CN104163850B

CN104163850B - 一种小分子抗体亲和肽及其应用

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Publication number: CN104163850B
Application number: CN201310300695.0A
Authority: CN
Inventors: 徐霞; 韦宇平; 徐建栋
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2013-07-17
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2033-07-17
Also published as: CN104163850A

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及一种抗体高选择性小分子抗体亲和肽及应用。本发明的小分子抗体亲和肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1‑54中的任一项所示。根据本发明的小分子抗体亲和肽，其与人免疫球蛋白IgG的Fc片段结合，并且不与人血清白蛋白HAS结合。采用本发明的小分子抗体亲和肽作为亲和配体，可以实现高效、安全、经济的IgG分离纯化。

Description

一种小分子抗体亲和肽及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及一种抗体高选择性小分子抗体亲和肽及其应用。

背景技术

免疫球蛋白IgG，即抗体是一种特殊的蛋白质分子，被作为体外诊断的试剂、治疗疾病的药物、免疫亲和层析的配基等，在生命科学研究、生物技术及医学领域中有着广泛的应用。

目前，IgG的分离纯化多采用抗体的天然亲和配体Protein A/G，由于Protein A/G存在与抗体Fc片段专一性识别的能力，使用Protein A/G亲和色谱纯化抗体，获得的产品的纯度较高。但是由于Protein A/G也属于具有活性的生物物质，因此Protein A/G分离也存在一些问题：

1）价格昂贵：因为蛋白A配基需要通过基因工程的方法生产纯化，因此生产成本高，其价格达到$10000/升亲和介质；

2）缺乏有效的清洗方法，由于蛋白A在碱性环境下不稳定，因此不能使用一般的氢氧化钠原位清洗法；

3）由于配基也属于蛋白质，易被存在原料液中的蛋白酶水解，从而降低分离效果；

4）与一般的化学配基相比，蛋白A色谱的使用生命周期较短；

5）配基易脱落，脱落的蛋白A会引起人的免疫反应且在临床上已经证实对人体有毒害；

6）洗脱pH较低（pH2-3），易引起一些抗体失活或者出现聚集，常常需要边收集产品，边中和，增加操作的复杂度。

对于抗体的分离纯化，也有很多研究者尝试使用小分子化合物作为配体，也取得的了一定的效果，但是目前的小分子化合物配体也存在一些问题：

1）生理毒性：目前的小分子化合物配体多含有杂环，具有一定毒性。例如，4-巯基-乙基吡啶（MEP），其对小鼠50%致死量为178mg/kg。

2）亲和性差：目前的小分子化合物配体亲和力通常较Protein A/G低。

3）选择性差：目前的小分子化合物配体在结合IgG的同时也会与主要分离杂质HAS（人血清白蛋白）结合。

所以，目前IgG的分离纯化缺乏一种高效安全经济的亲和配体。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种小分子抗体亲和肽作为亲和配体，实现高效安全经济的IgG分离纯化。

本发明的另一目的是提供上述小分子抗体亲和肽的应用。

本发明的小分子抗体亲和肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1-54中的任一项所示。

进一步地，根据本发明的小分子抗体亲和肽，其结构特征，自N端至C端如下：

NH₂-R¹-R²-R³-R⁴-COOH，

其中，R¹为苏氨酸（Thr）或谷氨酸（Glu）或门冬氨酸（Asp），R²为苏氨酸（Thr）或谷氨酸（Glu）或门冬氨酸（Asp），R³为谷氨酸（Glu）或门冬氨酸（Asp）或脯氨酸（Pro），R⁴为半胱氨酸（Cys）或甘氨酸（Gly）。也可以理解为R¹和R²为酸性氨基酸及其衍生物，R³为酸性氨基酸或脯氨酸，R⁴为半胱氨酸（Cys）或甘氨酸（Gly）。

根据本发明的小分子抗体亲和肽，所述小分子抗体亲和肽与人免疫球蛋白IgG的Fc片段结合，并且其不与人血清白蛋白HSA结合。

进一步的，本发明通过将所述的小分子肽偶联于载体以分离纯化免疫球蛋白IgG。

本发明提供了一种小分子抗体亲和肽，用于分离纯化免疫球蛋白IgG，通过将所述的小分子肽偶联于不同的载体可以实现不同条件下免疫球蛋白IgG的分离或纯化，例如将该小分子肽偶联于琼脂糖凝胶，可以制备亲和层析柱纯化免疫球蛋白IgG；而将该小分子肽偶联于透析器的中空纤维膜，则可应用于自身免疫性疾病的血液净化治疗，选择性的清除致病IgG。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

1）高效：该小分子抗体亲和肽的结合力与人免疫球蛋白天然配体Protein A/G相当，同时不与人血清白蛋白结合。

2）安全：该小分子抗体亲和肽分子量小（小于6肽），无免疫原性；其残基序列取自20种必需氨基酸，安全无毒。

3）经济：该小分子抗体亲和肽由固相合成而得，成本较低且便于质量管控。

因而采用该小分子抗体亲和肽作为亲和配体，可以实现高效、安全、经济的IgG分离纯化。

附图说明

图1为本发明中小分子抗体亲和肽1与免疫球蛋白IgG的SPR动力学测定曲线；

图2为天然配体（ProG）与免疫球蛋白IgG的SPR动力学测定曲线。

具体实施方式

实施例1多肽合成

1）活化树脂：称取1000mg FMOC Cys-wang Resin，加入10-15mL DMF浸泡30min（浸没全部树脂），使其充分溶胀。

2）脱保护：压滤除去浸泡树脂的DMF，加入用20%哌啶的DMF溶液10mL，氮气吹沸反应15min，然后压滤除去用20%哌啶的DMF溶液，脱除氨基的FMOC基团，用10mL异丙醇洗涤树脂三次，10mL DMF洗三次，而后用茚三酮法检测树脂应成黑色或紫色。

3）缩合反应：连接下一个氨基酸，称取FMOC-氨基酸（Glu、Asp或Pro）的用量是1.4mmol/g树脂，910mg TBTU，加入10mL DMF和0.45g HOBt混和均匀后，加入0.52mL DIEA配成反应液，室温下氮气吹沸反应2h。反应完毕后，用异丙醇洗涤树脂三次，然后用DMF洗涤树脂三次。检测氨基。

4）重复步骤2）-3）：按多肽的顺序自C端向N端延伸多肽。重复脱保护、洗涤、缩合的过程至剩余的氨基酸连接完毕，完成多肽的连接。

首位（R¹）氨基酸为Thr或Glu或Asp，第二位（R²）氨基酸为Thr或Glu或Asp，第三位氨基酸（R³）为Glu或Asp或Pro，末位氨基酸（R⁴）为Cys。

5）多肽切割：用氮气将多肽-树脂复合物吹干，按TFA/phenol/H20/thioanisole/EDT/TIS（80/5/5/5/3/2）的比例配成混和切割试剂。将肽树脂置于圆底烧瓶中，加入切割液磁力搅拌2小时，用200目砂芯过滤器除去树脂，滤液直接抽入冷冻乙醚中，3000r／min离心使粗肽沉淀，冻干至恒重即得粗肽，干燥称重。

6）粗肽用HPLC纯化至95%以上，质谱鉴定。

末位氨基酸（R⁴）为Gly时，同上述步骤。

实施例2IgG亲和特性测定

1）配制10mmol/L Hepes缓冲液，pH7.4，NaCl含量150mmol/L。

2）以1）中配制液体为流动相，运行BiacoreT200分析仪。

3）插入检测芯片CM5，设定流速30μL/min。

4）依次注入EDC和NHS各100μL，活化芯片。

5）将IgG溶解于醋酸钠缓冲液，pH4.5，IgG100μg/mL。

6）注入5）中IgG溶液100μL，固定IgG于芯片表面。

7）分别将小分子抗体亲和肽1（氨基酸序列如SEQ ID No.11所示），小分子抗体亲和肽2（氨基酸序列如SEQ ID No.34所示）和天然配体（ProG与ProA），溶解于1）中配制液体，含量100μg/mL。

8）依次注入不同浓度的多肽和天然配体（浓度由高到低依次为500μm，250μm，125μm，62.5μm和31.25μm），记录其与IgG的吸附曲线。求得其相关参数，具体结果见图1、图2及其表1（小分子亲和肽2与免疫球蛋白IgG的SPR动力学测定曲线图的绘制同小分子亲和肽1，ProA与免疫球蛋白IgG的SPR动力学测定曲线图的绘制同ProG，本实施例不再累述给出相关附图）。

表1为本发明中小分子抗体亲和肽，Protein A/G与免疫球蛋白IgG结合常数比较表

Ka为结合常数，Kd为解离常数，K_D为反应平衡常数

由附图及表1可知，本发明的小分子抗体亲和肽，作为亲和配体与IgG的结合解离效果与天然配体（ProG与ProA）相当，可以实现高效、安全、经济的IgG分离纯化。

实施例3小分子抗体亲和肽与IgG和HAS吸附特性比较

1）配制10mmol/L Hepes缓冲液，pH7.4，NaCl含量150mmol/L。

2）以1）中配制液体为流动相，运行BiacoreT200分析仪。

3）插入检测芯片CM5，设定流速30μL/min。

4）依次注入EDC和NHS各100μL，活化芯片。

5）将IgG溶解于醋酸钠缓冲液，pH4.5，IgG100μg/mL。同样将HSA溶解于醋酸钠缓冲液，pH4.5，HSA100μg/mL。

6）注入5）中IgG溶液100μL，固定IgG于芯片表面。

7）注入5）中HSA溶液100μL，固定HSA于另一芯片表面。

8）将小分子抗体亲和肽3（氨基酸序列如SEQ ID No.1所示），小分子抗体亲和肽4氨基酸序列如SEQ ID No.4所示）溶解于1）中配制液体，含量100μg/mL。

9）依次对不同芯片注入多肽，记录其与IgG和HSA的吸附曲线。记录多肽在IgG和HAS芯片表面的吸附量，具体结果见表2。

表2为本发明中小分子抗体亲和肽与IgG和HSA吸附特性比较

由表2可知，本发明的小分子抗体亲和肽对人免疫球蛋白IgG的Fc片段吸附量远大于其对人血清白蛋白HSA的吸附量，其亲和作用具有高度选择性。

实施例4亲和介质制备

1）取10mg小分子抗体亲和肽（氨基酸序列如SEQ ID No.5所示）溶解于10mLHepes缓冲液，pH7.4。

2）取巯基活化后的葡萄糖凝胶4FF1mL。

3）上述两者混合反应2小时。

4）反应完毕后，以Hepes缓冲液洗涤树脂，可得亲和介质。

Claims

1.一种小分子抗体亲和肽，其特征在于，所述小分子抗体亲和肽的氨基酸序列如SEQID No.1、4、11与34中的任一项所示。

2.权利要求1所述小分子抗体亲和肽的在非疾病诊断与治疗领域的应用。

3.根据权利要求2所述的小分子抗体亲和肽的应用，其特征在于，所述的应用为在分离、纯化或清除人免疫球蛋白IgG中的应用。