CN103111270A - 一种乙型肝炎抗原蛋白的吸附材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种特异性清除血浆中乙型肝炎毒蛋白的吸附材料及其制备方法。公开了琼脂糖凝胶与基因改造钠离子牛磺胆酸共转运多肽偶联的高分子材料，该材料以琼脂糖凝胶为载体基质，与双缩水甘油醚类偶联试剂反应后得到活性载体，然后再与融合了多肽标签的钠离子牛磺胆酸共转运多肽偶联反应而得到。该材料的合成方法简便、工艺路线短、制备安全；产品具有特异性强、对乙型肝炎毒蛋白的吸附效率高、再生性能好、无毒害、无热源反应，可用于临床上特异性清除血浆中乙肝毒蛋白的吸附治疗。
Description
技术领域
本发明属于医疗生物材料，具体涉及的是用于血液净化的乙型肝炎抗原蛋白的吸附材料及其制备方法。
背景技术
乙型病毒感染性肝炎是威胁人类健康的一类常见疾病，传播范围广，危害性大。是如今严重危害我国人民健康的疾病。我国是乙型肝炎高发区，人群总感染率高达60%，构成乙型肝炎传染源的表面抗原携带者约为10%。全国乙型肝炎表面抗原（HBsAg）携带者超过1.3亿，其中约10%最终转化为各种慢性肝炎，最终转化为肝硬化甚至肝癌，给社会带来了巨大的经济负担。目前，对抗乙肝病毒的药物主要是：干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯片；这些药品虽然对乙肝病毒复制指标（HBV-DNA）有一定的疗效，但治疗期间产生耐药性，乙肝病毒变异副作用大，转阴后反弹率高，治疗难度极大。由于中国乙肝病毒的状况严重，所以国家已经制定了疫苗注射制度。但研究已表明，很多乙肝病毒具有“免疫逃逸”的性能，即具备感染疫苗接种者的能力。总之，疫苗的应用前景不容乐观。
血液中的毒蛋白是乙型肝炎的主要致病因子。虽然已经有了早期的探索，但仍未定论的是如何特异有效地从血液中清除这些毒蛋白，而又不造成对机体的损害。亲和吸附治疗是血液净化的一种重要方法，其原理是将某一个配体固定在一个稳定无热源的载体上构建成亲和吸附柱，通过体外循环的方式特异性地清除患者血液中的致病因子，净化血液，打破免疫平衡，改善体内微环境，使得免疫系统处于优势，从而达到辅助治疗疾病的目的。目前临床上应用血液净化能够通过特异性地清除机体的自身抗体，治疗自身免疫性疾病、器官移植排斥反应，还有报道通过吸附低密度脂蛋白治疗高胆固醇血症等。此外，利用人源抗体吸附血液中乙肝颗粒的吸附柱也已有报道。新近的研究表明，钠离子牛磺胆酸共转运多肽是乙型肝炎病毒的功能性受体。利用这种多肽对乙肝毒蛋白进行吸附，能够利用血液净化疗法直接从血液中去除致病因子，在治疗过程中不丢失血浆有效成分，不引入异体血浆，从而具有避免交叉感染、无过敏性反应等优点，而且治疗效果明显，一个疗程便能极大改善体内血液微环境，因而具有良好的临床应用前景。
李湛勇和高庆伟等人分别发明了不同的乙型肝炎病毒免疫吸附柱。它们均是利用免疫结合反应对乙肝病毒颗粒进行吸附，但是它们的吸附材料都是以抗体材料作为基础，存在三个不足：1）有引发过敏性反应的生物安全性危险，从而产品的性能不稳定；2）抗体的生产极为繁琐复杂，制备过程步骤较多，因此得到的吸附材料产品批间差异大；3）单纯以抗体作为结合基础无法应对具有“免疫逃逸”性能的乙肝病毒颗粒。然而，用钠离子牛磺胆酸共转运多肽作为吸附基础的净化材料能够极大改善以上三点：1）此人造多肽与人体的天然多肽组成结构和空间构象完全一致，无免疫原性；2）制备简单，生产工艺过程短，能有效质控；3）无“免疫逃逸”效应，适效范围广，应用前景大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种无免疫原性，吸附效率高并且安全稳定性良好的乙型肝炎毒蛋白吸附材料。
本发明所要解决的另一个问题是提供上述乙型肝炎抗原蛋白吸附材料的制备方法，该方法路线较短、操作简便。
本发明所提供的乙型肝炎抗原蛋白的吸附材料，是琼脂糖凝胶与带标签的人源钠离子牛磺胆酸共转运多肽偶联的高分子材料，具有如下的化学结构：
其中：
琼脂糖凝胶是含有丰富羟基的天然多糖，它可参与不同类型的化学反应使其成为活性基团，能够在活化剂的作用下与多肽标签的羧基端反应。本发明的基本构想是：首先，通过链接标签的方式优化钠离子牛磺胆酸共转运多肽的纯化步骤；然后，利用融合的标签作为延伸的“俘获手臂”使活性配基能够在血浆中充分舒展，增加钠离子牛磺胆酸共转运多肽与乙肝毒蛋白的结合效率；随后，选用化学共价偶联剂作为活化琼脂糖的试剂，将多肽标签的氨基端固定在球珠上，而使得融合蛋白的羧基端，即钠离子牛磺胆酸共转运多肽部分伸展在球珠表面；最终，使得TagNTCP以共价键的方式固定在琼脂糖凝胶上。
上述TagNTCP的制备方法是以公开数据库中人源钠离子牛磺胆酸共转运多肽的氨基酸序列作为基础，以公开的编码序列作为参考，利用密码子偏好性对其进行优化改良，从而得到能准确编码与原NTCP多肽一级结构完全一致的原核表达序列；利用无酶克隆新技术——“一步法”将此序列插入含有多肽标签的原核表达载体菌株中，通过细菌培养的方式大量获得融合了多肽标签的人源钠离子牛磺胆酸共转运多肽；采用与多肽标签特异性结合的亲和层析柱对这个融合蛋白进行分离纯化，然后进行蛋白质复性；随后，将琼脂糖凝胶与偶联试剂反应形成活化琼脂糖凝胶；最后与纯化好的融合蛋白的氨基偶联，形成具有对乙肝毒蛋白有吸附活性的血液净化新材料，具体过程是：
1)人源钠离子牛磺胆酸共转运多肽为349aa，剪切之前mRNA长度为1631nt，去除内含子后编码序列为1047nt，优化前ATCG个数分别为229、273、303、242，优化后ATCG个数分别为217、292、279、259；
2)将步骤1）中优化后的编码序列利用无缝克隆技术插入包含多肽标签的表达载体质粒；
3)把步骤2）中获得的阳性克隆转化入原核表达菌株；
4)把步骤3）中获得的阳性菌株扩增培养；
5)在步骤4）获得的大量菌株中提取目标蛋白；
6)利用与融合标签匹配的纯化树脂在合适缓冲环境下对步骤5）中提取的融合蛋白进行纯化与回收；
7)选取化学偶联剂将步骤6）中获得的融合蛋白偶联到琼脂糖球珠上；
8)步骤7）反应获得产物进行活性端封闭反应。
具体的偶联试剂可以是固定多肽氨基端的任何化学试剂：例如溴化氰、双缩水甘油醚类、羰基二咪唑或者环氧氯丙烷等。
钠离子牛磺胆酸共转运多肽是一个跨膜蛋白，通过接合血液中乙肝毒蛋白介导乙肝病毒对于肝细胞的感染，所以自然伸展的转运多肽对于乙肝毒蛋白具有极强的结合与捕捉能力。为了确保转运多肽保持其对于毒蛋白的吸附能力，需要保证与琼脂糖凝胶键合后，其空间立体结构不变型，同时大分子乙肝毒蛋白及其复合物与转运多肽的接触也需要有足够的空间，从而钠离子牛磺胆酸共转运多肽吸附材料的微环境对其吸附能力影响很大。钠离子牛磺胆酸共转运多肽只有充分裸露在琼脂糖凝胶载体外面，被吸附的毒蛋白及其复合物才能尽可能无空间障碍地与其接触，充分发挥转运多肽的吸附能力。如果在材料表面与NTCP之间有一定长度的间隔臂，使其与材料表面保持一定的距离，将保证其空间结构不变，同时乙肝毒蛋白不受空间障碍地与NTCP尽可能接触，提高材料表面上NTCP的吸附效率。本发明利用多肽标签作为间隔臂，这些标签一方面可以作为纯化蛋白的工具，另一方面可以作为吸附材料中的间隔臂，将NTCP固定在琼脂糖凝胶上后使其能够充分暴露在材料表面，这样制得的材料吸附效率高，极大的降低生产成本的同时简化了生产工艺。
由于空间位阻的存在，大分子NTCP与琼脂糖活性表面结合后，将还有一些未反应完活性基团，它们是产生非特异性吸附的潜在因素，必须使其失活或惰性化。本发明采用甘氨酸或乙醇胺其中的一种作为封闭试剂，对步骤7）反应获得产物进行活性端封闭反应，除去未反应的活性基团。
本发明还提供了所述的吸附材料在血液净化中的应用。
基于以上叙述，本发明的显著优势和有益效果是：
1.随着研究的深入，钠离子牛磺胆酸共转运多肽已被确定为人体中乙肝病毒感染受体，它能够在肝细胞表面识别、结合及转运乙肝病毒进入细胞膜。这种特性使得它成为了结合乙肝毒蛋白的优良配基。此外，由于这些序列来自于人类基因组，所以异源排斥的可能性较低，极大降低了免疫排斥风险。
2.常见的多肽标签有很多种，例如：GTS、His及Myc等，虽然它们的一级结构不同，但都有一定的长度，这样就在琼脂糖凝胶载体表面与NTCP之间引入了间隔臂，为NTCP与乙肝毒蛋白的结合提供了足够的空间。与此同时，融合了这些多肽标签的蛋白容易通过对应的纯化吸附柱产品进行分离与纯化，操作简单，容易控制。
3.选用细菌表达体系生产对乙肝毒蛋白有特异结合能力的融合蛋白，克服了传统抗体生产工艺复杂，效价难以控制，成本高，不稳定等不足，使得合成更加简便和安全。
4.本发明已经对来自人体基因组的NTCP编码基因进行了基因改造，针对原核表达载体的密码子偏好性进行了优化，使得获得的融合蛋白种的NTCP部分的一级结构与人体中存在的蛋白完全一致，并能够通过细菌载体高量表达。
5.与琼脂糖凝胶结合以后，融合蛋白能够在血浆中恢复自然的伸展状态，具有极强的吸附能力。能够在短时间内，使得血浆中的乙肝毒蛋白浓度与总量出现明显降低，是血液治疗的良好手段。
附图说明
图1实施例三中更新吸附材料，连续吸附纯化抗原。
具体实施方式
以下通过实施例详述本发明。应理解的是，本发明的实施例用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质而进行的改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例一：人源重组受体蛋白的表达与纯化
a)从GenBank下载数据NM_003049，从中获取NTCP多肽的编码序列；
b)对所得编码序列进行基因改良，从而获得对应的原核表达序列，序列如下所示：
5’atggaagcacacaacgcgtctgcccctttcaacttcactctgccaccgaactttggcaaacgtccaacggacctggcactgtctgtaatcctggtattcatgctgttcttcattatgctgtctctgggttgcactatggagttctccaaaatcaaagcacatctgtggaaaccgaagggtctggcgattgcgctggtagcacagtatggcatcatgccactgactgctttcgttctgggtaaagtattccgtctgaaaaacattgaagcactggcgatcctggtatgtggttgctctccgggcggtaacctgtccaacgtgttctctctggccatgaaaggcgacatgaatctgagcatcgttatgactacttgcagcaccttttgcgctctgggcatgatgccgctgctgctgtacatctattctcgcggcatctacgatggtgatctgaaagacaaggttccgtataaaggtatcgtgatctccctggttctggtgctgatcccgtgcaccatcggtatcgttctgaagagcaaacgtccgcaatacatgcgctacgttattaaaggcggcatgatcattatcctgctgtgctctgtggcggtcaccgtcctgtctgccatcaacgtgggcaaaagcattatgttcgcgatgaccccgctgctgattgcgacctccagcctgatgccgttcatcggtttcctgctgggttacgtgctgtccgctctgttctgcctgaacggtcgctgtcgtcgtacggtttctatggaaaccggctgccagaacgtccagctgtgttccaccatcctgaatgttgcttttccgccggaagttattggcccgctgtttttctttccgctgctgtatatgatcttccagctgggcgaaggcctgctgctgatcgcaatcttctggtgttacgagaaatttaagaccccgaaagacaaaacgaaaatgatttacaccgcggctaccaccgaagaaactattccgggtgctctgggtaacggtacctacaaaggtgaagattgctctccttgtaccgct3’（SEQ ID NO：1）
c)利用无缝克隆在载体pGEX-6p-1质粒中的GST标签下游15号位点插入优化后的表达序列，并转化进入Origami2菌株中，筛选阳性克隆；
引物序列如下所示：
5’gggatccccggaattcatggaagcacacaacgcgtctg3’（SEQ ID NO：2）
5’tcgacccgggaattcagcggtacaaggagagcaatcttc3’（SEQ ID NO：3）
d)大量获得阳性克隆，随后提取细菌中的总蛋白；
e)利用Novagen公司商品化的GST－Bind纯化试剂盒对融合蛋白进行纯化。
没有活性的GST是不会与GST－Bind树脂结合的，只有正确折叠的功能性GST才能用于纯化。因此，GST－Tag融合的包涵体蛋白必须在纯化前进行重折叠。本案例采用Novagen的蛋白质重折叠试剂盒，快速有效的得到重折叠的GST。
10，000g离心5分钟收集细胞。倾去上清，尽量控干细胞沉淀，用40ml1×GST Bind/WashBuffer重悬细胞。
在盐冰浴中超声波处理样本1～3小时，在样本已经不再粘稠时停止。大的细胞块在1×GST Bind/Wash Buffer中用弗氏压榨法处理。将沉淀充分重悬并切割DNA。
5，000g离心15分钟收集包涵体和细胞碎片。
去上清，每100ml培养液以20ml1×GST Bind/Wash Buffer重悬沉淀。重复步骤3操作，若需要重复步骤1。
溶解洗涤后的包涵体，重折叠后用于谷光甘肽亲和纯化。
轻柔、充分翻转摇匀树脂悬浊液，用宽嘴吸头吸取所需体积的树脂浆，等待树脂沉淀。
当储存缓冲液液面降低到柱床上沿以下时，用5倍体积1×GST Bind/Wash Buffer洗树脂。
待GST Bind/Wash Buffer流到柱床上沿以下，加入制备好的蛋白抽提液。
以10倍体积1×GST Bind/Wash Buffer洗柱，收集穿过组分并置于冰上。
以3倍体积1×GST Bind/Wash Buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱组分。
实施例二：吸附材料的制备及受体蛋白的固定
利用乙二醇双缩水甘油醚作为偶联剂制备有环氧基活性的琼脂糖凝胶（SepharoseCL-4B）。
在2L的反应器中加入琼脂糖凝胶600ml，2mol／L的NaOH水溶液400ml，混匀，加入乙二醇双缩水甘油醚400ml后，置于恒温摇床中，在37℃反应1小时。结束反应，将凝胶过滤，用大量蒸馏水冲洗至pH＝7。将活化好的介质储存在4℃备用。用硫代硫酸纳法检测凝胶中的环氧基团数量，测得每毫升至少有40μmol的活性基团。
在2L的反应器中加入本例中合成的环氧活性琼脂糖凝胶（Sepharose CL-4B）200ml，0.3mol／L的硼酸缓冲液600ml，pH值控制在8.0～10.0范围内，加入3g融合蛋白，在37℃反应12小时，停止，回收未反应的融合蛋白，用0.5mol／L乙醇胺封闭未反应的活性基团，在室温反应10小时。用蒸馏水冲洗干净未反应组分，保存在0.2mol／L pH＝7.4的磷酸缓冲液中。用紫外法检测融合蛋白的键合量为5～5.5mg／ml。
实施例三：利用商品化乙型肝炎抗原作为吸附对象检测吸附材料的性能
将5ml例二中获得的吸附材料注入500ml三角烧瓶中，加入100ml乙肝抗原的PBS溶液。在恒温摇床中反应，37℃低速振荡90分钟，分别利用紫外法检测乙肝毒蛋白的浓度，取比值确定吸附效率。结果如表3-1所示
表3-1摇床条件下吸附材料对纯化抗原的吸附效率
将5ml例二中获得的吸附材料注入层析柱的滤膜上，用软管连通。用洁净的三角瓶回收滤过的乙肝抗原溶液。将滤过的溶液重新注入层析柱，重复“吸附－洗脱－吸附”反应50回合，分别利用紫外法检测乙肝毒蛋白的浓度，取比值确定吸附效率。
结果如表3-2所示
表3-2灌流条件下吸附材料对纯化抗原的吸附效率
将5ml例二中获得的吸附材料注入层析柱的滤膜上，用软管连通。将乙肝抗原初始浓度配置为1000ng／ml，合计100ml滤过吸附柱。用洁净的三角瓶回收滤过的乙肝抗原溶液。将滤过的溶液重新注入层析柱，重复“吸附－洗脱－吸附”反应50回合，分别利用紫外法检测乙肝毒蛋白的浓度，取比值确定吸附效率。随后，更换新吸附材料5ml，直到将滤过的过程重复50回合。更换吸附材料8次，模拟一次临床的血液吸附疗程，结果如图1所示。
实施例四：利用天然血浆中的乙肝毒蛋白检测吸附材料的性能
将25ml例二中获得的吸附材料置于2L反应器中，混入500ml天然阳性血浆。在恒温摇床中反应，37℃低速振荡90分钟，分别利用紫外法检测乙肝毒蛋白的浓度，取比值确定吸附效率。
结果如表4-1所示：
表4－1摇床条件下吸附材料对天然血浆的吸附效率
将25ml例二中获得的吸附材料置于80ml吸附柱模型中，用临床标准软管连通，并将入口管与蠕动泵连接，设置蠕动泵100ml／min流速，将500ml天然阳性血浆通过连通体系进行血液灌流模拟试验，室温运行90分钟，分别用紫外法检测乙肝毒蛋白的浓度，取比值确定吸附效率。
结果如表4-2所示：
表4－2灌流条件下吸附材料对天然血浆的吸附效率
实施例五：
吸附材料的动物试验
将例二中合成的融合蛋白吸附材料15ml，其中融合蛋白的键合量为80mg，放入烧杯中用生理盐水浸泡90分钟，再装于80ml柱中，用生理盐水充分冲洗柱子。亦动物兔为试验对象，将兔麻醉后，从兔的股动脉以20ml／min的速度泵出血液，经过血液分离器将血细胞与血浆分开，以15ml／min的速度将血浆灌入吸附柱中，灌流后再与血细胞混合一同注入兔的股静脉中。在实验过程中及实验后的24小时内，实验动物兔的一切生理指标正常。实验结果表明，本吸附柱不会造成动物的过敏性反应。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉真福医药科技发展有限公司
<120> 一种乙型肝炎抗原蛋白吸附材料及其制备方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggaagcac acaacgcgtc tgcccctttc aacttcactc tgccaccgaa ctttggcaaa 60
cgtccaacgg acctggcact gtctgtaatc ctggtattca tgctgttctt cattatgctg 120
tctctgggtt gcactatgga gttctccaaa atcaaagcac atctgtggaa accgaagggt 180
ctggcgattg cgctggtagc acagtatggc atcatgccac tgactgcttt cgttctgggt 240
aaagtattcc gtctgaaaaa cattgaagca ctggcgatcc tggtatgtgg ttgctctccg 300
ggcggtaacc tgtccaacgt gttctctctg gccatgaaag gcgacatgaa tctgagcatc 360
gttatgacta cttgcagcac cttttgcgct ctgggcatga tgccgctgct gctgtacatc 420
tattctcgcg gcatctacga tggtgatctg aaagacaagg ttccgtataa aggtatcgtg 480
atctccctgg ttctggtgct gatcccgtgc accatcggta tcgttctgaa gagcaaacgt 540
ccgcaataca tgcgctacgt tattaaaggc ggcatgatca ttatcctgct gtgctctgtg 600
gcggtcaccg tcctgtctgc catcaacgtg ggcaaaagca ttatgttcgc gatgaccccg 660
ctgctgattg cgacctccag cctgatgccg ttcatcggtt tcctgctggg ttacgtgctg 720
tccgctctgt tctgcctgaa cggtcgctgt cgtcgtacgg tttctatgga aaccggctgc 780
cagaacgtcc agctgtgttc caccatcctg aatgttgctt ttccgccgga agttattggc 840
ccgctgtttt tctttccgct gctgtatatg atcttccagc tgggcgaagg cctgctgctg 900
atcgcaatct tctggtgtta cgagaaattt aagaccccga aagacaaaac gaaaatgatt 960
tacaccgcgg ctaccaccga agaaactatt ccgggtgctc tgggtaacgg tacctacaaa 1020
ggtgaagatt gctctccttg taccgct 1047
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gggatccccg gaattcatgg aagcacacaa cgcgtctg 38
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcgacccggg aattcagcgg tacaaggaga gcaatcttc 39
Claims (6)
1.一种乙型肝炎抗原蛋白的吸附材料，其特征在于，是琼脂糖凝胶与带标签的人源钠离子牛磺胆酸共转运多肽偶联的高分子材料，具有如下的化学结构：
其中：
2.根据权利要求1所述的吸附材料，其特征在于，所述标签多肽为组氨酸标签或谷胱甘肽标签。
3.权利要求1或2所述吸附材料在在血液净化中的应用。
4.权利要求1或2所述的乙型肝炎抗原蛋白的吸附材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)人源钠离子牛磺胆酸共转运多肽为349aa，剪切之前mRNA长度为1631nt，去除内含子后编码序列为1047nt，优化前ATCG个数分别为229、273、303、242，优化后ATCG个数分别为217、292、279、259；
2)将步骤1）中优化后的编码序列利用无缝克隆技术插入包含多肽标签的表达载体质粒；
3)把步骤2）中获得的阳性克隆转化入原核表达菌株；
4)把步骤3）中获得的阳性菌株扩增培养；
5)在步骤4）获得的大量菌株中提取目标蛋白；
6)利用与融合标签匹配的纯化树脂在合适缓冲环境下对步骤5）中提取的融合蛋白进行纯化与回收；
7)选取化学偶联剂将步骤6）中获得的融合蛋白偶联到琼脂糖球珠上；
8)步骤7）反应获得产物进行活性端封闭反应。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的偶联试剂是溴化氰、双缩水甘油醚类、羰基二咪唑或者环氧氯丙烷。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，采用甘氨酸或乙醇胺其中的一种作为封闭试剂，对步骤7）反应获得产物进行活性端封闭反应。
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