DE4240386A1 - High purity, highly immunogenic hepatitis B vaccine - uses antigen isolated from human serum by affinity chromatography, induces antibodies in all subjects immunised - Google Patents
High purity, highly immunogenic hepatitis B vaccine - uses antigen isolated from human serum by affinity chromatography, induces antibodies in all subjects immunisedInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft einen hochreinen und hoch immuno genen Hepatitis B-Impfstoff sowie ein Verfahren und ein Immunadsorbens zu seiner Herstellung. Der erfindungsgemäße hochreine Hepatitis B-Impfstoff führt zu einer 100-%igen Bildung von anti-Hepatitis B-Antikörpern und stellt somit den ersten absolut vollwirksamen Hepatitis B-Impfstoff dar.The invention relates to a highly pure and highly immuno gene hepatitis B vaccine and a method and Immunoadsorbent for its manufacture. The invention high purity hepatitis B vaccine leads to a 100% Formation of anti-hepatitis B antibodies and thus represents the first absolutely effective hepatitis B vaccine represents.
Es ist bereits ein Hepatitis B-Impfstoff bekannt, der in den USA, in Frankreich, in Japan sowie in anderen Ländern auf dem Markt ist und auf einem gentechnisch erzeugten Hepatitis B-Antigen beruht, das auf der Basis von Pre-S2- codiertem Antigen hergestellt ist. Dieser herkömmliche Impfstoff führt selbst nach dreimal wiederholter Impfung nicht zu einer 100-%igen Antikörperbildung gegen Hepatitis B-Antigen.A hepatitis B vaccine is already known to be used in the United States, France, Japan, and other countries is on the market and on a genetically engineered one Hepatitis B antigen based on pre-S2 encoded antigen. This conventional one Vaccine performs even after repeated vaccination three times not 100% antibody formation against hepatitis B antigen.
Im Rahmen der Erfindung wurde erstmals und in überraschen der Weise festgestellt, daß es möglich ist, ein Hepatitis B-Vakzin mit gegenüber dem Stand der Technik höherer Immunogenität in großen Mengen technisch herzustellen, das zu einer 100-%igen Bildung von anti-Hepatits B-Antikörpern führt, und zwar bereits nach zweimaliger Impfung, wobei das Hepatitis B-Vakzin erfindungsgemäß durch Affinitäts chromatographie aus einem Ausgangsmaterial hergestellt wird, das Hepatitis B-Antigen (HB-Antigen) enthält, das Pre-S2-Protein mit Humanserumalbumin-Bindungsaktivität (HSA-BA) enthält.In the context of the invention was surprising for the first time found the way that it is possible to get hepatitis B vaccine with higher compared to the prior art Technically producing immunogenicity in large quantities to a 100% formation of anti-Hepatits B antibodies leads after just two vaccinations, whereby the hepatitis B vaccine according to the invention by affinity chromatography made from a starting material that contains hepatitis B antigen (HB antigen) that Pre-S2 protein with human serum albumin binding activity (HSA-BA) contains.
Aufgrund dieser überraschenden Feststellung konnte folg lich erstmals das sog. Non-Responder-Problem, d. h. das Problem des Nichtansprechens auf die Impfung, vollständig gelöst werden, das andererseits auf dem Gebiet der Vor beugung der Hepatitis B durch Impfung das gravierendste Problem darstellt, das durch High-Tech-Rekombinant- Hepatitis B-Vakzine bisher nicht gelöst werden konnte.Because of this surprising finding, Lich for the first time the so-called non-responder problem, d. H. the Problem of non-response to vaccination, complete to be solved, on the other hand, in the field of pre diffraction of hepatitis B by vaccination the most serious Represents problem caused by high-tech recombinant Hepatitis B vaccine has not yet been resolved.
Der Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, einen hochreinen und hoch immunogenen Hepatitis B-Impf stoff, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie dafür geeignete Immunadsorbentien anzugeben.The invention is accordingly based on the object a high-purity and highly immunogenic hepatitis B vaccine substance, a process for its production and for it specify suitable immunoadsorbents.
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Die Unteransprüche betreffen vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindungs konzeption.The task is solved according to the requirements. The subclaims relate to advantageous embodiments of the invention conception.
Nachstehend werden folgende Abkürzungen verwendet:The following abbreviations are used:
HB = Hepatitis B;
HB-Antigen = Hepatitis B-Antigen;
anti-HBs = anti-Hepatitis B-Antikörper,
anti-HB-Antikörper.HB = hepatitis B;
HB antigen = hepatitis B antigen;
anti-HBs = anti-hepatitis B antibody, anti-HB antibody.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines hoch reinen und hoch immunogenen HB-Impfstoffs beruht wesent lich auf der Affinitätschromatographie einer Human- HB-Antigen enthaltenden Lösung und ist gekennzeichnet durch folgende wesentlichen Schritte:The inventive method for producing a high pure and highly immunogenic HB vaccine is essential on the affinity chromatography of a human HB containing antigen solution and is labeled through the following essential steps:
-
A) Affinitätschromatographie von Human-Serum oder
Human-Post-partum-Placentaserum, das Pre-S2-Protein
mit Humanserumalbumin-Bindungsaktivität (HSA-BA) ent
hält,
an einem Chromatographiegel, das immobilisierte, hoch immunogene anti-HB-Antikörper aufweist,
unter Gewinnung einer gereinigten HB-Antigenlösung mit Gehalt an Pre-S2-Protein undA) Affinity chromatography of human serum or human post-partum placentaserum which contains pre-S2 protein with human serum albumin binding activity (HSA-BA),
on a chromatographic gel which has immobilized, highly immunogenic anti-HB antibodies,
to obtain a purified HB antigen solution containing pre-S2 protein and - B) Abtrennung von unerwünschten Proteinen durch Dialyse mit Salzlösung und anschließend mit Wasser, vorzugs weise durch kontinuierliche Dialyse.B) Separation of unwanted proteins by dialysis with saline and then with water, preferably wise through continuous dialysis.
Die auf dem Trägergel immobilisierten anti-HB-Antikörper (anti-HBs) sind vorzugsweise Ziegen-anti-HB-Antikörper. Das Trägergel des eingesetzten Chromatographiegels ist ferner bevorzugt ein Agarosegel (Sepharose, Pharmacia).The anti-HB antibodies immobilized on the carrier gel (anti-HBs) are preferably goat anti-HB antibodies. The carrier gel of the chromatography gel used is further preferably an agarose gel (Sepharose, Pharmacia).
Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden darin enthaltene HBV durch Wärmebehand lung bei 98 bis 100°C inaktiviert, vorzugsweise während einer Dauer von mindestens etwa 30 min. According to a preferred development of the invention HBV process contained therein by heat treatment inactivated at 98 to 100 ° C, preferably during a duration of at least about 30 minutes.
Dem Impfstoff werden vorteilhaft nach Schritt B und vor Schritt C Proteinstabilisierungsmittel zugesetzt, vorteil haft in einer Konzentration von 0,002-0,01 Masse-%, be zogen auf die Gesamtmasse des Impfstoffs.The vaccine will be beneficial after step B and before Step C added protein stabilizer, advantageous adheres in a concentration of 0.002-0.01 mass%, be drew on the total mass of the vaccine.
Geeignete derartige Proteinstabilisierungsmittel sind Polyoxyethylenderivate von Sorbitanestern (Polysorbate), und vorzugsweise Polyethoxysorbitanlaurat (Tween 20, Tween 21), Polyethoxysorbitanplamitat (Tween 40), Poly ethoxysorbitanstearat (Tween 60, Tween 61), Polyethoxy sorbitantristearat (Tween 65), Polyethoxysorbitanoleat (Tween 80, Tween 81) und/oder Polyethoxysorbitantrioleat (Tween 85).Suitable protein stabilizers of this type are Polyoxyethylene derivatives of sorbitan esters (polysorbates), and preferably polyethoxysorbitan laurate (Tween 20, Tween 21), polyethoxysorbitan plasticity (Tween 40), poly ethoxysorbitan stearate (Tween 60, Tween 61), polyethoxy sorbitan tristearate (Tween 65), polyethoxysorbitan oleate (Tween 80, Tween 81) and / or polyethoxysorbitan trioleate (Tween 85).
Die Elution des gereinigten HB-Antigens in Schritt A er folgt vorteilhaft mit MgCl2-Lösung, die vorzugsweise eine Konzentration von 5 M (5 mol pro Liter) aufweist.The elution of the purified HB antigen in step A, it advantageously follows with MgCl 2 solution, which preferably has a concentration of 5 M (5 mol per liter).
Die auf dem Chromatographiegel immobilisierten anti-HB- Antikörper werden vorteilhaft durch Immundiffusion (ID) und gegebenenfalls anschließende Reinigung hergestellt, die bevorzugt mit Libanol-Ammoniumsulfat oder an DEAE- Cellulose erfolgen kann.The anti-HB- Antibodies are beneficial through immunodiffusion (ID) and optionally subsequent cleaning, which preferably with libanol ammonium sulfate or on DEAE Cellulose can be made.
Zur Herstellung des Chromatographiegels werden vorteilhaft anti-HBs mit einem Titer von 1 : 4000 (ID) verwendet.To produce the chromatography crucible are advantageous anti-HBs with a titer of 1: 4000 (ID) were used.
Die Gesamtaktivität der an 100 ml Trägergel zu sorbieren den bzw. zu bindenden anti-HBs beträgt im Rahmen der Er findung vorzugsweise 8000 bis 10 000 Einheiten (ID).The total activity of sorbing on 100 ml carrier gel the anti-HBs to be bound is within the Er invention preferably 8000 to 10,000 units (ID).
Als Ausgangsmaterial wird in Schritt A erfindungsgemäß Serum bzw. Post-partum-Placentaserum eingesetzt, das gün stigerweise einen HB-Antigen-Titer von 1000 (RPHA), einen Pre-S2-Antigen-Titer von 500 (RPHA) und einen HSA-BA-Titer von < 60 (PHA) aufweist.In step A, the starting material according to the invention Serum or post-partum placentaserum used, the gün usually has an HB antigen titer of 1000 (RPHA), a pre-S2 antigen titer of 500 (RPHA) and one HSA-BA titer of <60 (PHA).
Die weitere Reinigung des Impfstoffs durch Dialyse in Schritt B erfolgt bevorzugt mit einer 0,85- bis 1,0%igen Salzlösung, vorzugsweise NaCl-Lösung, bevorzugt während 2 bis 4 d, und anschließend mit entionisiertem Wasser, be vorzugt während 1 bis 2 d.Further purification of the vaccine by dialysis in Step B is preferably carried out with a 0.85 to 1.0% Saline solution, preferably NaCl solution, preferably during 2 to 4 d, and then with deionized water, be preferred for 1 to 2 d.
Die Immobilisierung der anti-HB-Antikörper auf dem Träger gel, das bevorzugt Agarose darstellt, wird nach einer be vorzugten Ausführungsform der Erfindung nach dem CNBr-Ver fahren vorgenommen.Immobilization of anti-HB antibodies on the support Gel, which is preferably agarose, is after a be preferred embodiment of the invention according to the CNBr-Ver drive made.
Die erfindungsgemäßen hochgereinigten und hoch immunogenen Hepatitis B-Impfstoffe, mit denen eine 100-%ige Erzeugung von anti-Hepatitis B-Antikörpern möglich ist, sind nach einer günstigen Ausführungsform gekennzeichnet durch einen HB-Antigen-Titer von 1 : 2000 (RPHA), einen Pre-S2-Anti gen-Titer von 1 : 500 (RPHA) und einen HSA-BA-Titer von 1 : 100 (PHA).The highly purified and highly immunogenic according to the invention Hepatitis B vaccines that are 100% production of anti-hepatitis B antibodies is possible after a favorable embodiment characterized by a HB antigen titer of 1: 2000 (RPHA), a pre-S2 anti gene titer of 1: 500 (RPHA) and an HSA-BA titer of 1: 100 (PHA).
Der Gesamt-Proteingehalt beträgt nach einer günstigen Aus führungsform 0,006 Masse-% (60 µg/ml).The total protein content is after a favorable Aus leadership form 0.006% by mass (60 µg / ml).
Die erfindungsgemäßen Hepatitis B-Impfstoffe sind nach dem oben definierten Grundverfahren und ggfs. gemäß den erläu terten vorteilhaften Ausführungsformen erhältlich.The hepatitis B vaccines according to the invention are after Basic procedure defined above and, if necessary, according to the explanat ter advantageous embodiments available.
Die Erfindung erstreckt sich ferner auch auf die zur Her stellung des beanspruchten Hepatitis B-Impfstoffs verwend baren Immunadsorbentien zur affinitätschromatographischen Reinigung des Ausgangsmaterials; sie sind gekennzeichnet durch ein Trägergel, auf dem hoch immunogene anti-HB-Anti körper immobilisiert sind, die besonders vorteilhaft Ziegen-anti-HB-Antikörper sind. Das Trägergel ist dabei bevorzugt ein Agarosegel (Sepharosegel).The invention also extends to the forth position of the claimed hepatitis B vaccine available immunoadsorbents for affinity chromatography Cleaning of the raw material; they are marked through a carrier gel on which highly immunogenic anti-HB-Anti body immobilized, which are particularly advantageous Goat anti-HB antibodies are. The carrier gel is there preferably an agarose gel (Sepharose gel).
Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden hoch immunogene Ziegen-anti-HBs mit einem Titer von mehr als 1 : 4000 bzw. mehr als 1 : 4096 durch Immundiffusion (ID) hergestellt, die dann an einem mit CNBr stark aktivierten Agarosegel als Trägergel adsorbiert bzw. gebunden werden, das dann als Chromatographiegel dient.According to one embodiment, highly immunogenic Goat anti-HBs with a titer of more than 1: 4000 or more than 1: 4096 manufactured by immunodiffusion (ID), the then on an agarose gel strongly activated with CNBr as Carrier gel are adsorbed or bound, which then as Chromatography bar serves.
Die Konzentration des CNBr liegt dabei vorteilhaft im Be reich von 50 bis 600 mg/ml und noch bevorzugter im Bereich von 150 bis 300 mg/ml, wobei die anti-HBs einer Aktivität von 8000 bis 10 000 Einheiten (ID) pro 100 ml des Agarose gels entsprechen. Die Sorptionsdauer bzw. Bindungsdauer beträgt beispielsweise vorteilhaft 2 bis 5 h.The concentration of the CNBr is advantageously in the Be range from 50 to 600 mg / ml and more preferably in the range from 150 to 300 mg / ml, the anti-HBs having an activity from 8000 to 10,000 units (ID) per 100 ml of agarose correspond to gels. The sorption time or binding time is advantageously 2 to 5 hours, for example.
Proteinsubstanzen wie z. B. unvollständig mit dem Trägergel konjugierte bzw. daran unvollständig gebundene anti-HBs werden mit 5 M MgCl2-Lösung ausgewaschen.Protein substances such as B. incompletely conjugated or incompletely bound to the carrier gel anti-HBs are washed out with 5 M MgCl 2 solution.
Als Ausgangsmaterial wird an HB-Antigen positives Serum (Titer mehr als 1 : 1000 bzw. 1 : 1024 (RPHA)) verwendet, das Pre-S2-Antigen (Titer mehr als 1 : 500 bzw. mehr als 1 : 512 (RPHA)) mit Humanserum-Albumin-Bindungsaktivität (HSA-BA) enthält, die einem Titer von mehr als 1 : 60 bzw. mehr als 1 : 64 (PHA) entspricht. Dieses Ausgangsmaterial wird aus Humanserum bzw. Human-Post-partum-Placentaserum gewonnen und der anschließenden affinitätschromatographischen Rei nigung unterzogen. The starting material is positive serum on HB antigen (Titer more than 1: 1000 or 1: 1024 (RPHA)) used that Pre-S2 antigen (titer more than 1: 500 or more than 1: 512 (RPHA)) with human serum albumin binding activity (HSA-BA) contains a titer of more than 1:60 or more than 1:64 (PHA) corresponds. This raw material is made from Human serum or human post-partum placentaserum obtained and the subsequent affinity chromatography series subjected to cleaning.
Die in Schritt A gereinigte Probe wird dann in Schritt B mit Salzlösung und anschließend mit entionisiertem Wasser durch Dialyse gereinigt, wobei besonders günstig bei etwa 4°C während einer Dialysedauer von 2 d verfahren wird. Anschließend ist das Präparat praktisch frei von den hoch immunogenen anti-HBs, Ziegen-Ig G, etc., die im Produkt nur noch in irrelevanten Spurenmengen vorliegen.The sample cleaned in step A is then in step B with saline and then with deionized water cleaned by dialysis, being particularly cheap at about 4 ° C during a dialysis period of 2 d. Then the preparation is practically free of the high immunogenic anti-HBs, goat Ig G, etc., in the product only in irrelevant trace amounts.
Zur vollständigen Inaktivierung von in den Präparationen vorliegenden HBV werden die Präparate einer Hitzebehand lung bei 98 bis 100°C unterzogen, die mindestens 30 min dauert. Vorteilhafterweise werden die Proben vor der Wär mebehandlung mit einem Proteinstabilisierungsmittel ver setzt, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,002 bis 0,01 Volum-%.For the complete inactivation of in the preparations HBV is the preparation for a heat treatment treatment at 98 to 100 ° C, the at least 30 min lasts. The samples are advantageously pre-heated treatment with a protein stabilizer ver sets, preferably in a concentration of 0.002 to 0.01% by volume.
Erfindungsgemäß geeignete Proteinstabilisierungsmittel sind Polyoxyethylenderivate von Sorbitanestern (Poly sorbate), worunter folgende besonders günstig geeignete Produkte gehören: Polyethoxysorbitanlaurat (Tween 20, Tween 21), Polyethoxysorbitanplamitat (Tween 40), Poly ethoxysorbitanstearat (Tween 60, Tween 61), Polyethoxy sorbitantristearat (Tween 65), Polyethoxysorbitanoleat (Tween 80, Tween 81) und/oder Polyethoxysorbitantrioleat (Tween 85).Protein stabilizing agents suitable according to the invention are polyoxyethylene derivatives of sorbitan esters (poly sorbate), among which the following are particularly suitable Products include: polyethoxysorbitan laurate (Tween 20, Tween 21), polyethoxysorbitan plasticity (Tween 40), poly ethoxysorbitan stearate (Tween 60, Tween 61), polyethoxy sorbitan tristearate (Tween 65), polyethoxysorbitan oleate (Tween 80, Tween 81) and / or polyethoxysorbitan trioleate (Tween 85).
Im Anschluß an die HBV-Inaktivierung werden die Präparate vorzugsweise mit 1 : 2000 verdünnter Formalinlösung und 1 : 10 000 verdünntem Merciolat versetzt, wonach sich eine weitere Inaktivierung bei 37°C anschließt, die etwa 96 h lang durchgeführt wird.Following HBV inactivation, the preparations preferably with 1: 2000 diluted formalin solution and 1: 10,000 diluted merciolate, after which a further inactivation at 37 ° C, which is about Is carried out for 96 hours.
Das erhaltene Präparat wird anschließend sterilfiltriert, z. B. durch eine 0,45-µm-Filmmembran, und anschließend vollständig an Aluminiumhydroxidgel adsorbiert, wonach ein besonders hoch immunogenes HB-Vakzin resultiert.The preparation obtained is then sterile filtered, e.g. B. through a 0.45-µm film membrane, and then completely adsorbed on aluminum hydroxide gel, after which a particularly high immunogenic HB vaccine results.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbei spielen näher erläutert, die lediglich erläuternd, aber nicht einschränkend sind.The invention is described below with reference to exemplary embodiments play explained in more detail, but only illustrative are not restrictive.
Hoch wechselwirkungsfähige Ziegen-anti-HBs mit einem Titer von mehr als 1 : 4096 (ID) wurden mit Libanol-Ammoniumsulfat in bekannter Weise gereinigt, worauf sich eine weitere Reinigung durch Gelfiltration mit Sepharose 6 B (Pharmacia, Schweden) anschloß. 100 ml Sepharose 4 B (Pharmacia, Schweden) wurden dann zur Aktivierung mit CNBr in einer Konzentration von 300 mg/ml versetzt, worauf die hoch aktiven anti-HBs mit einem Titer von 8000 (ID) zuge setzt wurden. Die Sorption bzw. Bindung wurde während einer Reaktionsdauer von 2 bis 5 h unter Rühren bei Raum temperatur durchgeführt, wonach das Produkt zweimal mit 5 M MgCl2-Lösung gewaschen wurde.Highly interactive goat anti-HBs with a titer of more than 1: 4096 (ID) were purified in a known manner with libanol ammonium sulfate, which was followed by further purification by gel filtration with Sepharose 6 B (Pharmacia, Sweden). 100 ml of Sepharose 4 B (Pharmacia, Sweden) were then mixed with CNBr in a concentration of 300 mg / ml for activation, whereupon the highly active anti-HBs with a titer of 8000 (ID) were added. The sorption or binding was carried out for 2 to 5 hours with stirring at room temperature, after which the product was washed twice with 5 M MgCl 2 solution.
Anschließend wurden 1500 ml Humanserum mit einem Titer von 1 : 512 (PHA) an HSA-BA, einem Titer von 1 : 512 (RPHA) an Pre-S2 und einem Titer an HBS-Antigen von 1 : 2048 (RPHA) auf der mit immobilisierten anti-HBs konjugierten Chroma tographiesäule bei Raumtemperatur während einer Reaktions dauer von 5 h adsorbiert, wonach mit 5 M MgCl2-Lösung eluiert wurde. Bei der Elution wurde eine Fraktion von 120 ml HBS-Antigenlösung erhalten, die Pre-S2-Protein mit einem Titer von 1 : 16 384 (RPHA) enthielt. Then 1500 ml of human serum with a titer of 1: 512 (PHA) on HSA-BA, a titer of 1: 512 (RPHA) on Pre-S2 and a titer of HBS antigen of 1: 2048 (RPHA) on the with immobilized anti-HBs-conjugated chromatography column adsorbed at room temperature for a reaction time of 5 h, after which it was eluted with 5 M MgCl 2 solution. A fraction of 120 ml of HBS antigen solution containing pre-S2 protein with a titer of 1:16 384 (RPHA) was obtained on elution.
Das erhaltene Präparat wurde dann gegen Salzlösung bzw. entionisiertes Wasser 2 d dialysiert und anschließend mit Salzlösung verdünnt, so daß der Titer (RPHA) 1 : 2048 be trug. Anschließend wurde Tween 80 in einer Menge zuge setzt, daß die Endkonzentration 0,02% betrug. Anschlie ßend wurde die Wärmebehandlung 30 min bei 98°C durchge führt.The preparation obtained was then against saline or DI water dialyzed 2 d and then with Dilute saline so that the titer (RPHA) 1: 2048 be wore. Then Tween 80 was added in an amount sets that the final concentration was 0.02%. Then The heat treatment was carried out at 98 ° C. for 30 minutes leads.
Die 30minütige Wärmebehandlung bei 98°C führte zu einer vollständigen Inaktivierung der HBV. Das Präparat wurde dann mit Formalinlösung (1 : 2000) und 0,01% Merciolat ver setzt, worauf eine zusätzliche Inaktivierung bei 37°C während 96 h vorgenommen wurde.The 30 minute heat treatment at 98 ° C resulted in one complete inactivation of HBV. The preparation was then ver with formalin solution (1: 2000) and 0.01% merciolate sets, whereupon an additional inactivation at 37 ° C. during 96 hours.
Das erhaltene Präparat wurde dann durch eine 0,45-µm-Film membran sterilfiltriert und dann vollständig an Aluminium hydroxidgel adsorbiert, wobei 450 ml eines hoch immunoge nen HB-Impfstoffs erhalten wurden.The preparation obtained was then passed through a 0.45 µm film membrane sterile filtered and then completely on aluminum adsorbed hydroxide gel, with 450 ml of a highly immunogenic HB vaccine were obtained.
200 ml Sepharose 4B wurden mit 150 mg/ml CNBr aktiviert und dann mit 12 000 Einheiten (ID) hochgereinigten anti-HBs versetzt, die an DEAE-Cellulose (DE 52, Whatman, England) gereinigt worden waren; dadurch wurde eine Säule zur Affi nitätschromatographie erhalten.200 ml of Sepharose 4B were activated with 150 mg / ml CNBr and then with 12,000 units (ID) of highly purified anti-HBs added to DEAE cellulose (DE 52, Whatman, England) had been cleaned; this made a pillar an affi Get Chromatography.
2000 ml Human-Post-partum-Placentaserum mit einem HB-Anti gen-Titer von 1 : 32 768 (RPHA), einem Pre-S2-Titer von 1 : 2048 (RPHA) und mit einem HSA-BA-Titer von 1 : 1024 (PHA) wurde mit der oben erhaltenen Säule affinitätschromato graphisch gereinigt, wobei 230 ml HB-Antigenlösung (Titer 1 : 65 536 (RPHA)) mit einem Gehalt an Pre-S2-Protein erhal ten wurden. Die erhaltene Probe wurde gegen Salzlösung sowie anschließend gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann mit Tween 20 versetzt, so daß die Endkonzentra tion 0,015 Masse-% erreichte, und darauf 40 min einer Wärmebehandlung bei 98°C unterzogen.2000 ml human post partum placentaserum with an HB anti gene titer of 1:32 768 (RPHA), a pre-S2 titer of 1: 2048 (RPHA) and with an HSA-BA titer of 1: 1024 (PHA) was affinity chromato with the column obtained above graphically cleaned, with 230 ml HB antigen solution (titer 1: 65 536 (RPHA)) containing Pre-S2 protein were. The sample obtained was against saline and then dialyzed against distilled water and then mixed with Tween 20 so that the final concentration tion reached 0.015 mass%, and then 40 min Subjected to heat treatment at 98 ° C.
Die Präparation wurde dann der oben beschriebenen zusätz lichen HBV-Inaktivierung unterzogen, sterilfiltriert und anschließend an Aluminiumhydroxidgel adsorbiert, wobei 1800 ml eines hoch immunogenen HB-Impfstoffs erhalten wurden.The preparation then became the addition described above HBV inactivation, sterile filtered and then adsorbed on aluminum hydroxide gel, wherein Received 1800 ml of a highly immunogenic HB vaccine were.
Die Daten der Analyse der Komponenten dieses erfindungs gemäßen Impfstoffs sowie seine Wirksamkeit zur Erzeugung von anti-HBs gehen aus den nachstehenden Tabellen hervor.The data of the analysis of the components of this invention vaccine and its effectiveness in production anti-HBs are shown in the tables below.
1. Daten der Analyse der Komponenten (gereinigte Probe, unmittelbar nach Adsorption am Aluminiumhydroxidgel)1. Data of the analysis of the components (cleaned sample, immediately after adsorption on aluminum hydroxide gel)
- 1) HB-Antigen-Titer < 1 : 2048 (RPHA).1) HB antigen titer <1: 2048 (RPHA).
- 2) Pre-S2-Protein-Titer < 1 : 512 (RPHA).2) Pre-S2 protein titer <1: 512 (RPHA).
- 3) HSA-BA-Titer < 1:128 (PHA).3) HSA-BA titer <1: 128 (PHA).
- 4) Gesamtproteingehalt < 0,006 Masse-% (60 µg/ml).4) Total protein content <0.006% by mass (60 µg / ml).
-
5) Ziegen-anti-HBs:
Durch RIA oder PHA nicht nachweisbar. Selbst wenn diese Antikörper in Spurenmengen vorlie gen, ist ihre Menge auf einen vernachlässigbaren Wert von 5.10-3 IU/ml begrenzt.5) Goat anti HBs:
Not detectable by RIA or PHA. Even if these antibodies are present in trace amounts, their amount is limited to a negligible value of 5.10 -3 IU / ml. -
6) Menge an Ziegen-Normal-Ig G:
Selbst wenn diese Komponente in Spurenmengen vor liegt, ist ihre Menge auf einen vernachlässigbaren Wert unter 0,00000034 Masse-% begrenzt.6) Amount of goat normal Ig G:
Even if this component is present in trace amounts, its amount is limited to a negligible value below 0.00000034 mass%. -
7) Normale Humanserumproteine:
Durch Immunelektrophorese nicht nachweisbar.7) Normal human serum proteins:
Not detectable by immunoelectrophoresis.
2. Wirksamkeit zur Erzeugung von anti-HBs.2. Effectiveness for producing anti-HBs.
-
1) Wirksamkeit zur Erzeugung von anti-HBs bei unter
suchten Probanden
Bei 30 mit dem erfindungsgemäßen, hoch immunogenen HB-Impfstoff geimpften Probanden (Erwachsene mit einem Alter über 15 Jahre Impfung mit jeweils. 1,0 ml, bei Kindern Impfung mit jeweils 0,25 - 0,5 ml, zweimalige Impfung mit einem Zeitabstand von 1 Monat, dritte Impfung am 90. Tag) zeigte keine der geimpften Personen während der Beobachtungsdauer ir gendeine unerwünschte Reaktion, es trat kein anti- HBc auf , und die Enzymwerte (GPT , GOT ) waren unver ändert.
Auf der anderen Seite wurde festgestellt, daß be reits nach der zweiten Impfung 100% anti-HBs gebil det worden waren, wie aus den Ergebnissen der nach stehenden Tabelle 1 hervorgeht.1) Effectiveness for the generation of anti-HBs in examined subjects
In 30 subjects vaccinated with the highly immunogenic HB vaccine according to the invention (adults over the age of 15 years with 1.0 ml each, in children with 0.25-0.5 ml each, two vaccinations with a time interval of 1 month, third vaccination on the 90th day) none of the vaccinated persons showed any undesired reaction during the observation period, no anti-HBc occurred and the enzyme values (GPT, GOT) were unchanged.
On the other hand, it was found that 100% anti-HBs had already been formed after the second vaccination, as can be seen from the results in Table 1 below. -
2) Vergleich von herkömmlichem Rekombinant-HB-Impfstoff
mit Pre-S2-Codierung mit dem erfindungsgemäßen Impf
stoff bezüglich der Erzeugung von anti-HBs
Es wurde festgestellt, daß der von Hefe abgeleitete und nach dem DNA-Rekombinantverfahren hergestellte herkömmliche Impfstoff (Takeda TGP-943T, Japan, 1989), der Pre-S2-Protein enthält, nach der zweiten Impfung lediglich zu einer 47-%igen Bildung von anti-HBS und sogar nach der dritten Impfung ledig lich zu einer 92-%igen Bildung von anti-HBs führt. Die entsprechenden Ergebnisse sind in Tabelle 2 zu sammengefaßt.2) Comparison of conventional recombinant HB vaccine with pre-S2 coding with the vaccine according to the invention with regard to the generation of anti-HBs
It was found that the conventional vaccine (Takeda TGP-943T, Japan, 1989) derived from yeast and produced by the DNA recombinant method, which contains pre-S2 protein, only produced 47% after the second vaccination anti-HBS and even after the third vaccination only leads to a 92% formation of anti-HBs. The corresponding results are summarized in Table 2.
Die Ergebnisse der obigen Tabelle 2 zeigen, daß der her kömmliche HB-Impfstoff auch bei Dreifachimpfung nicht zu einer 100-%igen Ausbildung von anti-HB-Antikörpern führt, also das Problem der nicht auf die Impfung ansprechenden Probanden auf dieser Basis nicht gelöst werden kann.The results of Table 2 above show that the forth Conventional HB vaccine is not available even with triple vaccination leads to a 100% formation of anti-HB antibodies, so the problem of those not responding to vaccination Subjects cannot be solved on this basis.
Auf der anderen Seite zeigen die Ergebnisse der Tabelle 3, daß der erfindungsgemäße Impfstoff bereits nach zweima liger Impfung zu einer 100-%igen Ausbildung von anti-HB- Antikörpern führt, so daß damit erstmals das Problem des Nichtansprechens auf die Impfung vollständig gelöst ist, da sämtliche geimpften Personen auf die Impfung ansprechen und ausreichend anti-HB-Antikörper ausbilden, und zwar be reits nach zweimaliger Impfung.On the other hand, the results of Table 3 show that the vaccine according to the invention already after two vaccination for a 100% formation of anti-HB Antibodies leads, so that for the first time the problem of Non-response to vaccination is fully resolved because all vaccinated people respond to the vaccination and form sufficient anti-HB antibodies, namely be after two vaccinations.
Der mit der Erfindungskonzeption verbundene große techni sche Fortschritt geht aus den obigen Vergleichsergebnissen hervor. Er ist umso höher zu bewerten, da die Hepatitis B eine außerordentlich schwerwiegende Erkrankung darstellt und durch die Erfindung erstmals ein Weg eröffnet wird, eine 100-%ige Prävention dieser Erkrankung durch Impfung zu erzielen.The great technology associated with the concept of the invention progress is based on the comparison results above forth. It is all the more important because the hepatitis B is an extremely serious illness and the invention opens a way for the first time, 100% prevention of this disease through vaccination to achieve.
Die Erfindung, wie sie oben unter Bezug auf die Ausfüh rungsbeispiele erläutert wurde, ist nicht auf diese bei spielhaften Angaben beschränkt. Die Erfindungskonzeption umfaßt auch alle Modifizierungen und Weiterbildungen im Rahmen des Erfindungs- und Anspruchsgegenstands.The invention as described above with reference to the embodiment Rungsbeispiele was explained, is not on these limited playful information. The concept of the invention also includes all modifications and further training in Framework of the subject matter of the invention and claim.
Claims (19)
durch Affinitätschromatographie einer Human-HB-Antigen enthaltenden Lösung,
gekennzeichnet durch
- A) Affinitätschromatographie von Human-Serum oder
Human-Post-partum-Placentaserum, das Pre-S2-Protein
mit Humanserumalbumin-Bindungsaktivität (HSA-BA)
enthält,
an einem Chromatographiegel, das immobilisierte, hoch immunogene anti-HB-Antikörper aufweist,
unter Gewinnung einer gereinigten HB-Antigenlösung mit Gehalt an Pre-S2-Protein
und - B) Abtrennung von unerwünschten Proteinen durch Dialyse mit Salzlösung und anschließend mit Wasser.
by affinity chromatography of a solution containing human HB antigen,
marked by
- A) Affinity chromatography of human serum or human post-partum placentaserum which contains pre-S2 protein with human serum albumin binding activity (HSA-BA),
on a chromatographic gel which has immobilized, highly immunogenic anti-HB antibodies,
to obtain a purified HB antigen solution containing pre-S2 protein
and - B) Separation of unwanted proteins by dialysis with saline and then with water.
- C) Inaktivierung von HBV durch Wärmebehandlung bei 98-100°C, vorzugsweise während mindestens 30 min.
- C) HBV inactivation by heat treatment at 98-100 ° C, preferably for at least 30 min.
Polyethoxysorbitanlaurat (Tween 20, Tween 21),
Polyethoxysorbitanpalmitat (Tween 40),
Polyethoxysorbitanstearat (Tween 60, Tween 61),
Polyethoxysorbitantristearat (Tween 65),
Polyethoxysorbitanoleat (Tween 80, Tween 81) und/oder
Polyethoxysorbitantrioleat (Tween 85). 6. The method according to claim 5, characterized in that the vaccine as a protein stabilizer polyoxyethylene derivatives of sorbitan esters (polysorbates) are added, preferably
Polyethoxysorbitan laurate (Tween 20, Tween 21),
Polyethoxysorbitan palmitate (Tween 40),
Polyethoxysorbitan stearate (Tween 60, Tween 61),
Polyethoxysorbitan tristearate (Tween 65),
Polyethoxysorbitan oleate (Tween 80, Tween 81) and / or
Polyethoxysorbitan trioleate (Tween 85).
gekennzeichnet durch
einen HB-Antigen-Titer von 1 : 2000 (RPHA),
einen Pre-S2-Antigen-Titer von 1 : 500 (RPHA)
und
einen HSA-BA-Titer von 1 : 100 (PHA).15. Highly purified and highly immunogenic hepatitis B vaccine, with which a 100% production of anti-heptatitis B antibodies is possible
marked by
an HB antigen titer of 1: 2000 (RPHA),
a pre-S2 antigen titer of 1: 500 (RPHA)
and
an HSA-BA titer of 1: 100 (PHA).
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| WO2000001345A3 (en) * | 1998-07-03 | 2000-02-24 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Use of an amphipathic compound for providing an adjuvant to a subunit vaccine |
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