローンを単離し、親クローン由来のアンプルおよびサブクローン由来のアンプルを凍結した。
【００２３】
一組のモノクローナル抗体を、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対するＥＬＩＳＡ用に選択した。Ｍａｂ２８をコーティング抗体として選択し、そしてビオチンで標識化したＭａｂ２９．８を第２抗体として選択した。Ｍａｂ１２．６および２９．８は、ウェスタンブロット解析における天然および組換え体ｈｓＬＤＬＲの同定に適していることが見出され、そしてＭａｂ２８および３０はウェスタンブロット解析における組換え体ｈｓＬＤＬＲの同定に適していることが見出された。Ｍａｂ１２．６および５０．３０は、ｈｓＬＤＬＲの抗ウイルス活性を阻害するために適していることが見出された。
【００２４】
本発明により、Ｍａｂ１２．６、２８および２９．８は、ヒト肝細胞の初代培養におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のウイルスゲノム複製を阻害することも見出された。このように、それらの抗体は、Ｃ型肝炎感染の治療に使用され得る（図３）。
【００２５】
それらのクローンにより産生されるＭａｂのサブクラスアイソタイプが決定された。クローン１２．６、２８、２９．８および３０はＩｇＧ１として同定され、一方、クローン５０．３０はＩｇＭであることが見出された。
【００２６】
ｈｓＬＤＬＲの＋２９１型に対して開発されたＭａｂは、ｈｓＬＤＬＲのほかの型、すなわち組換え体ＣＨＯ細胞において産生されるｒ−ｈｓＬＤＬＲの＋２９２型および＋３３１型をも、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット解析において認識した。＋２９２型はアミノ酸残基Ａｓｐ＋４からＣｙｓ＋２９２までの受容体のＮ末端部を含み、そして＋３３１型はアミノ酸残基Ａｓｐ＋４からＣｙｓ＋３３１までの受容体のＮ末端部を含む。
【００２７】
モノクローナル抗体を生成するためのマウスの免疫化に使用される抗原は、ＣＨＯ細胞において産生されるｒ−ｈｓＬＤＬＲ＋２９１型であった。そのｒ−ｈｓＬＤＬＲの産生は、固定相フィブラセルマトリクスシステム（Ｆｉｂｒａｃｅｌ ｍａｔｒｉｘ ｓｙｓｔｅｍ）を用いるバイオリアクターにおいて実施された。ｒ−ｈｓＬＤＬＲは均質に精製され、そしてマウスを免疫化するために使用された。
【００２８】
最も優れたマウス免疫応答動物由来の免疫脾臓細胞は、ハイブリドーマの融合および生成のために使用された。
【００２９】
本明細書において記載される抗体に関し、用語「モノクローナル抗体」は、
モノクローナル抗体、キメラ抗体、完全にヒト化した抗体、可溶型または結合型で標識化され得る抗イデオタイプ抗体に対する抗体（抗−抗Ｉｄ抗体）、ならびに、酵素的切断、ペプチド合成または組換え技術などの、しかしながらそれらに限定されないあらゆる既知の技術により提供されるそれらの断片を含むことを意味する。
【００３０】
モノクローナル抗体は、抗原に特異的な抗体の実質的に均質な集団を含み、該集団は実質的に同種のエピトープ結合部位を含有する。Ｍａｂは当業者に知られる方法により得ることができる。たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５−４９７ （１９７５）； Ｕ． Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４， ３７６， １１０； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８）； ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｎ． Ｙ．，（１９９２−１９９６）を参照のこと。これらの参考文献の内容は、出典を指示することにより完全に本明細書に取りこまれる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤおよびそれらのサブクラスを含むあらゆる免疫グロブリンのクラスであってよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロ、インサイチュまたはインビボで培養してもよい。インビボまたはインサイチュでの高力価のＭａｂの産生は、現在の好ましい産生方法である。
【００３１】
キメラ抗体は、マウスＭａｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどの、異なる部位が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体は、主として、投与の際に免疫原性を低下させるため、および産生の際に収率をあげるために使用されている。たとえば、マウスのＭａｂはハイブリドーマからの高い収率であるが、ヒトにおいて高い免疫原性を有しているため、ヒト／マウスキメラＭａｂｓが使用される。キメラ抗体およびそれらの産生方法は当業者に知られている（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ３２７３−３２７７ （１９８４）： Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１： ６８５１−６８５５ （１９８４） ； Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６４３−６４６ （１９８４）； Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １２５０２３ （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １４． １９８４）： Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ２６８−２７０ （１９８５）； Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １７１４９６ （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９， １９８５）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １７３４９４ （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｒｃｈ ５． １９８６）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ８６０１５３３， （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｒｃｈ １３， １９８６）； Ｋｕｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １８４１８７ （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊｕｎｅ １１， １９８６）； Ｓａｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７： １０６６−１０７４ （１９８６）； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． Ｗ０８７０２６７１ （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｙ ７， １９８７）； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４： ３４３９−３４４３ （１９８７）； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４： ２１４−２１８ （１９８７）； Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０： １０４１−１０４３ （１９８８）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ３２３−３２７； Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ｓｕｐｒａ． ）。これらの参考文献は、出典を指示することにより完全に本明細書に取りこまれる。
【００３２】
「完全なヒト化抗体」は、ヒト免疫グロブリンの可変領域および定常領域を共に含有する分子である。完全にヒト化した抗体は、治療の用途に潜在的に使用され得る。自己免疫疾患などの慢性および再発性の疾患に対しては繰り返し治療することが要求される。完全なヒト抗体の製造方法は、内因性のＩｇ遺伝子を不活性にしたマウスにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入することによるマウス体液性免疫系の「ヒト化」、すなわちヒトＩｇを産生することができるマウス系統（ゼノマウス）の産生からなる。一般的な免疫応答を最終的に引き起こすために要求されるＩｇ遺伝子座の物質的な構造ならびに遺伝子転位および発現過程に関して、Ｉｇ遺伝子座は非常に複雑である。抗体多様性は、Ｉｇ遺伝子座に存在する様々なＶ、ＤおよびＪ遺伝子間のコンビナトリアル転位によって主に生成される。それらの遺伝子座はまた、抗体発現、対立遺伝子排除、クラススイッチおよび親和性成熟を制御する散在性制御因子を含有する。転位していないヒトＩｇ導入遺伝子のマウスへの導入は、マウスの組換え機構がヒト遺伝子に適合することを証明した。さらに、様々なアイソタイプの抗原特異的ｈｕ−ｍＡｂを分泌するハイブリドーマは、抗原によるゼノマウス免疫化によって得ることができる。
【００３３】
完全なヒト化抗体およびそれらの産生方法は、当業者に知られている（Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５： １４６−１５６ （１９９７）： Ｂｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｘ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１： １３２３−１３２６ （１９９１）； Ｔｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７： ７２２−７２７ （２０００）； Ｐａｔｅｎｔ ＷＯ ９８／２４８９３）。
【００３４】
抗イデオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、独特の決定基を認識し、一般に抗体の抗原結合部位に結合される抗体である。Ｉｄ抗体は、Ｍａｂの供給源として同種かつ同遺伝子型の動物（たとえばマウス系統）を免疫化し、そのＭａｂに対して抗Ｉｄが製造されることによって製造され得る。免疫化された動物は、イデオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することにより、免疫性を与える抗体のイデオタイプ決定基を認識し応答する。たとえば、Ｕ． Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４， ６９９， ８８０を参照のこと。それは出典を指示することにより完全に本明細書に取りこまれる。
【００３５】
抗Ｉｄ抗体はまた、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生するさらに他の動物において、免疫応答を誘導するための「免疫源」として使用され得る。抗−抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した本来のＭａｂと、エピトープが同一であってもよい。すなわち、Ｍａｂのイデオタイプ決定基に対する抗体を使用することにより、同一の特異性を有する抗体を発現するほかのクローンを同定することが可能である。
【００３６】
したがって、本発明のＬＤＬＲに対して生成されたＭａｂ、そのアイソフォーム、アナログ、断片または誘導体は、ＢＡＬＢ／ｃマウスなどの適当な動物において抗Ｉｄ抗体を誘導するために使用され得る。そのような免疫化されたマウス由来の脾臓細胞は、抗Ｉｄ Ｍａｂを分泌する抗Ｉｄハイブリドーマを産生するために使用される。さらには、抗Ｉｄ Ｍａｂを、カサガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体に結合し、さらなるＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用し得る。それらのマウスからの血清は、前記ＬＤＬＲタンパク質またはそのアナログ、断片および誘導体のエピトープに特異的な本来のＭａｂの結合特性を有する抗−抗Ｉｄ抗体を含有するであろう。
【００３７】
したがって、抗Ｉｄ Ｍａｂは、それら独自のイデオタイプエピトープ、または評価されたそのエピトープに構造的に類似する「イデオトープ」を有する。用語「モノクローナル抗体」はまた、完全な分子および、たとえば抗原に結合することができるそのＦａｂおよびＦ（ａｂ′）２などの断片の双方を含むことを意図されている。ＦａｂおよびＦ（ａｂ′）２断片は、完全な抗体のＦｃ断片を欠き、血液循環からより早急に排除され、そして完全な抗体よりも非特異的組織結合が少ない（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ２４： ３１６−３２５ （１９８３））。
【００３８】
本発明において有用な抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ′）２ならびにほかの断片は、本明細書において開示される完全な抗体分子用の方法にしたがい、ＬＤＬＲタンパク質の検出および定量のために使用し得ることは評価されるであろう。そのような断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を産生）またはペプシン（Ｆ（ａｂ′）２断片を産生）などの酵素を用いるタンパク質分解的切断によって、一般に産生される。
【００３９】
モノクローナル抗体が分子に特異的に反応することができ、それにより分子が抗体に結合する場合は、モノクローナル抗体は分子に「結合することができる」といわれる。用語「エピトープ」は、抗体により結合され得るあらゆる分子の一部であって、またその抗体によっても認識される一部を指すことを意図されている。エピトープまたは「抗原決定基」は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面配置から構成され、特異的な３次元構造の特徴および固有の電荷特性を有する。
【００４０】
「抗原」は、抗体により結合され得る分子または分子の一部であり、抗原はさらに、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を動物に産生させることができる。抗原は１つ以上のエピトープを有し得る。前記で言及した特異的反応は、抗原は、高い選択的様式で、他の抗原によってつくられ得るほかの多数の抗体ではなく、その対応する抗体上のエピトープに反応することを示すものとして意図されている。
【００４１】
本発明に有用な、抗体の断片を含む抗体は、試料中のＬＤＬＲタンパク質を量的または質的に検出するために、または本発明のＬＤＬＲタンパク質を発現する細胞の存在を検出するために使用され得る。これは、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー検出法または蛍光測定検出法と組み合わせる、蛍光標識化抗体（下記を参照のこと）を用いる免疫蛍光技術により達成することができる。
【００４２】
本発明において有用な抗体（またはその断片）は、本発明のＬＤＬＲタンパク質のインサイチュ検出法のための免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法などにおいて、組織学的に使用され得る。インサイチュ検出法は、患者から組織学的標本を取りだし、そして本発明の標識化抗体をその標本に供給することにより達成され得る。抗体（または断片）は、標識化抗体（または断片）を生物学的試料に適用することにより、または標識化抗体（または断片）を生物学的試料で覆うことにより提供されることが好ましい。そのような手法を使用することによって、ＬＤＬＲタンパク質の存在だけでなくその検査される組織上の配置もまた、決定することができる。本発明を用いれば、当業者は、そのようなインサイチュ検定法を達成するために、広く様々な組織学的方法（染色手法など）を改変し得ることを、容易に理解するであろう。
【００４３】
本発明のＬＤＬＲタンパク質用のそのような検定は、通常は、ＬＤＬＲタンパク質を同定することができる標識化抗体の存在下において、生物学的流体、組織抽出物、リンパ球もしくは白血球などの採取したばかりの細胞、または組織培養においてインキュベーションされている細胞などの生物学的試料をインキュベーションし、ついで本分野において既知のあらゆる技術により該抗体を検出することを含む。
【００４４】
生物学的試料は、ニトロセルロースなどの固相支持体または担体、または細胞、細胞片もしくは可溶性タンパク質を固定することができるほかの支持体または担体に結合してもよい。ついで、支持体または担体を適当な緩衝液で洗い、前記のように本発明したがって標識化抗体で処理する。固相支持体または担体はついで、結合していない抗体を除去するために緩衝液で２回洗う。ついで、前記固定支持体または担体上の結合した標識の量は、従来の方法により検出される。
【００４５】
「固相支持体」、「固相担体」、「固定支持体」、「固定担体」、「支持体」または「担体」は、抗原または抗体を結合することができるあらゆる支持体または担体を意図されている。公知の支持体または担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンアミラーゼ類、天然および修飾セルロース類、ポリアクリルアミド類、ガブロス（ｇａｂｂｒｏｓ）ならびに磁鉄鉱を含む。担体の性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性あるいは不溶性のどちらかであり得る。支持体材料は、結合される分子が抗原または抗体に結合することができる限り、事実上あらゆる構造構成を有していてもよい。したがって、支持体または担体の構成は、ビーズのような球状、試験管の内面または棒の外表面のようなシリンダー状であってもよい。あるいは、その表面は、シート、検定細片（ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ）などの平面であってもよい。好ましい支持体または担体はポリスチレンビーズを含む。当業者は、抗体を結合するほかの適当な担体を理解するであろうし、または日常の試験の用途により同様のことを確認することができるであろう。
【００４６】
前記のように、本発明の得られた多くの抗体の結合活性は、既知の方法にしたがって測定され得る。当業者は、日常の試験を使用することによって、各測定法における作用のおよび最善の検定条件を決定することができるであろう。
【００４７】
洗い、撹拌、振とう、濾過などのほかの工程は通常のもの、あるいは特定の状況に必要なものである場合、前記検定に追加してもよい。
【００４８】
本発明の抗体が標識化され得る方法の１つは、酵素に抗体を結合し、酵素免疫検定（ＥＩＡ）において使用するものである。その結果、のちに酵素が適当な基質にさらされると、たとえば分光光度計法、蛍光測定法または可視的方法によって検出され得る化学的部分を産生するための方法において、酵素は基質と反応する。抗体を検出できるように標識化するために使用される酵素は、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定されない。検出は、酵素に対する色素原基質を使用する比色分析法により達成され得る。検出はまた、同様に調整された標準物に対する基質の酵素的反応の程度を可視的に比較することにより、達成され得る。
【００４９】
検出は、様々なほかの免疫検定を用いることにより達成してもよい。たとえば、抗体または抗体断片を放射活性標識することにより、放射性免疫検定法（ＲＩＡ）を用いてＲ−ＰＴＰａｓｅを検出することが可能である。ＲＩＡの適当な説明は、本明細書に出典を指示することにより取りこまれるＣｈａｒｄ， Ｔ．による“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”と題された章にとくに関連する、Ｗｏｒｋ， Ｔ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＮＹ （１９７８）によるＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙにみられる。放射活性アイソトープは、ｇカウンターまたはシンチレーションカウンターを使用した方法などにより、またはオートラジオグラフィーにより検出され得る。
【００５０】
蛍光化合物により本発明の抗体を標識することも可能である。蛍光標識化抗体が適当な波長の光にさらされると、蛍光によりその存在が検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、ピコシアニン、アロフィコシアニン、Ｏ−フタルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレサミンである。
【００５１】
抗体はまた、１５２Ｅまたはほかのランタニド類などの蛍光放射金属を用いて検出可能に標識化することができる。それらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＥＴＰＡ）などの金属キレート群を用いることにより、抗体に結合することができる。
【００５２】
抗体はまた、化学発光化合物に結合することにより検出可能に標識化することができる。ついで、化学発光を付加した抗体の存在は、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することにより測定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【００５３】
さらに、本発明の抗体を標識するために、生物発光化合物を使用してもよい。生物発光は、触媒タンパク質により化学発光反応の効率が増大される生物系において見出された、化学発光の１つの型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより測定することができる。標識の目的で重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【００５４】
本発明の抗体分子は、同様に「両側」または「サンドイッチ」検定として知られる免疫測定検定法における使用に適応されてもよい。典型的な免疫測定検定法において、定量の非標識化抗体（または抗体の断片）が固定支持体または担体に結合され、そして定量の検出可能に標識化された可溶性抗体を添加することにより、固相抗体、抗原および標識化抗体のあいだで形成される３元の複合体の検出および／または定量を行う。
【００５５】
典型的で好ましい免疫測定検定は、まず、試験される試料と固相に結合する抗体を接触させ、二元の固相抗体−抗原複合体の形成によって試料から抗原を抽出する「フォワード」検定を含む。適当なインキュベーション後、固相支持体または担体を、液体試料の残渣（もしあるとすれば、未反応の抗原を含む）を除去するために洗い、ついで未知量の標識化抗体（「リポーター分子」として機能する）を含有する溶液と接触させる。非標識化抗体をの中で、固定支持体または担体に結合した抗原と標識化抗体とを複合体にするための第２のインキュベーションののち、未反応の標識化抗体を除去するために固定支持体または担体を２回洗う。
【００５６】
本発明の抗原を用いることによってもまた有用であり得るもう１つの型の「サンドイッチ」検定において、いわゆる「同時」および「逆」検定が用いられる。同時検定は、固定支持体または担体に結合した抗体、および標識化抗体をともに同時に試験される試料に添加するために、１つのインキュベーション工程を含む。インキュベーションを完了したのち、液体試料の残渣および非複合体の標識化抗体を除去するために固定支持体または担体を洗った。固定支持体または担体に結合した標識化抗体の存在は、ついで、従来の「フォワード」サンドイッチ検定と同様に測定される。
【００５７】
「逆」検定において、まず、標識化抗体の溶液を液体試料に徐々に添加し、ついで適当なインキュベーション期間が設けられたのちに、固定支持体または担体に結合した非標識化抗体を添加する。２回目のインキュベーションののち、試験試料の残渣および未反応の標識化抗体の溶液を除くために、固定相を従来の様式で洗う。ついで、固定支持体または担体に結合した標識化抗体の測定は、「同時」および「フォワード」検定と同様にして測定される。
【００５８】
ここで、以下の非限定的な実施例を用いて本発明を説明する。
【００５９】
［実施例］
実施例１ ＣＨＯ ｒ−ｈｓＬＤＬＲの調製
２つの発現ベクター（アミノ酸残基Ａｓｐ（＋４）から始まりＧｌｕ２９１（＋２９１）までのＬＤＬＲのＮ末端リガンド結合ドメインを含有するｐｓＬＤＬＲ０１、およびＤＨＦＲに対するマウス遺伝子を含有するｐＤＨＦＲ。双方ともＳＶ４０初期領域のプロモーターおよび転写終結エレメントにより調節される）を用いる、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を欠くＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞（Ｕｒｌａｕｂ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， １９８０）への共トランスフェクションにより、ヒト可溶性ＬＤＬＲを発現する安定な組換え体ＣＨＯ細胞を生成した。トランスフェクションは、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ）（ギブコＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）製）を用いる陽イオンリポソームにより、製造業者により記載されたプロトコルにしたがって実施した。トランスフェクションの７２時間後、デオキシヌクレオシドおよびリボヌクレオシドを欠き、かつ１０％の透析ＦＣＳを補充した選択培地に細胞を移した。ＤＨＦＲ活性を発現する細胞はコロニーを形成することができ、トリプシンを含ませたペーパーディスクで細胞をつりあげることによって単離した。細胞を増殖させ、ついでｒ−ｈｓＬＤＬＲ活性に対するスクリーニングを行った。ついで、トランスフェクションされた細胞を用いてＭＴＸによる遺伝子増幅を行い、続いて安定なプロデューサークローンのサブクローニングおよび選択を行った。
【００６０】
５リットルのＣｅｌｌｉＧｅｎバイオリアクターにおける無血清培地（ギブコＣＨＯ−Ａ−ＳＦＭ、カタログ番号９５−００９１ＤＪ）中で、＃３３−１０−２９−２１と命名した安定なＣＨＯプロデューサークローン細胞を用いて、ｒ−ｈｓＬＤＬＲ（＋２９１型）を産出した。粗製の収集物は、０．８−０２μカートリッジフィルター（ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）カタログ番号ＣＳＳ９２ＤＳＣＣＫ）による濾過によって清澄化し、そして５−ｋＤａ膜で覆って１００倍に濃縮した。最初の免疫化に用いられたｒ−ｈｓＬＤＬＲの＋２９１型は、スモールスケール精製方法を用いて精製された。その方法において、ＤＥＡＥセファロース陽イオン交換カラムが用いられ、ついでブチル−ＴＳＫカラムにおける疎水的相互作用工程、続いてＨＴＰカラムおよびセファクリル１００カラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。ＳＥＣの分画＃２７は、下記の実施例９記載の抗ウイルス検定において検出された７８０ユニット／μｇの特異的抗ウイルス活性を有していたので、ＳＥＣの分画＃２７を選択した。その分画におけるタンパク質を、Ｎ末端分析により、ｒ−ｈｓＬＤＬＲとして同定した。
【００６１】
ＣＨＯ＋２９１ｒ−ｈｓＬＤＬＲの第２の群を精製し、マウスの促進注射用に用いた。以下の工程、ａ）清澄化および粗製収集物の１００倍濃縮、ｂ）ＨＱ ＰＯＲＯＳ陰イオン交換カラム、およびｃ）２つの疎水的相互作用（ＨＩＣ）工程（ブチル−ＴＳＫカラムでの捕捉およびフェニル５ＰＷカラムによる流下）を含む、収率が改良された精密な工程を用いて精製した。最終のＨＩＣ工程由来の非結合分画を透析し、そしてＨＳ−ＰＯＲＯＳ陽イオン交換カラムにより精製した。その最終工程はヒドロキシアパタイト（ＨＴＰ）カラムであった。そして、ｒ−ｈｓＬＤＬＲは約９０％まで精製され、ＲＰ−ＨＰＬＣにおける単一の主要ピークとして溶出された。
【００６２】
実施例２ マウスの免疫化
前記実施例１のＳＥＣカラムの分画＃２７の精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲ１０μｇを、１００μｇ／ｍｌの濃度で、完全フロイントアジュバンド（ＣＦＡ、５０％ｖ／ｖ）で均質化し、５匹の７週齢のＢａｌｂ／Ｃ雌マウスの肢に注射にした。
【００６３】
第１回の免疫化から４週間後、マウスは、ＣＦＡの５０％（ｖ／ｖ）溶液における同分画の精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲ１０μｇにより筋肉内注射で促進された。
【００６４】
第２回の注射から２週間後、以下の実施例３記載の直接的ＥＬＩＳＡを用いて、ｒ−ｈｓＬＤＬＲの抗体に対するマウス血清の試験を行なった。
【００６５】
第２回の注射の１０週間後、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに最も顕著に特異的な免疫活性を有する２匹のマウスＭ−１およびＭ−２を、前記実施例１記載の精密な精製方法で得られた精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲ１０μｇにより、さらに促進させた。
【００６６】
１４週間後にマウスは採血され、ｒ−ｈｓＬＤＬＲの抗体に対する試験を行った。ついで、マウスにＰＢＳ中ｒ−ｈｓＬＤＬＲ５０μｇの２回のさらなる促進薬を、１回目は腹腔内に、そして２回目は２日後、腹腔内および静脈内の双方に与えた。
【００６７】
２回目の注射から２週間後にマウスは採血され、その抗血清は、下記実施例３の直接的ＥＬＩＳＡにより、抗ｒ−ｈｓＬＤＬＲ活性に対して試験された。各抗血清は１：１００〜１：３２０００に順次に希釈され、そして、前記実施例１記載の精密な精製方法により精製されたｒ−ｈｓＬＤＬＲを１０Ｕ／穴でコートした９６穴プレート２組に用いた。検定用緩衝液およびＤＭＥＭ＋ＰＢＳ含有１０％ＨＳ＋１％ＢＳＡまたはゼラチン＋０．０５％ツイーン２０＋０．０５％チメローサルを、ブランクとして各列の第１番目の穴に使用した。正常なマウス血清（ＮＭＳ）を、陰性コントロールとして、最後の２列に同じ希釈割合で用いた。酵素反応の吸光度を、４９２および４０５ｎｍにおいてＥＬＳＡリーダーで測定した。
【００６８】
この試験結果は、マウスＭ−１の血清がｒ−ｈｓＬＤＬＲに対し、より高い特異的免疫活性を有していることを示したので、犠牲死させ、ミエローマ細胞を用いて融合するために脾臓細胞を採取した（Ｅｓｈｈａｒ Ｚ， １９８５）。
【００６９】
実施例３ 抗血清試験の直接ＥＬＩＳＡおよびハイブリドーマクローンスクリーニング
陽性抗血清のスクリーニングのための直接ＥＬＩＳＡを、以下のように実施した。ＰＢＳ＋１％ゼラチン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製、カタログ番号Ｇ−７７６５）＋０．９ｍＭ Ｃａ＋２および０．５ｍＭ Ｍｇ＋２、ｐＨ５．６中ｒ−ｈｓＬＤＬＲ（実施例１の精密な精製方法により精製）１００ユニット／ｍｌの１００μｌ（以下、検定用緩衝液と呼ぶ）を用い、振とうしながら９０分間３７℃で９６穴プレートをコートした。そのプレートを、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０（ポリオキシエチレン−モノラウリン酸ソルビタン−シグマＰ−１３７９）（以下、洗浄溶液と呼ぶ）で６回洗った。
【００７０】
免疫化マウス由来の１：１００〜１：３２０００に順次希釈された抗血清試料、またはハイブリドーマ細胞培養物由来の上清を穴に添加し、９０分間３７℃で振とうしながらインキュベーションし、ついで洗浄溶液で６回洗った。
【００７１】
１：１２００に希釈されたマウスＦａｂ（シグマ社製、カタログ番号４６０１−１）の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ＡＰＡ複合ヤギ抗体１００μｌを穴に添加し、９０分間３７℃で振とうしながらインキュベーションし、ついで洗浄溶液で６回洗った。
【００７２】
基質溶液１００μｌ（ＯＰＤ１錠およびＨ２Ｏ２１錠を２０ｍｌの水に溶解することにより調製）を穴に添加し、そしてＲＴで３０分間インキュベーションした。酵素反応は、１００μｌ／穴の４Ｎ ＨＣｌの添加により停止させた。
【００７３】
９６穴プレートにおける吸光度を４９２および４０５ｎｍにおけるＥＬＩＳＡリーダーを用いて読みとり、得られた結果を、ＥＬＩＳＡリーダーに連結したＰＣコンピュータのＭｕｌｔｉＣａｌｃソフトウェアによって、４つのパラメトリックロジスティックアルゴリズムを用いて計算した。
【００７４】
実施例４ 融合、ハイブリドーマ製造、クローンの選択および腹水液からの抗体の精製
融合方法およびハイブリドーマ細胞選択は、Ｅｓｈｈａｒ Ｚ， １９８５記載のプロトコルにしたがって実施した。つまり、融合する２〜４日前に促進されたマウスＭ−１由来の脾臓細胞を、ＰＥＧを用いる短時間のインキュベーションによってミエローマ細胞と融合した。はじめに、ＰＥＧをＤＭＥＭでゆっくり希釈し、ついで遠心により完全に除去した。細胞をＤＭＥＭ−ＨＡＴ培地に再懸濁し、約３．４×１０−４細胞／穴の濃度で９６穴プレートに配置させ、８％ＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で１０〜１４日間インキュベーションした。１０日間内にすべてのハイブリドーマの穴の培地を、１０％ウマ血清（ＨＳ）で補充したＤＭＥＭに交換した。前記実施例３記載の直接ＥＬＩＳＡにより、ｒ−ｈｓＬＤＬＲのＭａｂの存在に対するハイブリドーマ培養上清試料のスクリーニングを行った。検定用緩衝液およびＤＭＥＭ＋１０％ＨＳをブランクとして使用した。Ｍａｂ Ｃ７（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）より商業的に入手可能）およびＭ−１マウス抗血清を陽性コントロールとして使用し、可溶性ｐ５５ＴＮＦ受容体に対するモノクローナル抗体を陰性コントロ−ルとして使用した。培養上清において抗体の存在が検出された穴由来の細胞を２４穴プレートに移し、ついで２５ｃｍ２Ｔ−フラスコに移した。展開された培養は、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対するＭａｂの分泌についてモニターされた。陽性培養物由来の細胞のアンプルを液体窒素において凍結し保存した。
【００７５】
ｒ−ｈｓＬＤＬＲの抗体を検出するために、合計約１０００培養物をスクリーニングした。最も高い免疫活性を有する５４の培養物を数回、再試験した。最も高い活性を有する５つの培養物（１２、２８、２９、３０および５０）を、９６穴プレートにおける限界希釈によりクローン化した。直接ＥＬＩＳＡにより、増殖するクローン由来の上清を数回、ｒ−ｈｓＬＤＬＲの抗体に対して試験した。
【００７６】
陽性ハイブリドーマクローンの細胞を組織培養フラスコにおいて１５％ウマ血清を含有するＤＭＥＭで増殖させ、培養物の一部から得たアンプルを凍結した。並行して、異なるハイブリドーマクローンの細胞を２〜４匹の各マウスに注射し、腹水液を得た。硫酸アンモニウム沈殿法により、またはタンパク質Ｇカラムのどちらかにおいて、抗体を腹水液から精製した。つまり、７．５ｍｌの腹水液を２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７において１：３に希釈し、５ｍｌタンパク質Ｇカラム（Ｃ１０／１０）に添加した。２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７を用いてカラムを洗い、１００ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ２．７を用いてＭａｂを溶出した。１Ｍトリス緩衝液ｐＨ９．３を用いて、溶出分画のｐＨを７〜７．５に調整した。
【００７７】
実施例５ ＥＬＩＳＡに使用するためのＭａｂの対のスクリーニングおよびＥＬＩＳＡパラメータの最適化
下記実施例６記載のｒ−ｈｓＬＤＬＲ用サンドイッチＥＬＩＳＡにおける第１および第２抗体として使用される最適なＭａｂの対を選択するために、前記実施例４記載のように腹水液から精製されたＭａｂは、マトリックス形式での一連の実験を実施するために使用された。つまり、硫酸アンモニウム沈殿法によりまたはタンパク質Ｇカラムのどちからにおいて精製された５つのハイブリドーマ（＃１２、２８．２８、２９．０８、３０および５０．０５）由来の腹水液で、９６穴プレートをコートした。ＣＨＯ細胞において産生されたｒ−ｈｓＬＤＬＲの＋２９１型ならびに＋２９２型（アミノ酸残基Ａｓｐ＋４からＣｙｓ＋２９２まで）および＋３３１（アミノ酸残基Ａｓｐ＋４からＣｙｓ＋３３１まで）型を抗原として用い、抗体をスクリーニングした。サンドイッチＥＬＩＳＡにおける第２抗体としての適合性の短時間スクリーニングのために、前述の部分的に精製された各Ｍａｂの１ｍｌをビオチンにより標識した。つまり、硫酸アンモニウム沈殿法で精製されたＭａｂの１．５ｍｇを、０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３３０μｌにより、ｐＨ８．５に調整した。０．７５ｍｇのビオチン−ＯＳｕ Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）−ビオチン（ビオチン−ＯＳｕ、シグマ社製、カタログ番号Ｈ１７５９、２００μｌＤＭＳＯにおける５ｍｇの溶液）を抗体溶液に添加し、そして緩やかに振とうしながら室温で２時間インキュベーションし、ついで２〜８℃において一晩インキュベーションした。ビオチン化Ｍａｂと過剰な未反応ビオチン−ＯＳｕとを分けるために、反応溶液をセファデックスＧ−２５Ｍ（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カタログ番号１７−０８５１−０１）ＰＤ１０カラムに適用した。
【００７８】
最初の予備実験は、Ｍａｂ２９．０８および３０がＥＬＩＳＡにおける第２抗体として使用された場合、バックグラウンドを超えて最も高いシグナルを産生することを示した。
【００７９】
それら２つのクローンの反応は、プレートのコーティングに使用される抗体１２、２８、２９．０８および５０とともに、第２抗体として再度試験された。この実験結果は明らかに、Ｍａｂ２８はコーティングに最適な抗体であることを示した。
【００８０】
シグナル強度および特異性に関し、最もよい結果は、マイクロタイタープレートのコーティングに使用されたＭａｂ２８および第２抗体としてビオチンで標識化したＭａｂ２９．０８により得られた。それらのＭａｂを使用することにより、ｒ−ｈｓＬＤＬＲの３つの型すべて（＋２９１、＋２９２および＋３３１）でよい結果が得られた。すべての型について、４９２／４０５ｎｍにおける吸光度は約１．３ＯＤであった。
【００８１】
ｒ−ｈｓＬＤＬＲ抗原の３つの型は、０．９〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲の一連の希釈で分析された。コーティングに使用されたＭａｂ２８および第２抗体としてビオチン化されたＭａｂ２９．０８により、用量反応曲線を得た。その組み合わせは、ｒ−ｈｓＬＤＬＲの１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲において、直線反応を示した。
【００８２】
以下の条件を試験することによって、試薬濃度、インキュベーション時間、緩衝液およびプレートの選択など、ＥＬＩＳＡ試験に影響し得る様々な条件を最適化した。
・ＰＢＳ中５〜１０μｇ／ｍｌのＭａｂ２８によるマイクロタイターウェルのコーティング
・緩衝液組成：
ａ）ＰＢＳ＋ツイーン２０
ｂ）トリス＋Ｃａ＋２＋ＮａＣｌ＋ツイーン２０
・ブロッキング溶液
ａ）ＰＢＳ中１％ゼラチン、０．０５％ツイーン、０．００５％チメローサル
ｂ）ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン、０．００５％チメローサル
ｃ）ＰＢＳ中１％ＦＢＳ、０．０５％ツイーン、０．００５％チメローサル
ｄ）ＰＢＳ中１％ミルク、０．０５％ツイーン、０．００５％チメローサル
ｅ）Ｉブロック（Ｉ Ｂｌｏｃｋ）、ハイペップ（Ｈｙ Ｐｅｐ）およびハイイースト（Ｈｙ Ｙｅａｓｔ）
・１０．７４〜０．５３７μｇ／ｍｌの濃度範囲に相当する１：５００、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：８０００、１：１００００の濃度におけるビオチンで標識された第２Ｍａｂ２９．０８
・エクストルアビジン（Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ）濃度：４〜０．２μｇ／ｍｌの濃度範囲に相当する１：５００、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：８０００、１：１００００。
【００８３】
それらの実験に基づき、下記実施例６記載のサンドイッチＥＬＩＳＡ試験のための最終手順を確立した。
【００８４】
実施例６ ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対するサンドイッチＥＬＩＳＡの確立
Ｍａｂ２８および２９．０８を用いて、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対するサンドイッチＥＬＩＳＡを確立した。つまり、１００μｌのタンパク質Ｇ精製Ｍａｂ２８（５μｇ／ｍｌ）を用い、２〜８℃で一晩または３７℃で３時間、９６穴プレートをコートした。ついで、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０を用い、プレートを５回洗った。プレートを２００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡまたはゼラチン＋０．０５％ツイーン２０＋チメローサル０．０５％）とともに３７℃で１時間または４℃で一晩インキュベーションし、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で５回洗った。１００μｌの検量曲線抗原（ブロッキング溶液で希釈された０．５〜３２ｎｇ／ｍｌのＣＨＯ＋２９１ｒ−ｈｓＬＤＬＲ）または試料を穴に添加し、ついで振とうしながら３７℃で９０分間インキュベーションした。ついで、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０を用いてプレートを５回洗った。
【００８５】
ブロッキング溶液に溶解したビオチン化Ｍａｂ２９．０８（０．６７μｇ／ｍｌ）１００μｌ／穴を添加し、そして３７℃で１時間、振とうしながらインキュベーションした。ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０を用いてプレートを５回洗った。市販のエクストルアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（エクストルアビジン ＴＭ−ペルオキシダーゼ バイオメーカー（ＢｉｏＭａｋｏｒ）、カタログ番号０６４５−１）を１：１００００に希釈した１００μｌを穴に添加し、１時間３７℃で振とうしながらインキュベーションした。ついで、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０を用いてプレートを５回洗った。１２５μｌの前記基質溶液を各穴に添加し、その色が所望の強度に達するまで約１０分間インキュベーションした。反応は、１２５μｌの４Ｎ ＨＣｌを添加することにより停止した。９６穴プレートにおける吸光度を４９２および４０５ｎｍ波長においてＥＬＩＳＡリーダーを用いることにより読みとり、その結果をＥＬＩＳＡリーダーに連結したＰＣコンピュータのＭｕｌｔｉＣａｌｃソフトウェアにより計算した。
【００８６】
実施例７ モノクローナル抗体アイソタイプ
モノクローナル抗体Ｉｇアイソタイプは、市販のアイソタイピングキット（ファルミンゲン インターナショナル社製（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を用い、製造会社の検定手順にしたがって測定された。クローン１２．６、２８、２９．８および３０をＩｇＧ１として同定し、一方、クローン５０．３０はＩｇＭクラスであることが分かった。
【００８７】
実施例８ ＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロット解析
精製したｒ−ｈｓＬＤＬＲの＋２９１型およびヒトの尿から精製された天然ＬＤＬＲを、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対して開発されたモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット解析により解析した。つまり、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを、１００ｎｇ／レーンのｒ−ｈｓＬＤＬＲのＣＨＯ＋２９１型または天然の尿ｈｓＬＤＬＲもしくはＴＢＰ−１粗製採取物（陰性コントロールとして）とともに還元条件下（４０ｍＭ ＤＴＴ）において添加した。１つのレーンには低分子量マーカー（ＬＭＷ）を添加した。このサンプルの組み合わせを５回実施した。ゲル上で分離されたタンパク質を、電気溶出によりニトロセルロース膜に移した。１０％低脂肪ミルク、０．１％ツイーン２０を含有するＰＢＳにおいて、膜を１６時間インキュベーションした。膜を細片に切断し、選択した５つのＭａｂ（１２．６、３０、５０．３０、２８または２９．０８（１：４０００希釈の腹水液））のうち１つとともに、各細片を室温で２時間インキュベーションした。
【００８８】
膜の細片は、０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳで洗い（３×１５分間）、第２抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ−アルカリホスファターゼ）（１：１００００希釈、バイオメーカー社製）とのヤギ抗マウス複合体）で２時間インキュベーションした。
【００８９】
細片を、０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳで洗った（３×１５分間）。陽性のバンドを、増強された化学発光（ＥＣＬ、アマシャム社製）により検出した。
【００９０】
モノクローナル抗体＃１２．６および＃２９．８は、ウェスタンブロット解析において、尿の精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲならびに＋２９１型の精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲの双方を認識した（図２）。Ｍａｂ２８および３０は、＋２９１型の精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲを認識した。
【００９１】
実施例９ モノクローナル抗体によるｒ−ｈｓＬＤＬＲ抗ウイルス活性の阻害
ＶＳＶ／ＷＩＳＨ系における細胞変性効果（ＣＰＥ）阻害検定を用いることにより、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに特異的に反応したＭａｂを、インビトロにおけるｒ−ｈｓＬＤＬＲ（＋２９１型）の抗ウイルス活性を阻害する能力に対して試験した。
【００９２】
ＷＩＳＨ細胞（ヒト羊膜が起源）を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにおいて、１０％ＦＢＳおよび４ｍＭグルタミンで補充したＭＥＭで培養した。検定開始２４時間前に、指数関数的に増殖する細胞を９６穴組織培養プレートに４００００細胞／穴の密度で播種した。試験すべき試料および標準を希釈し、細胞を有する穴に分配した。即時に、０．５ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でＶＳＶを穴に添加した。プレートを１６〜１８時間３７℃でインキュベーションし、ついでエタノールで洗った。グラムクリスタルバイオレット染色により、生存細胞の単層を観察した。標準に対する細胞変性効果の定量は、標準濃度に対する色密度（ｃｏｌｏｕｒ ｄｅｎｓｉｔｙ）をプロットすることにより、実施した。
【００９３】
抗体の中和効果を解析するために、試験されるＭａｂの腹水液の濃度を上げながら、ｒ−ｈｓＬＤＬＲを３７℃で３０分間プレインキュベーションした。ついで、それらの溶液を９６マイクロタイタープレートにおけるＷＩＳＨ細胞の培養物に添加し、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を添加した。１８時間のインキュベーションののち、クリスタルバイオレットで残った細胞を染色することにより、ＶＳＶ媒介細胞溶解を測定した。標準濃度に対する色強度（ＥＬＩＳＡリーダーにより測定）をプロットすることにより、標準に対する細胞変性効果の半定量を実施した。
【００９４】
ｒ−ｈｓＬＤＬＲの濃度をあげながら、Ｍａｂの効果を試験した。表１に示すように、２つのＭａｂ（１２．６および５０．３０）は中和活性を示すことが分かった。
【００９５】
表１に示す実験において、２つのＭａｂの阻害効果は、腹水液の１：４０希釈で試験された。この希釈で、Ｍａｂ１２．６は、Ｍａｂ５０．３０よりもいくらか高い活性を示した。これは、Ｍａｂの特性ならびに腹水液におけるそれらの濃度の違いに由来する結果かもしれない。
【００９６】
Ｍａｂの阻害効果は、Ｍａｂ濃度に対してｒ−ｈｓＬＤＬＲ濃度を上げることいより解消されることができた。実際に６２．５Ｕ／ｍｌのｒ−ｈｓＬＤＬＲ濃度では、どちらのＭａｂも、解析された抗体濃度において、ｒ−ｈｓＬＤＬＲ活性に対する効果を有していなかった。
【００９７】
【表１】
【００９８】
ｒ−ｈｓＬＤＬＲの抗ウイルス活性阻害は、Ｍａｂ１２．６および５０．３０の濃度を上げながら使用することによって測定された。Ｍａｂ１２．６は、１：４０希釈（腹水液）においては〜６０％で、および１：２０５００希釈においては〜３５％で、ｒ−ｈｓＬＤＬＲの抗ウイルス活性を阻害した。クローン５０．３０は、１：４０希釈においては〜４５％で、および１：２０５００希釈においては〜１５％で、ｒ−ｈｓＬＤＬＲ活性を阻害した。
【００９９】
両Ｍａｂを用いて得られた用量反応曲線、および、阻害効果が過剰のｒ−ｈｓＬＤＬＲによって減じられるという見解により、Ｍａｂはｒ−ｈｓＬＤＬＲへの結合によってその効果を発揮することが示唆された。
【０１００】
実施例１０ モノクローナル抗体によるＨＣＶ複製の阻害
ｒ−ｈｓＬＤＬＲ特異的なＭａｂは、初代培養のヒト肝細胞におけるＨＣＶ複製阻害能力に関して試験された。ＦＴ１６７細胞培養物は、医療目的で葉切除を要する５７歳の男性患者（結腸腫瘍の転移、右葉）由来であった。
【０１０１】
ヒト肝細胞の初代培養を、２工程コラゲナーゼ潅流法（ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｔｅｐｓ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｍａｕｒｅｌ Ｐ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ． ２２： １０５−１３２ （１９９６）， Ｐｉｃｈａｒｄ Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４１： １０４７−１０５５ （１９９２）， Ｆｅｒｒｉｎｉ ＪＢ． Ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ−Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ １０７： ３１−４５ （１９９７））によって調製した。平板培養前の細胞の生存能力は、トリパンブルー排除試験（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｔｅｓｔ）を用いて測定された。３ｍｌ培地中４百万個の細胞を、コラーゲンでプレコートした６０ｍｍプラスチック皿において平板培養した。長期無血清培養培地は、公表されたように補充したウィリアムズＥ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ Ｅ）からなる（Ｌａｎｆｏｒｄ Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２５ ： １７４−１８２ （１９８９））。つづいで、その培地を４８時間ごとに取り替えた。培養物は、空気および５％二酸化炭素からなる湿潤雰囲気下において３７℃で維持した。それらの培養条件において、ヒト肝細胞は、少なくとも３５日間、その分化した表現型を保ち（Ｆｅｒｒｉｎｉ ＪＢ． Ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ−Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ １０７： ３１−４５ （１９９７））、ＨＣＶ感染に感受性であり、ウイルスゲノム複製に対して許容的である（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ７９： ２３６７−２３７４ （１９９８））。
【０１０２】
ＨＣＶ陽性血清試料：ＥＩＡ ＨＣＶ３．０およびケイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）ＲＩＢＡ ＨＣＶ３．０ＳＩＡにより抗ＨＣＶ抗体陽性を検査された患者由来のヒト血清バンクが設立された。それらの患者の誰もが、ＨＢＶまたはＨＩＶに共感染していなかった。各血清試料において、ＨＣＶ ＲＮＡは、ロッシュ モニター（ｔｈｅ Ｒｏｃｈｅ ｍｏｎｉｔｏｒ）により定量され、ラインプローブ検定（ｌｉｎｅ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ）により遺伝子型を決定された（イノ−リパ ＨＣＶ ＩＩ（Ｉｎｎｏ−Ｌｉｐａ ＨＣＶ ＩＩ）、イノジェネティクス社（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）製）。凍結−解凍サイクルを避けるために、少量のアリコートで血清試料を−８０℃で保存した。それらの実験において、試料Ｓ４２（遺伝子型Ｉｂ；ウイルス負荷：４１００００コピー／ｍｌ）を使用した。
【０１０３】
感染およびつぎの処理のために、肝細胞培養物は、滅菌条件でＰ３研究室（ヒト感染性微生物に対する高度な締め出し）に移された。平板培養の３日後、単離の傷害から細胞が回復したとき、３ｍＬ培地中に存在するＨＣＶ陽性血清試料（Ｓ４２）の２５μｌとともに一晩インキュベーションすることにより、肝細胞のインビトロ感染を実施した。感染後、３ｍＬの新鮮な培地で細胞を３回洗い、そして長期培養培地における正常な条件下で培養を続けた。
【０１０４】
細胞を、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対する３つの異なるＭａｂ（Ｍａｂ１２．６、Ｍａｂ２８、Ｍａｂ２９．８）で処理した。感染の３０分前に、細胞を２または８μｇ／ｍｌの異なるＭａｂに曝した。ついで、細胞を前記のように感染させた。
【０１０５】
コントロール培養物は、同様の条件下であるが抗ウイルス処理をせずに、感染させた。並行実験において、比較のために同じ条件下で、同じ培養物を５０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮαで処理した（ＩＦＮαは細胞におけるＨＣＶ複製を強く阻害する）。すべての処理は２組で実施した。
【０１０６】
感染後５日で、培地を除去し、そして冷たいリン酸緩衝化食塩水を用いて培養物を３回洗った。グアニジニウムイソチオシアネート−酸性フェノール抽出手順を用い、４×１０６肝細胞からＲＮＡを精製した（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ＰＮ． Ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ Ｎ． Ａｎａｌｙｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２： １５６−１５９ （１９８７））。沈殿したＲＮＡをジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理された水５０μｌに溶かし、定量した。１μｇの細胞ＲＮＡを、鎖特異的ｒＴｔｈ ＲＴ−ＰＣＲ検定において解析した。
【０１０７】
感染の可能性を避けるために、鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ検定は、つづいて３つの異なる部屋（前ＰＣＲ室、ＰＣＲ室および後ＰＣＲ室）を用いて実施した。１０μｌのＤＥＰＣ処理された水に溶かしたＲＮＡをミネラルオイルで覆い、９５℃で１分間加熱した。温度を７０℃に下げ、予め加熱されたｃＤＮＡ反応混合液１０μｌを添加した。ついでアニーリングのために温度を２分間６０℃に下げ、そしてｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）製）を用い、ｃＤＮＡ反応を２０分間７０℃で実施した。温度を７０℃に維持し、同時に、ｒＴｔｈ ＲＴ活性を抑制するために、Ｍｎ２＋のキレート剤としてＥＧＴＡを含有する予め温められた緩衝液４０μｌを添加した。反応チューブを７０℃に維持し、同時に、予め温められたＰＣＲ混合液４０μｌを添加した。Ｇｅｎｅ Ａｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９６００（パーキン−エルマー社製）において実施されたＰＣＲ条件は、９４℃１分間の開始サイクル、９４℃１５秒間、５８℃３０秒間および７２℃３０秒間からなる５０サイクル、および７２℃７分間の最終伸長工程からなる。プラス鎖ＨＣＶ ＲＮＡ検定のために、リバースプライマーＰ３のヌクレオチド配列は、５′−ＴＧＧ／ＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＴＣ−３′（ｎｔ３４２〜３２０）であり、そしてフォワードプライマーＰ４のヌクレオチド配列は、５′−ＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴ−３′（ｎｔ：３８〜５６）である（Ｌａｓｋｕｓ Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７８： ２７４７−２７５０ （１９９７））。マイナス鎖を検出するために、同じプライマーを逆の順序で使用した。アガロース（２％）上でのゲル電気泳動法によって増幅産物の１０分の１を解析し、ついでＢＥＴで着色し、ＵＶ光のもとで写真撮影を行った。すべての一連の実験において、合成ＨＣＶ ＲＮＡ（＋）および（−）鎖の希釈を行い、培養された肝細胞の解析のための条件に似せるために、１μｇの全肝臓ＲＮＡを添加した。それらの混合液は、ＲＴ−ＰＣＲ検定および解析のための陽性コントロールとして使用した。
【０１０８】
図３は、ＬＤＬｒに対するＭａｂの存在下では、ＨＣＶマイナス鎖の産生が培養ＦＴ１６７において完全に阻害されることを示す。したがって、ウイルスゲノムの複製は強く阻害された。その結果は、ＬＤＬＲがＨＣＶに対する受容体であり得るという見解に一致した。
【０１０９】
実施例１１ ＬＤＬＲに対するキメラ抗体の産生
ｍＲＮＡは、ＬＤＬＲ特異的ｍＡｂを産生するハイブリドーマ株から精製した。
【０１１０】
重鎖可変ドメイン由来のエクソンＣＨ１の５′末端に対する相補オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ １）および軽鎖可変ドメインのＣκｈエクソンの５′に対する相補オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ ２）を用い、精製したｍＲＮＡを鋳型として用いて、特異的なｃＤＮＡを合成した。
【０１１１】
２つのｃＤＮＡが得られ、そのうちの１つは重鎖の可変領域（ＬＤＬＲ特異的）をコードし、他方は軽鎖の可変領域（ＬＤＬＲ特異的）をコードする。ｃＤＮＡをクローン化して配列決定する。
【０１１２】
キメラ重鎖の構築のために、クローン化したヒトＩｇ重鎖遺伝子の可変領域を、マウスの重鎖可変ドメイン（ＬＤＬＲ特異的）をコードするクローン化ＤＮＡに交換する（遺伝子操作を用いる）。遺伝子操作は、特異的な制限酵素を用いるヒトＩｇからの可変領域の除去、およびマウス可変領域のライゲーションを含む。キメラ軽鎖を得るために、同じ手順を実施した。
【０１１３】
２つの哺乳動物発現プラスミドを構築する。１つはキメラ重鎖遺伝子を含み、他方はキメラ軽鎖遺伝子を含む。両ベクターは、ハイブリドーマ細胞株（ＳＰ６）を共トランスフェクションするために使用した。
【０１１４】
ＬＤＬＲ特異的Ｉｇの産生は、トランスフェクションした細胞の培養上清を第２抗体として用いるＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにより試験される。リガンドに対するキメラ抗体の親和性は、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって記録された。
【０１１５】
実施例１２ ヒト免疫グロブリン遺伝子座（ゼノマウス）を有するように処理されたトランスジェニックマウスの作製およびｈＬＤＬＲに対するヒトｍＡｂの製造
ゼノマウス作製は、ＷＯ ９８／２４８９３およびＭｅｎｄｅｚ Ｍ， Ｊ． ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５： １４６−５６ （１９９７）に記載されている。
【０１１６】
ヒト重鎖可変領域（約１０００ｋｂ）を含有するＹＡＣについて、ヒト−酵母人工染色体（ＹＡＣ）ライブラリーをスクリーニングする（ＹＡＣクローニング方法は、１００ｋｂより大きい挿入サイズが必要とされる場合の選択方法である）。
【０１１７】
それらのＹＡＣは、サザンブロット解析およびパルスフィールド電気泳動法（ＰＦＧＥ）により特徴づけられる。ＹＡＣは生殖系列立体配置（ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ ｃｏｎｆｉｇｕｌａｔｉｏｎ）においてＣμ、Ｃδ、ＤｈおよびＶｈ領域を含むべきである。
【０１１８】
ＹＡＣに含有されるオーバーラップ配列を利用し、段階的な組換え計画によって、酵母でＹＡＣの組換えを行った。組換えを行う前に、ＹＡＣ（Ｖ領域を有する）の３′末端をＨＰＲＴ選択マーカーに結合した。組換えられたＹＡＣの構造は、ＰＦＧＥおよびサザンブロット解析により確認した（生殖系列立体配置におけるＣ領域からＶｈ領域までのヒト重鎖遺伝子座の存在）。
【０１１９】
完全なγ２定常領域、マウスのエンハンサー、ネオマイシン耐性遺伝子を有するベクターを用いることによりＹＡＣ無動原体アームをターゲッティングし、完全な可変領域を含有する最終的な重鎖（すなわち、８２のＶｈ遺伝子、６のＪｈ遺伝子および３つの異なる定常領域Ｃμ、Ｃδ、Ｃγならびにそれらに対応する調節配列）をもたらした。このＹＡＣをｙＨ２と命名した。この構築をゼノマウスの産出用に使用した。
【０１２０】
全カッパ遺伝子座を含有する再構築ＹＡＣにネオマイシン選択マーカーを結合したことを除き、前記で使用したものと同様の計画をカッパ遺伝子座の再構築に利用した。このＹＡＣをｙＫ２と命名した。
【０１２１】
ＹＡＣ含有酵母スフェロプラストとＨＰＲＴ欠損Ｅ１４．ＴＧ３ＢマウスＥＳ細胞との融合により、ｙＨ２を含有するＹＡＣをＥＳ細胞に導入する。ＨＰＲＴ陽性細胞を選択する。陽性クローンを増殖させ、そしてサザンブロットおよびＣＨＥＦブロット解析によって解析する。完全なｙＨ２ＹＡＣを含有するクローンを選択する。
【０１２２】
ＥＳ細胞におけるｙＫ２ＹＡＣの導入および選択は、ｙＨ２ＹＡＣについての記載と同様に実施した。
【０１２３】
ＹＨ２含有ＥＳ細胞をマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊブラストサイトに微量注入する。作製されたキメラの雄は、子孫への生殖系遺伝に対して評価される。
【０１２４】
ｙＨ２およびまたはｙＫ２トランスジェニックマウスはＤＩマウスと交配される（遺伝子ターゲッティングされ不活性化されたマウスの重鎖遺伝子座およびカッパ鎖遺伝子座に対してホモ接合型）。ｙＨ２；ＤＩトランスジェニック株をｙＫ２；ＤＩトランスジェニック株と交配させ、ゼノマウス株を作製した。
【０１２５】
ゼノマウスにおけるＢ細胞発生の再構成および抗体産生は、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡによって評価される。
【０１２６】
ゼノマウスの免疫化は実施例２記載のように実施される。
【０１２７】
ハイブリドーマ調製および陽性クローンのスクリーニング方法は、実施例３および４記載の方法と同様である。
【０１２８】
ハイブリドーマクローン１２．６、２８、２９．８、３０および５０．３０は、ブダペスト条約にしたがって、ザ コレクション ナショナル デ カルチャー デ マイクロオーガニスムズ（ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）（ＣＮＣＭ）、パスツール研究所、パリ、に寄託し、それぞれ寄託番号Ｉ−２３９０、Ｉ−２３９１、Ｉ−２３９２、Ｉ−２３９３およびＩ−２３９４を与えられた。
【０１２９】
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Ｌａｎｆｏｒｄ Ｒ． Ｅ．， Ｃａｒｅｙ， Ｋ． Ｄ．， Ｅｓｔｌａｃｋ， Ｌ．Ｅ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｇ． Ｃ．， ａｎｄ Ｈａｙ， Ｒ． Ｖ． （１９８９） “Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｂａｂｏｏｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ”Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２５：１７４−８２．
Ｌａｓｋｕｓ Ｔ．， Ｒａｄｋｏｗｓｋｉ， Ｍ．， Ｗａｎｇ， Ｌ． Ｆ．， Ｃｉａｎｃｉａｒａ， Ｊ．， Ｖａｒｇａｓ， Ｈ．， ａｎｄ Ｒａｋｅｌａ， Ｊ． （１９９７）． “Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｉｓ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｒｅ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｏ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ： ａ ｃａｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｅｘｔｒａｈｅｐａｔｉｃ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７８ ： ２７４７−５０．
Ｍａｕｒｅｌ Ｐ． （１９９６）“Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｙｓｔｅｍｓ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｄｒｕｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｍａｎ”． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ． ２２ ： １０５−１３２
Ｍｅｎｄｅｚ． Ｍ． Ｍ．， Ｇｒｅｅｎ， Ｌ． Ｌ．， Ｃｏｒｖａｌａｎ， Ｊ． Ｒ． Ｆ．， Ｊｉａ Ｘ−Ｃ．， Ｍａｙｎａｒｄ−Ｃｕｒｒｉｅ， Ｅ． Ｅ．， Ｙａｎｇ， Ｘ−Ｄ．， Ｇａｌｌｏ． Ｍ． Ｌ．， Ｌｏｕｉｅ， Ｄ． Ｍ．， Ｌｅｅ， Ｄ． Ｖ．， Ｅｒｉｃｋｓｏｎ， Ｋ． Ｌ．， Ｌｕｎａ， Ｊ．， Ｒｏｙ， Ｃ．Ｍ−Ｎ．， Ａｂｄｅｒｒａｈｉｍ， Ｈ．， Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ， Ｆ．， Ｎｏｇｕｃｈｉ， Ｍ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｍ．， Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ， Ａ．， Ｈａｌｅｓ， Ｊ． Ｆ．， Ｆｉｎｅｒ， Ｍ． Ｈ．， Ｄａｖｉｓ， Ｃ． Ｇ．， Ｚｓｅｂｏ， Ｋ． Ｍ． ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ， Ａ． （１９９７）．“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｏｆ ｍｅｇａｂａｓｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｏｃｉ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｉｃｅ”． Ｎａｔｕｒｅ
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Ｓｕｄｈｏｆ， Ｔ． Ｃ．， Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｊ． Ｌ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｍ． Ｓ．， ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ． Ｗ． （１９８５）． “Ｔｈｅ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ： ａ ｍｏｓａｉｃ ｏｆ ｅｘｏｎｓ ｓｈａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２８（４７０１）， ８１５−２２．
Ｕｒｌａｕｂ， Ｇ． ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｌ． Ａ． （１９８０） Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｍｕｔａｎｔｓ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７： ４２１６−４２２０．
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対するモノクローナル抗体の開発を表すフローチャートを示す図である。
【図２】
図２は、レーン１にｒ−ｈｓＬＤＬＲの＋２９１型、レーン２に尿ｈｓＬＤＬＲおよび陰性コントロールとしてのレーン３に組換え体ヒトｐ５５ＴＮＦ受容体（ｒ−ｈＴＢＰ−１）の、各細片の下方に示すモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット解析を示す図である。図面左の矢印は分子量マーカーの位置を示し、図面右の矢印は、各矢印の上に示されるｈｓＬＤＬＲ型の位置を示す。
【図３】
図３は、培養ＦＴ１６７におけるＨＣＶ（＋）鎖および（−）鎖の産生に対するＭａｂ１２．６、２８および２９．８の効果を示す図である。細胞は、感染３０分前にＭａｂ抗ＬＤＬＲ（８または２μｇ／ｍｌ）により処理された。ついで、細胞は２５μｌのＨＣＶ（＋）血清（Ｎ°４２；１ｂ）で一晩感染させた。感染の翌日、３回の洗いを実施し、そして４８時間ごとに新しい培地を添加して交換した。感染５日後に肝細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、そして１μｇの細胞のＲＮＡをｒＴｔｈ ＲＴ−ＰＣＲ（パーキン エルマー社製）により解析した。検定は２回実施した。＋ＳＰ：プラス鎖ＲＮＡ検定；−ＳＰ：マイナス鎖ＲＮＡ検定；Ｘ：ブランク
［本発明の分野］
本発明は、低密度リポタンパク質に対するヒト受容体（ＬＤＬＲ）を特異的に認識するモノクローナル抗体に関する。それらの抗体は、たとえば、生産工程におけるヒト可溶性ＬＤＬＲ（ｈｓＬＤＬＲ）の同定および精製、ならびにＣ型肝炎感染（ＨＣＶ）などの疾患の同定および治療において有用である。
【０００２】
［本発明の背景］
すべての真核生物の形質膜の成分であるコレステロールは、高等生物における細胞の増殖および生存に必須である。しかしながら、コレステロールの高い血清レベルは、全身の動脈におけるアテローム硬化性のプラーク形成の一因となることにより、疾患および死を引き起こす。哺乳動物におけるコレステロール合成の主な部位は肝臓である。コレステロールのかなりの量が腸によっても形成されている。それらの臓器によるコレステロール形成の速度は、食事供給源（ｄｉｅｔａｒｙ ｓｏｕｒｃｅｓ）から吸収されるコレステロールの量に対して非常に反応しやすい。肝臓および腸以外の細胞は、新たなコレステロールの合成によってではなく、血漿からコレステロールを得る。コレステロールおよびほかの脂質は、増加する密度にしたがって分類されるリポタンパク質により、体液に輸送される。リポタンパク質は、極性脂質とアポタンパク質とからなる外皮に囲まれた疎水性脂質のコアからなる粒子である。そのようなリポタンパク質は、高い疎水性の脂質を可溶化し、特異的な標的細胞や組織の中および外への特定の脂質の移動を制御するシグナルを収容するという、２つの役割を担う。コレステロールは、非肝細胞の形質膜上にある特異的受容体に結合する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）により、体液に輸送される。ついで、受容体−ＬＤＬ複合体は、受容体媒介エンドサイトーシスとして知られる輸送機構により、細胞の中へと内在化される（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． １９７９）。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体は、哺乳動物細胞において多数のリガンドのエンドサイトーシスを媒介する、構造的に関連付けられた細胞表面受容体のファミリーのプロトタイプである。
【０００３】
ＬＤＬ受容体は８２２アミノ酸残基からなり、１６４０００の分子量を示す。ＬＤＬ受容体はいくつかのドメインからなり、そのドメイン中には他のタンパク質に配列相同性を有するものがある。そのＮＨ２末端のリガンド結合ドメインは、７つのシステインリッチの不完全な繰り返しを配された２９２残基からなる。各繰り返しは、１つから３つのパターンでジスルフィド結合された６つのシステイン残基を含有する（Ｂｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ． １９９５）。このドメインに、４つのさらなるドメインが続く。第１番目は４００アミノ酸残基からなりかつＥＧＦ受容体に相同性を有しており、第２番目はＯ−結合糖に富む５８アミノ酸残基からなるものであり、第３番目は２２アミノ酸残基からなる１つの膜貫通ドメインであり、および第４番目は５０アミノ酸残基からなる細胞質ドメインである（Ｓｕｄｈｏｆ ｅｔ ａｌ． １９８５）、（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ． １９８６）。
【０００４】
ＬＤＬ受容体の生理学的な重要性は、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）に関するＢｒｏｗｎおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎの研究により明らかにされた。当該疾患は、ＬＤＬに対する機能的な受容体の欠如または欠失を生じる分子遺伝学的障害が原因で発見された（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ． １９７６）。ＦＨ突然変異の種類のいくつかは特徴づけられた（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． １９７５）。
【０００５】
抗ウイルス活性を示す可溶型のｓＬＤＬＲは、インターフェロンに誘導された細胞の培養上清から（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９３）および体液において（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９４）同定され単離された。インターフェロンに誘導されるタンパク質のいくつかは、ＩＦＮによる抗ウイルス状態の誘導に役立つものとして同定されている。抗ウイルス活性を示すそのようなタンパク質の１つが、ヒト羊膜ＷＩＳＨ細胞の培養上清に産生され蓄積された。このタンパク質が均質に精製され、そしてｓＬＤＬＲとして同定された（ＥＰ０５５３６６７およびＦｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９３を参照）。ｓＬＤＬＲは、インターフェロンに応答して抗ウイルス状態にはいる哺乳動物細胞により、培地中に分泌されることが見出された。インターフェロンと異なり、ｓＬＤＬＲは細胞において抗ウイルス状態を誘導しないが、それ自体で抗ウイルス性である。ｓＬＤＬＲは、ウイルスの複製、成熟および出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）の過程で存在していなければならないようであることが分かり、ｓＬＤＬＲは、ウイルスの集合または出芽の阻害を導く複雑な過程に関連しているかもしれないことが示唆された（未公開データ）。Ｃ型肝炎ウイルスのエンドサイトーシスは、培養細胞上のＬＤＬ受容体により媒介されていることが最近示された（Ａｇｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ． １９９９）。それらおよびほかの発見は、ＬＤＬ受容体のファミリーがウイルス受容体として働き得ることを示唆する。したがって、ｓＬＤＬＲ受容体に対する抗体は、細胞のＬＤＬ受容体に結合することによるウイルス粒子の侵入および出芽を妨害するかもしれない。
【０００６】
これまでに知られているＬＤＬＲの唯一入手可能なモノクローナル抗体は、ウシＬＤＬＲの抗体であるＣ７であり（Ｂｅｉｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ． １９８１，アマシャム社、ＵＫより商業的に入手可能）、均質に精製されたウシ副腎皮質ＬＤＬＲによるマウスの免疫化により製造された。ウシ副腎皮質由来の膜が可溶化され、受容体はＤＥＡＥセルロースカラムからの溶出により部分的に精製された（Ｂｅｉｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ． １９８１）。ウシＬＤＬＲの抗体は、ヒトＬＤＬＲと弱い交差反応を示すのみである。
【０００７】
実際、ウシＬＤＬＲに対するＣ７Ｍａｂは、組換えヒトＬＤＬＲの検出および定量に使用される際に著しい不利益を有することが分かった：
ａ）Ｃ７Ｍａｂは、ヒトＬＤＬＲに対して非常に低い親和性を有する。
ｂ）Ｃ７Ｍａｂは、細胞培養物由来の不純物と顕著に交差反応する。
【０００８】
ヒトＬＤＬＲの特異的な抗体は、以前は入手可能ではなかった。精製、同定のために、または検定開発目的のために新規タンパク質に対する抗体をおこすことは非常に一般的であるため、これは驚くべきことである。モノクローナル抗体を生成するための条件は、効果的なマウスの免疫化を可能とする、利用可能な充分に量の多い高度に精製された抗原であるため、そのような抗体はこれまでつくられていないということが考えられる。高度に精製された抗原は、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて単一の大きなピークとしてあらわれるものである。さらには、精製過程で抗原の同定および定量の方法を確立することは容易ではなかった。本発明により、本願明細書において説明される抗ウイルス活性検定は、精製過程でＬＤＬＲの同定に使用された。
【０００９】
効果的な免疫検定（ＥＬＩＳＡ）を開発するための方法、およびウェスタンブロットにおいてタンパク質を同定するための方法を提供するために、ヒト可溶性ＬＤＬＲに対する特異的Ｍａｂを生成する必要がある。それらの抗体は、組換えヒト可溶性ＬＤＬＲの産生および精製過程の進行中における組換えタンパク質の記録および定量のために、および天然タンパク質の検出のために必要とされる。
【００１０】
［本発明の要旨］
本発明は、ヒトＬＤＬ受容体およびその断片を特異的に認識して結合することができるモノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞株の生成を可能とする。
【００１１】
さらに詳細には、本発明は、ヒト可溶性ＬＤＬ受容体を特異的に認識して結合することができるモノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞株の生成を可能とする。
【００１２】
したがって、本発明は、モノクローナル抗体Ｃ７を除く、ヒトＬＤＬ受容体およびその断片を特異的に認識して結合するモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、抗−抗Ｉｄ抗体またはそれらの断片に関する。
【００１３】
本発明は、ヒト可溶性ＬＤＬＲを認識して結合し、下記の要求を満たすモノクローナル抗体を提供する。
１．ヒト可溶性ＬＤＬＲの検出のためのＥＬＩＳＡ、たとえばサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、における対として使用され得るＭａｂ
２．ウェスタンブロット分析におけるＬＤＬＲの同定のために使用され得るＭａｂ
３．ヒト可溶性ＬＤＬＲの抗ウイルス性生物学的活性を中和するために使用され得るＭａｂ
４．ＨＣＶなどのウイルス感染を阻害するために使用され得るＭａｂ。
【００１４】
本発明はさらに、ヒトＬＤＬＲの検出および／または定量の目的で、既知の方法での本発明の特異的モノクローナル抗体の使用を含む、ヒトＬＤＬＲの検出および／または定量方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、組換えヒトＬＤＬＲで免疫化した哺乳動物由来の脾臓細胞および均質もしくは不均質のリンパ系細胞からなるクローン化されたハイブリドーマを提供する。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体は、従来の方法で、たとえばｈｓＬＤＬで免疫化した哺乳動物由来の脾臓細胞および均質もしくは不均質のリンパ系細胞からなるクローン化されたハイブリドーマを液体培地または哺乳動物の腹腔において増殖させ、ハイブリドーマがモノクローナル抗体を産出および蓄積することを可能にすることにより、製造される。
【００１７】
さらにもうひとつの態様において、本発明は、粗ＬＤＬＲ含有する材料を本発明のモノクローナル抗体に接触させることを含むヒトＬＤＬＲの精製方法を提供する。吸着させたＬＤＬＲ特異的なモノクローナル抗体を含むカラムは、組換えタンパク質の精製方法におけるアフィニティー精製工程として使用し得る。
【００１８】
組換え体ヒトＬＤＬＲの検出および測定方法は、実施例５に記載されているようなＥＬＩＳＡ検定において、本発明のモノクローナル抗体を抗体として使用することを含む。
【００１９】
動物用を免疫化するためのＬＤＬＲまたはＬＤＬＲの断片としては、温血哺乳動物のＬＤＬＲであるかぎり、いかなるＬＤＬＲも使用し得る。ＬＤＬＲのムテインもまた使用し得る。そのような哺乳動物のヒト可溶性ＬＤＬＲの代表例は、ヒトＬＤＬＲの配列の位置＋４のアミノ酸Ａｓｐで始まり位置＋２９１のアミノ酸Ｇｌｕで終わるアミノ酸配列を含む可溶性ＬＤＬＲ＋２９１型であり、＋２９２型などのほかの型も同様に使用し得る。
【００２０】
［本発明の詳細な説明］
ヒト可溶性ＬＤＬＲ（ｈｓＬＤＬＲ）に対するモノクローナル抗体を生成する。それらのモノクローナル抗体を使用することにより、ｈｓＬＤＬＲの同定のためのＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングならびにｈｓＬＤＬＲの抗ウイルス活性に対する中和検定を開発した。
【００２１】
Ｍａｂは、ヒト可溶性ＬＤＬＲのＡｓｐ＋４からＧｌｕ＋２９１までのＮ末端リガンド結合ドメインからなるｈｓＬＤＬＲの組換え体＋２９１型で免疫化したマウスにおいて、生成された。ｈｓＬＤＬＲの組換え体＋２９１型はＣＨＯ細胞で産生され、均質に精製された。
【００２２】
免疫化したマウスは、著しい力価の特異的抗体を産生した。ハイブリドーマのスクリーニングののち、５つのクローン（番号１２、２８、２９、３０および５０）が、高抗体プロデューサーとして同定された。サブクローニングのために、それらのクローンはさらに選択された。サブクローニングののち、高抗体産生能を有する２９のサブクローンを単離し、親クローン由来のアンプルおよびサブクローン由来のアンプルを凍結した。
【００２３】
一組のモノクローナル抗体を、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対するＥＬＩＳＡ用に選択した。Ｍａｂ２８をコーティング抗体として選択し、そしてビオチンで標識化したＭａｂ２９．８を第２抗体として選択した。Ｍａｂ１２．６および２９．８は、ウェスタンブロット解析における天然および組換え体ｈｓＬＤＬＲの同定に適していることが見出され、そしてＭａｂ２８および３０はウェスタンブロット解析における組換え体ｈｓＬＤＬＲの同定に適していることが見出された。Ｍａｂ１２．６および５０．３０は、ｈｓＬＤＬＲの抗ウイルス活性を阻害するために適していることが見出された。
【００２４】
本発明により、Ｍａｂ１２．６、２８および２９．８は、ヒト肝細胞の初代培養におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のウイルスゲノム複製を阻害することも見出された。このように、それらの抗体は、Ｃ型肝炎感染の治療に使用され得る（図３）。
【００２５】
それらのクローンにより産生されるＭａｂのサブクラスアイソタイプが決定された。クローン１２．６、２８、２９．８および３０はＩｇＧ１として同定され、一方、クローン５０．３０はＩｇＭであることが見出された。
【００２６】
ｈｓＬＤＬＲの＋２９１型に対して開発されたＭａｂは、ｈｓＬＤＬＲのほかの型、すなわち組換え体ＣＨＯ細胞において産生されるｒ−ｈｓＬＤＬＲの＋２９２型および＋３３１型をも、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット解析において認識した。＋２９２型はアミノ酸残基Ａｓｐ＋４からＣｙｓ＋２９２までの受容体のＮ末端部を含み、そして＋３３１型はアミノ酸残基Ａｓｐ＋４からＣｙｓ＋３３１までの受容体のＮ末端部を含む。
【００２７】
モノクローナル抗体を生成するためのマウスの免疫化に使用される抗原は、ＣＨＯ細胞において産生されるｒ−ｈｓＬＤＬＲ＋２９１型であった。そのｒ−ｈｓＬＤＬＲの産生は、固定相フィブラセルマトリクスシステム（Ｆｉｂｒａｃｅｌ ｍａｔｒｉｘ ｓｙｓｔｅｍ）を用いるバイオリアクターにおいて実施された。ｒ−ｈｓＬＤＬＲは均質に精製され、そしてマウスを免疫化するために使用された。
【００２８】
最も優れたマウス免疫応答動物由来の免疫脾臓細胞は、ハイブリドーマの融合および生成のために使用された。
【００２９】
本明細書において記載される抗体に関し、用語「モノクローナル抗体」は、
モノクローナル抗体、キメラ抗体、完全にヒト化した抗体、可溶型または結合型で標識化され得る抗イデオタイプ抗体に対する抗体（抗−抗Ｉｄ抗体）、ならびに、酵素的切断、ペプチド合成または組換え技術などの、しかしながらそれらに限定されないあらゆる既知の技術により提供されるそれらの断片を含むことを意味する。
【００３０】
モノクローナル抗体は、抗原に特異的な抗体の実質的に均質な集団を含み、該集団は実質的に同種のエピトープ結合部位を含有する。Ｍａｂは当業者に知られる方法により得ることができる。たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５−４９７ （１９７５）； Ｕ． Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４， ３７６， １１０； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８）； ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｎ． Ｙ．，（１９９２−１９９６）を参照のこと。これらの参考文献の内容は、出典を指示することにより完全に本明細書に取りこまれる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤおよびそれらのサブクラスを含むあらゆる免疫グロブリンのクラスであってよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロ、インサイチュまたはインビボで培養してもよい。インビボまたはインサイチュでの高力価のＭａｂの産生は、現在の好ましい産生方法である。
【００３１】
キメラ抗体は、マウスＭａｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどの、異なる部位が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体は、主として、投与の際に免疫原性を低下させるため、および産生の際に収率をあげるために使用されている。たとえば、マウスのＭａｂはハイブリドーマからの高い収率であるが、ヒトにおいて高い免疫原性を有しているため、ヒト／マウスキメラＭａｂｓが使用される。キメラ抗体およびそれらの産生方法は当業者に知られている（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１： ３２７３−３２７７ （１９８４）： Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１： ６８５１−６８５５ （１９８４） ； Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１２： ６４３−６４６ （１９８４）； Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １２５０２３ （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １４． １９８４）： Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４： ２６８−２７０ （１９８５）； Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １７１４９６ （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９， １９８５）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １７３４９４ （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｒｃｈ ５． １９８６）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ８６０１５３３， （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｒｃｈ １３， １９８６）； Ｋｕｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ １８４１８７ （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊｕｎｅ １１， １９８６）； Ｓａｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７： １０６６−１０７４ （１９８６）； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． Ｗ０８７０２６７１ （ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｍａｙ ７， １９８７）； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４： ３４３９−３４４３ （１９８７）； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４： ２１４−２１８ （１９８７）； Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０： １０４１−１０４３ （１９８８）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ３２３−３２７； Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ｓｕｐｒａ． ）。これらの参考文献は、出典を指示することにより完全に本明細書に取りこまれる。
【００３２】
「完全なヒト化抗体」は、ヒト免疫グロブリンの可変領域および定常領域を共に含有する分子である。完全にヒト化した抗体は、治療の用途に潜在的に使用され得る。自己免疫疾患などの慢性および再発性の疾患に対しては繰り返し治療することが要求される。完全なヒト抗体の製造方法は、内因性のＩｇ遺伝子を不活性にしたマウスにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を導入することによるマウス体液性免疫系の「ヒト化」、すなわちヒトＩｇを産生することができるマウス系統（ゼノマウス）の産生からなる。一般的な免疫応答を最終的に引き起こすために要求されるＩｇ遺伝子座の物質的な構造ならびに遺伝子転位および発現過程に関して、Ｉｇ遺伝子座は非常に複雑である。抗体多様性は、Ｉｇ遺伝子座に存在する様々なＶ、ＤおよびＪ遺伝子間のコンビナトリアル転位によって主に生成される。それらの遺伝子座はまた、抗体発現、対立遺伝子排除、クラススイッチおよび親和性成熟を制御する散在性制御因子を含有する。転位していないヒトＩｇ導入遺伝子のマウスへの導入は、マウスの組換え機構がヒト遺伝子に適合することを証明した。さらに、様々なアイソタイプの抗原特異的ｈｕ−ｍＡｂを分泌するハイブリドーマは、抗原によるゼノマウス免疫化によって得ることができる。
【００３３】
完全なヒト化抗体およびそれらの産生方法は、当業者に知られている（Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５： １４６−１５６ （１９９７）： Ｂｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｘ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１： １３２３−１３２６ （１９９１）； Ｔｏｍｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７： ７２２−７２７ （２０００）； Ｐａｔｅｎｔ ＷＯ ９８／２４８９３）。
【００３４】
抗イデオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、独特の決定基を認識し、一般に抗体の抗原結合部位に結合される抗体である。Ｉｄ抗体は、Ｍａｂの供給源として同種かつ同遺伝子型の動物（たとえばマウス系統）を免疫化し、そのＭａｂに対して抗Ｉｄが製造されることによって製造され得る。免疫化された動物は、イデオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することにより、免疫性を与える抗体のイデオタイプ決定基を認識し応答する。たとえば、Ｕ． Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４， ６９９， ８８０を参照のこと。それは出典を指示することにより完全に本明細書に取りこまれる。
【００３５】
抗Ｉｄ抗体はまた、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を産生するさらに他の動物において、免疫応答を誘導するための「免疫源」として使用され得る。抗−抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導した本来のＭａｂと、エピトープが同一であってもよい。すなわち、Ｍａｂのイデオタイプ決定基に対する抗体を使用することにより、同一の特異性を有する抗体を発現するほかのクローンを同定することが可能である。
【００３６】
したがって、本発明のＬＤＬＲに対して生成されたＭａｂ、そのアイソフォーム、アナログ、断片または誘導体は、ＢＡＬＢ／ｃマウスなどの適当な動物において抗Ｉｄ抗体を誘導するために使用され得る。そのような免疫化されたマウス由来の脾臓細胞は、抗Ｉｄ Ｍａｂを分泌する抗Ｉｄハイブリドーマを産生するために使用される。さらには、抗Ｉｄ Ｍａｂを、カサガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体に結合し、さらなるＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用し得る。それらのマウスからの血清は、前記ＬＤＬＲタンパク質またはそのアナログ、断片および誘導体のエピトープに特異的な本来のＭａｂの結合特性を有する抗−抗Ｉｄ抗体を含有するであろう。
【００３７】
したがって、抗Ｉｄ Ｍａｂは、それら独自のイデオタイプエピトープ、または評価されたそのエピトープに構造的に類似する「イデオトープ」を有する。用語「モノクローナル抗体」はまた、完全な分子および、たとえば抗原に結合することができるそのＦａｂおよびＦ（ａｂ′）２などの断片の双方を含むことを意図されている。ＦａｂおよびＦ（ａｂ′）２断片は、完全な抗体のＦｃ断片を欠き、血液循環からより早急に排除され、そして完全な抗体よりも非特異的組織結合が少ない（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ２４： ３１６−３２５ （１９８３））。
【００３８】
本発明において有用な抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ′）２ならびにほかの断片は、本明細書において開示される完全な抗体分子用の方法にしたがい、ＬＤＬＲタンパク質の検出および定量のために使用し得ることは評価されるであろう。そのような断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を産生）またはペプシン（Ｆ（ａｂ′）２断片を産生）などの酵素を用いるタンパク質分解的切断によって、一般に産生される。
【００３９】
モノクローナル抗体が分子に特異的に反応することができ、それにより分子が抗体に結合する場合は、モノクローナル抗体は分子に「結合することができる」といわれる。用語「エピトープ」は、抗体により結合され得るあらゆる分子の一部であって、またその抗体によっても認識される一部を指すことを意図されている。エピトープまたは「抗原決定基」は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面配置から構成され、特異的な３次元構造の特徴および固有の電荷特性を有する。
【００４０】
「抗原」は、抗体により結合され得る分子または分子の一部であり、抗原はさらに、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を動物に産生させることができる。抗原は１つ以上のエピトープを有し得る。前記で言及した特異的反応は、抗原は、高い選択的様式で、他の抗原によってつくられ得るほかの多数の抗体ではなく、その対応する抗体上のエピトープに反応することを示すものとして意図されている。
【００４１】
本発明に有用な、抗体の断片を含む抗体は、試料中のＬＤＬＲタンパク質を量的または質的に検出するために、または本発明のＬＤＬＲタンパク質を発現する細胞の存在を検出するために使用され得る。これは、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー検出法または蛍光測定検出法と組み合わせる、蛍光標識化抗体（下記を参照のこと）を用いる免疫蛍光技術により達成することができる。
【００４２】
本発明において有用な抗体（またはその断片）は、本発明のＬＤＬＲタンパク質のインサイチュ検出法のための免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法などにおいて、組織学的に使用され得る。インサイチュ検出法は、患者から組織学的標本を取りだし、そして本発明の標識化抗体をその標本に供給することにより達成され得る。抗体（または断片）は、標識化抗体（または断片）を生物学的試料に適用することにより、または標識化抗体（または断片）を生物学的試料で覆うことにより提供されることが好ましい。そのような手法を使用することによって、ＬＤＬＲタンパク質の存在だけでなくその検査される組織上の配置もまた、決定することができる。本発明を用いれば、当業者は、そのようなインサイチュ検定法を達成するために、広く様々な組織学的方法（染色手法など）を改変し得ることを、容易に理解するであろう。
【００４３】
本発明のＬＤＬＲタンパク質用のそのような検定は、通常は、ＬＤＬＲタンパク質を同定することができる標識化抗体の存在下において、生物学的流体、組織抽出物、リンパ球もしくは白血球などの採取したばかりの細胞、または組織培養においてインキュベーションされている細胞などの生物学的試料をインキュベーションし、ついで本分野において既知のあらゆる技術により該抗体を検出することを含む。
【００４４】
生物学的試料は、ニトロセルロースなどの固相支持体または担体、または細胞、細胞片もしくは可溶性タンパク質を固定することができるほかの支持体または担体に結合してもよい。ついで、支持体または担体を適当な緩衝液で洗い、前記のように本発明したがって標識化抗体で処理する。固相支持体または担体はついで、結合していない抗体を除去するために緩衝液で２回洗う。ついで、前記固定支持体または担体上の結合した標識の量は、従来の方法により検出される。
【００４５】
「固相支持体」、「固相担体」、「固定支持体」、「固定担体」、「支持体」または「担体」は、抗原または抗体を結合することができるあらゆる支持体または担体を意図されている。公知の支持体または担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンアミラーゼ類、天然および修飾セルロース類、ポリアクリルアミド類、ガブロス（ｇａｂｂｒｏｓ）ならびに磁鉄鉱を含む。担体の性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性あるいは不溶性のどちらかであり得る。支持体材料は、結合される分子が抗原または抗体に結合することができる限り、事実上あらゆる構造構成を有していてもよい。したがって、支持体または担体の構成は、ビーズのような球状、試験管の内面または棒の外表面のようなシリンダー状であってもよい。あるいは、その表面は、シート、検定細片（ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ）などの平面であってもよい。好ましい支持体または担体はポリスチレンビーズを含む。当業者は、抗体を結合するほかの適当な担体を理解するであろうし、または日常の試験の用途により同様のことを確認することができるであろう。
【００４６】
前記のように、本発明の得られた多くの抗体の結合活性は、既知の方法にしたがって測定され得る。当業者は、日常の試験を使用することによって、各測定法における作用のおよび最善の検定条件を決定することができるであろう。
【００４７】
洗い、撹拌、振とう、濾過などのほかの工程は通常のもの、あるいは特定の状況に必要なものである場合、前記検定に追加してもよい。
【００４８】
本発明の抗体が標識化され得る方法の１つは、酵素に抗体を結合し、酵素免疫検定（ＥＩＡ）において使用するものである。その結果、のちに酵素が適当な基質にさらされると、たとえば分光光度計法、蛍光測定法または可視的方法によって検出され得る化学的部分を産生するための方法において、酵素は基質と反応する。抗体を検出できるように標識化するために使用される酵素は、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定されない。検出は、酵素に対する色素原基質を使用する比色分析法により達成され得る。検出はまた、同様に調整された標準物に対する基質の酵素的反応の程度を可視的に比較することにより、達成され得る。
【００４９】
検出は、様々なほかの免疫検定を用いることにより達成してもよい。たとえば、抗体または抗体断片を放射活性標識することにより、放射性免疫検定法（ＲＩＡ）を用いてＲ−ＰＴＰａｓｅを検出することが可能である。ＲＩＡの適当な説明は、本明細書に出典を指示することにより取りこまれるＣｈａｒｄ， Ｔ．による“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”と題された章にとくに関連する、Ｗｏｒｋ， Ｔ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＮＹ （１９７８）によるＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙにみられる。放射活性アイソトープは、ｇカウンターまたはシンチレーションカウンターを使用した方法などにより、またはオートラジオグラフィーにより検出され得る。
【００５０】
蛍光化合物により本発明の抗体を標識することも可能である。蛍光標識化抗体が適当な波長の光にさらされると、蛍光によりその存在が検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、ピコシアニン、アロフィコシアニン、Ｏ−フタルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレサミンである。
【００５１】
抗体はまた、１５２Ｅまたはほかのランタニド類などの蛍光放射金属を用いて検出可能に標識化することができる。それらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＥＴＰＡ）などの金属キレート群を用いることにより、抗体に結合することができる。
【００５２】
抗体はまた、化学発光化合物に結合することにより検出可能に標識化することができる。ついで、化学発光を付加した抗体の存在は、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することにより測定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマチックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【００５３】
さらに、本発明の抗体を標識するために、生物発光化合物を使用してもよい。生物発光は、触媒タンパク質により化学発光反応の効率が増大される生物系において見出された、化学発光の１つの型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより測定することができる。標識の目的で重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【００５４】
本発明の抗体分子は、同様に「両側」または「サンドイッチ」検定として知られる免疫測定検定法における使用に適応されてもよい。典型的な免疫測定検定法において、定量の非標識化抗体（または抗体の断片）が固定支持体または担体に結合され、そして定量の検出可能に標識化された可溶性抗体を添加することにより、固相抗体、抗原および標識化抗体のあいだで形成される３元の複合体の検出および／または定量を行う。
【００５５】
典型的で好ましい免疫測定検定は、まず、試験される試料と固相に結合する抗体を接触させ、二元の固相抗体−抗原複合体の形成によって試料から抗原を抽出する「フォワード」検定を含む。適当なインキュベーション後、固相支持体または担体を、液体試料の残渣（もしあるとすれば、未反応の抗原を含む）を除去するために洗い、ついで未知量の標識化抗体（「リポーター分子」として機能する）を含有する溶液と接触させる。非標識化抗体をの中で、固定支持体または担体に結合した抗原と標識化抗体とを複合体にするための第２のインキュベーションののち、未反応の標識化抗体を除去するために固定支持体または担体を２回洗う。
【００５６】
本発明の抗原を用いることによってもまた有用であり得るもう１つの型の「サンドイッチ」検定において、いわゆる「同時」および「逆」検定が用いられる。同時検定は、固定支持体または担体に結合した抗体、および標識化抗体をともに同時に試験される試料に添加するために、１つのインキュベーション工程を含む。インキュベーションを完了したのち、液体試料の残渣および非複合体の標識化抗体を除去するために固定支持体または担体を洗った。固定支持体または担体に結合した標識化抗体の存在は、ついで、従来の「フォワード」サンドイッチ検定と同様に測定される。
【００５７】
「逆」検定において、まず、標識化抗体の溶液を液体試料に徐々に添加し、ついで適当なインキュベーション期間が設けられたのちに、固定支持体または担体に結合した非標識化抗体を添加する。２回目のインキュベーションののち、試験試料の残渣および未反応の標識化抗体の溶液を除くために、固定相を従来の様式で洗う。ついで、固定支持体または担体に結合した標識化抗体の測定は、「同時」および「フォワード」検定と同様にして測定される。
【００５８】
ここで、以下の非限定的な実施例を用いて本発明を説明する。
【００５９】
［実施例］
実施例１ ＣＨＯ ｒ−ｈｓＬＤＬＲの調製
２つの発現ベクター（アミノ酸残基Ａｓｐ（＋４）から始まりＧｌｕ２９１（＋２９１）までのＬＤＬＲのＮ末端リガンド結合ドメインを含有するｐｓＬＤＬＲ０１、およびＤＨＦＲに対するマウス遺伝子を含有するｐＤＨＦＲ。双方ともＳＶ４０初期領域のプロモーターおよび転写終結エレメントにより調節される）を用いる、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を欠くＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞（Ｕｒｌａｕｂ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， １９８０）への共トランスフェクションにより、ヒト可溶性ＬＤＬＲを発現する安定な組換え体ＣＨＯ細胞を生成した。トランスフェクションは、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ）（ギブコＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）製）を用いる陽イオンリポソームにより、製造業者により記載されたプロトコルにしたがって実施した。トランスフェクションの７２時間後、デオキシヌクレオシドおよびリボヌクレオシドを欠き、かつ１０％の透析ＦＣＳを補充した選択培地に細胞を移した。ＤＨＦＲ活性を発現する細胞はコロニーを形成することができ、トリプシンを含ませたペーパーディスクで細胞をつりあげることによって単離した。細胞を増殖させ、ついでｒ−ｈｓＬＤＬＲ活性に対するスクリーニングを行った。ついで、トランスフェクションされた細胞を用いてＭＴＸによる遺伝子増幅を行い、続いて安定なプロデューサークローンのサブクローニングおよび選択を行った。
【００６０】
５リットルのＣｅｌｌｉＧｅｎバイオリアクターにおける無血清培地（ギブコＣＨＯ−Ａ−ＳＦＭ、カタログ番号９５−００９１ＤＪ）中で、＃３３−１０−２９−２１と命名した安定なＣＨＯプロデューサークローン細胞を用いて、ｒ−ｈｓＬＤＬＲ（＋２９１型）を産出した。粗製の収集物は、０．８−０２μカートリッジフィルター（ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）カタログ番号ＣＳＳ９２ＤＳＣＣＫ）による濾過によって清澄化し、そして５−ｋＤａ膜で覆って１００倍に濃縮した。最初の免疫化に用いられたｒ−ｈｓＬＤＬＲの＋２９１型は、スモールスケール精製方法を用いて精製された。その方法において、ＤＥＡＥセファロース陽イオン交換カラムが用いられ、ついでブチル−ＴＳＫカラムにおける疎水的相互作用工程、続いてＨＴＰカラムおよびセファクリル１００カラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。ＳＥＣの分画＃２７は、下記の実施例９記載の抗ウイルス検定において検出された７８０ユニット／μｇの特異的抗ウイルス活性を有していたので、ＳＥＣの分画＃２７を選択した。その分画におけるタンパク質を、Ｎ末端分析により、ｒ−ｈｓＬＤＬＲとして同定した。
【００６１】
ＣＨＯ＋２９１ｒ−ｈｓＬＤＬＲの第２の群を精製し、マウスの促進注射用に用いた。以下の工程、ａ）清澄化および粗製収集物の１００倍濃縮、ｂ）ＨＱ ＰＯＲＯＳ陰イオン交換カラム、およびｃ）２つの疎水的相互作用（ＨＩＣ）工程（ブチル−ＴＳＫカラムでの捕捉およびフェニル５ＰＷカラムによる流下）を含む、収率が改良された精密な工程を用いて精製した。最終のＨＩＣ工程由来の非結合分画を透析し、そしてＨＳ−ＰＯＲＯＳ陽イオン交換カラムにより精製した。その最終工程はヒドロキシアパタイト（ＨＴＰ）カラムであった。そして、ｒ−ｈｓＬＤＬＲは約９０％まで精製され、ＲＰ−ＨＰＬＣにおける単一の主要ピークとして溶出された。
【００６２】
実施例２ マウスの免疫化
前記実施例１のＳＥＣカラムの分画＃２７の精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲ１０μｇを、１００μｇ／ｍｌの濃度で、完全フロイントアジュバンド（ＣＦＡ、５０％ｖ／ｖ）で均質化し、５匹の７週齢のＢａｌｂ／Ｃ雌マウスの肢に注射にした。
【００６３】
第１回の免疫化から４週間後、マウスは、ＣＦＡの５０％（ｖ／ｖ）溶液における同分画の精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲ１０μｇにより筋肉内注射で促進された。
【００６４】
第２回の注射から２週間後、以下の実施例３記載の直接的ＥＬＩＳＡを用いて、ｒ−ｈｓＬＤＬＲの抗体に対するマウス血清の試験を行なった。
【００６５】
第２回の注射の１０週間後、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに最も顕著に特異的な免疫活性を有する２匹のマウスＭ−１およびＭ−２を、前記実施例１記載の精密な精製方法で得られた精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲ１０μｇにより、さらに促進させた。
【００６６】
１４週間後にマウスは採血され、ｒ−ｈｓＬＤＬＲの抗体に対する試験を行った。ついで、マウスにＰＢＳ中ｒ−ｈｓＬＤＬＲ５０μｇの２回のさらなる促進薬を、１回目は腹腔内に、そして２回目は２日後、腹腔内および静脈内の双方に与えた。
【００６７】
２回目の注射から２週間後にマウスは採血され、その抗血清は、下記実施例３の直接的ＥＬＩＳＡにより、抗ｒ−ｈｓＬＤＬＲ活性に対して試験された。各抗血清は１：１００〜１：３２０００に順次に希釈され、そして、前記実施例１記載の精密な精製方法により精製されたｒ−ｈｓＬＤＬＲを１０Ｕ／穴でコートした９６穴プレート２組に用いた。検定用緩衝液およびＤＭＥＭ＋ＰＢＳ含有１０％ＨＳ＋１％ＢＳＡまたはゼラチン＋０．０５％ツイーン２０＋０．０５％チメローサルを、ブランクとして各列の第１番目の穴に使用した。正常なマウス血清（ＮＭＳ）を、陰性コントロールとして、最後の２列に同じ希釈割合で用いた。酵素反応の吸光度を、４９２および４０５ｎｍにおいてＥＬＳＡリーダーで測定した。
【００６８】
この試験結果は、マウスＭ−１の血清がｒ−ｈｓＬＤＬＲに対し、より高い特異的免疫活性を有していることを示したので、犠牲死させ、ミエローマ細胞を用いて融合するために脾臓細胞を採取した（Ｅｓｈｈａｒ Ｚ， １９８５）。
【００６９】
実施例３ 抗血清試験の直接ＥＬＩＳＡおよびハイブリドーマクローンスクリーニング
陽性抗血清のスクリーニングのための直接ＥＬＩＳＡを、以下のように実施した。ＰＢＳ＋１％ゼラチン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製、カタログ番号Ｇ−７７６５）＋０．９ｍＭ Ｃａ＋２および０．５ｍＭ Ｍｇ＋２、ｐＨ５．６中ｒ−ｈｓＬＤＬＲ（実施例１の精密な精製方法により精製）１００ユニット／ｍｌの１００μｌ（以下、検定用緩衝液と呼ぶ）を用い、振とうしながら９０分間３７℃で９６穴プレートをコートした。そのプレートを、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０（ポリオキシエチレン−モノラウリン酸ソルビタン−シグマＰ−１３７９）（以下、洗浄溶液と呼ぶ）で６回洗った。
【００７０】
免疫化マウス由来の１：１００〜１：３２０００に順次希釈された抗血清試料、またはハイブリドーマ細胞培養物由来の上清を穴に添加し、９０分間３７℃で振とうしながらインキュベーションし、ついで洗浄溶液で６回洗った。
【００７１】
１：１２００に希釈されたマウスＦａｂ（シグマ社製、カタログ番号４６０１−１）の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ＡＰＡ複合ヤギ抗体１００μｌを穴に添加し、９０分間３７℃で振とうしながらインキュベーションし、ついで洗浄溶液で６回洗った。
【００７２】
基質溶液１００μｌ（ＯＰＤ１錠およびＨ２Ｏ２１錠を２０ｍｌの水に溶解することにより調製）を穴に添加し、そしてＲＴで３０分間インキュベーションした。酵素反応は、１００μｌ／穴の４Ｎ ＨＣｌの添加により停止させた。
【００７３】
９６穴プレートにおける吸光度を４９２および４０５ｎｍにおけるＥＬＩＳＡリーダーを用いて読みとり、得られた結果を、ＥＬＩＳＡリーダーに連結したＰＣコンピュータのＭｕｌｔｉＣａｌｃソフトウェアによって、４つのパラメトリックロジスティックアルゴリズムを用いて計算した。
【００７４】
実施例４ 融合、ハイブリドーマ製造、クローンの選択および腹水液からの抗体の精製
融合方法およびハイブリドーマ細胞選択は、Ｅｓｈｈａｒ Ｚ， １９８５記載のプロトコルにしたがって実施した。つまり、融合する２〜４日前に促進されたマウスＭ−１由来の脾臓細胞を、ＰＥＧを用いる短時間のインキュベーションによってミエローマ細胞と融合した。はじめに、ＰＥＧをＤＭＥＭでゆっくり希釈し、ついで遠心により完全に除去した。細胞をＤＭＥＭ−ＨＡＴ培地に再懸濁し、約３．４×１０−４細胞／穴の濃度で９６穴プレートに配置させ、８％ＣＯ２インキュベータにおいて３７℃で１０〜１４日間インキュベーションした。１０日間内にすべてのハイブリドーマの穴の培地を、１０％ウマ血清（ＨＳ）で補充したＤＭＥＭに交換した。前記実施例３記載の直接ＥＬＩＳＡにより、ｒ−ｈｓＬＤＬＲのＭａｂの存在に対するハイブリドーマ培養上清試料のスクリーニングを行った。検定用緩衝液およびＤＭＥＭ＋１０％ＨＳをブランクとして使用した。Ｍａｂ Ｃ７（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）より商業的に入手可能）およびＭ−１マウス抗血清を陽性コントロールとして使用し、可溶性ｐ５５ＴＮＦ受容体に対するモノクローナル抗体を陰性コントロ−ルとして使用した。培養上清において抗体の存在が検出された穴由来の細胞を２４穴プレートに移し、ついで２５ｃｍ２Ｔ−フラスコに移した。展開された培養は、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対するＭａｂの分泌についてモニターされた。陽性培養物由来の細胞のアンプルを液体窒素において凍結し保存した。
【００７５】
ｒ−ｈｓＬＤＬＲの抗体を検出するために、合計約１０００培養物をスクリーニングした。最も高い免疫活性を有する５４の培養物を数回、再試験した。最も高い活性を有する５つの培養物（１２、２８、２９、３０および５０）を、９６穴プレートにおける限界希釈によりクローン化した。直接ＥＬＩＳＡにより、増殖するクローン由来の上清を数回、ｒ−ｈｓＬＤＬＲの抗体に対して試験した。
【００７６】
陽性ハイブリドーマクローンの細胞を組織培養フラスコにおいて１５％ウマ血清を含有するＤＭＥＭで増殖させ、培養物の一部から得たアンプルを凍結した。並行して、異なるハイブリドーマクローンの細胞を２〜４匹の各マウスに注射し、腹水液を得た。硫酸アンモニウム沈殿法により、またはタンパク質Ｇカラムのどちらかにおいて、抗体を腹水液から精製した。つまり、７．５ｍｌの腹水液を２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７において１：３に希釈し、５ｍｌタンパク質Ｇカラム（Ｃ１０／１０）に添加した。２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７を用いてカラムを洗い、１００ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ２．７を用いてＭａｂを溶出した。１Ｍトリス緩衝液ｐＨ９．３を用いて、溶出分画のｐＨを７〜７．５に調整した。
【００７７】
実施例５ ＥＬＩＳＡに使用するためのＭａｂの対のスクリーニングおよびＥＬＩＳＡパラメータの最適化
下記実施例６記載のｒ−ｈｓＬＤＬＲ用サンドイッチＥＬＩＳＡにおける第１および第２抗体として使用される最適なＭａｂの対を選択するために、前記実施例４記載のように腹水液から精製されたＭａｂは、マトリックス形式での一連の実験を実施するために使用された。つまり、硫酸アンモニウム沈殿法によりまたはタンパク質Ｇカラムのどちからにおいて精製された５つのハイブリドーマ（＃１２、２８．２８、２９．０８、３０および５０．０５）由来の腹水液で、９６穴プレートをコートした。ＣＨＯ細胞において産生されたｒ−ｈｓＬＤＬＲの＋２９１型ならびに＋２９２型（アミノ酸残基Ａｓｐ＋４からＣｙｓ＋２９２まで）および＋３３１（アミノ酸残基Ａｓｐ＋４からＣｙｓ＋３３１まで）型を抗原として用い、抗体をスクリーニングした。サンドイッチＥＬＩＳＡにおける第２抗体としての適合性の短時間スクリーニングのために、前述の部分的に精製された各Ｍａｂの１ｍｌをビオチンにより標識した。つまり、硫酸アンモニウム沈殿法で精製されたＭａｂの１．５ｍｇを、０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３３０μｌにより、ｐＨ８．５に調整した。０．７５ｍｇのビオチン−ＯＳｕ Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）−ビオチン（ビオチン−ＯＳｕ、シグマ社製、カタログ番号Ｈ１７５９、２００μｌＤＭＳＯにおける５ｍｇの溶液）を抗体溶液に添加し、そして緩やかに振とうしながら室温で２時間インキュベーションし、ついで２〜８℃において一晩インキュベーションした。ビオチン化Ｍａｂと過剰な未反応ビオチン−ＯＳｕとを分けるために、反応溶液をセファデックスＧ−２５Ｍ（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カタログ番号１７−０８５１−０１）ＰＤ１０カラムに適用した。
【００７８】
最初の予備実験は、Ｍａｂ２９．０８および３０がＥＬＩＳＡにおける第２抗体として使用された場合、バックグラウンドを超えて最も高いシグナルを産生することを示した。
【００７９】
それら２つのクローンの反応は、プレートのコーティングに使用される抗体１２、２８、２９．０８および５０とともに、第２抗体として再度試験された。この実験結果は明らかに、Ｍａｂ２８はコーティングに最適な抗体であることを示した。
【００８０】
シグナル強度および特異性に関し、最もよい結果は、マイクロタイタープレートのコーティングに使用されたＭａｂ２８および第２抗体としてビオチンで標識化したＭａｂ２９．０８により得られた。それらのＭａｂを使用することにより、ｒ−ｈｓＬＤＬＲの３つの型すべて（＋２９１、＋２９２および＋３３１）でよい結果が得られた。すべての型について、４９２／４０５ｎｍにおける吸光度は約１．３ＯＤであった。
【００８１】
ｒ−ｈｓＬＤＬＲ抗原の３つの型は、０．９〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲の一連の希釈で分析された。コーティングに使用されたＭａｂ２８および第２抗体としてビオチン化されたＭａｂ２９．０８により、用量反応曲線を得た。その組み合わせは、ｒ−ｈｓＬＤＬＲの１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲において、直線反応を示した。
【００８２】
以下の条件を試験することによって、試薬濃度、インキュベーション時間、緩衝液およびプレートの選択など、ＥＬＩＳＡ試験に影響し得る様々な条件を最適化した。
・ＰＢＳ中５〜１０μｇ／ｍｌのＭａｂ２８によるマイクロタイターウェルのコーティング
・緩衝液組成：
ａ）ＰＢＳ＋ツイーン２０
ｂ）トリス＋Ｃａ＋２＋ＮａＣｌ＋ツイーン２０
・ブロッキング溶液
ａ）ＰＢＳ中１％ゼラチン、０．０５％ツイーン、０．００５％チメローサル
ｂ）ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン、０．００５％チメローサル
ｃ）ＰＢＳ中１％ＦＢＳ、０．０５％ツイーン、０．００５％チメローサル
ｄ）ＰＢＳ中１％ミルク、０．０５％ツイーン、０．００５％チメローサル
ｅ）Ｉブロック（Ｉ Ｂｌｏｃｋ）、ハイペップ（Ｈｙ Ｐｅｐ）およびハイイースト（Ｈｙ Ｙｅａｓｔ）
・１０．７４〜０．５３７μｇ／ｍｌの濃度範囲に相当する１：５００、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：８０００、１：１００００の濃度におけるビオチンで標識された第２Ｍａｂ２９．０８
・エクストルアビジン（Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ）濃度：４〜０．２μｇ／ｍｌの濃度範囲に相当する１：５００、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：８０００、１：１００００。
【００８３】
それらの実験に基づき、下記実施例６記載のサンドイッチＥＬＩＳＡ試験のための最終手順を確立した。
【００８４】
実施例６ ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対するサンドイッチＥＬＩＳＡの確立
Ｍａｂ２８および２９．０８を用いて、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対するサンドイッチＥＬＩＳＡを確立した。つまり、１００μｌのタンパク質Ｇ精製Ｍａｂ２８（５μｇ／ｍｌ）を用い、２〜８℃で一晩または３７℃で３時間、９６穴プレートをコートした。ついで、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０を用い、プレートを５回洗った。プレートを２００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡまたはゼラチン＋０．０５％ツイーン２０＋チメローサル０．０５％）とともに３７℃で１時間または４℃で一晩インキュベーションし、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０で５回洗った。１００μｌの検量曲線抗原（ブロッキング溶液で希釈された０．５〜３２ｎｇ／ｍｌのＣＨＯ＋２９１ｒ−ｈｓＬＤＬＲ）または試料を穴に添加し、ついで振とうしながら３７℃で９０分間インキュベーションした。ついで、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０を用いてプレートを５回洗った。
【００８５】
ブロッキング溶液に溶解したビオチン化Ｍａｂ２９．０８（０．６７μｇ／ｍｌ）１００μｌ／穴を添加し、そして３７℃で１時間、振とうしながらインキュベーションした。ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０を用いてプレートを５回洗った。市販のエクストルアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（エクストルアビジン ＴＭ−ペルオキシダーゼ バイオメーカー（ＢｉｏＭａｋｏｒ）、カタログ番号０６４５−１）を１：１００００に希釈した１００μｌを穴に添加し、１時間３７℃で振とうしながらインキュベーションした。ついで、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン２０を用いてプレートを５回洗った。１２５μｌの前記基質溶液を各穴に添加し、その色が所望の強度に達するまで約１０分間インキュベーションした。反応は、１２５μｌの４Ｎ ＨＣｌを添加することにより停止した。９６穴プレートにおける吸光度を４９２および４０５ｎｍ波長においてＥＬＩＳＡリーダーを用いることにより読みとり、その結果をＥＬＩＳＡリーダーに連結したＰＣコンピュータのＭｕｌｔｉＣａｌｃソフトウェアにより計算した。
【００８６】
実施例７ モノクローナル抗体アイソタイプ
モノクローナル抗体Ｉｇアイソタイプは、市販のアイソタイピングキット（ファルミンゲン インターナショナル社製（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を用い、製造会社の検定手順にしたがって測定された。クローン１２．６、２８、２９．８および３０をＩｇＧ１として同定し、一方、クローン５０．３０はＩｇＭクラスであることが分かった。
【００８７】
実施例８ ＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロット解析
精製したｒ−ｈｓＬＤＬＲの＋２９１型およびヒトの尿から精製された天然ＬＤＬＲを、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対して開発されたモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット解析により解析した。つまり、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを、１００ｎｇ／レーンのｒ−ｈｓＬＤＬＲのＣＨＯ＋２９１型または天然の尿ｈｓＬＤＬＲもしくはＴＢＰ−１粗製採取物（陰性コントロールとして）とともに還元条件下（４０ｍＭ ＤＴＴ）において添加した。１つのレーンには低分子量マーカー（ＬＭＷ）を添加した。このサンプルの組み合わせを５回実施した。ゲル上で分離されたタンパク質を、電気溶出によりニトロセルロース膜に移した。１０％低脂肪ミルク、０．１％ツイーン２０を含有するＰＢＳにおいて、膜を１６時間インキュベーションした。膜を細片に切断し、選択した５つのＭａｂ（１２．６、３０、５０．３０、２８または２９．０８（１：４０００希釈の腹水液））のうち１つとともに、各細片を室温で２時間インキュベーションした。
【００８８】
膜の細片は、０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳで洗い（３×１５分間）、第２抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ−アルカリホスファターゼ）（１：１００００希釈、バイオメーカー社製）とのヤギ抗マウス複合体）で２時間インキュベーションした。
【００８９】
細片を、０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳで洗った（３×１５分間）。陽性のバンドを、増強された化学発光（ＥＣＬ、アマシャム社製）により検出した。
【００９０】
モノクローナル抗体＃１２．６および＃２９．８は、ウェスタンブロット解析において、尿の精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲならびに＋２９１型の精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲの双方を認識した（図２）。Ｍａｂ２８および３０は、＋２９１型の精製ｒ−ｈｓＬＤＬＲを認識した。
【００９１】
実施例９ モノクローナル抗体によるｒ−ｈｓＬＤＬＲ抗ウイルス活性の阻害
ＶＳＶ／ＷＩＳＨ系における細胞変性効果（ＣＰＥ）阻害検定を用いることにより、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに特異的に反応したＭａｂを、インビトロにおけるｒ−ｈｓＬＤＬＲ（＋２９１型）の抗ウイルス活性を阻害する能力に対して試験した。
【００９２】
ＷＩＳＨ細胞（ヒト羊膜が起源）を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにおいて、１０％ＦＢＳおよび４ｍＭグルタミンで補充したＭＥＭで培養した。検定開始２４時間前に、指数関数的に増殖する細胞を９６穴組織培養プレートに４００００細胞／穴の密度で播種した。試験すべき試料および標準を希釈し、細胞を有する穴に分配した。即時に、０．５ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でＶＳＶを穴に添加した。プレートを１６〜１８時間３７℃でインキュベーションし、ついでエタノールで洗った。グラムクリスタルバイオレット染色により、生存細胞の単層を観察した。標準に対する細胞変性効果の定量は、標準濃度に対する色密度（ｃｏｌｏｕｒ ｄｅｎｓｉｔｙ）をプロットすることにより、実施した。
【００９３】
抗体の中和効果を解析するために、試験されるＭａｂの腹水液の濃度を上げながら、ｒ−ｈｓＬＤＬＲを３７℃で３０分間プレインキュベーションした。ついで、それらの溶液を９６マイクロタイタープレートにおけるＷＩＳＨ細胞の培養物に添加し、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を添加した。１８時間のインキュベーションののち、クリスタルバイオレットで残った細胞を染色することにより、ＶＳＶ媒介細胞溶解を測定した。標準濃度に対する色強度（ＥＬＩＳＡリーダーにより測定）をプロットすることにより、標準に対する細胞変性効果の半定量を実施した。
【００９４】
ｒ−ｈｓＬＤＬＲの濃度をあげながら、Ｍａｂの効果を試験した。表１に示すように、２つのＭａｂ（１２．６および５０．３０）は中和活性を示すことが分かった。
【００９５】
表１に示す実験において、２つのＭａｂの阻害効果は、腹水液の１：４０希釈で試験された。この希釈で、Ｍａｂ１２．６は、Ｍａｂ５０．３０よりもいくらか高い活性を示した。これは、Ｍａｂの特性ならびに腹水液におけるそれらの濃度の違いに由来する結果かもしれない。
【００９６】
Ｍａｂの阻害効果は、Ｍａｂ濃度に対してｒ−ｈｓＬＤＬＲ濃度を上げることいより解消されることができた。実際に６２．５Ｕ／ｍｌのｒ−ｈｓＬＤＬＲ濃度では、どちらのＭａｂも、解析された抗体濃度において、ｒ−ｈｓＬＤＬＲ活性に対する効果を有していなかった。
【００９７】
【表１】
ｒ−ｈｓＬＤＬＲの抗ウイルス活性阻害は、Ｍａｂ１２．６および５０．３０の濃度を上げながら使用することによって測定された。Ｍａｂ１２．６は、１：４０希釈（腹水液）においては〜６０％で、および１：２０５００希釈においては〜３５％で、ｒ−ｈｓＬＤＬＲの抗ウイルス活性を阻害した。クローン５０．３０は、１：４０希釈においては〜４５％で、および１：２０５００希釈においては〜１５％で、ｒ−ｈｓＬＤＬＲ活性を阻害した。
【００９９】
両Ｍａｂを用いて得られた用量反応曲線、および、阻害効果が過剰のｒ−ｈｓＬＤＬＲによって減じられるという見解により、Ｍａｂはｒ−ｈｓＬＤＬＲへの結合によってその効果を発揮することが示唆された。
【０１００】
実施例１０ モノクローナル抗体によるＨＣＶ複製の阻害
ｒ−ｈｓＬＤＬＲ特異的なＭａｂは、初代培養のヒト肝細胞におけるＨＣＶ複製阻害能力に関して試験された。ＦＴ１６７細胞培養物は、医療目的で葉切除を要する５７歳の男性患者（結腸腫瘍の転移、右葉）由来であった。
【０１０１】
ヒト肝細胞の初代培養を、２工程コラゲナーゼ潅流法（ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｔｅｐｓ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｍａｕｒｅｌ Ｐ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ． ２２： １０５−１３２ （１９９６）， Ｐｉｃｈａｒｄ Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４１： １０４７−１０５５ （１９９２）， Ｆｅｒｒｉｎｉ ＪＢ． Ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ−Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ １０７： ３１−４５ （１９９７））によって調製した。平板培養前の細胞の生存能力は、トリパンブルー排除試験（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｔｅｓｔ）を用いて測定された。３ｍｌ培地中４百万個の細胞を、コラーゲンでプレコートした６０ｍｍプラスチック皿において平板培養した。長期無血清培養培地は、公表されたように補充したウィリアムズＥ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ Ｅ）からなる（Ｌａｎｆｏｒｄ Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ２５ ： １７４−１８２ （１９８９））。つづいで、その培地を４８時間ごとに取り替えた。培養物は、空気および５％二酸化炭素からなる湿潤雰囲気下において３７℃で維持した。それらの培養条件において、ヒト肝細胞は、少なくとも３５日間、その分化した表現型を保ち（Ｆｅｒｒｉｎｉ ＪＢ． Ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ−Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ １０７： ３１−４５ （１９９７））、ＨＣＶ感染に感受性であり、ウイルスゲノム複製に対して許容的である（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ７９： ２３６７−２３７４ （１９９８））。
【０１０２】
ＨＣＶ陽性血清試料：ＥＩＡ ＨＣＶ３．０およびケイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）ＲＩＢＡ ＨＣＶ３．０ＳＩＡにより抗ＨＣＶ抗体陽性を検査された患者由来のヒト血清バンクが設立された。それらの患者の誰もが、ＨＢＶまたはＨＩＶに共感染していなかった。各血清試料において、ＨＣＶ ＲＮＡは、ロッシュ モニター（ｔｈｅ Ｒｏｃｈｅ ｍｏｎｉｔｏｒ）により定量され、ラインプローブ検定（ｌｉｎｅ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ）により遺伝子型を決定された（イノ−リパ ＨＣＶ ＩＩ（Ｉｎｎｏ−Ｌｉｐａ ＨＣＶ ＩＩ）、イノジェネティクス社（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）製）。凍結−解凍サイクルを避けるために、少量のアリコートで血清試料を−８０℃で保存した。それらの実験において、試料Ｓ４２（遺伝子型Ｉｂ；ウイルス負荷：４１００００コピー／ｍｌ）を使用した。
【０１０３】
感染およびつぎの処理のために、肝細胞培養物は、滅菌条件でＰ３研究室（ヒト感染性微生物に対する高度な締め出し）に移された。平板培養の３日後、単離の傷害から細胞が回復したとき、３ｍＬ培地中に存在するＨＣＶ陽性血清試料（Ｓ４２）の２５μｌとともに一晩インキュベーションすることにより、肝細胞のインビトロ感染を実施した。感染後、３ｍＬの新鮮な培地で細胞を３回洗い、そして長期培養培地における正常な条件下で培養を続けた。
【０１０４】
細胞を、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対する３つの異なるＭａｂ（Ｍａｂ１２．６、Ｍａｂ２８、Ｍａｂ２９．８）で処理した。感染の３０分前に、細胞を２または８μｇ／ｍｌの異なるＭａｂに曝した。ついで、細胞を前記のように感染させた。
【０１０５】
コントロール培養物は、同様の条件下であるが抗ウイルス処理をせずに、感染させた。並行実験において、比較のために同じ条件下で、同じ培養物を５０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮαで処理した（ＩＦＮαは細胞におけるＨＣＶ複製を強く阻害する）。すべての処理は２組で実施した。
【０１０６】
感染後５日で、培地を除去し、そして冷たいリン酸緩衝化食塩水を用いて培養物を３回洗った。グアニジニウムイソチオシアネート−酸性フェノール抽出手順を用い、４×１０６肝細胞からＲＮＡを精製した（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ＰＮ． Ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ Ｎ． Ａｎａｌｙｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２： １５６−１５９ （１９８７））。沈殿したＲＮＡをジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理された水５０μｌに溶かし、定量した。１μｇの細胞ＲＮＡを、鎖特異的ｒＴｔｈ ＲＴ−ＰＣＲ検定において解析した。
【０１０７】
感染の可能性を避けるために、鎖特異的ＲＴ−ＰＣＲ検定は、つづいて３つの異なる部屋（前ＰＣＲ室、ＰＣＲ室および後ＰＣＲ室）を用いて実施した。１０μｌのＤＥＰＣ処理された水に溶かしたＲＮＡをミネラルオイルで覆い、９５℃で１分間加熱した。温度を７０℃に下げ、予め加熱されたｃＤＮＡ反応混合液１０μｌを添加した。ついでアニーリングのために温度を２分間６０℃に下げ、そしてｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）製）を用い、ｃＤＮＡ反応を２０分間７０℃で実施した。温度を７０℃に維持し、同時に、ｒＴｔｈ ＲＴ活性を抑制するために、Ｍｎ２＋のキレート剤としてＥＧＴＡを含有する予め温められた緩衝液４０μｌを添加した。反応チューブを７０℃に維持し、同時に、予め温められたＰＣＲ混合液４０μｌを添加した。Ｇｅｎｅ Ａｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９６００（パーキン−エルマー社製）において実施されたＰＣＲ条件は、９４℃１分間の開始サイクル、９４℃１５秒間、５８℃３０秒間および７２℃３０秒間からなる５０サイクル、および７２℃７分間の最終伸長工程からなる。プラス鎖ＨＣＶ ＲＮＡ検定のために、リバースプライマーＰ３のヌクレオチド配列は、５′−ＴＧＧ／ＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＴＣ−３′（ｎｔ３４２〜３２０）であり、そしてフォワードプライマーＰ４のヌクレオチド配列は、５′−ＣＡＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴ−３′（ｎｔ：３８〜５６）である（Ｌａｓｋｕｓ Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７８： ２７４７−２７５０ （１９９７））。マイナス鎖を検出するために、同じプライマーを逆の順序で使用した。アガロース（２％）上でのゲル電気泳動法によって増幅産物の１０分の１を解析し、ついでＢＥＴで着色し、ＵＶ光のもとで写真撮影を行った。すべての一連の実験において、合成ＨＣＶ ＲＮＡ（＋）および（−）鎖の希釈を行い、培養された肝細胞の解析のための条件に似せるために、１μｇの全肝臓ＲＮＡを添加した。それらの混合液は、ＲＴ−ＰＣＲ検定および解析のための陽性コントロールとして使用した。
【０１０８】
図３は、ＬＤＬｒに対するＭａｂの存在下では、ＨＣＶマイナス鎖の産生が培養ＦＴ１６７において完全に阻害されることを示す。したがって、ウイルスゲノムの複製は強く阻害された。その結果は、ＬＤＬＲがＨＣＶに対する受容体であり得るという見解に一致した。
【０１０９】
実施例１１ ＬＤＬＲに対するキメラ抗体の産生
ｍＲＮＡは、ＬＤＬＲ特異的ｍＡｂを産生するハイブリドーマ株から精製した。
【０１１０】
重鎖可変ドメイン由来のエクソンＣＨ１の５′末端に対する相補オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ １）および軽鎖可変ドメインのＣκｈエクソンの５′に対する相補オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ ２）を用い、精製したｍＲＮＡを鋳型として用いて、特異的なｃＤＮＡを合成した。
【０１１１】
２つのｃＤＮＡが得られ、そのうちの１つは重鎖の可変領域（ＬＤＬＲ特異的）をコードし、他方は軽鎖の可変領域（ＬＤＬＲ特異的）をコードする。ｃＤＮＡをクローン化して配列決定する。
【０１１２】
キメラ重鎖の構築のために、クローン化したヒトＩｇ重鎖遺伝子の可変領域を、マウスの重鎖可変ドメイン（ＬＤＬＲ特異的）をコードするクローン化ＤＮＡに交換する（遺伝子操作を用いる）。遺伝子操作は、特異的な制限酵素を用いるヒトＩｇからの可変領域の除去、およびマウス可変領域のライゲーションを含む。キメラ軽鎖を得るために、同じ手順を実施した。
【０１１３】
２つの哺乳動物発現プラスミドを構築する。１つはキメラ重鎖遺伝子を含み、他方はキメラ軽鎖遺伝子を含む。両ベクターは、ハイブリドーマ細胞株（ＳＰ６）を共トランスフェクションするために使用した。
【０１１４】
ＬＤＬＲ特異的Ｉｇの産生は、トランスフェクションした細胞の培養上清を第２抗体として用いるＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにより試験される。リガンドに対するキメラ抗体の親和性は、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって記録された。
【０１１５】
実施例１２ ヒト免疫グロブリン遺伝子座（ゼノマウス）を有するように処理されたトランスジェニックマウスの作製およびｈＬＤＬＲに対するヒトｍＡｂの製造
ゼノマウス作製は、ＷＯ ９８／２４８９３およびＭｅｎｄｅｚ Ｍ， Ｊ． ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５： １４６−５６ （１９９７）に記載されている。
【０１１６】
ヒト重鎖可変領域（約１０００ｋｂ）を含有するＹＡＣについて、ヒト−酵母人工染色体（ＹＡＣ）ライブラリーをスクリーニングする（ＹＡＣクローニング方法は、１００ｋｂより大きい挿入サイズが必要とされる場合の選択方法である）。
【０１１７】
それらのＹＡＣは、サザンブロット解析およびパルスフィールド電気泳動法（ＰＦＧＥ）により特徴づけられる。ＹＡＣは生殖系列立体配置（ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ ｃｏｎｆｉｇｕｌａｔｉｏｎ）においてＣμ、Ｃδ、ＤｈおよびＶｈ領域を含むべきである。
【０１１８】
ＹＡＣに含有されるオーバーラップ配列を利用し、段階的な組換え計画によって、酵母でＹＡＣの組換えを行った。組換えを行う前に、ＹＡＣ（Ｖ領域を有する）の３′末端をＨＰＲＴ選択マーカーに結合した。組換えられたＹＡＣの構造は、ＰＦＧＥおよびサザンブロット解析により確認した（生殖系列立体配置におけるＣ領域からＶｈ領域までのヒト重鎖遺伝子座の存在）。
【０１１９】
完全なγ２定常領域、マウスのエンハンサー、ネオマイシン耐性遺伝子を有するベクターを用いることによりＹＡＣ無動原体アームをターゲッティングし、完全な可変領域を含有する最終的な重鎖（すなわち、８２のＶｈ遺伝子、６のＪｈ遺伝子および３つの異なる定常領域Ｃμ、Ｃδ、Ｃγならびにそれらに対応する調節配列）をもたらした。このＹＡＣをｙＨ２と命名した。この構築をゼノマウスの産出用に使用した。
【０１２０】
全カッパ遺伝子座を含有する再構築ＹＡＣにネオマイシン選択マーカーを結合したことを除き、前記で使用したものと同様の計画をカッパ遺伝子座の再構築に利用した。このＹＡＣをｙＫ２と命名した。
【０１２１】
ＹＡＣ含有酵母スフェロプラストとＨＰＲＴ欠損Ｅ１４．ＴＧ３ＢマウスＥＳ細胞との融合により、ｙＨ２を含有するＹＡＣをＥＳ細胞に導入する。ＨＰＲＴ陽性細胞を選択する。陽性クローンを増殖させ、そしてサザンブロットおよびＣＨＥＦブロット解析によって解析する。完全なｙＨ２ＹＡＣを含有するクローンを選択する。
【０１２２】
ＥＳ細胞におけるｙＫ２ＹＡＣの導入および選択は、ｙＨ２ＹＡＣについての記載と同様に実施した。
【０１２３】
ＹＨ２含有ＥＳ細胞をマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊブラストサイトに微量注入する。作製されたキメラの雄は、子孫への生殖系遺伝に対して評価される。
【０１２４】
ｙＨ２およびまたはｙＫ２トランスジェニックマウスはＤＩマウスと交配される（遺伝子ターゲッティングされ不活性化されたマウスの重鎖遺伝子座およびカッパ鎖遺伝子座に対してホモ接合型）。ｙＨ２；ＤＩトランスジェニック株をｙＫ２；ＤＩトランスジェニック株と交配させ、ゼノマウス株を作製した。
【０１２５】
ゼノマウスにおけるＢ細胞発生の再構成および抗体産生は、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡによって評価される。
【０１２６】
ゼノマウスの免疫化は実施例２記載のように実施される。
【０１２７】
ハイブリドーマ調製および陽性クローンのスクリーニング方法は、実施例３および４記載の方法と同様である。
【０１２８】
ハイブリドーマクローン１２．６、２８、２９．８、３０および５０．３０は、ブダペスト条約にしたがって、ザ コレクション ナショナル デ カルチャー デ マイクロオーガニスムズ（ｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）（ＣＮＣＭ）、パスツール研究所、パリ、に寄託し、それぞれ寄託番号Ｉ−２３９０、Ｉ−２３９１、Ｉ−２３９２、Ｉ−２３９３およびＩ−２３９４を与えられた。
【０１２９】
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Ｍｅｎｄｅｚ． Ｍ． Ｍ．， Ｇｒｅｅｎ， Ｌ． Ｌ．， Ｃｏｒｖａｌａｎ， Ｊ． Ｒ． Ｆ．， Ｊｉａ Ｘ−Ｃ．， Ｍａｙｎａｒｄ−Ｃｕｒｒｉｅ， Ｅ． Ｅ．， Ｙａｎｇ， Ｘ−Ｄ．， Ｇａｌｌｏ． Ｍ． Ｌ．， Ｌｏｕｉｅ， Ｄ． Ｍ．， Ｌｅｅ， Ｄ． Ｖ．， Ｅｒｉｃｋｓｏｎ， Ｋ． Ｌ．， Ｌｕｎａ， Ｊ．， Ｒｏｙ， Ｃ．Ｍ−Ｎ．， Ａｂｄｅｒｒａｈｉｍ， Ｈ．， Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ， Ｆ．， Ｎｏｇｕｃｈｉ， Ｍ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｍ．， Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ， Ａ．， Ｈａｌｅｓ， Ｊ． Ｆ．， Ｆｉｎｅｒ， Ｍ． Ｈ．， Ｄａｖｉｓ， Ｃ． Ｇ．， Ｚｓｅｂｏ， Ｋ． Ｍ． ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ， Ａ． （１９９７）．“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｏｆ ｍｅｇａｂａｓｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｏｃｉ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｉｃｅ”． Ｎａｔｕｒｅ
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ｒ−ｈｓＬＤＬＲに対するモノクローナル抗体の開発を表すフローチャートを示す図である。
【図２】
図２は、レーン１にｒ−ｈｓＬＤＬＲの＋２９１型、レーン２に尿ｈｓＬＤＬＲおよび陰性コントロールとしてのレーン３に組換え体ヒトｐ５５ＴＮＦ受容体（ｒ−ｈＴＢＰ−１）の、各細片の下方に示すモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット解析を示す図である。図面左の矢印は分子量マーカーの位置を示し、図面右の矢印は、各矢印の上に示されるｈｓＬＤＬＲ型の位置を示す。
【図３】
図３は、培養ＦＴ１６７におけるＨＣＶ（＋）鎖および（−）鎖の産生に対するＭａｂ１２．６、２８および２９．８の効果を示す図である。細胞は、感染３０分前にＭａｂ抗ＬＤＬＲ（８または２μｇ／ｍｌ）により処理された。ついで、細胞は２５μｌのＨＣＶ（＋）血清（Ｎ°４２；１ｂ）で一晩感染させた。感染の翌日、３回の洗いを実施し、そして４８時間ごとに新しい培地を添加して交換した。感染５日後に肝細胞を採取し、ＲＮＡを精製し、そして１μｇの細胞のＲＮＡをｒＴｔｈ ＲＴ−ＰＣＲ（パーキン エルマー社製）により解析した。検定は２回実施した。＋ＳＰ：プラス鎖ＲＮＡ検定；−ＳＰ：マイナス鎖ＲＮＡ検定；Ｘ：ブランク
Claims (25)
- モノクローナル抗体Ｃ７を除く、ヒトＬＤＬ受容体およびその断片を特異的に認識して結合するモノクローナル抗体、キメラ抗体、完全なヒト化抗体、抗−抗ＩＤ抗体またはそれらの断片。
- ヒト可溶性ＬＤＬ受容体を特異的に認識して結合する請求項１記載のモノクローナル抗体。
- 番号Ｉ−２３９０によってＣＮＣＭに寄託されるハイブリドーマクローン１２．６により発現されるＭａｂである請求項１記載のモノクローナル抗体。
- 番号Ｉ−１２９１によってＣＮＣＭに寄託されるハイブリドーマクローン２８により発現されるＭａｂである請求項１記載のモノクローナル抗体。
- 番号Ｉ−２３９２によってＣＮＣＭに寄託されるハイブリドーマクローン２９．８により発現されるＭａｂである請求項１記載のモノクローナル抗体。
- 番号Ｉ−２３９３によってＣＮＣＭに寄託されるハイブリドーマクローン３０により発現されるＭａｂである請求項１記載のモノクローナル抗体。
- 番号Ｉ−２３９３によってＣＮＣＭに寄託されるハイブリドーマクローン５０．３０により発現されるＭａｂである請求項１記載のモノクローナル抗体。
- 免疫グロブリンアイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＭに属する請求項３、４、５、６または７記載のモノクローナル抗体。
- 請求項１、２、３、４、５、６、７または８記載のモノクローナル抗体の使用を含むヒトＬＤＬＲの検出および／または定量方法。
- ＥＬＩＳＡにおける対に使用され得る請求項１記載のモノクローナル抗体。
- ハイブリドーマクローン２８または２９．８により生成されるモノクローナル抗体である請求項１０記載のモノクローナル抗体。
- ウェスタンブロット解析においてＬＤＬＲを同定することができる請求項１記載のモノクローナル抗体。
- ハイブリドーマクローン１２．６、クローン２８、クローン２９．８またはクローン３０により生成されるモノクローナル抗体である請求項１２記載のモノクローナル抗体。
- ｒ−ｈｓＬＤＬＲの抗ウイルス生物活性を中和することができる請求項１記載のモノクローナル抗体。
- ハイブリドーマ細胞クローン１２．６またはクローン５０．３０により生成されるモノクローナル抗体である請求項１４記載のモノクローナル抗体。
- Ｃ型肝炎ウイルスの複製を阻害することができる請求項１記載のモノクローナル抗体。
- ハイブリドーマクローン１２．６、クローン２８またはクローン２９．８により生成されるモノクローナル抗体である請求項１６記載のモノクローナル抗体。
- 番号Ｉ−２３９０によってＣＮＣＭに寄託されるハイブリドーマクローン１２．６。
- 番号Ｉ−２３９１によってＣＮＣＭに寄託されるハイブリドーマクローン２８。
- 番号Ｉ−２３９２によってＣＮＣＭに寄託されるハイブリドーマクローン２９．８。
- 番号Ｉ−２３９３によってＣＮＣＭに寄託されるハイブリドーマクローン３０。
- 番号Ｉ−２３９３によってＣＮＣＭに寄託されるハイブリドーマクローン５０．３０。
- ｈｓＬＤＬで免疫化した哺乳動物由来の脾臓細胞と均質または不均質のリンパ細胞とからなるクローン化ハイブリドーマを液体培地または哺乳動物の腹腔において増殖させ、ハイブリドーマにモノクローナル抗体を産生させることを含む、請求項１記載のモノクローナル抗体の製造方法。
- 前記ＬＤＬＲ免疫原が高度に精製されたヒトＬＤＬＲである請求項２１記載の方法。
- 請求項１、２、３、４、５、６、７または８記載のモノクローナル抗体とヒトＬＤＬＲ含有材料とを接触させることからなる、ヒトＬＤＬＲの精製方法。
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